(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-06-16
(45)【発行日】2023-06-26
(54)【発明の名称】抗突然変異ＫＲＡＳ Ｔ細胞受容体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20230619BHJP
C07K 14/725 20060101ALI20230619BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20230619BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230619BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230619BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20230619BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20230619BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
C07K14/725 ZNA
C12N15/85 Z
C12N5/10
A61P35/00
A61K38/17 100
A61K39/00 Z
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2021063092
(22)【出願日】2021-04-01
(62)【分割の表示】P 2017527874の分割
【原出願日】2015-11-24
(65)【公開番号】P2021104044
(43)【公開日】2021-07-26
【審査請求日】2021-04-26
(31)【優先権主張番号】62/084,654
(32)【優先日】2014-11-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/171,321
(32)【優先日】2015-06-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】510002280
【氏名又は名称】アメリカ合衆国
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(72)【発明者】
【氏名】ワン、チョン ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】ユ、ジヤ
(72)【発明者】
【氏名】ヤン、ジェームズ シー．
【審査官】中野 あい
(56)【参考文献】
【文献】特表２００１－５１４１９０（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許第０７７０９００２（ＵＳ，Ｂ１）
【文献】EUROPEAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY，1996年02月，VOL:26, NR:2，PAGE(S):435-443，http://dx.doi.org/10.1002/eji.1830260225
【文献】Vaccine, 2003 Oct 1, vol. 21, no. 27-30, pp. 4285-4296
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
哺乳動物における、ＶＶＶＧＡＤＧＶＧＫ（配列番号２）、ＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（配列番号３３）又はＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含む突然変異エピトープを発現するがんを治療又は予防するための組成物であって、該組成物は突然変異エピトープに対し抗原特異性を有する、単離又は精製されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含み、
該突然変異エピトープは、（ａ）ＶＶＶＧＡＤＧＶＧＫ（配列番号２）を含むか、又は（ｂ）ＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（配列番号３３）又はＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（配列番号３５）から成り、
ＴＣＲが、ＨＬＡ－Ａ１１分子に関連して提示される突然変異エピトープに対し抗原特異性を有し、及び
(a)配列番号３のアミノ酸配列を含むα鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号４のアミノ酸配列を含むα鎖ＣＤＲ２、配列番号５のアミノ酸配列を含むα鎖ＣＤＲ３、配列番号６のアミノ酸配列を含むβ鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含むβ鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸配列を含むβ鎖ＣＤＲ３；
(b)配列番号１２５のアミノ酸配列を含むα鎖ＣＤＲ１、配列番号１２６のアミノ酸配列を含むα鎖ＣＤＲ２、配列番号１２７のアミノ酸配列を含むα鎖ＣＤＲ３、配列番号１２８のアミノ酸配列を含むβ鎖ＣＤＲ１、配列番号１２９のアミノ酸配列を含むβ鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３０のアミノ酸配列を含むβ鎖ＣＤＲ３；
(c)配列番号１３７のアミノ酸配列を含むα鎖ＣＤＲ１、配列番号１３８のアミノ酸配列を含むα鎖ＣＤＲ２、配列番号１３９のアミノ酸配列を含むα鎖ＣＤＲ３、配列番号１４０のアミノ酸配列を含むβ鎖ＣＤＲ１、配列番号１４１のアミノ酸配列を含むβ鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４２のアミノ酸配列を含むβ鎖ＣＤＲ３；
(d)配列番号１４９のアミノ酸配列を含むα鎖ＣＤＲ１、配列番号１５０のアミノ酸配列を含むα鎖ＣＤＲ２、配列番号１５１のアミノ酸配列を含むα鎖ＣＤＲ３、配列番号１５２のアミノ酸配列を含むβ鎖ＣＤＲ１、配列番号１５３のアミノ酸配列を含むβ鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５４のアミノ酸配列を含むβ鎖ＣＤＲ３；又は
(e)配列番号１４９のアミノ酸配列を含むα鎖ＣＤＲ１、配列番号１５０のアミノ酸配列を含むα鎖ＣＤＲ２、配列番号２０７のアミノ酸配列を含むα鎖ＣＤＲ３、配列番号１５２のアミノ酸配列を含むβ鎖ＣＤＲ１、配列番号１５３のアミノ酸配列を含むβ鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５４のアミノ酸配列を含むβ鎖ＣＤＲ３を含む。
【請求項2】
ＴＣＲが
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むα鎖可変領域、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むβ鎖可変領域；
（ｂ）配列番号１３１のアミノ酸配列を含むα鎖可変領域、及び配列番号１３２のアミノ酸配列を含むβ鎖可変領域；
（ｃ）配列番号１４３のアミノ酸配列を含むα鎖可変領域、及び配列番号１４４のアミノ酸配列を含むβ鎖可変領域；
（ｄ）配列番号１５５のアミノ酸配列を含むα鎖可変領域、及び配列番号１５６のアミノ酸配列を含むβ鎖可変領域；又は
（ｅ）配列番号２０８のアミノ酸配列を含むα鎖可変領域、及び配列番号１５６のアミノ酸配列を含むβ鎖可変領域
を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項3】
ＴＣＲが
（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むα鎖定常領域、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むβ鎖定常領域；
（ｂ）配列番号１３５のアミノ酸配列を含むα鎖定常領域、及び配列番号１３６のアミノ酸配列を含むβ鎖定常領域；
（ｃ）配列番号１４７のアミノ酸配列を含むα鎖定常領域、及び配列番号１４８のアミノ酸配列を含むβ鎖定常領域；又は
（ｄ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含むα鎖定常領域、及び配列番号１６０のアミノ酸配列を含むβ鎖定常領域
を含む、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項4】
ＴＣＲが
（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むα鎖、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むβ鎖；
（ｂ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含むα鎖、及び配列番号１３４のアミノ酸配列を含むβ鎖；
（ｃ）配列番号１４５のアミノ酸配列を含むα鎖、及び配列番号１４６のアミノ酸配列を含むβ鎖；
（ｄ）配列番号１５７のアミノ酸配列を含むα鎖、及び配列番号１５８のアミノ酸配列を含むβ鎖；又は
（ｅ）配列番号２０９のアミノ酸配列を含むα鎖、及び配列番号１５８のアミノ酸配列を含むβ鎖
を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項5】
ＴＣＲが、ＶＶＶＧＡＤＧＶＧＫ（配列番号２）を含む突然変異エピトープに対し抗原特異性を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項6】
ＴＣＲが、ＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（配列番号３３）又はＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（配列番号３５）から成る突然変異エピトープに対し抗原特異性を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項7】
ＴＣＲが
（ａ）配列番号３～５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、及び配列番号６～８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；
（ｂ）配列番号１２５～１２７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、及び配列番号１２８～１３０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；
（ｃ）配列番号１３７～１３９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、及び配列番号１４０～１４２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；
（ｄ）配列番号１４９～１５１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、及び配列番号１５２～１５４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；又は
（ｅ）配列番号１４９、１５０及び２０７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、及び配列番号１５２～１５４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖
を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項8】
ＴＣＲが
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；
（ｂ）配列番号１３１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、及び配列番号１３２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；
（ｃ）配列番号１４３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、及び配列番号１４４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；
（ｄ）配列番号１５５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、及び配列番号１５６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；又は
（ｅ）配列番号２０８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、及び配列番号１５６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖
を含む、請求項７記載の組成物。
【請求項9】
ＴＣＲが
（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；
（ｂ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、及び配列番号１３４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；
（ｃ）配列番号１４５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、及び配列番号１４６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；
（ｄ）配列番号１５７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、及び配列番号１５８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；又は
（ｅ）配列番号２０９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、及び配列番号１５８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖
を含む、請求項７又は８に記載の組成物。
【請求項10】
ＴＣＲが、単離又は精製された核酸にコードされている、請求項１～９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項11】
該核酸が組換え発現ベクターに含まれる、請求項１０記載の組成物。
【請求項12】
該組換え発現ベクターが宿主細胞内にある、請求項１１記載の組成物。
【請求項13】
該宿主細胞がヒトのである、請求項１２記載の組成物。
【請求項14】
該組成物が、細胞集団内の少なくとも１つの宿主細胞を含む、請求項１２又は１３記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１４年１１月２６日出願の米国仮特許出願第６２／０８４，６５４号及び２０１５年６月５日出願の米国仮特許出願第６２／１７１，３２１号（それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
本特許出願は、２０１４年１１月２６日出願の米国仮特許出願第６２／０８４，６５４号及び２０１５年６月５日出願の米国仮特許出願第６２／１７１，３２１号（それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
【0002】
電子提出された物件の参照による組み込み
本明細書と同時提出され、且つ、以下の通り識別されるコンピューター可読のヌクレオチド／アミノ酸の配列表が、参照により、本明細書にその全体が組み込まれる：２０１５年１１月２０日付ファイル名「７２２２６１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、２３１，１６４バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル１件。
本明細書と同時提出され、且つ、以下の通り識別されるコンピューター可読のヌクレオチド／アミノ酸の配列表が、参照により、本明細書にその全体が組み込まれる：２０１５年１１月２０日付ファイル名「７２２２６１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、２３１，１６４バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル１件。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
ある種のがんは、特に、がんが転移性で切除不能になった場合、治療選択肢が非常に限られる場合がある。例えば、手術、化学療法、及び放射線療法等の治療の進歩にもかかわらず、例えば膵臓がん、結腸直腸がん、肺がん、子宮内膜がん、卵巣がん及び前立腺がん等の多くのがんの予後は、不良な場合がある。従って、がんに対するさらなる治療について、満たされていないニーズがある。
ある種のがんは、特に、がんが転移性で切除不能になった場合、治療選択肢が非常に限られる場合がある。例えば、手術、化学療法、及び放射線療法等の治療の進歩にもかかわらず、例えば膵臓がん、結腸直腸がん、肺がん、子宮内膜がん、卵巣がん及び前立腺がん等の多くのがんの予後は、不良な場合がある。従って、がんに対するさらなる治療について、満たされていないニーズがある。
【発明の概要】
【0004】
発明の要旨
本発明の一実施形態は、突然変異エピトープに対し抗原特異性を有する、単離又は精製されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、突然変異エピトープが、（ａ）ＶＶＶＧＡＤＧＶＧＫ（配列番号２）を含むか、又は（ｂ）ＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（配列番号３３）若しくはＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（配列番号３５）から成る、ＴＣＲを提供する。
本発明の一実施形態は、突然変異エピトープに対し抗原特異性を有する、単離又は精製されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、突然変異エピトープが、（ａ）ＶＶＶＧＡＤＧＶＧＫ（配列番号２）を含むか、又は（ｂ）ＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（配列番号３３）若しくはＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（配列番号３５）から成る、ＴＣＲを提供する。
【0005】
本発明は、本発明のＴＣＲに関連する、関連のポリペプチド及びタンパク質並びに関連の核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団及び医薬組成物を更に提供する。
【0006】
本発明により、哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法、及び哺乳動物におけるがんを治療又は予防する方法が、更に提供される。
【発明を実施するための形態】
【0007】
発明の詳細な説明
カーステン・ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）（ＧＴＰａｓｅ ＫＲａｓ、Ｖ－Ｋｉ－Ｒａｓ２カーステン・ラット肉腫ウイルスがん遺伝子、又はＫＲＡＳ２とも呼ばれる）は、低分子量ＧＴＰａｓｅスーパーファミリーのメンバーである。ＫＲＡＳの２つの転写産物変異体：ＫＲＡＳ変異体Ａ及びＫＲＡＳ変異体Ｂが存在する。以降、「ＫＲＡＳ」（突然変異型又は非突然変異型）への言及は、別段の指定がない限り、変異型Ａ及び変異型Ｂの両方を指す。特定の理論又はメカニズムには縛られないが、ＫＲＡＳは、突然変異した場合、多くのヒトがんの発がんにおいて、初期に、シグナル伝達に関与すると考えられている。単一のアミノ酸置換が突然変異を活性化し得る。活性化されると、突然変異ＫＲＡＳはグアノシン－５’－三リン酸（ＧＴＰ）に結合し、ＧＴＰをグアノシン５’－二リン酸（ＧＤＰ）に変換する。突然変異ＫＲＡＳタンパク質産物は、構成的に活性化され得る。突然変異ＫＲＡＳタンパク質は、例えば、膵臓がん（例、膵臓上皮がん（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ））、結腸直腸がん、肺がん（例、肺
腺がん）、子宮内膜がん、卵巣がん（例、上皮性卵巣がん）及び前立腺がん等の様々なヒトのがんのいずれかにおいても発現し得る。
カーステン・ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）（ＧＴＰａｓｅ ＫＲａｓ、Ｖ－Ｋｉ－Ｒａｓ２カーステン・ラット肉腫ウイルスがん遺伝子、又はＫＲＡＳ２とも呼ばれる）は、低分子量ＧＴＰａｓｅスーパーファミリーのメンバーである。ＫＲＡＳの２つの転写産物変異体：ＫＲＡＳ変異体Ａ及びＫＲＡＳ変異体Ｂが存在する。以降、「ＫＲＡＳ」（突然変異型又は非突然変異型）への言及は、別段の指定がない限り、変異型Ａ及び変異型Ｂの両方を指す。特定の理論又はメカニズムには縛られないが、ＫＲＡＳは、突然変異した場合、多くのヒトがんの発がんにおいて、初期に、シグナル伝達に関与すると考えられている。単一のアミノ酸置換が突然変異を活性化し得る。活性化されると、突然変異ＫＲＡＳはグアノシン－５’－三リン酸（ＧＴＰ）に結合し、ＧＴＰをグアノシン５’－二リン酸（ＧＤＰ）に変換する。突然変異ＫＲＡＳタンパク質産物は、構成的に活性化され得る。突然変異ＫＲＡＳタンパク質は、例えば、膵臓がん（例、膵臓上皮がん（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ））、結腸直腸がん、肺がん（例、肺
腺がん）、子宮内膜がん、卵巣がん（例、上皮性卵巣がん）及び前立腺がん等の様々なヒトのがんのいずれかにおいても発現し得る。
【0008】
本発明の一実施形態は、突然変異ヒトＫＲＡＳ（以降、「突然変異ＫＲＡＳ」）に対し抗原特異性を有する、単離又は精製されたＴＣＲを提供する。以降、「ＴＣＲ」への言及は、別段明示されない限り、ＴＣＲの機能的部分及び機能的変異体も指す。本発明のＴＣＲは、任意の突然変異ＫＲＡＳタンパク質、ポリペプチド又はペプチドに対し抗原特異性を有し得る。本発明の一実施形態においては、ＴＣＲは、配列番号１、３２、１２２又は１２３のアミノ酸配列を含むか、又はから成る突然変異ＫＲＡＳタンパク質に対し抗原特異性を有する。配列番号１及び３２の各々の突然変異ＫＲＡＳ変異体Ａタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１及び３２において、１２位のグリシンが、それぞれアスパラギン酸又はバリンに置換されていること以外は、通常、配列番号２９の未変異の野生型（ＷＴ）ＫＲＡＳタンパク質変異体Ａのアミノ酸配列の１～１８９位に対応する。配列番号１２２及び１２３の各々の突然変異ＫＲＡＳ変異体Ｂタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１２２及び１２３において、１２位のグリシンが、それぞれアスパラギン酸又はバリンに置換されていること以外は、通常、配列番号１２１の未変異のＷＴ ＫＲＡＳタンパク質変異体Ｂのアミノ酸配列の１～１８８位に対応する。本発明の好ましい実施形態においては、ＴＣＲは、ＶＶＶＧＡＤＧＶＧＫ（配列番号２）又はＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むか、又はから成る突然変異ＫＲＡＳ７－１６ペプチドに対し抗原特異性を有する。配列番号２及び３３の突然変異ＫＲＡＳペプチドアミノ酸配列は、配列番号２及び３３において、６位のグリシンが、それぞれアスパラギン酸又はバリンに置換されていること以外は、通常、配列番号３０の未変異のＷＴ ＫＲＡＳ７－１６ペプチドアミノ酸配列の１位～１０位に対応する。本発明の一実施形態においては、ＴＣＲは、ＶＶＧＡＤＧＶＧＫ（配列番号３４）ＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むか又はから成る突然変異ＫＲＡＳ８－１６ペプチドに対し抗原特異性を有する。配列番号３４及び３５の突然変異ＫＲＡＳペプチドアミノ酸配列は、配列番号３４及び３５において、５位のグリシンが、それぞれアスパラギン酸又はバリンに置換されていること以外は、通常、配列番号３１の未変異のＷＴ ＫＲＡＳ８－１６ペプチドアミノ酸配列の１～９位に対応する。好ましい実施形態においては、ＴＣＲは、突然変異ＫＲＡＳエピトープに対する抗原特異性を有し、突然変異ＫＲＡＳエピトープは、（ａ）ＶＶＶＧＡＤＧＶＧＫ（配列番号２）を含むか、又は（ｂ）ＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（配列番号３３）若しくはＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（配列番号３５）から成る。特に好ましい実施形態においては、ＴＣＲは、ＶＶＶＧＡＤＧＶＧＫ（配列番号２）を含む突然変異ＫＲＡＳエピトープに対し抗原特異性を有する。別の好ましい実施形態においては、ＴＣＲは、ＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（配列番号３３）又はＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（配列番号３５）から成る突然変異ＫＲＡＳエピトープに対し抗原特異性を有する。突然変異ＫＲＡＳアミノ酸配列ＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（配列番号３３）及びＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（配列番号３５）は、本明細書においては、「ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ」とも呼ばれる。突然変異ＫＲＡＳアミノ酸配列ＶＶＶＧＡＤＧＶＧＫ（配列番号２）及びＶＶＧＡＤＧＶＧＫ（配列番号３４）は、本明細書においては、「ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ」とも呼ばれる。
【0009】
本明細書に記載の、突然変異ＫＲＡＳエピトープのアミノ酸配列は、ヒトのがんにおける他の２つの突然変異型がん遺伝子、神経芽細胞腫ＲＡＳウイルス（Ｖ－Ｒａｓ）がん遺伝子ホモログ（ＮＲＡＳ）及びハーベイラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＨＲＡＳ）にも見出される。突然変異ヒトＮＲＡＳ及び突然変異ヒトＨＲＡＳのアミノ酸配列は、本明細書に記載の突然変異ヒトＫＲＡＳエピトープ配列を含有する。従って、本発明の一実施形態においては、本発明のＴＣＲは、突然変異ヒトＮＲＡＳ及びＨＲＡＳに対する抗原特異性も有する。突然変異ヒトＫＲＡＳ、突然変異ヒトＮＲＡＳ、及び突然変異ヒトＨＲＡＳは、本明細書では集合的に「突然変異標的（複数可）」と呼ばれる。
【0010】
本発明の一実施形態においては、本発明のＴＣＲは、突然変異標的（例、突然変異ＫＲＡＳ）を、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ依存的様態で認識することができる。「ＭＨＣクラスＩ依存的様態」は、本明細書で用いる場合、ＭＨＣクラスＩ分子関連の範囲内で、ＴＣＲが、突然変異標的（例、突然変異ＫＲＡＳ）への結合に際して、免疫応答を誘発することを意味する。ＭＨＣクラスＩ分子は、当該技術分野で公知の任意のＭＨＣクラスＩ分子（例、ＨＬＡ－Ａ分子）であり得る。本発明の好ましい実施形態においては、ＴＣＲは、ＨＬＡ－Ａ１１分子に関連して提示される突然変異エピトープに対し抗原特異性を有する。
【0011】
本発明のＴＣＲは、養子細胞移入用に用いられる細胞に発現する場合を含め、多くの利点を提供する。突然変異ＫＲＡＳ、突然変異ＮＲＡＳ、及び突然変異ＨＲＡＳは、がん細胞に発現し、正常な非がん性細胞には発現しない。特定の理論又はメカニズムに縛られないが、本発明のＴＣＲは、好都合なことに、正常な非がん性細胞の破壊を最小限にし、又はなくし、それによって、毒性を、例えば最小限にし又はなくすことによって、低減しつつ、がん細胞の破壊を目的とすると考えられている。更に、本発明のＴＣＲは、好都合なことに、例えば化学療法、外科手術、又は放射線療法等の他のタイプの治療に応答しない突然変異ＫＲＡＳ陽性がん、突然変異ＮＲＡＳ陽性がん、及び突然変異ＨＲＡＳ陽性がんのうちの１つ以上を首尾よく治療又は予防し得る。更に、本発明のＴＣＲは、結合活性が非常に高い、突然変異ＫＲＡＳ、突然変異ＮＲＡＳ、及び突然変異ＨＲＡＳのうちの１つ以上の認識を提供し得、これは、未操作腫瘍細胞（例、インターフェロン（ＩＦＮ）－γで治療されていない、突然変異ＫＲＡＳ及びＨＬＡ－Ａ１１の一方又は両方をコードするベクターでトランスフェクションされていない、突然変異ＫＲＡＳ７－１６又は突然変異ＫＲＡＳ８－１６ペプチドでパルスされていない、又はそれらの組合せの、腫瘍細胞）を認識する能力を提供し得る。
【0012】
語句「抗原特異性」は、本明細書で用いる場合、ＴＣＲが、突然変異標的（例、突然変異ＫＲＡＳ）に、高い結合活性により特異的に結合でき、また免疫学的に認識できることを意味する。例えば、ＴＣＲは、（ａ）低濃度の突然変異標的ペプチド（例、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、０．０５ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、又は上記の値のうちの任意の２つによって規定される範囲）でパルスした抗原陰性ＨＬＡ－Ａ１１＋標的細胞又は（ｂ）標的細胞が突然変異標的を発現するように、突然変異標的をコードするヌクレオチド配列が導入された抗原陰性ＨＬＡ－Ａ１１＋標的細胞との共培養の際に、ＴＣＲを発現するＴ細胞が少なくとも約２００ｐｇ／ｍＬ以上（例、２００ｐｇ／ｍＬ以上、３００ｐｇ／ｍＬ以上、４００ｐｇ／ｍＬ以上、５００ｐｇ／ｍＬ以上、６００ｐｇ／ｍＬ以上、７００ｐｇ／ｍＬ以上、１０００ｐｇ／ｍＬ以上、５，０００ｐｇ／ｍＬ以上、７，０００ｐｇ／ｍＬ以上、１０，０００ｐｇ／ｍＬ以上、２０，０００ｐｇ／ｍＬ以上、又は上記の値のうちの任意の２つによって規定される範囲）のＩＦＮ－γを分泌する場合、突然変異標的について「抗原特異性」を有すると考えられ得る。本発明のＴＣＲを発現する細胞は、より高濃度の突然変異標的ペプチドでパルスした抗原陰性ＨＬＡ－Ａ１１＋標的細胞との共培養の際も、ＩＦＮ－γを分泌し得る。
【0013】
代替的に又は追加的に、ＴＣＲを発現するＴ細胞が、（ａ）低濃度の突然変異標的ペプチドでパルスした抗原陰性ＨＬＡ－Ａ１１＋標的細胞又は（ｂ）標的細胞が突然変異標的を発現するように、突然変異標的をコードするヌクレオチド配列が導入された抗原陰性ＨＬＡ－Ａ１１＋標的細胞と共培養した際に、ネガティブコントロールに発現したＩＦＮ－γの量と比較して、少なくとも２倍の多さのＩＦＮ－γを分泌する場合、ＴＣＲは、突然変異標的に対し「抗原特異性」を有すると考えられ得る。ネガティブコントロールは、例えば、（ｉ）（ａ）同濃度の、関係性の無いペプチド（例、突然変異標的ペプチドと異なる配列を有する他の何らかのペプチド）でパルスした抗原陰性ＨＬＡ－Ａ１１＋標的細胞
又は（ｂ）標的細胞が関係性の無いペプチドを発現するように、関係性の無いペプチドをコードするヌクレオチド配列が導入された抗原陰性ＨＬＡ－Ａ１１＋標的細胞と共培養した、ＴＣＲを発現するＴ細胞、或いは（ｉｉ）（ａ）同濃度の突然変異標的ペプチドでパルスした抗原陰性ＨＬＡ－Ａ１１＋標的細胞又は（ｂ）標的細胞が突然変異標的を発現するように、突然変異標的をコードするヌクレオチド配列が導入された抗原陰性ＨＬＡ－Ａ１１＋標的細胞と共培養した、非形質導入Ｔ細胞（例、ＴＣＲを発現しないで、ＰＢＭＣに由来する）であり得る。ＩＦＮ－γ分泌は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等の、当該技術分野で公知の方法により測定され得る。
又は（ｂ）標的細胞が関係性の無いペプチドを発現するように、関係性の無いペプチドをコードするヌクレオチド配列が導入された抗原陰性ＨＬＡ－Ａ１１＋標的細胞と共培養した、ＴＣＲを発現するＴ細胞、或いは（ｉｉ）（ａ）同濃度の突然変異標的ペプチドでパルスした抗原陰性ＨＬＡ－Ａ１１＋標的細胞又は（ｂ）標的細胞が突然変異標的を発現するように、突然変異標的をコードするヌクレオチド配列が導入された抗原陰性ＨＬＡ－Ａ１１＋標的細胞と共培養した、非形質導入Ｔ細胞（例、ＴＣＲを発現しないで、ＰＢＭＣに由来する）であり得る。ＩＦＮ－γ分泌は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等の、当該技術分野で公知の方法により測定され得る。
【0014】
代替的に又は追加的に、（ａ）低濃度の突然変異標的ペプチドでパルスした抗原陰性ＨＬＡ－Ａ１１＋標的細胞又は（ｂ）標的細胞が突然変異標的を発現するように、突然変異標的をコードするヌクレオチド配列が導入された抗原陰性ＨＬＡ－Ａ１１＋標的細胞と共培養した際に、ＩＦＮ－γを分泌するネガティブコントロールＴ細胞の数と比較して、少なくとも２倍の多さの数の、ＴＣＲを発現するＴ細胞がＩＦＮ－γを分泌する場合、ＴＣＲは、突然変異標的に対し「抗原特異性」を有すると考えられ得る。ペプチド及びネガティブコントロールの濃度は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通りであり得る。ＩＦＮ－γを分泌する細胞の数は、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ等の、当該技術分野で公知の方法により測定され得る。
【0015】
本発明は、ＴＣＲのアルファ（α）鎖、ＴＣＲのベータ（β）鎖、ＴＣＲのガンマ（γ）鎖、ＴＣＲのデルタ（δ）鎖、又はそれらの組合せ等の、２ポリペプチド（即ち、ポリペプチド鎖）を含むＴＣＲを提供する。本発明のＴＣＲのポリペプチドは、ＴＣＲが、突然変異標的（例、突然変異ＫＲＡＳ）に対し抗原特異性を有するならば、任意のアミノ酸配列を含み得る。
【0016】
本発明の一実施形態においては、ＴＣＲは２つのポリペプチド鎖を含み、その各々が、ＴＣＲの相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む可変領域を含む。本発明の一実施形態においては、ＴＣＲは：（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ１）、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ２）、及び配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ３）を含む第１のポリペプチド鎖、並びに、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ１）、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ２）、及び配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３）を含む第２のポリペプチド鎖；（ｂ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含む抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ１、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ２、配列番号１２７のアミノ酸配列を含む抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ３を含む第１のポリペプチド鎖、並びに、配列番号１２８のアミノ酸配列を含む抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ１、配列番号１２９のアミノ酸配列を含む抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ２、及び配列番号１３０のアミノ酸配列を含む抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３を含む第２のポリペプチド鎖；（ｃ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含む抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ１、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ２、配列番号１３９のアミノ酸配列を含む抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ３を含む第１のポリペプチド鎖、並びに、配列番号１４０のアミノ酸配列を含む抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ１、配列番号１４１のアミノ酸配列を含む抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ２、及び配列番号１４２のアミノ酸配列を含む抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３を含む第２のポリペプチド鎖；又は（ｄ）配列番号１４９のアミノ酸配列を含む抗ＫＲＡＳ
Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ１、配列番号１５０のアミノ酸配列を含む抗ＫＲＡＳ
Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ２、配列番号１５１のアミノ酸配列を含む抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ３を含む第１のポリペプチド鎖、並びに、配列番号１５２のアミノ酸配列を含む抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ１、配列番号１５３のアミノ酸配列を含む抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ２、及び配列番号１５４のアミノ酸配列を含む抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３を含む第２のポリペプチド鎖を含む。これに関して、本発明のＴＣＲは、配列番号３～８；１２５～１３０；１３７～１４２；及び１４９～１５４から成る群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つ以上を含み得る。好ましくは、ＴＣＲは、配列番号３～５；配列番号６～８；配列番号１２５～１２７；配列番号１２８～１３０；配列番号１３７～１３９；配列番号１４０～１４２；配列番号１４９～１５１；又は配列番号１５２～１５４のアミノ酸配列を含む。特に好ましい実施形態においては、ＴＣＲは、（ａ）配列番号３～８の全て；（ｂ）配列番号１２５～１３０の全て；（ｃ）配列番号１３７～１４２の全て；（ｄ）配列番号１４９～１５４の全てのアミノ酸配列を含む。
Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ１、配列番号１５０のアミノ酸配列を含む抗ＫＲＡＳ
Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ２、配列番号１５１のアミノ酸配列を含む抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ３を含む第１のポリペプチド鎖、並びに、配列番号１５２のアミノ酸配列を含む抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ１、配列番号１５３のアミノ酸配列を含む抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ２、及び配列番号１５４のアミノ酸配列を含む抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３を含む第２のポリペプチド鎖を含む。これに関して、本発明のＴＣＲは、配列番号３～８；１２５～１３０；１３７～１４２；及び１４９～１５４から成る群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つ以上を含み得る。好ましくは、ＴＣＲは、配列番号３～５；配列番号６～８；配列番号１２５～１２７；配列番号１２８～１３０；配列番号１３７～１３９；配列番号１４０～１４２；配列番号１４９～１５１；又は配列番号１５２～１５４のアミノ酸配列を含む。特に好ましい実施形態においては、ＴＣＲは、（ａ）配列番号３～８の全て；（ｂ）配列番号１２５～１３０の全て；（ｃ）配列番号１３７～１４２の全て；（ｄ）配列番号１４９～１５４の全てのアミノ酸配列を含む。
【0017】
本発明の一実施形態においては、ＴＣＲは、上記のＣＤＲを含むＴＣＲの可変領域のアミノ酸配列を含む。これに関して、ＴＣＲは、配列番号９（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖の可変領域）；配列番号１０（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖の可変領域）；配列番号９及び１０の両方；配列番号１３１（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲα鎖の可変領域）；配列番号１３２（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲβ鎖の可変領域）；配列番号１３１及び１３２の両方；配列番号１４３（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲα鎖の可変領域）；配列番号１４４（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲβ鎖の可変領域）；配列番号１４３及び１４４の両方；配列番号１５５（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖の可変領域）；配列番号１５６（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖の可変領域）；又は配列番号１５５及び１５６の両方のアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、本発明のＴＣＲは、配列番号９及び１０の両方；配列番号１３１及び１３２の両方；配列番号１４３及び１４４の両方；又は配列番号１５５及び１５６の両方のアミノ酸配列を含む。
【0018】
本発明の一実施形態においては、ＴＣＲは、ＴＣＲの定常領域のアミノ酸配列を更に含む。これに関して、ＴＣＲは、配列番号１３のアミノ酸配列（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖の定常領域）、配列番号１４（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖の定常領域）、配列番号１３及び１４の両方；配列番号１３５（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲα鎖の定常領域）、配列番号１３６（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲβ鎖の定常領域）、配列番号１３５及び１３６の両方；配列番号１４７（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲα鎖の定常領域）、配列番号１４８（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲβ鎖の定常領域）、配列番号１４７及び１４８の両方；配列番号１５９（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖の定常領域）、配列番号１６０（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖の定常領域）、又は配列番号１５９及び１６０の両方を含み得る。好ましくは、本発明のＴＣＲは、配列番号１３及び１４の両方；配列番号１３５及び１３６の両方；配列番号１４７及び１４８の両方；配列番号１５９及び１６０の両方のアミノ酸配列を含む。
【0019】
本発明の一実施形態においては、本発明のＴＣＲは、可変領域と定常領域との組合せを含み得る。これに関して、ＴＣＲは：（ａ）配列番号９（α鎖の可変領域）及び配列番号１３（α鎖の定常領域）の両方のアミノ酸配列を含むα鎖；配列番号１０（β鎖の可変領域）及び配列番号１４（β鎖の定常領域）の両方のアミノ酸配列を含むβ鎖；若しくは配列番号９、１０、１３、及び１４の全てのアミノ酸配列；（ｂ）配列番号１３１（α鎖の可変領域）及び配列番号１３５（α鎖の定常領域）の両方のアミノ酸配列を含むα鎖；配列番号１３２（β鎖の可変領域）及び配列番号１３６（β鎖の定常領域）の両方のアミノ酸配列を含むβ鎖；若しくは配列番号１３１、１３２、１３５、及び１３６の全てのアミノ酸配列；（ｃ）配列番号１４３（α鎖の可変領域）及び配列番号１４７（α鎖の定常領域）の両方のアミノ酸配列を含むα鎖；配列番号１４４（β鎖の可変領域）及び配列番号
１４８（β鎖の定常領域）の両方のアミノ酸配列を含むβ鎖；若しくは配列番号１４３、１４４、１４７、及び１４８の全てのアミノ酸配列；又は（ｄ）配列番号１５５（α鎖の可変領域）及び配列番号１５９（α鎖の定常領域）の両方のアミノ酸配列を含むα鎖；配列番号１５６（β鎖の可変領域）及び配列番号１６０（β鎖の定常領域）の両方のアミノ酸配列を含むβ鎖；若しくは配列番号１５５、１５６、１５９、及び１６０の全てのアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、本発明のＴＣＲは、（ａ）配列番号９、１０、１３、及び１４の全て；（ｂ）配列番号１３１、１３２、１３５、及び１３６の全て；（ｃ）配列番号１４３、１４４、１４７、及び１４８の全て；又は（ｄ）配列番号１５５、１５６、１５９、及び１６０の全てのアミノ酸配列を含む。
１４８（β鎖の定常領域）の両方のアミノ酸配列を含むβ鎖；若しくは配列番号１４３、１４４、１４７、及び１４８の全てのアミノ酸配列；又は（ｄ）配列番号１５５（α鎖の可変領域）及び配列番号１５９（α鎖の定常領域）の両方のアミノ酸配列を含むα鎖；配列番号１５６（β鎖の可変領域）及び配列番号１６０（β鎖の定常領域）の両方のアミノ酸配列を含むβ鎖；若しくは配列番号１５５、１５６、１５９、及び１６０の全てのアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、本発明のＴＣＲは、（ａ）配列番号９、１０、１３、及び１４の全て；（ｂ）配列番号１３１、１３２、１３５、及び１３６の全て；（ｃ）配列番号１４３、１４４、１４７、及び１４８の全て；又は（ｄ）配列番号１５５、１５６、１５９、及び１６０の全てのアミノ酸配列を含む。
【0020】
本発明の一実施形態においては、本発明のＴＣＲは、本明細書に記載のＣＤＲ領域及び定常領域のいずれかの組合せを含み得る。これに関して、ＴＣＲは：（ａ）配列番号３～５及び１３の全てのアミノ酸配列；配列番号６～８及び１４の全てのアミノ酸配列を含むβ鎖；若しくは配列番号３～８及び１３～１４の全てのアミノ酸配列；（ｂ）配列番号１２５～１２７及び１３５の全てのアミノ酸配列；配列番号１２８～１３０及び１３６の全てのアミノ酸配列を含むβ鎖；若しくは配列番号１２５～１３０及び１３５～１３６の全てのアミノ酸配列；（ｃ）配列番号１３７～１３９及び１４７の全てのアミノ酸配列；配列番号１４０～１４２及び１４８の全てのアミノ酸配列を含むβ鎖；若しくは配列番号１３７～１４２及び１４７～１４８の全てのアミノ酸配列；又は（ｄ）配列番号１４９～１５１及び１５９の全てのアミノ酸配列；配列番号１５２～１５４及び１６０の全てのアミノ酸配列を含むβ鎖；若しくは配列番号１４９～１５４及び１５９～１６０の全てのアミノ酸配列を含むα鎖を含み得る。
【0021】
本発明の一実施形態においては、本発明のＴＣＲは、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖を含み得る。本発明のＴＣＲのα鎖及びβ鎖の各々は、独立して、任意のアミノ酸配列を含み得る。これに関して、本発明のＴＣＲα鎖は、配列番号１１（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖）、配列番号１３３（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲα鎖）、配列番号１４５（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲα鎖）又は配列番号１５７（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖）のアミノ酸配列を含み得る。このタイプのα鎖は、ＴＣＲの任意のβ鎖と対合し得る。これに関して、本発明のＴＣＲβ鎖は、配列番号１２（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖）、配列番号１３４（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲβ鎖）、配列番号１４６（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲβ鎖）又は配列番号１５８（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖）のアミノ酸配列を含み得る。従って、本発明のＴＣＲは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１１及び１２の両方、配列番号１３３及び１３４の両方、配列番号１４５及び１４６の両方、又は配列番号１５７及び１５８の両方のアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、本発明のＴＣＲは、配列番号１１及び１２の両方、配列番号１３３及び１３４の両方、配列番号１４５及び１４６の両方、又は配列番号１５７及び１５８の両方のアミノ酸配列を含む。
【0022】
本発明の一実施形態においては、本発明のＴＣＲは、（ｉ）ＣＤ４の存在下且つＣＤ８の非存在下で、又は（ｉｉ）ＣＤ８の存在下且つＣＤ４の非存在下で、突然変異標的（例、突然変異ＫＲＡＳ）を認識する。好ましい実施形態においては、（ｉ）配列番号１２５～１３０；（ｉｉ）配列番号１３１～１３２；又は（ｉｉｉ）配列番号１３３及び１３４のアミノ酸配列を含むＴＣＲが、（ｉ）ＣＤ４の存在下且つＣＤ８の非存在下、又は（ｉｉ）ＣＤ８の存在下且つＣＤ４の非在下のいずれでも、突然変異標的（ｔａｒｅｇｅｔ）（例、突然変異ＫＲＡＳ）を認識する。従って、これらの本発明のＴＣＲは、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋の細胞のいずれに発現する場合でも、好都合なことに、突然変異標的（例、突然変異ＫＲＡＳ）を認識し得る。
【0023】
本発明の一実施形態においては、ＴＣＲはマウスＴＣＲである。本明細書で用いる場合、用語「マウスの」は、本明細書に記載のＴＣＲ又はＴＣＲの任意の構成要素（例、相補性決定領域（ＣＤＲ）、可変領域、定常領域、α鎖及び／又はβ鎖）に言及するときは、マウスに由来するＴＣＲ（又はその構成要素）、即ち、マウスＴ細胞起源であるか、若しくはかつてマウスＴ細胞に発現していたＴＣＲ（又はその構成要素）を意味する。本発明の一実施形態においては、（ｉ）配列番号３～８の全て；（ｉｉ）配列番号９及び１０；（ｉｉｉ）配列番号１１及び１２；（ｉｖ）配列番号３～８及び１３～１４の全て；（ｖ）配列番号９、１０、１３、及び１４の全て；（ｖｉ）配列番号１２５～１３０の全て；（ｖｉｉ）配列番号１３１及び１３２；（ｖｉｉｉ）配列番号１３３及び１３４；（ｉｘ）配列番号１２５～１３０及び１３５～１３６の全て；（ｘ）配列番号１３１、１３２、１３５、及び１３６の全て；（ｘｉ）配列番号１３７～１４２の全て；（ｘｉｉ）配列番号１４３及び１４４；（ｘｉｉｉ）配列番号１４５及び１４６；（ｘｉｖ）配列番号１３７～１４２及び１４７～１４８の全て；（ｘｖ）配列番号１４３、１４４、１４７、及び１４８の全て；（ｘｖｉ）配列番号１４９～１５４の全て；（ｘｖｉｉ）配列番号１５５及び１５６；（ｘｖｉｉｉ）配列番号１５７及び１５８；（ｘｉｘ）配列番号１４９～１５４及び１５９～１６０の全て；又は（ｘｘ）配列番号１５５、１５６、１５９、及び１６０の全てを含むＴＣＲが、マウスのＴＣＲである。
【0024】
本発明の範囲には、本明細書に記載の本発明のＴＣＲの機能的変異体が含まれる。用語「機能的変異体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｖａｒｉａｎｔ）」は、本明細書で用いる場合、親ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質と実質的又は顕著な配列同一性又は類似性を有するＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質であって、該機能的変異体がＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質（該機能的変異体はそれらの変異体である）の生物学的活性を保持するものを指す。機能的変異体は、例えば、親ＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質と類似の（ｓｉｍｉｌａｒ）程度に、同（ｓａｍｅ）程度に、又はより高い程度に、突然変異標的（例、突然変異ＫＲＡＳ）（親ＴＣＲが抗原特異性を有するか、又は親ポリペプチド若しくはタンパク質が特異的に結合する）と特異的に結合する能力を保持する、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質（親ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質）の変異体を包含する。親ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質に関連して、機能的変異体は、親ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質に対して、アミノ酸配列において、例えば、少なくとも約３０％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一であり得る。
【0025】
機能的変異体は、例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する親ＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列を含み得る。保存的アミノ酸置換は、当該技術分野で公知であり、特定の物理的及び／又は化学的特性を有する１つのアミノ酸が、同じ化学的又は物理的特性を有する別のアミノ酸と交換されるアミノ酸置換が挙げられる。例えば、保存的アミノ酸置換は、酸性アミノ酸の、酸性の別のアミノ酸（例、Ａｓｐ又はＧｌｕ）との置換、非極性側鎖を有するアミノ酸の、非極性側鎖を有する別のアミノ酸（例、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ等）との置換、塩基性アミノ酸の、塩基性の別のアミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ等）との置換、極性側鎖を有するアミノ酸の、極性側鎖を有する別のアミノ酸（Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ等）との置換等であり得る。
【0026】
代替的に又は追加的に、機能的変異体は、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を有する親ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質のアミノ酸配列を含み得る。この場合、非保存的アミノ酸置換が、機能的変異体の生物学的活性を妨害又は阻害しないことが好ましい。好ましくは、非保存的アミノ酸置換は、親ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質と比較して機能的変異体の生物学的活性が増加するように、機能的変異体の生物学的活性を増強する。本発明の一実施形態においては、機能的変異体は、（ｉ）配列番号４６～５６
及び２０７、７０～８０及び２０８、並びに９４～１０４及び２０９のいずれか１つの、それぞれ、置換ＣＤＲ３α、α鎖の可変領域、又は全長α鎖のアミノ酸配列；（ｉｉ）配列番号５７～６９、８１～９３、及び１０５～１１７のいずれか１つの、それぞれ、置換ＣＤＲ３β、β鎖の可変領域、又は全長β鎖のアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）（ｉｉ）のアミノ酸配列のいずれか１つと組み合わされた（ｉ）のアミノ酸配列のいずれか１つとの対を含む、置換ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質である。
及び２０７、７０～８０及び２０８、並びに９４～１０４及び２０９のいずれか１つの、それぞれ、置換ＣＤＲ３α、α鎖の可変領域、又は全長α鎖のアミノ酸配列；（ｉｉ）配列番号５７～６９、８１～９３、及び１０５～１１７のいずれか１つの、それぞれ、置換ＣＤＲ３β、β鎖の可変領域、又は全長β鎖のアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）（ｉｉ）のアミノ酸配列のいずれか１つと組み合わされた（ｉ）のアミノ酸配列のいずれか１つとの対を含む、置換ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質である。
【0027】
例えば、本発明の一実施形態においては、置換ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質は、（ａ）配列番号４６～５６及び２０７のいずれか１つの置換ＣＤＲ３αアミノ酸配列（表１）及び（ｂ）配列番号５７～６９のいずれか１つの置換ＣＤＲ３βアミノ酸配列（表ＩＩ）の一方又は両方を含み得る。本発明の一実施形態は、配列番号４６～５６及び２０７の置換ＣＤＲ３αアミノ酸配列のいずれか１つと組み合わせた、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される天然の非置換ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、及びＣＤＲ３βアミノ酸配列のいずれか１つ以上を有するＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を提供する。これに関して、本発明の一実施形態は、配列番号１４９～１５０、２０７、及び１５２～１５４の全てのアミノ酸配列を含む置換ＴＣＲを提供する。本発明の別の実施形態は、配列番号５７～６９の置換ＣＤＲ３βアミノ酸配列のいずれか１つと組み合わせた、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される天然の非置換ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、及びＣＤＲ２βアミノ酸配列のいずれか１つ以上を有するＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を提供する。
【0028】
【表1】
【0029】
【表2】
【0030】
本発明の一実施形態においては、配列番号４６～５６の置換ＣＤＲ３αのアミノ酸配列の各々は、配列番号５の天然の非置換ＣＤＲ３αのアミノ酸配列を含まない。本発明の一実施形態においては、配列番号２０７の置換ＣＤＲ３αのアミノ酸配列は、配列番号１５１の天然の非置換ＣＤＲ３αのアミノ酸配列を含まない。同様に、本発明の一実施形態に
おいては、配列番号５７～６９の置換ＣＤＲ３βのアミノ酸配列の各々は、配列番号８の天然の非置換ＣＤＲ３βのアミノ酸配列を含まない。
おいては、配列番号５７～６９の置換ＣＤＲ３βのアミノ酸配列の各々は、配列番号８の天然の非置換ＣＤＲ３βのアミノ酸配列を含まない。
【0031】
本発明の一実施形態は、（ｉ）配列番号７０～８０及び２０８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、α鎖の置換可変領域（表ＩＩＩ）及び（ｉｉ）配列番号８１～９３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、β鎖の置換可変領域（表ＩＶ）の一方又は両方を含む置換ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を提供する。本発明の一実施形態は、配列番号７０～８０及び２０８の置換可変領域α鎖のアミノ酸配列のいずれか１つと組み合わせた、本発明の他の態様に関して本明細書に記載されるβ鎖の天然の非置換可変領域のいずれかを有するＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を提供する。本発明の別の実施形態は、配列番号８１～９３の置換可変領域β鎖のアミノ酸配列のいずれか１つと組み合わせた、本発明の他の態様に関して本明細書に記載されるα鎖の天然の非置換可変領域のいずれかを有するＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を提供する。
【0032】
【表3】
【0033】
【表4】
【0034】
本発明の一実施形態においては、配列番号７０～８０の置換可変領域α鎖のアミノ酸配列の各々は、配列番号９の天然の非置換可変領域α鎖のアミノ酸配列を含まない。本発明の一実施形態においては、配列番号２０８の置換可変領域α鎖のアミノ酸配列は、配列番号１５５の天然の非置換可変領域α鎖のアミノ酸配列を含まない。同様に、本発明の一実
施形態においては、配列番号８１～９３の置換可変領域β鎖のアミノ酸配列の各々は、配列番号１０の天然の非置換可変領域β鎖のアミノ酸配列を含まない。
施形態においては、配列番号８１～９３の置換可変領域β鎖のアミノ酸配列の各々は、配列番号１０の天然の非置換可変領域β鎖のアミノ酸配列を含まない。
【0035】
本発明の一実施形態は、（ｉ）配列番号９４～１０４及び２０９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む置換全長α鎖（表Ｖ）及び（ｉｉ）配列番号１０５～１１７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む置換全長β鎖（表ＶＩ）の一方又は両方を含む置換ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を提供する。本発明の一実施形態は、配列番号９４～１０４及び２０９の置換全長α鎖のアミノ酸配列のいずれか１つと組み合わせた、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される天然の非置換全長β鎖配列のいずれかを有するＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を提供する。本発明の別の実施形態は、配列番号１０５～１１７の置換全長β鎖配列のいずれか１つと組み合わせた、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される天然の非置換全長α鎖のいずれかを有するＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を提供する。
【0036】
【表5】
【0037】
【表6】
【0038】
本発明の一実施形態においては、配列番号９４～１０４の置換全長α鎖のアミノ酸配列の各々は、配列番号１１の天然の非置換全長α鎖のアミノ酸配列を含まない。本発明の一実施形態においては、配列番号２０９の置換全長α鎖のアミノ酸配列は、配列番号１５７の天然の非置換全長α鎖のアミノ酸配列を含まない。同様に、本発明の一実施形態におい
ては、配列番号１０５～１１７の置換全長β鎖のアミノ酸配列の各々は、配列番号１２の天然の非置換全長β鎖のアミノ酸配列を含まない。
ては、配列番号１０５～１１７の置換全長β鎖のアミノ酸配列の各々は、配列番号１２の天然の非置換全長β鎖のアミノ酸配列を含まない。
【0039】
ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質の他の構成要素（例、他のアミノ酸）が、ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質の生物学的活性を実質的に変化させないように、ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質は、本明細書に記載の特定のアミノ酸配列（単数）又はアミノ酸配列（複数）から実質的に成り得る。これに関して、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質は、例えば、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号２０９、配列番号１１及び１２の両方、配列番号１３３及び１３４の両方、配列番号１４５及び１４６の両方、配列番号１５７及び１５８の両方、又は配列番号１５８及び２０９の両方のアミノ酸配列から実質的になり得る。また、例えば、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号２０８、配列番号９及び１０の両方、配列番号１３１及び１３２の両方、配列番号１４３及び１４４の両方、配列番号１５５及び１５６の両方、又は配列番号１５６及び２０８の両方のアミノ酸配列（複数可）から実質的に成り得る。更に、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質は、（ａ）配列番号３（α鎖のＣＤＲ１）、配列番号４（α鎖のＣＤＲ２）、配列番号５（α鎖のＣＤＲ３）、配列番号６（β鎖のＣＤＲ１）、配列番号７（β鎖のＣＤＲ２）、配列番号８（β鎖のＣＤＲ３）、又はそれらの任意の組合せ（例、配列番号３～５；６～８；若しくは３～８）；（ｂ）配列番号１２５（α鎖のＣＤＲ１）、配列番号１２６（α鎖のＣＤＲ２）、配列番号１２７（α鎖のＣＤＲ３）、配列番号１２８（β鎖のＣＤＲ１）、配列番号１２９（β鎖のＣＤＲ２）、配列番号１３０（β鎖のＣＤＲ３）、又はそれらの任意の組合せ（例、配列番号１２５～１２７；１２８～１３０；若しくは１２５～１３０）；（ｃ）配列番号１３７（α鎖のＣＤＲ１）、配列番号１３８（α鎖のＣＤＲ２）、配列番号１３９（α鎖のＣＤＲ３）、配列番号１４０（β鎖のＣＤＲ１）、配列番号１４１（β鎖のＣＤＲ２）、配列番号１４２（β鎖のＣＤＲ３）、又はそれらの任意の組合せ（例、配列番号１３７～１３９；１４０～１４２；若しくは１３７～１４２）；（ｄ）配列番号１４９（α鎖のＣＤＲ１）、配列番号１５０（α鎖のＣＤＲ２）、配列番号１５１（α鎖のＣＤＲ３）、配列番号１５２（β鎖のＣＤＲ１）、配列番号１５３（β鎖のＣＤＲ２）、配列番号１５４（β鎖のＣＤＲ３）、又はそれらの任意の組合せ（例、配列番号１４９～１５１；１５２～１５４；若しくは１４９～１５４）；或いは（ｅ）配列番号１４９（α鎖のＣＤＲ１）、配列番号１５０（α鎖のＣＤＲ２）、配列番号２０７（α鎖の置換ＣＤＲ３）、配列番号１５２（β鎖のＣＤＲ１）、配列番号１５３（β鎖のＣＤＲ２）、配列番号１５４（β鎖のＣＤＲ３）、又はそれらの任意の組合せ（例、配列番号１４９～１５０及び２０７；１５２～１５４；若しくは１４９～１５０、２０７、及び１５２～１５４）のアミノ酸配列から実質的に成り得る。
【0040】
本発明により、本明細書に記載されるＴＣＲのいずれかの機能的部分を含むポリペプチドも提供される。用語「ポリペプチド」は、本明細書で用いる場合、オリゴペプチドを含み、１つ以上のペプチド結合によって連結されたアミノ酸の一本鎖を指す。
【0041】
本発明のポリペプチドに関して、機能的部分は、該機能的部分が突然変異標的（例、突然変異ＫＲＡＳ）に特異的に結合するならば、それが一部であるＴＣＲの、連続するアミノ酸を含む任意の部分であり得る。用語「機能的部分」は、ＴＣＲに関して用いられる場合、本発明のＴＣＲの任意の部分又は断片を指し、その部分又は断片は、それが一部であるところのＴＣＲ（親ＴＣＲ）の生物学的活性を保持する。機能的部分は、例えば、突然変異標的（例、突然変異ＫＲＡＳ）に（例、ＨＬＡ－Ａ１１依存的な様態で）特異的に結合する能力か、又はがんを検出、治療、若しくは予防する能力を、親ＴＣＲと類似の程度で、同程度で、又はより高い程度で保持するＴＣＲの部分を包含する。親ＴＣＲに関して
、機能的部分は、例えば、親ＴＣＲの、約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上を含み得る。
、機能的部分は、例えば、親ＴＣＲの、約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上を含み得る。
【0042】
機能的部分は、該部分のアミノ末端若しくはカルボキシ末端において、又は両方の末端において、親ＴＣＲのアミノ酸配列には見受けられない追加のアミノ酸を含み得る。望ましくは、追加のアミノ酸は、機能的部分の生物的機能（例、突然変異標的（例、突然変異ＫＲＡＳ）に特異的に結合すること；及び／又はがんを検出する、がんを治療又は予防する能力を有すること等）を妨害しない。より望ましくは、追加のアミノ酸は、親ＴＣＲ又はその機能的変異体の生物活性と比較して、生物活性を増強させる。
【0043】
ポリペプチドは、本発明のＴＣＲのα鎖及び／又はβ鎖の可変領域（複数可）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の１つ以上を含む機能的部分等の、本発明のＴＣＲのα鎖及びβ鎖のいずれか又は両方の機能的部分を含み得る。本発明の一実施形態においては、ポリペプチドは、（ａ）配列番号３（α鎖のＣＤＲ１）、４（α鎖のＣＤＲ２）、５（α鎖のＣＤＲ３）、６（β鎖のＣＤＲ１）、７（β鎖のＣＤＲ２）、８（β鎖のＣＤＲ３）、若しくはそれらの組合せ；（ｂ）配列番号１２５（α鎖のＣＤＲ１）、１２６（α鎖のＣＤＲ２）、１２７（α鎖のＣＤＲ３）、１２８（β鎖のＣＤＲ１）、１２９（β鎖のＣＤＲ２）、１３０（β鎖のＣＤＲ３）、若しくはそれらの組合せ；（ｃ）配列番号１３７（α鎖のＣＤＲ１）、１３８（α鎖のＣＤＲ２）、１３９（α鎖のＣＤＲ３）、１４０（β鎖のＣＤＲ１）、１４１（β鎖のＣＤＲ２）、１４２（β鎖のＣＤＲ３）、若しくはそれらの組合せ；（ｄ）配列番号１４９（α鎖のＣＤＲ１）、１５０（α鎖のＣＤＲ２）、１５１（α鎖のＣＤＲ３）、１５２（β鎖のＣＤＲ１）、１５３（β鎖のＣＤＲ２）、１５４（β鎖のＣＤＲ３）、若しくはそれらの組合せ；又は（ｅ）配列番号１４９（α鎖のＣＤＲ１）、１５０（α鎖のＣＤＲ２）、２０７（α鎖の置換ＣＤＲ３）、１５２（β鎖のＣＤＲ１）、１５３（β鎖のＣＤＲ２）、１５４（β鎖のＣＤＲ３）、若しくはそれらの組合せのアミノ酸配列を含む機能的部分を含み得る。好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号３～５；６～８；１２５～１２７；１２８～１３０；１３７～１３９；１４０～１４２；１４９～１５１；１５２～１５４；配列番号３～８の全て；配列番号１２５～１３０の全て；配列番号１３７～１４２の全て；配列番号１４９～１５４の全て；又は配列番号１４９～１５０、２０７及び１５２～１５４の全てのアミノ酸配列を含む機能的部分を含む。より好ましくは、ポリペプチドは、配列番号３～８の全て；配列番号１２５～１３０の全て；配列番号１３７～１４２の全て；配列番号１４９～１５４の全て；又は配列番号１４９～１５０、２０７及び１５２～１５４の全てのアミノ酸配列を含む機能的部分を含む。
【0044】
本発明の一実施形態においては、本発明のポリペプチドは、例えば、上記のＣＤＲ領域の組合せを含む、本発明のＴＣＲ又はその機能的変異体の可変領域を含み得る。これに関して、ポリペプチドは、配列番号９（α鎖の可変領域）、配列番号１０（β鎖の可変領域）、配列番号１３１（α鎖の可変領域）、配列番号１３２（β鎖の可変領域）、配列番号１４３（α鎖の可変領域）、配列番号１４４（β鎖の可変領域）、配列番号１５５（α鎖の可変領域）、配列番号１５６（β鎖の可変領域）、配列番号２０８（α鎖の置換可変領域）、配列番号９及び１０の両方、配列番号１３１及び１３２の両方、配列番号１４３及び１４４の両方、配列番号１５５及び１５６の両方、又は配列番号２０８及び１５６の両方のアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号９及び１０の両方、配列番号１３１及び１３２の両方、配列番号１４３及び１４４の両方、配列番号１５５及び１５６の両方、又は配列番号２０８及び１５６の両方のアミノ酸配列を含む。
【0045】
本発明の一実施形態においては、本発明のポリペプチドは、上記の本発明のＴＣＲ又はその機能的変異体の定常領域を更に含み得る。これに関して、ポリペプチドは、配列番号１３（α鎖の定常領域）、配列番号１４（β鎖の定常領域）、配列番号１３５（α鎖の定
常領域）、配列番号１３６（β鎖の定常領域）、配列番号１４７（α鎖の定常領域）、配列番号１４８（β鎖の定常領域）、配列番号１５９（α鎖の定常領域）、配列番号１６０（β鎖の定常領域）、配列番号１３及び１４の両方、配列番号１３５及び１３６の両方、配列番号１４７及び１４８の両方、又は配列番号１５９及び１６０の両方のアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号１３及び１４の両方、配列番号１３５及び１３６の両方、配列番号１４７及び１４８の両方、又は配列番号１５９及び１６０の両方のアミノ酸配列を含む。
常領域）、配列番号１３６（β鎖の定常領域）、配列番号１４７（α鎖の定常領域）、配列番号１４８（β鎖の定常領域）、配列番号１５９（α鎖の定常領域）、配列番号１６０（β鎖の定常領域）、配列番号１３及び１４の両方、配列番号１３５及び１３６の両方、配列番号１４７及び１４８の両方、又は配列番号１５９及び１６０の両方のアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号１３及び１４の両方、配列番号１３５及び１３６の両方、配列番号１４７及び１４８の両方、又は配列番号１５９及び１６０の両方のアミノ酸配列を含む。
【0046】
本発明の一実施形態においては、本発明のポリペプチドは、本発明のＴＣＲ又はその機能的変異体の可変領域及び定常領域の組合せを含み得る。これに関して、ポリペプチドは：（ａ）配列番号９（α鎖の可変領域）及び配列番号１３（α鎖の定常領域）の両方、配列番号１０（β鎖の可変領域）及び配列番号１４（β鎖の定常領域）の両方、若しくは配列番号９、１０、１３、及び１４の全てのアミノ酸配列；（ｂ）配列番号１３１（α鎖の可変領域）及び配列番号１３５（α鎖の定常領域）の両方、配列番号１３２（β鎖の可変領域）及び配列番号１３６（β鎖の定常領域）の両方、若しくは配列番号１３１、１３２、１３５、及び１３６の全てのアミノ酸配列；（ｃ）配列番号１４３（α鎖の可変領域）及び配列番号１４７（α鎖の定常領域）の両方、配列番号１４４（β鎖の可変領域）及び配列番号１４８（β鎖の定常領域）の両方、若しくは配列番号１４３、１４４、１４７及び１４８の全てのアミノ酸配列；（ｄ）配列番号１５５（α鎖の可変領域）及び配列番号１５９（α鎖の定常領域）の両方、配列番号１５６（β鎖の可変領域）及び配列番号１６０（β鎖の定常領域）の両方、若しくは配列番号１５５、１５６、１５９、及び１６０の全てのアミノ酸配列；又は（ｅ）配列番号２０８（α鎖の置換可変領域）及び配列番号１５９（α鎖の定常領域）の両方、配列番号１５６（β鎖の可変領域）及び配列番号１６０（β鎖の定常領域）の両方、若しくは配列番号２０８、１５６、１５９、及び１６０の全てのアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号９、１０、１３及び１４の全て；配列番号１３１、１３２、１３５、及び１３６の全て；配列番号１４３、１４４、１４７、及び１４８の全て；配列番号１５５、１５６、１５９、及び１６０の全て；又は配列番号２０８、１５６、１５９、及び１６０の全てのアミノ酸配列を含む。
【0047】
本発明の一実施形態においては、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載のＣＤＲ領域のいずれかと本発明のＴＣＲの定常領域との組合せを含み得る。これに関して、ポリペプチドは、配列番号３～５及び１３の全て、配列番号６～８及び１４の全て、配列番号３～８及び１３～１４の全て；配列番号１２５～１２７及び１３５の全て、配列番号１２８～１３０及び１３６の全て、配列番号１２５～１３０及び１３５～１３６の全て、配列番号１３７～１３９及び１４７の全て、配列番号１４０～１４２及び１４８の全て、配列番号１３７～１４２及び１４７～１４８の全て、配列番号１４９～１５１及び１５９の全て、配列番号１４９～１５０、２０７及び１５９の全て、配列番号１５２～１５４及び１６０の全て、配列番号１４９～１５４及び１５９～１６０の全て、又は配列番号１４９～１５０、２０７、１５２～１５４及び１５９～１６０の全てのアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号３～８及び１３～１４の全て、配列番号１２５～１３０及び１３５～１３６の全て、配列番号１３７～１４２及び１４７～１４８の全て、配列番号１４９～１５４及び１５９～１６０の全て、又は配列番号１４９～１５０、２０７、１５２～１５４、及び１５９～１６０の全てのアミノ酸配列を含む。
【0048】
本発明の一実施形態においては、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載されるＴＣＲのα鎖又はβ鎖の全長を含み得る。これに関して、本発明のポリペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１５７、配列番号２０９、配列番号１５８、配列番号１１及び１２の両方、配列番号１３３及び１３４の両方、配列番号１４５及び１４６の両方、配列番号１５７及び１５８の両方、又は配列番号２０９及び１５８の両方のアミノ酸配列を含み得る。好ま
しくは、ポリペプチドは、配列番号１１及び１２の両方、配列番号１３３及び１３４の両方、配列番号１４５及び１４６の両方、配列番号１５７及び１５８の両方、又は配列番号２０９及び１５８の両方のアミノ酸配列を含む。
しくは、ポリペプチドは、配列番号１１及び１２の両方、配列番号１３３及び１３４の両方、配列番号１４５及び１４６の両方、配列番号１５７及び１５８の両方、又は配列番号２０９及び１５８の両方のアミノ酸配列を含む。
【0049】
本発明は、本明細書に記載のポリペプチドの少なくとも１つを含むタンパク質を更に提供する。「タンパク質」により、１つ以上のポリペプチド鎖を含む分子が意味される。
【0050】
一実施形態においては、本発明のタンパク質は、配列番号３～５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号６～８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；配列番号１２５～１２７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１２８～１３０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；配列番号１３７～１３９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１４０～１４２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；配列番号１４９～１５１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１５２～１５４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；又は配列番号１４９～１５０及び２０７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１５２～１５４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖を含み得る。代替的に又は追加的に、本発明のタンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；配列番号１３１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１３２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；配列番号１４３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１４４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；配列番号１５５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１５６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；又は配列番号２０８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１５６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖を含み得る。タンパク質は、例えば、（ａ）配列番号９及び１３の両方、若しくは配列番号３～５及び１３の全てのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、並びに配列番号１０及び１４の両方、若しくは配列番号６～８及び１４の全てのアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（ｂ）配列番号１３１及び１３５の両方、若しくは配列番号１２５～１２７及び１３５の全てのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、並びに配列番号１３２及び１３６の両方、若しくは配列番号１２８～１３０及び１３６の全てのアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（ｃ）配列番号１４３及び１４７の両方、若しくは配列番号１３７～１３９及び１４７の全てのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、並びに配列番号１４４及び１４８の両方、若しくは配列番号１４０～１４２及び１４８の全てのアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（ｄ）配列番号１５５及び１５９の両方、若しくは配列番号１４９～１５１及び１５９の全てのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、並びに配列番号１５６及び１６０の両方、若しくは配列番号１５２～１５４及び１６０の全てのアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；又は（ｅ）配列番号２０８及び１５９の両方、若しくは配列番号１４９～１５０、２０７及び１５９の全てのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、並びに配列番号１５６及び１６０の両方、若しくは配列番号１５２～１５４、及び１６０の全てのアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖を含み得る。代替的に又は追加的に、本発明のタンパク質は、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（ｂ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１３４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（ｃ）配列番号１４５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１４６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（ｄ）配列番号１５７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１５８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；又は（ｅ）配列番号２０９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１５８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖を含み得る。この場合、本発明のタンパク質はＴＣＲであり得る。或いは、例えば、タンパク質が、配列番号１１及び１２の両方、配列番号１３３及び１３４の両方、配列番号１４５及び１４６の両方、配列番号１５７
及び１５８の両方、又は配列番号２０９及び１５８の両方のアミノ酸配列を含む単一のポリペプチド鎖を含む場合、又はタンパク質の第１及び／又は第２のポリペプチド鎖（複数可）が他のアミノ酸配列（例、免疫グロブリン又はその一部をコードするアミノ酸配列）を更に含む場合、本発明のタンパク質は、融合タンパク質であり得る。これに関して、本発明は、少なくとも１つの他のポリペプチドとともに、本明細書に記載される本発明のポリペプチドの少なくとも１つを含む融合タンパク質も提供する。他のポリペプチドは、融合タンパク質の個別のポリペプチド（ｓｅｐａｒａｔｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）として存在し得るか、又は本明細書に記載の本発明のポリペプチドの１つとインフレーム（タンデム）で発現するポリペプチドとして存在し得る。他のポリペプチドは、免疫グロブリン、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＭＨＣ分子、ＣＤ１分子（例、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄなど）を含むが、これらに限定されない、任意のペプチド性若しくはタンパク質性分子又はそれら一部をコードし得る。
及び１５８の両方、又は配列番号２０９及び１５８の両方のアミノ酸配列を含む単一のポリペプチド鎖を含む場合、又はタンパク質の第１及び／又は第２のポリペプチド鎖（複数可）が他のアミノ酸配列（例、免疫グロブリン又はその一部をコードするアミノ酸配列）を更に含む場合、本発明のタンパク質は、融合タンパク質であり得る。これに関して、本発明は、少なくとも１つの他のポリペプチドとともに、本明細書に記載される本発明のポリペプチドの少なくとも１つを含む融合タンパク質も提供する。他のポリペプチドは、融合タンパク質の個別のポリペプチド（ｓｅｐａｒａｔｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）として存在し得るか、又は本明細書に記載の本発明のポリペプチドの１つとインフレーム（タンデム）で発現するポリペプチドとして存在し得る。他のポリペプチドは、免疫グロブリン、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＭＨＣ分子、ＣＤ１分子（例、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄなど）を含むが、これらに限定されない、任意のペプチド性若しくはタンパク質性分子又はそれら一部をコードし得る。
【0051】
融合タンパク質は、本発明のポリペプチドの１つ以上のコピー、及び／又は他のポリペプチドの１つ以上のコピーを含み得る。例えば、融合タンパク質は、本発明のポリペプチド及び／又は他のポリペプチドのコピーを１、２、３、４、５つ又はそれ以上含み得る。融合タンパク質を作製する好適な方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、組換え法が挙げられる。
【0052】
本発明のいくつかの実施形態においては、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、及びタンパク質は、α鎖及びβ鎖を連結するリンカーペプチドを含む単一のタンパク質として発現し得る。これに関して、配列番号１１及び１２の両方、配列番号１３３及び１３４の両方、配列番号１４５及び１４６の両方、配列番号１５７及び１５８の両方、配列番号２０９及び１５８の両方、配列番号９及び１０の両方、配列番号１３１及び１３２の両方、配列番号１４３及び１４４の両方、配列番号１５５及び１５６の両方、配列番号２０８及び１５６の両方、配列番号３～８の全て、配列番号１２５～１３０の全て、配列番号１３７～１４２の全て、配列番号１４９～１５４の全て、配列番号９、１０、１３及び１４の全て、配列番号１３１、１３２、１３５、及び１３６の全て、配列番号１４３、１４４、１４７、及び１４８の全て、配列番号１５５、１５６、１５９及び１６０の全て、配列番号２０８、１５６、１５９及び１６０の全て、配列番号３～８及び１３～１４の全て、配列番号１２５～１３０及び１３５～１３６の全て、配列番号１３７～１４２及び１４７～１４８の全て、配列番号１４９～１５４及び１５９～１６０の全て、又は配列番号１４９～１５０、２０７、１５２～１５４及び１５９～１６０の全てを含む本発明のＴＣＲ、ポリペプチド及びタンパク質が、リンカーペプチドを更に含み得る。リンカーペプチドは、好都合なことに、宿主細胞において、組換えＴＣＲ、ポリペプチド、及び／又はタンパク質の発現を促進し得る。リンカーペプチドは、任意の好適なアミノ酸配列を含み得る。本発明の一実施形態においては、ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質は、自己切断性ウイルスリンカーペプチドを含む。例えば、リンカーペプチドは、配列番号２８を含み得る。リンカーペプチドを含むコンストラクトを宿主細胞で発現させる際、リンカーペプチドは切断され得、α鎖及びβ鎖が分離され得る。本発明の一実施形態においては、ＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質は、全長α鎖、全長β鎖、及びα鎖とβ鎖との間に位置するリンカーペプチドを含むアミノ酸配列（例えば、配列番号４５（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲ）、配列番号１６２（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲ）、配列番号２０１（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲ）、又は配列番号２０３（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲ）のアミノ酸配列）を含み得る。
【0053】
本発明のタンパク質は、本明細書に記載される本発明のポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む組換え抗体であり得る。「組換え抗体」は、本明細書で用いる場合、本発明のポリペプチドのうちの少なくとも１つ、及び抗体のポリペプチド鎖、又はその部分を含む組換え（例、遺伝学的に操作された）タンパク質を指す。抗体のポリペプチド、又はそ
の部分は、抗体の、重鎖、軽鎖、重鎖若しくは軽鎖の可変領域若しくは定常領域、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、又はＦｃ、Ｆａｂ若しくはＦ（ａｂ）２’断片等であり得る。抗体のポリペプチド鎖、又はその部分は、組換え抗体の、分離したポリペプチドとして存在し得る。或いは、抗体のポリペプチド鎖、又はその部分は、本発明のポリペプチドとインフレーム（タンデム）に発現するポリペプチドとして存在し得る。抗体のポリペプチド、又はその部分は、本明細書に記載の抗体及び抗体断片のいずれかを含む、任意の抗体又は任意の抗体断片のポリペプチドであり得る。
の部分は、抗体の、重鎖、軽鎖、重鎖若しくは軽鎖の可変領域若しくは定常領域、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、又はＦｃ、Ｆａｂ若しくはＦ（ａｂ）２’断片等であり得る。抗体のポリペプチド鎖、又はその部分は、組換え抗体の、分離したポリペプチドとして存在し得る。或いは、抗体のポリペプチド鎖、又はその部分は、本発明のポリペプチドとインフレーム（タンデム）に発現するポリペプチドとして存在し得る。抗体のポリペプチド、又はその部分は、本明細書に記載の抗体及び抗体断片のいずれかを含む、任意の抗体又は任意の抗体断片のポリペプチドであり得る。
【0054】
本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質（それらの機能的変異体を含む）は、ＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質（又はそれらの機能的変異体）がそれらの生物学的活性（例、突然変異標的（例、突然変異ＫＲＡＳ）に特異的に結合する能力；哺乳動物におけるがんを検出する能力；又は哺乳動物におけるがんを治療又は予防する能力等を保持するのであれば、任意の長さであり得、即ち、任意の数のアミノ酸を含み得る。例えば、ポリペプチドは、長さが、５０、７０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００又はそれ以上のアミノ酸等の、約５０～約５０００アミノ酸の範囲であり得る。これに関して、本発明のポリペプチドは、オリゴペプチドも含む。
【0055】
本発明の（ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）ＴＣＲ、ポリペプチド、及びタンパク質は、１つ以上の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含み得る。かかる合成アミノ酸は、当該技術分野において公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α－アミノｎ－デカン酸、ホモセリン、Ｓ－アセチルアミノメチル－システイン、トランス－３－及びトランス－４－ヒドロキシプロリン、４－アミノフェニルアラニン、４－ニトロフェニルアラニン、４－クロロフェニルアラニン、４－カルボキシフェニルアラニン、β－フェニルセリン β－ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α－ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン－２－カルボン酸、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’－ベンジル－Ｎ’－メチル－リジン、Ｎ’，Ｎ’－ジベンジル－リジン、６－ヒドロキシリジン、オルニチン、α－アミノシクロペンタンカルボン酸、α－アミノシクロヘキサンカルボン酸、α－アミノシクロヘプタンカルボン酸、α－（２－アミノ－２－ノルボルナン）－カルボン酸、α，γ－ジアミノ酪酸、α，β－ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、及びα－ｔｅｒｔ－ブチルグリシンが挙げられる。
【0056】
本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、及びタンパク質（それらの機能的変異体を含む）は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ－アシル化、（例、ジスルフィド架橋を介して）環化され、若しくは、酸付加塩に変換され得、且つ／又は、必要に応じて、二量体化若しくは重合され、又はコンジュゲート化され得る。
【0057】
本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、及び／又はタンパク質は、例えば、ｄｅ ｎｏｖｏ合成等の、当該技術分野において公知の方法によって得られ得る。また、ポリペプチド及びタンパク質は、標準的な組換え法を用いて、本明細書に記載の核酸を用いて組換えで産生され得る。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）参照。或いは、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、及び／又はタンパク質（それらの機能的変異体を含む）は、Ｓｙｎｐｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、及びＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）等の企業により商業的に合成され得る。この点において、本発明のＴＣＲ、ポリペプチ
ド、及びタンパク質は、合成、組換え、単離及び／又は精製をされたものであり得る。
ド、及びタンパク質は、合成、組換え、単離及び／又は精製をされたものであり得る。
【0058】
本発明の範囲には、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、宿主細胞集団、又は抗体、若しくはその抗原結合部分のいずれかを含むコンジュゲート（例、バイオコンジュゲート）が含まれる。コンジュゲート及び一般的にコンジュゲートを合成する方法は、当該技術分野において公知である。
【0059】
本発明の一実施形態は、本明細書に記載の、ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本明細書で用いる場合、「核酸」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸分子」を含み、一般にＤＮＡ又はＲＮＡのポリマーを意味し、これは一本鎖又は二本鎖の、合成された又は天然のソースから得た（例、単離及び／又は精製された）ものであり得、天然、非天然又は改変された（ａｌｔｅｒｅｄ）ヌクレオチドを含有し得、修飾されていないオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見いだされるホスホジエステルの代わりに、天然の、非天然の、又は改変された、ヌクレオチド間結合（ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）結合又はホスホロチオエート結合等）を含有し得る。１実施形態においては、核酸は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含む。一般に、核酸は、挿入、欠失、逆位、及び／又は置換を何れも含まないことが好ましい。しかし、本明細書で検討する通り、ある場合には、核酸が１つ以上の挿入、欠失、逆位、及び／又は置換を含むことが好適である場合がある。
【0060】
好ましくは、本発明の核酸は、組換え体である。用語「組換え体」は、本明細書で用いる場合、（ｉ）天然又は合成の核酸セグメントを、生細胞中で複製し得る核酸分子に連結することによって、生細胞外で構築される分子、又は（ｉｉ）上記（ｉ）に記載した分子の複製から生じる分子を指す。本明細書における目的のためには、複製は、インビトロ複製又はインビボ複製であり得る。
【0061】
核酸は、当該技術分野における公知の手順を用いて、化学合成及び／又は酵素的ライゲーション反応に基づいて構築され得る。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ｅｔ ａｌ．（上記）を参照。例えば、核酸は、天然に存在するヌクレオチド、又は、分子の生物学的安定性を増加させるように、又はハイブリダイゼーションの際に形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された多様な修飾ヌクレオチド（例、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチド）を用いて、化学的に合成され得る。核酸を生成するために用いられ得る修飾ヌクレオチドの例としては、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β－Ｄ－ガラクトシルキューオシン（ｂｅｔａ－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－置換アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、β－Ｄ－マンノシルキューオシン（ｂｅｔａ－Ｄ－ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル及び２，６－ジアミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。
或いは、本発明の核酸の１つ以上が、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）及びＳｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）等の企業から購入され得る。
ｅｔ ａｌ．（上記）を参照。例えば、核酸は、天然に存在するヌクレオチド、又は、分子の生物学的安定性を増加させるように、又はハイブリダイゼーションの際に形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された多様な修飾ヌクレオチド（例、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチド）を用いて、化学的に合成され得る。核酸を生成するために用いられ得る修飾ヌクレオチドの例としては、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β－Ｄ－ガラクトシルキューオシン（ｂｅｔａ－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－置換アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、β－Ｄ－マンノシルキューオシン（ｂｅｔａ－Ｄ－ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル及び２，６－ジアミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。
或いは、本発明の核酸の１つ以上が、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）及びＳｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）等の企業から購入され得る。
【0062】
核酸は、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質のいずれかをコードする任意のヌクレオチド配列を含み得る。本発明の一実施形態においては、核酸は、（ａ）配列番号２２（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ１）；配列番号２３のヌクレオチド配列（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ２）；配列番号２４のヌクレオチド配列（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ３）；配列番号２５のヌクレオチド配列（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ１）；配列番号２６のヌクレオチド配列（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ２）；若しくは配列番号２７のヌクレオチド配列（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３）；（ｂ）配列番号１６４（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ１）；配列番号１６５のヌクレオチド配列（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ２）；配列番号１６６のヌクレオチド配列（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ３）；配列番号１６７のヌクレオチド配列（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ１）；配列番号１６８のヌクレオチド配列（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ２）；若しくは配列番号１６９のヌクレオチド配列（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３）；（ｃ）配列番号１７７（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ１）；配列番号１７８のヌクレオチド配列（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ２）；配列番号１７９のヌクレオチド配列（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ３）；配列番号１８０のヌクレオチド配列（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ１）；配列番号１８１のヌクレオチド配列（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ２）；若しくは配列番号１８２のヌクレオチド配列（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３）；又は（ｄ）配列番号１８９（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ１）；配列番号１９０のヌクレオチド配列（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ２）；配列番号１９１のヌクレオチド配列（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ３）；配列番号１９２のヌクレオチド配列（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ１）；配列番号１９３のヌクレオチド配列（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ２）；若しくは配列番号１９４のヌクレオチド配列（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３）のヌクレオチド配列を含み得る。好ましくは、核酸は、配列番号２２～２４の全て；配列番号２５～２７の全て；配列番号２２～２７の全て；配列番号１６４～１６６の全て；配列番号１６７～１６９の全て；配列番号１６４～１６９の全て；配列番号１７７～１７９の全て；配列番号１８０～１８２の全て；配列番号１７７～１８２の全て；配列番号１８９～１９１の全て；配列番号１９２～１９４の全て；配列番号１８９～１９４のヌクレオチド配列を含む。特に好ましい実施形態においては、核酸は、配列番号２２～２７の全て；配列番号１６４～１６９の全て；配列番号１７７～１８２の全て；又は配列番号１８９～１９４の全てのヌクレオチド配列を含む。本発明の一実施形態においては、核酸は、（ａ）配列番号１５（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖の可変領域）；配列番号１６（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖の可変領域）；又は配列番号１５及び１６の両方；（ｂ）配列番号１７０（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖の可変領域）；配列番号１７１（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖の可変領域）；又は配列番号１７０及び１７１の両方；（ｃ）配列番号１８３（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲα鎖の可変領域）；配列番号１８４（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲβ鎖の可変領域）；又は配列番号１８３及び１８４の両方；（ｄ）配列番号１９５（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲα鎖の可変領域）；配列番号１９６（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲβ鎖の可変領域）；又は配列番号１９５及び１９６の両方のヌクレオチド配列を含み得る。好ましくは、核酸は、配列番号１５及び１６の両方；配列番号１７０及び１７１の両方；配列番号１８３及び１８４の両方；又は配列番号１９５及び１９６の両方のヌクレオチド配列を含む。本発明の別の実施形態においては、核酸は、（ａ）配列番号１７（全長の抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖）；配列番号１８（全長の抗ＫＲＡＳ Ｇ
１２Ｄ ＴＣＲβ鎖）；若しくは配列番号１７及び１８の両方；（ｂ）配列番号１７２（全長の抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖）；配列番号１７３（全長の抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖）；若しくは配列番号１７２及び１７３の両方；（ｃ）配列番号１８５（全長の抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲα鎖）；配列番号１８６（全長の抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲβ鎖）；若しくは配列番号１８５及び１８６の両方；又は（ｄ）配列番号１９７（全長の抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲα鎖）；配列番号１９８（全長の抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲβ鎖）；若しくは配列番号１９７及び１９８の両方のヌクレオチド配列を含み得る。好ましくは、核酸は、配列番号１７及び１８の両方；配列番号１７２及び１７３の両方；配列番号１８５及び１８６の両方；又は配列番号１９７及び１９８の両方のヌクレオチド配列を含む。
１２Ｄ ＴＣＲβ鎖）；若しくは配列番号１７及び１８の両方；（ｂ）配列番号１７２（全長の抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖）；配列番号１７３（全長の抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖）；若しくは配列番号１７２及び１７３の両方；（ｃ）配列番号１８５（全長の抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲα鎖）；配列番号１８６（全長の抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲβ鎖）；若しくは配列番号１８５及び１８６の両方；又は（ｄ）配列番号１９７（全長の抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲα鎖）；配列番号１９８（全長の抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲβ鎖）；若しくは配列番号１９７及び１９８の両方のヌクレオチド配列を含み得る。好ましくは、核酸は、配列番号１７及び１８の両方；配列番号１７２及び１７３の両方；配列番号１８５及び１８６の両方；又は配列番号１９７及び１９８の両方のヌクレオチド配列を含む。
【0063】
本発明の一実施形態においては、核酸は、ＴＣＲα鎖又はβ鎖の定常領域をコードするヌクレオチド配列を更に含む。これに関して、本明細書に記載の核酸のいずれもが、（ａ）配列番号１９（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖の定常領域）；配列番号２０（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖の定常領域）；若しくは配列番号１９及び２０の両方；（ｂ）配列番号１７４（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲα鎖の定常領域）；配列番号１７５（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲβ鎖の定常領域）；若しくは配列番号１７４及び１７５の両方；（ｃ）配列番号１８７（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲα鎖の定常領域）；配列番号１８８（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲβ鎖の定常領域）；若しくは配列番号１８７及び１８８の両方；又は（ｄ）配列番号１９９（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲα鎖の定常領域）；配列番号２００（抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲβ鎖の定常領域）；若しくは配列番号１９９及び２００の両方；のヌクレオチド配列を更に含み得る。好ましくは、核酸は、配列番号１５及び１９の両方；配列番号１６及び２０の両方；配列番号１５～１６及び１９～２０の全て；配列番号２２～２４及び１９の全て；配列番号２５～２７及び２０の全て；配列番号２２～２７及び１９～２０の全て；配列番号１７０及び１７４の両方；配列番号１７１及び１７５の両方；配列番号１７０～１７１及び１７４～１７５の全て；配列番号１６４～１６６及び１７４の全て；配列番号１６７～１６９及び１７５の全て；配列番号１６４～１６９及び１７４～１７５の全て；配列番号１８３及び１８７の両方；配列番号１８４及び１８８の両方；配列番号１８３～１８４及び１８７～１８８の全て；配列番号１７７～１７９及び１８７；配列番号１８０～１８２及び１８８の全て；配列番号１７７～１８２及び１８７～１８８の全て；配列番号１９５及び１９９の両方；配列番号１９６及び２００の両方；配列番号１９５～１９６及び１９９～２００の全て；配列番号１８９～１９１及び１９９の全て；配列番号１９２～１９４及び２００の全て；又は配列番号１８９～１９４及び１９９～２００の全てのヌクレオチド配列を含む。特に好ましい実施形態においては、核酸は、配列番号１５～１６及び１９～２０の全て；配列番号２２～２７及び１９～２０の全て；配列番号１７０～１７１及び１７４～１７５の全て；配列番号１６４～１６９及び１７４～１７５の全て；配列番号１８３～１８４及び１８７～１８８の全て；配列番号１７７～１８２及び１８７～１８８の全て；配列番号１９５～１９６及び１９９～２００の全て；又は配列番号１８９～１９４及び１９９～２００の全てのヌクレオチド配列を含む。
【0064】
本明細書に記載の核酸のいずれもが、リンカーペプチドをコードするヌクレオチド配列を更に含み得る。リンカーペプチドをコードするヌクレオチド配列は、任意の好適なヌクレオチド配列を含み得る。例えば、リンカーペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４４のヌクレオチド配列を含み得る。
【0065】
本発明の一実施形態においては、配列番号２２～２４の全て；配列番号２５～２７の全て；配列番号２２～２７の全て；配列番号１５及び１６の両方；配列番号１７及び１８の両方；配列番号１５及び１９の両方；配列番号１６及び２０の両方；配列番号１５～１６及び１９～２０の全て；配列番号２２～２４及び１９の全て；配列番号２５～２７及び２
０の全て；配列番号２２～２７及び１９～２０の全て；配列番号１６４～１６９の全て；配列番号１７０及び１７１の両方；配列番号１７２及び１７３の両方；配列番号１６４～１６９及び１７４～１７５の全て；配列番号１７０～１７１及び１７４～１７５の全て；配列番号１７７～１８２の全て；配列番号１８３～１８４の両方；配列番号１８５～１８６の両方；配列番号１７７～１８２及び１８７～１８８の全て；配列番号１８３～１８４及び１８７～１８８の全て；配列番号１８９～１９４の全て；配列番号１９５～１９６の両方；配列番号１９７～１９８の両方；配列番号１８９～１９４及び１９９～２００の全て；又は配列番号１９５～１９６及び１９９～２００の全てのヌクレオチド配列を含む核酸は、マウスＴＣＲをコードする。
０の全て；配列番号２２～２７及び１９～２０の全て；配列番号１６４～１６９の全て；配列番号１７０及び１７１の両方；配列番号１７２及び１７３の両方；配列番号１６４～１６９及び１７４～１７５の全て；配列番号１７０～１７１及び１７４～１７５の全て；配列番号１７７～１８２の全て；配列番号１８３～１８４の両方；配列番号１８５～１８６の両方；配列番号１７７～１８２及び１８７～１８８の全て；配列番号１８３～１８４及び１８７～１８８の全て；配列番号１８９～１９４の全て；配列番号１９５～１９６の両方；配列番号１９７～１９８の両方；配列番号１８９～１９４及び１９９～２００の全て；又は配列番号１９５～１９６及び１９９～２００の全てのヌクレオチド配列を含む核酸は、マウスＴＣＲをコードする。
【0066】
本発明は、本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列、又は本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列に対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、核酸も提供する。
【0067】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、好ましくは、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。「高ストリンジェンシー条件」とは、ヌクレオチド配列が、非特異的ハイブリダイゼーションよりも検出可能に強い量で標的配列（本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高ストリンジェンシー条件としては、正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、又は散らばったミスマッチを少しだけ含有するポリヌクレオチドを、ヌクレオチド配列にマッチしたいくつかの小領域（例、３～１０塩基）を偶然有するランダム配列から識別する条件が挙げられる。かかる相補的な小領域は、１４～１７又はそれ以上の塩基の全長相補体よりも容易に融解され、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションにより、それらが容易に識別可能となる。比較的高ストリンジェンシーの条件としては、例えば、低塩及び／又は高温条件（約０．０２～０．１ＭのＮａＣｌ又は当量によって、約５０～７０℃の温度で提供される等）が挙げられる。かかる高ストリンジェンシー条件は、許容したとしても、ヌクレオチド配列とテンプレート鎖若しくは標的鎖との間のミスマッチをほとんど許容せず、本発明のＴＣＲのいずれかの発現を検出するのに特に好適である。条件は、漸増量のホルムアミドの添加によって、よりストリンジェントになり得ることが、一般的に理解される。
【0068】
本発明は、本明細書に記載の核酸のいずれかと、少なくとも約７０％以上（例、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％）同一であるヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。これに関して、核酸は、本明細書に記載のヌクレオチド配列のいずれかから実質的になり得る。
【0069】
本発明の核酸は、組換え発現ベクターに組み込まれ得る。これに関して、本発明は、本発明の核酸のいずれかを含む組換え発現ベクターを提供する。本発明の一実施形態においては、組換え発現ベクターは、α鎖、β鎖及びリンカーペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、一実施形態においては、組換え発現ベクターは、配列番号２１（α鎖及びβ鎖である配列番号１１及び１２を、それらの間に位置するリンカーと共にコードする）；配列番号１６３（α鎖及びβ鎖である配列番号１５７及び１５８を、それらの間に位置するリンカーと共にコードする）；配列番号２０２（α鎖及びβ鎖である配列番号１４５及び１４６を、それらの間に位置するリンカーと共にコードする）又は配列番号１７６（α鎖及びβ鎖である配列番号１３３及び１３４を、それらの間に位置するリンカーと共にコードする）のヌクレオチド配列を含む。
【0070】
本明細書における目的のためには、用語「組換え発現ベクター」とは、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの発現を可能にする、遺伝学的に改
変されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンストラクトを意味し、この場合、コンストラクトは、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ベクターは、細胞内でｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを発現させるのに十分な条件下で細胞と接触させられる。本発明のベクターは、全体としては天然には存在しない。しかし、該ベクターの一部は天然に存在し得る。本発明の組換え発現ベクターは、ＤＮＡ及びＲＮＡ（一本鎖又は二本鎖であり得、合成されるか、又は一部が天然のソースから得られ得、天然、非天然又は改変されたヌクレオチドを含有し得る）を含む（がこれらに限定されない）、任意のタイプのヌクレオチドを含み得る。組換え発現ベクターは、天然に存在するヌクレオチド間結合、天然に存在しないヌクレオチド間結合、又は両方のタイプの結合を含み得る。好ましくは、天然に存在しない又は改変されたヌクレオチド又はヌクレオチド間結合は、ベクターの転写や複製を妨害しない。
変されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンストラクトを意味し、この場合、コンストラクトは、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ベクターは、細胞内でｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを発現させるのに十分な条件下で細胞と接触させられる。本発明のベクターは、全体としては天然には存在しない。しかし、該ベクターの一部は天然に存在し得る。本発明の組換え発現ベクターは、ＤＮＡ及びＲＮＡ（一本鎖又は二本鎖であり得、合成されるか、又は一部が天然のソースから得られ得、天然、非天然又は改変されたヌクレオチドを含有し得る）を含む（がこれらに限定されない）、任意のタイプのヌクレオチドを含み得る。組換え発現ベクターは、天然に存在するヌクレオチド間結合、天然に存在しないヌクレオチド間結合、又は両方のタイプの結合を含み得る。好ましくは、天然に存在しない又は改変されたヌクレオチド又はヌクレオチド間結合は、ベクターの転写や複製を妨害しない。
【0071】
本発明の組換え発現ベクターは、任意の好適な組換え発現ベクターであり得、任意の好適な宿主細胞を形質転換又はトランスフェクションするために用いられ得る。好適なベクターとしては、プラスミド及びウイルス等の繁殖及び増幅のため、若しくは発現のため、又は両方のために設計されたベクターが挙げられる。ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から成る群から選択され得る。λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４及びλＮＭ１１４９等のバクテリオファージベクターも用いられ得る。植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ－Ｃｌ、ｐＭＡＭ及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。好ましくは、組換え発現ベクターは、ウイルスベクター（例、レトロウイルスベクター）である。特に好ましい実施形態においては、組換え発現ベクターはＭＳＧＶ１ベクターである。
【0072】
本発明の組換え発現ベクターは、例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上記）に記載されている標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて調製され得る。環状又は線状の発現ベクターのコンストラクトは、原核又は真核の宿主細胞において機能する複製系を含有するように調製され得る。複製系は、ＣｏｌＥｌ、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス等（例）に由来し得る。
【0073】
望ましくは、組換え発現ベクターは、適宜、ベクターがＤＮＡベースであるかＲＮＡベースであるかを考慮して、ベクターが導入される宿主細胞のタイプ（例、バクテリア、真菌、植物、又は動物）に特異的な、転写、並びに翻訳の開始及び終止コドン等の調節配列を含む。
【0074】
組換え発現ベクターは、形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞の選択を可能にする、１つ以上のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子は、殺生物剤耐性（例、抗生物質、重金属などに対する耐性）、原栄養性を提供するための栄養要求性宿主細胞における補完等を含む。本発明の発現ベクターに好適なマーカー遺伝子としては、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【0075】
組換え発現ベクターは、ＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列に、又は、ＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質をコードするヌクレ
オチド配列に相補的であるか、又はハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に結合した天然の、又は非天然のプロモーターを含み得る。プロモーターの選択（例、強力なプロモーター、弱いプロモーター、誘導プロモーター、組織特異的プロモーター及び発生特異的（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）プロモーター）は、当業者の通常の技術の範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列をプロモーターと組み合わせることも、当業者の技術の範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーター、又はウイルスプロモーター（例、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、及びマウス幹細胞ウイルス長鎖末端反復配列（ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）において見受けられるプロモーター）であり得る。
オチド配列に相補的であるか、又はハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に結合した天然の、又は非天然のプロモーターを含み得る。プロモーターの選択（例、強力なプロモーター、弱いプロモーター、誘導プロモーター、組織特異的プロモーター及び発生特異的（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）プロモーター）は、当業者の通常の技術の範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列をプロモーターと組み合わせることも、当業者の技術の範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーター、又はウイルスプロモーター（例、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、及びマウス幹細胞ウイルス長鎖末端反復配列（ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）において見受けられるプロモーター）であり得る。
【0076】
本発明の組換え発現ベクターは、一過性の発現のため、安定した発現のためのいずれか、又はその両方のために設計され得る。また、組換え発現ベクターは、構成的発現のため、又は誘導性発現のために作製され得る。
【0077】
更に、組換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製され得る。用語「自殺遺伝子」は、本明細書で用いる場合、自殺遺伝子を発現する細胞を死に至らしめる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、その遺伝子を発現する細胞に対し物質（例、薬物）に対する感受性を付与し、細胞が該物質と接触したとき又は該物質に曝露されたときに細胞を死に至らしめる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当該技術分野において公知であり、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びニトロレダクターゼが挙げられる。
【0078】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載の組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を更に提供する。用語「宿主細胞」は、本明細書で用いる場合、本発明の組換え発現ベクターを含有し得る任意の型の細胞を指す。宿主細胞は、真核細胞（例、植物、動物、真菌又は藻類）であり得、又は、原核細胞（例、バクテリア若しくは原生動物）であり得る。宿主細胞は、培養細胞、又は、初代細胞であり得、即ち、生物（例、ヒト）から直接単離され得る。宿主細胞は、接着細胞、又は、浮遊細胞、即ち、懸濁物中で増殖する細胞であり得る。好適な宿主細胞は、当該技術分野において公知であり、例えば、ＤＨ５α Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞等が挙げられる。組換え発現ベクターを増幅又は複製する目的のためには、宿主細胞は、好ましくは、原核細胞（例、ＤＨ５α細胞）である。組換えＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質を産生する目的のためには、宿主細胞は、好ましくは、哺乳動物細胞である。最も好ましくは、宿主細胞はヒト細胞である。宿主細胞は任意のタイプの細胞であり得、任意のタイプの組織由来であり得、任意の発生段階のものであり得るが、宿主細胞は、好ましくは、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）又は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。より好ましくは、宿主細胞は、Ｔ細胞である。
【0079】
本明細書における目的のためには、Ｔ細胞は、任意のＴ細胞（培養Ｔ細胞（例、初代Ｔ細胞）、若しくは培養Ｔ細胞株（例、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１など）由来のＴ細胞、又は哺乳動物から得られたＴ細胞等）であり得る。哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は、多数のソース（血液、骨髄、リンパ節、胸腺又は他の組織若しくは体液が含まれるが、これらに限定されない）から得られ得る。Ｔ細胞は、濃縮又は精製もされ得る。好ましくは、Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。Ｔ細胞は、任意のタイプのＴ細胞であり得、任意の発生段階のものであり得る（ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞（例、セントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞）、ナイーブＴ細胞等が挙げられるが、これらに限定されない）。
【0080】
本発明は、本明細書に記載の少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞集団も提供する。細胞集団は、少なくとも１つの他の細胞（例、組換え発現ベクターをいずれも含まない宿主細胞（例、Ｔ細胞）又はＴ細胞以外の細胞（例、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋細胞、脳細胞など））に加えて、記載される組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を含む、不均質な集団であり得る。或いは、細胞集団は、実質的に均質な集団であり得、該集団は、組換え発現ベクターを含む宿主細胞を主に含む（例、組換え発現ベクターを含む宿主細胞から実質的になる）。集団は細胞のクローン集団でもあり得、該集団の全ての細胞は、組換え発現ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンであり、その結果、集団の全ての細胞が組換え発現ベクターを含む。本発明の一実施形態においては、細胞集団は、本明細書に記載される通りの組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン集団である。
【0081】
本発明の一実施形態においては、集団中の細胞数が急速に増幅され得る。Ｔ細胞数の増幅は、例えば、米国特許第８，０３４，３３４号；米国特許第８，３８３，０９９号；米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３号；Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２６：３３２－４２（２００３）；及びＲｉｄｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２８：１８９－２０１（１９９０）に記載の通りの、当該技術分野で既知の多くの方法のいずれかによって達成され得る。一実施形態においては、Ｔ細胞数の増幅は、Ｔ細胞をＯＫＴ３抗体、ＩＬ－２、およびフィーダーＰＢＭＣ（例、放射線照射された同種異系ＰＢＭＣ）と共に培養することによって行われる。
【0082】
本発明は、本明細書に記載されるＴＣＲのいずれかの機能的部分に特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分を更に提供する。好ましくは、機能的部分（例、配列番号３、１２５、１３７、若しくは１４９（α鎖のＣＤＲ１）、配列番号４、１２６、１３８、若しくは１５０（α鎖のＣＤＲ２）、配列番号５、１２７、１３９、１５１、若しくは２０７（α鎖のＣＤＲ３）、配列番号６、１２８、１４０、若しくは１５２（β鎖のＣＤＲ１）、配列番号７、１２９、１４１、若しくは１５３（β鎖のＣＤＲ２）、配列番号８、１３０、１４２、若しくは１５４（β鎖のＣＤＲ３）、配列番号９、１３１、１４３、１５５、若しくは２０８（α鎖の可変領域）、配列番号１０、１３２、１４４、若しくは１５６（β鎖の可変領域）、又はそれらの組合せ（例、配列番号３～５；配列番号６～８；配列番号３～８；配列番号９；配列番号１０；配列番号９～１０；配列番号１２５～１２７、配列番号１２８～１３０、配列番号１２５～１３０、配列番号１３７～１３９、配列番号１４０～１４２、配列番号１３７～１４２、配列番号１４９～１５１、配列番号１４９～１５０及び２０７、配列番号１５２～１５４、配列番号１４９～１５４、配列番号１４９～１５０、２０７及び１５２～１５４；配列番号１３１～１３２、配列番号１４３～１４４、配列番号１５５～１５６；配列番号２０８；又は配列番号２０８及び１５６）のアミノ酸配列を含む機能的部分）は、がん抗原に特異的に結合する。より好ましくは、機能的部分は、配列番号３～８、配列番号９及び１０、配列番号１２５～１３０、配列番号１３７～１４２、配列番号１４９～１５４、配列番号１４９～１５０、２０７及び１５２～１５４、配列番号１３１～１３２、配列番号１４３～１４４、配列番号１５５～１５６、又は配列番号２０８及び１５６のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態においては、抗体又はその抗原結合部分は、６つのＣＤＲ（α鎖のＣＤＲ１～３及びβ鎖のＣＤＲ１～３）全てによって形成されるエピトープに結合する。抗体は、当該技術分野で公知の任意のタイプの免疫グロブリンであり得る。例えば、抗体は、任意のアイソタイプ（例、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ等）のものであり得る。抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであり得る。抗体は、天然に存在する抗体、例、哺乳動物（例、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスター、ヒト等）から単離及び／又は精製された抗体であり得る。或いは、抗体は、遺伝学的に操作された抗体（例、ヒト化抗体又はキメラ抗体）であり得る。抗体は、モノマー又はポリマー形態であり得る。また、抗体は、本発明
のＴＣＲの機能的部分に対し、任意のレベルの親和性又は結合活性を有し得る。望ましくは、抗体は、他のペプチド又はタンパク質と交差反応性が最小限であるように、本発明のＴＣＲの機能的部分に対し特異的である。
のＴＣＲの機能的部分に対し、任意のレベルの親和性又は結合活性を有し得る。望ましくは、抗体は、他のペプチド又はタンパク質と交差反応性が最小限であるように、本発明のＴＣＲの機能的部分に対し特異的である。
【0083】
本発明のＴＣＲの任意の機能的部分又は機能的変異体と結合する能力について、抗体を試験する方法が当該技術分野において公知であり、任意の抗原抗体結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降及び競合阻害アッセイ等）が挙げられる。
【0084】
抗体を作製する好適な方法は、当該技術分野において公知である。例えば、標準的なハイブリドーマ法は、Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、８ｔｈＥｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ（２０１１）（例））に記載されている。或いは、ＥＢＶ－ハイブリドーマ法、非ヒト動物において抗体を製造する方法、及びバクテリオファージベクター発現系等、他の方法が当該技術分野において公知である。
【0085】
ファージ提示法も、本発明の抗体を生成するために用いられ得る。これに関して、抗体の抗原結合可変（Ｖ）ドメインをコードするファージライブラリーは、標準的な分子生物学及び組換えＤＮＡ技術（例、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２０１２）参照）を使って生成され得る。所望の特異性を伴う可変領域をコードするファージは、所望の抗原への特異的結合に関して選択され、完全又は部分的抗体は、選択された可変ドメインを含むように再構成される。再構成された抗体をコードする核酸配列は、ハイブリドーマ産生に用いられる骨髄腫細胞等、好適な細胞株へと導入され、その結果、モノクローナル抗体の特性を有する抗体が細胞によって分泌される（例、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（上記）参照）。
【0086】
ヒト化抗体を生成するための方法は、当該技術分野において周知である。抗体は、特定の重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックであるトランスジェニックマウスによっても産生され得る。かかる方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（上記）に記載されている。
【0087】
本発明は、本明細書に記載される抗体のいずれかの抗原結合部分も提供する。抗原結合部分は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓＦｖ、ｓＦｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）及びトリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）等、少なくとも１つの抗原結合部位を有する任意の部分であり得る。
【0088】
単鎖可変領域断片（ｓＦｖ）抗体断片（これは、合成ペプチドを介して抗体軽鎖のＶドメインに連結された抗体重鎖の可変（Ｖ）ドメインを含む、切断型Ｆａｂ断片から成る）は、慣用的な組換えＤＮＡテクノロジー技術を用いて生成され得る（例、Ｊａｎｅｗａｙ
ｅｔ ａｌ．，（上記）参照）。同様に、ジスルフィド安定化可変領域断片（ｄｓＦｖ）は、組換えＤＮＡ技術によって調製され得る。しかしながら、本発明の抗体断片は、これらの例示的な抗体断片のタイプに限定されない。
ｅｔ ａｌ．，（上記）参照）。同様に、ジスルフィド安定化可変領域断片（ｄｓＦｖ）は、組換えＤＮＡ技術によって調製され得る。しかしながら、本発明の抗体断片は、これらの例示的な抗体断片のタイプに限定されない。
【0089】
また、抗体又はその抗原結合部分は、検出可能な標識（例えば、放射性同位体、蛍光色素分子（例、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ）、及び元素粒子（例、金粒子）等）を含むように修飾され得る。
【0090】
本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）、及び抗体（その抗原結合部分を含む）は、単離及び／又は精製され得る。用語「単離された」は、本明細書で用いる場合、その自然環境から取り出されたことを意味する。用語「精製された」は、本明細書で用いる場合、純度が増したことを意味するが、「純度」は、相対的な用語であって、必ずしも絶対的純度として解釈されるべきでない。例えば、純度は、少なくとも約５０％であり得、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％を超え得、又は１００％であり得る。
【0091】
本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）、及び抗体（その抗原結合部分を含む）は、これら全てが、以降、「本発明のＴＣＲ材料」と総称されるものであるが、医薬組成物等、組成物へと製剤化され得る。これに関して、本発明は、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）、及び抗体（その抗原結合部分を含む）のいずれか、並びに医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。本発明のＴＣＲ材料のいずれかを含有する本発明の医薬組成物は、１超の本発明のＴＣＲ材料（例、ポリペプチド及び核酸）又は２つ以上の異なるＴＣＲを含み得る。或いは、医薬組成物は、化学療法剤等、別の医薬的に活性な物質（複数可）又は薬剤（複数可）（例、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）など）と組み合わせて、本発明のＴＣＲ材料を含み得る。
【0092】
好ましくは、担体は医薬的に許容可能な担体である。医薬組成物に関して、担体は、考慮中の特定の本発明のＴＣＲ材料のために従来用いられているもののいずれかであり得る。かかる医薬的に許容可能な担体は、当業者に周知であり、公衆にとって容易に入手可能である。医薬的に許容可能な担体は、使用条件下で有害な副作用や毒性を有さないものであることが好ましい。
【0093】
担体の選択は、特定の本発明のＴＣＲ材料によって、そして本発明のＴＣＲ材料を投与するために用いられる特定の方法によってある程度決定される。従って、多様な、本発明の医薬組成物の好適な製剤がある。好適な製剤としては、経口、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内及び腹腔内投与のための、いずれかの製剤が挙げられ得る。本発明のＴＣＲ材料を投与するために、１超の路が用いられ得、特定の例においては、特定の経路が、別の経路よりも迅速且つ効果的な反応をもたらし得る。
【0094】
好ましくは、本発明のＴＣＲ材料は、注射により、静脈内（例）に投与される。本発明のＴＣＲ材料が、本発明のＴＣＲ（又はその機能的変異体）を発現する宿主細胞である場合には、注射用の細胞のための医薬的に許容可能な担体は、任意の等張性の担体、例えば、通常の生理食塩水（水中約０．９０％ ｗ／ｖのＮａＣｌ、水中約３００ｍＯｓｍ／ＬのＮａＣｌ、又は水１リットル当たり約９．０ｇのＮａＣｌ）、ＮＯＲＭＯＳＯＬ Ｒ電解質溶液（Ａｂｂｏｔｔ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ Ａ（Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、水中約５％のデキストロース、又は乳酸リンゲル液等が挙げられ得る。一実施形態においては、医薬的に許容可能な担体には、ヒト血清アルブミン（ａｌｂｕｍｅｎ）が補充される。
【0095】
本発明の目的のためには、投与される本発明のＴＣＲ材料の量又は用量（例、本発明の
ＴＣＲ材料が１つ以上の細胞の場合、細胞数）は、被験者又は動物において、適切な期間にわたって治療的又は予防的応答（例）をもたらすのに十分であるべきである。例えば、本発明のＴＣＲ材料の用量は、がん抗原（例、突然変異ＫＲＡＳ）と結合するのに、又は、投与時から約２時間以上、例、１２～２４時間以上という期間でがんを検出、治療若しくは予防するのに十分でなければならない。特定の実施形態においては、期間は、もっと長くなり得る。用量は、特定の本発明のＴＣＲ材料の有効性、及び動物（例、ヒト）の状態と、治療する動物（例、ヒト）の体重とによって決定される。
ＴＣＲ材料が１つ以上の細胞の場合、細胞数）は、被験者又は動物において、適切な期間にわたって治療的又は予防的応答（例）をもたらすのに十分であるべきである。例えば、本発明のＴＣＲ材料の用量は、がん抗原（例、突然変異ＫＲＡＳ）と結合するのに、又は、投与時から約２時間以上、例、１２～２４時間以上という期間でがんを検出、治療若しくは予防するのに十分でなければならない。特定の実施形態においては、期間は、もっと長くなり得る。用量は、特定の本発明のＴＣＲ材料の有効性、及び動物（例、ヒト）の状態と、治療する動物（例、ヒト）の体重とによって決定される。
【0096】
投与される用量を決定するための多くのアッセイが当該技術分野において公知である。本発明の目的のために、標的細胞が溶解される程度、又は、それぞれが異なる用量のＴ細胞を与えられた哺乳動物１セットのうち、１匹の哺乳動物へ、所与の用量のかかるＴ細胞を投与した際の、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を発現するＴ細胞によってＩＦＮ－γが分泌される程度を比較することを含むアッセイが、哺乳動物に投与する開始用量を決定するために用いられ得る。一定用量の投与の際の、標的細胞が溶解する程度、又はＩＦＮ－γが分泌される程度は、当該技術分野において公知の方法によってアッセイされ得る。
【0097】
本発明のＴＣＲ材料の用量は、特定の本発明のＴＣＲ材料の投与に伴い得る任意の有害な副作用の存在、性質及び程度によっても決定される。典型的には、主治医が、年齢、体重、全般的健康、食習慣、性別、投与する本発明のＴＣＲ材料、投与経路、及び治療されているがんの重篤度等、様々な要因を考慮に入れて、個々の患者を治療するための本発明のＴＣＲ材料の用量を決定する。本発明のＴＣＲ材料が細胞集団である実施形態においては、注入あたりで投与される細胞の数は、約１×１０６から約１×１０１２細胞又はより多く（例）まで変わり得る。特定の実施形態においては、１×１０６未満の細胞が投与され得る。
【0098】
本発明のＴＣＲ材料の治療効力又は予防効力を修飾によって増大させるために、本発明のＴＣＲ材料（ｉｎｖｅｎｔｉｖｅ ＴＣＲ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）が、いくつもの形に修飾され得ることを、当業者は容易に理解する。例えば、本発明のＴＣＲ材料は、直接的又は標的化部分への架橋物（ｂｒｉｄｇｅ）を介する間接的のいずれかでコンジュゲート化され得る。化合物（例、本発明のＴＣＲ材料）を標的化部分にコンジュゲート化する実務は、当該技術分野において公知である。用語「標的化部分」は、本明細書で用いる場合、細胞表面受容体を特異的に認識し、これに結合する任意の分子又は物質を指し、標的化部分は、該受容体が表面に発現する細胞の集団への、本発明のＴＣＲ材料の送達を指令する。標的化部分としては、細胞表面受容体（例、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、ＣＤ２８、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦ）、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）等）に結合する抗体又はその断片、ペプチド、ホルモン、成長因子、サイトカイン、及び他の任意の天然リガンド又は非天然リガンドが挙げられるが、これらに限定されない。用語「架橋物」は、本明細書で用いる場合、本発明のＴＣＲ材料を標的化部分に連結させる任意の物質又は分子を指す。当業者は、本発明のＴＣＲ材料の機能には必要でない、本発明のＴＣＲ材料における部位が、架橋物及び／又は標的化部分を結合させるのに理想的な部位であると認識する（但し、架橋物及び／又は標的化部分は、本発明のＴＣＲ材料に結合して、本発明のＴＣＲ材料の機能（即ち、突然変異標的（例、突然変異ＫＲＡＳ）に結合する能力、又はがんを検出、治療若しくは予防する能力）を妨害しないものとする）。
【0099】
本発明の医薬組成物、ＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞又は細胞集団が、がんの治療又は予防の方法において用いられ得ることが検討される。特定の理論には縛られないが、本発明のＴＣＲは、突然変異標的（例、突然変異
ＫＲＡＳ）に特異的に結合すると考えられ、その結果、ＴＣＲ（又は関連する本発明のポリペプチド又はタンパク質）が、細胞に発現すると、突然変異標的（例、突然変異ＫＲＡＳ）を発現する標的細胞に対する免疫反応を調節することができる。これに関して、本発明は、哺乳動物におけるがんの治療又は予防の方法であって、本明細書に記載の医薬組成物、ＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質のいずれか、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む、任意の核酸又は組換え発現ベクター、又は本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド若しくはタンパク質のいずれかをコードする組換えベクターを含む任意の宿主細胞又は細胞集団を、哺乳動物におけるがんを治療又は予防するのに有効な量で、哺乳動物に投与することを含む、方法を提供する。
ＫＲＡＳ）に特異的に結合すると考えられ、その結果、ＴＣＲ（又は関連する本発明のポリペプチド又はタンパク質）が、細胞に発現すると、突然変異標的（例、突然変異ＫＲＡＳ）を発現する標的細胞に対する免疫反応を調節することができる。これに関して、本発明は、哺乳動物におけるがんの治療又は予防の方法であって、本明細書に記載の医薬組成物、ＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質のいずれか、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む、任意の核酸又は組換え発現ベクター、又は本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド若しくはタンパク質のいずれかをコードする組換えベクターを含む任意の宿主細胞又は細胞集団を、哺乳動物におけるがんを治療又は予防するのに有効な量で、哺乳動物に投与することを含む、方法を提供する。
【0100】
本発明の実施形態は、哺乳動物におけるがんの治療又は予防において用いるための、本明細書に記載の医薬組成物、ＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む任意の核酸若しくは組換え発現ベクター、又は本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質のいずれかをコードする組換えベクターを含む任意の宿主細胞又は細胞集団のいずれかを提供する。
【0101】
用語「治療する」及び「予防する」並びにそれらの派生語は、本明細書で用いる場合、１００％の、又は完全な治療又は予防を必ずしも意味しない。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する、様々な程度の治療又は予防が存在する。これに関して、本発明の方法は、任意のレベルの任意の量の、哺乳動物におけるがんの治療又は予防を提供し得る。更に、本発明の方法が提供する治療又は予防は、治療又は予防されている１つ以上の、がんの状態又は症状の治療又は予防を含み得る。例えば、治療又は予防は、腫瘍の退行を促進することを含み得る。また、本明細書における目的のために、「予防」は、がんの発症、又はその症状若しくは状態を遅延させることを包含し得る。
【0102】
哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法も提供される。該方法は、（ｉ）哺乳動物由来の１つ以上の細胞を含む試料と、本明細書に記載の、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、抗体若しくはその抗原結合部分、又は医薬組成物のいずれかとを接触させ、それによって複合体を形成すること、及び該複合体を検出することを含み、該複合体の検出が哺乳動物におけるがんの存在を示す。
【0103】
哺乳動物におけるがんを検出する本発明の方法に関して、細胞の試料は、全細胞、その溶解物、又は全細胞溶解物の画分（例、核若しくは細胞質画分、全タンパク質画分、又は核酸画分）を含む試料であり得る。
【0104】
本発明の検出方法の目的のためには、接触は、哺乳動物に関してインビトロ又はインビボで行い得る。好ましくは、接触はインビトロである。
【0105】
また、複合体の検出は、当該技術分野で公知の、任意の数の方法によって行い得る。例えば、本明細書に記載の本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、又は抗体、若しくはその抗原結合部分は、例えば、放射性同位体、蛍光色素（例、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、及び元素粒子（例、金粒子）等の検出可能な標識で標識され得る。
【0106】
宿主細胞又は細胞集団が投与される、本発明の方法の目的のためには、細胞は、哺乳動物に対して同種異系又は自己の細胞であり得る。好ましくは、細胞は哺乳動物に対して自
己である。
己である。
【0107】
本発明の方法に関して、がんは、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、肺胞横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん、肛門、肛門管又は肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頸部、胆嚢又は胸膜のがん、鼻、鼻腔、又は中耳のがん、口腔のがん、膣のがん、外陰のがん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、結腸直腸（ｃｏｌｏｃｒｅｃｔａｌ）がん、子宮内膜がん、食道がん、子宮頸がん、胃腸カルチノイド腫瘍、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、口腔咽頭のがん、卵巣がん、陰茎のがん、膵臓がん、腹膜がん、大網がん及び腸間膜がん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎臓がん、皮膚がん、小腸がん、軟部組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮のがん、尿管がん及び膀胱がんのいずれかを含む、任意のがんであり得る。好ましいがんは（ｃａｎｃｅｒ ｉｓ ｃａｎｃｅｒ ｉｓ）、膵臓がん、結腸直腸がん、肺がん、子宮内膜がん、卵巣がん、又は前立腺がんである。好ましくは、肺がんは肺腺がんであり、卵巣がんは上皮性卵巣がんであり、膵臓がんは膵臓上皮がんである。別の好ましい実施形態においては、がんは、突然変異ヒトＫＲＡＳ、突然変異ヒトＮＲＡＳおよび突然変異ヒトＨＲＡＳに存在する、ＶＶＶＧＡＤＧＶＧＫ（配列番号２）、ＶＶＧＡＤＧＶＧＫ（配列番号３４）、ＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（配列番号３３）又はＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（配列番号３５）の突然変異アミノ酸配列が発現するがんである。
【0108】
本発明の方法において哺乳動物というのは、任意の哺乳動物であり得る。用語「哺乳動物」は、本明細書で用いる場合、マウス及びハムスター等、ネズミ目の哺乳動物、及びウサギ等、ウサギ目の哺乳動物を含むが、これらに限定されない、任意の哺乳動物を指す。哺乳動物が、ネコ科の動物（ネコ）及びイヌ科の動物（イヌ）を含むネコ目由来であることが好ましい。哺乳動物が、ウシ科の動物（ウシ）及びイノシシ科の動物（ブタ）を含むウシ目、又はウマ科の動物（ウマ）を含むウマ目（Ｐｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）由来であることが、より好ましい。哺乳動物が、霊長目、セボイド（Ｃｅｂｏｉｄｓ）目若しくはシモイド（Ｓｉｍｏｉｄｓ）目（サル）又は、類人（Ａｎｔｈｒｏｐｏｉｄｓ）目（ヒト及び類人猿）であることが、最も好ましい。特に好ましい哺乳動物は、ヒトである。
【0109】
以下の実施例は、本発明を更に説明するが、もちろん、決してその範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【実施例】
【0110】
実施例１
本実施例は、マウス抗ＫＲＡＳ７－１６ Ｇ１２Ｄ １０マー ＴＣＲの単離を実例で示す。
本実施例は、マウス抗ＫＲＡＳ７－１６ Ｇ１２Ｄ １０マー ＴＣＲの単離を実例で示す。
【0111】
コンピュータアルゴリズムを用いて、候補ＨＬＡ－Ａ１１＊０１ＫＲＡＳペプチドを作成した。該アルゴリズムに関しては、強い結合剤閾値は５０ｎＭ、弱い結合剤閾値は５００ｎＭであった。候補ペプチドを表１に示す。
【0112】
【表7】
【0113】
Ｇ１２Ｄ １０マーペプチド（配列番号２）で、ＨＬＡ－Ａ１１トランスジェニックマウスを３回免疫した。３回目の免疫後、脾臓及びリンパ節を取り出し、様々な濃度（１μＭ、０．１μＭ及び０．０１μＭ）のＧ１２Ｄ １０マーペプチドと共にインビトロで７日間培養した。リンパ節（ＬＮ）及び脾臓培養物から単離したＴ細胞を、（ｉ）（ａ）ペプチドなし（ＣＯＳ／Ａ１１）、（ｂ）ＷＴ ＫＲＡＳ７－１６ペプチド（配列番号３０）（ＣＯＳ／Ａ１１＋ＷＴペプチド）、（ｃ）Ｇ１２Ｄ １０マーペプチド（配列番号２）（ＣＯＳ／Ａ１１＋Ｇ１２Ｄペプチド）、又は（ｄ）Ｇ１２Ｖ １０マーペプチド（配列番号３３）（ＣＯＳ／Ａ１１＋Ｇ１２Ｖペプチド）でパルスした、ＨＬＡ－Ａ１１を発現するように形質導入したＣＯＳ７細胞（ＣＯＳ７／Ａ１１）；及び（ｉｉ）（ａ）ＷＴ
ＫＲＡＳミニ遺伝子（２３マーの配列番号１１８をコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／ＷＴ）又は（ｂ）Ｇ１２Ｄミニ遺伝子（２３マーの配列番号１１９をコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／Ｇ１２Ｄ）をコードするベクターでトランスフェクションしたＣＯＳ７／Ａ１１細胞に対する反応性について試験した。インターフェロン（ＩＦＮ）－γを測定した。結果を表２Ａ（パルスした標的細胞）及び表２Ｂ（トランスフェクションした標的細胞）に示す。表２Ａ及び２Ｂに示す通り、ＨＬＡ－Ａ１１拘束性マウスＴ細胞は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄペプチド（配列番号２）に対して反応性であった。
ＫＲＡＳミニ遺伝子（２３マーの配列番号１１８をコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／ＷＴ）又は（ｂ）Ｇ１２Ｄミニ遺伝子（２３マーの配列番号１１９をコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／Ｇ１２Ｄ）をコードするベクターでトランスフェクションしたＣＯＳ７／Ａ１１細胞に対する反応性について試験した。インターフェロン（ＩＦＮ）－γを測定した。結果を表２Ａ（パルスした標的細胞）及び表２Ｂ（トランスフェクションした標的細胞）に示す。表２Ａ及び２Ｂに示す通り、ＨＬＡ－Ａ１１拘束性マウスＴ細胞は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄペプチド（配列番号２）に対して反応性であった。
【0114】
【表8】
【0115】
【表9】
【0116】
ｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅（ＲＡＣＥ）を用いて、各陽性ウェル中の細胞からＴＣＲを単離した。２つの支配的なアルファ鎖と４つの支配的なベータ鎖を同定した（表３）。
【0117】
【表10】
【0118】
実施例２
本実施例は、配列番号１１を含むＴＣＲα鎖及び配列番号１２を含むＴＣＲβ鎖を発現するよう形質導入したＰＢＬが、ＨＬＡ－Ａ１１＋／Ｇ１２Ｄ １０マー＋の標的に対して反応性であることを実証する。
本実施例は、配列番号１１を含むＴＣＲα鎖及び配列番号１２を含むＴＣＲβ鎖を発現するよう形質導入したＰＢＬが、ＨＬＡ－Ａ１１＋／Ｇ１２Ｄ １０マー＋の標的に対して反応性であることを実証する。
【0119】
表３の２つの支配的なα鎖及び４つの支配的なβ鎖を、個別に、ＭＳＧＶ１レトロウイルスベクターにクローニングした。表４に示す通り、ＰＢＬを、α鎖およびβ鎖の様々な対のうちの１つを発現するよう、個別に共形質導入した。形質導入ＰＢＬを、（ｉ）（ａ）Ｇ１２Ｄ １０マーペプチド（配列番号２）、（ｂ）Ｇ１２Ｖ １０マーペプチド（配
列番号３３）、（ｃ）ＷＴ ＫＲＡＳ １０マーペプチド（配列番号３０）、若しくは（ｄ）ペプチドなし（なし）でパルスした、ＨＬＡ－Ａ１１を発現するＴ２／Ａ１１＋（表４Ａ）若しくはＣＯＳ７／Ａ１１＋（表４Ｂ）の細胞；又は（ｉｉ）（ａ）Ｇ１２Ｄミニ遺伝子（２３マーの配列番号１１９をコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／Ｇ１２Ｄ）、（ｂ）Ｇ１２Ｖミニ遺伝子（２３マーの配列番号１２０をコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／Ｇ１２Ｖ）、（ｃ）ＷＴ ＫＲＡＳミニ遺伝子（２３マーの配列番号１１８コードする）（ＣＯＳ７／Ａ１１／ＷＴ）で形質導入したＣＯＳ７／Ａ１１細胞、若しくは（ｄ）細胞なし（培地のみ）（表４Ｃ）に対する反応性についてスクリーニングした。ＩＦＮ－γ分泌を測定した。結果を表４Ａ～Ｃに示す。表４Ａ～Ｃにおいて、太字のＩＦＮ－γ分泌値は、反応性を示したＴＣＲα鎖及びβ鎖の対を示し、下線付き太字のＩＦＮ－γ分泌値は、最良の反応性を示したＴＣＲα鎖及びβ鎖の対を示す。表４Ａ～Ｃに示す通り、マウスＴＣＲα鎖ＴＲＡＶ１２Ｎ－３＊０１（配列番号１１）及びマウスＴＣＲβ鎖ＴＲＢＶ４＊０１（配列番号１２）を発現するよう共形質導入したＰＢＬは、Ｇ１２Ｄ １０マーでパルスしたＨＬＡ－Ａ１１発現ＣＯＳ７細胞又はＧ１２Ｄトランスフェクタントの標的細胞に対し反応性を示した。
列番号３３）、（ｃ）ＷＴ ＫＲＡＳ １０マーペプチド（配列番号３０）、若しくは（ｄ）ペプチドなし（なし）でパルスした、ＨＬＡ－Ａ１１を発現するＴ２／Ａ１１＋（表４Ａ）若しくはＣＯＳ７／Ａ１１＋（表４Ｂ）の細胞；又は（ｉｉ）（ａ）Ｇ１２Ｄミニ遺伝子（２３マーの配列番号１１９をコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／Ｇ１２Ｄ）、（ｂ）Ｇ１２Ｖミニ遺伝子（２３マーの配列番号１２０をコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／Ｇ１２Ｖ）、（ｃ）ＷＴ ＫＲＡＳミニ遺伝子（２３マーの配列番号１１８コードする）（ＣＯＳ７／Ａ１１／ＷＴ）で形質導入したＣＯＳ７／Ａ１１細胞、若しくは（ｄ）細胞なし（培地のみ）（表４Ｃ）に対する反応性についてスクリーニングした。ＩＦＮ－γ分泌を測定した。結果を表４Ａ～Ｃに示す。表４Ａ～Ｃにおいて、太字のＩＦＮ－γ分泌値は、反応性を示したＴＣＲα鎖及びβ鎖の対を示し、下線付き太字のＩＦＮ－γ分泌値は、最良の反応性を示したＴＣＲα鎖及びβ鎖の対を示す。表４Ａ～Ｃに示す通り、マウスＴＣＲα鎖ＴＲＡＶ１２Ｎ－３＊０１（配列番号１１）及びマウスＴＣＲβ鎖ＴＲＢＶ４＊０１（配列番号１２）を発現するよう共形質導入したＰＢＬは、Ｇ１２Ｄ １０マーでパルスしたＨＬＡ－Ａ１１発現ＣＯＳ７細胞又はＧ１２Ｄトランスフェクタントの標的細胞に対し反応性を示した。
【0120】
【表11】
【0121】
【表12】
【0122】
【表13】
【0123】
実施例３
本実施例は、配列番号１１を含むＴＣＲα鎖及び配列番号１２を含むＴＣＲβ鎖で共形質導入したＰＢＬが、ＨＬＡ－Ａ１１＋／Ｇ１２Ｄ＋の膵臓腫瘍細胞株ＦＡ６－２／Ａ１１に対して反応性であることを実証する。
本実施例は、配列番号１１を含むＴＣＲα鎖及び配列番号１２を含むＴＣＲβ鎖で共形質導入したＰＢＬが、ＨＬＡ－Ａ１１＋／Ｇ１２Ｄ＋の膵臓腫瘍細胞株ＦＡ６－２／Ａ１１に対して反応性であることを実証する。
【0124】
ヒトＰＢＬを、配列番号１１を含むＴＣＲα鎖及び配列番号１２を含むＴＣＲβ鎖で共形質導入した。共形質導入細胞を、（ｉ）（ａ）ＨＬＡ－Ａ１１単独でトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞（ＣＯＳ７／Ａ１１）又は（ｂ）ＷＴ ＫＲＡＳミニ遺伝子（２３マーの配列番号１１８をコードする）（ＣＯＳ７／Ａ１１／ＫＲＡＳ ＷＴ）、（ｃ）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄミニ遺伝子（２３マーの配列番号１１９をコードする）（ＣＯＳ７／Ａ１１／ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ）、（ｄ）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖミニ遺伝子（２３マーの配列番号１２０をコードする）（ＣＯＳ７／Ａ１１／ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ）で形質導入した、ＨＬＡ－Ａ１１でトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞；（ｉｉ）膵臓腫瘍細胞株Ｍｉａ－Ｐａｃａ２／Ａ１１、Ｔ３ｍ４／Ａ１１、ＡｓＰＣ－１、ＦＡ６－２／Ａ１１、ＭＤＡ－Ｐａｎｃ－４８／Ａ１１、ＰＡＮＣ－１、ＰＫ－４５ｐ／Ａ１１、ＳＫ．ＰＣ．３／Ａ１１、ｘ１３５ｍ１／Ａ１１、又は（ｉｉｉ）培地単独と共培養した。ＩＦＮ－γ分泌を測定した。結果を表５に示す。腫瘍細胞株のＫＲＡＳ突然変異を括弧内に示す。表５に示す通り、ＴＣＲα鎖ＴＲＡＶ１２Ｎ－３＊０１（配列番号１１）及びＴＣＲβ鎖ＴＲＢＶ４＊０１（配列番号１２）で共形質導入したＰＢＬは、ＨＬＡ－Ａ１１＋／Ｇ１２Ｄ＋の膵臓腫瘍細胞株ＦＡ６－２／Ａ１１に対し反応性を示した。
【0125】
【表14】
【0126】
実施例４
本実施例は、ＴＣＲα鎖ＴＲＡＶ１２Ｎ－３＊０１（配列番号１１）及びＴＣＲβ鎖ＴＲＢＶ４＊０１（配列番号１２）をコードするレトロウイルスベクターで形質導入したＰＢＬが、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ １０マーペプチド（配列番号２）でパルスしたＣＯＳ７／Ａ１１細胞に対し、反応性を示すことを実証する。
本実施例は、ＴＣＲα鎖ＴＲＡＶ１２Ｎ－３＊０１（配列番号１１）及びＴＣＲβ鎖ＴＲＢＶ４＊０１（配列番号１２）をコードするレトロウイルスベクターで形質導入したＰＢＬが、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ １０マーペプチド（配列番号２）でパルスしたＣＯＳ７／Ａ１１細胞に対し、反応性を示すことを実証する。
【0127】
ヒトＰＢＬを、ＴＣＲα鎖ＴＲＡＶ１２Ｎ－３＊０１（配列番号１１）及びＴＣＲβ鎖ＴＲＢＶ４＊０１（配列番号１２）をコードするレトロウイルスベクターで形質導入した。形質導入したＰＢＬを、表６に示す様々な濃度の、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ １０マーペプチド（配列番号２）、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ９マーペプチド（配列番号３４）、ＫＲＡＳ
Ｇ１２Ｄ ９マーペプチド（配列番号１２４）、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ １０マーペプチド（配列番号３３）、又はＷＴ ＫＲＡＳ １０マーペプチド（配列番号３０）でパルスしたＣＯＳ７／Ａ１１細胞と共培養した。ＩＦＮ－γ分泌を測定した。結果を表６に示す。表６に示す通り、ＴＣＲα鎖ＴＲＡＶ１２Ｎ－３＊０１（配列番号１１）及びＴＣＲβ鎖ＴＲＢＶ４＊０１（配列番号１２）を発現するよう形質導入したヒトＰＢＬは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ １０マーペプチド（配列番号２）でパルスしたＣＯＳ７／Ａ１１細胞に対し反応性を示した。
Ｇ１２Ｄ ９マーペプチド（配列番号１２４）、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ １０マーペプチド（配列番号３３）、又はＷＴ ＫＲＡＳ １０マーペプチド（配列番号３０）でパルスしたＣＯＳ７／Ａ１１細胞と共培養した。ＩＦＮ－γ分泌を測定した。結果を表６に示す。表６に示す通り、ＴＣＲα鎖ＴＲＡＶ１２Ｎ－３＊０１（配列番号１１）及びＴＣＲβ鎖ＴＲＢＶ４＊０１（配列番号１２）を発現するよう形質導入したヒトＰＢＬは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ １０マーペプチド（配列番号２）でパルスしたＣＯＳ７／Ａ１１細胞に対し反応性を示した。
【0128】
【表15】
【0129】
実施例５
本実施例は、ＴＣＲα鎖ＴＲＡＶ１２Ｎ－３＊０１（配列番号１１）及びＴＣＲβ鎖ＴＲＢＶ４＊０１（配列番号１２）をコードするレトロウイルスベクターで形質導入したＰＢＬが、ＨＬＡ－Ａ１１を発現する膵臓腫瘍株ＦＡ６－２／Ａ１１に対し、反応性を示すことを実証する。
本実施例は、ＴＣＲα鎖ＴＲＡＶ１２Ｎ－３＊０１（配列番号１１）及びＴＣＲβ鎖ＴＲＢＶ４＊０１（配列番号１２）をコードするレトロウイルスベクターで形質導入したＰＢＬが、ＨＬＡ－Ａ１１を発現する膵臓腫瘍株ＦＡ６－２／Ａ１１に対し、反応性を示すことを実証する。
【0130】
ヒトＰＢＬを、ＴＣＲα鎖ＴＲＡＶ１２Ｎ－３＊０１（配列番号１１）及びＴＣＲβ鎖ＴＲＢＶ４＊０１（配列番号１２）をコードするレトロウイルスベクターで形質導入した。非形質導入のコントロールＰＢＬ又は形質導入ＰＢＬを、表７に示す標的細胞と共培養した。ＩＦＮ－γ分泌を測定した。結果を表７に示す。腫瘍細胞株のＫＲＡＳ変異を括弧内に示す。表７に示す通り、ＴＣＲα鎖ＴＲＡＶ１２Ｎ－３＊０１（配列番号１１）及びＴＣＲβ鎖ＴＲＢＶ４＊０１（配列番号１２）を発現するよう形質導入したヒトＰＢＬは、ＦＡ６－２／Ａ１１腫瘍細胞株に対し反応性を示した。非形質導入ＰＢＬは、表７に記載の各標的細胞との共培養の際に、１００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＦＮ－γを分泌した。
【0131】
【表16】
【0132】
実施例６
本実施例は、マウス抗ＫＲＡＳ７－１６ Ｇ１２Ｖ １０マーＴＣＲの単離を実例で示す。
本実施例は、マウス抗ＫＲＡＳ７－１６ Ｇ１２Ｖ １０マーＴＣＲの単離を実例で示す。
【0133】
Ｇ１２Ｖ １０マーペプチド（配列番号３３）で、ＨＬＡ－Ａ１１トランスジェニックマウスを２回免疫した。２回目の免疫後、脾臓及びリンパ節を取り出し、Ｇ１２Ｖ １０マーペプチドを用いて、様々な濃度（１μＭ、０．１μＭ及び０．０１μＭ）で７日間、インビトロで培養した。リンパ節及び脾臓培養物から単離したＴ細胞を、（ｉ）（ａ）Ｇ１２Ｖミニ遺伝子（２３マーの配列番号１２０をコードする）（ＣＯＳＡ１１／Ｇ１２Ｖ）；（ｂ）ＷＴ ＫＲＡＳミニ遺伝子（２３マーの配列番号１１８をコードする）（ＣＯＳＡ１１／ＷＴ）；（ｃ）Ｇ１２Ｄミニ遺伝子（２３マーの配列番号１１９をコードする）（ＣＯＳＡ１１／Ｇ１２Ｄ）をコードするベクターでトランスフェクションしたＣＯＳ７／Ａ１１細胞；（ｉｉ）ＨＬＡ－Ａ１１を発現するＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ＋の膵腫瘍細胞株Ｐａｃａ４４／Ａ１１、ＳＫＰＣ３／Ａ１１、若しくはｘ１３５ｍ１／Ａ１１；又は（ｉｉｉ）標的細胞なし（培地）に対する反応性について試験した（表８）。結果を表８に示す。表８において、下線付きのＩＦＮ－γ分泌値は、トランスフェクタント及び腫瘍に対する反応性を示した細胞を示す。
【0134】
【表17】
【0135】
５’ＲＡＣＥを用いて、非常に特異的な、Ｇ１２Ｖペプチドとトランスフェクタントとの反応性を示した細胞からオリゴクローナルＴＣＲを単離した。支配的な２つのアルファ鎖及び支配的な３つのベータ鎖を同定した（表９）。
【0136】
【表18】
【0137】
実施例７
本実施例は、（ｉ）配列番号１３３を含むＴＣＲα鎖及び配列番号１３４を含むＴＣＲβ鎖、又は（ｉｉ）配列番号１４５を含むＴＣＲα鎖及び配列番号１４６を含むＴＣＲβを発現するよう形質導入したＰＢＬが、ＨＬＡ－Ａ１１＋／Ｇ１２Ｖ １０マー＋の標的に対して反応性であることを実証する。
本実施例は、（ｉ）配列番号１３３を含むＴＣＲα鎖及び配列番号１３４を含むＴＣＲβ鎖、又は（ｉｉ）配列番号１４５を含むＴＣＲα鎖及び配列番号１４６を含むＴＣＲβを発現するよう形質導入したＰＢＬが、ＨＬＡ－Ａ１１＋／Ｇ１２Ｖ １０マー＋の標的に対して反応性であることを実証する。
【0138】
表９の２つの支配的なα鎖及び３つの支配的なβ鎖を、ＭＳＧＶ１レトロウイルスベクターに個々にクローニングした。表１０Ａ～１０Ｂに示す通り、抗ＣＤ３刺激ＰＢＬを個々に共形質導入して、α鎖及びβ鎖の様々な対のうちの１つを発現させた。形質導入したＰＢＬを、（ｉ）（ａ）Ｇ１２Ｄ １０マーペプチド（配列番号２）、（ｂ）Ｇ１２Ｖ １０マーペプチド（配列番号３３）、若しくは（ｃ）ＷＴ ＫＲＡＳ １０マーペプチド（配列番号３０）でパルスした、ＣＯＳ７／Ａ１１＋の細胞（表１０Ａ）又は（ｉｉ）（ａ）Ｇ１２Ｄミニ遺伝子（２３マーの配列番号１１９をコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／Ｇ１２Ｄ）、（ｂ）Ｇ１２Ｖミニ遺伝子（２３マーの配列番号１２０をコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／Ｇ１２Ｖ）、若しくは（ｃ）ＷＴ ＫＲＡＳミニ遺伝子（２３マーの配列番号１１８をコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／ＷＴ）で形質導入したＣＯＳ７／Ａ１１細胞（表１０Ｂ）に対する反応性に関してスクリーニングした。ペプチドでパルスしなかった非形質導入Ｃｏｓ７／Ａ１１細胞（Ｃｏｓ７／Ａ１１）及び細胞を含まない培地（培地）をネガティブコントロールとして用いた。ＧＦＰでパルス又は形質導入したＰＢＬはポジティブコントロールとして用いた。ＩＦＮ－γ分泌を測定した。
【0139】
結果を表１０Ａ～１０Ｂに示す。表１０Ａ～１０Ｂにおいて、太字のＩＦＮ－γ分泌値は、反応性を示したＴＣＲα鎖及びβ鎖の対を示す。表１０Ａ～１０Ｂに示す通り、（ｉ
）マウスＴＣＲα鎖ＴＲＡＶ１９＊０１（配列番号１４５）及びマウスＴＣＲβ鎖ＴＲＢＶ１３－１＊０２（配列番号１４６）又は（ｉｉ）マウスＴＣＲα鎖ＴＲＡＶ３－３＊０１（配列番号１３３）及びマウスＴＣＲβ鎖ＴＲＢＶ４＊０１（配列番号１３４）の両方を発現するよう共形質導入したＰＢＬが、Ｇ１２Ｖ １０マーでパルスしたＨＬＡ－Ａ１１発現ＣＯＳ７細胞又はＧ１２Ｖトランスフェクタント標的細胞に対する反応性を示したが、コントロールのペプチド又はコントロールのトランスフェクタントにはそうではなかった。
）マウスＴＣＲα鎖ＴＲＡＶ１９＊０１（配列番号１４５）及びマウスＴＣＲβ鎖ＴＲＢＶ１３－１＊０２（配列番号１４６）又は（ｉｉ）マウスＴＣＲα鎖ＴＲＡＶ３－３＊０１（配列番号１３３）及びマウスＴＣＲβ鎖ＴＲＢＶ４＊０１（配列番号１３４）の両方を発現するよう共形質導入したＰＢＬが、Ｇ１２Ｖ １０マーでパルスしたＨＬＡ－Ａ１１発現ＣＯＳ７細胞又はＧ１２Ｖトランスフェクタント標的細胞に対する反応性を示したが、コントロールのペプチド又はコントロールのトランスフェクタントにはそうではなかった。
【0140】
【表19】
【0141】
【表20】
【0142】
実施例８
本実施例は、ＴＲＡＶ３－３＊０１／ＴＲＢＶ４＊０１マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲ（配列番号１３３及び１３４）が、ＴＲＡＶ１９＊０１／ＴＲＢＶ１３－１＊０２マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲ（配列番号１４５及び１４６）と比較して、パルスした標的ペプチドに対し、より高い親和性を有することを実証する。
本実施例は、ＴＲＡＶ３－３＊０１／ＴＲＢＶ４＊０１マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲ（配列番号１３３及び１３４）が、ＴＲＡＶ１９＊０１／ＴＲＢＶ１３－１＊０２マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲ（配列番号１４５及び１４６）と比較して、パルスした標的ペプチドに対し、より高い親和性を有することを実証する。
【0143】
ＰＢＬを、（ｉ）ＴＲＡＶ３－３＊０１／ＴＲＢＶ４＊０１マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲ（配列番号１３３及び１３４）又は（ｉｉ）ＴＲＡＶ１９＊０１／ＴＲＢＶ１３－１＊０２マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲ（配列番号１４５及び１４６）のいずれかで形質導入した。形質導入した細胞を、表１１Ａ及び１１Ｂに示す濃度の、（ａ）Ｇ１２Ｄ １０マーペプチド（配列番号２）、（ｂ）Ｇ１２Ｖ １０マーペプチド（配列番号３３）、（ｃ）ＷＴ ＫＲＡＳ１０マーペプチド（配列番号３０）、（ｄ）Ｇ１２Ｄ ９マーペプチド（配列番号３４）、又は（ｅ）Ｇ１２Ｖ ９マーペプチド（配列番号３５
）でパルスしたＣｏｓ７／Ａ１１細胞と共培養した。ＩＦＮ－γ分泌を測定した。
）でパルスしたＣｏｓ７／Ａ１１細胞と共培養した。ＩＦＮ－γ分泌を測定した。
【0144】
結果を表１１Ａ（ＴＲＡＶ３－３＊０１／ＴＲＢＶ４＊０１（配列番号１３３及び１３４））及び表１１Ｂ（ＴＲＡＶ１９＊０１／ＴＲＢＶ１３－１＊０２（配列番号１４５及び１４６））に示す。表１１Ａ～１１Ｂにおいて、太字のＩＦＮ－γ分泌値は、ＴＣＲが反応性を示した標的ペプチド濃度を示す。表１１Ａ～１１Ｂに示す通り、ＴＲＡＶ３－３＊０１／ＴＲＢＶ４＊０１ＴＣＲ（配列番号１３３及び１３４）で形質導入したＴ細胞は、９マー及び１０マーの両方のペプチドでパルスしたＣｏｓ７／Ａ１１を認識し、濃度０．０１ｎＭでパルスした９マーを認識した。従って、ＴＲＡＶ３－３＊０１／ＴＲＢＶ４＊０１ＴＣＲ（配列番号：１３３及び１３４）は、ＴＲＡＶ１９＊０１／ＴＲＢＶ１３－１＊０２（配列番号：１４５及び１４６）ＴＣＲと比較して、より高い結合活性を伴って、パルスした標的ペプチドを認識した。ＴＲＡＶ３－３＊０１／ＴＲＢＶ４＊０１（配列番号１４５及び１４６）ＴＣＲの、Ｇ１２Ｖ ９マーペプチドに対する反応性が、１０マーペプチドと比較して増加したことにより、９マーペプチドが最小の決定因子であることも示唆された。
【0145】
【表21】
【0146】
【表22】
【0147】
実施例９
本実施例は、ＴＲＡＶ３－３＊０１／ＴＲＢＶ４＊０１マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲ（配列番号１３３及び１３４）が、ＨＬＡ－Ａ１１＋ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ＋の膵臓腫瘍細胞株を認識することを実証する。
本実施例は、ＴＲＡＶ３－３＊０１／ＴＲＢＶ４＊０１マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲ（配列番号１３３及び１３４）が、ＨＬＡ－Ａ１１＋ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ＋の膵臓腫瘍細胞株を認識することを実証する。
【0148】
ＰＢＬを、（ｉ）ＴＲＡＶ３－３＊０１／ＴＲＢＶ４＊０１マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲ（配列番号１３３及び１３４）又は（ｉｉ）ＴＲＡＶ１９＊０１／ＴＲＢＶ１３－１＊０２マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲ（配列番号１４５及び１４６）のいずれかで形質導入した。表１２に示す通り、形質導入細胞を、（ｉ）（ａ）Ｇ１２Ｄミニ遺伝子（２３マーの配列番号１１９をコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／Ｇ１２Ｄ）、（ｂ）Ｇ１２Ｖミニ遺伝子（２３マーの配列番号１２０をコードする（ＣＯＳ／Ａ１１／Ｇ１２Ｖ）、又は（ｃ）ＷＴ ＫＲＡＳミニ遺伝子（２３マーの配列番号１１８をコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／ＷＴ）で形質導入したＣＯＳ７／Ａ１１細胞；（ｉｉ）ＨＬＡ－Ａ１１で形質導入したＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ陰性膵臓腫瘍細胞株；（ｉｉｉ）ＨＬＡ－Ａ１１で形質導入したＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ＋の膵臓腫瘍細胞株；又は（ｉｖ）親（非形質導入）膵臓腫瘍細胞株と共培養した。ＩＦＮ－γ分泌を測定した。
【0149】
結果を表１２に示す。表１２において、太字のＩＦＮ－γ分泌値は、ＴＣＲが反応性を示した標的細胞を示す。表１２に示す通り、ＴＲＡＶ３－３＊０１／ＴＲＢＶ４＊０１マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲ（配列番号１３３及び１３４）は、ＴＲＡＶ１９＊０１／ＴＲＢＶ１３－１＊０２マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲ（配列番号１４５及び１４６）と比較して、より多くの、ＨＬＡ－Ａ１１＋ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ＋の膵臓腫瘍細胞株を認識した。
【0150】
【表23】
【0151】
実施例１０
本実施例は、ＴＲＡＶ３－３＊０１／ＢＶ４＊０１マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲ（配列番号１３３及び１３４）についての、ＩＦＮ－γ産生と、突然変異ＫＲＡＳ発現との間の相関を実証する。
本実施例は、ＴＲＡＶ３－３＊０１／ＢＶ４＊０１マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲ（配列番号１３３及び１３４）についての、ＩＦＮ－γ産生と、突然変異ＫＲＡＳ発現との間の相関を実証する。
【0152】
表１３に示す膵臓腫瘍細胞株の各々が発現するＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ｍＲＮＡのコピー数を測定し、表示した細胞株が発現する、β－アクチンｍＲＮＡのコピー数と比較した（表１３）。実施例９で測定した、各細胞株との共培養に際しての、ＴＲＡＶ３－３＊０１／ＢＶ４＊０１マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲ（配列番号１３３及び１３４）で形質導入したＰＢＬによって分泌されるＩＦＮ－γの量を、表１３に再掲した（ｒｅｐｒｏｄｕｃｅｄ）。ＴＲＡＶ３－３＊０１／ＢＶ４＊０１マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲ（配列番号１３３及び１３４）の反応性（標的細胞との共培養に際してのＩＦＮ－γ分泌に関して）は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ｍＲＮＡのコピー数と相関した。
【0153】
【表24】
【0154】
実施例１１
本実施例は、ＴＲＡＶ３－３＊０１／ＢＶ４＊０１マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲ（配列番号１３３及び１３４）が、（ｉ）ＣＤ４の存在下且つＣＤ８の非存在下、又は（ｉｉ）ＣＤ８の存在下且つＣＤ４の非存在下のいずれでも、突然変異ＫＲＡＳを認識することを実証する。
本実施例は、ＴＲＡＶ３－３＊０１／ＢＶ４＊０１マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲ（配列番号１３３及び１３４）が、（ｉ）ＣＤ４の存在下且つＣＤ８の非存在下、又は（ｉｉ）ＣＤ８の存在下且つＣＤ４の非存在下のいずれでも、突然変異ＫＲＡＳを認識することを実証する。
【0155】
ＰＢＬを、ＴＲＡＶ３－３＊０１／ＢＶ４＊０１マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲ（配列番号１３３及び１３４）をコードするヌクレオチド配列で形質導入した。フローサイトメトリーにより、形質導入細胞（Ｔｒｎａｓｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌｓ）を表１４に示す集団に選別した。選別した細胞集団を、（ｉ）（ａ）Ｇ１２Ｄミニ遺伝子（１６３マーをコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／Ｇ１２Ｄ）、（ｂ）Ｇ１２Ｖミニ遺伝子（１６３マーをコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／Ｇ１２Ｖ）、若しくは（ｃ）ＷＴ ＫＲＡＳミニ遺伝子（１６３マーをコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／ＷＴ）で形質導入したＣＯＳ７／Ａ１１細胞；又は（ｉｉ）形質導入しなかったか、又はＨＬＡ－Ａ１１で形質導入したＳＫ．ＰＣ３膵腫瘍細胞株と共培養した。細胞を含まない培地をネガティブコントロールとして用いた。ＩＦＮ－γ分泌を測定した。
【0156】
結果を表１４に示す。表１４において、太字のＩＦＮ－γ分泌値は、ＴＣＲが反応性を示した標的細胞を示す。表１４に示す通り、ＴＲＡＶ３－３＊０１／ＢＶ４＊０１マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＴＣＲ（配列番号１３３及び１３４）は、（ｉ）ＣＤ４の存在下且つＣＤ８の非存在下、又は（ｉｉ）ＣＤ８の存在下且つＣＤ４の非存在下のいずれでも、標的細胞を認識した。従って、ＴＲＡＶ３－３＊０１／ＢＶ４＊０１マウス抗ＫＲＡＳ
Ｇ１２Ｖ ＴＣＲ（配列番号１３３及び１３４）は、結合活性が非常に高い、標的の認識をもたらす。
Ｇ１２Ｖ ＴＣＲ（配列番号１３３及び１３４）は、結合活性が非常に高い、標的の認識をもたらす。
【0157】
【表25】
【0158】
実施例１２
本実施例は、マウス抗ＫＲＡＳ７－１６ Ｇ１２Ｄ １０マーＴＣＲの単離を実例で示す。
本実施例は、マウス抗ＫＲＡＳ７－１６ Ｇ１２Ｄ １０マーＴＣＲの単離を実例で示す。
【0159】
Ｇ１２Ｄ １０マーペプチド（配列番号２）により、ＨＬＡ－Ａ１１トランスジェニックマウスを３回免疫した。３回目の免疫の後、脾臓及びリンパ節を取り出し、様々な濃度（１μＭ、０．１μＭ及び０．０１μＭ）のＧ１２Ｄ １０マーペプチドと共にインビトロで７日間培養した。ＬＮ及び脾臓の培養物から単離したＴ細胞を、（ｉ）（ａ）ペプチドなし（なし）、（ｂ）ＷＴ ＫＲＡＳ７－１６ペプチド（配列番号３０）（ＣＯＳ／Ａ１１＋ＷＴペプチド）、（ｃ）Ｇ１２Ｄ １０マーペプチド（配列番号２）（ＣＯＳ／Ａ１１＋Ｇ１２Ｄペプチド）、（ｄ）Ｇ１２Ｖ １０マーペプチド（配列番号３３）（ＣＯＳ／Ａ１１＋Ｇ１２Ｖペプチド）、（ｅ）Ｇ１２Ｖ ９マーペプチド（配列番号３５）、又は（ｆ）Ｇ１２Ｄ ９マーペプチド（配列番号３４）でパルスした、ＨＬＡ－Ａ１１を発現するよう形質導入したＣＯＳ７細胞（ＣＯＳ７／Ａ１１）；及び（ｉｉ）（ａ）ＷＴ
ＫＲＡＳミニ遺伝子（２３マーの配列番号１１８をコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／ＷＴ）、（ｂ）Ｇ１２Ｄミニ遺伝子（２３マーの配列番号１１９をコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／Ｇ１２Ｄ）、又は（ｃ）（ｂ）Ｇ１２Ｖミニ遺伝子（２３マーの配列番号１２０をコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／Ｇ１２Ｄ）をコードするベクターでトランスフェクションしたＣＯＳ７／Ａ１１細胞に対する反応性について試験した。インターフェロン（ＩＦＮ）－γを測定した。
ＫＲＡＳミニ遺伝子（２３マーの配列番号１１８をコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／ＷＴ）、（ｂ）Ｇ１２Ｄミニ遺伝子（２３マーの配列番号１１９をコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／Ｇ１２Ｄ）、又は（ｃ）（ｂ）Ｇ１２Ｖミニ遺伝子（２３マーの配列番号１２０をコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／Ｇ１２Ｄ）をコードするベクターでトランスフェクションしたＣＯＳ７／Ａ１１細胞に対する反応性について試験した。インターフェロン（ＩＦＮ）－γを測定した。
【0160】
結果を表１５Ａ（ペプチドパルス）及び表１５Ｂ（トランスフェクタント）に示す。表１５Ａ及び１５Ｂにおいて、太字のＩＦＮ－γ分泌値は、ＴＣＲが反応性を示した標的ペプチド及び標的細胞を示す。表１５Ａ及び１５Ｂに示す通り、ＨＬＡ－Ａ１１拘束性マウスＴ細胞は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄペプチドである配列番号２に対して反応性であった。
【0161】
【表26】
【0162】
【表27】
【0163】
ＬＮ及び脾臓の培養物から単離したＴ細胞も、様々な濃度のＧ１２Ｄペプチドで６～７日間インビトロで刺激し、次いで表１６に示す、ＨＬＡ－Ａ１１を発現するＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ＋の膵臓細胞株と共培養した。ＩＦＮ－γを測定した。
【0164】
結果を表１６に示す。表１６において、太字のＩＦＮ－γ分泌値は、ＴＣＲが反応性を示した標的細胞を示す。表１６に示す通り、ＬＮ及び脾臓の培養物から単離したＴ細胞は、ＨＬＡ－Ａ１１発現ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ＋の膵臓細胞株と反応性であった。
【0165】
【表28】
【0166】
５’ＲＡＣＥを用いて、反応性細胞からＴＣＲを単離した。２つの支配的なアルファ鎖及び１つの支配的なベータ鎖を同定した（表１７）。
【0167】
【表29】
【0168】
実施例１３
本実施例は、配列番号１５７を含むＴＣＲα鎖及び配列番号１５８を含むＴＣＲβ鎖を発現するよう形質導入したＰＢＬが、ＨＬＡ－Ａ１１＋／Ｇ１２Ｄ １０マー＋の標的に対して反応性であることを実証する。
本実施例は、配列番号１５７を含むＴＣＲα鎖及び配列番号１５８を含むＴＣＲβ鎖を発現するよう形質導入したＰＢＬが、ＨＬＡ－Ａ１１＋／Ｇ１２Ｄ １０マー＋の標的に対して反応性であることを実証する。
【0169】
表１７の２つの支配的なα鎖及びβ鎖を、ＭＳＧＶ１レトロウイルスベクターに個別にクローニングした。ＰＢＬを、表１８に示す通り、α鎖及びβ鎖の２つの対のうちの１つを発現するよう、個別に共形質導入した。形質導入したＰＢＬを、（ｉ）（ａ）Ｇ１２Ｄミニ遺伝子（２３マーの配列番号１１９をコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／Ｇ１２Ｄ）、（ｂ）Ｇ１２Ｖミニ遺伝子（２３マーの配列番号１２０をコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／Ｇ１２Ｖ）、（ｃ）ＷＴ ＫＲＡＳミニ遺伝子（２３マーの配列番号１１８をコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／ＷＴ）で形質導入したＣＯＳ７／Ａ１１細胞、又は（ｄ）細胞なし（培地のみ）に対する反応性についてスクリーニングした（表１８）。ＩＦＮ－γ分泌を測定した。
【0170】
結果を表１８に示す。表１８に示す通り、マウスＴＣＲα鎖ＴＲＡＶ４－４＊０１（１）（配列番号１５７）及びマウスＴＣＲβ鎖ＴＲＢＶ１２－２＊０１（配列番号１５８）を発現するよう共形質導入したＰＢＬは、ＨＬＡ－Ａ１１を発現するＧ１２Ｄトランスフェクタント標的細胞に対し反応性を示した。
【0171】
【表30】
【0172】
ＰＢＬを、ＴＣＲ ＴＲＡＶ４－４＊０１（１）／ＴＲＢＶ１２－２＊０１（配列番号１５７及び１５８）を発現するよう形質導入し、（ａ）Ｇ１２Ｄミニ遺伝子（２３マーの配列番号１１９をコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／Ｇ１２Ｄ）、（ｂ）Ｇ１２Ｖミニ遺伝子（２３マーの配列番号１２０をコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／Ｇ１２Ｖ）、（ｃ）ＷＴ ＫＲＡＳミニ遺伝子（２３マーの配列番号１１８をコードする）（ＣＯＳ／Ａ１１／ＷＴ）で形質導入したＣＯＳ７／Ａ１１細胞、（ｄ）形質導入しなかったか、又は、ＨＬＡ－Ａ１１及び表示されたＫＲＡＳ突然変異を発現するよう形質導入した、表１９に示す
膵臓腫瘍株に対する反応性についてスクリーニングした。表１９に、各膵臓腫瘍細胞株に発現するＫＲＡＳ突然変異を示す。ＩＦＮ－γ分泌を測定した。
膵臓腫瘍株に対する反応性についてスクリーニングした。表１９に、各膵臓腫瘍細胞株に発現するＫＲＡＳ突然変異を示す。ＩＦＮ－γ分泌を測定した。
【0173】
結果を表１９に示す。表１９に示す通り、ＴＣＲ ＴＲＡＶ４－４＊０１（１）／ＴＲＢＶ１２－２＊０１（配列番号１５７及び１５８）で形質導入したＰＢＬは、ＨＬＡ－Ａ１１＋Ｇ１２Ｄ＋の膵臓腫瘍株を認識した。
【0174】
【表31】
【0175】
実施例１４
本実施例は、ＴＲＡＶ４－４＊０１（１）／ＴＲＢＶ１２－２＊０１マウス抗ＫＲＡＳ
Ｇ１２Ｄ ＴＣＲ（配列番号１５７及び１５８）について、ＩＦＮ－γ産生と、突然変異ＫＲＡＳ発現との間の相関を実証する。
本実施例は、ＴＲＡＶ４－４＊０１（１）／ＴＲＢＶ１２－２＊０１マウス抗ＫＲＡＳ
Ｇ１２Ｄ ＴＣＲ（配列番号１５７及び１５８）について、ＩＦＮ－γ産生と、突然変異ＫＲＡＳ発現との間の相関を実証する。
【0176】
表２０に示す膵臓腫瘍細胞株のそれぞれが発現するＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡのコピー数を測定し、各細胞株が発現する、β－アクチンｍＲＮＡのコピー数と比較した（表２０）。各細胞株との共培養に際して、ＴＲＡＶ４－４＊０１（１）／ＴＲＢＶ１２－２＊０１マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲ（配列番号１５７及び１５８）で形質導入し
たＰＢＬによって分泌されたＩＦＮ－γ量を表１３に示す。ＴＲＡＶ４－４＊０１（１）／ＴＲＢＶ１２－２＊０１マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲ（配列番号１５７及び１５８）の（標的細胞との培養に際してのＩＦＮ－γ分泌に関する）反応性は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡのコピー数と相関していた。
たＰＢＬによって分泌されたＩＦＮ－γ量を表１３に示す。ＴＲＡＶ４－４＊０１（１）／ＴＲＢＶ１２－２＊０１マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲ（配列番号１５７及び１５８）の（標的細胞との培養に際してのＩＦＮ－γ分泌に関する）反応性は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡのコピー数と相関していた。
【0177】
【表32】
【0178】
実施例１５
本実施例は、ＴＲＡＶ４－４／ＤＶ１０＊０１／ＢＶ１２－２＊０１マウス抗ＫＲＡＳ
Ｇ１２Ｄ ＴＣＲ（配列番号１５７及び１５８）が、ＴＲＡＶ１２Ｎ－３＊０１／ＢＶ４＊０１マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲ（配列番号１１及び１２）と比較して、パルスした標的ペプチドに対し、より高い親和性を有することを実証する。
本実施例は、ＴＲＡＶ４－４／ＤＶ１０＊０１／ＢＶ１２－２＊０１マウス抗ＫＲＡＳ
Ｇ１２Ｄ ＴＣＲ（配列番号１５７及び１５８）が、ＴＲＡＶ１２Ｎ－３＊０１／ＢＶ４＊０１マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲ（配列番号１１及び１２）と比較して、パルスした標的ペプチドに対し、より高い親和性を有することを実証する。
【0179】
ＰＢＬを、（ｉ）Ｔ ＴＲＡＶ４－４／ＤＶ１０＊０１／ＢＶ１２－２＊０１マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲ（配列番号１５７及び１５８）又は（ｉｉ）ＴＲＡＶ１２Ｎ－３＊０１／ＢＶ４＊０１マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲ（配列番号１１及び１２）のいずれかで形質導入した。形質導入した細胞を、表２１Ａ及び２１Ｂに示す濃度の、（ａ）Ｇ１２Ｄ １０マーペプチド（配列番号２）、（ｂ）ＷＴ ＫＲＡＳ １０マーペプチド（配列番号３０）、（ｃ）Ｇ１２Ｄ９マーペプチド（配列番号３４）又は（ｄ）ＷＴ ＫＲＡＳ ９マーペプチド（配列番号３１）でパルスしたＣｏｓ７／Ａ１１細胞と共培養した。ＩＦＮ－γ分泌を測定した。
【0180】
結果を表２１Ａ（ＴＲＡＶ４－４／ＤＶ１０＊０１／ＢＶ１２－２＊０（配列番号１５７及び１５８））並びに表２１Ｂ（ＴＲＡＶ１２Ｎ－３＊０１／ＢＶ４＊０１（配列番号１１及び１２））に示す。表２１Ａ～２１Ｂに示す通り、ＴＲＡＶ４－４／ＤＶ１０＊０１／ＢＶ１２－２＊０（配列番号１５７及び１５８）で形質導入したＴ細胞は、１×１０－９の濃度でパルスした１０マーを認識した。従って、ＴＲＡＶ４－４／ＤＶ１０＊０１／ＢＶ１２－２＊０（配列番号１５７及び１５８）は、ＴＲＡＶ１２Ｎ－３＊０１／ＢＶ４＊０１（配列番号１１及び１２）のＴＣＲと比較して、より高い結合活性を伴って、パルスした標的ペプチドを認識した。
【0181】
【表33】
【0182】
【表34】
【0183】
実施例１６
本実施例は、ＴＲＡＶ４－４／ＤＶ１０＊０１／ＢＶ１２－２＊０１マウス抗ＫＲＡＳ
Ｇ１２Ｄ ＴＣＲ（配列番号１５７及び１５８）が、ＴＲＡＶ１２Ｎ－３＊０１／ＢＶ４＊０１マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲ（配列番号１１及び１２）と比較して、Ｇ１２Ｄ＋の膵臓腫瘍細胞株に対し、高い親和性を有することを実証する。
本実施例は、ＴＲＡＶ４－４／ＤＶ１０＊０１／ＢＶ１２－２＊０１マウス抗ＫＲＡＳ
Ｇ１２Ｄ ＴＣＲ（配列番号１５７及び１５８）が、ＴＲＡＶ１２Ｎ－３＊０１／ＢＶ４＊０１マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲ（配列番号１１及び１２）と比較して、Ｇ１２Ｄ＋の膵臓腫瘍細胞株に対し、高い親和性を有することを実証する。
【0184】
ＰＢＬを、（ｉ）ＴＲＡＶ４－４／ＤＶ１０＊０１／ＢＶ１２－２＊０１マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲ（配列番号１５７及び１５８）又は（ｉｉ）ＴＲＡＶ１２Ｎ－３＊０１／ＢＶ４＊０１マウス抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲ（配列番号１１及び１２）のいずれかで形質導入した。表２２に示す通り、形質導入した細胞を、形質導入しなかったか、又はＨＬＡ－Ａ１１及び突然変異ＫＲＡＳで形質導入した膵臓細胞株と共培養した。ＩＦＮ－γ分泌を測定した。
【0185】
結果を表２２に示す。表２２に示す通り、ＴＲＡＶ４－４／ＤＶ１０＊０１／ＢＶ１２－２＊０（配列番号１５７及び１５８）で形質導入したＴ細胞は、ＴＲＡＶ１２Ｎ－３＊０１／ＢＶ４＊０１（配列番号１１及び１２）のＴＣＲと比較して、Ｇ１２Ｄ＋の膵臓腫瘍細胞株を、高い結合活性を伴って認識した。
【0186】
【表35】
【0187】
実施例１７
本実施例は、突然変異ＫＲＡＳを発現するがんの患者に、突然変異ＫＲＡＳを認識するマウスＴＣＲをコードするベクターで形質導入したＰＢＬを投与する、第Ｉ相／ＩＩ相の研究を実例で示す。
本実施例は、突然変異ＫＲＡＳを発現するがんの患者に、突然変異ＫＲＡＳを認識するマウスＴＣＲをコードするベクターで形質導入したＰＢＬを投与する、第Ｉ相／ＩＩ相の研究を実例で示す。
【0188】
研究に含めるのに適格な患者は、養子細胞療法（ＡＣＴ）／ＩＬ－２に関する通常の基準を満たし、且つ以下を有する：
・ＨＬＡ－Ａ１１＋の、突然変異ＫＲＡＳ発現腫瘍（免疫組織化学による測定で）；
・放射性ヨウ素不応性がん；及び
・陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）陽性の腫瘍又は過去６ヶ月以内における腫瘍の進行の証明。
・ＨＬＡ－Ａ１１＋の、突然変異ＫＲＡＳ発現腫瘍（免疫組織化学による測定で）；
・放射性ヨウ素不応性がん；及び
・陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）陽性の腫瘍又は過去６ヶ月以内における腫瘍の進行の証明。
【0189】
自己ＰＢＬを、マウス抗突然変異ＫＲＡＳ ＴＣＲ（配列番号１１及び１２）のアルファ鎖及びベータ鎖をコードするベクターにより、レトロウイルスで形質導入する。患者を、前処置的な、非骨髄破壊性の高用量シクロホスファミド（Ｃｙ）及びフルダラビン（Ｆｌｕ）で治療する。患者を、高用量のＩＬ－２で、８時間ごとに許容値まで治療する。第Ｉ相においては、開始用量の、レトロウイルスで形質導入した１×１０８細胞で、患者を治療する。投与量は半対数（ｈａｌｆ－ｌｏｇｓ）で増加させ、コホートごとで患者１名に最大１×１０１０細胞の投与量とし、コホート当たり患者３人が従う。第ＩＩ相は、奏功率２０％を目標とする２段階設計となっている。
【0190】
実施例１８
本実施例は、ヒトのがんにおけるＫＲＡＳ突然変異の頻度を実例で示す。
本実施例は、ヒトのがんにおけるＫＲＡＳ突然変異の頻度を実例で示す。
【0191】
ヒトの様々ながんにおける、ＫＲＡＳ突然変異の頻度（％）を表２３に示す。表２３は、全てのＫＲＡＳ突然変異の中の特定のＫＲＡＳ突然変異の頻度（％）も示す。
【0192】
【表36】
【0193】
実施例１９
本実施例は、ＴＲＡＶ４－４／ＤＶ１０＊０１／ＢＶ１２－２＊０１ ＴＣＲのＣＤＲ３α領域におけるグリシン残基の置換が、野生型ＴＲＡＶ４－４／ＤＶ１０＊０１／ＢＶ１２－２＊０１ ＴＣＲと比較して、抗ＫＲＡＳ反応性の増強をもたらすことを実証する。
本実施例は、ＴＲＡＶ４－４／ＤＶ１０＊０１／ＢＶ１２－２＊０１ ＴＣＲのＣＤＲ３α領域におけるグリシン残基の置換が、野生型ＴＲＡＶ４－４／ＤＶ１０＊０１／ＢＶ１２－２＊０１ ＴＣＲと比較して、抗ＫＲＡＳ反応性の増強をもたらすことを実証する。
【0194】
ＴＲＡＶ４－４／ＤＶ１０＊０１／ＢＶ１２－２＊０１ ＴＣＲのＣＤＲ３α領域のグリシン残基をアラニン残基で置換して、置換ＴＲＡＶ４－４／ＤＶ１０＊０１／ＢＶ１２－２＊０１ ＴＣＲ（ＣＤＲ３アルファＧ１１２Ａ）を用意した。ＰＢＬを、（ｉ）野生型ＴＲＡＶ４－４／ＤＶ１０＊０１／ＢＶ１２－２＊０１ ＴＣＲ（配列番号１５７及び１５８）又は（ｉｉ）置換ＴＲＡＶ４－４／ＤＶ１０＊０１／ＢＶ１２－２＊０１ ＴＣＲ（配列番号２０９及び１５８）のいずれかで形質導入した。形質導入細胞を、ＨＬＡ－Ａ１１及びＷＴ ＫＲＡＳで形質導入したＣｏｓ細胞（Ｃｏｓ／Ａ１１／ＷＴ）、ＨＬＡ－Ａ１１及びＧ１２Ｄ ＫＲＡＳで形質導入したＣｏｓ細胞（Ｃｏｓ／Ａ１１／Ｇ１２Ｄ）、ＨＬＡ－Ａ１１で形質導入した膵臓腫瘍細胞株ＦＡ６－２（ＦＡ６－２／Ａ１１）、又は膵臓腫瘍細胞株Ｐａｎｃ－１と共培養した。単独で培養した形質導入細胞（培地）をコントロールとして用いた。ＩＦＮ－γ分泌（ｐｇ／ｍｌ）を測定した。結果を表２４に示す。
【0195】
【表37】
【0196】
表２４に示す通り、ＴＲＡＶ４－４／ＤＶ１０＊０１／ＢＶ１２－２＊０１ ＴＣＲのＣＤＲ３α領域のグリシン残基の置換は、野生型ＴＲＡＶ４－４／ＤＶ１０＊０１／ＢＶ１２－２＊０１ ＴＣＲと比較して、抗ＫＲＡＳ反応性の増強をもたらした。
【0197】
刊行物、特許出願及び特許を含む、本明細書に引用した全ての参考文献は、それぞれの参考文献が参照によって組み込まれることが個々に且つ具体的に示されているのと同程度及びその全体が本明細書に記載されているのと同程度まで、参照によって本明細書に組み込まれる。
【0198】
本発明の説明に関して（特に、以下の特許請求の範囲に関して）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つの」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書に特記しないか文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈すべきである。１つ以上の事項の列挙の後での用語「少なくとも１つの」の使用（例えば、「Ａ及びＢのうち少なくとも１つの」）は、本明細書に特記しない又は文脈と明らかに矛盾しない限り、列挙した事項（Ａ若しくはＢ）から選択された１つの事項又は列挙した事項（Ａ及びＢ）のうち２つ以上の任意の組合せを意味すると解釈すべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特記しない限り、オープンエンドの用語（即ち、「～を含むがそれらに限定されない」を意味する）と解釈すべきである。本明細書の値の範囲の記述は、本明細書に特記しない限り、その範囲内に入る各個別の値に個々に言及する省略方法として働くことのみを意図しており、各個別の値は、それが本明細書に個々に記述されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に特記しない又は文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施できる。本明細書に提供される任意の及び全ての例又は例示的語句（例、「等（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、本発明をよりよく説明することのみを意図しており、特段特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書の全ての語句は、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施に必須のものとして示していると解釈すべきではない。
【0199】
発明を実施するための、発明者が知る最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、上述の説明を読めば当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がかかるバリエーションを適宜使用することを予期しており、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されたのとは異なる方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法によって許容されるとおり、本明細書に添付した特許請求の範囲に記載される対象の全ての改変及び均等物を含む。更に、その全ての可能なバリエーションでの上記要素の任意の組合せが、本明細書に特記しない限り又は文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【配列表】