特許 7296588 ミツアリア属に属する菌株及び該菌株を用いた微生物農薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-06-15

(45)【発行日】2023-06-23

(54)【発明の名称】ミツアリア属に属する菌株及び該菌株を用いた微生物農薬

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20230616BHJP

   A01P 3/00 20060101ALI20230616BHJP

   A01P 21/00 20060101ALI20230616BHJP

   A01N 63/20 20200101ALI20230616BHJP

   A01G 7/06 20060101ALI20230616BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 E

C12N1/20 A

A01P3/00

A01P21/00

A01N63/20

A01G7/06 A

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2019511208

(86)(22)【出願日】2018-03-30

(86)【国際出願番号】 JP2018013857

(87)【国際公開番号】W WO2018186307

(87)【国際公開日】2018-10-11

【審査請求日】2021-03-16

(31)【優先権主張番号】P 2017074841

(32)【優先日】2017-04-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【微生物の受託番号】NPMD  NITE BP-02445

(73)【特許権者】

【識別番号】504139662

【氏名又は名称】国立大学法人東海国立大学機構

(73)【特許権者】

【識別番号】000000169

【氏名又は名称】クミアイ化学工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100097825

【弁理士】

【氏名又は名称】松本 久紀

(72)【発明者】

【氏名】清水 将文

(72)【発明者】

【氏名】マレク・カレド・マリアン

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 聡美

(72)【発明者】

【氏名】尾崎 剛一

【審査官】新留 豊

(56)【参考文献】

【文献】SOMEYA, N. et al.，Diversity of Culturable Chitinolytic Bacteria from Rhizospheres of Agronomic Plants in Japan，Microbes Environ.，2011年，Vol. 26, No. 1，pp. 7-14，Ａｂｓｔｒａｃｔ欄、表１

【文献】BENITEZ, M. S. and GARDENER, B. B. M.，Linking Sequence to Function in Soil Bacteria: Sequence-Directed Isolation of Novel Bacteria Contributing to Soilborne Plant Disease Suppression，Applied and Environmental Microbiology，2009年，Vol. 75, No. 4，pp. 915-924，Ａｂｓｔｒａｃｔ欄、図１

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／２０－７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ミツアリア・キトサンニタビダ（Ｍｉｔｓｕａｒｉａ ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ）ＴＷＲ１１４菌株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０２４４５）。

【請求項2】

請求項１に記載の菌株の生菌体又は該生菌体を含む培養物を有効成分として含有することを特徴とする、細菌性植物病害防除剤。

【請求項3】

野菜類青枯病防除剤及び／又はかいよう病防除剤である、請求項２に記載の剤。

【請求項4】

ナス科植物の防除剤である、請求項２又は３に記載の剤。

【請求項5】

請求項１に記載の菌株の生菌体又は該生菌体を含む培養物を、植物体及び／又は土壌に接触させるステップを含んでなる、細菌性植物病害防除方法。

【請求項6】

野菜類青枯病及び／又はかいよう病を防除することを特徴とする、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

ナス科植物の病害を防除することを特徴とする、請求項５又は６に記載の方法。

【請求項8】

請求項１に記載の菌株の生菌体又は該生菌体を含む培養物を有効成分として含有することを特徴とする、植物成長調節剤。

【請求項9】

野菜類種子発芽促進剤及び／又は野菜類成長促進剤である、請求項８に記載の剤。

【請求項10】

請求項１に記載の菌株の生菌体又は該生菌体を含む培養物を、植物体及び／又は土壌に接触させるステップを含んでなる、植物成長調節方法。

【請求項11】

野菜類種子発芽促進及び／又は野菜類成長促進をすることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ミツアリア（Ｍｉｔｓｕａｒｉａ）属細菌菌株、及び、該菌株等を用いた細菌性植物病害防除剤、植物成長調節剤などに関する。

【背景技術】

【0002】

病原性細菌による農作物病害（植物病害）の防除は、全世界の農業関係者にとって非常に重要な課題であり、これには耕種的防除や殺菌消毒剤の使用などの対応がなされている。しかし、細菌性植物病害の中には、このような耕種的防除や殺菌消毒剤等を用いても防除が困難であるものが存在する。

【0003】

例えば、野菜類青枯病は、土壌中に生息する細菌であるラルストニア・ソラナセラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）によって引き起こされる土壌伝染性病害であり、トマト、ナス、ピーマン、バレイショ等では、この青枯病菌に感染すると、植物全体が急速に萎凋し、最後には枯死するため、作物の生産性に大きく影響する。また、本菌は熱帯、亜熱帯、温帯地域を中心に世界各地に分布し、上記のナス科植物を中心に２００種以上の作物が感染して被害を受けることから、青枯病は農業場面における深刻かつ重要な問題の一つである。

【0004】

そして、これまでに多くの青枯病防除方法が考案されており、例えば化学農薬の使用や太陽光消毒、還元消毒などの土壌消毒、抵抗性台木の品種育成等が行われているが、土壌消毒等によって土壌表面の菌が殺菌されても、青枯病菌は土壌深部（５０ｃｍ～１ｍ位）までにおいて長期間生存可能であるため、このような深さまで届く土壌殺菌剤等が存在しないこともあり、完全に土壌中から本菌を排除することは困難である。また、抵抗性品種については抵抗性が完全ではなく、環境条件によっては効果が不十分なことがある。更に、青枯病抵抗性誘導剤（特許文献１）などの提案もされているが、これも十分な効果を奏するものではない。

【0005】

そのため、近年では病原体が土壌に存在している条件下で、拮抗的な作用で植物体の発病を抑制する防除方法として生物農薬を用いる方法が提案されている。青枯病菌についても、これまでにシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ラルストニア属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、ピシウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属の各菌株を用いた微生物農薬による防除が検討されているが（例えば、アシネトバクター ＧＥＢＴ３４９菌株を用いたものについて非特許文献１）、これらの生物農薬でも防除効果が十分ではない。また、複数の微生物を含む堆肥投入により青枯病を防除する試みもされているが、その有効性は明らかではなく、防除に失敗する例も多い。更に、これらの方法は土壌、根圏及び植物体内で拮抗菌が定着する必要があるが、非常に多様な条件下である土壌では常時安定した効果を示すことが困難な場合が多く、また、植物体内で病原性を示さない菌株の定着及び増殖自体が困難であることも多く、生物農薬を用いた防除方法が確立できない要因のひとつになっている。

【0006】

一方、かいよう病は、トマトやウメ、キウイフルーツ、カンキツ類などに感染し、これも最終的には植物体を枯死させる細菌性植物病害である。これもまた、クラビバクター・ミシガネンシス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）などの細菌によって引き起こされる土壌伝染性病害であり、病原菌は土壌中で３年以上生存することが可能とも言われており、青枯病と同様に防除が極めて困難な病害であると言える。

【0007】

このような技術背景において、当業界では、十分な基本活性を有するだけではなく、植物体内で病原性を示すことなく、土壌や植物体などで定着し且つ増殖可能な微生物を用いた、青枯病やかいよう病などのような従来防除が困難であった細菌性植物病害にも十分な（実用的且つ安定的な）防除効果を発揮し、且つ、農薬として安全に使用可能である細菌性病害防除剤等の開発及び商品化が強く望まれていた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【文献】特開２０１２－２１１１２４号公報

【非特許文献】

【0009】

【文献】日本植物病理学会報，Ｖｏｌ．８２（２０１６），Ｎｏ．３，ｐ．２４６

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明は、実際の作物生産現場において安定的な細菌性植物病害防除効果を発揮する、生物農薬として安全に使用可能な植物非病原性の菌株、及び、当該菌株を用いた細菌性植物病害防除剤等を提供する目的でなされたものである。

【課題を解決するための手段】

【0011】

上記目的達成のため、本発明者らは鋭意研究の結果、従来の知見では細菌性植物病害の防除作用が知られていなかったミツアリア属に属する菌株が細菌性植物病害の防除等に実用的な効果を発揮することを見出し、且つ、実際の作物生産現場でも安全に使用することができることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0012】

すなわち、本発明の実施形態は次のとおりである。
（１）細菌性植物病害防除作用を有するミツアリア属に属する菌株。
（２）ミツアリア・キトサンニタビダ（Ｍｉｔｓｕａｒｉａ ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ）に属する菌株である、（１）に記載の菌株。
（３）ミツアリア・キトサンニタビダ ＴＷＲ１１４菌株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０２４４５）。
（４）（１）～（３）のいずれか１つに記載の菌株の生菌体又は該生菌体を含む培養物を有効成分として含有することを特徴とする、細菌性植物病害防除剤。
（５）野菜類青枯病防除剤及び／又はかいよう病防除剤（例えば、野菜類かいよう病防除剤）である、（４）に記載の剤。
（６）ナス科植物の防除剤である、（４）又は（５）に記載の剤。
（７）（１）～（３）のいずれか１つに記載の菌株の生菌体又は該生菌体を含む培養物を、植物体及び／又は土壌（特に根圏土壌）に接触させるステップを含んでなる、細菌性植物病害防除方法。
（８）野菜類青枯病及び／又はかいよう病（例えば、野菜類かいよう病）を防除することを特徴とする、（７）に記載の方法。
（９）ナス科植物の病害を防除することを特徴とする、（７）又は（８）に記載の方法。
（１０）（１）～（３）のいずれか１つに記載の菌株の生菌体又は該生菌体を含む培養物を有効成分として含有することを特徴とする、植物成長調節剤。
（１１）野菜類種子発芽促進剤及び／又は野菜類成長促進剤である、（１０）に記載の剤。
（１２）（１）～（３）のいずれか１つに記載の菌株の生菌体又は該生菌体を含む培養物を、植物体及び／又は土壌（特に根圏土壌）に接触させるステップを含んでなる、植物成長調節方法。
（１３）野菜類種子発芽促進及び／又は野菜類成長促進をすることを特徴とする、（１２）に記載の方法。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、青枯病やかいよう病などの従来防除が困難であった細菌性植物病害防除にも顕著な効果（実用的且つ安定的効果）を示し、且つ、実際の作物生産現場で安全に使用できる細菌性植物病害防除剤等を提供することができる。更に、副次的なものとして、植物成長調節剤等の提供も可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】実施例１のトマト青枯病防除効果確認試験における、トマト青枯病菌接種１４日後のトマト株撮影写真を示す（図面代用写真）。左側の５株が無処理区（Ｃｏｎｔｒｏｌ）であり、右側の５株がＴＷＲ１１４菌株処理区（ＴＷＲ１１４）である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

まず、本発明では、細菌性植物病害防除剤等の有効成分として、ミツアリア（Ｍｉｔｓｕａｒｉａ）属に属する菌株、例えばミツアリア・キトサンニタビダ（Ｍｉｔｓｕａｒｉａ ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ）に属する菌株などを使用する。なお、本発明において「細菌性植物病害」とは、病原体が細菌である植物病による有用植物の被害を意味し、糸状菌やウイルスなどが病原体の植物病による被害は包含されない。このミツアリア属菌は、従来の知見では細菌性植物病害防除作用が全く知られていなかった属であり、且つ、植物病原性を有する種は知られていない。

【0016】

特に、岐阜県岐阜市柳戸１－１（岐阜大学構内）のネギ根圏土壌より単離された菌株であって、細菌学的性質及び１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のゲノムシークエンスによる系統解析で同定したところ、植物非病原性であり且つミツアリア・キトサンニタビダに属する新菌株であることが明らかとなったＴＷＲ１１４菌株、あるいは当該菌株の変異株であって当該菌株と同等の性質を保持するものを使用するのがより好ましい。なお、ＡＰＩ２０ＮＥのキット（シスメックス・ビオメリュー株式会社製品）を用いて行った試験から、このＴＷＲ１１４菌株は以下に示すような細菌学的性質を有することが明らかとなっている。

【0017】

（Ａ）形態学的性質
形態：桿菌
大きさ：幅０．９～１．９μｍ、長さ０．９～３．０μｍ
運動性：＋
（Ｂ）培養的性質
コロニーの色：ベージュ色～薄いピンク色
ブイヨン寒天平板培養：ベージュ色～薄いピンク色のコロニーを形成し、表面は光沢がある。
（Ｃ）生理学的性質
グラム染色性：－
硝酸塩の還元：＋
インドール生成（トリプトファン）：－
グルコース発酵：－
アルギニンジヒドロラーゼ：－
ウレアーゼ：－
加水分解（β－グルコシダーゼ）：－
加水分解（プロテアーゼ）：＋
最適生育ｐＨ：中性域
最適生育温度：３０～３５℃
同化（グルコース）：＋
同化（アラビノース）：＋
同化（マンノース）：＋
同化（マンニトール）：－
同化（Ｎ－アセチル－グルコサミン）：＋
同化（マルトース）：＋
同化（グルコン酸カリウム）：＋
同化（カプリン酸）：－
同化（アジピン酸）：－
同化（リンゴ酸塩）：＋
同化（クエン酸三ナトリウム）：－
同化（酢酸フェニル）：－

【0018】

このＴＷＲ１１４菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構・特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に２０１７年（平成２９年）３月１７日付けで国内寄託された後、２０１８年（平成３０年）１月２２日付けで国際寄託への移管請求が受領されたものであって、その国際寄託番号はＮＩＴＥ ＢＰ－０２４４５である。

【0019】

ミツアリア属に属する菌株の培養に使用することのできる培地は、当該菌株が増殖し得るものであれば任意のものでよい。例えば、ブイヨン培地など一般的な培地の他、グルコース、ペプトン、イーストエキスを含む培地などが挙げられる。また、液体培地以外に、寒天入りの斜面培地及び平板培地等の固体培地を用いてもよい。

【0020】

培地の炭素源としては、ミツアリア属に属する菌株が同化しうるあらゆるものが利用可能である。具体的には、グルコース、アラビノース、マンノース、澱粉加水分解物、糖蜜など、ミツアリア属に属する菌株が利用し得る各種の合成又は天然炭素源をあげることができる。また、培地の窒素源としては、同様に、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆粕などの有機窒素含有物をはじめ、該菌株が利用し得る各種の合成又は天然物が利用可能である。更に、微生物培養の常法に従って、食塩、リン酸塩などの無機塩類、カルシウム、マグネシウム、鉄などの金属の塩類、ビタミン、アミノ酸、核酸関連物質などの微量栄養源も必要に応じて添加することができる。さらには、必要に応じて消泡剤等の種々の添加剤を添加することもできる。

【0021】

そして、ミツアリア属に属する菌株の培養は、振盪培養法、通気培養法などの好気的条件下で行うことができる。培養条件は、これに限定されるものではないが、温度は２０～４０℃、好ましくは３０～３５℃、ｐＨは５～８、好ましくは６～７、培養期間は１～４日、好ましくは２～３日とするのがよい。

【0022】

以上のようにして培養したミツアリア属に属する菌株は、菌体を分離することなく生菌体を含む培養物の状態で細菌性植物病害防除剤等の有効成分として使用することができる。また、上記培養物から、通常の方法、例えば膜分離又は遠心分離等の処理によって生菌体を分離し、必要に応じて洗浄した、培養分離菌体自体又はその処理物（培養分離菌体と他成分の混合物など）を有効成分として使用することもできる。更には、上記培養物又は分離した生菌体を凍結乾燥、スプレードライ等の方法によって乾燥した乾燥物や、これらの液体や固体による希釈物等の状態でも使用することもできる。また、農薬製剤の慣用的な方法等に従って各種の添加物と共に各種の剤型に製剤化した状態で用いることもできる。かかる剤型としては、例えば粒剤、乳剤、水和剤、フロアブル剤等が挙げられる。

【0023】

本発明に係る細菌性植物病害防除剤等に含まれる生菌体の濃度は、所望の効果を発揮する限り特に制限されないが、あまり菌濃度が少ないと十分な結果が得られず、逆にあまり菌濃度を多くしても菌が無駄になることがあるので、例えば、液剤として調製して使用する場合、１×１０^５～１×１０^１０ｃｆｕ／ｍｌの範囲で適宜調整することができ、望ましくは１×１０^６～１×１０^９ｃｆｕ／ｍｌの範囲が好適である。ここで、本発明において「ｃｆｕ」とはコロニーフォーミングユニット（Ｃｏｌｏｎｙ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ）を意味する。なお、培養物を使用する場合でも、上記生菌体濃度に準じて適宜設計すればよい。

【0024】

本発明は、例えば植物病原性のラルストニア・ソラナセラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）に属する細菌を病原体とするナス科植物（ナス、トマト、ピーマン、パプリカ、バレイショ（ジャガイモ）などのナス科野菜類）、ウリ科植物（キュウリ、ゴーヤなどのウリ科野菜類）等の青枯病や、クラビバクター・ミシガネンシス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）やシュードモナス・シリンガ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）、キサントモナス・シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉ）などの細菌を病原体とするトマト、ウメ、キウイフルーツ、カンキツ類（オレンジ類、グレープフルーツ類、みかん類、香酸柑橘類など）等のかいよう病などの、各種細菌性植物病害対して広く好適な防除効果を発揮する。特に、ナス科野菜類（ナス科作物）の青枯病やトマトかいよう病に対して非常に効果的であることが特徴である。
なお、本発明において「防除」とは、農作物（植物）が対象とする細菌性植物病害菌に感染すること等を防止することにより、当該植物病害等を回避することを意味する。

【0025】

さらに本発明は、例えばナス科作物やアブラナ科作物（ハクサイ、キャベツ、ダイコン、カブ、ブロッコリー、カリフラワー、チンゲンサイ、コマツナ、ミズナなど）等の種子の発芽促進作用や根、茎、葉の成長促進作用などの植物成長調節効果をも発揮し、植物成長調節剤としての使用も可能である。

【0026】

本発明に係る植物病害防除剤等は、そのまま直接施用するか、あるいは水などで希釈して施用することができる。薬剤としての施用方法は、特に限定されず、例えば、直接作物や種子に散布や浸漬等で付着させる方法、土壌に散布する方法、作物や土壌に添加する水や肥料に添加する方法、農機具に処理する方法などが挙げられる。この中で、土壌に添加する水に薬剤を添加する方法及び農機具に処理する方法がより好適である。このように、根、茎、葉、種子などの植物体上、あるいはその栽培土壌中に本発明に係る細菌性植物病害防除剤等を存在させることで、各種の細菌性植物病害を抑止し、また植物の成長を調節する。

【0027】

本発明の薬剤施用量は、適用作物、対象病害、施用方法、発生傾向、被害の程度、環境条件、使用する剤型などによって異なるため、適宜調整されることが好ましく一概には規定できないが、例えば、作物１株あたり液剤を１ｍｌ～１０Ｌ、好ましくは２ｍｌ～３Ｌ、更に好ましくは２．５ｍｌ～１Ｌ処理する方法などを例示することができる。また、施用時期は、これも対象病害や剤型等により異なるが、種子段階での効果を所望する場合には播種前及び／又は播種後に、成長段階での効果を所望する場合には定植前及び／又は定植後４週間程度までの間に適宜処理するのが好ましい。さらには、本発明は耐性菌出現の懸念がない微生物農薬であるため、数日間の連続使用や連作での連用も可能である。

【0028】

さらに、本発明に係る細菌性植物病害防除剤等は、必要に応じて、無機銅化合物、例えば塩基性硫酸銅、無水硫酸銅、水酸化第二銅、塩基性塩化銅等、有機銅化合物、例えば有機銅、ノニルフェノールスルホン酸銅等、無機硫黄化合物、例えば硫黄、全硫化態硫黄等、有機硫黄化合物、例えばジネブ、マンネブ、プロピネブ、チアジアジン、チウラム、ポリカーバメート等、アニリノピリミジン系化合物、例えばシプロジニル、ピリメタニル、メパニピリム等、フェニルピロール系化合物、例えばフルジオキソニル等、有機塩素系化合物、例えばクロロタロニル、キャプタン、トリアジン、フルアジナム、スルフェン酸、フサライド等、炭酸水素塩剤、例えば炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等、有機リン系化合物、例えばＥＤＤＰ、ホセチル、トルクロホスメチル、ＩＢＰ等、ベンズイミダゾール系化合物、例えばカルベンダジム、チオファネートメチル、チアベンダゾール、ベノミル、フベリダゾール等、ジカルボキシイミド系化合物、例えばイプロジオン、プロシミドン、ビンクロゾリン等、アゾール系化合物、例えばフェンブコナゾール、シメコナゾール、ジクロブトラゾール、トリチコナゾール、イプコナゾール、フルコナゾール、ミクロブタニル、ペンコナゾール、ビテルタノール、ブロムコナゾール、オキスポコナゾール、シプロコナゾール、ジフェノコナゾール、ジニコナゾール、エポキシコナゾール、フェンブコナゾール、フルキンコナゾール、フルシラゾール、フルトリアホール、ヘキサコナゾール、イミベンコナゾール、メトコナゾール、プロピコナゾール、シプコナゾール、テブコナゾール、テトラコナゾール、トリアジメホン、トリアジメノール等、イミダゾール系化合物、例えばトリフルミゾール、プロクロラズ、イマザリル、ペフラゾエート等、ピペラジン系化合物、例えばトリホリン等、モルホリン系化合物、例えばフェンプロピモルフ、トリデモルフ、フェンプロピジン等、ヒドロキシピリミジン系化合物、例えばエチリモル、ジメチリモル等、グアニジン化合物、例えばイミノクタジン酢酸塩、イミノクタジンアルベシル酸塩、グアザチン等、酸アミド系化合物、例えばオキシカルボキシン等、ベンゾアニリド系化合物、例えばメプロニル、ジクロメジン、フルトラニル、ペンシクロン、フラメトピル、チフルザミド等、アシルアラニン系化合物、例えば、オキサジキシル、メタラキシル、メトキシアクリレート系化合物、例えばアゾキシストロビン、クレソキシムメチル、メトミノストロビン、トリフロキシストロビン、ピコキシストロビン、ピラクロストロビン、オリサストロビン等、キノキサリン系化合物、例えばキノメチオネート等、ヒドロキシアニリド系化合物、例えばフェンヘキサミド等、シアノアセトアミド系化合物、例えばシモキサニル等、シアノイミダゾール系化合物、例えばシアゾファミド等、その他ファモキサドン、スピロキサミン、トリアゾキシド、ピラゾホス、フルオルイミド、ジメトモルフ、イプロバリカルブ、フェナミドン、エタボキサム、シフルフェナミド、ジチアノン、カルプロパミド、プロベナゾール、メタスルホカルブ、ピロキロン、ヒドロキシイソキサゾール、トリシクラゾール、ジフルメトリム、フェナジンキシド、イソプロチオラン、オキソリニック酸、アシベンゾラル－Ｓ－メチル、キノキシフェン、ベンチアバリカルブイソプロピル、チアジニルから選択される１種又は２種以上の化学農薬を併用することもできる。この場合、有効成分である菌株に大きな影響を与えない条件で混合剤化して施用しても良く、また、別々に時間をおいて、あるいは両者を同時に施用しても良い。

【0029】

このようにして、ミツアリア属細菌菌株、例えばミツアリア・キトサンニタビダ ＴＷＲ１１４菌株等の生菌体又は該生菌体を含む培養物を有効成分とすることで、野菜類青枯病、かいよう病などの細菌性植物病害防除にも顕著な効果を示し、また、植物成長調節効果も発揮する、実際の作物生産現場でも安全に使用できる薬剤を提供することができる。

【0030】

以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではなく、本発明の技術的思想内においてこれらの様々な変形が可能である。

【実施例1】

【0031】

（トマト青枯病防除効果確認試験１）
トマト（品種：ポンテローザ）を、育苗培土を充填した直径９ｃｍのビニールポット（底層に育苗培土１５０ｇ、中層に川砂２０ｇ、上層に育苗培土１５０ｇ）で４複葉期まで生育させた。そして、ミツアリア・キトサンニタビダ ＴＷＲ１１４菌株懸濁液３０ｍｌを７０ｍｌの滅菌水と混合した後、ビニールポットに底面給水によって処理し、３０℃の温室で３日間保管した。その後、トマト青枯病菌懸濁液１００ｍｌを同じ底面給水処理により接種した。比較として、トマト青枯病菌懸濁液のみを底面給水処理したもの（無処理区）も実施した。なお、ＴＷＲ１１４菌株懸濁液は、ＮＢ培地（肉エキス０．５％、ペプトン１．５％、塩化ナトリウム０．５％、リン酸一水素カリウム０．５％、ｐＨ７．０）で２７℃、１２０ｒｐｍ、４８時間振盪培養後に遠心集菌（５０００×ｇ、１５分）し、これを滅菌水で懸濁した操作を２回したものを使用し、６００ｎｍ吸光度（ＯＤ６００）が１．０（３×１０^９ｃｆｕ／ｍｌ）となるように調製した。また、トマト青枯病菌懸濁液は、ＣＰＧ培地で２４時間振とう培養後に遠心集菌したものをＭｇＣｌ_２（１０ｍＭ）で希釈し、６００ｎｍ吸光度（ＯＤ６００）が１．０（約１×１０^９ｃｆｕ／ｍｌ）となるように調製して使用した。

【0032】

そして、これらの処理をした各１０株について、トマト青枯病菌接種７日後にトマト青枯病の発病ポット数を調査し、発病株率を算出した。また、トマト青枯病菌接種１４日後に、各５株について目視確認及び写真撮影を行った。

【0033】

この試験結果を下記表１（発病株率）及び図１（撮影写真）に示した。無処理区は全ての株がトマト青枯病を発病したのに対して、ＴＷＲ１１４菌株処理区は発病株率が大きく低下しており、目視でも明らかにトマト青枯病発病が抑制されていることが確認でき、当該菌株がトマト青枯病に対して高い防除効果を発揮することが示された。

【0034】

【表1】

【実施例2】

【0035】

（トマト青枯病防除効果確認試験２）
トマト（品種：ポンテローザ）を、園芸培土を充填したポット（９ｃｍ×９ｃｍ）で４複葉期まで生育させた。そして、ＴＷＲ１１４菌株懸濁液３０ｍｌを灌注処理し、３０℃の温室で４日間保管した。その後、トマト青枯病菌懸濁液５０ｍｌを同じ灌注処理により接種した。比較として、トマト青枯病菌懸濁液のみを灌注処理したもの（無処理区）及び非特許文献１に記載のアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）ＧＥＢＴ３４９菌株懸濁液１０ｍｌを茎葉散布処理したもの（対照区）も実施した。なお、ＴＷＲ１１４菌株懸濁液及びＧＥＢＴ３４９菌株懸濁液は、当該菌株をそれぞれＮＢ培地（肉エキス０．５％、ペプトン１．５％、塩化ナトリウム０．５％、リン酸一水素カリウム０．５％、ｐＨ７．０）で２７℃、１２０ｒｐｍ、４８時間振盪培養後に遠心集菌（５０００×ｇ、１５分）し、これを滅菌水で懸濁した操作を２回したものを使用し、いずれも６００ｎｍ吸光度（ＯＤ６００）が１．０（３×１０^９ｃｆｕ／ｍｌ）となるように調製した。また、トマト青枯病菌懸濁液は、ＹＰ培地で２４時間振とう培養後に遠心集菌したものを蒸留水で１００倍に希釈して使用した。

【0036】

そして、これらの処理をした各３株について、トマト青枯病菌接種１０日後にトマト青枯病の発病程度を以下の基準で指数調査し、発病度及び防除価を算出した。

【0037】

＜発病指数＞
０：発病なし
１：一部の小葉が萎凋
２：半数未満の複葉が萎凋
３：半数以上の複葉が萎凋
４：枯死
＜発病度及び防除価＞
発病度＝Σ（発病指数×該当株数）／（調査株数×４）×１００
防除価＝１００－（処理区の発病度／無処理区の発病度）×１００

【0038】

この試験結果を下記表２に示した。無処理区の発病度が５８．３であり、対照区の発病度が４１．７、防除価２８．６であるのに対し、ＴＷＲ１１４菌株処理区は非常に低い発病度（８．３）及び高い防除価（８５．７）を示し、当該菌株がトマト青枯病に対して対照区と比較しても非常に高い防除効果を発揮することが示された。

【0039】

【表2】

【実施例3】

【0040】

（バレイショ青枯病防除効果確認試験）
バレイショ（品種：デジマ）を、園芸培土を充填した直径９ｃｍのビニールポットで４複葉期まで生育させた。そして、ＴＷＲ１１４菌株懸濁液３０ｍｌをビニールポットに灌注処理し、３０℃の温室で４日間保管した。その後、バレイショ青枯病菌懸濁液５０ｍｌを同じ灌注処理により接種した。比較として、バレイショ青枯病菌懸濁液のみを灌注処理したもの（無処理区）及びアシネトバクター ＧＥＢＴ３４９菌株懸濁液１０ｍｌを茎葉散布処理したもの（対照区）も実施した。なお、ＴＷＲ１１４菌株懸濁液及びＧＥＢＴ３４９菌株懸濁液は、当該菌株をそれぞれＮＢ培地（肉エキス０．５％、ペプトン１．５％、塩化ナトリウム０．５％、リン酸一水素カリウム０．５％、ｐＨ７．０）で３０℃、１２０ｒｐｍ、２４時間振盪培養後に遠心集菌（５０００×ｇ、１０分）し、これを滅菌水で懸濁した操作を２回したものを使用し、いずれも６００ｎｍ吸光度（ＯＤ６００）が１．０（３×１０^９ｃｆｕ／ｍｌ）となるように調製した。また、バレイショ青枯病菌懸濁液は、ＹＰ培地で２４時間振とう培養したものを蒸留水で１００倍に希釈して使用した。

【0041】

そして、これらの処理をした各３株について、バレイショ青枯病菌接種１４日後にバレイショ青枯病の発病程度を以下の基準で指数調査し、発病度及び防除価を算出した。

【0042】

＜発病指数＞
０：発病なし
１：一部の小葉が萎凋
２：半数未満の複葉が萎凋
３：半数以上の複葉が萎凋
４：枯死
＜発病度及び防除価＞
発病度＝Σ（発病指数×該当株数）／（調査株数×４）×１００
防除価＝１００－（処理区の発病度／無処理区の発病度）×１００

【0043】

この試験結果を下記表３に示した。無処理区の発病度が５０であり、対照区が無処理区よりも高い発病度（７５．０）であるのに対し、ＴＷＲ１１４菌株処理区は発病度１６．７、防除価６６．７であり、バレイショ青枯病に対しても非常に優れた防除効果を示した。

【0044】

【表3】

【実施例4】

【0045】

（トマトかいよう病防除効果確認試験）
トマト（品種：桃太郎エイト）を、実施例１と同様に育苗培土を充填した直径９ｃｍのビニールポットで４複葉期まで生育させた。そして、トマトかいよう病菌懸濁液をハサミに霧吹きで１回噴霧後、ＴＷＲ１１４菌株懸濁液をハサミの両面に各１回噴霧した。その後ハサミでトマト第１本葉を葉柄の付け根から切除し、２８℃のガラス温室で１ヵ月栽培した。比較として、トマトかいよう病菌懸濁液のみをハサミに噴霧して切除処理したもの（無処理区）も実施した。なお、ＴＷＲ１１４菌株懸濁液は、実施例１と同様の方法で調製し、また、トマトかいよう病菌懸濁液は、ＰＳＢ培地で４日間振とう培養後に遠心集菌したものを滅菌水に懸濁し、約６×１０^８ｃｆｕ／ｍｌに調製して使用した。

【0046】

そして、これらの処理をした各株について、トマトかいよう病菌接種２８日後に各複葉の発病程度を以下の基準で指数調査し、発病度及び防除価を以下の式から算出した。

【0047】

＜発病指数＞
０：無病徴
１：複葉の一部に壊死・萎凋症状あり
２：複葉の大部分が壊死・萎凋
＜発病度及び防除価＞
発病度（％）＝｛Σ（発病指数×複葉数）／全複葉数×２｝×１００
防除価＝｛１－（処理区の発病度／無処理区の発病度）｝×１００

【0048】

この試験結果を下記表４に示した。無処理区は発病度が９１．４であったのに対して、ＴＷＲ１１４菌株は無処理区と比較して発病度が大きく低下しており（４６．６）且つ高い防除価を示し（４９．０）、当該菌株がトマトかいよう病に対しても優れた防除効果を発揮することが示された。

【0049】

【表4】

【実施例5】

【0050】

（トマト種子発芽促進効果確認試験）
直径６０ｍｍのシャーレ２枚にそれぞれ濾紙を敷き、各６０粒のトマト種子（品種：ポンテローザ）を濾紙上に播種した。更に、ＴＷＲ１１４菌株懸濁液又は水道水を２ｍｌ添加し、夜間２０℃、日中２５℃の恒温器内に静置した。なお、ＴＷＲ１１４菌株懸濁液は、ＮＢ培地で２７℃、１２０ｒｐｍ、６日間振盪培養後に遠心集菌（５０００×ｇ、１５分）し、これを滅菌水で懸濁した操作を２回したものを使用し、６００ｎｍ吸光度（ＯＤ６００）が１．０となるように調製した。

【0051】

そして、これらについて播種６日後に各種子の発芽状態を目視観察し、発芽率を算出した。

【0052】

この試験結果を下記表５に示した。無処理区である水道水添加区が発芽率６５．０％であるのに対し、ＴＷＲ１１４菌株処理区は無処理区と比較して発芽率が大きく向上しており（８５．０％）、当該菌株がトマト種子発芽促進効果を発揮することが示された。

【0053】

【表5】

【実施例6】

【0054】

（トマト成長促進効果確認試験）
直径９ｃｍのビニールポットに滅菌土壌（育苗培土：川砂：バーミキュライト＝１：１：１）を充填し、ここでトマト（品種：ポンテローザ）を４複葉期まで生育させた。そして、ＴＷＲ１１４菌株懸濁液３０ｍｌを滅菌水７０ｍｌと混合した後、ビニールポットに底面給水により処理し、３０℃の温室で２８日間保管した。その間、適宜底面給水を行った。比較として、底面給水処理のみしたもの（無処理区）も実施した。なお、ＴＷＲ１１４菌株懸濁液は、実施例１と同様の方法により調製した。

【0055】

そして、これらについて処理２７日後に茎葉部と根部の新鮮重を測定した。

【0056】

この試験結果を下記表６に示した。この結果から、ＴＷＲ１１４菌株処理によりトマト根部の生育が促進されることが示された。

【0057】

【表6】

【実施例7】

【0058】

（キャベツ種子発芽促進効果確認試験）
直径６０ｍｍのシャーレ２枚にそれぞれ濾紙を敷き、水道水を１ｍｌ添加した後、各３０粒のキャベツ種子（品種：四季獲）を濾紙上に播種した。更に、ＴＷＲ１１４菌株懸濁液、又は水道水を１ｍｌ添加し、夜間２０℃、日中２５℃の恒温器内に静置した。なお、ＴＷＲ１１４菌株懸濁液は、ＮＢ培地で２７℃、１２０ｒｐｍ、６日間振盪培養後に遠心集菌（５０００×ｇ、１５分）し、これを滅菌水で懸濁した操作を２回したものを使用し、６００ｎｍ吸光度（ＯＤ６００）が０．３２となるように調製した。

【0059】

そして、これらについて播種６日後に各種子の発芽状態を目視観察し、発芽率を算出した。

【0060】

この試験結果を下記表７に示した。水道水添加区が発芽率６３．３％であるのに対し、ＴＷＲ１１４菌株処理区は無処理区と比較して発芽率が向上しており（７３．３％）、当該菌株がキャベツ種子発芽促進効果も発揮することが示された。

【0061】

【表7】

【0062】

以上より、ＴＷＲ１１４菌株生菌での処理により、トマト青枯病、バレイショ青枯病、トマトかいよう病などの実用的防除が可能となり、更に、トマトやキャベツの種子発芽促進、トマトの成長促進なども可能となることが明らかとなった。

【0063】

本発明を要約すれば次のとおりである。

【0064】

本発明は、実際の作物生産現場において安定的な細菌性植物病害防除効果等を発揮する、生物農薬として安全に使用可能な植物非病原性の菌株、及び、当該菌株を用いた細菌性植物病害防除剤等を提供することを目的とする。

【0065】

そして、従来の知見では細菌性植物病害の防除作用が知られていなかったミツアリア属細菌菌株の生菌体又は該生菌体を含む培養物を有効成分とすることで、野菜類青枯病防除剤、かいよう病防除剤などの細菌性植物病害防除剤等を提供できる。

【受託番号】

【0066】

本発明において寄託手続きがなされている微生物の受託番号を下記に示す。
（１）ミツアリア・キトサンニタビダ（Ｍｉｔｓｕａｒｉａ ｃｈｉｔｏｓａｎｉｔａｂｉｄａ）ＴＷＲ１１４菌株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０２４４５）。

【図1】