特許7293406コリネバクテリウム属菌株およびその培養物を含む胃腸疾患予防、治療または改善用組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-06-09
(45)【発行日】2023-06-19
(54)【発明の名称】コリネバクテリウム属菌株およびその培養物を含む胃腸疾患予防、治療または改善用組成物
(51)【国際特許分類】
A23K 10/16 20160101AFI20230612BHJP
A23L 33/135 20160101ALI20230612BHJP
A61K 35/74 20150101ALI20230612BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20230612BHJP
【ＦＩ】
A23K10/16
A23L33/135
A61K35/74 A
A61P31/04 171
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2021574298
(86)(22)【出願日】2020-06-02
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-31
(86)【国際出願番号】 KR2020007169
(87)【国際公開番号】W WO2020251208
(87)【国際公開日】2020-12-17
【審査請求日】2021-12-14
(31)【優先権主張番号】10-2019-0071007
(32)【優先日】2019-06-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】507406611
【氏名又は名称】シージェイ チェルジェダン コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】110001818
【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ
(72)【発明者】
【氏名】キム，ヤン‐ス
(72)【発明者】
【氏名】イ，ナホム
(72)【発明者】
【氏名】ホン，ヨン・ギ
【審査官】吉原 健太
(56)【参考文献】
【文献】特表２００７－５２５９５１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００７－１９５５４３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１３－１４６２４７（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１４／０１４７５２２（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ２３Ｋ １０／００ － ５０／９０
Ａ２３Ｌ ５／４０ － ５／４９
Ａ２３Ｌ ３１／００ － ３３／２９
Ａ６１Ｋ ３５／００ － ３６／０６８
Ａ６１Ｐ １／００ － ４３／００
Ａ６１Ｋ ３１／００ － ３１／３２７
Ｃ１２Ｎ １／００ － ７／０８
Ｃ１２Ｐ １／００ － ４１／００
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株、その培養物、およびトレオニンを含み、
ここで、前記コリネバクテリウム属菌株は、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、および、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）からなるグループから選択される１種以上である、胃腸疾患の予防または改善用飼料組成物。
【請求項2】
前記コリネバクテリウム属菌株は加熱殺菌菌体である、請求項１に記載の飼料組成物。
【請求項3】
前記培養物は、コリネバクテリウム属菌株を培地で培養した発酵物である、請求項１又は２に記載の飼料組成物。
【請求項4】
前記培地はトレオニン生産用培地である、請求項３に記載の飼料組成物。
【請求項5】
前記トレオニンを６０～８０重量％で含む、請求項１～４のうちのいずれか一項に記載の飼料組成物。
【請求項6】
前記コリネバクテリウム属菌株およびその培養物は、乾燥された形態で含まれる、請求項１～５のうちのいずれか一項に記載の飼料組成物。
【請求項7】
前記胃腸疾患は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）感染によることである、請求項１～６のうちのいずれか一項に記載の飼料組成物。
【請求項8】
前記胃腸疾患は、胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、消化性潰瘍、および胃ガンからなる群より選択された１種以上である、請求項１～７のうちのいずれか一項に記載の飼料組成物。
【請求項9】
前記トレオニンは、（１）前記コリネバクテリウム属菌株、その培養物、またはこれら全てに含まれるか、
（２）別途に添加されるか、
（３）前記コリネバクテリウム属菌株、その培養物、またはこれら全てに含まれ、ここに追加的に添加されたものである、請求項１～８のうちのいずれか一項に記載の飼料組成物。
【請求項10】
コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株、その培養物、およびトレオニンを含み、
ここで、前記コリネバクテリウム属菌株は、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、および、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）からなるグループから選択される１種以上である、胃腸疾患予防または治療用薬学的組成物。
【請求項11】
コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株、その培養物、およびトレオニンを含み、
ここで、前記コリネバクテリウム属菌株は、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、および、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）からなるグループから選択される１種以上である、胃腸疾患予防または改善用食品組成物。
【請求項12】
コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株、その培養物、およびトレオニンを含み、
ここで、前記コリネバクテリウム属菌株は、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、および、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）からなるグループから選択される１種以上である、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）に対する抗菌用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、コリネバクテリウム属菌株、その培養物、およびトレオニンを含む胃腸疾患予防、治療、または改善用組成物に関するものである。
【背景技術】
【0002】
胃病変において胃潰瘍は最も大きな発病率を占めており、全畜種で世界共通的に発病している。胃潰瘍の発病率は畜産産業の発達と共に増加しており、食欲減少による成長率下落と共に、苦痛を伴った症状で動物福祉的な側面から胃潰瘍発生防止に対する努力が強化されている。
【0003】
トレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ、Ｔｈｒ）は、腸上皮保護物質であるムチン（ｍｕｃｉｎｅ）を構成する主要アミノ酸（Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、ＡＡ）である。ムチンタンパク質はタンパク質の吸収を促進すると同時に、胃液のような強酸性の消化液から消化器官を保護して腸健康維持のために重要な役割を果たす。実際に、飼料内Ｔｈｒ処理が子豚（ｐｉｇｌｅｔ）においてムチン合成を助けて腸健康を改善させると報告されている（非特許文献１）。
【0004】
飼料または食品用Ｔｈｒの生産は微生物による発酵方法によって生産され、この時、主に使用される微生物の種類としては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅ．ｃｏｌｉ）とコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などがある。同一なＡＡを生産するにもかかわらず、この二つの菌株はそれぞれグラム陰性菌とグラム陽性菌に区分される。グラム陰性菌とグラム陽性菌の両方とも細胞壁はペプチドグリカン（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ、ＰＧ）からなっている。しかし、グラム陰性菌の場合、ＰＧ以外に脂肪タンパク質（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）からなる脂質多糖類（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）層が追加的に存在し、このＬＰＳ層には体性抗原（Ｏ抗原）であるＬｉｐｉｄ Ａがあって毒性を示す特性がある。したがって、製薬業界では発熱性（ｐｙｒｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）、致死性（ｌｅｔｈａｌｉｔｙ）、シュワルツマン反応性（Ｓｃｈｗａｒｔｚｍａｎ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）、補助剤活性度（ａｄｊｕｖａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ）およびマクロファージ活性（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）のような有害な生物学的活性で非経口剤から内毒素を除去するのが必須的である（非特許文献２）。
【0005】
最近、飼料添加物の経済的な効用性による高度精製過程の単純化（または省略）による顆粒型（ｇｒａｎｕｌｅ ｔｙｐｅ）の飼料用アミノ酸の生産は必然的に発酵に使用されたバクテリアが死菌（ｈｅａｔ ｋｉｌｌｅｄ）形態で製品に混入される。いくつかの研究は代表的なグラム陽性菌である乳酸菌（Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ）死菌体が酸と熱に対する強い耐性で環境に安定的であり、高度濃縮が可能であって取り扱い容易である点、そして腸内定着した有益菌のエサとして用いられて乳酸菌特有の免疫強化活性を増強させることが報告されている（非特許文献３）。
【0006】
このような背景下に、本出願者らは胃腸疾患の予防および治療に効果がある薬学的組成物を開発するために鋭意努力した結果、コリネバクテリウム属菌株、その培養物、およびトレオニンを含む組成物が胃腸疾患の予防、治療および改善に効果があるのを確認して本出願を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【文献】Ｌａｗ Ｇ．（２０００） Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｏｎ ｇｕｔ ｍｕｃｉｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｉｎ ｐｉｇｌｅｔｓ ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ｉｎｔｒａｇａｓｔｒｉｃ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ。 Ｍａｓｔｅｒ ｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌｂｅｒｔａ。１－１４３。
【文献】Ｍｉｙａｍｏｔｏ Ｔ．， Ｏｋｏｎｏ Ｓ． ａｎｄ Ｋａｓａｉ Ｎ（２００９） Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｂｙ ｓｏｆｔ ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ。 Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、７５（１５）、５０５８－５０６３。
【文献】Ｌｅｅ Ｉ．Ｈ．（２０１８） 動物用抗菌剤と代替剤をめぐる最新動向。Ｐｉｇ ＆ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ、４、７０－７３。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本出願は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株、その培養物、およびトレオニンを含む、胃腸疾患予防または改善用飼料組成物を提供する。
【0009】
本出願は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株、その培養物、およびトレオニンを含む、胃腸疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【0010】
本出願は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株、その培養物、およびトレオニンを含む、胃腸疾患予防または改善用食品組成物を提供する。
【0011】
本出願は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株、その培養物、およびトレオニンを含む、ヘリコバクター・ピロリに対する抗菌用組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0012】
一様相は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株、その培養物、およびトレオニンを含む、胃腸疾患の予防、改善、または治療用組成物を提供することができる。
【0013】
本出願で、“予防”とは一例による組成物の投与によって疾患の発病を抑制または遅延させる全ての行為を意味し、“治療”とは一例による組成物の投与によって疾患の疑いおよび発病個体の症状が好転するか有利に変更される全ての行為を意味し、“改善”とは、一例による組成物の投与で疾患が治療される状態に係るパラメータ、例えば症状の程度を少なくとも減少させる全ての行為を意味することができる。前記疾患は胃腸疾患を意味することができる。
【0014】
一様相は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株、その培養物、およびトレオニンを含む、胃腸疾患予防または改善用飼料組成物を提供することができる。
【0015】
本出願で、“コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｃｏｒｙｎｅ ｓｐ．）菌株”は全てのコリネバクテリウム属菌株を含むことができる。コリネバクテリウム属菌株は例えば、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・クルジラクティス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）、コリネバクテリウム・デセルティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｓｅｒｔｉ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・カルーナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）、コリネバクテリウム・シングラレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｎｇｕｌａｒｅ）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、コリネバクテリウム・ストリアトゥム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ）、コリネバクテリウム・ポルーティソリ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｌｌｕｔｉｓｏｌｉ）、コリネバクテリウム・イミタンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｉｔａｎｓ）、コリネバクテリウム・テスツジノリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔｕｄｉｎｏｒｉｓ）、および／またはコリネバクテリウム・フラベスセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）であってもよく、さらに具体的に、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、またはその組み合わせ（コリネバクテリウム・グルタミクムおよびコリネバクテリウム・アンモニアゲネス）であってもよい。
【0016】
一例で、前記コリネバクテリウム属菌株は、トレオニン生産能があるものであり得る。本出願で、トレオニン生産能があるということは、当該微生物が培地で培養される時、微生物内および／または前記培地にトレオニンを生産および蓄積する能力を示すことを意味する。
【0017】
一例による胃腸疾患の予防、改善、または治療用組成物がコリネバクテリウム・グルタミクムを含む場合、コリネバクテリウム・グルタミクム以外の他の種類のコリネバクテリウム属菌株（例えば、コリネバクテリウム・エフィシエンス）を含む組成物より（１）胃腸疾患の予防、改善、または治療効果および／または（２）抗ヘリコバクター・ピロリ効能が優れる。
【0018】
一例による胃腸疾患の予防、改善、または治療用組成物がコリネバクテリウム・アンモニアゲネスを含む場合、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス以外の他の種類のコリネバクテリウム属菌株（例えば、コリネバクテリウム・エフィシエンス）を含む組成物より（１）胃腸疾患の予防、改善、または治療効果および／または（２）抗ヘリコバクター・ピロリ効能が優れる。
【0019】
一例による胃腸疾患の予防、改善、または治療用組成物がコリネバクテリウム・グルタミクムおよびコリネバクテリウム・アンモニアゲネスを含む場合、コリネバクテリウム・グルタミクムおよびコリネバクテリウム・アンモニアゲネス以外の他の種類のコリネバクテリウム属菌株（例えば、コリネバクテリウム・エフィシエンス）を含む組成物より（１）胃腸疾患の予防、改善、または治療効果および／または（２）抗ヘリコバクター・ピロリ効能が優れる。
【0020】
一例で、前記組成物が抗ヘリコバクター・ピロリ効能が優れているということは、ヘリコバクター・ピロリ菌株に対して抗菌活性が優れるかヘリコバクター・ピロリによって感染された細胞（例えば、胃粘膜細胞）の細胞死滅を防止する活性に優れているのを意味することができる。
【0021】
前記コリネバクテリウム属菌株は培養液中に培養培地を除去して濃縮された菌体を意味することができ、培養物から濃縮された菌体のみを回収するために遠心分離および／または濾過過程を経ることができる。
【0022】
一例で、前記コリネバクテリウム属菌株は死菌体の形態で含まれてもよい。本出願で、“死菌体”とは、生菌の反対になる概念であって発酵を通じて得られた生菌と代謝産物を熱処理などによって菌の成長が起こらないようにした形態を意味する。死菌体は、細胞質（ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）、細胞壁（ｃｅｌｌ ｗａｌｌ）、バクテリオシン（ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ）などの抗菌活性物質、多糖類（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、および／または有機酸などを含むことができる。
【0023】
一例によって死菌体を含む組成物は生菌を含む組成物より下記の（１）～（６）からなる群より選択された１種以上の特徴を有することができる。
【0024】
（１）耐酸性優秀；
（２）耐熱性優秀；
（３）高濃度に濃縮が可能；
（４）安定性優秀；
（５）取り扱いおよび保管容易；および
（６）腸内有益菌のエサとして利用可能。
（２）耐熱性優秀；
（３）高濃度に濃縮が可能；
（４）安定性優秀；
（５）取り扱いおよび保管容易；および
（６）腸内有益菌のエサとして利用可能。
【0025】
前記コリネバクテリウム属菌株はチンダルおよび／または熱処理によって死菌化できる。一例で、前記コリネバクテリウム属菌株およびその培養物を滅菌した培養液は菌株の死菌体を含む。例えば、前記熱処理は、６０～１３０℃の温度で３～３０分間行われることであり得る。また、前記熱処理は、１回～１０回の超高温殺菌（ｕｌｔｒａ ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ）オートクレーブ（ａｕｔｏｃｌａｖｅ）、および／または熱風乾燥で行うことができる。前記超高温殺菌は１１０℃～１３０℃の温度で３．０～１０．０秒間行われることであってもよく、例えば、１００℃で１．０秒～１０秒間２回、１２１℃で１．０～１０．０秒間１回行われることであってもよく、前記オートクレーブは１２０～１２５℃、または１２１℃で１０分～３０分、１５分～２５分、または２０分間行うことであってもよく、前記熱風乾燥は６０～７０℃の温度で行われることであってもよい。
【0026】
一具体例で、コリネバクテリウム属菌株の死菌体、コリネバクテリウム属菌株の培養物、およびトレオニンを含む組成物がインビトロおよび／またはインビボ上で（１）胃腸疾患の予防または治療効果および／または（２）抗ヘリコバクター・ピロリ効果に優れるのを確認した。
【0027】
一例による組成物は、前記コリネバクテリウム属菌株（または菌株の死菌体）を２０～４０ＯＤ（波長（ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ） ５６０～５６５ｎｍ）、２５～３５ＯＤ（波長 ５６０～５６５ｎｍ）、または３０ＯＤ濃度（波長 ５６０～５６５ｎｍ）で含むことができる。
【0028】
一例による組成物は、前記コリネバクテリウム属菌株（または菌株の死菌体）を２０～４０ＯＤ（波長 ５６０～５６５ｎｍ）、２５～３５ＯＤ（波長 ５６０～５６５ｎｍ）、または３０ＯＤ濃度（波長 ５６０～５６５ｎｍ）で１～１００ｇ／Ｌ、５～１００ｇ／Ｌ、１０～１００ｇ／Ｌ、１５～１００ｇ／Ｌ、２０～１００ｇ／Ｌ、２１～１００ｇ／Ｌ、１～８０ｇ／Ｌ、５～８０ｇ／Ｌ、１０～８０ｇ／Ｌ、１５～８０ｇ／Ｌ、２０～８０ｇ／Ｌ、２１～８０ｇ／Ｌ、１～６０ｇ／Ｌ、５～６０ｇ／Ｌ、１０～６０ｇ／Ｌ、１５～６０ｇ／Ｌ、２０～６０ｇ／Ｌ、２１～６０ｇ／Ｌ、１～５０ｇ／Ｌ、５～５０ｇ／Ｌ、１０～５０ｇ／Ｌ、１５～５０／Ｌ、２０～５０ｇ／Ｌ、２１～５０ｇ／Ｌ、１～３０ｇ／Ｌ、５～３０ｇ／Ｌ、１０～３０ｇ／Ｌ、１５～３０ｇ／Ｌ、２０～３０ｇ／Ｌ、２１～３０ｇ／Ｌ、１～２５ｇ／Ｌ、５～２５ｇ／Ｌ、１０～２５ｇ／Ｌ、１５～２５ｇ／Ｌ、２０～２５ｇ／Ｌ、または２１～２５ｇ／Ｌずつ含むことができる。
【0029】
一例による組成物は、前記コリネバクテリウム属菌株（または菌株の死菌体）を１～１００ｇ／Ｌ、５～１００ｇ／Ｌ、１０～１００ｇ／Ｌ、１５～１００ｇ／Ｌ、２０～１００ｇ／Ｌ、２１～１００ｇ／Ｌ、１～８０ｇ／Ｌ、５～８０ｇ／Ｌ、１０～８０ｇ／Ｌ、１５～８０ｇ／Ｌ、２０～８０ｇ／Ｌ、２１～８０ｇ／Ｌ、１～６０ｇ／Ｌ、５～６０ｇ／Ｌ、１０～６０ｇ／Ｌ、１５～６０ｇ／Ｌ、２０～６０ｇ／Ｌ、２１～６０ｇ／Ｌ、１～５０ｇ／Ｌ、５～５０ｇ／Ｌ、１０～５０ｇ／Ｌ、１５～５０ｇ／Ｌ、２０～５０ｇ／Ｌ、２１～５０ｇ／Ｌ、１～３０ｇ／Ｌ、５～３０ｇ／Ｌ、１０～３０ｇ／Ｌ、１５～３０ｇＬ、２０～３０ｇ／Ｌ、２１～３０ｇ／Ｌ、１～２５ｇ／Ｌ、５～２５ｇ／Ｌ、１０～２５ｇ／Ｌ、１５～２５ｇ／Ｌ、２０～２５ｇ／Ｌ、または２１～２５ｇ／Ｌ濃度で含むことができる。
【0030】
一例による組成物は、前記コリネバクテリウム属菌株（または菌株の死菌体）を０．１～１０重量％、０．１～８重量％、０．１～５重量％、０．１～４重量％、０．１～３．５重量％、０．１～３重量％、０．１～１重量％、１～１０重量％、１～８重量％、１～５重量％、１～４重量％、１～３．５重量％、１～３重量％、２～１０重量％、２～８重量％、２～５重量％、２～４重量％、２～３．５重量％、２～３重量％、３～１０重量％、３～８重量％、３～５重量％、３～４重量％、３～３．５重量％、３．５～１０重量％、３．５～８重量％、３．５～５重量％、または３．５～４重量％の含量で含むことができる。
【0031】
一例で、前記コリネバクテリウム属菌株は前記菌株の培養物に含まれたものであり得る。
【0032】
前記“培養物”は前記コリネバクテリウム属菌株を培養した後に得られた産物を意味し、発酵物を含むことができる。一例で、前記培養物は、コリネバクテリウム属菌株を培地で培養した発酵物であり得る。前記“発酵物”は、微生物を用いた有機物質の酵素的または代謝的分解の結果物を意味する。本出願で、“発酵”は、微生物を用いた有機物質の酵素的または代謝的分解を含む全ての活性または過程中の腐敗反応ではないことを意味することができる。
【0033】
前記培養物（または発酵物）はコリネバクテリウム属菌株の全体培養物、その希釈液、濃縮物、乾燥物、凍結乾燥物、破砕物、および／または分画物などであってもよく、前記濃縮物は前記培養物を遠心分離または蒸発させて得ることができ、前記乾燥物を前記培養物を乾燥機などを用いて乾燥して得ることができ、前記凍結乾燥物は前記培養物を凍結乾燥機などを用いて凍結乾燥して得ることができ、破砕物は前記菌株または培養物を物理的にまたは超音波処理して得ることができ、前記分画物は前記培養物、破砕物などを遠心分離、クロマトグラフィーなどの方法に適用して得ることができる。
【0034】
前記培養物または発酵物は固状（固体、例えば、乾燥物）、液状（液体）、または流動状であり得るが、これで制限されない。
【0035】
一例で、前記培養物は、コリネバクテリウム属菌株を一定期間培養して得られた培養された菌株、その代謝物、および／または余分の栄養分などを含む全体培地を意味することができる。
【0036】
一例で、前記培養物は、コリネバクテリウム属菌株を培地で培養した発酵物から菌株（菌体）および／またはトレオニンを除いた残りの成分を意味するものであり得る。
一例で、前記培養物は、コリネバクテリウム属菌株が除去または除去されていないものであり得る。
一例で、前記培養物は、コリネバクテリウム属菌株が除去または除去されていないものであり得る。
【0037】
一例で、前記培養物は、コリネバクテリウム属菌株を培地で培養した培養液から菌株を除去した培養液（または培養物）であり得る。前記菌株を除去した培養液（または培養物）は無細胞（ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ）培養液（または培養物）であるか死菌体を含む培養液であってもよく、例えば、ろ過、遠心分離して菌株を除去した濾液（遠心分離した上澄液）、および／または死菌体を含む培養液（または培養液の乾燥物）であってもよい。
【0038】
一例による組成物は、前記培養物（または発酵物）を１～８０重量％、５～８０重量％、１０～８０重量％、１５～８０重量％、２０～８０重量％、２３～８０重量％、２５～８０重量％、１～６０重量％、５～６０重量％、１０～６０重量％、１５～６０重量％、２０～６０重量％、２３～６０重量％、２５～６０重量％、１～５０重量％、５～５０重量％、１０～５０重量％、１５～５０重量％、２０～５０重量％、２３～５０重量％、２５～５０重量％、１～４０重量％、５～４０重量％、１０～４０重量％、１５～４０重量％、２０～４０重量％、２３～４０重量％、２５～４０重量％、１～３０重量％、５～３０重量％、１０～３０重量％、１５～３０重量％、２０～３０重量％、２３～３０重量％、２５～３０重量％、１～２５重量％、５～２５重量％、１０～２５重量％、１５～２５重量％、２０～２５重量％、または２３～２５重量％で含むことができる。一例によれば、前記範囲外の含量で培養物を含む組成物より前記範囲で培養物を含む組成物は（１）胃腸疾患の予防または治療効果および／または（２）抗ヘリコバクター・ピロリ効能に優れる。
【0039】
前記培養物はコリネバクテリウム属菌株を含むことができ、培養物内のコリネバクテリウム属菌株を０．１～１０重量％、０．１～８重量％、０．１～５重量％、０．１～４重量％、０．１～３．５重量％、０．１～３重量％、０．１～１重量％、１～１０重量％、１～８重量％、１～５重量％、１～４重量％、１～３．５重量％、１～３重量％、２～１０重量％、２～８重量％、２～５重量％、２～４重量％、２～３．５重量％、２～３重量％、３～１０重量％、３～８重量％、３～５重量％、３～４重量％、３～３．５重量％、３．５～１０重量％、３．５～８重量％、３．５～５重量％、または３．５～４重量％の含量で含むことができる。
【0040】
一例で、コリネバクテリウム属菌株およびその培養物は、コリネバクテリウム属菌株を培地で一定期間培養して得られた製造した培養物を熱処理（または滅菌（例えば、オートクレーブまたは熱風乾燥））したりして得られたコリネバクテリウム属菌株の死菌体が含まれている培養物であり得る。
【0041】
本出願で、“培養”は、微生物を適当に人工的に調節した環境条件で生育させる一連の行為を意味する。前記培養は、当業界に知られた任意の培養条件および培養方法を使用することができる。例えば、前記培養は、公知された回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法、バッチ工程または注入バッチまたは繰り返し注入バッチ工程（ｆｅｄ ｂａｔｃｈ ｏｒ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｆｅｄ ｂａｔｃｈ ｐｒｏｃｅｓｓ）で連続式に行うことができる。この時、培養条件は、特にこれに制限されないが、塩基性化合物（例：水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例：リン酸または硫酸）を使用して適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５～９、ｐＨ６～８、またはｐＨ６．８）を調節することができる。一例で、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して気泡生成を抑制することができ／できるか、酸素または酸素－含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持することができる。
【0042】
一例で、培養温度は２０～４５℃、２５～４０℃、３０～４０℃、３０～３５℃、または３５～４０℃であってもよく、培養条件は１００～５００ｒｐｍ、１５０～３００ｒｐｍ、１５０～２５０ｒｐｍ、または２００ｒｐｍであってもよく、培養時間（期間）は１～１６０時間、１０～１００時間、１２～７２時間、２４～７２時間、３０～６０時間、４０～５０時間、４５～５０時間、または４８時間であってもよい。培養期間は有用物質（例えば、Ｌ－トレオニン、トレオニン、トレオニン、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）が所望の生産量が得られるまで続いてもよい。一例で、培養は前記範囲の培養温度で前記範囲の培養時間行うことができる。
【0043】
培養に使用される培地は適切な方式で特定菌株の要件を充足しなければならず、当業者は公知された内容により適切に使用することができる。一例によれば、コリネバクテリウム属菌株を培養するための培地は公知された文献（例えば、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ． Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．， ＵＳＡ， １９８１）を参照することができるが、これに制限されるわけではない。
【0044】
前記コリネバクテリウム属菌株を培養するためには適当な炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミンなどを含む通常の培地内で嫌気性条件下で温度、ｐＨなどを調節しながら適切な方式で特定菌株の生存要件を充足させることができる。前記培地で使用できる炭素源としては炭素供給源としては糖および炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、デンプンおよびセルロース）、油脂および脂肪（例えば、大豆油、ヒマワリ油、落花生油、およびヤシ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、およびリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロールおよびエタノール）および有機酸（例えば、酢酸）などを個別的に使用するかまたは混合して使用することができるが、これに制限されるわけではない。窒素供給源としては窒素－含有有機化合物（例：ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、とうもろこし浸漬液、大豆粕粉およびウレア）、または無機化合物（例：硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウム）などを個別的に使用するかまたは混合して使用することができるが、これに制限されるわけではない。リン供給源としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別的に使用するかまたは混合して使用することができるが、これに制限されるわけではない。また、培養培地は成長に必要なその他の金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）を含むことができ／できるかアミノ酸およびビタミンのような必須成長物質を含むことができるが、これに制限されるわけではない。
【0045】
一例で、前記培地はトレオニン生産用培地（例えば、ｎｏ．４３５培地）であってもよく、前記コリネバクテリウム属菌株、およびその培養物はコリネバクテリウム属菌株をトレオニン生産用培地で培養した培養物であってもよく、トレオニンは培養培地中に排出されるか、細胞中に含まれていてもよい。
【0046】
一例で、前記コリネバクテリウム属菌株および／またはその（前記コリネバクテリウム属菌注）培養物はトレオニンを含むことができる。
【0047】
一例で、前記コリネバクテリウム属菌株および／またはその培養物は、トレオニンを含まないものであってもよい。
【0048】
本出願で、“トレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ、Ｔｈｒ）”、“トレオニン”はヒドロキシ－α－アミノ酸であって体内で生成されない必須アミノ酸の一つであって化学式ＨＯ２ＣＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３のアミノ酸を意味する。前記トレオニンは、光学異性質体Ｌ型（Ｌ－型トレオニン（Ｌ－Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ、Ｌ－Ｔｈｒ））、Ｄ型、またはその組み合わせであり得る。トレオニンは必須アミノ酸であって腸上皮保護物質であるムチン（ｍｕｃｉｎｅ）を構成し、不足すれば成長停止、体重減少を起こすことがある。
【0049】
一例により、コリネバクテリウム属菌株、その培養物、および／またはトレオニンを混合した場合に上昇的に優れた（１）胃腸疾患の予防または治療効果および／または（２）抗ヘリコバクター・ピロリ効能を示すことができる。
【0050】
一例による組成物は、トレオニンを５０～９０重量％、５０～８５重量％、５０～８０重量％、５０～７５重量％、５０～７０重量％、５５～９０重量％、５５～８５重量％、５５～８０重量％、５５～７５重量％、５５～７０重量％、６０～９０重量％、６０～８５重量％、６０～８０重量％、６０～７５重量％、６０～７０重量％、６５～９０重量％、６５～８５重量％、６５～８０重量％、６５～７５重量％、６５～７０重量％、７０～９０重量％、７０～８５重量％、７０～８０重量％、７０～７５重量％、または７０重量％で含むことができる。前記範囲外の含量でトレオニンを含む組成物より前記範囲でトレオニンを含む組成物は（１）胃腸疾患の予防または治療効果および／または（２）抗ヘリコバクター・ピロリ効能に優れる。
【0051】
前記トレオニンは、商業的に利用可能なものであるか抽出法、発酵法、酵素法、および／または合成法などを使用して生産されたものであり得る。例えば、コリネ型菌株を用いてトレオニンが含まれている発酵物を得た後に精製して得られるか、トレオニン生合成経路を通じて生合成されるか、および／または化学的に合成されたものであり得る。
【0052】
前記トレオニンは、一例による組成物に（１）前記コリネバクテリウム属菌株および／またはその培養物に含まれるか（２）前記コリネバクテリウム属菌株および／またはその培養物に含まれない形態で追加的に含まれるかまたは（３）その組み合わせ（例えば、組成物に含まれるコリネバクテリウム属菌株およびその培養物がトレオニンを含み、その外に追加的にトレオニンを含む）であり得る。
【0053】
一例による組成物に含まれるトレオニンは、
（１）前記コリネバクテリウム属菌株、その培養物、またはこれら全て（菌株および培養物）に含まれるか；
（２）別途に添加されるか；
（３）前記コリネバクテリウム属菌株、その培養物、またはこれら全て（菌株および培養物）に含まれ、ここに追加的に（別途に）添加されたものであり得る。
（１）前記コリネバクテリウム属菌株、その培養物、またはこれら全て（菌株および培養物）に含まれるか；
（２）別途に添加されるか；
（３）前記コリネバクテリウム属菌株、その培養物、またはこれら全て（菌株および培養物）に含まれ、ここに追加的に（別途に）添加されたものであり得る。
【0054】
前記でトレオニンが別途に添加されたことは、菌株および／または培養物に含まれているトレオニン以外に精製されたトレオニンを追加的に添加したことを意味することができる。
【0055】
前記トレオニンはその形態が粉末および／または顆粒であり得る。顆粒型トレオニンの場合、１００～１０００μｍまたは２００～１０００μｍの粒度を有することができる。
一例による組成物は、前記コリネバクテリウム属菌株０．１～５重量部、前記培養物１０～９０重量部、および前記トレオニン１０～８０重量部を含むことができる。具体的に、菌株０．２～５重量部、培養物１２～８８重量部、およびトレオニン１０．５～７８重量部、菌株０．３～５重量部、培養物１３～８７重量部、およびトレオニン１１～７７重量部、菌株０．４～５重量部、培養物１４～８６重量部、およびトレオニン１１．５～７６重量部、菌株０．５～５重量部、培養物１５～８５重量部、およびトレオニン１２～７５重量部、菌株０．６～５重量部、培養物１６～８４重量部、およびトレオニン１２．５～７４重量部、菌株０．７～５重量部、培養物１７～８３重量部、およびトレオニン１３～７３重量部、菌株０．８～５重量部、培養物１８～８２重量部、およびトレオニン１３．５～７２重量部、菌株０．９～５重量部、培養物１９～８１重量部、およびトレオニン１４～７１重量部、菌株０．９～４重量部、培養物２０～８０重量部、およびトレオニン１４～７０重量部、菌株１～４重量部、培養物２１～７９重量部、およびトレオニン１４～６９重量部、菌株１～３重量部、培養物２２～７８重量部、およびトレオニン１４～６８重量部で含むことができる。
一例による組成物は、前記コリネバクテリウム属菌株０．１～５重量部、前記培養物１０～９０重量部、および前記トレオニン１０～８０重量部を含むことができる。具体的に、菌株０．２～５重量部、培養物１２～８８重量部、およびトレオニン１０．５～７８重量部、菌株０．３～５重量部、培養物１３～８７重量部、およびトレオニン１１～７７重量部、菌株０．４～５重量部、培養物１４～８６重量部、およびトレオニン１１．５～７６重量部、菌株０．５～５重量部、培養物１５～８５重量部、およびトレオニン１２～７５重量部、菌株０．６～５重量部、培養物１６～８４重量部、およびトレオニン１２．５～７４重量部、菌株０．７～５重量部、培養物１７～８３重量部、およびトレオニン１３～７３重量部、菌株０．８～５重量部、培養物１８～８２重量部、およびトレオニン１３．５～７２重量部、菌株０．９～５重量部、培養物１９～８１重量部、およびトレオニン１４～７１重量部、菌株０．９～４重量部、培養物２０～８０重量部、およびトレオニン１４～７０重量部、菌株１～４重量部、培養物２１～７９重量部、およびトレオニン１４～６９重量部、菌株１～３重量部、培養物２２～７８重量部、およびトレオニン１４～６８重量部で含むことができる。
【0056】
一例による組成物で、前記菌株およびその培養物とトレオニンの重量比（菌株およびその培養物の重量：トレオニンの重量）は、１：０．１～１：１０、１：０．１～１：５、１：０．１～１：３、１：０．２～１：１０、１：０．２～１：５、１：０．２～１：３、１：０．５～１：１０、１：０．５～１：５、１：０．５～１：３、１：１～１：１０、１：１～１：５、１：１～１：３、１：３～１：１０、１：３～１：５、または１：３であってもよい。
【0057】
一例による組成物は、リグニンスルホン酸塩を追加的に含むことができる。一例による組成物がリグニンスルホン酸塩を追加的に含めば、（１）胃腸疾患の予防または治療効果および／または（２）抗ヘリコバクター・ピロリ効能が優れることになり得る。
【0058】
一例による組成物は、組成物に含まれるトレオニン含量を調節するために、リグニンスルホン酸カルシウム（Ｃａｌｃｉｕｍ ｌｉｇｎｏｓｕｌｆｏｎａｔｅ）を追加的に含むことができる。一例によれば、組成物はリグニンスルホン酸カルシウムを０．１～５０重量％、０．１～３０重量％、０．１～２５重量％、０．１～２０重量％、０．１～１５重量％、０．１～１０重量％、０．１～７重量％、１～５０重量％、１～３０重量％、１～２５重量％、１～２０重量％、１～１５重量％、１～１０重量％、１～７重量％、３～５０重量％、３～３０重量％、３～２５重量％、３～２０重量％、３～１５重量％、３～１０重量％、３～７重量％、５～５０重量％、５～３０重量％、５～２５重量％、５～２０重量％、５～１５重量％、５～１０重量％、５～７重量％、６．５～５０重量％、６．５～３０重量％、６．５～２５重量％、６．５～２０重量％、６．５～１５重量％、６．５～１０重量％、または６．５～７重量％で含むことができる。
【0059】
一例で、組成物は、前記コリネバクテリウム属菌株、およびその培養物を乾燥された形態（例えば、‘コリネバクテリウム属菌株およびその培養物’の乾燥物）で含むことができる。前記乾燥物はコリネバクテリウム属菌株およびその培養物を乾燥して製造することができ、前記乾燥物はトレオニンを含むことができる。一例で、前記乾燥は、真空乾燥、熱風乾燥、凍結乾燥、常温通風乾燥、薄膜乾燥、および／または真空乾燥からなる群より選択された１種以上の方法で行うことであり得る。
【0060】
一例で、組成物は、前記コリネバクテリウム属菌株、その培養物、およびトレオニンを乾燥された形態（例えば、トレオニンを含む‘コリネバクテリウム属菌株およびその培養物’の乾燥物）で含むことができる。
【0061】
一例による組成物の剤形はオイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液形態であるかエキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤またはゲル（例えば、ハイドロゲル）形態であってもよく、分散剤または安定化剤を追加的に含むことができる。
【0062】
一具体例による組成物はコリネバクテリウム属菌株およびその培養物（発酵物）を乾燥させて製造することができ、この組成物にはトレオニン、コリネバクテリウム属菌株（例えば、死菌体の形態の菌注）、およびトレオニンと菌株以外の培養物の成分を含むことができる。一例でコリネバクテリウム属菌株およびその培養物を乾燥させて製造した一例による組成物は顆粒型であってもよく、これは精製された粉末型のトレオニンより（１）胃腸疾患の予防または治療効果および／または（２）抗ヘリコバクター・ピロリ効能に優れるものであり得る。
【0063】
本出願で、“顆粒（ｇｒａｎｕｌｅ）”とは粉末が凝集されて３０～１５０倍の大きな粒子を形成した状態を意味し、“顆粒化”とは原料が顆粒状態になるように工程などを処理して誘導することを意味することができる。一例で、前記コリネバクテリウム属菌株、その培養物、および／またはトレオニンを含む組成物を乾燥する過程で組成物が顆粒形態を示すことができる。
【0064】
一例で、前記胃腸疾患は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）感染によるものであり得る。
【0065】
一例で、前記胃腸疾患は、胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、消化性潰瘍、および胃ガンからなる群より選択された１種以上のものであり得る。
【0066】
前記胃炎は胃内壁の炎症が発生した状態を意味し、前記胃潰瘍は胃腸で粘膜を保護する防御因子と粘膜損傷を誘発する攻撃因子の均衡が崩れるにつれて発生することがある。胃潰瘍の原因と見られる前記攻撃因子は、胃酸、各種消火酵素、胆汁、服用した薬物、アルコール、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）の感染、非ステロイド消炎剤服用、喫煙などがある。
【0067】
一例による組成物を飼料組成物として使用する場合、市販される飼料組成物に一例による組成物を添加した形態の飼料組成物の形態として製造できる。一例による組成物が使用できる飼料は粉末またはペレット剤形、または液状剤形であるのが好ましいが、これに制限されるわけではない。また、飼料に添加される本出願の組成物の添加量は特別な制限を要するものではない。
【0068】
本出願で、“飼料”は、動物が食べ、摂取し、消化させるためのまたはこれに適当な任意の天然または人工規定食、一食食などまたは前記一食食の成分を意味することができる。
【0069】
前記飼料の種類は特に制限されず、当該技術分野で通常使用される飼料を使用することができる。前記飼料の非制限的な例としては、穀物類、根果類、食品加工副産物類、藻類、繊維質類、製薬副産物類、油脂類、デンプン類、ウリ類または穀物副産物類などのような植物性飼料；タンパク質類、無機物類、油脂類、鉱物性類、油脂類、単細胞タンパク質類、動物性プランクトン類または飲食物などのような動物性飼料が挙げられる。これらは単独で使用されるか２種以上を混合して使用できる。
【0070】
一例による組成物を含む飼料を給与することができる個体（動物）は特に制限はないが、哺乳類、魚類、甲殻類および／または貝殻類であってもよく、例えば、豚、牛、馬、ヤギ、鹿、羊、鶏、鴨、ガチョウ、七面鳥、犬、猫、ウサギ、魚であってもよい。
【0071】
前記飼料組成物は、賦形剤、希釈剤、添加剤をさらに含むことができる。前記飼料組成物は前記構成成分以外にも動物の成長促進に有効な成分、栄養成分、栄養補助成分、保存安定性を高める成分、被覆剤成分、疾病予防などのためのアミノ酸剤、ビタミン剤、酵素剤、非蛋白態窒素化合物、珪酸塩剤、緩衝剤、抽出剤、生菌剤；アミラーゼ、リパーゼなどの酵素；Ｌ－アスコルビン酸、塩化コリン、イノシトールなどのビタミン；塩化カリウム、クエン酸鉄、酸化マグネシウム、リン酸塩類などのミネラル；リシン、アラニン、メチオニンなどのアミノ酸；フマル酸、酪酸、乳酸などの有機酸またはその塩；ビタミンＣ、ビタミンＥなどの抗酸化剤、プロピオン酸カルシウムなどのカビ防止剤；レシチン、グリセリン脂肪酸エステルなどの乳化剤；および／または色素などを含むことができる。前記に記述されていなくても一例による飼料組成物は通常の技術者に予想できる範囲内の他のその他の栄養成分を追加的に含むことができる。
【0072】
他の様相は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株、その培養物、およびトレオニンを含む、胃腸疾患予防または治療用薬学的組成物を提供することができる。一例による予防または治療用薬学的組成物に含まれるコリネバクテリウム属菌株、その培養物、トレオニン、および／または胃腸疾患については前記胃腸疾患予防または改善用飼料組成物について説明した通りである。
【0073】
一例による薬学的組成物は薬学的組成物の製造に通常使用する適切な担体、賦形剤または希釈剤を追加的に含むことができる。具体的に、前記薬学的組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型剤形、外用剤、坐剤および滅菌注射用水の形態に剤形化して使用できる。前記薬学的組成物に含むことができる担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートおよび鉱物油が挙げられる。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製される。経口投与のための固状製剤には錠剤、丸剤、散剤（粉末剤）、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固状製剤は前記組成物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混合して調製される。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムスチレート、タルクのような潤滑剤も使用される。経口投与のための液状製剤としては懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当し、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれる。非経口投与のための製剤には滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用できる。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用できる。
【0074】
一例による薬学的組成物は薬剤学的に有効な量で投与でき、本出願で、“薬剤学的に有効な量”とは医学的治療または予防に適用可能な合理的な受益／危険比率で疾患を治療または予防するに十分な量を意味し、有効容量水準は疾患の重症度、薬物の活性、患者の年齢、体重、健康、性別、患者の薬物に対する敏感度、使用された本出願組成物の投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、使用された本出願の組成物と配合または同時使用される薬物を含む要素およびその他の医学分野によく知られた要素により決定できる。一例による薬学的組成物は、個別治療剤として投与するか他の治療剤と併用して投与でき、従来の治療剤とは順次にまたは同時に投与できる。そして、単一または多重投与できる。前記要素を全て考慮して副作用なく最小限の量で最大効果を得ることができる量を投与するのが重要である。
【0075】
一例による薬学組成物の投与量は例えば、哺乳動物に一日間約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇ、具体的に０．００１～１０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。本出願の薬学組成物の投与頻度は特にこれに制限されないが、１日１回投与するかまたは容量を分割して数回投与することができる。前記投与量はいかなる面でも本出願の範囲を制限するのではない。
【0076】
一例による薬学的組成物は目的組織に到達できる限り投与方法には制限がない。例えば、関節腔内注射、経口投与、動脈注射、静脈注射または経皮注射などが含まれる。また、前記薬学的組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与できる。
他の様相は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株、その培養物、およびトレオニンを含む、胃腸疾患予防または改善用食品組成物を提供することができる。胃腸疾患予防または改善用食品組成物に含まれるコリネバクテリウム属菌株、その培養物、トレオニン、および／または胃腸疾患については胃腸疾患予防または改善用飼料組成物で説明した通りである。
他の様相は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株、その培養物、およびトレオニンを含む、胃腸疾患予防または改善用食品組成物を提供することができる。胃腸疾患予防または改善用食品組成物に含まれるコリネバクテリウム属菌株、その培養物、トレオニン、および／または胃腸疾患については胃腸疾患予防または改善用飼料組成物で説明した通りである。
【0077】
前記食品は、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料、ビタミン複合剤、健康機能（性）食品および健康食品などがあり、通常の意味での食品を全て含む。
【0078】
前記健康機能（性）食品（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｏｏｄ）とは、特定保健用食品（ｆｏｏｄ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉａｌ ｈｅａｌｔｈ ｕｓｅ、ＦｏＳＨＵ）と同一な用語であって、栄養供給以外にも生体調節機能が効率的に現れるように加工された医学、医療効果の高い食品を意味する。ここで、“機能（性）”とは、人体の構造および機能に対して栄養素を調節するか生理学的作用などのような保健用途に有用な効果を得ることを意味する。本出願の食品は、当業界で通常使用される方法によって製造可能であり、前記製造時には当業界で通常添加する原料および成分を添加して製造することができる。また、前記食品の剤形も食品と認定される剤形であれば制限なく製造できる。本出願の食品用組成物は多様な形態の剤形に製造でき、一般薬品とは異なり食品を原料にして薬品の長期服用時発生することがある副作用などがないという長所があり、携帯性に優れて、本出願の食品は胃潰瘍の予防または改善の効果を増進させるための補助剤として摂取が可能である。
【0079】
前記健康食品（ｈｅａｌｔｈ ｆｏｏｄ）は一般食品に比べて積極的な健康維持や増進効果を有する食品を意味し、健康補助食品（ｈｅａｌｔｈ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｆｏｏｄ）は健康補助目的の食品を意味する。場合によって、健康機能食品、健康食品、健康補助食品の用語は混用できる。
【0080】
具体的に、前記健康機能食品は一例による組成物を飲料、お茶類、香辛料、ガム、菓子類などの食品素材に添加するか、カプセル化、粉末化、懸濁液などに製造した食品であって、これを摂取する場合、健康上特定の効果をもたらすものを意味するが、一般薬品とは異なり食品を原料にして薬品の長期服用時発生することがある副作用がないという長所がある。
【0081】
一例による食品組成物は、日常的に摂取することが可能であるため、胃腸疾患の予防または改善に対して高い効果を期待することができるので、非常に有用に使用できる。
前記食品組成物は生理学的に許容可能な担体を追加的に含むことができ、担体の種類は特に制限されず当該技術分野で通常使用される担体であればいずれも使用することができる。
前記食品組成物は生理学的に許容可能な担体を追加的に含むことができ、担体の種類は特に制限されず当該技術分野で通常使用される担体であればいずれも使用することができる。
【0082】
また、前記食品組成物は、食品組成物に通常使用されて匂い、味、視覚などを向上させることができる追加成分を含むことができる。例えば、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ナイアシン（ｎｉａｃｉｎ）、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）、葉酸（ｆｏｌａｔｅ）、パントテン酸（ｐａｎｔｈｏｔｅｎｉｃ ａｃｉｄ）などを含むことができる。また、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、カルシウム（Ｃａ）、クロム（Ｃｒ）、マグネシウム（Ｍｇ）、マンガン（Ｍｎ）、銅（Ｃｕ）、クロム（Ｃｒ）などのミネラルを含むことができる。また、リシン、トリプトファン、システイン、バリンなどのアミノ酸を含むことができる。
【0083】
また、前記食品組成物は、防腐剤（ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、サリチル酸、デヒドロ酢酸ナトリウムなど）、殺菌剤（さらし粉と高度さらし粉、次亜塩素酸ナトリウムなど）、酸化防止剤（ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）など）、着色剤（タール色素など）、発色剤（亜硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウムなど）、漂白剤（亜硫酸ナトリウム）、調味料（ＭＳＧグルタミン酸ナトリウムなど）、甘味料（ズルチン、チクロ、サッカリン、ナトリウムなど）、香料（バニリン、ラクトン類など）、膨脹剤（明礬、Ｄ－酒石酸水素カリウムなど）、強化剤、乳化剤、増粘剤（糊料）、被膜剤、ガム基礎剤、泡抑制剤、溶剤、改良剤などの食品添加物（ｆｏｏｄ ａｄｄｉｔｉｖｅｓ）を含むことができる。前記添加物は食品の種類によって選別されて適切な量で使用できる。
【0084】
一例による組成物はそのまま添加するか他の食品または食品成分と共に使用でき、通常の方法によって適切に使用できる。有効成分の混合量はその使用目的（予防、健康または治療的処置）によって適するように決定できる。一般に、食品または飲料の製造時に本出願の食品組成物は食品または飲料に対して５０重量部以下、具体的に２０重量部以下の量で添加できる。しかし、健康および衛生を目的で長期間摂取する場合には前記範囲以下の含量を含むことができ、安全性面で何らの問題もないため有効成分は前記範囲以上の量でも使用できる。
【0085】
前記食品組成物の一例として健康飲料組成物として使用でき、この場合、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。前述の天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド；マルトース、スクロースのようなジサッカライド；デキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカライド；キシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールであり得る。甘味剤は、タウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味剤；サッカリン、アスパルテームのような合成甘味剤などを使用することができる。前記天然炭水化物の比率は、本出願の健康飲料組成物１００ｍＬ当り一般に約０．０１～０．０４ｇ、具体的に約０．０２～０．０３ｇであり得る。
【0086】
前記以外に健康飲料組成物は様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸、ペクチン酸の塩、アルギン酸、アルギン酸の塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコールまたは炭酸化剤などを含有することができる。その他に天然果物ジュース、果物ジュース飲料、または野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。このような成分は独立的にまたは混合して使用することができる。このような添加剤の比率はそんなに重要ではないが、本出願の健康飲料組成物１００重量部当り０．０１～０．１重量部の範囲で選択されるのが一般的である。
一例による食品組成物は胃腸疾患の予防または改善効果を示すことができれば多様な重量％で含むことができるが、例えば、一例による組成物を食品組成物の総重量に対して０．００００１～１００重量％、０．０１～８０重量％、または１０～５０重量％で含むことができるが、これに制限されない。
一例による食品組成物は胃腸疾患の予防または改善効果を示すことができれば多様な重量％で含むことができるが、例えば、一例による組成物を食品組成物の総重量に対して０．００００１～１００重量％、０．０１～８０重量％、または１０～５０重量％で含むことができるが、これに制限されない。
【0087】
一例によるコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株、その培養物、およびトレオニンを含む組成物は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）増殖抑制、ヘリコバクター・ピロリによって誘導された、炎症、酸化ストレス、血管成長、および／または細胞自己死滅を抑制することによって胃腸疾患（例えば、胃潰瘍）を予防、治療、または改善するものであり得る。
【0088】
一例によるコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株、その培養物、およびトレオニンを含む組成物は、粘液合成および分泌促進、組織再生促進、胃粘膜損傷抑制、組織再生促進、酸化ストレス抑制、胃粘膜細胞細胞自己死滅抑制、および／または炎症抑制することによって胃腸疾患を予防、治療、または改善するものであり得る。
【0089】
一例による組成物でコリネバクテリウム属菌株含有有無；コリネバクテリウム属菌株が死菌体として含まれるかどうか；コリネバクテリウム属菌株の種類；培養物を含むかどうか；トレオニンを含むかどうか；および／またはコリネバクテリウム属菌株、その培養物とトレオニンの組み合わせ有無などによって（１）胃腸疾患の予防または治療効果および／または（２）抗ヘリコバクター・ピロリ効能に差があるのを確認し、一例による組成物が最も優れた効果を示すことを確認した。
【0090】
他の様相は、前記胃腸疾患の予防、改善、または治療用組成物（飼料組成物、食品組成物、または薬学的組成物）を個体（患者）に投与する段階を含む胃腸疾患の予防、改善または治療方法を提供することができる。飼料組成物、食品組成物、薬学的組成物、および胃腸疾患に関することは前述の通りである。
【0091】
一例によれば、前記胃腸疾患の予防、改善、または治療方法は、投与する段階以前に前記胃腸疾患の予防、改善、または治療を必要とする個体（患者）を確認（選別）する段階を追加的に含むことができる。
【0092】
本出願で、“個体”とは、胃腸疾患が発病したか発病する可能性があるヒトを含む全ての動物を意味することができる。
【0093】
前記胃腸疾患の予防または治療方法が適用される対象個体は胃腸疾患が発病したか発病可能な人間を含む哺乳動物であってもよく、例えば、豚、牛、馬、ヤギ、鹿、羊、鶏、鴨、ガチョウ、七面鳥、犬、猫、および／またはであり得る。
【0094】
本出願で、“投与”はある適切な方法で対象個体に前記胃腸疾患の予防、改善、または治療用組成物を導入することを意味し、投与経路は目的組織に到達できる限り経口または非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉、腹腔内または局所適用）の多様な経路を通じて投与できる。
【0095】
前記予防、改善、または治療方法は、一例による飼料組成物、食品組成物、または薬学組成物を（薬学的）有効量で投与することであり得る。適した総１日使用量は正しい医学的判断範囲内で処置によって決定でき、１回または数回に分けて投与することができる。しかし、特定個体（患者）に対する具体的な治療的有効量は達成しようとする反応の種類と程度、場合によって異なる製剤が使用されるかどうかをはじめとする具体的組成物、個体（患者）の年令、体重、一般健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物と共に使用されるか同時使用される薬物をはじめとする多様な因子と医薬分野によく知られた類似因子によって異なって適用することができる。
【0096】
他の様相は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株、その培養物、およびトレオニンを含む、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）に対する抗菌用組成物を提供することができる。前記ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）に対する抗菌用組成物に含まれるコリネバクテリウム属菌株、その培養物、トレオニン、および／または胃腸疾患については胃腸疾患予防または治療用薬学的組成物で説明した通りである。
【0097】
一例によりコリネバクテリウム属菌株、その培養物、およびトレオニンを組み合わせれば、ヘリコバクター・ピロリに対する抗菌効果が上昇的に優れるようになり得る。
【0098】
他の様相はコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株、およびその培養物、を含む、胃腸疾患の予防、改善、または治療用組成物を提供することができ、前記菌株および培養物はトレオニンを含むものであり得る。
【0099】
他の様相はコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株およびその培養物（発酵物）を含む胃腸疾患予防、改善、または治療のための有効成分製造用組成物を提供することができ、前記コリネバクテリウム属菌株または前記培養物（発酵物）はトレオニンを含むまたは含有するものであり得る。
【0100】
前記胃腸疾患予防または治療のための有効成分製造用組成物は組成物全体重量に対して、前記コリネバクテリウム属菌株０．１～５重量部、前記発酵物１０～９０重量部、および前記トレオニン１０～８０重量部を含むことができる。具体的に、組成物全体重量に対して菌株０．２～５重量部、発酵物１２～８８重量部、およびトレオニン１０．５～７８重量部、菌株０．３～５重量部、発酵物１３～８７重量部、およびトレオニン１１～７７重量部、菌株０．４～５重量部、発酵物１４～８６重量部、およびトレオニン１１．５～７６重量部、菌株０．５～５重量部、発酵物１５～８５重量部、およびトレオニン１２～７５重量部、菌株０．６～５重量部、発酵物１６～８４重量部、およびトレオニン１２．５～７４重量部、菌株０．７～５重量部、発酵物１７～８３重量部、およびトレオニン１３～７３重量部、菌株０．８～５重量部、発酵物１８～８２重量部、およびトレオニン１３．５～７２重量部、菌株０．９～５重量部、発酵物１９～８１重量部、およびトレオニン１４～７１重量部、菌株０．９～４重量部、発酵物２０～８０重量部、およびトレオニン１４～７０重量部、菌株１～４重量部、発酵物２１～７９重量部、およびトレオニン１４～６９重量部、菌株１～３重量部、発酵物２２～７８重量部、およびトレオニン１４～６８重量部で含むことができるが、これで制限されない。
【0101】
前記胃腸疾患予防または治療のための有効成分製造用組成物は前記トレオニン含量を調節するために、リグニンスルホン酸カルシウム（Ｃａｌｃｉｕｍ ｌｉｇｎｏｓｕｌｆｏｎａｔｅ）を追加的に含むことができる。前記リグニンスルホン酸カルシウムは前記組成物全体重量に対して、０．１～５０重量％、０．１～３０重量％、０．１～２５重量％、０．１～２０重量％、０．１～１５重量％、０．１～１０重量％、０．１～７重量％、１～５０重量％、１～３０重量％、１～２５重量％、１～２０重量％、１～１５重量％、１～１０重量％、１～７重量％、３～５０重量％、３～３０重量％、３～２５重量％、３～２０重量％、３～１５重量％、３～１０重量％、３～７重量％、５～５０重量％、５～３０重量％、５～２５重量％、５～２０重量％、５～１５重量％、５～１０重量％、５～７重量％、６．５～５０重量％、６．５～３０重量％、６．５～２５重量％、６．５～２０重量％、６．５～１５重量％、６．５～１０重量％、６．５～７重量％、０．１～１８重量％、０．１～１６重量％、０．１～１４重量％、０．１～１３重量％、０．１～１２重量％、０．１～１１重量％、０．１～９重量％、０．１～８重量％、または０．１～７重量％で含まれてもよいが、これで制限されるわけではなく、組成物内トレオニンが目的とする含量に到達するように制限なく添加することができる。
【0102】
他の様相は、前記胃腸疾患予防または治療のための有効成分製造用組成物を含む胃腸疾患予防または治療用薬学組成物を提供することができる。
【0103】
他の様相は、胃腸疾患予防または治療のための有効成分製造用組成物を含む胃腸疾患予防または改善用食品組成物を提供することができる。
【0104】
他の様相は、胃腸疾患予防または治療のための有効成分製造用組成物を含む胃腸疾患予防または改善用飼料組成物を提供することができる。
【0105】
他の様相は、前記顆粒型のコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株およびその培養物（発酵物）を含む胃腸疾患予防または治療のための有効成分製造用組成物を有効性分として含む胃腸疾患治療用製剤を提供する。
【0106】
前記コリネバクテリウム属菌株およびその発酵物、胃腸疾患、予防、改善、および治療については前述の通りである。
【0107】
本出願で、“製剤”とは医薬品の本質に変化を与えず主に物理的操作、例えば粉砕、混合、練り、浸出（しみ出させること）または蒸発などによって調製、保存または使用に便利であり、また治療効果を十分に発揮するように加工することを言い、またこれによって製造された製品も製剤（ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）と称している（化学大辞典、２００１年５月２０日、セファ編集部）。
【0108】
前記製剤を製造するために製剤化する場合に使用する添加剤、即ち、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、希釈剤または賦形剤については前述の通りであり、経口投与のための固状製剤およびこれに含まれる添加剤、経口投与のための液状製剤およびこれに含まれる添加剤または非経口投与のための製剤およびこれに添加される添加剤については前述の通りである。
【0109】
前記製剤は固状剤形、液状剤形または流動状剤形であり得るが、これで制限されず、胃潰瘍の予防、治療および改善効果を示す剤形であれば制限なく適用することができる。
前記剤形については前述の通りである。
前記剤形については前述の通りである。
【0110】
他の様相は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株およびその培養物を乾燥する段階を含む、（１）胃腸疾患の予防、改善、または治療効果；および／または（２）ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）に対する抗菌効果を有する有効成分の製造方法を提供することができる。
【0111】
前記コリネバクテリウム属菌株およびその培養物については前述の通りである。
【0112】
一例で、前記乾燥する段階は、真空乾燥、熱風乾燥、凍結乾燥、常温通風乾燥、薄膜乾燥、および／または真空乾燥からなる群より選択された１種以上の方法で行うことであり得る。
【0113】
一例で、前記乾燥する段階は、コリネバクテリウム属菌株およびその培養物にトレオニンを別途に添加した組成物を乾燥することであり得る。
【0114】
一例で、前記有効成分の製造方法は、前記乾燥する段階後に製造された乾燥物にトレオニンを別途に追加する段階を追加的に含むことができる。
【発明の効果】
【0115】
本出願による組成物は細胞実験で抗ヘリコバクター・ピロリ効能および動物実験で胃潰瘍改善効能、胃粘液合成効能などに優れることが確認されたところ、胃腸疾患の予防および治療用薬学組成物、胃腸疾患改善用食品または飼料用組成物に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0116】
【図1】グループ１～８のＨ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に対する抗菌活性を示す。
【図2a】Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ菌株を用いて６時間１００ ＭＯＩで感染させたＲＧＭ１細胞にグループ１～８を処理時、炎症媒介因子の発現を測定した結果を示す。具体的に、図２ａはＨ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に感染したＲＧＭ１細胞でグループ１～８処理によるＣｏｘ－２ ｍＲＮＡ発現変化を示し、図２ｂはＨ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に感染したＲＧＭ１細胞でグループ１～８処理によるｉＮＯＳのタンパク質発現変化を示し、図２ｃはＨ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に感染したＲＧＭ１細胞でグループ１～８処理によるリン酸化されたＮＦ－κＢ ｐ６５タンパク質発現変化を示す。ＧＡＰＤＨおよびベータ－アクチン（β－ａｃｔｉｎ）はそれぞれｍＲＮＡおよびタンパク質の内部対照群（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用された。図２ａ～図６ｂでＮ（左側から一番目の列）は陰性対照群（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ無処理ＲＧＭ１細胞）を示し、Ｈ．ｐ（左側から二番目の列）は陽性対照群（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染したＲＧＭ１細胞）を示し、グループ１～８はＨ．ｐｙｌｏｒｉ感染したＲＧＭ１細胞にグループ１～８の組成物が処理された細胞での結果を示す。
【図2b】Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ菌株を用いて６時間１００ ＭＯＩで感染させたＲＧＭ１細胞にグループ１～８を処理時、炎症媒介因子の発現を測定した結果を示す。具体的に、図２ａはＨ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に感染したＲＧＭ１細胞でグループ１～８処理によるＣｏｘ－２ ｍＲＮＡ発現変化を示し、図２ｂはＨ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に感染したＲＧＭ１細胞でグループ１～８処理によるｉＮＯＳのタンパク質発現変化を示し、図２ｃはＨ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に感染したＲＧＭ１細胞でグループ１～８処理によるリン酸化されたＮＦ－κＢ ｐ６５タンパク質発現変化を示す。ＧＡＰＤＨおよびβ－アクチンはそれぞれｍＲＮＡおよびタンパク質の内部対照群（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用された。図２ａ～図６ｂでＮ（左側から一番目の列）は陰性対照群（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ無処理ＲＧＭ１細胞）を示し、Ｈ．ｐ（左側から二番目の列）は陽性対照群（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染したＲＧＭ１細胞）を示し、グループ１～８はＨ．ｐｙｌｏｒｉ感染したＲＧＭ１細胞にグループ１～８の組成物が処理された細胞での結果を示す。
【図2c】Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ菌株を用いて６時間１００ ＭＯＩで感染させたＲＧＭ１細胞にグループ１～８を処理時、炎症媒介因子の発現を測定した結果を示す。具体的に、図２ａはＨ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に感染したＲＧＭ１細胞でグループ１～８処理によるＣｏｘ－２ ｍＲＮＡ発現変化を示し、図２ｂはＨ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に感染したＲＧＭ１細胞でグループ１～８処理によるｉＮＯＳのタンパク質発現変化を示し、図２ｃはＨ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に感染したＲＧＭ１細胞でグループ１～８処理によるリン酸化されたＮＦ－κＢ ｐ６５タンパク質発現変化を示す。ＧＡＰＤＨおよびβ－アクチンはそれぞれｍＲＮＡおよびタンパク質の内部対照群（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用された。図２ａ～図６ｂでＮ（左側から一番目の列）は陰性対照群（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ無処理ＲＧＭ１細胞）を示し、Ｈ．ｐ（左側から二番目の列）は陽性対照群（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染したＲＧＭ１細胞）を示し、グループ１～８はＨ．ｐｙｌｏｒｉ感染したＲＧＭ１細胞にグループ１～８の組成物が処理された細胞での結果を示す。
【図3a】Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に感染したＲＧＭ１細胞でグループ１～８処理による酸化ストレス関連タンパク質（ＨＩＦ－１ａ）の発現変化を示す。β－アクチンは内部対照群として使用された。
【図3b】Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に感染したＲＧＭ１細胞でグループ１～８処理による細胞内活性酸素の濃度変化を測定した結果（ＤＣＦ増減結果）を示す。
【図4a】Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に感染したＲＧＭ１細胞でグループ１～８処理によるＨＯ－１ ｍＲＮＡの発現変化を示す。
【図4b】Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に感染したＲＧＭ１細胞でグループ１～８処理によるＧＳＴ（ｐｉ）およびＨＯ－１タンパク質発現変化を示す。ＧＡＰＤＨおよびβ－アクチンは内部対照群として使用された。
【図5a】Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に感染したＲＧＭ１細胞でグループ１～８処理による細胞自己死滅阻害効能を示す。具体的に、図５ａは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に感染したＲＧＭ１細胞でグループ１～８処理によるＢａｘ、およびＢｃｌ－２タンパク質の発現変化を示し、β－アクチンは内部対照群として使用された。図５ｂは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に感染したＲＧＭ１細胞でグループ１～８処理によるアポトーシス変化（ＴＵＮＥＬ染色結果）を示す。
【図5b】Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に感染したＲＧＭ１細胞でグループ１～８処理による細胞自己死滅阻害効能を示す。具体的に、図５ａは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に感染したＲＧＭ１細胞でグループ１～８処理によるＢａｘ、およびＢｃｌ－２タンパク質の発現変化を示し、β－アクチンは内部対照群として使用された。図５ｂは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に感染したＲＧＭ１細胞でグループ１～８処理によるアポトーシス変化（ＴＵＮＥＬ染色結果）を示す。
【図6a】Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に感染したＲＧＭ１細胞でグループ１～８処理による血管生成および粘膜増殖成長因子の変化結果を示す。図６ａは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に感染したＲＧＭ１細胞でグループ１～８処理によるＴＧＦ－βおよびＶＥＧＦタンパク質の発現変化を示し、β－アクチンは内部対照群として使用された。図６ｂは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に感染したＲＧＭ１細胞でグループ１～８処理によるβ－カテニン（β－ｃａｔｅｎｉｎ）タンパク質の発現変化を示し、ラミンＢ（Ｌａｍｉｎ Ｂ）は内部対照群として使用された。
【図6b】Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に感染したＲＧＭ１細胞でグループ１～８処理による血管生成および粘膜増殖成長因子の変化結果を示す。図６ａは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に感染したＲＧＭ１細胞でグループ１～８処理によるＴＧＦ－βおよびＶＥＧＦタンパク質の発現変化を示し、β－アクチンは内部対照群として使用された。図６ｂは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に感染したＲＧＭ１細胞でグループ１～８処理によるβ－カテニンタンパク質の発現変化を示し、ラミンＢは内部対照群として使用された。
【図7a】ＷＩＲＳモデル動物実験群で一例による組成物の投与によるＳＲＭＤ（ストレス関連粘膜疾患（ｓｔｒｅｓｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍｕｃｏｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ））改善効能を示す。具体的に、図７ａは、各実験群の胃に対する病理学的写真を示し、右側二列の写真はｘ４０倍率で表示された。図７ｂは、ＷＩＲＳモデル動物実験群で一例による組成物の投与による（Ａ）病変点数（ｇｒｏｓｓ ｌｅｓｉｏｎ ｉｎｄｅｘ：左側上段グラフ）、（Ｂ）炎症；病理的点数（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ；ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｓｃｏｒｅ：右側上段グラフ）、（Ｃ）潰瘍／びらん；病理的点数（Ｕｌｃｅｒ／ｅｒｏｓｉｎ；ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｓｃｏｒｅ：左側下段グラフ）、（Ｄ）再生；病理的点数（Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ；ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｓｃｏｒｅ：右側下段グラフ）を示す。図７ａ～図１０でグループ１－４は表５の動物実験群１－４を意味する。
【図7b】ＷＩＲＳモデル動物実験群で一例による組成物の投与によるＳＲＭＤ（ストレス関連粘膜疾患）改善効能を示す。具体的に、図７ａは、各実験群の胃に対する病理学的写真を示し、右側二列の写真は×４０倍率で表示された。図７ｂは、ＷＩＲＳモデル動物実験群で一例による組成物の投与による（Ａ）病変点数（ｇｒｏｓｓ ｌｅｓｉｏｎ ｉｎｄｅｘ：左側上段グラフ）、（Ｂ）炎症；病理的点数（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ；ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｓｃｏｒｅ：右側上段グラフ）、（Ｃ）潰瘍／びらん；病理的点数（Ｕｌｃｅｒ／ｅｒｏｓｉｎ；ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｓｃｏｒｅ：左側下段グラフ）、（Ｄ）再生；病理的点数（Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ；ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｓｃｏｒｅ：右側下段グラフ）を示す。図７ａ～図１０でグループ１－４は表５の動物実験群１－４を意味する。
【図8a】ＷＩＲＳモデル動物実験群で一例による組成物の投与による炎症、血管新生およびシグナル伝達の変化を示す。（Ａ）図８ａは動物実験群１－４でｉＮＯＳ、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γ ｍＲＮＡの発現変化を示し、図８ｂは動物実験群１－４でＰＤＧＦ ｍＲＮＡの発現変化を示し、図８ｃは動物実験群１－４でｐ－ＩκＢαのタンパク質発現変化を示し、図８ｄは動物実験群１－４でｐ－ＥＲＫおよびｐ－ＪＮＫのタンパク質変化を示す。ＧＡＰＤＨおよびβ－アクチンはそれぞれｍＲＮＡおよびタンパク質の内部対照群として使用された。
【図8b】ＷＩＲＳモデル動物実験群で一例による組成物の投与による炎症、血管新生およびシグナル伝達の変化を示す。（Ａ）図８ａは動物実験群１－４でｉＮＯＳ、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γ ｍＲＮＡの発現変化を示し、図８ｂは動物実験群１－４でＰＤＧＦ ｍＲＮＡの発現変化を示し、図８ｃは動物実験群１－４でｐ－ＩκＢαのタンパク質発現変化を示し、図８ｄは動物実験群１－４でｐ－ＥＲＫおよびｐ－ＪＮＫのタンパク質変化を示す。ＧＡＰＤＨおよびβ－アクチンはそれぞれｍＲＮＡおよびタンパク質の内部対照群として使用された。
【図8c】ＷＩＲＳモデル動物実験群で一例による組成物の投与による炎症、血管新生およびシグナル伝達の変化を示す。（Ａ）図８ａは動物実験群１－４でｉＮＯＳ、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γ ｍＲＮＡの発現変化を示し、図８ｂは動物実験群１－４でＰＤＧＦ ｍＲＮＡの発現変化を示し、図８ｃは動物実験群１－４でｐ－ＩκＢαのタンパク質発現変化を示し、図８ｄは動物実験群１－４でｐ－ＥＲＫおよびｐ－ＪＮＫのタンパク質変化を示す。ＧＡＰＤＨおよびβ－アクチンはそれぞれｍＲＮＡおよびタンパク質の内部対照群として使用された。
【図8d】ＷＩＲＳモデル動物実験群で一例による組成物の投与による炎症、血管新生およびシグナル伝達の変化を示す。（Ａ）図８ａは動物実験群１－４でｉＮＯＳ、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γ ｍＲＮＡの発現変化を示し、図８ｂは動物実験群１－４でＰＤＧＦ ｍＲＮＡの発現変化を示し、図８ｃは動物実験群１－４でｐ－ＩκＢαのタンパク質発現変化を示し、図８ｄは動物実験群１－４でｐ－ＥＲＫおよびｐ－ＪＮＫのタンパク質変化を示す。ＧＡＰＤＨおよびβ－アクチンはそれぞれｍＲＮＡおよびタンパク質の内部対照群として使用された。
【図9a】ＷＩＲＳモデル動物実験群で一例による組成物の投与による細胞自己死滅、細胞周期の変化を示す結果である。具体的に、図９ａは動物実験群１－４で胃の粘膜のＳＲＭＤ領域で細胞自己死滅水準を示すＴＵＮＥＬ分析結果であり、図９ｂはＰＡＲＰ－１、Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、切断型カスパーゼ－８（Ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－８）および切断型カスパーゼ－３（Ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３）のタンパク質発現変化を示し、図９ｃはＣＤＫ４およびサイクリン（Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１）のタンパク質発現変化を示す。β－アクチンは内部対照群として使用された。
【図9b】ＷＩＲＳモデル動物実験群で一例による組成物の投与による細胞自己死滅、細胞周期の変化を示す結果である。具体的に、図９ａは動物実験群１－４で胃の粘膜のＳＲＭＤ領域で細胞自己死滅水準を示すＴＵＮＥＬ分析結果であり、図９ｂはＰＡＲＰ－１、Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、切断型カスパーゼ－８および切断型カスパーゼ－３のタンパク質発現変化を示し、図９ｃはＣＤＫ４および サイクリンＤ１のタンパク質発現変化を示す。β－アクチンは内部対照群として使用された。
【図9c】ＷＩＲＳモデル動物実験群で一例による組成物の投与による細胞自己死滅、細胞周期の変化を示す結果である。具体的に、図９ａは動物実験群１－４で胃の粘膜のＳＲＭＤ領域で細胞自己死滅水準を示すＴＵＮＥＬ分析結果であり、図９ｂはＰＡＲＰ－１、Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、切断型カスパーゼ－８および切断型カスパーゼ－３のタンパク質発現変化を示し、図９ｃはＣＤＫ４および サイクリンＤ１のタンパク質発現変化を示す。β－アクチンは内部対照群として使用された。
【図10】動物実験群１－４の胃の組織でのムチン（Ｍｕｃｉｎ）含量を示す。
【発明を実施するための形態】
【0117】
以下、本出願の理解を助けるために実施例を挙げて詳細に説明する。但し、下記の実施例は本出願の内容を例示するものに過ぎず、本出願の範囲が下記実施例に限定されるのではない。本出願の実施例は当業界で平均的な知識を有する者に本出願をより完全に説明するために提供させるものである。
【実施例】
【0118】
実施例１．コリネバクテリウム属菌株含有組成物および細胞感染
【0119】
実施例１－１．コリネバクテリウム属菌株含有組成物製造
コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株を含有する菌株組成物の抗ヘリコバクター、細胞自己死滅抑制および細胞保護効能とコリネバクテリウム属菌株間の効能差を検証するためにグループ１～グループ８の組成物を製造した。
コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、およびコリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）の野生型菌株をＣＪ第一製糖 ＢＩＯ Ｒ＆Ｄ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｂｌｏｓｓｏｍ ｐａｒｋ）から提供を受けて使用し、前記菌株をそれぞれトレオニン生産用ブロス（ｂｒｏｔｈ）に接種して３５℃で４８時間２００ｒｐｍで培養した。トレオニン生産用ブロスの成分および含量は下記表１に記載した。
コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株を含有する菌株組成物の抗ヘリコバクター、細胞自己死滅抑制および細胞保護効能とコリネバクテリウム属菌株間の効能差を検証するためにグループ１～グループ８の組成物を製造した。
コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、およびコリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）の野生型菌株をＣＪ第一製糖 ＢＩＯ Ｒ＆Ｄ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｂｌｏｓｓｏｍ ｐａｒｋ）から提供を受けて使用し、前記菌株をそれぞれトレオニン生産用ブロス（ｂｒｏｔｈ）に接種して３５℃で４８時間２００ｒｐｍで培養した。トレオニン生産用ブロスの成分および含量は下記表１に記載した。
【0120】
【表1】
【0121】
グループ１はコリネバクテリウム・グルタミクムを前記条件で培養して製造した発酵ブロスを遠心分離して菌体を除去した発酵ブロスの上澄液を含み、グループ２はトレオニンを１００ｇ／Ｌの濃度で含むバッファー（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）である。グループ３～５は前記条件で菌株を培養して製造した発酵ブロスを遠心分離して菌体を収集し、収集した菌体をバッファー（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）に懸濁して製造した。グループ６～８は前記条件で各菌株を培養した発酵ブロスであって、各菌株および各菌株を前記培地で培養した培養物（表２では‘発酵ブロスの上澄液’と記載する）を含む。グループ３～８の組成物は各菌株を３０ＯＤ（波長 ５６２ｎｍ）濃度で含み、オートクレーブ（ａｕｔｏｃｌａｖｅ）を通じて死菌体形態で菌株を含む。
【0122】
グループ１～８は全てトレオニンを含み、各菌株（死菌体形態で含む）または培養物内にトレオニンを含むグループが存在するので、菌株および／または培養物内のトレオニン含量を測定してグループ１～８での最終トレオニン濃度が１００ｇ／Ｌになるように追加的にトレオニン（ＣＪ ＢＩＯ菌株を通じて生産されたトレオニン；純度＞９９％）を添加した。
【0123】
各グループの成分は下記表２に記載した。表２でグループ１およびグループ６の‘発酵ブロスの上澄液’は‘Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株’を前記条件で培養して製造した培養物から菌体を除去したものを意味し、グループ７および８の発酵ブロスの上澄液はそれぞれ‘Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ菌株’および‘Ｃ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ菌株’を前記条件で培養して製造した培養物から菌体を除去したものを意味する。
【0124】
【表2】
【0125】
【0126】
実施例１－２．ラット胃粘膜細胞株培養
正常ラットの胃粘膜細胞株であるＲＧＭ１細胞は１０％のウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）が含まれているＤＭＥＭ（ダルベッコ改変必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ））とＨａｍ Ｆ１２混合培地で３７℃細胞培養器（９５％ ａｉｒ、５％ ＣＯ２）で培養した。前記ＲＧＭ１細胞株は日本Ｔｓｕｋｕｂａ大学のＭａｔｓｕｉ教授によって樹立され、同意（ｃｏｎｓｅｎｔ）後に使用された。
正常ラットの胃粘膜細胞株であるＲＧＭ１細胞は１０％のウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）が含まれているＤＭＥＭ（ダルベッコ改変必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ））とＨａｍ Ｆ１２混合培地で３７℃細胞培養器（９５％ ａｉｒ、５％ ＣＯ２）で培養した。前記ＲＧＭ１細胞株は日本Ｔｓｕｋｕｂａ大学のＭａｔｓｕｉ教授によって樹立され、同意（ｃｏｎｓｅｎｔ）後に使用された。
【0127】
実施例１－３．Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ菌株および細胞感染
ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ；Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）菌株（ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ Ａ［ＣａｇＡ］＋ｓｔｒａｉｎ、ＮＣＴＣ １１６３７）はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入した。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ菌株は５％仔ウシ血清（ｂｏｖｉｎｅ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）と抗生剤が添加されたブルセラ液体培地（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｂｒｏｔｈ）で１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ（ＯＤ ６００＝１）になるまで１０％ ＣＯ２条件で振盪培養した。
ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ；Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）菌株（ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ Ａ［ＣａｇＡ］＋ｓｔｒａｉｎ、ＮＣＴＣ １１６３７）はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入した。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ菌株は５％仔ウシ血清（ｂｏｖｉｎｅ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）と抗生剤が添加されたブルセラ液体培地（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｂｒｏｔｈ）で１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ（ＯＤ ６００＝１）になるまで１０％ ＣＯ２条件で振盪培養した。
【0128】
１００：１の感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、ＭＯＩ）（以下、１００ ＭＯＩ）でＲＧＭ１細胞をＨ．ｐｙｌｏｒｉ菌株に６時間感染させた。
【0129】
実施例２．ｉｎ ｖｉｔｒｏでコリネバクテリウム属含有菌株組成物の抗ヘリコバクター効能検定
寒天拡散法（Ｄｉｓｃ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）を使用して血液寒天プレート（ｂｌｏｏｄ ａｇａｒ ｐｌａｔｅ）でＨ．ｐｙｌｏｒｉの成長抑制効能、即ち、抗ヘリコバクター効能を測定した。具体的に、精製された水にＴＳＡ（トリプチケースソイ寒天培地（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ａｇａｒ））４０ｇ／Ｌを溶かした後、オートクレーブ(１２１℃、２０分）した。約５０℃程度に冷ました後、５％羊血液（ｓｈｅｅｐ ｂｌｏｏｄ）を添加した後、抗生剤｛トリメトプリム（ｔｒｉｍｅｔｈｏｐｒｉｍ）（５ｍｇ／Ｌ）、ポリミキシンＢ（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ Ｂ）（２５００Ｕ／Ｌ）、バンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）（１０ｍｇ／Ｌ）｝を添加した。滅菌されたプレートに前記培地を２０～２５ｍｌずつ分注した後、４℃で保管した。
寒天拡散法（Ｄｉｓｃ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）を使用して血液寒天プレート（ｂｌｏｏｄ ａｇａｒ ｐｌａｔｅ）でＨ．ｐｙｌｏｒｉの成長抑制効能、即ち、抗ヘリコバクター効能を測定した。具体的に、精製された水にＴＳＡ（トリプチケースソイ寒天培地（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ａｇａｒ））４０ｇ／Ｌを溶かした後、オートクレーブ(１２１℃、２０分）した。約５０℃程度に冷ました後、５％羊血液（ｓｈｅｅｐ ｂｌｏｏｄ）を添加した後、抗生剤｛トリメトプリム（ｔｒｉｍｅｔｈｏｐｒｉｍ）（５ｍｇ／Ｌ）、ポリミキシンＢ（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ Ｂ）（２５００Ｕ／Ｌ）、バンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）（１０ｍｇ／Ｌ）｝を添加した。滅菌されたプレートに前記培地を２０～２５ｍｌずつ分注した後、４℃で保管した。
【0130】
製造した血液寒天プレートにＨ．ｐｙｌｏｒｉ菌株液２００μｌを分注して塗抹した後、滅菌されたディスクペーパーを載せ、前記実施例１－１で製造したグループ１～８の組成物４０μｌずつをそれぞれディスクペーパーに吸収させ、３７℃のＣＯ２インキュベータで４８時間培養した後、ディスク周囲の生育阻止環の直径を測定して図１に示した。（グループ１の結果はグラフに表示していない）図１で‘未処置（Ｎｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ）’はＨ．ｐｙｌｏｒｉに感染していないＲＧＭ１細胞を意味する。
【0131】
図１に示されているように、グループ６および７で生育阻止環の直径数値が無処理群に比べて有意的に高くてグループ６および７が有意な抗ヘリコバクター活性を有することを確認した。
【0132】
また、以後実験に使用するグループ１－８の適正濃度を導出しようとした。
【0133】
前記実施例１－１で製造したグループ１～８の組成物を１／４、１／４０、または１／１００に希釈した希釈液をそれぞれ４０μｌずつＨ．ｐｙｌｏｒｉに処理し、細胞生存率を測定した。１／４の希釈濃度では多数のグループで０．５以下の生存率を示し、１／１００の希釈濃度ではグループ間の明確な結果差がなかったので、グループ１に比べて有意的な結果差が現れる１／４０の希釈液を以後実験に使用した。
【0134】
実施例３．コリネバクテリウム属菌株含有組成物による炎症媒介因子（ｍｅｄｉａｔｏｒ）とこれを転写するＮＦ－κＢの変化検定
前記実施例１－３の方法のようにＨ．ｐｙｌｏｒｉに感染した（１００ ＭＯＩ）ＲＧＭ１細胞を６時間１／４０濃度に希釈したグループ１～８の組成物４０μｌでそれぞれ処理した。その後、前記組成物が処理されたＲＧＭ１細胞で、炎症媒介因子であるＣｏｘ－２ ｍＲＮＡの発現量をＲＴ－ＰＣＴ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ）分析を通じて確認し、その結果を図２ａに示した。
前記実施例１－３の方法のようにＨ．ｐｙｌｏｒｉに感染した（１００ ＭＯＩ）ＲＧＭ１細胞を６時間１／４０濃度に希釈したグループ１～８の組成物４０μｌでそれぞれ処理した。その後、前記組成物が処理されたＲＧＭ１細胞で、炎症媒介因子であるＣｏｘ－２ ｍＲＮＡの発現量をＲＴ－ＰＣＴ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ）分析を通じて確認し、その結果を図２ａに示した。
【0135】
具体的に、ＲＮＡはＴＲＩｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を用いて抽出し、抽出されたＲＮＡはモロニーマウス白血病ウイルス（ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ、ＮＣ）を用いてｃＤＮＡに合成した。ＰＣＲ分析に使用されたそれぞれのプライマーの塩基配列は下記表３に示し、内部標準（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ）としてグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＧＡＰＤＨ）を使用した。
【0136】
【表3】
【0137】
また、前記組成物が処理されたＲＧＭ１細胞で、ｉＮＯＳタンパク質の発現量およびこれを転写するＮＦ－κＢ ｐ６５リン酸化の増減有無をウエスタンブロット分析を通じて確認し、その結果を図２ｂおよび図２ｃに示した。
【0138】
具体的に、組成物が処理されて培養された細胞をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）溶液で洗浄した後、細胞溶解バッファー（ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、５０ｍＭ ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２５ｍＭ ＮａＦ、２０ｍＭ ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ－ｂｉｓ（βＮ’－ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、１ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ ｔａｂｌｅｔ［Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｍａｎｎｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ］）で溶解させてタンパク質溶解物（ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｙｓａｔｅ）を製造した。これをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）で電気泳動した後、展開させたタンパク質をＰＶＤＦメンブレン（Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）に移してそれぞれの１次抗体（ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）と２次抗体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）で反応させた後、化学発光システム（ｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて分析した。
【0139】
図２ａに示されているように、正常ＲＧＭ１細胞（Ｎ）に比べてＨ．ｐｙｌｏｒｉに感染したＲＧＭ１細胞（Ｈ．ｐ）でＣｏｘ－２のｍＲＮＡは有意に増加され、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染によって増加されたＣｏｘ－２のｍＲＮＡ発現がグループ６の組成物添加によって最も有意に減少された。
【0140】
図２ｂおよび図２ｃに示されているように、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染によってｉＮＯＳタンパク質発現およびこれを転写するＮＦ－κＢ ｐ６５のリン酸化は有意に増加されたが、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染によって増加されたｉＮＯＳタンパク質の発現およびＮＦ－κＢ ｐ６５のリン酸化がグループ６の組成物添加によって最も有意に減少された。前記結果から一例による組成物がヘリコバクター菌株による炎症媒介経路を調節することが分かった。
【0141】
実施例４．ｉｎ ｖｉｔｒｏでコリネバクテリウム属含有菌株組成物による酸化ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ）弱化効能検定
前記実施例１－３の方法のようにＨ．ｐｙｌｏｒｉに感染した（１００ＭＯＩ）ＲＧＭ１細胞を１／４０濃度に希釈したグループ１～８の組成物４０μｌでそれぞれ６時間処理した。その後、前記実施例３と類似の方法でウエスタンブロットを行って、酸化ストレスに関連したＨＩＦ－１αの発現量変化を測定してその結果を図３ａに示した。
前記実施例１－３の方法のようにＨ．ｐｙｌｏｒｉに感染した（１００ＭＯＩ）ＲＧＭ１細胞を１／４０濃度に希釈したグループ１～８の組成物４０μｌでそれぞれ６時間処理した。その後、前記実施例３と類似の方法でウエスタンブロットを行って、酸化ストレスに関連したＨＩＦ－１αの発現量変化を測定してその結果を図３ａに示した。
【0142】
図３ａに示されているように、ヘリコバクター・ピロリ感染によって有意にＨＩＦ－１ａ増加され、グループ６および７でＨＩＦ－１ａ発現が顕著に減少された。
【0143】
また、細胞内活性酸素の濃度変化を測定するためにＤＣＦ－ＤＡプローブを活用したＤＣＦ増強反応を共焦点映像機（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｉｍａｇｅｒ）で分析した。非蛍光物質であるＤＣＦ－ＤＡ（２’，７’－ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ）は細胞内過酸化物（ｐｅｒｏｘｉｄｅｓ）存在時、活性酸素種（ＲＯＳ）によって酸化されて緑色の蛍光を帯びるようになるので、特定波長で蛍光強さ程度として活性酸素種の量を直接定量することができる。具体的に、２４ウェルプレート（２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に５×１０５個／ウェルにＲＧＭ－１細胞（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ無処理ＲＧＭ１細胞；またはＨ．ｐｙｌｏｒｉに感染した（１００ＭＯＩ）ＲＧＭ１細胞（実施例１－３）を分注し３７℃細胞培養器（９５％ ａｉｒ、５％ ＣＯ２）で一晩培養後、グループ１～８の組成物をそれぞれ一定時間処理した。ＤＭＥＭで細胞を洗浄した後、１０μｇ／ｍｌ ＤＣＦ－ＤＡ（２’，７’－ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を培地に添加してインキュベータで３０分間培養した。培養後、４℃のＰＢＳで洗浄した細胞を蛍光顕微鏡で観察および撮影してその結果を図３ｂに示した。
【0144】
図３ｂに示されているように、ヘリコバクター・ピロリ感染後に増加されたＤＣＦ－ＤＡの蛍光強さはグループ１、３、６、および８処理群で統計的に有意に減少され（Ｐ＜０．０５）、グループ６処理群でその減少程度が最も大きいこと（Ｐ＜０．０１）を確認した。前記結果から一例による組成物によってヘリコバクター菌株による酸化ストレスや低酸素応答（ｈｙｐｏｘｉａ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を即刻対処することができるのが分かった。
【0145】
実施例５．ｉｎ ｖｉｔｒｏでコリネバクテリウム属含有菌株組成物によるヘリコバクター・ピロリ連関抗酸化媒介細胞保護効能検定
前記実施例１－３の方法のようにＨ．ｐｙｌｏｒｉに感染した（１００ＭＯＩ）ＲＧＭ１細胞に６時間１／４０濃度に希釈したグループ１～８の組成物４０μｌをそれぞれ処理した。その後、代表的な細胞保護因子（ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ）である抗酸化機能のＨＯ－１ ｍＲＮＡの発現変化を実施例３による方法（ＰＣＲ）で分析して図４ａに示し、ＨＯ－１およびＧＳＴ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ｐｉ））タンパク質発現変化を実施例３による方法（ウエスタンブロット分析）と類似に分析して図４ｂに示した。
前記実施例１－３の方法のようにＨ．ｐｙｌｏｒｉに感染した（１００ＭＯＩ）ＲＧＭ１細胞に６時間１／４０濃度に希釈したグループ１～８の組成物４０μｌをそれぞれ処理した。その後、代表的な細胞保護因子（ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ）である抗酸化機能のＨＯ－１ ｍＲＮＡの発現変化を実施例３による方法（ＰＣＲ）で分析して図４ａに示し、ＨＯ－１およびＧＳＴ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ｐｉ））タンパク質発現変化を実施例３による方法（ウエスタンブロット分析）と類似に分析して図４ｂに示した。
【0146】
その結果、図４ａおよび図４ｂのように対照群ではヘリコバクター・ピロリ感染後、ＨＯ－１ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現の有意な減少が観察され、グループ６～８処理群で減少されたＨＯ－１発現が顕著に増加され、その中でもグループ６処理群でＨＯ－１の発現が最も顕著に増加された。また図４ｂに示されているように、グループ６および７でＧＳＴ（ｐｉ）発現が顕著に減少され、その中でもグループ６処理群でＧＳＴ（ｐｉ）発現が最も有意に減少された。
【0147】
前記結果から、一例による組成物はヘリコバクター菌株に対してＨＯ－１反応に主に基づく抗酸化作用および細胞保護効能を示すことが分かった。
【0148】
実施例６．ｉｎ ｖｉｔｒｏでコリネバクテリウム属含有菌株組成物によるヘリコバクター・ピロリ連関細胞自己死滅阻害効能検定
前記実施例１－３の方法のようにＨ．ｐｙｌｏｒｉに感染した（１００ＭＯＩ）ＲＧＭ１細胞を６時間１／４０濃度に希釈したグループ１～８の組成物４０μｌでそれぞれ処理した。その後、実施例３の方法と類似に、ウエスタンブロットを通じてＢｃｌ－２およびＢａｘの発現量を確認してその結果を図５ａに示し、ＴＵＮＥＬ染色でアポトーシス（細胞死滅）を分析してその結果を図５ｂに示した。具体的に、ＴＵＮＥＬ染色は細胞をＬａｂ－Ｔｅｋ ｃｈａｍｂｅｒ ｓｌｉｄｅに１×１０５個／ｃｈａｍｂｅｒで分注した後、３７℃細胞培養器（９５％ ａｉｒ、５％ ＣＯ２）で培養した。その後、それぞれの試薬を一定時間処理した後、アポトーシス検出キット（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用して製造会社の実験方法のとおり行った。培養液を除去してＰＢＳ溶液で３回洗浄後、４％ ＰＦＡ（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）を添加し常温で２０分間固定した。ＰＢＳで再び２回洗浄後、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を４℃で５分間処置しＴｄＴ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）とヌクレオチド混合物（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｘｔｕｒｅ）を混合して製造した溶液で３７℃で光遮断した後に６０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、蛍光顕微鏡で細胞自滅死を観察した。
前記実施例１－３の方法のようにＨ．ｐｙｌｏｒｉに感染した（１００ＭＯＩ）ＲＧＭ１細胞を６時間１／４０濃度に希釈したグループ１～８の組成物４０μｌでそれぞれ処理した。その後、実施例３の方法と類似に、ウエスタンブロットを通じてＢｃｌ－２およびＢａｘの発現量を確認してその結果を図５ａに示し、ＴＵＮＥＬ染色でアポトーシス（細胞死滅）を分析してその結果を図５ｂに示した。具体的に、ＴＵＮＥＬ染色は細胞をＬａｂ－Ｔｅｋ ｃｈａｍｂｅｒ ｓｌｉｄｅに１×１０５個／ｃｈａｍｂｅｒで分注した後、３７℃細胞培養器（９５％ ａｉｒ、５％ ＣＯ２）で培養した。その後、それぞれの試薬を一定時間処理した後、アポトーシス検出キット（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用して製造会社の実験方法のとおり行った。培養液を除去してＰＢＳ溶液で３回洗浄後、４％ ＰＦＡ（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）を添加し常温で２０分間固定した。ＰＢＳで再び２回洗浄後、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を４℃で５分間処置しＴｄＴ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）とヌクレオチド混合物（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｘｔｕｒｅ）を混合して製造した溶液で３７℃で光遮断した後に６０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、蛍光顕微鏡で細胞自滅死を観察した。
【0149】
図５ａに示されているようにＨ．ｐｙｌｏｒｉに感染した細胞（Ｈ．ｐ）でＢｃｌ－２の発現減少とＢａｘの発現増加を観察することができ、グループ６～８処理群で顕著に増加されたＢａｘ発現が減少し、減少したＢｃｌ－２の発現が増加したのを確認することができ、その中でもグループ６処理群で効果が最も優れていた。
【0150】
ヘリコバクター・ピロリ感染は細胞死滅の有意な増加によって粘膜損傷および潰瘍を誘発すると知られており、図５ｂに示されているようにＴＵＮＥＬ染色結果でもヘリコバクター・ピロリ感染によって統計的に有意なアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の増加が観察されたが（Ｐ＜０．０１）、グループ６～８処理群で顕著にアポトーシスが減少され、その中でもグループ６処理群で最もアポトーシスが減少された。
【0151】
実施例７．ｉｎ ｖｉｔｒｏでコリネバクテリウム属含有菌株組成物によるヘリコバクター・ピロリ連関細胞成長、血管成長、そして増殖因子の変化検定
前記実施例１－３の方法のようにＨ．ｐｙｌｏｒｉに感染した（１００ＭＯＩ）ＲＧＭ１細胞を６時間１／４０濃度に希釈したグループ１～８の組成物４０μｌでそれぞれ処理した。その後、実施例３の方法と類似に、ウエスタンブロットでＴＧＦ－βおよびＶＥＧＦの変化を分析してその結果を図６ａに示した。
前記実施例１－３の方法のようにＨ．ｐｙｌｏｒｉに感染した（１００ＭＯＩ）ＲＧＭ１細胞を６時間１／４０濃度に希釈したグループ１～８の組成物４０μｌでそれぞれ処理した。その後、実施例３の方法と類似に、ウエスタンブロットでＴＧＦ－βおよびＶＥＧＦの変化を分析してその結果を図６ａに示した。
【0152】
その結果、図６ａに示されているようにヘリコバクター感染後増加されたＴＧＦ－βおよびＶＥＧＦは無分別な粘膜増殖や癌性炎症を助長するようになるのに反して、グループ６～８処理群でＴＧＦ－βおよびＶＥＧＦの発現を有意味に減少させ、特にグループ６処理群で最もＴＧＦ－βおよびＶＥＧＦの発現が減少された。これから一例による組成物はヘリコバクター・ピロリ感染による諸般炎症や癌化を緩和させることができる結果を示した。
【0153】
また、ヘリコバクター・ピロリが感染された細胞でｎｕｃｌｅａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎを活用してβ－カテニンの核移入（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ）をウエスタンブロットで確認しその結果を図６ｂに示した。図６ｂに示されているように、ヘリコバクター・ピロリの感染によって増加されたβ－カテニンの核移入（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ）をグループ６の処理によって顕著に阻害させることができるのを確認した。
【0154】
前記実施例１～７の全ての実験値はＴ検定（Ｔ－ｔｅｓｔ）を通じた方法で統計検証し、ｐ＜０．０５以上である場合を統計的に有意であると定義した。
【0155】
実施例８．トレオニンを含むサンプルの製造
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ野生型菌株（ＣＪ第一製糖 ＢＩＯ Ｒ＆Ｄ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｂｌｏｓｓｏｍ ｐａｒｋ））をトレオニン生産用ブロス（表１）に接種して、３５℃、２００ｒｐｍ条件で４８時間培養して製造した発酵ブロス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ）を精製および結晶化してサンプル１を製造した。サンプル１は粉末形態の精製されたトレオニンを９９重量％以上含んでいる。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ野生型菌株（ＣＪ第一製糖 ＢＩＯ Ｒ＆Ｄ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｂｌｏｓｓｏｍ ｐａｒｋ））をトレオニン生産用ブロス（表１）に接種して、３５℃、２００ｒｐｍ条件で４８時間培養して製造した発酵ブロス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ）を精製および結晶化してサンプル１を製造した。サンプル１は粉末形態の精製されたトレオニンを９９重量％以上含んでいる。
【0156】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍをトレオニン生産用培地で培養して得られた発酵ブロス（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ含む）を直接乾燥（６０～７０℃で熱風乾燥）してサンプル２を製造した。また、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを前記条件で培養して得られた発酵ブロスに多様な含量でリグニンスルホン酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ－ｌｉｇｎｏｓｕｌｆｏｎａｔｅ、Ａｌａｄｄｉｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｏ．、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈａｎａ）を添加し、リグニンスルホン酸カルシウムが添加された発酵ブロス（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ含む）を乾燥して（６０～７０℃で熱風乾燥）、サンプル３～５を製造した。サンプル２～５は熱風乾燥を通じてＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを死菌体の形態で含んでいる。
【0157】
サンプル２～５は約２００～１０００μｍの粒度を有する顆粒形態に製造された。サンプル１～５の構成成分および含量は表４に記載した。表４で、Ｔｈｒ（重量％）、リグニンスルホン酸カルシウム（重量％）、および残り発酵物成分（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌体含む）（重量％）は前記発酵ブロスを乾燥して製造された乾燥物内の重量％を意味し、乾燥物中発酵物はＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株を含む。また、発酵物内含まれるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株の含量を表４に記載した。
【0158】
【表4】
【0159】
実施例９．ＳＲＭＤ（ストレス関連粘膜疾患）のためのＷＩＲＳ（水浸耐性ストレス（Ｗａｔｅｒ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ－ｒｅｓｔｒａｉｎｔ ｓｔｒｅｓｓ））モデル準備
総１１０匹のＳＤラットをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）から購入して動物施設に保管した。実験動物はＡＡＡＬＡＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｐｏｌｉｃｉｅｓによって公認動物施設で取り扱われた。動物はＷＩＲＳ露出される２４時間前に絶食させ、水は自由に摂取することができるようにした。各グループの１０匹のマウスをＷＩＲＳ用ケージに入れて６時間水に浸した。
総１１０匹のＳＤラットをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）から購入して動物施設に保管した。実験動物はＡＡＡＬＡＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｐｏｌｉｃｉｅｓによって公認動物施設で取り扱われた。動物はＷＩＲＳ露出される２４時間前に絶食させ、水は自由に摂取することができるようにした。各グループの１０匹のマウスをＷＩＲＳ用ケージに入れて６時間水に浸した。
【0160】
ＷＩＲＳ処理８時間前に前記実施例８で製造されたサンプル１～サンプル５を同一なトレオニンが投与（０．１５重量％／食餌）されるようにラットに経口投与し、ＷＩＲＳを６時間適用後に動物を犠牲にさせて胃を摘出し、切開および内容物を除去して、胃腸内面の写真を撮ってこれを図１１に示した。図１１に示されているように、ラットの胃組織を肉眼で見てみた結果、ＷＩＲＳ誘発群（図１１で２番目行）で胃出血が発生し、サンプル１＜サンプル５＜サンプル４＜サンプル３またはサンプル２の順に胃出血程度が減少したの（胃潰瘍治療効果に優れること）を確認することができた。
【0161】
一方、以後実験は下記表５に表されているように４個の動物実験群に分けて実施した。食塩水の経口投与以後、何らの処理もしていない無処理群（陽性対照群、動物実験群１）、６時間ＷＩＲＳを適用したＷＩＲＳグループ（陰性対照群、動物実験群２）、ＷＩＲＳ処理８時間以前にサンプル１（実施例８で製造）が０．１５重量％含まれている飼料（動物実験群３）とサンプル３（実施例８で製造）が０．２１重量％含まれている飼料（動物実験群４）をそれぞれ３０ｍｇ／ｋｇ ｂｏｄｙで経口処理した動物実験群に分けた。動物実験群３と４の飼料内Ｌ－Ｔｈｒ（Ｌ型－トレオニン）含量は０．１５重量％／食餌で同一に設定した。
【0162】
【表5】
【0163】
全ての実験動物（ラット）は、ＷＩＲＳ６時間後、高い服用量の麻酔剤（チオペンタールナトリウム（ｔｈｉｏｐｅｎｔａｌ ｓｏｄｉｕｍ）、５０ｍｇ／ｋｇ）で犠牲になった。
下記実施例１０～１２に記載された動物実験群１－４は前記表５の動物実験群１－４を意味し、図７ａ～図１０でグループ１－４は表５の動物実験群１－４を意味する。
下記実施例１０～１２に記載された動物実験群１－４は前記表５の動物実験群１－４を意味し、図７ａ～図１０でグループ１－４は表５の動物実験群１－４を意味する。
【0164】
実施例１０．ＳＲＭＤ（ストレス関連粘膜疾患）改善効能検定
前記実施例９で犠牲になったラットの胃を切開してさらに大きな曲率（ｃｕｒｖａｔｕｒｅ）に沿って開放した後、冷たいＰＢＳ溶液で洗浄した。拡大写真を通じてびらん（ｅｒｏｓｉｏｎｓ）または潰瘍（ｕｌｃｅｒｓ）の数と大きさを決定した後、解剖学的観察のために半分を解剖した。切除された胃はプラスチックシートの上に広げ１０％緩衝ホルマリンに４時間固定させてパラフィンティッシュスライド製作に使用され、残り半分は分子生物学的観察のために液体窒素タンクに保管した。また、粘膜の均質液（ｍｕｃｏｓａｌ ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）は同一動物実験群を混合して保管した。
前記実施例９で犠牲になったラットの胃を切開してさらに大きな曲率（ｃｕｒｖａｔｕｒｅ）に沿って開放した後、冷たいＰＢＳ溶液で洗浄した。拡大写真を通じてびらん（ｅｒｏｓｉｏｎｓ）または潰瘍（ｕｌｃｅｒｓ）の数と大きさを決定した後、解剖学的観察のために半分を解剖した。切除された胃はプラスチックシートの上に広げ１０％緩衝ホルマリンに４時間固定させてパラフィンティッシュスライド製作に使用され、残り半分は分子生物学的観察のために液体窒素タンクに保管した。また、粘膜の均質液（ｍｕｃｏｓａｌ ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）は同一動物実験群を混合して保管した。
【0165】
顕微鏡を用いて肉眼で胃試料を観察し（図７ａ）、対照群および各実験群（動物実験群１－４）で病変点数、炎症；病理的点数、潰瘍／びらん；病理的点数、再生；病理的点数を計算して図７ｂに示した。図７ａに示されているように、びらん、出血および潰瘍のようなＳＲＭＤの有意な発生が全ての動物実験群２のラットで現れたが、動物実験群３または動物実験群４でＳＲＭＤが有意に改善された。図７ｂに示されているように、病変点数（ｇｒｏｓｓ ｌｅｓｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）、炎症；病理的点数（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ；ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｓｃｏｒｅ）、潰瘍／びらん；病理的点数（Ｕｌｃｅｒ／ｅｒｏｓｉｎ；ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｓｃｏｒｅ）、再生；病理的点数（Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ；ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｓｃｏｒｅ）は動物実験群３および４で有意に（ｐ＜０．０５）改善され、特に動物実験群４の病変点数は動物実験群３に比べて有意に低く、再生；病理的点数は動物実験群３より有意に改善された。
【0166】
実施例１１．抗炎症効能検定
ＳＲＭＤは虚血－再かん流（ｉｓｃｈｅｍｉｃ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）損傷と病理生理学的に関連しているため動物実験群１～４でＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）を含む血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｓｉｓ）成長因子のｍＲＮＡ発現と炎症媒介因子であるｉＮＯＳ、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、およびＰＤＧＦのｍＲＮＡ発現を測定しその結果を図８ａおよび図８ｂに示した。
ＳＲＭＤは虚血－再かん流（ｉｓｃｈｅｍｉｃ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）損傷と病理生理学的に関連しているため動物実験群１～４でＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）を含む血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｓｉｓ）成長因子のｍＲＮＡ発現と炎症媒介因子であるｉＮＯＳ、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、およびＰＤＧＦのｍＲＮＡ発現を測定しその結果を図８ａおよび図８ｂに示した。
【0167】
具体的に、総ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｋｏｒｅａ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）を使用して抽出した。炎症性サイトカインおよび媒介因子の発現測定に使用されたプライマーを下記表６に示した。増幅はＰｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００を使用して１０×反応緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｋｏｒｅａ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）、１．５ｍＭ／Ｌ ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ／Ｌデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）、各プライマー１ｍＭ／ＬおよびＴａｑ ＤＮＡ重合酵素（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｒｏｍｅｇａ）２．５ｕｎｉｔを用いて分析した。各サイクルは９５℃で１分間変性、５５℃で４５分間アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃で４５秒間増幅から構成された。
【0168】
【表6】
【0169】
また、各動物実験群１－４でｐ－ＩκＢα、ｐ－ＥＲＫおよびｐ－ＪＮＫのタンパク質水準を測定して図８ｃおよび図８ｄに示した。具体的に、タンパク質水準を測定するためのウエスタンブロットを行うために、採集された胃粘膜（Ｇａｓｔｒｉｃ ｍｕｃｏｓａ）を２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、３００ｍＭスクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）および２ｍＭ ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）を含有するｉｃｅ－ｃｏｌｄ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で組織均質機（ｔｉｓｓｕｅ ｈｏｍｏｇｅｎａｔｏｒ）で均質化させた。３０μｇのタンパク質を８％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）ゲルで電気泳動した後、セミドライトランスファーシステム（Ｓｅｍｉｄｒｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｙｓｔｅｍ、Ｈｏｅｆｅｒ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用してＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜に移した。非特異的結合は５％脱脂粉乳（ｎｏｎ－ｆａｔ ｄｒｙ ｍｉｌｋ）で培養して防止した。膜を４℃で１次抗体の５００倍希釈液と共に一晩恒温培養した後、１：１０００に希釈したＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）結合－２次抗体として培養した。ＥＣＬ検出キット（ＥＣＬ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｋｏｒｅａ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）を用いて免疫複合体を検出しＸ－ｒａｙフィルムに自動放射線照射した。ウエスタンブロットに使用した抗体は次の通りである。β－アクチン、ｉＮＯＳ（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＣＯＸ－２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）、Ｐ－ＪＮＫ（ｐｈｏｓｐｈｏｒ－ＪＮＫ）、Ｐ－ＥＲＫ（ｐｈｏｓｐｈｏｒ－ＥＲＫ）、Ｂｃｌ－２（Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ２）、Ｂａｘ（Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ－２－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｘ－ｐｒｏｔｅｉｎ）、および サイクリンＤ１抗体はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）から購入した。ｐ－ＩκＢα（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｋａｐｐａ Ｂ ａｌｐｈａ）、ｐ－ＳＴＡＴ３（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ３）、ＰＡＲＰ（ｐｏｌｙ（ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ＣＤＫ４（ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ４）、およびＣＤＫ２（ｃｙｃｌｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ２）はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から購入した。ＨＯ－１（Ａ ｈｅｍｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ－１）抗体はＥｎｚｏ ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）から購入した。
【0170】
図８ａに示されているように、動物実験群２（ＷＩＲＳ誘導されたＳＲＭＤ）でｉＮＯＳ、ＴＮＦ－α、インターフェロンガンマ （ＩＦＮ－γ）のｍＲＮＡ発現が有意に増加したが、増加された炎症媒介因子（ｉＮＯＳ、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ）の発現は動物実験群３または動物実験群４で有意に減少し（Ｐ＜０．０１またはＰ＜０．０５、図８ａ）、ＴＮＦ－αおよびｉＦＮ－γの発現は特に動物実験群４で動物実験群３より有意的に減少した（Ｐ＜０．０５、図８ａ）。
【0171】
図８ｂに示されているように、血管新生成長因子であるＰＤＧＦの発現は動物実験群２で有意に増加したが、動物実験群３または動物実験群４で有意に減少し（Ｐ＜０．０１、図８ｂ）、特に動物実験群４でその減少程度がさらに高かった。
【0172】
図８ｃに示されているように、ｐ－ＩκＢαの発現量をタンパク質水準で測定した結果、動物実験群２でＷＩＲＳによってｐ－ＩκＢαの発現が有意に減少し、ｐ－ＩκＢαの発現減少はＮＦ－κＢの転写的活性化に関連している。反面、動物実験群４で減少されたｐ－ＩκＢαの発現が有意に増加し（Ｐ＜０．０１、図８ｃ）、動物実験群３よりｐ－ＩκＢαの発現が有意に増加し（Ｐ＜０．０１、図８ｃ）、ｐ－ＩκＢαの発現の増加はＮＦ－ｋＢのレドックス阻害（ｒｅｄｏｘ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を誘発する。
【0173】
一方、局所貧血および炎症に関連するシグナル伝達に関連して図８ｄに示されているように、動物実験群２で、ｐ－ＥＲＫおよびｐ－ＪＮＫ活性化が現れ、動物実験群４で前記シグナル伝達は全部非活性化されたが、動物実験群３で部分的に非活性化された（Ｐ＜０．０１）。
【0174】
実施例１２．胃粘膜保護効能検定
びらんまたは潰瘍を起こすＳＲＭＤは当該領域で増加されたアポトーシス、即ち、細胞自己死滅を示すので、動物実験群による胃粘膜上のアポトーシスを測定した。具体的に、ＴｄＴ ＦｒａｇＥＬ ＤＮＡ分裂検出キット（ＴｄＴ ＦｒａｇＥＬ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）およびＴＵＮＥＬ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）方法を用いて細胞自己死滅を視覚化した。各実験群でアポトーシスが大量発生する領域（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｈｏｔ ｓｐｏｔ）を探してＡＩ（アポトーシス指数（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｉｎｄｅｘ））を測定するために、ＴＵＮＥＬ－免疫染色部分（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ－ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ）－ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｃｔｉｏｎ）を１００倍拡大してスキャンした。その後、４００フィールドでＴＵＮＥＬ－陽性細胞の数を計数してＡＩを記録した。腐食性または潰瘍性病変を含む切片で少なくとも５個のホットスポットを無作為に選択して平均係数を決定し、図９ａにその結果を示し、結果は総細胞数の平均百分率で表示された。図９ａに示されているように、アポトーシス（細胞自己死滅）は動物実験群２で動物実験群１より有意的に増加され、増加されたアポトーシス水準が動物実験群２に比べて動物実験群３と動物実験群４で有意に減少され（Ｐ＜０．０１、図９ａ）、動物実験群３に比べて動物実験群４で有意的に低い水準に観察された（Ｐ＜０．０１、図９ａ）。
びらんまたは潰瘍を起こすＳＲＭＤは当該領域で増加されたアポトーシス、即ち、細胞自己死滅を示すので、動物実験群による胃粘膜上のアポトーシスを測定した。具体的に、ＴｄＴ ＦｒａｇＥＬ ＤＮＡ分裂検出キット（ＴｄＴ ＦｒａｇＥＬ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）およびＴＵＮＥＬ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）方法を用いて細胞自己死滅を視覚化した。各実験群でアポトーシスが大量発生する領域（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｈｏｔ ｓｐｏｔ）を探してＡＩ（アポトーシス指数（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｉｎｄｅｘ））を測定するために、ＴＵＮＥＬ－免疫染色部分（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ－ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ）－ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｃｔｉｏｎ）を１００倍拡大してスキャンした。その後、４００フィールドでＴＵＮＥＬ－陽性細胞の数を計数してＡＩを記録した。腐食性または潰瘍性病変を含む切片で少なくとも５個のホットスポットを無作為に選択して平均係数を決定し、図９ａにその結果を示し、結果は総細胞数の平均百分率で表示された。図９ａに示されているように、アポトーシス（細胞自己死滅）は動物実験群２で動物実験群１より有意的に増加され、増加されたアポトーシス水準が動物実験群２に比べて動物実験群３と動物実験群４で有意に減少され（Ｐ＜０．０１、図９ａ）、動物実験群３に比べて動物実験群４で有意的に低い水準に観察された（Ｐ＜０．０１、図９ａ）。
【0175】
ＴＵＮＥＬ結果を検証するために、細胞自己死滅防止タンパク質であるＢｃｌ－２および細胞自己死滅を誘導する切断型ＰＡＲＰ（ｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰ）、Ｂａｘ、切断型カスパーゼ－８、切断型カスパーゼ－３発現に対して前記実施例１１の方法のようにウエスタンブロット分析を行ってその結果を図９ｂに示した。
【0176】
図９ｂに示されているように、動物実験群２でＰＡＲＰ分裂、Ｂａｘ、切断型カスパーゼ－８、および切断型カスパーゼ－３発現は有意に増加し、増加されたＰＡＲＰ分裂、Ｂａｘ、切断型カスパーゼ－８、および切断型カスパーゼ－３発現が動物実験群３および４で有意に減少し、動物実験群３に比べて特に動物実験群４で有意的に低い水準に観察された。一方、細胞自己死滅防止タンパク質であるＢｃｌ－２発現は動物実験群４で有意に増加した（図９ｂ）。
【0177】
細胞周期（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ）関連遺伝子であるＣＤＫ４、 サイクリンＤ１の活性を実施例１１による方法でタンパク質水準で確認してその結果を図９ｃに示した。図９ｃに示されているように、ＣＤＫ４および サイクリンＤ１の発現は動物実験群２で有意に増加され（Ｐ＜０．０１）、増加されたＣＤＫ４および サイクリンＤ１の発現は動物実験群３および４で有意に減少された。特に、動物実験群３より動物実験群４でＣＤＫ４と サイクリンＤ１の発現が有意的に低かった（図９ｃ、Ｐ＜０．０１～０．０５）。
【0178】
動物実験群１～４の胃組織でＰＡＳ染色を通じてムチン（Ｍｕｃｉｎ）含量を確認してその結果を図１０に示した。図１０に示されているように、動物実験群２で有意に低い水準の胃粘液（ｇａｓｔｒｉｃ ｍｕｃｉｎ）が観察され（Ｐ＜０．０１）、胃粘液の発現は動物実験群３および４で有意に保存され、動物実験群３より４で粘液発現が有意的に高かった（Ｐ＜０．０１）。
【0179】
前記のような結果からＷＩＲＳは粘膜完全性（ｍｕｃｏｓａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を威嚇したが、一例による組成物（サンプル）の前処理によってこのような威嚇が緩和されることが分かった。
【0180】
前記実施例８～１１の結果は平均±ＳＤで表される。データは一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析され、グループ間の統計的有意性はＤｕｎｃａｎの多重範囲テストによって決定された。統計的有意性はＰ＜０．０５で収斂した。
【0181】
以上の説明から、本願の属する技術分野の当業者は本願がその技術的な思想や必須的特徴を変更せずに他の具体的な形態に実施できるというのを理解することができるはずである。これに関連して、以上で記述した実施例は全ての面で例示的なものであり限定的なものではないと理解しなければならない。本願の範囲は前記詳細な説明よりは後述の特許請求の範囲の意味および範囲、そしてその等価概念から導出される全ての変更または変形された形態が本願の範囲に含まれると解釈されなければならない。
【図1】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図3a】
【図3b】
【図4a】
【図4b】
【図5a】
【図5b】
【図6a】
【図6b】
【図7a】
【図7b】
【図8a】
【図8b】
【図8c】
【図8d】
【図9a】
【図9b】
【図9c】
【図10】
【図11】
【配列表】