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特許7295276Ｌ－トレオニン排出タンパク質の変異体及びそれを用いたＬ－トレオニン生産方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-06-12
(45)【発行日】2023-06-20
(54)【発明の名称】Ｌ－トレオニン排出タンパク質の変異体及びそれを用いたＬ－トレオニン生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/31 20060101AFI20230613BHJP
C07K 14/245 20060101ALI20230613BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230613BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230613BHJP
C12P 13/08 20060101ALI20230613BHJP
C12R 1/19 20060101ALN20230613BHJP
【ＦＩ】
C12N15/31
C07K14/245 ZNA
C12N1/21
C12N15/63 Z
C12P13/08 C
C12R1:19
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2021569881
(86)(22)【出願日】2020-09-09
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-27
(86)【国際出願番号】 KR2020012154
(87)【国際公開番号】W WO2021049866
(87)【国際公開日】2021-03-18
【審査請求日】2021-11-24
(31)【優先権主張番号】10-2019-0111509
(32)【優先日】2019-09-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】514199250
【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダング コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】ソ、チャン イル
(72)【発明者】
【氏名】キム、ヒョ ジン
(72)【発明者】
【氏名】イ、ジ スン
(72)【発明者】
【氏名】チェ、ソル
【審査官】山▲崎▼ 真奈
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０９８５２５７２（ＣＮ，Ａ）
【文献】国際公開第２００２／０３６７９７（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特開２０００－１８９１７７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００９－５１７０８８（ＪＰ，Ａ）
【文献】Accession No. WP_097344017，Database GenBank [online]，2019年06月，インターネット<https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/WP_097344017.1>［検索日2022年9月20日］
【文献】Accession No. A0A3R0W092，Database UniProt [online]，2019年04月，インターネット<https://rest.uniprot.org/unisave/A0A3R0W092?format=txt&versions=1>［検索日2022年9月20日］
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸配列の５３番目に相当する位置にトレオニンへの置換、又は配列番号１のアミノ酸配列の６２番目に相当する位置に他のアミノ酸への置換を含み、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上かつ１００％未満の配列同一性を有し、Ｌ－トレオニン排出活性を有する、Ｌ－トレオニン排出タンパク質の変異体。
【請求項2】
前記他のアミノ酸は、セリン、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸、リシン、プロリン、システイン、グリシン、トレオニン、イソロイシン、チロシン、バリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸又はトリプトファンから選択される、請求項１に記載のタンパク質の変異体。
【請求項3】
前記タンパク質の変異体は、配列番号９３～１１２から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質の変異体。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質の変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項5】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項6】
配列番号１のアミノ酸配列の５３番目に相当する位置にトレオニンへの置換、又は配列番号１のアミノ酸配列の６２番目に相当する位置に他のアミノ酸への置換を含み、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上かつ１００％未満の配列同一性を有する、Ｌ－トレオニン排出タンパク質の変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含み、Ｌ－トレオニンを生産する微生物。
【請求項7】
前記微生物は、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）又はエシェリキア属（Escherichia sp.）微生物である、請求項６に記載のＬ－トレオニンを生産する微生物。
【請求項8】
配列番号１のアミノ酸配列の５３番目に相当する位置にトレオニンへの置換、又は配列番号１のアミノ酸配列の６２番目に相当する位置に他のアミノ酸への置換を含み、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上かつ１００％未満の配列同一性を有する、Ｌ－トレオニン排出タンパク質の変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含む微生物を培地で培養するステップを含むＬ－トレオニン生産方法。
【請求項9】
前記方法は、培養された培地又は微生物からＬ－トレオニンを回収するステップをさらに含む、請求項８に記載のＬ－トレオニン生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、Ｌ－トレオニン排出タンパク質の変異体及びそれを用いたＬ－トレオニン生産方法に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｌ－トレオニン（L-Threonine, L-Thr）は、必須アミノ酸の一つであり、飼料添加剤などとして広く用いられており、また、輸液剤などの医薬品原料、健康食品素材などとして広く用いられている。
【0003】
現在は、微生物を用いた直接発酵法がＬ－トレオニン生産に主に用いられている。Ｌ－トレオニン生産に用いられる微生物として、初期には化学的又は物理的突然変異によるアナログ耐性を示す選択菌株が主に用いられていたが、１９９０年代に遺伝子組換え技術が急激に発展し、分子レベルの調節機序が解明されることにより、遺伝子操作技法を用いた組換え菌株が主に用いられている。
【0004】
一方、特定アミノ酸排出遺伝子の発現は、微生物における当該アミノ酸の生産性向上をもたらした。コリネバクテリウム属微生物のＬ－リシン排出遺伝子（ｌｙｓＥ）の発現強化は、リシンの生産性を向上させた（特許文献１）。また、大腸菌において機能が知られていない遺伝子であるｙａｈＮ遺伝子、ｙｅａＳ遺伝子、ｙｆｉＫ遺伝子及びｙｇｇＡ遺伝子を強化することにより、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－リシン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－プロリン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－バリン及びＬ－イソロイシンの生産性が向上するという特許（特許文献２）も開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】国際公開第９７／０２３５９７号
【文献】欧州特許第１０１６７１０号明細書
【文献】韓国登録特許第１０－０６２００９２号公報
【文献】韓国登録特許第１０－１７８３１７０号公報
【文献】韓国登録特許第１０－１６３２６４２号公報
【文献】特開平０５－２２７９７７号公報
【文献】韓国公開特許第１０－２０１９－０００３０１９号公報
【文献】韓国登録特許第１０－１１２６０４１号公報
【文献】韓国登録特許第１０－００５８２８６号公報
【文献】韓国登録特許第１０－０１５９８１２号公報
【非特許文献】
【0006】
【文献】Daley DO et al., Global topology analysis of the Escherichia coli inner membrane proteome, Science. 2005 May 27; 308(5726):1321-3.
【文献】Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444
【文献】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277
【文献】Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453
【文献】Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)
【文献】Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990)
【文献】Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994
【文献】[CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073
【文献】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482
【文献】Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)
【文献】Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745
【文献】J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989
【文献】F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York
【文献】Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8
【文献】TURBA E, et al, Agric. Biol. Chem. 53:2269～2271, 1989
【文献】Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008
【文献】Nucleic Acids Rersearch, 18, (1990) 4631
【文献】DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix
【文献】Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545
【文献】J Bacteriol. 1993 Feb;175(4):959-65
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明者らは、ｒｈｔＣによりコードされるＬ－トレオニン排出タンパク質（ＲｈｔＣ）の排出能向上のために変異型ｒｈｔＣを選択し、それによりＬ－トレオニン生産量が画期的に向上することを確認し、本出願を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本出願は、配列番号１の５３番目又は６２番目に相当する位置に他のアミノ酸への置換を含み、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、１００％未満の配列相同性を有し、Ｌ－トレオニン排出活性を有する、Ｌ－トレオニン排出タンパク質の変異体を提供することを目的とする。
【0009】
また、本出願は、前記Ｌ－トレオニン排出タンパク質の変異体をコードするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。
さらに、本出願は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供することを目的とする。
さらに、本出願は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供することを目的とする。
【0010】
さらに、本出願は、前記Ｌ－トレオニン排出タンパク質の変異体、前記タンパク質の変異体をコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含む、Ｌ－トレオニンを生産する微生物を提供することを目的とする。
【0011】
さらに、本出願は、前記微生物を培地で培養するステップを含むＬ－トレオニン生産方法を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【0012】
本出願のＬ－トレオニン排出タンパク質の変異体を用いて、Ｌ－トレオニンを生産する微生物を培養すると、従来の非変異タンパク質を有する微生物に比べて高収率でＬ－トレオニンを生産することができる。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下、これらを具体的に説明する。なお、本出願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。また、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。
【0014】
前記目的を達成するための本出願の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも１つのアミノ酸置換を含むＬ－トレオニン排出タンパク質の変異体を提供する。
具体的には、本出願は、配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）５３番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、かつ／又はｉｉ）６２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたタンパク質の変異体を提供する。前記アミノ酸置換は、ｉ）５３番目のアミノ酸のトレオニンへの置換であってもよく、ｉｉ）６２番目のアミノ酸のセリン、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸、リシン、プロリン、システイン、グリシン、トレオニン、イソロイシン、チロシン、バリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸又はトリプトファンから選択されるアミノ酸への置換であってもよい。
具体的には、本出願は、配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）５３番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、かつ／又はｉｉ）６２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたタンパク質の変異体を提供する。前記アミノ酸置換は、ｉ）５３番目のアミノ酸のトレオニンへの置換であってもよく、ｉｉ）６２番目のアミノ酸のセリン、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸、リシン、プロリン、システイン、グリシン、トレオニン、イソロイシン、チロシン、バリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸又はトリプトファンから選択されるアミノ酸への置換であってもよい。
【0015】
本出願における「トレオニン（Threonine, Thr）」とは、体内で合成されず、食品からのみ供給可能な必須アミノ酸の一つであり、腸管上皮保護物質であるムチン（mucin）を構成し、不足すると成長停止、体重減少をもたらすことがある。トレオニンは、飼料添加剤、輸液剤などの医薬品原料、健康食品素材などとして広く用いられている。他のアミノ酸と同様に、トレオニンにもＤ型とＬ型の立体異性体が存在し、自然に由来するトレオニンのほとんどはＬ型立体異性体であるＬ－トレオニン（L-Threonine, L-Thr）として存在する。本発明において、トレオニン（Threonine, Thr）はＬ－トレオニン（L-Threonine, L-Thr）と混用される。
【0016】
本出願における「Ｌ－トレオニン排出タンパク質（L-threonine exporter, L-threonine efflux protein）」は、Ｌ－トレオニンを細胞外に排出するように媒介するタンパク質であり、５つの膜貫通ドメイン（transmembrane domains）を有する内膜タンパク質として知られている。実験トポロジー（experimental topology）分析において、そのＣ末端が細胞質に存在することが示唆されている（非特許文献１）。前記Ｌ－トレオニン排出タンパク質は、例えば配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列を含むタンパク質は、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列からなるタンパク質と混用される。本出願において、前記Ｌ－トレオニン排出タンパク質は、ＲｈｔＣタンパク質又はＲｈｔＣと混用される。
【0017】
本出願における配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５は、Ｌ－トレオニン排出活性を有するアミノ酸配列である。具体的には、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５は、ｒｈｔＣ遺伝子によりコードされるＬ－トレオニン排出活性を有するタンパク質配列である。配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列は、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからその配列が得られる。例えば、配列番号１は大腸菌（Escherichia coli, E.coli）由来のもの、配列番号１１３はシゲラ・フレクスネリ（Shigella flexneri）由来のもの、配列番号１１５はエシェリキア・フェルグソニイ（Escherichia fergusonii）由来のものであってもよいが、これらに限定されるものではなく、前記アミノ酸配列を含むタンパク質と同じ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列であればいかなるものでもよい。配列番号１１３又は配列番号１１５は、配列番号１との相同性がそれぞれ９９％であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0018】
また、本出願におけるＬ－トレオニン排出活性を有するタンパク質は、たとえ配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列を含むタンパク質であると定義したとしても、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列の前後の無意味な配列付加、自然発生する突然変異、又はその非表現突然変異（silent mutation）を除外するものではなく、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列を含むタンパク質と同一又は相当する活性を有するものであれば、本出願のＬ－トレオニン排出活性を有するタンパク質に含まれることは当業者にとって自明である。具体的には、本出願のＬ－トレオニン排出活性を有するタンパク質は、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列であってもよく、それと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。また、そのような相同性又は同一性を有し、前記タンパク質に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本出願の変異対象となるタンパク質に含まれることは言うまでもない。
【0019】
すなわち、本出願に「特定配列番号で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はポリペプチド」、「特定配列番号で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質又はポリペプチド」と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であっても本出願に用いられることは言うまでもない。例えば、「配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド」は、配列番号１に相当する配列、又はそれと同一もしくは相当する活性を有する配列であれば「配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド」に属することは言うまでもない。
【0020】
本出願における「変異体（variant）」とは、少なくとも１つのアミノ酸の保存的置換（conservative substitution）及び／又は改変（modification）により前記列挙した配列（the recited sequence）とは異なるが、前記タンパク質の機能（functions）又は特性（properties）が維持されるタンパク質を意味する。変異体は、数個のアミノ酸置換、欠失又は付加により識別される配列（identified sequence）とは異なる。このような変異体は、一般に前記タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸を改変し、前記改変したタンパク質の特性を評価することにより識別することができる。すなわち、変異体の能力は、本来のタンパク質（native protein）より向上するか、変わらないか又は低下する。また、一部の変異体には、Ｎ末端リーダー配列や膜貫通ドメイン（transmembrane domain）などの少なくとも１つの部分が除去された変異体も含まれる。他の変異体には、成熟タンパク質（mature protein）のＮ及び／又はＣ末端から一部分が除去された変異体も含まれる。前記「変異体」には、変異型、改変、変異したタンパク質、変異型ポリペプチド、変異などの用語（英語表現では、modification、modified protein、modified polypeptide、mutant、mutein、divergent、variantなど）が用いられるが、変異を意味する用語であればこれらに限定されるものではない。本出願の目的上、前記変異体は、天然の野生型又は非変異タンパク質に比べて変異したタンパク質の活性が上昇したものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0021】
本出願における「保存的置換（conservative substitution）」とは、あるアミノ酸が類似した構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸に置換されることを意味する。前記変異体は、少なくとも１つの生物学的活性を依然として有する状態で、例えば少なくとも１つの保存的置換を有する。このようなアミノ酸置換は、一般に残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（amphipathic nature）における類似性に基づいて発生し得る。例えば、電荷を帯びた側鎖（electrically charged amino acid）を有するアミノ酸のうち正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられ、負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、グルタミン酸及びアスパラギン酸が挙げられ、電荷を帯びていない側鎖（uncharged amino acid）を有するアミノ酸のうち非極性アミノ酸（nonpolar amino acid）としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン及びプロリンが挙げられ、極性（polar）又は親水性（hydrophilic）アミノ酸としては、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられ、前記非極性アミノ酸のうち芳香族アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが挙げられる。
【0022】
また、変異体は、ポリペプチドの特性と二次構造に最小限の影響を及ぼすアミノ酸の欠失又は付加を含んでもよい。例えば、ポリペプチドは、翻訳と同時に（co-translationally）又は翻訳後に（post-translationally）タンパク質の移転（transfer）に関与するタンパク質のＮ末端のシグナル（又はリーダー）配列に結合されてもよい。また、前記ポリペプチドは、ポリペプチドを確認、精製又は合成できるように、他の配列又はリンカーに結合されてもよい。
【0023】
前記「他のアミノ酸に置換」は、置換前のアミノ酸とは異なるアミノ酸であれば限定されるものではない。すなわち、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列の５３番目のアミノ酸であるアラニンがアラニン以外の他のアミノ酸残基に置換されたもの、又は６２番目のアミノ酸であるロイシンがロイシン以外の他のアミノ酸残基に置換されたものであれば限定されるものではない。なお、本出願における「特定アミノ酸が置換された」とは、他のアミノ酸に置換されたと表記していなくても、置換前のアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換されたことを意味することは言うまでもない。
【0024】
前記変異体は、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列において５３番目又は６２番目のアミノ酸の１つ以上のアミノ酸が置換前のアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換されたものであってもよい。あるいは、前記変異体は、電荷を帯びていない側鎖（uncharged amino acid）を有する、置換前のアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換された変異体であってもよいが、これに限定されるものではない。
【0025】
具体的には、前記変異体は、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列において、ｉ）５３番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されるか、又はｉｉ）６２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異体であってもよい。前記他のアミノ酸への置換は、ｉ）５３番目のアミノ酸のトレオニンへの置換であってもよく、ｉｉ）６２番目のアミノ酸のセリン、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸、リシン、プロリン、システイン、グリシン、トレオニン、イソロイシン、チロシン、バリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸又はトリプトファンから選択されるアミノ酸への置換であってもよい。より具体的には、前記変異体は、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列において、ｉ）５３番目のアミノ酸がトレオニンに置換された変異体であってもよく、ｉｉ）６２番目のアミノ酸がセリン、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸、リシン、プロリン、システイン、グリシン、トレオニン、イソロイシン、チロシン、バリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸又はトリプトファンから選択されるアミノ酸に置換された変異体であってもよい。
【0026】
本出願が提供するＬ－トレオニン排出タンパク質の変異体とは、前述したＬ－トレオニン排出能を有するタンパク質の特異的位置のアミノ酸が置換され、Ｌ－トレオニン排出能が変異前のタンパク質に比べて向上した変異体を意味してもよい。
【0027】
配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列において、ｉ）５３番目のアミノ酸がトレオニンに置換されるか、又はｉｉ）６２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異体は、配列番号９３～１１２、１１４及び１１６のいずれかのアミノ酸配列を含むものであってもよく、具体的には配列番号９３～１１２、１１４及び１１６のいずれかのアミノ酸配列から必須に構成される（consisting essentially of）ものであってもよく、より具体的には配列番号９３～１１２、１１４及び１１６のいずれかのアミノ酸配列からなるものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0028】
前記変異体は、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５の５３番目又は６２番目に相当する位置に他のアミノ酸への置換を含み、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上、１００％未満の配列相同性を有し、Ｌ－トレオニン排出活性を有するものであってもよい。
【0029】
また、前記変異体は、配列番号９３～１１２、１１４及び１１６のいずれかのアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列において、５３番目及び６２番目のアミノ酸から選択される１つ以上のアミノ酸が固定されており、それと８０％以上の相同性もしくは同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよいが、これらに限定されるものではない。具体的には、本出願の変異体には、配列番号９３～１１２、１１４及び１１６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性又は同一性を有するポリペプチドが含まれる。また、そのような相同性又は同一性を有し、前記タンパク質に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、５３番目又は６２番目のアミノ酸位置以外の一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本出願に含まれることは言うまでもない。
【0030】
本出願における「相同性（homology）」又は「同一性（identity）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列又は塩基配列が互いに関連する程度を意味し、百分率で表される。本出願における相同性及び同一性は、しばしば相互交換的に用いられる。
【0031】
保存されている（conserved）ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列相同性又は同一性は標準的な配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（homologous）又は同じ（identical）配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件（stringent conditions）下において、一般に配列全体又は全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上ハイブリダイズする。そのハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドがコドンの代わりに縮退コドンを有するようにするものであってもよい。
【0032】
任意の２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、例えば非特許文献２のようなデフォルトパラメーターと「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。あるいは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献３）（バージョン５．０．０又はそれ以降のバージョン）で行われるように、ニードルマン＝ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献４）を用いて決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（非特許文献５）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（非特許文献６，７，８）を含む）。例えば、国立生物工学情報センターのＢＬＡＳＴ又はＣｌｕｓｔａｌＷを用いて相同性、類似性又は同一性を決定することができる。
【0033】
ポリヌクレオチドの相同性、類似性又は同一性は、例えば非特許文献９に開示されているように、非特許文献４などのＧＡＰコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち短いものにおける記号の総数で、類似する配列記号（すなわち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を割った値と定義している。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメーターは、（１）二進法比較マトリックス（同一性は１、非同一性は０の値をとる）及び非特許文献１０に開示されているように、非特許文献１１の加重比較マトリックス（又はＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）と、（２）各ギャップに３．０のペナルティ、及び各ギャップの各記号に追加の０．１０ペナルティ（又はギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）と、（３）末端ギャップに無ペナルティとを含む。
【0034】
また、任意の２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、定義されたストリンジェントな条件下にてサザンハイブリダイゼーション実験で配列を比較することにより確認することができ、定義される好適なハイブリダイゼーション条件は当該技術の範囲内であり、当業者に周知の方法（例えば、非特許文献１２、１３）で決定される。
【0035】
本出願における「Ｌ－トレオニン排出タンパク質の変異体」とは、Ｌ－トレオニン生産能を有する変異型ポリペプチド、Ｌ－トレオニン生産変異型ポリペプチド、Ｌ－トレオニンを生産する変異型ポリペプチド、Ｌ－トレオニン排出活性を有する変異型ポリペプチド、Ｌ－トレオニン排出活性変異体、Ｌ－トレオニン排出変異体、変異型ＲｈｔＣ、ＲｈｔＣ変異体、変異型Ｌ－トレオニン排出タンパク質などと混用される。また、前記タンパク質は、大腸菌（Escherichia coli, E.coli）由来のものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0036】
前記Ｌ－トレオニン排出タンパク質の変異体は、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列において５３番目及び／又は６２番目の位置に変異を含んでもよく、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５にアミノ酸が付加、欠失したアミノ酸配列であっても、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のＮ末端から５３番目及び／又は６２番目のアミノ酸に相当する位置のアミノ酸が置換された変異体であれば本出願に含まれる。前記Ｌ－トレオニン排出タンパク質の変異体は、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列において５３番目又は６２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものであって、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列を含むタンパク質や野生型微生物由来の変異前のＬ－トレオニン排出タンパク質に比べて、強化された活性を有する変異型Ｌ－トレオニン排出タンパク質であってもよい。このようなＬ－トレオニン排出タンパク質の変異体とは、前述した配列番号１、配列番号１１３もしくは配列番号１１５、及び／又は配列番号１、配列番号１１３もしくは配列番号１１５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の相同性もしくは同一性を有するアミノ酸において、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５の５３番目又は６２番目に相当する位置のアミノ酸が変異したものを意味する。
【0037】
前記５３番目又は６２番目のアミノ酸変異は、ｉ）５３番目のアミノ酸のトレオニンへの置換であってもよく、ｉｉ）６２番目のアミノ酸のセリン、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸、リシン、プロリン、システイン、グリシン、トレオニン、イソロイシン、チロシン、バリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸又はトリプトファンから選択されるアミノ酸への置換であってもよい。
【0038】
具体的には、前記Ｌ－トレオニン排出タンパク質の変異体は、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列において、ｉ）５３番目のアミノ酸がトレオニンに置換されたものであってもよく、ｉｉ）６２番目のアミノ酸がセリン、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸、リシン、プロリン、システイン、グリシン、トレオニン、イソロイシン、チロシン、バリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸又はトリプトファンから選択されるアミノ酸に置換されたものであってもよく、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列を含むタンパク質や野生型微生物由来の変異前のＬ－トレオニン排出タンパク質に比べて、強化された活性を有するものであってもよい。
【0039】
本出願の目的上、前記Ｌ－トレオニン排出タンパク質の変異体を含む微生物は、Ｌ－トレオニン生産量が増加することを特徴とする。これは、野生型微生物がＬ－トレオニンを生産できないか、Ｌ－トレオニンを生産したとしても極微量しか生産できないのに対して、本出願のＬ－トレオニン排出タンパク質の変異体によりＬ－トレオニン生産量を増加させることができるということに意義がある。
【0040】
本出願の他の態様は、前記Ｌ－トレオニン排出タンパク質の変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。
前記Ｌ－トレオニン、配列番号１のアミノ酸配列を含むＬ－トレオニン排出活性を有するタンパク質及びその変異体については前述した通りである。
前記Ｌ－トレオニン、配列番号１のアミノ酸配列を含むＬ－トレオニン排出活性を有するタンパク質及びその変異体については前述した通りである。
【0041】
本出願における「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単量体（monomer）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（polymer）であって、所定の長さより長いＤＮＡ又はＲＮＡ鎖であり、より具体的には前記変異体をコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
【0042】
本出願のＬ－トレオニン排出タンパク質の変異体をコードするポリヌクレオチドは、本出願のＬ－トレオニン排出活性を有する変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であればいかなるものでもよい。本出願において、Ｌ－トレオニン排出タンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子はｒｈｔＣ遺伝子であり、前記遺伝子は大腸菌（Escherichia coli, E. coli）、シゲラ・フレクスネリ（Shigella flexneri）又はエシェリキア・フェルグソニイ（Escherichia fergusonii）由来のものであってもよいが、これらに限定されるものではない。また、前記遺伝子は、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、より具体的には配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号２の塩基配列を含む配列であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0043】
具体的には、本出願のポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により、又は前記ポリペプチドを発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮して、ポリペプチドのアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。具体的には、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列において５３番目又は６２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたＬ－トレオニン排出タンパク質の変異体をコードするポリヌクレオチド配列であればいかなるものでもよい。
【0044】
また、公知の遺伝子配列から製造されるプローブ、例えば前記塩基配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることにより、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列において５３番目又は６２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたＬ－トレオニン排出活性を有するタンパク質をコードする配列であればいかなるものでもよい。前記「ストリンジェントな条件（stringent condition）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（非特許文献１４参照）に具体的に記載されている。例えば、相同性又は同一性の高い遺伝子同士、４０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９７％以上、特に具体的には９９％以上の相同性又は同一性を有する遺伝子同士をハイブリダイズし、それより相同性又は同一性の低い遺伝子同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーション（southern hybridization）の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件が挙げられる。
【0045】
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションの厳格さに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、ＤＮＡにおいて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本出願には、実質的に類似する核酸配列だけでなく、全配列に相補的な単離された核酸フラグメントが含まれてもよい。
【0046】
具体的には、相同性又は同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節される。
【0047】
ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切な厳格さはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である（例えば、非特許文献１４）。
本出願のさらに他の態様は、前記Ｌ－トレオニン排出タンパク質の変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本出願のさらに他の態様は、前記Ｌ－トレオニン排出タンパク質の変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【0048】
前記Ｌ－トレオニン、配列番号１のアミノ酸配列を含むＬ－トレオニン排出活性を有するタンパク質及びその変異体については前述した通りである。
本出願における「ベクター」とは、好適な宿主内で標的ポリペプチドを発現させることができるように、好適な調節配列に作動可能に連結された前記標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記調節配列には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。ベクターは、好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれてもよい。
本出願における「ベクター」とは、好適な宿主内で標的ポリペプチドを発現させることができるように、好適な調節配列に作動可能に連結された前記標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記調節配列には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。ベクターは、好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれてもよい。
【0049】
本出願に用いられるベクターは、特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターが用いられる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。
【0050】
例えば、細胞内染色体導入用ベクターにより、染色体内で標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換え（homologous recombination）により行うことができるが、これに限定されるものではない。前記染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち標的核酸分子が挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、表面ポリペプチドの発現などの選択可能表現型を付与するマーカーが用いられる。選択剤（selective agent）で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。
【0051】
本出願のさらに他の態様は、前記Ｌ－トレオニン排出タンパク質の変異体を含むか、それをコードするポリヌクレオチドを含み、Ｌ－トレオニンを生産する微生物を提供する。
本出願における「変異型ポリペプチドを含む微生物」又は「Ｌ－トレオニン排出タンパク質の変異体を含む微生物」とは、自然に弱いＬ－トレオニン生産能を有する微生物、又はＬ－トレオニン生産能のない親株にＬ－トレオニン生産能が付与された微生物を意味する。具体的には、前記微生物は、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列に少なくとも１つのアミノ酸変異を含むＬ－トレオニン排出タンパク質の変異体を発現する微生物であり、前記アミノ酸変異は、Ｎ末端から５３番目又は６２番目のアミノ酸の他のアミノ酸への置換を含むものであってもよい。また、前記微生物は、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列において５３番目又は６２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、Ｌ－トレオニン排出活性を有する、変異型ポリペプチドを発現する微生物であってもよいが、これらに限定されるものではない。
本出願における「変異型ポリペプチドを含む微生物」又は「Ｌ－トレオニン排出タンパク質の変異体を含む微生物」とは、自然に弱いＬ－トレオニン生産能を有する微生物、又はＬ－トレオニン生産能のない親株にＬ－トレオニン生産能が付与された微生物を意味する。具体的には、前記微生物は、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列に少なくとも１つのアミノ酸変異を含むＬ－トレオニン排出タンパク質の変異体を発現する微生物であり、前記アミノ酸変異は、Ｎ末端から５３番目又は６２番目のアミノ酸の他のアミノ酸への置換を含むものであってもよい。また、前記微生物は、配列番号１、配列番号１１３又は配列番号１１５のアミノ酸配列において５３番目又は６２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、Ｌ－トレオニン排出活性を有する、変異型ポリペプチドを発現する微生物であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0052】
前記Ｌ－トレオニン、配列番号１のアミノ酸配列を含むＬ－トレオニン排出活性を有するタンパク質及びその変異体については前述した通りである。
本出願における、タンパク質が「発現するように／する」とは、標的タンパク質が微生物内に導入されるか、微生物内で発現するように改変された状態を意味する。前記標的タンパク質が微生物内に存在するタンパク質の場合、内在性活性又は改変前の活性に比べて活性が強化された状態を意味する。本出願の目的上、「標的タンパク質」は、前述したＬ－トレオニン排出能を有するタンパク質の変異体であってもよい。
本出願における、タンパク質が「発現するように／する」とは、標的タンパク質が微生物内に導入されるか、微生物内で発現するように改変された状態を意味する。前記標的タンパク質が微生物内に存在するタンパク質の場合、内在性活性又は改変前の活性に比べて活性が強化された状態を意味する。本出願の目的上、「標的タンパク質」は、前述したＬ－トレオニン排出能を有するタンパク質の変異体であってもよい。
【0053】
具体的には、「タンパク質の導入」とは、微生物が本来持っていなかった特定タンパク質の活性が現れるようにすること、又は当該タンパク質の内在性活性もしくは改変前の活性に比べて向上した活性が現れるようにすることを意味する。例えば、特定タンパク質をコードするポリヌクレオチドが微生物内の染色体に導入されることや、特定タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが微生物内に導入されてその活性が現れることであってもよい。また、「活性の強化」とは、微生物が有する特定タンパク質の内在性活性又は改変前の活性に比べて活性が向上することを意味する。「内在性活性」とは、自然要因又は人為的要因により遺伝的に変異して微生物の形質が変化する場合に、形質変化の前に親株が本来有していた特定タンパク質の活性を意味する。
【0054】
具体的には、本出願の活性強化は、前記タンパク質変異体をコードする遺伝子の細胞内のコピー数を増加する方法、前記タンパク質変異体をコードする遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法、前記Ｌ－トレオニン排出活性を有するタンパク質変異体をコードする遺伝子発現調節配列を活性が強力な配列に置換する方法、染色体上のＬ－トレオニン排出活性を有する天然タンパク質をコードする遺伝子を前記タンパク質変異体をコードする遺伝子に代替する方法、前記タンパク質変異体の活性が強化されるように前記Ｌ－トレオニン排出活性を有するタンパク質をコードする遺伝子に変異をさらに導入する方法、及び微生物にタンパク質変異体を導入する方法からなる群から選択される少なくとも１つの方法で行われるが、これらに限定されるものではない。
【0055】
前記遺伝子のコピー数を増加する方法は、特にこれらに限定されるものではないが、ベクターに作動可能に連結された形態で行われるか、宿主細胞内の染色体内に挿入されることにより行われてもよい。具体的には、本出願のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主に関係なく複製されて機能するベクターが宿主細胞内に導入されることにより行われる。あるいは、前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主細胞内の染色体に前記ポリヌクレオチドを挿入することのできるベクターが宿主細胞の染色体内に導入されることにより行われる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換えにより行うことができる。
【0056】
次に、ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列を改変する方法は、特にこれらに限定されるものではないが、前記発現調節配列の活性がさらに強化されるように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うこともでき、より高い活性を有する核酸配列に置換することにより行うこともできる。前記発現調節配列には、特にこれらに限定されるものではないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節する配列などが含まれる。
【0057】
前記ポリヌクレオチド発現単位の上流には、本来のプロモーターに代えて強力なプロモーターが連結されるが、これに限定されるものではない。公知の強力なプロモーターの例としては、ｃｊ１～ｃｊ７プロモーター（特許文献３）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ＳＰＬ７プロモーター、ＳＰＬ１３（ｓｍ３）プロモーター（特許文献４）、Ｏ２プロモーター（特許文献５）、ｔｋｔプロモーター、ｙｃｃＡプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0058】
また、染色体上のポリヌクレオチド配列を改変する方法は、特にこれらに限定されるものではないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性がさらに強化されるように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うこともでき、より高い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に置換することにより行うこともできる。
【0059】
このようなタンパク質活性の導入及び強化とは、対応するタンパク質の活性又は濃度が野生型や非改変の微生物菌株におけるタンパク質の活性又は濃度に比べて、一般に少なくとも１％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％又は５００％、最大で１０００％又は２０００％まで増加することを意味するが、これらに限定されるものではない。
【0060】
本出願における「非改変微生物」とは、微生物に自然に発生し得る突然変異を含む菌株を除外するものではなく、天然菌株自体、前記Ｌ－トレオニン排出タンパク質の変異体を含まない微生物、又は前記Ｌ－トレオニン排出タンパク質の変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されていない微生物を意味する。
【0061】
本出願における、前記Ｌ－トレオニン排出タンパク質の変異体又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む微生物は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターでの形質転換により作製される組換え微生物であってもよいが、これに限定されるものではない。
【0062】
本出願における「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、それらが全て含まれるものである。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡやＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0063】
また、前記「作動可能に連結」されたものとは、本出願の標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されたものを意味する。
【0064】
本出願における「Ｌ－トレオニンを生産する微生物」とは、自然に又は人為的に遺伝的改変が行われた微生物が全て含まれるものであり、外部遺伝子が挿入されるか、内在性遺伝子の活性が強化又は不活性化されるなどの原因により、特定機序が弱化又は強化された微生物であって、目的とするＬ－トレオニン生産のために遺伝的変異を起こすか、活性を強化した微生物であってもよい。本出願の目的上、前記Ｌ－トレオニンを生産する微生物は、前記Ｌ－トレオニン排出タンパク質の変異体を含み、培地中の炭素源から目的とするＬ－トレオニンを野生型や非改変微生物と比較して過剰量で生産する微生物を意味する。本出願における前記「Ｌ－トレオニンを生産する微生物」は、「Ｌ－トレオニン生産能を有する微生物」又は「Ｌ－トレオニン生産微生物」と混用される。
【0065】
前記Ｌ－トレオニンを生産する微生物は、組換え微生物であってもよい。前記組換え微生物については前述した通りである。
前記Ｌ－トレオニンを生産する微生物は、Ｌ－トレオニンを生産するものであればその種類が特に限定されるものではなく、具体的には、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、エシェリキア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterbacter）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、プロビデンシア（Providencia）属及びブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物であってもよく、より具体的には、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属又はエシェリキア（Escherichia）属に属する微生物である。
前記Ｌ－トレオニンを生産する微生物は、Ｌ－トレオニンを生産するものであればその種類が特に限定されるものではなく、具体的には、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、エシェリキア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterbacter）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、プロビデンシア（Providencia）属及びブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物であってもよく、より具体的には、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属又はエシェリキア（Escherichia）属に属する微生物である。
【0066】
さらに具体的には、エシェリキア属（Escherichia）微生物は、大腸菌（Escherichia coli）であってもよく、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Corynebacterium crudilactis）、コリネバクテリウム・デセルティ（Corynebacterium deserti）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）、コリネバクテリウム・シングラレ（Corynebacterium singulare）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Corynebacterium halotolerans）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Corynebacterium striatum）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Corynebacterium pollutisoli）、コリネバクテリウム・イミタンス（Corynebacterium imitans）、コリネバクテリウムテス・テスツディノリス（Corynebacterium testudinoris）、コリネバクテリウム・フラベッセンス（Corynebacterium flavescens）などであり、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）であるが、Ｌ－トレオニン排出活性を有するタンパク質が導入又は強化されてＬ－トレオニン生産量を増加させる、コリネバクテリウム属又はエシェリキア属に属する微生物であればいかなるものでもよい。
【0067】
本出願において、前記Ｌ－トレオニン排出活性を有するタンパク質又は前記タンパク質変異体が発現するように改変された、Ｌ－トレオニンを生産する微生物の親株は、Ｌ－トレオニンを生産する微生物であれば特に限定されるものではない。前記Ｌ－トレオニンを生産する微生物は、Ｌ－トレオニンの生産量を増加させるために、Ｌ－トレオニンの生合成経路を強化した微生物、Ｌ－トレオニンに対するフィードバック阻害を解除した微生物、Ｌ－トレオニンの生合成経路を弱化させる遺伝子を不活性化した微生物、Ｌ－トレオニンオペロンの活性を増加させた微生物、及び／又はＬ－トレオニンアナログに対する耐性を付与した微生物であってもよい。
【0068】
具体的には、前記Ｌ－トレオニンの生合成経路を強化するために、例えばトレオニン合成酵素をコードするｔｈｒＣ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするｐｐｃ遺伝子、グルコース取り込みに関与するｇａｌＰ遺伝子、リシン感受性アスパルトキナーゼ３（lysine-sensitive aspartokinase 3）をコードするｌｙｓＣ遺伝子、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（homoserine dehydrogenase）をコードするｈｏｍ遺伝子、オキサロ酢酸（Oxaloacetate）ｐｏｏｌ増加を誘導するｐｙｃ遺伝子などの発現を微生物中で強化又は増加させてもよい。
【0069】
前記Ｌ－トレオニンに対するフィードバック阻害を解除するために、例えばｌｙｓＣ遺伝子、ｈｏｍ遺伝子、アスパルトキナーゼとホモセリンデヒドロゲナーゼ１の二官能性を有する（Bifunctional aspartokinase/homoserine dehydrogenase 1）ｔｈｒＡ遺伝子などの遺伝子変異を微生物内に導入してもよい。
【0070】
前記Ｌ－トレオニンの生合成経路を弱化させる遺伝子を不活性化するために、例えばＬ－トレオニン生合成の中間体であるオキサロ酢酸（ＯＡＡ）のホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）への変換に関与するｐｃｋＡ遺伝子、ｌｙｓＣ遺伝子を抑制するｔｙｒＲ遺伝子、グルコース取り込みに関与するｇａｌＰ遺伝子の発現を抑制するｇａｌＲ遺伝子、ＤＮＡ－結合転写二重調節因子（DNA-binding transcriptional dual regulator）であるｍｃｂＲ遺伝子などの発現を微生物中で弱化又は不活性化させてもよい。
【0071】
前記Ｌ－トレオニンオペロンの活性を増加させるために、アスパルトキナーゼ（aspartokinase）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（homoserine dehydrogenase）、ホモセリンキナーゼ（homoserine kinase）及びトレオニンシンターゼ（threonine synthase）をコードする遺伝子から構成されるトレオニンオペロン（特許文献６）を含むプラスミド、大腸菌由来のトレオニンオペロンなどを微生物に導入し（非特許文献１５）、微生物中でトレオニンオペロン発現を増加させてもよい。
【0072】
また、前記微生物は、Ｌ－トレオニンアナログであるα－アミノ－β－ヒドロキシ吉草酸、Ｄ，Ｌ－トレオニンヒドロキサメートなどに対する耐性を有するものであってもよい。
【0073】
しかし、これらに限定されるものではなく、当該技術分野で公知の遺伝子発現調節方法によりＬ－トレオニン生産能を強化することができる。
本出願における「強化／増加」は、内在性活性に比べて活性が増加することが全て含まれる概念である。
本出願における「強化／増加」は、内在性活性に比べて活性が増加することが全て含まれる概念である。
【0074】
このような遺伝子の活性の強化又は増加は、当該分野で周知の様々な方法を適用することにより達成することができる。前記方法の例として、遺伝子の細胞内コピー数を増加させる方法、遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法、遺伝子の発現調節配列を活性が強力な配列に置換する方法、遺伝子の活性が強化されるように当該遺伝子に変異をさらに導入する方法、及び微生物に外来遺伝子を導入する方法からなる群から選択される少なくとも１つの方法が挙げられ、それらの組み合わせによっても達成することができるが、前記例に特に限定されるものではない。
【0075】
本出願における「不活性化」は、内在性活性に比べて活性が弱化することや、活性がなくなることが全て含まれる概念である。
このような遺伝子の活性の不活性化は、当該分野で周知の様々な方法を適用することにより達成することができる。前記方法の例として、前記遺伝子の活性を除去する場合をはじめとして、染色体上の遺伝子の全部又は一部を欠失させる方法、当該タンパク質の活性が低下するように突然変異させた遺伝子により染色体上の前記タンパク質をコードする遺伝子を代替する方法、前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法、前記タンパク質をコードする遺伝子の発現調節配列を活性が弱い配列や活性のない配列に置換する方法（例えば、前記遺伝子のプロモーターを内在性プロモーターより弱いプロモーターに置換する方法）、前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の全部又は一部を欠失させる方法、前記染色体上の遺伝子の転写産物に相補的に結合させて前記ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入する方法、前記タンパク質をコードする遺伝子のＳＤ配列の前にＳＤ配列と相補的な配列を人為的に付加することにより２次構造物を形成させてリボソーム（ribosome）の付着を不可能にする方法、当該配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写するようにプロモーターを付加するＲＴＥ（Reverse transcription engineering）方法などが挙げられ、それらの組み合わせによっても達成することができるが、前記例に特に限定されるものではない。
このような遺伝子の活性の不活性化は、当該分野で周知の様々な方法を適用することにより達成することができる。前記方法の例として、前記遺伝子の活性を除去する場合をはじめとして、染色体上の遺伝子の全部又は一部を欠失させる方法、当該タンパク質の活性が低下するように突然変異させた遺伝子により染色体上の前記タンパク質をコードする遺伝子を代替する方法、前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法、前記タンパク質をコードする遺伝子の発現調節配列を活性が弱い配列や活性のない配列に置換する方法（例えば、前記遺伝子のプロモーターを内在性プロモーターより弱いプロモーターに置換する方法）、前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の全部又は一部を欠失させる方法、前記染色体上の遺伝子の転写産物に相補的に結合させて前記ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入する方法、前記タンパク質をコードする遺伝子のＳＤ配列の前にＳＤ配列と相補的な配列を人為的に付加することにより２次構造物を形成させてリボソーム（ribosome）の付着を不可能にする方法、当該配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写するようにプロモーターを付加するＲＴＥ（Reverse transcription engineering）方法などが挙げられ、それらの組み合わせによっても達成することができるが、前記例に特に限定されるものではない。
【0076】
本出願のさらに他の態様は、前記Ｌ－トレオニンを生産する微生物を培地で培養するステップを含むＬ－トレオニン生産方法を提供する。
前記Ｌ－トレオニン、配列番号１のアミノ酸配列を含むＬ－トレオニン排出活性を有するタンパク質、その変異体、タンパク質の発現、及び微生物については前述した通りである。
前記Ｌ－トレオニン、配列番号１のアミノ酸配列を含むＬ－トレオニン排出活性を有するタンパク質、その変異体、タンパク質の発現、及び微生物については前述した通りである。
【0077】
本出願における「培養」とは、前記微生物を適宜調節した環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当該技術分野で公知の好適な培地と培養条件で行われる。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して用いることができる。具体的には、前記培養は、回分、連続及び流加培養であるが、これらに限定されるものではない。
【0078】
本出願における「培地」とは、前記微生物を培養するために必要な栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水をはじめとする栄養物質や発育因子などを供給する。具体的には、本出願の微生物の培養に用いられる培地及び他の培養条件は、通常の微生物の培養に用いられるものであればいかなるものでもよく、好適な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地中で好気性条件下にて温度、ｐＨなどを調節して本出願の微生物を培養することができる。
【0079】
本出願における前記炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトースなどの炭水化物、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などの有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのアミノ酸などが挙げられる。また、デンプン加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米糠、キャッサバ、バガス、トウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄養源を用いることができ、具体的にはグルコースや殺菌した前処理糖蜜（すなわち、還元糖に変換した糖蜜）などの炭水化物を用いることができ、その他適量の炭素源であればいかなるものでも用いることができる。これらの炭素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
【0080】
前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源と、グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類又はその分解生成物、脱脂大豆ケーキ又はその分解生成物などの有機窒素源とを用いることができる。これらの窒素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
【0081】
前記リン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム又はそれらに相当するナトリウム含有塩などが挙げられる。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどを用いることができ、それ例外に、アミノ酸、ビタミン及び／又は好適な前駆体などを用いることができる。これらの構成成分又は前駆体は、培地に回分式又は連続式で添加することができる。しかし、これらに限定されるものではない。
【0082】
本出願において、微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を培地に好適な方法で添加することにより、培地のｐＨを調整することができる。また、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。さらに、培地の好気状態を維持するために、培地中に酸素又は酸素含有気体を注入してもよく、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体を注入しなくてもよく、窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入してもよいが、これらに限定されるものではない。
【0083】
培地の温度は、２０℃～５０℃、具体的には３０℃～３７℃であってもよいが、これらに限定されるものではない。培養期間は、有用物質の所望の生成量が得られるまで続けられ、具体的には１０時間～１００時間であってもよいが、これに限定されるものではない。
【0084】
前記培養により生産されたＬ－トレオニンは、培地中に排出されるか、排出されずに細胞内に残留する。
前記Ｌ－トレオニン生産方法は、培養された微生物又は培地からＬ－トレオニンを回収（recover）するステップをさらに含んでもよい。
前記Ｌ－トレオニン生産方法は、培養された微生物又は培地からＬ－トレオニンを回収（recover）するステップをさらに含んでもよい。
【0085】
本出願の前記培養ステップで生産されたＬ－トレオニンを回収する方法は、培養方法に応じて、当該分野で公知の好適な方法を用いて培養液から目的とするＬ－トレオニンを回収（collect）することができる。例えば、遠心分離、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化、ＨＰＬＣなどが用いられ、当該分野で公知の好適な方法を用いて培地又は微生物から目的とするＬ－トレオニンを回収することができる。
【0086】
また、前記回収ステップは、精製工程を含んでもよく、当該分野で公知の好適な方法を用いて行うことができる。よって、前述したように回収されるＬ－トレオニンは、精製された形態であってもよく、Ｌ－トレオニンを含有する微生物発酵液であってもよい（非特許文献１６）。
【実施例】
【0087】
以下、実施例を挙げて本出願をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示するものにすぎず、本出願がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例1】
【0088】
Ｌ－トレオニン排出タンパク質の変異ライブラリー及びプラスミドの作製
エラープローンＰＣＲ（error-prone PCR）に用いる鋳型（template）を作製するために、大腸菌（Escherichia coli）Ｗ３１１０ゲノムＤＮＡから配列番号４３及び４４を用いてＰＣＲを行い、塩基配列断片を確保した。
エラープローンＰＣＲ（error-prone PCR）に用いる鋳型（template）を作製するために、大腸菌（Escherichia coli）Ｗ３１１０ゲノムＤＮＡから配列番号４３及び４４を用いてＰＣＲを行い、塩基配列断片を確保した。
【0089】
配列番号４３（ｒｈｔＣ Ｆ）
ＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＣＴＧＡＴＴＣＧＴＧＣＧＣＡＴＧＴＴＧ
配列番号４４（ｒｈｔＣ Ｒ）
ＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＣＡＣＣＧＣＧＡＡＡＴＡＡＴＣＡＡＡＴ
次に、ＳｍａＩ制限酵素で切断したｐＣＬ１９２０（非特許文献１７）と前述したように得られたＤＮＡ断片をギブソンアセンブリ方法でクローニングすることにより、組換えプラスミドｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣを得た。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。
ＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＣＴＧＡＴＴＣＧＴＧＣＧＣＡＴＧＴＴＧ
配列番号４４（ｒｈｔＣ Ｒ）
ＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＣＡＣＣＧＣＧＡＡＡＴＡＡＴＣＡＡＡＴ
次に、ＳｍａＩ制限酵素で切断したｐＣＬ１９２０（非特許文献１７）と前述したように得られたＤＮＡ断片をギブソンアセンブリ方法でクローニングすることにより、組換えプラスミドｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣを得た。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。
【0090】
Ｌ－トレオニン排出タンパク質をコードする野生型ｒｈｔＣにランダム突然変異（random mutagenesis）誘発システムを適用するためにエラープローンＰＣＲを行い、エラープローンＰＣＲを行う際にｄｉｖｅｒｓｉｆｙＰＣＲランダム突然変異キット（diversify PCR random mutagenesis kit, Takara）を用いた。変異率（mutation rate）の条件選定のために、ＭｎＳＯ４濃度を変えた次の２つの条件でエラープローンＰＣＲを行った。変異を導入するＤＮＡの鋳型として、前述したｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣを用いた。エラープローンＰＣＲを行うための組成物の組成を表１に示す。条件は、９５℃で３０秒間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、６８℃で３０秒間の重合を２５サイクル行い、次いで６８℃で６０秒間の重合反応を行うものとした。プライマーとして配列番号４３及び４４を用いた。
【0091】
【表1】
【0092】
表１の条件で行ったエラープローンＰＣＲ産物をＤｐｎＩで処理して鋳型プラスミドを除去したＤＮＡとＳｍａＩ制限酵素で切断したｐＣＬ１９２０により、ギブソンアセンブリ方法を用いて組換え変異プラスミドライブラリーを得た。前記方法で得た変異ライブラリー（mutant library）ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣとｐＣＬ１９２０を大腸菌（Escherichia coli)Ｋ１２細胞に形質転換し、５０ｕｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ平板培地にプレーティングした。変異ライブラリーを形質転換したＫ１２から５０個のコロニーを選択し、変異率（mutation rate）及び様々な位置における変異発生の有無を判断するためにシーケンシング（sequencing）を行った。シーケンシングの結果、ｃａｓｅ＃１の条件の変異率は１．２ｋｂ－１であり、ｃａｓｅ＃２の条件では２．０ｋｂ－１であった。ｃａｓｅ＃１、＃２はどちらも変異ライブラリー（mutant library）の確保に適した変異率を有すると判断し、前記条件で作製したライブラリーを用いて有効変異選択作業を行った。Ｌ－トレオニン（L-Threonine）を６０ｇ／Ｌで含むＭ９最小培地（minimal media）を９６ディープウェルプレート（deep-well plate）に３００ｕｌずつ分注し、その後前述したように形質転換したＫ１２／ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ、Ｋ１２／ｐＣＬ１９２０、Ｋ１２／変異ライブラリーコロニーを接種した。次に、１２００ｒｐｍ／１５ｈｒ／３７℃の条件で培養し、その後６００ｎｍの波長でＯＤを測定した。野生型大腸菌Ｋ１２菌株は一般にＭ９培地でＬ－トレオニンＭＩＣ（Minimal Inhibition Concentration）濃度である３０ｇ／Ｌ前後で成長阻害を示すので、画期的にトレオニン排出能が改善された菌株であれば６０ｇ／ＬのＬ－トレオニン濃度で成長するものと判断した。ほとんどの変異菌株ライブラリーは、ディープウェルプレートにおいて、コントロール菌株（Ｋ１２／ｐＣＬ１９２０，Ｋ１２／ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ）と同様に、成長がほとんど観察されなかった。それとは対照的に成長が観察された４種の菌株を選択し、ＯＤを記録した。
【0093】
【表2】
【0094】
前述したように選択した４種の変異菌株からｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ変異型プラスミドを抽出し、その後変異の確認のためにシーケンシングを行った。その結果、プロモーター領域でないコード配列（ＣＤＳ）において変異が発生することが確認された。また、表２に示す変異型プラスミドを、上から順にｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ（ｍ１）、ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ（ｍ２）、ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ（ｍ３）、ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ（ｍ４）と命名した。
【0095】
コリネ菌株における変異型ｒｈｔＣの活性を比較評価するために、挿入用プラスミドを次の方法で作製した。
相同組換えのために、Ｎｃｇｌ２５３３の上流及び下流領域をそれぞれ配列番号４５及び４６と配列番号５１及び５２に増幅した。次に、ｇａｐＡプロモーターを変異型ｒｈｔＣのプロモーターとして活用するために、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号４７及び４８のプライマーを用いてＰＣＲを行った。次に、表２で選択した変異型ｒｈｔＣの断片を確保するために、配列番号４９及び５０のプライマーを用いて、それぞれのｒｈｔＣ、ｒｈｔＣ（ｍ１）、ｒｈｔＣ（ｍ２）、ｒｈｔＣ（ｍ３）、ｒｈｔＣ（ｍ４）断片を得た。
相同組換えのために、Ｎｃｇｌ２５３３の上流及び下流領域をそれぞれ配列番号４５及び４６と配列番号５１及び５２に増幅した。次に、ｇａｐＡプロモーターを変異型ｒｈｔＣのプロモーターとして活用するために、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号４７及び４８のプライマーを用いてＰＣＲを行った。次に、表２で選択した変異型ｒｈｔＣの断片を確保するために、配列番号４９及び５０のプライマーを用いて、それぞれのｒｈｔＣ、ｒｈｔＣ（ｍ１）、ｒｈｔＣ（ｍ２）、ｒｈｔＣ（ｍ３）、ｒｈｔＣ（ｍ４）断片を得た。
【0096】
配列番号４５（Ｎｃｇｌ２５３３ ｕｐ Ｆ）
ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＡＧＣＡＡＧＡＴＣＴＡＧＴＣＡＴＣＡＡ
配列番号４６（Ｎｃｇｌ２５３３ ｕｐ Ｒ）
ＧＴＣＧＴＴＴＴＴＡＧＧＣＴＴＣＣＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＴＴＴＴＧＣＡ
配列番号４７（ＰｇａｐＡ Ｆ）
ＡＡＴＧＴＴＴＴＣＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣＣＴＡＡＡＡＡＣＧＡＣＣＧＡＧＣ
配列番号４８（ＰｇａｐＡ Ｒ）
ＡＡＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＣＴＡＡＡＧＡＴ
配列番号４９（ｒｈｔＣ＿ｍ Ｆ）
ＴＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＧＴＴＧＡＴＧＴＴＡＴＴＴＣＴＣＡＣ
配列番号５０（ｒｈｔＣ＿ｍ Ｒ）
ＴＡＡＧＣＡＧＧＴＴＧＡＴＴＴＴＣＡＣＣＧＣＧＡＡＡＴＡＡＴＣＡＡＡＴ
配列番号５１（Ｎｃｇｌ２５３３ ｄｎ Ｆ）
ＡＴＴＡＴＴＴＣＧＣＧＧＴＧＡＡＡＡＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＴＡＧＧＣＧＴ
配列番号５２（Ｎｃｇｌ２５３３ ｄｎ Ｒ）
ＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＴＡＴＡＧＣＴＡＣＣＡＴＣＴＧＧＧＴＧＧ
前記過程で得られたＰＣＲ断片とＳｍａＩ制限酵素で切断した染色体形質転換用ベクターｐＤＺをギブソンアセンブリ方法でクローニングすることにより、野生型及び変異型ｒｈｔＣ組換えプラスミド５種を得た。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。作製したプラスミドをそれぞれｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ（ｍ１）、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ（ｍ２）、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ（ｍ３）、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ（ｍ４）と命名した。
ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＡＧＣＡＡＧＡＴＣＴＡＧＴＣＡＴＣＡＡ
配列番号４６（Ｎｃｇｌ２５３３ ｕｐ Ｒ）
ＧＴＣＧＴＴＴＴＴＡＧＧＣＴＴＣＣＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＴＴＴＴＧＣＡ
配列番号４７（ＰｇａｐＡ Ｆ）
ＡＡＴＧＴＴＴＴＣＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣＣＴＡＡＡＡＡＣＧＡＣＣＧＡＧＣ
配列番号４８（ＰｇａｐＡ Ｒ）
ＡＡＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＣＴＡＡＡＧＡＴ
配列番号４９（ｒｈｔＣ＿ｍ Ｆ）
ＴＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＧＴＴＧＡＴＧＴＴＡＴＴＴＣＴＣＡＣ
配列番号５０（ｒｈｔＣ＿ｍ Ｒ）
ＴＡＡＧＣＡＧＧＴＴＧＡＴＴＴＴＣＡＣＣＧＣＧＡＡＡＴＡＡＴＣＡＡＡＴ
配列番号５１（Ｎｃｇｌ２５３３ ｄｎ Ｆ）
ＡＴＴＡＴＴＴＣＧＣＧＧＴＧＡＡＡＡＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＴＡＧＧＣＧＴ
配列番号５２（Ｎｃｇｌ２５３３ ｄｎ Ｒ）
ＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＴＡＴＡＧＣＴＡＣＣＡＴＣＴＧＧＧＴＧＧ
前記過程で得られたＰＣＲ断片とＳｍａＩ制限酵素で切断した染色体形質転換用ベクターｐＤＺをギブソンアセンブリ方法でクローニングすることにより、野生型及び変異型ｒｈｔＣ組換えプラスミド５種を得た。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。作製したプラスミドをそれぞれｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ（ｍ１）、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ（ｍ２）、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ（ｍ３）、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ（ｍ４）と命名した。
【実施例2】
【0097】
Ｌ－トレオニン生産菌株の作製
２－１：変異型リシン感受性アスパルトキナーゼ３（ＬｙｓＣ）形質転換
リシン感受性アスパルトキナーゼ３（lysine-sensitive aspartokinase 3）のｌｙｓＣ遺伝子の発現強化と、Ｌ－リシン（L-Lysine）及びＬ－トレオニン（L-Threonine）に対するフィードバック阻害解除のための変異（Ｌ３７７Ｋ）形質（特許文献７）の導入を試みた。具体的には、染色体上の相同組換え（Homologous recombination）が発生するｌｙｓＣプロモーターの上流（Upstream）領域とｌｙｓＣの３７７番目の変異の下流（Downstream）領域を得て、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２のｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３及び４のプライマーを用いてｌｙｓＣプロモーターの上流（Upstream）領域の遺伝子断片をＰＣＲにより得て、配列番号９及び１０のプライマーを用いてｌｙｓＣの３７７番目の変異の下流（Downstream）領域の遺伝子断片をＰＣＲにより得た。
２－１：変異型リシン感受性アスパルトキナーゼ３（ＬｙｓＣ）形質転換
リシン感受性アスパルトキナーゼ３（lysine-sensitive aspartokinase 3）のｌｙｓＣ遺伝子の発現強化と、Ｌ－リシン（L-Lysine）及びＬ－トレオニン（L-Threonine）に対するフィードバック阻害解除のための変異（Ｌ３７７Ｋ）形質（特許文献７）の導入を試みた。具体的には、染色体上の相同組換え（Homologous recombination）が発生するｌｙｓＣプロモーターの上流（Upstream）領域とｌｙｓＣの３７７番目の変異の下流（Downstream）領域を得て、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２のｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３及び４のプライマーを用いてｌｙｓＣプロモーターの上流（Upstream）領域の遺伝子断片をＰＣＲにより得て、配列番号９及び１０のプライマーを用いてｌｙｓＣの３７７番目の変異の下流（Downstream）領域の遺伝子断片をＰＣＲにより得た。
【0098】
配列番号３（ｌｙｓＣ ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｕｐ１）
ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＡＣＡＡＧＣＡＣＴＧＧＴＴＧ
配列番号４（ｌｙｓＣ ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｕｐ２）
ＡＧＴＡＧＣＧＣＴＧＧＧＡＴＧＴＴＴＣＴＣＴＴＴＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＣ
配列番号９（ｌｙｓＣ Ｄｏｗｎ １）
ＧＡＡＣＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＴＴＴＣＣＡＣＣＴＣＴＧＡＧＡＴ
配列番号１０（ｌｙｓＣ Ｄｏｗｎ ２）
ＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＴＴＣＡＣＣＴＣＡＧＡＧＡＣＧＡＴＴＡ
次に、ｐＥＣＣＧ１１７－Ｐｃｊ７－ＧＦＰ（特許文献３）プラスミドを鋳型とし、配列番号５及び６のプライマーを用いて、Ｐｃｊ７プロモーター断片をＰＣＲにより得た。
ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＡＣＡＡＧＣＡＣＴＧＧＴＴＧ
配列番号４（ｌｙｓＣ ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｕｐ２）
ＡＧＴＡＧＣＧＣＴＧＧＧＡＴＧＴＴＴＣＴＣＴＴＴＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＣ
配列番号９（ｌｙｓＣ Ｄｏｗｎ １）
ＧＡＡＣＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＴＴＴＣＣＡＣＣＴＣＴＧＡＧＡＴ
配列番号１０（ｌｙｓＣ Ｄｏｗｎ ２）
ＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＴＴＣＡＣＣＴＣＡＧＡＧＡＣＧＡＴＴＡ
次に、ｐＥＣＣＧ１１７－Ｐｃｊ７－ＧＦＰ（特許文献３）プラスミドを鋳型とし、配列番号５及び６のプライマーを用いて、Ｐｃｊ７プロモーター断片をＰＣＲにより得た。
【0099】
配列番号５（Ｐｃｊ７ １）
ＧＡＡＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＡＧＡＧＡＡＡＣＡＴＣＣＣＡＧＣＧＣＴＡＣＴ
配列番号６（Ｐｃｊ７ ２）
ＴＡＣＧＡＣＣＡＧＧＧＣＣＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＣＣＴＴＴＣＧＴＴＧＧＧ
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号７及び８のプライマーを用いて、ｌｙｓＣ Ｌ３７７Ｋ変異の上流領域の遺伝子断片をＰＣＲにより得た。
ＧＡＡＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＡＧＡＧＡＡＡＣＡＴＣＣＣＡＧＣＧＣＴＡＣＴ
配列番号６（Ｐｃｊ７ ２）
ＴＡＣＧＡＣＣＡＧＧＧＣＣＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＣＣＴＴＴＣＧＴＴＧＧＧ
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号７及び８のプライマーを用いて、ｌｙｓＣ Ｌ３７７Ｋ変異の上流領域の遺伝子断片をＰＣＲにより得た。
【0100】
配列番号７（ｌｙｓＣ １）
ＣＧＡＡＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＣＡＴＧＧＣＣＣＴＧＧＴＣＧＴＡＣＡＧＡＡ
配列番号８（ｌｙｓＣ ２）
ＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＴＴＴＴＣＧＡＴＧＴＴＣＡＣＧＴＴＧＡＣ
前記ＰＣＲ反応は、ポリメラーゼとしてＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用いた。条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
ＣＧＡＡＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＣＡＴＧＧＣＣＣＴＧＧＴＣＧＴＡＣＡＧＡＡ
配列番号８（ｌｙｓＣ ２）
ＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＴＴＴＴＣＧＡＴＧＴＴＣＡＣＧＴＴＧＡＣ
前記ＰＣＲ反応は、ポリメラーゼとしてＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用いた。条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
【0101】
前記過程で得られた４種のＰＣＲ断片とＳｍａＩ制限酵素で切断した染色体形質転換用ベクターｐＤＺ（特許文献８）をギブソンアセンブリ（非特許文献１８）方法でクローニングすることにより、組換えプラスミドを得て、ｐＤＺ－Ｐｃｊ７＿ｌｙｓＣＬ３７７Ｋと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。
【0102】
作製したｐＤＺ－Ｐｃｊ７＿ｌｙｓＣ Ｌ３７７Ｋベクターを野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２菌株にエレクトロポレーション（非特許文献１９）で形質転換し、その後２次交差過程を経て、染色体上で野生型ｌｙｓＣ遺伝子が変異型Ｐｃｊ７＿ｌｙｓＣＬ３７７Ｋ遺伝子に置換された菌株を得た。当該遺伝子が挿入された相同組換え上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する配列番号１１及び１２のプライマーを用いたＰＣＲとゲノムシーケンシングにより当該遺伝的操作を確認した。
【0103】
配列番号１１（ｃｏｎｆｉｒｍ ｌｙｓＣ１）
ＡＣＡＴＴＣＣＡＣＣＣＡＴＴＡＣＴＧＣＡ
配列番号１２（ｃｏｎｆｉｒｍ ｌｙｓＣ ２）
ＴＣＴＴＣＡＴＣＧＧＴＴＴＣＧＡＡＧＧＴ
得られた形質転換菌株をＣｇｌ－ＴＨ－１と命名した。
ＡＣＡＴＴＣＣＡＣＣＣＡＴＴＡＣＴＧＣＡ
配列番号１２（ｃｏｎｆｉｒｍ ｌｙｓＣ ２）
ＴＣＴＴＣＡＴＣＧＧＴＴＴＣＧＡＡＧＧＴ
得られた形質転換菌株をＣｇｌ－ＴＨ－１と命名した。
【0104】
２－２：変異型ホモセリンデヒドロゲナーゼ（Ｈｏｍ）形質転換
ＤＮＡ－結合転写二重調節因子（DNA-binding transcriptional dual regulator）であるｍｃｂＲ調節を解除し、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（homoserine dehydrogenase）であるｈｏｍの発現量を増加させるために、ｈｏｍプロモーター（promoter）をＰｃｊ７プロモーターに置換した。さらに、ｈｏｍのＬ－トレオニンに対するフィードバック阻害解除のための変異（Ｇ３７８Ｅ，Ｒ３９８Ｑ）をＣｇｌ－ＴＨ－１に適用し、Ｌ－トレオニン生産の増加を試みた。前記変異型ｈｏｍ形質転換のために、ｐＤＺ－Ｐｃｊ７＿ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ，Ｒ３９８Ｑ）を作製した。Ｐｃｊ７プロモーターをｈｏｍプロモーターと置換するために、相同組換え（Homologous recombination）が発生するｈｏｍプロモーターの上流（Upstream）領域を得た。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１４及び５５のプライマーを用いて、ｈｏｍプロモーターの上流領域の断片をＰＣＲにより得た。
ＤＮＡ－結合転写二重調節因子（DNA-binding transcriptional dual regulator）であるｍｃｂＲ調節を解除し、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（homoserine dehydrogenase）であるｈｏｍの発現量を増加させるために、ｈｏｍプロモーター（promoter）をＰｃｊ７プロモーターに置換した。さらに、ｈｏｍのＬ－トレオニンに対するフィードバック阻害解除のための変異（Ｇ３７８Ｅ，Ｒ３９８Ｑ）をＣｇｌ－ＴＨ－１に適用し、Ｌ－トレオニン生産の増加を試みた。前記変異型ｈｏｍ形質転換のために、ｐＤＺ－Ｐｃｊ７＿ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ，Ｒ３９８Ｑ）を作製した。Ｐｃｊ７プロモーターをｈｏｍプロモーターと置換するために、相同組換え（Homologous recombination）が発生するｈｏｍプロモーターの上流（Upstream）領域を得た。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１４及び５５のプライマーを用いて、ｈｏｍプロモーターの上流領域の断片をＰＣＲにより得た。
【0105】
配列番号１４（ｕｐ Ｆ）
ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＴＡＴＧＣＡＧＴＧＡＧＣ
配列番号５５（ｕｐ Ｒ）
ＧＧＡＴＧＴＴＴＣＴＴＴＧＧＡＧＣＴＴＣＧＣＴＣＡＡＴＣＡＴ
ｐＥＣＣＧ１１７－Ｐｃｊ７－ＧＦＰ（特許文献３）プラスミドを鋳型とし、配列番号１３及び５６のプライマーを用いて、Ｐｃｊ７プロモーター断片をＰＣＲにより得た。
ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＴＡＴＧＣＡＧＴＧＡＧＣ
配列番号５５（ｕｐ Ｒ）
ＧＧＡＴＧＴＴＴＣＴＴＴＧＧＡＧＣＴＴＣＧＣＴＣＡＡＴＣＡＴ
ｐＥＣＣＧ１１７－Ｐｃｊ７－ＧＦＰ（特許文献３）プラスミドを鋳型とし、配列番号１３及び５６のプライマーを用いて、Ｐｃｊ７プロモーター断片をＰＣＲにより得た。
【0106】
配列番号１３（ｃｊ７ Ｆ）
ＧＡＡＧＣＴＣＣＡＡＡＧＡＡＡＣＡＴＣＣＣＡＧＣＧＣＴＡＣＴ
配列番号５６（ｃｊ７ Ｒ）
ＡＧＡＴＧＣＴＧＡＧＧＴＣＡＴＧＡＴＴＧＴＴＣＴＣＣＴＡＴＡＡＴＣＧＣ
次に、ｈｏｍ変異（Ｇ３７８Ｅ，Ｒ３９８Ｑ）を適用するために、ｈｏｍアミノ酸の１～３７８番目のコード配列の上流とＧ３７８Ｅ／Ｒ３９８Ｑ変異を含む配列、及びＲ３９８Ｑの下流配列を次の方法で得た。
ＧＡＡＧＣＴＣＣＡＡＡＧＡＡＡＣＡＴＣＣＣＡＧＣＧＣＴＡＣＴ
配列番号５６（ｃｊ７ Ｒ）
ＡＧＡＴＧＣＴＧＡＧＧＴＣＡＴＧＡＴＴＧＴＴＣＴＣＣＴＡＴＡＡＴＣＧＣ
次に、ｈｏｍ変異（Ｇ３７８Ｅ，Ｒ３９８Ｑ）を適用するために、ｈｏｍアミノ酸の１～３７８番目のコード配列の上流とＧ３７８Ｅ／Ｒ３９８Ｑ変異を含む配列、及びＲ３９８Ｑの下流配列を次の方法で得た。
【0107】
具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１７及び１８のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｈｏｍアミノ酸の１～３７８番目のコード配列の断片を得た。同様に、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１５及び２０のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｈｏｍＧ３７８Ｅ／Ｒ３９８Ｑ変異を含む配列断片を得た。次に、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１９及び２１のプライマーを用いてＰＣＲを行い、相同組換え（Homologous recombination）が発生するｈｏｍ Ｒ３９８Ｑの下流配列断片を得た。
【0108】
配列番号１７（ｈｏｍ Ｆ）
ＴＡＴＡＧＧＡＧＡＡＣＡＡＴＣＡＴＧＡＣＣＴＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＣＣＣ
配列番号１８（Ｇ３７８Ｅ Ｒ）
ＧＣＣＡＡＡＡＣＣＴＣＣＡＣＧＣＧＡＴＣＴＴ
配列番号１５（Ｇ３７８Ｅ Ｆ）
ＡＡＧＡＴＣＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＴＴＴＧＧＣ
配列番号２０（Ｒ３９８Ｑ Ｒ）
ＧＣＧＣＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＧＧＡＴＴＧＴＡＣＧＣ
配列番号１９（Ｒ３９８Ｑ Ｆ）
ＧＣＧＴＡＣＡＡＴＣＣＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＧＣＧＣ
配列番号２１（ｈｏｍ Ｒ）
ＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＡＣＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＴＧＴＴＧＴＧ
前記過程で得られた５種のＰＣＲ断片とＳｍａＩ制限酵素で切断した染色体形質転換用ベクターｐＤＺをギブソンアセンブリ方法でクローニングすることにより組換えプラスミドを得て、ｐＤＺ－Ｐｃｊ７＿ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ，Ｒ３９８Ｑ）と命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。
ＴＡＴＡＧＧＡＧＡＡＣＡＡＴＣＡＴＧＡＣＣＴＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＣＣＣ
配列番号１８（Ｇ３７８Ｅ Ｒ）
ＧＣＣＡＡＡＡＣＣＴＣＣＡＣＧＣＧＡＴＣＴＴ
配列番号１５（Ｇ３７８Ｅ Ｆ）
ＡＡＧＡＴＣＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＴＴＴＧＧＣ
配列番号２０（Ｒ３９８Ｑ Ｒ）
ＧＣＧＣＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＧＧＡＴＴＧＴＡＣＧＣ
配列番号１９（Ｒ３９８Ｑ Ｆ）
ＧＣＧＴＡＣＡＡＴＣＣＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＧＣＧＣ
配列番号２１（ｈｏｍ Ｒ）
ＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＡＣＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＴＧＴＴＧＴＧ
前記過程で得られた５種のＰＣＲ断片とＳｍａＩ制限酵素で切断した染色体形質転換用ベクターｐＤＺをギブソンアセンブリ方法でクローニングすることにより組換えプラスミドを得て、ｐＤＺ－Ｐｃｊ７＿ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ，Ｒ３９８Ｑ）と命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。
【0109】
作製したｐＤＺ－Ｐｃｊ７＿ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ，Ｒ３９８Ｑ）ベクターをＣｇｌ－ＴＨ－１菌株にエレクトロポレーションで形質転換し、その後２次交差過程を経て、染色体上で野生型ｈｏｍ遺伝子が変異型Ｐｃｊ７＿ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ，Ｒ３９８Ｑ）遺伝子に置換された菌株を得た。当該遺伝子が挿入された相同組換え上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する配列番号２２及び２３のプライマーを用いたＰＣＲとゲノムシーケンシングにより当該遺伝的操作を確認した。
【0110】
配列番号２２（ｈｏｍ ｃｏｎｆ Ｆ）
ＴＧＧＧＴＡＧＧＴＣＧＡＧＴＴＧＴＴＡＡ
配列番号２３（ｈｏｍ ｃｏｎｆ Ｒ）
ＣＡＧＣＧＣＡＧＴＣＧＣＡＣＧＡＡＴＡＴ
得られた形質転換菌株をＣｇｌ－ＴＨ－２と命名した。
ＴＧＧＧＴＡＧＧＴＣＧＡＧＴＴＧＴＴＡＡ
配列番号２３（ｈｏｍ ｃｏｎｆ Ｒ）
ＣＡＧＣＧＣＡＧＴＣＧＣＡＣＧＡＡＴＡＴ
得られた形質転換菌株をＣｇｌ－ＴＨ－２と命名した。
【0111】
２－３：ピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｙｃ）の発現強化のための変異の適用
オキサロ酢酸（Oxaloacetate）ｐｏｏｌ増加によりＬ－トレオニン生成を強化するために、ピルビン酸カルボキシラーゼ（pyruvate carboxylase）のｐｙｃ遺伝子の発現増加を試みた。ｐｙｃ発現強化のために、ｐｙｃ遺伝子のプロモーターをＰｃｊ７プロモーターに置換した。ｐＥＣＣＧ１１７－Ｐｃｊ７－ＧＦＰ（特許文献３）プラスミドを鋳型とし、配列番号２４及び１６のプライマーを用いて、Ｐｃｊ７プロモーター断片をＰＣＲにより得た。
オキサロ酢酸（Oxaloacetate）ｐｏｏｌ増加によりＬ－トレオニン生成を強化するために、ピルビン酸カルボキシラーゼ（pyruvate carboxylase）のｐｙｃ遺伝子の発現増加を試みた。ｐｙｃ発現強化のために、ｐｙｃ遺伝子のプロモーターをＰｃｊ７プロモーターに置換した。ｐＥＣＣＧ１１７－Ｐｃｊ７－ＧＦＰ（特許文献３）プラスミドを鋳型とし、配列番号２４及び１６のプライマーを用いて、Ｐｃｊ７プロモーター断片をＰＣＲにより得た。
【0112】
配列番号２４（ＣＪ７ Ｆ）
ＣＡＡＣＣＴＴＴＧＣＡＡＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＣＡＴＣＣＣＡＧＣＧＣＴＡＣＴ
配列番号１６（ＣＪ７ Ｒ）
ＴＧＴＧＴＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＣＣＴＴＴＣＧＴＴＧＧＧ
前記Ｐｃｊ７プロモーターをｐｙｃプロモーターと置換するための相同組換え（Homologous recombination）が発生するｐｙｃプロモーターの上流（Upstream）領域を得た。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２５及び２６のプライマーを用いて、ｐｙｃプロモーターの上流（Upstream）領域の断片をＰＣＲにより得た。
ＣＡＡＣＣＴＴＴＧＣＡＡＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＣＡＴＣＣＣＡＧＣＧＣＴＡＣＴ
配列番号１６（ＣＪ７ Ｒ）
ＴＧＴＧＴＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＣＣＴＴＴＣＧＴＴＧＧＧ
前記Ｐｃｊ７プロモーターをｐｙｃプロモーターと置換するための相同組換え（Homologous recombination）が発生するｐｙｃプロモーターの上流（Upstream）領域を得た。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２５及び２６のプライマーを用いて、ｐｙｃプロモーターの上流（Upstream）領域の断片をＰＣＲにより得た。
【0113】
配列番号２５（ｕｐｓｔｒｅａｍ Ｆ）
ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＧＡＣＡＧＴＴＧＣＴＧＡＴＣＴＧＧＣＴ
配列番号２６（ｕｐｓｔｒｅａｍ Ｒ）
ＡＧＴＡＧＣＧＣＴＧＧＧＡＴＧＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＡＣＣＴＴＧＣＡＡＡＧＧＴＴＧ
Ｐｃｊ７プロモーターの下流相同領域（homologous region）として活用するｐｙｃコード配列のＮ末端（N-term）を得るために、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２７及び２８のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｐｙｃプロモーターの下流の断片を得た。
ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＧＡＣＡＧＴＴＧＣＴＧＡＴＣＴＧＧＣＴ
配列番号２６（ｕｐｓｔｒｅａｍ Ｒ）
ＡＧＴＡＧＣＧＣＴＧＧＧＡＴＧＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＡＣＣＴＴＧＣＡＡＡＧＧＴＴＧ
Ｐｃｊ７プロモーターの下流相同領域（homologous region）として活用するｐｙｃコード配列のＮ末端（N-term）を得るために、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２７及び２８のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｐｙｃプロモーターの下流の断片を得た。
【0114】
配列番号２７（ｐｙｃ Ｆ）
ＧＧＡＡＴＡＡＴＴＡＣＴＣＴＡＡＴＧＴＣＧＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＣＴＴＣ
配列番号２８（ｐｙｃ Ｒ）
ＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＣＡＴＴＴＴＣＡＧＡＣＡＧＧＡＡＧＣ
前記過程で得られた３種のＰＣＲ断片とＳｍａＩ制限酵素で切断した染色体形質転換用ベクターｐＤＺをギブソンアセンブリ方法でクローニングすることにより組換えプラスミドを得て、ｐＤＺ－Ｐｃｊ７＿ｐｙｃと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。
ＧＧＡＡＴＡＡＴＴＡＣＴＣＴＡＡＴＧＴＣＧＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＣＴＴＣ
配列番号２８（ｐｙｃ Ｒ）
ＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＣＡＴＴＴＴＣＡＧＡＣＡＧＧＡＡＧＣ
前記過程で得られた３種のＰＣＲ断片とＳｍａＩ制限酵素で切断した染色体形質転換用ベクターｐＤＺをギブソンアセンブリ方法でクローニングすることにより組換えプラスミドを得て、ｐＤＺ－Ｐｃｊ７＿ｐｙｃと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。
【0115】
作製したｐＤＺ－Ｐｃｊ７＿ｐｙｃベクターをＣｇｌ－ＴＨ－２菌株にエレクトロポレーションで形質転換し、その後２次交差過程を経て、染色体上で野生型ｐｙｃプロモーターが変異型Ｐｃｊ７＿ｐｙｃ遺伝子に置換された菌株を得た。当該遺伝子が挿入された相同組換え上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する配列番号２９及び３０のプライマーを用いたＰＣＲとゲノムシーケンシングにより当該遺伝的操作を確認した。
【0116】
配列番号２９（ｐｙｃ ｃｏｎｆ Ｆ）
ＡＣＧＣＡＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＣＧＴＧ
配列番号３０（ｐｙｃ ｃｏｎｆ Ｒ）
ＣＧＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＡＣＧＡＧＡＴＧ
得られた形質転換菌株をＣｇｌ－ＴＨ－３と命名した。
ＡＣＧＣＡＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＣＧＴＧ
配列番号３０（ｐｙｃ ｃｏｎｆ Ｒ）
ＣＧＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＡＣＧＡＧＡＴＧ
得られた形質転換菌株をＣｇｌ－ＴＨ－３と命名した。
【0117】
２－４：変異型Ｌ－トレオニンオペロン、Ｎｃｇｌ０１７９欠損、及びアスパルトキナーゼとホモセリンデヒドロゲナーゼ１の二官能性を有するタンパク質（ＴｈｒＡ（Ｓ３５２Ｐ）ＢＣ）の１ｃｏｐｙ挿入
Ｌ－トレオニン生合成を強化するために、大腸菌由来Ｌ－トレオニンオペロンの適用を試みた。特に、アスパルトキナーゼとホモセリンデヒドロゲナーゼ１の二官能性を有する（Bifunctional aspartokinase/homoserine dehydrogenase 1）ｔｈｒＡ遺伝子は、Ｌ－トレオニンに対するフィードバック阻害を解除するために、ｔｈｒＡ（Ｓ３５２Ｐ）（非特許文献２０）変異を適用した。次に、ＳＰＬ７プロモーター（特許文献４）を用いて、Ｌ－トレオニンオペロンの発現増加を試みた。
Ｌ－トレオニン生合成を強化するために、大腸菌由来Ｌ－トレオニンオペロンの適用を試みた。特に、アスパルトキナーゼとホモセリンデヒドロゲナーゼ１の二官能性を有する（Bifunctional aspartokinase/homoserine dehydrogenase 1）ｔｈｒＡ遺伝子は、Ｌ－トレオニンに対するフィードバック阻害を解除するために、ｔｈｒＡ（Ｓ３５２Ｐ）（非特許文献２０）変異を適用した。次に、ＳＰＬ７プロモーター（特許文献４）を用いて、Ｌ－トレオニンオペロンの発現増加を試みた。
【0118】
次に、前記ＳＰＬ７＿ｔｈｒＡ（Ｓ３５２Ｐ）ＢＣをＮｃｇｌ０１７９の位置に挿入するために、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、Ｎｃｇｌ０１７９の上流及び下流相同領域（homologous region）の断片により、それぞれ配列番号３１及び３２と配列番号３７及び３８に塩基配列を増幅した。次に、合成したＳＰＬ７プロモーターを鋳型とし、配列番号３３及び３４にＳＰＬ７を増幅した。
【0119】
ｔｈｒＡ（Ｓ３５２Ｐ）アミノ酸の３５２番目のコード配列の上流は配列番号３５及び３６に、ｔｈｒＡ（Ｓ３５２Ｐ）アミノ酸の３５２番目の下流及びｔｈｒＢＣは配列番号３９及び４０に塩基配列を増幅した。
【0120】
配列番号３１（Ｎｃｇｌ０１７９ ＵＰ Ｆ）
ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＴＴＴＧＡＧＴＡＡＴＴＧＧＴＡＡＴＡＣ
配列番号３２（Ｎｃｇｌ０１７９ ＵＰ Ｒ）
ＴＧＡＡＧＣＧＣＣＧＧＴＡＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＣＧＧＧＣＧＡＴＴＡＴ
配列番号３７（Ｎｃｇｌ０１７９ ＤＯＷＮ Ｆ）
ＡＴＧＡＡＴＣＡＴＣＡＧＴＡＡＴＴＡＡＴＧＧＣＣＣＴＣＧＡＴＴＴＧＧＣ
配列番号３８（Ｎｃｇｌ０１７９ ＤＯＷＮ Ｒ）
ＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＴＧＧＡＡＴＡＡＴＣＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡ
配列番号３３（ＳＰＬ７ Ｆ）
ＡＴＣＧＣＣＣＧＴＴＴＡＡＧＣＧＧＧＴＡＣＣＧＧＣＧＣＴＴＣＡＴＧＴ
配列番号３４（ＳＰＬ７ Ｒ）
ＣＴＴＣＡＡＣＡＣＴＣＧＣＡＴＧＡＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＴ
配列番号３５（Ｓ３５２Ｐ ＵＰ Ｆ）
ＡＴＣＡＡＡＡＣＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＣＧＡＧＴＧＴＴＧＡＡＧＴＴＣＧＧ
配列番号３６（Ｓ３５２Ｐ ＵＰ Ｒ）
ＴＡＣＴＧＴＡＴＴＣＧＧＡＡＧＡＴＧＧＴＴＧＣＧＴＡＡＴＣＡＧＣＡＣＣＡＣ
配列番号３９（Ｓ３５２Ｐ ＤＯＷＮ Ｆ）
ＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＴＡＣＧＣＡＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＧＡＡＴＡＣＡＧＴＡ
配列番号４０（Ｓ３５２Ｐ ＤＯＷＮ Ｒ）
ＡＡＡＴＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＴＡＡＴＴＡＣＴＧＡＴＧＡＴＴＣＡＴＣＡＴＣ
前記過程で得られた５種のＰＣＲ断片とＳｍａＩ制限酵素で切断した染色体形質転換用ベクターｐＤＺをギブソンアセンブリ方法でクローニングすることにより組換えプラスミドを得て、ｐＤＺ－ＳＰＬ７＿ｔｈｒＡ（Ｓ３５２Ｐ）ＢＣと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。
ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＴＴＴＧＡＧＴＡＡＴＴＧＧＴＡＡＴＡＣ
配列番号３２（Ｎｃｇｌ０１７９ ＵＰ Ｒ）
ＴＧＡＡＧＣＧＣＣＧＧＴＡＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＣＧＧＧＣＧＡＴＴＡＴ
配列番号３７（Ｎｃｇｌ０１７９ ＤＯＷＮ Ｆ）
ＡＴＧＡＡＴＣＡＴＣＡＧＴＡＡＴＴＡＡＴＧＧＣＣＣＴＣＧＡＴＴＴＧＧＣ
配列番号３８（Ｎｃｇｌ０１７９ ＤＯＷＮ Ｒ）
ＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＴＧＧＡＡＴＡＡＴＣＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡ
配列番号３３（ＳＰＬ７ Ｆ）
ＡＴＣＧＣＣＣＧＴＴＴＡＡＧＣＧＧＧＴＡＣＣＧＧＣＧＣＴＴＣＡＴＧＴ
配列番号３４（ＳＰＬ７ Ｒ）
ＣＴＴＣＡＡＣＡＣＴＣＧＣＡＴＧＡＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＴ
配列番号３５（Ｓ３５２Ｐ ＵＰ Ｆ）
ＡＴＣＡＡＡＡＣＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＣＧＡＧＴＧＴＴＧＡＡＧＴＴＣＧＧ
配列番号３６（Ｓ３５２Ｐ ＵＰ Ｒ）
ＴＡＣＴＧＴＡＴＴＣＧＧＡＡＧＡＴＧＧＴＴＧＣＧＴＡＡＴＣＡＧＣＡＣＣＡＣ
配列番号３９（Ｓ３５２Ｐ ＤＯＷＮ Ｆ）
ＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＴＡＣＧＣＡＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＧＡＡＴＡＣＡＧＴＡ
配列番号４０（Ｓ３５２Ｐ ＤＯＷＮ Ｒ）
ＡＡＡＴＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＴＡＡＴＴＡＣＴＧＡＴＧＡＴＴＣＡＴＣＡＴＣ
前記過程で得られた５種のＰＣＲ断片とＳｍａＩ制限酵素で切断した染色体形質転換用ベクターｐＤＺをギブソンアセンブリ方法でクローニングすることにより組換えプラスミドを得て、ｐＤＺ－ＳＰＬ７＿ｔｈｒＡ（Ｓ３５２Ｐ）ＢＣと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。
【0121】
作製したｐＤＺ－ＳＰＬ７＿ｔｈｒＡ（Ｓ３５２Ｐ）ＢＣベクターをＣｇｌ－ＴＨ－３菌株にエレクトロポレーションで形質転換し、その後２次交差過程を経て、染色体上でＳＰＬ７＿ｔｈｒＡ（Ｓ３５２Ｐ）ＢＣオペロンが挿入された菌株を得た。当該遺伝子が挿入された相同組換え上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する配列番号４１及び４２のプライマーを用いたＰＣＲとゲノムシーケンシングにより当該遺伝的操作を確認した。
【0122】
配列番号４１（ｔｈｒ ｃｏｎｆ Ｆ）
ＧＡＴＴＣＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＴＧＴＣ
配列番号４２（ｔｈｒ ｃｏｎｆ Ｒ）
ＧＡＣＡＣＣＡＴＣＧＣＡＧＣＣＣＧＡＣ
得られた形質転換菌株をＣｇｌ－ＴＨ－４と命名した。
ＧＡＴＴＣＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＴＧＴＣ
配列番号４２（ｔｈｒ ｃｏｎｆ Ｒ）
ＧＡＣＡＣＣＡＴＣＧＣＡＧＣＣＣＧＡＣ
得られた形質転換菌株をＣｇｌ－ＴＨ－４と命名した。
【0123】
前記菌株Ｃｇｌ－ＴＨ－４をＣＪ０９－５０１０と命名し、２０１９年５月３１日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ１２５３７Ｐとして国際寄託した。
【0124】
２－５：変異型Ｌ－トレオニン排出タンパク質（ＲｈｔＣ）導入コリネバクテリウム菌株のＬ－トレオニン生産
実施例１で作製したｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ（ｍ１）、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ（ｍ２）、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ（ｍ３）、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ（ｍ４）ベクターをＣｇｌ－ＴＨ－４菌株にそれぞれエレクトロポレーションで形質転換し、その後２次交差過程を経て、染色体上で野生型ｒｈｔＣと変異型ｒｈｔＣ遺伝子４種が挿入された各菌株を得た。当該遺伝子が挿入された相同組換え上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する配列番号５３及び５４のプライマーを用いたＰＣＲとゲノムシーケンシングにより当該遺伝的操作を確認した。
実施例１で作製したｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ（ｍ１）、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ（ｍ２）、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ（ｍ３）、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ（ｍ４）ベクターをＣｇｌ－ＴＨ－４菌株にそれぞれエレクトロポレーションで形質転換し、その後２次交差過程を経て、染色体上で野生型ｒｈｔＣと変異型ｒｈｔＣ遺伝子４種が挿入された各菌株を得た。当該遺伝子が挿入された相同組換え上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する配列番号５３及び５４のプライマーを用いたＰＣＲとゲノムシーケンシングにより当該遺伝的操作を確認した。
【0125】
配列番号５３（ＨＲ ｏｕｔｓｉｄｅ Ｆ）
ＡＡＧＧＡＡＴＡＴＣＣＣＧＧＡＧＡＡＣＣ
配列番号５４（ＨＲ ｏｕｔｓｉｄｅ Ｒ）
ＴＴＧＣＧＴＴＴＧＡＡＡＡＧＣＣＣＴＣＧ
得られた形質転換菌株をそれぞれＣｇｌ－ＴＨ－５、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（ｍ１）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（ｍ２）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（ｍ３）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（ｍ４）と命名した。
ＡＡＧＧＡＡＴＡＴＣＣＣＧＧＡＧＡＡＣＣ
配列番号５４（ＨＲ ｏｕｔｓｉｄｅ Ｒ）
ＴＴＧＣＧＴＴＴＧＡＡＡＡＧＣＣＣＴＣＧ
得られた形質転換菌株をそれぞれＣｇｌ－ＴＨ－５、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（ｍ１）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（ｍ２）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（ｍ３）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（ｍ４）と命名した。
【0126】
さらに、コリネバクテリウム菌株において変異型ｒｈｔＣ導入の効果を確認するために、作製したＣｇｌ－ＴＨ－５、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（ｍ１）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（ｍ２）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（ｍ３）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（ｍ４）菌株のＬ－トレオニン生産量を比較すべく、次の方法で培養した。種培地（グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４８ｇ，ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ０．５ｇ，ビオチン１００ｕｇ，チアミンＨＣｌ１０００ｕｇ，パントテン酸カルシウム２０００ｕｇ，ニコチンアミド２０００ｕｇ，ｐＨ７．０（蒸留水１リットル中））２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地（グルコース７０ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４１５ｇ，ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ１．２ｇ，ＫＨ２ＰＯ４１ｇ，酵母抽出物５ｇ，ビオチン９００ｕｇ，チアミン塩酸塩４５００ｕｇ，パントテン酸カルシウム４５００ｕｇ，ＣａＣＯ３３０ｇ，ｐＨ７．０（蒸留水１リットル中））２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間振盪培養した。培養終了後に、ＨＰＬＣによりＬ－トレオニンの生産量を測定した。その結果を表３に示す。
【0127】
【表3】
【0128】
表３に示すように、実施例２－４の方法で作製したＣｇｌ－ＴＨ－４は１１．１ｇ／ＬのＬ－トレオニンを生産し、それにＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ野生型形質が挿入されたＣｇｌ－ＴＨ－５は１４．０ｇ／ＬのＬ－トレオニンを生産した。また、ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ（ｍ）変異型形質が挿入されたＣｇｌ－ＴＨ－５（ｍ１）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（ｍ２）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（ｍ３）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（ｍ４）はそれぞれ１７．９ｇ／Ｌ、２４．０ｇ／Ｌ、２１．８ｇ／Ｌ、１７．９ｇ／ＬのＬ－トレオニンを生産した。Ｌ－トレオニン発酵収率としては、Ｃｇｌ－ＴＨ－４に比べてＣｇｌ－ＴＨ－５が４．１％ｐの上昇を示したのに対して、変異型が適用されたＣｇｌ－ＴＨ－５（ｍ１）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（ｍ２）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（ｍ３）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（ｍ４）菌株はそれぞれＣｇｌ－ＴＨ－４に比べて９．７％ｐ、１８．４％ｐ、１５．３％ｐ、９．７％ｐの上昇を示した。特に、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（ｍ２）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（ｍ３）は、Ｃｇｌ－ＴＨ－５の収率上昇の約４倍に相当する大きな収率上昇効果を示した。Ｃｇｌ－ＴＨ－５（ｍ２）に適用された変異型ＲｈｔＣは、配列番号９４のアミノ酸配列を有し、具体的には６２番目の位置のアミノ酸のロイシン（Ｌｅｕ）がセリン（Ｓｅｒ）に改変された変異（Ｌ６２Ｓ）を含んでいた。また、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（ｍ３）に適用された変異型ＲｈｔＣは、配列番号９３のアミノ酸配列を有し、具体的には５３番目の位置のアミノ酸のアラニン（Ａｌａ）がトレオニン（Ｔｈｒ）に改変された変異（Ａ５３Ｔ）を含んでいた。
【0129】
前述した２つの菌株、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（ｍ２）及びＣｇｌ－ＴＨ－５（ｍ３）をそれぞれＣＡ０９－５０１２及びＣＡ０９－５０３６と命名し、２０１９年５月３１日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ１２５３８Ｐ及びＫＣＣＭ１２５３９Ｐとして国際寄託した。
【実施例3】
【0130】
変異型Ｌ－トレオニン排出タンパク質導入大腸菌菌株のＬ－トレオニン生産
実施例１で作製したｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ、選択した変異型プラスミド４種、及び空ベクターｐＣＬ１９２０をそれぞれＬ－トレオニン生産能を有する大腸菌菌株であるＴＦ４０７６（ＫＦＣＣ１０７１８，特許文献９（韓国特許出願第１９９０－００２２９６５号））に形質転換し、ＴＦ４０７６／ｐＣＬ１９２０、ＴＦ４０７６／ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ、ＴＦ４０７６／ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ（ｍ１）、ＴＦ４０７６／ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ（ｍ２）、ＴＦ４０７６／ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ（ｍ３）、ＴＦ４０７６／ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ（ｍ４）菌株を作製した。作製した菌株のＬ－トレオニン生産量の比較のために、フラスコ評価を行った。フラスコ評価は、５０ｕｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを添加したＬＢプレートに各菌株を画線接種（streaking）し、３３℃の培養器で１６時間培養し、その後単一コロニー（colony）をＬＢ培地２ｍｌに接種し、次いで２００ｒｐｍ／３３℃の培養器で１２時間培養した。次に、２５０ｍｌのフラスコに表４の組成からなるＬ－トレオニン生産フラスコ培地２５ｍｌを入れ、前述したように培養した培養液を５００ｕｌずつ投入した。その後、フラスコを２００ｒｐｍ／３３℃の培養器で４８時間培養し、次いでＨＰＬＣを用いて各菌株から得られたＬ－トレオニン量を比較した。その結果を表５に示す。
実施例１で作製したｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ、選択した変異型プラスミド４種、及び空ベクターｐＣＬ１９２０をそれぞれＬ－トレオニン生産能を有する大腸菌菌株であるＴＦ４０７６（ＫＦＣＣ１０７１８，特許文献９（韓国特許出願第１９９０－００２２９６５号））に形質転換し、ＴＦ４０７６／ｐＣＬ１９２０、ＴＦ４０７６／ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ、ＴＦ４０７６／ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ（ｍ１）、ＴＦ４０７６／ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ（ｍ２）、ＴＦ４０７６／ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ（ｍ３）、ＴＦ４０７６／ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ（ｍ４）菌株を作製した。作製した菌株のＬ－トレオニン生産量の比較のために、フラスコ評価を行った。フラスコ評価は、５０ｕｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを添加したＬＢプレートに各菌株を画線接種（streaking）し、３３℃の培養器で１６時間培養し、その後単一コロニー（colony）をＬＢ培地２ｍｌに接種し、次いで２００ｒｐｍ／３３℃の培養器で１２時間培養した。次に、２５０ｍｌのフラスコに表４の組成からなるＬ－トレオニン生産フラスコ培地２５ｍｌを入れ、前述したように培養した培養液を５００ｕｌずつ投入した。その後、フラスコを２００ｒｐｍ／３３℃の培養器で４８時間培養し、次いでＨＰＬＣを用いて各菌株から得られたＬ－トレオニン量を比較した。その結果を表５に示す。
【0131】
【表4】
【0132】
【表5】
【0133】
表５に示すように、Ｌ－トレオニン生産能を有する大腸菌菌株に変異型ｒｈｔＣプラスミドを導入すると、Ｌ－トレオニン収率が大幅に上昇する結果が得られた。特に、ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ（ｍ２）、ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ（ｍ３）を適用すると、Ｌ－トレオニン収率が大幅に上昇する結果が得られた。
【実施例4】
【0134】
Ｌ－トレオニン排出タンパク質の６２番目のアミノ酸であるロイシンの飽和突然変異誘発（Saturated mutagenesis）
表３及び表５に示すように、ｒｈｔＣ（Ｌ６２Ｓ）の変異型が野生型に比べて高い収率上昇効果を示すので、ＲｈｔＣの６２番目のアミノ酸であるロイシンを他のアミノ酸に変異させ、６２番目の位置のＬ－トレオニン排出改善の有効性についての検証を試みた。ロイシンをロイシン以外の１９種の他のアミノ酸に変異するために、実施例１で作製したｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣを鋳型とし、部位特異的突然変異誘発（Site-Directed Mutagenesis）を次の方法で行った。
表３及び表５に示すように、ｒｈｔＣ（Ｌ６２Ｓ）の変異型が野生型に比べて高い収率上昇効果を示すので、ＲｈｔＣの６２番目のアミノ酸であるロイシンを他のアミノ酸に変異させ、６２番目の位置のＬ－トレオニン排出改善の有効性についての検証を試みた。ロイシンをロイシン以外の１９種の他のアミノ酸に変異するために、実施例１で作製したｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣを鋳型とし、部位特異的突然変異誘発（Site-Directed Mutagenesis）を次の方法で行った。
【0135】
【表6】
【0136】
【表7】
【0137】
ＲｈｔＣの６２番目のロイシン（Ｌ）を他のアミノ酸に置換するために、表６のＰＣＲ産物を作製し、表７の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ実行時に、表８の突然変異誘発プライマー（mutagenic primer）セットを用いた。ＰＣＲ終了後に、ＤｐｎＩ制限酵素１ｕｌを添加し、次いで３７℃で１時間処理した。ＤｐｎＩ処理したＤＮＡ３ｕｌＤＨ５ａコンピテントセル（competent cell）に形質転換してｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ変異型プラスミドを確保し、シーケンシングにより表８に示す各変異に置換されたことを確認した。
【0138】
【表8-1】
【0139】
【表8-2】
【0140】
【表8-3】
【0141】
【表8-4】
【0142】
表８に示すように作製したｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ Ｌ６２Ｒ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ａ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｄ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｋ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｐ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｃ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｇ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｔ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｉ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｙ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｖ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｈ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｆ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｍ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｑ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｎ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｅ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｗベクターを実施例２－５の方法でＣｇｌ－ＴＨ－４菌株にそれぞれエレクトロポレーションで形質転換し、その後２次交差過程を経て、染色体上で変異型ｒｈｔＣ遺伝子が挿入された１９種の菌株を得た。当該遺伝子が挿入された相同組換え上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する配列番号５３及び５４のプライマーを用いたＰＣＲとゲノムシーケンシングにより当該遺伝的操作を確認した。
【0143】
配列番号５３（ＨＲ ｏｕｔｓｉｄｅ Ｆ）
ＡＡＧＧＡＡＴＡＴＣＣＣＧＧＡＧＡＡＣＣ
配列番号５４（ＨＲ ｏｕｔｓｉｄｅ Ｒ）
ＴＴＧＣＧＴＴＴＧＡＡＡＡＧＣＣＣＴＣＧ
得られた形質転換菌株をそれぞれＣｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｒ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ａ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｄ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｋ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｐ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｃ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｇ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｔ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｉ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｙ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｖ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｈ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｆ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｍ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｑ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｎ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｅ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｗ）と命名した。
ＡＡＧＧＡＡＴＡＴＣＣＣＧＧＡＧＡＡＣＣ
配列番号５４（ＨＲ ｏｕｔｓｉｄｅ Ｒ）
ＴＴＧＣＧＴＴＴＧＡＡＡＡＧＣＣＣＴＣＧ
得られた形質転換菌株をそれぞれＣｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｒ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ａ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｄ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｋ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｐ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｃ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｇ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｔ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｉ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｙ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｖ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｈ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｆ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｍ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｑ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｎ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｅ）、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（Ｌ６２Ｗ）と命名した。
【0144】
前記方法で作製した１８種の菌株と前述したように作製したＣｇｌ－ＴＨ－４、Ｃｇｌ－ＴＨ－５、Ｃｇｌ－ＴＨ－５（ｍ２）菌株を実施例２－５のＬ－トレオニン生産フラスコ培地と培養方法で培養し、培養終了後に、ＨＰＬＣによりＬ－トレオニンの生産量を測定した。その結果を表９に示す。
【0145】
【表9-1】
【0146】
【表9-2】
【0147】
【表9-3】
【0148】
表９に示すように、野生型ｒｈｔＣを挿入したＣｇｌ－ＴＨ－５に比べて、ＲｈｔＣタンパク質の６２番目のアミノ酸の変異を適用した１９種の変異の全てが３．４～１６．９％ｐの発酵収率の向上を示した。
【実施例5】
【0149】
人工変異法によるＡＨＶ耐性菌株のスクリーニング
コリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１０８８１（特許文献１０）を親株として、Ｌ－トレオニンアナログであるＡＨＶ（2-amino-3-hydroxy-valerate）に対する耐性を付与した。
コリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１０８８１（特許文献１０）を親株として、Ｌ－トレオニンアナログであるＡＨＶ（2-amino-3-hydroxy-valerate）に対する耐性を付与した。
【0150】
ＮＴＧ（N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine）を用いた人工変異法により変異を誘導した。実施例２－５の種培地で１８時間培養したＫＦＣＣ１０８８１菌株を再び種培地４ｍｌに接種し、その後ＯＤ６６０が約１．０になるまで培養した。培養液を遠心分離して菌体を回収し、その後５０ｍＭトリス－マレート（Tris-malate）緩衝液（ｐＨ６．５）で２回洗浄し、最後に４ｍｌの同じ緩衝液に懸濁した。菌体懸濁液に最終濃度１５０ｍｇ／ｌになるようにＮＴＧ溶液（０．０５Ｍトリス－マレート緩衝液(ｐＨ６．５)において２ｍｇ／ｍｌの濃度）を添加して室温で２０分間静置し、その後遠心分離により菌体を回収し、ＮＴＧ除去のために同じ緩衝液で２回洗浄した。最終的に、洗浄した菌体を２０％グリセリン溶液４ｍｌに懸濁し、使用するまで－７０℃で保管した。３ｇ／ｌのＡＨＶを含む最小培地にＮＴＧ処理菌株を塗抹し、前記過程でＡＨＶ耐性を有する変異型ＫＦＣＣ１０８８１菌株を１５５株得た。
【実施例6】
【0151】
ＡＨＶ耐性ＫＦＣＣ１０８８１菌株からのＬ－トレオニン生産菌株の選択
実施例５で得た１５５株のＡＨＶ耐性菌株に対してＬ－トレオニン生産能試験を行った。実施例２－５の種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１５５株の菌株を接種し、その後３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。Ｌ－トレオニン生産培地（グルコース３０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４２ｇ，尿素３ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４４０ｇ，ペプトン２．５ｇ，ＣＳＬ（Ｓｉｇｍａ）５ｇ（１０ｍｌ），ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ０．５ｇ，ロイシン４００ｍｇ，ＣａＣＯ３２０ｇ，ｐＨ７．２（蒸留水１リットル中））２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。
実施例５で得た１５５株のＡＨＶ耐性菌株に対してＬ－トレオニン生産能試験を行った。実施例２－５の種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１５５株の菌株を接種し、その後３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。Ｌ－トレオニン生産培地（グルコース３０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４２ｇ，尿素３ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４４０ｇ，ペプトン２．５ｇ，ＣＳＬ（Ｓｉｇｍａ）５ｇ（１０ｍｌ），ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ０．５ｇ，ロイシン４００ｍｇ，ＣａＣＯ３２０ｇ，ｐＨ７．２（蒸留水１リットル中））２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。
【0152】
培養終了後に、生産された様々なアミノ酸の生産量をＨＰＬＣにより測定した。実験を行った１５５株の菌株のうち、Ｌ－トレオニン生産能に優れる上位２２株におけるアミノ酸の培養液中の濃度を表１０に示す。前記過程により確認した２２株の候補をそれぞれＫＦＣＣ１０８８１－１～ＫＦＣＣ１０８８１－２２と命名した。
【0153】
【表10】
【0154】
表１０に示すように、ＡＨＶ耐性を有する２２種の菌株は、対照群（ＫＦＣＣ１０８８１）において観察されないＬ－トレオニン生産結果を示す。また、前記ＡＨＶ耐性菌株のうち、ＫＦＣＣ１０８８１－１０を最も優れたＬ－トレオニン菌株として選択した。
【実施例7】
【0155】
変異型Ｌ－トレオニン排出タンパク質導入ＫＦＣＣ１０８８１－１０菌株のＬ－トレオニン生産
実施例１で作製したｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ（ｍ２）、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ（ｍ３）と、実施例４で表８に示すように作製したｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｒ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ａ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｄ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｋ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｐ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｃ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｇ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｔ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｉ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｙ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｖ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｈ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｆ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｍ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｑ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｎ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｅ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２ＷベクターをＫＦＣＣ１０８８１－１０菌株にそれぞれエレクトロポレーションで形質転換し、その後２次交差過程を経て、染色体上で変異型ｒｈｔＣ遺伝子が挿入された２２種の菌株を得た。当該遺伝子が挿入された相同組換え上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する配列番号５３及び５４のプライマーを用いたＰＣＲとゲノムシーケンシングにより当該遺伝的操作を確認した。
実施例１で作製したｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ（ｍ２）、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣ（ｍ３）と、実施例４で表８に示すように作製したｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｒ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ａ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｄ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｋ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｐ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｃ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｇ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｔ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｉ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｙ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｖ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｈ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｆ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｍ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｑ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｎ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２Ｅ、ｐＤＺ－ＰｇａｐＡ＿ｒｈｔＣＬ６２ＷベクターをＫＦＣＣ１０８８１－１０菌株にそれぞれエレクトロポレーションで形質転換し、その後２次交差過程を経て、染色体上で変異型ｒｈｔＣ遺伝子が挿入された２２種の菌株を得た。当該遺伝子が挿入された相同組換え上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する配列番号５３及び５４のプライマーを用いたＰＣＲとゲノムシーケンシングにより当該遺伝的操作を確認した。
【0156】
配列番号５３（ＨＲ ｏｕｔｓｉｄｅ Ｆ）
ＡＡＧＧＡＡＴＡＴＣＣＣＧＧＡＧＡＡＣＣ
配列番号５４（ＨＲ ｏｕｔｓｉｄｅ Ｒ）
ＴＴＧＣＧＴＴＴＧＡＡＡＡＧＣＣＣＴＣＧ
得られた形質転換菌株をそれぞれＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣ ＷＴ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｓ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＡ５３Ｔ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｒ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ａ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｄ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｋ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｐ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｃ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｇ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｔ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｉ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｙ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｖ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｈ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｆ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｍ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｑ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｎ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｅ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｗ）と命名した。
ＡＡＧＧＡＡＴＡＴＣＣＣＧＧＡＧＡＡＣＣ
配列番号５４（ＨＲ ｏｕｔｓｉｄｅ Ｒ）
ＴＴＧＣＧＴＴＴＧＡＡＡＡＧＣＣＣＴＣＧ
得られた形質転換菌株をそれぞれＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣ ＷＴ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｓ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＡ５３Ｔ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｒ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ａ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｄ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｋ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｐ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｃ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｇ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｔ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｉ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｙ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｖ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｈ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｆ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｍ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｑ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｎ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｅ）、ＫＦＣＣ１０８８１－１０（ｒｈｔＣＬ６２Ｗ）と命名した。
【0157】
当該ｒｈｔＣ遺伝子が挿入された相同組換え上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する配列番号５３及び５４のプライマーを用いたＰＣＲとゲノムシーケンシングにより当該遺伝的操作を確認した。
【0158】
次に、前記方法で作製した菌株２２種を実施例６のＬ－トレオニン生産培地と培養方法で培養し、培養終了後に、ＨＰＬＣによりＬ－トレオニンの生産量を測定した。その結果を表１１に示す。
【0159】
【表11-1】
【0160】
【表11-2】
【0161】
【表11-3】
【0162】
表１１に示すように、ＫＦＣＣ１０８８１－１０に変異型ＲｈｔＣを導入すると、実施例３及び４における結果と同様に、野生型ＲｈｔＣに比べて高いレベルの収率上昇が観察された。
【実施例8】
【0163】
変異型Ｌ－トレオニン排出タンパク質導入ＴＦ４０７６菌株のＬ－トレオニン生産
大腸菌Ｗ３１１０由来ｒｈｔＣタンパク質（配列番号１）と相同性が高い他の菌株由来ｒｈｔＣに本出願の変異を導入し、Ｌ－トレオニン生産結果を確認した。
大腸菌Ｗ３１１０由来ｒｈｔＣタンパク質（配列番号１）と相同性が高い他の菌株由来ｒｈｔＣに本出願の変異を導入し、Ｌ－トレオニン生産結果を確認した。
【0164】
具体的には、実施例１と同様に、大腸菌Ｗ３１１０、シゲラ・フレクスネリ（Shigella flexneri）、エシェリキア・フェルグソニイ（Escherichia fergusonii）のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより塩基配列断片をそれぞれ確保し（ｅｃｏ ｒｈｔＣ，ｓｆｅｒｈｔＣ，ｅｆｅｒｈｔＣ）、それに実施例１の方法でＬ６２Ｓ変異を導入した変異型ｒｈｔＣをそれぞれ作製した。作製した変異型ｒｈｔＣ又は各菌株の野生型ｒｈｔＣをｐＣＬ１９２０とクローニングすることにより、組換えプラスミドｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ．ｅｃｏ、ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ．ｅｃｏＬ６２Ｓ、ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ．ｓｆｅ、ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ．ｓｆｅＬ６２Ｓ、ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ．ｅｆｅ、ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ．ｅｆｅＬ６２Ｓを得た。
【0165】
前述したように作製した組換えプラスミドをそれぞれＬ－トレオニン生産能を有する大腸菌菌株であるＴＦ４０７６に形質転換し、ＴＦ４０７６／ｐＣＬ１９２０、ＴＦ４０７６／ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ．ｅｃｏ、ＴＦ４０７６／ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ．ｅｃｏＬ６２Ｓ、ＴＦ４０７６／ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ．ｓｆｅ、ＴＦ４０７６／ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ．ｓｆｅＬ６２Ｓ、ＴＦ４０７６／ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ．ｅｆｅ、ＴＦ４０７６／ｐＣＬ１９２０－Ｐｎ＿ｒｈｔＣ．ｅｆｅＬ６２Ｓ菌株を作製した。作製した菌株のＬ－トレオニン生産量の比較のためにフラスコ評価を行った。その結果を表１２に示す。
【0166】
【表12】
【0167】
表１２に示すように、大腸菌Ｗ３１１０、シゲラ・フレクスネリ又はエシェリキア・フェルグソニイ由来ＲｈｔＣにＬ６２Ｓ変異を導入した変異型ＲｈｔＣをＴＦ４０７６に導入すると、実施例３、４及び７における結果と同様に、野生型ＲｈｔＣに比べて高いレベルの収率上昇が観察された。
【0168】
よって、基準配列が異なる場合も、本発明の５３番目又は６２番目に相当する位置において他のアミノ酸に置換すると、Ｌ－トレオニン排出能が向上することが分かる。
以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【0169】
【表13】
【0170】
【表14】
【0171】
【表15】
【配列表】