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特許7297090ＰＤＬ１及びＴＧＦβに対する二機能性融合タンパク質並びにその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-06-15
(45)【発行日】2023-06-23
(54)【発明の名称】ＰＤＬ１及びＴＧＦβに対する二機能性融合タンパク質並びにその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230616BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230616BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230616BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230616BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230616BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230616BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230616BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230616BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230616BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230616BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230616BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20230616BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230616BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20230616BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230616BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20230616BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20230616BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
C12N15/62 Z
C07K19/00
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61P35/00
A61P35/02
A61K39/395 N
A61K39/395 D
A61K38/17
A61K47/68
A61K47/64
A61K48/00
A61K35/12
C12P21/08
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2021560523
(86)(22)【出願日】2020-06-08
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-07
(86)【国際出願番号】 CN2020094855
(87)【国際公開番号】W WO2020248926
(87)【国際公開日】2020-12-17
【審査請求日】2021-10-08
(31)【優先権主張番号】201910497064.X
(32)【優先日】2019-06-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201910497723.X
(32)【優先日】2019-06-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】521442039
【氏名又は名称】山東博安生物技術股▲ふん▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＤＯＮＧ ＢＯＡＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．３９， Ｋｅｊｉ Ａｖｅｎｕｅ， Ｈｉｇｈ－Ｔｅｃｈ Ｚｏｎｅ， Ｙａｎｔａｉ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】宋徳勇
(72)【発明者】
【氏名】徐洪光
(72)【発明者】
【氏名】韓鎮
【審査官】小倉 梢
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１３－５１１９５９（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／２０５９８５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／２１８２１５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１８－５３１２１９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５１９３７５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５３６０９９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１９－５０３６８７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００８－５４４７５５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５２７９４９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５０６２１７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５００２０７（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＰＤＬ１に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、３つの重鎖相補性決定領域を含み、ＨＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号８により表され、ＨＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号９により表され、ＨＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号１０により表され、３つの軽鎖相補性決定領域をさらに含み、ＬＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号５により表され、ＬＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号６により表され、ＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号７により表される、抗体又はその抗原結合断片。
【請求項2】
配列番号２により表される重鎖可変領域及び配列番号１により表される軽鎖可変領域を含む、ＰＤＬ１に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項3】
前記その抗原結合断片が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、又はｄｓＦｖ断片を含む、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片及びＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメインを含む二機能性融合タンパク質であって、前記抗体又はその抗原結合断片及びＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメインは、リンカーにより結合している二機能性融合タンパク質。
【請求項5】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項４に記載の二機能性融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項6】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項４に記載の二機能性融合タンパク質を発現する細胞。
【請求項7】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項４に記載の二機能性融合タンパク質、又は請求項５に記載の核酸、又は請求項６に記載の細胞を含む医薬組成物。
【請求項8】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項４に記載の二機能性融合タンパク質、又は請求項５に記載の核酸、又は請求項６に記載の細胞を含むキット。
【請求項9】
癌の処置、予防、検出又は診断のための薬剤であって、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項４に記載の二機能性融合タンパク質、又は請求項５に記載の核酸、又は請求項６に記載の細胞を含む、薬剤。
【請求項10】
前記癌は、胃癌、食道癌、頭頸部癌、膀胱癌、子宮頸癌、肉腫、細胞腫、肺癌、結腸癌、卵巣癌、腎臓癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、黒色腫、乳癌、骨髄腫、神経膠腫、白血病及びリンパ腫のうちの一又は複数を含む、請求項９に記載の薬剤。
【請求項11】
癌の処置、予防、検出又は診断のための薬剤の製造における、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項４に記載の二機能性融合タンパク質、又は請求項５に記載の核酸、又は請求項６に記載の細胞の使用。
【請求項12】
前記癌は、胃癌、食道癌、頭頸部癌、膀胱癌、子宮頸癌、肉腫、細胞腫、肺癌、結腸癌、卵巣癌、腎臓癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、黒色腫、乳癌、骨髄腫、神経膠腫、白血病及びリンパ腫のうちの一又は複数を含む、請求項１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオ医薬又はバイオ医薬品の技術分野に関する。具体的には、本発明は、抗ＰＤＬ１抗体、ＰＤＬ１及びＴＧＦβに対する二機能性融合タンパク質、及びそのバリアント及び抗原結合断片、並びにその調製方法及び癌を処置するための方法及び使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ＰＤ１（プログラム細胞死－１）及びＰＤＬ１（プログラム細胞死－１リガンド１）は重要な種類の免疫チェックポイントタンパク質であり、ＰＤ１は活性化Ｔ細胞及びＮＫ細胞の表面上で発現され、腫瘍細胞は、ＰＤＬ１を大量に発現させることによりＰＤ１への結合後にＴ細胞及びＮＫ細胞の突然変異及び増殖を阻害し、次いで免疫監視から逃れる（Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９９：１２２９３－７，２００２）（Ｏｈｉｇａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １１：２９４７－５３，２００５）。したがって、ＰＤ１及びＰＤＬ１間の相互作用を遮断することにより、Ｔ細胞を再活性化させることができ、腫瘍細胞を特定し、殺滅して患者に利益を与えることができる。
【0003】
ＴＧＦβは早期腫瘍の成長を阻害し得るが、腫瘍が進行し続けるにつれ、腫瘍細胞はもはやＴＧＦβに感受性でなくなり、その時点でＴＧＦβは上皮－間質移行を順次促進し、免疫系を抑制することにより腫瘍成長を促進する（Ｂｉｅｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２００６；６：５０６－２０）。
【0004】
ＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメインは１３６アミノ酸残基長にすぎず、ＴＧＦβＲＩＩはＴＧＦβ１に結合し得る（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９５；２７０：２７４７－５４）。可溶性ＴＧＦβＲＩＩ－Ｆｃは抗癌剤として試験されており、それはネズミモデルにおいて悪性中皮腫の成長を阻害し得ることが示されている（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００４；１０：５９０７－１８）（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００４；１０：５９０７－１８）。
【0005】
Ｍｅｒｃｋ社からのＭ７８２４二機能性融合タンパク質（中国特許出願第２０１５８０００７８６５．３号明細書）は、（Ｇ４Ｓ）４ＧによりＴＧＦβＲＩＩに結合している抗ＰＤＬ１抗体アベルマブであり、いくつかの第Ｉ相及び第ＩＩ相臨床試験が完了しており、それは種々の固形腫瘍において十分に機能した（ＭＳＢ００１１３５９Ｃ）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかしながら、疾患処置についての患者の医薬的要求、特に抗体薬物についての要求に直面し、より高い結合活性及びより良好な効力を有する抗ＰＤＬ１抗体又はＰＤＬ１及びＴＧＦβに対する二機能性融合タンパク質を提供することが依然として緊急に臨床的に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の全文において、ＶＬ（軽鎖可変領域）、ＶＨ（重鎖可変領域）、ＬＣＤＲ（軽鎖相補性決定領域）、ＨＣＤＲ（重鎖相補性決定領域）、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３に関する種々の実施形態を、個々に又は任意の組み合わせで実施することができる。
【0008】
本発明は、抗体若しくはその抗原結合断片、又は二機能性融合タンパク質並びにその調製方法及び使用に関する。
【0009】
本発明の一態様において、本発明は、３つの重鎖相補性決定領域を含み、ＨＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号８により表され、ＨＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号９により表され、ＨＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号１０により表される抗体又はその抗原結合断片に関する。さらに、抗体又はその抗原結合断片は、３つの軽鎖相補性決定領域も含み、ＬＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号５により表され、ＬＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号６により表され、ＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号７により表される。
【0010】
本発明の一態様において、本発明において提供される抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２により表される重鎖可変領域を含み；好ましくは、配列番号１により表される軽鎖可変領域をさらに含む。
【0011】
本発明の一態様において、本発明は、３つの軽鎖相補性決定領域を含み、ＬＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号１１により表され、ＬＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号６により表され、ＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号１２により表され；及び／又は３つの重鎖相補性決定領域を含み、ＨＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号１３により表され、ＨＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号１４により表され、ＨＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号１５により表される抗体又はその抗原結合断片に関する。
【0012】
別の態様において、本発明は、配列番号３により表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域、及び／又は配列番号４により表されるアミノ酸配列の重鎖可変領域を含む抗体又はその抗原結合断片に関する。
【0013】
別の態様において、上記態様のいずれか１つの抗体又はその抗原結合断片の軽鎖定常領域の配列は、配列番号１６である。
【0014】
別の態様において、上記態様のいずれか１つの抗体又はその抗原結合断片の重鎖定常領域の配列は、配列番号１７である。
【0015】
具体的には、本発明において提供される抗体又はその抗原結合断片は、好ましくは、配列番号１により表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域、配列番号２により表されるアミノ酸配列の重鎖可変領域、配列番号１６により表されるアミノ酸配列の軽鎖定常領域及び配列番号１７により表されるアミノ酸配列の重鎖定常領域を含む。或いは、本発明において提供される抗体又はその抗原結合断片は、好ましくは、配列番号３により表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域、配列番号４により表されるアミノ酸配列の重鎖可変領域、配列番号１６により表されるアミノ酸配列の軽鎖定常領域及び配列番号１７により表されるアミノ酸配列の重鎖定常領域を含む。
【0016】
別の態様において、本発明は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ｄｓＦｖ断片などを含む、上記態様のいずれか１つの抗体又はその抗原結合断片に関する。
【0017】
別の態様において、上記抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つは、ＰＤＬ１に結合する。
【0018】
別の態様において、本発明は、上記態様のいずれか１つの抗体又はその抗原結合断片及びＴＧＦβＲＩＩ断片を含む二機能性融合タンパク質に関し、好ましくは、ＴＧＦβＲＩＩ断片は、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインを含む。
【0019】
別の態様において、二機能性融合タンパク質において、上記態様のいずれか１つの抗体又はその抗原結合断片は、リンカーによりＴＧＦβＲＩＩ断片に結合しており、好ましくは、ＴＧＦβＲＩＩ断片は、好ましくは、（Ｇ４Ｓ）４Ｇ（すなわち、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ）リンカーにより抗体又はその抗原結合断片の重鎖定常領域のＣ末端に結合しており、好ましくは、二機能性融合タンパク質の重鎖定常領域の配列は、配列番号２２であり、好ましくは、二機能性融合タンパク質のＴＧＦβＲＩＩ断片の配列は、配列番号２３であり；具体的には、二機能性融合タンパク質の構造は、抗体又はその抗原結合断片－（Ｇ４Ｓ）４Ｇ－ＴＧＦβＲＩＩ断片である。
【0020】
別の態様において、二機能性融合タンパク質において、抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域の配列は、配列番号１であり、重鎖可変領域の配列は、配列番号２であり、好ましくは、二機能性融合タンパク質において、軽鎖定常領域の配列は、配列番号１６であり、重鎖定常領域の配列は、配列番号２２であり、ＴＧＦβＲＩＩ断片の配列は、配列番号２３であり；具体的には、（Ｇ４Ｓ）４Ｇにより結合している重鎖定常領域及びＴＧＦβＲＩＩ断片の配列は、配列番号１８である。
【0021】
別の態様において、二機能性融合タンパク質において、抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域の配列は、配列番号３であり、重鎖可変領域の配列は、配列番号４であり、好ましくは、二機能性融合タンパク質において、軽鎖定常領域の配列は、配列番号１６であり、重鎖定常領域の配列は、配列番号２２であり、ＴＧＦβＲＩＩ断片の配列は、配列番号２３であり；具体的には、（Ｇ４Ｓ）４Ｇにより結合している重鎖定常領域及びＴＧＦβＲＩＩ断片の配列は、配列番号１８である。
【0022】
別の態様において、上記二機能性融合タンパク質のいずれか１つは、ＰＤＬ１及びＴＧＦβに結合する。
【0023】
別の態様において、本発明は、上記態様のいずれか１つの抗体若しくはその抗原結合断片又は二機能性融合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0024】
別の態様において、本発明は、上記態様の核酸を含むベクターに関し、又はベクターは、上記態様のいずれか１つの抗体若しくはその抗原結合断片若しくは二機能性融合タンパク質を発現し得る。好ましくは、ベクターは、ウイルスベクターであり得；好ましくは、ウイルスベクターとしては、限定されるものではないが、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられ；好ましくは、ベクターは、非ウイルスベクターであり得；好ましくは、ベクターは、哺乳類細胞発現ベクターであり得；好ましくは、発現ベクターは、細菌発現ベクターであり得；好ましくは、発現ベクターは、真菌発現ベクターであり得る。
【0025】
別の態様において、本発明は、上記態様のいずれか１つの抗体若しくはその抗原結合断片又は二機能性融合タンパク質の細胞を発現し得る細胞に関する。好ましくは、細胞は、細菌細胞であり；好ましくは、細菌細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などであり；好ましくは、細胞は、真菌細胞であり；好ましくは、真菌細胞は、酵母細胞であり；好ましくは、酵母細胞は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などであり；好ましくは、細胞は、哺乳類細胞であり；好ましくは、哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒト胚性腎細胞（２９３）、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＤＣ細胞、ＮＫ細胞などである。
【0026】
別の態様において、本発明は、上記態様のいずれか１つの抗体若しくはその抗原結合断片、二機能性融合タンパク質、核酸、ベクター又は細胞を含む医薬組成物に関し、好ましくは、医薬組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含み、好ましくは、薬学的に許容可能な賦形剤としては、以下の１つ以上：薬学的に許容可能な溶媒、分散剤、添加剤、可塑剤などが挙げられる。
【0027】
別の態様において、医薬組成物は、他の治療剤をさらに含み得る。一部の実施形態において、他の治療剤としては、化学療法剤、免疫療法剤、又はホルモン療法剤が挙げられる。抗体又は抗原結合断片及び他の治療剤の併用投与は、治療効果を向上させ得る。
【0028】
別の態様において、「治療効果を向上させる」は、他の治療剤又は治療の治療効果を向上させることを指す。本発明において提供される抗体又は抗原結合断片は、個々に又は他の治療剤若しくは治療と併用して投与することができる。一部の実施形態において、他の治療剤又は治療としては、化学療法剤、免疫療法剤、ホルモン療法剤、放射線療法及び手術が挙げられる。
【0029】
別の態様において、本発明の抗体若しくはその抗原結合断片を含むキット、又は二機能性融合タンパク質を含むキット、又は抗体若しくはその抗原結合断片若しくは二機能性融合タンパク質をコードする核酸を含むキットが提供される。
【0030】
別の態様において、本発明は、疾患の処置又は予防のための医薬品の調製における、上記態様のいずれか１つの抗体若しくはその抗原結合断片、二機能性融合タンパク質、核酸、ベクター又は細胞の用途に関する。
【0031】
別の態様において、本発明は、診断又は検出キットの調製における、上記態様のいずれか１つの抗体若しくはその抗原結合断片、二機能性融合タンパク質又は核酸の用途に関する。
【0032】
別の態様において、上記態様のいずれか１つの抗体若しくはその抗原結合断片、二機能性融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞又は医薬組成物を、必要とされる対象に投与することを含む、疾患を処置し、又は予防する方法が提供される。
【0033】
別の態様において、上記態様のいずれか１つの抗体若しくはその抗原結合断片、二機能性融合タンパク質、核酸又はキットを、必要とされる対象又はサンプルに投与することを含む、診断又は検出の方法が提供される。好ましくは、方法は、疾患を診断し、又は検出する方法である。
【0034】
別の態様において、本発明は、疾患の処置又は予防のための、上記態様のいずれか１つの抗体若しくはその抗原結合断片、二機能性融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞又は医薬組成物の使用に関する。
【0035】
別の態様において、本発明は、検出又は診断のための、上記態様のいずれか１つの抗体若しくはその抗原結合断片、二機能性融合タンパク質、核酸、又はキットの使用に関する。好ましくは、使用は、疾患を診断し、又は検出するためのものである。
【0036】
別の態様において、疾患は、癌である。
【0037】
別の態様において、癌としては、胃癌、食道癌、頭頸部癌、膀胱癌、子宮頸癌、肉腫、細胞腫、肺癌、結腸癌、卵巣癌、腎臓癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、黒色腫、乳癌、骨髄腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫などが挙げられる。
【0038】
別の態様において、本発明は、細胞を上記ベクターにより形質移入し、形質移入細胞により抗体若しくはその抗原結合断片、若しくは二機能性融合タンパク質を発現させることを含み；又は上記細胞を用いて抗体若しくはその抗原結合断片、若しくは二機能性融合タンパク質を発現させることを含む、上記態様のいずれか１つの抗体若しくはその抗原結合断片、又は二機能性融合タンパク質を調製する方法に関する。
【0039】
本発明において提供される抗体若しくはその抗原結合断片又は二機能性融合タンパク質は、以下の利点の１つ以上：ＴＧＦβ１結合活性の向上、ＰＤＬ１親和性の向上、ＰＤ１へのＰＤＬ１の結合を遮断する能力の向上、ＴＧＦβ１機能の遮断活性の向上、Ｔ細胞のＩＦＮ－γの分泌を促進する能力の向上、より良好な免疫調節効果及びより良好な腫瘍抑制効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【0040】
【図1】５回の免疫化後のＢｏＡｎ－ｈＭａｂ１マウスの血清力価（２５００倍希釈）を示す。
【図2】ＴＧＦβ１タンパク質への二機能性融合タンパク質の結合を示す。
【図3】二機能性融合タンパク質がＣＤ４＋ＴによるＩＦＮ－γの分泌を促進することを示す。
【図4】ＴＧＦβ１機能に対する二機能性融合タンパク質の遮断効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0041】
本発明は、具体的な実施形態との関連で以下にさらに記載される。記載される実施形態は本発明の実施形態の一部であるが、実施形態の全てではない。以下の実施例は、本発明の方法及び組成物をどのように使用するかの一般的開示及び記載を、本発明が属する分野の当業者に提供するために挙げられ、本発明の範囲を限定することを意図しないことが理解されるべきである。本発明の実施形態に基づき、発明の着想を用いずに当業者により得られる全ての他の実施形態は、本発明の範囲内である。
【0042】
材料及び試薬：ＰＤＬ１タンパク質（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，カタログ番号：１００８４－Ｈ０８Ｈ）；ＰＤ１タンパク質（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，カタログ番号：１０３７７－Ｈ０８Ｈ）；ＴＧＦβ１（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，カタログ番号：１０８０４－ＨＮＡＣ）；ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ，１００１８９６０）；ＴＭＢ（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｍａｋｅｗｏｎｄｅｒ，カタログ番号：１００１）；ＳＴＲＥＰ／ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ，カタログ番号：８９０８０３）；ＨＢＳ－ＥＰ＋１×緩衝液（ＧＥ，カタログ番号：ＢＲ－１００８－２６）；酵素標識プレート（Ｓｕｚｈｏｕ Ｂｅａｖｅｒ，カタログ番号：４０３０１）；バイオセンサーチップ（ＧＥ，カタログ番号：ＢＲ１００５３０）；９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，カタログ番号：３７９９）；抗ヒトＩｇＧ Ｆｃアミノカップリングキット（ＧＥ，カタログ＃ＢＲ－１００８－３９）；
【実施例】
【0043】
実施例１ ＰＤＬ１及びＴＧＦβに対する二機能性融合タンパク質の調製
１．１ ＰＤＬ１タンパク質の免疫化
ＰＤＬ１タンパク質を完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号：Ｆ５８８１－１０ＭＬ）、不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号：Ｆ５５０６－１０ＭＬ）又はゴールドアジュバント（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号：Ｔ２６８４－１ｍＬ）により乳化してＢｏａｎ ｂｉｏの完全ヒト抗体トランスジェニックマウスＢｏＡｎ－ｈＭａｂ１（中国特許第１０３５７１８７２Ｂ号明細書に記載の方法に従って調製）を免疫化する。６匹の雄及び５匹の雌を含む合計１１匹のマウスをこのとき免疫化し、マウスの月齢は６～１２か月であり、合計５回の免疫化を実施し、より高い血清力価を有する６匹のマウスを上記ＰＤＬ１タンパク質によるブースター免疫化のために選択した。ＥＬＩＳＡにより検出された血清力価（２５００倍希釈）を図１に示す。ここで、ＰＬ１Ｑ１５、ＰＬ１Ｑ１６、ＰＬ１Ｑ１８、ＰＬ１Ｑ１９及びＰＬ１Ｑ２１マウスはフロイントアジュバントにより免疫化されたマウスであり、ＰＬ１Ｑ２４マウスはゴールドアジュバントにより免疫化されたマウスであった。
１．１ ＰＤＬ１タンパク質の免疫化
ＰＤＬ１タンパク質を完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号：Ｆ５８８１－１０ＭＬ）、不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号：Ｆ５５０６－１０ＭＬ）又はゴールドアジュバント（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号：Ｔ２６８４－１ｍＬ）により乳化してＢｏａｎ ｂｉｏの完全ヒト抗体トランスジェニックマウスＢｏＡｎ－ｈＭａｂ１（中国特許第１０３５７１８７２Ｂ号明細書に記載の方法に従って調製）を免疫化する。６匹の雄及び５匹の雌を含む合計１１匹のマウスをこのとき免疫化し、マウスの月齢は６～１２か月であり、合計５回の免疫化を実施し、より高い血清力価を有する６匹のマウスを上記ＰＤＬ１タンパク質によるブースター免疫化のために選択した。ＥＬＩＳＡにより検出された血清力価（２５００倍希釈）を図１に示す。ここで、ＰＬ１Ｑ１５、ＰＬ１Ｑ１６、ＰＬ１Ｑ１８、ＰＬ１Ｑ１９及びＰＬ１Ｑ２１マウスはフロイントアジュバントにより免疫化されたマウスであり、ＰＬ１Ｑ２４マウスはゴールドアジュバントにより免疫化されたマウスであった。
【0044】
１．２ ファージライブラリーの確立
１．１におけるより高い血清力価を有する６匹のマウスを犠死させ、脾臓を摘出し、脾臓をシリンジゴム栓により粉砕し、破壊し、フィルター（ＦＡＬＣＯＮ，カタログ番号：３５２３５０）により濾過し、濾過された脾臓を後の使用のために冷凍した。ＲＮＡ抽出後、逆転写を実施してｃＤＮＡを得、ファージライブラリーを確立するためのステップは、Ｃａｒｌｏｓ Ｆ．Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ，Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌに記載の方法を指し、重鎖及び軽鎖の可変領域をＰＣＲによりｃＤＮＡから得、次いで重鎖及び軽鎖の可変領域の重複伸長ＰＣＲにより単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を得、ｓｃＦｖをＳｆｉＩ酵素（ＮＥＢ，カタログ番号：＃Ｒ０１２３Ｌ）により消化し、次いでプラスミドｐＣＯＭＢ３ｘ（ＢＩＯＶＥＣＴＯＲ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｐｌａｓｍｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｔｒａｉｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ．，５１０８３７）をＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）によりライゲートし、ライゲーション生成物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１コンピテント細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ，カタログ番号：Ａ９６５９５－２）中に電気的形質移入し、形質移入ＴＧ１を３７℃、２２０ｒｐｍのシェーカー中でインキュベートした後、ファージを添加して感染させ、培養物の上清を回収し、濃縮し、精製してファージライブラリーを得た。
１．１におけるより高い血清力価を有する６匹のマウスを犠死させ、脾臓を摘出し、脾臓をシリンジゴム栓により粉砕し、破壊し、フィルター（ＦＡＬＣＯＮ，カタログ番号：３５２３５０）により濾過し、濾過された脾臓を後の使用のために冷凍した。ＲＮＡ抽出後、逆転写を実施してｃＤＮＡを得、ファージライブラリーを確立するためのステップは、Ｃａｒｌｏｓ Ｆ．Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ，Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌに記載の方法を指し、重鎖及び軽鎖の可変領域をＰＣＲによりｃＤＮＡから得、次いで重鎖及び軽鎖の可変領域の重複伸長ＰＣＲにより単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を得、ｓｃＦｖをＳｆｉＩ酵素（ＮＥＢ，カタログ番号：＃Ｒ０１２３Ｌ）により消化し、次いでプラスミドｐＣＯＭＢ３ｘ（ＢＩＯＶＥＣＴＯＲ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｐｌａｓｍｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｔｒａｉｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ．，５１０８３７）をＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）によりライゲートし、ライゲーション生成物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１コンピテント細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ，カタログ番号：Ａ９６５９５－２）中に電気的形質移入し、形質移入ＴＧ１を３７℃、２２０ｒｐｍのシェーカー中でインキュベートした後、ファージを添加して感染させ、培養物の上清を回収し、濃縮し、精製してファージライブラリーを得た。
【0045】
１．３ ファージライブラリーのスクリーニング
プレートスクリーニング：ＣＢＳ緩衝液の調製：１．５９ｇのＮａ２ＣＯ３（Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ，１００１９２６０）及び２．９３ｇのＮａＨＣＯ３を秤量し、蒸留水を１Ｌまで添加してＣＢＳ緩衝液を調製した。ＰＤＬ１タンパク質をＣＢＳ緩衝液により１０μｇ／ｍＬに希釈し、次いでスクリーニングプレート（Ｃｏｓｔａｒ，４２５９２）に１００μｇ／ウェルにおいて添加し、８つのウェルをそれぞれのライブラリーに使用し、スクリーニングプレートを４℃において一晩放置し；ウェルプレート中のタンパク質溶液を翌日廃棄し、プレートを２％のＢＳＡ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ，Ａ８０１０）により１時間シールし、ファージライブラリー（２×１０１２個／ウェル）サンプルを添加して３７℃において２時間インキュベートし、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）により４～１０回洗浄した後、ＰＤＬ１特異的結合ファージを溶出緩衝液（４．２ｍｌの濃塩酸（Ｃｏｍｅｏ）を５００ｍｌの超純水に添加し、グリシン粉末（Ｂｉｏｔｏｐｐｅｄ，ＢＧ０６１７－５００）によりｐＨを２．２に調整する）により溶出させた。
プレートスクリーニング：ＣＢＳ緩衝液の調製：１．５９ｇのＮａ２ＣＯ３（Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ，１００１９２６０）及び２．９３ｇのＮａＨＣＯ３を秤量し、蒸留水を１Ｌまで添加してＣＢＳ緩衝液を調製した。ＰＤＬ１タンパク質をＣＢＳ緩衝液により１０μｇ／ｍＬに希釈し、次いでスクリーニングプレート（Ｃｏｓｔａｒ，４２５９２）に１００μｇ／ウェルにおいて添加し、８つのウェルをそれぞれのライブラリーに使用し、スクリーニングプレートを４℃において一晩放置し；ウェルプレート中のタンパク質溶液を翌日廃棄し、プレートを２％のＢＳＡ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ，Ａ８０１０）により１時間シールし、ファージライブラリー（２×１０１２個／ウェル）サンプルを添加して３７℃において２時間インキュベートし、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）により４～１０回洗浄した後、ＰＤＬ１特異的結合ファージを溶出緩衝液（４．２ｍｌの濃塩酸（Ｃｏｍｅｏ）を５００ｍｌの超純水に添加し、グリシン粉末（Ｂｉｏｔｏｐｐｅｄ，ＢＧ０６１７－５００）によりｐＨを２．２に調整する）により溶出させた。
【0046】
マグネティックビーズスクリーニング：ＰＤＬ１－ｍＦｃタンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号：ＰＤ１－Ｈ５２Ａ３）のビオチン化（タンパク質とビオチンとのモル比は１：２である）：ＰＤＬ１－ｍＦｃタンパク質を０．１ＭのｐＨ８．０のＮａＨＣＯ３に変化させ、適切な量のビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ，２１３３５）を精密天秤により秤量し、次いで超純水により溶解させ、適切な量の溶解ビオチンをＰＤＬ１－ｍＦｃタンパク質溶液に直ちに添加し、ロータリーミキサー上で暗所で４０分間インキュベートし、次いで標識後にＰＤＬ１－ｍＦｃタンパク質溶液をＰＢＳに変化させた。ビオチン化ＰＤＬ１－ｍＦｃタンパク質（３μｇ／ライブラリー）をマグネティックビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ストレプトアビジン，カタログ番号：００３５５８７１）（１０μＬ／ライブラリー）に室温において１時間結合させ、次いで２％のＢＳＡによりシールした後、ファージライブラリーと室温において２時間インキュベートし、４～１０回洗浄した後にＰＤＬ１特異的結合ファージを溶出緩衝液（ｐＨ２．２）により溶出させた。
【0047】
ファージクローンは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を介してｓｃＦｖを発現し、次いでＥＬＩＳＡを介してｓｃＦｖによるＰＤＬ１／ＰＤ１結合の遮断を検出し、活性を遮断するクローンを後続の分子の構築のために保持する。
【0048】
ｓｃＦｖによるＰＤＬ１／ＰＤ１結合の遮断のＥＬＩＳＡ検出：ＰＤＬ１タンパク質をｐＨ９．６のＣＢＳにより０．５μｇ／ｍＬに希釈し、酵素標識プレートにより１００μＬ／ウェルでコーティングし、４℃において一晩インキュベートし；プレートを洗浄した後、３％の脱脂粉乳を３７℃において１時間シーリングに使用した。プレートを洗浄後した後、５０μＬのｓｃＦｖペリプラズムをそれぞれのウェルに添加した。次いで、ビオチン標識ＰＤＬ１－Ｆｃタンパク質（最終濃度は０．２μｇ／ｍＬであった）を５０μＬ／ウェルで添加し、３７℃において１時間インキュベートし；プレートを洗浄した後、ＰＢＳＴにより希釈されたＳＴＲＥＰ／ＨＲＰを１００μＬ／ウェルで添加し、３７℃において１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、１００μＬのＴＭＢを発色のためにそれぞれのウェルに添加し、１０分後、５０μＬの２ＭのＨ２ＳＯ４をそれぞれのウェルに添加して発色を停止させ、ＯＤ４５０をマイクロプレートリーダーにより読み取った。
【0049】
１．４ 二機能性融合タンパク質の構築及び産生
マグネティックビーズスクリーニングされたクローンＢＡ５３３、ＢＡ６０３、ＢＡ６１３、ＢＡ６２３、ＢＡ６４９、ＢＡ６６９、ＢＡ４４６及びプレートスクリーニングされたクローンＢＡ７０５を、シーケンシングのためにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄに送付した。それぞれのクローンの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列を以下の表１に提示する。
マグネティックビーズスクリーニングされたクローンＢＡ５３３、ＢＡ６０３、ＢＡ６１３、ＢＡ６２３、ＢＡ６４９、ＢＡ６６９、ＢＡ４４６及びプレートスクリーニングされたクローンＢＡ７０５を、シーケンシングのためにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄに送付した。それぞれのクローンの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列を以下の表１に提示する。
【0050】
【0051】
可変領域遺伝子増幅（２＊Ｐｈａｎｔａ Ｍａｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ，製造業者：Ｖａｚｙｍｅ，カタログ番号：Ｐ５１５－ＡＡ）、シグナルペプチド及び可変領域重複伸長、相同組換え（ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ ＩＩ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ，製造業者：Ｖａｚｙｍｅ，カタログ番号：Ｃ１１２－０１）及び他の方法を介して、ＶＨをコードするヌクレオチド配列断片を、配列番号１８をコードするヌクレオチド配列を有するベクターｐＣＤＮＡ３．４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中に最終的に挿入し、配列番号１８は、（Ｇ４Ｓ）４Ｇにより結合しているＩｇＧ１抗体の重鎖定常領域の配列及びＴＧＦβＲＩＩ配列を含有し、ＶＬをコードするヌクレオチド配列断片を、抗体の軽鎖定常領域アミノ酸配列（配列番号１６）をコードするヌクレオチド配列を有するベクターｐＣＤＮＡ３．４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中に挿入し、次いでＨＥＫ２９３細胞を形質移入し、３７℃＼８％のＣＯ２＼１２５ｒｐｍのシェーカー中で６から７日間インキュベートし、最後に培養物上清をプロテインＡフィラーにより精製して後続の検出のために表２の二機能性融合タンパク質のクローンを得た。
【0052】
【0053】
対照二機能性融合タンパク質の産生：Ｍｅｒｃｋ社のＭ７８２４二機能性融合タンパク質は、（Ｇ４Ｓ）４ＧによりＴＧＦβＲＩＩに結合している抗ＰＤＬ１抗体アベルマブであり、いくつかの第Ｉ相及び第ＩＩ相臨床試験は完了しており、それは種々の固形腫瘍において十分機能した。Ｍｅｒｃｋ社のアベルマブの可変領域のアミノ酸配列（重鎖可変領域の配列は配列番号１９であり、軽鎖可変領域の配列は配列番号２０である）をＩＭＧＴデータベースにより決定し、完全遺伝子を合成し、次いでＨＥＫ２９３細胞中での発現のためにベクターｐＣＤＮＡ３．４中に挿入し、精製された二機能性融合タンパク質をＰＬＴＧＢ－Ｍ７８２４－ＩｇＧ１と命名する（重鎖可変領域の配列は配列番号１９であり、軽鎖可変領域の配列は配列番号２０であり、軽鎖定常領域の配列は配列番号２１であり、重鎖定常領域及びＴＧＦβＲＩＩの配列は配列番号１８である）。
【0054】
１．５ 二機能性融合タンパク質によるＰＤＬ１－ＰＤ１結合の遮断のＥＬＩＳＡ検出
ＰＤ１タンパク質をｐＨ９．６におけるＣＢＳにより０．５μｇ／ｍＬに希釈し、次いで酵素標識プレートにより１００μＬ／ウェルでコーティングし、４℃において一晩インキュベートし；プレートを洗浄した後、３％の脱脂粉乳を３７℃において１時間のシーリングに使用し；プレートを洗浄した後、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）を添加して二機能性融合タンパク質を異なる濃度（０．５μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬ、０．１２５μｇ／ｍＬ、０．０６２５μｇ／ｍＬ、０．０３１２５μｇ／ｍＬ、０．０１５６２５μｇ／ｍＬ）に５０μＬ／ウェルで希釈し、次いでビオチン標識ＰＤＬ１－Ｆｃタンパク質（最終濃度は０．２μｇ／ｍＬである）を５０μＬ／ウェルで添加し、３７℃において１時間インキュベートし；ＰＢＳＴにより希釈されたＳＴＲＥＰ／ＨＲＰを１００μＬ／ウェルで添加し、３７℃において１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ＴＭＢを発色のために添加し、１０分後に５０μＬの２ＭのＨ２ＳＯ４をそれぞれのウェルに添加して発色を停止させ、ＯＤ４５０をマイクロプレートリーダー上で読み取った。結果は、本発明の候補二機能性融合タンパク質（ＰＬＴＧＢＱ１６－ＢＡ４６６－ＩｇＧ１、ＰＬＴＧＢＱ１９－ＢＡ５３３－ＩｇＧ１、ＰＬＴＧＢＱ２４－ＢＡ６０３－ＩｇＧ１、ＰＬＴＧＢＱ２１－ＢＡ６２３－ＩｇＧ１、ＰＬＴＧＢＱ２１－ＢＡ６４９－ＩｇＧ１、ＰＬＴＧＢＱ２１－ＢＡ６６９－ＩｇＧ１、ＰＬＴＧＢＱ２４－ＢＡ７０５－ＩｇＧ１、ＰＬＴＧＢＨ０３－ＢＴ６１３－ＩｇＧ１）がＰＤＬ１へのＰＤ１の結合を有効に遮断し得ることを示す。
ＰＤ１タンパク質をｐＨ９．６におけるＣＢＳにより０．５μｇ／ｍＬに希釈し、次いで酵素標識プレートにより１００μＬ／ウェルでコーティングし、４℃において一晩インキュベートし；プレートを洗浄した後、３％の脱脂粉乳を３７℃において１時間のシーリングに使用し；プレートを洗浄した後、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）を添加して二機能性融合タンパク質を異なる濃度（０．５μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬ、０．１２５μｇ／ｍＬ、０．０６２５μｇ／ｍＬ、０．０３１２５μｇ／ｍＬ、０．０１５６２５μｇ／ｍＬ）に５０μＬ／ウェルで希釈し、次いでビオチン標識ＰＤＬ１－Ｆｃタンパク質（最終濃度は０．２μｇ／ｍＬである）を５０μＬ／ウェルで添加し、３７℃において１時間インキュベートし；ＰＢＳＴにより希釈されたＳＴＲＥＰ／ＨＲＰを１００μＬ／ウェルで添加し、３７℃において１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ＴＭＢを発色のために添加し、１０分後に５０μＬの２ＭのＨ２ＳＯ４をそれぞれのウェルに添加して発色を停止させ、ＯＤ４５０をマイクロプレートリーダー上で読み取った。結果は、本発明の候補二機能性融合タンパク質（ＰＬＴＧＢＱ１６－ＢＡ４６６－ＩｇＧ１、ＰＬＴＧＢＱ１９－ＢＡ５３３－ＩｇＧ１、ＰＬＴＧＢＱ２４－ＢＡ６０３－ＩｇＧ１、ＰＬＴＧＢＱ２１－ＢＡ６２３－ＩｇＧ１、ＰＬＴＧＢＱ２１－ＢＡ６４９－ＩｇＧ１、ＰＬＴＧＢＱ２１－ＢＡ６６９－ＩｇＧ１、ＰＬＴＧＢＱ２４－ＢＡ７０５－ＩｇＧ１、ＰＬＴＧＢＨ０３－ＢＴ６１３－ＩｇＧ１）がＰＤＬ１へのＰＤ１の結合を有効に遮断し得ることを示す。
【0055】
１．６ ＴＧＦβ１タンパク質への二機能性融合タンパク質の結合のＥＬＩＳＡ検出
ＴＧＦβ１をｐＨ９．６のＣＢＳにより異なる濃度（０．２μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、０．０１２５μｇ／ｍＬ）に希釈し、次いで酵素標識プレートにより１００μＬ／ウェルでそれぞれコーティングし、４℃において一晩インキュベートし；プレートを洗浄した後、３％の脱脂粉乳を３７℃において１時間のシーリングに使用し；プレートを洗浄した後、１００μＬのＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）希釈された候補二機能性融合タンパク質（１μｇ／ｍＬ）をそれぞれのウェルに添加し、３７℃において１時間インキュベートし；次いでヤギ抗ヒトＩｇＧ／ＨＲＰを添加し、３７℃において１時間インキュベートし；プレートを洗浄した後、ＴＭＢを発色のために添加し、１０分後に５０μＬの２ＭのＨ２ＳＯ４をそれぞれのウェルに添加して発色を停止させ、ＯＤ４５０をマイクロプレートリーダー上で読み取った。結果を表３及び図２に示す。
ＴＧＦβ１をｐＨ９．６のＣＢＳにより異なる濃度（０．２μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、０．０１２５μｇ／ｍＬ）に希釈し、次いで酵素標識プレートにより１００μＬ／ウェルでそれぞれコーティングし、４℃において一晩インキュベートし；プレートを洗浄した後、３％の脱脂粉乳を３７℃において１時間のシーリングに使用し；プレートを洗浄した後、１００μＬのＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）希釈された候補二機能性融合タンパク質（１μｇ／ｍＬ）をそれぞれのウェルに添加し、３７℃において１時間インキュベートし；次いでヤギ抗ヒトＩｇＧ／ＨＲＰを添加し、３７℃において１時間インキュベートし；プレートを洗浄した後、ＴＭＢを発色のために添加し、１０分後に５０μＬの２ＭのＨ２ＳＯ４をそれぞれのウェルに添加して発色を停止させ、ＯＤ４５０をマイクロプレートリーダー上で読み取った。結果を表３及び図２に示す。
【0056】
候補二機能性融合タンパク質ＰＬＴＧＢＱ１９－ＢＡ５３３－ＩｇＧ１及びＰＬＴＧＢＱ２１－ＢＡ６６９－ＩｇＧ１は、対照群ＰＬＴＧＢ－Ｍ７８２４－ＩｇＧ１よりも種々の濃度において高いＯＤ値を有し、候補二機能性融合タンパク質がＴＧＦβ１に対するより良好な結合能を有することを示す。
【0057】
さらに、候補二機能性融合タンパク質ＰＬＴＧＢＱ１９－ＢＡ５３３－ＩｇＧ１及びＰＬＴＧＢＱ２１－ＢＡ６６９－ＩｇＧ１は、対照群ＰＬＴＧＢ－Ｍ７８２４－ＩｇＧ１よりも良好にＴＧＦ経路を遮断し得、臨床においてより良好な免疫調節及び抗腫瘍特性を有することが予測される。
【0058】
【0059】
実施例２ 二機能性融合タンパク質の特徴付け
２．１ 二機能性融合タンパク質の産生
ＥｘｐｉＣＨＯ（Ｔｈｅｒｍｏ，カタログ番号：Ａ２９１２９）発現系を使用して形質移入し、二機能性融合タンパク質を発現させ、プロテインＡ（ＧＥ，Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ）カラムを使用して上清を精製し：細胞培養液を４５００ｇにおいて遠心分離し、０．４５μｍフィルターにより濾過し、ローディング及び平衡化後に標的二機能性融合タンパク質を０．１ＭのｐＨ３．２のグリシン緩衝液により溶出させ、ｐＨ８．０の１Ｍのトリスにより中和した。サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ，カタログ番号：ＡＧ３１９１０９）を使用して精製し：カラムを１．５ＣＶの緩衝液により平衡化し、サンプルをロードし、サンプル容量は３％のＣＶ以下であり、緩衝液によりリンスし続け、ピークが出現した後に標的二機能性融合タンパク質を回収する。
２．１ 二機能性融合タンパク質の産生
ＥｘｐｉＣＨＯ（Ｔｈｅｒｍｏ，カタログ番号：Ａ２９１２９）発現系を使用して形質移入し、二機能性融合タンパク質を発現させ、プロテインＡ（ＧＥ，Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ）カラムを使用して上清を精製し：細胞培養液を４５００ｇにおいて遠心分離し、０．４５μｍフィルターにより濾過し、ローディング及び平衡化後に標的二機能性融合タンパク質を０．１ＭのｐＨ３．２のグリシン緩衝液により溶出させ、ｐＨ８．０の１Ｍのトリスにより中和した。サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ，カタログ番号：ＡＧ３１９１０９）を使用して精製し：カラムを１．５ＣＶの緩衝液により平衡化し、サンプルをロードし、サンプル容量は３％のＣＶ以下であり、緩衝液によりリンスし続け、ピークが出現した後に標的二機能性融合タンパク質を回収する。
【0060】
２．２ 二機能性融合タンパク質活性の混合リンパ球反応／ＭＬＲ検出
ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号：１１８７５－０９３）、ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号：１００９１－１４８）、ＨＥＰＥＳ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ，カタログ番号：Ｈ１０９０）を９０：１０：１に従って混合して完全培地を調製し、ＤＣ細胞（ＡＬＬＣＥＬＬＳ，カタログ番号：ＰＢ－ＤＣ００１Ｆ－０．３Ｍ）及びＣＤ４＋Ｔ細胞（ＡＬＬＣＥＬＬＳ，カタログ番号：ＰＢ００９－２Ｆ－Ｃ－３Ｍ）を完全培地によりそれぞれ再懸濁させ、次いで１：１０の細胞比に従って９６ウェル丸底プレートに添加し、最終容量は１５０μＬ／ウェルである。二機能性融合タンパク質を完全培地により２つの濃度：４μｇ／ｍＬ及び０．４μｇ／ｍＬに希釈し、細胞ウェルに５０μＬ／ウェルでそれぞれ添加し、最終容量は２００μＬである。５日間培養した後、培養物上清をＩＦＮ－γキット（ｃｉｓｂｉｏ，カタログ番号：６２ＨＩＦＮＧＰＥＧ）により検出した。検出結果を表４及び図３に示す。
ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号：１１８７５－０９３）、ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号：１００９１－１４８）、ＨＥＰＥＳ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ，カタログ番号：Ｈ１０９０）を９０：１０：１に従って混合して完全培地を調製し、ＤＣ細胞（ＡＬＬＣＥＬＬＳ，カタログ番号：ＰＢ－ＤＣ００１Ｆ－０．３Ｍ）及びＣＤ４＋Ｔ細胞（ＡＬＬＣＥＬＬＳ，カタログ番号：ＰＢ００９－２Ｆ－Ｃ－３Ｍ）を完全培地によりそれぞれ再懸濁させ、次いで１：１０の細胞比に従って９６ウェル丸底プレートに添加し、最終容量は１５０μＬ／ウェルである。二機能性融合タンパク質を完全培地により２つの濃度：４μｇ／ｍＬ及び０．４μｇ／ｍＬに希釈し、細胞ウェルに５０μＬ／ウェルでそれぞれ添加し、最終容量は２００μＬである。５日間培養した後、培養物上清をＩＦＮ－γキット（ｃｉｓｂｉｏ，カタログ番号：６２ＨＩＦＮＧＰＥＧ）により検出した。検出結果を表４及び図３に示す。
【0061】
候補二機能性融合タンパク質ＰＬＴＧＢＱ１９－ＢＡ５３３－ＩｇＧ１及びＰＬＴＧＢＱ２１－ＢＡ６６９－ＩｇＧ１は、対照群ＰＬＴＧＢ－Ｍ７８２４－ＩｇＧ１よりも同じ濃度において高いＩＦＮ－γ分泌値を有する。
【0062】
さらに、候補二機能性融合タンパク質ＰＬＴＧＢＱ１９－ＢＡ５３３－ＩｇＧ１及びＰＬＴＧＢＱ２１－ＢＡ６６９－ＩｇＧ１は、対照群ＰＬＴＧＢ－Ｍ７８２４－ＩｇＧ１よりも良好な免疫調節及び抗腫瘍特性を有し得ることが予測される。
【0063】
【0064】
２．３ 二機能性融合タンパク質及びＰＤＬ１タンパク質の親和性のＳＰＲ検出
抗体結合カイネティクスは、検出のためにＢＩＡｃｏｒｅ８Ｋ装置を採用する。抗ヒトＩｇＧ抗体を、抗ヒトＩｇＧ ＦｃアミノカップリングキットによりＣＭ５バイオセンサーチップにカップリングしておよそ１０００ＲＵ（応答単位）を得た。ＰＤＬ１をＨＢＳ－ＥＰ＋１×緩衝液により５０ｎＭに希釈し、次いで合計５つの濃度（５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ）に２倍希釈し、ブランク対照を設定した。測定ステップ及び条件は以下のとおりであった：二機能性融合タンパク質サンプルインジェクション２μｇ／ｍＬ、サンプルインジェクション時間７０秒、流量５μｌ／分、安定時間５秒；ＰＤＬ１タンパク質結合及び解離：結合６０秒、流量３０μｌ／分、解離４５０秒；再生：再生を３ＭのＭｇＣｌ２緩衝液により３０秒間実施し、３回に分けて開始した。会合定数（ｋａ）及び解離定数（ｋｄ）を、１対１ラングミュアモデル（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して計算し、平衡解離定数ＫＤをｋｄ／ｋａから計算する。それぞれの二機能性融合タンパク質の親和性データを表５に示す。
抗体結合カイネティクスは、検出のためにＢＩＡｃｏｒｅ８Ｋ装置を採用する。抗ヒトＩｇＧ抗体を、抗ヒトＩｇＧ ＦｃアミノカップリングキットによりＣＭ５バイオセンサーチップにカップリングしておよそ１０００ＲＵ（応答単位）を得た。ＰＤＬ１をＨＢＳ－ＥＰ＋１×緩衝液により５０ｎＭに希釈し、次いで合計５つの濃度（５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ）に２倍希釈し、ブランク対照を設定した。測定ステップ及び条件は以下のとおりであった：二機能性融合タンパク質サンプルインジェクション２μｇ／ｍＬ、サンプルインジェクション時間７０秒、流量５μｌ／分、安定時間５秒；ＰＤＬ１タンパク質結合及び解離：結合６０秒、流量３０μｌ／分、解離４５０秒；再生：再生を３ＭのＭｇＣｌ２緩衝液により３０秒間実施し、３回に分けて開始した。会合定数（ｋａ）及び解離定数（ｋｄ）を、１対１ラングミュアモデル（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して計算し、平衡解離定数ＫＤをｋｄ／ｋａから計算する。それぞれの二機能性融合タンパク質の親和性データを表５に示す。
【0065】
結果は、本発明の候補二機能性融合タンパク質ＰＬＴＧＢＱ１９－ＢＡ５３３－ＩｇＧ１及びＰＬＴＧＢＱ２１－ＢＡ６６９－ＩｇＧ１が、対照群ＰＬＴＧＢ－Ｍ７８２４－ＩｇＧ１と実質的に等価のＰＤＬ１親和性を有することを示す。ここで、ＰＬＴＧＢＱ１９－ＢＡ５３３－ＩｇＧ１は対照群よりも良好なＰＤＬ１親和性を有する。
【0066】
【0067】
２．４ ＭＶ－１－Ｌｕ細胞によるＴＧＦβ１機能に対する二機能性融合タンパク質の遮断効果の検出
ＥＭＥＭ（ＡＴＣＣ，カタログ番号：３０－２００３）、ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号：１００９９－１４１）及びＨＥＰＥＳ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ，カタログ番号：Ｈ１０９０）を９０：１０：１に従って混合して完全培地を調製し、ＭＶ－１－Ｌｕ細胞を完全培地により再懸濁させ、白色９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，カタログ番号：３９１７）に５０μＬ／ウェル、２０００個の細胞／ウェルで添加した。二機能性融合タンパク質を完全培地により３３３．３ｎｇ／ｍＬに希釈し、次いで連続して合計６つの濃度に３回希釈し、細胞ウェル中に２５μＬ／ウェルで添加した。ＴＧＦβ１を完全培地により２ｎｇ／ｍｌに希釈し、細胞ウェル中に２５μＬ／ウェルで添加した。二機能性融合タンパク質の最終濃度：８３．３ｎｇ／ｍＬ、２７．８ｎｇ／ｍＬ、９．２６ｎｇ／ｍＬ、３．０９ｎｇ／ｍＬ、１．０３ｎｇ／ｍＬ及び０．３４ｎｇ／ｍＬ。４日間培養した後、９６ウェルプレートの蛍光値（蛍光値は細胞数を表し得る）をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号：Ｇ７５７１）により検出し、検出結果を図４に示す。
ＥＭＥＭ（ＡＴＣＣ，カタログ番号：３０－２００３）、ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号：１００９９－１４１）及びＨＥＰＥＳ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ，カタログ番号：Ｈ１０９０）を９０：１０：１に従って混合して完全培地を調製し、ＭＶ－１－Ｌｕ細胞を完全培地により再懸濁させ、白色９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，カタログ番号：３９１７）に５０μＬ／ウェル、２０００個の細胞／ウェルで添加した。二機能性融合タンパク質を完全培地により３３３．３ｎｇ／ｍＬに希釈し、次いで連続して合計６つの濃度に３回希釈し、細胞ウェル中に２５μＬ／ウェルで添加した。ＴＧＦβ１を完全培地により２ｎｇ／ｍｌに希釈し、細胞ウェル中に２５μＬ／ウェルで添加した。二機能性融合タンパク質の最終濃度：８３．３ｎｇ／ｍＬ、２７．８ｎｇ／ｍＬ、９．２６ｎｇ／ｍＬ、３．０９ｎｇ／ｍＬ、１．０３ｎｇ／ｍＬ及び０．３４ｎｇ／ｍＬ。４日間培養した後、９６ウェルプレートの蛍光値（蛍光値は細胞数を表し得る）をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号：Ｇ７５７１）により検出し、検出結果を図４に示す。
【0068】
候補二機能性融合タンパク質ＰＬＴＧＢＱ１９－ＢＡ５３３－ＩｇＧ１及びＰＬＴＧＢＱ２１－ＢＡ６６９－ＩｇＧ１は、ＴＧＦβ１機能の遮断において対照群ＰＬＴＧＢ－Ｍ７８２４－ＩｇＧ１よりも良好な活性を有することを確認することができる。
【0069】
さらに、候補二機能性融合タンパク質ＰＬＴＧＢＱ１９－ＢＡ５３３－ＩｇＧ１及びＰＬＴＧＢＱ２１－ＢＡ６６９－ＩｇＧ１は、対照群ＰＬＴＧＢ－Ｍ７８２４－ＩｇＧ１よりも良好にＴＧＦ経路を遮断し得、より良好な免疫調節及び抗腫瘍特性を有することが予測される。
【0070】
実施例３ マウスＭＣ３８－ｈＰＤＬ１結腸癌モデルにおける抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体の効力試験
二機能性融合タンパク質に対応するＩｇＧ１モノクローナル抗体を構築し、ＰＬＴＧＢＱ１９－ＢＡ５３３－ＩｇＧ１に対応するモノクローナル抗体はＢＡ５３３－ＩｇＧ１（重鎖可変領域の配列は配列番号２であり、軽鎖可変領域の配列は配列番号１であり、軽鎖定常領域の配列は配列番号１６であり、重鎖定常領域の配列は配列番号１７である）であり；ＰＬＴＧＢＱ２１－ＢＡ６６９－ＩｇＧ１に対応するモノクローナル抗体はＢＡ６６９－ＩｇＧ１（重鎖可変領域の配列は配列番号４であり、軽鎖可変領域の配列は配列番号３であり、軽鎖定常領域の配列は配列番号１６であり、重鎖定常領域の配列は配列番号１７である）であり；ＰＬＴＧＢ－Ｍ７８２４－ＩｇＧに対応するモノクローナル抗体はアベルマブ（重鎖可変領域の配列は配列番号１９であり、軽鎖可変領域の配列は配列番号２０であり、軽鎖定常領域の配列は配列番号２１であり、重鎖定常領域の配列は配列番号１７である）である。
二機能性融合タンパク質に対応するＩｇＧ１モノクローナル抗体を構築し、ＰＬＴＧＢＱ１９－ＢＡ５３３－ＩｇＧ１に対応するモノクローナル抗体はＢＡ５３３－ＩｇＧ１（重鎖可変領域の配列は配列番号２であり、軽鎖可変領域の配列は配列番号１であり、軽鎖定常領域の配列は配列番号１６であり、重鎖定常領域の配列は配列番号１７である）であり；ＰＬＴＧＢＱ２１－ＢＡ６６９－ＩｇＧ１に対応するモノクローナル抗体はＢＡ６６９－ＩｇＧ１（重鎖可変領域の配列は配列番号４であり、軽鎖可変領域の配列は配列番号３であり、軽鎖定常領域の配列は配列番号１６であり、重鎖定常領域の配列は配列番号１７である）であり；ＰＬＴＧＢ－Ｍ７８２４－ＩｇＧに対応するモノクローナル抗体はアベルマブ（重鎖可変領域の配列は配列番号１９であり、軽鎖可変領域の配列は配列番号２０であり、軽鎖定常領域の配列は配列番号２１であり、重鎖定常領域の配列は配列番号１７である）である。
【0071】
マウス結腸癌ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。培養条件は、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号：１００９９－１４１Ｃ）及び１％のＰ／Ｓ（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号：１５０７０－０６３）をＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号：１１９６５－０９２）培地中で添加し、５％のＣＯ２で３７℃においてインキュベーター中で培養することである。継代培養を週２～３回実施する。Ｂ－ｈＰＤ－Ｌ１ヒト化マウス、雌、６～８週齢をＪｉａｎｇｓｕ Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。
【0072】
良好な状態のＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を回収し、ＰＢＳ中で再懸濁させ、混合し、細胞濃度を５×１０６個／ｍｌに調整し、０．１ｍｌの細胞懸濁液をそれぞれのマウスの背側肢（ｄｏｒｓａｌ ｌｉｍｂ）上で皮下接種した。平均腫瘍容積が８７ｍｍ３に達したとき、無作為化を開始した。それぞれ６匹のマウスの７つの群が存在し、投与を群分けの日に開始し、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体をＰＢＳにより希釈し、それぞれの抗体は、２日ごとに１回腹腔内注射により投与される２つの用量：３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇを有し、同じ容量のＰＢＳを溶媒対照群において対照として与えた。マウスを秤量し、腫瘍容積を週２～３回測定し、腫瘍容積（ｍｍ３）＝０．５×長径×短径２とした。対照群の腫瘍容積が２０００ｍｍ３に達したとき、マウスを安楽死させ、腫瘍を取り出し、秤量した。結果を図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ並びに表６及び７に示す。
【0073】
図５Ａに示されるとおり、マウスの体重はいかなる有害反応もなく安定的に増加する。
【0074】
図５Ｂ及び図７Ｃに示されるとおり、ＢＡ５３３－ＩｇＧ１、ＢＡ６６９－ＩｇＧ１、及びアベルマブを１０ｍｇ／ｋｇの用量において投与した場合、それらはマウスＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１の腫瘍の成長を有意に阻害し得、相対腫瘍抑制率ＴＧＩ（％）≧８０％、であり、それら３つの間で統計差は存在しない。ＢＡ５３３－ＩｇＧ１、ＢＡ６６９－ＩｇＧ１、及びアベルマブを３ｍｇ／ｋｇの用量において投与した場合、ＢＡ５３３－ＩｇＧ１及びＢＡ６６９－ＩｇＧ１の腫瘍抑制率はアベルマブよりも優れていた。
【0075】
上記結果は、低用量において、候補抗体は対照抗体よりも良好な腫瘍抑制効果を有し、高用量において、それらはまた同等の腫瘍抑制効果を有することを示す。
【0076】
【0077】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A-5B】
【図5C】
【配列表】