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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-06-15
(45)【発行日】2023-06-23
(54)【発明の名称】ＴＩＧＩＴに対する抗体及びその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230616BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230616BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230616BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230616BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230616BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230616BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230616BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230616BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230616BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230616BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230616BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230616BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230616BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/02 C
C12P21/08
A61K39/395 U
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61P35/00
A61P43/00 121
A61K45/00
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2021564195
(86)(22)【出願日】2020-05-22
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-12
(86)【国際出願番号】 KR2020006705
(87)【国際公開番号】W WO2020251187
(87)【国際公開日】2020-12-17
【審査請求日】2021-12-24
(31)【優先権主張番号】10-2019-0069931
(32)【優先日】2019-06-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】517095191
【氏名又は名称】グリーン クロス コーポレーション
【氏名又は名称原語表記】Ｇｒｅｅｎ Ｃｒｏｓｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
(73)【特許権者】
【識別番号】515047781
【氏名又は名称】モガム インスティチュート フォー バイオメディカル リサーチ
【氏名又は名称原語表記】ＭＯＧＡＭ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(74)【代理人】
【氏名又は名称】森田 憲一
(72)【発明者】
【氏名】パク ヘヨン
(72)【発明者】
【氏名】ソン ウンジョン
(72)【発明者】
【氏名】イ ウンヒ
(72)【発明者】
【氏名】ヨム ヘイン
(72)【発明者】
【氏名】ナム ヘミ
(72)【発明者】
【氏名】キム ムンギョン
(72)【発明者】
【氏名】イ ジウォン
(72)【発明者】
【氏名】シン ジュンヒョク
(72)【発明者】
【氏名】ホ ミンギュ
(72)【発明者】
【氏名】イム ソジョン
(72)【発明者】
【氏名】イム オクチェ
(72)【発明者】
【氏名】イム ヤンミ
(72)【発明者】
【氏名】ウォン ジョンファ
【審査官】山内 達人
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／２０４４０５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／１０２５３６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／１６０７０４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１８－５３３３７１（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ｃ０７Ｋ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＴＩＧＩＴ（Ｔ ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｉｇ ａｎｄ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ－Ｂａｓｅｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｍｏｔｉｆ Ｄｏｍａｉｎｓ）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、配列番号３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号５の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２；配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３；
配列番号６の重鎖ＣＤＲ１；配列番号７の重鎖ＣＤＲ２；配列番号８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２；配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３；
配列番号９の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２；配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２１の軽鎖ＣＤＲ２；配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ３；
配列番号９の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２；配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２１の軽鎖ＣＤＲ２；配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ３；又は
配列番号１２の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２；配列番号１３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２６の軽鎖ＣＤＲ２；配列番号２７の軽鎖ＣＤＲ３、
を含む、抗体又はその抗原結合断片。
【請求項2】
配列番号２８～３２からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項3】
配列番号３４～３８からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
【請求項5】
請求項４に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項6】
請求項５に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項7】
次の段階を含むＴＩＧＩＴに結合する抗体又はその抗原結合断片の製造方法：（ａ）請求項６に記載の細胞を培養する段階；及び
（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階。
【請求項8】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む癌の予防又は治療用組成物。
【請求項9】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、他の抗癌治療と併用するための癌の予防又は治療用組成物。
【請求項10】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、免疫チェックポイント抑制剤と併用するための癌の予防又は治療用組成物。
【請求項11】
前記免疫チェックポイント抑制剤は、ＰＤ－１をターゲットとする薬物又は抗体であることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＴＩＧＩＴ（Ｔ ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｉｇ ａｎｄ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ－Ｂａｓｅｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｍｏｔｉｆ Ｄｏｍａｉｎｓ）に対する抗体又はその抗原結合断片、これをコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターで形質転換された細胞、前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法、これを含む癌の予防又は治療用組成物及び併用投与用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
癌組織は、免疫細胞が接近できない場合と、免疫細胞が癌組織中に浸透しているが、癌組織によって免疫反応が抑制されている場合がある。人体の免疫システムは、Ｔ細胞の過多増殖による過剰免疫反応を抑制するための免疫チェックポイントシステムを有するが、このような免疫チェックポイントに関与する免疫チェックポイントタンパク質（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）をターゲットとする免疫チェックポイント遮断剤（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ）は、癌細胞を直接に標的（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）する方式ではなく、癌組織の周辺にあるが、癌細胞が発現させる免疫抑制因子（ＣＤ８０、ＴＩＧＩＴ）によって活性の低下したＴＩＬ（ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）、特に、ＣＴＬ（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ）の活性を回復させることにより、ＣＴＬが癌細胞を除去するように誘導する。このとき、癌細胞表面の抑制因子とＴ細胞抑制受容体（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）との結合を防ぐことにより、抑制信号伝達（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を遮断し、他の刺激信号伝達（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を有効に作用させ、結果的にＣＴＬの活性を高める効果を奏する。
【0003】
既存の化学治療剤では、薬物の深刻な副作用から、薬物の投与を中断しなければならない場合が多いのに対し、免疫チェックポイント遮断剤は、全生存期間（ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ）と無増悪生存期間（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ－ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ）などにおいて臨床的優位を示し、副作用も軽微な程度に止まり得る。また、既存の化学治療剤は、同一癌の再発時に、治療剤に対する抵抗性を獲得し、投与不可になってしまうのに対し、免疫チェックポイント遮断剤の投与による抗癌免疫反応は、同一癌腫の再発時にメモリー応答（ｍｅｍｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を起こし、速かに癌細胞を退治することができる。
【0004】
免疫チェックポイント遮断剤と関連して、免疫チェックポイント受容体であるＣＴＬＡ－４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ－４）特異的な単クローン抗体であるイピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）が、転移性悪性黒色腫においてその効果を示している。続いて、ＰＤ－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ－１）とＰＤ－１に対するリガンドであるＰＤ－Ｌ１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ－１）に特異的な単クローン抗体が開発されており、その代表として、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）とデュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）などがある。ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１抑制剤は、悪性黒色腫の他に種々の腫瘍でもその効果を示している。
【0005】
一方、ＴＩＧＩＴ（＝Ｖｓｔｍ－３，ＷＵＣＡＭ）は、ＰＤ－１と同様に、ＮＫ細胞とＴ細胞が活性化しながら発現が誘導される共抑制分子（ｃｏ－ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）であり、癌細胞はＴＩＧＩＴに対するリガンドを過発現させることによってＴ細胞を抑制し、Ｔ細胞からの攻撃を回避できる。抗ＴＩＧＩＴ抗体は、癌細胞のＴＩＧＩＴを用いた免疫活性抑制を遮断することによって癌患者の免疫機能を回復させ、癌の進行を防ぐと予想される。
【0006】
ＴＩＧＩＴは、ＰＤ－１と類似に、ＣＤ８＋ＣＴＬとＣＤ４＋ Ｔヘルパー細胞（ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌ）で誘導発現し、癌組織において免疫反応を抑制することを主導するＦｏｘＰ３＋ ＴｒｅｇではＰＤ－１と共に持続的に発現し、Ｔｒｅｇ活性化時に、より高いレベルで誘導発現する。
【0007】
現在まで数種類の抗ＴＩＧＩＴ抗体が報告されたが（米国特許出願公開第２０１７－００８８６１３号など）、具体的な機序に対する研究はまだ僅かな実情であり、しかも、実際に治療剤として使用可能なレベルの効力（ｅｆｆｉｃａｃｙ）を有する抗体が開発されていない実情であり、依然として高レベルの効力を有するＴＩＧＩＴ特異的抗体に対する要求が切に望まれている状況である。
【0008】
このような技術的背景下で、本出願の発明者らは、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体を開発するために努力した。その結果、本発明者らは、ＴＩＧＩＴに高い親和力で結合する抗ＴＩＧＩＴ抗体を開発し、このような抗ＴＩＧＩＴ抗体が効率的な免疫抗癌治療剤として働き得ることを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【0009】
本発明の目的は、ＴＩＧＩＴに対する新規抗体又はその抗原結合断片を提供することにある。
【0010】
本発明の他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を提供することにある。
【0011】
本発明の他の目的は、前記核酸を含むベクター、該ベクターで形質転換された細胞及びその製造方法を提供することにある。
【0012】
本発明のさらに他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を含む癌の予防又は治療用組成物を提供することにある。
【0013】
本発明のさらに他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を他の薬物と共に投与して癌を予防又は治療するための併用投与用組成物を提供することにある。
【0014】
上記の目的を達成するために、本発明は、ＴＩＧＩＴ（Ｔ ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｉｇ ａｎｄ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ－Ｂａｓｅｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｍｏｔｉｆ Ｄｏｍａｉｎｓ）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、配列番号３、６、９又は１２の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４、７又は１０の重鎖ＣＤＲ２；配列番号５、８、１１又は１３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１４、１７、２０、２３又は２５の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１５、１８、２１又は２６の軽鎖ＣＤＲ２；配列番号１６、１９、２２、２４又は２７の軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0015】
本発明は、また、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を提供する。
【0016】
本発明は、また、前記核酸を含むベクターを提供する。
【0017】
本発明は、また、前記ベクターで形質転換された細胞を提供する。
【0018】
本発明は、また、次の段階を含む前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法を提供する：（ａ）前記細胞を培養する段階；及び、（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階。
【0019】
本発明は、また、前記抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む癌の予防又は治療用組成物を提供する。
【0020】
本発明は、また、前記抗体又はその抗原結合断片を他の抗癌治療と併用するための癌の予防又は治療用組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】ｓｃＦｖ形態の抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合力を確認した結果である。
【0022】
【図2】ＩｇＧ形態の抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合力を確認した結果である。
【0023】
【図3】１１種の抗ＴＩＧＩＴ抗体に対して行った、ＴＩＧＩＴとそのリガンドであるＰＶＲ（ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に対するブロッキングアッセイ（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｓｓａｙ）結果である。
【0024】
【図4】オクテット（Ｏｃｔｅｔ）を用いて抗ＴＩＧＩＴ抗体の親和度を測定した結果である。
【0025】
【図5】ＢＩＡＣＯＲＥで抗ＴＩＧＩＴ抗体の親和度を測定した結果である。
【0026】
【図6】細胞表面に発現したＴＩＧＩＴとＴＩＧＩＴ候補抗体との結合力を測定した結果である。
【0027】
【図7】ＴＩＧＩＴのリガンドであるＰＶＲに対するＴＩＧＩＴ候補抗体の競争力を確認した結果である。
【0028】
【図8】ＴＩＧＩＴ候補抗体のＴＩＧＩＴとＰＶＲとの結合抑制効果によるＴ細胞活性化を分析した結果である。
【0029】
【図9】ＴＩＧＩＴ候補抗体のマウス、サル及びヒトのＴＩＧＩＴへの結合力があるどうかの交差反応を確認した結果である。
【0030】
【図10】調節Ｔ細胞（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ）とＣＦＳＥ標識されたレスポンダー（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）細胞を共同培養して、ＴＩＧＩＴ候補抗体によって調節Ｔ細胞の機能が抑制されることを確認した結果である。
【0031】
【図11】ＴＩＧＩＴ候補抗体の抗癌効果を確認した結果である。
【0032】
【図12A-12B】樹状細胞と同種異系Ｔ細胞を用いた混合リンパ球反応において明示された抗体を処理した時、Ｔ細胞の増殖及びＩＦＮ－γ分泌量の変化を分析した結果である。
【0033】
【図13】健康な供与者の調節性（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）Ｔ細胞に明示の抗体を処理した時、各活性指標を発現する細胞の比率を分析した結果である。
【0034】
【図14】多発性骨髄腫患者のＣＤ８陽性Ｔ細胞と調節性Ｔ細胞において枯渇指標（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）を発現させる細胞の比率を分析した結果である。
【0035】
【図15】多発性骨髄腫患者のＰＢＭＣに明示の抗体を処理した時、ＩＦＮ－γ分泌量の変化を分析した結果である。
【0036】
【図16】ＨＴ２９細胞株においてＰＶＲの発現を分析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【0037】
特に断らない限り、本明細書で使われる技術的及び科学的用語はいずれも、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、本技術分野でよく知られており、通常用いられるものである。
【0038】
本発明は、一観点において、ＴＩＧＩＴ（Ｔ ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｉｇ ａｎｄ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ－Ｂａｓｅｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｍｏｔｉｆ Ｄｏｍａｉｎｓ）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、配列番号３、６、９又は１２の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４、７又は１０の重鎖ＣＤＲ２；配列番号５、８、１１又は１３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１４、１７、２０、２３又は２５の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１５、１８、２１又は２６の軽鎖ＣＤＲ２；配列番号１６、１９、２２、２４又は２７の軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体又はその抗原結合断片に関する。
【0039】
前記ＴＩＧＩＴは、配列番号１の配列を含む。
【0040】
本明細書で使われる用語“抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）”は、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗ＴＩＧＩＴ抗体を意味する。本発明の範囲には、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する完全な抗体形態の他に、前記抗体分子の抗原結合断片も含まれる。
【0041】
本発明の抗体は、単一クローン抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦＶ）及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、これらの抗体のエピトープ結合断片などを含むが、これに限定されるものではない。
【0042】
前記単一クローン抗体は、抗原上の単一決定因子に対する抗体を意味し、実質的に同質的な抗体集団から得た抗体、すなわち、集団を占めている個々の抗体が、微量で存在し得る可能な天然発生的突然変異の以外には同一であるものを指す。
【0043】
“エピトープ”は、抗体が特異的に結合可能なタンパク質決定部位（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を意味する。エピトープは、一般に化学的に活性である表面分子群、例えば、アミノ酸又は糖側鎖で構成され、一般に、特定の３次元の構造的特徴の他に、特定の電荷特性も有する。立体的エピトープ及び非立体的エピトープは、変性溶媒の存在下で前者に対する結合は消失されるが、後者に対しては消失されないという点で区別される。
【0044】
完全な抗体は、２個の全長の軽鎖及び２個の全長の重鎖を有する構造であり、各軽鎖は重鎖とジスルフィド結合で連結されている。重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びエプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の定常領域は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する。
【0045】
抗体の抗原結合断片又は抗体断片は、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含む。抗体断片のうち、Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域、軽鎖の定常領域、及び重鎖の一番目の定常領域（ＣＨ１）を有する構造であり、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域だけを有する最小の抗体片である。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが連結されており、一本鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ，ｓｃＦｖ）は一般に、ペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とが共有結合で連結されたり又はＣ末端で直接連結されており、二重鎖Ｆｖと同様にダイマーのような構造をなすことができる。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全抗体をパパインで制限切断すればＦａｂが得られ、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ’）２断片が得られる。）、又は遺伝子組換え技術で作製してもよい。
【0046】
“Ｆｖ”断片は、完全な抗体認識及び結合部位を含有する抗体断片である。このような領域は、１個の重鎖可変ドメインと１個の軽鎖可変ドメインが、例えば、ｓｃＦｖで強固に事実上共有して連合した二量体からなる。
【0047】
“Ｆａｂ”断片は、軽鎖の可変及び定常ドメインと、重鎖の可変及び第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、一般に、それらの間にヒンジシステインによってそれらのカルボキシ末端の近くに共有して連結される一対のＦａｂ断片を含む。
【0048】
“一本鎖Ｆｖ”又は“ｓｃＦｖ”抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含むが、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖内に存在する。Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のために目的とする構造を形成できるようにするＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含むことができる。
【0049】
一実施例において、本発明に係る抗体は、Ｆｖ形態（例えば、ｓｃＦｖ）であるか、完全な抗体形態である。また、重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）又はエプシロン（ε）のいずれか一つのアイソタイプから選ばれてよい。例えば、定常領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ３（ＩｇＧ３）又はガンマ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ型でよい。
【0050】
本明細書で使われる用語“重鎖”とは、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨと３個の定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３とを含む全長重鎖及びその断片を全て意味する。また、本明細書で使われる用語“軽鎖”とは、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬと定常領域ドメインＣＬとを含む全長軽鎖及びその断片を全て意味する。
【0051】
重鎖及び／又は軽鎖の一部が特別な種から由来したり、又は特別な抗体部類又は亜部類に属する抗体内の相応する配列と同一であるか或いはそれと相同性であるのに対し、残りの鎖はさらに他の種から由来したり、又はさらに他の抗体部類又は亜部類に属する抗体内の相応する配列と同一であるか或いはそれと相同性である“キメラ”抗体（免疫グロブリン）の他、目的とする生物学的活性を示す前記抗体の断片も含まれる。
【0052】
本願に使われている“抗体可変ドメイン”は、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、及び骨格領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖及び重鎖部分のことを指す。ＶＨは、重鎖の可変ドメインのことを指す。ＶＬは、軽鎖の可変ドメインのことを指す。
【0053】
“相補性決定領域”（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）は、抗原結合のために必要な存在である、抗体可変ドメインのアミノ酸残基のことを指す。各可変ドメインは典型的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として確認された３個のＣＤＲ領域を有する。本発明の一実施例において、配列番号３、６、９又は１２の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４、７又は１０の重鎖ＣＤＲ２；配列番号５、８、１１又は１３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１４、１７、２０、２３又は２５の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１５、１８、２１又は２６の軽鎖ＣＤＲ２；配列番号１６、１９、２２、２４又は２７の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【0054】
本発明において、前記ＴＩＧＩＴに結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３の重鎖ＣＤＲ１；配列番号４の重鎖ＣＤＲ２；配列番号５の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２；配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３；
配列番号６の重鎖ＣＤＲ１；配列番号７の重鎖ＣＤＲ２；配列番号８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２；配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３；
配列番号９の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２；配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２１の軽鎖ＣＤＲ２；配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ３；
配列番号９の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２；配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２１の軽鎖ＣＤＲ２；配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ３；又は
配列番号１２の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２；配列番号１３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２６の軽鎖ＣＤＲ２；配列番号２７の軽鎖ＣＤＲ３を含むことができる。
配列番号６の重鎖ＣＤＲ１；配列番号７の重鎖ＣＤＲ２；配列番号８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２；配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３；
配列番号９の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２；配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２１の軽鎖ＣＤＲ２；配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ３；
配列番号９の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２；配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２１の軽鎖ＣＤＲ２；配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ３；又は
配列番号１２の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２；配列番号１３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２６の軽鎖ＣＤＲ２；配列番号２７の軽鎖ＣＤＲ３を含むことができる。
【0055】
“骨格領域”（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは典型的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４として確認された４個のＦＲを有する。
【0056】
ＴＩＧＩ抗体は１価又は２価であり、一本鎖又は二本鎖を含む。機能的に、ＴＩＧＩ抗体の結合親和性は、１０－５Ｍ～１０－１２Ｍの範囲内にある。例えば、ＴＩＧＩ抗体の結合親和性は、１０－６Ｍ～１０－１２Ｍ、１０－７Ｍ～１０－１２Ｍ、１０－８Ｍ～１０－１２Ｍ、１０－９Ｍ～１０－１２Ｍ、１０－５Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－６Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－７Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－８Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－９Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－１０Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－５Ｍ～１０－１０Ｍ、１０－６Ｍ～１０－１０Ｍ、１０－７Ｍ～１０－１０Ｍ、１０－８Ｍ～１０－１０Ｍ、１０－９Ｍ～１０－１０Ｍ、１０－５Ｍ～１０－９Ｍ、１０－６Ｍ～１０－９Ｍ、１０－７Ｍ～１０－９Ｍ、１０－８Ｍ～１０－９Ｍ、１０－５Ｍ～１０－８Ｍ、１０－６Ｍ～１０－８Ｍ、１０－７Ｍ～１０－８Ｍ、１０－５Ｍ～１０－７Ｍ、１０－６Ｍ～１０－７Ｍ又は１０－５Ｍ～１０－６Ｍである。
【0057】
前記ＴＩＧＩＴに結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２８～３２からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖可変領域を含むことができる。また、前記ＴＩＧＩＴに結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３４～３８からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖可変領域を含むことができる。
【0058】
本発明に係る具体的実施例において、配列番号２８の重鎖可変領域及び配列番号３４の軽鎖可変領域；配列番号２９の重鎖可変領域及び配列番号３５の軽鎖可変領域；配列番号３０の重鎖可変領域及び配列番号３６の軽鎖可変領域；配列番号３１の重鎖可変領域及び配列番号３７の軽鎖可変領域；又は、配列番号３２の重鎖可変領域及び配列番号３８の軽鎖可変領域を含むことができる。
【0059】
“ファージディスプレイ”は、変異体ポリペプチドを、ファージ、例えば繊維状ファージ粒子の表面上に、外皮タンパク質の少なくとも一部との融合タンパク質としてディスプレイする技術である。ファージディスプレイの有用性は、無作為化タンパク質変異体の大きいライブラリーを対象にして、標的抗原と高親和度で結合する配列を迅速ながらも効率的に分類できるということにある。ペプチド及びタンパク質ライブラリーをファージ上にディスプレイすることは、特異的結合特性を有するポリペプチドを見出すために、数百万個のポリペプチドをスクリーニングすることに用いられてきた。
【0060】
ファージディスプレイ技術は、特定リガンド（例えば、抗原）と結合する新規タンパク質を生成及び選別するための強力な道具を提供している。ファージディスプレイ技術を用いて、タンパク質変異体の大きいライブラリーを生成させ、標的抗原と高親和性で結合する配列を迅速に分類することができる。変異体ポリペプチドを暗号化する核酸をウイルス性外皮タンパク質、例えば、遺伝子ＩＩＩタンパク質又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質を暗号化する核酸配列と融合させる。タンパク質又はポリペプチドを暗号化する核酸配列を、遺伝子ＩＩＩタンパク質の一部を暗号化する核酸配列と融合させた１価ファージディスプレイシステムが開発されている。１価ファージディスプレイシステムでは、遺伝子融合物が低レベルで発現し、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質も発現して粒子感染性が維持される。
【0061】
繊維状ファージの表面上におけるペプチドの発現とＥ．ｃｏｌｉの周辺細胞質における機能性抗体断片の発現を立証することが、抗体ファージディスプレイライブラリーを開発する上で重要である。抗体又は抗原結合性ポリペプチドのライブラリーは、多数の方式、例えば、無作為ＤＮＡ配列を挿入することによって単一遺伝子を変更させる方法、又は関連遺伝子系列をクローニングする方法で製造した。ライブラリーを対象にして、目的とする特徴を伴う抗体又は抗原結合性タンパク質の発現に関してスクリーニングすることができる。
【0062】
ファージディスプレイ技術は、目的とする特徴を有する抗体を製造するための通常のハイブリドーマ及び組換え方法に比べて、いくつかの利点を有する。このような技術は、動物を使用しなくとも短時間で様々な配列を持つ大きい抗体ライブラリーを生成可能にする。ハイブリドーマの製造又はヒト化抗体の製造は、数ヶ月の製造期間がかかり得る。また、免疫が一切要求されないため、ファージ抗体ライブラリーは、毒性であるか又は抗原性の低い抗原に対しても抗体を生成させることができる。また、ファージ抗体ライブラリーを用いて新規な治療的抗体を生成及び確認することができる。
【0063】
ファージディスプレイライブラリーを用いて免疫又は非免疫させたヒト、生殖細胞系配列、又は未感作（ｎａｉｖｅ）Ｂ細胞Ｉｇレパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｒｙ）からヒト抗体を生成させる技術を用いることができる。各種リンパ系組織を用いて、未感作又は非免疫抗原結合性ライブラリーを製造することができる。
【0064】
ファージディスプレイライブラリーから高親和性抗体を確認及び分離できる技術は、治療用新規抗体分離に重要である。ライブラリーから高親和性抗体を分離することは、ライブラリーのサイズ、細菌性細胞における生産効率及びライブラリーの多様性に左右され得る。ライブラリーのサイズは、抗体又は抗原結合性タンパク質の不適切なフォールディング及び停止コドンの存在による非効率的生産によって減少する。細菌性細胞での発現は、抗体又は抗原結合性ドメインが適切にフォールディングされない場合には抑制され得る。発現は、可変／定常界面の表面又は選別されたＣＤＲ残基における残基を交互に突然変異させることによって改善させることができる。骨格領域の配列は、細菌性細胞において抗体ファージライブラリーを生成させる場合に適切なフォールディングを提供するための一要素である。
【0065】
高親和性抗体分離において抗体又は抗原結合性タンパク質の様々なライブラリーを生成させることが重要である。ＣＤＲ３領域は、それらがしばしば抗原結合に参加することが明らかにされた。重鎖上のＣＤＲ３領域は、サイズ、配列及び構造的立体形態面において非常に様々であり、これを用いて様々なライブラリーを製造することができる。
【0066】
また、各位置において２０個アミノ酸を全て使用して可変重鎖及び軽鎖のＣＤＲ領域を無作為化することによって多様性を発生させることができる。２０個の全てのアミノ酸を使用すれば、多様性の大きい変異体抗体配列が生成され、新規の抗体を確認する機会が増加し得る。
【0067】
本発明の抗体又は抗体断片は、ＴＩＧＩＴを特異的に認識できる範囲内で、本明細書に記載された本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体の配列だけでなく、その生物学的均等物も含むことができる。例えば、抗体の結合親和度及び／又はその他生物学的特性をより改善させるために、抗体のアミノ酸配列に更なる変化を与えることができる。このような変形は、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む。このようなアミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づいてなる。アミノ酸側鎖置換体のサイズ、形態及び種類に対する分析により、アルギニン、リジン（ｌｙｓｉｎｅ）及びヒスチジンはいずれも陽電荷を帯びた残基であり；アラニン、グリシン及びセリンは、類似のサイズを有し；フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは類似の形態を有するということがわかる。したがって、このような考慮事項に基づき、アルギニン、リジン及びヒスチジン；アラニン、グリシン及びセリン；そしてフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは生物学的に機能均等物といえる。
【0068】
上述した生物学的均等活性を有する変異を考慮すると、本発明の抗体又はこれをコードする核酸分子は、配列番号に記載された配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むものと解釈される。前記の実質的な同一性は、上記の本発明の配列と任意の他の配列を最大限に対応するようにアラインし、当業界における通常のアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、少なくとも９０％の相同性、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアラインメント方法は、当業界に公知されている。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）は、ＮＢＣＩなどから接近可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動して用いることができる。ＢＬＳＡＴは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で接続可能である。このプログラムを用いた配列相同性比較方法は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌで確認できる。
【0069】
これに基づき、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、明細書に記載の明示された配列又は全体と比較して、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の相同性を有することができる。このような相同性は、当業界に公知の方法による配列比較及び／又は整列によって決定されてよい。例えば、配列比較アルゴリズム（すなわち、ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ ２．０）、手動整列、肉眼検査を用いて本発明の核酸又はタンパク質のパーセント配列相同性を決定することができる。
【0070】
本発明は、他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸に関する。
【0071】
本発明の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を分離して抗体又はその抗原結合断片を組み換えて生産することができる。核酸を分離し、これを複製可能なベクター内に挿入して、さらにクローニングしたり（ＤＮＡの増幅）又はさらに発現させる。これに基づき、本発明は、さらに他の観点において、前記核酸を含むベクターに関する。
【0072】
“核酸”は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸において基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドの他に、糖又は塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明の重鎖及び軽鎖可変領域をコードする核酸の配列は変形されてよい。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失、又は非保存的置換又は保存的置換を含む。
【0073】
前記抗体を暗号化するＤＮＡは、通常の過程を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖を暗号化するＤＮＡと特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に分離又は合成する。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分には一般に、次のいずれか一つ以上が含まれるが、それに制限されない：信号配列、複製起点、一つ以上のマーカー遺伝子、増強因子要素、プロモーター、及び転写終結配列。
【0074】
本明細書で使われる用語、“ベクター”は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段であり、プラスミドベクター；コスミドベクター；バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターなどを含む。前記ベクターにおいて抗体をコードする核酸はプロモーターと作動的に連結されている。
【0075】
“作動的に連結”とは、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列間の機能的な結合を意味し、これによって、前記調節配列は前記他の核酸配列の転写及び／又は解読を調節する。
【0076】
原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させ得る強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合座及び転写／解読終結配列を含むのが一般である。また、例えば、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例えば、メタロチオニンプロモーター、β－アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）又は哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーターエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が利用でき、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般に有する。
【0077】
場合によって、ベクターはそれから発現する抗体の精製を容易にするために、他の配列と融合されてもよい。融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ，ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ，ＵＳＡ）及び６ｘ Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）などがある。
【0078】
前記ベクターは、選択標識として当業界において通常用いられる抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。
【0079】
本発明は、さらに他の観点において、前記言及されたベクターで形質転換された細胞に関する。本発明の抗体を生成させるために用いられた細胞は、原核生物、酵母又は高等真核生物細胞でよいが、これに制限されるものではない。
【0080】
エシェリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルスサブチリス及びバチルスチューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））、プロテウスミラビルス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）及びスタフィロコカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコカスカルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ））のような原核宿主細胞を用いることができる。
【0081】
ただし、動物細胞に対する関心が最も大きく、有用な宿主細胞株の例は、ＣＯＳ－７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、ＣＨＯ／－ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ－７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＫ－Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、Ｕ２０Ｓ、又はＨＴ１０８０でよいが、これに制限されるものではない。
【0082】
本発明は、さらに他の観点において、（ａ）前記細胞を培養する段階；及び、（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階を含む前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法に関する。
【0083】
前記細胞は、各種の培地で培養できる。市販用の培地はいずれも培養培地として使用可能である。当業者に公知のその他全ての必須補充物が適度の濃度で含まれてよい。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどが発現のために選別された宿主細胞と共に既に用いられており、これは当業者にとって明白であろう。
【0084】
前記抗体又はその抗原結合断片の回収は、例えば、遠心分離又は限外濾過によって不純物を除去し、その結果を、例えば、親和クロマトグラフィーなどを用いて精製することができる。追加のその他精製技術、例えば、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどを用いることができる。
【0085】
本発明は、さらに他の観点において、前記抗体を有効成分として含む癌又は腫瘍の予防又は治療用組成物に関する。
【0086】
本発明は、例えば、（ａ）本発明に係るＴＩＧＩＴに対する抗体又はその抗原結合断片の薬剤学的有効量；及び、（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む癌又は腫瘍の予防又は治療用薬剤学的組成物であってよい。本発明は、また、患者に必要な有効量で本発明に係るＴＩＧＩＴに対する抗体又はその抗原結合断片を投与する段階を含む癌又は腫瘍の予防又は治療方法に関する。
【0087】
“癌”又は“腫瘍”は、典型的に調節されない細胞成長／増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態のことを指したり意味する。
【0088】
前記組成物は、上述した本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片を有効成分として用いるので、この両者に共通する内容は記載を省略する。
【0089】
下記の実施例から立証されるように、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ＴＩＧＩＴに高い親和度で結合し、抗腫瘍Ｔ細胞活性を回避する癌を治療するのに有用に用いることができる。
【0090】
本発明の組成物で治療可能な癌又は癌腫は、特に制限されず、固形癌及び血液癌のいずれをも含む。前記血液癌としては、例えば、リンパ腫、白血病又は多発性骨髄腫が含まれてよい。
【0091】
本発明に係る具体的な実施例において、多発性骨髄腫患者の調節Ｔ細胞においてＴＩＧＩＴの発現が高いことを確認し、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片を処理する場合に、多発性骨髄腫患者のＰＢＭＣに抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激を与えた時のＩＦＮ－γ分泌量が有意に増加することが確認できる。
【0092】
癌は、例えば、黒色腫などの皮膚癌、肝癌、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胃癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵癌、膀胱癌、大腸癌、結腸癌、子宮頸癌、脳癌、前立腺癌、骨癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腎臓癌、食道癌、胆道癌、精巣癌、直膓癌、頭頸部癌、頸椎癌、尿管癌、骨肉腫、神経芽細胞腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、星状細胞腫、神経芽細胞腫及び神経膠腫からなる群から選ばれてよいが、これに限定されるものではない。
【0093】
本発明に係る具体的な実施例において、ヒト大腸癌細胞異種移植モデルに本発明に係る抗体又はその抗原結合断片を処理する場合、優れた腫瘍成長抑制効果を示すことができることを確認した。
【0094】
本発明は、また、抗体又はその抗原結合断片を他の抗癌治療と併用し、他の薬物、例えば抗癌剤と共に投与して癌を予防又は治療するための併用投与用組成物に関する。
【0095】
本発明は、例えば、（ａ）本発明に係るＴＩＧＩＴに対する抗体又はその抗原結合断片の薬剤学的有効量；及び、（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む、癌又は腫瘍を予防又は治療するための併用投与用組成物であってよい。本発明は、また、患者に、必要な有効量で本発明に係るＴＩＧＩＴに対する抗体又はその抗原結合断片を投与する段階を含む、癌又は腫瘍の予防又は治療のための併用投与方法に関する。
【0096】
前記組成物は、上述した本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片を有効成分として用いるので、この両者に共通する内容は記載を省略する。
【0097】
前記抗体の他に別の抗癌治療剤を併用することにより、ＴＩＧＩＴを過発現させる腫瘍細胞を効果的に標的化し、抗腫瘍Ｔ細胞活性を増加させ、よって、腫瘍細胞を標的化する免疫反応を増大させることができる。
【0098】
その他抗新生物剤又は免疫原性製剤［（例えば、弱化した癌細胞、腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド及び炭水化物分子を含む。）、抗原伝達細胞、例えば、腫瘍由来抗原又は核酸でパルスされた樹状細胞、免疫刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮα２、ＧＭ－ＣＳＦ）、及び免疫刺激サイトカインを暗号化する遺伝子で形質感染された細胞（例えば、ＧＭ－ＣＳＦを含むが、これに制限されない。）］；標準癌治療療法（例えば、化学治療法、放射線治療法又は手術）；又は、その他抗体（前記ＴＩＧＩＴ抗体以外の抗体、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦ受容体、その他成長因子受容体、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ－４０、４－ＩＢＢ、及びＩＣＯＳを含むが、これに制限されない。）と共に使用されてよい。
【0099】
前記薬物、例えば抗癌剤は、免疫チェックポイント抑制剤であることを特徴とするが、これに制限されない。
【0100】
本発明は、他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片を免疫チェックポイント抑制剤と併用するための癌の予防又は治療用組成物に関する。
【0101】
本発明において、前記免疫チェックポイント抑制剤は、抗原提示細胞（ＡＰＣ，ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）と免疫細胞、例えばＴ細胞とが会う部位にＴ細胞抑制信号を遮断し、Ｔ細胞活性化を誘導できる製剤を意味する。前記免疫チェックポイント抑制剤は、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＣＴＬＡ－４などをターゲットとする薬物であり得るが、これに制限されない。
【0102】
前記免疫チェックポイント抑制剤は、具体的に、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体であることを特徴とし得るが、これに限定されず、具体的には、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）又はデュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）などが用いられてよいが、これに限定されるものではない。
【0103】
本発明の具体的な実施例によれば、抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片と、抗ＰＤ－１抗体であるペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）とを併用する場合、抗ＴＩＧＩＴ抗体単独使用に比べてＴ細胞反応性が増加し、増加したＴ細胞増殖を観察したし、ＩＦＮ－γ分泌量も増加し得ることを確認した。
【0104】
“併用”とは、抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片と、別の薬物、例えば抗癌剤を、それぞれ同時に、順次に、又は逆順に投与できることを意味し、通常の技術者による範囲内の適切な有効量の組合で投与されてよい。本発明の組成物は、個別治療剤として投与されたり、或いは他の治療剤と併用して投与されてよく、従来の治療剤とは順次に又は同時に投与されてよい。
【0105】
前記組成物に適用される疾患である癌は、典型的に免疫治療療法に反応する癌、及びいままで免疫療法に関連していない癌を含む。治療用に好適な癌の非制限的な例は、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓癌（例えば、透明細胞癌腫）、前立腺癌（例えば、ホルモン不応前立腺癌腫）、膵臓腺癌腫、乳癌、結腸癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、食道癌、頭頸部扁平細胞癌腫、肝癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、膠芽細胞腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、又は多発性骨髄腫のような血液癌、及びその他新生物癌腫を含む。さらに、本発明は、本発明の抗体を用いて成長を抑制できる不応又は再発癌を含む。
【0106】
抗体又は抗体断片は、単独、又はワクチンと共に使用され、病原体、毒素、及び自己抗原に対する免疫反応を刺激させることができる。抗体又はその抗原－結合断片は、例えば、ヒト免疫欠乏ウイルス、肝炎ウイルス部類Ａ、Ｂ及びＣ、エプスタインバールウイルス（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）、ヒトサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、ヒトパピローマ（ｐａｐｉｌｌｏｍａ）ウイルス、ヘルペスウイルスを含むが、これに制限されず、ヒトを伝染させるウイルスに対する免疫反応を刺激させるために用いられてよい。抗体又はその抗原－結合断片は、細菌又は真菌寄生体、及びその他病原体の感染に対する免疫反応を刺激させるために用いられてよい。
【0107】
本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に一般に用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロ－ス、ポリビニルピロリドン、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むこともできる。
【0108】
本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与でき、非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与できる。
【0109】
経口投与のとき、タンパク質又はペプチドは消化してしまうため、経口用組成物は、活性薬剤をコートしたり、或いは胃での分解から保護されるように剤形化する必要がある。また、薬剤学的組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与されてよい。
【0110】
本発明に係る組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって様々であり、熟練した通常の医師は、所望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方できる。例えば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇである。本明細書において用語“薬剤学的有効量”は、癌を予防又は治療するのに十分な量を意味する。
【0111】
本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することにより、単位容量の形態で製造されたり、又は多回容量容器内に内入して製造されてよい。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液形態であるか、エキス剤、散剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。
【実施例】
【0112】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【0113】
実施例１．ＴＩＧＩＴ抗体選別
ヒト合成ライブラリーファージ（Ｈｕｍａｎ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ ｐｈａｇｅ）を、ヒトＴＩＧＩＴ－Ｈｉｓ抗原のコートされたチューブで２時間反応させた。反応後に、洗浄バッファー（ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄し、溶出バッファー（１％ ＢＳＡ／０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．０）で常温で１０分間反応させてファージを回収した。回収されたファージをＸＬＩ－Ｂｌｕｅコンピテント細胞に感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）させ、３７℃で１時間培養した。その後、ＶＣＳ Ｍ１３ヘルパーファージ１ｍＬを処理して１時間３７℃で培養し、ＳＢ培地８０ｍｌ、カナマイシン１００μｌ、カルベニシリン１００μｌをさらに処理して３７℃で２０時間培養した。培養後に、上澄液を回収してＰＥＧ溶液（２０％ ＰＥＧ、１５％ ＮａＣｌ）でファージを沈殿させ、１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ ２ｍｌで再懸濁（ｒｅ－ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）させて次の次数のパンニングに使用した。
ヒト合成ライブラリーファージ（Ｈｕｍａｎ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ ｐｈａｇｅ）を、ヒトＴＩＧＩＴ－Ｈｉｓ抗原のコートされたチューブで２時間反応させた。反応後に、洗浄バッファー（ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄し、溶出バッファー（１％ ＢＳＡ／０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．０）で常温で１０分間反応させてファージを回収した。回収されたファージをＸＬＩ－Ｂｌｕｅコンピテント細胞に感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）させ、３７℃で１時間培養した。その後、ＶＣＳ Ｍ１３ヘルパーファージ１ｍＬを処理して１時間３７℃で培養し、ＳＢ培地８０ｍｌ、カナマイシン１００μｌ、カルベニシリン１００μｌをさらに処理して３７℃で２０時間培養した。培養後に、上澄液を回収してＰＥＧ溶液（２０％ ＰＥＧ、１５％ ＮａＣｌ）でファージを沈殿させ、１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ ２ｍｌで再懸濁（ｒｅ－ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）させて次の次数のパンニングに使用した。
【0114】
ヒトＴＩＧＩＴ特異的ヒト抗体を選別するために、ファージ表面にヒト抗体ライブラリーをディスプレイさせた後、次数の増加につれて、抗原であるＴＩＧＩＴの濃度を変化させ、合計３ラウンドのパンニングを行った。パンニングの次数が進行するにつれて、ＴＩＧＩＴの濃度を１００ｎＭから１ｎＭまでに減少させた。ファージのアウトプット力価（ｏｕｔｐｕｔ ｔｉｔｅｒ）は、表１の通りである。
【0115】
【表1】
【0116】
実施例２．ＴＩＧＩＴに対する結合力確認
２．１ ＳｃＦｖ形態の抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合力確認
ＥＬＩＳＡプレートに抗原ヒトＴＩＧＩＴ－ＦＣを３μｇ／ｍｌ濃度で５０μｌを入れた後、４℃で一晩培養した後、１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳで常温２時間ブロッキングした。合計１６種のｓｃＦｖ抗ＴＩＧＩＴ抗体を８０ｎＭを開始濃度としてＰＢＳに１／３連続希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）した後、ヒトＴＩＧＩＴ－Ｆｃプレートに５０μｌを入れ、常温２時間反応させた。ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回洗浄した後、抗Ｈｉｓ－ＨＲＰをＰＢＳに１／１０００に希釈して５０μｌを入れた後、常温１時間反応させた。ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回洗浄した後、ＴＭＢ液５０μｌを入れた。常温で５分反応させた後、ＴＭＢ停止溶液５０μｌを入れ、ＥＬＩＳＡ読み取り機により吸光度４５０ｎｍで値を測定した。
２．１ ＳｃＦｖ形態の抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合力確認
ＥＬＩＳＡプレートに抗原ヒトＴＩＧＩＴ－ＦＣを３μｇ／ｍｌ濃度で５０μｌを入れた後、４℃で一晩培養した後、１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳで常温２時間ブロッキングした。合計１６種のｓｃＦｖ抗ＴＩＧＩＴ抗体を８０ｎＭを開始濃度としてＰＢＳに１／３連続希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）した後、ヒトＴＩＧＩＴ－Ｆｃプレートに５０μｌを入れ、常温２時間反応させた。ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回洗浄した後、抗Ｈｉｓ－ＨＲＰをＰＢＳに１／１０００に希釈して５０μｌを入れた後、常温１時間反応させた。ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回洗浄した後、ＴＭＢ液５０μｌを入れた。常温で５分反応させた後、ＴＭＢ停止溶液５０μｌを入れ、ＥＬＩＳＡ読み取り機により吸光度４５０ｎｍで値を測定した。
【0117】
その結果を図１に示した。ＥＣ５０値を基準に合計１１種（１Ｃ３、１Ｅ４、１Ｅ１２、１Ｆ２、１Ｆ１０、１Ｇ８、ＷＩＮ＿１Ｂ６、ＷＩＮ＿１Ｂ１１、ＷＩＮ＿１Ｄ２、１Ｅ８、１Ｂ１１）のクローン（ｃｌｏｎｅ）を選別した。
【0118】
２．２ ＩｇＧ形態の抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合力確認
ｓｃＦｖ抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体のうち、ヒトＴＩＧＩＴへの結合力が高かった１１種の抗体に対して、ＩｇＧ形態に転換した。ＥＬＩＳＡプレートに抗原ヒトＴＩＧＩＴ－Ｆｃを３μｇ／ｍｌ濃度で５０μｌを入れ、４℃で一晩培養した後、１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳで常温２時間ブロッキングした。合計１１種のＩｇＧ形態の抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体を６．６ｎＭを開始濃度としてＰＢＳに１／２連続希釈した後、ヒトＴＩＧＩＴ－Ｆｃプレートに５０μｌを入れた後、常温で２時間反応させた。ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回洗浄した後、抗Ｈｉｓ－ＨＲＰをＰＢＳに１／１０００に希釈して５０μｌを入れ、常温で１時間反応させた。ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回洗浄した後、ＴＭＢ液５０μｌを入れた。常温５分反応させた後、ＴＭＢ停止溶液５０μｌを入れ、ＥＬＩＳＡ読み取り機により吸光度４５０ｎｍで値を測定した。その結果を表２及び図２に示した。
ｓｃＦｖ抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体のうち、ヒトＴＩＧＩＴへの結合力が高かった１１種の抗体に対して、ＩｇＧ形態に転換した。ＥＬＩＳＡプレートに抗原ヒトＴＩＧＩＴ－Ｆｃを３μｇ／ｍｌ濃度で５０μｌを入れ、４℃で一晩培養した後、１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳで常温２時間ブロッキングした。合計１１種のＩｇＧ形態の抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体を６．６ｎＭを開始濃度としてＰＢＳに１／２連続希釈した後、ヒトＴＩＧＩＴ－Ｆｃプレートに５０μｌを入れた後、常温で２時間反応させた。ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回洗浄した後、抗Ｈｉｓ－ＨＲＰをＰＢＳに１／１０００に希釈して５０μｌを入れ、常温で１時間反応させた。ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回洗浄した後、ＴＭＢ液５０μｌを入れた。常温５分反応させた後、ＴＭＢ停止溶液５０μｌを入れ、ＥＬＩＳＡ読み取り機により吸光度４５０ｎｍで値を測定した。その結果を表２及び図２に示した。
【0119】
【表2】
【0120】
１Ｅ４、１Ｆ２、１Ｇ８、ＷＩＮ－１Ｄ２、１Ｅ８が、ＥＣ５０ １ｎＭ程度の結合力を示すことが確認された。
【0121】
実施例３．ＴＩＧＩＴのリガンドであるＰＶＲに対するＴＩＧＩＴ候補抗体の競争力確認
３．１ ヒトＰＶＲ発現及び精製
ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＨ１５５４２．１から提供されたヒトＰＶＲ配列のうち、ＥＣＤ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）Ｇｌｙ２７－Ａｓｎ３４３部分のアミノ酸（配列番号２）を合成した。
３．１ ヒトＰＶＲ発現及び精製
ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＨ１５５４２．１から提供されたヒトＰＶＲ配列のうち、ＥＣＤ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）Ｇｌｙ２７－Ａｓｎ３４３部分のアミノ酸（配列番号２）を合成した。
【0122】
合成されたヒトＰＶＲを鋳型としてｈＰＶＲ－Ｆ（５’－ＧＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＧＣＧＡ－３’）／ｈＰＶＲ－Ｒプライマー（５’－ＧＧＣＣＡＧＧＣＴＧＧＣＣＧＴＴＣＣ－３’）でＰＣＲを行った後、Ｓｆｉ Ｉ酵素を用いてｐｃｌｗ－ｈｕＩｇＧ４ベクターに挿入した。Ｅｘｐｉ２９３ＦTM ２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ ３０ｍｌに軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）と重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）ＤＮＡをそれぞれ１：１の割合で３０μｇを、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３試薬を用いて一過性発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）させた後、１０日培養した。細胞培養液（上澄液）を０．２２μｍボトルトップフィルターを用いて濾過した後、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａビード２００μｌを入れ、バイオローテーターで２時間混ぜて反応させた。培養後に、ビードと抗体の混合物をプロテインＡカラムに入れた。プロテインＡカラムを結合バッファー２ｍｌで２回洗浄した。プロテインＡカラムに、２００μｌのプロテインＡ溶出バッファーを用いて合計５回の溶出分画（ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｒａｃｔｉｏｎ）を集めた。溶出された抗体をＺｅｂａスピン脱塩カラム（Ｚｅｂａ ｓｐｉｎ ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ）を用いて１，０００ｒｐｍで５分遠心分離して脱塩した。
【0123】
３．２ 競争力確認
ＥＬＩＳＡプレートに抗原ヒトＴＩＧＩＴ－Ｆｃを３μｇ／ｍｌ濃度で５０μｌ入れ、４℃で一晩培養した後、１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳで常温２時間ブロッキングした。リガンドであるビオチン化ヒトＰＶＲと抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体を１：０、１：０．１、１：１、１：１０のモル比で混ぜた後、常温で１０分反応させた。その後、５０μｌずつをヒトＴＩＧＩＴコートされたプレートに入れた後、常温で２時間培養させた。ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回洗浄した後、抗ＳＡ－ＨＲＰをＰＢＳで１：３０００希釈後に５０μｌ入れた後、常温で１時間培養させた。ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回洗浄した後、ＴＭＢ液５０μｌを入れた。常温５分反応させた後、ＴＭＢ停止溶液５０μｌを入れ、ＥＬＩＳＡ読み取り機により吸光度４５０ｎｍで値を測定した。
ＥＬＩＳＡプレートに抗原ヒトＴＩＧＩＴ－Ｆｃを３μｇ／ｍｌ濃度で５０μｌ入れ、４℃で一晩培養した後、１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳで常温２時間ブロッキングした。リガンドであるビオチン化ヒトＰＶＲと抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体を１：０、１：０．１、１：１、１：１０のモル比で混ぜた後、常温で１０分反応させた。その後、５０μｌずつをヒトＴＩＧＩＴコートされたプレートに入れた後、常温で２時間培養させた。ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回洗浄した後、抗ＳＡ－ＨＲＰをＰＢＳで１：３０００希釈後に５０μｌ入れた後、常温で１時間培養させた。ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回洗浄した後、ＴＭＢ液５０μｌを入れた。常温５分反応させた後、ＴＭＢ停止溶液５０μｌを入れ、ＥＬＩＳＡ読み取り機により吸光度４５０ｎｍで値を測定した。
【0124】
その結果を図３に示した。ＴＩＧＩＴとＰＶＲに対するブロッキングアッセイを、１１種の抗ＴＩＧＩＴ抗体に対して行い、１１種ともにリガンドブロッキングすることを確認した。
【0125】
実施例４．抗ＴＩＧＩＴ抗体の親和度測定
４．１ オクテット（Ｏｃｔｅｔ）を用いた測定
ヒトＴＩＧＩＴ－ＨＩＳを５μｇ／ｍｌで１ＸＫＢバッファーに希釈して準備した。抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体を、開始濃度１００ｎＭから始めて１ＸＫＢバッファーで１／２連続希釈して準備した。Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓセンサーを１ＸＫＢバッファーに１０分反応させた後、オクテットを用いてヒトＴＩＧＩＴ－ＨＩＳに対する抗体の親和力を測定した。その結果を、表３及び図４に示した。
４．１ オクテット（Ｏｃｔｅｔ）を用いた測定
ヒトＴＩＧＩＴ－ＨＩＳを５μｇ／ｍｌで１ＸＫＢバッファーに希釈して準備した。抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体を、開始濃度１００ｎＭから始めて１ＸＫＢバッファーで１／２連続希釈して準備した。Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓセンサーを１ＸＫＢバッファーに１０分反応させた後、オクテットを用いてヒトＴＩＧＩＴ－ＨＩＳに対する抗体の親和力を測定した。その結果を、表３及び図４に示した。
【0126】
【表3】
【0127】
１１種の抗ＴＩＧＩＴ抗体に対する親和力をオクテットを用いて測定し、それらのうち、１Ｂ１１、１Ｅ１２、１Ｆ２、１Ｅ８は、解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）が他のクローンに比べて劣っていることを確認した。
【0128】
４．２ 抗ＴＩＧＩＴ抗体のＩｇＧ４形態転換
最終５種の抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体に対してそれぞれの重鎖可変領域（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）と軽鎖可変領域（Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）を合成した。
最終５種の抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体に対してそれぞれの重鎖可変領域（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）と軽鎖可変領域（Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）を合成した。
【0129】
【表4】
【0130】
【表5】
【0131】
４．３ Ｂｉａｃｏｒｅ実験
（１）イモビライゼーション（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）
抗プロテインＡを１０μｇ／ｍｌの濃度となるようにアセテート４．０バッファーに希釈して準備した。１００ｎＭ ＮＨＳ、４００ｍＭ ＥＤＣと１Ｍエタノールアミンを準備した。センサーチップはＣＭ５を使用し、接触時間（ｃｏｎｔａｃｔ ｔｉｍｅ）３００秒（５分）、流量（ｆｌｏｗ ｒａｔｅ）５μｇ／ｍｌ、及びイモビライゼーションレベル（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ）２５００ＲＵと指定した。システムコントロール窓でランニング（ｒｕｎｎｉｎｇ）を進行後に、ターゲットＲＵに到達するか確認した。
（１）イモビライゼーション（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）
抗プロテインＡを１０μｇ／ｍｌの濃度となるようにアセテート４．０バッファーに希釈して準備した。１００ｎＭ ＮＨＳ、４００ｍＭ ＥＤＣと１Ｍエタノールアミンを準備した。センサーチップはＣＭ５を使用し、接触時間（ｃｏｎｔａｃｔ ｔｉｍｅ）３００秒（５分）、流量（ｆｌｏｗ ｒａｔｅ）５μｇ／ｍｌ、及びイモビライゼーションレベル（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ）２５００ＲＵと指定した。システムコントロール窓でランニング（ｒｕｎｎｉｎｇ）を進行後に、ターゲットＲＵに到達するか確認した。
【0132】
（２）ＫＤ測定
捕捉抗体１Ｇ８、ＷＩＮ＿１Ｂ６と参照抗体を１ＸＨＢＳ－ＥＰバッファーに１μｇ／ｍｌで希釈し、ターゲットレベルを３００ＲＵと指定した。光源ＴＩＧＩＴ－ＨＩＳを１６０ｎＭから始めて１ＸＨＢＳ－ＥＰで１／２連続希釈し、接触時間１２０秒、解離時間（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）６００秒と指定して反応させた。ランニングが完了すると、評価用ソフトウェア（ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてフィット（ｆｉｔｔｉｎｇ）してｋａ、ｋｄ及びＫＤ値を求めた。
捕捉抗体１Ｇ８、ＷＩＮ＿１Ｂ６と参照抗体を１ＸＨＢＳ－ＥＰバッファーに１μｇ／ｍｌで希釈し、ターゲットレベルを３００ＲＵと指定した。光源ＴＩＧＩＴ－ＨＩＳを１６０ｎＭから始めて１ＸＨＢＳ－ＥＰで１／２連続希釈し、接触時間１２０秒、解離時間（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）６００秒と指定して反応させた。ランニングが完了すると、評価用ソフトウェア（ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてフィット（ｆｉｔｔｉｎｇ）してｋａ、ｋｄ及びＫＤ値を求めた。
【0133】
その結果を図５に示した。１Ｇ８、ＷＩＮ＿１Ｂ６と参照抗体に対してＢＩＡＣＯＲＥで親和力を測定した。参照抗体と候補抗体１Ｇ８は、ｎＭ以上の親和力を示し、他の候補抗体であるＷＩＮ＿１Ｂ６は、１０ｎＭ以上の親和力を示した。
【0134】
実施例５．細胞表面に発現したＴＩＧＩＴとＴＩＧＩＴ候補抗体の結合力確認
ＴＩＧＩＴを安定的に発現させる細胞株を製作するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１（ＡＴＣＣ；ＴＩＢ－１５２ＴＭ）にＴＩＧＩＴ ｃＤＮＡを形質注入させ、抗生剤であるＧ４１８ １ｍｇ／ｍｌを処理して選別し、ＴＩＧＩＴ過発現細胞株を作製した（Ｊｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ）。Ｊｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ細胞株を、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＤＰＢＳ（以下、ＦＡＣＳバッファー）に再浮遊（ｒｅｓｕｓｐｅｎｄ）し、１，５００ｒｐｍで遠心分離した後、細胞数が３×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌとなるようにＦＡＣＳバッファーに再浮遊し、Ｕ底９６ウェルプレートの各ウェルに１００μｌずつ入れた。その後、各ウェルの細胞及び培養液を回収し、１，５００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄液を捨てた。回収した細胞を、ヒトＦｃブロック（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｃａｔ．＃５６４２２０）溶液を０．５μｌ入れたＦＡＣＳバッファー５０μｌに再浮遊した後、４℃で１５分間培養した。ＴＩＧＩＴ候補抗体又はヒトＩｇＧ４（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ．＃ Ｉ４６３９）を、ＦＡＣＳバッファー５０μｌに、２５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．０４μｇ／ｍｌ、０．００８μｇ／ｍｌ、０．００１６μｇ／ｍｌ、０．０００３２μｇ／ｍｌ濃度の２倍となるように希釈した。Ｆｃブロッカーがある状態の細胞に、先に希釈したＴＩＧＩＴ候補抗体又はヒトＩｇＧ４を５０μｌずつ入れて、２５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．０４μｇ／ｍｌ、０．００８μｇ／ｍｌ、０．００１６μｇ／ｍｌ、０．０００３２μｇ／ｍｌの濃度となるようにした後、４℃で１時間３０分間反応させた。ＴＩＧＩＴ候補抗体と反応させた細胞をＦＡＣＳバッファーに再浮遊した後、１，５００ｒｐｍで遠心分離して洗浄する過程を２回反復した。フィコエリトリン（以下、ＰＥ）標識されたヤギ抗ヒトＦａｂ’２（Ｐｈｙｃｏｅｒｉｔｈｒｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｆａｂ’２）（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ．＃ Ｐ８０４７）をＦＡＣＳバッファーに１：５００体積比率に希釈させた後、各ウェルに１００μｌずつ入れ、４℃で３０分間、暗い所で反応させた。ＰＥと反応させた細胞を回収してＦＡＣＳバッファーに再浮遊し、１，５００ｒｐｍで遠心分離して上澄液を捨てる洗浄過程を２回反復した。その後、細胞を固定バッファー（ＢＤ ＣｙｔｏｆｉｘTM；Ｃａｔ．＃５５４６５５）１００μｌに再浮遊した後、４℃で３０分間、暗い所で培養した。固定バッファーと反応させた細胞を回収してＦＡＣＳバッファーに再浮遊し、１，５００ｒｐｍで遠心分離して上澄液を捨てる洗浄過程を２回反復した。洗浄した細胞をＦＡＣＳバッファー２００μｌに再浮遊した後、ＦＡＣＳ ＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ装備で細胞に標識されたＰＥのＭＦＩ（ｍｅｄｉａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を比較した。全てのＦＡＣＳ分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いた。その結果を図６に示し、ＴＩＧＩＴ候補抗体のうち、ＷＩＮ＿１Ｂ６、ＷＩＮ＿１Ｄ２、１Ｅ８、１Ｆ１０、１Ｇ８において高い結合力を示すことを確認した。
ＴＩＧＩＴを安定的に発現させる細胞株を製作するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１（ＡＴＣＣ；ＴＩＢ－１５２ＴＭ）にＴＩＧＩＴ ｃＤＮＡを形質注入させ、抗生剤であるＧ４１８ １ｍｇ／ｍｌを処理して選別し、ＴＩＧＩＴ過発現細胞株を作製した（Ｊｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ）。Ｊｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ細胞株を、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＤＰＢＳ（以下、ＦＡＣＳバッファー）に再浮遊（ｒｅｓｕｓｐｅｎｄ）し、１，５００ｒｐｍで遠心分離した後、細胞数が３×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌとなるようにＦＡＣＳバッファーに再浮遊し、Ｕ底９６ウェルプレートの各ウェルに１００μｌずつ入れた。その後、各ウェルの細胞及び培養液を回収し、１，５００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄液を捨てた。回収した細胞を、ヒトＦｃブロック（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｃａｔ．＃５６４２２０）溶液を０．５μｌ入れたＦＡＣＳバッファー５０μｌに再浮遊した後、４℃で１５分間培養した。ＴＩＧＩＴ候補抗体又はヒトＩｇＧ４（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ．＃ Ｉ４６３９）を、ＦＡＣＳバッファー５０μｌに、２５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．０４μｇ／ｍｌ、０．００８μｇ／ｍｌ、０．００１６μｇ／ｍｌ、０．０００３２μｇ／ｍｌ濃度の２倍となるように希釈した。Ｆｃブロッカーがある状態の細胞に、先に希釈したＴＩＧＩＴ候補抗体又はヒトＩｇＧ４を５０μｌずつ入れて、２５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．０４μｇ／ｍｌ、０．００８μｇ／ｍｌ、０．００１６μｇ／ｍｌ、０．０００３２μｇ／ｍｌの濃度となるようにした後、４℃で１時間３０分間反応させた。ＴＩＧＩＴ候補抗体と反応させた細胞をＦＡＣＳバッファーに再浮遊した後、１，５００ｒｐｍで遠心分離して洗浄する過程を２回反復した。フィコエリトリン（以下、ＰＥ）標識されたヤギ抗ヒトＦａｂ’２（Ｐｈｙｃｏｅｒｉｔｈｒｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｆａｂ’２）（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ．＃ Ｐ８０４７）をＦＡＣＳバッファーに１：５００体積比率に希釈させた後、各ウェルに１００μｌずつ入れ、４℃で３０分間、暗い所で反応させた。ＰＥと反応させた細胞を回収してＦＡＣＳバッファーに再浮遊し、１，５００ｒｐｍで遠心分離して上澄液を捨てる洗浄過程を２回反復した。その後、細胞を固定バッファー（ＢＤ ＣｙｔｏｆｉｘTM；Ｃａｔ．＃５５４６５５）１００μｌに再浮遊した後、４℃で３０分間、暗い所で培養した。固定バッファーと反応させた細胞を回収してＦＡＣＳバッファーに再浮遊し、１，５００ｒｐｍで遠心分離して上澄液を捨てる洗浄過程を２回反復した。洗浄した細胞をＦＡＣＳバッファー２００μｌに再浮遊した後、ＦＡＣＳ ＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ装備で細胞に標識されたＰＥのＭＦＩ（ｍｅｄｉａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を比較した。全てのＦＡＣＳ分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いた。その結果を図６に示し、ＴＩＧＩＴ候補抗体のうち、ＷＩＮ＿１Ｂ６、ＷＩＮ＿１Ｄ２、１Ｅ８、１Ｆ１０、１Ｇ８において高い結合力を示すことを確認した。
【0135】
実施例６．ＴＩＧＩＴのリガンドであるＰＶＲに対するＴＩＧＩＴ候補抗体の競争力確認
ＴＩＧＩＴ過発現細胞株（Ｊｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ）を２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ添加したＤＰＢＳ（以下、ＦＡＣＳバッファー）に再浮遊し、１，５００ｒｐｍで遠心分離した後、細胞数が３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＦＡＣＳバッファーに再浮遊してＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに１００μｌずつ入れた。その後、各ウェルの細胞及び培養液を回収して１，５００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄液を捨てた。回収した細胞をヒトＦｃブロック（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｃａｔ．＃５６４２２０）溶液を０．５μｌ入れたＦＡＣＳバッファー５０μｌに再浮遊した後、４℃で１５分間培養した。
ＴＩＧＩＴ過発現細胞株（Ｊｕｒｋａｔ－ＴＩＧＩＴ）を２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ添加したＤＰＢＳ（以下、ＦＡＣＳバッファー）に再浮遊し、１，５００ｒｐｍで遠心分離した後、細胞数が３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＦＡＣＳバッファーに再浮遊してＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに１００μｌずつ入れた。その後、各ウェルの細胞及び培養液を回収して１，５００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄液を捨てた。回収した細胞をヒトＦｃブロック（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｃａｔ．＃５６４２２０）溶液を０．５μｌ入れたＦＡＣＳバッファー５０μｌに再浮遊した後、４℃で１５分間培養した。
【0136】
ＨＥＫ２９３（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｃａｔ．＃ Ａ１４５２７）細胞から精製されたＰＶＲ－Ｆｃを、各ウェルに１０μｇずつ０．５μｌで入れ、４℃で１時間反応させた。ＰＶＲ－Ｆｃと反応させた細胞をＦＡＣＳバッファーに再浮遊した後、１，５００ｒｐｍで遠心分離して洗浄する過程を２回反復した。ＴＩＧＩＴ候補抗体又はヒトＩｇＧ４（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ．＃ Ｉ４６３９）をＦＡＣＳバッファー１００μｌに、１０μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．０４μｇ／ｍｌ、０．００８μｇ／ｍｌ、０．００１６μｇ／ｍｌ、０．０００３２μｇ／ｍｌの濃度となるように希釈し、各ウェルに１００μｌずつ入れて細胞を再浮遊した後、４℃で１時間反応させた。ＴＩＧＩＴ候補抗体と反応させた細胞をＦＡＣＳバッファーに再浮遊した後、１，５００ｒｐｍで遠心分離して洗浄する過程を２回反復した。抗ＰＶＲ－ＰＥ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ．＃１２－１５５０－４１）を各ウェルに処理した後、４℃で３０分間、暗い所で反応させた。抗ＰＶＲ－ＰＥ抗体と反応させた細胞を回収してＦＡＣＳバッファーに再浮遊し、１，５００ｒｐｍで遠心分離して上澄液を捨てる洗浄過程を２回反復した。その後、細胞を固定バッファー（ＢＤ ＣｙｔｏｆｉｘTM；Ｃａｔ．＃５５４６５５）１００μｌに再浮遊した後、４℃で３０分間、暗い所で培養した。固定バッファーと反応させた細胞を回収してＦＡＣＳバッファーに再浮遊し、１，５００ｒｐｍで遠心分離して上澄液を捨てる洗浄過程を２回反復した。洗浄した細胞をＦＡＣＳバッファー２００μｌに再浮遊した後、ＦＡＣＳ ＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ装備で細胞に標識されたＰＥのＭＦＩ（ｍｅｄｉａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を比較した。全てのＦＡＣＳ分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いた。その結果を図７に示し、ＴＩＧＩＴ候補抗体のうち、ＷＩＮ＿１Ｂ６、ＷＵＮ＿１Ｂ１１、ＷＩＮ＿１Ｄ２、１Ｇ８、１Ｅ８においてＰＶＲと強く結合することを確認した。
【0137】
実施例７．ＴＩＧＩＴ候補抗体のＴＩＧＩＴとＰＶＲとの結合抑制効果によるＴ細胞活性化分析
ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｊ２３０５）を用いて、ＴＩＧＩＴ候補抗体によるＴ細胞活性化を確認した。－１４０℃に保管中であるＴｈａｗ－ａｎｄ－Ｕｓｅ ＴＩＧＩＴ効果器細胞１バイアルを溶かし、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ Ｎｏ．１１８７５－０６５）を１２ｍｌ入れて再浮遊させた。細胞液を８０μｌずつ９６ウェル白色平底アッセイプレートの内側６０個の溝に入れ、３７℃で１６時間～１８時間培養させた。翌日、－１４０℃に保管中であるＴｈａｗ－ａｎｄ－Ｕｓｅ ＣＤ１５５ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞１バイアルを溶かし、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ Ｎｏ．１１８７５－０６５）３ｍｌを入れて細胞を再浮遊させた。ＴＩＧＩＴ候補抗体は最高濃度を３００μｇ／ｍｌ（６Ｘ）として準備し、２．５倍ずつ順次に１０回希釈させた。前日に培養したＴＩＧＩＴ効果器細胞プレートを取り出し、抗体２０μｌを入れてＴｈａｗ－ａｎｄ－Ｕｓｅ ＣＤ１５５ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞浮遊物を２０μｌ入れて３７℃、ＣＯ２インキュベーターで６時間培養した。６時間後、９６ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、常温で２０分放置した。Ｂｉｏ－ｇｌｏ基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）とバッファー１０ｍｌを混ぜた後、細胞懸濁液（ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）の入っている内側６０個の溝に１２０μｌを処理後に１０分間放置した。ＧｌｏＭａｘ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ Ｓｙｓｔｅｍで発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を測定した。その結果を図８に示し、５種のＴＩＧＩＴ候補抗体のうち、１Ｇ８処理時にＥＣ５０値は２．１ｎＭと、候補抗体のうち最高にＴ細胞の活性化能力を増加させることを確認した。
ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｊ２３０５）を用いて、ＴＩＧＩＴ候補抗体によるＴ細胞活性化を確認した。－１４０℃に保管中であるＴｈａｗ－ａｎｄ－Ｕｓｅ ＴＩＧＩＴ効果器細胞１バイアルを溶かし、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ Ｎｏ．１１８７５－０６５）を１２ｍｌ入れて再浮遊させた。細胞液を８０μｌずつ９６ウェル白色平底アッセイプレートの内側６０個の溝に入れ、３７℃で１６時間～１８時間培養させた。翌日、－１４０℃に保管中であるＴｈａｗ－ａｎｄ－Ｕｓｅ ＣＤ１５５ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞１バイアルを溶かし、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ Ｎｏ．１１８７５－０６５）３ｍｌを入れて細胞を再浮遊させた。ＴＩＧＩＴ候補抗体は最高濃度を３００μｇ／ｍｌ（６Ｘ）として準備し、２．５倍ずつ順次に１０回希釈させた。前日に培養したＴＩＧＩＴ効果器細胞プレートを取り出し、抗体２０μｌを入れてＴｈａｗ－ａｎｄ－Ｕｓｅ ＣＤ１５５ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞浮遊物を２０μｌ入れて３７℃、ＣＯ２インキュベーターで６時間培養した。６時間後、９６ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、常温で２０分放置した。Ｂｉｏ－ｇｌｏ基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）とバッファー１０ｍｌを混ぜた後、細胞懸濁液（ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）の入っている内側６０個の溝に１２０μｌを処理後に１０分間放置した。ＧｌｏＭａｘ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ Ｓｙｓｔｅｍで発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を測定した。その結果を図８に示し、５種のＴＩＧＩＴ候補抗体のうち、１Ｇ８処理時にＥＣ５０値は２．１ｎＭと、候補抗体のうち最高にＴ細胞の活性化能力を増加させることを確認した。
【0138】
実施例８．ＴＩＧＩＴ候補抗体の交差反応確認
ＴＩＧＩＴ抗体がマウス、サル及びヒトのＴＩＧＩＴに対する結合力があるどうかを確認するために、ＨＥＫ２９３細胞に、それぞれの対照群ベクターとしてｐＥＦ１ａ－ＡｃＧＦＰ－Ｎ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｃａｔ Ｎｏ．６３１９７３）、マウスＴＩＧＩＴ、サルＴＩＧＩＴ及びヒトＴＩＧＩＴプラスミドを２０μｇそれぞれ入れ、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｌ３０００００１）を用いて形質注入した。形質注入４８時間後に蛍光顕微鏡でＧＦＰ発現を確認した後、細胞を、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｃａｔ．＃１２６０５０１０）を１ｍｌ処理して剥がし、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ Ｎｏ．１１９９５－０６５）を９ｍｌで希釈した後、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄液を除去した。ＰＢＳで１回洗浄した後、ＦＡＣＳバッファーに細胞数が５×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌの濃度となるように再浮遊させた。ヒトＦｃブロック溶液を各サンプル当たり１μｌ入れ、４℃で１０分間反応させた。ヒトＩｇＧ４、ＷＩＮ＿１Ｂ６、ＷＩＮ＿１Ｄ２、Ｅ８、１Ｆ１０、１Ｇ８を１μｇ／５×１０５ｃｅｌｌｓ濃度で処理し、４℃で１時間反応させた。ＦＡＣＳバッファーで洗浄後、ＰＥ標識されたヤギ抗ヒトＦａｂ’２抗体をＦＡＣＳバッファーに１：２００に希釈して各サンプル当たりに１００μｌずつ入れ、４℃で３０分間反応させた。ＦＡＣＳバッファーを２００μｌまで満たした後、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄液を除去した。固定バッファー３００μｌを入れて細胞を再浮遊させた。ＦＡＣＳ ＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ装備でＧＦＰを発現させた細胞を選別し、ＴＩＧＩＴ候補抗体はＰＥ蛍光チャネルで確認し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。その結果を図９に示し、ＴＩＧＩＴ候補抗体のうち、ＷＩＮ＿１Ｂ６、ＷＩＮ＿１Ｄ２、Ｅ８、１Ｇ８はヒトの他にサルのＴＩＧＩＴにも結合することを、細胞表面に発現したタンパク質に対する結合力によって確認した。しかし、マウスのＴＩＧＩＴにはいずれも結合しないことを確認した。
ＴＩＧＩＴ抗体がマウス、サル及びヒトのＴＩＧＩＴに対する結合力があるどうかを確認するために、ＨＥＫ２９３細胞に、それぞれの対照群ベクターとしてｐＥＦ１ａ－ＡｃＧＦＰ－Ｎ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｃａｔ Ｎｏ．６３１９７３）、マウスＴＩＧＩＴ、サルＴＩＧＩＴ及びヒトＴＩＧＩＴプラスミドを２０μｇそれぞれ入れ、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｌ３０００００１）を用いて形質注入した。形質注入４８時間後に蛍光顕微鏡でＧＦＰ発現を確認した後、細胞を、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｃａｔ．＃１２６０５０１０）を１ｍｌ処理して剥がし、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ Ｎｏ．１１９９５－０６５）を９ｍｌで希釈した後、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄液を除去した。ＰＢＳで１回洗浄した後、ＦＡＣＳバッファーに細胞数が５×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌの濃度となるように再浮遊させた。ヒトＦｃブロック溶液を各サンプル当たり１μｌ入れ、４℃で１０分間反応させた。ヒトＩｇＧ４、ＷＩＮ＿１Ｂ６、ＷＩＮ＿１Ｄ２、Ｅ８、１Ｆ１０、１Ｇ８を１μｇ／５×１０５ｃｅｌｌｓ濃度で処理し、４℃で１時間反応させた。ＦＡＣＳバッファーで洗浄後、ＰＥ標識されたヤギ抗ヒトＦａｂ’２抗体をＦＡＣＳバッファーに１：２００に希釈して各サンプル当たりに１００μｌずつ入れ、４℃で３０分間反応させた。ＦＡＣＳバッファーを２００μｌまで満たした後、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄液を除去した。固定バッファー３００μｌを入れて細胞を再浮遊させた。ＦＡＣＳ ＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ装備でＧＦＰを発現させた細胞を選別し、ＴＩＧＩＴ候補抗体はＰＥ蛍光チャネルで確認し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。その結果を図９に示し、ＴＩＧＩＴ候補抗体のうち、ＷＩＮ＿１Ｂ６、ＷＩＮ＿１Ｄ２、Ｅ８、１Ｇ８はヒトの他にサルのＴＩＧＩＴにも結合することを、細胞表面に発現したタンパク質に対する結合力によって確認した。しかし、マウスのＴＩＧＩＴにはいずれも結合しないことを確認した。
【0139】
実施例９．ＴＩＧＩＴ候補抗体の調節性（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）Ｔ細胞の抑制能確認
９．１ 末梢血液から単核球細胞（ＰＢＭＣ）分離
濃縮赤血球血液バッグ（２００～２５０ｍｌ）から１８Ｇニードル及び５０ｍｌ注射器を用いて、血液を使い捨てボトル（ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ ｂｏｔｔｌｅ）に移した後、ＤＰＢＳを追加して１：１に血液を希釈した。１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ－ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃａｔ Ｎｏ．１７－１４４０－０３）を新しい５０ｍｌコニカルチューブに準備し、Ｆｉｃｏｌｌ－ｐａｑｕｅ上に３０ｍｌの希釈血液をコニカルチューブの壁面にピペットチップを当てて徐々にレイヤリングした。１，５００ｒｐｍ、２５℃で３０分間遠心分離し（ｎｏ ｂｒａｋｅ）、遠心分離終了後にＰＢＭＣ層を丁寧に採取して新しい５０ｍｌコニカルチューブに移した後、洗浄バッファーを入れて合計で５０ｍｌにし、１５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。上澄液を捨てた後、細胞を洗浄バッファーで再浮遊し、１，５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して上澄液を捨てた後、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＩＭＤＭ（ＧＩＢＣＯ，Ｃａｔ Ｎｏ．１２４４０－０５３）で１回洗浄後に細胞数及び生存能力（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）をチェックし、６ウェルプレートに１６時間～１８時間培養した。
９．１ 末梢血液から単核球細胞（ＰＢＭＣ）分離
濃縮赤血球血液バッグ（２００～２５０ｍｌ）から１８Ｇニードル及び５０ｍｌ注射器を用いて、血液を使い捨てボトル（ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ ｂｏｔｔｌｅ）に移した後、ＤＰＢＳを追加して１：１に血液を希釈した。１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ－ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃａｔ Ｎｏ．１７－１４４０－０３）を新しい５０ｍｌコニカルチューブに準備し、Ｆｉｃｏｌｌ－ｐａｑｕｅ上に３０ｍｌの希釈血液をコニカルチューブの壁面にピペットチップを当てて徐々にレイヤリングした。１，５００ｒｐｍ、２５℃で３０分間遠心分離し（ｎｏ ｂｒａｋｅ）、遠心分離終了後にＰＢＭＣ層を丁寧に採取して新しい５０ｍｌコニカルチューブに移した後、洗浄バッファーを入れて合計で５０ｍｌにし、１５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。上澄液を捨てた後、細胞を洗浄バッファーで再浮遊し、１，５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して上澄液を捨てた後、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＩＭＤＭ（ＧＩＢＣＯ，Ｃａｔ Ｎｏ．１２４４０－０５３）で１回洗浄後に細胞数及び生存能力（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）をチェックし、６ウェルプレートに１６時間～１８時間培養した。
【0140】
９．２ 調節性Ｔ細胞分離
前日に培養したＰＢＭＣから調節性Ｔ細胞を分離するために、調節性Ｔ細胞分離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ，Ｃａｔ Ｎｏ．１８０６３）を用いた。５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌの分離されたヒトＰＢＭＣを丸底チューブ（ｒｏｕｎｄ－ｂｏｔｔｏｍ ｔｕｂｅ）に入れ、１００μｌ ＣＤ２５陽性選択カクテル（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｃｏｃｋｔａｉｌ）を入れた後、常温で５分間反応させた。６０μｌ Ｒｅｌｅａｓａｂｌｅ ＲａｐｉｄＳｐｈｅｒｅｓ（使用前にボルテックス）を入れ、１００μｌ ＣＤ４＋ Ｔ細胞濃縮カクテル（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｃｏｃｋｔａｉｌ）をさらに入れた後、常温で５分間反応させた。再浮遊した後、丸底チューブをマグネットに挿入した後、常温で１０分間反応させ、ピペットで丁寧に上澄液（ＣＤ４＋ＣＤ２５－）を抜き取って新しいチューブに移した。マグネットからチューブを丁寧に分離した後、ＥａｓｙＳｅｐバッファーを２．５ｍｌ入れて２～３回丁寧にピペット再浮遊した後、再びマグネットに装着した後、常温で５分間反応させた後、ピペットで丁寧に上澄液（ＣＤ４＋ＣＤ２５－）抜き取る。この過程を２回反復した。マグネットからチューブを分離し、開始した量でＥａｓｙＳｅｐバッファーを入れた後、２００μｌ放出バッファーを入れて５回以上再浮遊した後、ＣＤ１２７ｈｉｇｈディプリーションカクテル（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｃｏｃｋｔａｉｌ）を１００ｕｌ入れた後、常温で５分間反応させた。Ｄｅｘｔｒａｎ ＲａｐｉｄＳｐｈｅｒｅｓ（使用前にボルテックス）を２０μｌ入れ、常温で５分間反応させて再浮遊した後、丸底チューブをマグネットに挿入した後、常温で５分間反応させた。ピペットで丁寧に上澄液（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ）を抜き取って新しいチューブに移した後、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＩＭＤＭ（ＧＩＢＣＯ，Ｃａｔ Ｎｏ．１２４４０－０５３）で１回洗浄後に細胞数を測定した。
前日に培養したＰＢＭＣから調節性Ｔ細胞を分離するために、調節性Ｔ細胞分離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ，Ｃａｔ Ｎｏ．１８０６３）を用いた。５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌの分離されたヒトＰＢＭＣを丸底チューブ（ｒｏｕｎｄ－ｂｏｔｔｏｍ ｔｕｂｅ）に入れ、１００μｌ ＣＤ２５陽性選択カクテル（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｃｏｃｋｔａｉｌ）を入れた後、常温で５分間反応させた。６０μｌ Ｒｅｌｅａｓａｂｌｅ ＲａｐｉｄＳｐｈｅｒｅｓ（使用前にボルテックス）を入れ、１００μｌ ＣＤ４＋ Ｔ細胞濃縮カクテル（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｃｏｃｋｔａｉｌ）をさらに入れた後、常温で５分間反応させた。再浮遊した後、丸底チューブをマグネットに挿入した後、常温で１０分間反応させ、ピペットで丁寧に上澄液（ＣＤ４＋ＣＤ２５－）を抜き取って新しいチューブに移した。マグネットからチューブを丁寧に分離した後、ＥａｓｙＳｅｐバッファーを２．５ｍｌ入れて２～３回丁寧にピペット再浮遊した後、再びマグネットに装着した後、常温で５分間反応させた後、ピペットで丁寧に上澄液（ＣＤ４＋ＣＤ２５－）抜き取る。この過程を２回反復した。マグネットからチューブを分離し、開始した量でＥａｓｙＳｅｐバッファーを入れた後、２００μｌ放出バッファーを入れて５回以上再浮遊した後、ＣＤ１２７ｈｉｇｈディプリーションカクテル（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｃｏｃｋｔａｉｌ）を１００ｕｌ入れた後、常温で５分間反応させた。Ｄｅｘｔｒａｎ ＲａｐｉｄＳｐｈｅｒｅｓ（使用前にボルテックス）を２０μｌ入れ、常温で５分間反応させて再浮遊した後、丸底チューブをマグネットに挿入した後、常温で５分間反応させた。ピペットで丁寧に上澄液（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ）を抜き取って新しいチューブに移した後、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＩＭＤＭ（ＧＩＢＣＯ，Ｃａｔ Ｎｏ．１２４４０－０５３）で１回洗浄後に細胞数を測定した。
【0141】
９．３ レスポンダー細胞にＣＦＳＥ標識
前日に培養したＰＢＭＣ １×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（１ｍｌ）を１５ｍｌチューブに入れ、２０ｕＭ ＣＦＳＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ Ｎｏ．６５－０８５０－８４）を１ｍｌ入れて細胞をよく混ぜ、アルミホイルで光を遮断して３７℃ ＣＯ２培養器で２０分間反応させた。２０分後に、１０ｍｌの１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加した冷たいＩＭＤＭを入れ、１，２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、この過程を２回反復した。
前日に培養したＰＢＭＣ １×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（１ｍｌ）を１５ｍｌチューブに入れ、２０ｕＭ ＣＦＳＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ Ｎｏ．６５－０８５０－８４）を１ｍｌ入れて細胞をよく混ぜ、アルミホイルで光を遮断して３７℃ ＣＯ２培養器で２０分間反応させた。２０分後に、１０ｍｌの１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加した冷たいＩＭＤＭを入れ、１，２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、この過程を２回反復した。
【0142】
９．４ 調節性Ｔ細胞とＣＦＳＥ標識されたレスポンダー細胞共同培養
ＣＦＳＥで標識したレスポンダー細胞を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＩＭＤＭに再浮遊して９６ウェル丸プレートに２×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌで入れ、調節性Ｔ細胞を０：１、０．１：１（２×１０４）、０．２５：１（５×１０４）、０．５：１（１×１０５）の割合で（Ｔｒｅｇ：レスポンダー）を入れた。溶解性（Ｓｏｌｕｂｌｅ）抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（２μｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加し、ヒトＩｇＧ４とＴＩＧＩＴ抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度で各ウェルに入れた後、３７℃、５％ ＣＯ２培養器で５日間培養した。５日後に細胞及び培養液を回収して１，５００ｒｐｍで遠心分離し、上澄液はＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡのために－８０℃に保管し、残りの細胞は回収し、ＦＡＣＳバッファーに交替した後、４℃で１５分間Ｆｃ受容体をブロッキング（ｂｌｏｋｉｎｇ）した。それぞれ異なる染料が標識されたＣＤ４５－ＰＥ（ＴＯＮＢＯ，Ｃａｔ Ｎｏ．５０－０４５９－Ｔ１００）、ＣＤ３－Ｐｅｒｃｉｆｉｃ ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ Ｎｏ．３００３３０）、ＣＤ８－ＡＰＣ（ＴＯＮＢＯ，Ｃａｔ Ｎｏ．２０－００８８－Ｔ１００）、ＣＤ４－ＰＥ－Ｃｙ７（ＴＯＮＢＯ，Ｃａｔ Ｎｏ．６０－００４９－Ｔ１００）、ＣＤ２５－ＡＰＣ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ Ｎｏ．３０２６１４）に対する抗体をプレートに処理した後、３０分間４℃で反応させた。反応後、ＦＡＣＳバッファーを満たして遠心分離し、この過程を３回反復する。細胞を固定バッファー（ＢＤ ｃｙｔｏｆｉｘ；ｃａｔ．＃５５４６５５）１００μｌに再浮遊した後、３０分間４℃で反応させた。ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した後、分析のために、ＦＡＣＳバッファー２００μｌで再浮遊した。ＦＡＣＳ ＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ装備でＣＤ８細胞のうちＣＦＳＥで細胞増殖を確認し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。その結果を図１０に示した。ＴＩＧＩＴ候補抗体によって調節性Ｔ細胞の機能が抑制され、対照群に比べてＣＤ８Ｔ細胞が１４％程度増加した細胞増殖を示した。
ＣＦＳＥで標識したレスポンダー細胞を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＩＭＤＭに再浮遊して９６ウェル丸プレートに２×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌで入れ、調節性Ｔ細胞を０：１、０．１：１（２×１０４）、０．２５：１（５×１０４）、０．５：１（１×１０５）の割合で（Ｔｒｅｇ：レスポンダー）を入れた。溶解性（Ｓｏｌｕｂｌｅ）抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（２μｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加し、ヒトＩｇＧ４とＴＩＧＩＴ抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度で各ウェルに入れた後、３７℃、５％ ＣＯ２培養器で５日間培養した。５日後に細胞及び培養液を回収して１，５００ｒｐｍで遠心分離し、上澄液はＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡのために－８０℃に保管し、残りの細胞は回収し、ＦＡＣＳバッファーに交替した後、４℃で１５分間Ｆｃ受容体をブロッキング（ｂｌｏｋｉｎｇ）した。それぞれ異なる染料が標識されたＣＤ４５－ＰＥ（ＴＯＮＢＯ，Ｃａｔ Ｎｏ．５０－０４５９－Ｔ１００）、ＣＤ３－Ｐｅｒｃｉｆｉｃ ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ Ｎｏ．３００３３０）、ＣＤ８－ＡＰＣ（ＴＯＮＢＯ，Ｃａｔ Ｎｏ．２０－００８８－Ｔ１００）、ＣＤ４－ＰＥ－Ｃｙ７（ＴＯＮＢＯ，Ｃａｔ Ｎｏ．６０－００４９－Ｔ１００）、ＣＤ２５－ＡＰＣ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ Ｎｏ．３０２６１４）に対する抗体をプレートに処理した後、３０分間４℃で反応させた。反応後、ＦＡＣＳバッファーを満たして遠心分離し、この過程を３回反復する。細胞を固定バッファー（ＢＤ ｃｙｔｏｆｉｘ；ｃａｔ．＃５５４６５５）１００μｌに再浮遊した後、３０分間４℃で反応させた。ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した後、分析のために、ＦＡＣＳバッファー２００μｌで再浮遊した。ＦＡＣＳ ＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ装備でＣＤ８細胞のうちＣＦＳＥで細胞増殖を確認し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。その結果を図１０に示した。ＴＩＧＩＴ候補抗体によって調節性Ｔ細胞の機能が抑制され、対照群に比べてＣＤ８Ｔ細胞が１４％程度増加した細胞増殖を示した。
【0143】
９．５ ＴＩＧＩＴ候補抗体によるＩＦＮ－γ分泌量確認
－８０℃に保管した試料上澄液を常温で溶かし、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離する。ＩＦＮ－γ分泌量を測定するために、ヒトＩＦＮ－γイムノアッセイキット（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ，Ｃａｔ Ｎｏ．ＤＩＦ５０）を用いた。ＥＬＩＳＡに使用される全ての使用を常温に準備した。マイクロプレートストリップ（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｓｔｒｉｐｓ）をサンプル数だけ準備し、サンプルを入れる各ウェルに、１００μｌずつ希釈液ＲＤ１－５１を入れた。上澄液をキャリブレータ希釈液（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ ｄｉｌｕｅｎｔ）ＲＤ６－２１で２０倍に希釈する。ＩＦＮ－γ標準株（ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｔｏｃｋ）（１０００ｐｇ／ｍｌ）を５００ｐｇ／ｍｌに希釈した後、１：１体積比率に順次希釈を６回行った。各ウェル当たり標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）とサンプルを１００μｌ入れて常温で２時間反応させた。洗浄バッファーで３回洗浄後に、ヒトＩＦＮ－γコンジュゲ－トをウェル当たり２００μｌずつ処理した後、常温で２時間反応させた。洗浄バッファーで３回洗浄後に、基質溶液をウェル当たり２００μｌずつ処理し、常温で３０分間反応させた後に各ウェル当たり停止溶液を５０μｌずつ処理し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｒｅａｄｅｒ装備を用いて５４０ｎｍ又は５７０ｎｍ波長でＯ．Ｄ値を測定した。測定値は、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ５．４．１プログラムを用いて分析した。その結果を図１０に示した。ＴＩＧＩＴ候補抗体によって調節性Ｔ細胞の機能が抑制され、培養上澄液で測定したＩＦＮ－γ分泌量は、対照群に比べて２倍程度高い数値を示した。
－８０℃に保管した試料上澄液を常温で溶かし、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離する。ＩＦＮ－γ分泌量を測定するために、ヒトＩＦＮ－γイムノアッセイキット（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ，Ｃａｔ Ｎｏ．ＤＩＦ５０）を用いた。ＥＬＩＳＡに使用される全ての使用を常温に準備した。マイクロプレートストリップ（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｓｔｒｉｐｓ）をサンプル数だけ準備し、サンプルを入れる各ウェルに、１００μｌずつ希釈液ＲＤ１－５１を入れた。上澄液をキャリブレータ希釈液（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ ｄｉｌｕｅｎｔ）ＲＤ６－２１で２０倍に希釈する。ＩＦＮ－γ標準株（ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｔｏｃｋ）（１０００ｐｇ／ｍｌ）を５００ｐｇ／ｍｌに希釈した後、１：１体積比率に順次希釈を６回行った。各ウェル当たり標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）とサンプルを１００μｌ入れて常温で２時間反応させた。洗浄バッファーで３回洗浄後に、ヒトＩＦＮ－γコンジュゲ－トをウェル当たり２００μｌずつ処理した後、常温で２時間反応させた。洗浄バッファーで３回洗浄後に、基質溶液をウェル当たり２００μｌずつ処理し、常温で３０分間反応させた後に各ウェル当たり停止溶液を５０μｌずつ処理し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｒｅａｄｅｒ装備を用いて５４０ｎｍ又は５７０ｎｍ波長でＯ．Ｄ値を測定した。測定値は、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ５．４．１プログラムを用いて分析した。その結果を図１０に示した。ＴＩＧＩＴ候補抗体によって調節性Ｔ細胞の機能が抑制され、培養上澄液で測定したＩＦＮ－γ分泌量は、対照群に比べて２倍程度高い数値を示した。
【0144】
実施例１０．ＴＩＧＩＴ候補抗体の抗癌効果確認
Ｒａｊｉ癌細胞とＰＶＲ過発現するように作製されたＲａｊｉ－ＰＶＲ細胞株をＲＰＭＩ １６４０培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｃａｔ．＃１１８７５０９３）に１×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌ濃度で１５ｍｌチューブに再浮遊し、３０μｌ Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ（ｆｉｎａｌ ３０ｕＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ．＃Ｃ３０９９）を入れた後、３７℃で暗くして１時間反応させる。１時間後、ＲＰＭＩ １６４０培地で２回洗浄後に、ＲＰＭＩ １６４０培地１×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌ濃度で再浮遊して９６ウェルプレートに入れる。増幅培養した（Ｅｘｐａｎｄｅｄ）ＮＫ細胞を、癌細胞と３：１にして各ウェルに入れ、この時、１Ｇ８を１０μｇ／ｍｌ濃度で各ウェルに共に入れ、対照群としてヒトＩｇＧ４を同一に処理し、光を遮断して３７℃温度で５％ ＣＯ２条件で６時間共同培養する。６時間後、９６ウェルプレートを２，０００ｒｐｍ、３分間遠心分離し、１００μｌ上澄液を取って９６ウェル黒プレートに移した後、ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｄｅｒにより４８５ｎｍ／５３５ｎｍ波長で各試料の値を測定した。下のような数式を用いて溶解度（ｌｙｓｉｓ）値を分析した。その結果を図１１に示した。ＰＶＲが過発現した細胞において１Ｇ８処理によってＮＫ細胞の癌細胞死が増加したことを確認し、これは、ＰＶＲ発現依存的にＴＩＧＩＴに対する特異的標的化（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）による効力を示すことを確認した。
Ｒａｊｉ癌細胞とＰＶＲ過発現するように作製されたＲａｊｉ－ＰＶＲ細胞株をＲＰＭＩ １６４０培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｃａｔ．＃１１８７５０９３）に１×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌ濃度で１５ｍｌチューブに再浮遊し、３０μｌ Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ（ｆｉｎａｌ ３０ｕＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ．＃Ｃ３０９９）を入れた後、３７℃で暗くして１時間反応させる。１時間後、ＲＰＭＩ １６４０培地で２回洗浄後に、ＲＰＭＩ １６４０培地１×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌ濃度で再浮遊して９６ウェルプレートに入れる。増幅培養した（Ｅｘｐａｎｄｅｄ）ＮＫ細胞を、癌細胞と３：１にして各ウェルに入れ、この時、１Ｇ８を１０μｇ／ｍｌ濃度で各ウェルに共に入れ、対照群としてヒトＩｇＧ４を同一に処理し、光を遮断して３７℃温度で５％ ＣＯ２条件で６時間共同培養する。６時間後、９６ウェルプレートを２，０００ｒｐｍ、３分間遠心分離し、１００μｌ上澄液を取って９６ウェル黒プレートに移した後、ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｄｅｒにより４８５ｎｍ／５３５ｎｍ波長で各試料の値を測定した。下のような数式を用いて溶解度（ｌｙｓｉｓ）値を分析した。その結果を図１１に示した。ＰＶＲが過発現した細胞において１Ｇ８処理によってＮＫ細胞の癌細胞死が増加したことを確認し、これは、ＰＶＲ発現依存的にＴＩＧＩＴに対する特異的標的化（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）による効力を示すことを確認した。
【0145】
実施例１１．ＴＩＧＩＴ候補抗体（１Ｇ８）とＰＤ－１抗体の併用処理によるＴ細胞反応性増加確認
１１．１ 末梢血液から分離された単核細胞（ＰＢＭＣ）からＣＤ１４陽性細胞分離後に成熟した樹状細胞に分化
冷凍保存された（Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）健康な供与者由来末梢血液単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ，ＰＢＭＣ）を３７℃水槽で速かに溶かした後、５０ｍＬコニカルチューブ（ｃｏｎｉｃａｌ ｔｕｂｅ）に移して振り動かしながら解凍培地（ｔｈａｗｉｎｇ ｍｅｄｉａ）（ＲＰＭＩ，Ｇｉｂｃｏ１１８７５－０９３＋１０％ ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ１６０００－０４４）を一滴ずつ点滴して混ぜた。その後、１２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して上澄液を除去し、４０ｍＬのＭＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋０．５％ ＦＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）に再浮遊させた後、細胞数を定量した。細胞１０７個当たり２０μＬのＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０－０５０－２０１）と８０μＬのＭＡＣＳバッファーを処理した後、１５分間光を遮断し、４℃で培養した。その後、１３５０ｒｐｍ、４℃で８分間遠心分離して上澄液を除去し、５００μＬのＭＡＣＳバッファーに再懸濁させた後、ＱｕａｄｒｏＭＡＣＳセパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０－０９０－９７６）に装着されたＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ１３０－０４２－４０１）にロードした。ＬＳカラムをＭＡＣＳバッファーで３ｍＬずつ３回洗浄した後、ＱｕａｄｒｏＭＡＣＳセパレーターから除去した後、１５ｍＬコニカルチューブ上に移した後、プランジャーで押してＣＤ１４陽性細胞を得た。得られたＣＤ１４陽性細胞は、１．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度でｃｏｍｐｌｅｔｅ ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ，Ｇｉｂｃｏ Ａ１０４９１－０１＋１０％ ＦＢＳ＋５５μＭ β－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，Ｇｉｂｃｏ ２１９８５－０２３＋１Ｘ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ，Ｇｉｂｃｏ １５２４０）に再浮遊させ、２Ｘ ＧＭ－ＣＳＦ（２×１０３Ｕ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，２１５－ＧＭ－０１０）と２Ｘ ＩＬ－４（２×１０３Ｕ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，２０４－ＩＬ－０１０）サイトカインが含まれたｃｏｍｐｌｅｔｅ ＲＰＭＩと１：１の比率に混ぜて６ウェルプレートに入れた後、３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。３日後、各ウェルで上清培養液１．５ｍＬずつを１ｍＬピペットで除去し、各ウェルに１Ｘ ＧＭ－ＣＳＦ＋１Ｘ ＩＬ－４が含まれたｃｏｍｐｌｅｔｅ ＲＰＭＩ培地を２ｍＬずつ追加した。２日後、各６ウェルで２ｍＬ培養液を除去し、各サイトカインＧＭ－ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍＬ）＋ＩＬ－４（１０００Ｕ／ｍＬ）＋ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，２１０－ＴＡ－０１０）＋ＩＬ－１β（１０ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，２０１－ＬＢ－００５）＋ＩＬ－６（１０ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，２０６－ＩＬ－０１０）＋ＰＧＥ２（１μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ，Ｐ０４０９－１ＭＧ）が含まれた培地を３ｍＬ追加し、２日間細胞を３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。細胞を解いて培養して７日目に、底に接合した成熟した樹状細胞をピペッティングして５０ｍＬ ニカルチューブに集めた後、細胞数を測定し、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に調整した。
１１．１ 末梢血液から分離された単核細胞（ＰＢＭＣ）からＣＤ１４陽性細胞分離後に成熟した樹状細胞に分化
冷凍保存された（Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）健康な供与者由来末梢血液単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ，ＰＢＭＣ）を３７℃水槽で速かに溶かした後、５０ｍＬコニカルチューブ（ｃｏｎｉｃａｌ ｔｕｂｅ）に移して振り動かしながら解凍培地（ｔｈａｗｉｎｇ ｍｅｄｉａ）（ＲＰＭＩ，Ｇｉｂｃｏ１１８７５－０９３＋１０％ ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ１６０００－０４４）を一滴ずつ点滴して混ぜた。その後、１２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して上澄液を除去し、４０ｍＬのＭＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋０．５％ ＦＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）に再浮遊させた後、細胞数を定量した。細胞１０７個当たり２０μＬのＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０－０５０－２０１）と８０μＬのＭＡＣＳバッファーを処理した後、１５分間光を遮断し、４℃で培養した。その後、１３５０ｒｐｍ、４℃で８分間遠心分離して上澄液を除去し、５００μＬのＭＡＣＳバッファーに再懸濁させた後、ＱｕａｄｒｏＭＡＣＳセパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０－０９０－９７６）に装着されたＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ１３０－０４２－４０１）にロードした。ＬＳカラムをＭＡＣＳバッファーで３ｍＬずつ３回洗浄した後、ＱｕａｄｒｏＭＡＣＳセパレーターから除去した後、１５ｍＬコニカルチューブ上に移した後、プランジャーで押してＣＤ１４陽性細胞を得た。得られたＣＤ１４陽性細胞は、１．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度でｃｏｍｐｌｅｔｅ ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ，Ｇｉｂｃｏ Ａ１０４９１－０１＋１０％ ＦＢＳ＋５５μＭ β－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，Ｇｉｂｃｏ ２１９８５－０２３＋１Ｘ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ，Ｇｉｂｃｏ １５２４０）に再浮遊させ、２Ｘ ＧＭ－ＣＳＦ（２×１０３Ｕ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，２１５－ＧＭ－０１０）と２Ｘ ＩＬ－４（２×１０３Ｕ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，２０４－ＩＬ－０１０）サイトカインが含まれたｃｏｍｐｌｅｔｅ ＲＰＭＩと１：１の比率に混ぜて６ウェルプレートに入れた後、３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。３日後、各ウェルで上清培養液１．５ｍＬずつを１ｍＬピペットで除去し、各ウェルに１Ｘ ＧＭ－ＣＳＦ＋１Ｘ ＩＬ－４が含まれたｃｏｍｐｌｅｔｅ ＲＰＭＩ培地を２ｍＬずつ追加した。２日後、各６ウェルで２ｍＬ培養液を除去し、各サイトカインＧＭ－ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍＬ）＋ＩＬ－４（１０００Ｕ／ｍＬ）＋ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，２１０－ＴＡ－０１０）＋ＩＬ－１β（１０ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，２０１－ＬＢ－００５）＋ＩＬ－６（１０ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，２０６－ＩＬ－０１０）＋ＰＧＥ２（１μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ，Ｐ０４０９－１ＭＧ）が含まれた培地を３ｍＬ追加し、２日間細胞を３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。細胞を解いて培養して７日目に、底に接合した成熟した樹状細胞をピペッティングして５０ｍＬ ニカルチューブに集めた後、細胞数を測定し、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に調整した。
【0146】
１１．２．末梢血液から分離された単核細胞（ＰＢＭＣ）から全体Ｔ細胞（ｐａｎ Ｔ ｃｅｌｌ）分離及びＶＰＤ４５０染色
樹状細胞を分離した供与者とは異なる同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）供与者から分離された冷凍保存された末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、３７℃水槽で速かに溶かした後、５０ｍＬコニカルチューブに移して振り動かしながら解凍培地を一滴ずつ点滴して混ぜた。その後、１２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して上澄液を除去し、４０ｍＬのＭＡＣＳバッファーに再浮遊させた後、細胞数を定量した。細胞１０７個当たり１０μＬの全体Ｔ細胞ビオチン抗体（ｐａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｂｉｏｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０－０９６－５３５）と４０μＬのＭＡＣＳバッファーを処理した後、５分間光を遮断し、４℃で培養した。その後、細胞１０７個当たり２０μＬの抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０－０９６－５３５）と３０μＬのＭＡＣＳバッファーを処理した後、１０分間光を遮断し、４℃で培養した。培養が終わった後、最終体積が５００μＬとなるようにＭＡＣＳバッファーで量を合わせた後、ＱｕａｄｒｏＭＡＣＳセパレーターに装着されたＬＳカラムにロードした。ＬＳカラムをＭＡＣＳバッファーで３ｍＬずつ３回ロードしながら、ＬＳカラムから流れ出た細胞を１５ｍＬコニカルチューブに全て集めた後、細胞数を定量した。集まったＴ細胞を１２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して上澄液を除去した後、１Ｘ ＰＢＳ溶液に再浮遊して最終濃度を２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬに合わせた。細胞の入っている溶液と同じ体積の１μＭ ＶＰＤ４５０溶液を入れた後、細胞をよく混ぜ、アルミニウムホイールで光を遮断して３７℃のＣＯ２インキュベーターで２０分間反応させた。その後、１０ｍＬの解凍培地を入れ、１２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した後、上澄液を除去する過程を２回反復した。得られたＴ細胞の最終濃度が２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにｃｏｍｐｌｅｔｅ ＲＰＭＩ培地に再浮遊させた。
樹状細胞を分離した供与者とは異なる同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）供与者から分離された冷凍保存された末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、３７℃水槽で速かに溶かした後、５０ｍＬコニカルチューブに移して振り動かしながら解凍培地を一滴ずつ点滴して混ぜた。その後、１２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して上澄液を除去し、４０ｍＬのＭＡＣＳバッファーに再浮遊させた後、細胞数を定量した。細胞１０７個当たり１０μＬの全体Ｔ細胞ビオチン抗体（ｐａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｂｉｏｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０－０９６－５３５）と４０μＬのＭＡＣＳバッファーを処理した後、５分間光を遮断し、４℃で培養した。その後、細胞１０７個当たり２０μＬの抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０－０９６－５３５）と３０μＬのＭＡＣＳバッファーを処理した後、１０分間光を遮断し、４℃で培養した。培養が終わった後、最終体積が５００μＬとなるようにＭＡＣＳバッファーで量を合わせた後、ＱｕａｄｒｏＭＡＣＳセパレーターに装着されたＬＳカラムにロードした。ＬＳカラムをＭＡＣＳバッファーで３ｍＬずつ３回ロードしながら、ＬＳカラムから流れ出た細胞を１５ｍＬコニカルチューブに全て集めた後、細胞数を定量した。集まったＴ細胞を１２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して上澄液を除去した後、１Ｘ ＰＢＳ溶液に再浮遊して最終濃度を２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬに合わせた。細胞の入っている溶液と同じ体積の１μＭ ＶＰＤ４５０溶液を入れた後、細胞をよく混ぜ、アルミニウムホイールで光を遮断して３７℃のＣＯ２インキュベーターで２０分間反応させた。その後、１０ｍＬの解凍培地を入れ、１２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した後、上澄液を除去する過程を２回反復した。得られたＴ細胞の最終濃度が２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにｃｏｍｐｌｅｔｅ ＲＰＭＩ培地に再浮遊させた。
【0147】
１１．３ 樹状細胞と同種異系Ｔ細胞を用いた混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＭＬＲ）試験
１１．１で由来した、７日間試験管で成熟した樹状細胞と、２．２で分離されたＶＰＤ４５０が染色された同種異系Ｔ細胞を、１：２０の比率に共同培養をするために、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＲＰＭＩ培地の量を調整し、次のように最終濃度を合わせた（樹状細胞最終濃度：１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ；Ｔ細胞最終濃度：２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）。９６ウェルＵ底プレートに各ウェル当たり５×１０３ｃｅｌｌｓ／５０μＬの樹状細胞と１×１０５ｃｅｌｌｓ／５０μＬのＴ細胞をピペッティングして移した。一定の比率で細胞を移した後、次のように合計５つの条件で５日間共同培養を行った：１）樹状細胞とＴ細胞だけを培養、２）１）の条件にヒトＩｇＧ４タイプのアイソタイプ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，４０３７０２）を処理、３）１）の条件にＴＩＧＩＴ候補抗体（１Ｇ８）を単独処理、４）１）の条件にＰＤ－１抗体（ＭＳＤ，Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）を単独処理、５）１）の条件にＴＩＧＩＴ候補抗体（１Ｇ８）とＰＤ－１抗体を併用処理。全ての実験において各抗体の最終濃度は５μｇ／ｍＬとなるように調整した。各抗体を処理した後、９６ウェルプレートを３７℃のＣＯ２インキュベーターで５日間培養した。５日後に細胞及び培養液を回収して２０００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄液はヒトＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡ試験分析のために－８０℃冷凍高に保管し、９６ウェルプレートに残った細胞にはＦＡＣＳバッファー（１％ ＦＢＳ／シースバッファー(ｓｈｅａｔｈ ｂｕｆｆｅｒ)）を添加した後、１２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、上澄液を除去する過程を２回反復した。１００μＬのＦＡＣＳバッファーに再浮遊して５ｍＬチューブに準備し、抗体を処理した後、３０分間光を遮断し、４℃で培養した。抗体は、ＦＩＴＣ抗ＣＤ８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ３０１００６）、ＰＥ抗ＴＩＧＩＴ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，１２－９５００－４２）、ＰＥ－Ｃｙ７抗ＰＤ－１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，２５－２７９９－４２）、ＡＰＣ抗ＣＤ４（Ｔｏｎｂｏ２０－００４９－Ｔ１００）、ＡＰＣ－Ｃｙ７抗ＣＤ３（ＢＤ５６０１７６）、ＰｅｒＣＰ Ｃｙ５．５抗７ＡＡＤ（ＢＤ５５９９２５）を使用した。その後、、各サンプル当たりに１ｍＬ ＦＡＣＳバッファーを入れ、４℃、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上澄液を除去して試料を得た。ＬＳＲ ＦｏｒｔｅｓｓａでＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞のうちＶＰＤ４５０陰性／陽性比率によって各グループの細胞増殖程度を確認し、分析した結果を図１２Ａに示した。
１１．１で由来した、７日間試験管で成熟した樹状細胞と、２．２で分離されたＶＰＤ４５０が染色された同種異系Ｔ細胞を、１：２０の比率に共同培養をするために、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＲＰＭＩ培地の量を調整し、次のように最終濃度を合わせた（樹状細胞最終濃度：１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ；Ｔ細胞最終濃度：２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）。９６ウェルＵ底プレートに各ウェル当たり５×１０３ｃｅｌｌｓ／５０μＬの樹状細胞と１×１０５ｃｅｌｌｓ／５０μＬのＴ細胞をピペッティングして移した。一定の比率で細胞を移した後、次のように合計５つの条件で５日間共同培養を行った：１）樹状細胞とＴ細胞だけを培養、２）１）の条件にヒトＩｇＧ４タイプのアイソタイプ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，４０３７０２）を処理、３）１）の条件にＴＩＧＩＴ候補抗体（１Ｇ８）を単独処理、４）１）の条件にＰＤ－１抗体（ＭＳＤ，Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）を単独処理、５）１）の条件にＴＩＧＩＴ候補抗体（１Ｇ８）とＰＤ－１抗体を併用処理。全ての実験において各抗体の最終濃度は５μｇ／ｍＬとなるように調整した。各抗体を処理した後、９６ウェルプレートを３７℃のＣＯ２インキュベーターで５日間培養した。５日後に細胞及び培養液を回収して２０００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄液はヒトＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡ試験分析のために－８０℃冷凍高に保管し、９６ウェルプレートに残った細胞にはＦＡＣＳバッファー（１％ ＦＢＳ／シースバッファー(ｓｈｅａｔｈ ｂｕｆｆｅｒ)）を添加した後、１２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、上澄液を除去する過程を２回反復した。１００μＬのＦＡＣＳバッファーに再浮遊して５ｍＬチューブに準備し、抗体を処理した後、３０分間光を遮断し、４℃で培養した。抗体は、ＦＩＴＣ抗ＣＤ８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ３０１００６）、ＰＥ抗ＴＩＧＩＴ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，１２－９５００－４２）、ＰＥ－Ｃｙ７抗ＰＤ－１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，２５－２７９９－４２）、ＡＰＣ抗ＣＤ４（Ｔｏｎｂｏ２０－００４９－Ｔ１００）、ＡＰＣ－Ｃｙ７抗ＣＤ３（ＢＤ５６０１７６）、ＰｅｒＣＰ Ｃｙ５．５抗７ＡＡＤ（ＢＤ５５９９２５）を使用した。その後、、各サンプル当たりに１ｍＬ ＦＡＣＳバッファーを入れ、４℃、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上澄液を除去して試料を得た。ＬＳＲ ＦｏｒｔｅｓｓａでＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞のうちＶＰＤ４５０陰性／陽性比率によって各グループの細胞増殖程度を確認し、分析した結果を図１２Ａに示した。
【0148】
図１２Ａで、ＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞のいずれにおいても、ＩｇＧ４アイソタイプ抗体処理対照群に比べて、ＴＩＧＩＴ候補抗体（１Ｇ８）単独処理時には統計的に有意な細胞増殖の増加が起きなかったが、ＰＤ－１抗体単独処理時には統計的に有意な細胞増殖の増加が起きた。この時、ＰＤ－１抗体単独処理時の反応に比べて、ＰＤ－１抗体とＴＩＧＩＴ候補抗体（１Ｇ８）を併用処理した条件において、統計的に有意な、より増加した細胞増殖が観察された。
【0149】
１１．４ ＩＦＮ－γ分泌量変化確認
－８０℃に保管した試料上澄液を常温で溶かし、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＩＦＮ－γ分泌量を測定するために、ヒトＩＦＮ－ｇａｍｍａ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＤＩＦ５０）を用いた。ＥＬＩＳＡに使用された全ての試料を常温に放置して準備した。マイクロプレートストリップをサンプル数だけ準備し、サンプルを入れる各ウェルに、１００μＬずつ希釈液ＲＤ１－５１を入れた。上澄液は、キャリブレータ希釈液ＲＤ６－２１で２０倍に希釈し、ＩＦＮ－γ標準株（１０００ｐｇ／ｍＬ）は５００ｐｇ／ｍＬに希釈した後、１：１体積比率に順次希釈を６回行った。各ウェル当たりに標準とサンプルを１００μＬ入れ、常温で２時間反応させた。洗浄バッファーで３回洗浄後に、ヒトＩＦＮ－γコンジュゲ－トをウェル当たり２００μＬずつ処理した後、常温で２時間反応させた。洗浄バッファーで３回洗浄後に、基質溶液をウェル当たりに２００μＬずつ処理し、常温で３０分間反応させた後、各ウェル当たりに停止溶液を５０μＬずつ処理し、直ちにＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｒｅａｄｅｒ装備を用いて５４０ｎｍ又は５７０ｎｍ波長でＯ．Ｄ値を測定した。測定値は、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ５．４．１プログラムを用いて分析した測定値を図１２Ｂに示した。
－８０℃に保管した試料上澄液を常温で溶かし、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＩＦＮ－γ分泌量を測定するために、ヒトＩＦＮ－ｇａｍｍａ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＤＩＦ５０）を用いた。ＥＬＩＳＡに使用された全ての試料を常温に放置して準備した。マイクロプレートストリップをサンプル数だけ準備し、サンプルを入れる各ウェルに、１００μＬずつ希釈液ＲＤ１－５１を入れた。上澄液は、キャリブレータ希釈液ＲＤ６－２１で２０倍に希釈し、ＩＦＮ－γ標準株（１０００ｐｇ／ｍＬ）は５００ｐｇ／ｍＬに希釈した後、１：１体積比率に順次希釈を６回行った。各ウェル当たりに標準とサンプルを１００μＬ入れ、常温で２時間反応させた。洗浄バッファーで３回洗浄後に、ヒトＩＦＮ－γコンジュゲ－トをウェル当たり２００μＬずつ処理した後、常温で２時間反応させた。洗浄バッファーで３回洗浄後に、基質溶液をウェル当たりに２００μＬずつ処理し、常温で３０分間反応させた後、各ウェル当たりに停止溶液を５０μＬずつ処理し、直ちにＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｒｅａｄｅｒ装備を用いて５４０ｎｍ又は５７０ｎｍ波長でＯ．Ｄ値を測定した。測定値は、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ５．４．１プログラムを用いて分析した測定値を図１２Ｂに示した。
【0150】
図１２Ｂで、ＩｇＧ４アイソタイプ抗体処理対照群に比べてＴＩＧＩＴ候補抗体単独処理時にはＩＦＮ－γ分泌量の差異がなかったが、ＰＤ－１抗体単独処理時には統計的に有意なＩＦＮ－γ分泌量の増加が起きた。この時、ＰＤ－１抗体単独処理時の反応に比べて、ＰＤ－１抗体とＴＩＧＩＴ候補抗体（１Ｇ８）を併用処理した条件において統計的に有意な、より増加（平均して４７％程度）したＩＦＮ－γ分泌量が観察された。
【0151】
実施例１２．ＴＩＧＩＴ候補抗体（１Ｇ８）による調節性Ｔ細胞の活性指標（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）発現減少確認
１２．１ 健康な供与者末梢血液から分離された単核細胞（ＰＢＭＣ）にＴＩＧＩＴ候補抗体（１Ｇ８）処理
冷凍保存された健康な供与者由来末梢血液単核細胞を３７℃水槽に速かに溶かした後、５０ｍＬコニカルチューブに移して振り動かしながら解凍培地を一滴ずつ点滴して混ぜた。その後、１２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して上澄液を除去し、１５ｍＬの解凍培地に細胞を再浮遊させた後、細胞数を定量した。１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬでｃｏｍｐｌｅｔｅ ＲＰＭＩに再懸濁させた後、９６ウェルＵ底プレートに１×１０６細胞とＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（ｇｉｂｃｏ，１１１．３１Ｄ）２μＬを、一つのウェル当たりに合計２００μＬに合わせて３倍数で分注した。各グループ別に当該抗体（１Ｇ８、ｈＩｇＧ４）は最終濃度１ｍｇ／ｍＬに処理して６日間培養した。
１２．１ 健康な供与者末梢血液から分離された単核細胞（ＰＢＭＣ）にＴＩＧＩＴ候補抗体（１Ｇ８）処理
冷凍保存された健康な供与者由来末梢血液単核細胞を３７℃水槽に速かに溶かした後、５０ｍＬコニカルチューブに移して振り動かしながら解凍培地を一滴ずつ点滴して混ぜた。その後、１２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して上澄液を除去し、１５ｍＬの解凍培地に細胞を再浮遊させた後、細胞数を定量した。１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬでｃｏｍｐｌｅｔｅ ＲＰＭＩに再懸濁させた後、９６ウェルＵ底プレートに１×１０６細胞とＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（ｇｉｂｃｏ，１１１．３１Ｄ）２μＬを、一つのウェル当たりに合計２００μＬに合わせて３倍数で分注した。各グループ別に当該抗体（１Ｇ８、ｈＩｇＧ４）は最終濃度１ｍｇ／ｍＬに処理して６日間培養した。
【0152】
１２．２ 調節性Ｔ細胞の形質変化分析
６日間培養した細胞をプレートのまま４℃で２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後に上澄液を除去し、ウェル当たりに２００μＬのＰＢＳで再浮遊した後、４℃、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄液を除去した後、死んだ細胞を区分するために、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤTM Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌ３４９５７）を処理し、３０分間光を遮断して４℃で培養した。ウェル当たりにＦＡＣＳバッファー１００μＬをさらに処理し、４℃、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄液を除去し、抗体を処理した後、３０分間光を遮断して４℃で培養した。抗体は、ＢＶ４２１抗ＣＤ２５（ＢＤ ５６２４４２）、ＦＩＴＣ抗ＣＤ１２７（ＢＤ ５６４４２３）、ＢＢ７００抗ＣＤ８（ＢＤ ５６６４５２）、Ｒ７００抗ＣＤ４（ＢＤ ５６４９７５）、ＡＰＣ－Ｈ７抗ＣＤ３（ＢＤ ５６０１７６）、ＰＥ－Ｃｙ７抗ＣＤ３９（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ２５－０３９９－４１）、ＰＥ－Ｃｙ７抗ＰＤ－１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １３５２１６）、Ａｌｅｘａ６４７抗ＩＣＯＳ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３１３５１６）、Ａｌｅｘａ６４７抗ＴＩＧＩＴ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３７２７２４）、ＰＥ－Ｃｙ７抗ＬＡＧ－３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３６９３１０）、ＰＥ－Ｃｙ７抗ＨＬＡ－ＤＲ（ＢＤ ５６５０９６）、ＡＰＣ抗ＣＣＭ１（Ｒ＆Ｄ ＦＡＢ２２４４Ａ）を使用した。ウェル当たりにＦＡＣＳバッファー１００μＬをさらに処理し、４℃、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄液を除去した後、ＦｏｘＰ３／ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ｓｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，００－５５２３－００）のプロトコルに従って細胞内染色（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行った。抗体は、ＰＥ抗ＦｏｘＰ３（ｅＢｉｏｓｉｃｅｎｃｅ １２－４７７６－４２）、ＡＰＣ抗ＣＴＬＡ－４（Ｒ＆Ｄ ＦＡＢ３８６Ａ）を使用した。染色を終えた細胞をＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析した結果を図１３に示した。
６日間培養した細胞をプレートのまま４℃で２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後に上澄液を除去し、ウェル当たりに２００μＬのＰＢＳで再浮遊した後、４℃、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄液を除去した後、死んだ細胞を区分するために、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤTM Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌ３４９５７）を処理し、３０分間光を遮断して４℃で培養した。ウェル当たりにＦＡＣＳバッファー１００μＬをさらに処理し、４℃、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄液を除去し、抗体を処理した後、３０分間光を遮断して４℃で培養した。抗体は、ＢＶ４２１抗ＣＤ２５（ＢＤ ５６２４４２）、ＦＩＴＣ抗ＣＤ１２７（ＢＤ ５６４４２３）、ＢＢ７００抗ＣＤ８（ＢＤ ５６６４５２）、Ｒ７００抗ＣＤ４（ＢＤ ５６４９７５）、ＡＰＣ－Ｈ７抗ＣＤ３（ＢＤ ５６０１７６）、ＰＥ－Ｃｙ７抗ＣＤ３９（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ２５－０３９９－４１）、ＰＥ－Ｃｙ７抗ＰＤ－１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １３５２１６）、Ａｌｅｘａ６４７抗ＩＣＯＳ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３１３５１６）、Ａｌｅｘａ６４７抗ＴＩＧＩＴ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３７２７２４）、ＰＥ－Ｃｙ７抗ＬＡＧ－３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３６９３１０）、ＰＥ－Ｃｙ７抗ＨＬＡ－ＤＲ（ＢＤ ５６５０９６）、ＡＰＣ抗ＣＣＭ１（Ｒ＆Ｄ ＦＡＢ２２４４Ａ）を使用した。ウェル当たりにＦＡＣＳバッファー１００μＬをさらに処理し、４℃、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄液を除去した後、ＦｏｘＰ３／ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ｓｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，００－５５２３－００）のプロトコルに従って細胞内染色（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行った。抗体は、ＰＥ抗ＦｏｘＰ３（ｅＢｉｏｓｉｃｅｎｃｅ １２－４７７６－４２）、ＡＰＣ抗ＣＴＬＡ－４（Ｒ＆Ｄ ＦＡＢ３８６Ａ）を使用した。染色を終えた細胞をＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析した結果を図１３に示した。
【0153】
図１３で、１Ｇ８抗体が正常人の調節性Ｔ細胞の活性指標のうち、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ３の発現には影響を与えないが、ＣＤ３９とＣＴＬＡ－４の発現を有意に減少させることを確認した。
【0154】
実施例１３．多発性骨髄腫患者のＣＤ８Ｔ細胞と調節性Ｔ細胞の枯渇指標（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ ｍａｋｅｒ）発現分析
冷凍保存された多発性骨髄腫患者由来末梢血液単核細胞を３７℃水槽に速かに溶かした後、５０ｍＬコニカルチューブに移して振り動かしながら解凍培地を一滴ずつ点滴して混ぜた。その後、１２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して上澄液を除去し、１５ｍＬの解凍培地に細胞を再浮遊させた後、細胞数を定量した。解凍させた患者の末梢血液単核細胞を４個のＦＡＣＳチューブに分けて入れた後、ＰＢＳ ２ｍＬを追加し、４℃、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄液を除去した後、死んだ細胞を区分するために、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤTMＦｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔを処理し、３０分間光を遮断して４℃で培養した。各チューブにＦＡＣＳバッファー２ｍＬをさらに処理し、４℃、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄液を除去し、抗体を処理した後、３０分間光を遮断して４℃で培養した。抗体は、Ａｌｅｘａ７００抗ＣＤ３（ＢＤ ５５７９４３）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５抗ＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３４４７１０）、ＢＢ７００抗ＣＤ８（ＢＤ ５６６４５２）、Ｒ７００抗ＣＤ４（ＢＤ ５６４９７５）、ＢＶ４２１抗ＣＤ２５（ＢＤ ５６２４４２）、ＢＶ７８６抗ＣＤ１２７（ＢＤ ５６３３２４）、ＦＩＴＣ抗ＣＤ１３８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３５６５０８）、ＰＥ－Ｃｙ７抗ＰＤ－１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １３５２１６）、ＢＶ４２１抗ＴＩＧＩＴ（ＢＤ ７４７８４４）、Ａｌｘ６４７抗ＴＩＧＩＴ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３７２７２４）、ＡＰＣ抗Ｔｉｍ－３（Ｒ＆Ｄ ＦＡＢ２３５６ａＡ）、ＰＥ－Ｃｙ７抗ＬＡＧ－３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３６９３１０）、ＡＰＣ抗ＣＴＬＡ－４（Ｒ＆Ｄ ＦＡＢ３８６Ａ）を使用した。染色後チューブ当たりにＦＡＣＳバッファー２ｍＬを追加し、４℃、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄液除去後、ＦｏｘＰ３／ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ｓｅｔのプロトコルに従って細胞内染色を行った。抗体は、ＰＥ抗ＦｏｘＰ３（ｅＢｉｏｓｉｃｅｎｃｅ １２－４７７６－４２）、ＡＰＣ抗ＣＴＬＡ－４（Ｒ＆Ｄ ＦＡＢ３８６Ａ）を使用した。染色を終えた細胞をＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析した結果を図１４に示した。
冷凍保存された多発性骨髄腫患者由来末梢血液単核細胞を３７℃水槽に速かに溶かした後、５０ｍＬコニカルチューブに移して振り動かしながら解凍培地を一滴ずつ点滴して混ぜた。その後、１２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して上澄液を除去し、１５ｍＬの解凍培地に細胞を再浮遊させた後、細胞数を定量した。解凍させた患者の末梢血液単核細胞を４個のＦＡＣＳチューブに分けて入れた後、ＰＢＳ ２ｍＬを追加し、４℃、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄液を除去した後、死んだ細胞を区分するために、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤTMＦｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔを処理し、３０分間光を遮断して４℃で培養した。各チューブにＦＡＣＳバッファー２ｍＬをさらに処理し、４℃、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄液を除去し、抗体を処理した後、３０分間光を遮断して４℃で培養した。抗体は、Ａｌｅｘａ７００抗ＣＤ３（ＢＤ ５５７９４３）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５抗ＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３４４７１０）、ＢＢ７００抗ＣＤ８（ＢＤ ５６６４５２）、Ｒ７００抗ＣＤ４（ＢＤ ５６４９７５）、ＢＶ４２１抗ＣＤ２５（ＢＤ ５６２４４２）、ＢＶ７８６抗ＣＤ１２７（ＢＤ ５６３３２４）、ＦＩＴＣ抗ＣＤ１３８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３５６５０８）、ＰＥ－Ｃｙ７抗ＰＤ－１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １３５２１６）、ＢＶ４２１抗ＴＩＧＩＴ（ＢＤ ７４７８４４）、Ａｌｘ６４７抗ＴＩＧＩＴ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３７２７２４）、ＡＰＣ抗Ｔｉｍ－３（Ｒ＆Ｄ ＦＡＢ２３５６ａＡ）、ＰＥ－Ｃｙ７抗ＬＡＧ－３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３６９３１０）、ＡＰＣ抗ＣＴＬＡ－４（Ｒ＆Ｄ ＦＡＢ３８６Ａ）を使用した。染色後チューブ当たりにＦＡＣＳバッファー２ｍＬを追加し、４℃、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄液除去後、ＦｏｘＰ３／ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ｓｅｔのプロトコルに従って細胞内染色を行った。抗体は、ＰＥ抗ＦｏｘＰ３（ｅＢｉｏｓｉｃｅｎｃｅ １２－４７７６－４２）、ＡＰＣ抗ＣＴＬＡ－４（Ｒ＆Ｄ ＦＡＢ３８６Ａ）を使用した。染色を終えた細胞をＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析した結果を図１４に示した。
【0155】
図１４で、多発性骨髄腫患者のＣＤ８Ｔ細胞の枯渇指標５種のうち、ＴＩＧＩＴの発現が他の４種に比べて顕著に高いことを確認した。多発性骨髄腫患者の調節性Ｔ細胞の場合、ＰＤ－１とＴＩＧＩＴの発現を比較したとき、ＴＩＧＩＴの発現が著しく高かった。
【0156】
実施例１４．ＴＩＧＩＴ候補抗体（１Ｇ８）による多発性骨髄腫患者末梢血液単核細胞におけるＩＦＮ－γ発現増加確認
１４．１ 多発性骨髄腫患者の末梢血液単核細胞にＴＩＧＩＴ候補抗体（１Ｇ８）処理
冷凍保存された多発性骨髄腫患者由来末梢血液単核細胞を３７℃水槽に速かに溶かした後、５０ｍＬコニカルチューブに移して振り動かしながら解凍培地を一滴ずつ点滴して混ぜた。その後、１２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して上澄液を除去し、１５ｍＬの解凍培地に細胞を再浮遊させた後、細胞数を定量した。５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬでｃｏｍｐｌｅｔｅ ＲＰＭＩに再浮遊した後、９６ウェルＵ底プレートにウェル当たり１×１０５個の細胞とＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８２μＬを３倍数で分注した。各グループ別に当該抗体（ＴＩＧＩＴ候補抗体（１Ｇ８）、ＰＤ－１抗体、ｈＩｇＧ４、ＴＩＧＩＴ候補抗体（１Ｇ８）とＰＤ－１抗体を併用処理）を１ｍｇ／ｍＬで処理した。４日後、４℃、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上清培養液を９６ウェルＵ底プレートに１００μＬずつ収集し、－２０℃に密封して保管した。
１４．１ 多発性骨髄腫患者の末梢血液単核細胞にＴＩＧＩＴ候補抗体（１Ｇ８）処理
冷凍保存された多発性骨髄腫患者由来末梢血液単核細胞を３７℃水槽に速かに溶かした後、５０ｍＬコニカルチューブに移して振り動かしながら解凍培地を一滴ずつ点滴して混ぜた。その後、１２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して上澄液を除去し、１５ｍＬの解凍培地に細胞を再浮遊させた後、細胞数を定量した。５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬでｃｏｍｐｌｅｔｅ ＲＰＭＩに再浮遊した後、９６ウェルＵ底プレートにウェル当たり１×１０５個の細胞とＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８２μＬを３倍数で分注した。各グループ別に当該抗体（ＴＩＧＩＴ候補抗体（１Ｇ８）、ＰＤ－１抗体、ｈＩｇＧ４、ＴＩＧＩＴ候補抗体（１Ｇ８）とＰＤ－１抗体を併用処理）を１ｍｇ／ｍＬで処理した。４日後、４℃、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上清培養液を９６ウェルＵ底プレートに１００μＬずつ収集し、－２０℃に密封して保管した。
【0157】
１４．２ ＩＦＮ－γ分泌量変化確認
－２０℃に保管した培養液をプレートのまま常温に放置して溶かす。ＩＦＮ－γ分泌量を定量するために、ＢＤＴＭ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）ヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカインキット（ＢＤ，５６０４８４）のプロトコルに従った。キットから提供する凍結乾燥したサイトカイン標準株（ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｔｏｃｋ）を１５ｍＬチューブに移した後、２ｍＬの希釈用バッファーでピペッティングを十分にして溶解させた後、常温に最小で１５分間放置する。その後、３００μＬの同一容量のバッファーで１：１に順次に希釈し、１０個の標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）を準備する。陰性基準の標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）は希釈用バッファーとして準備する。培養液は、キットの希釈用バッファーを用いて１：２０に希釈した。各サイトカインの捕捉用ビーズ（ｃａｐｔｕｒｅ ｂｅａｄ）を、サンプル数と標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）数分だけ準備し、９６ウェル１．１ｍＬクラスターチューブバルク（Ａｘｙｇｅｎ，ＭＴＳ－１１－Ｃ）にサンプル５０μＬと混ぜた捕捉用ビーズ（ｃａｐｔｕｒｅ ｂｅａｄ）サンプル５０μＬ、ＰＥ検出用抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）５０μＬを入れてよく混ぜる。光を遮断して３時間培養した後、３００μＬの洗浄バッファーを加えて４℃、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上澄液を除去する。過程の完了した各サンプルのＩＦＮ－γ分泌量をＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析し、図１５に示した。
－２０℃に保管した培養液をプレートのまま常温に放置して溶かす。ＩＦＮ－γ分泌量を定量するために、ＢＤＴＭ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）ヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカインキット（ＢＤ，５６０４８４）のプロトコルに従った。キットから提供する凍結乾燥したサイトカイン標準株（ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｔｏｃｋ）を１５ｍＬチューブに移した後、２ｍＬの希釈用バッファーでピペッティングを十分にして溶解させた後、常温に最小で１５分間放置する。その後、３００μＬの同一容量のバッファーで１：１に順次に希釈し、１０個の標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）を準備する。陰性基準の標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）は希釈用バッファーとして準備する。培養液は、キットの希釈用バッファーを用いて１：２０に希釈した。各サイトカインの捕捉用ビーズ（ｃａｐｔｕｒｅ ｂｅａｄ）を、サンプル数と標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）数分だけ準備し、９６ウェル１．１ｍＬクラスターチューブバルク（Ａｘｙｇｅｎ，ＭＴＳ－１１－Ｃ）にサンプル５０μＬと混ぜた捕捉用ビーズ（ｃａｐｔｕｒｅ ｂｅａｄ）サンプル５０μＬ、ＰＥ検出用抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）５０μＬを入れてよく混ぜる。光を遮断して３時間培養した後、３００μＬの洗浄バッファーを加えて４℃、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上澄液を除去する。過程の完了した各サンプルのＩＦＮ－γ分泌量をＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析し、図１５に示した。
【0158】
図１５で、多発性骨髄腫患者のＰＢＭＣに抗ＣＤ３／２８刺激を与えた時のＩＦＮ－γ分泌量が、ＴＩＧＩＴ候補抗体（１Ｇ８）を処理した場合に有意に増加することを確認した。
【0159】
実施例１５．ヒト化マウスを用いたヒト大腸癌細胞異種移植モデルにおいてＴＩＧＩＴ候補抗体（１Ｇ８）の腫瘍成長抑制効果確認
ＴＩＧＩＴ候補抗体（１Ｇ８）の腫瘍成長抑制効果をｉｎ ｖｉｖｏで確認するために、免疫細胞の不在しているＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，５～６週齢）マウスにヒト癌細胞株と正常人の末梢血液単核細胞を移植する異種移植動物モデルを使用した。ヒト癌細胞株には、ヒト大腸癌細胞株であるＨＴ２９（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ－３８）を使用し、ＰＥ抗ＰＶＲ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１２－１５５０－４１）を用いてＰＶＲ発現を確認した結果を図１６に示した。ＨＴ２９細胞に発現したＰＶＲは、免疫細胞で発現したＴＩＧＩＴと結合して免疫細胞の活性抑制効果を誘発する。まず、ＨＴ２９細胞３．５×１０６ｃｅｌｌｓ／０．２ｍＬを、雌ＮＯＧマウスの右腋窩下側皮下に注射し、腫瘍が形成されるようにした（Ｄａｙ ０）。腫瘍細胞注射６時間後に、末梢血液単核細胞７×１０６ｃｅｌｌｓ／０．２ｍＬを腹腔内注射し、ヒトの兔疫体系を備えたマウスモデルを作った。腫瘍体積が５０～８０ｍｍ３に育った時、類似の腫瘍サイズを有するグループに分類し、ＴＩＧＩＴ候補抗体（１Ｇ８）（１０ｍｇ／ｋｇ）をマウスの腹腔に１週に２回、合計で６回投与した。ＴＩＧＩＴ候補抗体（１Ｇ８）が１０ｍｇ／ｋｇの容量で投与された実験群の平均腫瘍体積は、陰性対照群の平均腫瘍体積と比較して、約２８．１％程度の腫瘍成長抑制効果を示した（＊：Ｐ＜０．０５）。
ＴＩＧＩＴ候補抗体（１Ｇ８）の腫瘍成長抑制効果をｉｎ ｖｉｖｏで確認するために、免疫細胞の不在しているＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，５～６週齢）マウスにヒト癌細胞株と正常人の末梢血液単核細胞を移植する異種移植動物モデルを使用した。ヒト癌細胞株には、ヒト大腸癌細胞株であるＨＴ２９（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ－３８）を使用し、ＰＥ抗ＰＶＲ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１２－１５５０－４１）を用いてＰＶＲ発現を確認した結果を図１６に示した。ＨＴ２９細胞に発現したＰＶＲは、免疫細胞で発現したＴＩＧＩＴと結合して免疫細胞の活性抑制効果を誘発する。まず、ＨＴ２９細胞３．５×１０６ｃｅｌｌｓ／０．２ｍＬを、雌ＮＯＧマウスの右腋窩下側皮下に注射し、腫瘍が形成されるようにした（Ｄａｙ ０）。腫瘍細胞注射６時間後に、末梢血液単核細胞７×１０６ｃｅｌｌｓ／０．２ｍＬを腹腔内注射し、ヒトの兔疫体系を備えたマウスモデルを作った。腫瘍体積が５０～８０ｍｍ３に育った時、類似の腫瘍サイズを有するグループに分類し、ＴＩＧＩＴ候補抗体（１Ｇ８）（１０ｍｇ／ｋｇ）をマウスの腹腔に１週に２回、合計で６回投与した。ＴＩＧＩＴ候補抗体（１Ｇ８）が１０ｍｇ／ｋｇの容量で投与された実験群の平均腫瘍体積は、陰性対照群の平均腫瘍体積と比較して、約２８．１％程度の腫瘍成長抑制効果を示した（＊：Ｐ＜０．０５）。
【産業上の利用可能性】
【0160】
本発明に係る抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片は、ＴＩＧＩＴに特異的であり、強く結合し、既存の抗ＴＩＧＩＴ抗体に比べて優れた治療効能を示すことが明らかにされた。したがって、本発明に係る抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片は、免疫細胞活性化を用いる抗癌免疫治療剤として利用可能である。
【0161】
また、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片は、化学医薬品及びその他抗癌治療剤と併用治療療法などに活用可能である。
【0162】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施態様に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】