特許 7293354 顕微透過光コントラスト法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-06-09

(45)【発行日】2023-06-19

(54)【発明の名称】顕微透過光コントラスト法

(51)【国際特許分類】

   G02B 21/36 20060101AFI20230612BHJP

【ＦＩ】

G02B21/36

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2021524979

(86)(22)【出願日】2019-11-08

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-17

(86)【国際出願番号】 EP2019080710

(87)【国際公開番号】W WO2020094851

(87)【国際公開日】2020-05-14

【審査請求日】2022-08-01

(31)【優先権主張番号】102018128083.1

(32)【優先日】2018-11-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】DE

(73)【特許権者】

【識別番号】511079735

【氏名又は名称】ライカ マイクロシステムズ シーエムエス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

【氏名又は名称原語表記】Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＣＭＳ ＧｍｂＨ

【住所又は居所原語表記】Ｅｒｎｓｔ－Ｌｅｉｔｚ－Ｓｔｒａｓｓｅ １７－３７， Ｄ－３５５７８ Ｗｅｔｚｌａｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100114890

【弁理士】

【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト

(74)【代理人】

【識別番号】100098501

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 拓

(74)【代理人】

【識別番号】100116403

【弁理士】

【氏名又は名称】前川 純一

(74)【代理人】

【識別番号】100134315

【弁理士】

【氏名又は名称】永島 秀郎

(74)【代理人】

【識別番号】100135633

【弁理士】

【氏名又は名称】二宮 浩康

(74)【代理人】

【識別番号】100162880

【弁理士】

【氏名又は名称】上島 類

(72)【発明者】

【氏名】クリスティアン シューマン

【審査官】殿岡 雅仁

(56)【参考文献】

【文献】特開平０３－２６７９１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表平０８－５０２６００（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平１０－２６８１９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１２－０８８５３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１７－１７３８２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１３／０２５８０９０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２０１４－２４０９３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１５－２０３７０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開昭５８－２１１７３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１１－１４１４４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】独国特許出願公開第１０２０１８１０３４０３（ＤＥ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０２Ｂ ２１／００ － ２１／３６

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

顕微透過光コントラスト法であって、
非対称な第１の照明瞳（３８）によって少なくとも部分的に試料（１６）を照明し、
第１の部分画像（５４ａ）を生成するために、非対称な第１の検出瞳（４０）によって少なくとも部分的に前記試料（１６）を結像し、
光軸に対して垂直に延在している平面への投影において、前記第１の照明瞳（３８）および前記第１の検出瞳（４０）を互いに回動させて、互いに部分的に重なり合うように配置し、これにより、角度空間の少なくとも１つの第１の領域が明視野にあり、前記第１の領域とは異なる前記角度空間の第２の領域が暗視野にあり、前記第１の部分画像（５４ａ）が第１の明視野部分および第１の暗視野部分を有するようにし、
非対称な第２の照明瞳によって少なくとも部分的に前記試料（１６）を照明し、
第２の部分画像（５４ｂ）を生成するために、非対称な第２の検出瞳によって少なくとも部分的に前記試料（１６）を結像し、
前記光軸に対して垂直に延在している前記平面への投影において、前記第２の照明瞳および前記第２の検出瞳を互いに回動させて、互いに部分的に重なり合うように配置し、これにより、前記角度空間の少なくとも１つの第３の領域が明視野にあり、前記第３の領域とは異なる、前記角度空間の第４領域が暗視野にあり、前記第２の部分画像が第２の明視野部分および第２の暗視野部分を有するようにし、
前記第１の部分画像（５４ａ）および前記第２の部分画像（５４ｂ）から、数値的に前記試料（１６）の複素伝達関数を再構成することにより、前記試料（１６）の画像を生成する、
方法。

【請求項2】

前記第１の照明瞳（３８）を通る第１の照明光によって少なくとも部分的に前記試料（１６）を照明し、前記第２の照明瞳を通る第２の照明光によって少なくとも部分的に前記試料（１６）を照明し、前記第１の照明光および前記第２の照明光は、異なる分光組成を有する、
請求項１記載の方法。

【請求項3】

前記第１の部分画像（５４ａ）および前記第２の部分画像（５４ｂ）を同時に生成する、
請求項２記載の方法。

【請求項4】

前記第１の部分画像（５４ａ）および／または前記第２の部分画像（５４ｂ）に対し、サンプリングの適合化、ノイズリダクションまたはスペクトル再分配を実行する、
請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。

【請求項5】

前記試料（１６）の種々異なる層に対して前記画像の生成のステップを繰り返し、このように生成された複数の前記画像から画像スタックを生成する、
請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。

【請求項6】

前記第１の照明瞳（３８）の照明プロファイルおよび／または前記第２の照明瞳の照明プロファイルを検出する、
請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。

【請求項7】

前記試料（１６）を透過した後、前記第１の照明瞳（３８）および／または前記第２の照明瞳の画像を生成し、前記画像を用いて位相伝達関数（４６）および振幅伝達関数（４８）を計算する、
請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。

【請求項8】

前記第１の照明瞳（３８）、前記第２の照明瞳、前記第１の検出瞳（４０）および／または前記第２の検出瞳を遮断する、
請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。

【請求項9】

前記第１の照明瞳（３８）、前記第２の照明瞳、前記第１の検出瞳（４０）および／または前記第２の検出瞳の種々異なる遮断に対して、前記画像を生成するステップを繰り返す、
請求項８項記載の方法。

【請求項10】

前記第１の照明瞳（３８）、前記第２の照明瞳、前記第１の検出瞳（４０）および／または前記第２の検出瞳はそれぞれ扇形または弓形の形状を有する、
請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。

【請求項11】

前記第１の照明瞳（３８）と前記第２の照明瞳とを回動によって重ねることができように前記第１の照明瞳（３８）と前記第２の照明瞳とが互い配置されており、かつ／または、前記第１の検出瞳（４０）と前記第２の検出瞳とを回動によって重ねることができるように前記第１の検出瞳（４０）と前記第２の検出瞳とが互いに配置されている、
請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。

【請求項12】

顕微透過光コントラスト法を実施する装置であって、前記装置は、
非対称な第１の照明瞳（３８）によって少なくとも部分的に試料（１６）を照明し、非対称な第２の照明瞳によって少なくとも部分的に前記試料（１６）を照明するように構成された照明ユニット（１８、６４）と、
第１の部分画像（５４ａ）を生成するために、非対称な第１の検出瞳（４０）によって少なくとも部分的に前記試料（１６）を結像し、第２の部分画像（５４ｂ）を生成するために、非対称な第２の検出瞳によって少なくとも部分的に前記試料（１６）を結像するように構成された検出ユニット（２０、６８）と、
を有し、
光軸に対して垂直に延在している平面への投影において、前記第１の照明瞳（３８）および前記第１の検出瞳（４０）が互いに回動されて、互いに部分的に重なり合うように配置されており、これにより、角度空間の少なくとも１つの第１の領域が明視野にあり、第１の領域とは異なる前記角度空間の第２の領域が暗視野にあり、前記第１の部分画像（５４ａ）が第１の明視野部分および第１の暗視野部分を有し、
前記光軸に対して垂直に延在している前記平面への投影において、前記第２の照明瞳および前記第２の検出瞳が互いに回動されて、互いに部分的に重なり合うように配置されており、これにより、前記角度空間の少なくとも１つの第３の領域が明視野にあり、前記第３の領域とは異なる前記角度空間の第４領域が暗視野にあり、前記第２の部分画像（５４ｂ）が第２の明視野部分および第２の暗視野部分を有し、
前記装置はさらに、前記第１の部分画像（５４ａ）および前記第２の部分画像（５４ｂ）から、数値的に前記試料（１６）の複素伝達関数を再構成することにより、前記試料（１６）の画像を生成するように構成された制御ユニット（２２）を有する、装置。

【請求項13】

前記照明ユニット（１８、６４）は、前記第１の照明瞳（３８）および前記第２の照明瞳を生成する第１の変調要素（２８、６６）を有し、前記検出ユニット（２０、６８）は、前記第１の検出瞳および前記第２の検出瞳を生成する第２の変調要素（３２、７０）を有する、
請求項１２記載の装置。

【請求項14】

前記装置は、前記第１の検出瞳（４０）の照明プロファイルおよび／または前記第２の検出瞳の照明プロファイルを検出するベルトランレンズ系（７６）を有する、
請求項１２または１３記載の装置。

【請求項15】

請求項１２から１４までのいずれか１項記載の装置を有する顕微鏡。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、顕微透過光コントラスト法と、顕微透過光コントラスト法を実施する装置と、に関する。

【背景技術】

【0002】

光学顕微鏡法の分野では、特に生物学的な試料を結像する際に画像コントラストを改善することを目標とする種々異なる位相コントラスト法が公知である。最もよく知られているこのような方法は、慣用の透過光型顕微鏡法においても利用可能な、ゼルニケによる位相コントラストおよびノマルスキーによる微分干渉コントラストである。

【0003】

ゼルニケによる古典的な位相コントラスト法では、照明側の光リングと、対物レンズ瞳に設けられている位相リングと、が重ね合わされる。このような重ね合わせが必要であることは特に、試料によって誘導される瞳収差が生じる場合に不利である。例えば、マイクロタイタープレートの個々のくぼみなどのような、液体が充填された、断面の小さな試料容器では、液体の表面張力により、著しく際立った液体メニスカスが生じてしまい、この液体メニスカスにより、試料を透過する際の照明瞳のずれに結び付いてしまう。光リングと位相リングを持続的に重ね合わせることは、この状況では不可能である。

【0004】

ノマルスキーによる微分位相干渉法、略してＤＩＣでは、照明光は、ウォラストンプリズムにより、互いにコヒーレントではあるが、試料において互いに側方にずらされた２つの部分束に分解される。これらの２つの部分束は、対物レンズ側において、別のウォラストンプリズムにより、重ね合わせられて干渉させられる。ＤＩＣ法における２つの部分束の偏光に応じたこの分解は、結果的に、プラスチックから作製される一般的な試料容器の底部によって生じるような複屈折が、これに伴う偏光の影響によって著しいコントラスト劣化に結び付いてしまうことになる。慣用のプラスチック試料容器の作製における望ましくないこの複屈折は回避することができないため、ノマルスキーによるＤＩＣ法は、例えばプラスチックシャーレまたはプラスチックマイクロタイタープレートには適用できない。

【0005】

さらに、コンピュータ実装式の透過光コントラスト法の急速に発展する分野が存在し、例えば、L.TianおよびL.WallerによるOpt. Exp. 23 (2015)、11394に記載されている微分位相コントラストと称される方法、M. TeagueによるJ. Opt. Soc. Am. 73 (1983)、1434に記載されている強度伝搬イメージング法と称される方法、およびH. Lu等によるOpt. Exp. 24 (2016)、23545に記載されている瞳変調コントラストと称される方法が存在する。これらの方法は、光学伝達関数（例えばBornおよびWolfによるPrinciples Of Optics、第７版、ISBN 978-0-521-6422-4、10.6.3. Imaging with partially coherent quasi-monochromatic illuminationを参照されたい）、もしくは弱物体伝達関数としても公知でありかつ例えばN. StreiblによるJ. Opt. Soc. Am. A 2 (1985)、121に記載されているその線形近似の知識により、試料の位相情報および吸収情報の量的な再構成が可能であることに基づいている。これは、２次元でも３次元でも行うことが可能である。これらの方法における欠点は、これが、検出開口に対する、照明開口の特定の比を必要とすることである。例えば、微分位相コントラストでは、照明開口は検出開口以上の大きさでなければならない。瞳変調コントラストでは、照明開口は、検出開口以下の大きさでなければならない。

【0006】

しかしながら上で挙げたコンピュータ実装式の透過光コントラスト法はいくかの欠点を有する。例えば、空間周波数が低い際に位相伝達関数が、ごくわずかな値までの小さすぎる値に結果的にならないようにしたい場合、微分位相コントラストでは、透過光照明システムによって対物レンズ瞳を完全に照明する必要がある。したがってこの方法は、複式顕微鏡において、特に大開口の液浸対物レンズを使用する際には、容認できるコストで汎用的に適用可能ではない。というのは、この際には対物レンズ瞳の完全な照明には大きなコストを伴うからである。強度伝搬イメージングには、試料の異なるデフォーカスにおける画像の撮像が必要である。これらのデフォーカスが、典型的な集束駆動部により、すなわちステージまたは対物レンズリボルバの移動、集束可能なレンズ、例えば液体ベースのレンズ、波面マニピュレータ、例えば空間的な光変調器（空間光変調器ＳＬＭ（Spatial Light Modulator）とも称される）、または変形可能なミラーのいずれによって実現されるかとは関わりなく、複数の画像を時間的に連続して撮像しなければならない。これにより、画像撮像レートが減少してしまい、動的な試料では場合によっては画像アーチファクトが生成されてしまう。種々異なって集束される複数のカメラによる実現も確かに考えられるが、コストがかかり、複式顕微鏡の拡大領域全体を利用することができないこともあり得る。瞳変調コントラストには、コヒーレントな光源が必要であり、このコヒーレントの光源には、コストがかかり、レーザ安全性を保証するための付加的な安全手段が必要である。さらにコヒーレントな照明により、達成可能な分解能が減少してしまう。

【0007】

さらに、従来技術については、複数の画像が同時に撮像される微分位相コントラス法が開示されているZ. Phillips等によるPLoS ONE 12 (2017)、e0171228およびW. Lee等によるOpt. Exp. 25 (2017)、8398を参照されたい。これは、照明瞳のスペクトル符号化によって達成される。しかしながらこの方法も同様に、微分位相コントラストに関連して述べた複数の欠点を有する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の課題は、複式顕微鏡の利用可能な拡大領域および開口領域にわたって使用可能な、顕微透過光コントラスト法を示すことである。さらに本発明の課題は、対応する顕微透過光コントラスト法を実施可能な装置を示すことである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

この課題は、請求項１の特徴的構成を有する方法により、また請求項１３の特徴的構成を有する装置により解決される。有利な発展形態は、従属請求項に示されている。

【0010】

本発明による顕微透過光コントラスト法では、非対称な第１の照明瞳によって少なくとも部分的に試料を照明し、第１の部分画像を生成するために、非対称な第１の検出瞳によって少なくとも部分的に試料を結像し、光軸に対して垂直に延在している平面への投影において、第１の照明瞳および第１の検出瞳を互いに回動させて、互いに部分的に重なり合うように配置し、これにより、角度空間の少なくとも１つの第１の領域が、明視野にあり、第１の領域とは異なる角度空間の第２の領域が、暗視野にあるようにする。さらに、非対称な第２の照明瞳によって少なくとも部分的に試料を照明し、第２の部分画像を生成するために、非対称な第２の検出瞳によって少なくとも部分的に試料を結像し、光軸に対して垂直に延在している平面への投影において、第２の照明瞳および第２の検出瞳を互いに回動させて、互いに部分的に重なり合うように配置し、これにより、角度空間の少なくとも１つの第３の領域が、明視野にあり、第３の領域とは異なる角度空間の第４領域が、暗視野にあるようにする。第１の部分画像および第２の部分画像から、試料の画像を生成する。

【0011】

本出願において角度空間とは、特に平面波の光学において角度スペクトルとも称される、２つの部分画像の空間周波数スペクトルの空間と理解される。したがって角度空間は、２つの部分画像のフーリエ変換の空間を表す。

【0012】

本出願において、用語「非対称」は、２つの検出瞳に対応付けられている対物レンズの光軸に関するものであり、すなわち、非対称と称される瞳は、本明細書以外の透過光型顕微鏡において一般的であるように２つの検出瞳に対応付けられる対物レンズの光軸に関して回転対称ではない。例えば、２つの照明瞳および２つの検出瞳はそれぞれ、扇形、弓形または円弧の形状を有する。２つの照明瞳および２つの検出瞳の相互のそれぞれの回動は、以下では、極周りの回動とも称される。ここで用語「極周りに」は、対物レンズの光軸によって極方向が定められる極座標系に関するものである。

【0013】

対物レンズから見ると、一方では第１の照明瞳と第１の検出瞳とが、他方では第２の照明瞳と第２の検出瞳とがそれぞれ部分的に重なり合っている。これによって実現されるのは、第１の部分画像もしくは第２の部分画像がそれぞれ１つの明視野部分、すなわち明るい背景と、１つの暗視野部分、すなわち暗い背景と、を有することである。したがって照明瞳により、試料の非対称な照明が実現される。

【0014】

第１の部分画像もしくは第２の部分画像の明視野部分により、コントラストが強くかつ彩色に富む試料の詳細（いわゆる振幅物体または振幅構造）が結像される。これに対して暗視野部分では、透明またはほぼ透明の試料の詳細（いわゆる位相物体または位相構造）がそれぞれ結像され、これらは、これらを通過する光ビームの位相だけを変化させる。これに対応して、暗視野部分により、この方法の位相感度が確保される。第１の部分画像および第２の部分画像の明視野部分と暗視野部分とを組み合わせることにより、部分画像から生成される画像における試料の位相情報も振幅情報も共に表すことできる。位相情報と振幅情報とを組み合わせることにより、試料のコントラストの強い画像を生成可能である。試料の画像はいわば、複数の部分画像から合成され、したがって対物レンズ瞳全体の照明を必要としないため、本発明による方法は、高開口の対物レンズと共に使用可能であり、また低開口の対物レンズと共に使用可能である。特に、本発明による方法では、照明開口が対物レンズの開口よりも大きいかまたは小さいかは無関係である。このことは、特に、交換可能な対物レンズを有する複式顕微鏡では有利である。さらに、本発明による方法は、ただ１つのセンサ素子だけで実現可能であり、これにより、複式顕微鏡の拡大領域全体を利用可能である。

【0015】

本発明による方法において、試料の画像を生成する３つ以上の部分画像を生成できることは自明のことである。別のそれぞれの部分画像には、別の非対称な照明瞳と、別の非対称な検出瞳と、が対応付けられており、これらは互いに、角度空間の少なくとも１つの領域が、明視野にあり、この領域とは異なる角度空間の別の領域が、暗視野にあるように配置されている。

【0016】

別の有利な一発展形態では、第１の照明瞳を通る第１の照明光によって少なくとも部分的に試料を照明し、第２の照明瞳を通る第２の照明光によって少なくとも部分的に試料を照明し、第１の照明光および第２の照明光は、異なる分光組成を有する。好適には第１の部分画像および第２の部分画像を同時に撮像する。これにより、特に、試料における動的な過程を撮像する際に、第１の部分画像および第２の部分画像を時間的にずらして撮像することによる画像アーチファクトの発生が阻止される。この関連において、それぞれの照明瞳のスペクトル符号化も言及される。これによって可能になるのは、２つの照明瞳を通る角度空間の領域が、２つの部分画像に互いに分割されることである。この分割は例えばＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラの前のベイヤー行列によって、または複数の単色ＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラの前のスペクトル分解プリズム装置によって、またはダイクロイックのビームスプリットプレートを利用することによって実現することも可能である。

【0017】

別の有利な一実施形態では、第１の部分画像および／または第２の部分画像に対し、サンプリングの、すなわちサンプリングレートの適合化、ノイズリダクションまたはスペクトル再分配を実行する。試料の画像を生成するための後続処理を行う前に、試料の２つの部分画像およびこれらから生成される画像の画質を改善するために、種々異なる画像処理演算を第１の部分画像および／または第２の部分画像に適用可能である。

【0018】

好適には、第１の部分画像および第２の部分画像から数値的に試料の複素伝達関数を再構成することにより、試料の画像を生成する。複素散乱関数とも称される複素伝達関数には、試料の位相情報および振幅情報が含まれる。複素伝達関数は、結像に使用される装置の位相伝達関数および振幅伝達関数を用い、例えば、M. Chen等によるBiomed. Opt. Exp. 7 (2016)、3940に記載されているように、例えばウィーナーフィルタを用い、または反復法を用い、従来技術において公知の方法によって数値的に計算可能である。

【0019】

有利な一発展形態では、試料の種々異なる層に対して画像の生成のステップを繰り返し、このように生成された複数の画像から画像スタックを生成する。

【0020】

別の有利な一発展形態では、第１の照明瞳の照明プロファイルおよび／または第２の照明瞳の照明プロファイルを検出する。これにより、照明プロファイルの目標値と、照明プロファイルの検出した実際値と、を比較することにより、また第１の照明瞳および／または第２の照明瞳を適合化することにより、非対称な照明の、特に角度スペクトルのアダプティブな適合化が可能になる。

【0021】

有利な一発展形態では、試料を透過した後、第１の照明瞳および／または第２の照明瞳の画像を生成し、この画像を用いて位相伝達関数および振幅伝達関数を動的に計算する。動的に生成される位相伝達関数および振幅伝達関数（光学伝達関数とも称される）は、特に、試料の複素伝達関数の再構成のベースとして使用可能である。動的に生成される位相伝達関数および振幅伝達関数を使用することは、あらかじめ特定された位相伝達関数および振幅伝達関数を使用するのと比べて、結像に使用される光学系における短期的な変化に再構成が依存しないという利点を有する。動的な伝達関数の生成には、暗視野における照明スペクトルの外挿もしくはモデリングも含まれることが可能である。というのは照明スペクトルの測定のために、例えば、ベルトランレンズ系によっては暗視野を結像できないためである。

【0022】

別の有利な一発展形態では、第１の照明瞳、第２の照明瞳、第１の検出瞳および／または第２の検出瞳を遮断する。

【0023】

好適には、第１の照明瞳、第２の照明瞳、第１の検出瞳および／または第２の検出瞳の種々異なる遮断に対して、画像を生成するステップを繰り返す。このような順次の撮像により、カラー符号化されるチャネルのクロストークが低減され、また試料の生成される画像の品質に決定的な影響を及ぼす信号対雑音比が改善される。

【0024】

好適には第１の照明瞳、第２の照明瞳、第１の検出瞳および／または第２の検出瞳はそれぞれ扇形または弓形の形状を有する。

【0025】

第１の照明瞳と第２の照明瞳とを回動によって重ねることができるようにこれらが互い配置されており、かつ／または第１の検出瞳と第２の検出瞳とを回動によって重ねることができるようにこれらが互いに配置されていると有利である。これにより、第１の部分画像および第２の部分画像は、互いに簡単な幾何学的関係を有し、これにより、第１の部分画像および第２の部分画像から試料の画像を生成するのが特に容易である。

【0026】

本発明はさらに、顕微透過光コントラスト法を実施する装置に関する。この装置は、非対称な第１の照明瞳によって少なくとも部分的に試料を照明し、非対称な第２の照明瞳によって少なくとも部分的に試料を照明するように構成された照明ユニットと、第１の部分画像を生成するために、非対称な第１の検出瞳によって少なくとも部分的に試料を結像し、第２の部分画像を生成するために、非対称な第２の検出瞳によって少なくとも部分的に試料を結像するように構成された検出ユニットと、を有し、光軸に対して垂直に延在している平面への投影において、第１の照明瞳および第１の検出瞳が互いに回動されて、互いに部分的に重なり合うように配置されており、これにより、角度空間の少なくとも１つの第１の領域が、明視野にあり、第１の領域とは異なる角度空間の第２の領域が、暗視野にあり、かつ第１の部分画像が、第１の明視野部分および第１の暗視野部分を有し、光軸に対して垂直に延在している平面への投影において、第２の照明瞳および第２の検出瞳が互いに回動されて、互いに部分的に重なり合うように配置されており、これにより、角度空間の少なくとも１つの第３の領域が、明視野にあり、第３の領域とは異なる角度空間の第４領域が、暗視野にあり、かつ第２の部分画像が、第２の明視野部分および第２の暗視野部分を有し、上記の装置はさらに、第１の部分画像および第２の部分画像から試料の画像を生成するように構成された制御ユニットを有する。

【0027】

好適には、照明ユニットは、第１の照明瞳および第２の照明瞳を生成する第１の変調要素を有し、検出ユニットは、第１の検出瞳および第２の検出瞳を生成する第２の変調要素を有する。第１の変調要素および第２の変調要素は、第１の照明瞳および第２の照明瞳もしくは第１の検出瞳および第２の検出瞳を絞りの形態で物理的に生成する。第１の変調要素および／または第２の変調要素は、種々異なる絞り、交換可能な絞りのシステム、マイクロミラー装置、または空間光変調器（略してＳＬＭ）であってよい。択一的には第１の照明瞳および第２の照明瞳をＬＥＤアレイによって生成することも可能である。

【0028】

有利な一実施形態では、上記の装置は、第１の検出瞳の照明プロファイルおよび／または第２の検出瞳の照明プロファイルを検出するベルトランレンズ系を有する。ベルトランレンズ系により、第１の検出瞳および／または第２の検出瞳のコノスコープ観察が可能になる。これにより、第１の照明瞳および／または第２の照明瞳の適合化によって、例えば第１の変調要素の制御によって、非対称な照明のアダプティブな適合化が可能になる。

【0029】

好適には照明ユニットは、インコヒーレントな光源を有する。インコヒーレントな光源は、コヒーレントな光源、すなわちレーザ光源よりもコスト的に有利である。さらに、レーザ安全性を保証するためのコストのかかる手段が省略される。

【0030】

本発明はさらに、上で説明した形態の装置を有する顕微鏡、特に透過光型顕微鏡に関する。この顕微鏡は、正立顕微鏡としても倒立顕微鏡としても構成可能である。

【0031】

以下では、図面に基づき、本発明を説明する。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1】第１実施例としての透過光型顕微鏡を示す概略図である。

【図2】図１の透過光型顕微鏡において、第１の照明瞳と第１の検出瞳との、相互の相対的な位置を示す図である。

【図3】図１の透過光型顕微鏡の振幅伝達関数を示す図である。

【図4】図１の透過光型顕微鏡の位相伝達関数を示す図である。

【図5】部分画像から合成された画像の位相伝達関数を示す図である。

【図6】図１の透過光型顕微鏡を用いて撮像した試料の３つの部分画像を示す図である。

【図7】ウィーナーフィルタを用いて３つの部分画像から再構成された、試料の振幅構造および位相構造を示す図である。

【図8】第２実施例としての透過光型顕微鏡を示す概略図である。

【図9】ベルトランレンズ系を有する、第３実施例としての透過光型顕微鏡を示す概略図である。

【図10】本発明による顕微透過光コントラスト法の特別な一実施形態を示す流れ図である。

【発明を実施するための形態】

【0033】

図１には、第１実施例としての透過光型顕微鏡１０の概略図が示されている。透過光型顕微鏡１０は、顕微透過光コントラスト法を実施する装置１２と、試料１６に向けられている対物レンズ１４と、を有する。装置１２は、試料１６を照明する照明ユニット１８、検出ユニット２０および制御ユニット２２を有する。

【0034】

照明ユニット１８は、インコヒーレントな照明光２６を生成する光源２４と、照明ユニット１８の瞳面に配置されておりかつ例えば、交換可能な絞りのシステム、マイクロミラー装置または空間光変調器によって形成されている第１の変調要素２８と、コンデンサ３０と、を有する。光源２４によって生成される照明光２６は、第１の変調要素２８を通過した後、コンデンサ３０に当たり、このコンデンサ３０により、照明光２６は試料１６に向けられる。

【0035】

試料１６は、照明光２６を散乱および／または減衰させ、これにより、照明光２６から検出光２７が生じ、検出光２７が、試料１６の結像に使用される。試料１６から出射した検出光２７は、対物レンズ１４により、検出ユニット２０に向けられる。

【0036】

検出ユニット２０は、第２の変調要素３２を有し、第２の変調要素３２は、対物レンズ１４の瞳面に配置されておりかつ例えば、交換可能な絞りのシステム、マイクロミラー装置または空間光変調器によって形成されている。対物レンズ１４の外部にある瞳面を対物レンズ１４が有しない場合、対物レンズ１４の内部にある瞳面は、適切なリレー系により、対物レンズ１４の外部に向かって実際に結像可能であり、第２の変調要素３２は、この実際の中間瞳面に位置決め可能である。検出ユニット２０はさらに、チューブレンズ３４と、空間分解能を有する検出要素３６、例えばＣＣＤ素子またはＣＭＯＳ素子と、を有する。

【0037】

試料１６から出射する検出光２７は、対物レンズ１４により、まず第２の変調要素３２に向けられる。第２の変調要素３２を通過した後、検出光２７は、チューブレンズ３４を通って検出要素３６に当たる。有限チューブ長に対して補正された対物レンズ１４を用いた１段階式の結像の場合には、チューブレンズを省略することも可能である。

【0038】

制御ユニット２２は、より詳細に図２に示された第１の照明瞳３８および第２の照明瞳を生成するために第１の変調要素２８を制御する。これにより、照明光２６によって角度空間のどの領域が照明されるかが制御ユニット２２によって動的に制御される。さらに制御ユニット２２は、より詳細に図２に示された第１の検出瞳４０および第２の検出瞳を生成するために第２の変調要素３２を制御する。これにより、検出ユニット２０によって角度空間のどの領域が結像されるかが制御ユニット２２によって動的に制御される。さらに制御ユニット２２は、検出要素３６を制御し、これにより、第１の照明瞳３８および第１の検出瞳４０に対応付けられている第１の部分画像と、第２の照明瞳および第２の検出瞳に対応付けられている第２の部分画像と、が生成され、第１の部分画像および第２の部分画像から試料１６の画像が生成される。

【0039】

第１実施例では、試料１６の画像を生成するために２つの部分画像だけが撮像される。しかしながら３つ以上の部分画像を撮像することも可能である。制御ユニット２２はこのことを目的として、別の照明瞳を生成するために第１の変調要素２８を制御し、別の検出瞳を生成するために第２の変調要素３２を制御する。さらに制御ユニット２２は、検出要素３６を制御し、これにより、別の照明瞳および別の検出瞳にそれぞれ対応付けられている別の部分画像が生成され、第１の部分画像と、第２の部分画像と、別の部分画像と、から試料１６の画像が生成される。

【0040】

図２には、図１の透過光型顕微鏡において、第１の照明瞳３８と第１の検出瞳４０との相互の相対的な位置が略示されている。図２の描画は、対物レンズ１４から見た瞳３８、４０を示している。

【0041】

第１の照明瞳３８および第１の検出瞳４０は、これらが部分的に重なり合うように配置されている。これにより、暗視野照明を実現する第１の照明領域４２と、明視野照明を実現する第２の照明領域４４と、が生じる。したがって第１の検出瞳４０によって結像される第１の部分画像は、明視野部分および暗視野部分を有する。

【0042】

図２に示された実施例において、第１の検出瞳４０の開口は、第１の照明瞳３８の開口の２倍の大きさを有する。択一的な一実施例では第１の検出瞳４０の開口は、第１の照明瞳３８の開口よりも小さくてもよい。第１の照明瞳３８および第１の検出瞳４０はそれぞれ、扇形の形状を有し、中心角は１２０°の値を有する。したがって１２０°だけ回動させることにより、第１の照明瞳３８および第１の検出瞳４０から、第２の照明瞳および第２の検出瞳を容易に生成可能である。図２に示された実施例では、第１の照明瞳３８および第１の検出瞳４０は、互いに６０°の角度だけ極周りに回動されている。

【0043】

図１および図２に示された透過光型顕微鏡１０によって角度空間全体を結像しようとする場合、第１の照明瞳３８もしくは第１の検出瞳４０から２４０°だけそれぞれ回動されることによって生成される第３の照明瞳および第３の検出瞳に対応付けられる第３の部分画像を生成しなければならない。

【0044】

図３には、図１の透過光型顕微鏡１０の振幅伝達関数４６が部分画像について示されている。振幅伝達関数４６は、角度空間における関数であり、空間周波数の絶対値が、透過光型顕微鏡１０によってどのように伝達されるかを示す。

【0045】

図４には、図１の透過光型顕微鏡１０の位相伝達関数４８が部分画像について示されている。位相伝達関数４８は、振幅伝達関数４６と同様に角度空間における関数であり、空間周波数の位相が、透過光型顕微鏡１０によってどのように伝達されるかを示す。位相伝達関数４８は、非対称な照明に典型的なゼロ点通過５０を有する。

【0046】

図５には、部分画像から生成された試料１６の画像の位相伝達関数５２が示されている。図５から見て取ることができるのは、試料１６の複数の部分画像を組み合わせることにより、透過光型顕微鏡１０によって結像される空間周波数の領域が拡大され、部分画像の位相伝達関数のゼロ点通過５０が、角度空間の原点を除いて取り除かれていることであり、このことは、試料１６の画像のコントラストの改善に結び付く。

【0047】

図６には、光学シミュレーションによって生成された３つの部分画像５４ａ、５４ｂ、５４ｃが示されており、これらは、図１の透過光型顕微鏡１０を用いて撮像されたものである。

【0048】

３つの部分画像５４ａ、５４ｂ、５４ｃの第１の画像５４ａは、図２に示された第１の照明瞳３８によって照明されており、同様に図２に示された第１の検出瞳４０によって結像されている。３つの部分画像５４ａ、５４ｂ、５４ｃの第２の部分画像５４ｂは、対物レンズ１４の光軸の周りで１２０°だけ第１の照明瞳３８を回動させることによって生成された第２の照明瞳によって照明されており、対物レンズ１４の光軸の周りで１２０°だけ第１の検出瞳４０を回動させることによって生成される第２の検出瞳によって結像されている。３つの部分画像５４ａ、５４ｂ、５４ｃの第３の部分画像５４ｃは、対物レンズ１４の光軸の周りで２４０°だけ第１の照明瞳３８を回動させることによって生成された第３の照明瞳によって照明されており、対物レンズ１４の光軸の周りで２４０°だけ第１の検出瞳４０を回動させることによって生成される第３の検出瞳によって結像されている。

【0049】

３つの部分画像５４ａ、５４ｂ、５４ｃのそれぞれには、振幅構造５６も透過の位相構造５８も有する試料１６が示されている。

【0050】

図７には、ウィーナーフィルタを用いて３つの部分画像５４ａ、５４ｂ、５４ｃから再構成された、試料１６の振幅構造５６および位相構造５８が示されている。

【0051】

図８には、第２実施例としての透過光型顕微鏡６０の概略図が示されている。図８に示された透過光型顕微鏡６０は、図１に示された透過光型顕微鏡１０とは、制御ユニット２２により、第１の変調要素６６および第２の変調要素７０が動的に制御されない点が実質的に異なっている。

【0052】

図８の透過光型顕微鏡６０は、本発明による透過光コントラスト法を実施する装置６２を有する。装置６２は、試料１６を照明する照明ユニット６４および検出ユニット６８を有する。図１および図８において、同じまたは同じ作用の要素には同じ参照符号が付されている。

【0053】

照明ユニット６４は、照明ユニット６４の瞳面に配置されておりかつ第１の照明瞳３８および第２の照明瞳に対応して、光源２４から出射する照明光２６をスペクトル符号化するように構成されている第１の変調要素６６を有する。これは、例えば、第１の照明瞳３８もしくは第２の照明瞳の形態でそれぞれ構成されている複数のスペクトルフィルタを用いて行うことが可能である。

【0054】

検出ユニット６８は、対物レンズ１４の瞳面に配置されておりかつ第１の検出瞳４０および第２の検出瞳に対応して、試料１６から出射する検出光２７をスペクトル符号化するように構成されている第２の変調要素７０と、空間分解能を有する検出要素７２と、を有する。空間分解能を有する検出要素７２は、検出光２７を２つの部分画像に分割するように構成されている。この分割は、ベイヤー行列によって行われる。

【0055】

制御ユニット２２は検出要素７２を制御し、これにより、第１の照明瞳３８および第１の検出瞳４０に対応付けられている第１の部分画像と、第２の照明瞳および第２の検出瞳に対応付けられている第２の部分画像と、が同時に生成され、第１の部分画像および第２の部分画像から試料１６の画像が生成される。

【0056】

図９には、第３実施例としての透過光型顕微鏡７４の概略図が示されている。図９に示された透過光型顕微鏡７４は、図１に示された透過光型顕微鏡１０とは、本発明による透過光コントラスト法を実施する装置７８が付加的にベルトランレンズ系７６を有する点が実質的に異なっている。図１および図９において、同じまたは同じ作用の要素には同じ参照符号が付されている。

【0057】

ベルトランレンズ系７６は、対物レンズ１４の焦平面に配置されたビームスプリッタ８０を有し、ビームスプリッタ８０により、検出光２７の一部分が、空間分解能を有する別の検出要素８２に向けられる。ベルトランレンズ系７６により、検出瞳の照明プロファイルを検出可能である。これにより、ここでも制御ユニット２２によって可能になるのは、変調要素２８を制御することにより、照明ユニット１８による照明の角度スペクトルをアダプティブに適合することである。

【0058】

図１および図９において、同じまたは同じ作用の特徴的構成には同じ参照符号が付されている。

【0059】

図１０には、本発明による顕微透過光コントラスト法の特別な一実施形態を示す流れ図が示されている。

【0060】

第１ステップＳ１では、全部でＮ個の部分画像を撮像する。これらの部分画像は、それぞれ１つの照明瞳および検出瞳に対応付けられている。照明瞳および検出瞳は、角度空間の少なくとも１つの領域が、明視野にあり、この領域とは異なる角度空間の別の領域が、暗視野にあるようにそれぞれ互いに配置されている。したがってＮ個の部分画像のそれぞれは、明視野部分および暗視野部分を有する。Ｎ個の部分画像の撮像は、順次に、すなわち時間的に続けて、または同時に行うことが可能である。撮像を同時に行う場合には、かなり前で図８に関連して詳しく説明したように、それぞれ１つの照明瞳のスペクトル符号化を行う必要がある。

【0061】

第２ステップＳ２では、Ｎ個の部分画像を前処理する。すなわち、部分画像毎に、例えばサンプリングが適合化され、ノイズリダクションが実行され、かつ／またはスペクトル再分配が実行される。これは、Ｎ個の部分画像から再構成される試料１６の画像の画質の改善に役立つ。

【0062】

第３ステップＳ３では、Ｎ個の部分画像および所属の伝達関数、すなわち光学伝達関数から、試料１６の複素伝達関数、すなわち複数散乱ポテンシャルが、試料１６の画像として再構成される。これは、例えば、ウィーナーフィルタを介して、または反復法を介して行うことが可能であり、これらは、例えばM. Chen等によるBiomed. Opt. Exp. 7 (2016)、3940に記載されている。このような再構成の一実施例が、図６および図７に示されている。試料１６の複素伝達関数の表現は、特に別の振幅分布として、また位相分布として行われてよい。

【符号の説明】

【0063】

１０ 透過光型顕微鏡
１２ 装置
１４ 対物レンズ
１６ 試料
１８ 照明ユニット
２０ 検出ユニット
２２ 制御ユニット
２４ 光源
２６ 照明光
２７ 検出光
２８ 変調要素
３０ コンデンサ
３２ 変調要素
３４ チューブレンズ
３６ 検出要素
３８ 照明瞳
４０ 検出瞳
４２、４４ 領域
４６、４８ 伝達関数
５０ ゼロ点通過
５２ 伝達関数
５４ａ、５４ｂ、５４ｃ 部分画像
５６ 振幅物体
５８ 位相物体
６０ 透過光型顕微鏡
６２ 装置
６４ 照明ユニット
６６ 変調要素
６８ 検出ユニット
７０ 変調要素
７２ 検出要素
７４ 透過光型顕微鏡
７６ ベルトランレンズ系
７８ 装置
８０ ビームスプリッタ
８２ 検出要素

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】