▶ ザ テキサス エー アンド エム ユニバーシティー システムの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-06-13
(45)【発行日】2023-06-21
(54)【発明の名称】抗原特異的抗体を選択的に枯渇させるための融合タンパク質
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20230614BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20230614BHJP
C07K 14/76 20060101ALI20230614BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230614BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20230614BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
C07K14/47
C07K14/76
C07K16/28
C12N15/11 Z
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2019529975
(86)(22)【出願日】2017-12-01
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-01-16
(86)【国際出願番号】 US2017064186
(87)【国際公開番号】W WO2018102668
(87)【国際公開日】2018-06-07
【審査請求日】2020-12-01
(31)【優先権主張番号】62/429,367
(32)【優先日】2016-12-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】504261103
【氏名又は名称】ザ テキサス エー アンド エム ユニバーシティー システム
(74)【代理人】
【識別番号】110000741
【氏名又は名称】弁理士法人小田島特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】オーバー，エリザベス・サリー・ウォード
(72)【発明者】
【氏名】デバナボイナ，ベンカタ・シバ・チャラン
(72)【発明者】
【氏名】オーバー，ライムンド・ヨハネス
【審査官】長谷川 強
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１２－５０３００７（ＪＰ，Ａ）
【文献】The International Journal of BiologicalMarkers, 2004, Vol.19, No.3, p.213-220
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １９／００
Ｃ０７Ｋ １４／４７
Ｃ０７Ｋ １４／７６
Ｃ０７Ｋ １６／２８
Ｃ１２Ｎ １５／１１
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記（Ａ）および（Ｂ）を含むＳｅｌｄｅｇであって、（Ａ）細胞表面受容体又は細胞表面分子に特異的に結合するように構成されるタンパク質又はタンパク質フラグメントを有する標的成分、但し、前記タンパク質又はタンパク質フラグメントは、下記（１）～（３）からなる群より選ばれる：
（１）抗体Ｆｃフラグメントであって、野生型Ｆｃフラグメントと比較して、
（ｉ）６．８より高く且つ７．５未満のｐＨでのＦｃＲｎへの結合親和性は増加するように改変され、且つ
（ｉｉ）ＦｃγＲ及び／又は補体（Ｃ１ｑ）への低下した結合親和性を有するか、或いはＩｇＧ２又はＩｇＧ４由来のＦｃフラグメントである、抗体Ｆｃフラグメント、
（２）細胞表面リガンドに特異的な抗体であって、但し、前記抗体のＦｃフラグメントは、
（ｉ）野生型Ｆｃフラグメントと比較して、ＦｃγＲ及び／又は補体（Ｃ１ｑ）への結合親和性は低下するように改変されているか、或いは
（ｉｉ）ＩｇＧ２又はＩｇＧ４由来のＦｃフラグメントである、抗体、
（３）細胞表面レセプターに対するリガンドであって、但し、前記リガンドは、下記（ｉ）又は（ｉｉ）の抗体Ｆｃフラグメントと融合している
（ｉ）野生型Ｆｃフラグメントと比較して、ＦｃγＲ及び／又は補体（Ｃ１ｑ）への結合親和性は低下するように改変されている抗体Ｆｃフラグメント
（ｉｉ）ＩｇＧ２又はＩｇＧ４由来のＦｃフラグメントである、リガンド、
及び
（Ｂ）標的抗原特異的抗体に特異的に結合するように構成される抗原の１分子を有する１価の抗原成分、
ここで、前記標的成分は前記抗原成分と直接又は間接的に融合していることを特徴とする、Ｓｅｌｄｅｇ。
【請求項2】
前記標的成分は、６．８より高く且つ７．５未満のｐＨにおいて１０μＭ未満の解離定数で細胞表面受容体又は細胞表面分子に結合する、請求項１に記載のＳｅｌｄｅｇ。
【請求項3】
少なくとも１つの第１の標的成分及び第２の標的成分を含み、ここで第１の標的成分のタンパク質又はタンパク質フラグメントは第２の標的成分のタンパク質又はタンパク質フラグメントと異なる細胞表面受容体又は異なる細胞表面分子に結合するように構成されている、請求項１に記載のＳｅｌｄｅｇ。
【請求項4】
前記第１及び第２の標的タンパク質成分は、２つの免疫グロブリンＦｃフラグメントのヘテロダイマーを含み、前記ヘテロダイマーの１つの免疫グロブリンＦｃフラグメントは前記抗原成分に融合し、他の免疫グロブリンＦｃフラグメントは融合していない、請求項３に記載のＳｅｌｄｅｇ。
【請求項5】
前記抗原成分が免疫グロブリンＦｃフラグメントのヒンジ－ＣＨ2－ＣＨ3ドメインのＮ末端又はＣ末端において１つの免疫グロブリンＦｃフラグメントに融合している、請求項１に記載のＳｅｌｄｅｇ。
【請求項6】
前記標的成分は、Ｓｅｌｄｅｇ及び細胞表面受容体又は細胞表面分子を含む複合体のエンドソーム中への進入（ｅｎｔｒｙ）に続いて細胞表面受容体又は細胞表面分子から解離するように構成される、請求項１に記載のＳｅｌｄｅｇ。
【請求項7】
請求項１に記載のＳｅｌｄｅｇであって、前記標的成分が、１つ以上のアルブミン分子、アルブミンフラグメント若しくはＦｃＲｎに特異的に結合するように構成される突然変異アルブミン変異体；
トランスフェリン受容体に結合するように構成される１つ以上の抗体可変ドメイン若しくはナノボディー；
トランスフェリン受容体に結合するように構成される１つ以上のタンパク質分子若しくはタンパク質ドメイン；
ホスファチジルセリンに結合するように構成される１つ以上のタンパク質分子若しくはタンパク質ドメイン；及び／又は
ホスファチジルセリンに結合するように構成される１つ以上の抗体可変ドメイン若しくはナノボディー；
を含む、Ｓｅｌｄｅｇ。
【請求項8】
前記１つ以上のタンパク質分子若しくはタンパク質ドメインは、カルシウム依存性機構を介してホスファチジルセリンに結合するように構成され、或いは、前記標的成分が、シナプトタグミン１のＣ２Ａドメインを含む、請求項７に記載のＳｅｌｄｅｇ。
【請求項9】
患者から標的抗原特異的抗体を枯渇させるための、請求項１から８のいずれかに記載のＳｅｌｄｅｇであって、前記Ｓｅｌｄｅｇが患者中の循環又は標的組織から標的抗原特異的抗体の少なくとも５０％をクリアランスするのに十分な量で患者に投与される、Ｓｅｌｄｅｇ。
【請求項10】
前記Ｓｅｌｄｅｇが投与から２４時間以内に前記患者中の循環又は標的組織から前記標的抗原特異的抗体の少なくとも５０％をクリアランスするのに十分な量、
投与から４８時間以内に前記患者中の循環又は標的組織から前記標的抗原特異的抗体の少なくとも５０％をクリアランスするのに十分な量、或いは
投与から４８時間以内に前記患者中の循環又は標的組織から前記標的抗原特異的抗体の少なくとも９０％をクリアランスするのに十分な量、のいずれかの量で投与される、請求項９に記載のＳｅｌｄｅｇ。
【請求項11】
前記Ｓｅｌｄｅｇが前記循環中又は前記標的抗原特異的抗体が標的とする組織中で非標的抗体の１０％未満をクリアランスする、
前記循環中又は前記標的抗原特異的抗体が標的とする組織中で非標的抗体の１％未満をクリアランスする、或いは
前記患者において臨床的に不利な影響を引き起こさない量の該患者の循環又は標的組織中の標的とされない抗体をクリアランスする、請求項９に記載のＳｅｌｄｅｇ。
【請求項12】
前記Ｓｅｌｄｅｇが自己免疫疾患に冒された患者に投与され、前記標的抗原特異的抗体は自己抗原に特異的に結合するか、
臓器を移植された患者に投与され、前記標的抗原特異的抗体は移植された前記臓器上の抗原に特異的に結合するか、
腫瘍画像化の間にコントラストを増すために投与され、前記標的抗原特異的抗体は腫瘍抗原に特異的に結合するか、
生物学的製剤を受け取った患者に投与され、前記標的抗原特異的抗体は前記生物学的製剤であるか、
前記患者が治療薬に特異的な抗体を有する場合、治療薬の送達の前に該患者に投与され、Ｓｅｌｄｅｇは前記治療薬に関して特異的な抗体を標的とするように構成されるか、或いは
診断用画像化においてコントラストの向上のために投与される、請求項９に記載のＳｅｌｄｅｇ。
【請求項13】
前記Ｓｅｌｄｅｇが細胞表面受容体又は細胞表面分子を発現する細胞によって前記標的抗原特異的抗体の分解を引き起こす、請求項９に記載のＳｅｌｄｅｇ。
【請求項14】
請求項１に記載のＳｅｌｄｅｇであって、前記標的抗原特異的抗体は抗ＭＯＧ抗体であり、
前記標的抗原特異的抗体は抗ＨＥＲ２抗体であり、
当該Ｓｅｌｄｅｇは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、若しくは配列番号３４のアミノ酸配列、又はこれらアミノ酸配列に対し９０％の同一性を有する配列、の少なくとも１つのアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、或いは
当該Ｓｅｌｄｅｇは、ｉ）配列番号２プラス配列番号６、ｉｉ）配列番号４プラス配列番号６、ｉｉｉ）配列番号８プラス配列番号１０、ｉｖ）配列番号１２プラス配列番号１４、ｖ）配列番号１６プラス配列番号１８プラス配列番号２０、ｖｉ）配列番号２０プラス配列番号２２プラス配列番号２４、ｖｉｉ）配列番号２６プラス配列番号２８、ｖｉｉｉ）配列番号３０プラス配列番号６、ｉｘ）配列番号３２プラス配列番号６若しくはｘ）配列番号３４プラス配列番号６のアミノ酸配列、又はこれらアミノ酸配列に対し９０％の同一性を有する配列、を有するタンパク質のヘテロダイマーを含む、Ｓｅｌｄｅｇ。
【請求項15】
請求項１４に記載のＳｅｌｄｅｇであって、前記標的抗原特異的抗体は抗ＭＯＧ抗体であり、
前記標的成分は、下記（ｉ）および（ｉｉ）のヘテロダイマーを含み、
（ｉ）免疫グロブリンＦｃフラグメントに直接又はリンカーを介して連結されたＭＯＧの残基１－１１７；および
（ｉｉ）免疫グロブリンＦｃフラグメント、
ここで、前記免疫グロブリンＦｃフラグメントは、ＩｇＧ１由来であり、ＦＣγＲおよびＣ１ｑへの結合を減少させるためのＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ（ＥＵナンバリングシステム）の変異、およびＦｃＲｎへの結合を増加させるためのＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｆ（ＥＵナンバリングシステム）の変異を含み、
前記ヘテロダイマーの成分（ｉ）は、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、前記ヘテロダイマーの成分（ｉｉ）は、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｓｅｌｄｅｇ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は人為改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）タンパク質、そしてさらに具体的に体から標的抗原特異的抗体を選択的に枯渇させる融合タンパク質（“Ｓｅｌｄｅｇｓ”）に関する。
【背景技術】
【0002】
抗体は、人体及び哺乳類の身体の血液その他の体液中に存在するＹ形のタンパク質である。抗体は体の免疫系の重要な成分である。それらは抗原と呼ばれる異種標的の独特の部分を認識することにより機能する。抗体はその２つの抗原結合部位を介して選択的に抗原を認識し、それへの免疫反応を開始させる（ｔｒｉｇｇｅｒ）ことができる。それぞれの抗原結合部位は、抗体のＹ形の上部先端のそれぞれの末端にある。標的抗原は１つ又は両方の抗原結合部位に結合する場合がある。抗体のＹ形の基部はＦｃフラグメントと呼ばれる。抗体がその標的に結合すると、Ｆｃ領域は抗体エフェクター機能を介して標的クリアランスをもたらすことができる。そのような反応は抗原を破壊するための細胞プロセスを含み得る。ある種の自己免疫疾患及び他の病気において、体における自己抗原を標的とする病原性抗体が作られ、発病に寄与する場合がある。抗体は、細胞から分泌されて血漿中で遊離している可溶性の形態又はＢ細胞の外膜に結合している膜結合形態の２つの物理的形態のいずれかにある場合がある。分泌される抗体は自己反応性抗体を含む疾患における病状（ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）を引き起こす。それらは移植拒絶又はタンパク質に基づく治療の排除にも寄与し得る。
【0003】
標的分子に特異的に結合する抗体の能力の故に、それらを癌及び自己免疫のような疾患の処置に用いることができる。それらは例えばポジトロンエミッショントモグラフィー（ＰＥＴ）において放射性標識抗体を用いる全身画像化の間に腫瘍の検出にも用途を有する。しかしながら、それらの比較的長い生体内持続性（ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ）は非腫瘍組織における高いバックグラウンドに導き、腫瘍画像化に関する劣ったコントラスト及び望ましくないオフターゲット効果を生じ得る。
【発明の概要】
【0004】
本開示は本明細書で“Ｓｅｌｄｅｇｓ”と呼ばれる融合タンパク質を含み、それは抗原特異的抗体の選択的クリアランスを可能にするように構成される。Ｓｅｌｄｅｇは細胞表面受容体又は他の細胞表面分子に特異的に結合するように構成される標的成分及び抗原特異的抗体又はその変異体に特異的に結合するように構成される抗原成分を含む。
【0005】
Ｓｅｌｄｅｇの標的成分は、細胞表面受容体又は他の細胞表面分子に特異的に結合するように構成されるタンパク質又はタンパク質フラグメントを含む。Ｓｅｌｄｅｇの抗原成分は、標的抗原特異的抗体に特異的に結合するように構成される抗原又は抗原フラグメント又は抗原類似物の１分子を含む。抗原成分は標的成分に直接又は間接的に融合している。
【0006】
本開示は、患者中の循環又は標的組織から標的抗原特異的抗体の少なくとも５０％をクリアランスするのに十分な量でＳｅｌｄｅｇを患者に投与することにより、患者から標的抗原特異的抗体を枯渇させる方法も含む。
【0007】
上記のＳｅｌｄｅｇｓ及び方法はさらに以下の詳細を含む場合があり、それらは明らかに互いに排他的でなければ互いと組み合わされる場合がある：ｉ）標的成分は中性近辺のｐＨにおいて１０μＭ未満の解離定数で細胞表面受容体又は細胞表面分子に結合すること
ができる；ｉｉ）中性近辺のｐＨは６．８より高く且つ７．５未満の場合がある；ｉｉｉ）Ｓｅｌｄｅｇは少なくとも１つの第１の標的成分及び第２の標的成分を含むことができ、ここで第１の標的成分のタンパク質又はタンパク質フラグメントは第２の標的成分のタンパク質又はタンパク質フラグメントと異なる細胞表面受容体又は異なる細胞表面分子に結合するように構成される；ｉｖ）標的成分は２つの免疫グロブリンＦｃフラグメントのヘテロダイマーを含む場合があり、そこにおいてヘテロダイマーの１つの免疫グロブリンＦｃフラグメントは抗原成分に融合しており、他の免疫グロブリンＦｃフラグメントは融合していない場合がある；ｖ）免疫グロブリンＦｃフラグメントはＦｃガンマ受容体への結合が実質的に低下しているか又は検出可能な結合をしていない場合がある；ｖｉ）免疫グロブリンＦｃフラグメントはＦｃガンマ受容体又は補体に結合しない免疫グロブリンのクラス又はイソタイプに由来することができる；ｖｉｉ）免疫グロブリンＦｃフラグメントをＦｃガンマ受容体及び補体に結合するように構成することができる；ｖｉｉｉ）免疫グロブリンＦｃフラグメントの少なくとも１つを、中性近辺のｐＨにおいて非修飾免疫グロブリンＦｃフラグメントより高いＦｃＲｎに関する結合親和性を有するように修飾することができる；ｉｘ）抗原成分は、免疫グロブリンＦｃフラグメントのヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインのＮ末端又はＣ末端において１つの免疫グロブリンＦｃフラグメントに融合している場合がある；ｘ）免疫グロブリンＦｃフラグメントをＦｃガンマ受容体及び／又は補体（Ｃ１ｑ）への結合親和性を有していないかあるいは非修飾免疫グロブリンＦｃフラグメントより低いＦｃガンマ受容体及び／又は補体（Ｃ１ｑ）への結合親和性を有するように修飾する場合がある；ｘｉ）標的成分は、細胞表面受容体又は細胞表面分子に特異的に結合するように構成される１つ以上の抗体可変領域又はそのフラグメントを含む場合がある；ｘｉｉ）抗体可変領域又はそのフラグメントは少なくとも１つのナノボディーを含む場合がある；ｘｉｉｉ）ナノボディーはナノボディー多量体の場合があり、そこにおいて１つのナノボディーは抗原成分に融合しており、ナノボディー多量体中の他のすべてのナノボディーは融合していない場合がある；ｘｉｖ）標的成分を、Ｓｅｌｄｅｇ及び細胞表面受容体又は細胞表面分子を含む複合体のエンドソーム中への進入（ｅｎｔｒｙ）に続いて細胞表面受容体又は細胞表面分子から解離するように構成する場合がある；ｘｖ）抗原成分は標的成分上のＮ末端位置又はＣ末端位置に融合している場合がある；ｘｖｉ）抗原成分は標的成分上の非末端位置に融合している場合がある；ｘｖｉｉ）抗原成分は化学反応を介して、リンカーを介して又は１つの組み合わされた抗原成分－標的成分融合タンパク質の形成の間（ｄｕｒｉｎｇ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ－ｔａｒｇｅｔｔｉｎｇ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）に標的成分に融合する場合がある；ｘｖｉｉｉ）標的成分は１つ以上のアルブミン分子、アルブミンフラグメント又はＦｃＲｎに特異的に結合するように構成される突然変異アルブミン変異体の場合がある；ｘｉｘ）標的成分は、トランスフェリン受容体に結合するように構成される１つ以上の抗体可変ドメイン又はナノボディーを含む場合がある；ｘｘ）標的成分は、トランスフェリン受容体に結合するように構成される１つ以上のタンパク質分子又はタンパク質ドメインを含む場合がある；ｘｘｉ）標的成分は、ホスファチジルセリンに結合するように構成される１つ以上のタンパク質分子又はタンパク質ドメインを含む場合がある；ｘｘｉｉ）標的タンパク質成分は、ホスファチジルセリンに結合するように構成される１つ以上の抗体可変ドメイン又はナノボディーを含む場合がある；ｘｘｉｉｉ）１つ以上のタンパク質分子又はタンパク質ドメインを、カルシウム依存性機構を介してホスファチジルセリンに結合するように構成する場合がある；ｘｘｉｖ）標的成分は、シナプトタグミン１のＣ２Ａドメインを含む場合がある；ｘｘｖ）Ｓｅｌｄｅｇは少なくとも１つの第１の抗原成分及び第２の抗原成分を含む場合があり、ここで第１の抗原成分の抗原、抗原フラグメント又は抗原類似物の１分子は第２の抗原成分の抗原分子、抗原フラグメント又は抗原類似物の１分子と異なる；ｘｘｖｉ）Ｓｅｌｄｅｇは少なくとも１つの第１の抗原成分及び第２の抗原成分を含む場合があり、ここで第１の抗原成分の抗原、抗原フラグメント又は抗原類似物の１分子は第２の抗原成分の抗原分子、抗原フラグメント又は抗原類似物の１分子と同じであ
る；ｘｘｖｉｉ）前記方法は、投与から５時間以内に患者中の循環又は標的組織から標的抗原特異的抗体の少なくとも５０％をクリアランスするのに十分な量のＳｅｌｄｅｇを投与することを含む場合がある；ｘｘｖｉｉｉ）前記方法は、中性近辺のｐＨにおいて１０μＭ未満の解離定数で細胞表面受容体又は他の細胞表面分子に結合するように構成されたタンパク質又はタンパク質フラグメントを含む標的成分を有するＳｅｌｄｅｇを投与することを含む場合がある；ｘｘｉｘ）投与されるＳｅｌｄｅｇの十分な量は、枯渇させられるべき標的抗原特異的抗体の量に少なくとも等モルである量の場合がある；ｘｘｘ）前記方法は、投与から２時間以内に患者中の循環又は標的組織から標的抗原特異的抗体の少なくとも９０％をクリアランスするのに十分な量でＳｅｌｄｅｇを投与することを含む場合がある；ｘｘｘｉ）投与から１時間以内に患者中の循環又は標的組織から標的抗原特異的抗体の少なくとも５０％をクリアランスするのに十分な量でＳｅｌｄｅｇを投与する場合がある；ｘｘｘｉｉ）患者の５０％が循環又は標的組織中で閾量の標的抗原特異的抗体を再生したと予想されるときはいつでもＳｅｌｄｅｇを再投与する場合がある；ｘｘｘｉｉｉ）Ｓｅｌｄｅｇは、循環中又は標的抗原特異的抗体が標的とする組織において非標的抗体の１０％未満をクリアランスする場合がある；ｘｘｘｉｖ）Ｓｅｌｄｅｇは、患者において臨床的に不利な影響を引き起こさない量の患者の循環又は標的組織中の標的とされない抗体をクリアランスする場合がある；ｘｘｘｖ）Ｓｅｌｄｅｇは、循環中又は標的抗原特異的抗体が標的とする組織中で非標的抗体の１％未満をクリアランスする場合がある；ｘｘｘｖｉ）Ｓｅｌｄｅｇは、細胞表面受容体又は細胞表面分子を発現する細胞により、標的抗原特異的抗体の分解を引き起こす場合がある；ｘｘｘｖｉｉ）自己免疫疾患に冒された患者にＳｅｌｄｅｇを投与する場合があり、標的抗原特異的抗体は自己抗原に特異的に結合する場合がある；ｘｘｘｖｉｉｉ）移植臓器を受け取った患者にＳｅｌｄｅｇを投与する場合があり、標的抗原特異的抗体は移植臓器上の抗原に特異的に結合する場合がある；ｘｘｘｉｘ）腫瘍画像化の間にコントラストを増すためにＳｅｌｄｅｇを投与する場合があり、標的抗原特異的抗体は腫瘍抗原に特異的に結合する場合がある；ｘｌ）生物学的製剤を受け取った患者にＳｅｌｄｅｇを投与する場合があり、標的抗原特異的抗体は生物学的製剤の場合がある；ｘｌｉ）患者が治療薬に特異的な抗体を有する場合、治療薬の送達の前にＳｅｌｄｅｇを患者に投与する場合があり、Ｓｅｌｄｅｇは治療薬に関して特異的な抗体を標的とするように構成される；ｘｌｉｉ）ＰＥＴ画像コントラスト剤を与えるためにＳｅｌｄｅｇを投与する場合がある；ｘｌｉｉｉ）標的抗原特異的抗体は抗ＭＯＧ抗体の場合がある；ｘｌｉｖ）標的抗原特異的抗体は抗ＨＥＲ２抗体の場合がある；ｘｌｖ）Ｓｅｌｄｅｇは配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２又は配列番号３４あるいはそれらの相同体の少なくとも１つのアミノ酸配列を有するタンパク質を含む場合がある；ｘｌｖｉ）Ｓｅｌｄｅｇは配列番号２プラス配列番号６、配列番号４プラス配列番号６、配列番号８プラス配列番号１０、配列番号１２プラス配列番号１４、配列番号１６プラス配列番号１８プラス配列番号２０、配列番号２０プラス配列番号２２プラス配列番号２４、配列番号２６プラス配列番号２８、配列番号３０プラス配列番号６、配列番号３２プラス配列番号６又は配列番号３４プラス配列番号６又はそれらの相同体のアミノ酸配列を有するタンパク質のヘテロダイマーを含む場合がある。
ができる；ｉｉ）中性近辺のｐＨは６．８より高く且つ７．５未満の場合がある；ｉｉｉ）Ｓｅｌｄｅｇは少なくとも１つの第１の標的成分及び第２の標的成分を含むことができ、ここで第１の標的成分のタンパク質又はタンパク質フラグメントは第２の標的成分のタンパク質又はタンパク質フラグメントと異なる細胞表面受容体又は異なる細胞表面分子に結合するように構成される；ｉｖ）標的成分は２つの免疫グロブリンＦｃフラグメントのヘテロダイマーを含む場合があり、そこにおいてヘテロダイマーの１つの免疫グロブリンＦｃフラグメントは抗原成分に融合しており、他の免疫グロブリンＦｃフラグメントは融合していない場合がある；ｖ）免疫グロブリンＦｃフラグメントはＦｃガンマ受容体への結合が実質的に低下しているか又は検出可能な結合をしていない場合がある；ｖｉ）免疫グロブリンＦｃフラグメントはＦｃガンマ受容体又は補体に結合しない免疫グロブリンのクラス又はイソタイプに由来することができる；ｖｉｉ）免疫グロブリンＦｃフラグメントをＦｃガンマ受容体及び補体に結合するように構成することができる；ｖｉｉｉ）免疫グロブリンＦｃフラグメントの少なくとも１つを、中性近辺のｐＨにおいて非修飾免疫グロブリンＦｃフラグメントより高いＦｃＲｎに関する結合親和性を有するように修飾することができる；ｉｘ）抗原成分は、免疫グロブリンＦｃフラグメントのヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインのＮ末端又はＣ末端において１つの免疫グロブリンＦｃフラグメントに融合している場合がある；ｘ）免疫グロブリンＦｃフラグメントをＦｃガンマ受容体及び／又は補体（Ｃ１ｑ）への結合親和性を有していないかあるいは非修飾免疫グロブリンＦｃフラグメントより低いＦｃガンマ受容体及び／又は補体（Ｃ１ｑ）への結合親和性を有するように修飾する場合がある；ｘｉ）標的成分は、細胞表面受容体又は細胞表面分子に特異的に結合するように構成される１つ以上の抗体可変領域又はそのフラグメントを含む場合がある；ｘｉｉ）抗体可変領域又はそのフラグメントは少なくとも１つのナノボディーを含む場合がある；ｘｉｉｉ）ナノボディーはナノボディー多量体の場合があり、そこにおいて１つのナノボディーは抗原成分に融合しており、ナノボディー多量体中の他のすべてのナノボディーは融合していない場合がある；ｘｉｖ）標的成分を、Ｓｅｌｄｅｇ及び細胞表面受容体又は細胞表面分子を含む複合体のエンドソーム中への進入（ｅｎｔｒｙ）に続いて細胞表面受容体又は細胞表面分子から解離するように構成する場合がある；ｘｖ）抗原成分は標的成分上のＮ末端位置又はＣ末端位置に融合している場合がある；ｘｖｉ）抗原成分は標的成分上の非末端位置に融合している場合がある；ｘｖｉｉ）抗原成分は化学反応を介して、リンカーを介して又は１つの組み合わされた抗原成分－標的成分融合タンパク質の形成の間（ｄｕｒｉｎｇ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ－ｔａｒｇｅｔｔｉｎｇ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）に標的成分に融合する場合がある；ｘｖｉｉｉ）標的成分は１つ以上のアルブミン分子、アルブミンフラグメント又はＦｃＲｎに特異的に結合するように構成される突然変異アルブミン変異体の場合がある；ｘｉｘ）標的成分は、トランスフェリン受容体に結合するように構成される１つ以上の抗体可変ドメイン又はナノボディーを含む場合がある；ｘｘ）標的成分は、トランスフェリン受容体に結合するように構成される１つ以上のタンパク質分子又はタンパク質ドメインを含む場合がある；ｘｘｉ）標的成分は、ホスファチジルセリンに結合するように構成される１つ以上のタンパク質分子又はタンパク質ドメインを含む場合がある；ｘｘｉｉ）標的タンパク質成分は、ホスファチジルセリンに結合するように構成される１つ以上の抗体可変ドメイン又はナノボディーを含む場合がある；ｘｘｉｉｉ）１つ以上のタンパク質分子又はタンパク質ドメインを、カルシウム依存性機構を介してホスファチジルセリンに結合するように構成する場合がある；ｘｘｉｖ）標的成分は、シナプトタグミン１のＣ２Ａドメインを含む場合がある；ｘｘｖ）Ｓｅｌｄｅｇは少なくとも１つの第１の抗原成分及び第２の抗原成分を含む場合があり、ここで第１の抗原成分の抗原、抗原フラグメント又は抗原類似物の１分子は第２の抗原成分の抗原分子、抗原フラグメント又は抗原類似物の１分子と異なる；ｘｘｖｉ）Ｓｅｌｄｅｇは少なくとも１つの第１の抗原成分及び第２の抗原成分を含む場合があり、ここで第１の抗原成分の抗原、抗原フラグメント又は抗原類似物の１分子は第２の抗原成分の抗原分子、抗原フラグメント又は抗原類似物の１分子と同じであ
る；ｘｘｖｉｉ）前記方法は、投与から５時間以内に患者中の循環又は標的組織から標的抗原特異的抗体の少なくとも５０％をクリアランスするのに十分な量のＳｅｌｄｅｇを投与することを含む場合がある；ｘｘｖｉｉｉ）前記方法は、中性近辺のｐＨにおいて１０μＭ未満の解離定数で細胞表面受容体又は他の細胞表面分子に結合するように構成されたタンパク質又はタンパク質フラグメントを含む標的成分を有するＳｅｌｄｅｇを投与することを含む場合がある；ｘｘｉｘ）投与されるＳｅｌｄｅｇの十分な量は、枯渇させられるべき標的抗原特異的抗体の量に少なくとも等モルである量の場合がある；ｘｘｘ）前記方法は、投与から２時間以内に患者中の循環又は標的組織から標的抗原特異的抗体の少なくとも９０％をクリアランスするのに十分な量でＳｅｌｄｅｇを投与することを含む場合がある；ｘｘｘｉ）投与から１時間以内に患者中の循環又は標的組織から標的抗原特異的抗体の少なくとも５０％をクリアランスするのに十分な量でＳｅｌｄｅｇを投与する場合がある；ｘｘｘｉｉ）患者の５０％が循環又は標的組織中で閾量の標的抗原特異的抗体を再生したと予想されるときはいつでもＳｅｌｄｅｇを再投与する場合がある；ｘｘｘｉｉｉ）Ｓｅｌｄｅｇは、循環中又は標的抗原特異的抗体が標的とする組織において非標的抗体の１０％未満をクリアランスする場合がある；ｘｘｘｉｖ）Ｓｅｌｄｅｇは、患者において臨床的に不利な影響を引き起こさない量の患者の循環又は標的組織中の標的とされない抗体をクリアランスする場合がある；ｘｘｘｖ）Ｓｅｌｄｅｇは、循環中又は標的抗原特異的抗体が標的とする組織中で非標的抗体の１％未満をクリアランスする場合がある；ｘｘｘｖｉ）Ｓｅｌｄｅｇは、細胞表面受容体又は細胞表面分子を発現する細胞により、標的抗原特異的抗体の分解を引き起こす場合がある；ｘｘｘｖｉｉ）自己免疫疾患に冒された患者にＳｅｌｄｅｇを投与する場合があり、標的抗原特異的抗体は自己抗原に特異的に結合する場合がある；ｘｘｘｖｉｉｉ）移植臓器を受け取った患者にＳｅｌｄｅｇを投与する場合があり、標的抗原特異的抗体は移植臓器上の抗原に特異的に結合する場合がある；ｘｘｘｉｘ）腫瘍画像化の間にコントラストを増すためにＳｅｌｄｅｇを投与する場合があり、標的抗原特異的抗体は腫瘍抗原に特異的に結合する場合がある；ｘｌ）生物学的製剤を受け取った患者にＳｅｌｄｅｇを投与する場合があり、標的抗原特異的抗体は生物学的製剤の場合がある；ｘｌｉ）患者が治療薬に特異的な抗体を有する場合、治療薬の送達の前にＳｅｌｄｅｇを患者に投与する場合があり、Ｓｅｌｄｅｇは治療薬に関して特異的な抗体を標的とするように構成される；ｘｌｉｉ）ＰＥＴ画像コントラスト剤を与えるためにＳｅｌｄｅｇを投与する場合がある；ｘｌｉｉｉ）標的抗原特異的抗体は抗ＭＯＧ抗体の場合がある；ｘｌｉｖ）標的抗原特異的抗体は抗ＨＥＲ２抗体の場合がある；ｘｌｖ）Ｓｅｌｄｅｇは配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２又は配列番号３４あるいはそれらの相同体の少なくとも１つのアミノ酸配列を有するタンパク質を含む場合がある；ｘｌｖｉ）Ｓｅｌｄｅｇは配列番号２プラス配列番号６、配列番号４プラス配列番号６、配列番号８プラス配列番号１０、配列番号１２プラス配列番号１４、配列番号１６プラス配列番号１８プラス配列番号２０、配列番号２０プラス配列番号２２プラス配列番号２４、配列番号２６プラス配列番号２８、配列番号３０プラス配列番号６、配列番号３２プラス配列番号６又は配列番号３４プラス配列番号６又はそれらの相同体のアミノ酸配列を有するタンパク質のヘテロダイマーを含む場合がある。
【0008】
本発明ならびにその特徴及び利点をさらに完全に理解するために、ここで添付の図面と一緒に理解される以下の記述に言及し、図面は一定の比率で拡大縮小されておらず（ｎｏｔ ｔｏ ｓｃａｌｅ）、図面中で同じ数字は同じ特徴を指す
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】Ｓｅｌｄｅｇの存在下における抗原特異的抗体の分解に導く選ばれた細胞事象（ｃｅｌｌｕａｒ ｅｖｅｎｔｓ）の略図である；
【図2A】ＦｃフラグメントのＮ末端位置に融合した抗原を含むＳｅｌｄｅｇの略図である；
【図2B】ＦｃフラグメントのＣ末端位置に融合した抗原を含むＳｅｌｄｅｇの略図である；
【図2C】Ｆｃフラグメントの非末端位置に融合した抗原を含むＳｅｌｄｅｇの略図である；
【図2D】細胞表面受容体又は細胞表面分子に結合するタンパク質又はタンパク質フラグメントの末端位置に融合した抗原を含むＳｅｌｄｅｇの略図である；
【図2E】細胞表面受容体又は細胞表面分子に結合するタンパク質又はタンパク質フラグメントの非末端位置に融合した抗原を含むＳｅｌｄｅｇの略図である；
【図2F】ＦｃフラグメントのＮ末端位置に融合した抗原及びＦｃフラグメントのＣ末端に融合した細胞表面タンパク質又は細胞表面受容体に結合するタンパク質又はタンパク質フラグメントを含むＳｅｌｄｅｇの略図である；
【図2G】ＦｃフラグメントのＣ末端位置に融合した抗原及びＦｃフラグメントのＮ末端に融合した細胞表面タンパク質又は細胞表面受容体に結合するタンパク質又はタンパク質フラグメントを含むＳｅｌｄｅｇの略図である；
【図2H】細胞表面タンパク質又は細胞表面受容体に結合する抗体のＣ末端位置に融合した抗原を含むＳｅｌｄｅｇの略図である；
【図2I】ＦｃフラグメントのＣ末端位置に融合した抗原及びＦｃフラグメントのＮ末端に融合した細胞表面タンパク質又は細胞表面受容体に結合するｓｃＦｖフラグメントを含むＳｅｌｄｅｇの略図である；
【図2J】ＦｃフラグメントのＮ末端位置に融合した抗原及びＦｃフラグメントのＣ末端に融合した細胞表面タンパク質又は細胞表面受容体に結合するｓｃＦｖフラグメントを含むＳｅｌｄｅｇの略図である；
【図2K】ＦｃフラグメントのＮ末端位置に融合した２種類の抗原を含むＳｅｌｄｅｇの略図である；
【図2L】ＦｃフラグメントのＮ末端位置に融合した２種類の抗原及びＦｃフラグメントのＣ末端に融合した細胞表面タンパク質又は細胞表面受容体に結合するタンパク質又はタンパク質フラグメントを含むＳｅｌｄｅｇの略図である；
【図2M】ＦｃフラグメントのＮ末端位置に融合した２個の抗原分子を含むＳｅｌｄｅｇの略図である；
【図2N】ＦｃフラグメントのＮ末端位置に融合した２個の抗原分子及びＦｃフラグメントのＣ末端に融合した細胞表面タンパク質又は細胞表面受容体に結合するタンパク質又はタンパク質フラグメントを含むＳｅｌｄｅｇの略図である；
【図3A】２つの代表的なＦｃＲｎ標的化Ｓｅｌｄｅｇｓ、ヒト表皮成長因子受容体２Ｓｅｌｄｅｇ（“ＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇ”）及びミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質Ｓｅｌｄｅｇ（“ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ”）の略図である；
【図3B】ｐＨ６．０及び７．４における代表的なＦｃＲｎ標的化ＳｅｌｄｅｇのＦｃＲｎへの結合の増加を示す。
【図3C】ＦｃＲｎ標的化Ｓｅｌｄｅｇの保存安定性を評価するための４℃（３０日）及び３７℃（５日）におけるインキュベーション後の２つの代表的なＦｃＲｎ標的化ＳｅｌｄｅｇｓのＨＰＬＣ分析を示す。
【図3D】代表的な正規化された体カウント（ｂｏｄｙ ｃｏｕｎｔｓ）対時間を報告するグラフを示し、代表的なＦｃＲｎ標的化Ｓｅｌｄｅｇによる抗原特異的抗体のクリアランスを示している；
【図3E】代表的な正規化された血液及び体カウント対時間を報告する追加のグラフを示し、代表的なＦｃＲｎ標的化Ｓｅｌｄｅｇによる抗原特異的抗体のクリアランスを示している；
【図3F】代表的な正規化された血液及び体カウント対時間を報告する追加のグラフを示し、代表的なＦｃＲｎ標的化Ｓｅｌｄｅｇによる抗原特異的抗体のクリアランスを示している；
【図4A】左上のパネルにおいて、ホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合する標的タンパク質（シナプトタグミン１のＣ２Ａドメイン、Ｓｙｔ１）に融合した抗原を含むＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳと呼ばれる代表的なＳｅｌｄｅｇを示し；右上のパネルにおいて図４Ａは、ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ、ＰＳへの結合が実質的に減少する突然変異を有するＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ（ＤＮ）及び抗原（ＭＯＧ）が結合していないＦｃ－Ｓｙｔ１の組換えタンパク質の代表的なＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（還元及び非還元状態）を示し；下のパネルにおいて図４Ａは、右上の図４Ａに示される組換えタンパク質、ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ、ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ（ＤＮ）及びＦｃ－Ｓｙｔ１の代表的なＨＰＬＣ分布を示す；
【図4B】代表的な正規化された血液及び体カウント対時間を報告する追加のグラフを示し、代表的なＰＳ－標的化Ｓｅｌｄｅｇによる抗原特異的抗体のクリアランスを示している；
【図5A】代表的なＦｃＲｎ標的化Ｓｅｌｄｅｇｓ及び参照標準タンパク質の存在下での細胞中における抗原特異的抗体の堆積を示す代表的なデータを報告するグラフを示す；
【図5B】標的抗原特異的抗体の存在下における代表的なＦｃＲｎ標的化Ｓｅｌｄｅｇ及び参照標準タンパク質の代表的な１つのシリーズの顕微鏡画像であり、代表的なエンドソームの顕微鏡画像を切り出し、拡大し、右上の角の差し込み図に示した；
【図5C】標的抗原特異的抗体の存在下における代表的なＦｃＲｎ標的化Ｓｅｌｄｅｇ及び参照標準タンパク質の別のシリーズの代表的な顕微鏡画像であり、代表的なエンドソームの顕微鏡画像を切り出し、拡大し、右上の角の差し込み図に示した；
【図6A】標的抗原特異的抗体の存在下における代表的なＦｃＲｎ標的化Ｓｅｌｄｅｇ及び参照標準タンパク質の別のシリーズの代表的な顕微鏡画像であり、代表的なリソソームの顕微鏡画像を切り出し、拡大し、右上の角の差し込み図に示した；
【図6B】Ｓｅｌｄｅｇが標的としている抗原を認識しない抗原特異的抗体の存在下における代表的なＦｃＲｎ標的化Ｓｅｌｄｅｇの別のシリーズの代表的な顕微鏡画像であり、代表的なリソソームの顕微鏡画像を切り出し、拡大し、右上の角の差し込み図に示した；
【図7】代表的なＰＳ－標的化Ｓｅｌｄｅｇｓ及び参照標準タンパク質の存在下での細胞中における抗原特異的抗体の堆積を示す代表的なデータを報告するグラフを示す。
【図8】トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合する標的タンパク質（抗体）に融合した抗原を含む代表的なＳｅｌｄｅｇの略図である；抗原（ＭＯＧ）が結合していない標的タンパク質（抗体）の分析を含む組換えタンパク質のＨＰＬＣ分布を示す；
【図9】代表的ＴｆＲ－標的化Ｓｅｌｄｅｇ及び参照標準タンパク質の存在下での細胞中における抗原特異的抗体の堆積を示す代表的なデータを報告するグラフである；
【図10A】放射性標識されたＨＥＲ２特異的抗体の送達及び代表的なＦｃＲｎ標的化Ｓｅｌｄｅｇ、参照標準タンパク質又はビヒクル参照標準を用いる処置の後のマウスにおける腫瘍のポジトロンエミッショントモグラフィー（ＰＥＴ）分析の代表的な一系列である。
【図10B】放射性標識されたＨＥＲ２特異的抗体の送達及び代表的なＦｃＲｎ標的化Ｓｅｌｄｅｇ、参照標準タンパク質又はビヒクル参照標準を用いる処置の後の腫瘍保有マウスの腫瘍：胸部領域に関するコントラスト測定値（ｃｏｎｔｒａｓｔ ｍｅａｓｕｒｅｓ）を報告するグラフを示す。
【0010】
発明の詳細な説明
本開示は人為改変タンパク質、そしてさらに具体的に体からの枯渇のために抗原特異的抗体を選択的に標的とするように構成される融合タンパク質であるＳｅｌｄｅｇｓに関する。Ｓｅｌｄｅｇｓは、抗原特異的抗体に結合し、分解酵素を含有する後期エンドソーム又はリソソームにそれらを向けることにより、標的とされる抗原特異的抗体の選択的な分解を引き起こす。Ｓｅｌｄｅｇは、少なくとも１つの標的成分及び抗原成分を含む融合タンパク質又は分子である。標的成分は細胞表面受容体又は他の細胞表面分子に結合するよ
うに構成されるタンパク質又はタンパク質フラグメント又は他の分子を含む。抗原成分は、標的とされる抗原特異的抗体により認識される抗原、抗原フラグメント又は抗原類似物の１分子を含む。
本開示は人為改変タンパク質、そしてさらに具体的に体からの枯渇のために抗原特異的抗体を選択的に標的とするように構成される融合タンパク質であるＳｅｌｄｅｇｓに関する。Ｓｅｌｄｅｇｓは、抗原特異的抗体に結合し、分解酵素を含有する後期エンドソーム又はリソソームにそれらを向けることにより、標的とされる抗原特異的抗体の選択的な分解を引き起こす。Ｓｅｌｄｅｇは、少なくとも１つの標的成分及び抗原成分を含む融合タンパク質又は分子である。標的成分は細胞表面受容体又は他の細胞表面分子に結合するよ
うに構成されるタンパク質又はタンパク質フラグメント又は他の分子を含む。抗原成分は、標的とされる抗原特異的抗体により認識される抗原、抗原フラグメント又は抗原類似物の１分子を含む。
【0011】
抗原特異的抗体が抗原成分に結合すると、Ｓｅｌｄｅｇ及び抗原特異的抗体を含む複合体が形成される。複合体は細胞表面受容体又は他の細胞表面分子に結合するようにも構成されており、Ｓｅｌｄｅｇ、抗原特異的抗体及び標的とされる細胞表面受容体又は他の細胞表面分子を含む複合体の細胞内移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を可能にする（図１を参照されたい）。標的とされる細胞表面受容体又は細胞表面分子は、エンドソーム中に入ると、酸性のｐＨ、低いカルシウム濃度及び／又は細胞外環境からエンドソーム環境を区別する他の条件の故に、複合体から解離する場合がある。エンドソーム中への移行及びリソソーム進入は、複合体の選択的な分解を生ずる。
【0012】
本明細書で用いられる「抗原特異的抗体」という用語は、特定の抗原、抗原フラグメント又は抗原類似物に結合する抗体を指す。
【0013】
本明細書で用いられる「抗原フラグメント」という用語は、抗原特異的抗体により認識されることができる抗原の一部を指す。
【0014】
本明細書で用いられる「抗原類似物」という用語は、抗原特異的抗体により認識される抗原の一部と同じ全体的な形及び性質を有するタンパク質、タンパク質フラグメント、ペプチド又は他の分子を指す。
【0015】
本明細書で用いられる「細胞表面分子」という用語は、細胞の原形質膜上に露出しているタンパク質又は他の生体分子（例えばリン脂質、炭水化物）を指す。
【0016】
Ｓｅｌｄｅｇは、ＩｇＧ抗体のＦｃフラグメント（本明細書で「免疫グロブリンＦｃフラグメント」とも呼ばれる）に融合した抗原、ＦｃＲｎ特異的ナノボディー－抗原融合分子、その可変領域を介してＦｃＲｎに結合し、抗原に融合しているＦｃＲｎ特異的抗体、アルブミン－抗原融合タンパク質、ＰＳ結合性タンパク質、ＴｆＲ特異的抗体あるいは本開示を読むと当業者が同定することができる細胞表面受容体又は他の細胞表面分子に結合するように構成される他のタンパク質、タンパク質フラグメント又は他の分子を含む場合がある。
【0017】
本明細書に説明されるＳｅｌｄｅｇｓの例は、中性近辺のｐＨにおいて１０μＭ未満の親和性（解離定数）を以てヒトＦｃＲｎ、露出したホスファチジルセリン（ＰＳ）又はトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）のような細胞表面分子に結合するように構成される標的成分を含む。
【0018】
ＦｃＲｎ及びＴｆＲはタンパク質であり、ＰＳはリン脂質であり、それらは体内の多種の細胞タイプの表面上及び内部に見出される場合がある。本発明はこれらの受容体又は細胞表面分子を標的とすることに制限されず、当業者が同定可能な他のものの中でも低密度リポタンパク質受容体、高密度リポタンパク質受容体、アシアロ糖タンパク質受容体、阻害性（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）Ｆｃガンマ受容体、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、Ｇタンパク質共役受容体、インスリン受容体、グルカゴン受容体、ガラクトース受容体、マンノース受容体、ＶＥＧＦ受容体、マンノース受容体のような多くの他の標的が包含され得る。他の標的を例えば以下の出版物又はデータベースにおいて同定することができる：Ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｔｌａｓ（Ｂａｕｓｃｈ－Ｆｌｕｃｋ，Ｄ．，Ｈｏｆｍａｎｎ，Ａ．，Ｂｏｃｋ，Ｔ．，Ｆｒｅｉ，Ａ．Ｐ．，Ｃｅｒｃｉｅｌｌｏ，Ｆ．，Ｊａｃｏｂｓ，Ａ．，Ｍｏｅｓｔ，Ｈ．，Ｏｍａｓｉｔｓ，Ｕ．，Ｇｕｎｄｒｙ
，Ｒ．Ｌ．，Ｙｏｏｎ，Ｃ．，Ｓｃｈｉｅｓｓ，Ｒ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ａ．，Ｍｉｒｋｏｗｓｋａ，Ｐ．，Ｈａｅｒｔｌｏｖａ，Ａ．，Ｖａｎ Ｅｙｋ，Ｊ．Ｅ．，Ｂｏｕｒｑｕｉｎ，Ｊ－Ｐ．，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．，Ｂｏｈｅｌｅｒ，Ｋ．Ｒ．，Ｚａｎｄｓｔｒａ，Ｐ．，Ｗｏｌｌｓｃｈｅｉｄ，Ｂ．（２０１５）Ａ ｍａｓｓ ｓｐｅｒｔｏｍｅｔｒｉｃ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｔｌａｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０：ｅ０１２１３１４）及びｔｈｅ Ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｔｌａｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／ｈｕｍａｎｐｒｏｔｅｏｍｅ／ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）。
，Ｒ．Ｌ．，Ｙｏｏｎ，Ｃ．，Ｓｃｈｉｅｓｓ，Ｒ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ａ．，Ｍｉｒｋｏｗｓｋａ，Ｐ．，Ｈａｅｒｔｌｏｖａ，Ａ．，Ｖａｎ Ｅｙｋ，Ｊ．Ｅ．，Ｂｏｕｒｑｕｉｎ，Ｊ－Ｐ．，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．，Ｂｏｈｅｌｅｒ，Ｋ．Ｒ．，Ｚａｎｄｓｔｒａ，Ｐ．，Ｗｏｌｌｓｃｈｅｉｄ，Ｂ．（２０１５）Ａ ｍａｓｓ ｓｐｅｒｔｏｍｅｔｒｉｃ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｔｌａｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０：ｅ０１２１３１４）及びｔｈｅ Ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｔｌａｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／ｈｕｍａｎｐｒｏｔｅｏｍｅ／ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）。
【0019】
標的成分は中性近辺のｐＨにおいて１０μＭ未満の親和性（解離定数）で細胞表面受容体又は他の細胞表面分子に結合することができる。
【0020】
従ってＳｅｌｄｅｇの標的成分は、細胞表面受容体又は他の細胞表面分子に特異的に結合するように構成されるいずれの型の分子も含むことができる。そのような分子には、タンパク質、タンパク質フラグメント、リボ核酸又はデオキシリボ核酸のようなポリヌクレオチド、ポリペプチド、多糖類、脂質、アミノ酸、ペプチド、糖類ならびに／或いは本開示を読むと当業者が同定することができる他の小分子又は大分子及び／又はポリマーが含まれ得る。例えばＳｅｌｄｅｇの標的成分は細胞受容体に関するリガンドであるポリヌクレオチドを含むことができる。
【0021】
Ｓｅｌｄｅｇは少なくとも１つの第１の標的成分及び第２の標的成分を含むことができ、ここで第１の標的成分のタンパク質又はタンパク質フラグメントは第２の標的成分のタンパク質又はタンパク質フラグメントと異なる細胞表面受容体又は異なる細胞表面分子に結合することように構成される。
【0022】
図１に示される通り、Ｓｅｌｄｅｇ２０は細胞１０の表面上の細胞表面受容体又は他の分子３０に可逆的に結合する場合がある。細胞外空間５０に存在する標的抗原特異的抗体４０はＳｅｌｄｅｇ２０に可逆的に結合する場合がある。この結合は典型的に６．８より高く且つ７．５未満のｐＨのような中性近辺のｐＨにおいて起こり、それは、それが細胞外空間５０の典型的なｐＨだからである。非標的抗体６０はＳｅｌｄｅｇ２０に結合しないか又はいずれの結合も非特異的であるほど非常に低い親和性で結合する。Ｓｅｌｄｅｇ２０及び標的抗原特異的抗体４０が結合した細胞表面受容体又は分子３０は経路Ａを介し、エンドソーム７０中への受容体媒介吸収を介して細胞１０内に移行する。受容体又は他の分子を細胞の表面に再循環させて戻すことができる。従って経路Ｂ上で、Ｓｅｌｄｅｇ２０及び標的抗原特異的抗体４０が結合した受容体又は分子３０を細胞１０の表面に循環させて戻す。次いで標的抗原特異的抗体４０は放出される場合があり、Ｓｅｌｄｅｇ２０から同じ又は別のＳｅｌｄｅｇに再結合する場合があるか又はそれは結合したままの場合がある。類似して、Ｓｅｌｄｅｇ２０は次いで受容体又は分子３０から放出される場合があり、同じ又は別の細胞表面受容体又は分子に再結合する場合がある。いくつかのＳｅｌｄｅｇｓの場合、Ｓｅｌｄｅｇ２０と抗体４０の複合体は、初期又は後期エンドソーム中でこの区画内の酸性のｐＨ又は低いＣａ－２濃度の故に受容体又は他の分子３０から解離する場合がある（経路Ｃ）。従って、経路Ｄにおいて受容体又は細胞表面分子は細胞表面に再循環して戻る場合があるが、抗体４０に結合したＳｅｌｄｅｇ２０はリソソーム中に入り、経路Ｅにおいてフラグメント８０に分解する。いくつかのＳｅｌｄｅｇｓの場合、細胞１０中への移行に続くいくつかの時点に、Ｓｅｌｄｅｇ２０及び標的抗原特異的抗体４０が結合した受容体又は分子３０は経路Ｆにおいて後期エンドソーム／リソソームに入り、そこで少なくとも標的抗原特異的抗体４０はフラグメント８０に分解する。このリソソーム中への進入は、Ｓｅｌｄｅｇ２０が受容体又は分子３０を二量体又はもっと高次の凝集物に架橋すると増加すると思われる。
【0023】
選択的枯渇のこの機構を介し、Ｓｅｌｄｅｇは標的とされない特異性の抗体のレベルに不利に影響せずに抗原特異的抗体を標的とし、体から選択的に枯渇させる。
【0024】
特に本明細書に説明されるＳｅｌｄｅｇは、標的とされない特異性の抗体の枯渇の故の患者における不利な臨床的影響を有することなく、抗原特異的抗体を標的とし、体から選択的に枯渇させることができる。そのような不利な臨床的影響には、例えば免疫抑制ならびに流行性結膜炎、気管支炎、耳感染症、副鼻腔感染症、風邪、下痢、肺炎、カンジダ症、髄膜炎、皮膚感染症及び他の日和見感染症、特に通常は抗体媒介免疫反応を介して抑制される日和見感染症のようなその症状；ならびに低血小板数（ｌｏｗ ｐｌａｔｅｌｅｔ
ｃｏｕｎｔｓ）又は貧血のような血液疾患ならびに低ガンマグロブリン血症及び腹痛、鼓張、吐き気、嘔吐、下痢又は体重減少のようなその症状が含まれる。
ｃｏｕｎｔｓ）又は貧血のような血液疾患ならびに低ガンマグロブリン血症及び腹痛、鼓張、吐き気、嘔吐、下痢又は体重減少のようなその症状が含まれる。
【0025】
一般に本開示に従うＳｅｌｄｅｇｓは、中性近辺のｐＨにおいて標的成分を介して細胞表面受容体／分子に特異的に結合するように且つ標的成分に直接又は間接的に融合した抗原成分を介して中性近辺のｐＨにおいて抗原特異的抗体にも特異的に結合するように構成される。本明細書で用いられる「特異的に結合する」という用語は、標的成分と細胞表面受容体／分子の間又は抗原成分と抗原特異的抗体の間の検出可能な選択的分子間相互作用を指す。例えば特異的に結合するために、抗原は標的とされている抗体との検出可能な相互作用を示す必要があり、一方で他の抗体との検出可能な相互作用を示さないことが必要である。特異的な結合の検出法は、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴分析及び当業者により同定され得る他の方法のように当該技術分野内で既知である。
【0026】
従ってＳｅｌｄｅｇは、患者の循環中の抗原特異的抗体の少なくとも一部が、標的とされる細胞表面受容体又は標的とされる他の細胞表面分子を発現する細胞中に移行し、その後細胞内で分解することを可能にする。
【0027】
本開示に従うＳｅｌｄｅｇは、抗原、抗原フラグメント又は抗原類似物の各型の、他の場合に本明細書で「１分子」と呼ばれるＳｅｌｄｅｇ当たりに１つのコピーを含有することにより免疫反応を避ける場合があり、それはＦｃガンマ受容体結合及び／又は補体結合を減少させるか又は排除する突然変異の挿入と組み合わされて、抗体架橋及びおそらく炎症性の免疫複合体の形成を減少させると思われる。特にＳｅｌｄｅｇｓの少なくとも９９％、Ｓｅｌｄｅｇｓの少なくとも９９．５％又はＳｅｌｄｅｇｓの少なくとも９９．９％は、中性近辺のｐＨにおいて抗原、抗原フラグメント又は抗原類似物のＳｅｌｄｅｇ当たりに１つのコピーのみを含有する場合がある。本開示に従う他のＳｅｌｄｅｇｓは、抗原、抗原フラグメント又は抗原類似物の１つより多い分子を含有することができる。Ｓｅｌｄｅｇ分子当たりに１つの抗原の分子を含有するＳｅｌｄｅｇｓが結合する抗体の２価性（ｂｉｖａｌｅｎｔ ｎａｔｕｒｅ）は、抗体当たりに２つのＳｅｌｄｅｇ分子の複合体を生ずる場合があり、それは標的受容体二量化を介してＳｅｌｄｅｇ－抗体複合体のリソソーム送達の有効性を向上させると思われる。
【0028】
Ｓｅｌｄｅｇは少なくとも１つの第１の抗原成分及び第２の抗原成分を含むことができ、ここで第１の抗原成分の抗原、抗原フラグメント又は抗原類似物の１分子は第２の抗原成分の抗原分子、抗原フラグメント又は抗原類似物の１分子と異なる。従って少なくとも１つの第１の抗原成分及び第２の抗原成分を含むＳｅｌｄｅｇｓは１つより多い特異性の抗原特異的抗体のクリアランスを可能にする。
【0029】
Ｓｅｌｄｅｇは少なくとも１つの第１の抗原成分及び第２の抗原成分を含むことができ、ここで第１の抗原成分の抗原、抗原フラグメント又は抗原類似物の１分子は第２の抗原成分の抗原分子、抗原フラグメント又は抗原類似物の１分子と同じである。
【0030】
従ってＳｅｌｄｅｇｓは、例えば標的成分のＣ末端及び／又はＮ末端に融合した１つ以上の抗原成分を含むことができ、ここでそれぞれの抗原成分の抗原、抗原フラグメント又は抗原類似物の１分子は同じ又は異なることができる。
【0031】
さらにＳｅｌｄｅｇｓは、ヒトに投与する場合のＳｅｌｄｅｇへの免疫反応の可能性を避けるか又は低下させるために、ヒト又はヒト化タンパク質又はタンパク質フラグメントを含有する場合がある。抗原成分の抗原、抗原フラグメント又は抗原類似物は、好ましくはヒトへのＳｅｌｄｅｇの投与のためにヒトタンパク質又はタンパク質フラグメントである。標的成分も、ヒトへのＳｅｌｄｅｇの投与のために、好ましくはヒト抗体フラグメント又はヒトアルブミン又はアルブミンフラグメントのようなヒトタンパク質又はタンパク質フラグメントあるいはヒト化抗体又はヒト化抗体フラグメントである。Ｓｅｌｄｅｇをヒト以外の動物における使用のために開発する場合、その動物に由来するか又はその動物と免疫学的に適合性であるように改変されたタンパク質又はタンパク質フラグメントを代わりに用いる場合がある。
【0032】
図２Ａは、ＩｇＧのＦｃフラグメント１１０を有する標的成分に融合した抗原１００を含むＳｅｌｄｅｇ２０ａの活性の略図である。当業者が理解する通り、ＩｇＧのＦｃフラグメントは抗体のＹ形の基部（ｌｏｗｅｒ ｂａｓｅ）のすべてであり、それはスルフヒドリル架橋ヒンジ領域及びＣＨ２及びＣＨ３ドメインである。Ｓｅｌｄｅｇはヒンジ領域を有していないＦｃフラグメントを有する場合があるか、又はヒンジ領域がスルフヒドリル架橋を有していないＦｃフラグメントを有する場合がある。Ｆｃフラグメント１１０はＳｅｌｄｅｇ２０ａがＦｃＲｎ発現細胞上のＦｃＲｎ分子に結合するのを可能にする。図２Ａに示される例において、抗原１００はヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３１２０のＮ末端においてＦｃフラグメント１１０ａに融合する場合がある。抗原１００をＦｃフラグメント１１０ａに融合させ、得られる抗原－Ｆｃフラグメントをノブズイントゥホールズ（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）戦略（例えばＭｏｏｒｅ，Ｇ．Ｌ．，Ｂａｕｔｉｓｔａ，Ｃ．，Ｐｏｎｇ，Ｅ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｄ．Ｈ．，Ｊａｃｉｎｔｏ，Ｊ．，Ｅｉｖａｚｉ，Ａ．，Ｍｕｃｈｈａｌ，Ｕ．Ｓ．，Ｋａｒｋｉ，Ｓ．，Ｃｈｕ，Ｓ．Ｙ．，Ｌａｚａｒ，Ｇ．Ａ．，（２０１１）．Ａ ｎｏｖｅｌ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒｍａｔ ｅｎａｂｌｅｓ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎｄ
ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｃｏ－ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔａｒｇｅｔ ａｎａｔｉｇｅｎｓ．ＭＡｂｓ ３，５４６－５５７に説明されているような）を用いて抗原のない別のＦｃフラグメント１１０ｂと二量化させると、示されているようなヘテロダイマー的Ｓｅｌｄｅｇ分子２０ａが生産される。Ｓｅｌｄｅｇ２０ａは抗原１００がモノマー的に表示されたＦｃフラグメントを有し、それは炎症又は他の不利な影響を引き起こし得る多量体的免疫複合体の形成を避ける。Ｆｃフラグメント１１０ａに融合した抗原１００のみを含むＳｅｌｄｅｇｓが生産され、いくつかの状況において用いられる場合があるが、Ｆｃフラグメントの二量化する傾向の故に、典型的に二量体が生産されるであろう。多量体的免疫複合体の形成に導き得る両方のＦｃフラグメント１１０ａが融合抗原１００を有するＦｃフラグメント二量体を避けるために、Ｓｅｌｄｅｇｓはノブズイントウホールズ突然変異及び／又は静電ステアリング突然変異（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｅｒｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）（例えばＧｕｎａｓｅｋａｒａｎ，Ｋ．，Ｐｅｎｔｏｎｙ，Ｍ．，Ｓｈｅｎ，Ｍ．，Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｌ．，Ｆｏｒｔｅ，Ｃ．，Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ａ．，Ｎｇ，Ｓ．Ｂ．，Ｂｏｒｎ，Ｔ．，Ｒｅｔｔｅｒ，Ｍ．，Ｍａｎｃｈｕｌｅｎｋｏ，Ｋ．，Ｓｗｅｅｔ，Ｈ．，Ｆｏｌｔｚ，Ｉ．Ｎ．，Ｗｉｔｔｅｋｉｎｄ，Ｍ．，Ｙａｎ，Ｗ．（２０１０） Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｅｒｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ＩｇＧ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８５，１９６３７－１９６４６に説明されているような）を
用いてヘテロダイマー形成を促進するように設計され、従って１つの抗原が融合したＦｃは１つしかない。ヘテロダイマーの形成のために、抗原－Ｆｃ融合体のＣ末端と第２のＦｃフラグメントのＮ末端の間における（Ｇ４Ｓ）１３リンカーペプチドの挿入（例えばＺｈｏｕ，Ｌ．，Ｗａｎｇ，Ｈ－Ｙ．，Ｔｏｎｇ，Ｓ．，Ｏｋａｍｏｎｏ，Ｃ．Ｔ．，Ｓｈｅｎ，Ｗ－Ｃ．，Ｚａｒｏ，Ｊ．Ｌ．（２０１６） Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｃ－ｄｉｍｅｒ－ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１１７，２４－３１に説明されているような）のような他の方法を用いることもできる。ノブズイントウホールズ突然変異、静電ステアリング突然変異及び／又はアルギニン突然変異あるいはＦｃガンマ受容体及び補体結合を減少させる他の突然変異を含むＳｅｌｄｅｇｓのいくつかの例のＤＮＡ配列及びタンパク質配列を実施例１０に説明する。
ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｃｏ－ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔａｒｇｅｔ ａｎａｔｉｇｅｎｓ．ＭＡｂｓ ３，５４６－５５７に説明されているような）を用いて抗原のない別のＦｃフラグメント１１０ｂと二量化させると、示されているようなヘテロダイマー的Ｓｅｌｄｅｇ分子２０ａが生産される。Ｓｅｌｄｅｇ２０ａは抗原１００がモノマー的に表示されたＦｃフラグメントを有し、それは炎症又は他の不利な影響を引き起こし得る多量体的免疫複合体の形成を避ける。Ｆｃフラグメント１１０ａに融合した抗原１００のみを含むＳｅｌｄｅｇｓが生産され、いくつかの状況において用いられる場合があるが、Ｆｃフラグメントの二量化する傾向の故に、典型的に二量体が生産されるであろう。多量体的免疫複合体の形成に導き得る両方のＦｃフラグメント１１０ａが融合抗原１００を有するＦｃフラグメント二量体を避けるために、Ｓｅｌｄｅｇｓはノブズイントウホールズ突然変異及び／又は静電ステアリング突然変異（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｅｒｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）（例えばＧｕｎａｓｅｋａｒａｎ，Ｋ．，Ｐｅｎｔｏｎｙ，Ｍ．，Ｓｈｅｎ，Ｍ．，Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｌ．，Ｆｏｒｔｅ，Ｃ．，Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ａ．，Ｎｇ，Ｓ．Ｂ．，Ｂｏｒｎ，Ｔ．，Ｒｅｔｔｅｒ，Ｍ．，Ｍａｎｃｈｕｌｅｎｋｏ，Ｋ．，Ｓｗｅｅｔ，Ｈ．，Ｆｏｌｔｚ，Ｉ．Ｎ．，Ｗｉｔｔｅｋｉｎｄ，Ｍ．，Ｙａｎ，Ｗ．（２０１０） Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｅｒｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ＩｇＧ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８５，１９６３７－１９６４６に説明されているような）を
用いてヘテロダイマー形成を促進するように設計され、従って１つの抗原が融合したＦｃは１つしかない。ヘテロダイマーの形成のために、抗原－Ｆｃ融合体のＣ末端と第２のＦｃフラグメントのＮ末端の間における（Ｇ４Ｓ）１３リンカーペプチドの挿入（例えばＺｈｏｕ，Ｌ．，Ｗａｎｇ，Ｈ－Ｙ．，Ｔｏｎｇ，Ｓ．，Ｏｋａｍｏｎｏ，Ｃ．Ｔ．，Ｓｈｅｎ，Ｗ－Ｃ．，Ｚａｒｏ，Ｊ．Ｌ．（２０１６） Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｃ－ｄｉｍｅｒ－ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１１７，２４－３１に説明されているような）のような他の方法を用いることもできる。ノブズイントウホールズ突然変異、静電ステアリング突然変異及び／又はアルギニン突然変異あるいはＦｃガンマ受容体及び補体結合を減少させる他の突然変異を含むＳｅｌｄｅｇｓのいくつかの例のＤＮＡ配列及びタンパク質配列を実施例１０に説明する。
【0033】
ノブズイントウホールズ突然変異の追加の例には、当業者が同定可能な他のものの中でもＹ３４９Ｔ／Ｔ３９４Ｆ：Ｓ３６４Ｈ／Ｆ４０５Ａ及びＹ３４９Ｔ／Ｆ４０５Ｆ：Ｓ３６４Ｈ／Ｔ３９４Ｆ（例えばＭｏｏｒｅ，Ｇ．Ｌ．，Ｂａｕｔｉｓｔａ，Ｃ．，Ｐｏｎｇ，Ｅ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｄ．Ｈ．，Ｊａｃｉｎｔｏ，Ｊ．，Ｅｉｖａｚｉ，Ａ．，Ｍｕｃｈｈａｌ，Ｕ．Ｓ．，Ｋａｒｋｉ，Ｓ．，Ｃｈｕ，Ｓ．Ｙ．，Ｌａｚａｒ，Ｇ．Ａ．，（２０１１） Ａ ｎｏｖｅｌ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒｍａｔ
ｅｎａｂｌｅｓ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎｄ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｃｏ－ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔａｒｇｅｔ ａｎａｔｉｇｅｎｓ．ＭＡｂｓ ３，５４６－５５７に説明されているような）ならびにＴ３６６Ｗ：Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ（例えばＡｔｗｅｌｌ，Ｓ．，Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．Ｂ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ（１９９７） Ｓｔａｂｅｌ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ ｆｒｏｍ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｔｈｅ ｄｏｍａｉｎ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｏｆ ａ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ ｕｓｉｎｇ ａ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂａｒｙ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７０，２６－３５に説明されているような）が含まれる。これらの代表的なノブズイントウホールズ突然変異の残基のナンバリング（ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）は、当業者が理解する通り、ＥＵ抗体ナンバリングシステムを指す。
ｅｎａｂｌｅｓ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎｄ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｃｏ－ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔａｒｇｅｔ ａｎａｔｉｇｅｎｓ．ＭＡｂｓ ３，５４６－５５７に説明されているような）ならびにＴ３６６Ｗ：Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ（例えばＡｔｗｅｌｌ，Ｓ．，Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．Ｂ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ（１９９７） Ｓｔａｂｅｌ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ ｆｒｏｍ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｔｈｅ ｄｏｍａｉｎ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｏｆ ａ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ ｕｓｉｎｇ ａ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂａｒｙ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７０，２６－３５に説明されているような）が含まれる。これらの代表的なノブズイントウホールズ突然変異の残基のナンバリング（ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）は、当業者が理解する通り、ＥＵ抗体ナンバリングシステムを指す。
【0034】
静電ステアリング突然変異の追加の例には、当業者が同定可能な他のものの中でもＥ３５６Ｋ／Ｄ３９９Ｋ：Ｋ３９２Ｄ／Ｋ４０９Ｄ及びＫ４０９Ｄ／Ｋ３７０Ｄ：Ｄ３５７Ｋ／Ｄ３９９Ｋ（例えばＧｕｎａｓｅｋａｒａｎ，Ｋ．，Ｐｅｎｔｏｎｙ，Ｍ．，Ｓｈｅｎ，Ｍ．，Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｌ．，Ｆｏｒｔｅ，Ｃ．，Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ａ．，Ｎｇ，Ｓ．Ｂ．，Ｂｏｒｎ，Ｔ．，Ｒｅｔｔｅｒ，Ｍ．，Ｍａｎｃｈｕｌｅｎｋｏ，Ｋ．，Ｓｗｅｅｔ，Ｈ．，Ｆｏｌｔｚ，Ｉ．Ｎ．，Ｗｉｔｔｅｋｉｎｄ，Ｍ．，Ｙａｎ，Ｗ．（２０１０） Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｅｒｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ＩｇＧ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８５，１９６３７－１９６４６に説明されているような）が含まれる。これらの代表的な静電ステアリング突然変異の残基のナンバリングは、当業者が理解する通り、ＥＵ抗体ナンバリングシステムを指す。
【0035】
アルギニン突然変異又はＦｃガンマ受容体及び補体（Ｃ１ｑ）への結合を減少させる他の突然変異の追加の例には、当業者が同定可能な他のものの中でもＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ（例えばＨｏｒｔｏｎ，Ｈ．Ｍ．，Ｂｅｒｎｅｔｔ，Ｍ．Ｊ．，Ｐｏｎｇ，Ｅ．，Ｐｅｉｐｐ，Ｍ．，Ｋａｒｋｉ，Ｓ．，Ｃｈｕ，Ｓ．Ｙ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｊ．Ｏ．，Ｖｏｓｔｉａｒ，Ｉ．，Ｊｏｙｃｅ，Ｐ．Ｆ．，Ｒｅｐｐ，Ｒ．，Ｄａｓｊａｒｌａｉｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｚｈｕｋｏｓｋｙ，Ｅ．（２０１０） Ｐｏｔｅｎｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａ
ｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎ Ｆｃ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｌｙｍｐｈｏｍａ ａｎｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６８，８０４９－８０５７；Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｌ．，Ｂａｕｔｉｓｔａ，Ｃ．，Ｐｏｎｇ，Ｅ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｄ．Ｈ．，Ｊａｃｉｎｔｏ，Ｊ．，Ｅｉｖａｚｉ，Ａ．，Ｍｕｃｈｈａｌ，Ｕ．Ｓ．，Ｋａｒｋｉ，Ｓ．，Ｃｈｕ，Ｓ．Ｙ．，Ｌａｚａｒ，Ｇ．Ａ．，（２０１１） Ａ ｎｏｖｅｌ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒｍａｔ ｅｎａｂｌｅｓ
ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎｄ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｃｏ－ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔａｒｇｅｔ ａｎａｔｉｇｅｎｓ．ＭＡｂｓ ３，５４６－５５７に説明されているような）、Ｎ２９７Ａ又はＮ２９７Ｑ（例えばＴａｏ，Ｍ－Ｈ．，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８９） Ｓｔｕｄｉｅｓ
ｏｆ ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｍｏｕｓｅ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ：ｒｏｌｅ ｏｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｕ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３，２５９５－２６０１；Ｌｕｘ，Ａ．，Ｙｕ，Ｘ．，Ｓｃａｎｌａｎ，Ｃ．Ｎ．，Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｆ．（２０１３） Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ ＩｇＧ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｈｕｍａｎ ＦｃγＲｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９０，４３１５－４３２３に説明されているような）、Ｄ２６５Ａ（例えばＬｕｘ，Ａ．，Ｙｕ，Ｘ．，Ｓｃａｎｌａｎ，Ｃ．Ｎ．，Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｆ．（２０１３） Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ ＩｇＧ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｈｕｍａｎ ＦｃγＲｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９０，４３１５－４３２３；Ｃｌｙｎｅｓ，Ｒ．Ａ．，Ｔｏｗｅｒｓ，Ｔ．Ｌ．，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．，Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．（２０００） Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６，４４３－４４６に説明されているような）、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（例えばＷｉｎｓ，Ｂ．Ｄ．，Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｓ．，Ｐａｒｒｅｎ，Ｐ．Ｗ．Ｈ．Ｉ．，Ｂａｒｎｅｓ，Ｎ．，Ｈｏｇａｒｔｈ，Ｐ．Ｍ．，（２０００） Ｔｈｅ ＩｇＧ Ｆｃ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦｃＲ） ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ：ｔｈｅ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ＦｃγＲＩ ａｎｄ ＦｃγＲＩＩａ ｂｉｎｄ
ｔｏ ａ ｒｅｇｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｆｃ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ｔｈａｔ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｎｅｏｎａｔａｌ ＦｃＲ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４，５３１３－５３１８に説明されているような）及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ（例えばＳｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ，Ｔ．，Ｈｅｒｔｅｒ，Ｓ．，Ｋｏｌｌｅｒ，Ｃ．Ｆ．，Ｇｒａｕ－Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｓ．，Ｓｔｅｉｎｈａｒｔ，Ｖ．，Ｓｐｉｃｋ，Ｃ．，Ｋｕｂｂｉｅｓ，Ｍ．，Ｋｌｅｉｎ，Ｃ．，Ｕｍａｎａ，Ｐ．，Ｍｏｓｓｎｅｒ，Ｅ．（２０１６） Ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１
ａｎｄ ＩｇＧ４ Ｆｃ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ａｂｏｌｉｓｈｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．ＰＥＤＳ，２９，４５７－４６６に説明されているような）が含まれる。これらの代表的なアルギニン突然変異又はＦｃガンマ受容体及び補体（Ｃ１ｑ）への結合を減少させる他の突然変異の残基のナンバリングは、当業者が理解する通り、ＥＵ抗体ナンバリングシステムを指す。
ｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎ Ｆｃ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｌｙｍｐｈｏｍａ ａｎｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６８，８０４９－８０５７；Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｌ．，Ｂａｕｔｉｓｔａ，Ｃ．，Ｐｏｎｇ，Ｅ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｄ．Ｈ．，Ｊａｃｉｎｔｏ，Ｊ．，Ｅｉｖａｚｉ，Ａ．，Ｍｕｃｈｈａｌ，Ｕ．Ｓ．，Ｋａｒｋｉ，Ｓ．，Ｃｈｕ，Ｓ．Ｙ．，Ｌａｚａｒ，Ｇ．Ａ．，（２０１１） Ａ ｎｏｖｅｌ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒｍａｔ ｅｎａｂｌｅｓ
ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎｄ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｃｏ－ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔａｒｇｅｔ ａｎａｔｉｇｅｎｓ．ＭＡｂｓ ３，５４６－５５７に説明されているような）、Ｎ２９７Ａ又はＮ２９７Ｑ（例えばＴａｏ，Ｍ－Ｈ．，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８９） Ｓｔｕｄｉｅｓ
ｏｆ ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｍｏｕｓｅ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ：ｒｏｌｅ ｏｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｕ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３，２５９５－２６０１；Ｌｕｘ，Ａ．，Ｙｕ，Ｘ．，Ｓｃａｎｌａｎ，Ｃ．Ｎ．，Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｆ．（２０１３） Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ ＩｇＧ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｈｕｍａｎ ＦｃγＲｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９０，４３１５－４３２３に説明されているような）、Ｄ２６５Ａ（例えばＬｕｘ，Ａ．，Ｙｕ，Ｘ．，Ｓｃａｎｌａｎ，Ｃ．Ｎ．，Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｆ．（２０１３） Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ ＩｇＧ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｈｕｍａｎ ＦｃγＲｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９０，４３１５－４３２３；Ｃｌｙｎｅｓ，Ｒ．Ａ．，Ｔｏｗｅｒｓ，Ｔ．Ｌ．，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．，Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．（２０００） Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６，４４３－４４６に説明されているような）、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（例えばＷｉｎｓ，Ｂ．Ｄ．，Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｓ．，Ｐａｒｒｅｎ，Ｐ．Ｗ．Ｈ．Ｉ．，Ｂａｒｎｅｓ，Ｎ．，Ｈｏｇａｒｔｈ，Ｐ．Ｍ．，（２０００） Ｔｈｅ ＩｇＧ Ｆｃ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦｃＲ） ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ：ｔｈｅ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ＦｃγＲＩ ａｎｄ ＦｃγＲＩＩａ ｂｉｎｄ
ｔｏ ａ ｒｅｇｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｆｃ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ｔｈａｔ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｎｅｏｎａｔａｌ ＦｃＲ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４，５３１３－５３１８に説明されているような）及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ（例えばＳｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ，Ｔ．，Ｈｅｒｔｅｒ，Ｓ．，Ｋｏｌｌｅｒ，Ｃ．Ｆ．，Ｇｒａｕ－Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｓ．，Ｓｔｅｉｎｈａｒｔ，Ｖ．，Ｓｐｉｃｋ，Ｃ．，Ｋｕｂｂｉｅｓ，Ｍ．，Ｋｌｅｉｎ，Ｃ．，Ｕｍａｎａ，Ｐ．，Ｍｏｓｓｎｅｒ，Ｅ．（２０１６） Ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１
ａｎｄ ＩｇＧ４ Ｆｃ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ａｂｏｌｉｓｈｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．ＰＥＤＳ，２９，４５７－４６６に説明されているような）が含まれる。これらの代表的なアルギニン突然変異又はＦｃガンマ受容体及び補体（Ｃ１ｑ）への結合を減少させる他の突然変異の残基のナンバリングは、当業者が理解する通り、ＥＵ抗体ナンバリングシステムを指す。
【0036】
ＦｃγＲの位置及び補体結合部位におけるか又はそれらに近い残基を標的とするＦｃγＲ及び／又は補体結合を排除する（ａｂｌａｔｅ）ための他の突然変異を用いることができる。ＩｇＧのＦｃ領域上のこれらの部位は位置決定されている（例えばＪｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．，Ｌｕｎｄ，Ｊ．（２００２） Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｏｎ
ｈｕｍａｎ ＩｇＧ－Ｆｃ ｆｏｒ ＦｃγＲ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｍｏｄｅｌｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔｓ．，８２，５７－６５；Ｄｕｎｃａｎ，Ａ．Ｒ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．（１９８８） Ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｆｏｒ Ｃ１ｑ ｏｎ ＩｇＧ．Ｎａｔｕｒｅ，３３２，７３８－７４０；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．，Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｈ．，Ｔｏｔｐａｌ，Ｋ．，Ｗｏｎｇ，Ｐ．Ｙ．，Ｕｌｔｓｃｈ，Ｍ．，Ｍｅｎｇ，Ｇ．，Ｍｕｌｋｅｒｒｉｎ，Ｍ．Ｇ．（２０００） Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｃ１ｑ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ ｒｉｔｕｘａｎ，ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ａ
ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ Ｆｃ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４，４１７８－４１８４；Ｈｏｇａｒｔｈ，Ｐ．Ｍ．，Ａｎａｎｉａ，Ｊ．，Ｗｉｎｅｓ，Ｂ．Ｄ．（２０１４） Ｔｈｅ ＦｃγＲ ｏｆ ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＩｇＧ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ， ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３８２，３２１－３５２に説明されている通り）。
ｈｕｍａｎ ＩｇＧ－Ｆｃ ｆｏｒ ＦｃγＲ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｍｏｄｅｌｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔｓ．，８２，５７－６５；Ｄｕｎｃａｎ，Ａ．Ｒ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．（１９８８） Ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｆｏｒ Ｃ１ｑ ｏｎ ＩｇＧ．Ｎａｔｕｒｅ，３３２，７３８－７４０；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．，Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｈ．，Ｔｏｔｐａｌ，Ｋ．，Ｗｏｎｇ，Ｐ．Ｙ．，Ｕｌｔｓｃｈ，Ｍ．，Ｍｅｎｇ，Ｇ．，Ｍｕｌｋｅｒｒｉｎ，Ｍ．Ｇ．（２０００） Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｃ１ｑ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ ｒｉｔｕｘａｎ，ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ａ
ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ Ｆｃ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４，４１７８－４１８４；Ｈｏｇａｒｔｈ，Ｐ．Ｍ．，Ａｎａｎｉａ，Ｊ．，Ｗｉｎｅｓ，Ｂ．Ｄ．（２０１４） Ｔｈｅ ＦｃγＲ ｏｆ ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＩｇＧ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ， ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３８２，３２１－３５２に説明されている通り）。
【0037】
Ｓｅｌｄｅｇｓは、ヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＧ４のようにＦｃガンマ受容体又は補体に結合しないか又は非常に弱い結合を有する免疫グロブリンのクラス又はイソタイプに由来するＦｃプラグメントを含む場合がある。
【0038】
診断用画像化のようないくつかの用途のために、Ｓｅｌｄｅｇｓは、Ｓｅｌｄｅｇ中に存在する抗原に対する炎症反応を向上させるためにＦｃガンマ受容体及び／又は補体に関する結合部位を有するＦｃフラグメントを含む場合がある。
【0039】
Ｆｃフラグメント１１０を、非修飾Ｆｃフラグメントと比較して中性近辺のｐＨにおけるＦｃＲｎに関するその結合親和性を実質的に向上させるように修飾する場合がある。例えば６．８より高く且つ７．５未満のｐＨにおけるＦｃフラグメント１１０とＦｃＲｎの間の解離定数は、表面プラズモン共鳴又は他の生物物理学的方法により決定されると１０μＭ未満の場合がある。しかしながら、Ｆｃフラグメント１１０は酸性のエンドソームｐＨ（約６．０）において非修飾Ｆｃフラグメントと比較して類似か又は向上したＦｃＲｎに関する親和性を有する場合があるか、又はそれを非修飾Ｆｃフラグメントと比較してエンドソームｐＨにおけるＦｃＲｎに関するずっと低いか又は無視し得る結合親和性を有するように修飾する場合がある。中性近辺のｐＨにおけるこの結合親和性における向上は、それぞれのＳｅｌｄｅｇがその結合した標的抗原特異的抗体を有効に移行させ、ＦｃＲｎ発現細胞中の後期エンドソーム又はリソソーム中に輸送することを可能にする。ＦｃＲｎに関するＦｃフラグメントの結合親和性の強化は、突然変異の挿入により達成される場合がある。天然に存在するＩｇＧｓは、中性近辺のｐＨと反対に酸性のｐＨレベルにおいてＦｃＲｎに関する実質的により高い結合親和性を有する。この性質は、ＦｃＲｎ発現細胞内におけるＩｇＧの再循環及び輸送のために必須である。対照的に、ｐＨ７．４におけるＦｃＲｎに関する結合親和性の向上は、例えば細胞中への受容体媒介移行及びリソソーム送達を生ずる。
【0040】
Ｆｃフラグメント１１０を修飾して、Ｆｃガンマ受容体及び補体（Ｃ１ｑ）に関する結合親和性を取り除くか又は実質的に低下させる場合もある。この修飾は、多量体的免疫複合体の形成により引き起こされる炎症反応を予防する。例えば実施例１０に説明する通り、Ｆｃ領域を、本明細書で「アルギニン突然変異」とも呼ばれる突然変異をさせてそれらがＦｃガンマ受容体に結合しないようにすることができる（Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ；ＥＵナンバリング）（例えばＭｏｏｒｅ，Ｇ．Ｌ．，Ｂａｕｔｉｓｔａ，Ｃ．，Ｐｏｎｇ，
Ｅ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｄ．Ｈ．，Ｊａｃｉｎｔｏ，Ｊ．，Ｅｉｖａｚｉ Ａ．，Ｍｕｃｈｈａｌ，Ｕ．Ｓ． Ｋａｒｋｉ，Ｓ．，Ｃｈｕ，Ｓ．Ｙ．，Ｌａｚａｒ，Ｇ．Ａ．（２０１１）．Ａ ｎｏｖｅｌ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒｍａｔ ｅｎａｂｌｅｓ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎｄ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｃｏ－ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔａｒｇｅｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ．ＭＡｂｓ ３，５４６－５５７に説明されている通り）（ＥＵナンバリング）。実施例１０において、これらの突然変異はＦｃ－Ｓｙｔ１の残基２２及び１１４（配列番号１０を参照されたい）ならびにＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳの残基１４４及び２３６（配列番号８を参照されたい）に相当する。Ｆｃガンマ受容体及び補体への結合を実質的に低下させるか又は排除する他の突然変異の例には、当業者が同定可能な他のものの中でもＮ２９７Ａ又はＮ２９７Ｑ（ＥＵナンバリング；例えばＴａｏ，Ｍ－Ｈ．，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８９） Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ
ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｍｏｕｓｅ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ：ｒｏｌｅ ｏｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３，２５９５－２６０１；Ｌｕｘ，Ａ．，Ｙｕ，Ｘ．，Ｓｃａｎｌａｎ，Ｃ．Ｎ．，Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｆ．（２０１３） Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ ＩｇＧ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｈｕｍａｎ ＦｃγＲｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９０，４３１５－４３２３に説明されているような）、Ｄ２６５Ａ（ＥＵナンバリング；例えばＬｕｘ，Ａ．，Ｙｕ，Ｘ．，Ｓｃａｎｌａｎ，Ｃ．Ｎ．，Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｆ．（２０１３） Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ ＩｇＧ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｈｕｍａｎ ＦｃγＲｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９０，４３１５－４３２３；Ｃｌｙｎｅｓ，Ｒ．Ａ．，Ｔｏｗｅｒｓ，Ｔ．Ｌ．，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．，Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．（２０００） Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ
ｍｏｄｕｌａｔｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６，４４３－４４６に説明されているような）、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＥＵナンバリング；例えばＷｉｎｓ，Ｂ．Ｄ．，Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｓ．，Ｐａｒｒｅｎ，Ｐ．Ｗ．Ｈ．Ｉ．，Ｂａｒｎｅｓ，Ｎ．，Ｈｏｇａｒｔｈ，Ｐ．Ｍ．，（２０００） Ｔｈｅ ＩｇＧ Ｆｃ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦｃＲ） ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ：ｔｈｅ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ＦｃγＲＩ ａｎｄ ＦｃγＲＩＩａ ｂｉｎｄ ｔｏ ａ ｒｅｇｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｆｃ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ｔｈａｔ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｎｅｏｎａｔａｌ ＦｃＲ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４，５３１３－５３１８に説明されているような）、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ（ＥＵナンバリング；例えばＳｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ，Ｔ．，Ｈｅｒｔｅｒ，Ｓ．，Ｋｏｌｌｅｒ，Ｃ．Ｆ．，Ｇｒａｕ－Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｓ．，Ｓｔｅｉｎｈａｒｔ，Ｖ．，Ｓｐｉｃｋ，Ｃ．，Ｋｕｂｂｉｅｓ，Ｍ．，Ｋｌｅｉｎ，Ｃ．，Ｕｍａｎａ，Ｐ．，Ｍｏｓｓｎｅｒ，Ｅ．（２０１６） Ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ａｎｄ ＩｇＧ４ Ｆｃ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ａｂｏｌｉｓｈｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．ＰＥＤＳ，２９，４５７－４６６に説明されているような）が含まれる。Ｆｃガンマ受容体に関する結合親和性における少なくとも１０分の１への低下（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｔ ｌｅａｓｔ １０－ｆｏｌｄ）が好ましい。
Ｅ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｄ．Ｈ．，Ｊａｃｉｎｔｏ，Ｊ．，Ｅｉｖａｚｉ Ａ．，Ｍｕｃｈｈａｌ，Ｕ．Ｓ． Ｋａｒｋｉ，Ｓ．，Ｃｈｕ，Ｓ．Ｙ．，Ｌａｚａｒ，Ｇ．Ａ．（２０１１）．Ａ ｎｏｖｅｌ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒｍａｔ ｅｎａｂｌｅｓ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎｄ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｃｏ－ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔａｒｇｅｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ．ＭＡｂｓ ３，５４６－５５７に説明されている通り）（ＥＵナンバリング）。実施例１０において、これらの突然変異はＦｃ－Ｓｙｔ１の残基２２及び１１４（配列番号１０を参照されたい）ならびにＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳの残基１４４及び２３６（配列番号８を参照されたい）に相当する。Ｆｃガンマ受容体及び補体への結合を実質的に低下させるか又は排除する他の突然変異の例には、当業者が同定可能な他のものの中でもＮ２９７Ａ又はＮ２９７Ｑ（ＥＵナンバリング；例えばＴａｏ，Ｍ－Ｈ．，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８９） Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ
ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｍｏｕｓｅ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ：ｒｏｌｅ ｏｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３，２５９５－２６０１；Ｌｕｘ，Ａ．，Ｙｕ，Ｘ．，Ｓｃａｎｌａｎ，Ｃ．Ｎ．，Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｆ．（２０１３） Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ ＩｇＧ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｈｕｍａｎ ＦｃγＲｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９０，４３１５－４３２３に説明されているような）、Ｄ２６５Ａ（ＥＵナンバリング；例えばＬｕｘ，Ａ．，Ｙｕ，Ｘ．，Ｓｃａｎｌａｎ，Ｃ．Ｎ．，Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｆ．（２０１３） Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ ＩｇＧ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｈｕｍａｎ ＦｃγＲｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９０，４３１５－４３２３；Ｃｌｙｎｅｓ，Ｒ．Ａ．，Ｔｏｗｅｒｓ，Ｔ．Ｌ．，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．，Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．（２０００） Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ
ｍｏｄｕｌａｔｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６，４４３－４４６に説明されているような）、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＥＵナンバリング；例えばＷｉｎｓ，Ｂ．Ｄ．，Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｓ．，Ｐａｒｒｅｎ，Ｐ．Ｗ．Ｈ．Ｉ．，Ｂａｒｎｅｓ，Ｎ．，Ｈｏｇａｒｔｈ，Ｐ．Ｍ．，（２０００） Ｔｈｅ ＩｇＧ Ｆｃ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦｃＲ） ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ：ｔｈｅ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ＦｃγＲＩ ａｎｄ ＦｃγＲＩＩａ ｂｉｎｄ ｔｏ ａ ｒｅｇｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｆｃ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ｔｈａｔ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｎｅｏｎａｔａｌ ＦｃＲ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４，５３１３－５３１８に説明されているような）、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ（ＥＵナンバリング；例えばＳｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ，Ｔ．，Ｈｅｒｔｅｒ，Ｓ．，Ｋｏｌｌｅｒ，Ｃ．Ｆ．，Ｇｒａｕ－Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｓ．，Ｓｔｅｉｎｈａｒｔ，Ｖ．，Ｓｐｉｃｋ，Ｃ．，Ｋｕｂｂｉｅｓ，Ｍ．，Ｋｌｅｉｎ，Ｃ．，Ｕｍａｎａ，Ｐ．，Ｍｏｓｓｎｅｒ，Ｅ．（２０１６） Ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ａｎｄ ＩｇＧ４ Ｆｃ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ａｂｏｌｉｓｈｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．ＰＥＤＳ，２９，４５７－４６６に説明されているような）が含まれる。Ｆｃガンマ受容体に関する結合親和性における少なくとも１０分の１への低下（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｔ ｌｅａｓｔ １０－ｆｏｌｄ）が好ましい。
【0041】
図２Ｂに示す通り、Ｓｅｌｄｅｇ２０ｂにおいて抗原１００は別の末端位置においてＦｃフラグメント１１０ａに結合する場合があるか又は図２Ｃに示す通り、Ｓｅｌｄｅｇ２０ｃにおいて抗原１００は非末端位置で結合する場合がある。特異的なＦｃＲｎ結合を妨げないいずれの位置も適している。そのような位置には、当業者が同定可能である通り、
直接又は立体的にＦｃＲｎ結合を遮断しないようにＦｃＲｎ相互作用部位（ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン境界面における残基２５２－２５６、３０９－３１１、４３３－４３６を包含する；ＥＵナンバリング）から十分に遠いアミノ酸残基が含まれる。
直接又は立体的にＦｃＲｎ結合を遮断しないようにＦｃＲｎ相互作用部位（ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン境界面における残基２５２－２５６、３０９－３１１、４３３－４３６を包含する；ＥＵナンバリング）から十分に遠いアミノ酸残基が含まれる。
【0042】
化学反応を介する結合、リンカーを介する結合又は１つの組み合わされた抗原－Ｆｃフラグメントタンパク質の形成の間を含むいずれかの適した方法で抗原１００をＦｃフラグメント１１０に融合させる場合がある。用いることができる化学結合の例は：アミンからアミン（ａｍｉｎｅ－ｔｏ－ａｍｉｎｅ）（ＮＨＳエステル）、スルフヒドリルからスルフヒドリル（マレイミド）、アミンからスルフヒドリル（ＮＨＳエステル／マレイミド）、スルフヒドリルから炭水化物（マレイミド／ヒドラジド）又は所望の化学反応性を有する非天然アミノ酸を介する結合である。この非天然アミノ酸をＦｃフラグメント及び／又は抗原の組換え体生産の間に挿入することができる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーを化学的に共役したタンパク質、タンパク質フラグメント又は他の分子の間に挿入することもできる。可能なリンカーにはグリシン－セリンリンカーペプチド又は他のもっと硬い（ｒｉｇｉｄ）リンカーペプチドの反復が含まれ、それは抗原－Ｆｃ融合のための組換え体発現プラスミド中でコードされる。連結の化学、連結の部位及びペプチドの選択は分子モデリングにより導かれ得、当業者が理解する通り、抗原又は細胞表面分子を標的とするタンパク質／タンパク質フラグメントの結合活性の損失を最小にするように設計されることができる。
【0043】
図２Ｄは、抗原１００が抗体可変領域１３０に結合しているＳｅｌｄｅｇ２０ｄの略図である。抗体可変領域１３０は細胞表面受容体又は細胞表面分子に特異的に結合する。抗体可変領域１３０は、それが細胞表面受容体又は細胞表面分子に特異的に結合する限り、可変領域全体又はそのフラグメントの場合がある。抗体可変領域１３０は、細胞表面受容体又は細胞表面分子に結合するように構成されている抗体の非可変領域の部分を含む場合がある。例えば抗体可変領域１３０はシングルドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（ｓｄＡｂ）又はラクダ由来ＶＨＨドメイン（通常ナノボディーとも呼ばれる）の場合がある。そのような可変領域は２つの逆平行βシートを含む免疫グロブリンドメインの全体的な折り畳み（ｏｖｅｒａｌｌ ｆｏｌｄ）を有し、且つ当業者が同定可能な他のものの中でもＴ細胞受容体可変ドメイン、抗体の定常領域ドメイン又は補助受容体、ＣＤ４のドメインのような免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーからのドメインも含むことができる。抗体可変領域１３０は図２Ｄに示す通りモノマーとして又は多量体として存在する場合がある。例えば抗体可変領域１３０がナノボディーとして存在する場合、第１のナノボディーのＣ末端と第２のナノボディーのＮ末端の間にＧＳＳＧＧＳＧＧＧＧＳのようなリンカーペプチドを用いてそれを改変して二量体を形成し、標的受容体／分子に関する結合活性を向上させる場合がある。抗体可変領域１３０がナノボディー又は多量体を形成するように改変された別のタンパク質である場合、ちょうどＦｃブラグメントを含有するＳｅｌｄｅｇｓに関して上記に説明した通りに、多量体が抗原１００の１つのコピーのみを含有するように、Ｓｅｌｄｅｇ形成の間に抗原１００のない変異体を含ませる場合がある。抗体可変領域は、ペプチドリンカーにより軽鎖可変（ＶＬ）ドメインに連結された重鎖可変（ＶＨ）ドメインのヘテロダイマーを含むこともでき、ｓｃＦｖフラグメントを形成する。ＶＨ及びＶＬドメインを連結するために用いられるリンカー配列は当業者に周知であり、ＶＨドメインのＣ末端をＶＬドメインのＮ末端に連結するＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［（Ｇ４Ｓ）３］配列を含む。いくつかの態様において、類似のリンカー配列を用いてＶＬドメインのＣ末端をＶＨドメインのＮ末端に連結することができる。細胞表面受容体又は他の細胞表面分子に結合するｓｃＦｖｓは、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ又は他の抗体ディスプレイ法を用いてｓｃＦｖｓのライブラリから単離され得る。Ｓｅｌｄｅｇの標的タンパク質成分は、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイなどを用いてＦａｂフラグメントのライブラリから単離され得る抗体のＦａｂフラグメントを含むこともできる。ナノボディー、ｓｃＦｖｓ及びＦａ
ｂフラグメントのために、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）中の残基をランダムに突然変異させるか、又はエラープローンポリメラーゼ連鎖反応を用い、突然変異したナノボディー又は可変ドメインのライブラリを形成することにより細胞表面受容体又は細胞表面分子への結合に関する親和性を向上させることができる。標的とされる代表的なＣＤＲ残基は軽鎖可変ドメインのＣＤＲ３（残基８９－９７；Ｋａｂａｔナンバリング）及び重鎖可変ドメインのＣＤＲ３（残基９５－１０２；Ｋａｂａｔナンバリング）中のものである。これらのライブラリをファージ又は酵母上に表示し（ｄｉｓｐｌａｙｅｄ）、当業者に既知の方法を用いて親和性がより高い変異体を選択することができる。
ｂフラグメントのために、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）中の残基をランダムに突然変異させるか、又はエラープローンポリメラーゼ連鎖反応を用い、突然変異したナノボディー又は可変ドメインのライブラリを形成することにより細胞表面受容体又は細胞表面分子への結合に関する親和性を向上させることができる。標的とされる代表的なＣＤＲ残基は軽鎖可変ドメインのＣＤＲ３（残基８９－９７；Ｋａｂａｔナンバリング）及び重鎖可変ドメインのＣＤＲ３（残基９５－１０２；Ｋａｂａｔナンバリング）中のものである。これらのライブラリをファージ又は酵母上に表示し（ｄｉｓｐｌａｙｅｄ）、当業者に既知の方法を用いて親和性がより高い変異体を選択することができる。
【0044】
図２Ｄは抗体可変領域１３０の末端位置における抗原１００を示しているが、それは代わりに非末端位置にある場合もある。抗原１００は、化学結合を介する結合、リンカーを介する結合又は１つの組み合わされた抗原－抗体可変領域融合タンパク質の形成の間を含むいずれかの適した方法で抗体可変領域１１０に融合する場合がある。
【0045】
Ｓｅｌｄｅｇは、抗体又は抗体フラグメント以外のタンパク質を含む標的成分に融合した抗原成分を含有する場合もあり、但しこのタンパク質は細胞表面受容体又は他の細胞表面分子に結合するように構成される。例えば図２Ｅに示す通り、Ｓｅｌｄｅｇ２０ｅはＦｃＲｎに結合することができるアルブミン又はアルブミンフラグメント１４０に融合した抗原１００を含む。アルブミン又はアルブミンフラグメントを、それが向上した親和性でＦｃＲｎに結合するように突然変異させるか又は修飾する場合がある。例えばエラープローンＰＣＲを用いて（ヒト血清）アルブミンのＦｃＲｎ結合ドメイン（ＤＩＩＩ）中に突然変異を挿入し、続いて突然変異したアルブミン変異体のライブラリを酵母又はファージ上に表示し、親和性がより高い変異体を選択することができる。あるいはまた、アルブミン：ＦｃＲｎ境界面におけるか又はその近辺の残基を突然変異させ、結合親和性が向上したアルブミン変異体を選択するか又はそれに関してスクリーニングすることにより、親和性がより高い変異体を生むことができる。図２Ｅはアルブミン又はアルブミンフラグメント１４０の非末端位置における抗原１００を示しているが、それは代わりに末端位置にある場合もある。抗原１００は、化学結合を介する結合、リンカーを介する結合又は１つの組み合わされた抗原－ＦｃＲｎ結合タンパク質の形成の間を含むいずれかの適した方法でアルブミン又はアルブミンフラグメント１４０に融合する場合がある。
【0046】
図２Ｆは、Ｆｃフラグメント１５０のＮ末端に結合した抗原１００を含む代表的なＳｅｌｄｅｇ２０ｆの略図である。図２Ｆに示す例において、細胞表面受容体又は細胞表面分子に結合するタンパク質又はタンパク質フラグメント１６０がＦｃフラグメント１５０ａのＣ末端に結合している。例えばタンパク質又はタンパク質フラグメントはホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合するシナプトタグミンのＣ２Ａドメインの場合がある。Ｆｃフラグメント１５０を向上した親和性でＦｃＲｎに結合するように改変することができ、且つそれがＦｃガンマ受容体及び補体に非常に低いか又は検出可能でない結合親和性で結合するように突然変異させる場合がある。融合した抗原１００を有するＦｃフラグメント１５０ａを２つ有するＦｃフラグメントホモダイマーは多量体的免疫複合体の形成に導き得、それを避けるために、図２Ｆに示すＳｅｌｄｅｇｓはノブズイントゥーホールズ及び／又は静電ステアリング突然変異を用い、ヘテロダイマー形成を促進するように設計され、従って１つのＦｃ－抗原を有するＦｃは１つだけある。図２Ｆにおいて、Ｆｃフラグメント１５０ａ及び１５０ｂの両方がそれらに融合したタンパク質又はタンパク質フラグメントを有し、それは細胞表面タンパク質又は他の細胞表面分子に結合する；あるいはまた、１つのみのそのようなタンパク質又はタンパク質フラグメントが存在する場合がある。図２Ｇに示す代表的なＳｅｌｄｅｇにおいて、抗原１００及び細胞表面受容体又は細胞表面分子に結合するタンパク質又はタンパク質フラグメント１６０はそれぞれＦｃフラグメント１５０ａ及び１５０ｂのＣ末端及びＮ末端に融合し、Ｓｅｌｄｅｇ２０ｇを形成している。
【0047】
図２Ｈは、細胞表面タンパク質又は細胞表面分子に結合する抗体１７０のＣ末端に結合した抗原１００を含む代表的なＳｅｌｄｅｇ２０ｈの略図である。抗体中のＦｃフラグメント（Ｆｃ）を向上した親和性でＦｃＲｎに結合するように改変することができ、それがＦｃガンマ受容体及び補体に非常に低いか又は検出可能でない結合親和性で結合するように突然変異させる場合がある。多量体的免疫複合体の形成に導き得る両方のＦｃフラグメントに抗原１００が融合した抗体ホモダイマーを避けるために、図２Ｈに示すＳｅｌｄｅｇｓはノブズイントゥーホールズ及び／又は静電ステアリング突然変異を用い、ヘテロダイマー形成を促進するように設計され、従って抗原１００が結合した抗体重鎖は抗体分子当たりに１つだけある。抗体の両方のＦａｂフラグメントは同じ細胞表面タンパク質又は他の細胞表面分子に結合する場合があるか、あるいはまたそれらは２種類以上の細胞表面タンパク質又は分子に結合することができる。
【0048】
図２Ｉは、細胞表面タンパク質又は細胞表面分子に結合するｓｃＦｖ（１８０）－Ｆｃ融合体のＣ末端に結合した抗原１００を含む代表的なＳｅｌｄｅｇ２０ｉの略図である。抗体中のＦｃフラグメント（Ｆｃ）を向上した親和性でＦｃＲｎに結合するように改変することができ、それがＦｃガンマ受容体及び補体に非常に低いか又は検出可能でない結合親和性で結合するように突然変異させる場合がある。多量体的免疫複合体の形成に導き得る両方のＦｃフラグメントに抗原１００が融合した抗体ホモダイマーを避けるために、図２Ｉに示すＳｅｌｄｅｇｓはノブズイントゥーホールズ及び／又は静電ステアリング突然変異を用い、ヘテロダイマー形成を促進するように設計され、従って抗原１００が結合した抗体重鎖－ｓｃＦｖ融合体は分子当たりに１つだけある。抗体の両方のｓｃＦｖフラグメントは同じ細胞表面タンパク質又は他の細胞表面分子に結合する場合があるか、あるいはまたそれらは２種類以上の細胞表面タンパク質又は分子に結合することができる。
【0049】
図２Ｊは、細胞表面タンパク質又は細胞表面分子に結合する－Ｆｃ－ｓｃＦｖ（１８０）融合体のＮ末端に結合した抗原１００を含む代表的なＳｅｌｄｅｇ２０ｊの略図である。抗体中のＦｃフラグメント（Ｆｃ）を向上した親和性でＦｃＲｎに結合するように改変することができ、それがＦｃガンマ受容体及び補体に非常に低いか又は検出可能でない結合親和性で結合するように突然変異させる場合がある。多量体的免疫複合体の形成に導き得る両方のＦｃフラグメントに抗原１００が融合した抗体ホモダイマーを避けるために、図２Ｊに示すＳｅｌｄｅｇｓはノブズイントゥーホールズ及び／又は静電ステアリング突然変異を用い、ヘテロダイマー形成を促進するように設計され、従って抗原１００が結合した抗体重鎖－ｓｃＦｖ融合体は分子当たりに１つだけある。抗体の両方のｓｃＦｖフラグメントは同じ細胞表面タンパク質又は他の細胞表面分子に結合する場合があるか、あるいはまたそれらは２種類以上の細胞表面タンパク質又は分子に結合することができる。
【0050】
図２Ｋに示す通り、代表的なＳｅｌｄｅｇ２０ｋにおいて２つの抗原成分（１００、１９０）が標的成分、例えばＦｃフラグメント１１０ａ及びＦｃフラグメント１１０ｂにＮ末端又は他の位置で結合し、異なる特異性の抗原特異的抗体をクリアランスすることができるＳｅｌｄｅｇを形成する場合がある。図２Ｋに示すＳｅｌｄｅｇｓは、ノブズイントゥーホールズ及び／又は静電ステアリング突然変異を用い、ヘテロダイマー形成を促進するように設計され、従って各Ｓｅｌｄｅｇ分子中にそれぞれの型の抗原分子（１００、１９０）がある。
【0051】
図２ＬはＦｃフラグメント１５０のＮ末端に結合した抗原１００及び抗原１９０を含む代表的なＳｅｌｄｅｇ２０ｌの略図である。図２Ｌに示す代表的な態様において、細胞表面受容体又は細胞表面分子に結合するタンパク質又はタンパク質フラグメント１６０はＦｃフラグメント１５０ａ及び１５０ｂのＣ末端に結合している。図２Ｌに示すＳｅｌｄｅｇｓは、ノブズイントゥーホールズ及び／又は静電ステアリング突然変異を用い、ヘテロ
ダイマー形成を促進するように設計され、従って各Ｓｅｌｄｅｇ分子中にそれぞれの型の抗原分子（１００、１９０）がある。図２Ｌにおいて、Ｆｃフラグメント１５０ａ及び１５０ｂの両方はそれらに融合したタンパク質又はタンパク質フラグメントを有し、それは細胞表面タンパク質又は他の細胞表面分子に結合するが、他の態様において、１つのみのそのようなタンパク質又はタンパク質フラグメントが存在する場合がある。
ダイマー形成を促進するように設計され、従って各Ｓｅｌｄｅｇ分子中にそれぞれの型の抗原分子（１００、１９０）がある。図２Ｌにおいて、Ｆｃフラグメント１５０ａ及び１５０ｂの両方はそれらに融合したタンパク質又はタンパク質フラグメントを有し、それは細胞表面タンパク質又は他の細胞表面分子に結合するが、他の態様において、１つのみのそのようなタンパク質又はタンパク質フラグメントが存在する場合がある。
【0052】
図２Ｍに示す通り、代表的なＳｅｌｄｅｇ２０ｍにおいて同じ抗原（１００）の２つの分子がＦｃフラグメント２００にＮ末端又は他の位置において結合し、代表的なＳｅｌｄｅｇ２０ｍを形成する場合がある。この代表的なＳｅｌｄｅｇはＦｃＲｎへの結合を強化する突然変異を含有するホモダイマーであり、ノブズイントゥーホールズ及び／又は静電ステアリング突然変異を含有しない。
【0053】
図２ＮはＦｃフラグメント２１０のＮ末端に結合した同じ抗原（１００）の２つの分子を含む代表的なＳｅｌｄｅｇ２０ｎの略図である。図２Ｎに示す代表的な態様において、細胞表面受容体又は細胞表面分子に結合するタンパク質又はタンパク質フラグメント１６０はＦｃフラグメント２１０のＣ末端に結合している。この代表的なＳｅｌｄｅｇはホモダイマーであり、ノブズイントゥーホールズ及び／又は静電ステアリング突然変異を含有しない。図２Ｎにおいて、ホモダイマー的Ｆｃフラグメント２００は両方のポリペプチド鎖に融合したタンパク質又はタンパク質フラグメントを有し、それらは細胞表面タンパク質又は他の細胞表面分子に結合するが、他の態様において１つのみのそのようなタンパク質又はタンパク質フラグメントが存在する場合がある。
【0054】
ＦｃＲｎを標的とするＳｅｌｄｅｇｓのために、類似の原理をＦｃＲｎに結合することができる他のタンパク質に適用する場合がある。さらに、ＦｃＲｎ標的化Ｓｅｌｄｅｇ又はその形成方法はＦｃＲｎ結合タンパク質の性質により影響される場合がある。アルブミンは二量体又は他の多量体を形成しない傾向があるが、他のＦｃＲｎ結合タンパク質は形成する場合があり、その場合には各Ｓｅｌｄｅｇが抗原の１つだけのコピーを含有するように抗体フラグメントを含有する方法に類似の方法で最終的なＳｅｌｄｅｇを形成する場合がある。図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｆ、２Ｇ、２Ｈ、２Ｉ、２Ｊ、２Ｋ、２Ｌに示す例において、Ｓｅｌｄｅｇはノブズイントゥーホールズ及び／又は静電ステアリング突然変異を用いて、１つのＦｃフラグメントに連結した１つの抗原を含み、１つのＦｃフラグメントに抗原が結合していないヘテロダイマーの形成を促進する（ｄｒｉｖｅ）ように改変された２つの抗体Ｆｃフラグメントを有する。Ｆｃフラグメントをさらに中性近辺のｐＨにおいて向上した親和性でＦｃＲｎに結合するように改変することができるか（図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｋ、２Ｍ）、又は１つ以上の細胞表面受容体若しくは分子を標的とする１つ以上のタンパク質、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント又は他の分子に連結することができる（図２Ｆ、２Ｇ、２Ｈ、２Ｉ、２Ｊ、２Ｌ、２Ｎ）。図２Ｆ、２Ｇ、２Ｈ、２Ｉ、２Ｊ、２Ｌ、２Ｎに示す例におけるＦｃフラグメントを、より高い親和性でＦｃＲｎに結合するように改変し、それらがＦｃＲｎ及び１つ以上の細胞表面受容体又は分子の両方を標的とするようにすることもできる。
【0055】
アルブミンは酸性のｐＨにおいて中性のｐＨにおけるより強くＦｃＲｎに結合する。しかしながらアルブミンを修飾して中性近辺のｐＨ又はエンドソームｐＨにおけるその結合親和性を変え、標的抗原特異的抗体の分解及びＳｅｌｄｅｇの再循環を促進することもある。類似して、抗体可変領域ＦｃＲｎ結合タンパク質はそのタンパク質に特異的なやり方でｐＨにより影響を受ける場合があるが、それでもそれらを修飾して中性近辺のｐＨ又はエンドソームｐＨにおけるその結合親和性を変え、標的抗原特異的抗体の分解を促進する場合がある。これらのＦｃＲｎ結合タンパク質は免疫グロブリン可変ドメイン、ｓｃＦｖ（ＶＨとＶＬドメインがＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳのようなリンカーペプチドにより互いに連結されているＶＨ：ＶＬヘテロダイマー）又はＦａｂフラグメントのライブラ
リから、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ又は当業者に既知の他の方法を用いて単離され得る。これらのライブラリは天然に存在する抗体可変遺伝子に由来することができるか、又は相補性決定領域（ＣＤＲｓ）がランダム化オリゴヌクレオチド配列を用いて作られる「半合成」ライブラリを生ずる方法を用いて作成され得る。さらなるそれらの親和性の向上を、例えばエラープローンＰＣＲを用いてＣＤＲｓにランダム突然変異を挿入し、続いてファージディスプレイ又は酵母ディスプレイを用いて選択することにより達成することができる。標的とされる代表的なＣＤＲ残基は軽鎖可変ドメインのＣＤＲ３（残基８９－９７；Ｋａｂａｔナンバリング）及び重鎖可変ドメインのＣＤＲ３（残基９５－１０２；Ｋａｂａｔナンバリング）中のものである。類似の方法を用い、他の細胞表面受容体／分子に結合する抗体に基づくタンパク質又は足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）に基づくタンパク質を単離することができる。
リから、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ又は当業者に既知の他の方法を用いて単離され得る。これらのライブラリは天然に存在する抗体可変遺伝子に由来することができるか、又は相補性決定領域（ＣＤＲｓ）がランダム化オリゴヌクレオチド配列を用いて作られる「半合成」ライブラリを生ずる方法を用いて作成され得る。さらなるそれらの親和性の向上を、例えばエラープローンＰＣＲを用いてＣＤＲｓにランダム突然変異を挿入し、続いてファージディスプレイ又は酵母ディスプレイを用いて選択することにより達成することができる。標的とされる代表的なＣＤＲ残基は軽鎖可変ドメインのＣＤＲ３（残基８９－９７；Ｋａｂａｔナンバリング）及び重鎖可変ドメインのＣＤＲ３（残基９５－１０２；Ｋａｂａｔナンバリング）中のものである。類似の方法を用い、他の細胞表面受容体／分子に結合する抗体に基づくタンパク質又は足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）に基づくタンパク質を単離することができる。
【0056】
Ｓｅｌｄｅｇｓは細胞表面上の受容体又は他の分子に特異的に結合するように構成されるいずれかの標的成分を含む場合もある（図２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ、２Ｈ、２Ｉ、２Ｊ、２Ｌ又は２Ｎ）。標的成分を直接又は間接的に（例えばリンカーを介して）、抗体媒介架橋を減少させるために抗原、抗原フラグメント又は抗原類似物のそれぞれの型の１分子を有する抗原成分に融合させる。本明細書で用いられる「抗原の型」という用語は、特異的な抗体に結合する抗原を指す。従ってＳｅｌｄｅｇは１つより多い抗原の型を含むことができ、ここで各Ｓｅｌｄｅｇはそれぞれの抗原の型の１分子のみを有する。標的タンパク質が免疫グロブリン由来Ｆｃフラグメントを含有する場合、Ｆｃ領域を、それがＦｃガンマ受容体及び補体に結合しないか又は実質的に低下したレベルで結合するように突然変異させることができる。Ｓｅｌｄｅｇｓのいくつかの異なる可能な構成を図２Ａ－Ｎに示す；多数の他の構成も当業者により構想され得るので、これらは例として示され、制限ではない。
【0057】
ＳｅｌｄｅｇｓはＦｃガンマ受容体及び補体に結合するＦｃフラグメントを含む場合がある。Ｆｃガンマ及び補体結合部位の存在は、特定の用途分野の状況下で、Ｓｅｌｄｅｇ中の抗原に対する免疫反応が望まれる場合（例えば腫瘍画像化において）に望ましい場合がある。そのような用途において、Ｆｃガンマ受容体及び補体に結合するように構成されるＳｅｌｄｅｇｓが好ましい場合がある。例えばアルギニン突然変異のような、本明細書に説明されるＦｃガンマ受容体及び／又は補体（Ｃ１ｑ）に関する結合親和性が低下したか又は結合親和性を有さないための改変された突然変異がないＦｃフラグメントを含むＳｅｌｄｅｇｓを、そのような免疫反応を引き出すように構成する場合がある。Ｆｃガンマ受容体及び／又は補体（Ｃ１ｑ）への結合を向上させるための当業者に既知の突然変異を有するＦｃフラグメントを含むＳｅｌｄｅｇｓを、そのような免疫反応を引き出すように構成する場合もある。そのようなＳｅｌｄｅｇｓを、Ｓｅｌｄｅｇ当たりに１つより多い同じ型の抗原分子を含むように構成し（図２Ｋ、２Ｌ、２Ｍ又は２Ｎ）、免疫複合体形成を強化する場合もある。
【0058】
例えばＳｅｌｄｅｇｓは標的ドメイン又は抗体フラグメント（例えばＦａｂフラグメント又はｓｃＦｖフラグメント）の数が変動させることができ、それは１－３個の標的ドメイン又は抗体フラグメントの範囲である（図２）。これらの標的ドメイン又は抗体フラグメントを免疫グロブリンＦｃフラグメントに連結することができるが、他の場合、標的ドメイン又は抗体フラグメントを互いに連結する場合がある；抗原及び抗体フラグメントをＦｃフラグメントに又は互いに、種々の向き（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）で融合させることができる（図２）；Ｓｅｌｄｅｇｓはリンカー配列を含むことができ、それは融合タンパク質の間で長さ及び組成においてさまざまであり、ドメイン又はフラグメント、例えばＩＥＧＲＭＤ、ＧＧＧＧＳ又はこのリンカーの２－３個の反復を用いることができる；小分子又はペプチドのような抗原類似物を用いることができる；Ｓｅｌｄｅｇｓ中のＦｃフラグメントを、それがＦｃガンマ受容体、補体に関する実質的に低下した結合親和性及び
ＦｃＲｎへの結合に関する向上した親和性を有するように突然変異させる場合がある；ＳｅｌｄｅｇのＦｃフラグメントは、抗原連結Ｆｃフラグメントと非抗原連結Ｆｃフラグメントのヘテロダイマー又は２種類の抗原を含有するヘテロダイマーが形成されるように、ノブズイントゥーホールズ及び／又は静電ステアリング突然変異のような突然変異を有する場合がある。
ＦｃＲｎへの結合に関する向上した親和性を有するように突然変異させる場合がある；ＳｅｌｄｅｇのＦｃフラグメントは、抗原連結Ｆｃフラグメントと非抗原連結Ｆｃフラグメントのヘテロダイマー又は２種類の抗原を含有するヘテロダイマーが形成されるように、ノブズイントゥーホールズ及び／又は静電ステアリング突然変異のような突然変異を有する場合がある。
【0059】
Ｓｅｌｄｅｇｓは、自己免疫性脳炎を含む自己免疫疾患と関連するタンパク質、糖タンパク質及び核酸を含む以下の抗原を含むことができる：当業者が同定可能な他のものの中でもミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、ミエリン関連糖タンパク質、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質、トランスアルドラーゼ、アセチルコリン受容体、筋特異的キナーゼ、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質４、インスリン、膵島抗原２、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５、亜鉛トランスポーター８、シトルリン化抗原、カルバミル化抗原、コラーゲン、軟骨ｇｐ３９、ｇｐ１３０－ＲＡＰＳ、６５ｋＤａ熱ショックタンパク質、フィブリラリン、小核タンパク質（ｓｎｏＲＮＰ）、アクアポリン４、甲状腺刺激因子受容体、核抗原、ＤＮＡ、ヒストン、糖タンパク質ｇｐ７０、リボソーム、ピルビン酸デヒドロゲナーゼデヒドロリオアミドアセチルトランスフェラーゼ、毛包抗原、ヒトトロポミオシンイソフォーム５、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパルテート（ＮＭＤＡ）受容体、α－アミノ－３－ヒドロキシ－５－メチル－４－イソオキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体、ＧＡＢＡＡ及びＧＡＢＡＢ受容体、グリシン受容体、ジペプチジル－ペプチダーゼ様タンパク質６（ＤＰＰＸ）、グルタメート受容体（ＧｌｕＲ５）、電位依存性カリウムチャンネル、Ｈｕ、甲状腺ペルオキシダーゼ、チログロブリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体、甲状腺ホルモンＴ３及びＴ４、デスモグレイン１及び３。以下の抗原は腫瘍と関連する抗原の例であり、診断用画像化の間に腫瘍特異的抗体をクリアランスするためにＳｅｌｄｅｇｓ中に導入され得る：ＨＥＲ２、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞関連抗原（ＰＳＣＡ）、ｃ－Ｍｅｔ、ＥｐＣＡＭ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）。他の抗原には、患者が特異的な抗体を有している治療薬又は移植片受容者中の抗体が認識する移植抗原が含まれる。さらに、抗原の分子類似物（合成、タンパク質フラグメントなど）を作製することが可能であり、これらをＳｅｌｄｅｇｓの作製に用いることもできる。上記の抗原は例であり、本開示を読んで当業者が同定し得る追加の型の可能な抗原を制限していない。
【0060】
本明細書に説明するいくつかの例において、Ｓｅｌｄｅｇは配列番号２プラス配列番号６、配列番号４プラス配列番号６、配列番号８プラス配列番号１０、配列番号１２プラス配列番号１４、配列番号１６プラス配列番号１８プラス抗体軽鎖配列番号２０、配列番号２２プラス配列番号２４プラス抗体軽鎖配列番号２０、配列番号２６プラス配列番号２８、配列番号３０プラス配列番号６、配列番号３２プラス配列番号６又は配列番号３４プラス配列番号６又はそれらの相同体のアミノ酸配列を含む融合タンパク質のヘテロダイマーであることができる。
【0061】
Ｓｅｌｄｅｇは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２又は配列番号３４と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質であることができる。
【0062】
本明細書で用いられる場合、２つの核酸又はポリペプチド配列の状況における「配列同一性」又は「同一性」は、特定される比較ウィンドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）にわたって最大対応（ｍａｘｉｍｕｍ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）に関して並べられると同じである２つの配列におけるヌクレオチド塩基又は残基を指す（ｍａｋｅ
ｓ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）。タンパク質への言及において配列同一性又は類似性のパーセンテージが用いられる場合、同一でない残基の位置は多くの場合に同類アミノ酸置換により異なることが認識され、同類アミノ酸置換ではアミノ酸残基が類似の物理化学的性質を有するアミノ酸残基の機能的に等価の残基で置換され、従って分子の機能的性質を変化させない。
ｓ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）。タンパク質への言及において配列同一性又は類似性のパーセンテージが用いられる場合、同一でない残基の位置は多くの場合に同類アミノ酸置換により異なることが認識され、同類アミノ酸置換ではアミノ酸残基が類似の物理化学的性質を有するアミノ酸残基の機能的に等価の残基で置換され、従って分子の機能的性質を変化させない。
【0063】
本明細書で用いられるアミノ酸の機能的に等価の残基は、典型的に最初のアミノ酸に実質的に類似の物理化学的及び立体化学的特性を有する他のアミノ酸残基を指す。物理化学的性質には水溶性（疎水性又は親水性）、誘電的及び電気化学的性質、生理学的ｐＨ、側鎖の部分的電荷（正、負又は中性）及び当業者が同定可能な他の性質が含まれる。立体化学的特性にはアミノ酸の空間的及びコンフォーメーション的配置ならびにそれらのキラリティーが含まれる。例えばグルタミン酸は本開示の意味においてアスパラギン酸に機能的に等価の残基であると考えられる。チロシン及びトリプトファンはフェニルアラニンに機能的に等価の残基と考えられる。アルギニン及びリシンはヒスチジンに機能的に等価の残基と考えられる。
【0064】
当業者は、典型的に２つのポリペプチド又はポリヌクレオチド配列を並べて整列配列（ａｌｉｇｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を形成し、次いで２つの整列配列の間で一致する文字、すなわち類似又は同一の文字の数を検出し、ギャップ（ｇａｐｓ）を含む各ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列中の整列文字の合計数で割られる一致する文字の合計数を計算する段階を含む方法により、配列間の類似性が測定されることを理解するであろう。類似性の結果は同一性のパーセンテージとして表される。
【0065】
本明細書で用いられる場合、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウに及ぶ２つの最適整列配列の比較により決定される値を意味し、ここでポリヌクレオチド配列の比較ウィンドウ中の部分は２つの配列の最適整列のための参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して付加又は欠失（ギャップ）を含む場合がある。パーセンテージは、両配列中に同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して一致する位置の数を与え、一致する位置の数を比較のウィンドウ中の位置の合計数で割り、結果を１００倍して配列同一性のパーセンテージを与えることにより計算される。
【0066】
本明細書で用いられる場合、「参照配列」は配列比較のための基礎として用いられる定義された配列である。参照配列は、例えば全長タンパク質又はタンパク質フラグメントの切片として特定される配列のサブセット又は全体の場合がある。参照配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ及びＵｎｉｐｒｏｔ及び当業者が同定可能な他のデータベースようなデータベースにおいて同定され得る配列の場合がある。
【0067】
当業者が理解する通り、いずれの２つの配列間のパーセント同一性の決定も、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。配列同一性の決定のための配列の比較のために、適した数学的アルゴリズムのコンピューターインプリメンテーションを用いることができる。そのようなインプリメンテーションには：当業者が同定可能な他のものの中でもＣＬＵＳＴＡＬ、ＡＬＩＧＮ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡが含まれるがこれらに限られない。
【0068】
例えば本開示に従うＳｅｌｄｅｇｓは、配列番号２、配列番号４、配列番号６又は配列番号８又は配列番号１０又は配列番号１２又は配列番号１４又は配列番号１６又は配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２又は配列番号３４に比較して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することができる。
【0069】
Ｓｅｌｄｅｇｓが標的とする抗原特異的抗体は、当業者が同定可能な他のものの中でも患者中に存在する自己抗体、治療薬に結合する抗体、移植片を認識する抗体及び診断用画像化において用いられる修飾された（例えば放射性標識された）抗体又はフラグメント／改変された形態の場合がある。
【0070】
下記の実施例に示す通り、Ｓｅｌｄｅｇｓはそれらの融合した抗原に関する特異性を有する標的抗原特異的抗体、例えば標的抗原特異的抗体ＨＥＲ２－特異的トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）又はペルツズマブ（ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）（“ＴＺＢ”又は“ＰＺＢ”）及びＭＯＧ特異的抗体（“８－１８Ｃ５”）を選択的に枯渇させることができる。下記の実施例に示す通り、全体的なＩｇＧレベルに負の影響を与えるか又は不利な免疫反応を引き出すことなく、標的抗原特異的抗体を選択的に枯渇させることができる。これらの発見は、処置がＦｃＲｎ阻害剤又はＢ細胞を破壊する抗体の使用を介して全体的なＩｇＧｓの枯渇を生ずる他の方法と対照的である。そのような方法は、それらがＳｅｌｄｅｇｓにより与えられる選択性を欠いているために、標的とされない特異性の抗体又はＢ細胞機能に不利に影響する。
【0071】
この独特の選択性に基づき、Ｓｅｌｄｅｇプラットフォームは多くの用途を有し、それは多くの他の標的タンパク質及び抗原を有するＳｅｌｄｅｇｓが作製される場合があるからである。そのような用途の例には自己免疫疾患の処置、移植前又はその間の抗体媒介拒絶の処置、腫瘍の全身画像化の間のコントラストの向上（例えば追加のＳｅｌｄｅｇｓの開発のために抗原として腫瘍抗原ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭ及びＣＥＡが用いられる場合がある）、投与後に不利な反応が観察された場合の特定の生物学的製剤の体濃度の枯渇、治療薬の送達の前の治療薬を認識する抗体をクリアランスするための抗体のクリアランスが含まれる。
【0072】
Ｓｅｌｄｅｇｓは、注射、特に静脈内、皮下若しくは筋肉内注射あるいは枯渇させられるべき抗原特異的抗体が標的とする組織中への注射を介するような、標的とされている細胞表面上の受容体又は他の分子を発現する細胞にそれらを送達できるいずれかの方法で投与される場合がある。Ｓｅｌｄｅｇｓをコードする発現構築物を含有するように遺伝子改変された細胞においてＳｅｌｄｅｇｓを発現させることもできる。特に、遺伝子改変された細胞からその場でＳｅｌｄｅｇｓを分泌することを可能にするタンパク質又はペプチドを含むＳｅｌｄｅｇタンパク質をコードする発現構築物を導入することにより、細胞を遺伝子改変することができる。例えばＳｅｌｄｅｇｓをコードする発現構築物を用いて患者由来の細胞をトランスフェクションし、トランスフェクションされた細胞をキメラ抗原－受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞治療に関して説明されている方法に類似の方法を用いて患者内に送達して戻すことができる。発現構築物は当業者に既知の発現ベクターを含み、例えばＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇをコードする遺伝子（配列番号１及び５）を、成熟ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ（配列番号１）及びＦｃ（配列番号５）に関するコード配列の５’末端に連結した免疫グロブリン遺伝子に由来するもののような分泌リーダーペプチドと一緒に含有する場合がある。
【0073】
Ｓｅｌｄｅｇｓは、すべての標的とされる受容体／細胞表面分子を遮断せず、細胞表面受容体／分子の正常な機能を可能にする量で投与される場合がある。用いられるＳｅｌｄｅｇの用量は、クリアランスのために標的とされている抗体の量に類似している場合があり、それは例えば抗体媒介疾患の詳細（ｓｐｅｃｉｆｉｃｓ）又はＳｅｌｄｅｇｓが診断用画像化においてコントラストの向上ために用いられているかどうかに依存するであろう。用いられるＳｅｌｄｅｇの量は標的とされている受容体の型の合計数未満であると思われ、標的とされる受容体の正常な機能は不利に影響されない。さらに、例えばＩｇＧ結合部位と重ならない部位でＦｃＲｎに結合するナノボディー（ＶＨＨ）を用いることにより
、Ｓｅｌｄｅｇｓを、それらが細胞表面受容体又は細胞表面分子の自然のリガンドと結合に関して競争しないように設計することができる（例えばＡｎｄｅｒｓｅｎ，Ｊ．Ｔ．，Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｐａｊｕｅｌｏ，Ｍ．，Ｆｏｓｓ，Ｓ．，Ｌａｎｄｓｖｅｒｋ，Ｏ．Ｊ．Ｂ．，Ｐｉｎｔｏ，Ｄ．，Ｓｚｙｒｏｋｉ，Ａ．，ｄｅ Ｈａａｒｄ，Ｈ．Ｊ．，Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｍ．，Ｖａｎｌａｎｄｓｈｏｏｔ，Ｐ．，Ｓａｎｄｌｉｅ，Ｉ．（２０１２） Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｔａｒｇｅｔ ｈｕｍａｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ． Ｓｃｉ． Ｒｅｐ．， ３， １１１８に説明されている通り）。さらにＳｅｌｄｅｇｓは循環中又は枯渇させられるべき抗原特異的抗体が標的とする組織中の標的とされない抗体の１０％未満、５％未満、１％未満又は０．１％未満をクリアランスする場合がある。Ｓｅｌｅｇ処置の間及び後の標的とされない抗体の保持は、本明細書に説明される他の効果の中でも正常な免疫機能及び感染の回避において重要な場合がある。
、Ｓｅｌｄｅｇｓを、それらが細胞表面受容体又は細胞表面分子の自然のリガンドと結合に関して競争しないように設計することができる（例えばＡｎｄｅｒｓｅｎ，Ｊ．Ｔ．，Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｐａｊｕｅｌｏ，Ｍ．，Ｆｏｓｓ，Ｓ．，Ｌａｎｄｓｖｅｒｋ，Ｏ．Ｊ．Ｂ．，Ｐｉｎｔｏ，Ｄ．，Ｓｚｙｒｏｋｉ，Ａ．，ｄｅ Ｈａａｒｄ，Ｈ．Ｊ．，Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｍ．，Ｖａｎｌａｎｄｓｈｏｏｔ，Ｐ．，Ｓａｎｄｌｉｅ，Ｉ．（２０１２） Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｔａｒｇｅｔ ｈｕｍａｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ． Ｓｃｉ． Ｒｅｐ．， ３， １１１８に説明されている通り）。さらにＳｅｌｄｅｇｓは循環中又は枯渇させられるべき抗原特異的抗体が標的とする組織中の標的とされない抗体の１０％未満、５％未満、１％未満又は０．１％未満をクリアランスする場合がある。Ｓｅｌｅｇ処置の間及び後の標的とされない抗体の保持は、本明細書に説明される他の効果の中でも正常な免疫機能及び感染の回避において重要な場合がある。
【0074】
Ｓｅｌｄｅｇｓは毎日か、毎週か、患者の５０％が循環中又は標的とされる抗原特異的抗体が認識する組織中で閾量の標的とされる抗原特異的抗体を再生したと予想されるときはいつでも投与される場合がある。標的とされる抗原特異的抗体のレベルは、血清試料を分析するための酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡｓ）を用いることにより決定され得る。あるいはまた、当業者に周知の他の方法を用いることができる。
【0075】
抗体媒介拒絶に関するリスクがある移植患者において、Ｓｅｌｄｅｇｓは移植の前又は後に投与される場合がある。標的抗原特異的抗体が循環中又は標的抗原特異的抗体により認識される組織中で標的抗原特異的抗体の閾値に達したら、緊急時用量（ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ ｄｏｓｅ）のＳｅｌｄｅｇｓを投与する場合がある。標的とされる抗原特異的抗体のレベルは、血清試料を分析するための酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡｓ）を用いることにより決定され得る。あるいはまた、当業者に周知の他の方法を用いることができる。
【0076】
タンパク質に基づく治療薬のような治療薬に関して特異的な抗体を有する患者において、Ｓｅｌｄｅｇｓはそのような抗体を枯渇させるために治療薬の送達の前に投与される場合がある。これは、治療薬が前の送達の間に免疫反応を引き出していた場合、又は治療薬に特異的な既存の抗体が患者内に存在している場合、急速な治療薬の抗体媒介クリアランスに関連する問題を克服すると思われる。タンパク質に基づく治療薬に関して特異的な既存の又は誘導される抗体を複数の異なる方法を用いて検出することができる（例えばＸｕｅ，Ｌ．，Ｃｌｅｍｅｎｔｓ－Ｅｇａｎ，Ａ．，Ａｍａｒａｖａｄｉ，Ｌ．，Ｂｉｒｃｈｌｅｒ，Ｍ．，Ｇｏｒｏｖｉｔｓ，Ｂ．，Ｌｉａｎｇ，Ｍ．，Ｍｙｌｅｒ，Ｈ．，Ｐｕｒｕｓｈｏｔｈａｍａ，Ｓ．，Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｍ．Ｓ．，Ｓｕｎｇ，Ｃ．（２０１７） Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｅ－ｅｘｉｓｔｉｎｇ ｄｒｕｇ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＡＡＰＳ，１９，１５７６－１５８６に説明されているもののような）。
【0077】
診断用／セラノスティック画像化において、放射性標識された画像化抗体の送達に腫瘍局在化（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を許すある期間が続くであろうと思われる。続いてＳｅｌｄｅｇｓを用いてオフターゲット部位（例えば循環）から放射性標識された抗体をクリアランスし、コントラストの向上を生ずる。例えばこの方法は以下の段階を含むことができる：第１に腫瘍抗原に結合する放射性標識（又は他の標識）された抗体を患者に注入する。第２に、放射性標識された抗体が腫瘍に結合するのを許すためのある期間（例えば１６－２４時間）の後に、注入された画像化剤の用量にモル量において等しい量でＳｅｌｄｅｇｓを注入する。クリアランス期間（例えば４－２４時間）の後にポジトロンエミッショントモグラフィー又は他の全身画像化様式を用いて患者を画像化する。
【0078】
投与から１時間以内、２時間以内、５時間以内、２４時間以内又は４８時間以内あるいはもっと長い時間以内に循環中又は標的抗原特異的抗体により認識される組織中の標的抗原特異的抗体の濃度の少なくとも５０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％を枯渇させるのに十分な量でＳｅｌｄｅｇｓを投与する場合がある。体内におけるＳｅｌｄｅｇｓの持続性は、抗原特異的抗体の枯渇においてそれがどれだけ長く活性を有しているかの決定要因であろう。Ｓｅｌｄｅｇｓを、それらが標的とする細胞表面受容体又は細胞表面分子の行動により種々の生体内半減期を有するように設計することができる。この細胞表面受容体又は細胞表面分子に関するＳｅｌｄｅｇの親和性を突然変異誘発及び当業者に既知の方法を用いて修飾し、循環及び／又は組織中における種々の持続性を有するＳｅｌｄｅｇｓを生ずることもできる。特に枯渇させられるべき抗原特異的抗体の量と少なくとも大体等モルにおける量でＳｅｌｄｅｇを投与する場合がある。例えば標的抗原特異的抗体に対して約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１又はもっと高いモル比にある量でＳｅｌｄｅｇを投与することができる。特に例えばＳｅｌｄｅｇが患者に投与される抗体（例えば抗ＭＯＧ又は抗ＨＥＲ２抗体など）を標的とする場合、例えば投与される標的抗原特異的抗体に対して約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１又はもっと高いモル比にある用量でＳｅｌｄｅｇを投与することができる。
【発明を実施するための形態】
【0079】
以下の実施例は本開示の特定の態様をさらに例示するために与えられる。それらは本開示のそれぞれの及びすべての側面を完全に詳細に開示又は説明することを意図しておらず、そのように理解されるべきではない。他にことわらなければ、細胞系及び組成物の呼称は、これらの実施例全体を通じて一貫して用いられる。
【実施例1】
【0080】
－ＦｃＲｎに結合するＳｅｌｄｅｇｓの発現及び精製
細胞上のＦｃＲｎを標的とするＳｅｌｄｅｇｓは、中性近辺のｐＨにおいてヒトＦｃγＲｓとの相互作用を排除し且つＦｃＲｎへのＳｅｌｄｅｇＦｃフラグメントの結合親和性を強化するための突然変異を有する二量体的ヒトＩｇＧ１由来Ｆｃフラグメント（図３Ａ）に連結したモノマーとしての組換え抗原を含有する。これらの２つのＳｅｌｄｅｇｓのヘテロダイマー形成は、ＣＨ３ドメインにおけるノブズイントゥーホールズ突然変異の挿入により達成される。
細胞上のＦｃＲｎを標的とするＳｅｌｄｅｇｓは、中性近辺のｐＨにおいてヒトＦｃγＲｓとの相互作用を排除し且つＦｃＲｎへのＳｅｌｄｅｇＦｃフラグメントの結合親和性を強化するための突然変異を有する二量体的ヒトＩｇＧ１由来Ｆｃフラグメント（図３Ａ）に連結したモノマーとしての組換え抗原を含有する。これらの２つのＳｅｌｄｅｇｓのヘテロダイマー形成は、ＣＨ３ドメインにおけるノブズイントゥーホールズ突然変異の挿入により達成される。
【0081】
代表的なＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇ（配列番号３、４、５及び６）を作製するための発現構築物を以下の通りに作製した：改変されたＦｃフラグメントに融合したＨＥＲ２を有するポリペプチド鎖を発現するために（配列番号３）、ＨＥＲ２リーダーペプチド及び細胞外ドメイン（６３０残基からなるＥＣＤ）をコードする遺伝子を標準的な分子生物学的方法を用いてＨＥＲ２過剰発現乳癌細胞系（ＢＴ－４７４）から単離した。この遺伝子をヒトＩｇＧ１由来Ｆｃフラグメントをコードする遺伝子のヒンジ領域のＮ末端に、オーバーラップ伸長（ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）によるスプライシングを用いてＩＥＧＲＭＤリンカーペプチドを介して融合させた。ＦｃγＲｓへの結合を排除するため（Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ；ＥＵナンバリング）、ＦｃＲｎへの結合を強化するため（ＭＳＴ－ＨＮ；Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ；ＥＵナンバリング）及び‘ノブズイントゥーホールズ’を作製するため（Ｙ３４９Ｔ／Ｔ３９４Ｆ；ＥＵナンバリング）の突然変異を標準的な方法を用いてＦｃフラグメント遺伝子中に挿入した。軽鎖定常領域中のシステインと架橋するヒンジ領域中のシステイン（Ｃ２２０；ＥＵナンバリング）もセリンに突然変異させた。ＦｃＲｎ強化突然変異、ＦｃγＲｓ結合を排除するための突然変異を有し、融合抗原のないＦｃフラグメント遺伝子を相補的ノブズイントゥーホールズ突然変異を用いて作製した（Ｓ３６４Ｈ／Ｆ４０５Ａ；ＥＵナンバリン
グ）（配列番号５）。Ｇｉｂｃｏ Ｅｘｐｉ２９３ＴＭ 発現系キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いる一過性トランスフェクションの後にＨＥＫ－２９３Ｆ（ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）細胞中で組換えタンパク質を発現させた。アニオン交換カラム（ＳＯＵＲＣＥ－１５Ｑ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、ｐＨ８．０及び直線状塩勾配（０－０．５Ｍ ＮａＣｌ）においてＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇを培養上澄み液から精製した。あるいはまた、タンパク質Ａ－セファロース及び標準的な方法を用いてＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇを精製することができる。カラム（イオン交換又はタンパク質Ａ－セファロース）からの溶離の後、ＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析した。実験における使用の前にＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ）中でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇをさらに精製した。類似の方法及びトランスフェクションされたＨＥＫ－２９３Ｆ細胞中で発現される組換えタンパク質を用いて他のＳｅｌｄｅｇｓのための発現プラスミドを作製した。ＦｃＲｎ強化突然変異のないＳｅｌｄｅｇｓ（例えばＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ、ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＴｆＲ；配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０）をタンパク質Ｇ－セファロースを用いて精製した。
グ）（配列番号５）。Ｇｉｂｃｏ Ｅｘｐｉ２９３ＴＭ 発現系キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いる一過性トランスフェクションの後にＨＥＫ－２９３Ｆ（ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）細胞中で組換えタンパク質を発現させた。アニオン交換カラム（ＳＯＵＲＣＥ－１５Ｑ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、ｐＨ８．０及び直線状塩勾配（０－０．５Ｍ ＮａＣｌ）においてＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇを培養上澄み液から精製した。あるいはまた、タンパク質Ａ－セファロース及び標準的な方法を用いてＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇを精製することができる。カラム（イオン交換又はタンパク質Ａ－セファロース）からの溶離の後、ＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析した。実験における使用の前にＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ）中でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇをさらに精製した。類似の方法及びトランスフェクションされたＨＥＫ－２９３Ｆ細胞中で発現される組換えタンパク質を用いて他のＳｅｌｄｅｇｓのための発現プラスミドを作製した。ＦｃＲｎ強化突然変異のないＳｅｌｄｅｇｓ（例えばＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ、ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＴｆＲ；配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０）をタンパク質Ｇ－セファロースを用いて精製した。
【0082】
２つの抗原に関して特異的な抗体を標的とするＳｅｌｄｅｇｓ：（１）ＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇ；及び（２）ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇを作製した。抗原ＨＥＲ２はトラスツズマブ（ＴＺＢ）又はペルツズマブ（ＰＺＢ）のようなＨＥＲ２特異的抗体を用いる治療のため及びＨＥＲ２過剰発現腫瘍の診断用画像化のためにも十分に定義された標的である。抗原ＭＯＧは多発性硬化症（ＭＳ）の動物モデル及びヒトにおけるＭＳの両方において自己反応性抗体（ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）により認識される。
【0083】
ＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇ及びＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇは、中性近辺のｐＨにおける結合親和性を向上させるＦｃＲｎ強化ＭＳＴ－ＨＮ突然変異（Ｍ２５２Ｙ，Ｓ２５４Ｔ，Ｔ２５６Ｅ，Ｈ４３３Ｋ，Ｎ４３４Ｆ；ＥＵナンバリング）がないことを除いてＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇ及びＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇに類似の構築物（それぞれ“ＨＥＲ２－ＷＴ”及び“ＭＯＧ－ＷＴ”）を作製するためにＦｃフラグメントに融合されたＨＥＲ２又はＭＯＧを含む組換え融合タンパク質と対照的に、中性のｐＨ及び酸性のｐＨにおいてＦｃＲｎに関する有意により高い結合親和性を保持している（図３Ｂ）。ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、組換えタンパク質とＦｃＲｎの相互作用を分析するための表面プラズモン共鳴実験を行った。ＰＢＳ（ｐＨ６．０又は７．４）プラス０．０１％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ－２０中の固定化されたＦｃＲｎ（ＣＭ５センサーチップ上に～６００ＲＵにおいて結合）上に１００ｎＭのＭＯＧ／ＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇ又はＭＯＧ／ＨＥＲ２－ＷＴを１０μｌ／分の流量で注入することによりＳｅｌｄｅｇ／ＷＴの組換えマウスＦｃＲｎへの結合を分析した。０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．１Ｍ 重炭酸ナトリウム，ｐＨ８．５を用いて、各注入及び解離段階に続いてフローセル（ｆｌｏｗ ｃｅｌｌｓ）を再生させた。データをゼロ調整し、バックグラウンドを引き去った（バックグラウンドは結合反応の間に緩衝液のみと結合したフローセル上に注入することにより得られた）。
【0084】
ＭＳＴ－ＨＮのようなＦｃＲｎ結合を向上させるための突然変異は以下の方法を用いて同定された：ＦｃＲｎ結合に必須であることが既知のアミノ酸（例えば２５３、４３５）に近接する残基をＦｃフラグメント遺伝子においてランダムに突然変異させ、突然変異したＦｃブラグメントのライブラリをファージ上で表示する。ファージディスプレー法
（Ｇｈｅｔｉｅ，Ｖ．，Ｐｏｐｏｖ，Ｓ．，Ｂｏｒｖａｋ，Ｊ．，Ｒａｄｕ，Ｃ．，Ｍａｔｅｓｏｉ，Ｄ．，Ｍｅｄｅｓａｎ，Ｃ．，Ｏｂｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．（１９９７）Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ
ａｎ ＩｇＧ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，
Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５，６３７－６４０；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．，Ｗｏｏｄｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．，Ｐａｌａｓｚｙｎｓｋｉ，Ｓ．Ｒ．，Ｐａｔｅｌ，Ｎ．Ｋ．，Ｂｒｒｅｗａｈ，Ｙ．Ａ．，Ｗｕ，Ｈ．，Ｋｉｅｎｅｒ，Ｐ．Ａ．，Ｌａｎｇｅｒｍａｎｎ，Ｓ．（２００１） Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｆｏｒ ｔｈｅ ｎｅｏｎａｔａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ： ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｓｑｕｅｎｃｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９，５１７１－５１８０）を用い、ＦｃＲｎに関する結合親和性が向上したＦｃフラグメントを選択した。あるいはまた、これらの残基をすべての他の可能なアミノ酸に突然変異させ、ＥＬＩＳＡ又は表面プラズモン共鳴結合分析のような方法を用いてＦｃＲｎに関するより高い親和性を有するＦｃフラグメントを同定することができる。
（Ｇｈｅｔｉｅ，Ｖ．，Ｐｏｐｏｖ，Ｓ．，Ｂｏｒｖａｋ，Ｊ．，Ｒａｄｕ，Ｃ．，Ｍａｔｅｓｏｉ，Ｄ．，Ｍｅｄｅｓａｎ，Ｃ．，Ｏｂｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．（１９９７）Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ
ａｎ ＩｇＧ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，
Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５，６３７－６４０；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．，Ｗｏｏｄｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．，Ｐａｌａｓｚｙｎｓｋｉ，Ｓ．Ｒ．，Ｐａｔｅｌ，Ｎ．Ｋ．，Ｂｒｒｅｗａｈ，Ｙ．Ａ．，Ｗｕ，Ｈ．，Ｋｉｅｎｅｒ，Ｐ．Ａ．，Ｌａｎｇｅｒｍａｎｎ，Ｓ．（２００１） Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｆｏｒ ｔｈｅ ｎｅｏｎａｔａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ： ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｓｑｕｅｎｃｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９，５１７１－５１８０）を用い、ＦｃＲｎに関する結合親和性が向上したＦｃフラグメントを選択した。あるいはまた、これらの残基をすべての他の可能なアミノ酸に突然変異させ、ＥＬＩＳＡ又は表面プラズモン共鳴結合分析のような方法を用いてＦｃＲｎに関するより高い親和性を有するＦｃフラグメントを同定することができる。
【0085】
サイズ排除分析は、最高で４℃で３０日間又は３７℃で５日間インキュベートされる場合、Ｓｅｌｄｅｇｓを含む組換えタンパク質がリン酸緩衝生理食塩水中のインキュベーション後に凝集物を形成しないことを示す（図３Ｃ）。
【実施例2】
【0086】
－ＦｃＲｎを標的とするＳｅｌｄｅｇｓが形質転換によりヒトＦｃγＲｓを発現するマウス（ｈｕＦｃγＲマウス）において標的抗原特異的抗体を枯渇させる能力
Ｓｅｌｄｅｇｓが標的抗原特異的抗体を枯渇させる能力を決定するために、外来遺伝子導入によりヒトＦｃγＲｓを発現するマウス（ｈｕＦｃγＲマウス；Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．，ＤｉＬｉｌｌｏ，Ｄ．Ｊ．，Ｂｏｕｒｎａｚｏｓ，Ｓ．，Ｌｉ，Ｆ．，Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．（２０１２）． Ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ Ｆｃγ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０９，６１８１－６１８６．ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２０３９５４１０９）に１５μｇの放射性標識された（１２５Ｉ標識された）ＭＯＧ特異的抗体８－１８Ｃ５を注入した。ｈｕＦｃγＲマウスに８－１８Ｃ５を注入してから２４時間後、注射を介して１２５μｇ又は３１μｇのＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ又は参照標準タンパク質を投与した。図３Ｄにおいて、“ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－Ｈｉｇｈ”は１２５μｇの用量に対応し、“ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－Ｌｏｗ”は３１μｇの用量に対応する。参照標準はリン酸緩衝生理食塩水（“ＰＢＳ”）及び非修飾ＭＯＧ－Ｆｃ融合タンパク質（“ＭＯＧ－ＷＴ”）である。ＭＯＧ－ＷＴは、それが中性近辺のｐＨにおける結合親和性を向上させるＦｃＲｎ強化ＭＳＴ－ＨＮ突然変異を欠いていることを除いてＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇに類似の構築物である。
Ｓｅｌｄｅｇｓが標的抗原特異的抗体を枯渇させる能力を決定するために、外来遺伝子導入によりヒトＦｃγＲｓを発現するマウス（ｈｕＦｃγＲマウス；Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．，ＤｉＬｉｌｌｏ，Ｄ．Ｊ．，Ｂｏｕｒｎａｚｏｓ，Ｓ．，Ｌｉ，Ｆ．，Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．（２０１２）． Ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ Ｆｃγ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０９，６１８１－６１８６．ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２０３９５４１０９）に１５μｇの放射性標識された（１２５Ｉ標識された）ＭＯＧ特異的抗体８－１８Ｃ５を注入した。ｈｕＦｃγＲマウスに８－１８Ｃ５を注入してから２４時間後、注射を介して１２５μｇ又は３１μｇのＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ又は参照標準タンパク質を投与した。図３Ｄにおいて、“ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－Ｈｉｇｈ”は１２５μｇの用量に対応し、“ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－Ｌｏｗ”は３１μｇの用量に対応する。参照標準はリン酸緩衝生理食塩水（“ＰＢＳ”）及び非修飾ＭＯＧ－Ｆｃ融合タンパク質（“ＭＯＧ－ＷＴ”）である。ＭＯＧ－ＷＴは、それが中性近辺のｐＨにおける結合親和性を向上させるＦｃＲｎ強化ＭＳＴ－ＨＮ突然変異を欠いていることを除いてＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇに類似の構築物である。
【0087】
図３Ｄのデータを作成するために、放射性標識された８－１８Ｃ５の全身カウントを、指示される時間に取った。８－１８Ｃ５投与から２４時間後、Ｓｅｌｄｅｇ又は参照標準送達の直前に得られる分当たりのカウント（“ＣＰＭ”）を各マウスに関する１００％とみなし、その後に得られる全身のＣＰＭをこの時点に正規化する。エラーバー（ｅｒｒｏｒ ｂａｒｓ）は標準偏差を示し、チューキーの多重比較（Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ）と共に二元配置分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を用い、ｐ＜０．０５及びｎ＝グループ当たり６匹のマウスで統計的に有意な差を決定した。
【0088】
ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇの１２５μｇ及び３１μｇの用量は、マウスにおいてＩｇＧレベルを全体的に排除することが示された５００μｇ，ＭＳＴ－ＨＮ Ａｂｄｅｇの用量より約２ないし８倍低い（２ ｔｏ ８－ｆｏｌｄ ｌｏｗｅｒ）（モルに基づいて）。そのように比較的低いＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇの用量は、ＦｃＲｎ結合に関するＳｅｌｄｅｇとの競争を介する融合した抗原に関して特異的でないＩｇＧｓへの影響を最小にするために用いられた。１２５μｇ又は３１μｇの用量は、８－１８Ｃ５標的抗原特異的抗体よりそ
れぞれ１６倍及び４倍モル過剰を意味する。
れぞれ１６倍及び４倍モル過剰を意味する。
【0089】
図３Ｄは、時間に対する放射性標識された８－１８Ｃ５（標的抗原特異的抗体）の正規化された体カウントのグラフを与えている。ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇの投与は、正規化された全身カウントにおいて８－１８Ｃ５の急速な用量依存性減少を生じ（図３Ｄ）、それは体から８－１８Ｃ５を選択的に枯渇させるＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇの能力を示す。対照的に、ＦｃＲｎ強化ＭＳＴ－ＨＮ突然変異を欠いた参照標準ＭＯＧ－ＷＴの注入は、８－１８Ｃ５抗体枯渇に影響を有していなかった。これは、ｐＨ６．０－７．４におけるＦｃＲｎに関する高い結合親和性を与えるためのＭＳＴ－ＨＮ突然変異の重要性を示す。
【実施例3】
【0090】
－ＦｃＲｎを標的とするＳｅｌｄｅｇｓの特異性ならびに血液中及び体全体の両方において標的抗原特異的抗体レベルにおける有意な低下を誘導するそれらの能力
Ｓｅｌｄｅｇｓの特異性及び種々の抗原認識性を有する抗体へのそれらの影響を分析するために、ＨＥＲ２特異的抗体ＴＺＢの行動をＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇ及びＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇの両方の存在下で調べた（図３Ｅ）。図３Ｅのデータを作成するために、ｈｕＦｃγＲマウスに１５μｇの放射性標識された（１２５Ｉ標識された）ＴＺＢを静脈内注射し、続いて４倍モル過剰のＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇ又は抗原特異性に関する参照標準としてＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇを静脈内注射した。追加の参照標準はリン酸緩衝生理食塩水（“ＰＢＳ”）、Ａｂｄｅｇ及び中性近辺のｐＨにおける結合親和性を向上させるＦｃＲｎ強化ＭＳＴ－ＨＮ突然変異を欠いていること以外はＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇに類似の構築物（“ＨＥＲ２－ＷＴ”）を作製するためにＦｃフラグメントに融合したＨＥＲ２を含む組換え融合タンパク質である。Ｓｅｌｄｅｇと対照的に、“Ａｂｄｅｇ”はＭＳＴ－ＨＮ突然変異を有するヒトＩｇＧ１由来抗体であり、それは非選択的に抗体を枯渇させる。そのようなタンパク質は、それらが一般的にＩｇＧ分解を引き起こす抗体なのでＡｂｄｅｇｓと呼ばれる。
Ｓｅｌｄｅｇｓの特異性及び種々の抗原認識性を有する抗体へのそれらの影響を分析するために、ＨＥＲ２特異的抗体ＴＺＢの行動をＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇ及びＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇの両方の存在下で調べた（図３Ｅ）。図３Ｅのデータを作成するために、ｈｕＦｃγＲマウスに１５μｇの放射性標識された（１２５Ｉ標識された）ＴＺＢを静脈内注射し、続いて４倍モル過剰のＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇ又は抗原特異性に関する参照標準としてＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇを静脈内注射した。追加の参照標準はリン酸緩衝生理食塩水（“ＰＢＳ”）、Ａｂｄｅｇ及び中性近辺のｐＨにおける結合親和性を向上させるＦｃＲｎ強化ＭＳＴ－ＨＮ突然変異を欠いていること以外はＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇに類似の構築物（“ＨＥＲ２－ＷＴ”）を作製するためにＦｃフラグメントに融合したＨＥＲ２を含む組換え融合タンパク質である。Ｓｅｌｄｅｇと対照的に、“Ａｂｄｅｇ”はＭＳＴ－ＨＮ突然変異を有するヒトＩｇＧ１由来抗体であり、それは非選択的に抗体を枯渇させる。そのようなタンパク質は、それらが一般的にＩｇＧ分解を引き起こす抗体なのでＡｂｄｅｇｓと呼ばれる。
【0091】
図３Ｅのデータを作成するために、マウスを出血させ、血液及び全身カウントを指示される時間に取った。ＴＺＢ投与から２４時間後、Ｓｅｌｄｅｇ又は参照標準送達の直前に得られる分当たりのカウント（“ＣＰＭ”）を各マウスに関する１００％とみなし、その後に得られる血液及び全身のＣＰＭをこの時点に正規化する。エラーバーは標準偏差を示し、チューキーの多重比較と共に二元配置分散分析を用い、ｐ＜０．０５及びｎ＝グループ当たり６匹のマウスで統計的に有意な差を決定した。
【0092】
図３Ｅは、時間に対する放射性標識されたＴＺＢ（標的抗原特異的抗体）の正規化された血液及び体カウントのグラフを与えている。ＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇの投与は、血液及び全身カウントの両方において正規化されたＴＺＢの体カウントにおける有意な低下を引き起こし、それは体からＴＺＢを選択的に枯渇させるＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇの能力を示す。対照的に、参照標準タンパク質はＰＢＳ参照標準に関して観察された行動に類似の行動を示した（図３Ｅ）。
【実施例4】
【0093】
－ＦｃＲｎを標的とするＳｅｌｄｅｇｓが標的抗原特異的抗体を急速に枯渇させる能力
マウスに放射性標識された（１２５Ｉ標識された）ＴＺＢ（１５μｇ）を静脈内注射し、２４時間後にＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇ（５１μｇ；ＴＺＢより４倍モル過剰）を静脈内送達した。追加の参照標準はリン酸緩衝生理食塩水（“ＰＢＳ”）及びＡｂｄｅｇ（６０μｇ）である。
マウスに放射性標識された（１２５Ｉ標識された）ＴＺＢ（１５μｇ）を静脈内注射し、２４時間後にＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇ（５１μｇ；ＴＺＢより４倍モル過剰）を静脈内送達した。追加の参照標準はリン酸緩衝生理食塩水（“ＰＢＳ”）及びＡｂｄｅｇ（６０μｇ）である。
【0094】
図３Ｆのデータを作成するために、マウスを出血させ、血液及び全身カウントを指示される時間に取った。ＴＺＢ投与から２４時間後、Ｓｅｌｄｅｇ又は参照標準送達の直前に
得られる分当たりのカウント（“ＣＰＭ”）を各マウスに関する１００％とみなし、その後に得られる血液及び全身のＣＰＭをこの時点に正規化する。エラーバーは標準偏差を示し、チューキーの多重比較と共に二元配置分散分析を用い、ｐ＜０．０５及びｎ＝グループ当たり５－６匹のマウスで統計的に有意な差を決定した。
得られる分当たりのカウント（“ＣＰＭ”）を各マウスに関する１００％とみなし、その後に得られる血液及び全身のＣＰＭをこの時点に正規化する。エラーバーは標準偏差を示し、チューキーの多重比較と共に二元配置分散分析を用い、ｐ＜０．０５及びｎ＝グループ当たり５－６匹のマウスで統計的に有意な差を決定した。
【0095】
図３Ｆは、時間に対する放射性標識されたＴＺＢ（標的抗原特異的抗体）の正規化された血液及び体カウントのグラフを与えている。ＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇの投与は、正規化されたＴＺＢの体及び血液カウントにおける急速な低下を引き起こし、それは体からＴＺＢを急速に枯渇させるＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇの能力を示す。注目すべきことに、ＴＺＢの血液カウントはＳｅｌｄｅｇ投与から２時間以内にバックグラウンドレベルの近くまで低下し（図３Ｆ）、体から標的抗原特異的抗体を急速に枯渇させるＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇの能力をさらに支持している。対照的に、６０μｇ／マウスの用量におけるＡｂｄｅｇの送達はＰＢＳ参照標準に関して観察された行動に類似の行動を示した（図３Ｆ）。
【実施例5】
【0096】
－細胞表面上の露出したホスファチジルセリン（ＰＳ）を標的とするＳｅｌｄｅｇｓの活性
我々は、標的タンパク質がシナプトタグミン１のＣ２ドメイン（Ｓｙｔ１）であるＳｅｌｄｅｇがｈｕＦｃγＲマウスにおいてＭＯＧに関して特異的な抗体を選択的に枯渇させる能力も調べた。Ｓｙｔ１は細胞上の露出したＰＳに結合し、Ｓｅｌｄｅｇはそのために設計されたＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳであり、略図的に示される（図４Ａ）。‘ＤＮ’突然変異（Ｄ１７３Ｎ，Ｄ１７９Ｎ，Ｄ２３１Ｎ，Ｄ２３３Ｎ及びＤ２３９Ｎ）の存在の故にＰＳに結合しないＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ（ＤＮ）も作製した。ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ及びＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ（ＤＮ）を、トランスフェクションされたＨＥＫ－２９３Ｆ細胞の培養上澄み液からタンパク質Ｇ－セファロース及び標準的な方法を用いて精製した。ヘテロダイマー形成はＦｃ領域中へのノブズイントゥーホールズ及び静電ステアリング突然変異の挿入により達成され、サイズ排除分析は組換えタンパク質が良好に行動することを示す（図４Ａ）。
我々は、標的タンパク質がシナプトタグミン１のＣ２ドメイン（Ｓｙｔ１）であるＳｅｌｄｅｇがｈｕＦｃγＲマウスにおいてＭＯＧに関して特異的な抗体を選択的に枯渇させる能力も調べた。Ｓｙｔ１は細胞上の露出したＰＳに結合し、Ｓｅｌｄｅｇはそのために設計されたＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳであり、略図的に示される（図４Ａ）。‘ＤＮ’突然変異（Ｄ１７３Ｎ，Ｄ１７９Ｎ，Ｄ２３１Ｎ，Ｄ２３３Ｎ及びＤ２３９Ｎ）の存在の故にＰＳに結合しないＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ（ＤＮ）も作製した。ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ及びＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ（ＤＮ）を、トランスフェクションされたＨＥＫ－２９３Ｆ細胞の培養上澄み液からタンパク質Ｇ－セファロース及び標準的な方法を用いて精製した。ヘテロダイマー形成はＦｃ領域中へのノブズイントゥーホールズ及び静電ステアリング突然変異の挿入により達成され、サイズ排除分析は組換えタンパク質が良好に行動することを示す（図４Ａ）。
【0097】
図４Ｂに示すデータの作成のために、マウスに放射性標識された（１２５Ｉ）キメラ８－１８Ｃ５（ヒト定常／マウス可変ドメイン；ＭＯＧ特異的；１５－２０μｇ）を静脈内注射し、２４時間後にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、４０μｇのＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ又は参照標準として３４μｇのＦｃ－Ｓｙｔ１（ＭＯＧが結合していない）又は４０μｇのＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ（ＤＮ）を静脈内送達した。指示される時間に放射性レベルを決定した。ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ又は参照標準送達の直前に得られる全身ＣＰＭ又は血液ＣＰＭレベルを１００％とみなし、得られる続くＣＰＭのすべてをこれらのＣＰＭレベルに対して正規化した。エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示し、ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ処置グループと参照標準グループ（Ｆｃ－Ｓｙｔ１、ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ（ＤＮ）及びＰＢＳ）の間の統計的に有意な差を＊により示した（ｐ＜０．０５，チューキーの多重比較を用いる二元配置分散分析；ｎ＝グループ当たり５－６匹のマウス）。
【0098】
ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳの投与は血液及び全身カウントの両方において８－１８Ｃ５の正規化された体カウントにおける有意な低下を引き起こし、それは体から８－１８Ｃ５を選択的に枯渇させるＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳの能力を示す。対照的に、参照標準タンパク質Ｆｃ－Ｓｙｔ１はＰＢＳ参照標準に関して観察された行動と類似の行動を示し、ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ（ＤＮ）は８－１８Ｃ５における低下を誘導したが（ＰＳへの残留結合の故に）、影響はＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳのそれよりずっと低かった（図４Ｂ）。
【実施例6】
【0099】
－ＦｃＲｎを標的とするＳｅｌｄｅｇｓが標的抗原特異的抗体を有効にエンドソーム中に移行させ、リソソームへの送達を介して分解を引き起こす能力
細胞レベルにおけるＳｅｌｄｅｇｓの活性の機構を決定するために、フローサイトメトリー及び蛍光顕微鏡検査を行い、標的抗原特異的抗体ＴＺＢ、ＰＺＢ及び８－１８Ｃ５の移行及び堆積へのＳｅｌｄｅｇｓの効果を分析した。最初に結合性がマウスＦｃＲｎに類似であるように突然変異したヒトＦｃＲｎ－ＧＦＰ発現構築物を用いてヒト内皮細胞（ＨＭＥＣ－１）をトランスフェクションした。
細胞レベルにおけるＳｅｌｄｅｇｓの活性の機構を決定するために、フローサイトメトリー及び蛍光顕微鏡検査を行い、標的抗原特異的抗体ＴＺＢ、ＰＺＢ及び８－１８Ｃ５の移行及び堆積へのＳｅｌｄｅｇｓの効果を分析した。最初に結合性がマウスＦｃＲｎに類似であるように突然変異したヒトＦｃＲｎ－ＧＦＰ発現構築物を用いてヒト内皮細胞（ＨＭＥＣ－１）をトランスフェクションした。
【0100】
Ｓｅｌｄｅｇｓは、結合した標的抗原特異的抗体を有効に細胞内のエンドソーム中に移行させ、８時間のインキュベーション後に標的抗原特異的抗体はリソソームに送達された。
【0101】
図５Ａは平均蛍光強度（“ＭＦＩ）”）のグラフであり、図５Ｂ及び図５Ｃは標的抗原特異的抗体の存在下におけるＳｅｌｄｅｇ活性の顕微鏡画像であり、代表的なエンドソームの顕微鏡画像を切り出し、拡大し、右上の角の差し込み図に示した。図５ＡはそれぞれＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇｓと一緒のＡｌｅｘａ ６４７標識されたＴＺＢ及びＭＯＧ－Ｓｅｌｅｇと一緒のＡｌｅｘａ ６４７標識された８－１８Ｃ５の存在下におけるより大きなＭＦＩを示す。このより大きなＭＦＩは、ＴＺＢ及び８－１８Ｃ５とのそれぞれＨＥＲ２－及びＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇの共－インキュベーション（４００ｎＭのＳｅｌｄｅｇ又はＷＴ参照標準プラス１００ｎＭの抗原特異的抗体；３０分のパルス、追跡なし又は６０分の追跡、図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃにおいてそれぞれ３０’Ｐ又は３０’Ｐ，６０’Ｃと標識）がＴＺＢ及び８－１８Ｃ５進入細胞の高いレベルを生ずることを示す。ＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇの存在下でＴＺＢの代わりにＨＥＲ２特異的抗体ペルツズマブ（ＰＺＢ）を用いた場合、類似の結果が得られた（図５Ａ）。さらに、各標的抗原特異的抗体の大部分は６０分の追跡の間、細胞により保持された。対照的に、負の参照標準ＨＥＲ２－ＷＴ（ＴＺＢ又はＰＺＢに関して選択的）及びＭＯＧ－ＷＴ（８－１８Ｃ５に関して選択的）の存在下で細胞内の標的抗原特異的抗体の堆積は実質的により低かった。
【0102】
図５Ｂ及びＣは抗原特異的抗体が細胞中に堆積すること、そしてＳｅｌｄｅｇｓの存在下におけるエンドソーム中のＦｃＲｎと関連していることを示す。図５Ｂの顕微鏡画像の作成のために、４００ｎＭのＡｌｅｘａ ５５５標識されたＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇ又はＨＥＲ２－ＷＴ（示される通り）との複合体における１００ｎＭのＡｌｅｘａ ６４７標識されたＴＺＢ（ＨＥＲ２特異的）を用いてＨＭＥＣ－１細胞を３０分間パルスし、洗浄し、直後に固定するか又は洗浄し、媒体中で６０分間追跡し、続いて固定した。固定された細胞を蛍光顕微鏡検査を用いて画像化した。図５Ｃ中のデータは、４００ｎＭのＡｌｅｘａ ５５５標識されたＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ又はＭＯＧ－ＷＴとの複合体における１００ｎＭのＡｌｅｘａ ６４７標識された８－１８Ｃ５（ＭＯＧ特異的）を用いる以外は同じ方法を用いて作成された。それぞれの顕微鏡画像中のバーは５μｍであり、それぞれの顕微鏡画像差し込み図中のバーは０．２５μｍである。図５Ｂ及び５Ｃに示されるデータは、抗原特異的抗体が参照標準（ＷＴ）タンパク質の存在下と比較してＦｃＲｎに結合するＳｅｌｄｅｇｓの存在下で実質的により高いレベルまでＦｃＲｎ発現細胞中に堆積することを示している。
【0103】
図６Ａは標的抗原特異的抗体の存在下におけるＳｅｌｄｅｇ活性の顕微鏡画像を示し、代表的なリソソームの顕微鏡画像を切り出し、拡大し、右上の角の差し込み図に示した。図６ＡのためにＡｌｅｘａ ５５５標識されたデキストランを用いてＨＭＥＣ－１細胞を２時間予備パルスし、洗浄し、次いで４００ｎＭのＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ又はＭＯＧ－ＷＴ（示される通り）との複合体における１００ｎＭのＡｌｅｘａ ６４７標識された８－１８Ｃ５（ＭＯＧ特異的）を用いて３０分間パルスし、続いて８時間追跡し、洗浄し、固
定し、画像化した。図６Ｂの顕微鏡画像の作成のために、Ａｌｅｘａ ５５５標識されたデキストランを用いてＨＭＥＣ－１細胞を２時間予備パルスし、洗浄し、次いで１００ｎＭのＡｌｅｘａ ６４７標識されたＴＺＢ又は８－１８Ｃ５抗体及び４００ｎＭのＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ又はＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇ（示される通り）を用いて３０分間パルスし、続いて８時間追跡し、洗浄し、固定し、画像化した。それぞれのオーバーレイ画像（ｏｖｅｒｌａｙ ｉｍａｇｅ）（右の列に示す）のために、ＧＦＰ、Ａｌｅｘａ ５５５及びＡｌｅｘａ ６４７をそれぞれ緑、赤及び青に疑似着色した（ｐｓｅｕｄｏ－ｃｏｌｏｒｅｄ）。それぞれの顕微鏡画像中のバーは５μｍであり、それぞれの顕微鏡画像差し込み図中のバーは０．２５μｍである。注目すべてことに、図６ＢはそれぞれＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ又はＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇの存在下で細胞がリソソーム中にＴＺＢ及び８－１８Ｃ５を堆積させないことを示し、それはそれらの効果の抗原特異性を示している。
定し、画像化した。図６Ｂの顕微鏡画像の作成のために、Ａｌｅｘａ ５５５標識されたデキストランを用いてＨＭＥＣ－１細胞を２時間予備パルスし、洗浄し、次いで１００ｎＭのＡｌｅｘａ ６４７標識されたＴＺＢ又は８－１８Ｃ５抗体及び４００ｎＭのＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ又はＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇ（示される通り）を用いて３０分間パルスし、続いて８時間追跡し、洗浄し、固定し、画像化した。それぞれのオーバーレイ画像（ｏｖｅｒｌａｙ ｉｍａｇｅ）（右の列に示す）のために、ＧＦＰ、Ａｌｅｘａ ５５５及びＡｌｅｘａ ６４７をそれぞれ緑、赤及び青に疑似着色した（ｐｓｅｕｄｏ－ｃｏｌｏｒｅｄ）。それぞれの顕微鏡画像中のバーは５μｍであり、それぞれの顕微鏡画像差し込み図中のバーは０．２５μｍである。注目すべてことに、図６ＢはそれぞれＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ又はＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇの存在下で細胞がリソソーム中にＴＺＢ及び８－１８Ｃ５を堆積させないことを示し、それはそれらの効果の抗原特異性を示している。
【実施例7】
【0104】
－ホスファチジルセリンを標的とするＳｅｌｄｅｇｓが標的抗原特異的抗体を有効に細胞中に移行させる能力
図７は、ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳがＭＯＧ特異的抗体（キメラ８－１８Ｃ５）を内皮細胞及びマクロファージ中に有効に移行させること及び吸収はＰＳ結合依存性であることを示す。ＰＳを露出させた内皮細胞（２Ｈ１１）又はマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）を、２０ｎＭのＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ、ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ（ＤＮ）又はＦｃ－Ｓｙｔ１（ＭＯＧなし）と混合された１０ｎＭのＡｌｅｘａ ６４７標識されたキメラ８－１８Ｃ５と一緒に２時間インキュベーションした。三重の試料に関するＡｌｅｘａ ６４７標識されたキメラ８－１８Ｃ５（マウス抗体、８－１８Ｃ５の可変ドメインを当業者に周知の方法を用いてヒトＩｇＧ１の定常領域、Ｃκに融合させることにより作製）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーにより決定した。
図７は、ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳがＭＯＧ特異的抗体（キメラ８－１８Ｃ５）を内皮細胞及びマクロファージ中に有効に移行させること及び吸収はＰＳ結合依存性であることを示す。ＰＳを露出させた内皮細胞（２Ｈ１１）又はマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）を、２０ｎＭのＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ、ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ（ＤＮ）又はＦｃ－Ｓｙｔ１（ＭＯＧなし）と混合された１０ｎＭのＡｌｅｘａ ６４７標識されたキメラ８－１８Ｃ５と一緒に２時間インキュベーションした。三重の試料に関するＡｌｅｘａ ６４７標識されたキメラ８－１８Ｃ５（マウス抗体、８－１８Ｃ５の可変ドメインを当業者に周知の方法を用いてヒトＩｇＧ１の定常領域、Ｃκに融合させることにより作製）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーにより決定した。
【0105】
この代表的なＰＳ結合Ｓｅｌｄｅｇはカルシウム依存性であり、従ってカルシウム濃度がずっと低いエンドソーム中で解離する。当業者に理解される通り、すべてのＰＳ標的化Ｓｅｌｄｅｇがカルシウム依存性であるわけではないと思われるが、いくつか、アネキシンＶを含むもののようないくつかもこの性質を有するであろう。さらに、いくつかの抗体はベータ２糖タンパク質１に結合することができ、それが今度はＰＳに結合することができる。
【実施例8】
【0106】
－トランスフェリン受容体を標的とするＳｅｌｄｅｇｓが標的抗原特異的抗体を有効にヒトトランスフェリン受容体を発現する細胞中に移行させる能力
トランスフェリン受容体を標的とする抗体に融合した抗原（ＭＯＧ）を含むＳｅｌｄｅｇ（ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＴｆＲ）を作製し、図８に略図的に示す。ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＴｆＲ及び参照標準抗体、Ａｂ－ＴｆＲ（ＭＯＧが存在しない）を、トランスフェクションされたＨＥＫ－２９３Ｆ細胞の培養上澄み液からタンパク質Ｇ－セファロース及び標準的な方法を用いて精製した。ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＴｆＲはＭＯＧ特異的抗体（キメラ８－１８Ｃ５）を有効に内皮（ＨＭＥＣ－１）細胞中に移行させ、吸収はＳｅｌｄｅｇ中のＭＯＧの存在に依存性である（図９）。ヒトＴｆＲを発現するＨＭＥＣ－１細胞を、２００ｎＭのＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＴｆＲ又はＴｆＲ特異的抗体（Ａｂ－ＴｆＲ；ＭＯＧなし）と混合された５０ｎＭのＡｌｅｘａ ６４７標識されたキメラ８－１８Ｃ５（ＭＯＧに関して特異的）と一緒に３０分間インキュベーションし、続いて洗浄し、追跡しないか（３０’Ｐ）又は３０分間に続いて洗浄し、６０分間追跡した（３０’Ｐ，６０’Ｃ）。三重の試料に関するＡｌｅｘａ ６４７標識された８－１８Ｃ５の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーにより決定した（図９）。
トランスフェリン受容体を標的とする抗体に融合した抗原（ＭＯＧ）を含むＳｅｌｄｅｇ（ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＴｆＲ）を作製し、図８に略図的に示す。ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＴｆＲ及び参照標準抗体、Ａｂ－ＴｆＲ（ＭＯＧが存在しない）を、トランスフェクションされたＨＥＫ－２９３Ｆ細胞の培養上澄み液からタンパク質Ｇ－セファロース及び標準的な方法を用いて精製した。ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＴｆＲはＭＯＧ特異的抗体（キメラ８－１８Ｃ５）を有効に内皮（ＨＭＥＣ－１）細胞中に移行させ、吸収はＳｅｌｄｅｇ中のＭＯＧの存在に依存性である（図９）。ヒトＴｆＲを発現するＨＭＥＣ－１細胞を、２００ｎＭのＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＴｆＲ又はＴｆＲ特異的抗体（Ａｂ－ＴｆＲ；ＭＯＧなし）と混合された５０ｎＭのＡｌｅｘａ ６４７標識されたキメラ８－１８Ｃ５（ＭＯＧに関して特異的）と一緒に３０分間インキュベーションし、続いて洗浄し、追跡しないか（３０’Ｐ）又は３０分間に続いて洗浄し、６０分間追跡した（３０’Ｐ，６０’Ｃ）。三重の試料に関するＡｌｅｘａ ６４７標識された８－１８Ｃ５の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーにより決定した（図９）。
【実施例9】
【0107】
－ＦｃＲｎを標的とするＳｅｌｄｅｇｓが放射性標識された抗体を用いる腫瘍のポジトロンエミッショントモグラフィー分析の間にバックグラウンドをクリアランスする能力
雌のＢＡＬＢ／ｃＳＣＩＤマウスに、ＨＥＲ２陽性乳癌細胞系、ＨＣＣ１９５４を乳房脂肪体中において移植した（マウス当たり０．５ｘ１０６個の細胞；注入前に細胞をＲＰＭＩ－１６４０／Ｍａｔｒｉｇｅｌ中に懸濁させた）。６－７日後、マウスに１２４－Ｉ標識されたＴＺＢ（６０μｇ／マウス）を注入し、２２時間後にポジトロンエミッショントモグラフィー（ＰＥＴ）を用いて分析した。マウスにモル当量のＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇ（５１μｇ／マウス）又は参照標準としてＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ（３１μｇ／マウス）若しくはＰＢＳビヒクルを注入した（ｎ＝グループ当たりに３匹のマウス）。Ｓｅｌｄｅｇｓ又はＰＢＳの注入から４時間後にＰＥＴを用いてマウスを分析した。Ｓｉｅｍｅｎｓ
Ｉｎｖｅｏｎ ＰＥＴ－ｃｏｍｐｕｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＣＴ）Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いてマウスの画像化を行った。
雌のＢＡＬＢ／ｃＳＣＩＤマウスに、ＨＥＲ２陽性乳癌細胞系、ＨＣＣ１９５４を乳房脂肪体中において移植した（マウス当たり０．５ｘ１０６個の細胞；注入前に細胞をＲＰＭＩ－１６４０／Ｍａｔｒｉｇｅｌ中に懸濁させた）。６－７日後、マウスに１２４－Ｉ標識されたＴＺＢ（６０μｇ／マウス）を注入し、２２時間後にポジトロンエミッショントモグラフィー（ＰＥＴ）を用いて分析した。マウスにモル当量のＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇ（５１μｇ／マウス）又は参照標準としてＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ（３１μｇ／マウス）若しくはＰＢＳビヒクルを注入した（ｎ＝グループ当たりに３匹のマウス）。Ｓｅｌｄｅｇｓ又はＰＢＳの注入から４時間後にＰＥＴを用いてマウスを分析した。Ｓｉｅｍｅｎｓ
Ｉｎｖｅｏｎ ＰＥＴ－ｃｏｍｐｕｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＣＴ）Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いてマウスの画像化を行った。
【0108】
図１０Ａに示すデータの作成のために、１２４－Ｉ標識されたＴＺＢの注入から２２時間に（‘２２時間’）及びＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇ、ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ又はＰＢＳの注入から４．５－５時間後に（‘４．５時間クリアランス’）マウスを画像化した。ＡＭＩＤＥソフトウェアパッケージにおいてＰＥＴ及びＣＴ画像を共登録した（ｃｏ－ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ）。図１０Ｂは１２４－Ｉ標識されたＴＺＢの注入後２２時間及びＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇ、ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ又はＰＢＳの注入から４．５－５時間後の場合の放射性標識強度に関するコントラスト測定値のグラフを与えている。コントラスト測定値の決定のために、問題の２つの領域を胸部領域（バックグラウンド）及び腫瘍において同定した。腫瘍における平均強度対胸部領域における平均強度の比に関する平均値（ｎ＝グループ当たり３匹のマウス）をプロットする。エラーバーは標準誤差を示す。ＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇで処置されたマウス対ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ又はＰＢＳで処置されたマウスの間の統計的に有意な差（ｐ＜０．０５）を示す。データは、ＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇの送達がマウスの胸部領域におけるバックグラウンドを低下させることを示している。
【実施例10】
【0109】
－代表的なＳｅｌｄｅｇｓ及び参照標準ならびにノブズイントゥーホールズ突然変異、アルギニン突然変異及び静電ステアリング突然変異のような突然変異を有するそれらの変異体のＤＮＡ及びタンパク質配列
表１は、本明細書に説明される代表的なタンパク質をコードするポリヌクレオチドのＤＮＡ配列を示し、表２は表１に示されるポリヌクレオチドによりコードされる代表的なタンパク質のアミノ酸配列を示し、ここで配列番号１のＤＮＡ配列は配列番号２のタンパク質をコードし、配列番号３のＤＮＡ配列は配列番号４のタンパク質をコードし、配列番号５のＤＮＡ配列は配列番号６のタンパク質をコードし、配列番号７のＤＮＡ配列は配列番号８のタンパク質をコードし、配列番号９のＤＮＡ配列は配列番号１０のタンパク質をコードし、配列番号１１のＤＮＡ配列は配列番号１２のタンパク質をコードし、配列番号１３のＤＮＡ配列は配列番号１４のタンパク質をコードし、配列番号１５のＤＮＡ配列は配列番号１６のタンパク質をコードし、配列番号１７のＤＮＡ配列は配列番号１８のタンパク質をコードし、配列番号１９のＤＮＡ配列は配列番号２０のタンパク質をコードし、配列番号２１のＤＮＡ配列は配列番号２２のタンパク質をコードし、配列番号２３のＤＮＡ配列は配列番号２４のタンパク質をコードし、配列番号２５のＤＮＡ配列は配列番号２６のタンパク質をコードし、配列番号２７のＤＮＡ配列は配列番号２８のタンパク質をコードし、配列番号２９のＤＮＡ配列は配列番号３０のタンパク質をコードし、配列番号３１のＤＮＡ配列は配列番号３２のタンパク質をコードし、配列番号３３のＤＮＡ配列は配列番号３４のタンパク質をコードする。
表１は、本明細書に説明される代表的なタンパク質をコードするポリヌクレオチドのＤＮＡ配列を示し、表２は表１に示されるポリヌクレオチドによりコードされる代表的なタンパク質のアミノ酸配列を示し、ここで配列番号１のＤＮＡ配列は配列番号２のタンパク質をコードし、配列番号３のＤＮＡ配列は配列番号４のタンパク質をコードし、配列番号５のＤＮＡ配列は配列番号６のタンパク質をコードし、配列番号７のＤＮＡ配列は配列番号８のタンパク質をコードし、配列番号９のＤＮＡ配列は配列番号１０のタンパク質をコードし、配列番号１１のＤＮＡ配列は配列番号１２のタンパク質をコードし、配列番号１３のＤＮＡ配列は配列番号１４のタンパク質をコードし、配列番号１５のＤＮＡ配列は配列番号１６のタンパク質をコードし、配列番号１７のＤＮＡ配列は配列番号１８のタンパク質をコードし、配列番号１９のＤＮＡ配列は配列番号２０のタンパク質をコードし、配列番号２１のＤＮＡ配列は配列番号２２のタンパク質をコードし、配列番号２３のＤＮＡ配列は配列番号２４のタンパク質をコードし、配列番号２５のＤＮＡ配列は配列番号２６のタンパク質をコードし、配列番号２７のＤＮＡ配列は配列番号２８のタンパク質をコードし、配列番号２９のＤＮＡ配列は配列番号３０のタンパク質をコードし、配列番号３１のＤＮＡ配列は配列番号３２のタンパク質をコードし、配列番号３３のＤＮＡ配列は配列番号３４のタンパク質をコードする。
【0110】
【表1-1】
【0111】
【表1-2】
【0112】
【表1-3】
【0113】
【表1-4】
【0114】
【表1-5】
【0115】
【表1-6】
【0116】
【表1-7】
【0117】
【表1-8】
【0118】
【表1-9】
【0119】
【表1-10】
【0120】
【表1-11】
【0121】
【表1-12】
【0122】
【表1-13】
【0123】
【表1-14】
【0124】
【表1-15】
【0125】
【表1-16】
【0126】
【表1-17】
【0127】
【表1-18】
【0128】
【表1-19】
【0129】
【表1-20】
【0130】
【表1-21】
【0131】
【表1-22】
【0132】
【表1-23】
【0133】
【表1-24】
【0134】
【表1-25】
【0135】
【表1-26】
【0136】
【表1-27】
【0137】
【表2-1】
【0138】
【表2-2】
【0139】
【表2-3】
【0140】
【表2-4】
【0141】
【表2-5】
【0142】
【表2-6】
【0143】
【表2-7】
【0144】
【表2-8】
【0145】
【表2-9】
【0146】
配列番号１のＤＮＡ配列は、ＦｃＲｎ結合を向上させる突然変異、ノブズイントゥーホールズ及びアルギニン突然変異を有する代表的なＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ融合タンパク質（配列番号２）をコードするポリヌクレオチドのものである。それぞれ配列番号１及び２のＭＯＧの代表的なＤＮＡ及びアミノ酸配列はマウス起源のものである。
【0147】
特に配列番号２の代表的なＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序でマウス（ｍ）ＭＯＧの残基１－１１７、残基１１８－１２２に第１のリンカー、残基１２３－１３８に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１３９－２４８に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２４９－３５５に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する融合タンパク質を形成する。配列番号２の代表的なＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇは、残基１６０、１６２、１６４，３４１及び３４２にＦｃＲｎ結合を向上させる突然変異、残基１４４及び２３６にアルギニン突然変異ならびに残基２５７及び３０２に‘ノブズイントゥーホールズ’突然変異を有する。通常免疫グロブリン軽鎖と対をなすシステイン残基（１２８）はセリンに突然変異している。配列番号２において言及されるアミノ酸残基の番号はタンパク質配列の番号であり、ＥＵナンバリング協定（ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）を指していない。
【0148】
配列番号３のＤＮＡ配列は、ＦｃＲｎ結合を向上させる突然変異、ノブズイントゥーホールズ及びアルギニン突然変異を有する代表的なＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇ融合タンパク質（配列番号４）をコードするポリヌクレオチドのものである。
【0149】
特に配列番号４の代表的なＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序でＨＥＲ２の残基１－６３０、残基６３１－６３６に第１のリンカー、残基６３７－６５０に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基６５１－７６０に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基７６１－８７６に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する融合タンパク質を形成する。配列番号４の代表的なＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇは残基６７２、６７４、６７６、８５３及び８５４にＦｃＲｎ結合を向上させる突然変異、残基６５６及び７４８にアルギニン突然変異ならびに残基７６９及び８１４に‘ノブズイントゥーホールズ’突然変異を有する。通常免疫グロブリン軽鎖と対をなすシステイン残基（６４０）はセリンに突然変異している。配列番号４において言及されるアミノ酸残基の番号はタンパク質配列の番号であり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【0150】
配列番号５のＤＮＡ配列は、ＦｃＲｎ結合を向上させる突然変異、ノブズイントゥーホールズ及びアルギニン突然変異を有する代表的なＦｃフラグメント（配列番号６）をコードするポリヌクレオチドのものである。配列番号６の融合タンパク質は、例えばＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ（配列番号２）又はＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇ（配列番号４）融合体とのヘテロダイマー形成のために構成される。
【0151】
特に配列番号６の代表的なＦｃフラグメントのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で残基１－１６に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１７－１２６に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１２７－２３３に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。配列番号６の代表的なＦｃフラグメントは、残基３８、４０、４２、２１９及び２２０にＦｃＲｎ結合を向上させる突然変異、残基２２及び１１４にアルギニン突然変異ならびに残基１５０及び１９１に‘ノブズイントゥーホールズ’突然変異を有する。通常免疫グロブリン軽鎖と対をなすシステイン残基（６）はセリンに突然変異している。配列番号６において言及されるアミノ酸残基の番号はタンパク質配列の番号であり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【0152】
配列番号７のＤＮＡ配列は、ノブズイントゥーホールズ突然変異及びアルギニン突然変異を有する代表的なＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ融合体をコードするポリヌクレオチドのものであり、コードされる融合タンパク質の対応するアミノ酸配列は配列番号８である。
【0153】
特に配列番号８の代表的なＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ融合体のアミノ酸配列は、Ｎ末
端からＣ末端への順序でｍＭＯＧの残基１－１１７、残基１１８－１２２に第１のリンカー、残基１２３－１３８に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１３９－２４８に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２４９－３５５に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。配列番号８の代表的なＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳは、残基１４４及び２３６にアルギニン突然変異ならびに残基２５７及び３０２に‘ノブズイントゥーホールズ’突然変異を有する。免疫グロブリン軽鎖と対をなすシステイン残基（１２８）はセリンに突然変異している。シナプトタグミンのＣ２Ａ ＰＳ結合ドメインの残基１４１－２６６（Ｓｙｔ１）（残基３６１－４８６として示されている）がＧＧＧＧＳリンカーペプチド（残基３５６－３６０）を介してＣＨ３ドメインのＣ末端に融合している。配列番号８において言及されるアミノ酸残基の番号はタンパク質配列の番号であり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
端からＣ末端への順序でｍＭＯＧの残基１－１１７、残基１１８－１２２に第１のリンカー、残基１２３－１３８に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１３９－２４８に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２４９－３５５に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。配列番号８の代表的なＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳは、残基１４４及び２３６にアルギニン突然変異ならびに残基２５７及び３０２に‘ノブズイントゥーホールズ’突然変異を有する。免疫グロブリン軽鎖と対をなすシステイン残基（１２８）はセリンに突然変異している。シナプトタグミンのＣ２Ａ ＰＳ結合ドメインの残基１４１－２６６（Ｓｙｔ１）（残基３６１－４８６として示されている）がＧＧＧＧＳリンカーペプチド（残基３５６－３６０）を介してＣＨ３ドメインのＣ末端に融合している。配列番号８において言及されるアミノ酸残基の番号はタンパク質配列の番号であり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【0154】
配列番号９のＤＮＡ配列は、例えばＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ（配列番号８）とのヘテロダイマー形成のために構成されるノブズイントゥーホールズ突然変異及びアルギニン突然変異を有する代表的なＦｃ－Ｓｙｔ１融合体（配列番号１０）をコードするポリヌクレオチドのものである。
【0155】
特に配列番号１０の代表的なＦｃ－Ｓｙｔ１融合体のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で、残基１－１６に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１７－１２６に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１２６－２３３に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。配列番号１０の代表的なＦｃ－Ｓｙｔ１融合タンパク質は、残基２２及び１１４にアルギニン突然変異ならびに残基１５０及び１９１に‘ノブズイントゥーホールズ’突然変異を有する。通常免疫グロブリン軽鎖と対をなすシステイン残基（６）はセリンに突然変異している。シナプトタグミンのＣ２Ａ ＰＳ結合ドメインの残基１４１－２６６（Ｓｙｔ１）（残基２３９－３６４として示されている）がＧＧＧＧＳリンカーペプチド（残基２３４－２３８）を介してＣＨ３ドメインのＣ末端に融合している。配列番号１０において言及されるアミノ酸残基の番号はタンパク質配列の番号であり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【0156】
配列番号１１のＤＮＡ配列は、ノブズイントゥーホールズ突然変異、静電ステアリング突然変異及びアルギニン突然変異を有する代表的なＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ融合体（配列番号１２）をコードするポリヌクレオチドのものである。
【0157】
特に配列番号１２の代表的なＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ融合体のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序でｍＭＯＧの残基１－１１７、残基１１８－１２２に第１のリンカー、残基１２３－１３８に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１３９－２４８に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２４９－３５５に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。配列番号１２の代表的なＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳは、残基１４４及び２３６にアルギニン突然変異、残基３００及び３１７に静電ステアリング突然変異ならびに残基２５７及び３０２に‘ノブズイントゥーホールズ’突然変異を有する。免疫グロブリン軽鎖と対をなすシステイン残基（１２８）はセリンに突然変異している。シナプトタグミンのＣ２Ａ ＰＳ結合ドメインの残基１４１－２６６（Ｓｙｔ１）（残基３６１－４８６として示されている）がＧＧＧＳリンカーペプチド（残基３５６－３６０）を介してＣＨ３ドメインのＣ末端に融合している。配列番号１２において言及されるアミノ酸残基の番号はタンパク質配列の番号であり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【0158】
配列番号１３のＤＮＡ配列は、例えばＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳ（配列番号１２）とのヘテロダイマー形成のために構成されるノブズイントゥーホールズ突然変異、静電ステアリング突然変異及びアルギニン突然変異を有する代表的なＦｃ－Ｓｙｔ１融合体（配列
番号１４）をコードするポリヌクレオチドのものである。
番号１４）をコードするポリヌクレオチドのものである。
【0159】
特に配列番号１４の代表的なＦｃ－Ｓｙｔ１融合タンパク質のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で、残基１－１６に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１７－１２６に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１２７－２３３に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。配列番号１４の代表的なＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＰＳは、残基２２及び１１４にアルギニン突然変異、残基１４３及び１８５に静電ステアリング突然変異ならびに残基１５０及び１９１に‘ノブズイントゥーホールズ’突然変異を有する。免疫グロブリン軽鎖と対をなすシステイン残基（６）はセリンに突然変異している。シナプトタグミンのＣ２Ａ ＰＳ結合ドメインの残基１４１－２６６（Ｓｙｔ１）（残基２３９－３６４として示されている）がＧＧＧＧＳリンカーペプチド（残基２３４－２３８）を介してＣＨ３ドメインのＣ末端に融合している。配列番号１４において言及されるアミノ酸残基の番号はタンパク質配列の番号であり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【0160】
配列番号１５のＤＮＡ配列は、ノブズイントゥーホールズ突然変異を有するＴｆＲ特異的抗体重鎖を含む代表的なＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＴｆＲ融合タンパク質（配列番号１６）をコードするポリヌクレオチドのものである。
【0161】
特に配列番号１６の代表的なＴｆＲ特異的抗体重鎖－ＭＯＧ融合体（ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＴｆＲ）のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で、残基１－１１６にＴｆＲ特異的ＶＨドメイン、残基１１７－２１３に免疫グロブリンＣＨ１ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２１４－２２９に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２３０－３３９に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基３４０－４４６に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。配列番号１６の代表的なＴｆＲ特異的抗体重鎖は残基３４８及び３９３に‘ノブズイントゥーホールズ’突然変異を有する。ｍＭＯＧの残基１－１１７（残基４５２－５６８として示される）がＧＧＧＧＳリンカーペプチド（残基４４７－４５１）を介してＣＨ３ドメインのＣ末端に融合している。配列番号１６において言及されるアミノ酸残基の番号はタンパク質配列の番号であり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【0162】
配列番号１７のＤＮＡ配列は代表的なＴｆＲ特異的抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドのものである。ノブズイントゥーホールズ突然変異を有するコードされる融合タンパク質（配列番号１８）は、例えばＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＴｆＲ（配列番号１６）とのヘテロダイマー形成のために構成される。
【0163】
特に、ＴｆＲ特異的抗体重鎖－ＭＯＧ融合体（配列番号１６）とのヘテロダイマー形成のための配列番号１８の代表的なＴｆＲ特異的抗体重鎖のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で、残基１－１１６にＴｆＲ特異的ＶＨドメイン、残基１１７－２１３に免疫グロブリンＣＨ１ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２１４－２２９に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２３０－３３９に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基３４０－４４６に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。配列番号１８の代表的なＴｆＲ特異的抗体重鎖は残基３６３及び４０４に‘ノブズイントゥーホールズ’突然変異を有する。配列番号１８において言及されるアミノ酸残基の番号はタンパク質配列の番号であり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【0164】
配列番号１９のＤＮＡ配列は、代表的なＴｆＲ特異的抗体の軽鎖（配列番号２０）をコードするポリヌクレオチドのものであり、例えばＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＴｆＲ融合体（配列番号１６）及びＴｆＲ特異的抗体重鎖（配列番号１８）とのヘテロダイマー形成のた
めに構成される。
めに構成される。
【0165】
特に、配列番号２０の代表的なＴｆＲ特異的抗体軽鎖のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で、残基１－１０７にＴｆＲ特異的ＶＬドメイン及び残基１０８－２１３に免疫グロブリンＣＬドメイン（ヒトＣκ）を有する。配列番号２０において言及されるアミノ酸残基の番号はタンパク質配列の番号であり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【0166】
配列番号２１のＤＮＡ配列は、アルギニン突然変異及びノブズイントゥーホールズ突然変異を有するＴｆＲ特異的抗体重鎖を有する代表的なＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＴｆＲ融合タンパク質（配列番号２２）をコードするポリヌクレオチドのものである。
【0167】
特に、配列番号２２の代表的なＴｆＲ特異的抗体重鎖－ＭＯＧ融合体（ＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＴｆＲ）のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で、残基１－１１６にＴｆＲ特異的ＶＨドメイン、残基１１７－２１３に免疫グロブリンＣＨ１ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２１４－２２９に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２３０－３３９に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基３４０－４４６に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。配列番号２２の代表的なＴｆＲ特異的抗体重鎖は残基２３５及び３２７にアルギニン突然変異ならびに残基３４８及び３９３に‘ノブズイントゥーホールズ’突然変異を有する。ｍＭＯＧの残基１－１１７（残基４５２－５６８として示される）がＧＧＧＧＳリンカーペプチド（残基４４７－４５１）を介してＣＨ３ドメインのＣ末端に融合している。配列番号２２において言及されるアミノ酸残基の番号はタンパク質配列の番号であり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【0168】
配列番号２３のＤＮＡ配列は、アルギニン突然変異及びノブズイントゥーホールズ突然変異を有し、例えばＭＯＧ－Ｓｅｌｄｅｇ－ＴｆＲ融合体（配列番号２２）とのヘテロダイマー形成のために構成される代表的なＴｆＲ特異的抗体重鎖（配列番号２４）をコードするポリヌクレオチドのものである。
【0169】
特に、配列番号２４の代表的なＴｆＲ特異的抗体重鎖のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で、残基１－１１６にＴｆＲ特異的ＶＨドメイン、残基１１７－２１３に免疫グロブリンＣＨ１ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２１４－２２９に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２３０－３３９に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基３４０－４４６に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。配列番号２４のＴｆＲ特異的抗体重鎖は残基２３５及び３２７にアルギニン突然変異ならびに残基３６３及び４０４に‘ノブズイントゥーホールズ’突然変異を有する。配列番号２４において言及されるアミノ酸残基の番号はタンパク質配列の番号であり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【0170】
配列番号２５のＤＮＡ配列は、ＦｃＲｎ結合を向上させる突然変異及びノブズイントゥーホールズ突然変異を有する代表的なＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇ融合タンパク質（配列番号２６）をコードするポリヌクレオチドのものである。
【0171】
特に、配列番号２６の代表的な変異体ＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で、ＨＥＲ２の残基１－６３０、６３１－６３６に第１のリンカー、残基６３７－６５０に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基６５１－７６０に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基７６１－８６７に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する融合タンパク質を形成する。配列番号２６のＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇは残基６７２、６７４、６７６、８５３及び８５４に
ＦｃＲｎ結合を向上させる突然変異及び残基７６９及び８１４に‘ノブズイントゥーホールズ’突然変異を有する。通常免疫グロブリン軽鎖と対をなすシステイン残基（６４０）はセリンに突然変異している。配列番号２６において言及されるアミノ酸残基の番号はタンパク質配列の番号であり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
ＦｃＲｎ結合を向上させる突然変異及び残基７６９及び８１４に‘ノブズイントゥーホールズ’突然変異を有する。通常免疫グロブリン軽鎖と対をなすシステイン残基（６４０）はセリンに突然変異している。配列番号２６において言及されるアミノ酸残基の番号はタンパク質配列の番号であり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【0172】
配列番号２７のＤＮＡ配列は、ＦｃＲｎ結合を向上させる突然変異及びノブズイントゥーホールズ突然変異を有し、例えばＨＥＲ２－Ｓｅｌｄｅｇ（配列番号２６）とのヘテロダイマー形成のために構成される代表的なＦｃフラグメント（配列番号２８）をコードするポリヌクレオチドのものである。
【0173】
特に、配列番号２８の代表的な変異体Ｆｃフラグメントのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で、残基１－１６に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１７－１２６に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１２７－２３３に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。配列番号２８の変異体Ｆｃフラグメントは残基３８、４０、４２、２１９及び２２０にＦｃＲｎ結合を向上させる突然変異ならびに残基１５０及び１９１に‘ノブズイントゥーホールズ’突然変異を有する。通常免疫グロブリン軽鎖と対をなすシステイン残基（６）はセリンに突然変異している。配列番号２８において言及されるアミノ酸残基の番号はタンパク質配列の番号であり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【0174】
配列番号２９のＤＮＡ配列は、ＦｃＲｎ結合を向上させる突然変異、ノブズイントゥーホールズ突然変異及びアルギニン突然変異を有する代表的な前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）－Ｓｅｌｄｅｇ融合タンパク質（配列番号３０）をコードするポリヌクレオチドのものである。この融合タンパク質は、例えば代表的なＦｃフラグメント（配列番号６）とヘテロダイマーを形成するであろう。
【0175】
特に、配列番号３０の代表的な変異体ＰＳＭＡ－Ｓｅｌｄｅｇのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で、残基１－１６に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１７－１２６に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１２７－２３３に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有し、それらが残基２３４－２３８におけるリンカーを介してＰＳＭＡの細胞外ドメイン（残基２３９－９４５）にＣ末端において融合している融合タンパク質を形成する。配列番号３０の変異体ＰＳＭＡ－Ｓｅｌｄｅｇは、残基３８、４０、４２、２１９及び２２０にＦｃＲｎ結合を向上させる突然変異、残基２２及び１１４にアルギニン突然変異ならびに残基１３５及び１８０に‘ノブズイントゥーホールズ’突然変異を有する。通常免疫グロブリン軽鎖と対をなすシステイン残基（６）はセリンに突然変異している。配列番号３０において言及されるアミノ酸残基の番号はタンパク質配列の番号であり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【0176】
配列番号３１のＤＮＡ配列は、ＦｃＲｎ結合を向上させる突然変異、ノブズイントゥーホールズ突然変異及びアルギニン突然変異を有する代表的なＧＡＤ６５－Ｓｅｌｄｅｇ融合タンパク質（配列番号３２）をコードするポリヌクレオチドのものである。この融合タンパク質は、例えば代表的なＦｃフラグメント（配列番号６）とヘテロダイマーを形成するであろう。
【0177】
特に、配列番号３２の代表的な変異体ＧＡＤ６５－Ｓｅｌｄｅｇのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で、ヒトグルタミン酸カルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）の残基１－５８５、残基５８６－５９０に第１のリンカー、残基５９１－６０６に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基６０７－７１６に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基７１７－８２３に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇ
Ｇ１由来）を有する融合タンパク質を形成する。配列番号３２の変異体ＧＡＤ６５－Ｓｅｌｄｅｇは残基６２８、６３０、６３２、８０９及び８１０にＦｃＲｎ結合を向上させる突然変異、残基６１２及び７０４にアルギニン突然変異ならびに残基７２５及び７７０に‘ノブズイントゥーホールズ’突然変異を有する。通常免疫グロブリン軽鎖と対をなすシステイン残基（５９６）はセリンに突然変異している。配列番号３２において言及されるアミノ酸残基の番号はタンパク質配列の番号であり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
Ｇ１由来）を有する融合タンパク質を形成する。配列番号３２の変異体ＧＡＤ６５－Ｓｅｌｄｅｇは残基６２８、６３０、６３２、８０９及び８１０にＦｃＲｎ結合を向上させる突然変異、残基６１２及び７０４にアルギニン突然変異ならびに残基７２５及び７７０に‘ノブズイントゥーホールズ’突然変異を有する。通常免疫グロブリン軽鎖と対をなすシステイン残基（５９６）はセリンに突然変異している。配列番号３２において言及されるアミノ酸残基の番号はタンパク質配列の番号であり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【0178】
配列番号３３のＤＮＡ配列は、ＦｃＲｎ結合を向上させる突然変異、ノブズイントゥーホールズ突然変異及びアルギニン突然変異を有する代表的なアクアポリン４－Ｓｅｌｄｅｇ融合タンパク質（配列番号３４）をコードするポリヌクレオチドのものである。この融合タンパク質は、例えば代表的なＦｃフラグメント（配列番号６）とヘテロダイマーを形成するであろう。
【0179】
特に、配列番号３４の代表的な変異体アクアポリン４（ＡＱＰ４）－Ｓｅｌｄｅｇのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で、ヒトアクアポリン４の残基１－３２３、残基３２４－３２８に第１のリンカー、残基３２９－３４４に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基３４５－４５４に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基４５５－５６１に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する融合タンパク質を形成する。配列番号３４の変異体ＡＱＰ４－Ｓｅｌｄｅｇは残基３６６、３６８、３７０、５４７、５４８にＦｃＲｎ結合を向上させる突然変異、残基３５０及び４４２にアルギニン突然変異ならびに残基４６３及び５０８に‘ノブズイントゥーホールズ’突然変異を有する。通常免疫グロブリン軽鎖と対をなすシステイン残基（３３４）はセリンに突然変異している。配列番号３４において言及されるアミノ酸残基の番号はタンパク質配列の番号であり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【0180】
上記で開示した主題は例であって制限的ではないと考えられるべきであり、添付の特許請求の範囲は本開示の真の精神及び範囲内に含まれる修正、強調及び他の態様のすべてを網羅することを意図している。かくして法が許す最大の程度まで、本開示の範囲は以下の請求項及びそれらの同等事項の許される最も広い解釈により決定されるべきであり、前記の詳細な記述により限定又は制限されるべきではない。
【0181】
本出願及び添付の特許請求の範囲中で用いられる場合、単数形“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”は、内容が明らかに他のように指定していなければ、複数の指示対象を含む。「複数の」（“ｐｌｕｒａｌｉｔｙ”）という用語は、内容が明らかに他のように指定していなければ、２つ以上の指示対象を含む。他に断らなければ、本明細書で用いられるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する技術分野における通常の熟練者が通常理解すると同じ意味を有する。
【図1】
【図2A-2F】
【図2G-2J】
【図2K-2N】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A-6B】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【配列表】