特許 7296472 プリドピジンを使用したミトコンドリア関連疾患および障害（それらの症状を含む）の治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-06-14

(45)【発行日】2023-06-22

(54)【発明の名称】プリドピジンを使用したミトコンドリア関連疾患および障害（それらの症状を含む）の治療

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/451 20060101AFI20230615BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230615BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20230615BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20230615BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20230615BHJP

   A61P 27/16 20060101ALI20230615BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230615BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20230615BHJP

   A61P 25/18 20060101ALI20230615BHJP

   A61K 9/72 20060101ALI20230615BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20230615BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20230615BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20230615BHJP

   A61K 9/20 20060101ALI20230615BHJP

   A61K 9/48 20060101ALI20230615BHJP

【ＦＩ】

A61K31/451

A61P43/00 105

A61P21/00

A61P27/02

A61P3/10

A61P27/16

A61P25/00

A61P3/00

A61P25/18

A61K9/72

A61K9/14

A61K9/08

A61K9/06

A61K9/20

A61K9/48

【請求項の数】 21

(21)【出願番号】P 2021555317

(86)(22)【出願日】2020-03-15

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-05-18

(86)【国際出願番号】 IL2020050308

(87)【国際公開番号】W WO2020188558

(87)【国際公開日】2020-09-24

【審査請求日】2021-09-13

(31)【優先権主張番号】62/818,796

(32)【優先日】2019-03-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】519062797

【氏名又は名称】プリレニア ニューロセラピューティクス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001379

【氏名又は名称】弁理士法人大島特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ヘイデン、マイケル

(72)【発明者】

【氏名】ゲヴァ、ミカル

(72)【発明者】

【氏名】カーヴァルホ レゴ、アナ クリスティーナ

【審査官】田澤 俊樹

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１８／２０７１９２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１８－５０６５６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】Eur. J. Clin. Invest.，2018年，Vol.48 No.Suppl.1，p.55

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／００－３３／４４

９／００－９／７２

Ａ６１Ｐ １／００－４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ミトコンドリア機能不全に関連する疾患、障害、またはその任意の症状の治療を必要とする対象を治療するための医薬組成物であって、
前記ミトコンドリア機能不全に関連する疾患、障害、またはその任意の症状が、ミトコンドリアミオパチー、リソソーム蓄積症、または双極性障害と、それに関連する疾患、障害、または任意の症状であり、
プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含み、
前記対象に投与されることにより前記対象を治療する、医薬組成物。

【請求項2】

前記ミトコンドリア機能不全に関連する疾患、障害、またはその任意の症状が、ミトコンドリアミオパチーと、それに関連する疾患、障害、または任意の症状である、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記ミトコンドリアミオパチーが、ＭＥＬＡＳ症候群、ＭＥＲＲＦ症候群、リー病、慢性進行性外眼筋麻痺（Ｃ／ＰＥＯ）、真性糖尿病および難聴（ＭＩＤＤまたはＤＡＤ）、カーンズ・セイヤー症候群（ＫＳＳ）、アルパーズ症候群、ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群（ＭＤＳ）、ミトコンドリア神経胃腸管系脳筋症（ＭＮＧＩＥ）、神経障害、運動失調症および網膜色素変性（ＮＡＲＰ）、ピアソン症候群、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、優性視神経萎縮症（ＤＯＡ）、色素性網膜症、ウルフラム症候群、フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）、ミトコンドリア神経胃腸管系脳筋症（ＭＮＧＩＥ）、ならびにそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記ミトコンドリア機能不全に関連する疾患、障害、またはその任意の症状が、リソソーム蓄積症と、それに関連する疾患、障害、または任意の症状である、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記リソソーム蓄積症が、糖原病ＩＩ型（ポンペ病）、多種スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、ムコリピドーシス（ＭＬ）Ｉ～ＩＩＩ型、Ｇ（Ｍ１）－ガングリオシドーシス、ファブリー病、ファーバー病、ゴーシェ病、ニーマン・ピック病、ムコリピドーシス（ＭＬ）ＩＶ型、シスチン症、神経セロイドリポフスチン症、およびそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項４に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記ミトコンドリア機能不全に関連する疾患、障害、またはその任意の症状が、双極性障害と、それに関連する疾患、障害、または任意の症状である、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記プリドピジンが、その中性／塩基の形態である、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記プリドピジンが、薬学的に許容される塩の形態である、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記プリドピジンが、プリドピジン塩酸塩である、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記組成物が、全身投与により投与される、請求項１～９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項11】

前記組成物が、経口投与により投与される、請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項12】

前記組成物が、吸入可能な粉末、注射剤、液体、ゲル、固体、カプセル、点眼薬、または錠剤の形態で投与される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項13】

前記組成物が、定期的に投与される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項14】

前記組成物が、１日１回、１日２回、１日３回、または１日１回よりも少ない頻度で投与される、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記組成物が、１日あたり１回用量、２回用量、または３回用量で投与される、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記プリドピジンが、１ｍｇ／日～４００ｍｇ／日の１日用量で投与される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項17】

前記プリドピジンが、１ｍｇ／日～３００ｍｇ／日の１日用量で投与される、請求項１６に記載の医薬組成物。

【請求項18】

前記プリドピジンが、１ｍｇ／日～９０ｍｇ／日の１日用量で投与される、請求項１６に記載の医薬組成物。

【請求項19】

前記プリドピジンが、２０ｍｇ／日～９０ｍｇ／日の１日用量で投与される、請求項１６に記載の医薬組成物。

【請求項20】

前記プリドピジンが、４５ｍｇ／日～９０ｍｇ／日の１日用量で投与される、請求項１６に記載の医薬組成物。

【請求項21】

前記プリドピジンが、２０ｍｇ／日～５０ｍｇ／日の１日用量で投与される、請求項１６に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ミトコンドリア機能不全に関連する疾患または障害に罹患している対象を治療するための方法であって、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む組成物を当該対象に投与することを含む、方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

ミトコンドリアは、ほとんどの真核細胞に見られ、酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）によるＡＴＰ合成を含む多くの代謝機能を実行する二重膜オルガネラである。ミトコンドリアは、生体分子の合成、カルシウム恒常性の維持、活性酸素種（ＲＯＳ）の生成、およびアポトーシスの活性化にも関与している。ミトコンドリアは、構造的に複雑で、非常にダイナミックな運動性オルガネラである。ミトコンドリアは、それらの形態およびほとんどのミトコンドリア機能を決定する融合および核分裂の連続サイクルのプロセスによって、一定の形態学的変化を受ける。

【0003】

ミトコンドリア機能不全は、細胞の恒常性におけるミトコンドリアの中心的な役割を考えると、ミトコンドリア病、がん、代謝性疾患および糖尿病、炎症状態、神経変性障害、神経障害、ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病などの神経変性疾患を含む多くの加齢性障害に関連している。プリドピジン（４－［３－（メチルスルホニル）フェニル］－１－プロピル－ピペリジン）（以前はＡＣＲ１６、Ｈｕｎｔｅｘｉｌ（登録商標）、ＴＶ－７８２０として知られていた）は、ＨＤおよびＡＬＳの治療のために臨床開発中である。プリドピジンは、ＨＤ、ＰＤ、ＡＬＳおよびＡＤのモデルを含む、神経変性疾患の動物および細胞モデルにおいて神経保護特性を発揮することが示された（Ｆｒａｎｃａｒｄｏ，Ｖｅｒｏｎｉｃａ，Ｍｉｃｈａｌ Ｇｅｖａ，Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ Ｂｅｚ，Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｄｅｎｉｓ，Ｌｉｌａｃｈ Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒ．Ｈａｙｄｅｎ，ａｎｄ Ｍ．Ａｎｇｅｌａ Ｃｅｎｃｉ．２０１９．"Ｐｒｉｄｏｐｉｄｉｎｅ Ｉｎｄｕｃｅｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ Ｖｉａ ｔｈｅ Ｓｉｇｍａ－１ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ．"Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ １６（２）：４６５－７９、Ｒｙｓｋａｍｐ，Ｄａｎｉｅｌ Ａ．，Ｌｉｌｉ Ｗｕ，Ｊｕｎ Ｗｕ，Ｄａｂｉｎ Ｋｉｍ，Ｇｅｒｈａｒｄ Ｒａｍｍｅｓ，Ｍｉｃｈａｌ Ｇｅｖａ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｈａｙｄｅｎ，ａｎｄ Ｉｌｙａ Ｂｅｚｐｒｏｚｖａｎｎｙ．２０１９"Ｐｒｉｄｏｐｉｄｉｎｅ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ Ｍｕｓｈｒｏｏｍ Ｓｐｉｎｅｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ Ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｉｇｍａ－１ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ．"Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ，１２４，４８９－５０４、Ｒｙｓｋａｍｐ，Ｄａｎｉｅｌ，Ｊｕｎ Ｗｕ，Ｍｉｃｈａｌ Ｇｅｖａ，Ｒｅｂｅｃｃａ Ｋｕｓｋｏ，Ｉｒｉｓ Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｈａｙｄｅｎ，ａｎｄ Ｉｌｙａ Ｂｅｚｐｒｏｚｖａｎｎｙ．２０１７．"Ｔｈｅ Ｓｉｇｍａ－１ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｅ Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｐｒｉｄｏｐｉｄｉｎｅ ｉｎ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ Ｄｉｓｅａｓｅ．"Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ ９７ （Ｐｔ Ａ）：４６－５９、Ｉｏｎｅｓｃｕ，Ａｒｉｅｌ，Ｔａｌ Ｇｒａｄｕｓ，Ｔｏｐａｚ Ａｌｔｍａｎ，Ｒｏｙ Ｍａｉｍｏｎ，Ｎｏｉ Ｓａｒａｆ Ａｖｒａｈａｍ，Ｍｉｃｈａｌ Ｇｅｖａ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｈａｙｄｅｎ，ａｎｄ Ｅｒａｎ Ｐｅｒｌｓｏｎ．２０１９．"Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｉｇｍａ－１ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖｉａ Ｐｒｉｄｏｐｉｄｉｎｅ Ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ＡＬＳ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ａ ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ Ｍｏｄｅｌ．"Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ＆Ｄｉｓｅａｓｅ １０ （３）：２１０、Ｇａｒｃｉａ－Ｍｉｒａｌｌｅｓ，Ｍａｒｔａ，Ｍｉｃｈａｌ Ｇｅｖａ，Ｊｉｎｇ Ｙｉｎｇ Ｔａｎ，Ｎｕｒ Ａｍｉｒａｈ Ｂｉｎｔｅ Ｍｏｈａｍｍａｄ Ｙｕｓｏｆ，Ｙｏｏｎｊｅｏｎｇ Ｃｈａ，Ｒｅｂｅｃｃａ Ｋｕｓｋｏ，Ｌｉａｎｇ Ｊｕｉｎ Ｔａｎ，ｅｔ ａｌ．２０１７．"Ｅａｒｌｙ Ｐｒｉｄｏｐｉｄｉｎｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｄｅｆｉｃｉｔｓ ｉｎ ＹＡＣ１２８ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｉｃｅ．"ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ．）。ミトコンドリア機能不全は、これら神経変性疾患それぞれの病理学で実証されている。

【発明の概要】

【0004】

第１の態様において、本発明は、ミトコンドリア機能不全に関連する疾患、障害、またはその任意の症状の治療を必要とする対象において当該治療を行うための方法であって、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む有効用量の組成物を当該対象に投与し、それにより当該対象を治療することを含む、方法を提供する。

【0005】

さらなる態様において、本発明は、ミトコンドリア機能不全に関連する疾患、障害、またはその任意の症状を治療するための方法において使用するための、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む組成物を提供する。

【0006】

いくつかの実施形態において、当該ミトコンドリア機能不全に関連する疾患、障害、またはその任意の症状は、ミトコンドリアミオパチーに関連する疾患、障害、またはその任意の症状である。

【0007】

他の実施形態において、当該ミトコンドリアミオパチーは、ＭＥＬＡＳ症候群、ＭＥＲＲＦ症候群、リー病、慢性進行性外眼筋麻痺（Ｃ／ＰＥＯ）、真性糖尿病および難聴（ＭＩＤＤまたはＤＡＤ）、カーンズ・セイヤー症候群（ＫＳＳ）、アルパーズ症候群、ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群（ＭＤＳ）、ミトコンドリア神経胃腸管系脳筋症（ＭＮＧＩＥ）、神経障害、運動失調症および網膜色素変性（ＮＡＲＰ）、ピアソン症候群、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、優性視神経萎縮症（ＤＯＡ）、色素性網膜症、ウルフラム症候群、フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）、ミトコンドリア神経胃腸管系脳筋症（ＭＮＧＩＥ）、ならびにそれらの任意の組み合わせから選択される。

【0008】

さらなる実施形態において、当該ミトコンドリア機能不全に関連する疾患、障害、またはその任意の症状は、リソソーム蓄積症に関連する疾患、障害、または任意の症状である。

【0009】

他の実施形態において、当該リソソーム蓄積症は、糖原病ＩＩ型（ポンペ病）、多種スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、ムコリピドーシス（ＭＬ）Ｉ～ＩＩＩ型、Ｇ（Ｍ１）－ガングリオシドーシス、ファブリー病、ファーバー病、ゴーシェ病、ニーマン・ピック病、ムコリピドーシス（ＭＬ）ＩＶ型、シスチン症、神経セロイドリポフスチン症、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。

【0010】

いくつかの実施形態において、当該ミトコンドリア機能不全に関連する疾患、障害、またはその任意の症状は、神経変性疾患に関連する疾患、障害、または任意の症状である。

【0011】

いくつかの実施形態において、当該神経変性疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。

【0012】

いくつかの実施形態において、当該ミトコンドリア機能不全に関連する疾患、障害、またはその任意の症状は、双極性障害である。

【0013】

いくつかの実施形態において、当該プリドピジンは、その中性／塩基の形態である。いくつかの実施形態において、当該プリドピジンは、薬学的に許容される塩の形態である。いくつかのさらなる実施形態において、当該プリドピジンは、プリドピジン塩酸塩である。

【0014】

いくつかの実施形態において、当該プリドピジンを含む組成物は、経口投与される。

【0015】

他の実施形態において、当該組成物は、吸入可能な粉末、注射剤、液体、ゲル、固体、カプセル、点眼薬、または錠剤の形態で投与される。

【0016】

いくつかの実施形態において、プリドピジンを含む組成物は、定期的に投与される（すなわち、当該プリドピジンは、毎日、毎時、毎週、毎月などの規則的な所定の時間間隔で投与され、それぞれがまた、任意選択的に、投与される用量および期間あたりの投与回数を定義する）。さらなる実施形態において、プリドピジンを含む組成物は、１日１回、１日２回、または１日３回投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンを含む組成物は、１日１回よりも少ない頻度で投与される。いくつかの実施形態において、プリドピジンを含む組成物は、１日あたり１回用量、２回用量、または３回用量で投与される。

【0017】

いくつかの実施形態において、プリドピジンは、１ｍｇ／日～４００ｍｇ／日の１日用量で投与される。いくつかの実施形態において、プリドピジンは、１ｍｇ／日～３００ｍｇ／日の１日用量で投与される。他の実施形態において、プリドピジンは、１ｍｇ／日～９０ｍｇ／日の１日用量で投与される。他の実施形態において、プリドピジンは、２０ｍｇ／日～９０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、４５ｍｇ／日～９０ｍｇ／日の１日用量で投与される。他の実施形態において、プリドピジンは、２０ｍｇ／日～５０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、１ｍｇ／日～１０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、１０ｍｇ／日～２０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、２０ｍｇ／日～３０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、３０ｍｇ／日～４０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、４０ｍｇ／日～５０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、５０ｍｇ／日～６０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、６０ｍｇ／日～７０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、７０ｍｇ／日～８０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、８０ｍｇ／日～９０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、９０ｍｇ／日～１００ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、１００ｍｇ／日～１５０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、１５０ｍｇ／日～２００ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、２００ｍｇ／日～２５０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、２５０ｍｇ／日～３００ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、３００ｍｇ／日～３５０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、３５０ｍｇ／日～４００ｍｇ／日の１日用量で投与される。

【図面の簡単な説明】

【0018】

本発明とみなされる主題は、本明細書の結論部分で特に指摘され、明確に特許請求される。しかしながら、本発明は、その目的、特徴、および利点とともに、構成および動作方法の両方に関して、添付の図面とともに読まれる場合、以下の詳細な説明を参照することによって最良に理解され得る。

【0019】

【図1A】図１Ａは、プリドピジンが異常なミトコンドリア形態を救済し、Ｙ１２８（ＹＡＣ１２８、ＨＤ）ニューロンにおけるミトコンドリア－ＥＲ接触を回復させることを示している。Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ色素で染色したＷＴおよびＹ１２８（ＨＤ）皮質／線条体ニューロンにおけるミトコンドリアネットワークの視覚的表現。

【図1B】図１Ｂは、プリドピジンが異常なミトコンドリア形態を救済し、Ｙ１２８（ＹＡＣ１２８、ＨＤ）ニューロンにおけるミトコンドリア－ＥＲ接触を回復させることを示している。図１Ａからの定量化－プリドピジン治療の前後で、ＷＴおよびＹ１２８（ＨＤ）皮質／線条体ニューロンのミトコンドリアの数は同様である（ｎ＝４）。

【図1C】図１Ｃは、プリドピジンが異常なミトコンドリア形態を救済し、Ｙ１２８（ＹＡＣ１２８、ＨＤ）ニューロンにおけるミトコンドリア－ＥＲ接触を回復させることを示している。Ｙ１２８ ＨＤミトコンドリアは、円形ミトコンドリアの割合が増加している。プリドピジン処置（１μＭ）により、Ｙ１２８の形態が正常レベルに修正された（ｎ＝４）。

【図1D】図１Ｄは、プリドピジンが異常なミトコンドリア形態を救済し、Ｙ１２８（ＹＡＣ１２８、ＨＤ）ニューロンにおけるミトコンドリア－ＥＲ接触を回復させることを示している。Ｙ１２８ ＨＤミトコンドリアは、伸長したミトコンドリアの割合が減少した形態障害を示している。プリドピジン処置（１μＭ）により、Ｙ１２８の形態が正常レベルに修正された（ｎ＝４）。

【図1E】図１Ｅは、プリドピジンが異常なミトコンドリア形態を救済し、Ｙ１２８（ＹＡＣ１２８、ＨＤ）ニューロンにおけるミトコンドリア－ＥＲ接触を回復させることを示している。ＷＴおよびＹ１２８ニューロンをミトコンドリアマーカー（図１Ｅの中央列）およびＥＲマーカー（図１Ｅの右列）で染色し、ＥＲとミトコンドリアの共局在を分析した（図１Ｅの左列）（ｎ＝約１５の投影／条件）。

【図1F】図１Ｆは、プリドピジンが異常なミトコンドリア形態を救済し、Ｙ１２８（ＹＡＣ１２８、ＨＤ）ニューロンにおけるミトコンドリア－ＥＲ接触を回復させることを示している。図１Ｆは、図１Ｅの定量化は、ＷＴと比較して、Ｙ１２８ニューロンでＭｉｔｏ－ＥＲの接触が減少していることを示している。プリドピジン（１μＭ）は、Ｍｉｔｏ－ＥＲの接触を大幅に増加させた。

【図1G】図１Ｇは、プリドピジンが異常なミトコンドリア形態を救済し、Ｙ１２８（ＹＡＣ１２８、ＨＤ）ニューロンにおけるミトコンドリア－ＥＲ接触を回復させることを示している。アスペクト比。ミトコンドリアの軸間の比率は、ミトコンドリアの健康状態を示しており（方法（段落００８３）および結果（段落００８９）を参照）、ＨＤニューロンでは減少している。プリドピジン処置は、Ｙ１２８ニューロンにおけるアスペクト比を救済した（図１Ｇ）。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１（クラスカル・ウォリス検定とそれに続くダン多重比較検定による）。

【図2A】図２Ａは、プリドピジンがＹ１２８ ＨＤニューロンのミトコンドリアダイナミクス障害を改善することを示している。ＭｉｔｏＤＳＲｅｄをトランスフェクトしたミトコンドリアを、スピニングディスク共焦点で１２分間追跡し、カイモグラフを使用して速度および方向性輸送を定量化した（ｎ＝７～９の投影／条件）。ＷＴ－上の画像は、逆行方向および順行方向の両方におけるミトコンドリアの動きを示している。Ｙ１２８－中央の画像は、ＨＤではＷＴと比較してどちらの方向にもミトコンドリアの動きがないことを示している。１μＭのプリドピジンで処置したＹ１２８－下の画像は、プリドピジン処置が、ＷＴと同様に、ミトコンドリアの動きを逆行および順行の両方において回復させたことを示している。＊ｐ＜０．０５、＄ｐ＜０．０５（順行性のＹ１２８基礎（ｂａｓａｌ）に対して）（二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くテューキーの多重比較検定による）。

【図2B】図２Ｂは、プリドピジンがＹ１２８ ＨＤニューロンのミトコンドリアダイナミクス障害を改善することを示している。図２Ａの定量化。輸送の方向性分析は、Ｙ１２８ニューロンでは静止ミトコンドリア％が増加するが、逆行輸送および順行輸送の両方が減少することを示している。プリドピジン処置により、静止ミトコンドリア％がＷＴレベルに低下し、逆行輸送および順行輸送の両方の割合がＷＴレベルまで増加した。＊ｐ＜０．０５、＄ｐ＜０．０５（順行性のＹ１２８基礎（ｂａｓａｌ）に対して）（二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くテューキーの多重比較検定による）。

【図2C】図２Ｃは、プリドピジンがＹ１２８ ＨＤニューロンのミトコンドリアダイナミクス障害を改善することを示している。Ｙ１２８ニューロンでは総速度が低下する。プリドピジン処置は、ミトコンドリアの総速度を上昇させる。＊ｐ＜０．０５、＄ｐ＜０．０５（順行性のＹ１２８基礎（ｂａｓａｌ）に対して）（二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くテューキーの多重比較検定による）。＊ｐ＜０．０５、＄ｐ＜０．０５（順行性のＹ１２８基礎（ｂａｓａｌ）に対して）（二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くテューキーの多重比較検定による）。

【図3A】図３Ａは、プリドピジンがＨＤ細胞モデルのミトコンドリア呼吸障害を救済することを示している。１μＭおよび５μＭのプリドピジンで２４時間処置したＷＴおよびＹ１２８皮質／線条体ニューロンにおいて酸素消費およびＡＴＰ産生を評価した。いずれの用量でも、基礎呼吸と最大呼吸の救済、およびＡＴＰ産生の増加が示されている（ｎ＝３）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（クラスカル・ウォリス検定とそれに続くダン多重比較検定による）。

【図3B】図３Ｂは、プリドピジンがＨＤ細胞モデルのミトコンドリア呼吸障害を救済することを示している。１μＭおよび５μＭのプリドピジンで２４時間処置したＷＴおよびＹ１２８皮質／線条体ニューロンにおいて酸素消費およびＡＴＰ産生を評価した。いずれの用量でも、基礎呼吸と最大呼吸の救済、およびＡＴＰ産生の増加が示されている（ｎ＝３）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（クラスカル・ウォリス検定とそれに続くダン多重比較検定による）。

【図3C】図３Ｃは、プリドピジンがＨＤ細胞モデルのミトコンドリア呼吸障害を救済することを示している。１μＭおよび５μＭのプリドピジンで２４時間処置したＷＴおよびＹ１２８皮質／線条体ニューロンにおいて酸素消費およびＡＴＰ産生を評価した。いずれの用量でも、基礎呼吸と最大呼吸の救済、およびＡＴＰ産生の増加が示されている（ｎ＝３）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（クラスカル・ウォリス検定とそれに続くダン多重比較検定による）。

【図3D】図３Ｄは、プリドピジンがＨＤ細胞モデルのミトコンドリア呼吸障害を救済することを示している。１μＭおよび５μＭのプリドピジンで２４時間処置したＷＴおよびＹ１２８皮質／線条体ニューロンにおいて酸素消費およびＡＴＰ産生を評価した。いずれの用量でも、基礎呼吸と最大呼吸の救済、およびＡＴＰ産生の増加が示されている（ｎ＝３）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（クラスカル・ウォリス検定とそれに続くダン多重比較検定による）。

【図3E】図３Ｅは、プリドピジンがＨＤ細胞モデルのミトコンドリア呼吸障害を救済することを示している。酸素消費およびＡＴＰ産生は、ＨＤ神経幹細胞（ＮＳＣ）において減少した。２４時間の１μＭプリドピジン処置は、ＡＴＰ産生だけでなく、基礎呼吸と最大呼吸の両方を救済した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（クラスカル・ウォリス検定とそれに続くダン多重比較検定による）。

【図3F】図３Ｆは、プリドピジンがＨＤ細胞モデルのミトコンドリア呼吸障害を救済することを示している。酸素消費およびＡＴＰ産生は、ＨＤ神経幹細胞（ＮＳＣ）において減少した。２４時間の１μＭプリドピジン処置は、ＡＴＰ産生だけでなく、基礎呼吸と最大呼吸の両方を救済した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（クラスカル・ウォリス検定とそれに続くダン多重比較検定による）。

【図3G】図３Ｇは、プリドピジンがＨＤ細胞モデルのミトコンドリア呼吸障害を救済することを示している。酸素消費およびＡＴＰ産生は、ＨＤ神経幹細胞（ＮＳＣ）において減少した。２４時間の１μＭプリドピジン処置は、ＡＴＰ産生だけでなく、基礎呼吸と最大呼吸の両方を救済した。＊ｐ＜０．０５（クラスカル・ウォリス検定とそれに続くダン多重比較検定による）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（クラスカル・ウォリス検定とそれに続くダン多重比較検定による）。

【図3H】図３Ｈは、プリドピジンがＨＤ細胞モデルのミトコンドリア呼吸障害を救済することを示している。酸素消費およびＡＴＰ産生は、ＨＤ神経幹細胞（ＮＳＣ）において減少した。２４時間の１μＭプリドピジン処置は、ＡＴＰ産生だけでなく、基礎呼吸と最大呼吸の両方を救済した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（クラスカル・ウォリス検定とそれに続くダン多重比較検定による）。

【図4A】図４Ａは、プリドピジン処置が、ミトコンドリア機能不全の誘発からＹ１２８ニューロンおよびＨＤリンパ芽球を保護することを示している。０．１μＭまたは１μＭのプリドピジンで処置した皮質（図４Ａ左および図４Ｂ）と線条体（図４Ａ右および図４Ｃ）のＷＴおよびＹ１２８ニューロンを、オリゴマイシン＋ＦＣＣＰ（カルボニルシアニド－４－（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン、酸化的リン酸化脱共役剤）による脱分極後のミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ、ΔΨ_ｍ）の変化について評価した（ｎ＝７～１０）。プリドピジン（０．１μＭおよび１μＭ）はＭＭＰを増加させた。ＭＭＰは、Ｙ１２８ニューロンでは減少し、皮質ニューロンおよび線条体ニューロンの両方でＷＴに匹敵するレベルに戻る。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（クラスカル・ウォリス検定とそれに続くダン多重比較検定による）。「Ｐｒｉ」はプリドピジンを指す。

【図4B】図４Ｂは、プリドピジン処置が、ミトコンドリア機能不全の誘発からＹ１２８ニューロンおよびＨＤリンパ芽球を保護することを示している。０．１μＭまたは１μＭのプリドピジンで処置した皮質（図４Ａ左および図４Ｂ）と線条体（図４Ａ右および図４Ｃ）のＷＴおよびＹ１２８ニューロンを、オリゴマイシン＋ＦＣＣＰ（カルボニルシアニド－４－（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン、酸化的リン酸化脱共役剤）による脱分極後のミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ、ΔΨ_ｍ）の変化について評価した（ｎ＝７～１０）。プリドピジン（０．１μＭおよび１μＭ）はＭＭＰを増加させた。ＭＭＰは、Ｙ１２８ニューロンでは減少し、皮質ニューロンおよび線条体ニューロンの両方でＷＴに匹敵するレベルに戻る。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（クラスカル・ウォリス検定とそれに続くダン多重比較検定による）。「Ｐｒｉ」はプリドピジンを指す。

【図4C】図４Ｃは、プリドピジン処置が、ミトコンドリア機能不全の誘発からＹ１２８ニューロンおよびＨＤリンパ芽球を保護することを示している。０．１μＭまたは１μＭのプリドピジンで処置した皮質（図４Ａ左および図４Ｂ）と線条体（図４Ａ右および図４Ｃ）のＷＴおよびＹ１２８ニューロンを、オリゴマイシン＋ＦＣＣＰ（カルボニルシアニド－４－（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン、酸化的リン酸化脱共役剤）による脱分極後のミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ、ΔΨ_ｍ）の変化について評価した（ｎ＝７～１０）。プリドピジン（０．１μＭおよび１μＭ）はＭＭＰを増加させた。ＭＭＰは、Ｙ１２８ニューロンでは減少し、皮質ニューロンおよび線条体ニューロンの両方でＷＴに匹敵するレベルに戻る。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（クラスカル・ウォリス検定とそれに続くダン多重比較検定による）。「Ｐｒｉ」はプリドピジンを指す。

【図4D】図４Ｄは、プリドピジン処置が、ミトコンドリア機能不全の誘発からＹ１２８ニューロンおよびＨＤリンパ芽球を保護することを示している。Ｈ_２Ｏ_２を使用してＹ１２８皮質／線条体共培養物において酸化ストレスが誘発され、その結果、ＭＭＰが有意に低下し（図４Ｅ）、細胞生存率が低下した（図４Ｆ）。プリドピジン処置（５μＭ）は、ＭＭＰを救済し（図４Ｄ）、細胞生存率を増加させた（図４Ｅ）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（クラスカル・ウォリス検定とそれに続くダン多重比較検定による）。「Ｐｒｉ」はプリドピジンを指す。

【図4E】図４Ｅは、プリドピジン処置が、ミトコンドリア機能不全の誘発からＹ１２８ニューロンおよびＨＤリンパ芽球を保護することを示している。Ｈ_２Ｏ_２を使用してＹ１２８皮質／線条体共培養物において酸化ストレスが誘発され、その結果、ＭＭＰが有意に低下し（図４Ｅ）、細胞生存率が低下した（図４Ｆ）。プリドピジン処置（５μＭ）は、ＭＭＰを救済し（図４Ｄ）、細胞生存率を増加させた（図４Ｅ）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（クラスカル・ウォリス検定とそれに続くダン多重比較検定による）。「Ｐｒｉ」はプリドピジンを指す。

【図4F】図４Ｆは、プリドピジン処置が、ミトコンドリア機能不全の誘発からＹ１２８ニューロンおよびＨＤリンパ芽球を保護することを示している。Ｈ_２Ｏ_２を使用してＹ１２８皮質／線条体共培養物において酸化ストレスが誘発され、Ｈ_２Ｏ_２を使用してＹ１２８皮質／線条体共培養物において酸化ストレスが誘発され、その結果、ＭＭＰが有意に低下し（図４Ｅ）、細胞生存率が低下した（図４Ｆ）。プリドピジン処置（５μＭ）は、ＭＭＰを救済し（図４Ｄ）、細胞生存率を増加させた（図４Ｅ）。ＨＤ患者または健常対照に由来するヒトリンパ芽球を、１μＭ、５μＭもしくは１０μＭのプリドピジンおよび／またはＨ_２Ｏ_２で前処置した。プリドピジンの全ての用量はΔΨ_ｍを増加させ、最も有意な効果は５μＭで達成された（ｎ＝４）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（クラスカル・ウォリス検定とそれに続くダン多重比較検定による）。「Ｐｒｉ」はプリドピジンを指す。

【図5A】図５Ａは、プリドピジンが、Ｙ１２８ニューロンならびにＨＤ ＮＳＣおよびリンパ芽球における酸化的攻撃誘発性の活性酸素種（ＲＯＳ）産生を元に戻すことを示している。Ｈ_２Ｏ_２レベルを記録するためＭｉｔｏＰＹ蛍光プローブで処置した皮質／線条体ニューロン培養物の代表的な画像である。ミトコンドリア複合体ＩＩＩ阻害剤であるアンチマイシンＡ（ＡｎｔＡ、２μＭ）を、示されているように添加して、ミトコンドリア機能不全を誘発した（左パネル－ＡｎｔＡ処置前、中央パネル－ＡｎｔＡ処置後の未処置ニューロン、右パネル－ＡｎｔＡ処置後のプリドピジン処置ニューロン）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（二元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くテューキーの多重比較検定による）。

【図5B】図５Ｂは、プリドピジンが、Ｙ１２８ニューロンならびにＨＤ ＮＳＣおよびリンパ芽球における酸化的攻撃誘発性の活性酸素種（ＲＯＳ）産生を元に戻すことを示している。皮質ニューロンにおける図５Ａの定量化。図５Ｃ：線条体ニューロンにおける図５Ａの定量化。１μＭプリドピジンで処置した皮質および線条体ニューロンは、示されているように、ＡｎｔＡの後にＭｉｔｏＰＹ蛍光プローブによって記録されたミトコンドリアのＨ_２Ｏ_２レベルの低下を示す（ｎ＝４、線条体ニューロンの場合は約２０個の細胞／条件、および皮質ニューロンの場合は約１０個の細胞／条件を考慮）。スケールバー＝３０μＭ。図５Ｄ：ヒトＮＳＣは、ミトコンドリア機能不全を誘発し、ミトコンドリアのＨ_２Ｏ_２レベルを高めるミトコンドリア複合体ＩＩ阻害剤であるミキソチアゾール（Ｍｙｘｏ、３μＭ）で処置した。プリドピジン（１μＭ）で２４時間処置すると、ミトコンドリアのＨ_２Ｏ_２レベルが低下した（ｎ＝４）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（二元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くテューキーの多重比較検定による）。

【図5C】図５Ｃは、プリドピジンが、Ｙ１２８ニューロンならびにＨＤ ＮＳＣおよびリンパ芽球における酸化的攻撃誘発性の活性酸素種（ＲＯＳ）産生を元に戻すことを示している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（二元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くテューキーの多重比較検定による）。

【図5D】図５Ｄは、プリドピジンが、Ｙ１２８ニューロンならびにＨＤ ＮＳＣおよびリンパ芽球における酸化的攻撃誘発性の活性酸素種（ＲＯＳ）産生を元に戻すことを示している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（二元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くテューキーの多重比較検定による）。

【図5E】図５Ｅは、プリドピジンが、Ｙ１２８ニューロンならびにＨＤ ＮＳＣおよびリンパ芽球における酸化的攻撃誘発性の活性酸素種（ＲＯＳ）産生を元に戻すことを示している。対照およびＨＤリンパ芽球をＨ_２Ｏ_２で攻撃してミトコンドリア機能不全を誘発すると、ＲＯＳレベルが上昇した（ＣｅｌｌＲｏｘ染色を使用してＲＯＳレベルを決定した）。５μＭプリドピジンで２４時間前処置すると、ＲＯＳレベルが有意に低下した（ｎ＝４）。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（クラスカル・ウォリス検定とそれに続くダン多重比較検定による）。

【図6A】図６Ａは、プリドピジン処置がＹ１２８マウスにおける運動障害の発症を遅延させ、ミトコンドリア複合体の活性を正規化し、単離されたＹ１２８線条体ミトコンドリアにおいてＨ_２Ｏ_２産生を減少させることを示している。インビボ実験計画の概略図：マウスをビヒクルまたはプリドピジンで４５日間処置した。ロータロッド行動試験（ＲＲ）は、治療前の０日目（１．５ヶ月齢）と４４日目（３ヶ月齢）に測定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス検定による）。

【図6B】図６Ｂは、プリドピジン処置がＹ１２８マウスにおける運動障害の発症を遅延させ、ミトコンドリア複合体の活性を正規化し、単離されたＹ１２８線条体ミトコンドリアにおいてＨ_２Ｏ_２産生を減少させることを示している。１．５ヶ月齢では、治療前、ＷＴと比較してＹ１２８マウスの運動能力に障害はない。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス検定による）。

【図6C】図６Ｃは、プリドピジン処置がＹ１２８マウスにおける運動障害の発症を遅延させ、ミトコンドリア複合体の活性を正規化し、単離されたＹ１２８線条体ミトコンドリアにおいてＨ_２Ｏ_２産生を減少させることを示している。３ヶ月齢では、ビヒクルで処置したＹ１２８マウスに有意な障害が観察された。プリドピジン治療は、ロータロッド運動試験において、ビヒクルで処置した対照と比較して、Ｙ１２８マウスによる落下までの潜時を有意に増加させた。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス検定による）。

【図6D】図６Ｄは、プリドピジン処置がＹ１２８マウスにおける運動障害の発症を遅延させ、ミトコンドリア複合体の活性を正規化し、単離されたＹ１２８線条体ミトコンドリアにおいてＨ_２Ｏ_２産生を減少させることを示している。酸素消費率（ＯＣＲ）を測定するためのＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦを使用して、ビヒクルで処置したまたはプリドピジンで処置した野生型およびＹ１２８マウスからの線条体ミトコンドリアにおける電子の流れを評価した。ミトコンドリア複合体阻害剤および基質、２μＭロテノン、１０ｍＭコハク酸塩、４μＭアンチマイシンＡおよび１ｍＭアスコルビン酸塩／１００ｍＭ ＴＭＰＤを順次注射して、ミトコンドリア複合体Ｉ、複合体ＩＩ、複合体ＩＩＩ、および複合体ＩＶの活性をそれぞれ計算した。複合体ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶは、Ｙ１２８マウスでのＯＣＲの増加を示し、これは初期の代償メカニズムを示唆し、プリドピジンはこの効果を救済する。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス検定による）。

【図6E】図６Ｅは、プリドピジン処置がＹ１２８マウスにおける運動障害の発症を遅延させ、ミトコンドリア複合体の活性を正規化し、単離されたＹ１２８線条体ミトコンドリアにおいてＨ_２Ｏ_２産生を減少させることを示している。酸素消費率（ＯＣＲ）を測定するためのＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦを使用して、ビヒクルで処置したまたはプリドピジンで処置した野生型およびＹ１２８マウスからの線条体ミトコンドリアにおける電子の流れを評価した。ミトコンドリア複合体阻害剤および基質、２μＭロテノン、１０ｍＭコハク酸塩、４μＭアンチマイシンＡおよび１ｍＭアスコルビン酸塩／１００ｍＭ ＴＭＰＤを順次注射して、ミトコンドリア複合体Ｉ、複合体ＩＩ、複合体ＩＩＩ、および複合体ＩＶの活性をそれぞれ計算した。複合体ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶは、Ｙ１２８マウスでのＯＣＲの増加を示し、これは初期の代償メカニズムを示唆し、プリドピジンはこの効果を救済する。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス検定による）。

【図6F】図６Ｆは、プリドピジン処置がＹ１２８マウスにおける運動障害の発症を遅延させ、ミトコンドリア複合体の活性を正規化し、単離されたＹ１２８線条体ミトコンドリアにおいてＨ_２Ｏ_２産生を減少させることを示している。酸素消費率（ＯＣＲ）を測定するためのＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦを使用して、ビヒクルで処置したまたはプリドピジンで処置した野生型およびＹ１２８マウスからの線条体ミトコンドリアにおける電子の流れを評価した。ミトコンドリア複合体阻害剤および基質、２μＭロテノン、１０ｍＭコハク酸塩、４μＭアンチマイシンＡおよび１ｍＭアスコルビン酸塩／１００ｍＭ ＴＭＰＤを順次注射して、ミトコンドリア複合体Ｉ、複合体ＩＩ、複合体ＩＩＩ、および複合体ＩＶの活性をそれぞれ計算した。複合体ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶは、Ｙ１２８マウスでのＯＣＲの増加を示し、これは初期の代償メカニズムを示唆し、プリドピジンはこの効果を救済する。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス検定による）。

【図6G】図６Ｇは、プリドピジン処置がＹ１２８マウスにおける運動障害の発症を遅延させ、ミトコンドリア複合体の活性を正規化し、単離されたＹ１２８線条体ミトコンドリアにおいてＨ_２Ｏ_２産生を減少させることを示している。酸素消費率（ＯＣＲ）を測定するためのＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦを使用して、ビヒクルで処置したまたはプリドピジンで処置した野生型およびＹ１２８マウスからの線条体ミトコンドリアにおける電子の流れを評価した。ミトコンドリア複合体阻害剤および基質、２μＭロテノン、１０ｍＭコハク酸塩、４μＭアンチマイシンＡおよび１ｍＭアスコルビン酸塩／１００ｍＭ ＴＭＰＤを順次注射して、ミトコンドリア複合体Ｉ、複合体ＩＩ、複合体ＩＩＩ、および複合体ＩＶの活性をそれぞれ計算した。複合体ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶは、Ｙ１２８マウスでのＯＣＲの増加を示し、これは初期の代償メカニズムを示唆し、プリドピジンはこの効果を救済する。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス検定による）。

【図6H】図６Ｈは、プリドピジン処置がＹ１２８マウスにおける運動障害の発症を遅延させ、ミトコンドリア複合体の活性を正規化し、単離されたＹ１２８線条体ミトコンドリアにおいてＨ_２Ｏ_２産生を減少させることを示している。酸素消費率（ＯＣＲ）を測定するためのＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦを使用して、ビヒクルで処置したまたはプリドピジンで処置した野生型およびＹ１２８マウスからの線条体ミトコンドリアにおける電子の流れを評価した。ミトコンドリア複合体阻害剤および基質、２μＭロテノン、１０ｍＭコハク酸塩、４μＭアンチマイシンＡおよび１ｍＭアスコルビン酸塩／１００ｍＭ ＴＭＰＤを順次注射して、ミトコンドリア複合体Ｉ、複合体ＩＩ、複合体ＩＩＩ、および複合体ＩＶの活性をそれぞれ計算した。複合体ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶは、Ｙ１２８マウスでのＯＣＲの増加を示し、これは初期の代償メカニズムを示唆し、プリドピジンはこの効果を救済する。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス検定による）。

【図6I】図６Ｉは、プリドピジン処置がＹ１２８マウスにおける運動障害の発症を遅延させ、ミトコンドリア複合体の活性を正規化し、単離されたＹ１２８線条体ミトコンドリアにおいてＨ_２Ｏ_２産生を減少させることを示している。ミトコンドリア複合体ＩＩＩの阻害にはアンチマイシンＡ（２μＭ）を使用した。ミトコンドリアのＨ_２Ｏ_２レベルは、ＷＴマウスと比較して、Ｙ１２８マウスから単離したミトコンドリアにおいて増加している。プリドピジンは、ミトコンドリアのＨ_２Ｏ_２マウスレベルを減少させた。ＸＹ線は、アンチマイシンＡを添加した後の蛍光の時間依存性変化を示している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス検定による）。

【図6J】図６Ｊは、プリドピジン処置がＹ１２８マウスにおける運動障害の発症を遅延させ、ミトコンドリア複合体の活性を正規化し、単離されたＹ１２８線条体ミトコンドリアにおいてＨ_２Ｏ_２産生を減少させることを示している。ミトコンドリア複合体ＩＩＩの阻害にはアンチマイシンＡ（２μＭ）を使用した。ミトコンドリアのＨ_２Ｏ_２レベルは、ＷＴマウスと比較して、Ｙ１２８マウスから単離したミトコンドリアにおいて増加している。プリドピジンは、ミトコンドリアのＨ_２Ｏ_２マウスレベルを減少させた。ＸＹ線は、アンチマイシンＡを添加した後の蛍光の時間依存性変化を示している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス検定による）。

【図6K】図６Ｋは、プリドピジン処置がＹ１２８マウスにおける運動障害の発症を遅延させ、ミトコンドリア複合体の活性を正規化し、単離されたＹ１２８線条体ミトコンドリアにおいてＨ_２Ｏ_２産生を減少させることを示している。ミトコンドリア複合体ＩＩＩの阻害にはアンチマイシンＡ（２μＭ）を使用した。ミトコンドリアのＨ_２Ｏ_２レベルは、ＷＴマウスと比較して、Ｙ１２８マウスから単離したミトコンドリアにおいて増加している。プリドピジンは、ミトコンドリアのＨ_２Ｏ_２マウスレベルを減少させた。ＸＹ線は、アンチマイシンＡを添加した後の蛍光の時間依存性変化を示している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス検定による）。

【図6L】図６Ｌは、プリドピジン処置がＹ１２８マウスにおける運動障害の発症を遅延させ、ミトコンドリア複合体の活性を正規化し、単離されたＹ１２８線条体ミトコンドリアにおいてＨ_２Ｏ_２産生を減少させることを示している。カルシウムの取り込みも、プリドピジンで処置したＹ１２８マウスからのミトコンドリアで改善されている。カルシウムの細胞外レベルは、プリドピジン処置に応答して減少する（図６Ｌ）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス検定による）。

【図6M】図６Ｍは、プリドピジン処置がＹ１２８マウスにおける運動障害の発症を遅延させ、ミトコンドリア複合体の活性を正規化し、単離されたＹ１２８線条体ミトコンドリアにおいてＨ_２Ｏ_２産生を減少させることを示している。カルシウムの取り込みも、プリドピジンで処置したＹ１２８マウスからのミトコンドリアで改善されている。カルシウムの細胞外レベルは、プリドピジン処置に応答して減少する（図６Ｌ）。これは、ミトコンドリアのカルシウムハンドリングが増加した証拠である（図６Ｍ）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス検定による）。

【図7A】図７Ａは、プリドピジンがｍＨｔｔ誘発性ＥＲストレスを減少させることを示している。Ｈ２ａ－ＧＦＰは、ＳＴＨｄｈＱ７／７細胞で変異体Ｈｔｔ９６Ｑ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ＨＤエクソン１）と一時的に共発現した。Ｈ２ａ－ＧＦＰ凝集は、ＥＲストレスのマーカーである。ｍＣｈｅｒｒｙとＧＦＰの凝集を評価し、共焦点顕微鏡で画像を取得した。未処置細胞と比較して、Ｈｔｔ９６ＱはＥＲストレスを増強し、０．０３μＭ、０．３μＭおよび３μＭでのプリドピジン処置が、これらの細胞におけるＥＲストレスを減少させる。比較のために、１００％はＨｔｔ９６Ｑ－ｍＣｈｅｒｒｙ凝集体を示す未処置細胞におけるＨ２ａ－ＧＦＰ相対強度を表し、０％はＨｔｔ９６Ｑ－ｃｈｅｒｒｙ凝集体を有さない未処置細胞におけるＨ２ａ－ＧＦＰ相対強度を表す。グラフは３回の実験の平均＋－ＳＥである。未処置の細胞と比較して、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。

【図7B】図７Ｂは、プリドピジンがｍＨｔｔ誘発性ＥＲストレスを減少させることを示している。Ｈ２ａ－ＧＦＰは、ＳＴＨｄｈＱ７／７細胞でＨｔｔ２０Ｑ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ＷＴ）と一時的に共発現した。Ｈ２ａ－ＧＦＰ凝集は、ＥＲストレスのマーカーである。ｍＣｈｅｒｒｙとＧＦＰの凝集を評価し、共焦点顕微鏡で画像を取得した。Ｈｔｔ２０Ｑ（ｗｔ）は、ＥＲストレスを誘発しない。比較のために、１００％はＨｔｔ９６Ｑ－ｍＣｈｅｒｒｙ凝集体を示す未処置細胞におけるＨ２ａ－ＧＦＰ相対強度を表し、０％はＨｔｔ９６Ｑ－ｃｈｅｒｒｙ凝集体を有さない未処置細胞におけるＨ２ａ－ＧＦＰ相対強度を表す。グラフは３回の実験の平均＋－ＳＥである。未処置の細胞と比較して、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。

【図8】プリドピジンが、ＨＤモデルで上昇するＥＲストレスの指標であるリン酸化ｅＩＦ２α（ｅＩＦ２α－Ｐ）レベルを低下させることを示している。変異体Ｈｔｔ（Ｈｔｔ９６Ｑ、実線）またはＷＴ Ｈｔｔ（Ｈｔｔ２０Ｑ、破線）をトランスフェクトして、０．３μＭおよび３μＭのプリドピジンで２４時間処置したＨＥＫ２９３細胞において、ｅＩＦ２α－Ｐレベルをアッセイした。総ｅＩＦ２αに対するｅＩＦ２α－Ｐの比率をイムノブロットによって定量化した。変異体Ｈｔｔは、ＷＴと比較してリン酸化ｅＩＦ２αのレベルを増加させ、両方のプリドピジン濃度は、ｅＩＦ２α－Ｐレベルを減少させた（＊ｐ＜０．０５）。

【発明を実施するための形態】

【0020】

以下の詳細な説明において、本発明の完全な理解を提供するために、多くの具体的な詳細が記載される。しかしながら、本発明がこれらの具体的な詳細を伴わずに実行されてもよいということが、当業者によって理解されるであろう。他の事例では、本発明を不明瞭にしないように、周知の方法、手順、および構成要素は、詳細に説明されていない。

【0021】

第１の態様において、本発明は、ミトコンドリア機能不全に関連する疾患、障害、またはその任意の症状の治療を必要とする対象において当該治療を行うための方法であって、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む有効用量の組成物を当該対象に投与し、それにより当該対象を治療することを含む、方法を提供する。

【0022】

さらなる態様において、本発明は、ミトコンドリア機能不全に関連する疾患、障害、またはその任意の症状を治療するための方法において使用するための、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む組成物を提供する。

【0023】

「ミトコンドリア機能不全に関連する疾患、障害、またはその任意の症状」について言及する場合、ミトコンドリアまたはその任意の一部の機能不全が直接的または間接的な役割を果たす、対象の健康を危険にさらすあらゆる種類の状態を包含すると理解されるべきである。

【0024】

いくつかの実施形態において、当該ミトコンドリア機能不全に関連する疾患、障害、または任意の症状は、ミトコンドリアミオパチーに関連する疾患、障害、またはその任意の症状である。

【0025】

他の実施形態において、当該ミトコンドリアミオパチーは、ＭＥＬＡＳ症候群、ＭＥＲＲＦ症候群、リー病、アルパーズ症候群、慢性進行性外眼筋麻痺（Ｃ／ＰＥＯ）、真性糖尿病および難聴（ＭＩＤＤまたはＤＡＤ）、カーンズ・セイヤー症候群（ＫＳＳ）、ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群（ＭＤＳ）、ミトコンドリア神経胃腸管系脳筋症（ＭＮＧＩＥ）、神経障害、運動失調症および網膜色素変性（ＮＡＲＰ）、ピアソン症候群、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、優性視神経萎縮症（ＤＯＡ）、色素性網膜症、ウルフラム症候群、フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）、ミトコンドリア神経胃腸管系脳筋症（ＭＮＧＩＥ）、ならびにそれらの任意の組み合わせから選択される。

【0026】

「ミトコンドリアミオパチー」について言及する場合、機能不全のミトコンドリアによって引き起こされるあらゆる疾患もしくは障害またはあらゆる症状を包含すると理解されるべきである。ミトコンドリア病は、ミトコンドリア機能に影響を及ぼすミトコンドリアＤＮＡの変異によって引き起こされる場合がある（時間の約１５％）。他のミトコンドリア病は、核ＤＮＡの遺伝子の変異によって引き起こされ、その遺伝子産物がミトコンドリア（ミトコンドリアタンパク質）に移入され、ミトコンドリアの状態を獲得する。ミトコンドリア病は、当該疾患がしばしば受け継がれる方法のため、およびミトコンドリアが細胞機能にとって非常に重要であるために、独特の特徴を呈する。神経筋疾患の症状があるこれらの疾患のサブクラスは、ミトコンドリアミオパチーと呼ばれることが多い。

【0027】

ミトコンドリアミオパチーの疾患および障害には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない。

【0028】

ＭＥＬＡＳ症候群（ミトコンドリアミオパチー、脳症、乳酸アシドーシス、および脳卒中）。ミトコンドリアＤＮＡの変異によって引き起こされる進行性神経変性障害。この疾患はあまり知られておらず、診断が難しい場合があるため、世界中でＭＥＬＡＳ発症者が何名なのかはまだ分かっていない。この症候群は、すべての民族ならびに弾性および女性の両方に影響を及ぼす。罹患者は通常、４歳～４０歳に症状を示し始める。予後は不良であり、当該疾患は致命的である場合が多い。ＭＥＬＡＳ症候群の治療法はなく、医療は主に支援的である。症状：ＭＥＬＡＳ症候群患者のすべての細胞にミトコンドリアの欠陥が存在するため、多種の症状が発症する可能性があり、衰弱させる場合が多い。脳卒中は脳の損傷を引き起こし、発作、しびれ、または部分的な麻痺につながる。脳症（脳疾患）は、振せん、筋肉のけいれん、失明、難聴を引き起こし、認知症につながることがある。ミオパチー（筋肉疾患）は、困難歩行、移動、食事および発話を引き起こす。

【0029】

ＭＥＲＲＦ症候群（または赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん）小児期に始まり、神経系および骨格筋、ならびに他の身体システムに影響を及ぼす非常にまれな障害。ＭＥＲＲＦの際立った特徴はミオクローヌスであり、これは、腕および脚、または全身に影響を及ぼす可能性のある突然の短い反射けいれん（ｊｅｒｋｉｎｇ ｓｐａｓｍｓ）からなる。さらに、ＭＥＲＲＦ症候群の人は、筋力低下（ミオパチー）、運動を調整する能力の障害（運動失調症）、発作、および知的機能の緩徐な悪化（認知症）を有する可能性がある。低身長、視神経の変性（視神経萎縮）、難聴、心筋症、および神経損傷による異常な感覚（末梢神経障害）も一般的な症状である。異常な筋細胞が存在し、ゴモリ・トリクローム変法で染色し、顕微鏡で見ると、これらの筋細胞は赤色ぼろ線維（ＲＲＦ）として現れる。ＭＥＲＲＦは、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の変異によって引き起こされる。

【0030】

リー病 出生時の有病率はおよそ３６０００人に１人と推定されている。症状は、典型的には１２ヶ月齢前に発症するが、まれに、青年期またはさらには成人早期に発症することもある。運動マイルストーンの喪失、頭部の制御が不十分な筋緊張低下、再発性嘔吐、および運動障害が一般的な初期症状である。錐体徴候および錐体外路徴候、眼振、呼吸障害、眼筋麻痺および末梢神経障害が、しばしば後で認められる。てんかんは比較的まれである。リー病に対する特別な治療法はない。

【0031】

慢性進行性外眼筋麻痺（Ｃ／ＰＥＯ） 外眼筋の緩徐進行性麻痺を特徴とする。患者は通常、両側性の対称的な進行性眼瞼下垂を経験し、その後、数ヶ月～数年後に眼筋麻痺を起こす。毛様体と虹彩の筋肉は関与していない。ＣＰＥＯは、ミトコンドリアミオパチーの最も頻繁な症状である。ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の変異に関連するＣＰＥＯは、他の臨床的徴候がない場合に発症する可能性があるが、通常は骨格筋衰弱に関連している。ただし、同様の臨床症状を有する人は、様々なミトコンドリアの欠陥を有し得る。

【0032】

真性糖尿病および難聴（ＭＩＤＤまたはＤＡＤ） ＭＩＤＤは、糖尿病患者の１％を占めている。３２４３位のミトコンドリアＤＮＡに変異を持っている人の８５％超が糖尿病の症状を示す。ＭＩＤＤ患者が通常診断される平均年齢は３７歳であるが、１１歳～６８歳の範囲であることが分かっている。３２４３位にミトコンドリアＤＮＡ変異を有する糖尿病患者のうち、７５％が感音難聴を経験している。これらの場合、難聴は通常、糖尿病の発症前に現れ、高音周波数の知覚の低下を特徴とする。糖尿病に関連する難聴は、通常、女性よりも男性における方が一般的で、急速に減少する。

【0033】

カーンズ・セイヤー症候群（ＫＳＳ） 発症：２０歳未満。カーンズ・セイヤー症候群の有病率は、１０万人あたりおよそ１～３人である。まれな神経筋障害。重要な臨床症状の特徴は、片側または両側性眼瞼下垂（まぶたの部分的な閉鎖）の存在である。この疾患は、主に３つの主要な所見によって特徴付けられる：特定の眼筋の進行性麻痺（慢性進行性外眼筋麻痺［ＣＰＥＯ］）；眼の内側を覆っている神経が豊富な膜上への着色（色素沈着）物質の異常な蓄積（非定型網膜色素変性）による慢性炎症、進行性変性および特定の眼構造の摩耗（網膜の色素変性）；ならびに心臓ブロックなどの心疾患（心筋症）。その他の所見には、筋力低下、低身長、難聴、および／または脳の一部（小脳）に影響を及ぼす問題による自発的運動を調整する能力の喪失（運動失調症）が含まれる場合がある。場合によっては、ＫＳＳは他の障害および／または状態に関連している可能性がある。

【0034】

アルパーズ症候群（アルパーズ・ハッテンロッヒャー症候群）： 発症：生後数週間から数年。症状：精神運動発達退行（認知症）、発作、および肝疾患。重度の継続的な発作は、生後１０年以内に死に至る。

【0035】

ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群（ＭＤＳ） 発症：乳児期。症状：この障害は通常、筋力低下および／または肝不全を引き起こし、まれに脳の異常を引き起こす。「筋緊張低下（ｆｌｏｐｐｉｎｅｓｓ）」、摂食困難、および発達遅延は一般的な症状であり、ＰＥＯおよび発作はあまり一般的ではない。

【0036】

ミトコンドリア神経胃腸管系脳筋症（ＭＮＧＩＥ） 発症：通常２０歳未満。症状：この障害は、ＰＥＯ、眼瞼下垂（まぶたの垂下）、四肢脱力、ならびに慢性下痢および腹痛などの胃腸（消化）の問題を引き起こす。別の一般的な症状は、末梢神経障害（感覚障害および筋力低下につながる可能性のある神経の機能不全）である。

【0037】

神経障害、運動失調症および網膜色素変性（ＮＡＲＰ） 発症：乳児期から成人期。症状：ＮＡＲＰは神経障害（感覚障害および筋力低下につながる可能性のある神経の機能不全）、運動失調症および色素性網膜炎（眼の網膜の変性（結果としての視力喪失））。また、発達の遅れ、発作、および認知症を引き起こす可能性がある。

【0038】

ピアソン症候群 発症：乳児期。症状：この症候群は、重度の貧血と膵臓の機能不全を引き起こす。当該疾患を生き延びた子供は通常、カーンズ・セイヤー症候群を発症する。

【0039】

レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ） 数日から数か月の期間にわたって連続的に両眼の急性かつ無痛の中心視力喪失を特徴とする。ＬＨＯＮは、ミトコンドリアＤＮＡの点変異に関連する最初の母系遺伝性眼科疾患であった。ＬＨＯＮの認識された疾患有病率は、英国および他の欧州地域で２５，０００人に１人と推定される。ミトコンドリア呼吸鎖複合体Ｉサブユニット遺伝子内の３つのｍｔＤＮＡ点変異（ＮＤ４のＧ１１７７８Ａ、ＮＤ１のＧ３４６０Ａ、およびＮＤ６のＴ１４４８４Ｃ）は、合わせてＬＨＯＮ症例の９５％を引き起こす。他の病原性ｍｔＤＮＡ変異は、特に非白人民族間で引き続き同定されている。例えば、漢民族で一般的であると思われる、ＮＤ５で最近同定されたｍｔＤＮＡ Ｔ１２３３８Ｃ変異などである。

【0040】

優性視神経萎縮症（ＤＯＡ） ＤＯＡは、主に網膜神経節細胞（ＲＧＣ）と網膜の神経線維層に影響を及ぼす遺伝性疾患である。ＤＯＡの有病率は、北欧で３５，０００人に１人と推定されている。視力は通常、２０歳以下で平均２０／８０～２０／１２０に低下する。神経網膜縁の菲薄化は、ＤＯＡの普遍的な所見であるように思われ、乳頭（ｄｉｓｃ）の「ソーサライゼーション」、０．５を超えるカップと乳頭の比率、乳頭周囲の萎縮などの所見が時折見られる。初期の視神経の出現は、しばしば視神経のセクターの蒼白を特徴とする。

【0041】

色素性網膜症および他の眼科的問題 色素性網膜症は、一部のミトコンドリア病に見られる可能性のある非特異的な所見である。色素性網膜症が見られる可能性のある、最も良く説明されている主なｍｔＤＮＡ疾患は、ミトコンドリア複合体Ｖサブユニット遺伝子ＡＴＰａｓｅ６のＴ８９９３Ｃ ｍｔＤＮＡ変異に起因する神経障害、運動失調症および網膜色素変性（ＮＡＲＰ）である。

【0042】

ウルフラム症候群 通常、小児期に発症するインスリン依存性真性糖尿病および進行性視神経萎縮に関連する遺伝性疾患である。さらに、ウルフラム症候群を有する多くの人々はまた、尿崩症および感音難聴を発症する。当該症候群の旧名はＤＩＤＭＯＡＤであり、これは尿崩症、真性糖尿病、視神経萎縮、および難聴を指す。一部の人はウルフラム症候群の原因となる同遺伝子に変異を有するが、当該症候群のすべての特徴を備えているわけではないため、ＷＦＳ１関連障害を有すると言われている。ウルフラム症候群の主な症状（真性糖尿病、視神経萎縮、尿崩症、および難聴）は、様々な年齢で現れ、様々な速度で変化する可能性がある。

【0043】

フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ） 遺伝性、進行性、神経変性運動障害で、典型的な発症年齢は１０～１５歳である。初期症状としては、不安定な姿勢、頻繁な転倒、自発的な動きを調整する能力の障害（運動失調症）による進行性の歩行困難などが挙げられる。罹患者は、しばしば不明瞭言語（構音障害）、特徴的な足の変形、および脊椎の不規則な湾曲（脊柱側弯症）を発症する。ＦＲＤＡは、しばしば心筋の疾患である心筋症に関連しており、心不全または心臓リズムの異常（不整脈）につながる可能性がある。ＦＲＤＡを有する人々の約３分の１が糖尿病を発症する。ＦＲＤＡに関連する症状および臨床所見は、主に、後根神経節として知られる構造の脊髄に入る時点での感覚神経線維の変性変化に起因する。これにより、脊髄の神経線維が二次的に変性し、自発的な動きを調整するのに役立つ脳の一部である小脳への感覚信号が不足する。

【0044】

ミトコンドリア神経胃腸管系脳筋症（ＭＮＧＩＥ） チミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）酵素欠損によって引き起こされる進行性代謝障害。ＴＰの欠如は、デオキシリボヌクレオシドチミジン（ｄＴｈｄ）およびデオキシウリジン（ｄＵｒｄ）の全身蓄積をもたらす。これらの患者の臨床的特徴としては、精神退行、眼筋麻痺、および致命的な胃腸管の合併症が挙げられる。ヌクレオシドの蓄積は、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の不均衡も引き起こす。これは、ｍｔＤＮＡ枯渇／欠失の異常に直接的または間接的な役割を果たす可能性があるが、正確な根本的なメカニズムは不明である。

【0045】

さらなる実施形態において、当該ミトコンドリア機能不全に関連する疾患、障害、またはその任意の症状は、リソソーム蓄積症に関連する疾患、障害、または任意の症状である。

【0046】

他の実施形態において、当該リソソーム蓄積症は、糖原病ＩＩ型（ポンペ病）、多種スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、ムコリピドーシス（ＭＬ）Ｉ～ＩＩＩ型、Ｇ（Ｍ１）－ガングリオシドーシス、ファブリー病、ファーバー病、ゴーシェ病、ニーマン・ピック病、ムコリピドーシス（ＭＬ）ＩＶ型、シスチン症、神経セロイドリポフスチン症、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。

【0047】

「リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）」について言及する場合、リソソーム内の未消化高分子の進行性の蓄積を特徴とする、あらゆる疾患、障害、または症状を包含すると理解されるべきである。物質の大量蓄積は、リソソームの機能に影響を及ぼし、ミトコンドリアなどの細胞小器官の細胞品質管理に影響を及ぼす可能性のあるオートファジーフラックスを減少させる。ＬＳＤは、ミトコンドリアの形態学的変化、ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）の低下、ＡＴＰ産生の減少、および反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成の増加など、ミトコンドリア機能不全の徴候を示す。さらに、オートファジーフラックスの減少は、機能不全のミトコンドリアの持続につながる可能性がある。リソソーム蓄積症の例としては、糖原病ＩＩ型（ポンペ病）、多種スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、ムコリピドーシス（ＭＬ）Ｉ～ＩＩＩ型、Ｇ（Ｍ１）－ガングリオシドーシス、ファブリー病、ファーバー病、ゴーシェ病、ニーマン・ピック病、ムコリピドーシス（ＭＬ）ＩＶ型、シスチン症、神経セロイドリポフスチン症が含まれるが、これらに限定されない。

【0048】

いくつかの実施形態において、当該ミトコンドリア機能不全に関連する疾患、障害、またはその任意の症状は、神経変性疾患に関連する疾患、障害、または任意の症状である。

【0049】

神経変性疾患は、ニューロンサブタイプの相対的な選択的死を特徴とする、神経系のあらゆる種類の身体障害性疾患、障害、または症状に関する。ミトコンドリア機能の障害は、ミトコンドリアダイナミクス（形状、サイズ、核分裂－融合、分布、運動など）の障害、ミトコンドリア膜電位の異常、酸素消費率、ＲＯＳレベルなど、これらの疾患の発症の鍵である。

【0050】

パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）、およびアルツハイマー病などの神経変性疾患では、ミトコンドリア機能が損なわれる。

【0051】

いくつかの実施形態において、当該神経変性疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）、アルツハイマー病、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。

【0052】

いくつかの実施形態において、当該ミトコンドリア機能不全に関連する疾患、障害、またはその任意の症状は、白質消失（ＶＷＭ）病である。白質消失病（ＶＷＭ）は、白質ジストロフィーとして総称される脳の白質またはミエリンに影響を及ぼす５０を超える状態のうちの１つである。中枢神経系髄鞘形成不全を伴う小児運動失調症（ＣＡＣＨ）としても知られるＶＷＭは、ミエリン、脳の白質、またはミエリンを破壊する非常にまれな神経学的状態である。そうすることで、体の残りの部分への脳信号の伝達に恒久的に影響を及ぼす。ＶＷＭ病で特定される臨床症状としては、びまん性ＣＮＳ髄鞘形成不全を伴う小児運動失調症（ＣＡＣＨ）、白質消失白質ジストロフィー（Ｖａｎｉｓｈｉｎｇ Ｗｈｉｔｅ Ｍａｔｔｅｒ Ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）（ＶＷＭ）、クリー白質脳症、卵巣機能不全を伴う白質消失白質ジストロフィー、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0053】

さらなる実施形態において、本発明は、ミトコンドリア機能不全に関連する疾患、障害、またはその任意の症状の治療を必要とする対象において当該治療を行うための方法であって、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む組成物を当該対象に投与することを含み、当該ミトコンドリア機能不全が双極性障害である、方法を提供する。

【0054】

双極性障害：躁病エピソードとうつ病エピソードを示す主要な精神障害で、頻繁に精神病症状を伴う。ミトコンドリアＤＮＡの変異およびミトコンドリア機能不全は、この障害を有する患者の一部の主要因である。

【0055】

さらなる実施形態において、本発明は、ミトコンドリア機能不全に関連する疾患、障害、またはその任意の症状の治療を必要とする対象において当該治療を行うための方法であって、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む組成物を当該対象に投与することを含む、方法を提供し、当該ミトコンドリア機能不全に関連する疾患または障害の症状としては、以下のもののうちのいずれか１つ以上が含まれる：成長不良、筋協調の喪失、筋力低下、神経学的欠損、発作、自閉症、自閉症スペクトル、自閉症様の特徴、学習障害、心疾患、肝疾患、腎疾患、胃腸障害、重度の便秘、糖尿病、感染リスクの増加、甲状腺機能不全、副腎機能不全、自律機能不全、混乱、失見当識、記憶喪失、成長不良、成長障害、協調運動不全、感覚（視覚、聴覚）の問題、精神機能の低下、臓器の疾患、認知症、呼吸器の問題、低血糖、無呼吸、乳酸アシドーシス、発作、嚥下困難、発達遅延、運動障害（ジストニア、筋肉のけいれん、振せん、舞踏病）、脳卒中、および脳萎縮。

【0056】

いくつかの実施形態において、当該プリドピジンは、その中性／塩基の形態である。他の実施形態において、当該プリドピジンは、薬学的に許容される塩の形態である。いくつかの実施形態において、当該プリドピジンは、プリドピジン塩酸塩である。

【0057】

本明細書に開示される方法および使用について、投与経路は、例えば、経口であり得る。投与経路は、効果が局所的（例えば、局所投与）であるか全身的（例えば、経腸または非経口投与）であるかによって分類することもできる。本明細書で使用される場合、「局所投与」は、その作用が望まれる場所への化合物または組成物の直接投与を意味するものとし、特に全身投与を除外する。本明細書で使用される場合、化合物または組成物の「局所投与」は、皮膚などの体表面または眼などの粘膜への化合物または組成物の適用を意味するものとする。本明細書で使用される場合、「眼内投与」は、対象の眼、または眼の周囲の皮膚（眼周囲の皮膚）もしくは眼の周囲の粘膜、特に対象の結膜への化合物または組成物の適用、すなわち局所投与を意味するものとする。本発明のプリドピジンおよび薬学的組成物の量は、経口投与、局所投与（ｔｏｐｉｃａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、全身投与、局所投与（ｌｏｃａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、または眼投与によって投与してもよい。

【0058】

いくつかの実施形態において、当該プリドピジンは、経口投与される。

【0059】

さらなる実施形態において、当該プリドピジンは、吸入可能な粉末、注射剤、液体、ゲル、固体、点眼薬、眼軟膏、カプセル、または錠剤の形態で投与される。

【0060】

本明細書で使用される場合、「プリドピジン」は、プリドピジン塩基、その薬学的に許容される塩、その誘導体、それらの類似体、またはプリドピジンとその類似体との組み合わせを意味する。

【0061】

プリドピジン誘導体の例は、重水素に富むバージョンのプリドピジンおよび塩である。重水素に富むプリドピジンおよび塩、ならびにそれらの調製方法の例は、米国出願公開第２０１３－０１９７０３１号、同第２０１６－０１６６５５９号および同第２０１６－００９５８４７号に記載されており、これらのそれぞれの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0062】

「重水素に富む」とは、化合物の任意の関連部位での重水素の存在量が、ある量の化合物のその部位に天然に存在する重水素の存在量よりも多いことを意味する。天然に存在する重水素分布は約０．０１５６％である。したがって、「重水素に富む」化合物では、その関連部位のうちのいずれかでの重水素の存在量は、０．０１５６％超過であり、０．０１５６％超過～１００％の範囲であり得る。重水素に富む化合物は、水素を重水素と交換するか、または重水素に富む出発物質で化合物を合成することによって得ることができる。

【0063】

本発明はまた、任意の薬学的に許容される塩を含むプリドピジンの任意の塩を含み、プリドピジンは正味電荷（正または負のいずれか）を有し、少なくとも１つの対イオン（逆の負または正電荷を有する）がプリドピジンに添加されて当該塩を形成する。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という句は、哺乳動物での薬学的用途に安全かつ有効であり、所望の生物学的活性を有する本発明の化合物の塩を意味する。薬学的に許容される塩には、本発明の化合物に存在する酸性基または塩基性基の塩が含まれる。薬学的に許容される酸付加塩には、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルカロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、およびパモ酸塩（すなわち、１，１'－メチレン－ビス－（２－ヒドロキシ－３－ナフトエート））が含まれるが、これらに限定されない。本発明の特定の化合物は、様々なアミノ酸と薬学的に許容される塩を形成することができる。適切な塩基塩には、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛、およびジエタノールアミン塩が含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩についての論評については、ＢＥＲＧＥ ＥＴ ＡＬ．，６６ Ｊ．ＰＨＡＲＭ．ＳＣＩ．１－１９（１９７７）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。別の実施形態において、本発明のプリドピジン塩は、塩酸塩である。

【0064】

いくつかの実施形態において、本発明の方法は、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩と、１つ以上のその類似体またはその薬学的に許容される塩との組み合わせを利用する。

【0065】

一実施形態において、プリドピジンの類似体は、以下の構造によって表される：

【0066】

【化1】

【0067】

他の実施形態において、本発明の方法は、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩と、化合物（１）の類似体またはその薬学的に許容される塩との組み合わせを利用する。

【0068】

他の実施形態において、本発明の方法は、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩と、化合物（１）の類似体および化合物（４）の類似体またはその薬学的に許容される塩との組み合わせを利用する。

【0069】

したがって、本発明はまた、薬学的に許容される助剤と混合された本発明の薬剤と、任意選択的に、他の治療薬と、を含む薬学的組成物に関する。助剤は、組成物の他の成分と適合性があり、そのレシピエントに有害ではないという意味で「許容できる」ものでなければならない。

【0070】

薬学的組成物には、経口、直腸、鼻、局所（経皮、頬および舌下を含む）、膣または非経口（皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む）投与またはインプラントを介した投与に好適なものが含まれる。組成物は、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製することができる。

【0071】

薬学的組成物には、経口、直腸、鼻、局所（経皮、頬および舌下を含む）、膣または非経口（皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む）投与またはインプラントを介した投与に好適なものが含まれる。組成物は、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製することができる。

【0072】

そのような方法は、本発明で使用される会合化合物またはそれらと任意の補助剤との組み合わせを導入するステップを含む。補助成分（複数可）とも呼ばれる補助剤には、担体、充填剤、結合剤、希釈剤、崩壊剤、潤滑剤、着色剤、香味剤、酸化防止剤、および湿潤剤などの当技術分野において慣習的なものが含まれる。

【0073】

経口投与に好適な薬学的組成物は、ピル、錠剤、糖衣錠もしくはカプセルなどの個別の剤形単位として、または粉末もしくは顆粒として、あるいは溶液もしくは懸濁液として提示され得る。有効成分はまた、ボーラスまたはペーストとして提示され得る。当該組成物をさらに加工して、直腸投与用の坐剤または浣腸にすることができる。

【0074】

本発明はさらに、前述のような用途のための組成物の使用説明書を含む、包装材料と組み合わせた、前述のような薬学的組成物を含む。

【0075】

非経口投与の場合、好適な組成物には、水性および非水性の滅菌注射が含まれる。当該組成物は、単位用量または複数用量の容器、例えば、密封されたバイアルおよびアンプルで提示され得、使用前に、無菌の液体担体、例えば、水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。経皮投与の場合、例えば、ゲル、パッチまたはスプレーが企図され得る。例えば経鼻吸入による肺投与に好適な組成物または製剤には、定量加圧エアロゾル、ネブライザーまたは吸入器によって生成され得る微細な粉塵またはミストが含まれる。

【0076】

当該組成物の正確な用量および投与計画は、達成される治療効果または栄養効果に必然的に依存し、処方、投与経路、ならびに当該組成物が投与される個々の対象の年齢および状態によって異なり得る。

【0077】

本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、望ましくない疾患、障害（疾患もしくは障害に関連する症状を含む）を改善する、そのような疾患、障害（疾患もしくは障害に関連する症状を含む）が発症する前にそれらの発現を防止する、疾患の進行を遅らせる、症状の悪化を遅らせる、寛解期間の開始を強化する、疾患の進行性慢性期に引き起こされる不可逆的損傷を遅らせる、当該進行期の開始を遅らせる、重症度を軽減するか、もしくは疾患を治癒する、生存率を改善するか、もしくはより迅速に回復させる、または疾患形態の発生を防止する、あるいは上記のうちの２つ以上の組み合わせに有効な治療量で本発明の組成物を投与することを指す。本明細書に開示される目的のための「有効量」は、当技術分野で既知であり得るような考慮事項によって決定される。当該量は、とりわけ、治療される疾患の種類および重症度、ならびに治療計画に応じて、上記のような所望の治療効果を達成するのに有効でなければならない。いくつかの実施形態において、プリドピジンまたはその薬学的に許容される塩を含む組成物は、１～４００ｍｇ、１日１回、１日２回、１日３回、または１日１回よりも少ない頻度である。一般的に知られているように、有効量は、様々な要因（受容体に対するリガンドの親和性、体内でのその分布プロファイル、体内での半減期などの様々な薬理学的パラメーターを含む）に、望ましくない副作用に、もしあれば、年齢および性別などの要因に、依存する。

【0078】

いくつかの実施形態において、プリドピジンは、１ｍｇ／日～４００ｍｇ／日の１日用量で投与される。いくつかの実施形態において、プリドピジンは、１ｍｇ／日～３００ｍｇ／日の１日用量で投与される。他の実施形態において、プリドピジンは、１ｍｇ／日～９０ｍｇ／日の１日用量で投与される。他の実施形態において、プリドピジンは、２０ｍｇ／日～９０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、４５ｍｇ／日～９０ｍｇ／日の１日用量で投与される。他の実施形態において、プリドピジンは、２０ｍｇ／日～５０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、１ｍｇ／日～１０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、１０ｍｇ／日～２０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、２０ｍｇ／日～３０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、３０ｍｇ／日～４０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、４０ｍｇ／日～５０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、５０ｍｇ／日～６０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、６０ｍｇ／日～７０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、７０ｍｇ／日～８０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、８０ｍｇ／日～９０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、９０ｍｇ／日～１００ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、１００ｍｇ／日～１５０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、１５０ｍｇ／日～２００ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、２００ｍｇ／日～２５０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、２５０ｍｇ／日～３００ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、３００ｍｇ／日～３５０ｍｇ／日の１日用量で投与される。さらなる実施形態において、プリドピジンは、３５０ｍｇ／日～４００ｍｇ／日の１日用量で投与される。

【0079】

実験セクション

【0080】

材料および方法

【0081】

ヘミ接合型ＹＡＣ１２８（Ｙ１２８）［ＨＤ５３系統；ｍＨＴＴ高発現体］およびＷＴマウス（ＦＶＢ／Ｎバックグラウンドを有する）のコロニーを、制御された温度（２２～２３℃）の条件下および１２時間の明／１２時間の暗サイクル下に収容した。食料および水は自由に摂取できた。すべてのマウス実験は、動物実験委員会のガイドライン、欧州共同体指令（２０１０／６３／ＥＵ）、および地方の動物管理委員会によって承認されたプロトコルに従って実施した。動物の苦痛を最小限に抑え、動物の使用数を減らすためにあらゆる努力を行った。

【0082】

一次ニューロン培養：初代皮質、線条体、および皮質－線条体共培養物を、同じ遺伝的バックグラウンド（ＦＶＢ／Ｎ）からの野生型（ＷＴ）マウス（対照として使用）またはヘミ接合型Ｙ１２８マウス［ＨＤ５３系統］の雄とＷＴの雌との交配の子孫から生成した。指定時期に妊娠させた（ｔｉｍｅｄ ｐｒｅｇｎａｎｔ）雌からの胚を、妊娠のＥ１５．５～１６．５日目に収集した。皮質－線条体共培養物では、皮質および線条体を顕微解剖し、さいの目に切って遺伝子型ごとにプールした。次に、組織を解離させ、粉砕した。強化した神経基礎培地中の、ポリ－Ｄ－リジンでコーティングしたプレートに細胞を播種された。細胞には、５日ごとに１／３の新鮮培地を供給した。

【0083】

純粋な皮質および線条体ニューロンを得るために、組織を顕微解剖し、機械的に消化した。強化した神経基礎培地中でニューロンを培養し、ポリ－Ｄ－リジン（０．１ｍｇ／ｍｌ）でコーティングしたプレート上の１３０×１０^３個の細胞／ｃｍ^２（高密度）または８５×１０^３（低密度）のいずれかの密度で播種した。培養物を、９５／５％の空気／ＣＯ_２インキュベーター中に３７℃で維持した。インビトロの３日目（ＤＩＶ３）に、５μＭ ５－フルオロ－２'－デオキシウリジン（５－ＦｄＵ）を添加して、分裂している非ニューロン細胞を減少させた。ＤＩＶ７に新鮮培地を加え、ＤＩＶ１２に細胞を使用した。

【0084】

ニューロンのトランスフェクション：線条体ニューロンに、リン酸カルシウム沈殿法を使用して、８ＤＩＶにｐＤｓＲｅｄ２－Ｍｉｔｏ Ｖｅｃｔｏｒをトランスフェクトした。次に、トランスフェクトされたニューロンを神経基礎培地で洗浄し、ＤＩＶ１２まで馴化培養培地を含む元の皿に戻した。

【0085】

リンパ芽球の培養およびトランスフェクション：Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手した健常対照（ＧＭ０２１７４）とＨＤ患者（ＮＡ０４７２４）からのリンパ芽球を、補充ＲＰＭＩ培地で増殖させた。リンパ芽球を５～６日ごとに１：３で継代した。

【0086】

ヒト神経幹細胞の培養：神経幹細胞（ＮＳＣ）は、ヘテロ接合型ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であるＨＤ４－ｉＰＳＣ（正常対立遺伝子（１９個のＣＡＧリピート）および拡張対立遺伝子（７２個のＣＡＧリピート）を有する）、ならびに対照ＡＭＳ４－ｉＰＳＣから分化させた。ｉＰＳＣが９０％コンフルエンスに達するまで、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．、カタログ番号：Ａ１４１３２０２）でコーティングした６ウェルプレート中でｉＰＳＣを維持した。ｉＰＳＣが９０％コンフルエンスに達した時点で神経誘導プロトコルを適用した。神経分化は、ＳＢ４３１５４２（Ｌｅｆｔｙ／Ａｃｔｉｖｉｎ／トランスフォーミング成長因子ベータ－ＴＧＦβ阻害剤）、ドルソモルフィン（骨形成タンパク質－ＢＭＰ阻害剤）、およびＸＡＶ－９３９（β－カテニン転写阻害剤およびアキシン安定剤）による二重ＳＭＡＤ阻害に基づいていた。神経誘導は０日目から１２～１５日目までの間に起こった。０日目から５日目まで、細胞をＦＧＦ_２を含まないｉＰＳＣ培地中で維持し、５μＭドルソモルフィンおよび１０μＭ ＳＢ４３１５４２とともにインキュベートした。培地は１日おきに交換した。５日目から１２日目まで、この培地を、Ｎ２培地の割合を増加させながら培地と徐々に交換した。１２日目～１５日目に、ロゼットでいっぱいのフィールドが形態学的に見えるようになった。分化のために、細胞をＧｅｌｔｒｅｘ（登録商標）でコーティングした１２ウェルプレートに再播種した。神経系統マーカータンパク質であるネスチンおよびＳＯＸ２の発現は、各分化プロセス時に免疫細胞化学によって確認された。

【0087】

プリドピジンのインキュベーション：特に明記しない限り、プリドピジンのインキュベーションは、使用したすべての細胞モデルで２４時間行った。最終濃度は、図および図の説明文に記載されている。

【0088】

ミトコンドリアネットワークとＥＲの共局在：皮質－線条体共培養物をＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ ＦＭ色素で３０分間標識した。染色した細胞を洗浄した後、室温で１５分間氷冷メタノールで固定した。

【0089】

ＭｉｔｏＤｓＲｅｄをトランスフェクトされた線条体ニューロンを４％パラホルムアルデヒドで固定し、透過処置してブロックした後、ＩＰ_３Ｒ３抗体（１：１０００、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＡＢ９０７６）とインキュベートした。核を検出するために、ニューロンをＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２とインキュベートし、載置した。

【0090】

共焦点画像は、ＬＳＭ ７１０ソフトウェアを備えたＺｅｉｓｓ共焦点顕微鏡で６３倍レンズを使用して、ｚ軸に沿って０．４６μｍ離れたスタックとして取得した。画像解析にはＦＩＪＩソフトウェアを使用した。Ｚスタック画像はバックグラウンドに対して正規化し、ミトコンドリア固有の蛍光を示すピーク強度領域を、Ｆｉｎｄ Ｆｏｃｉ（Ｈｅｒｂｅｒｔ，Ａｌｅｘ Ｄ．，Ａｎｔｏｎｙ Ｍ．Ｃａｒｒ，ａｎｄ Ｅｖａ Ｈｏｆｆｍａｎｎ．２０１４．"ＦｉｎｄＦｏｃｉ：Ａ Ｆｏｃｕｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｗｉｔｈ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｔｈａｔ Ｃｌｏｓｅｌｙ Ｍａｔｃｈｅｓ Ｈｕｍａｎ Ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓ， Ｒｅｄｕｃｅｓ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｉｅｓ ａｎｄ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ Ｓｐｅｅｄ ｏｆ Ａｎａｌｙｓｉｓ．"Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｌｉｃｈｔｅｎ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（１２））を使用して特定し、フィルターを適用することによって最適に分解した（ｒｅｓｏｌｖｅｄ）。ミトコンドリアの輪郭は、粒子解析（Ａｎａｌｙｚｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を使用して追跡した。ミトコンドリアの長さの指標として、アスペクト比（ミトコンドリアの長軸と短軸との比）を使用した。ＩＰ_３Ｒ３蛍光については、上記と同様にしきい値を設定し、ミトコンドリアの関心領域（ＲＯＩ）内で総密度（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄｅｎｓｉｔｙ）を計算して、ミトコンドリアとのＥＲの共局在を取得した。

【0091】

ミトコンドリアの運動の分析：ＭｉｔｏＤｓＲｅｄをトランスフェクトされた線条体ニューロンを洗浄し、Ｎａ^＋培地中でインキュベートし、ミトコンドリアの運動の研究を３７℃で実施した。ニューロンの投影は、Ｚｅｉｓｓスピニングディスク倒立共焦点で６３倍の対物レンズを使用して、合計１４５フレームで５秒ごとに画像化した。ミトコンドリアの運動分析は、Ｆｉｊｉのカイモグラフマクロ（Ｋｙｍｏｇｒａｐｈ Ｍａｃｒｏ）を使用して実施した。ＲＯＩは、投影全体でのミトコンドリアの軌跡をたどるセグメント化された線を使用して指定した。ｘ－ｙ次元（距離対時間）で生成されたカイモグラフを使用して、ミトコンドリアの速度を計算するための勾配を取得した。

【0092】

Ｓｅａｈｏｒｓｅ酸素呼吸計測：ＷＴおよびヘミ接合型Ｙ１２８皮質／線条体共培養物およびＮＳＣにおける酸素消費率（ＯＣＲ）は、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ－２４／９６フラックスアナライザー（Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。皮質－線条体一次ニューロンは、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ９６ Ｖ３細胞培養マイクロプレートで２０，０００個の細胞／ウェルの密度で培養した。Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）でコーティングしたＸＦ２４細胞培養マイクロプレートに、３０，０００個の細胞／ウェルでＮＳＣを播種し、３７℃で２４時間接着させた。グラフに示されている場合、実験の２４時間前に、プリドピジン（０．１ｍＭ、１ｍＭ、および／または５ｍＭ）を添加した。センサーカートリッジプレートは、約１６時間、３７℃で、非ＣＯ_２インキュベーター内で、浸漬型センサーとともにインキュベートした。ＯＣＲの３つのベースライン測定値をサンプリングした後、ミトコンドリア複合体Ｖ阻害剤オリゴマイシン（１ｍＭ）、プロトノフォアＦＣＣＰ（カルボニルシアニド－４－（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン、酸化的リン酸化脱共役剤）（ニューロンの場合は０．５ｍＭ、ＮＳＣの場合は０．３ｍＭ）、およびアンチマイシンＡ（ニューロンの場合は０．５ｍＭ、ＮＳＣの場合は１ｍＭ）＋ロテノン（ニューロンの場合は０．５ｍＭ、ＮＳＣの場合は１ｍＭ）を順次注射して、ミトコンドリア呼吸を完全に阻害した。したがって、ミトコンドリアの基礎呼吸、最大呼吸、およびＡＴＰ産生は、Ｓｅａｈｏｒｓｅソフトウェアによって自動的に計算および記録された。データを、タンパク質レベルに対して正規化した。

【0093】

ミトコンドリア膜電位：急冷条件下で正に帯電した蛍光プローブであるテトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ^＋）を使用して、皮質および線条体ニューロンにおいてミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ、ΔΨ_ｍ）を評価し、ミトコンドリアにおけるその蓄積を、オリゴマイシン＋ミトコンドリア呼吸脱共役剤ＦＣＣＰによるミトコンドリアの脱分極後に評価した。皮質／線条体の共培養物およびリンパ芽球において、同等のプローブであるテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ^＋）蛍光プローブを使用してＭＭＰを評価し、ミトコンドリアにおけるその蓄積をフローサイトメトリーによって直接評価した。示されている場合、プリドピジン（０．１μＭおよび１μＭ；２４時間）で前に処置した皮質および線条体ニューロンを、Ｎａ^＋培地中の１５０ｎＭ ＴＭＲＭ（急冷条件）とともに３７℃で３０分間インキュベートした。これらの条件下で、ミトコンドリアによるＴＭＲＭの保持は、ＭＭＰ／ΔΨの変化を推定するために研究された。基礎蛍光（５０３ｎｍ励起および５２５ｎｍ発光）が４分間記録された後、２．５μＭ ＦＣＣＰ＋２．５μｇ／ｍＬオリゴマイシンを添加して最大のミトコンドリア脱分極およびミトコンドリアプローブの放出を生じさせた。ＴＭＲＭ放出は、オリゴマイシン／ＦＣＣＰの添加前後の蛍光の違いに基づいて計算された。

【0094】

一次ニューロンまたはリンパ芽球を６ウェルプレートで培養した。実験条件に従って、細胞をプリドピジンおよび過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）の有無にかかわらず前処置し、続いて２５ｎＭのＴＭＲＥメチルエステルとともに３７℃で１５分間インキュベートした。ＴＭＲＥインキュベーション後、ＦＡＣＳ分析のために細胞を収集した。

【0095】

ミトコンドリアのＨ_２Ｏ_２濃度の測定：２４時間、皮質および線条体ニューロンをプリドピジン（０．１μＭおよび１μＭ）で前処置し、Ｎａ^＋培地中でミトコンドリアペルオキシイエロー１（ＭｉｔｏＰＹ１）プローブ（８μＭ）とともに３０分間、３７℃でインキュベートした。ＭｉｔｏＰＹ１を洗い流し、Ｚｅｎ Ｂｌａｃｋ ２０１２ソフトウェアを搭載したＺｅｉｓｓ倒立共焦点スピニングディスク顕微鏡で６３倍レンズを使用して、同じ実験培地中で１分ごとに３０分間ニューロンを画像化した。蛍光は、５０３ｎｍ励起および５２８ｎｍでの増強発光によって記録された（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｒｙａｎ Ｃ，Ｖｉｖｉａｎ Ｓ Ｌｉｎ，ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｊ Ｃｈａｎｇ．２０１３．"Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ ＭｉｔｏＰＹ１ ｆｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ ｉｎ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｏｆ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌｓ．"Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ８（６））。基礎読み取りの１０分後、ニューロンをアンチマイシンＡ（２μＭ）で刺激した。ミトコンドリアにおける特異的なＭｉｔｏＰＹ１蛍光は、細胞をＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ（３００ｎＭ）と共インキュベートすることによって確認された。各時点での蛍光強度は、時系列アナライザープラグイン（ｖ ３．０）を使用してＦＩＪＩで分析した。

【0096】

Ｇｅｌｔｅｘ（登録商標）をコーティングした９６ウェルアッセイプレートに、３７℃で２４時間、ＮＳＣを３０，０００／ウェルで播種した。その後、ＮＳＣを１ｍＭプリドピジンとともにさらに２４時間インキュベートした。取得前に、細胞を洗浄し、３７℃および５％ＣＯ_２で、１０ｍＭ ＭｉｔｏＰＹ１とともに２０分間インキュベートした。ＭｉｔｏＰＹ１蛍光の基礎レベルを１０～１５分間測定した後、ミキソチアゾール（３ｍＭミトコンドリア複合体ＩＩＩ阻害剤）に曝露し、さらに３０分間測定した。結果は、３０，０００個の細胞あたりの相対蛍光単位（ＲＦＵ）として計算された。単離されたミトコンドリアにおいて、Ｈ_２Ｏ_２レベルは、単離されたミトコンドリアの５μｇをホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（０．５単位／ｍＬ）を含むＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ試薬中に再懸濁することにより測定し、５７０ｎｍ励起および５８５ｎｍ発光で蛍光測定した。基礎読み取りの１０分後、ミトコンドリアをアンチマイシンＡ（２μＭ）で攻撃し、さらに１０分間測定した。結果を、蛍光の時間依存性変化として分析した。

【0097】

活性酸素種（ＲＯＳ）アッセイ：ＰＤＬでコーティングしたプレートに付着した一次ニューロンおよびリンパ芽球をＨ_２Ｏ_２（０～１ｍＭ）で最大６時間処置した。細胞を完全培地中の５μＭ ＣｅｌｌＲｏｘ ｒｅｄ試薬で処置した後、３０分間インキュベートした。洗浄後、酸化ストレスは、すべてのサンプルに同じ露出設定を使用して、４０倍の対物レンズを使用してＺｅｉｓｓ倒立顕微鏡で画像化することによって測定した。８つの確率場をサンプリングし、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して蛍光強度を測定した。

【0098】

インビボ研究計画：１．５ヶ月齢のＷＴおよびヘミ接合型Ｙ１２８マウス（雄と雌の割合が等しい）を４つの群に分けた。マウスには、４ヶ月齢まで、４５日間連続して強制経口投与によりプリドピジン（１００μＬ／２５ｇで３０ｍｇ／ｋｇ）または等量の滅菌水を投与した。マウスを、トウモロコシ皮の巣材およびロール紙を加えた（ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｉｎ）ケージごとに４匹の動物を収容し、各ケージは１つの個別の実験を表しており、１つの群は合計９匹の動物で構成された。動物の体重を毎週測定し、それに応じて処置容量を調整した。処置の直前および処置終了の前日に、マウスの行動をロータロッドで試験した。試験は、日中の設定された時間に盲験的に実施した。最後の強制経口投与の２４時間後、マウスを犠牲にし、ミトコンドリアを線条体から単離した。

【0099】

ロータロッド分析：運動学習および協調性をロータロッド装置で評価した。この試験では、マウスが落下しないように、一定の回転ロッド上に置いたときにマウスが走ることを学ぶ必要がある。タスクが学習されると、加速するロータロッドを使用して、運動協調性およびバランスを評価できる。マウスを行動室に２時間順応させた。手順はすべての対象で一貫しており、試験は最小の騒音レベルで行われた。トレーニングは、１４ｒｐｍの固定速度で、１時間間隔で１日４つのトレイル（各１２０秒）で構成された。試験段階は、翌日、加速されたロータロッドで４ｒｐｍから４０ｒｐｍまで５分間かけて実施し、２時間間隔で３回の試行で構成された。ロータロッドスコアは３回の試行の平均である。実験は、遺伝子型および処置について盲検化して実行した。運動協調性スコアは、トレーニング後に測定し、落下までの潜時は５ｒｐｍから４０ｒｐｍまで５分かけて加速されたロータロッドで定量化した。

【0100】

機能性ミトコンドリアの単離：ミトコンドリア単離バッファーで洗浄したマウス脳から線条体を解剖した。線条体ミトコンドリアは、均質化後の不連続パーコール密度勾配遠心分離を使用して単離した。単離したミトコンドリアのタンパク質含有量は、Ｂｉｏ－Ｒａｄアッセイによって定量化した。

【0101】

ミトコンドリア複合体の活性：複合体の活性は、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ法（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して酸素消費率（ＯＣＲ）を測定することによって評価した。ミトコンドリアアッセイ溶液で希釈した５μｇの単離ミトコンドリアを、４５０μＬのポリ（エチレンイミン）でコーティングしたＸＦ２４ Ｓｅａｈｏｒｓｅプレートに播種し、プレートを加湿ＣＯ_２フリーインキュベーター内で３７℃で１０～１２分間平衡化させた。電子伝達鎖を通る連続的な電子の流れを、ロテノン（２μＭ；複合体Ｉ阻害剤）、コハク酸塩（１０ｍＭ；複合体ＩＩ基質）、アンチマイシンＡ（４μＭ；複合体ＩＩＩ阻害剤）、およびアスコルビン酸塩／ＴＭＰＤ（１０ｍＭ／１００μＭ；シトクロムＣ／複合体ＩＶへの電子供与体）の連続注射後、ＯＣＲ測定によって評価した。

【0102】

ミトコンドリアのカルシウムハンドリング：単離されたミトコンドリアによるカルシウム（Ｃａ^２＋）の取り込みは、Ｃａ^２＋感受性プローブであるカルシウムグリーン（Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ）－５Ｎを使用して測定した。簡単に説明すると、５μｇミトコンドリアを１μＭオリゴマイシンおよび１５０ｎＭカルシウムグリーン－５Ｎとともにインキュベートし、分光蛍光光度計のマイクロプレートリーダーで蛍光を測定した（励起５０６ｎｍ、発光５２３ｎｍ）。２分のベースラインの後、１０μＭ ＣａＣｌ２のパルスを４分間隔でミトコンドリアに加えた。ミトコンドリアのＣａ^２＋ハンドリングは、ＣａＣｌ２パルス後の曲線下面積によって計算された。これは、ミトコンドリアによって取り込まれたミトコンドリア外のＣａ^２＋量を示している。

【0103】

ＥＲストレス測定：ＥＲストレスレベルは、ＥＲストレスの初期段階のタンパク質指標としてのＨ２ａ－ＧＦＰを使用して測定できる。Ｈ２ａ－ＧＦＰは誤って折りたたまれた分泌タンパク質であり、ＥＲストレスに応答して蓄積する。ＳＴＨｄｈＱ７／７は、７つのポリグルタミンリピート（野生型）を有するホモ接合型ヒト化ハンチンチン遺伝子（ＨＴＴ）を含むノックイントランスジェニックマウス由来の線条体由来細胞株である。ＳＴＨｄｈＱ７／７細胞を、Ｈｔｔ９６Ｑ－ｍＣｈｅｒｒｙ（変異体、ＨＤ患者におけるＨｔｔの典型的な病原性発現を模倣）またはＨｔｔ２０Ｑ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ＷＴ）コンストラクトのいずれかをトランスフェクトする。蛍光ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質に融合したｐｏｌｙＱ－拡張Ｈｔｔタンパク質（９６Ｑ）エクソン１が発現さえると、個々の細胞のけるタンパク質のレベルおよび凝集が蛍光顕微鏡を使用してモニターされ得る。

【0104】

細胞溶解およびイムノブロッティング：細胞を溶解し、ホスファターゼ阻害剤カクテル２および３と、１０ｍＭ ｂ－グリセロールホスフェートを溶解バッファーに添加して、リン酸化タンパク質を検出するためのホスファターゼを阻害した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびニトロセルロース膜への転写後、膜をブロックし、一次抗体で一晩４℃でイムノブロットし、次に洗浄して二次抗体でブロットした。洗浄後、増強化学発光アッセイを実行し、膜を露出させて定量化した。

【0105】

統計分析：図の説明文に示されている独立した実験または動物の数の平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として結果を表した。複数群間の比較は、クラスカル・ウォリス検定を使用したノンパラメトリック一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって実行した。多重比較の修正は、二元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くテューキー事後検定によって行った。２群間の比較は、ノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定またはパラメトリックなスチューデントｔ検定によって実行した。相互作用項を分析するためにＦ検定を実行した。ｐ＜０．０５で有意性が認められた。すべての分析は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｖｅｒｓｉｏｎ ８．０）を使用して実行した。ミトコンドリアパラメーターは、Ｙ１２８ ＨＤマウス胚から単離した一次ニューロン、ならびにヒトＨＤリンパ芽球および神経幹細胞（ＮＳＣ）を使用してインビトロで評価した。プリドピジンまたはビヒクルで処置したＹ１２８マウスから単離した線条体ミトコンドリアを、エクスビボモデルとして使用した。

【0106】

結果：ミトコンドリア機能に関する洞察は、形態および輸送を研究することによって得ることができる。ミトコンドリアの品質管理には分裂および融合のイベントが必要であるため、ミトコンドリアのアスペクト比（ミトコンドリアに相当する楕円の長軸と短軸との比率）と、シナプス末端での高いエネルギー需要を満たすために必要なミトコンドリアの輸送はいずれも、ミトコンドリア機能の測定値である。ＨＤモデルＹＡＣ１２８（Ｙ１２８）および野生型（ＷＴ）マウスから採取した皮質－線条体一次ニューロンをＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（図１Ａ）で染色し、ミトコンドリアの数（図１Ｂ）および形態（図１Ｃおよび１Ｄ）を評価した。ＨＤニューロンはミトコンドリア形態の障害を示した：年齢を一致させた野生型ニューロンと比較して、円形ミトコンドリアの数の有意な増加（図１Ｃ）および伸長したミトコンドリアの減少が観察された（ｐ＜０．０５）（図１Ｄ）。これらの条件下では、ミトコンドリアの質量に変化がないにもかかわらず、ミトコンドリアの断片化（分裂）が促進され（図１Ｂ）、ミトコンドリア機能の低下を示している。プリドピジン（１μＭ）処置は、円形ミトコンドリアと伸長したミトコンドリアの両方の数を救済した（ｐ＜０．０５）。

【0107】

ＷＴと比較して、Ｙ１２８ ＨＤニューロンにおけるＥＲとのミトコンドリアの不十分な共局在が、ｍｉｔｏＤｓＲｅｄ（ミトコンドリア側）をトランスフェクトされ、両方の細胞小器官を視覚化するための抗ＩＰ_３Ｒ（ＥＲ側）抗体で染色された線条体ニューロンで観察された（図１Ｅ）。プリドピジン（１μＭ）は、Ｙ１２８線条体ニューロンにおけるミトコンドリア－ＥＲの共局在を高度に増加させた（図１Ｅおよび１Ｆ、ｐ＜０．００１）。この結果は、ＡＴＰ産生ならびにミトコンドリアの輸送および速度の増加を説明することができる（図２Ａ～２Ｂで観察）。Ｙ１２８線条体ニューロンからのＭｉｔｏＤｓＲｅｄ標識ミトコンドリアもアスペクト比の低下を示し（ｐ＜０．０５）（図１Ｇ）、以前の結果を裏付けた（図１Ａ～Ｄ）。プリドピジン（１μＭ）で処置すると、断片化されたミトコンドリアの数が減少した（ｐ＜０．０５）（図１Ｅ、１Ｇ）。

【0108】

ミトコンドリアの順行性輸送もＨＤニューロンで大幅に減少し、Ｙ１２８線条体ニューロンにおけるミトコンドリアの約９０％が静止しているように見えた（ｐ＜０．０５）。プリドピジンは静止ミトコンドリアの割合を減らし、順行輸送および逆行輸送の両方を増加させる（ｐ＜０．０５）（図２Ａ、２Ｂ－定量化）。ミトコンドリアの輸送速度も低下し、野生型ニューロンと比較して、Ｙ１２８ニューロンでは半分の速度で移動した（ｐ＜０．０５）。この減少は、プリドピジン処置（１μＭ）後に改善された（ｐ＜０．０５）（図２Ａ、２Ｃ）。

【0109】

Ｙ１２８ニューロンは、基礎呼吸および最大呼吸の低下、ならびにＡＴＰ産生の低下を示した（図３Ａ～３Ｈ）。呼吸の低下は、ＨＤニューロンで実証されるミトコンドリアのダイナミクスおよび形態が障害された結果である可能性がある（図１Ａ～１Ｇおよび２Ａ～２Ｂ）。１μＭおよび５μＭ用量のプリドピジンによる処置は、ＨＤ Ｙ１２８皮質線条体ニューロンにおける基礎呼吸および最大呼吸（ｐ＜０．０１）、ならびにＡＴＰ産生（ｐ＜０．０５）を救済した（図３Ｂ（基礎）、３Ｃ（最大）、３Ｄ（ＡＴＰ産生））。プリドピジン１μＭはまた、ヘテロ接合型ＨＤ患者からのヒトｉＰＳＣ由来神経幹細胞（ＮＳＣ）（ＨＤ－ｉＰＳＣ）における基礎（ｐ＜０．００１）および最大（ｐ＜０．０５）ミトコンドリア呼吸、ならびにＡＴＰ産生を増加させた（図３Ｅ、３Ｆ（基礎）、３Ｇ（最大）、３Ｈ（ＡＴＰ産生））。

【0110】

ミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ、ΔΨ_ｍ）は、直接ＡＴＰ産生に影響を及ぼし、ミトコンドリアのＣａ^２＋シグナル伝達に影響を受ける。Ｙ１２８皮質および線条体ニューロンは、野生型皮質ニューロン（Ｐ＜０．０５）と比較して、オリゴマイシンおよびＦＣＣＰ誘発性ミトコンドリア機能不全の結果としてΔΨ_ｍの低下を示すが、これは、ＴＭＲＭのミトコンドリア保持の減少によって示される（図４Ａ、４Ｂ）。プリドピジン（０．１μＭおよび１μＭ）は、Ｙ１２８皮質ニューロンと線条体ニューロンの両方でΔΨ_ｍを増加させた（皮質ニューロンではｐ＜０．０５、線条体ニューロンでは、０．１μＭプリドピジンでｐ＜０．０５、１μＭプリドピジンでｐ＜０．０１）（図４Ａ～４Ｃ）。

【0111】

ΔΨ_ｍを評価するためのより強力な酸化の刺激として過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を使用した。０．１ｍＭのＨ_２Ｏ_２処置に応答して、顕著な減少が、Ｙ１２８ニューロン（Ｐ＜０．０００１）のΔΨ_ｍで観察される。プリドピジン（５μＭ）で処置し、次いで０．１ｍＭのＨ_２Ｏ_２に６時間曝露したＹ１２８皮質／線条体ニューロンは、Ｈ_２Ｏ_２により誘発されたΔΨ_ｍの完全な回復（ｐ＜０．００１）（図４Ｄ）、および細胞生存率の回復（ｐ＜０．０１）（図４Ｅ）を示した。ＨＤ患者に由来するリンパ芽球では、０．１ｍＭ Ｈ_２Ｏ_２処置によりΔΨ_ｍが５０％減少した。プリドピジン用量（１μＭ、５μＭ、および１０μＭプリドピジン）は全てΔΨ_ｍを増加させた。５μＭ容量は、０．１ｍＭのＨ_２Ｏ_２処置後に最大の保護効果を示した（ｐ＜０．０１）（図４Ｆ）。

【0112】

Ｙ１２８ニューロンおよびＨＤリンパ芽球からＨ_２Ｏ_２へのミトコンドリアの感受性の増加は、これらの細胞が酸化ストレスの増加を示すことを示唆している。これを試験するために、局所Ｈ_２Ｏ_２フラックスを、蛍光プローブＭｉｔｏＰＹ１で測定した。活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を誘発する複合体ＩＩＩ阻害剤アンチマイシンＡ（ＡｎｔＡ）は、皮質（ｐ＜０．０１）および線条体（ｐ＝０．０００１）Ｙ１２８ニューロンのミトコンドリア機能不全を刺激して、ＷＴニューロンと比較してミトコンドリア駆動のＨ_２Ｏ_２レベルを有意に２倍増加させることを示した。皮質ニューロンと線条体ニューロンの両方で、１μＭプリドピジンは、ＡｎｔＡによって促進されたｍｉｔｏ－Ｈ_２Ｏ_２レベルの増加を元に戻した（皮質ニューロンではｐ＜０．０００１、線条体ニューロンでは０．１μＭでｐ＜０．０１、１μＭでｐ＜０．０００１）（図５Ａ～５Ｃ）。

【0113】

別のミトコンドリア複合体ＩＩＩ阻害剤ミキソチアゾール（Ｍｙｘｏ、３μＭ）で処置されたＨＤ－ＮＳＣでは、細胞はｍｉｔｏ－Ｈ_２Ｏ_２レベルの大幅な増加を示した（ｐ＜０．０００１）。プリドピジン（１μＭ）は、複合体ＩＩＩの阻害によって誘発されたＨ_２Ｏ_２レベルの異常な増加を救済した（ｐ＜０．０１）（図５Ｄ）。基礎条件下では、ＨＤリンパ芽球は、対照リンパ芽球と比較した場合にＲＯＳ産生の増加を示した。Ｈ_２Ｏ_２で攻撃した場合、プリドピジン処置は、基礎条件とＨ_２Ｏ_２攻撃条件の両方でＲＯＳレベルを低下させた（ｐ＜０．００１）（図５Ｅ）。したがって、プリドピジンは３つのＨＤ細胞モデルでＲＯＳレベルを低下させた。

【0114】

プリドピジンの神経保護効果をインビボで再現した。１．５ヶ月齢のＷＴおよびＹ１２８マウス（発症前、雄と雌の割合が等しい）を、プリドピジン３０ｍｇ／ｋｇまたは水で４５日間連続して処置した。Ｙ１２８マウスは、ロータロッド性能試験において３ヶ月齢で運動障害を示すため、この試験を処置の前後に適用して、運動レベルに対するプリドピジンの有効性を試験した。１．５ヶ月（前処置）で、Ｙ１２８マウスは野生型マウスと同じ運動協調性を示した（図６Ａ、６Ｂ）。３ヶ月齢で、ビヒクルで処置したＹ１２８マウスは、加速ロータロッド試験中の落下までの潜時の減少によって観察されるように、ビヒクルで処置した野生型マウスと比較して運動障害を示した（ｐ＜０．０５）（図６Ｃ）。逆に、プリドピジンで処置したＨＤマウスは、ビヒクルで処置されたＨＤマウスと比較して、加速ロータロッドにおいて有意な運動能力の改善を示した（ｐ＜０．０５）（図６Ｃ）。行動分析後、機能性ミトコンドリアをすべてのマウス群の線条体から単離し、ロテノン、コハク酸塩、アンチマイシンＡ、アスコルビン酸塩／ＴＭＰＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'－テトラメチルｐ－フェニレンジアミン）（これらは、ミトコンドリア複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶそれぞれの個々の刺激または阻害を誘発する）の連続注射後にＯＣＲを測定することによって、電子伝達鎖を通る連続的な電子の流れを評価することによって、ミトコンドリア複合体の活性を評価して、それらの活性の計算を可能にした（図６Ｄ）。ビヒクルで処置したＹ１２８マウスからの線条体ミトコンドリアは、ビヒクルで処置した野生型マウスと比較して、複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶの活性が高く（ｐ＜０．０１）、初期の代償メカニズムを示唆している（図６Ｄ、６Ｆ）。興味深いことに、Ｙ１２８ ＨＤマウス線条体における複合体活性の増加は、ＡｎｔＡによる複合体ＩＩＩの阻害の前後でミトコンドリアのＨ_２Ｏ_２産生の増加を伴っていた（ｐ＜０．０５）（図６Ｄ、６Ｇ）。これらの結果は、異常な複合体活性が、電子漏出の増加を通じてミトコンドリアのＲＯＳ産生の根底にあり、ＡＴＰ産生の障害につながる可能性があることを示唆している。Ｙ１２８マウスにおけるインビボでのプリドピジン処置は、ミトコンドリア複合体の活性を正規化し、Ｈ_２Ｏ_２レベルをＷＴビヒクル処置マウスのレベルに対して正規化し（ｐ＜０．０５）（図６Ｉ～６Ｋ）、ミトコンドリアのＣａ^２＋緩衝能を増加させた（図６Ｌ、６Ｍ）。

【0115】

ミトコンドリアおよび小胞体（ＥＲ）は、機能的にも物理的にも関連している。ミトコンドリアと小胞体との物理的接触は、高度に特殊化されたＳ１Ｒに富んだ構造であるミトコンドリア関連膜（ＭＡＭ）の部位で発生する。ＭＡＭは、タンパク質、脂質、シグナル伝達分子、および重要なことにＣａ^２＋の交換のための導管として機能する。その結果、ＥＲストレスおよびミトコンドリア機能不全は密接に関連している（Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇｅｒｗｙｎ，Ｂａｓａｎｔ Ｋ．Ｐｕｒｉ，Ｋｅｎ Ｗａｌｄｅｒ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂｅｒｋ，Ｂｒｅｎｄｏｎ Ｓｔｕｂｂｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｍａｅｓ，ａｎｄ Ａｎｄｒｅ Ｆ．Ｃａｒｖａｌｈｏ．"Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ Ｓｔｒｅｓｓ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｏｌｅ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（２０１８）５５：８７６５－８７８７）。

【0116】

プリドピジンがｍＨｔｔ誘発性ＥＲストレスを低減する：変異体Ｈｔｔ９６Ｑ－ｍＣｈｅｒｒｙ（拡張）コンストラクトをトランスフェクトされたＳＴＨｄｈＱ７／７細胞では、ＥＲストレスを示す高レベルの蓄積Ｈ２ａ－ＧＦＰとともに、目に見えるＨｔｔ９６Ｑ－ｍＣｈｅｒｒｙ凝集体（通常は細胞ごとに１つの大きな凝集体）が観察され得る。目に見える凝集体がないＨｔｔ２０Ｑ－ｍＣｈｅｒｒｙ（正常）またはＨｔｔ９６Ｑ－ｍＣｈｅｒｒｙを発現するＳＴＨｄｈＱ７／７細胞は、低レベルのＨ２ａ－ＧＦＰ（ＥＲストレスなし）を示す。プリドピジンは、ｍＨｔｔ凝集体について陽性の細胞におけるＨ２ａ－ＧＦＰの蓄積を用量依存的に有意に減少させ（図７Ａ）、凝集体のない細胞またはＨｔｔ２０Ｑ－ｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞のＨ２ａ－ＧＦＰレベルを変化させない（図７Ｂ）。したがって、プリドピジンは、Ｈｔｔ誘発される小胞体ストレスを用量依存的に減少させる。

【0117】

ｅＩＦ２αのリン酸化はＥＲストレスの特徴である。Ｈｔｔ９６Ｑ－ｍＣｈｅｒｒｙを発現するＳＴＨｄｈＱ７／７細胞では、ｅＩＦ２α－リン酸化（ｅＩＦ２α－ｐ）レベルが、Ｈｔｔ２０Ｑ－ｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞より３．５倍高くなっている。プリドピジン処置は、ｅＩＦ２α－Ｐの有意な減少を引き起こし（総ｅＩＦ２αに対するｅＩＦ２α－Ｐの比率で測定）、細胞のＥＲストレスの減少を示している（図８）。

【0118】

結論として、前臨床結果は、ミトコンドリア機能不全がＨＤの特徴であり、酸化刺激に対する効果的な抗酸化応答を妨げることをインビトロおよびインビボ／エクスビボＨＤモデルで示している。この機能不全は、シナプスの完全性と細胞の生存に影響を及ぼす可能性がある。プリドピジンは、ＨＤヒトモデルとマウスモデルの両方でのＲＯＳレベルの低下、およびミトコンドリア速度の増加、ならびに伸長したミトコンドリアの割合（すべてミトコンドリア機能不全を示している）など、ＨＤモデルにおけるミトコンドリア機能の様々な態様を救済することを示している。したがって、プリドピジンは、ミトコンドリア機能不全の修復に効果的である。プリドピジンの投与はまた、Ｙ１２８マウスにおける最初の運動症状の出現を遅らせ、細胞生存率を高め、酸化的リン酸化の障害を救済した。さらに、インビトロＨＤモデル系では、Ｓ１ＲがＥＲ膜のＭＡＭ（ミトコンドリア関連膜）部位に位置するため、プリドピジンは、ミトコンドリア機能不全に密接に関連するＥＲストレスを軽減する。これらの高度に特殊化された部位は、ミトコンドリア分裂、Ｃａ^２＋シャトリング、および酸化ストレスなど、ミトコンドリア機能において重要な役割を果たしている。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図3H】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図6G】

【図6H】

【図6I】

【図6J】

【図6K】

【図6L】

【図6M】

【図7A】

【図7B】

【図8】