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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-06-15
(45)【発行日】2023-06-23
(54)【発明の名称】医薬組成物
(51)【国際特許分類】
G01N 33/50 20060101AFI20230616BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20230616BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20230616BHJP
A61K 31/352 20060101ALN20230616BHJP
A61K 31/465 20060101ALN20230616BHJP
A61K 36/752 20060101ALN20230616BHJP
A61K 131/00 20060101ALN20230616BHJP
C07D 401/04 20060101ALN20230616BHJP
C07D 311/30 20060101ALN20230616BHJP
C12Q 1/02 20060101ALN20230616BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALN20230616BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20230616BHJP
【ＦＩ】
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
G01N33/68
A61K31/352
A61K31/465 ZNA
A61K36/752
A61K131:00
C07D401/04 CSP
C07D311/30
C12Q1/02
C12Q1/6851 Z
C12N15/09 Z
【請求項の数】
1
(21)【出願番号】P 2020510057
(86)(22)【出願日】2019-03-25
(86)【国際出願番号】 JP2019012429
(87)【国際公開番号】W WO2019188950
(87)【国際公開日】2019-10-03
【審査請求日】2021-12-01
(31)【優先権主張番号】P 2018058171
(32)【優先日】2018-03-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504157024
【氏名又は名称】国立大学法人東北大学
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】山國 徹
(72)【発明者】
【氏名】川畑 伊知郎
【審査官】鶴見 秀紀
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１３／１９１２３６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Behavioural Brain Research，2011年，Vol.224,No.1， pp.50-57
【文献】Nutrients，2017年，Vol.9,No.9，pp.1-12
【文献】Neurochemical Research，2015年，Vol.40,No.8，pp.1563-1575
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０
Ａ６１Ｋ ３６／００－３６／９０６８
Ｃ０７Ｄ ４０１／０４
Ｃ０７Ｄ ３１１／３０
Ｇ０１Ｎ ３３／５０
Ｇ０１Ｎ ３３／１５
Ｇ０１Ｎ ３３／６８
Ｃ１２Ｎ １５／０９
Ｃ１２Ｑ １／６８５１
Ｃ１２Ｑ １／０２
Ａ６１Ｋ １３１／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験物質を神経細胞と接触させること、被験物質と接触した神経細胞におけるＶ－１タンパク質とアクチンキャッピングタンパク質との複合体のレベル及び／又はＣＯＸ Ｉの発現レベルを決定すること、
決定されたレベル及び／又は発現レベルが、被験物質と接触していない神経細胞におけるＶ－１タンパク質とアクチンキャッピングタンパク質との複合体のレベル及び／又はＣＯＸ Ｉの発現レベルと比べて高いときに、被験物質をミトコンドリアの恒常性維持・強化に有用な候補物質として選択すること、
を含む、ミトコンドリアの恒常性の維持及び／又は強化に有用な候補物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ニコチン、ノビレチン、シネセチン、及びチンピからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、ミトコンドリアの機能不全を伴う中枢神経変性疾患の処置のための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
ＡＴＰの安定的な供給システムであるミトコンドリアの機能維持は、細胞の生存にとって必要不可欠である。従って、多くの真核細胞におけるＡＴＰの安定的供給システムの破綻、すなわちミトコンドリアの機能不全は細胞死の決定的な原因となり得る。例えば、２大中枢神経変性疾患として知られるアルツハイマー病（ＡＤ）とパーキンソン病（ＰＤ）は、発症の一因として神経細胞の細胞死が知られている。
【0003】
ここで、神経細胞は神経軸索や樹状突起などの形態学的構造を維持するためにアクチン細胞骨格が不可欠であり、アクチンの脱重合－重合サイクルのＡＴＰ消費量は、脳の総消費エネルギーの１～５０％に上ると見積もられている（非特許文献１、２）。それ故、脳の神経細胞には、脳におけるＡＴＰの収支バランスが破綻しないようなＡＴＰの安定的な供給システムが内蔵されている可能性がある。
【0004】
一方、Ｖ－１（Ｍｙｏｔｒｏｐｈｉｎとも呼ばれる。）タンパク質は、アンキリンリピートタンパク質であり、ヒトのＶ－１は、１１８アミノ酸からなる。Ｖ－１は、分子内のアンキリンリピートを介してアクチンキャッピングタンパク質（ＣＰ、ＣａｐＺ）に結合する。ＣＰは、アクチンフィラメントの端に結合して、そこを塞ぐことによってアクチンの重合を抑制する。Ｖ－１は、そのアクチンキャッピング活性を阻害し、これによって、アクチン細胞骨格の形成を促進することが知られている（非特許文献３）。
【0005】
しかしながら、Ｖ－１のミトコンドリアに対する機能は、知られていなかった。
【0006】
シネンセチン、ノビレチンは、カンキツ（Citrus）属の果皮に含まれるポリメトキシフラボノイドであり、チンピ（陳皮）は、ウンシュウミカン又はマンダリンオレンジの成熟した果皮である。ノビレチン及びシネンセチンは、抗認知症効果を有することが知られている。また、チンピは、生薬として長く利用されている。しかしながら、いずれのミトコンドリアに対する機能は、知られていなかった。
ニコチンは、主としてタバコ Nicotiana tabacum の葉に含まれるアルカロイドの一種である。喫煙がパーキンソン病の発症リスクを減少させるというシステマティックレビューが知られている（非特許文献４）。しかしながら、ニコチンのミトコンドリアに対する機能は、知られていなかった。
ニコチンは、主としてタバコ Nicotiana tabacum の葉に含まれるアルカロイドの一種である。喫煙がパーキンソン病の発症リスクを減少させるというシステマティックレビューが知られている（非特許文献４）。しかしながら、ニコチンのミトコンドリアに対する機能は、知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【文献】Berstein,B.W. & Bamburg, J.R., J. Neurosci. 2003, 23: 1-6
【文献】Engl, E. & Attwell, D., J. Physiol.2015, 593.16: 3417-3429）
【文献】Takeda, S., Minakata, S., Koike, R., Kawahata, I., Narita, A., Kitazawa, M., Ota, M., Yamakuni, T., Maeda, Y. & Nitanai, Y. Two distinct mechanisms for actin capping protein regulation - steric and allosteric inhibition. PLoS Biology, e1000416, 2010.
【文献】Allam, M.F. et al., Smoking and Parkinson’s Disease: Systematic Review of Prospective Studies, Movement Disorders, 19, 6, 2004, 614-621
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、ニコチン、ノビレチン、シネセチン、及びチンピからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、ミトコンドリアの機能不全を伴う中枢神経変性疾患の処置のための医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者は、中枢神経培養系において、Ｖ－１タンパク質とアクチンキャッピングタンパク質の複合体がＣＯＸ ＩのｍＲＮＡレベルを上方制御すること、ニコチン、ノビレチン、シネセチン及びチンピがＶ－１タンパク質とアクチンキャッピングタンパク質の複合体の形成を促進し及びＣＯＸ ＩのｍＲＮＡレベルを上方制御することを見出し、本発明を完成させた。
本発明は、以下の態様を含む。
［１］ニコチン、ノビレチン、シネセチン、及びチンピからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、中枢神経変性疾患の処置のための医薬組成物であって、前記中枢神経変性疾患が、ミトコンドリアの機能不全を伴うことを特徴とする、前記医薬組成物、
［２］前記中枢神経変性疾患が、ミトコンドリアの機能不全を伴うアルツハイマー病、ミトコンドリアの機能不全を伴うパーキンソン病又はミトコンドリアの機能不全を伴う脳血管認知症である、［１］の医薬組成物、
［３］前記処置が、Ｖ－１タンパク質とアクチンキャッピングタンパク質の複合体の形成の促進である、［２］の医薬組成物、
［４］ミトコンドリアの機能不全の処置における使用のための、ニコチン、ノビレチン、シネセチン、及びチンピからなる群より選ばれる少なくとも１つの化合物、
［５］前記ミトコンドリアの機能不全が、ミトコンドリアの機能不全を伴うアルツハイマー病、ミトコンドリアの機能不全を伴うパーキンソン病又はミトコンドリアの機能不全を伴う脳血管認知症である、［４］の化合物。
［６］前記処置が、Ｖ－１タンパク質とアクチンキャッピングタンパク質の複合体の形成の促進である、［５］の化合物。
［７］被験物質を神経細胞と接触させること、
被験物質と接触した神経細胞におけるＶ－１タンパク質とアクチンキャッピングタンパク質との複合体のレベル及び／又はＣＯＸ Ｉの発現レベルを決定すること、
決定されたレベル及び／又は発現レベルが、被験物質と接触していない神経細胞におけるＶ－１タンパク質とアクチンキャッピングタンパク質との複合体のレベル及び／又はＣＯＸ Ｉの発現レベルと比べて高いときに、被験物質をミトコンドリアの恒常性維持・強化に有用な候補物質として選択すること、
を含む、ミトコンドリアの恒常性の維持及び／又は強化に有用な候補物質のスクリーニング方法。
本発明は、以下の態様を含む。
［１］ニコチン、ノビレチン、シネセチン、及びチンピからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、中枢神経変性疾患の処置のための医薬組成物であって、前記中枢神経変性疾患が、ミトコンドリアの機能不全を伴うことを特徴とする、前記医薬組成物、
［２］前記中枢神経変性疾患が、ミトコンドリアの機能不全を伴うアルツハイマー病、ミトコンドリアの機能不全を伴うパーキンソン病又はミトコンドリアの機能不全を伴う脳血管認知症である、［１］の医薬組成物、
［３］前記処置が、Ｖ－１タンパク質とアクチンキャッピングタンパク質の複合体の形成の促進である、［２］の医薬組成物、
［４］ミトコンドリアの機能不全の処置における使用のための、ニコチン、ノビレチン、シネセチン、及びチンピからなる群より選ばれる少なくとも１つの化合物、
［５］前記ミトコンドリアの機能不全が、ミトコンドリアの機能不全を伴うアルツハイマー病、ミトコンドリアの機能不全を伴うパーキンソン病又はミトコンドリアの機能不全を伴う脳血管認知症である、［４］の化合物。
［６］前記処置が、Ｖ－１タンパク質とアクチンキャッピングタンパク質の複合体の形成の促進である、［５］の化合物。
［７］被験物質を神経細胞と接触させること、
被験物質と接触した神経細胞におけるＶ－１タンパク質とアクチンキャッピングタンパク質との複合体のレベル及び／又はＣＯＸ Ｉの発現レベルを決定すること、
決定されたレベル及び／又は発現レベルが、被験物質と接触していない神経細胞におけるＶ－１タンパク質とアクチンキャッピングタンパク質との複合体のレベル及び／又はＣＯＸ Ｉの発現レベルと比べて高いときに、被験物質をミトコンドリアの恒常性維持・強化に有用な候補物質として選択すること、
を含む、ミトコンドリアの恒常性の維持及び／又は強化に有用な候補物質のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、ニコチン、ノビレチン、シネセチン、及びチンピからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、ミトコンドリアの機能不全を伴う中枢神経変性疾患の処置のための医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】中脳神経培養系でＶ－１／ＣＰ複合体は、ＣＯＸ Ｉ ｍＲＮＡレベルを上方制御する。Ｄ４４Ｒは、人工変異体Ｖ－１（ドミナントネガティブＶ－１変異体）である。野生型Ｖ－１（ＷＴ）と同様にレンチウイルスベクターＶＳＶ－Ｇ（Kato et al., Hum.Gene.Ther. 2011, 22: 1511-1523）で神経細胞に導入した。
【図2】中脳神経培養系の細胞生存率に対する野生型Ｖ－１（ＷＴ）、人工変異体Ｖ－１（Ｄ４４Ｒ）、突然変異体ＳＲＦ（Ishikawa et al., J.Neurosci. 2010, 285: 32734-32743）、Ｃ３エンザイム（ＲｈｏＡ阻害剤）、又はＹ－２７６３２(ＲＯＣＫ阻害剤)の効果である。数値は、平均±ＳＥＭである（ｎ＝３）。コントロールに対して、****は、ｐ＜０．０００１である。
【図3】中枢神経培養系におけるドネペジル、メマンチン、ノビレチン、シネンセチン、Ｎチンピ又はノビレチンとシネンセチンの混合物のＶ－１／ＣＰアセンブリー（複合体形成）に対する効果である。培養中脳神経ニューロンもしくは培養海馬ニューロンを各々１０μＭドネペジル、１０ｎＭ又は１０μＭメマンチン、３０μＭノビレチン、３０μＭシネンセチン、１００μｇ／ｍｌＮチンピ、又は３０μＭノビレチン及び３μＭシネンセチンの混合物で処理した。
【図4】中枢神経培養系におけるドネペジル、メマンチン、ノビレチン、シネンセチン、Ｎチンピ又はノビレチンとノビレチンの混合物のＣＯＸ Ｉ（シトクロームＣオキシダーゼサブユニットＩ）のｍＲＮＡレベルに対する効果である。数値は、平均±ＳＥＭである（ｎ＝３）。全ての対についてone-way ANOVA後のTukey testを行った。コントロールに対して、*は、ｐ＜０．０５であり、**は、ｐ＜０．０１であり、***は、ｐ＜０．００１であり、****は、ｐ＜０．０００１であり、ノビレチン及びシネセチン混合物に対して、#は、ｐ＜０．０５である。濃度は、図３と同じである。
【図5】中脳神経培養系における野生型（ＷＴ）又は人工変異体（Ｄ４４Ｒ）Ｖ－１のグルタチオンシンセターゼ及びグルタミン－システインリガーゼカタリティックサブユニット（ＧＣＬＣ）のｍＲＮＡレベルに対する影響である。数値は、平均±ＳＥＭである（ｎ＝３）。全ての対についてone-way ANOVA後のTukey testを行った。ＧＦＰコントロールに対して、***は、ｐ＜０．００１であり、Ｖ－１（Ｄ４４Ｒ）に対して、###は、ｐ＜０．００１であり、####は、ｐ＜０．０００１である。
【図6】中脳神経培養系（培養中脳神経ニューロンもしくは培養海馬ニューロン）で１０μＭ ＮＭＤＡ及び１０μＭ ニコチンによりＶ－１／ＣＰ複合体の形成が促進される。
【図7】培養海馬ニューロンにおける、３０μＭノビレチン及び３００μｇ／ｍｌＮチンピ、それぞれの、Ｖ－１／ＣＰタンパク質複合体形成に対する影響である。細胞をテストサンプルで２４時間処理した。細胞溶解物を抗Ｖ－１抗体での免疫沈降に付し、Ｖ－１と共免疫沈降したＣＰをマウス抗ＣＰα抗体で検出し、その後、この免疫沈降物をウサギ抗Ｖ－１抗体で再標識した。独立して、それぞれのインプットサンプルを抗総ＥＲＫ抗体でアッセイした。
【図8】ＰＣ１２Ｄ細胞における野生型（ＷＴ）又は人工変異体（Ｄ４４Ｒ）Ｖ－１、及び３０μＭノビレチン、３０μＭシネンセチン、１００μｇ／ｍｌＮチンピ、又は３０μＭノビレチン及び３μＭシネンセチンの混合物のＡＴＰ産生への影響を示す。
【図9】海馬ニューロンにおける野生型（ＷＴ）又は人工変異体（Ｄ４４Ｒ）Ｖ－１、及び３０μＭノビレチン、３０μＭシネンセチン、１００μｇ／ｍｌＮチンピ、１０μＭノビレチン及び１μＭシネンセチンの混合物の又は３０μＭノビレチン及び３μＭシネンセチンの混合物のＡＴＰ産生への影響を示す。ＧＦＰコントロールに対して、**は、ｐ＜０．０１であり、****は、ｐ＜０．０００１である。
【図10】加齢に伴うミトコンドリア関連タンパク質ＣＯＸＩの経時的なｍＲＮＡレベルの変化を示す。数値は、平均±ＳＥＭである（ｎ＝３）。Ｐ１４マウスに対して、＊＊は、ｐ＜０．０１であり、＊＊＊は、ｐ＜０．００１である。Ｐ４９マウスに対して、＃＃＃＃ は、ｐ＜０．０００１である。
【図11】中脳ドパミン神経の生後発達及び老化に伴うＶ－１及びＴＨの発現変化を示す。中脳ドパミン神経はＶ－１及びＴＨに対する両特異抗体で二重染色した。スケール：２０μｍ。上のパネルの破線の長方形は中脳の黒質緻密部を示し、下２枚のパネルはその拡大像を示す。
【図12】マウスにおける黒質ＴＨ陽性ニューロン（黒質ドパミン神経）におけるＶ－１とＣＰとの相互作用を示す。スケール：２０μｍ。上のパネルの破線の長方形は中脳の黒質緻密部を示し、下２枚のパネルはその拡大像を示す。なお、Ｐ１４マウスの黒質緻密部のＴＨ陽性神経にはＶ－１とＣＰの複合体は認められないことに注目されたい。
【図13】老齢（１７ヶ月齢）雄性C57BL/6Nマウス中脳におけるミトコンドリア電子伝達系複合体I～Vの各構成サブユニットタンパク質の発現に対するN陳皮（0.5 g/kg体重/日の用量で２週間経口投与）の効果（パネル左）、およびNMDA受容体サブユニットNR2D欠損C57BL/6Nマウス（NR2Dノックアウトマウス、雄性成体）中脳におけるミトコンドリア電子伝達系複合体I～Vの各構成サブユニットタンパク質の発現レベルの変化（パネル右）。パネル左：老齢マウスにおいて、N陳皮は中脳のミトコンドリア電子伝達系複合体I～Vの各構成サブユニットタンパク質の発現を増強した。パネル右：NR2D欠損マウス中脳において、野生型（WT）マウスと比べて上記複合体I～Vの各構成サブユニットの発現レベルの低下が認められた。この所見から、中脳ドパミン神経におけるミトコンドリアの恒常性維持機構はNMDA受容体サブユニットNR2D依存的である可能性が示唆された。
【発明を実施するための形態】
【0012】
「神経細胞」とは、神経系を構成する細胞で、その細胞体からは神経に特異的な形態の樹状突起や軸索を伸ばしている。これらは化学信号の受容および電気信号の発生・送信の場であり、それ故に神経細胞に不可欠な構造である。神経細胞は電気信号を発生する興奮性を有し、同時に神経伝達物質を合成・遊離する。興奮性シナプスでは軸索終末から化学信号として興奮性神経伝達物質を、他方、抑制性シナプスでは抑制性神経伝達物質が遊離される。これらの興奮性もしくは抑制性神経伝達物質により、標的細胞の電気信号の発生と神経伝達物質の遊離が調節される。このように、神経ネットワークを構築する神経細胞は、宿命的に電気信号を発生するための仕組みが組み込まれている。すなわち、神経細胞では、ＡＴＰ消費型のＮａ＋，Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ（ナトリウムイオンポンプ）の働きにより静止膜電位を形成し、電気信号発生の準備態勢を恒常的に整えている。さらに、神経に特徴的な樹状突起や軸索は、アクチン線維や微小管の細胞骨格によりその形態が保持されているが、これらの細胞骨格はいずれもその構造を維持するため、ＡＴＰを消費する。したがって、神経細胞は、その細胞体ばかりでなく、樹状突起や軸索にもミトコンドリアのＡＴＰ供給システムを配置せねばならない。このため、神経細胞にけるＡＴＰ供給システムの脆弱性が脳神経系システムの機能的脆弱性と直結している。故に、「ミトコンドリアの恒常性維持・強化」に資する薬剤の発見は極めて重要である。
【0013】
「Ｖ－１タンパク質」とは、１９９０年代初頭に、山國等によりラット脳から発見された酸性タンパク質である。その後、マウス、ヒトでも遺伝子が発見され、その生体での発現も確認された。Ｖ－１のｍＲＮＡは１１８個のアミノ酸のタンパク質をコードするが、脳ではアミノ末端のメチオニンが除去された１１７個のアミノ酸のタンパク質として存在する。本タンパク質はほとんどすべての末梢・中枢神経系の神経細胞、副腎髄質クロマフィン細胞で発現する他、骨格筋、心筋細胞、平滑筋でも発現する。なお、当該分子は心筋で発見されたｍｙｏｔｒｏｐｈｉｎと同一タンパク質である。黒質ドパミン神経や副腎髄質細胞などのカテコラミン産生細胞では、カテコラミン合成酵素遺伝子の転写を促進し、カテコラミン産生を増強する当該タンパク質の機能が知られている。また、アクチンキャッピングタンパク質に結合しその活性を阻害してアクチン細胞骨格の形成を促進する生理機能も明らかにされている。
【0014】
「アクチンキャッピングタンパク質（ＣＰ）」とは、細胞内のアクチン骨格形成調節因子。アクチン線維のプラス端に結合し、その伸長を抑える活性をもつことから、そのような名前が付与された。また、骨格筋細胞のＺ帯を構成するタンパク質であることから、ＣａｐＺとも呼ばれる。α－サブユニットとβ－サブユニット各１分子から構成されるヘテロ二量体分子としてアクチン線維のプラス端と結合する。細胞質に存在するフリーのアクチンキャッピングタンパク質はＶ－１と結合すると、アクチンキャッピング活性が消失することが証明されている。
【0015】
「ミトコンドリアの恒常性維持・強化」とは、ミトコンドリアの安定的なＡＴＰの産生能の維持・強化を指す。真核細胞生物において、様々な機能を有する器官や組織を構成するすべての細胞にとって、自らＡＴＰを安定的に産生・供給することは、その生存を担保する上で不可欠である。それ故に、細胞内の主要なＡＴＰ産生元であるミトコンドリアの機能不全、つまりＡＴＰの供給停止は、ヒトをはじめとして、細胞寿命の終焉を招くたけでなく、個体の死の決定的な原因にもなる。アルツハイマー病、パーキンソン病、脳血管性認知症を含む中枢神経変性疾患の発症にはそのメカニズとして「ミトコンドリアの恒常性維持・強化」システムの破綻が指摘されている（Michel,P. et al., Neuron 90, 2016, 675-691; Ittner, L.M. and Goets, J., Nature Reviews Neuroscience 12, 2011, 67-21）。これと関連して、特定の脳の部位で、老化によるミトコンドリアのＡＴＰ産生機能の劣化を示す証拠も存在する。したがって、脳の健康を維持する上で「ミトコンドリアの恒常性維持・強化」は不可欠である。
【0016】
「ＣＯＸＩ」とは、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットI（cytochrome c oxidase subunit I , COX I ）であり、ミトコンドリアの電子伝達系（呼吸鎖）の最終ステップの反応を触媒する複合体ＩＶを構成する重要なサブユニットの１つである。複合体ＩＶでは、複合体ＩＩＩを経由し、シトクロムｃ各々から受け取った電子を酸素に渡して、水２分子を生成する。なお、ＣＯＸＩはミトコンドリアＤＮＡにコードされる。そのため、ミトコンドリアの分子マーカーとして用いられる。
【0017】
タンパク質のレベルの決定方法は、従来公知の任意の方法を用いることできるが、たとえば、抗体を用いたウェスタンブロット分析がある。また、Ｖ－１／ＣＰ複合体レベルの定量には免疫沈降法を用いることができる。
【0018】
ｍＲＮＡ発現レベルの決定方法は、従来公知の任意の方法を用いることができるが、たとえば、リアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲ法を用いることができる。
【0019】
「ノビレチン」とは、カンキツ属に特徴的なフラボノイド類の一種のポリメトキシフラボン化合物。抗認知症作用、抗アルツハイマー病作用、降圧作用、抗炎症作用などの多様な生物活性を示す。
【0020】
「シネセチン」とは、ノビレチンと同様のカンキツ属に特徴的なフラボノイド類の一種のポリメトキシフラボン化合物である。動物実験で抗認知症作用などが報告されている。
【0021】
「チンピ」とは、ウンシュウミカン(Citrus unshiu Markovich)またはC. reticulate Blancoの成熟果皮で、漢方医学では芳香性苦味健胃薬、鎮咳・去痰薬などとして使用される生薬。「Ｎチンピ」とは、ノビレチンやシネンセチン高含有陳皮のことを指す。ノビレチン単体よりも強い抗認知症作用を示すことが知られている。
【0022】
ミトコンドリアの恒常性維持・強化剤には、保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる材料が添加されていてもよい。製剤上許容しうるとは、それ自体は上記の作用を有する材料であってもよいし、当該維持作用を有さない材料であってもよく、上記ミトコンドリアの恒常性維持・強化剤とともに投与可能な製剤上許容される材料を意味する。また、維持作用を有さない材料であって、維持剤と併用することによって相乗的効果もしくは相加的な安定化効果を有する材料であってもよい。
【0023】
製剤上許容される材料としては、例えば滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、緩衝剤、防腐剤、結合剤等を挙げることができる。
【0024】
緩衝剤としては、リン酸、クエン酸緩衝液、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、乳酸、リン酸カリウム、グルコン酸、カプリル酸、デオキシコール酸、サリチル酸、トリエタノールアミン、フマル酸等、他の有機酸等、あるいは、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、イミダゾール緩衝液等を挙げることが出来る。
【0025】
また溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製してもよい。緩衝液の濃度は一般には１～５００ｍＭであり、好ましくは５～１００ｍＭであり、さらに好ましくは１０～２０ｍＭである。
【0026】
また、ミトコンドリアの恒常性維持・強化剤は、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、アミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、糖アルコールを含んでいてもよい。
【0027】
多糖及び単糖等の糖類や炭水化物としては、例えばデキストラン、グルコース、フラクトース、ラクトース、キシロース、マンノース、マルトース、スクロース、トレハロース、ラフィノース等を挙げることができる。
【0028】
注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧ等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０）等と併用してもよい。
所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含有してもよい。
所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含有してもよい。
【0029】
また、必要に応じ、マイクロカプセル(ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル)に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム(リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等)としたりすることもできる("Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed., 1980等参照)。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明に適用し得る(Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 1981, 15: 167-277; Langer,Chem. Tech. 1982, 12: 98-105;米国特許第3,773,919号;欧州特許出願公開(EP)第58,481号; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556;EP第133,988号)。
使用される製剤上許容しうる担体は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
使用される製剤上許容しうる担体は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
【0030】
ミトコンドリアの恒常性維持・強化剤をヒトや他の動物の医薬として使用する場合には、これらの物質自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。製剤化する場合には、上記に記載の製剤上許容される材料を添加しても良い。
【0031】
ミトコンドリアの恒常性維持・強化剤は、医薬品の形態で投与することが可能であり、経口的または非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤などを選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇから１００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり０．１～１０００ｍｇ、好ましくは０．１～５０ｍｇの投与量を選ぶことができる。好ましい投与量、投与方法は、たとえば抗Ａｒｉｄ５Ａ抗体の場合には、血中にフリーの抗体が存在する程度の量が有効投与量であり、具体的な例としては、体重１ｋｇあたり１ヶ月（４週間）に０．１ｍｇから４０ｍｇ、好ましくは１ｍｇから２０ｍｇを１回から数回に分けて、例えば２回／週、１回／週、１回／２週、１回／４週などの投与スケジュールで点滴などの静脈内注射、皮下注射などの方法で、投与する方法などである。投与スケジュールは、投与後の状態の観察および血液検査値の動向を観察しながら２回／週あるいは１回／週から１回／２週、１回／３週、１回／４週のように投与間隔を延ばしていくなど調整することも可能である。
【0032】
本発明は、ニコチン、ノビレチン、シネセチン、及びチンピからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む医薬組成物を、その必要がある対象に投与することを含む、ミトコンドリアの機能不全を伴う中枢神経変性疾患の処置に関する。
中枢神経変性疾患は、好ましくは、ミトコンドリアの機能不全を伴うアルツハイマー病、ミトコンドリアの機能不全を伴うパーキンソン病又はミトコンドリアの機能不全を伴う脳血管認知症である。また、前記処置は、好ましくは、Ｖ－１タンパク質とアクチンキャッピングタンパク質の複合体の形成の促進である。
中枢神経変性疾患は、好ましくは、ミトコンドリアの機能不全を伴うアルツハイマー病、ミトコンドリアの機能不全を伴うパーキンソン病又はミトコンドリアの機能不全を伴う脳血管認知症である。また、前記処置は、好ましくは、Ｖ－１タンパク質とアクチンキャッピングタンパク質の複合体の形成の促進である。
【0033】
本発明は、ミトコンドリアの恒常性維持・強化に有用な候補物質のスクリーニング方法に関する。スクリーニング方法は、被験物質のＶ－Ｉタンパク質とアクチンキャッピングタンパク質の複合体の形成に対する影響を検出すること、及び検出される影響が、被験物質を用いない場合の影響と異なる被験物質を候補物質として選択することを含む。
【0034】
スクリーニング方法に使用されるＶ－１の由来となる生物種としては、特定の生物種に限定されるものではない。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、ニワトリ、昆虫などが挙げられる。
【0035】
「被験物質」は、特に限定されるものではなく、例えば天然化合物、有機化合物、無機化合物、核酸、タンパク質、ペプチド等の単一物質、並びに化合物ライブラリー、核酸ライブラリー、ペプチドライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被験物質は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、上記被験物質に加えて、これらの被験物質を複数種混合した混合物も含まれる。
【実施例】
【0036】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0037】
（ラット胎仔初代海馬神経細胞および中脳神経細胞の培養）
妊娠Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットを１２時間周期の明暗サイクルにて給餌・給水して飼育した。妊娠１８日目のラット（Ｅ１８）からイソフルラン深麻酔下にて腹部正中切開により無菌的に子宮を摘出した。実体顕微鏡下、氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中にて胎仔の海馬を摘出し、３７℃の神経細胞分散液（住友ベークライト）３０分間処置により組織を分散させ、１０００ｒｐｍにて５分間遠心分離した後、上清を除去した。次いで、細胞ペレットを分散液（住友ベークライト）中にて分散させ、さらにピペッティングにより十分分散させた細胞に除去液（住友ベークライト）を加えて９００ｒｐｍにて５分間遠心分離した後、上清を除去した。次に、ペレットをニューロバサル（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標） Ｍｅｄｉｕｍ ５００ｍｌ／フェノール・レッド不含、５０倍Ｂ２７サプリメント１０ｍｌ、０．５ｍＭ Ｌ－グルタミン、０．００５％ペニシリン－ストレプトマイシン）を用いて懸濁し、ポリ－Ｌ－リジンでコーティングしたプラスティックディッシュまたはプレートに播種した。培養１日後に培地交換、その後３～４日おきに培地を半量交換し、１０μＭ Ａｒａ－Ｃを含有する培地中３７℃にて５％ＣＯ２インキュベーター内で１４日間培養した。なお、薬物処置実験用試験培地は、Ａｒａ－Ｃおよび抗生物質不含のニューロバサル培地を用いた。
ラット中脳初代培養神経細胞は、既報の方法（Wakita et al. 2010）に従ってE16日目のWistar系ラットから中脳を採取し、神経培養分散液（住友ベークライト）を用いて分散後、播種した。培地には１０％のFBSを含有するEMEM培地を用いた。同中脳初代培養神経は、播種翌日、およびその後１日おきの半量培地交換を経て、５日目に各種発現ベクターを導入、または生薬エキスや各種化合物で処置して、４８時間後に種々の分析に供した。
妊娠Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットを１２時間周期の明暗サイクルにて給餌・給水して飼育した。妊娠１８日目のラット（Ｅ１８）からイソフルラン深麻酔下にて腹部正中切開により無菌的に子宮を摘出した。実体顕微鏡下、氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中にて胎仔の海馬を摘出し、３７℃の神経細胞分散液（住友ベークライト）３０分間処置により組織を分散させ、１０００ｒｐｍにて５分間遠心分離した後、上清を除去した。次いで、細胞ペレットを分散液（住友ベークライト）中にて分散させ、さらにピペッティングにより十分分散させた細胞に除去液（住友ベークライト）を加えて９００ｒｐｍにて５分間遠心分離した後、上清を除去した。次に、ペレットをニューロバサル（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標） Ｍｅｄｉｕｍ ５００ｍｌ／フェノール・レッド不含、５０倍Ｂ２７サプリメント１０ｍｌ、０．５ｍＭ Ｌ－グルタミン、０．００５％ペニシリン－ストレプトマイシン）を用いて懸濁し、ポリ－Ｌ－リジンでコーティングしたプラスティックディッシュまたはプレートに播種した。培養１日後に培地交換、その後３～４日おきに培地を半量交換し、１０μＭ Ａｒａ－Ｃを含有する培地中３７℃にて５％ＣＯ２インキュベーター内で１４日間培養した。なお、薬物処置実験用試験培地は、Ａｒａ－Ｃおよび抗生物質不含のニューロバサル培地を用いた。
ラット中脳初代培養神経細胞は、既報の方法（Wakita et al. 2010）に従ってE16日目のWistar系ラットから中脳を採取し、神経培養分散液（住友ベークライト）を用いて分散後、播種した。培地には１０％のFBSを含有するEMEM培地を用いた。同中脳初代培養神経は、播種翌日、およびその後１日おきの半量培地交換を経て、５日目に各種発現ベクターを導入、または生薬エキスや各種化合物で処置して、４８時間後に種々の分析に供した。
【0038】
（免疫沈降およびウェスタンブロット解析）
各種試料又はサンプルによるＶ－１／ＣＰ複合体形成変化の免疫沈降実験およびウェスタンブロット解析では、３５ｍｍディッシュに１×１０６細胞の海馬神経細胞、あるいは２×１０６細胞の中脳ドパミン神経細胞を含む細胞を播種し、前述の培養後、各種化合物または生薬エキス、自然食品を含む培地を添加し、４８時間処置を行った。免疫沈降実験では、前述の細胞をＰＢＳ（－）で２回洗浄後１０００ｒｐｍで遠心して細胞を回収し、いったん凍結、その後細胞溶解液ｍａｍｍａｌｉａｎ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を３００μｌ加え、氷上で３０分静置後、２７ゲージのニードルで細胞溶解液を１０回吸引し、４０００ｒｐｍで遠心し、上清を細胞抽出液として回収した。その後、４００μｇのタンパク質を含む細胞抽出液を２ｍｌチューブに移し、抗Ｖ－１抗体を結合させた免疫沈降用磁気ビーズＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（Ｖｅｒｉｔａｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混和し４℃で１６時間転倒混和し反応させた。その後、マグネットでＤｙｎａｂｅａｄｓを回収し、氷冷した洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．０１％ Ｔｗｅｅｎ－２０含有）で３回洗浄後、溶出バッファー（５０ｍＭ グリシン－ＨＣｌ，ｐＨ２．８）で抗Ｖ－１抗体と結合したタンパク質を溶出、回収した。この免疫沈降物を、抗ＣＰα抗体を用いてウェスタンブロット法で分析した。まず、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの分離ゲルとして１２％ポリアクリルアミドゲルを用い、１００Ｖ定電圧で泳動後、ゲルからＰＶＤＦメンブレンヘタンパク質を転写し、５％スキムミルクを含むＴＢＳ－Ｔバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０；以下ブロッキングバッファーという）を用いて室温にて１時間ブロッキングした。ブロッキングバッファーで１０００倍希釈した抗ＣＰα抗体と４℃にて１６時間インキュベートした。さらにメンブレンをＴＢＳ－Ｔで洗浄し、ブロッキングバッファーで１０００倍に希釈したＨＲＰ標識IｇＧ抗体（ＣＳＴ）と室温にて１時間インキュベートし、ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した。抗体陽性のバンドの検出はイモビロン・ウェスタン化学発光ＨＲＰ基質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いたＥＣＬ法で行った。
各種試料又はサンプルによるＶ－１／ＣＰ複合体形成変化の免疫沈降実験およびウェスタンブロット解析では、３５ｍｍディッシュに１×１０６細胞の海馬神経細胞、あるいは２×１０６細胞の中脳ドパミン神経細胞を含む細胞を播種し、前述の培養後、各種化合物または生薬エキス、自然食品を含む培地を添加し、４８時間処置を行った。免疫沈降実験では、前述の細胞をＰＢＳ（－）で２回洗浄後１０００ｒｐｍで遠心して細胞を回収し、いったん凍結、その後細胞溶解液ｍａｍｍａｌｉａｎ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を３００μｌ加え、氷上で３０分静置後、２７ゲージのニードルで細胞溶解液を１０回吸引し、４０００ｒｐｍで遠心し、上清を細胞抽出液として回収した。その後、４００μｇのタンパク質を含む細胞抽出液を２ｍｌチューブに移し、抗Ｖ－１抗体を結合させた免疫沈降用磁気ビーズＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（Ｖｅｒｉｔａｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混和し４℃で１６時間転倒混和し反応させた。その後、マグネットでＤｙｎａｂｅａｄｓを回収し、氷冷した洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．０１％ Ｔｗｅｅｎ－２０含有）で３回洗浄後、溶出バッファー（５０ｍＭ グリシン－ＨＣｌ，ｐＨ２．８）で抗Ｖ－１抗体と結合したタンパク質を溶出、回収した。この免疫沈降物を、抗ＣＰα抗体を用いてウェスタンブロット法で分析した。まず、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの分離ゲルとして１２％ポリアクリルアミドゲルを用い、１００Ｖ定電圧で泳動後、ゲルからＰＶＤＦメンブレンヘタンパク質を転写し、５％スキムミルクを含むＴＢＳ－Ｔバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０；以下ブロッキングバッファーという）を用いて室温にて１時間ブロッキングした。ブロッキングバッファーで１０００倍希釈した抗ＣＰα抗体と４℃にて１６時間インキュベートした。さらにメンブレンをＴＢＳ－Ｔで洗浄し、ブロッキングバッファーで１０００倍に希釈したＨＲＰ標識IｇＧ抗体（ＣＳＴ）と室温にて１時間インキュベートし、ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した。抗体陽性のバンドの検出はイモビロン・ウェスタン化学発光ＨＲＰ基質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いたＥＣＬ法で行った。
【0039】
（細胞生存率のＭＴＴ法を用いた定量解析）
各種天然化合物、生薬およびＶ－１遺伝子による細胞生存率変化のＭＴＴ法を用いた定量解析では、中脳ドパミン神経細胞を含む細胞を４８ウェルプレートに１．６×１０５細胞／ウェルで播種し、前述の培養後、４８時間の各種発現ベクター導入または２４時間の薬物処置を行った。その後、ＰＢＳに溶解させたＭＴＴ試薬（Ｄｏｊｉｎｄｏ、０．０１ｇ／２ｍＬ）を調製し、各ウェルに２０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、３７℃で４時間ＣＯ２インキュベーターの中でインキュベートした。その後、培地をアスピレートし、各ウェルにＤＭＳＯを１００μｌずつ加えて１０分間振とうさせた後、ＭＴＴ試薬が完全に溶解したことを確認し、吸光度計で５９０ｎｍの吸光度を測定、コントロール群を１として変化率を算出した。
各種天然化合物、生薬およびＶ－１遺伝子による細胞生存率変化のＭＴＴ法を用いた定量解析では、中脳ドパミン神経細胞を含む細胞を４８ウェルプレートに１．６×１０５細胞／ウェルで播種し、前述の培養後、４８時間の各種発現ベクター導入または２４時間の薬物処置を行った。その後、ＰＢＳに溶解させたＭＴＴ試薬（Ｄｏｊｉｎｄｏ、０．０１ｇ／２ｍＬ）を調製し、各ウェルに２０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、３７℃で４時間ＣＯ２インキュベーターの中でインキュベートした。その後、培地をアスピレートし、各ウェルにＤＭＳＯを１００μｌずつ加えて１０分間振とうさせた後、ＭＴＴ試薬が完全に溶解したことを確認し、吸光度計で５９０ｎｍの吸光度を測定、コントロール群を１として変化率を算出した。
【0040】
（ＰＣＲ法を用いたｍＲＮＡレベルの定量解析）
ＰＣＲ法を用いた各種天然化合物、生薬およびＶ－１遺伝子によるｍＲＮＡレベル変化の定量解析では、分離調製した海馬神経細胞または中脳ドパミン神経細胞を含む細胞を３５ｍｍディッシュにそれぞれ１×１０６細胞または２×１０６細胞を播種し、前述の培養後、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて細胞からＲＮＡを回収・精製した。鋳型ｃＤＮＡ合成には、ＲｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｋｉｔ （東洋紡）を用いて行った。各種ｍＲＮＡレベルの変化解析には定量的ＰＣＲ法を用い、以下のプライマーを使用して解析を行った：
ラットＣＯＸ Ｉ
フォーワードプライマー：５’－ＴＣＡＣＡＧＣＣＣＡＴＧＣＡＴＴＣＧＴＡ－３’
リバースプライマー：５’－ＡＧＡＴＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＣＣＧＧＣＴ－３’）
ラットβ－アクチン
フォーワードプライマー：５’－ＴＧＴＧＴＴＧＴＣＣＣＴＧＴＡＴＧＣＣＴ－３’
リバースプライマー：５’－ＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣＣ－３’。
ＰＣＲ法を用いた各種天然化合物、生薬およびＶ－１遺伝子によるｍＲＮＡレベル変化の定量解析では、分離調製した海馬神経細胞または中脳ドパミン神経細胞を含む細胞を３５ｍｍディッシュにそれぞれ１×１０６細胞または２×１０６細胞を播種し、前述の培養後、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて細胞からＲＮＡを回収・精製した。鋳型ｃＤＮＡ合成には、ＲｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｋｉｔ （東洋紡）を用いて行った。各種ｍＲＮＡレベルの変化解析には定量的ＰＣＲ法を用い、以下のプライマーを使用して解析を行った：
ラットＣＯＸ Ｉ
フォーワードプライマー：５’－ＴＣＡＣＡＧＣＣＣＡＴＧＣＡＴＴＣＧＴＡ－３’
リバースプライマー：５’－ＡＧＡＴＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＣＣＧＧＣＴ－３’）
ラットβ－アクチン
フォーワードプライマー：５’－ＴＧＴＧＴＴＧＴＣＣＣＴＧＴＡＴＧＣＣＴ－３’
リバースプライマー：５’－ＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣＣ－３’。
【0041】
ＰＣＲにはリアルタイム定量ＰＣＲ解析装置ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｎａｎｏ（Ｒｏｃｈｅ）を用い、ＣｙｂｅｒＧｒｅｅｎ法を用いた２ステップＰＣＲ（９５℃／１５秒、６０℃／３０秒を５０サイクル）によって定量的に解析した。ＣＯＸ Ｉ ｍＲＮＡ量はリファレンス遺伝子産物のβ－アクチン ｍＲＮＡ量で補正を行い、増加または減少率を算出した。
【0042】
（細胞内ＡＴＰ量の定量解析）
各種天然化合物、生薬およびＶ－１遺伝子による細胞内ＡＴＰ量変化の定量解析では、ＰＣ１２Ｄ細胞または培養海馬神経細胞を４８ウェルプレートに８×１０４細胞／ウェルで播種し、ＰＣ１２Ｄ細胞は４８時間後に、培養海馬神経細胞は前述の培養後、４８時間の各種発現ベクター導入または２４時間の薬物処置の後、培地を全量抜き取り、ＡＴＰ抽出試薬Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＡＴＰ測定キット（東洋ビーネット）を添加した。５分間の静置により細胞からＡＴＰを抽出後、キュベットに検体１００μＬを移し、前述キット内の発酵試薬であるＬ／Ｌ試薬１００μｌと混合した後、キュベットを３回振って混和し、ルミノメーターで１検体ごとに測定を行った。得られたデータはコントロールの発光量を１として変化率を算出した。
各種天然化合物、生薬およびＶ－１遺伝子による細胞内ＡＴＰ量変化の定量解析では、ＰＣ１２Ｄ細胞または培養海馬神経細胞を４８ウェルプレートに８×１０４細胞／ウェルで播種し、ＰＣ１２Ｄ細胞は４８時間後に、培養海馬神経細胞は前述の培養後、４８時間の各種発現ベクター導入または２４時間の薬物処置の後、培地を全量抜き取り、ＡＴＰ抽出試薬Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＡＴＰ測定キット（東洋ビーネット）を添加した。５分間の静置により細胞からＡＴＰを抽出後、キュベットに検体１００μＬを移し、前述キット内の発酵試薬であるＬ／Ｌ試薬１００μｌと混合した後、キュベットを３回振って混和し、ルミノメーターで１検体ごとに測定を行った。得られたデータはコントロールの発光量を１として変化率を算出した。
【0043】
（加齢に伴うミトコンドリア関連蛋白質ＣＯＸ Ｉの経時的なｍＲＮＡレベルの変化）
マウス中脳におけるＣＯＸ ＩｍＲＮＡレベルは成体期に最大となり加齢により減少した。Ｃ５７ＢＬ６マウスの中脳組織を採材し、ｍＲＮＡをＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙキットで抽出後、東洋紡ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅを用いてｃＤＮＡに逆転写、同ｃＤＮＡを定量的ＰＣＲ法により解析した。Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒには５’－ＣＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＡＴＡＴＡＧＣＡＴ－３’を、ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒには５’－ＡＴＧＧＧＣＴＡＧＡＴＴＴＣＣＧＧＣＴＡ－３’を使用した。
マウス中脳におけるＣＯＸ ＩｍＲＮＡレベルは成体期に最大となり加齢により減少した。Ｃ５７ＢＬ６マウスの中脳組織を採材し、ｍＲＮＡをＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙキットで抽出後、東洋紡ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅを用いてｃＤＮＡに逆転写、同ｃＤＮＡを定量的ＰＣＲ法により解析した。Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒには５’－ＣＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＡＴＡＴＡＧＣＡＴ－３’を、ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒには５’－ＡＴＧＧＧＣＴＡＧＡＴＴＴＣＣＧＧＣＴＡ－３’を使用した。
【0044】
中脳神経培養系でＶ－１／ＣＰ複合体は、ＣＯＸ ＩｍＲＮＡレベルを上方制御する
図１に示すとおり、中脳神経培養系において、野生型Ｖ－１とＣＰとの複合体は、ＣＯＸ Ｉ ｍＲＮＡレベルを上方制御した。これに対して、人工変異体Ｖ－１（Ｄ４４Ｒ）は、ＣＯＸＩｍＲＮＡレベルを下方制御した。この結果より、中脳神経において、Ｖ－１は、アクチンキャッピングタンパク質と結合し、ＣＯＸ ＩのＲＮＡレベルを上方制御することが示された。ＣＯＸ ＩはミトコンドリアＤＮＡにコードされるため、ミトコンドリアの分子マーカーとして用いられている。したがって、Ｖ－１は、ミトコンドリアの機能を促進することが示された。また、マウス中脳におけるＣＯＸ Ｉ ｍＲＮＡの発現は、１４日齢に対して、４９日齢では約１．７倍に増加し、５１２日齢では、約０．４に低下した。加齢によって、ミトコンドリア機能が低下していることが理解される（図１０）。
図１に示すとおり、中脳神経培養系において、野生型Ｖ－１とＣＰとの複合体は、ＣＯＸ Ｉ ｍＲＮＡレベルを上方制御した。これに対して、人工変異体Ｖ－１（Ｄ４４Ｒ）は、ＣＯＸＩｍＲＮＡレベルを下方制御した。この結果より、中脳神経において、Ｖ－１は、アクチンキャッピングタンパク質と結合し、ＣＯＸ ＩのＲＮＡレベルを上方制御することが示された。ＣＯＸ ＩはミトコンドリアＤＮＡにコードされるため、ミトコンドリアの分子マーカーとして用いられている。したがって、Ｖ－１は、ミトコンドリアの機能を促進することが示された。また、マウス中脳におけるＣＯＸ Ｉ ｍＲＮＡの発現は、１４日齢に対して、４９日齢では約１．７倍に増加し、５１２日齢では、約０．４に低下した。加齢によって、ミトコンドリア機能が低下していることが理解される（図１０）。
【0045】
中脳神経培養系の細胞生存率に対するＶ－１の効果
上記の中脳神経培養系において、野生型Ｖ－１は、細胞生存率を上昇させたのに対して、人工変異体Ｖ－１（Ｄ４４Ｒ）は、細胞生存率を低下させた（図２）。また、Ｒｈｏシグナル活性化に関与する、ＳＲＦ（血清応答因子）欠失突然変異体、Ｒｈｏを特異的に不活化するボツリヌスＣ３酵素、及び選択的かつ強力なＲＯＣＫ（Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤であるＹ－２７６３２は、細胞生存率を低下させた。ミトコンドリアの機能不全、すなわち、ＡＴＰの枯渇は、細胞死をもたらすことから、Ｖ－１は、ミトコンドリアの機能促進を介して、細胞生存率を上昇させることが示された。
上記の中脳神経培養系において、野生型Ｖ－１は、細胞生存率を上昇させたのに対して、人工変異体Ｖ－１（Ｄ４４Ｒ）は、細胞生存率を低下させた（図２）。また、Ｒｈｏシグナル活性化に関与する、ＳＲＦ（血清応答因子）欠失突然変異体、Ｒｈｏを特異的に不活化するボツリヌスＣ３酵素、及び選択的かつ強力なＲＯＣＫ（Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤であるＹ－２７６３２は、細胞生存率を低下させた。ミトコンドリアの機能不全、すなわち、ＡＴＰの枯渇は、細胞死をもたらすことから、Ｖ－１は、ミトコンドリアの機能促進を介して、細胞生存率を上昇させることが示された。
【0046】
神経培養系におけるＣＯＸＩ発現に対するＶ－１の効果
培養中脳ニューロン又は培養海馬ニューロンにおいて、ノビレチン、シネンセチン、Ｎチンピ又はノビレチンとシネンセチンの混合物は、Ｖ－１／ＣＰアセンブリー（複合体形成）を促進し、ＣＯＸＩの発現を促進した（図３及び図４）。これに対して市販のアルツハイマー病治療薬である、ドネペジル（コリンエステラーゼ阻害剤）、メマンチン（ＮＭＤＡ受容体拮抗剤）では、このような効果は認められなかった。既存のアルツハイマー病治療薬は、ミトコンドリアの機能促進効果を示さなかった。
培養中脳ニューロン又は培養海馬ニューロンにおいて、ノビレチン、シネンセチン、Ｎチンピ又はノビレチンとシネンセチンの混合物は、Ｖ－１／ＣＰアセンブリー（複合体形成）を促進し、ＣＯＸＩの発現を促進した（図３及び図４）。これに対して市販のアルツハイマー病治療薬である、ドネペジル（コリンエステラーゼ阻害剤）、メマンチン（ＮＭＤＡ受容体拮抗剤）では、このような効果は認められなかった。既存のアルツハイマー病治療薬は、ミトコンドリアの機能促進効果を示さなかった。
【0047】
神経培養系におけるグルタチオンシンセターゼ及びＧＣＬＣ発現に対するＶ－１の効果
中脳ニューロンにおいて、野生型Ｖ－１は、ミトコンドリアの機能不全の原因となる活性酸素種の消去に働くグルタチオンシンセターゼ及びグルタミン－システインリガーゼカタリティックサブユニット（ＧＣＬＣ）のｍＲＮＡレベルを上方制御した（図５）。これに対して、人工変異体Ｖ－１（Ｄ４４Ｒ）は、両遺伝子の発現を下方制御した。
中脳ニューロンにおいて、野生型Ｖ－１は、ミトコンドリアの機能不全の原因となる活性酸素種の消去に働くグルタチオンシンセターゼ及びグルタミン－システインリガーゼカタリティックサブユニット（ＧＣＬＣ）のｍＲＮＡレベルを上方制御した（図５）。これに対して、人工変異体Ｖ－１（Ｄ４４Ｒ）は、両遺伝子の発現を下方制御した。
【0048】
Ｖ－１／ＣＰ複合体の形成を促進する物質
培養中脳ニューロン又は培養海馬ニューロンにおいて、種々の物質（ＮＭＤＡ、ニコチン、ドネペジル、メマンチン、ノビレチン、シネンセチン、Ｎチンピ、及びノビレチン及びシネセチンの混合物）について、Ｖ－１／ＣＰ複合体の形成に対する影響を調べた。ＮＭＤＡは、記憶や学習に関与するＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体のアゴニストであり、ドネペジル及びメマンチンは、アルツハイマー病治療薬であり、ノビレチン、シネンセチン、及びＮチンピは、柑橘類に由来する物質もしくは生薬である。ＮＭＤＡ、ニコチン、ノビレチン、シネンセチン、及びＮチンピが、Ｖ－１／ＣＰ複合体の形成を促進した（図６）。また、３０μＭノビレチンは、３００μｇ／ｍｌＮチンピと同等の効果を示した（図７）。
培養中脳ニューロン又は培養海馬ニューロンにおいて、種々の物質（ＮＭＤＡ、ニコチン、ドネペジル、メマンチン、ノビレチン、シネンセチン、Ｎチンピ、及びノビレチン及びシネセチンの混合物）について、Ｖ－１／ＣＰ複合体の形成に対する影響を調べた。ＮＭＤＡは、記憶や学習に関与するＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体のアゴニストであり、ドネペジル及びメマンチンは、アルツハイマー病治療薬であり、ノビレチン、シネンセチン、及びＮチンピは、柑橘類に由来する物質もしくは生薬である。ＮＭＤＡ、ニコチン、ノビレチン、シネンセチン、及びＮチンピが、Ｖ－１／ＣＰ複合体の形成を促進した（図６）。また、３０μＭノビレチンは、３００μｇ／ｍｌＮチンピと同等の効果を示した（図７）。
【0049】
ＰＣ１２Ｄ細胞は、副腎髄質褐色細胞腫由来の未分化神経細モデルである。Ｖ－１タンパク質、ノビレチン、シネンセチン、及びＮチンピは、ＰＣ１２Ｄ細胞及び海馬ニューロンにおけるＡＴＰの産生を増加させ、これらが、ミトコンドリアの機能促進効果を有することを示した（図８、９）。
【0050】
中脳ドパミン神経の生後発達及び老化に伴うＶ－１及びＴＨの発現変化
Ｖ－１およびＴＨの免疫化学的解析
マウス中脳において加齢に伴うＶ－１およびドパミン生合成の律速酵素であるチロシン水酸化酵素（以下ＴＨ）の細胞レベルの発現量変化を解析するために、免疫化学的解析を行った。まず５０μｍの厚さで作製した４％パラホルムアルデヒド固定マウス中脳切片を、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを含むＰＢＳで１時間処置後、５％ヤギ血清を含むＰＢＳで２時間ブロッキング処理を行った。その後、１％ヤギ血清を含むＰＢＳで希釈したマウスモノクローナル抗ＴＨ抗体（２００倍希釈）およびウサギポリクローナル抗Ｖ－１抗体（５００倍希釈）を滴下し、４℃で１６時間処置した。次に、ＰＢＳで５分間３回洗浄後、２％ヤギ血清を含むＰＢＳで５００倍に希釈した抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８および抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６を滴下し、室温で１時間処置後、ＰＢＳで１０分間３回洗浄を行った。最後に、退色防止用の封入剤（アジレント・テクノロジー）で封入し１５分間静置させた後、蛍光顕微鏡（キーエンス）を用いて撮影を行った。
生後の各段階、すなわち生後１４日齢、４９日齢、５１２日齢において、ドパミン合成の律速酵素であるチロシン水酸化酵素（ＴＨ）及びＶ－１の発現を検討した。Ｖ－１及びＴＨは、加齢によって、発現が著しく減少していくことが明らかとなった（図１１）。
Ｖ－１およびＴＨの免疫化学的解析
マウス中脳において加齢に伴うＶ－１およびドパミン生合成の律速酵素であるチロシン水酸化酵素（以下ＴＨ）の細胞レベルの発現量変化を解析するために、免疫化学的解析を行った。まず５０μｍの厚さで作製した４％パラホルムアルデヒド固定マウス中脳切片を、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを含むＰＢＳで１時間処置後、５％ヤギ血清を含むＰＢＳで２時間ブロッキング処理を行った。その後、１％ヤギ血清を含むＰＢＳで希釈したマウスモノクローナル抗ＴＨ抗体（２００倍希釈）およびウサギポリクローナル抗Ｖ－１抗体（５００倍希釈）を滴下し、４℃で１６時間処置した。次に、ＰＢＳで５分間３回洗浄後、２％ヤギ血清を含むＰＢＳで５００倍に希釈した抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８および抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６を滴下し、室温で１時間処置後、ＰＢＳで１０分間３回洗浄を行った。最後に、退色防止用の封入剤（アジレント・テクノロジー）で封入し１５分間静置させた後、蛍光顕微鏡（キーエンス）を用いて撮影を行った。
生後の各段階、すなわち生後１４日齢、４９日齢、５１２日齢において、ドパミン合成の律速酵素であるチロシン水酸化酵素（ＴＨ）及びＶ－１の発現を検討した。Ｖ－１及びＴＨは、加齢によって、発現が著しく減少していくことが明らかとなった（図１１）。
【0051】
マウスにおける黒質ＴＨ陽性ニューロン（すなわち黒質ドパミンニューロン）におけるＶ－１とＣＰとの相互作用
Ｖ－１とＣＰとの相互作用を、Ｖ－１とＣＰに対する両特異抗体を使用したＰＬＡ（Proximity Ligation Assay）を用いて検出した。固定された細胞の内在性タンパク質を検出するために、二次抗体の特異性と相補的なオリゴヌクレオチドプローブのローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を組み合わせた。一対のオリゴヌクレオチド標識抗体（ＰＬＡプローブ）は、プローブが近接（４０ｎｍ以内）しているときにのみ増幅シグナルを生成した。
Ｖ－１とＣＰとの相互作用を、Ｖ－１とＣＰに対する両特異抗体を使用したＰＬＡ（Proximity Ligation Assay）を用いて検出した。固定された細胞の内在性タンパク質を検出するために、二次抗体の特異性と相補的なオリゴヌクレオチドプローブのローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を組み合わせた。一対のオリゴヌクレオチド標識抗体（ＰＬＡプローブ）は、プローブが近接（４０ｎｍ以内）しているときにのみ増幅シグナルを生成した。
【0052】
Ｖ－１／ＣＰ複合体の可視化解析（Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標） ＰＬＡ法）
マウス中脳組織における加齢に伴うＶ－１／ＣＰ複合体の可視化解析にはＤｕｏｌｉｎｋ Ｉｎ Ｓｉｔｕキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた。まず５０ μｍの厚さで作製した４％パラホルムアルデヒド固定マウス中脳切片を、ブロッキング溶液（キット内含）で室温で２時間処置した。その後、１％ヤギ血清を含むＰＢＳで希釈したマウスモノクローナル抗ＣＰα抗体（２００倍希釈）およびウサギポリクローナル抗Ｖ－１抗体（５００倍希釈）を滴下し、４℃で１６時間処置した。抗原に結合した抗ＣＰα抗体および抗Ｖ－１抗体に近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）処理を行うために、５倍希釈した抗マウスＰＬＡプローブおよび抗ウサギＰＬＡプローブ（キット内含）を滴下し３７℃で６０分間処置後、洗浄溶液Ａ（キット内含）で５分間２回の洗浄を行った。次に付加したＰＬＡプローブをライゲーション処理するために、４０倍希釈したリガーゼ（キット内含）を滴下し３７℃で３０分間処置後、洗浄溶液Ａ（キット内含）で２分間２回の洗浄を行った。最後に、ライゲーション処理されたＰＬＡプローブを標識するために、８０倍希釈したポリメラーゼ（キット内含）を滴下し、３７℃で１００分間処置後、洗浄溶液Ｂ（キット内含）で１０分間２回洗浄したのち、さらに１００倍希釈した洗浄溶液Ｂで１分間洗浄を行った。その後、退色防止用の封入剤（キット内含）に封入後１５分間静置させ、蛍光顕微鏡（キーエンス）を用いてＤｕｏｌｉｎｋ陽性スポットを観察、撮影を行った。
その結果、Ｖ－１とＣＰとの相互作用は、生後１４日ではドパミン神経でほとんど検出されないが、生後４９日齢では明確に検出され、しかも顕著な増加を認めた。しかし、その後は加齢（５１２日齢）とともに著しく減少することが明らかとなった（図１２）。
マウス中脳組織における加齢に伴うＶ－１／ＣＰ複合体の可視化解析にはＤｕｏｌｉｎｋ Ｉｎ Ｓｉｔｕキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた。まず５０ μｍの厚さで作製した４％パラホルムアルデヒド固定マウス中脳切片を、ブロッキング溶液（キット内含）で室温で２時間処置した。その後、１％ヤギ血清を含むＰＢＳで希釈したマウスモノクローナル抗ＣＰα抗体（２００倍希釈）およびウサギポリクローナル抗Ｖ－１抗体（５００倍希釈）を滴下し、４℃で１６時間処置した。抗原に結合した抗ＣＰα抗体および抗Ｖ－１抗体に近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）処理を行うために、５倍希釈した抗マウスＰＬＡプローブおよび抗ウサギＰＬＡプローブ（キット内含）を滴下し３７℃で６０分間処置後、洗浄溶液Ａ（キット内含）で５分間２回の洗浄を行った。次に付加したＰＬＡプローブをライゲーション処理するために、４０倍希釈したリガーゼ（キット内含）を滴下し３７℃で３０分間処置後、洗浄溶液Ａ（キット内含）で２分間２回の洗浄を行った。最後に、ライゲーション処理されたＰＬＡプローブを標識するために、８０倍希釈したポリメラーゼ（キット内含）を滴下し、３７℃で１００分間処置後、洗浄溶液Ｂ（キット内含）で１０分間２回洗浄したのち、さらに１００倍希釈した洗浄溶液Ｂで１分間洗浄を行った。その後、退色防止用の封入剤（キット内含）に封入後１５分間静置させ、蛍光顕微鏡（キーエンス）を用いてＤｕｏｌｉｎｋ陽性スポットを観察、撮影を行った。
その結果、Ｖ－１とＣＰとの相互作用は、生後１４日ではドパミン神経でほとんど検出されないが、生後４９日齢では明確に検出され、しかも顕著な増加を認めた。しかし、その後は加齢（５１２日齢）とともに著しく減少することが明らかとなった（図１２）。
【0053】
マウス中脳におけるミトコンドリアにおける電子伝達系（酸化的リン酸化）の複合体の発現に対する影響
N陳皮を経口投与した１７か月齢の雄性C57BL/6Nマウス、または既報（Yamamoto et al. 2016）のNMDA受容体NR2Dサブユニットノックアウトホモ接合体C57BL/6Nマウス（約２ヶ月齢の雄性成体）を用いた。なお、上記の１７ヶ月齢のマウスにおいてはN陳皮の経口投与（0.5 g/kg/日）を２週間行った。その後、使用した各動物個体から中脳部位を摘出し、サンプルバッファー（50 mM Tris-HCl, pH7.5, 100 mM DTT, 2% SDS, 10% Glycerol）中でホモジナイズし、95℃で5分（総ERKのウエスタンブロット解析用）または50℃で15分（ミトコンドリアのブロット解析用）ボイル後、超音波破砕（Bioraptor）を行った。遠心（13 krpm, 10分, 室温）後、得られた遠心上清（タンパク量20 μg/ウェル）をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１２％の分離ゲル）で分離し、ウェスタンブロット解析に供した。
ミトコンドリアの各複合体構成サブユニットの検出には、Total OXPHOS Rodent WB 抗体 Cocktail (Abcam, ab110413)を用いた。上記のＳＤＳ－電気泳動で中脳組織タンパク質を分離後、ゲルからＰＶＤＦメンブレンヘタンパク質を転写し、ブロットを１％スキムミルクを含むPBS(-)中で振盪しながら室温で１時間ブロッキングを行った。その後、１％スキムミルクを含むPBS(-)で6.0 μg/mLに希釈（２５０倍）した同抗体と４℃で一晩反応させた。次いで、抗マウスHRP標識二次抗体（CST、１０００倍希釈）と反応後、ECL法で検出を行った。また、protein loading controlとして総ERKを用いた。１０００倍希釈した抗p44/42（Erk1/2）抗体（CST#9102）と４℃で一晩反応後、抗ウサギHRP標識二次抗体（CST、１０００倍希釈）と反応させ、上述のECL法で総 ERK量を検出した。上記の実験結果については、少なくとも２回実験を繰り返し実施し、その再現性を確認した。
老齢マウス中脳におけるミトコンドリア電子伝達系の複合体I～Vの各構成サブユニットタンパク質の発現をウエスタンブロット法で精査した結果、N陳皮の経口投与により、その構成サブユニットタンパク質レベルがすべて増加し、その結果、成体の発現レベルまで回復した（図１３、パネル左）。さらに、成体マウスの中脳ドパミン神経で発現が認められたNMDA受容体サブユニットNR2Dを欠損する成体マウス（NR2Dノックアウトマウス）では、その中脳組織抽出液を用いて、上記の複合体I～Vの各構成サブユニットの発現レベルの低下が認められた（図１３、パネル右）。つまり、中脳ドパミン神経におけるミトコンドリアの恒常性維持機構はNMDA受容体サブユニットNR2D依存的である可能性が示唆された。
N陳皮を経口投与した１７か月齢の雄性C57BL/6Nマウス、または既報（Yamamoto et al. 2016）のNMDA受容体NR2Dサブユニットノックアウトホモ接合体C57BL/6Nマウス（約２ヶ月齢の雄性成体）を用いた。なお、上記の１７ヶ月齢のマウスにおいてはN陳皮の経口投与（0.5 g/kg/日）を２週間行った。その後、使用した各動物個体から中脳部位を摘出し、サンプルバッファー（50 mM Tris-HCl, pH7.5, 100 mM DTT, 2% SDS, 10% Glycerol）中でホモジナイズし、95℃で5分（総ERKのウエスタンブロット解析用）または50℃で15分（ミトコンドリアのブロット解析用）ボイル後、超音波破砕（Bioraptor）を行った。遠心（13 krpm, 10分, 室温）後、得られた遠心上清（タンパク量20 μg/ウェル）をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１２％の分離ゲル）で分離し、ウェスタンブロット解析に供した。
ミトコンドリアの各複合体構成サブユニットの検出には、Total OXPHOS Rodent WB 抗体 Cocktail (Abcam, ab110413)を用いた。上記のＳＤＳ－電気泳動で中脳組織タンパク質を分離後、ゲルからＰＶＤＦメンブレンヘタンパク質を転写し、ブロットを１％スキムミルクを含むPBS(-)中で振盪しながら室温で１時間ブロッキングを行った。その後、１％スキムミルクを含むPBS(-)で6.0 μg/mLに希釈（２５０倍）した同抗体と４℃で一晩反応させた。次いで、抗マウスHRP標識二次抗体（CST、１０００倍希釈）と反応後、ECL法で検出を行った。また、protein loading controlとして総ERKを用いた。１０００倍希釈した抗p44/42（Erk1/2）抗体（CST#9102）と４℃で一晩反応後、抗ウサギHRP標識二次抗体（CST、１０００倍希釈）と反応させ、上述のECL法で総 ERK量を検出した。上記の実験結果については、少なくとも２回実験を繰り返し実施し、その再現性を確認した。
老齢マウス中脳におけるミトコンドリア電子伝達系の複合体I～Vの各構成サブユニットタンパク質の発現をウエスタンブロット法で精査した結果、N陳皮の経口投与により、その構成サブユニットタンパク質レベルがすべて増加し、その結果、成体の発現レベルまで回復した（図１３、パネル左）。さらに、成体マウスの中脳ドパミン神経で発現が認められたNMDA受容体サブユニットNR2Dを欠損する成体マウス（NR2Dノックアウトマウス）では、その中脳組織抽出液を用いて、上記の複合体I～Vの各構成サブユニットの発現レベルの低下が認められた（図１３、パネル右）。つまり、中脳ドパミン神経におけるミトコンドリアの恒常性維持機構はNMDA受容体サブユニットNR2D依存的である可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【0054】
本発明により、中枢神経変性疾患の処置のための医薬組成物が提供される。また、本発明によりミトコンドリアの恒常性の維持及び／又は強化に有用な候補物質のスクリーニング方法を提供することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】