7297320 アンジェルマン症候群アンチセンス治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-06-16

(45)【発行日】2023-06-26

(54)【発明の名称】アンジェルマン症候群アンチセンス治療

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7088 20060101AFI20230619BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230619BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230619BHJP

   A61P 25/08 20060101ALI20230619BHJP

   A61P 25/18 20060101ALI20230619BHJP

   A61P 25/20 20060101ALI20230619BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20230619BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230619BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20230619BHJP

【ＦＩ】

A61K31/7088

A61K48/00

A61P25/00

A61P25/08

A61P25/18

A61P25/20

A61P25/28

A61P43/00 105

A61P43/00 111

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/113 130Z

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2020529238

(86)(22)【出願日】2018-11-30

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-02-18

(86)【国際出願番号】 US2018063416

(87)【国際公開番号】W WO2019109001

(87)【国際公開日】2019-06-06

【審査請求日】2021-11-29

(31)【優先権主張番号】62/593,431

(32)【優先日】2017-12-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/676,034

(32)【優先日】2018-05-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507191005

【氏名又は名称】ザ テキサス エイ・アンド・エム ユニヴァーシティ システム

(74)【代理人】

【識別番号】110000659

【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ディンドット，スコット ビクター

【審査官】内藤 康彰

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１５－５２９６３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／０８１２２３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１１－２５６１７１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／７０８８

Ｃ１２Ｎ １５／１１３

Ａ６１Ｐ ２５／２８

Ａ６１Ｐ ２５／００

Ａ６１Ｐ ２５／０８

Ａ６１Ｐ ２５／２０

Ａ６１Ｐ ２５／１８

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ａ６１Ｋ ４８／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびに薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩および／または賦形剤を含み、
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号２の核酸配列の連続した部分に１００％の相補性を有する、１７～２０個のヌクレオチド長の連続したヌクレオチド配列を含む、薬学的組成物。

【請求項2】

前記オリゴヌクレオチドが、配列番号９の核酸配列を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項3】

１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む、請求項１または２に記載の薬学的組成物。

【請求項4】

前記１つ以上の修飾されたヌクレオシドが、２’糖修飾されたヌクレオシドである、請求項３に記載の薬学的組成物。

【請求項5】

前記１つ以上の２’糖修飾されたヌクレオシドが、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ、およびロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオシドからなる群から独立して選択される、請求項４に記載の薬学的組成物。

【請求項6】

前記１つ以上の修飾されたヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシドである、請求項５に記載の薬学的組成物。

【請求項7】

前記薬学的組成物が、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項8】

前記連続したヌクレオチド配列内の前記ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項７に記載の薬学的組成物。

【請求項9】

前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮアーゼＨをリクルートすることができる、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項10】

前記オリゴヌクレオチドが、ギャップマーである、請求項９に記載の薬学的組成物。

【請求項11】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号６７～１１５からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項12】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号８９の核酸配列を含む、請求項１１に記載の薬学的組成物。

【請求項13】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号３６５、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、および３８３からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項14】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１８～６６からなる群から選択される核酸配列に対して相補的である、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項15】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号４０の核酸配列に対して相補的である、請求項１４に記載の薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月１日に出願された米国仮出願第６２／５９３，４３１号および２０１８年５月２４日に出願された出願シリアル第６２／６７６，０３４号の優先権を主張するものであり、これらは参照によりそれらのすべてが本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、２０１８年１１月３０日に作成された「９２２００１－２０２０ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」という題名のＡＳＣＩＩ．ｔｘｔファイルとして電子形態で提出された配列表を含む。配列表の内容は、そのすべてが本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

アンジェルマン症候群（ＡＳ）は、重度の知的障害および運動障害、てんかん、睡眠障害、ならびに異常に「幸せを感じる」気質に関連付けられる神経発達疾患である。ＡＳを有する個人は、多くの場合、２～３歳で診断され、通常の寿命を有する。彼らは、生涯にわたって、生活に介護および医療ケアを必要とする。現在、ＡＳを有する個人のための治療選択肢はほとんどなく、そのほとんどは、てんかん発作を治療するための抗てんかん薬を含む。

【0004】

アンジェルマン症候群は、母方から遺伝されたユビキチン－タンパク質リガーゼＥ３Ａ（ＵＢＥ３Ａ）遺伝子の発現または機能に影響する変異により引き起こされる。大部分の遺伝子とは異なり、ＵＢＥ３Ａは、ゲノムインプリンティングを受けており、ゲノムインプリンティングとは、遺伝子の他方のアレルをオンにしたままで、一方のアレルをオフにするという、自然に発生する、まれな現象である。中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロンでは、父方ＵＢＥ３Ａアレルはオフになっているが、体内の他のすべての細胞型では、ＵＢＥ３Ａの両方のアレルがオンになっている。このため、ＡＳは常に、母方から遺伝されたＵＢＥ３Ａアレルに影響する変異により引き起こされる。

【0005】

父方ＵＢＥ３Ａアレルは、いくつかのタンパク質コーディングおよび非コーディング転写物を発現する長鎖ＲＮＡ転写物の成分である、ＵＢＥ３Ａアンチセンス転写物（ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ）によりオフになっている。ＵＢＥ３Ａ－ＡＳは、父方アレルから、かつＣＮＳのニューロンにおいてのみ発現され、これは、父方ＵＢＥ３Ａアレルの発現をオフとするのに十分および必須である。何故ＵＢＥ３Ａがニューロンにおいて刷り込みを受けるのかということは不明確であるが、父方染色体上にＵＢＥ３Ａの不活性であるが機能的であるコピーが存在するために、それは、ＡＳを有する個人を治療するために独特の機会を作り出す。現在までの研究は、父方ＵＢＥ３Ａアレルをオンにすることが、ＡＳを治療するための実行可能な治療であることを示している。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本明細書では、自身の安定性のために重要であるＵＢＥ３Ａ－ＡＳ転写物の５’－末端にある領域が開示される。これらの知見に基づいて、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳの転写を終結し、父方ＵＢＥ３Ａアレルの発現を再活性化するために、この領域を標的とするために設計された。ＵＢＥ３Ａ－ＡＳの５’－末端を標的とするこれらのＡＳＯは、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳの転写を終結し、かつ父方ＵＢＥ３Ａアレルをオンとすることができる。ＳＮＨＧ１４は、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳを含む、いくつかの異なるＲＮＡをコードする多シストロン性転写物である。

【課題を解決するための手段】

【0007】

したがって、本明細書では、ＵＢＥ３Ａアンチセンス転写物（ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ）の５’－末端を表すと考えられている、ＳＮＯＲＤ１１５の３’－末端とＳＮＯＲＤ１０９Ｂの５’－末端との間の標的エクソンに対して少なくとも９８％（すなわち、９８％、９９％、または１００％）の相補性を有する、１０～３０個のヌクレオチド長（すなわち、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個）の連続したヌクレオチド配列を含有するＡＳＯが開示される。特に、標的エクソンは、ヒト染色体１５ヒトゲノムアセンブリｈｇ１９上の２５，５１１，５７７～２５，５１６，６８１位に対応する、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳの５’－末端中であり得る。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳの５’－末端中に位置する５つのエクソンのうちの１つであり、これは、２５，５１１，５７７～２５，５１１，７６１（エクソン１）、２５，５１２，０５９～２５，５１２，１９１（エクソン２）、２５，５１３，４７６～２５，５１３，６００（エクソン３）、２５，５１４，７５２～２５，５１４，８８０（エクソン４）、および２５，５１６，５６５～２５，５１６，６８１（エクソン５）位に対応し得る。したがって、標的核酸は、配列番号１、２、３、４、または５内の１０～３０個のヌクレオチドの連続した核酸配列であり得る。

【0008】

いくつかの実施形態では、標的配列は、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳエクソン１～５、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳエクソン５およびＳＮＯＲＤ１０９Ｂエクソン１、および／またはＳＮＯＲＤ１０９Ｂエクソン１～２を含むエクソン境界である。

【0009】

ＡＳＯを設計するための方法および戦略は、当該技術分野において知られている。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ヒト対象の間で保存されている配列を標的するために設計される。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、霊長類対象の間で保存されている配列を標的するために設計される。

【0010】

オリゴヌクレオチドは、例えば、ギャップマー設計を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチド（すなわち、当業者によって理解されているように、その標的核酸に対してアンチセンスである）であり得る。開示されたオリゴヌクレオチドは、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ転写物の分解、軽減、または除去により、ニューロンにおける父方ＵＢＥ３Ａ発現を誘導することができる。それは、ＳＮＯＲＤ１０９Ｂ ｓｎｏＲＮＡの上流部位にあるＵＢＥ３Ａ－ＡＳの５’－末端を標的とすることにより、これを行う。エクソン１～５を標的するように設計されたＡＳＯの実施例は、表１、２、３、４、または５において提供される。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、核酸配列、配列番号６、７、８、９、１０、または１１を含む。

【0011】

開示されたＡＳＯはまた、安定性、溶解性、活性、細胞分布、および／または細胞取込みを改善するために１つ以上の修飾を有することができる。例えば、開示されたＡＳＯは、１つ以上の糖修飾されたヌクレオシドおよび／または修飾されたヌクレオシド間結合を含有することができる。例えば、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、天然のホスホジエステルから、例えば、ヌクレアーゼ攻撃に対してより耐性のある結合へと修飾された１つ以上のヌクレオシド間結合を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、天然に生じる核酸塩基とは異なるが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能的である１つ以上の修飾された核酸塩基を含有する。

【0012】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。さらなる他の実施形態では、ＡＳＯは、デオキシヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの両方を含有する。例えば、ＡＳＯは、ギャップマー、ヘッドマー、またはテイルマーオリゴヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、ギャップマーの中心ブロックは、ヌクレアーゼ分解から内部ブロックを保護する修飾されたリボヌクレオチドのブロックに隣接される。例えば、ＡＳＯは、エキソヌクレアーゼに対する保護のための３’－および５’－末端にある３、４、または５個の修飾されたリボヌクレオチドモノマーと共に、標的ＲＮＡのＲＮアーゼＨ切断を活性化するために、７、８、９、１０個、またはそれ以上の天然のＤＮＡモノマーのストレッチを含有することができる。いくつかの場合では、修飾されたリボヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（ＯＭｅ）ＲＮＡヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）－修飾ヌクレオチド、または２’－ロック核酸（ＬＮＡ）である。ギャップマーＡＳＯの実施例は、表７、１１、および１７において提供される。したがって、いくつかの実施形態では、開示されたＡＳＯは、配列番号３６２～３９２から選択された核酸配列を有する。

【0013】

本明細書で開示される１つ以上のＡＳＯ、ならびに薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、および／または賦形剤を含む薬学的組成物も開示される。

【0014】

父方ＵＢＥ３Ａの発現が抑制されている標的細胞におけるＵＢＥ３Ａ発現のインビボまたはインビトロ誘導のための方法であって、１つ以上の開示されたＡＳＯまたは本明細書で開示される組成物を有効量で前述の細胞に投与することによる方法も開示される。

【0015】

ＵＢＥ３Ａのインビボ活性に関連する疾患、障害、または機能不全を治療または予防するための方法であって、治療的または予防的有効量の開示された１つ以上のＡＳＯを、アンジェルマン症候群などの疾患、障害、または機能不全を患っているか、またはその疑いのある対象へ投与することを含む方法も開示される。

【0016】

本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の詳細な説明において示される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかとなる。例えば、当業者は、本明細書を読むことにより、本開示がＵＢＥ３Ａの発現に影響を与えるための本明細書に記載されるような特定の配列の有用性を実証しており、そのような配列であるか、またはそれらを標的とする（例えば、相補的である）オリゴヌクレオチドフォーマットの有用性をさらに教示していることを認識するだろう。当業者は、本開示が任意の特定の作用機序に限定されないことを認識し、提供されるオリゴヌクレオチドは、それらが例えばＲＮアーゼＨ活性を含むアンチセンス機序を介して作用するかに関わらず、有用であり得、また、そのような配列であるか、またはそれらを標的とするオリゴヌクレオチドの他の治療的フォーマット（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ヌクレアーゼｇＲＮＡ等）もまた提供される。類似的に、当業者は、本明細書で記載されるような有用な配列を定義することにより、本発明はまた、そのような配列のための様々なフォーマット（例えば、それらが発現される（例えば、インビボ、インビトロ、またはその両方など）ベクターなどの核酸ベクターの一部として）も記載していることを認識するだろう。故に、当業者は、本開示を読むことにより、本明細書の「ＡＳＯ」への参照が例示的であり、適切な核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）が作用機序に関わらず利用され得ることを認識するだろう。当業者は、様々な機序のうちのいずれかを介して作用する核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）の適切なフォーマットおよび構造（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ヌクレアーゼｇＲＮＡ等）に関する広範な文献を認識している。いくつかの実施形態では、提供される核酸は、１つ以上の機序的コンテキストにおいて有用であることが当該技術分野において知られているフォーマットおよび／または構造的特徴（例えば、ＲＮアーゼＨ、ＲＩＳＣ、Ｃａｓなどの核酸指向ヌクレアーゼ等を含む）を組み込む。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1A-1D】ヒトおよびマウスにおけるＰｒａｄｅｒ－Ｗｉｌｌｉ／アンジェルマン症候群（ＰＷＳ／ＡＳ）刷り込み領域を示す。図１Ａは、ヒトＰＷＳ／ＡＳ刷り込み領域の参照配列の注釈を示す。図１Ｂは、マウスにおけるＰＷＳ／ＡＳ刷り込みオルソロガス領域の参照配列の注釈を示す。図１Ｃは、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳおよびＵＢＥ３Ａの３’－末端を示す。図１Ｄは、ヒト、マカク（カニクイザルマカク）、ブタ、ゾウ、マウス、およびラットの間のオルソロガス領域を示す鎖アラインメントを示す。標的領域は、非ヒト霊長類間では保存されているが、げっ歯類間では保存されていない。図１Ｄはまた、領域のゲノム的進化速度プロファイリング（ＧＥＲＰ）プロットも示す。正の値は、特定のＤＮＡ塩基での進化的制約を表す。

【図2A-2E】マウスＵｂｅ３ａ－ＡＳを標的とするＡＳＯの分析を示す。図２Ａは、マウスＵｂｅ３ａ－ＡＳ転写物およびマウス特異的ＡＳＯのおおよその位置の図である。ボックスおよび線はそれぞれ、エクソンおよびイントロンを表す。矢印は、転写の方向を表す。図２Ｂは、父方Ｕｂｅ３ａタンパク質レベルを測定するために使用されるＵｂｅ３ａＹＦＰレポーターアレルの図である。Ｕｂｅ３ａＹＦＰマウスモデルは、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を内因性Ｕｂｅ３ａ遺伝子座の３’－末端に標的させることにより産生された。Ｕｂｅ３ａ－ＡＳの発現は、父方Ｕｂｅ３ａＹＦＰアレルの転写を阻害し、Ｕｂｅ３ａ－ＡＳの損失は、父方Ｕｂｅ３ａＹＦＰ発現を再活性化し、これは、抗ＹＦＰ抗体を使用する免疫蛍光イメージングにより検出されることができる。図２Ｃは、マウス初代海馬ニューロンにおけるＡＳＯを調べるための実験タイムラインの図である。マウス初代海馬ニューロンは、父方から遺伝されたＵｂｅ３ａＹＦＰアレルを有する新生児マウス（０ＤＩＶ）から産生され、インビトロで７日（７ＤＩＶ）後に治療された。治療の３日後（１０ＤＩＶ）、Ｕｂｅ３ａＹＦＰタンパク質レベルが個々の細胞において測定された。図２Ｄは、ビヒクル（ｖｅｈ）、負対照ＡＳＯ（ＡＳＯ－Ｃ）、トポテカン（トポ）、ＡＳＯ－Ｂ、およびＡＳＯ１．１で治療された初代ニューロンにおける父方Ｕｂｅ３ａＹＦＰタンパク質を示す免疫蛍光画像を含む。図２Ｅは、ビヒクル（ｖｅｈ、１％のＤＭＳＯ；ｎ＝３）、対照ＡＳＯ（ＡＳＯ－Ｃ、１５μＭ；ｎ＝３）、トポテカン（トポ、０．３μＭ；ｎ＝３）、ＡＳＯ－Ｂ（１、５、１５μＭ；ｎ＝３）、ＡＳＯ－１．１（１、５、１５μＭ）、ＡＳＯ－１．２（１、５、１５μＭ）、およびＡＳＯ３．１（１、５、１５μＭ）で治療された個々のニューロン細胞における父方Ｕｂｅ３ａＹＦＰ平均強度レベルを示す。省略形：ＹＦＰ、黄色蛍光タンパク質；Ｔｘ、治療；ＤＩＶ、インビトロでの日数；ｎ．ｓ．、有意でない。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。

【図3A-3D】ヒトＵＢＥ３Ａ－ＡＳを標的とするＡＳＯの分析を示す。図３Ａは、ヒトＵＢＥ３Ａ－ＡＳおよびヒト特異的ＡＳＯ（ＡＳＯ１～６）のおおよその位置を示す図である。ＡＳＯ－７は、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳのイントロンに位置する。ボックスおよび線はそれぞれ、エクソンおよびイントロンを表す。図３Ｂは、カリオタイプに関して正常な個体からのヒトＧＡＢＡ作動性誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来ニューロンにおいてＡＳＯを調べるための実験タイムラインの図である。ヒトｉＰＳＣ－由来ニューロンは、１４ＤＩＶ後に治療され、次いで、２０ＤＩＶにて、ＲＮＡ単離のために処理された。図３Ｃおよび３Ｄは、対照ＡＳＯ（ＡＳＯ－Ｃ、１０μＭ）、およびＡＳＯ１～７（１０μＭ）、およびトポテカン（トポ、１μＭ）で治療したｉＰＳＣ－由来ニューロンにおけるＵＢＥ３Ａ－ＡＳ（図３Ｃ）およびＵＢＥ３Ａ（図３Ｄ）の相対的定常状態ＲＮＡレベル（ＡＳＯ－Ｃに対して正規化された）を示す。省略形：Ｔｘ、治療；ＤＩＶ、インビトロでの日にち。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。

【図4A-4I】ＧＡＢＡ作動性ｉＰＳＣ－由来ニューロンにおけるヒトＡＳＯ－４およびトポテカンの分析を示す。図４Ａ～４Ｆは、１０ポイントの１／２ｌｏｇ用量曲線のＡＳＯ－４およびトポテカン（１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、および３０μＭ）で治療されたｉＰＳＣ－由来ニューロンにおけるＵＢＥ３Ａ－ＡＳ（図４Ａ）、ＳＮＯＲＤ１１６（図４Ｂ）、ＩＰＷ（図４Ｃ）、ＳＮＯＲＤ１１５（図４Ｄ）、ＳＮＯＲＤ１０９Ａ／Ｂ（図４Ｅ）、およびＵＢＥ３Ａ（図４Ｆ）定常状態ＲＮＡレベルの相対的発現（１ｎＭに対して正規化された）を示す。図４Ｇは、５９ＤＩＶで治療されたＧＡＢＡ作動性ｉＰＳＣ－由来ニューロンにおけるＡＳＯ－４を調べるための実験タイムラインの図である。図４Ｈ～４Ｉは、ＡＳＯ－Ｃ（１０μＭ）およびＡＳＯ－４（１、５、および１０μＭ）で治療されたｉＰＳＣ－由来ニューロンにおけるＵＢＥ３Ａ－ＡＳ（図４Ｈ）およびＵＢＥ３Ａ（図４Ｉ）定常状態ＲＮＡレベルの相対的発現（ＡＳＯ－Ｃに対して正規化された）を示す。省略形：Ｔｘ、治療。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。

【図5A-5F】ヒトＧＡＢＡ作動性およびグルタミン酸作動性ｉＰＳＣ－由来ニューロンにおける最適化されたＡＳＯの分析を示す。図５Ａは、ＧＡＢＡ作動性ｉＰＳＣ－由来ニューロンにおける最適化されたＡＳＯを調べるための実験タイムラインの図である。図５Ｂは、ＡＳＯ－３．１、ＡＳＯ－３．２、ＡＳＯ－４．１、ＡＳＯ－４．２、ＡＳＯ－４．３、ＡＳＯ－４．４、ＡＳＯ－６．１、ＡＳＯ－４．Ｉ、およびＡＳＯ－４．Ｓの５ポイントの１／２ｌｏｇ用量曲線（３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ；ｎ＝６）で治療されたｉＰＳＣ－由来ニューロンにおけるＵＢＥ３Ａ－ＡＳ定常状態ＲＮＡレベルの（水対照に対して正規化された）相対的発現を示す。ＡＳＯ－４．ＩおよびＡＳＯ－４．Ｓは、２つの企業（ＡＳＯ－４．Ｉ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ＡＳＯ－４．Ｓ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）により製造されたＡＳＯ－４を表す。図５Ｃは、ＧＡＢＡ作動性ｉＰＳＣ－由来ニューロンにおけるＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１を調べるための実験タイムラインの図である。図５Ｄは、ＡＳＯ－４（ＡＳＯ－４．ＩおよびＡＳＯ－４．Ｓ）ならびにＡＳＯ－６．１の１０ポイントの１／２ｌｏｇ用量曲線（１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、および３０μＭ；ｎ＝３）で治療されたｉＰＳＣ－由来ニューロンにおけるＵＢＥ３Ａ－ＡＳおよびＵＢＥ３Ａ定常状態ＲＮＡレベルの（１ｎＭに対して正規化された）相対的発現を示す。図５Ｅは、グルタミン酸作動性ｉＰＳＣ－由来ニューロンにおけるＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１を調べるための実験タイムラインの図である。図５Ｆは、ＡＳＯ－４（ＡＳＯ－４．ＩおよびＡＳＯ－４．Ｓ）ならびにＡＳＯ－６．１の１０ポイントの１／２ｌｏｇ用量曲線（１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、および３０ｕＭ；ｎ＝３）で治療されたｉＰＳＣ－由来ニューロンにおけるＵＢＥ３Ａ－ＡＳおよびＵＢＥ３Ａ定常状態ＲＮＡレベルの（水対照に対して正規化された）相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。

【図6A-6D】マウスＰＷＳ／ＡＳ刷り込み領域におけるＡＳＯ標的領域の同定を示す。図６Ａは、マウス染色体７Ｃ上のオルソロガスＰＷＳ／ＡＳ刷り込み領域の参照配列の注釈を示す。図６Ｂは、マウス脳からのＲＮＡ－配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）データから産生された転写物アセンブリを示す。図６Ｃは、Ｓｎｏｒｄ１１５宿主遺伝子転写物／Ｕｂｅ３ａ－ＡＳの５’－末端のエクソン中に保持されたＳｎｏｒｄ１１５ ｓｎｏＲＮＡを示すＡＳＯ標的領域を示す。アラインされたＲＮＡ－ｓｅｑ読み取りは、アセンブリ転写物の下に示される。エクソンおよびイントロンはそれぞれボックスおよび線で示される。図６Ｄは、保持されたエクソンＳｎｏｒｄ１１５＿ＥＮＳＭＵＳＴ０００００１０１８３６（配列番号４９０）、Ｓｎｏｒｄ１１５＿ＥＮＳＭＵＳＴ０００００１０１９３６（配列番号４９１）、Ｓｎｏｒｄ１１５＿ＥＮＳＭＵＳＴ０００００１０４４９３（配列番号４９２）、Ｓｎｏｒｄ１１５＿ＥＮＳＭＵＳＴ００００００８２４４３（配列番号４９３）、およびＳｎｏｒｄ１１５＿ＥＮＳＭＵＳＴ０００００１０４４２７（配列番号４９４）中のｓｎｏＲＮＡの配列アラインメントであり、保持されたｓｎｏＲＮＡが、機能的ｓｎｏＲＮＡ形成のために必要とされる縮重ボックスを有することを示す。

【図7A-7G】ヒトＰＷＳ／ＡＳ刷り込み領域におけるＡＳＯ標的領域の同定を示す。図７Ａは、Ｐｒａｄｅｒ－Ｗｉｌｌｉ／アンジェルマン症候群（ＰＷＳ／ＡＳ）刷り込み領域の参照配列の注釈を示す。図７Ｂは、ヒトＰＷＳ多シストロン性転写物のＲＮＡ－ｓｅｑアセンブリを示す。図７Ｃは、ＳＮＯＲＤ１１５－４５を示し、これは、ＳＮＯＲＤ１１５宿主遺伝子転写物の３’－末端／ＵＢＥ３Ａ－ＡＳの５’－末端にあるエクソン中に保持されている。成人ヒト脳から産生されたアラインされたＲＮＡ－ｓｅｑ読み取りは、Ｌ１ラインが転写されていることを示す。図７Ｄは、ＳＮＯＲＤ１１５クラスター（ＳＮＯＲＤ１１５－３９－４８およびＳＮＯＲＤ１０９Ｂ）の３’－末端の参照配列の注釈を示す。図７Ｅは、ＳＮＯＲＤ１１５－４４とＳＮＯＲＤ１１５－４５との間のＬ１ライン要素の位置を示す。図７Ｆは、げっ歯類では軽減されているものの、ＳＮＯＲＤ１１５－４５－４８領域での保存を示す主要なクレードを表す有胎盤類の鎖アラインメントを示す。図７Ｇは、ＳＮＯＲＤ１１５－４４（機能的ｓｎｏＲＮＡ）（配列番号４９５）、ＳＮＯＲＤ１１５－４８（配列番号４９６）、ＳＮＯＲＤ１１５－４５（配列番号４９７）、ＳＮＯＲＤ１１５－４６（配列番号４９８）、およびＳＮＯＲＤ１１５－４７（配列番号４９９）に対する標的領域中のｓｎｏＲＮＡの配列アラインメントを示し、ＳＮＯＲＤ１１５－４５（保持された）、ＳＮＯＲＤ１１５－４６（部分的に保持された）、およびＳＮＯＲＤ１１６－４７が、機能的ｓｎｏＲＮＡ形成のために必要とされる縮重ボックスを有することを示す。

【図8A-8C】候補ＡＳＯの薬力学的分析を示す。図８Ａは、異なる骨格およびＲＮＡ修飾設計を有するＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１の１０ポイントの１／２ｌｏｇ用量曲線（１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、および３０μＭ；ｎ＝２）で治療されたＧＡＢＡ作動性ｉＰＳＣ－由来ニューロンにおける正規化されたＵＢＥ３Ａ－ＡＳ定常状態ＲＮＡレベルの近似用量応答曲線を示す。用量応答曲線は、４－パラメータロジスティック回帰モデル（Ｈｉｌｌ）を使用して近似される。グラフは、近似されたモデルおよび標準誤差を表す。Ｙ軸は、相対的ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ ＲＮＡレベルを表し、Ｘ軸は、ＡＳＯのｌｏｇモル（Ｍ）濃度を表す。図８Ｂおよび８Ｃは、候補ＡＳＯ間の関係を示し、３つのクラスターへとグループ分けする、近似用量応答曲線の階層的クラスター化の樹状および星状プロットである。

【図9】アンジェルマン症候群ｉＰＳＣ－由来ニューロンにおけるＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．ＯおよびＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌの薬力学的分析を示す。ＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．ＯおよびＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌの１０ポイントの１／２ｌｏｇ用量曲線（１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、および３０μＭ；ｎ＝３）で治療されたアンジェルマン症候群ｉＰＳＣ－由来ニューロンにおける正規化されたＵＢＥ３Ａ－ＡＳ定常状態ＲＮＡレベルの４－パラメータロジスティック回帰モデル（Ｈｉｌｌ）。

【図10】ＡＳＯ－６．１－ＰＯ－１．ＯおよびＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌで治療されたアンジェルマン症候群ｉＰＳＣニューロンにおけるＰＷＳ多シストロン性転写物によりコードされたＲＮＡの発現分析を示す。ビヒクル（１％のＨ２Ｏ；ｎ＝３）、ＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｏ（３０μＭ；ｎ＝３）、およびＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌ（３０μＭ；ｎ＝３）で治療されたＡＳ ｉＰＳＣ－由来ニューロンにおけるＳＮＵＲＦ、ＳＮＲＰＮ、ＳＮＨＧ１１６、ＳＮＯＲＤ１１６ ｓｎｏＲＮＡ、ＩＰＷ、ＳＮＨＧ１１５、ＳＮＯＲＤ１１５ ｓｎｏＲＮＡ、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ、およびＵＢＥ３Ａの正規化された定常状態ＲＮＡレベルが示される。データは、ビヒクルに対するＲＮＡの平均パーセンテージを表す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。アスタリスク（＊）は、ビヒクルに対する、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定を伴う一元ＡＮＯＶＡを使用する、統計的に有意な差異（ｐ＜０．０５）を示す。

【図11】カニクイザルマカクにおけるＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．ＯおよびＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌの薬力学的分析を示す。ビヒクル（０．９％の食塩水；ｎ＝５）、ＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｏ（１０ｍｇ；ｎ＝３）、およびＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌ（１０ｍｇ；ｎ＝３）で治療したマカクＣＮＳ領域におけるＵＢＥ３Ａ－ＡＳの定常状態ＲＮＡレベルが示される。データは、ビヒクルに対するＵＢＥ３Ａ－ＡＳ ＲＮＡの平均パーセンテージを表す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。アスタリスク（＊）は、ビヒクルに対する、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定を伴う一元ＡＮＯＶＡを使用する、統計的に有意な差異（ｐ ＜ ０．０５）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0018】

別名ユビキチン－タンパク質リガーゼＥ３Ａアンチセンス転写物およびＵＢＥ３Ａ－ＡＳ／Ｕｂｅ３ａ－ＡＳとしても知られている、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ／Ｕｂｅ３ａ－ＡＳ転写物は、ＵＢＥ３Ａ遺伝子に対してアンチセンスＤＮＡ鎖上にある、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ転写物の転写により産生される転写物についての名称である。すべて大文字を用いた遺伝子名はヒト遺伝子（例えば、ＵＢＥ３Ａ）を示し、初めの文字のみ大文字を用いた遺伝子名はマウス遺伝子（例えば、Ｕｂｅ３ａ）を示すことに留意されたい。ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ転写物は、ＳＮＵＲＦ－ＳＮＲＰＮをコードする大きな多シストロン性転写ユニット、オーファンＣ／Ｄボックス核小体低分子ＲＮＡ（ＳＮＯＲＤ）のクラスター、およびいくつかの特徴付けられていない長鎖非コーディングＲＮＡの部分として転写される。マウスおよびヒトの両方では、ＵＢＥ３Ａ／Ｕｂｅ３ａ遺伝子は、中枢神経系のニューロンにおいて刷り込みを受けており、それは、母方アレルからのみ発現される。ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ／Ｕｂｅ３ａ－ＡＳ転写物は、父方ＵＢＥ３Ａ／Ｕｂｅ３ａアレルの転写をサイレンシングするのに必須かつ十分であり、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ／Ｕｂｅ３ａ－ＡＳの阻害は、父方ＵＢＥ３Ａ／Ｕｂｅ３ａアレルの転写を再活性化する。母方から遺伝されたＵＢＥ３Ａアレルの機能または発現に影響する変異は、アンジェルマン症候群（ＡＳ）を引き起こす。ＡＳでは、父方アレルは、機能的であるが、後成的にサイレンシングされている。ＡＳ患者においてサイレンシングを止めると、父方ＵＢＥ３Ａアレルは、ニューロンにおける機能的ＵＢＥ３Ａの供給源となり得る。

【0019】

ＵＢＥ３Ａ－ＡＳをコードする多シストロン性転写ユニット（本明細書では以後、ＰＴＵと称される）は、約４５０，０００塩基対の長さである。ＰＴＵの転写は、ＳＮＵＲＦ－ＳＮＲＰＮ遺伝子座の上流エクソン（Ｕ－エクソン）で開始し、ＵＢＥ３Ａの５’－末端に向かって停止する。ＰＴＵは以下のように編制される（５’－３’）：ＳＮＵＲＦ－ＳＮＲＰＮ、ＳＮＯＲＤ１０７、ＳＮＯＲＤ６４、ＳＮＯＲＤ１０９Ａ、ＳＮＯＲＤ１１６（２９コピー）、ＩＰＷ、ＳＮＯＲＤ１１５（４８コピー）、ＳＮＯＲＤ１０９Ｂ、およびＵＢＥ３Ａ、これは、上流転写物の逆方向に配向している。多シストロン性転写物は、代替的スプライシングを受け、代替的３’－プロセシングに供される。ＳＮＵＲＦ－ＳＮＲＰＮは、２つのポリペプチドをコードする。ＳＮＯＲＤは、宿主遺伝子転写物（ＳＮＨＧ１４）のイントロン中にあり、スプライシングを受けたイントロンのエキソヌクレアーゼ脱分岐により産生される。ＵＢＥ３Ａ－ＡＳは、ＵＢＥ３Ａ遺伝子に重複する転写物の３’－末端を表す。大部分のＣ／ＤボックスｓｎｏＲＮＡは、リボソーム生合成において役割を果たし、それらは、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の２’－Ｏ－メチル化を導く。しかし、ＰＷＳ／ＡＳ領域に位置するｓｎｏＲＮＡは、既知のｒＲＮＡに対して相補的な任意の配列を欠失している。しかし、ＳＮＯＲＤ１１５ ｓｎｏＲＮＡは、セロトニン受容体２Ｃ ｐｒｅ－ｍＲＮＡの代替的スプライシングを変化させることが見出された。

【0020】

本明細書では、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ転写物の５’－末端はその安定性のために重要であるという証拠が開示される。本明細書で開示されるように、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳの５’－末端を標的とするＡＳＯは、おそらくＵＢＥ３Ａ－ＡＳの転写を終結し、かつ父方ＵＢＥ３Ａアレルをオンとすることにより、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳレベルを減少させることができる。

【0021】

本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、それが当業者によって一般的に理解されているように、２つ以上の共有結合したヌクレオシを含む分子として定義される。このような共有結合したヌクレオシドはまた、核酸分子またはオリゴマーとしても参照され得る。オリゴヌクレオチドは、固相化学合成、続いて、精製により、実験室で一般的に作製される。オリゴヌクレオチドの配列を参照する場合、参照は、共有結合したヌクレオチドもしくはヌクレオシドの核酸塩基部分の配列もしくは順序、またはそれらの修飾に対してなされる。本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、人工のもの、例えば、化学的に合成されたものである。本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドはまた、１つ以上の修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドも含み得る。

【0022】

本明細書で使用される用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸に、特に、標的核酸上の連続した配列にハイブリダイズすることにより、標的遺伝子の発現を調整することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖である。

【0023】

用語「連続したヌクレオチド配列」は、標的核酸に相補的であるオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書では、用語「連続した核酸塩基配列」および用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と互換的に使用される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチドは、連続したヌクレオチド配列中に存在する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、連続したヌクレオチド配列を含み、場合により、連続したヌクレオチド配列に官能基を付着させるのに使用されることができる、さらなるヌクレオチド（複数可）、例えば、ヌクレオチドリンカー領域を含んでもよい。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても、なくてもよい。

【0024】

ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドのブロックを構築し、天然に生じるおよび非天然に生じるヌクレオチドの両方を含むことができる。天然では、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、および１つ以上のホスフェート基（ヌクレオシドでは不在である）を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、「ユニット」または「モノマー」として互換的に称されてもよい。

【0025】

本明細書で使用される用語「修飾されたヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」は、糖部分または（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾を導入することにより、等価なＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオシドは、修飾された糖部分を含む。修飾されたヌクレオシドという用語はまた、本明細書では、用語「ヌクレオシドアナログ」または修飾された「ユニット」または修飾された「モノマー」と互換的に使用されてもよい。

【0026】

用語「修飾されたヌクレオシド間結合」は、２つのヌクレオシドを共に共有結合するホスホジエステル（ＰＯ）結合または天然のリン酸結合以外の結合として当業者に一般的に理解されているように定義される。修飾されたヌクレオシド間結合を有するヌクレオチドは、「修飾されたヌクレオチド」とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較してオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加する。天然に生じるオリゴヌクレオチドについては、ヌクレオシド間結合は、隣接ヌクレオシド間のホスホジエステル結合を作りだすホスフェート基を含む。修飾されたヌクレオシド間結合は、インビボ使用のためにオリゴヌクレオチドを安定化するのに特に有用であり、例えば、ギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内、ならびに修飾されたヌクレオシドの領域中などの、本明細書で開示されたオリゴヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの領域でヌクレアーゼ切断に対して保護するように働くことができる。

【0027】

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、天然のホスホジエステルから、例えば、ヌクレアーゼ攻撃に対してより耐性のある結合へと修飾された１つ以上のヌクレオシド間結合を含む。ヌクレアーゼ耐性は、血清中のオリゴヌクレオチドをインキュベートすることにより、またはヌクレアーゼ耐性アッセイ［例えば、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ）］を使用することにより、決定されることができ、この両方は当該技術分野において周知である。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増強することができるヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合として称される。

【0028】

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはそれらの連続したヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％は修飾されており、オリゴヌクレオチドまたはそれらの連続したヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の、例えば、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％、または例えば、少なくとも９０％が修飾されている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはそれらの連続したヌクレオチド配列のすべてのヌクレオシド間結合が修飾されている。

【0029】

いくつかの実施形態では、コンジュゲートなどのように、オリゴヌクレオチドを非ヌクレオチド官能基に結合させるヌクレオシド間結合はホスホジエステルであり得ることが認識されよう。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドを非ヌクレオチド官能基に結合させるヌクレオシド間結合は修飾されている。

【0030】

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはそれらの連続したヌクレオチド配列のすべてのヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。

【0031】

修飾されたヌクレオシド間結合は、例えば、ホスホロチオエート、ジホスホロチオエート、およびボラノホスフェートを含む群から選択され得る。いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオシド間結合は、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドのＲＮアーゼＨリクルートメントと適合するものであり、例えば、ホスホロチオエート、ジホスホロチオエート、またはボラノホスフェートである。

【0032】

いくつかの実施形態では、ヌクレオシド間結合は、硫黄（Ｓ）を含み、例えば、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

【0033】

ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態学、および製造の容易さに起因して特に有用である。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはそれらの連続したヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％はホスホロチオエートであり、オリゴヌクレオチドまたはそれらの連続したヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の、例えば、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％、または例えば、少なくとも９０％がホスホロチオエートである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはそれらの連続したヌクレオチド配列のすべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートである。

【0034】

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の中性のヌクレオシド間結合、特に、ホスホトリエステル、メチルホスホナート、ＭＭＩ、アミド－３、ホルムアセタールまたはチオホルムアセタールから選択されるヌクレオシド間結合を含む。さらなるヌクレオシド間結合は、ＷＯ２００９／１２４２３８（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。一実施形態では、ヌクレオシド間結合は、ＷＯ２００７／０３１０９１（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているリンカーから選択される。

【0035】

ホスホロチオエート結合などのヌクレアーゼ耐性結合は、ギャップマーについては領域Ｇ、またはヘッドマーおよびテイルマーの非修飾ヌクレオシド領域などのように、標的核酸と二本鎖を形成するときにヌクレアーゼをリクルートすることができるオリゴヌクレオチド領域において特に有用である。しかし、ホスホロチオエート結合はまた、ギャップマーについての領域ＦおよびＦ’、またはヘッドマーおよびテイルマーの修飾されたヌクレオシド領域などのように、非ヌクレアーゼリクルート領域および／または親和性増強領域においても有用であり得る。

【0036】

しかし、設計領域の各々は、ＬＮＡなどの修飾されたヌクレオシドがヌクレアーゼ分解に対して結合を保護する領域において特に、ホスホジエステル結合などの、ホスホロチオエート以外のヌクレオシド間結合を含むことができる。１つまたは２つの結合などのホスホジエステル結合を、特に修飾されたヌクレオシドユニット（典型的には、非ヌクレアーゼリクルート領域中）の間またはそれに隣接して含ませることにより、オリゴヌクレオチドのバイオアベイラビリティおよび／または生体分布を修飾することができる。ホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドの教示について、ＷＯ２００８／１１３８３２は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0037】

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートおよび／またはボラノホスフェート結合である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。

【0038】

核酸塩基という用語は、核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する、ヌクレオシドおよびヌクレオチド中に存在する、プリン（例えば、アデニンおよびグアニン）ならびにピリミジン（例えば、ウラシル、チミン、およびシトシン）部分を含む。核酸塩基という用語は、天然に生じる核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーションの間に機能的である修飾された核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、天然に生じる核酸塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、およびヒポキサンチン、ならびに非天然に生じるバリアントの両方を指す。

【0039】

いくつかの実施形態では、核酸塩基部分は、プリンまたはピリミジンを、修飾されたプリンまたはピリミジン、例えば、置換されたプリンまたは置換されたピリミジンに変更することにより修飾されており、例えば、イソシトシン、シュードイソシトシン、５－メチル－シトシン、５－チオゾロ－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－ブロモウラシル５－チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２’チオ－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、および２－クロロ－６－アミノプリンから選択される核酸塩基である。

【0040】

核酸塩基部分は、対応する各核酸塩基についての文字コード、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、またはＵにより示されることができ、ここで、各文字は、場合により、等価機能の修飾された核酸塩基を含むことができる。例えば、例示されるオリゴヌクレオチドでは、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、および５－メチルシトシン（５ｍＣ）から選択される。これらの修飾の組み合わせも使用され得る。例えば、５ｍＣのＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。同様に、２’－ヒドロキシメチル（２’－ＯＭｅ）５ｍＣが使用され得る。

【0041】

用語「相補性」は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのワトソン－クリック塩基対合についての能力を説明する。ワトソン－クリックの塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）およびアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは、修飾された核酸塩基、例えば、シトシンの代わりに使用されることが多い５－メチルシトシンを伴うヌクレオシドを含むことができ、したがって、相補性という用語は、非修飾の核酸塩基と修飾された核酸塩基との間のワトソン－クリック塩基対合を包含することが理解されよう。

【0042】

本明細書で使用される用語「相補性％」は、別の核酸分子（例えば、標的核酸）の特定の位置にある連続したヌクレオチド配列と特定の位置で相補的である（すなわち、ワトソン－クリック塩基対を形成する）、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）中の連続したヌクレオチド配列のヌクレオチドのパーセントでの数を指す。パーセンテージは、２つの配列間で対を形成するアラインされた塩基の数を計数し、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることにより、算出される。このような比較では、（塩基対を形成する）アラインされていない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチを呼ばれる。

【0043】

本明細書で使用される用語「ハイブリダイズしている」または「ハイブリダイズする」は、反対側の鎖上にある塩基対との間で水素結合を形成し、それにより二本鎖を形成する、２本の核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸）として理解されるものである。２本の核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。それは多くの場合、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二本鎖を形成している温度として定義される融解温度（Ｔｍ）に関して記載される。生理的条件では、Ｔｍは厳密には親和性に比例していない（ＭｅｒｇｎｙおよびＬａｃｒｏｉｘ、２００３、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １３：５１５－５３７）。標準状態のＧｉｂｂｓ自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性のより正確な表示であり、反応の解離定数（Ｋｄ）に、ΔＧ°＝－ＲＴｌｎ（Ｋｄ）の式によって関連付けられ、式中、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔＧ°は、反応に関連付けられるエネルギーであり、ここで、水性濃度は１Ｍであり、ｐＨは７であり、温度は３７℃である。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発的反応であり、自発的反応については、ΔＧ°はゼロ未満である。ΔＧ°は、実験的に測定することができ、例えば、Ｈａｎｓｅｎら、１９６５、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．３６－３８およびＨｏｌｄｇａｔｅら、２００５、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙに記載されているような等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）法により測定することができる。当業者は、ΔＧ°測定について市販装置が利用可能であることを知っているだろう。Ｓｕｇｉｍｏｔｏら、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１２１１－１１２１６およびＭｃＴｉｇｕｅら、２００４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：５３８８－５４０５により記載されている適切に誘導された熱力学的パラメータを使用する、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ、１９９８、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５：１４６０－１４６５により記載されているような最近傍モデルを使用することにより、ΔＧ°は数値的に推定することもできる。ハイブリダイゼーションによりその意図された核酸標的を調整する可能性を有するために、本明細書で開示されたオリゴヌクレオチドは、１０～３０個のヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドについて－１０ｋｃａｌ未満の推定されたΔＧ°値を伴って、標的核酸とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度または強度は、標準状態のＧｉｂｂｓ自由エネルギーΔＧ°により測定される。オリゴヌクレオチドは、－１０ｋｃａｌの範囲未満の、例えば、－１５ｋｃａｌ未満の、例えば、－２０ｋｃａｌ未満の、例えば、８～３０個のヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドについては－２５ｋｃａｌ未満の、推定されたΔＧ°値を伴って、標的核酸にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、－１０～－６０ｋｃａｌ、例えば、－１２～－４０、例えば、－１５～－３０ｋｃａｌまたは－１６～－２７ｋｃａｌ、例えば、－１８～－２５ｋｃａｌの推定されたΔＧ°値を伴って、標的核酸にはハイブリダイズする。

【0044】

いくつかの実施形態では、開示されたオリゴヌクレオチドは、標的核酸分子中に存在する標的配列と相補的であるか、またはそれにハイブリダイズする、少なくとも８ヌクレオチドの連続したヌクレオチド配列を含む。連続したヌクレオチド配列（およびしたがって標的配列）は、少なくとも８個の連続したヌクレオチド、例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の連続したヌクレオチド、例えば、１２～２５個の、例えば、１４～１８個の連続したヌクレオチドから構成される。

【0045】

いくつかの実施形態では、開示されたオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列を阻害、変異、または欠失する機能的核酸、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはヌクレアーゼｇＲＮＡである。

【0046】

本明細書で使用される用語「発現の調整」は、オリゴヌクレオチドの投与前のＵＢＥ３Ａの量と比較されたときにＵＢＥ３Ａ ＲＮＡ／タンパク質の量を変更するオリゴヌクレオチドの能力についての包括的な用語として理解されるものである。代替的には、発現の調整は、開示されたオリゴヌクレオチドが投与されない対照実験を参照することにより決定され得る。オリゴヌクレオチドにより影響を受ける調整は、すなわち、ＳＮＯＲＤ１１５－４５ ｓｎｏＲＮＡの下流にあるＵＢＥ３Ａ－ＡＳの５’－末端を標的することにより、父方ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ転写物の抑制を軽減する、除去する、予防する、弱める、低下する、または終結するその能力に関連する。調整は、例えば、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳにより影響を受ける阻害性機序の除去または遮断により、父方ＵＢＥ３Ａの発現を復活させる、増大する、または増強するオリゴヌクレオチドの能力として可視化することもできる。

【0047】

開示されたオリゴヌクレオチドは、修飾された糖部分、すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡ中で見出されるリボース糖部分と比較したときに糖部分の修飾を有する１つ以上のヌクレオシドを含んでもよい。リボース糖部分の修飾を有する数多くのヌクレオシドは、主に、親和性および／またはヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドの特定の特性を改善する目的で作製される。そのような修飾は、例えば、ヘキソース環（ＨＮＡ）もしくは二環での置換によりリボース環構造が修飾されたもの、リボース環（ＬＮＡ）上のＣ２およびＣ４炭素環のビラジカル結合を典型的に有するもの、またはＣ２炭素とＣ３炭素との間の結合を典型的に欠失している連結されていないリボース環（例えば、ＵＮＡ）を含む。他の糖修飾されたヌクレオシドは、例えば、ビシクロヘキソースヌクレオシド（ＷＯ２０１１／０１７５２１）または三環式ヌクレオシド（ＷＯ２０１３／１５４７９８）を含む。修飾されたヌクレオシドはまた、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルホリノ核酸の場合のように、糖部分が非糖部分で置換されたヌクレオシドを含む。

【0048】

糖修飾はまた、リボース環上の置換基を、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオシドで天然に見出される水素または２’－ＯＨ基以外の基へ変更することによりなされる修飾も含む。置換は、例えば、２’、３’、４’または５’位で導入されてもよい。修飾された糖部分を有するヌクレオシドはまた、２’置換されたヌクレオシドなどの２’修飾されたヌクレオシドも含む。実際、２’置換されたヌクレオシドの開発に対して多くの関心が集中されて、数多くの２’置換されたヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれた場合に増強されたヌクレオシド耐性および増強された親和性などの有益な特性を有することが見出された。

【0049】

２’糖修飾されたヌクレオシドは、２’位でＨもしくは－ＯＨ以外の置換基を有するヌクレオシド（２’置換されたヌクレオシド）であり、または２’連結されたビラジカルを含み、２’置換されたヌクレオシドおよびＬＮＡ（２’－４’ビラジカル結合した）ヌクレオシドを含む。例えば、２’修飾された糖は、オリゴヌクレオチドに対して増強された結合親和性および／または増大したヌクレアーゼ耐性を提供することができる。２’置換された修飾されたヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ（Ｏ－Ｍｅ）、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、および２’－フルオロ－ＡＮＡ（Ｆ－ＡＮＡ）である。さらなる例については、Ｆｒｅｉｅｒ ＆ Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１９９７、２５、４４２９－４４４３およびＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２０００、３（２）、２９３－２１３；ならびにＤｅｌｅａｖｅｙおよびＤａｍｈａ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２、１９、９３７を参照されたい。

【0050】

ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオシドは、ヌクレオチドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’との間にリンカー基（ビラジカルまたは結合と称される）を含む修飾されたヌクレオシドである。これらのヌクレオシドは、文献中では、ブリッジ核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）とも呼ばれる。

【0051】

ヌクレアーゼ介在分解は、そのような配列と二本鎖を形成するときに相補的ヌクレオチド配列の分解を介在することができるオリゴヌクレオチドを指す。

【0052】

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的核酸のヌクレアーゼ介在分解を介して機能してもよく、ここで、開示されたオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ、特に、エンドヌクレアーゼ、好ましくは、エンドリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、例えば、ＲＮアーゼＨをリクルートすることができる。ヌクレアーゼ介在機序を介して作用するオリゴヌクレオチド設計の例は、少なくとも５～６個のＤＮＡヌクレオシドの領域を典型的に含み、親和性増強ヌクレオシドが片側または両側に隣接しているオリゴヌクレオチド、例えば、ギャップマー、ヘッドマー、およびテイルマーである。

【0053】

本明細書で使用される用語「ギャップマー」は、１つ以上の親和性増強修飾ヌクレオシド（フランク）が５’および３’で隣接している、ＲＮアーゼＨリクルートオリゴヌクレオチドの領域（ギャップ）を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。様々なギャップマー設計が本明細書で記載される。ヘッドマーおよびテイルマーは、ＲＮアーゼＨをリクルートすることができるオリゴヌクレオチドであり、ここでは、フランクの一方が欠失しており、すなわち、オリゴヌクレオチドの末端の一方のみが親和性増強修飾ヌクレオシドを含む。ヘッドマーについては、３’フランクが欠失しており（すなわち、５’フランクが親和性増強修飾ヌクレオシドを含む）、テイルマーについては、５’フランクが欠失している（すなわち、３’フランクが親和性増強修飾ヌクレオシドを含む）。

【0054】

１つ以上の非ヌクレオチド部分に対する開示されたオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションは、例えば、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取込み、または安定性に影響を与えることにより、オリゴヌクレオチドの薬理学を改善することができる。いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの細胞分布、バイオアベイラビリティ、代謝、排泄、浸透、および／または細胞取込みを改善することにより、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を修飾または増強する。特に、コンジュゲートは、オリゴヌクレオチドを特定の器官、組織、または細胞型に標的化してもよく、それにより、その器官、組織、または細胞型におけるオリゴヌクレオチドの効果を増強することができる。同時に、コンジュゲートは、非標的細胞型、組織、または器官におけるオリゴヌクレオチドの活性、例えば、非標的細胞型、組織、または器官におけるオフターゲット活性または活性を軽減するように役割を果たすことができる。ＷＯ９３／０７８８３およびＷＯ２０１３／０３３２３０は、適切なコンジュゲート部分を提供し、これらは参照により本明細書に組み込まれる。ＷＯ２０１２／１４３３７９は、トランスフェリン受容体に対して親和性を有する抗体断片に対するコンジュゲーションにより、血液脳関門を超えて薬物を送達する方法を提供し、これは参照により本明細書に組み込まれる。

【0055】

いくつかの実施形態では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、薬剤物質、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌の毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、カプシド）、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非ヌクレオチド部分は、抗体または抗体断片、例えば、血液脳関門を超えての送達を促進する抗体または抗体断片、特に、トランスフェリン受容体を標的とする抗体または抗体断片。

【0056】

用語「対象」は、投与または治療の標的である任意の個体を指す。対象は、脊椎動物、例えば、哺乳類であり得る。故に、対象は、ヒトまたは動物患者であり得る。用語「患者」は、臨床者、例えば、医師の治療を受けている対象を指す。

【0057】

用語「治療的有効」は、疾患または障害の１つ以上の原因または症状を改善するのに十分な量の、使用される組成物の量を指す。そのような改善は、軽減または変更のみを必要とし、排除は必ずしも必要としない。

【0058】

用語「薬学的に許容される」は、健全な医学的判断の範囲内にあり、合理的な利益／危険性の比に応じて、過度の毒性、炎症、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、ヒトおよび動物の組織に接触させての使用に適切である、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。

【0059】

用語「治療」は、疾患、病理学的状態、または障害を治す、緩和する、安定化させる、または予防することを意図した、患者の医学的管理を指す。この用語は、積極的な治療、すなわち、疾患、病理学的状態、または障害の改善に向けて具体的に管理された治療を含み、また、対症的な治療、すなわち、疾患、病理学的状態、または障害の原因の除去に向けて管理された治療も含む。加えて、この用語は、一時緩和治療、すなわち、疾患、病理学的状態、または障害を治すのではなく症状を緩和するために設計された治療；予防的治療、すなわち、関連する疾患、病理学的状態、または障害の発症を最小限にするか、または部分的もしくは完全に阻害するように管理された治療；および支持的治療、すなわち、関連する疾患、病理学的状態、または障害の改善に向けて管理された別の特異的な治療を補足するために利用される治療を含む。

【0060】

用語「阻害する」は、当業者が認識するように、特定の時点で評価されることができる、活性、応答、状態、疾患、または他の生理学的パラメータにおける減少を指し、そのようなものとして、いくつかの実施形態では、阻害は、開始の遅延、または頻度の減少であり得るか、またはそれらを含み得る。いくつかの実施形態では、阻害は、活性、応答、状態、または疾患の完全な除去を含むことができるが、これらに限定されない。これはまた、例えば、天然または対照レベルと比較したときに、活性、応答、状態、または疾患における１０％の減少を含み得る。故に、減少は、天然または対照レベルと比較したときに、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、または任意の量の減少であり得る。

【0061】

アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、ＳＮＯＲＤ１１５宿主遺伝子転写物（ＡＦ４００５００）の５’－末端にあるエクソンを標的するために設計され、これは、ＳＮＯＲＤ１１５－４６、ＳＮＯＲＤ１１５－４７、ＳＮＯＲＤ１１５－４８、およびＳＮＯＲＤ１０９Ｂ ｓｎｏＲＮＡを包含し、ＵＢＥ３Ａアンチセンス転写物（ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ）の５’－末端を表すと考えられる。特に、標的核酸は、ヒト染色体１５ヒトゲノムアセンブリｈｇ１９上の２５，５１１，５７７～２５，５１６，６８１位に対応する、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳの５’－末端であり得る。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳの５’－末端中に位置する５つのエクソンのうちの１つであり、これは、２５，５１１，５７７～２５，５１１，７６１（エクソン１）、２５，５１２，０５９～２５，５１２，１９１（エクソン２）、２５，５１３，４７６～２５，５１３，６００（エクソン３）、２５，５１４，７５２～２５，５１４，８８０（エクソン４）、および２５，５１６，５６５～２５，５１６，６８１（エクソン５）位に対応し得る。

【0062】

したがって、 いくつかの実施形態では、標的核酸は、 ＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＣＴＣＴＴＴＧＧＣＣＴＧＴＴＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＴＧＡＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＴＴＴＡＡＴＧＡＡＡＡＴＧＣＴＣＴＴＧＡＣＡＣＣＡＡＴＧＣＡＴＣＣＴＡＧＣＡＴＣＡＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＡＡＧＣＣＴＴＣＴＣＡＡＧＴＧＴＧＣＡＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＴＡＴＧＴＣＴＴＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＡＡＴＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＧ（エクソン１、配列番号１）である。

【0063】

いくつかの実施形態では、標的核酸は、 ＴＡＡＧＡＣＡＴＧＣＴＧＣＣＡＡＧＡＧＡＴＧＴＧＣＣＡＴＴＣＴＡＴＴＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＡＧＴＡＧＣＴＴＣＣＴＴＴＡＣＣＧＡＣＧＴＧＴＡＴＡＴＴＣＴＡＴＣＴＡＧＡＡＣＡＴＴＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＡＧＡＣＴＣＣＣＡＣＣＴＡＡＧＧＧＡＡＴＴＡＧＴＴＴＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＧ（エクソン２、配列番号２）である。

【0064】

いくつかの実施形態では、標的核酸は、 ＡＴＡＡＡＧＡＣＴＧＣＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＣＣＣＴＣＴＧＧＴＧＴＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＧＣＡＡＧＴＧＣＴＡＣＣＧＣＡＣＡＧＧＣＡＴＧＣＴＧＣＡＧＴＧＡＡＴＴＴＡＡＣＴＧＡＴＣＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＡＡＣＣＧＴＴＧＴＴＴＡＡＧＧＡＴＧＣＴＡＴＴＣＴＧ（エクソン３、配列番号３）である。

【0065】

いくつかの実施形態では、標的核酸は、ＡＡＡＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＴＴＴＡＣＣＣＴＧＴＴＧＴＴＣＡＧＧＧＡＧＡＡＡＣＴＧＡＣＡＣＣＡＣＴＣＡＡＣＴＧＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＡＡＡＡＴＧＴＧＧＣＡＴＣＣＡＧＴＣＣＡＣＴＴＴＡＣＣＡＴＣＡＧＴＧＴＴＴＡＡＧＧＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧ（エクソン４、配列番号４）である。

【0066】

いくつかの実施形態では、標的核酸は、 ＡＴＡＡＧＧＡＴＧＡＣＴＧＡＧＧＡＡＧＡＧＴＡＣＴＣＴＴＴＧＧＣＴＴＧＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＴＧＡＣＡＣＡＣＣＣＡＧＡＴＡＴＣＴＧＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣＴＧＴＧＡＡＣＴＴＴＣＡＡＣＣＡＧＧＡＴＴＴＡＡＧＧＡＴＧＣＣＡＣＴＣＴＧ（エクソン５、配列番号５）である。

【0067】

いくつかの実施形態では、開示されたＡＳＯは、核酸配列ＴＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＧＣＣＡＧＧＣＡＣ（ＡＳＯ－１、配列番号６）を有する。

【0068】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、核酸配列ＧＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＧＴＣＡＴＣＣ （ＡＳＯ－２、配列番号７）を有する。

【0069】

いくつかの実施形態では、開示されたＡＳＯは、核酸配列ＴＧＴＣＡＧＴＴＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＣＡ（ＡＳＯ－３、配列番号８）を有する。

【0070】

いくつかの実施形態では、開示されたＡＳＯは、核酸配列ＴＡＧＡＡＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴＣＴＴＧＧ（ＡＳＯ－４、配列番号９）を有する。

【0071】

いくつかの実施形態では、開示されたＡＳＯは、核酸配列ＧＴＴＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＡＣＡＧＴＣＴ（ＡＳＯ－６、配列番号１０）を有する。

【0072】

いくつかの実施形態では、開示されたＡＳＯは、核酸配列ＣＴＧＧＴＧＴＣＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＡＧ（ＡＳＯ－７、配列番号１１）を有する。

【0073】

ＳＮＯＲＤ１１５領域の３’－末端の標的エクソン１であり得るさらなるＡＳＯは、以下の表１で提供される。ＳＮＯＲＤ１１５の３’－末端の標的エクソン２であり得る例示的なＡＳＯは、以下の表２で提供される。ＳＮＯＲＤ１１５の３’－末端の標的エクソン３であり得る例示的なＡＳＯは、以下の表３で提供される。ＳＮＯＲＤ１１５の３’－末端の標的エクソン４であり得る例示的なＡＳＯは、以下の表４で提供される。ＳＮＯＲＤ１１５の３’－末端の標的エクソン５であり得る例示的なＡＳＯは、以下の表５で提供される。

【表1】

【表2】

【表3】

【表4】

【表5】

【0074】

開示されたオリゴヌクレオチドは、父方ＵＢＥ３Ａの発現、特に、ニューロン細胞における父方発現されたＵＢＥ３Ａの誘導または上方制御の調整をすることができる。調整は、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳの５’－末端にハイブリダイズすることにより成し遂げられる。ある実施形態では、本明細書で開示されたオリゴヌクレオチドは、－１０ｋｃａｌ未満のΔＧ°、例えば、－１０～－６０ｋｃａｌ、例えば、－１２～－４０、例えば、－１５～－３０ｋｃａｌまたは－１６～－２７ｋｃａｌ、例えば、－１８～－２５ｋｃａｌのΔＧ°を伴って、配列番号１の標的核酸の下位配列にハイブリダイズする。

【0075】

いくつかの実施形態では、開示されたオリゴヌクレオチドは、食塩水または非標的オリゴヌクレオチドで治療されたニューロン細胞におけるＵＢＥ３Ａの発現レベルと比較して少なくとも２０％だけ、より好ましくは、食塩水または非標的オリゴヌクレオチドで治療されたニューロン細胞におけるＵＢＥ３Ａの発現レベルと比較して少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、８０％、１００％、１２０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％または２５０％だけ、ＵＢＥ３Ａの発現を増大することができる。いくつかの実施形態では、開示されたオリゴヌクレオチドは、食塩水または非標的オリゴヌクレオチドで治療されたニューロン細胞におけるＳＮＯＲＤ１１１５－４５の下流のＳＮＨＧ１４転写物のレベルと比較して少なくとも２０％だけ、より好ましくは、食塩水または非標的オリゴヌクレオチドで治療されたニューロン細胞におけるＳＮＯＲＤ１１１５－４５の下流のＳＮＨＧ１４転写物のレベルと比較して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％だけ、ＳＮＯＲＤ１１５－４５の下流のＳＮＨＧ１４転写物のレベルを軽減することができる。

【0076】

開示されたオリゴヌクレオチドによる標的調整は、オリゴヌクレオチドの連続したヌクレオチド配列と標的核酸との間のハイブリダイゼーションによって駆動される。いくつかの実施形態では、開示されたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間のミスマッチを含む。ミスマッチにも関わらず、標的核酸に対するハイブリダイゼーションはなお、ＵＢＥ３Ａ発現の所望の調整を示すのに十分であり得る。ミスマッチから生じた軽減された結合親和性は、好都合にも、オリゴヌクレオチド配列内に存在するＬＮＡを含む２’修飾されたヌクレオシドなどを標的するための結合親和性を増大することができる、オリゴヌクレオチド中の増大した数のヌクレオチドおよび／または増大した数の修飾されたヌクレオシドによって埋め合わされる。

【0077】

開示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書で開示されるＵＢＥ３Ａ－ＡＳの５’－末端中に位置する５つのエクソンのうちの１つに対して少なくとも９０％の相補性、例えば、少なくとも９１％、例えば、少なくとも９２％、例えば、少なくとも９３％、例えば、少なくとも９４％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９６％、例えば、少なくとも９７％、例えば、少なくとも９８％、または１００％の相補性を有する、１０～３０個のヌクレオチド長の連続したヌクレオチド配列を有することができる。

【0078】

オリゴヌクレオチド設計は、オリゴヌクレオチド配列中のヌクレオシド糖修飾のパターンを指す。開示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、糖修飾されたヌクレオシドを含み、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはアラビノ核酸（ＡＮＡ）ヌクレオシドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、糖修飾されたヌクレオシドおよびＤＮＡヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、糖修飾されたヌクレオシドおよびＲＮＡヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、糖修飾されたヌクレオシドおよびＡＮＡヌクレオシドを含む。

【0079】

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾されたヌクレオシド、例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の修飾されたヌクレオシドを含む。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１～１０個の修飾されたヌクレオシド、例えば、２～９個の修飾されたヌクレオシド、例えば、３～８個の修飾されたヌクレオシド、例えば、４～７個の修飾されたヌクレオシド、例えば、６または７個の修飾されたヌクレオシドを含む。

【0080】

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む。いくつかの実施形態では、連続したヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェートヌクレオシド間結合である。

【0081】

いくつかの実施形態では、開示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の糖修飾されたヌクレオシド、例えば、２’糖修飾されたヌクレオシドを含む。好ましくは、開示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上のＬＮＡヌクレオシドまたは２’糖修飾されたヌクレオシドを含み、ここで、２’位は、－Ｆ；－ＣＦ３、－ＣＮ、－Ｎ３、－ＮＯ、－ＮＯ２、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）、－ＮＨ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）、または－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）２；－Ｏ－（Ｃ２－Ｃ１０アルケニル）、－Ｓ－（Ｃ２－Ｃ１０アルケニル）、－ＮＨ－（Ｃ２－Ｃ１０アルケニル）、または－Ｎ（Ｃ２－Ｃ１０アルケニル）２；－Ｏ－（Ｃ２－Ｃ１０アルキニル）、－Ｓ－（Ｃ２－Ｃ１０アルキニル）、－ＮＨ－（Ｃ２－Ｃ１０アルキニル）、－Ｎ（Ｃ２－Ｃ１０アルキニル）２、－Ｏ－－（Ｃ１－Ｃ１０アルキレン）－Ｏ－－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキレン）－ＮＨ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキレン）－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）２、－ＮＨ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキレン）－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）、および－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）－（Ｃ１－Ｃ１０アルキレン）－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）からなる群から独立して選択された置換基によって置換されている。

【0082】

いくつかの実施形態では、開示されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のＬＮＡユニット、例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８個のＬＮＡユニット、例えば、２～６個のＬＮＡユニット、例えば、３～７個のＬＮＡユニット、４～８個のＬＮＡユニット、または３、４、５、６もしくは７個のＬＮＡユニットを含む。いくつかの実施形態では、すべての修飾されたヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、ＬＮＡは、－Ｌ－の２’－４’ビラジカル結合を含み、式中、－Ｌ－は、－Ｏ－ＣＨ２－であり、－ＣＨ２－は場合により置換されている。いくつかの実施形態では、ＬＮＡは、－Ｌ－の２’－４’ビラジカル結合を含み、式中、－Ｌ－は、－Ｏ－ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、ＬＮＡは、－Ｌ－の２’－４’ビラジカル結合を含み、式中、－Ｌ－は、－Ｏ－ＣＨ（Ｅｔ）－である。さらなる一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡと、以下のＬＮＡユニット：ベータ－Ｄもしくはアルファ－Ｌ配置のいずれかであるチオ－ＬＮＡ、アミノ－ＬＮＡ、オキシ－ＬＮＡ、および／またはＥＮＡ、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上との両方を含み得る。さらなる一実施形態では、すべてのＬＮＡシトシンユニットは、５－メチル－シトシンである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたは連続したヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の５’末端に少なくとも１つのＬＮＡユニット、および３’末端に少なくとも２つのＬＮＡユニットを有する。

【0083】

いくつかの実施形態では、開示されたオリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨをリクルートすることができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、本明細書では単に「ギャップマー」とも称される、ギャップマー設計または構造を有する。ギャップマー構造では、オリゴヌクレオチドは、’５－＞３’の方向に少なくとも３つの別個の構造的領域、５’－フランク、ギャップ、および３’－フランク、Ｆ－Ｇ－Ｆ’を含む。この設計では、フランキング領域ＦおよびＦ’（ウイング領域とも呼ばれる）は、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ標的核酸に相補的である修飾されたヌクレオシドの連続したストレッチを含み、一方で、ギャップ領域、Ｇは、オリゴヌクレオチドが標的核酸と二本鎖を形成するときにヌクレアーゼ、好ましくは、エンドヌクレアーゼ、例えば、ＲＮアーゼ、例えば、ＲＮアーゼＨをリクルートすることができるヌクレオチドの連続したストレッチを含む。ヌクレアーゼ、特に、ＲＮアーゼＨをリクルートすることができるヌクレオシドは、ＤＮＡ、アルファ－Ｌ－オキシ－ＬＮＡ、２’－フルオロ－ＡＮＡおよびＵＮＡからなる群から選択され得る。領域Ｇの５’および３’末端に隣接する領域ＦおよびＦ’は、好ましくは、非ヌクレアーゼリクルートヌクレオシド（３’エンド構造を伴うヌクレオシド）、より好ましくは、１つ以上の親和性増強修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、３’フランクは、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、好ましくは、少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、５’フランクは、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、５’および３’フランキング領域の両方は、ＬＮＡヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、フランキング領域中のすべてのヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。他の実施形態では、フランキング領域は、ＬＮＡヌクレオシドおよび他のヌクレオシド（混合フランク）の両方、例えば、ＤＮＡヌクレオシドおよび／または非－ＬＮＡ修飾ヌクレオシド、例えば、２’置換されたヌクレオシドを含み得る。この場合では、ギャップは、親和性増強修飾ヌクレオシド、好ましくは、ＬＮＡ、例えば、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡが５’および３’末端で隣接している少なくとも５個のＲＮアーゼＨリクルートヌクレオシド（２’エンド構造を伴うヌクレオシド、好ましくは、ＤＮＡ）の連続した配列として定義される。結果として、ギャップ領域に隣接した５’フランキング領域および３’フランキング領域のヌクレオシドは、修飾されたヌクレオシド、好ましくは、非ヌクレアーゼリクルートヌクレオシドである。フランクがＤＮＡを含む混合フランクを伴うオリゴヌクレオチドでは、５’および３’ヌクレオシドは、修飾されたヌクレオシドである。

【0084】

開示されたオリゴヌクレオチドを製造するための方法は知られている。いくつかの場合では、方法はホスホロアミダイト化学を使用する（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１５４、ｐａｇｅｓ ２８７－３１３を参照されたい）。さらなる一実施形態では、方法は、連続したヌクレオチド配列をコンジュゲート部分（リガンド）と反応させることをさらに含む。

【0085】

いくつかの実施形態では、キラル原子を含む１つ以上の修飾されたヌクレオシド間結合での立体化学の制御を提供するオリゴヌクレオチド方法論が利用される。例えば、これらの方法論について参照により組み込まれる、ＷＯ２０１０／０６４１４６、ＷＯ２０１４／０１２０８１、ＷＯ２０１５／１０７４２５、ＷＯ２０１６／０７９１８３、ＷＯ２０１６／０７９１８１、ＷＯ２０１６／０９６９３８、ＷＯ２０１７／１９４４９８、およびＷＯ２０１８／１７７８２５を参照されたい。

【0086】

当業者は、本開示により提供される有用な核酸が本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドの配列を保存および／または発現するものを含むことを認識するだろう。いくつかの実施形態では、そのような核酸は、細胞（例えば、微生物細胞、例えば、生産のための、および／または哺乳類細胞、例えば、治療のための）への送達、および／または細胞における複製および／または発現のために適切なベクターであってもよく、またはそれを含んでもよい。当業者は、様々な技術を認識している（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応によるなどの増幅、制限消化によるなどの切断、例えば、ギャップ修復によるなどのインビトロまたはインビボのいずれかでのライゲーションによるなどの結合、のうちの１つ以上を利用するなどの組換え核酸技術）。

【0087】

前述したオリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドコンジュゲートのいずれか、および薬学的に許容される希釈剤、担体、塩および／または賦形剤を含む薬学的組成物も開示される。薬学的に許容される希釈剤は、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）を含み、薬学的に許容される塩は、ナトリウムおよびカリウム塩を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、希釈剤は、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）である。

【0088】

開示されたオリゴヌクレオチドは、薬学的組成物または製剤の調整のための薬学的に許容される活性または不活性物質と混合されてもよい。薬学的組成物の製剤化のための組成物および方法は、投与経路、疾患の程度、または投与される用量を含むがこれらに限定されない多数の基準に依存する。

【0089】

当業者は、オリゴヌクレオチド療法などの核酸療法の貯蔵および／または投与のために有用な様々な製剤化ストラテジーを認識している。例えば、Ｐｕｓｈｐｅｎｄｒａら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、Ｆｒｏｍ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ、ｅｄ． ＥｒｄｍａｎｎおよびＢａｒｃｉｓｚｅｗｓｋｉ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、２０１２；Ｊｕｌｉａｎｏ 「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」 Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．４４：６５１８、２０１６などを参照されたい。

【0090】

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、プロドラッグとして製剤化される。特に、オリゴヌクレオチドコンジュゲートに関しては、プロドラッグが作用部位、例えば、標的細胞に送達されると、コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドから切断され得る。

【0091】

疾患を治療または予防するための方法であって、治療的または予防的有効量の本明細書で開示されるオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的組成物を、疾患を患っているか、またはその疑いのある対象へ投与することを含む方法も開示される。

【0092】

本明細書で参照されるような障害の治療用医薬の製造のための、または本明細書で参照されるような障害の治療方法のための開示されたオリゴヌクレオチドの使用も開示される。

【0093】

開示された薬学的組成物は、局所的（例えば、皮膚、吸入、眼、または耳へ）、または経腸（例えば、経口的に、もしくは胃腸管を介して）、または非経口的（例えば、静脈内、皮下、筋内、脳内、脳室内、もしくは髄腔内）投与により投与されてもよい。いくつかの実施形態では、開示された薬学的組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋内注射もしくは注入、髄腔内もしくは頭蓋内、例えば、脳内もしくは脳室内への投与を含む非経口経路により投与される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、脳内または脳室内注射により投与される。別の実施形態では、活性のあるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートが、髄腔内に投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、小脳延髄槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｅ ｍａｇｎａ）注射により投与される。

【0094】

いくつかの実施形態では、本明細書で記載される薬学的組成物を用いるＡＳ療法は、ＡＳを患っているか、またはその疑いのある対象（複数可）に投与される。いくつかの実施形態では、対象は、母方ＵＢＥ３Ａ遺伝子における欠損に関連した遺伝的特徴を有すると決定されている。いくつかの実施形態では、ＡＳ関連の遺伝的特徴は、母方欠失であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＡＳ関連の遺伝的特徴は、片親性ダイソミーであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＡＳ関連の遺伝的特徴は、ＵＢＥ３Ａ変異であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＡＳ関連の遺伝的特徴は、刷り込み欠損であるか、またはそれを含む。

【0095】

いくつかの実施形態では、対象は、ＡＳに関連付けられている１つ以上の発達履歴および／またはラボ的知見特徴、例えば、以下のもののうちの１つ以上を有すると決定されている：
（ｉ）正常な頭囲を有し、かつ大きな先天性異常がない、正常な出生前および出生時履歴；
（ｉｉ）新生児および／または乳児の時期の授乳時に困難がある；
（ｉｉｉ）６～１２月齢までに発達遅延のエビデンスがみられ、時に、躯幹の低緊張状態に関連付けられる；
（ｉｖ）不安定な四肢の動き、および／または笑いの増大；
（ｖ）発達は遅延されるが、進展する（技能の喪失はない）；
（ｖｉ）正常な代謝、血液、および化学的ラボ的プロファイル；
（ｖｉｉ）ＭＲＩまたはＣＴを使用して評価された場合に構造的に正常な脳（軽度の皮質萎縮または髄鞘形成異常を有することがある）。

【0096】

代替的または追加的に、いくつかの実施形態では、対象は、ＡＳに一貫して関連付けられる１つ以上の臨床的特徴、例えば、以下のもののうちの１つ以上を示すことが決定されている：
（ｉ）発達の遅延、機能的に重大である；
（ｉｉ）運動またはバランス障害、通常は、歩行失調および／または四肢の振戦運動。いくつかの実施形態では、そのような運動障害は軽度であり得る。いくつかの実施形態では、そのような運動障害は、明らかな運動失調として現れないが、例えば、前傾、不安定さ、不器用さ、または素早くぎくしゃくした動きであるか、またはそれらを含み得る；
（ｉｉｉ）独特な挙動：笑い／笑顔の頻度が増えること；明らかに幸せな様子；簡単に興奮する性格、多くの場合、高揚して手を羽ばたかせたり手を振ったりする運動を伴う；多動的挙動の任意の組み合わせ
（ｉｖ）言語障害、例えば、言葉の使用を欠いているか、または最小限である；代替的または追加的に、感受性および非言語的コミュニケーションスキルは言語スキルに比べて高い。

【0097】

代替的または追加的に、いくつかの実施形態では、対象は、ＡＳに頻繁に（例えば、時間の約８０％）関連付けられる１つ以上の臨床的特徴、例えば、以下のもののうちの１つ以上を示すことが決定されている：
（ｉ）頭囲の成長が、遅延され、不釣り合いなものであり、通常は、結果として、２歳までに小脳症を生じる（正常なＯＦＣの≦２Ｓ．Ｄ．）。いくつかの実施形態では、小脳症は、１５ｑ１１．２－ｑ１３欠失を伴う人においてより顕著である；
（ｉｉ）てんかん発作、通常は、３歳までに発症する。いくつかの実施形態では、てんかん発作の重症度は、年齢に従って減少し得るが、それにも関わらず、いくつかの実施形態では、てんかん発作障害は、大人になっても継続する。
（ｉｖ）当該技術分野において知られているような特徴的なパターンを伴う異常なＥＥＧ。いくつかの実施形態では、ＥＥＧの異常さは、人生の初めの２年で生じ、臨床的特徴に先行することがあり、臨床的なてんかん発作事象に相関しないこともある。

【0098】

代替的または追加的に、いくつかの実施形態では、対象は、ＡＳに時折（例えば、時間の約２０％～８０％）関連付けられる１つ以上の臨床的特徴、例えば、以下のもののうちの１つ以上を示すことが決定されている：
（ｉ）平らな後頭部
（ｉｉ）後頭動脈溝
（ｉｉｉ）舌を突き出している
（ｉｖ）舌を押し出す；吸い込み／飲み込み障害
（ｖ）乳児期の授乳における問題および／または躯幹の低緊張状態
（ｖｉ）上顎前突
（ｖｉｉ）広く開いた口、広く隙間の空いた歯
（ｖｉｉｉ）頻繁によだれを垂らす
（ｉｘ）過剰な噛む／口の動きの挙動
（ｘ）斜視
（ｘｉ）色素不足の皮膚、薄い色の髪の毛および眼の色、いくつかの実施形態では、家族と比較して決定され、典型的には欠失の場合においてのみ見られる。
（ｘｉｉ）過剰な四肢下部の深部腱反射
（ｘｉｉｉ）特に歩行運動中の、高揚した湾曲した腕の位置
（ｘｉｖ）回内または外反した足首を伴うすそ広がりな足どり
（ｘｖ）熱に対する感受性の増大
（ｘｖｉ）異常な睡眠覚醒サイクル、および睡眠の必要性の減少
（ｘｖｉｉ）水に対する興味／水に魅惑されること；特定の紙およびプラスチックなどのカサカサ音のなる物品に対して魅惑されること
（ｘｖｉｉｉ）食べ物に関連した異常な挙動
（ｘｉｘ）肥満（年齢の高い小児において）
（ｘｘ）脊柱側湾症
（ｘｘｉ）便秘

【0099】

いくつかの実施形態では、本明細書で記載されるような核酸療法（例えば、ＡＳＯなどのオリゴヌクレオチド療法）を用いるＡＳの治療のための療法レジメンは、本明細書で記載されるようなオリゴヌクレオチドを含むおよび／または送達する薬学的組成物の１つ以上の用量の投与であるか、それを含む。

【0100】

いくつかの実施形態では、提供される療法レジメンが実施される対象は、例えば、１つ以上の他の核酸療法（例えば、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳを標的とする１つ以上の他のオリゴヌクレオチド）を含む１つ以上の他のＡＳ療法を受けているか、または以前に受けた。例えば、ＷＯ２０１４００４５７２Ａ３、ＵＳ９６１７５３９Ｂ２、ＵＳ２０１７０３６２５９２Ａ１、およびＥＰ２８６４４７９Ｂ１を参照されたい。

【0101】

いくつかの実施形態では、提供される療法レジメンが実施される対象は、１回以上のてんかん発作を以前に患ったか、または患っており、および／または抗てんかん発作療法を受けているか、または以前に受けた。例えば。いくつかの実施形態では、対象は、１つ以上のバルプル酸、クロナゼパム、フェノバルビタール、トピラマート、カルバマゼピン、ラモトリジン、レベチラセタム、フェニトイン、ゾニサミド、エトサクシミド、ガバペンチン、フェルバマート（ｆｅｌｂａｔａｍｅ）、オキシカルバゼピン、トランキセン（ｔｒａｎｘｅｎｅ）、ＡＣＴＳ、ニトラゼパム、プレガバリン、ミソリン、ビガバトリンなどを以前に受けたか、または受けていてもよい。いくつかの特定の実施形態では、対象は、１つ以上のバルプル酸、クロナゼパム、フェノバルビタール、トピラマート、カルバマゼピン、ラモトリジン、および／またはレベチラセタムを以前に受けたか、または受けていてもよい。

【0102】

代替的または追加的に、いくつかの実施形態では、対象は、例えば、ケトン食療法、低血糖指数療法等などの食事療法を以前に受けたか、または受けていてもよい。

【0103】

さらになお代替的または追加的に、いくつかの実施形態では、対象は、迷走神経刺激因子を用いる治療を以前に受けたか、または受けていてもよい。

【0104】

本開示を読む当業者には明らかであるように、提供される治療方法は、本明細書に記載されるようなオリゴヌクレオチドおよびさらなる療法（例えば、代替的なオリゴヌクレオチドおよび／または抗てんかん療法および／または１つ以上の他の療法介入）の一方または両方を実施することを含み、その結果、対象は、組み合わせ療法（例えば、それらに同時に曝露される、例えば、重複した投与を介するなど）を受けることになる。髄腔内投与用の投与形態である医薬の製造のための本明細書で開示されたオリゴヌクレオチドの使用も開示される。

【0105】

脳内または脳室内投与用の投与形態である医薬の製造のための本明細書で開示されたオリゴヌクレオチドの使用も開示される。

【0106】

脳室内投与用の投与形態である医薬の製造のための本明細書で開示されたオリゴヌクレオチドの使用も開示される。

【0107】

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、別の治療薬との組み合わせ治療において使用される。治療薬は、例えば、抗けいれん薬であり得る。

【0108】

本発明の多数の実施形態が記載されている。それにも関わらず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な修飾がなされてもよいことが理解されよう。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。

【実施例】

【0109】

実施例１：
結果
マウスおよびヒトＣＮＳのＲＮＡ－配列決定分析は、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳの安定性および／または転写のために重要であると考えられている領域を同定した。領域のさらなる分析は、マウスとヒトとの間の低レベルの配列保存を示した（図１Ａ～１Ｄ）。

【0110】

これらの知見に基づいて、Ｕｂｅ３ａ－ＡＳ転写物における特定領域を標的とするために、マウス特異的ＡＳＯが設計された（表６および図２Ａ）。この領域を標的とするＡＳＯが父方Ｕｂｅ３ａアレルの発現を再活性化するかどうかを試験するために、初代海馬ニューロンの培養液をＵｂｅ３ａＹＦＰレポーターマウスモデルから産生し（Ｕｂｅ３ａ＋／ＹＦＰ；図２Ｂ）、インビトロでの７日目（ＤＩＶ）にて、対照ＡＳＯ［ＡＳＯ－Ｃ（１０ｕＭ、ｎ＝３）］、Ｕｂｅ３ａ－ＡＳを標的とする３つのＡＳＯ［ＡＳＯ－１．１、ＡＳＯ－１．２、ＡＳＯ－３．１（１μＭ、５μＭ、および１５μＭ、ｎ＝３）］、ならびにＡＳＯ－Ｂ（１μＭ、５μＭ、および１５μＭ、ｎ＝３）］で治療した。正対照として、ニューロンは、トポテカン［トポ（３００ｎＭ、ｎ＝３）］で治療され、負はビヒクル対照［Ｖｅｈ（１％、ｎ＝３）；図２Ｃ］であった。治療の３日後（１０ＤＩＶ）、免疫蛍光イメージングを使用して、個々の細胞中の父方Ｕｂｅ３ａＹＦＰタンパク質レベルが定量された。対照（ＡＳＯ－ＣおよびＶｅｈ）と比較して、各治療は実質的に父方Ｕｂｅ３ａＹＦＰタンパク質レベルを増大し、ＡＳＯ－１．１（１５μＭ）、ＡＳＯ－３．１（１５μＭ）、およびトポテカン治療（図２Ｄおよび２Ｅ）では同様のレベルが成し遂げられた

【0111】

次いで、この領域を標的とするために、ヒト特異的ＡＳＯが設計され、これは、ヒトの非多形的領域ならびにマカク（アカゲザルおよびカニクイザル）で保存されている領域（１００％）を標的とする４つのＡＳＯを含んだ（表７および図３Ａ）。ヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）神経前駆細胞は、１４ＤＩＶの間にＧＡＢＡ作動性ニューロンに分化し、次いで、対照ＡＳＯ［ＡＳＯ－Ｃ（１０μＭ、ｎ＝３）］、トポテカン［トポ（１μＭ、ｎ＝２）］、ならびにＵＢＥ３Ａ－ＡＳを標的とする６つのＡＳＯ［ＡＳＯ－１、ＡＳＯ－２、ＡＳＯ－３、ＡＳＯ－４、ＡＳＯ－５、およびＡＳＯ－６（１０μＭ、ｎ＝３）］で治療された。さらに、ＳＮＯＲＤ１０９Ｂの下流のイントロン領域を標的とするＡＳＯが含まれた（ＡＳＯ－７）。治療の６日後（２０ＤＩＶ）、ＲＮＡをニューロンから単離し、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳおよびＵＢＥ３Ａの定常状態ＲＮＡレベルを対照治療に対して推定した（図３Ｂ）。ＡＳＯ－７を除き、各ＡＳＯは有意にＵＢＥ３Ａ－ＡＳ ＲＮＡレベルを減少し、ＡＳＯ－２およびＡＳＯ－４は最大の効果を有した（表８および図３Ｃ）。各ＡＳＯでの治療後に、ＵＢＥ３Ａ ＲＮＡレベルも増大した（図３Ｄ）。

【0112】

ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ ＲＮＡレベルに対する効果を考慮して、ＡＳＯ－４の効力もさらに調べられた。ＧＡＢＡ作動性ｉＰＳＣ－由来ニューロンは、１４ＤＩＶにて、１０ポイントの１／２ｌｏｇ用量曲線のＡＳＯ－４、および正対照として、および治療間の比較のためにトポテカンで治療された［１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、および３０μＭ（ＡＳＯ－４、ｎ＝６；トポテカン、ｎ＝２）］。２０ＤＩＶにて、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳの定常状態ＲＮＡレベルが測定され、用量応答曲線を近似して、ＩＣ５０およびＥ最大（すなわち、最大ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ阻害）を推定した（表９および図４Ａ）。用量応答曲線のＡＳＯ－４およびトポテカンは有意に異なり（並列試験：Ｆ（３，１４５）＝１１．２、ｐ＜０．０００１）、故に、相対的効力は推定されなかった。等価試験は、ＡＳＯ－４およびトポテカンのＩＣ５０およびＥ最大が等価でなかったことを示した［ＡＳＯ－４／トポテカンＩＣ５０比：＝１．２（信頼下限＝１．１；信頼上限＝１．３）；Ｅ最大比＝－４．１（信頼下限＝－１２．９；信頼上限＝４．８）］。

【0113】

次いで、ＡＳＯ－４標的領域の上流に位置するＳＮＯＲＤ１１６、ＩＰＷ、ＳＮＯＲＤ１１５、およびＳＮＯＲＤ１０９Ａ ＲＮＡについて、ＡＳＯ－４およびトポテカンの効果を調べた（図１Ａを参照されたい）。ＳＮＯＲＤ１１６を除き、ＡＳＯ－４は、ＩＰＷ、ＳＮＯＲＤ１１５、およびＳＮＯＲＤ１０９Ａ／ＢのＲＮＡレベルに対して有意な効果を有したが、用量依存性の様式ではなかった。対照的に、トポテカンは、ＳＮＯＲＤ１１６、ＩＰＷ、ＳＮＯＲＤ１１５、およびＳＮＯＲＤ１０９Ａ／Ｂ ＲＮＡレベルに対して有意な効果を示し、これは用量依存性であった（表１０および図４Ｂ－４Ｅ）。より高い濃度のトポテカン（３μＭ、１０μＭ、および３０μＭ；図４Ｆ）を除き、ＡＳＯ－４およびトポテカンの両方は、用量依存性の様式で総ＵＢＥ３Ａ ＲＮＡレベルを増大した。

【0114】

ｉＰＳＣ－由来ニューロンの分化のより遅い時点において、ＡＳＯ－４の効力がさらに調べられた。ＧＡＢＡ作動性ｉＰＳＣ－由来ニューロンは、５９ＤＩＶにおいて対照ＡＳＯ［ＡＳＯ－Ｃ、１０μＭ（ｎ＝３）］およびＡＳＯ－４［１ｕＭ、５μＭ、および１０μＭ（ｎ＝３）］で治療され、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳおよびＵＢＥ３Ａの定常状態ＲＮＡレベルは上記したように測定された（図４Ｇ）。より速い時点におけるＡＳＯ－４で治療したニューロンとは異なり、ＵＢＥ３ＡおよびＵＢＥ３Ａ－ＡＳのＲＮＡレベルは、高度に逆比例していた（図４Ｈおよび４Ｉ）。例えば、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ ＲＮＡレベルに対するＡＳＯ－４（１０μＭ）の効果は、１４および５９ＤＩＶで治療したニューロン間で同様であった［２０ＤＩＶ：ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ：↓８７％（９５％信頼区間（ＣＩ）：８０～９５％）；６５ＤＩＶ：↓８１％（９５％ ＣＩ：７４～８８％）］が、ＵＢＥ３Ａ ＲＮＡレベルに対するＡＳＯ－４の効果は実質的に５９ＤＩＶで治療したニューロンで増大していた［２０ＤＩＶ：↑３０％（９５％ＣＩ：１６～４４％）；６５ＤＩＶ：↑８６％（９５％ＣＩ：５９％～１１３％）］。

【0115】

次いで、ＡＳＯ－４（ＡＳＯ－４．１、ＡＳＯ－４．２、ＡＳＯ－４．３、およびＡＳＯ－４．４）の標的配列ならびに他の２つの標的領域、ＡＳＯ－３（ＡＳＯ－３．１およびＡＳＯ－３．２）およびＡＳＯ－６（ＡＳＯ－６．１）（表１１）を最適化するために、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳの５’－末端を標的とするさらなるＡＳＯが設計された。さらに、比較目的のために、２つの異なる販売元においてＡＳＯ－４が製造された（ＡＳＯ－４．Ｓ、Ｓｉｇｍａ；ＡＳＯ－４．Ｉ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ヒトｉＰＳＣ－由来ニューロン（ＧＡＢＡ作動性）は、１４ＤＩＶにて、５ポイントの１／２ｌｏｇ用量曲線のＡＳＯ－３．１、ＡＳＯ－３．２、ＡＳＯ－４．Ｓ、ＡＳＯ－４．Ｉ、ＡＳＯ－４．１、ＡＳＯ－４．２、ＡＳＯ－４．３、ＡＳＯ－４．４、およびＡＳＯ－６．１［３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ（ｎ＝６）］で治療された。２０ＤＩＶにて、各ＡＳＯのＩＣ５０およびＥ最大が上記されたように推定された（図５Ａ－Ｂおよび表１２）。用量応答曲線はＡＳＯ間で同様であり（並列試験：Ｆ（１６，５１３）＝１．６、ｐ＝０．０６）、ＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１は最高の相対的効力を有した（表１３）。有意な差はＡＳＯ－４．ＳとＡＳＯ－４．Ｉとの間で観察されなかった。

【0116】

ｉＰＳＣ－由来ニューロンの分化のより遅い時点において、ＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１の効力がさらに調べられた。ＧＡＢＡ作動性ｉＰＳＣ－由来ニューロンは、２９ＤＩＶにて、１０ポイントの１／２ｌｏｇ用量曲線のＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６で治療された［１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、および３０μＭ（ｎ＝３）］。３５ＤＩＶにて、各ＡＳＯのＩＣ５０およびＥ最大が上記されたように推定された（図５Ｃ～Ｄおよび表１４）。用量応答曲線のＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１は同様ではなかった（並列試験：Ｆ（３，１７２）＝２２．７、ｐ＜０．０００１）。等価試験は、ＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１が等価な効力を有したが、異なるＥ最大値を有したことを示し［ＡＳＯ－６．１／ＡＳＯ－４比：ＩＣ５０＝１．０３（信頼下限＝１．０；信頼上限＝１．１）；Ｅ最大＝－１．３（信頼下限＝－２．６；信頼上限＝－０．０８）］、ＡＳＯ－６．１はＵＢＥ３Ａ－ＡＳレベルの最大の阻害を有した。ＵＢＥ３Ａ ＲＮＡレベルに対するＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１の効果は同様であり、各治療は用量依存性の様式でＲＮＡレベルを増大した（図５Ｄ）。

【0117】

ＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１は、グルタミン酸作動性ｉＰＳＣ－由来ニューロンにおいても調べられた。グルタミン酸作動性ｉＰＳＣ－由来ニューロンは、１４ＤＩＶにて、１０ポイントの１／２ｌｏｇ用量曲線のＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１で治療された［１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、および３０μＭ（ｎ＝３）］。２０ＤＩＶにて、各ＡＳＯのＩＣ５０およびＥ最大が上記されたように推定された（図５Ｅ－Ｆおよび表１５）。用量応答曲線のＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１は同様であり、有意に異ならず（並列試験：Ｆ（３，１６５）＝１．９、ｐ＝０．１）、ＡＳＯ－６．１は最高の相対的効力を有した（表１６）。期待されたように、ＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１は、用量依存性の様式でＵＢＥ３Ａ ＲＮＡレベルを増大したが（図５Ｆ）、各濃度について治療に帰することができなかった高い程度の変動が存在した（Ｒ２＝０．１７）。

【0118】

結論
ＡＳのための療法の開発に向けて、マウスおよびヒトニューロンにおいて、特定領域を標的とするＡＳＯがＵｂｅ３ａ－ＡＳ／ＵＢＥ３Ａ－ＡＳを阻害し、父方Ｕｂｅ３ａ／ＵＢＥ３Ａアレルの発現を再活性化するかを決定するために、実験が実施された。まとめると、知見は、マウスおよびヒトニューロンにおけるこの領域を標的とするＡＳＯは強力なアンチセンス活性を有し、Ｕｂｅ３ａ／ＵＢＥ３Ａの刷り込みを反転させることを示す。

【0119】

Ｕｂｅ３ａ－ＡＳを標的する３つのＡＳＯのうちの２つ（ＡＳＯ－１．１およびＡＳＯ－３．１）は、マウスニューロンにおいて父方Ｕｂｅ３ａアレルの発現を、最適濃度のトポテカン（３００ｎＭ）により成し遂げられたものと同様のレベルまで再活性化した。

【0120】

同様に、ヒト特異的ＡＳＯの各々は、ヒトｉＰＳＣ－由来ニューロンにおけるＵＢＥ３Ａ－ＡＳの定常状態ＲＮＡレベルを有意に減少し、より高い濃度のＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１はほぼ完全にＵＢＥ３Ａ－ＡＳの発現を廃止した。ＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１標的領域がヒトとマカクとの間で１００％保存されていることを考慮すると、これらのＡＳＯの効力は、カニクイザルまたはアカゲザルマカクのいずれかにおいてインビボで調べることができる。トポテカンとは異なり、ＡＳＯ－４は、上流ＳＮＯＲＤ１１６、ＩＰＷ、ＳＮＯＲＤ１１５、またはＳＮＯＲＤ１０９Ａ／Ｂ ＲＮＡに対して、あるとしても小さな効果を有し、これは、ＡＳＯが標的領域またはその下流での転写を終結するという考えと一致する。

【0121】

低濃度（３ｎＭ）のＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１は、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ ＲＮＡレベルを有意に減少するが、より高い濃度（≧１００ｎＭ）のＡＳＯはＵＢＥ３Ａ ＲＮＡレベルを増大するために必須ではない。これは、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳがＵＢＥ３Ａの転写を阻害するために必要とされる特定の閾値、またはＵＢＥ３Ａ－ＡＳの不活性化が父方ＵＢＥ３Ａの再活性化を導く時間のずれ、またはＵＢＥ３Ａ ＲＮＡレベルを定量するために使用されるアッセイの感受性を反映してもよい。

【0122】

まとめると、知見は、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳにおける候補領域を標的とするＡＳＯが、ニューロンにおけるＵＢＥ３Ａの刷り込みをほとんど完全に廃止し、将来の臨床開発のために少なくとも２つのＡＳＯを明らかにしていることを示唆している。

【0123】

異なるＲＮＡ修飾［２’－ヒドロキシメチル（２’－ＯＭｅ）、２’－メトキシ－エチル ２’－ＭＯＥ、およびロック核酸（ＬＮＡ）］、および骨格［ホスホロチオエート（ＰＳ）およびホスホジエステル（ＰＯ）］から構成されるＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１の誘導体も設計された（表１７）。

【表6】

【表7】

【表8】

【表9】

【表10】

【表11】

【表12】

【表13】

【表14】

【表15】

【表16】

【表17】

【0124】

材料および方法
アンチセンスオリゴヌクレオチド設計
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、Ｓｏｌｉｇｏ（核酸の統計的折り畳みおよび調節性ＲＮＡの研究のためのソフトウェア）を使用して設計された。簡単に言うと、最も低い結合部位分断エネルギーおよび自由結合エネルギーを伴う候補ＡＳＯ（２０～１８ｍｅｒ）が、各標的配列について同定され、次いで、増大した効果を有するモチーフについて検査した。Ｓｏｌｉｇｏにより作製された標的配列の予測された最も低い自由エネルギー質量中心二次構造内のアクセシビリティに基づいて、ＡＳＯはさらにフィルターにかけられた。いくつかの場合では、ＲＮＡｆｏｌｄおよびＭｆｏｌｄにより作製された最も低い自由エネルギー構造を使用して、二次構造モデルが比較された。

【0125】

ヒトＡＳＯは、以下の基準を使用してフィルターにかけられた：１）標的配列は、多形性であった［ｄｂＳＮＰ１３８、ｄｂＳＮＰ１５０、および１０００ゲノムフェーズ３統合バリアント細胞（ＳＮＶ、ＩＮＤＥＬ、およびＳＶ）］；２）標的配列は、アカゲザルおよびカニクイザルマカクで１００％保存されていなかった；３）標的配列は、保持されたＳｎｏｒｄ１１５／ＳＮＯＲＤ１１５ ｓｎｏＲＮＡ（エクソンあたり）の上流に位置した。次いで、残存するＡＳＯを、自由エネルギー（＜＝－８ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、標的部位ヌクレオチドについての平均非対合確率、結合部位分断エネルギー（低＞高）、二次構造内の位置（Ｅｎｓｅｍｂｌ質量中心）、および高い／低い効果に関連する配列モチーフの存在／不在によりランク付けした。

【0126】

マウス初代海馬ニューロン
海馬ニューロンの初代培養液は、Ｕｂｅ３ａｍ＋／ｐＹＦＰの雄と野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌を交配することによるＰ０－Ｐ１子マウス（Ｕｂｅ３ａｍ＋／ｐ＋およびＵｂｅ３ａｍ＋／ｐＹＦＰ）から産生された。遺伝子型は、以前に記載された方法を使用して決定された。簡単に言うと、海馬ニューロンは、ポリ－Ｄ－リジン（１５２０２８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびラミニン（２３０１７－０１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をコーティングした９６ウェルオプティカルボトムプレートにて、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補足した神経基礎Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中で培養した。培養液は使用時まで５％のＣＯ２中、３７℃で維持された。

【0127】

マウスニューロンイメージング
マウス初代海馬ニューロンは、１０ＤＩＶ（治療の３日後）に、４％のパラホルムアルデヒドを用いて固定された。次いで、培養液は、１ＸＰＢＳで２回洗浄され、ＰＢＳ中の４％のパラホルムアルデヒドで１５分間固定され、次いで、１ＸＰＢＳ中で３回洗浄された。細胞は、５％のヤギまたはロバ血清を加えたＰＢＳ（Ｔ－ＰＢＳ）中の０．３％のトリトン－Ｘ１００中で、１～２時間、室温で穏やかに攪拌しながらブロッキングされた。細胞は、抗－ＧＦＰ［Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＮＢ ６００－３０８（ウサギ）］および抗－ＮｅｕＮ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０５－５５７（ｍｏｕｓｅ）］抗体と共に２４時間、４℃で穏やかに攪拌しながらインキュベートされた。細胞は、０．１％のＴｗｅｅｎ ２０ １ＸＰＢＳ中で各々１５分間ずつ３回洗浄され、次いで、抗ウサギ４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１１１－５４５－１４４）および抗マウスＣｙ３（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１１５－１６５－１６６）二次抗体と共に２４時間４℃で暗所にてインキュベートされた。次いで、細胞は、０．１％のＴｗｅｅｎ２０ １ＸＰＢＳ中で各々１５分間ずつ４回洗浄された。３回目の洗浄において１：１０００の希釈でＨｏｅｃｈｓｔ染色（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、核が標識された。

【0128】

Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５およびＧｅｎ５ Ｉｍａｇｅ＋ソフトウェア（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用して、プレートが画像化された。簡単に言うと、４Ｘの対立倒立を使用して、自動画像ステッチのために重複タイルを伴う５ｘ４の自動焦点画像を獲得することにより、各ウェルのモンタージュ画像を作製した。使用されたフィルターは、ＤＡＰＩ（３７７，４７７）、ＧＦＰ（４６９，５２５）、およびＲＦＰ（５３１，５９３）であった。露光時間およびゲインは、負および正対照を使用して、各プレートについて調整された。ＧＦＰおよびＲＦＰフィルターについて使用したのと同じ焦点高さを用いて、自動焦点を各ウェルについて核（Ｈｏｅｃｈｓｔ染色、ＤＡＰＩ）に対して実施した。Ｇｅｎ５ Ｉｍａｇｅ＋ソフトウェアにより画像を共にステッチした。

【0129】

ＩＮ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ ６．０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用して、単一細胞の画像分析を実施した。簡単に言うと、核（Ｈｏｅｃｈｓｔ染色、ＤＡＰＩ）または成熟ニューロン（ＮｅｕＮ、ＲＦＰ）のいずれかについて、獲得画像において無作為に選択された細胞のサイズおよび強度に基づいて包含および排除パラメータを最適化することにより、個々のトラックマスクを作製した。次いで、ＧＦＰの平均および中央強度値を、選択されたマスクの境界内で獲得し、各細胞内のＵｂｅ３ａＹＦＰについての強度値を産生した。

【0130】

ヒト誘導多能性幹細胞由来ニューロン
ＧＡＢＡ作動性およびグルタミン酸作動性誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来神経前駆細胞（ＮＲＣ－１００－０１０－００１およびＧＮＣ－３０１－０３０－００１、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を、製造元のプロトコルに従ってニューロンに分化させた。簡単に言うと、神経前駆細胞は解凍され、化学的に画定された培地中で再懸濁され、ポリ－Ｄ－リジンおよびラミニンでコーティングされた滅菌培養プレートへ添加された。プレーティングの２４時間後に培地を交換し、次いで、培地の半分をその後３～５日毎に交換した。

【0131】

ＲＮＡ単離
培養されたｉＰＳＣ－由来ニューロンについて、Ｃｅｌｌ－ｔｏ－ＣＴキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５５μｌのライセート容積にて使用して、ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ合成を実施した。

【0132】

ＲＮＡレベルの分析
標的転写物の定常状態ＲＮＡレベルは、ＴａｑＭａｎ定量的リバース－転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）アッセイを使用して測定された。全反応容積は、１０ｕＬであり、２μｌのｃＤＮＡ、１Ｘの遺伝子発現マスターミックス（４３６９０１６、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、および１ＸのＴａｑＭａｎプライマーアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含んだ。サイクリング条件は、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、ならびに９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の４０サイクルであり、各サイクルの６０℃での工程において読み取りが行われた。反応は、ＢＩＯ－ＲＡＤ Ｔ１０００ ＣＦＸ９６サーモサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）において実行され、内部対照（ＰＰＩＡ、Ｈｓ９９９９９９０４＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および標的［ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ、Ｈｓ０１３７２９５７＿ｍ１；ＳＮＯＲＤ１１６－１１、Ｈｓ０４２７５２６８＿ｇＨ；ＳＮＯＲＤ１１５、Ｈｓ０４２７５２８８＿ｇＨ；ＩＰＷ、Ｈｓ０３４５５４０９＿ｓ１；ＳＮＯＲＤ１０９Ａ／Ｂ、ＡＰ４７ＷＶＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；ＵＢＥ３Ａ：フォワードＡＴＡＴＧＴＧＧＡＡＧＣＣＧＧＡＡＴＣＴ（配列番号５００）；リバース：ＣＣＣＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＡＡＴＣＡＧＡＡ（配列番号５０１）；およびプローブ：ＡＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣＴＡＴＡＣＣＡＧＧ（配列番号５０２）］反応を共に実施した。データを取り出し、ＢＩＯＲＡＤ ＣＦＸ Ｍａｅｓｔｒｏソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で分析した。内部対照Ｃｑ値≧３０を有する試料をフィルター分けした。データの品質を視覚的に調査して、技術的および／またはプレートレプリケートの間の不一致を同定した。推測統計および記述統計のための測定は、ΔΔＣｑ値（２－ΔΔＣｑ＝２－（Ｃｑ［標的］－Ｃｑ［内部対照］）－（Ｃｑ［標的］－Ｃｑ［内部対照］））からなる。

【0133】

実施例２：ＡＳＯ標的領域の同定
マウス組織および細胞から産生されたＲＮＡ－配列決定データの分析は、Ｓｎｏｒｄ１１５クラスターの３’－末端とＵｂｅ３ａアンチセンス（Ｕｂｅ３ａ－ＡＳ）転写物の５’－末端との間に位置する領域を明らかにし、これは、Ｓｎｏｒｄ１１５宿主遺伝子転写物のプロセシングおよびＵｂｅ３ａ－ＡＳの転写のために重要であると考えられている遺伝要素を含有している（図６Ａ～６Ｄ）。ヒト組織から産生されたＲＮＡ－配列決定データの分析は、ＳＮＯＲＤ１１５クラスターの３’末端とＳＮＯＲＤ１０９Ｂとの間に位置する領域を明らかにし（図７Ａ～７Ｇ）、これは、マウスにおいて観察されたものと同様の要素を含んだ；しかし、この領域の比較分析は、ヒトとげっ歯類との間には配列保存がほとんどないか、または全く存在しないことを示した。

【0134】

材料および方法
ＲＮＡ－配列決定
ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡｅａｓｙ Ｐｌｕｓ（７４１３６、Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して単離された。ＲＮＡ濃度は、Ｑｕｂｉｔ蛍光定量（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定され、ＲＮＡ品質は、４２００ Ａｇｉｌｅｎｔ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して評価された。ＲＮＡ－配列決定ライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡキット（２００２０５９７、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を製造元のプロトコルに従って使用して産生された。７５塩基対の対になった末端配列決定は、Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｃｏｒｅにおいて、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して実施された。生の配列決定読み取りは、ＣＡＳＡＶＡを使用して処理された。得られたＦＡＳＴＱ配列は、ＦＡＳＴＱＣを使用して調べられた。

【0135】

ＦＡＳＴＱ配列は、Ｈｉｓａｔ２（バージョン２．１．０）を以下の設定で使用してヒト参照アセンブリ（ｈｇ１９）に対してアラインされた：－－ｆｒ。次いで、アラインされたＳＡＭ配列をバイナリー（ｂｉｎａｒｙ）ＢＡＭ配列に変換し、インデックスを付け、Ｓａｍｔｏｏｌｓを使用してソーティングした。個々の試料からのＢＡＭファイルを合成し、Ｓａｍｔｏｏｌｓを使用してインデックスを付けた。アラインされた配列は、Ｓａｍｔｏｏｌｓのビューコマンドを使用してフィルター分けされ、非独自的にアラインされた読み取りを除いた（品質＞１）。

【0136】

転写物アセンブリは、以下のオプションでＳｔｒｉｎｇｔｉｅ（バージョン１．３．４．ｄ）を使用して合成した試料から産生された：（ｓｔｒａｎｄｅｄ）－－ｒｆ－ｆ０－ｊ２。ｇｆｆｒｅａｄ （ＧＦＦ ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）を使用して、単一のエクソン転写物は、アセンブリされた転写物から排除された。

【0137】

実施例３：リードＡＳＯの同定
ＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６．１標的配列を標的とし、かつ異なる骨格設計およびＲＮＡ修飾からなる１８個のＡＳＯが、潜在的なリードＡＳＯを同定するために設計された（表１７）。正常なｉＰＳＣ由来ニューロン（ＧＡＢＡ作動性）は、１０ポイントの１／２ｌｏｇ用量曲線の各ＡＳＯで治療され、ＩＣ５０およびＥ最大値を比較された。神経前駆細胞は１８ＤＩＶでニューロンに分化し、次いで、１０ポイントの１／２ｌｏｇ用量応答ＡＳＯ［１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、および３０μＭ（ｎ＝２）］で治療された。２４ＤＩＶにて、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳの定常状態ＲＮＡレベルが測定され、上記したように用量応答曲線が近似された（図８Ａおよび表１８）。用量応答曲線は有意に異なった（並列試験：Ｆ（５１，６０６）＝７．８６；ｐ＜０．０００１；Ｒ２＝０．９０）ので、相対的効力は推定されなかった。近似曲線の階層的なクラスター化は、ＡＳＯの３クラスターを明らかにし、クラスター１が９つの最も強力なＡＳＯを表した（図８Ｂおよび８Ｃ）。クラスター１の分析は、ＡＳＯが同様の曲線を有し（並列試験：Ｆ（２４，２９９）＝１．０１；ｐ＝０．５；Ｒ２＝０．９３）、ＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌが他のＡＳＯと比べて少なくとも３倍強力であることを示した（表１９）。しかし、さらなる分析は、ＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌ、ＡＳＯ－６．１．ＰＳ．Ｍ、およびＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｍが等価なＩＣ５０値を有するが、他のＡＳＯは若干効力が少ないことを示した（表２０）。相対的効力および内部選択基準に基づいて、ＡＳＯ－４．４．ＰＳ．ＬおよびＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｏがさらに調査された。

【表18】

【表19】

【表20】

【0138】

材料および方法
方法は、別記されない限り、実施例２で記載されたものと同様であった。

【0139】

実施例４：アンジェルマン症候群ｉＰＳＣニューロンにおけるＡＳＯ－６．１－ＰＯ－１．ＯおよびＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌの薬力学的分析
次いで、ＡＳＯ－６．１．ＰＳ．ＯおよびＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌの効力が、１５ｑ１１－ｑ１３領域の母方由来欠失を有するアンジェルマン症候群患者からのｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて調べられた。誘導多能性幹細胞は、ニューロンに分化し、次いで、１０ポイントの１／２ｌｏｇ用量曲線のＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．ＯおよびＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌ［１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、および３０μＭ（ｎ＝３）］で治療された。治療の６日後に、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳの定常状態ＲＮＡレベルが測定され、用量応答曲線が上記したように近似された（図９Ａ）。用量応答曲線は、ＡＳＯ間で同様であったが（並列試験：Ｆ（３，１３２）＝１．０７、ｐ＝０．４、Ｒ２＝０．８２）、ＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌ（４３７ｎＭ）はＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｏ（１．２２ｕＭ）よりもおよそ２．７倍だけより強力であった。ＩＣ５０値は等価であった［ＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｏ／ＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌ ＩＣ５０比：＝０．９６（信頼下限＝０．９；信頼上限＝１．０）］。Ｅ最大値は同様であった（３０μＭ：ＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌ＝０．０１±０．０００７；ＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｏ＝０．０５±０．００４）が、信頼区間［ＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｏ／ＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌ Ｅ最大比：＝－９．１（信頼下限＝－２２４；信頼上限＝２０５）］に起因して等価であるとは見なされなかった。

【0140】

材料および方法
方法は、別記されない限り、実施例２で記載されたものと同様であった。

【0141】

アンジェルマン症候群誘導多能性幹細胞由来ニューロン
アンジェルマン症候群ｉＰＳ細胞（ＡＧ１－０ ｉＰＳＣｓ）（ＥＣＮ００１、Ｋｅｒａｆａｓｔ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）は、ヒト胚性幹細胞培地［ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１１３３０－０５７、Ｇｉｂｃｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｄｕｂｌｉｎ、Ｉｒｅｌａｎｄ）、２０％のノックアウト血清リプレイスメント（１０８２８－０２８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１Ｘの非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ－グルタミン、７μｌ／ｍＬの２－メルカプトエタノール、および４μｇ／ｍＬの基礎線維芽細胞成長因子］中で、照射マウス胚性線維芽細胞と共培養された。初回継代では、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭヒトＥＳ／ｉＰＳ培地（ＳＣＭ１３０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）についての製品マニュアルに従って、ＡＧ１－０細胞が継代され、この培地は、フィーダーフリーであり、細胞を解離するためにＤｉｓｐａｓｅＩＩ（ＳＣＭ１３３、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を利用する。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ｈＥＳＣ適格性マトリックス（３５４２７７、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）を細胞外マトリックスとして使用した。第２の継代では、マトリックスは、ビクロネクチン（ＣＣ１３０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）に変更された。続く継代の間、分化した細胞がコロニーのおよそ＜５％を表すまで、分化の領域は手動で除去された。４回の続く継代の後、ＡＧ１－０細胞は、細胞外マトリックスとしてビクロネクチンを欠いているＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＥＳ／ｉＰＳ神経新生キット（ＳＣＲ６０３、ＳＣＭ１１０、およびＳＣＭ１１１）を使用して、分化された。初回継代はＥＺ－ＬｉＦＴ（ＳＣＭ１３９、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を用いて実施され、高品質のｉＰＳ細胞を得た。神経前駆細胞をステージゼロ（Ｐ０）で凍結し、その後、分化のために解凍した。分化は、ポリ－Ｄ－リジン（１０μｇ／ｍＬ）およびラミニン［１０μｇ／ｍＬ（２３０１７－０１５、Ｇｉｂｃｏ）でコーティングされた滅菌培養プレートにて、分化培地（ＳＣＭ１１１）中、分化の１０日間において実施された。いくつかの場合では、細胞は、セルラーダイナミクス維持培地（ＮＲＭ－１００－１２１－００１、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中で分化された。

【0142】

実施例５：ＡＳＯ－６．１－ＰＯ－１．Ｏ、およびＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌで処理したアンジェルマン症候群ｉＰＳＣニューロンにおけるＰＷＳ多シストロン性転写物の発現分析
ＡＳＯ－４．４．ＰＳ．ＬおよびＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｏが、ＰＷＳ多シストロン性転写物によりコードされるＲＮＡ転写物のレベルに影響を与えるかを決定するために、ＲＮＡ－配列決定が、各ＡＳＯで治療されたＡＳ ｉＰＳ細胞において実施され、ＳＮＵＲＦ、ＳＮＲＰＮ、ＳＮＯＲＤ１１６宿主遺伝子転写物（ＳＮＨＧ１１６）、ＳＮＯＲＤ１１６ ｓｎｏＲＮＡ、ＩＰＷ、ＳＮＯＲＤ１１５宿主遺伝子転写物（ＳＮＨＧ１１５）、ＳＮＯＲＤ１１５ ｓｎｏＲＮＡ、およびＵＢＥ３Ａ－ＡＳの定常状態ＲＮＡレベルが定量化された。ＵＢＥ３Ａ定常状態ＲＮＡレベルも測定された。アンジェルマン症候群ｉＰＳ細胞は上記したようにニューロンへと分化し、次いで、ビヒクル（１％のＨ２Ｏ、ｎ＝３）、ＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌ（３０ｕμＭ、ｎ＝３）およびＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｏ（３０μＭ、ｎ＝３）で治療された。治療の６日後、培養液から単離された総ＲＮＡ（ｒＲＮＡ枯渇した）に対して、ＲＮＡ ＲＮＡ－配列決定が実施された。ＳＮＨＧ１１６、ＳＮＨＧ１１５、およびＵＢＥ３Ａ－ＡＳ転写物の注釈を作製するために、トランスクリプトームが、ビヒクルＲＮＡ－ｓｅｑデータからアセンブリされ、次いで、参照遺伝子注釈へと組み込まれた。ビヒクルに対して、ＳＮＵＲＦ、ＳＮＲＰＮ、ＳＮＨＧ１１６、ＳＮＯＲＤ１１６ ｓｎｏＲＮＡ、およびＳＮＯＲＤ１１５ ｓｎｏＲＮＡの定常状態ＲＮＡレベルは同様であり、有意に異ならなかった。ＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｏではなく、ＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌは、ＩＰＷレベル（１．５倍）を減少したが、効果は有意ではなかった。ＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．ＯおよびＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌは、ＳＮＨＧ１１５およびＵＢＥ３Ａ－ＡＳ ＲＮＡレベルを有意に減少した。ＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．ＯおよびＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌは、ＳＮＨＧ１１５レベルに対して同様の効果を有した；しかし、ＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌは、ＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｏ（ＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌ：－６．１倍変化；ＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｏ：－２．８倍変化）よりも、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ ＲＮＡレベルに対してはるかに大きな効果を有した。ＡＳＯ治療は、ＵＢＥ３Ａ ＲＮＡレベルをおよそ１．２倍増大したが、効果は有意ではなかった（図１０および表２１）。

【表21】

【0143】

材料および方法
方法は、別記されない限り、実施例４で記載されたものと同様であった。

【0144】

ＰＷＳ ＲＮＡの示差的発現分析
ＲｅｆＳｅｑ遺伝子注釈の正規化されたＦＰＫＭ（１００万あたり１０００あたりの断片）値は、デフォルト設定および以下のオプションを用いるＣｕｆｆｎｏｒｍを使用して推定される：－ｕ。各遺伝子注釈のＦＰＫＭ値は、各試料についてアウトプットファイルから決定され、記述および推測統計のために使用された。

【0145】

実施例６：カニクイザルマカクにおけるＡＳＯ－６．１－ＰＯ－１．ＯおよびＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌの薬力学的分析
ＡＳＯ－４およびＡＳＯ－６標的領域は、いくつかの非ヒト霊長類（ＮＨＰ）種にわたって保存されており、故に、大型動物モデルにおける安全性および効率性の研究の両方が可能となる。中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＡＳＯ－４．４．ＰＳ．ＬおよびＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｏの効能を調べるために、ＡＳＯが、髄腔内腰部穿刺によりカニクイザルマカクへ送達された。動物は、ビヒクル（０．９％の食塩水、ｎ＝５）、ＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｏ（１０ｍｇ、ｎ＝３）、およびＡＳＯ．４．４．ＰＳ．Ｌ（１０ｍｇ、ｎ＝３）の単回ボーラス注射を投与された。治療の２８日後、中枢神経（ＣＮＳ）組織が収集され、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳの定常状態ＲＮＡレベルが測定された。総じて、ＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌは、ＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｏよりも、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ ＲＮＡレベルに対してより大きな効果を有した（表２２）。ＡＳＯ－４．４．ＰＳ．Ｌは、大部分のＣＮＳ領域においてＵＢＥ３Ａ－ＡＳ ＲＮＡを減少し、側頭葉、一次運動皮質、脳橋、髄、海馬、淡蒼球、前頭皮質（放射冠）、前頭前野、および脊髄腰部において大きな効果を有した。同様に、ＡＳＯ－６．１．ＰＯ－１．Ｏは、大部分のＣＮＳ領域においてＵＢＥ３Ａ－ＡＳ ＲＮＡレベルを減少し、大きな効果は、脳橋、動眼神経核、および脊髄腰部において観察された（図１１および表２３）。

【表22】

【表23】

【0146】

材料および方法
ＡＳＯの投与
ＮＨＰ研究は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにて、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓの各制度により認可されたプロトコルを使用して実施された。２～４ｋｇの体重の雄および雌カニクイザルマカク（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を麻酔し、単回１ｍＬ用量のＡＳＯまたはビヒクルを髄腔内腰部穿刺により投与した。ビヒクル対照品目（０．９％の塩化ナトリウム）中に凍結乾燥したＡＳＯを溶解させることにより、投与用溶液を調製し、０．２μｍのフィルターを介して濾過した。ＣＮＳおよび脊髄試料を回収し、ＣＮＳを４ｍｍの冠状スライスに切片化した。組織試料を即時凍結し、ＲＮＡ単離まで－８０℃で貯蔵した。

【0147】

ＲＮＡ単離
４ｍｍの組織パンチを目的の各領域から採取し、そのおよそ半分はＲＮＡ単離のために使用した。ＲＮＡ単離は、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙプラスミニキット（７４１３６、Ｑｉａｇｅｎ）を使用して実施され、組織崩壊および溶解は、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ中の５ｍｍのステンレススチールビーズを用いて実施された。ＲＮＡは、２容積の３０μｌの水中に溶離され、全溶離容積は６０μｌとなった。ＲＮＡは、ＱｕｂｉｔおよびＲＮＡ ＸＲアッセイ（Ｑ３３２２４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量化された。ｃＤＮＡは、高性能ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡキット（４３８７４０６、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を全反応容積５０μｌで使用して、２μｇのインプットＲＮＡから合成された。

【0148】

組織におけるＵＢＥ３Ａ－ＡＳ ＲＮＡレベルの分析
カニクイザルマカクのＵＢＥ３Ａ－ＡＳ ＲＮＡレベルは、ＳＹＢＲ緑色定量的リバース－転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を使用して推定された。全反応容積は、１０μｌであり、２μｌのｃＤＮＡ、１ＸのＰｏｗｅｒＵｐ ＳＹＢＲグリーンマスターミックス（Ａ２５７４１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および５００ｎＭの各プライマー（フォワードおよびリバース）を含んだ。サイクリング条件は、５０℃で２分間、９５℃で２分間、ならびに９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の４０サイクルであり、各サイクルの６０℃での工程において読み取りが行われた。反応は、ＢＩＯ－ＲＡＤ Ｔ１０００ ＣＦＸ９６サーモサイクラーで実行され、内部対照（ＰＰＩＡ、フォワード：ＧＴＣＴＣＣＴＴＣＧＡＧＣＴＧＴＴＴＧＣ （配列番号５０３）；リバース：ＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＡ （配列番号５０４））および標的（ＵＢＥ３Ａ－ＡＳ、フォワード：ＣＣＴＧＴＧＡＡＣＴＴＴＣＡＡＣＣＡＧＧＡ （配列番号５０５）；リバース：ＧＧＡＴＣＡＧＡＣＴＣＣＡＧＧＣＣＴＴＣ（配列番号５０６））反応が別々に実施された。データが回収され、初期分析がＢＩＯＲＡＤ ＣＦＸ Ｍａｅｓｔｒｏソフトウェアを用いて実施され、深層統計分析は、ＥｘｃｅｌおよびＪＭＰを用いて実施された。

【0149】

実施例７：スプライスされたＵＢＥ３Ａ－ＡＳ転写物のエクソン境界を標的とするＡＳＯ
いくつかの実施形態では、標的配列は、ＵＢＥ３Ａ－ＡＳエクソン１～５およびＳＮＯＲＤ１０９Ｂエクソン１～２を含むエクソン境界である。標的配列は、各エクソン（隣接エクソンの５’および３’－末端を表す１９個のヌクレオチド）のエクソンの境界を中心として配置する３８個のヌクレオチド（各エクソンの１９個のヌクレオチド）からなる。セグメント１～２、２～３、３～４、５～６、７～８、９～１０、および１１～１２を含むエクソン境界を伴う、１２セグメントの配列が存在した。染色体コーディネートは表２４に提供される。スプライスされたエクソン（｜、エクソンのジャンクション）および介入エクソンの配列（［］）を示す単一の合成されたジャンクション配列が作製された。エクソンのジャンクションを標的とするＡＳＯ（２０－、１９、および１８－ｍｅｒ）は、表２５に提供される。

【0150】

合成されたジャンクション配列
ＡＡＴＧＡＡＡＴＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＧ｜ＴＡＡＧＡＣＡＴＧＣＴＧＣＣＡＡＧＡＧ［］ＡＴＴＡＧＴＴＴＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＧ｜ＧＡＴＡＡＡＧＡＣＴＧＣＴＧＡＧＡＡＧ［］ＧＴＴＴＡＡＧＧＡＴＧＣＴＡＴＴＣＴＧ｜ＡＡＡＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡ［］ＴＴＡＡＧＧＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧ｜ＧＡＴＡＡＧＧＡＴＧＡＣＴＧＡＧＧＡＡ［］ＡＴＴＴＡＡＧＧＡＴＧＣＣＡＣＴＣＴＧ｜ＧＴＴＡＡＡＡＧＣＴＧＡＡＡＣＡＡＣＴ［］ＧＡＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＡＡＡＡＧＡＧ｜ＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＡＴＣＣ（配列番号４８９）。
｜＝３’－５’ エクソンのジャンクション
［］＝介入エクソンの配列

【表24】

【表25】

【0151】

実施例８：ＵＢＥ３ａ－ＡＳエクソン１～５を標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲガイド
上記するように、いくつかの実施形態では、開示されたオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列を阻害、変異、または欠失する機能的核酸、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはヌクレアーゼｇＲＮＡである。

【0152】

ＵＢＥ３ａ－ＡＳエクソン１～５を標的とするｓｉＲＮＡの実施例は、表２６において提供される。ＵＢＥ３ａ－ＡＳエクソン１～５を標的とするｓｈＲＮＡの実施例は、表２７において提供される。ＵＢＥ３ａ－ＡＳエクソン１～５を標的とするｇＲＮＡの実施例は、表２８において提供される。

【表26】

【表27】

【表28】

【0153】

別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、開示された本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書で引用された刊行物およびそれらが引用した材料は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。

【0154】

当業者であれば、単に慣用的な実験手法を使用することで、本明細書で記載された特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または、それらを確認することができるだろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図される。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A-4C】

【図4D-4F】

【図4G】

【図4H】

【図4I】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図6A】

【図6B-6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D-7F】

【図7G】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

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