特許 7298907 新規ルシフェラーゼおよびその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-06-19

(45)【発行日】2023-06-27

(54)【発明の名称】新規ルシフェラーゼおよびその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/53 20060101AFI20230620BHJP

   C12Q 1/66 20060101ALI20230620BHJP

   C12Q 1/6897 20180101ALI20230620BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20230620BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230620BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230620BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230620BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230620BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230620BHJP

   A01K 67/027 20060101ALI20230620BHJP

   C12N 9/02 20060101ALN20230620BHJP

【ＦＩ】

C12N15/53 ZNA

C12Q1/66

C12Q1/6897

C12M1/00 A

C12N1/15

C12N1/21

C12N1/19

C12N5/10

C12N15/63 Z

A01K67/027

C12N9/02

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2019538322

(86)(22)【出願日】2017-12-06

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-02-20

(86)【国際出願番号】 RU2017050125

(87)【国際公開番号】W WO2018139956

(87)【国際公開日】2018-08-02

【審査請求日】2020-11-20

(31)【優先権主張番号】2017102986

(32)【優先日】2017-01-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】RU

(73)【特許権者】

【識別番号】519251771

【氏名又は名称】オブシェストヴォ ス オグラニチェンノイ オトヴェトストヴェンノスチュ“プランタ”

(74)【代理人】

【識別番号】100091683

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄

(74)【代理人】

【識別番号】100179316

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 寛奈

(72)【発明者】

【氏名】ヤムポルスキー，イリヤ ヴィクトロヴィッチ

【審査官】新留 豊

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１４－５０７１１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５２７０７０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００５－５３５２９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００７－５２５４３４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００４－５１４４６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】Dennis E. Desjardin, et al.，Fungi bioluminescence revisited.，Photochemical & Photobiological Sciences，2008年，7，170-182

【文献】E M Ilondu et al.，Bioluminescence in mushroom and its application potentials.，Nigerian Journal of Science and Environment，2016年，Vol.14(1)，p.132-139

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／００－３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ルシフェラーゼまたはその機能的断片をコードする単離核酸であって：
３－ヒドロキシヒスピジン、(Ｅ）－６－（４－ジエチルアミノ）スチリル）－３，４－ジヒドロキシ－２Ｈ－ピラン－２－オン、（Ｅ）－３，４－ジヒドロキシ－６－（４－ヒドロキシスチリル）－２Ｈ－ピラン－２－オン、（Ｅ）－６－（２－１Ｈ－インドール－３－イル）ビニル）－３，４－ジヒドロキシ－２Ｈ－ピラン－２－オン、（Ｅ）－６－（２－（１，２，３，５，６，７－ヘキサヒドロピリド［３，２，１－ｉｊ］キノリン－９－イル）ビニル）－３，４－ジヒドロキシ－２Ｈ－ピラン－２－オン、（Ｅ）－３，４－ジヒドロキシ－６－（２－（６－ヒドロキシナフタレン－２－イル）ビニル）－２Ｈ－ピラン－２－オンからなる群から選択される分子を酸化可能であり、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を特徴とするタンパク質をコードする核酸。

【請求項2】

宿主細胞における核酸の発現に必要な調節エレメントの制御下にある、請求項１の核酸分子を含む発現カセットであって、染色体外エレメントの形態で細胞ゲノムに組み込まれているか、または細胞に導入されており、請求項１の核酸によってコードされるルシフェラーゼの発現をもたらすことができる発現カセット。

【請求項3】

細胞ゲノムに組み込まれたエレメントまたは染色体外エレメントの形態で、請求項２の発現カセットを含む、請求項１の核酸によってコードされるルシフェラーゼを産生する細胞。

【請求項4】

３－ヒドロキシヒスピジン、(Ｅ）－６－（４－ジエチルアミノ）スチリル）－３，４－ジヒドロキシ－２Ｈ－ピラン－２－オン、（Ｅ）－３，４－ジヒドロキシ－６－（４－ヒドロキシスチリル）－２Ｈ－ピラン－２－オン、（Ｅ）－６－（２－１Ｈ－インドール－３－イル）ビニル）－３，４－ジヒドロキシ－２Ｈ－ピラン－２－オン、（Ｅ）－６－（２－（１，２，３，５，６，７－ヘキサヒドロピリド［３，２，１－ｉｊ］キノリン－９－イル）ビニル）－３，４－ジヒドロキシ－２Ｈ－ピラン－２－オン、（Ｅ）－３，４－ジヒドロキシ－６－（２－（６－ヒドロキシナフタレン－２－イル）ビニル）－２Ｈ－ピラン－２－オンからなる群から選択される分子を酸化可能であり、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を特徴とする、単離ルシフェラーゼまたはその機能的断片。

【請求項5】

（１）請求項１の核酸、または請求項２の発現カセット、または請求項４のタンパク質、および
（２）請求項１のルシフェラーゼによる酸化が可能なルシフェリン
を含むキット。

【請求項6】

請求項１の核酸を含むトランスジェニック生物。

【請求項7】

請求項４のタンパク質に特異的に結合する抗体。

【請求項8】

宿主細胞における核酸の発現に必要な調節エレメントの制御下にある、細胞内局在シグナルに動作可能に融合された、請求項１の核酸分子を含む発現カセットであって、染色体外エレメントの形態で細胞ゲノムに組み込まれているか、または細胞に導入されており、細胞内局在シグナルに結合された請求項１の核酸によってコードされるルシフェラーゼの発現をもたらすことができる発現カセット。

【請求項9】

細胞および細胞構造の標識方法であって、細胞への請求項２または請求項８の発現カセットの導入を含む方法。

【請求項10】

ルシフェラーゼまたはその機能的断片を発現する方法であって、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４の配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を特徴とするタンパク質をコードする単離核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏ系、細胞、または生物に導入することにより、３－ヒドロキシヒスピジン、(Ｅ）－６－（４－ジエチルアミノ）スチリル）－３，４－ジヒドロキシ－２Ｈ－ピラン－２－オン、（Ｅ）－３，４－ジヒドロキシ－６－（４－ヒドロキシスチリル）－２Ｈ－ピラン－２－オン、（Ｅ）－６－（２－１Ｈ－インドール－３－イル）ビニル）－３，４－ジヒドロキシ－２Ｈ－ピラン－２－オン、（Ｅ）－６－（２－（１，２，３，５，６，７－ヘキサヒドロピリド［３，２，１－ｉｊ］キノリン－９－イル）ビニル）－３，４－ジヒドロキシ－２Ｈ－ピラン－２－オン、（Ｅ）－３，４－ジヒドロキシ－６－（２－（６－ヒドロキシナフタレン－２－イル）ビニル）－２Ｈ－ピラン－２－オンからなる群から選択される分子を酸化させることが可能である、方法。

【請求項11】

生物発光を生成する方法であって、３－ヒドロキシヒスピジンを培地または土壌に添加することによりトランスジェニック植物に導入することを含み、
前記トランスジェニック植物はルシフェラーゼをコードする核酸を有し、
前記ルシフェラーゼは、３－ヒドロキシヒスピジン、(Ｅ）－６－（４－ジエチルアミノ）スチリル）－３，４－ジヒドロキシ－２Ｈ－ピラン－２－オン、（Ｅ）－３，４－ジヒドロキシ－６－（４－ヒドロキシスチリル）－２Ｈ－ピラン－２－オン、（Ｅ）－６－（２－１Ｈ－インドール－３－イル）ビニル）－３，４－ジヒドロキシ－２Ｈ－ピラン－２－オン、（Ｅ）－６－（２－（１，２，３，５，６，７－ヘキサヒドロピリド［３，２，１－ｉｊ］キノリン－９－イル）ビニル）－３，４－ジヒドロキシ－２Ｈ－ピラン－２－オン、（Ｅ）－３，４－ジヒドロキシ－６－（２－（６－ヒドロキシナフタレン－２－イル）ビニル）－２Ｈ－ピラン－２－オンからなる群から選択される分子を酸化可能であり、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を特徴とする、方法。

【請求項12】

生物発光を生成するトランスジェニック植物の使用であって、前記トランスジェニック植物はルシフェラーゼをコードする核酸を有し、
前記ルシフェラーゼは、３－ヒドロキシヒスピジン、(Ｅ）－６－（４－ジエチルアミノ）スチリル）－３，４－ジヒドロキシ－２Ｈ－ピラン－２－オン、（Ｅ）－３，４－ジヒドロキシ－６－（４－ヒドロキシスチリル）－２Ｈ－ピラン－２－オン、（Ｅ）－６－（２－１Ｈ－インドール－３－イル）ビニル）－３，４－ジヒドロキシ－２Ｈ－ピラン－２－オン、（Ｅ）－６－（２－（１，２，３，５，６，７－ヘキサヒドロピリド［３，２，１－ｉｊ］キノリン－９－イル）ビニル）－３，４－ジヒドロキシ－２Ｈ－ピラン－２－オン、（Ｅ）－３，４－ジヒドロキシ－６－（２－（６－ヒドロキシナフタレン－２－イル）ビニル）－２Ｈ－ピラン－２－オンからなる群から選択される分子を酸化可能であり、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を特徴とし、
前記トランスジェニック植物は、植物細胞において３－ヒドロキシヒスピジンを生合成することを特徴とする、使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は一般に生物学および化学の分野に関し、具体的にはルシフェラーゼに関する。

【背景技術】

【0002】

生物発光とは、生物または生体分子が光を生成して発する能力を指す。生物発光を生成する能力は、特定のタンパク質、つまりルシフェラーゼまたは発光タンパク質の存在によって決まる。ルシフェラーゼは、低分子量化合物、すなわちルシフェリンの酸化を触媒し、これをオキシルシフェリンに変換する酵素である。酸化に伴って発光し、オキシルシフェリンが放出される。

【0003】

発光タンパク質もルシフェリンの酸化を触媒するが、この場合ルシフェリンは、安定した発光タンパク質複合体を形成する補欠分子族として作用する。発光タンパク質によって生成される光の量は、その濃度におおよそ比例するが、ルシフェラーゼでは酵素とルシフェリンの両方の濃度に依存する。多くの場合、発光タンパク質によって触媒される生物発光反応は、媒体中の金属イオンの放出に反応して活性化される。例えばエクオリン発光タンパク質は、カルシウムイオンの放出に反応してルシフェリン（セレンテラジン）の酸化を触媒し、それによって短い閃光が発せられる。

【0004】

ルシフェラーゼは、生物医学や生物工学の多くの用途においてレポーター遺伝子として用いられている。具体的には、診断法、媒体中の微生物や毒物の検出法で用いられており、またさまざまな物質の濃度の測定、シグナル伝達カスケードの活性化の検出などに用いられる［非特許文献１、２、３］。ルシフェラーゼの応用方法は数多く考察されている［非特許文献１、４、５］。

【0005】

現在、数種類の生物発光系が知られている。さまざまな生物が長年にわたる進化の過程で独自に生物発光系を発展させたことがわかっている［非特許文献６、７］。

【0006】

Ｄ－ルシフェリンの酸化を触媒するキタアメリカホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）のルシフェラーゼについて記述されている［非特許文献８、９］。Ｄ－ルシフェリンの酸化に伴って、発光最大値が５６０ｎｍの黄緑色光が放出される。同じＤ－ルシフェリンは、別の昆虫ルシフェラーゼによっても酸化される。現在、発光最大値が５３６～６３０ｎｍの範囲にある光を発するホノオムシ科、コメツキムシ科、ホタル科のさまざまな昆虫種の酵素３０種以上がクローニングされている。また、昆虫ルシフェラーゼの変異体についても記述されており、合成Ｄ－ルシフェリン類似体の生成により、異なる特性を有するルシフェリン－ルシフェラーゼ対を得ることが可能になっている［非特許文献１０］。多種多様な類似体にもかかわらず、Ｄ－ルシフェリンは反応の量子効率が高いため（０．８８＋－０．２５［非特許文献１１］）、依然としてもっとも一般的なｉｎ ｖｉｖｏ生物発光の基質となっている。この系を用いるうえで著しい支障となるのが、キタアメリカホタルのルシフェラーゼの分子量が比較的大きいことである（６１ｋＤａ）。このため、いくつかのキメラタンパク質を（例えばウイルスの研究用に）生成するのには向いていない。ゲノムが多いと安定性が低いのがその理由だ［非特許文献１２、１３］。そのほか、Ｄ－ルシフェリンの異性体であるＬ－ルシフェリンは反応の強力な競合的阻害剤となるため、鏡像異性的に純粋な形態でＤ－ルシフェリンを得る必要があることも問題となる［非特許文献１４］。キタアメリカホタルのルシフェラーゼが分泌型でないことも、ｉｎ ｖｉｖｏ生物発光信号を定量化するうえで制限となる。

【0007】

また、セレンテラジンの酸化を触媒する数多くのルシフェラーゼと発光タンパク質についても記述されている。例えば、レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）、メトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）におけるセレンテラジン依存性生物発光は［非特許文献１５］に記述されており、幅広く用いられている。セレンテラジン依存性ルシフェラーゼおよび発光タンパク質の変異体と、セレンテラジンの合成類似体も得られている［非特許文献４］。セレンテラジン系は、分泌能、小型、利用可能なルシフェラーゼが多種多様という有利な点が複数存在するにもかかわらず、その用途を大きく制限しているのが、生物発光の発光最大値が青色領域に位置することだ。そうすると青色光の大部分が、興味ある組織によってｉｎ ｖｉｖｏで吸収される。さらに、生物発光基質自体が、周囲酸素によって非酵素的酸化の際に発光することがあり（組織中にスーパーオキシドアニオンとペルオキシナイトライトイオンが存在するためプロセスが促進される）、これにより生物発光信号測定においてノイズが生じる。

【0008】

海洋細菌に関連する生物発光系の別の例についても記述されている。この系は他の生物発光系とは大きく異なる。細菌ルシフェリン（ミリスチンアルデヒド）は、反応中に酸化されるが、生物発光体ではない［非特許文献１５］。ルシフェリンに加え、発光反応の主要な成分はＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）およびＦＭＮ－Ｈ_２（フラビンモノヌクレオチド）であり、その酸化誘導体が真の光源として作用する。海洋細菌の生物発光系は、原核生物の発現系にしか適用できないため、使用が限られている。

【0009】

反応性の高いルシフェリンおよび安定性の高いルシフェラーゼを特徴とする貝虫亜綱ウミホタル（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）の生物発光系も知られている［非特許文献１６］。この生物発光系の主な欠点の１つは、空気中での、とりわけ不純物存在下でのウミホタルルシフェリンの安定性が極めて低いことである。ルシフェリンの最大生物発光は４４８～４６３ｎｍの範囲にある（溶液のイオン強度に依存する）。このためこの系は、深部組織で未変化の形でｉｎ ｖｉｖｏ応用するのに適していない。

【0010】

渦鞭毛藻類およびオキアミ類の生物発光系も知られている。現在、この群の３種のルシフェラーゼをコードする遺伝子がクローニングされている［非特許文献１５］。この系の大きな欠点は、知識が不足していることである。ルシフェラーゼの全配列はまだ同定されておらず、系の応用範囲が定まっていない。現在、渦鞭毛藻類とオキアミ類の生物発光メカニズムに関連する知識は断片的である。

【0011】

今日、複数の生物発光系が用いられているにもかかわらず、新たな特性を有するルシフェリン－ルシフェラーゼ対がさらに必要とされている。とりわけ、水溶性細胞透過性ルシフェリンを酸化できるＡＴＰおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性ルシフェラーゼが有利であり得る。

【0012】

この点で、菌類ルシフェラーゼは非常に興味深い。菌類生物発光はよく知られている。また、アリストテレスの論文でも言及されている。しかしながら、菌類生物発光系については依然としてよくわかっていない。１９５９年にＡｉｒｔｈとＭｃＥｌｒｏｙは、菌類生物発光系が少なくとも１つの感熱性成分（すなわちルシフェラーゼ）と非感熱性成分（すなわちルシフェリン）と１つのＮＡＤ（Ｐ）Ｈとを含んでいることを示した［非特許文献１７］。２０１５年にＰｕｒｔｏｖらは菌類ルシフェリンを検出した。それが、膜透過性分子、３－ヒドロキシヒスピジンであった［非特許文献１８］。しかしながら、菌類ルシフェラーゼはクローニングされなかった。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0013】

【文献】Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１，ｖｏｌ．４，ｐ．２９７－３１９

【文献】Ｂａｄｒ ａｎｄ Ｔａｎｎｏｕｓ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１１，２９，ｐ．６２４－６３３

【文献】Ａｎｄｒｅｕ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２０１１，ｖｏｌ．３５，ｐ．３６０－３９４

【文献】Ｋａｓｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２０１６，ｖｏｌ．４５，ｐ．６０４８－６０７７

【文献】Ｗｉｄｄｅｒ ａｎｄ Ｆａｌｌｓ，ＩＥＥＥ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，２０１４，ｖｏｌ．２０，ｐ．２３２－２４１

【文献】Ｈｅｒｒｉｎｇ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，１９８７，ｖｏｌ．１，ｐ．１４７－１６３

【文献】Ｈａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０，ｖｏｌ．２，ｐ．４４３－９３

【文献】ｄｅ Ｗｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，（米），１９８５，ｖｏｌ．８２，ｐ．７８７０－７８７３

【文献】ｄｅ Ｗｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，（米），１９８７，ｖｏｌ．７，ｐ．７２５－７３７

【文献】Ｔｈｏｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１０，ｖｏｌ．１７，ｐ．６４６－６５７

【文献】Ｓｅｌｉｇｅｒ ａｎｄ ＭｃＥｌｒｏｙ，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，１９６０，ｖｏｌ．８８，ｐ．１３６－１４１

【文献】Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１３，ｖｏｌ．８７，ｐ．１３３２１－１３３２９；

【文献】Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ，２０１５，ｖｏｌ．７，ｐ．５３１９－５３２７

【文献】Ｌｅｍｂｅｒｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９６，ｖｏｌ．３１７，ｐ．２７３－２７７

【文献】Ｏ．Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ，Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．Ｐｔｅ．Ｌｔｄ，２００６

【文献】Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９６９，ｖｏｌ．１６４，ｐ．１２９９－３００

【文献】Ａｉｒｔｈ ａｎｄ ＭｃＥｌｒｏｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９５９，ｖｏｌ．７７，ｐ．２４９－２５０

【文献】Ｐｕｒｔｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，２０１５，ｖｏｌ．５４，ｐ．８１２４－８１２８

【文献】Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２４，ｐ．４５９２－４５９３

【文献】Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９０，ｖｏｌ．２１５，ｐ．４０３－４１０

【文献】Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ，インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ＞

【文献】Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９

【文献】Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，米国保健福祉省国立衛生研究所（ＮＩＨ）

【文献】Ｇｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９３，ｖｏｌ．１４，ｐ．２２

【文献】Ｂａｒａｎｙ，Ｇｅｎｅ，１９８５，ｖｏｌ．３７，ｐ．１１１－１２３

【文献】Ｃｏｌｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９８５，ｖｏｌ．１９９，ｐ．５３７－５３９

【文献】Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９，ｐｐ．１５．３－１５．１０８

【文献】Ｋｒｏｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，ｖｏｌ．３０５（３），ｐ．５６７－５８０

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【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

本発明は、新規ルシフェラーゼおよびその機能性変異体をコードする単離核酸分子を提供する。前記ルシフェラーゼは３－ヒドロキシヒスピジンを酸化させ、それにより発光をもたらす。前記ルシフェラーゼはＡＴＰおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈに依存しない。好ましい実施形態では、前記核酸は菌類から単離するか、または遺伝子工学的手法を用いて得る。

【課題を解決するための手段】

【0015】

いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０２、０４、０６、０８、１０、１２、１４、１６、または１８の群から選択されるルシフェラーゼをコードする。ヌクレオチド配列の例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７に示される。

【0016】

いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示される特定の共通アミノ酸配列を含むルシフェラーゼをコードする。

【0017】

いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、天然ルシフェラーゼと比べてＣ末端および／またはＮ末端から短いルシフェラーゼの機能的断片をコードする。

【0018】

いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、そのアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０２、０４、０６、０８、１０、１２、１４、１６、または１８の群から選択されるルシフェラーゼと実質的に同一であるルシフェラーゼをコードする。いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、そのアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４の群から選択される機能的断片と実質的に同一であるルシフェラーゼの機能的断片をコードする。

【0019】

遺伝コードの縮重ゆえに、提供されたヌクレオチド配列とは異なる、またはそれとハイブリダイズする核酸分子も、本発明の範囲に含まれる。

【0020】

他の実施形態では、本発明の核酸を含むベクターも提供される。また本発明は、選択された宿主細胞における核酸の発現に必要な本発明の核酸および調節エレメントを含む発現カセットを提供する。さらに、本発明の核酸、ベクター、または発現カセットを含む細胞、安定した細胞株、トランスジェニック生物（例えば、植物、動物、菌類、微生物）が提供される。

【0021】

他の実施形態では、上記の核酸によってコードされる本発明の機能性ルシフェラーゼが提供される。

【0022】

さらに、本発明の核酸を含む核酸またはベクターまたは発現カセットを含むキットが提供される。

【0023】

さらに、本発明のタンパク質またはその断片と特異的に結合する抗体が提供される。

【0024】

さらに、本発明の核酸およびタンパク質を用いた細胞、細胞構造、および生体分子を標識する方法が提供される。

【0025】

技術結果には、生物発光系の使用分野における技術手段の拡大が含まれる。これは、発光を伴う３－ヒドロキシヒスピジン酸化の触媒が可能な酵素の新たな群のアミノ酸およびヌクレオチド配列を同定することによって実現される。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】天然系（１）および異種系で（２）発現したときのシロヒカリタケ（Ｎｅｏｎｏｔｈｏｐａｎｕｓ ｎａｍｂｉ）のルシフェラーゼの生物発光スペクトルを示す。

【図2】シロヒカリタケ（１）、ナラタケ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｍｅｌｌｅａ）（２）、Ｍｙｃｅｎａ ｃｉｔｒｉｃｏｌｏｒ（３）、オニナラタケ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｏｓｔｏｙａｅ）（４）、ヤコウタケ（Ｍｙｃｅｎａ ｃｈｌｏｒｏｐｈｏｓ）（５）、ワタゲナラタケ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｇａｌｌｉｃａ）（６）、ワサビタケ（Ｐａｎｅｌｌｕｓ ｓｔｉｐｔｉｃｕｓ）（７）、Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｏｌｅａｒｉｕｓ（８）のルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ Ｋｙｏｔｏ細胞、および非形質移入対照細胞（９）による生物発光強度の経時的な変化を示す。

【図3】シロヒカリタケ（１）、ナラタケ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｍｅｌｌｅａ）（２）、Ｍｙｃｅｎａ ｃｉｔｒｉｃｏｌｏｒ（３）、オニナラタケ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｏｓｔｏｙａｅ）（４）、ヤコウタケ（Ｍｙｃｅｎａ ｃｈｌｏｒｏｐｈｏｓ）（５）、ワタゲナラタケ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｇａｌｌｉｃａ）（６）、ワサビタケ（Ｐａｎｅｌｌｕｓ ｓｔｉｐｔｉｃｕｓ）（７）、Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｏｌｅａｒｉｕｓ（８）のルシフェラーゼを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞、および非形質移入対照細胞（９）による生物発光強度の経時的な変化を示す。

【図4】Ｈｉｓタグを認識し、ホースラディッシュペルオキシダーゼに接合した抗体を用いたウエスタンブロットの写真である。レーン１：シロヒカリタケのＨｉｓタグなしルシフェラーゼを発現する細胞の核欠失後上清。レーン２：シロヒカリタケのＨｉｓタグ付きルシフェラーゼを発現する細胞の核欠失後上清。レーン３：１４００００ｇでの遠心分離によって得た上清。レーン４：１４００００ｇでの遠心分離によって得たペレット。

【図5】本発明のルシフェラーゼのアミノ酸配列のマルチプルアライメントを示す。Ｎ末端膜貫通領域には下線が引かれている。共通配列は最上部に示されている。

【図6】ＩＰＴＧ誘導前の、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライセートを含む、クマシーブルー染色された勾配ポリアクリルアミドゲル（１０～２５％）（レーン１）；室温で一晩発現させた後の大腸菌ライセート（レーン２）；細胞溶解および３５０００ｇでの遠心分離後の上清（レーン３）；大腸菌封入体の抽出物（レーン４）の写真。

【図7】シロヒカリタケの組み換えルシフェラーゼの生物発光強度におけるｐＨへの依存度を示す。

【図8】赤色伝送チャネル（最上部、ｍＫａｔｅ２）および緑色伝送チャネル（最下部、ルシフェラーゼ）で撮影され顕微鏡写真上に重ねられた透過顕微鏡写真を示す。

【図9】シロヒカリタケのルシフェラーゼ（マウスの背中の左側に移植）およびキタアメリカホタルルシフェラーゼ（右側に移植）を用いた、生体マウスの腫瘍細胞の標識を示す。マウス写真と、移植された腫瘍から発せられる光シグナル記録の重ね合わせを示す。

【図10】シロヒカリタケのルシフェラーゼを用いた、神経胚形成期（１６～１７期）にあるアフリカツメガエル胚の神経系の標識を示す。ルシフェラーゼ生物発光が示されている。

【発明を実施するための形態】

【0027】

本発明は、新規ルシフェラーゼ、その機能的断片、相同体、および変異体をコードする核酸分子、ならびに前記核酸によってコードされるタンパク質を対象とする。興味ある核酸分子は菌類から単離するか、または遺伝子工学的に操作する。また、これらの核酸分子を含む宿主細胞、安定した細胞株、およびトランスジェニック生物が提供される。さらに、本発明のタンパク質に特異的な抗体が提供される。

【0028】

前記タンパク質およびヌクレオチド組成物は、多くの用途や方法に、具体的には、生物、細胞、細胞小器官、またはタンパク質の標識に用いられる。また、前記タンパク質およびヌクレオチド組成物は、タンパク質－タンパク質相互作用の検出方法や、さまざまな条件下でのプロモーター活性の試験に用いられる。さらに、そうした方法や用途のためのキットが提供される。

【0029】

定義
本発明の主題に関するさまざまな用語が、上記ならびに明細書および特許請求の範囲で用いられている。

【0030】

本明細書で用いられる用語「ルシフェラーゼ」は、ルシフェリンを酸化することができるタンパク質を意味し、酸化反応には発光（ルミネセンス）を伴い、酸化ルシフェリンが放出される。

【0031】

本明細書で用いられる用語「ヒト化」は、コドンを最適化して哺乳類細胞でタンパク質を発現させるために核酸配列に加えられる変更を指す（非特許文献１９）。

【0032】

本明細書で用いられる用語「単離」は、ある分子または細胞が自然の状態で存在する環境とは異なる環境にあることを意味する。

【0033】

本明細書で用いられる用語「変異体」または「誘導体」は、本発明のタンパク質のＮ末端、および／またはＣ末端で、ならびに／あるいは天然アミノ酸配列内で、１つまたは複数のアミノ酸が付加される、および／または置換される、および／または欠失される、および／または挿入される本発明のタンパク質を指す。本明細書で用いられる用語「変異体」は、変異体タンパク質をコードする核酸分子を指す。さらに、本明細書における用語「変異体」は、タンパク質または核酸よりも長いまたは短い任意の多様体を指す。

【0034】

用語「相同性」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と他のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列との相互連係を言い表すのに用いられる。この相互連係は、これらの比較される配列間における同一性および／または類似性の程度によって決まる。

【0035】

本明細書では、比較のために選択された領域内で、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列が、特定の配列と少なくとも４０％同一であれば、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列は参照配列と「実質的に同様」または「実質的に同一」となる。したがって、実質的に同様の配列とは、例えば少なくとも４５％同一、または少なくとも５０％同一、または少なくとも５５％同一、または少なくとも６０％同一、または少なくとも６２％同一、または少なくとも６５％同一、または少なくとも７０％同一、または少なくとも７５％同一、例えば少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８％、または９９％同一）となる。互いに同一の２個の配列も、実質的に同様である。本発明の目的上、比較されるルシフェラーゼ配列の長さは、少なくとも１００個のアミノ酸、好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、例えば２００～２３０個のアミノ酸、またはタンパク質もしくは機能的断片のアミノ酸配列の全長である。核酸については、比較される配列の長さは、一般に少なくとも３００個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも６００個のヌクレオチドである。

【0036】

配列の同定は、参照配列に基づいて決定される。配列解析のアルゴリズムは、当技術分野では、例えば非特許文献２０に記載されているＢＬＡＳＴが知られている。本発明の目的上、標準パラメータを含むギャップありアライメントを用いた、国立生物工学情報センターが提供するＢＬＡＳＴソフトウェアパッケージ（非特許文献２１）を使ったヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の比較を、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列間の同一性および類似性の程度を決定するのに用いることができる。

【0037】

本明細書で用いられる用語「機能的」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、特定の試験または課題について機能できることを意味する。ルシフェラーゼに関して用いられる用語「機能的」は、タンパク質が、ルミネセンスを伴うルシフェリン酸化反応を触媒できることを意味する。

【0038】

本明細書で用いられる「生化学的特性」は、タンパク質フォールディング速度、成熟速度、半減期、触媒速度、ｐＨ安定性、および温度安定性などのような特性を指す。

【0039】

本明細書で用いられる「スペクトル特性」は、スペクトル、量子効率、およびルミネセンス強度などのような特性を指す。

【0040】

キメラタンパク質に関して用いられる「動作可能に連結された」などのような用語は、互いに物理的および機能的に連結されるポリペプチド配列を指す。もっとも好ましい実施形態では、キメラ分子のポリペプチド成分の機能は、単離されたポリペプチド成分の機能特性と比べて不変である。例えば、本発明のルシフェラーゼは、興味ある融合パートナーと融合することができる。この場合、キメラタンパク質はルシフェラーゼ特性を保持し、興味あるポリペプチドはその元の生物活性を保持する。いくつかの実施形態では、ルシフェラーゼおよび融合パートナーの両方の活性は、単離タンパク質の活性と比べて低下していることがある。そのようなキメラタンパク質も、本発明の範囲で応用される。核酸に関して用いられる「動作可能に連結された」などのような用語は、核酸が、接合で読み枠および終止コドンの「ミス」がないように共有結合されることを意味する。「動作可能に連結された」成分（タンパク質、ポリペプチド、連結配列、タンパク質ドメインなど）を含むキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、前記成分をコードする断片からなることは、当業者に十分理解されるであろう。このとき断片は、ヌクレオチド配列の転写および翻訳の際に完全なキメラタンパク質が生成されるように共有結合される。

【0041】

本明細書で用いられる用語「特異的にハイブリダイズする」は、当技術分野で一般的に用いられる所定条件下で、そうしたハイブリダイゼーションを可能にする、２個の単鎖核酸分子間または十分に相補的な配列間の関係性を示す（用語「実質的に相補的な」を使用する場合もある）。

【0042】

ポリペプチドを「コードする」ヌクレオチド配列とは、そのようなポリペプチドが、ｍＲＮＡの転写および翻訳の際にヌクレオチド配列から生成されることを意味する。これについて、ｍＲＮＡと同一であり、配列表で一般的に用いられるコード鎖、および転写の際に鋳型として用いられる相補的な鎖の両方を特定することができる。この用語が、均一なアミノ酸配列をコードする任意の変性ヌクレオチド配列も含むことは、当業者に十分理解されるであろう。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含む配列を含む。

【0043】

核酸分子
本発明はルシフェラーゼおよびその機能的断片をコードする（例えば、切断型または拡張型ルシフェラーゼ多様体をコードする）核酸分子を提供する。好ましい実施形態では、本発明の核酸は、そのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８の群から選択されるルシフェラーゼをコードする。上記のルシフェラーゼと実質的に同様である前記ルシフェラーゼの相同体および変異体をコードする核酸分子も、本発明の範囲に含まれる。興味あるこれら特定種の核酸分子のそれぞれについて、以下の実験の項で詳しく開示する。

【0044】

本明細書で用いられる核酸分子は、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡなどのＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、本発明のルシフェラーゼをコードし、適切な条件下で（例えば、生理的細胞内条件下で）、異種発現系でルシフェラーゼとして発現させることができるオープンリーディングフレームを有するＤＮＡ分子（またはｃＤＮＡ）である。

【0045】

いくつかの実施形態では、ルシフェラーゼをコードする本発明の核酸分子は、菌類から単離される。興味ある特定の核酸分子は、シロヒカリタケ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ワタゲナラタケ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ナラタケ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、オニナラタケ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、ヤコウタケ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、Ｍｙｃｅｎａ ｃｉｔｒｉｃｏｌｏｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｏｌｅａｒｉｕｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、およびワサビタケ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１８）のルシフェラーゼをコードする核酸を含む。そのような核酸のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７に示される。

【0046】

いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は遺伝子的に操作される。核酸を得る方法は当技術分野で周知である。例えば、アミノ酸配列情報（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～１８）またはヌクレオチド配列情報（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、５、７、９、１１、１３、１５、または１７）が利用できれば、オリゴヌクレオチド合成による本発明の単離核酸分子を調製することが可能となる。アミノ酸配列の情報が利用できれば、遺伝コードの縮重のために、それぞれ異なる複数の核酸を合成することができる。所望の宿主のためのコドン多様体を選択する方法は、当技術分野で周知である。

【0047】

合成オリゴヌクレオチドは、ホスホラミダイト法を用いて調製できる。得られたコンストラクトは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、または例えば非特許文献２２に記載されている方法や、例えば非特許文献２３に記載されている指示に従った方法など、当技術分野で周知の方法によって精製できる。本発明の長い二重鎖ＤＮＡ分子は、次のように合成できる。すなわち、隣接する断片と結合できる適切な末端を含む、必要な相補性を有する複数の小さな断片を合成できる。隣接する断片は、組み換えに基づく方法でＤＮＡリガーゼによって、またはＰＣＲの際に結合できる。

【0048】

本発明のルシフェラーゼをコードする核酸分子は、担子菌門、好ましくは担子菌綱、特にハラタケ目に属する菌類の生物源からもクローニングできる。

【0049】

本発明は、相同で、実質的に同様で、同一である核酸、または本発明のタンパク質をコードする核酸から得られる核酸も含む。

【0050】

本発明の核酸は、例えば単離されている、数が増加している、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系で、または自然の状態に存在するのとは異なる細胞もしくは生物で存在または発現するなど、自然の状態で存在する環境とは異なる環境にある。

【0051】

類似性の高いヌクレオチド配列間のヌクレオチド配列における改変または差異は、通常の複製または重複で生じるヌクレオチド配列置換を表し得る。その他の置換は、調節領域の特定のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列のコドンを改変するなど、特定の目的のために、具体的に計算し、配列に挿入することができる。そのような特別な置換は、さまざまな変異技術を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで行う、またはこうした変化を誘発もしくは選択する特定の育成条件下で宿主生物から得ることができる。そのように特別に調製された配列の多様体は、元の配列の「変異体」または「誘導体」と呼ぶことができる。

【0052】

本発明は、そのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８に示されるルシフェラーゼと実質的に同様であるルシフェラーゼをコードする核酸も提供する。そのようなポリペプチドまたはその断片をコードする核酸は、既知の複数の方法のいずれかによって得ることができる。本発明のｃＤＮＡ断片は、高ストリンジェント条件下で、標的生物のｃＤＮＡライブラリーに対するハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。プローブは、長い断片または短い縮重プライマーであり得る。類似の配列を有する核酸は、高ストリンジェント条件下で、例えば５０℃以上の高温（例えば６０℃または６５℃）、５０％ホルムアミド、０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭ塩化ナトリウム／１．５ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳで、ハイブリダイゼーションによって検出できる。参照配列、例えばアレル多様体、遺伝子組み換えされた核酸多様体などと実質的に同一の領域を有する核酸は、高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、参照配列に結合する。そのようなヌクレオチド配列は、プローブ、具体的には、参照ＤＮＡ配列に相補的な標識プローブを用いて単離できる。

【0053】

そのようなポリペプチドまたはその断片をコードする核酸は、ゲノムまたはトランスクリプトームの配列決定の際に検出することもできる。具体的には、実質的に同様のルシフェラーゼは、生物の配列決定の際に、例えば、さまざまな種の菌類、主に担子菌門、例えば担子菌綱、特にハラタケ目の配列決定の際に得られるデータに基づいて予測される仮定的タンパク質の配列の中で同定できる。

【0054】

本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示される配列と実質的に同様の、特定の共通アミノ酸配列を含むルシフェラーゼをコードする核酸も提供する。本明細書において、用語「共通配列」は、本発明の異なるルシフェラーゼで（個々のアミノ酸のわずかな変化を伴って）定期的に生じる平均アミノ酸配列を意味する。

【0055】

変異核酸または由来核酸は、鋳型配列で１つまたは複数のヌクレオチドを修飾、欠失、もしくは付加することによって、またはその組み合わせで鋳型核酸の多様体を作製することによって、上記の核酸から選択される鋳型核酸から得ることができる。修飾、付加、または欠失は、エラープローンＰＣＲ、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発、アセンブリＰＣＲ、セクシャルＰＣＲ変異誘発、ｉｎ ｖｉｖｏ変異誘発、カセット変異誘発、再帰的アンサンブル変異誘発、指数関数的アンサンブル変異誘発、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、遺伝子再構築、遺伝子部位飽和変異誘発（ＧＳＳＭ）、合成ライゲーション再構築（ＳＬＲ）、またはその組み合わせを含む、当技術分野で周知の任意の方法を用いて行い得る（例えば非特許文献２４～２７参照）。修飾、付加、および欠失は、組み換え、再帰的配列組み換え、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ変異誘発、ウラシル含有鋳型変異誘発、ギャップトデュプレックス変異誘発、ポイントミスマッチ修復変異誘発、修復欠損宿主株変異誘発、化学的変異誘発、放射線変異誘発、欠失変異誘発、制限選択変異誘発、制限精製変異誘発、人工遺伝子合成、アンサンブル変異誘発、キメラ核酸マルチマー作製、またはその組み合わせを含む方法によって導入し得る。いくつかの実施形態では、変異核酸または由来核酸によってコードされるルシフェラーゼは、野生型ルシフェラーゼと同じスペクトル特性または生化学的特性を有する。他の実施形態では、変異核酸または由来核酸は、特性が変化したルシフェラーゼをコードする。

【0056】

また、本発明のタンパク質をコードする核酸の縮重多様体が提供される。縮重核酸多様体は、核酸コドンと、同じアミノ酸をコードする他のコドンとの置換を含む。具体的には、核酸の縮重多様体を作製することにより、宿主細胞における発現を増加させる。この実施形態では、宿主細胞遺伝子において好ましくない、またはあまり好ましくない核酸コドンを、宿主細胞における遺伝子のコード配列に豊富に存在するコドンと置換する。このとき、前記置換コドンは同じアミノ酸をコードする。興味ある縮重多様体の例について、以下の実験の項でさらに詳しく説明する。

【0057】

これらのルシフェラーゼの切断型多様体および拡張型多様体をコードする核酸も、本発明の範囲に含まれる。本明細書で用いられるこれらのタンパク質多様体は、ポリペプチド鎖の修飾Ｃ末端、Ｎ末端、または両方の末端を改変させたアミノ酸配列を含む。

【0058】

切断型多様体において、１つまたは複数の（通常は最大３９個、大抵は３７個以下の）アミノ酸を配列から除去、またはその他のアミノ酸で置換し得る。具体的には、ルシフェラーゼの膜貫通領域をコードする配列、およびＮ末端に先行するアミノ酸配列を、完全に、または部分的に除去することができる。膜貫通領域は、先行技術から知られる方法を用いて、例えば［非特許文献２８、２９］に記載されるアルゴリズムを用いて同定することができる。解析には、前記アルゴリズムに基づき、［非特許文献３０］に記載されているソフトウェアを使用できる。拡張型多様体では、タンパク質のＣ末端またはＮ末端は、付加アミノ酸を含み得る。機能的断片のアミノ酸配列の例、および対応するコード化ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～３４に示される。機能的断片の発現については、それらをコードする核酸は、少なくとも調節配列および転写開始点を含む核酸と動作可能に連結される。またこれらの核酸は、６－Ｈｉｓタグをコードする配列、シグナルペプチド、または機能的タンパク質ドメインを含み得る。

【0059】

上記の修飾はルシフェラーゼのスペクトル特性を実質的には変化させないが、細胞内局在を変化させ、宿主細胞におけるタンパク質フォールディングを促進し、凝集を低減し、またはタンパク質の生化学的特性、例えば半減期を調整することができる。いくつかの実施形態では、これらの修飾はタンパク質の生化学的特性を変化させない。上記のあらゆる種類の修飾および変異は、原則として、核酸レベルで行われる。

【0060】

本発明の核酸分子は、主題のタンパク質全体、またはその一部をコードし得る。二重鎖断片または単鎖断片は、標準法、酵素制限、ＰＣＲ増幅などに従って、オリゴヌクレオチドの化学合成によってＤＮＡ配列から得ることができる。一般にＤＮＡ断片の長さは、少なくとも約１５個のヌクレオチド、通常は少なくとも約１８個、または約２５個のヌクレオチドとなり、少なくとも約５０個のヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、主題の核酸分子は、約１００個、約２００個、約３００個、約４００個、約５００個、約６００個以上の長さであり得る。主題の核酸は、主題のタンパク質の断片または完全タンパク質をコードできる。例えば主題の核酸は、約２５個のアミノ酸、約５０個、約７５個、約１００個、約１２５個、約１５０個、約２００個のアミノ酸、最大で完全長のタンパク質のポリペプチドをコードし得る。

【0061】

主題の核酸は、単離し、実質的に純粋な形で獲得し得る。実質的に純粋な形とは、核酸が少なくとも約５０％純粋であり、通常は少なくとも約９０％純粋であり、かつ通常は「組み換え」である、すなわち、自然界でその自然宿主に存在する染色体の配列と一般に結合しない１つまたは複数のヌクレオチドが隣接していることを意味する。

【0062】

また、以下に詳細に説明する本発明のタンパク質またはその断片を含む融合タンパク質をコードする核酸も提供される。

【0063】

主題の核酸を含むベクターおよびその他の核酸コンストラクトも提供される。適切なベクターは、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、プラスミド、コスミド、ファージなどを含み、好ましくはプラスミドを含み、本発明の核酸配列のクローニング、増幅、発現、適切な宿主への導入などに用いられる。適切なベクターの選択は、当業者にとって容易である。コンストラクトを調製するには、通常は、ベクターの切断制限酵素部位にＤＮＡリガーゼを結合させることによって、核酸の一部または完全長の核酸をベクターに挿入する。あるいは、所望のヌクレオチド配列を、ｉｎ ｖｉｖｏ相同組み換えによって、通常は所望のヌクレオチド配列の側部で相同領域をベクターに結合させることによって挿入することができる。相同性の領域は、オリゴヌクレオチドの連結によって、または、例えば所望のヌクレオチド配列の一部および相同領域の両方を有するプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって付加される。ベクターは、原則として、染色体外エレメントとして細胞に導入されることで、宿主におけるその複製を確保する複製起点を有する。ベクターは、宿主における核酸の発現および組み換え機能性ルシフェラーゼの生成をもたらす調節エレメントも含み得る。発現ベクターにおいて、前記核酸は、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、オペレーター、リプレッサー、サイレンサー、インスレーター、およびインデューサーを含み得る調節配列と機能的に連結される。

【0064】

とりわけ、主題のルシフェラーゼもしくはそれに基づくキメラタンパク質を得るために、または主題の核酸分子の複製のために用いられる、発現カセットまたは発現系も提供される。発現カセットは染色体外エレメントとして存在し得るか、または、前記発現カセットを細胞に導入することで、細胞のゲノムに組み込まれ得る。発現では、本発明の核酸によってコードされる遺伝子産物は、例えば、細菌系、酵母、植物、昆虫、両生類、哺乳類系を含む任意の簡便な発現系で発現される。発現カセットでは、標的核酸は、プロモーター、エンハンサー、終止配列、オペレーター、リプレッサー、およびインデューサーを含むことのできる調節配列に動作可能に連結される。所望の産物を発現させられる発現カセットまたは発現系を調製する方法は、当業者には周知である。

【0065】

本発明のタンパク質を持続的に発現する細胞株は、当技術分野で周知の方法によって選択することができる（例えば、ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、またはハイグロマイシンなどの選択マーカーを用いた共導入により、ゲノムに組み込まれた遺伝子を含む形質導入細胞の同定および単離が可能となる）。

【0066】

上記の発現系は、原核生物宿主または真核生物宿主で用いることができる。大腸菌（Е．ｃｏｌｉ）、枯草菌（В．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、またはヒト胚細胞ではない高等生物の細胞など、酵母、植物（例えば、シロイヌナズナ［Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ］、ベンサミアナタバコ［Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ］、ニセツリガネゴケ［Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ］）、脊椎動物、例えば、ＣＯＳ－７細胞、ヒト胎児腎細胞２９３、ＣＨＯ、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞などの宿主細胞を、タンパク質の生成に使用し得る。

【0067】

上述の宿主細胞のいずれか、またはその他の適切な宿主細胞もしくは生物を、本発明の核酸の複製および／または発現に用いる場合、得られた複製核酸、発現タンパク質またはポリペプチドは、宿主細胞または生物の生成物として、本発明の範囲に含まれる。生成物は当技術分野で周知の適切な手段によって回収し得る。

【0068】

ＰＣＲ、ローリングサークル増幅、ハイブリダイゼーションスクリーニングプローブなどのためのプライマーとして有用な、主題の核酸の小さなＤＮＡ断片も提供される。大きなＤＮＡ断片は、上述のように、コード化ポリペプチドの生成に有用である。しかしながら、ＰＣＲなど幾何学的増幅反応での使用には、小さなＤＮＡ断片、すなわちプライマーの対を用いる。プライマー配列の正確な組成は本発明にとって重要ではないが、大半の用途ではプライマーは、当技術分野で周知のように、ストリンジェント条件下で主題の配列にハイブリダイズする。少なくとも約５０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１００個のヌクレオチドから核酸配列全体まで及ぶ増幅産物を生成するプライマー対を選択することが好ましい。プライマー配列を選択するアルゴリズムは一般に知られており、市販のソフトウェアパッケージで利用できる。増幅プライマーは、ＤＮＡの相補的な鎖にハイブリダイズし、互いにプライミングする。

【0069】

本発明の核酸分子は、生物学的試料における遺伝子の発現を同定するために使用し得る。ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡなど特定のヌクレオチド配列の存在について細胞を探索する方法については、文献で十分に確立されている。つまり、ＤＮＡまたはｍＲＮＡを細胞試料から単離する。ｍＲＮＡは、逆転写酵素を用いてＲＴ－ＰＣＲで増幅し、相補的なＤＮＡ鎖を形成し、続いて主題のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応増幅を行い得る。あるいは、ｍＲＮＡ試料をゲル電気泳動によって分離し、適切な支持体、例えばニトロセルロース、ナイロンなどに移したのち、プローブとして主題のＤＮＡの断片を用いて探索する。オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、および固体チップ上に配列されるＤＮＡプローブへのハイブリダイゼーションといった他の技術も使用し得る。主題の配列にハイブリダイズするｍＲＮＡの検出は、試料における遺伝子発現を示している。

【0070】

タンパク質
本発明は、ルシフェラーゼ、ならびに全長タンパク質およびその一部または断片を含む、その相同体、誘導体、および変異体も提供する。

【0071】

主題のタンパク質は、酸素存在下でルシフェリンの酸化を触媒できるルシフェラーゼである。酸化反応は、媒体中のＡＴＰ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈなどの代謝産物の存在には依存しない。主題のタンパク質は、以下の構造を有する３－ヒドロキシヒスピジンを酸化するため、既知のルシフェラーゼとは異なる。

【0072】

【化1】

【0073】

主題のルシフェラーゼは、その他の化学化合物の酸化を触媒できる。そのような化合物を検出するために、単離ルシフェラーゼと前記化学化合物とを適切な条件下で結合させ、酸化反応の際に発せられる光を検出する。主題のルシフェラーゼで、ルシフェリンとして機能できる化合物の例には、例えば以下がある。

【0074】

以下の構造をもつ（Ｅ）－６－（４－ジエチルアミノ）スチリル）－３，４－ジヒドロキシ－２Ｈ－ピラン－２－オン。

【0075】

【化2】

【0076】

以下の構造をもつ（Ｅ）－３，４－ジヒドロキシ－６－（４－ヒドロキシスチリル）－２Ｈ－ピラン－２－オン。

【0077】

【化3】

【0078】

以下の構造をもつ（Ｅ）－６－（２－１Ｈ－インドール－３－イル）ビニル）－３，４－ジヒドロキシ－２Ｈ－ピラン－２－オン。

【0079】

【化4】

【0080】

以下の構造をもつ（Ｅ）－６－（２－（１，２，３，５，６，７－ヘキサヒドロピリド［３，２，１－ｉｊ］キノリン－９－イル）ビニル）－３，４－ジヒドロキシ－２Ｈ－ピラン－２－オン。

【0081】

【化5】

【0082】

以下の構造をもつ（Ｅ）－３，４－ジヒドロキシ－６－（２－（６－ヒドロキシナフタレン－２－イル）ビニル）－２Ｈ－ピラン－２－オン。

【0083】

【化6】

【0084】

本発明のルシフェラーゼによるルシフェリンの酸化は、検出可能な光の放出を伴う。

【0085】

本発明のいくつかの実施形態では、反応時に放出される光は、従来の方法（例えば、目視検査、暗視、分光測光、分光蛍光分析、画像撮影記録、特殊発光、および例えばＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ［Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ］といった蛍光検出装置など）を用いて検出できる。記録される光は、光子1個から例えば光度が１ｃｄの容易に見える光、および例えば光度が１００ｃｄ以上の明るい光までの強度範囲内で発せられ得る。

【0086】

３－ヒドロキシヒスピジンの酸化の際に発せられる光は、４００～７００ｎｍの範囲内、多くの場合４５０～６５０ｎｍの範囲内にあり、発光最大値が５２０～５９０ｎｍである。

【0087】

主題のタンパク質は５０℃未満の温度で、多くの場合４５℃以下で活性を維持する。すなわち３０～４２℃の温度範囲で活性を維持し、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの異種発現系で用いることができる。

【0088】

主題のタンパク質をｐＨ安定性は４～１０の範囲内、多くの場合は６．５～９．５の範囲内にある。主題のタンパク質の最適なｐＨ安定性は７．０～８．０、例えば７．３～７．５の範囲内にある。

【0089】

興味ある特定のタンパク質は、シロヒカリタケ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ワタゲナラタケ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ナラタケ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、オニナラタケ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、ヤコウタケ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、Ｍｙｃｅｎａ ｃｉｔｒｉｃｏｌｏｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｏｌｅａｒｉｕｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、およびワサビタケ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１８）の天然ルシフェラーゼ、ならびに例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４に示されるアミノ酸配列を含み以下の実験の項で詳しく説明する、それらの組み換えおよび切断型多様体を含む。

【0090】

上記のルシフェラーゼおよびその機能的断片と実質的に同様のルシフェラーゼも提供される。多くの実施形態において、興味あるアミノ酸配列は、配列が大幅に同一、例えば少なくとも４０％同一、例えば少なくとも４５％同一、または少なくとも５０％同一、または少なくとも５５％同一、または少なくとも６０％同一、または少なくとも６５％同一、または少なくとも７０％同一、または少なくとも７５％同一、例えば少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８％、または９９％同一）である。具体的には、これはタンパク質機能領域をもたらすアミノ酸の配列、すなわち本発明の天然ルシフェラーゼの一部である膜貫通領域の配列の後に位置するタンパク質配列を指す。

【0091】

本発明は、本発明の天然ルシフェラーゼに備わっており、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示される特定の共通配列を含むルシフェラーゼも提供する。共通配列は、複数の関連配列におけるこの位置で最も一般的に発生するアミノ酸を同定することによって、本発明のルシフェラーゼを複数回比較して得られる。

【0092】

本発明は上記のタンパク質の変異体も提供する。変異体は、それを得たタンパク質の生物学的特性を保持し得るか、または野生型タンパク質のものとは異なる生物学的特性を持ち得る。本発明に従ったタンパク質の「生物学的特性」という用語は、さまざまなルシフェリンを酸化する能力；ｉｎ ｖｉｖｏおよび／もしくはｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性（例えば、半減期）などの生化学的特性；成熟速度；凝集傾向、またはオリゴマー化傾向などのような特性を指すが、これに限定されない。変異体は、１つまたは複数のアミノ酸の改変、１つまたは複数のアミノ酸の欠失または挿入；Ｎ末端切断または延長、Ｃ末端切断または延長などを含む。

【0093】

変異体は、上記の核酸分子の項で詳しく説明したような従来の分子生物学の技術を用いて獲得し得る。

【0094】

本発明のタンパク質は単離された形態であり、すなわち所定のタンパク質は、他のタンパク質、またはオリゴ糖、核酸、およびその断片などの他の天然生体分子を実質的に含まない。これに関連して、用語「実質的に含まない」は、単離タンパク質を含む前記組成物の７０％未満、通常６０％未満、多くの場合５０％未満が、他の天然生体分子で構成されていることを意味する。いくつかの実施形態では、前記タンパク質は実質的に純粋な形である。これに関連して、用語「実質的に純粋な形」は、前記タンパク質が、少なくとも９５％純粋、通常は少なくとも９７％純粋、多くの場合少なくとも９９％純粋であることを意味する。

【0095】

好ましい実施形態では、標的タンパク質は合成法を用いて、例えば、上述のように、適切な宿主において興味あるタンパク質をコードする配列をコードする組み換え核酸を発現することによって得られる。任意の従来のタンパク質精製手順を用いてよく、適切な基準ガイド（非特許文献３１）に適当なタンパク質精製技術が記載されている。例えば、ライセートは元の供給源から調製し、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィなどを用いて精製し得る。

【0096】

本発明は、例えば細胞内局在配列（例えば、核局在化シグナル、ペルオキシソーム局在化シグナル、ミトコンドリア、ゴルジ装置など）、シグナルペプチド、または任意の興味あるタンパク質もしくはポリペプチドと融合した本発明のタンパク質またはその機能的断片を含む融合タンパク質も含む。融合タンパク質は、例えば、ルシフェラーゼのＮ末端および／またはＣ末端と動作可能にインフレームで融合した本発明のルシフェラーゼおよび第２のポリペプチド（「融合パートナー」）を含み得る。融合パートナーは、融合パートナー（例えば、エピトープタグ）に特異的な抗体と結合できるポリペプチド、その抗体または結合断片、触媒機能を与えるもしくは細胞応答を誘発するポリペプチド、そのリガンドまたはレセプターまたはミメティックなどを含むがこれに限定されない。

【0097】

本発明は、本発明のルシフェラーゼと特異的に結合する抗体も提供する。適切な抗体は、当技術分野で周知の技術を用いて獲得し得る。例えば、ポリクローナル抗体は、（非特許文献３２）に記載されている技術を用いて獲得し得る。モノクローナル抗体は、（非特許文献３３）に記載されているように獲得し得る。ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦＡｂなどの抗体断片を含むキメラ抗体にも興味がある。

【0098】

形質転換体
本発明の核酸は、トランスジェニック生物、または細胞株における部位特異的遺伝子改変を含む形質転換体を作製するのに使用し得る。本発明のトランスジェニック細胞は、導入遺伝子として存在する１つまたは複数の本発明の核酸を含む。本発明の目的上、ヒト胚細胞を除く原核宿主（例えば、大腸菌、ストレプトマイセス属、枯草菌、アシドフィルス菌など）または真核宿主などの任意の適切な宿主を使用し得る。本発明のトランスジェニック生物は、細菌、藍色細菌、菌類、植物、動物を含む原核生物または真核生物であり得る。このとき、本発明の異種核酸を含む生物の１つまたは複数の細胞は、当技術分野で周知の遺伝子導入技術など、人間の介入によって導入される。

【0099】

本発明の単離核酸は、当技術分野で周知の方法、例えば感染、形質移入、形質転換、遺伝子銃送達、またはトランス接合（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）によって宿主に導入することができる。核酸分子（すなわちＤＮＡ）をそのような生物に導入する技術は広く知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋらなどの参考文献に記載されている（非特許文献３４）。

【0100】

一実施形態では、トランスジェニック生物は原核生物であり得る。原核宿主の形質転換法は当技術分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら［非特許文献３５、３６］参照）。

【0101】

その他の実施形態では、前記トランスジェニック生物は、菌類、例えば酵母であり得る。酵母は、異種遺伝子発現の媒介物として広く用いられている（例えば、非特許文献３７、３８参照）。維持のために宿主ゲノムによる組み換えが必要とされる統合ベクター、および自己複製プラスミドベクターなど、数種類の酵母ベクターが利用できる。

【0102】

もう１つの宿主生物体は動物である。トランスジェニック動物は、当技術分野で周知であり、参考文献（非特許文献３９～４２）に記載されているトランスジェニック技術によって得ることができる。例えば、トランスジェニック動物は相同組み換えによって得ることができ、内在性遺伝子座が改変される。あるいは、核酸コンストラクトは、ゲノム中にランダムに組み込まれる。組み込みを安定させるベクターには、プラスミド、レトロウイルス、その他の動物ウイルス、ＹＡＣなどがある。

【0103】

核酸は、マイクロインジェクションなどによる意図的な遺伝子操作によって、または組み換えウイルスもしくは組み換えウイルスベクターなどを用いた感染によって、細胞の前駆体に導入することで直接的または間接的に細胞に導入することができる。「遺伝子操作」という用語は、古典的な交雑育種または体外受精を含まず、むしろ組み換え核酸分子の導入を指す。この核酸分子は染色体内に組み込み得るか、または染色体外複製ＤＮＡであり得る。

【0104】

相同組み換えのためのＤＮＡコンストラクトは、本発明の核酸の少なくとも一部を含む。このとき前記遺伝子は、所望の１つまたは複数の遺伝子組み換えを有し、標的遺伝子座に対する相同性領域を含む。ランダムな組み込みのためのＤＮＡコンストラクトは、組み換えを仲介する相同性領域を含む必要はない。ポジティブ選択およびネガティブ選択のためのマーカーも含み得る。相同組み換えによる標的遺伝子改変を有する細胞を作製する方法は、当技術分野で周知である。哺乳類細胞を形質移入するさまざまな方法が、例えば非特許文献４３に記載されている。

【0105】

胚幹（ＥＳ）細胞については、ＥＳ細胞株を使用し得るか、または胚細胞を、マウス、ラット、モルモットなどの宿主から新たに獲得し得る。そのような細胞は、適切な線維芽細胞支持細胞層上で増殖させるか、または白血病抑制因子（ＬＩＦ）の存在下で増殖させる。形質転換ＥＳ細胞または胚細胞は、当技術分野で周知の適切な技術を用いて、トランスジェニック動物の作製に使用し得る。

【0106】

トランスジェニック動物は、非ヒト哺乳類(例えば、マウス、ラット)、鳥類または両性類などの非ヒト動物であり得、機能性試験、薬物スクリーニングなどで使用し得る。

【0107】

トランスジェニック植物も獲得し得る。トランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物を作製する方法は、特許第５，７６７，３６７号明細書、特許第５，７５０，８７０号明細書、特許第５，７３９，４０９号明細書、特許第５，６８９，０４９号明細書、特許第５，６９０，０４５号明細書、特許第５，６７４，７３１号明細書、特許第５，６５６，６６６号明細書、特許第５，６３３，１５５号明細書、特許第５，６２９，４７０号明細書、特許第５，５９５，８９６号明細書、特許第５，５７６，１９８号明細書、特許第５，５３８，８７９号明細書、特許第５，４８４，９５６号明細書に記載されており、その開示は参照により本明細書に援用される。トランスジェニック植物を作製させる方法は、非特許文献４４および４５でも確認される。

【0108】

例えば、体細胞を含む胚形成外植片は、トランスジェニック宿主の作製に使用し得る。細胞または組織の収集後、興味ある外来ＤＮＡを植物細胞に導入する。そのような導入では、さまざまな異なる方法が利用できる。単離プロトプラストを用いることで、多価カチオン（例えば、ＰＥＧまたはＰＬＯ）存在下で興味ある外来コード配列を含むプラスミドのようなネイキッドＤＮＡを用いたプロトプラストのインキュベーションなどのＤＮＡ媒介遺伝子導入プロトコルによって導入する機会、または興味ある外来配列を含むネイキッドＤＮＡ存在下での上記プロトプラストのエレクトロポレーションの機会が生じる。次いで、外来ＤＮＡをうまく取り込んだプロトプラストを選択し、カルスに成長させ、最後に、オーキシンおよびサイトカイニンなどの刺激因子を適切な量と比率で接触させることにより、トランスジェニック植物に成長させる。

【0109】

当業者が利用できる「遺伝子銃」法またはアグロバクテリウム媒介形質転換のような他の適切な植物作製方法も使用し得る。

【0110】

使用方法
本発明のポリペプチドおよび核酸は、さまざまな用途で用いられる。例えば、生物工学および医学において、診断、品質管理、環境試験などのアッセイの試薬として用いられる。さらに、国内用途や娯楽用途で、例えば、光源として利用できる生物発光トランスジェニック植物および動物の作製において用いられる。

【0111】

例えば、本組成物の核酸は、媒体におけるさまざまな外部シグナルの検出に、例えば哺乳類の腸におけるシグナルの検出に用いられる。実施形態では、シグナル伝達カスケードをコードする発現カセットが宿主のゲノムに導入され、分析された環境シグナルがトリガーとして機能し、ルシフェラーゼ遺伝子発現がレポーターとして機能する。ルシフェラーゼ遺伝子発現は、シグナル伝達カスケード伝達によって直接的に、または、例えば［非特許文献４６］に記載されている技術を用いて、細胞ゲノムで遺伝子変異を誘発することによって起こすことができる。例えば、周囲媒体におけるテトラサイクリンの存在を検出する大腸菌株を作製するために、ｔｅｔＡ遺伝子プロモーターの制御下にあるルシフェラーゼコード配列、および構成プロモーターの制御下でトランスポゾンＴｎ１０のテトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）をコードする配列を大腸菌ゲノムに導入する。大腸菌のゲノム編集は、例えば［非特許文献４７］に記載されている当技術分野で周知の技術を用いて行う。媒体におけるテトラサイクリンの存在は、試料媒体でインキュベートされた後に遺伝子組み替えした大腸菌細胞と、そのようなインキュベーションを行っていない対照細胞とに３－ヒドロキシヒスピジン溶液を添加した後に生物発光強度を比較することによって検出する。同様に、他の周囲媒体シグナルに対して感受性がある他の微生物菌株は、所望のシグナルに対して特異的に感受性があるエレメントを持つシグナル伝達カスケードの対応するエレメントを置換することによって作製できる。主題のルシフェラーゼによる発光は、ＡＴＰ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈなどの代謝産物が細胞内で利用できるかに依存しないため、細胞のさまざまな生理学的状態においてレポーターシグナルの安定性が確保される。

【0112】

また、本発明の核酸は、水中の毒物、例えばヘキサクロロシクロヘキサン誘導体などの存在を検出する方法でも用いられる。急速タンパク質分解のシグナルと動作可能に融合したルシフェラーゼの構成的産生をもたらす発現カセットを、宿主（例えば大腸菌）に導入する。毒性を測定するために、生物発光検出キュベットで試料液体を用いて凍結乾燥細菌を９０分間インキュベートし、同時に、別の細菌アリコートを、対照液体を用いてインキュベートする。毒物を含有していない溶液を用いた試料と比較した、分析プローブにおける生物発光強度の交互変化が、毒作用の基準となる。したがって、ルミネセンス強度の低下に基づいて毒作用を測定し得る。

【0113】

また、本発明の分子は、試料溶液中の３－ヒドロキシヒスピジンの濃度を検出するのに使用し得る。このために、既知の濃度で精製ルシフェラーゼを含有する試薬をキュベットに入れ、ルミノメーターを用いて背景生物発光信号を記録する。制御校正測定を以下のように行う。既知の濃度の３－ヒドロキシヒスピジン溶液をキュベットに添加し、生物発光強度を記録する。３－ヒドロキシヒスピジンの存在下と非存在下での発光強度シグナル強度の差は、３－ヒドロキシヒスピジンの濃度に比例する値となる。実施する測定に適した３－ヒドロキシヒスピジン溶液のこれらの濃度について、作業をくり返す。得られたデータに基づいて、生物発光強度の３－ヒドロキシヒスピジン濃度への依存の校正曲線をプロットする。未知の試料における３－ヒドロキシヒスピジン濃度は、上記校正曲線を用いて未知の濃度の３－ヒドロキシヒスピジン溶液を試薬に添加した後、生物発光強度に基づいて測定する。主題のタンパク質および核酸は、他の化合物を含む複合混合物中の３－ヒドロキシヒスピジンの濃度を特異的に測定できる唯一の既存試薬である。

【0114】

本組成物の核酸を用いて、さらに発光トランスジェニック植物または動物を作製することができる。例えば、トランスジェニックコケ（ニセツリガネゴケ）を作製するには、構成プロモーター、例えばイネのＡｋｔＩ遺伝子のプロモーター、または誘導プロモーター、例えばダイズのＧｍｈｓｐ１７．３Ｂ遺伝子の感熱性プロモーターの制御下で、宿主細胞における発現のために最適化されたルシフェラーゼコード配列にそのゲノムを組み込む必要がある。そのような組み込みには、当技術分野で周知の任意の技術、例えば、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９ヌクレアーゼ、およびゲノム遺伝子座に相補的なガイドＲＮＡを用いてコケのゲノムＤＮＡに二重鎖ギャップを形成することによって誘発される相同組み換えを用いてよい。この場合、組み込まれる遺伝子コンストラクトは、長さが約２５０個のヌクレオチドの二重鎖ギャップの領域において、ゲノムの領域に相同の領域が隣接されることになる。コケ細胞へのＤＮＡ導入には、任意の既知の技術、例えば、ポリエチレングリコールを用いたネイキッドＤＮＡによるコケプロトプラストの形質転換を使用し得る。形質転換後、細胞壁再生用増殖培地でコケプロトプラストを増殖させ、次いで、配偶体再生用の固体培地に移すものとする。遺伝子組み換え植物は、３－ヒドロキシヒスピジンまたは関連分子を培地または土壌に添加したときに光源として、または宿主細胞において３－ヒドロキシヒスピジン生合成が生じた場合に、自律的な生物発光として機能し得る。主題のルシフェラーゼは主に緑色光を発するため、光合成植物組織による発光に最適であり、それは、可視スペクトルの緑色領域においてそのような組織の吸収が低下するからである。

【0115】

本組成物の核酸は、細胞タンパク質、小器官、個々の細胞または組織を視覚化するのにも使用できる。例えば、生物における腫瘍細胞の移動を視覚化するために、ルシフェラーゼの核酸配列を、発現カセットまたは発現ベクターの一部として腫瘍細胞に導入する。そのような導入には、当技術分野で周知の任意の方法を用いることができる。例えば、ルシフェラーゼをコードする核酸は、腫瘍細胞のゲノムに組み込んでから宿主に移植できる。他の実施形態では、核酸はあらゆる生体細胞に組み込まれるが、腫瘍細胞のみにおいて、プロモーターの制御下で活性化される。３－ヒドロキシヒスピジンは細胞膜を貫通できるため、主題のルシフェラーゼは、組織固定や透過処理せずに、生物生体内で視覚化できる。がん腫瘍の増殖や転移を視覚化するために、試料生物にルシフェリン溶液を導入し、生物発光の検出に適した装置を用いて組織を視覚化する必要がある。

【0116】

キット
本発明は、本発明の核酸およびタンパク質の１つまたは複数を実現するキットも提供する。

【0117】

前記キットは、通常、本発明に従ったタンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸を、好ましくは宿主における標的タンパク質の発現をもたらすエレメント、例えば、標的タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターまたは発現カセットとともに含む。また、前記キットは、本発明のルシフェラーゼによって仲介されるルミネセンス反応を起こすルシフェリンを含む。

【0118】

いくつかの実施形態では、ルシフェリンは、３－ヒドロキシヒスピジン、（Ｅ）－６－（４－ジエチルアミノ）スチリル）－３，４－ジヒドロキシ－２Ｈ－ピラン－２－オン、（Ｅ）－３，４－ジヒドロキシ－６－（４－ヒドロキシスチリル）－２Ｈ－ピラン－２－オン、（Ｅ）－６－（２－１Ｈ－インドール－３－イル）ビニル）－３，４－ジヒドロキシ－２Ｈ－ピラン－２－オン、（Ｅ）－６－（２－（１，２，３，５，６，７－ヘキサヒドロピリド［３，２，１－ｉｊ］キノリン－９－イル）ビニル）－３，４－ジヒドロキシ－２Ｈ－ピラン－２－オン、および（Ｅ）－３，４－ジヒドロキシ－６－（２－（６－ヒドロキシナフタレン－２－イル）ビニル）－２Ｈ－ピラン－２－オンからなる群から選択される。

【0119】

前記キットは、通常、適切な容器に入った、通常、緩衝液などの適切な貯蔵媒体中に存在する。前記成分は凍結乾燥の形態でキットに存在し得る。

【0120】

また、キットは主題のタンパク質に特異的な抗体を含み得る。いくつかの実施形態では、前記キットは、それぞれが標的タンパク質をコードする複数の異なるベクターを含み、前記ベクターは、例えば構成的発現など、異なる媒体で、および／またはさまざまな条件下で発現するようデザインされており、前記ベクターは、哺乳類細胞における発現にとって強力なプロモーター、または従来のプロモーター組み込みおよび遅延発現などのためのマルチクローニングサイトを有する非プロモーターベクターを含む。

【0121】

上記の成分に加えて、対象キットは、主題の方法を実行するための指示も含む。指示は対象キット中にさまざまな形態で存在し得、そうした形態の１つまたは複数が各キット中に存在し得る。

【0122】

以下に実施例を示すが、これは本発明を説明するためのものであって、限定するものではない。

【実施例1】

【0123】

シロヒカリタケのルシフェラーゼのコード配列の単離
シロヒカリタケの菌糸体の全ＲＮＡを、［非特許文献４８］に記載されている方法を用いて単離した。ｃＤＮＡはＳＭＡＲＴ ＰＣＲ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、アメリカ）を用い、製造者の手順書に従って増幅した。ＰＣＲ産物をｐＧＡＰＺベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、アメリカ）にクローニングし、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ株の大腸菌コンピテント細胞に形質転換した。細菌をペトリ皿でゼオシン抗生物質存在下で増殖させた。１６時間後、コロニーを皿から洗い取り、強く混合し、プラスミドＤＮＡ抽出キット（Ｅｖｒｏｇｅｎ、ロシア）を用いて、そこからプラスミドＤＮＡを抽出した。単離したプラスミドＤＮＡをＡｖｒＩＩ制限部位で線状化し、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５細胞を形質転換するのに用いた。［非特許文献４９］に記載されている、酢酸リチウムおよびジチオスレイトールを用いる方法に従ってエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションした細胞を、１Ｍソルビトール、２％（ｗ／ｖ）グルコース、１．３４％（ｗ／ｖ）酵母ニトロゲンベース（ＹＮＢ）、０．００５％（ｗ／ｖ）、０．００００４％（ｗ／ｖ）ビオチン、および２％（ｗ／ｖ）寒天を含むＲＤＢ培地を入れたペトリ皿に塗布した。酵母中に生じたさまざまなシロヒカリタケのｃＤＮＡライブラリは、約１００万クローンとなった。得られたコロニーに３－ヒドロキシヒスピジン溶液を噴霧し、細胞中のルシフェラーゼの存在を発光によって検出した。コロニーから発せられた光は、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＣＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、アメリカ）を用いて検出した。３－ヒドロキシヒスピジン添加後にルミネセンスが検出されたコロニーを選択し、ＰＣＲ用の標準プラスミドプライマーとともに鋳型として用いた。ＰＣＲ産物はＳａｎｇｅｒ法によって配列決定した。得られた核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０１に示される。それにコードされるアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０２に示される。

【0124】

発現ルシフェラーゼの生物発光を分析するために、ルミネセンスが観察されたＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓコロニーを単離し、２５０ｍＬのＹＰＤ培地を入れた７５０ｍＬフラスコで７２時間、３０℃で増殖させ、２００ｒｐｍで撹拌した。次いで、５０００ｇで１５分間、４℃で遠心分離し、ペレットにした。得られたペレットは、０．１％ＤＤＭを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で２時間、４℃で再懸濁した。懸濁液は、２１０００ｇで３０分間、４℃で遠心分離した。生物発光反応は、得られた上清７５０μＬを、１％ＤＤＭの３－ヒドロキシヒスピジン溶液２５０μＬ（２５μＭ）に添加することによって活性化した。Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ分光蛍光光度計を用いて生物発光を検出した。得られたスペクトルは、シロヒカリタケ菌糸体生物発光のものと実質的に同一だった（図１）。

【実施例2】

【0125】

さまざまな真菌種のルシフェラーゼのコード配列の単離
ワタゲナラタケ、ナラタケ、オニナラタケ、ヤコウタケ、Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｏｌｅａｒｉｕｓ、およびワサビタケからゲノムＤＮＡを単離し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ技術（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、アメリカ）を用い、製造者の推奨に従って全ゲノム配列決定を行った。配列決定結果を用いて仮定的タンパク質のアミノ酸配列を予測し、実施例１に従って検出したシロヒカリタケのルシフェラーゼの相同体を検索した。相同体は、非特許文献５０に記載されている配列解析のアルゴリズムおよび国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）が提供するソフトウェアを用いて検索した。アミノ酸配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋデータベースにある真菌ゲノム配列決定データで検索した。ＢＬＡＳＴＰ検索プログラムの標準パラメータを検索に用いた。その結果、仮定的タンパク質、すなわち、シロヒカリタケのルシフェラーゼの配列の相同体が、ワタゲナラタケ、ナラタケ、オニナラタケ、ヤコウタケ、Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｏｌｅａｒｉｕｓ、ワサビタケ、およびＭｙｃｅｎａ ｃｉｔｒｉｃｏｌｏｒで検出された。検出されたルシフェラーゼはすべて互いに実質的に同一である。アミノ酸配列の同一性の程度を表１に示す。

【0126】

【表1】

【0127】

ヌクレオチド配列の保存領域のマルチプルアライメントに基づいて、縮重プライマーをコンストラクトした。プライマーの構造はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６～４３に示される。ワタゲナラタケ、ナラタケ、オニナラタケ、ヤコウタケ、Ｍｙｃｅｎａ ｃｉｔｒｉｃｏｌｏｒ、Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｏｌｅａｒｉｕｓ、およびワサビタケの子実体と菌糸体から全ＲＮＡを単離し、実施例１に従ってｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡを、上記プライマーとともにＰＣＲに用いた。１μＬの２０倍増幅ｃＤＮＡ、Ｅｎｃｙｃｌｏポリメラーゼ混合物（Ｅｖｒｏｇｅｎ）、市販の１倍緩衝液、２００μＭ ｄＮＴＰ、および０．５μＭのプライマー１７１１～１７１４のうちの１つ、および０．５μＭのプライマー１７１５～１７１８のうちの１つを含む５０μＬ反応混合物中でＰＣＲを実施した。ＰＴＣ－２００ ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒで、「ブロック」温度制御方法を用いてＰＣＲサイクルを３０回行った（各サイクルは、次の条件下で実施した：９５℃で１０秒間、５５℃で１０秒間、７２℃で１分間）。ＰＣＲ産物はｐＴＡｄｖベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングし、プラスミドＤＮＡを単離し、Ｍ１３ユニバーサルプライマーを用いてＳａｎｇｅｒ法によって配列決定した。すべての例で、試料菌類のｃＤＮＡはルシフェラーゼ配列を示した。

【0128】

ワサビタケｃＤＮＡの増幅により、１４６位でバリンがイソロイシンに単一アミノ酸置換されることを特徴とするルシフェラーゼ配列の２つの多様体が得られた（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５～１８）。

【実施例3】

【0129】

哺乳類細胞におけるルシフェラーゼの発現
実施例１および２に従って得られたルシフェラーゼのコード配列を、哺乳類細胞における発現のために最適化（ヒト化）した。ヒト化核酸は、標準的な技術を用いてオリゴヌクレオチド合成によって得た。ヒト化核酸のヌクレオチドプロファイルはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４～５１に示され、対応するタンパク質のアミノ酸プロファイルはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６に示される野生型タンパク質と同一である。得られた核酸は、ｍＫａｔｅ２－ケラチン融合タンパク質をコードする配列の代わりに、ＮｈｅｌおよびＮｏｔｌ制限部位を用いて、ｐｍＫａｔｅ２－ケラチンベクター（Ｅｖｒｏｇｅｎ、ロシア）にクローニングした。プラスミドＤＮＡを精製し、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、アメリカ）を用いて、製造者の手順書に従って、ＨＥＫ２９３ＮＴ細胞およびＨｅＬａ細胞に形質移入した。形質移入の２４時間後、３－ヒドロキシヒスピジンを６６０μｇ／ｍＬの濃度で培地に添加し、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＣＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて細胞ルミネセンスを検出した。全試料の発光強度は、非トランスフェクト対照細胞から生じるシグナルより１桁大きかった（図２）。

【0130】

ベクターに組み入れられたヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１は、部位特異的変異誘発により、１４６位でバリンがイソロイシンに置換された。得られた配列を含むベクターをＨＥＫ２９３ＮＴ細胞に形質移入した。形質移入の２４時間後、３－ヒドロキシヒスピジンを６６０μｇ／ｍＬの濃度で培地に添加し、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＣＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて細胞ルミネセンスを検出した。この多様体も生物発光反応において３－ヒドロキシヒスピジンを酸化できることが示された。

【実施例4】

【0131】

Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞におけるシロヒカリタケのルシフェラーゼの発現
実施例１に従ってシロヒカリタケのルシフェラーゼをコードするＤＮＡを得た。ルシフェラーゼ遺伝子は、遺伝子特異的な末端プライマーを用いて増幅し、ＢｓｔＢＩ ａｎｄ ＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を用いて、Ｃ末端Ｈｉｓタグをコードする配列とインフレームで、ＧＡＰ－ｐＰｉｃＺＡ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。エレクトロポレーションによって、得られた遺伝子コンストラクトを、低プロテアーゼ活性を特徴とするＰｉｃｈｉａ ｐｉｎｋ株に形質転換した。［非特許文献４９］に記載されている、酢酸リチウムおよびジチオスレイトールを用いる方法に従ってエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションした細胞を、ＹＰＤ培地（２％（ｗ／ｖ）ペプトン、１％（ｗ／ｖ）酵母抽出物、２％（ｗ／ｖ）グルコース、２％（ｗ／ｖ）寒天）、および濃度が１００μｇ／ｍＬのゼオシン抗生物質を入れたペトリ皿に塗布した。

【0132】

ルシフェラーゼを産生するＰｉｃｈｉａ ｐｉｎｋクローンは、コロニーに３－ヒドロキシヒスピジン溶液を噴霧し、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＣＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて生物発光を可視化することによって検出した。最も高いルミネセンス強度を特徴とするクローンを選択した。クローンを単離し、２５０ｍＬのＹＰＤ培地を入れた７５０ｍＬフラスコで７２時間、３０℃で増殖させ、２００ｒｐｍで撹拌した。ルシフェラーゼ発現細胞は、５０００ｇで１５分間、４℃で遠心分離し、ペレットにした。得られたペレットは、１００ｍＬの溶解緩衝液（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１Ｍ ＫＣｌ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＴＣＥＰ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ７．４）で再懸濁し、ＡＰＶ２０００高圧ホモジナイザー（ＳＰＸ）を用いて６００バールで２０回処理した。溶解物は８０００ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。得られた核欠失後上清を１４００００ｇで２時間、４℃で遠心分離した。得られた残渣（ミクロソーム画分）は１０ｍＬの水で再懸濁した。Ｌａｅｍｍｌｉ法に従って変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（クーマシーブルーで染色した１０～２５％ポリアクリルアミドゲル）で試料を分解し、Ｈｉｓタグを認識する抗体複合体およびホースラディッシュペルオキシダーゼを用いたウエスタンブロットに使い、化学ルミネセンスシグナルを検出した（図４）。ウエスタンブロットでは、２８ｋＤａタンパク質の領域においてゲル中で移動するルシフェラーゼの特異的染色が示され、これはシロヒカリタケのルシフェラーゼの予想分子量と大体一致していた。また、ウエスタンブロットから、組み換えルシフェラーゼと１４００００ｇでの遠心分離で得られた残渣との共沈が明らかになった。

【実施例5】

【0133】

ルシフェラーゼの機能的断片を得る
シロヒカリタケのルシフェラーゼの切断型断片をコードするオープンリーディングフレームを、オリゴヌクレオチド合成を用いて得た。Ｎ末端６、９、１２、１５、２１、２５、３１、３３、３５、３７、および４０アミノ酸残基が切断されたルシフェラーゼ断片をコードする核酸を、転写開始点およびＨｉｓタグをコードする核酸に動作可能に融合させ、次いで、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼを用いてｐＥＴ－２３ベクターにクローニングした。このベクターを用いてＢＬ２１－ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＢＬ２１－Ｇｏｌｄ高収量株の誘導体）の大腸菌細胞を形質転換した。細胞を、１％ＮａＣｌ、１％トリプトン、０．５％酵母抽出物、１．５％寒天、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、１００μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、および水を含む培地を入れたペトリ皿に移し、３７℃で一晩インキュベートした。次いで、大腸菌コロニーにルシフェリン溶液を噴霧し、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＣＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、アメリカ）で可視化し、発現ルシフェラーゼ断片の機能性を判定した。Ｎ末端６、９、１２、１５、２１、２５、３１、３３、３５、３７アミノ酸残基が切断されたルシフェラーゼ断片は、ルシフェリン溶液を噴霧すると発光することがわかった。

【0134】

ルシフェラーゼ断片を動作可能に融合させたＮ末端のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２および５３に示される。

【0135】

［非特許文献３０］に記載されるソフトウェアを用いてシロヒカリタケのルシフェラーゼのアミノ酸配列を分析したところ、最初の３９個のアミノ酸が膜貫通領域を有することが示された（図５）。得られたデータに基づいて、膜貫通領域を含む配列の除去は、発光を伴う３－ヒドロキシヒスピジンの酸化を触媒する菌類ルシフェラーゼの能力に影響を及ぼさないことが結論づけられた。

【0136】

［非特許文献３０］で提供されているソフトウェアを用いて、実施例２に従ってクローニングしたワタゲナラタケ、ナラタケ、オニナラタケ、ヤコウタケ、Ｍｙｃｅｎａ ｃｉｔｒｉｃｏｌｏｒ、Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｏｌｅａｒｉｕｓ、およびワサビタケのルシフェラーゼを分析した。いずれの場合も、膜貫通領域を含むＮ末端断片がアミノ酸配列で検出された（図５）。膜貫通領域を含むＮ末端配列を除去後に得られたルシフェラーゼ断片のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～３４に示される。

【0137】

ルシフェラーゼのマルチプルアライメントを図５に示す。タンパク質がＣ末端に長さ８～１１アミノ酸の非保存断片を含むことがわかる。断片は、ルシフェラーゼの機能を失うことなく、除去、または他のＣ末端と置換することもできる。ルシフェラーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示される共通配列を有する高相同性の中心領域を有していることもわかる。

【実施例6】

【0138】

他のルシフェリンを用いたルシフェラーゼの使用
哺乳類細胞における発現に必要な菌類ルシフェラーゼのコード配列を含むプラスミドを、実施例３に従って得て、ＨＥＫ２９３Ｎ細胞の形質移入に用いた。形質移入の２４時間後に、トリプシン－ベルセン溶液（０．０２５％トリプシン）を用いて細胞を皿からはがし、遠心分離によって培地をリン酸生食緩衝液（ｐＨ８．０）と置換し、細胞を再懸濁して、超音波を用いて溶解させ、３－ヒドロキシヒスピジンまたはその類似体の１つ（（Ｅ）－６－（４－ジエチルアミノ）スチリル）－３，４－ジヒドロキシ－２Ｈ－ピラン－２－オン、（Ｅ）－３，４－ジヒドロキシ－６－（４－ヒドロキシスチリル）－２Ｈ－ピラン－２－オン、（Ｅ）－６－（２－１Ｈ－インドール－３－イル）ビニル）－３，４－ジヒドロキシ－２Ｈ－ピラン－２－オン、（Ｅ）－６－（２－（１，２，３，５，６，７－ヘキサヒドロピリド［３，２，１－ｉｊ］キノリン－９－イル）ビニル）－３，４－ジヒドロキシ－２Ｈ－ピラン－２－オン、および（Ｅ）－３，４－ジヒドロキシ－６－（２－（６－ヒドロキシナフタレン－２－イル）ビニル）－２Ｈ－ピラン－２－オン）を６６０μｇ／ｍＬの濃度で培地に添加した。

【0139】

Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ分光蛍光光度計を用いて、生物発光スペクトルを検出した。すべての試料が、試験したすべてのルシフェリンを伴って発光した。使用したルシフェリンに応じて、以下のようにルミネセンス最適置換が観察された。（Ｅ）－３，４－ジヒドロキシ－６－（２－（６－ヒドロキシナフタレン－２－イル）ビニル）－２Ｈ－ピラン－２－オンの酸化の際に、５８０ｎｍ超の波長を有する光子の著しい放出を伴う長波長領域へのシフトが観察され、（Ｅ）－６－（２－１Ｈ－インドール－３－イル）ビニル）－３，４－ジヒドロキシ－２Ｈ－ピラン－２－オンの酸化の際に、短波長領域へのシフトが観察される。

【実施例7】

【0140】

組み換えルシフェラーゼを得る
配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２を、ルシフェラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３）の機能的断片をコードする核酸の５’末端に動作可能に連結し、得られたコンストラクトを、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼを用いてｐＥＴ－２３ベクターにクローニングした。このベクターを用いてＢＬ２１－ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＢＬ２１－Ｇｏｌｄ高収量株の誘導体）の大腸菌細胞を形質転換した。１．５％寒天、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、および１００μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地を入れたペトリ皿に細胞を置き、３７℃で一晩インキュベートした。次いで大腸菌コロニーを、アンピシリンおよびクロラムフェニコールを補充した４ｍＬの液体ＬＢ培地に移植し、揺り動かしながら３７℃で一晩インキュベートした。１ｍＬの一晩培養物を、アンピシリンおよびクロラムフェニコールを予備添加した１００ｍＬのＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ培地（Ｎｏｖａｇｅｎ）に移植した。培養物は、６００ｎｍで最適な光学濃度０．６ＯＤに達するまで、３７℃で２．５時間増殖させ、次いで室温で１６時間増殖させた。次いで、細胞をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ５８１０Ｒ遠心分離機で４５００ｒｐｍ、２０分間遠心分離してペレットにし、３５ｍＬの緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で再懸濁し、超音波処理した。細胞ライセートを７５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、残渣を抽出し、さらに上清を３５０００ｒｐｍで１時間遠心分離して、可溶性画分からミクロソーム画分を分離した。残渣は、尿素（８Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）を含む１０ｍＬの緩衝液中で、室温で一晩溶解させた。

【0141】

予想した組み換え産物の存在を電気泳動で検証した。シロヒカリタケのルシフェラーゼの断片に対するそうした解析の一例を図６に示す。シロヒカリタケのルシフェラーゼの予想分子量におおよそ相当する２８ｋＤａ領域のバンドが観察できる。単離した組み換えタンパク質のアリコートを、ポリアクリルアミドゲルに添加して電気泳動した。また、これを用いて組み換えタンパク質の機能性と安定性を検証した。単離した組み換えタンパク質は３－ヒドロキシヒスピジンを添加すると発光し、発光最大値は５２０～５３５ｎｍ領域で、発光強度はシロヒカリタケのルシフェラーゼの機能的断片が最大、Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｏｌｅａｒｉｕｓが最小であった。組み換えタンパク質は緩衝液（ｐＨ７～９）中で活性化し、ｐＨ７．３～８で生物発光の最大強度を示した。生物発光強度の溶液ｐＨ依存性を示す図表の一例を図７に示す。

【0142】

温度安定性を分析するために、ルシフェラーゼをさまざまな温度で１０分間、ｐＨ７．４でインキュベートした。インキュベーションの最後に３－ヒドロキシヒスピジンをタンパク質に添加し、上記のように生物発光強度を分析した。ルシフェラーゼは、インキュベーション後、５０℃未満の温度で最大活性の１０％超、４０℃未満の温度で活性の３０％超、３８℃未満の温度で７０％超、３４℃以下の温度で活性の１００％の活性を保持した。

【実施例8】

【0143】

シロヒカリタケのルシフェラーゼを細胞標識に用いる
実施例３に従って得られたサイトメガロウイルスプロモーターの制御下にあるシロヒカリタケのルシフェラーゼを含むベクターを、赤色蛍光タンパク質をコードするｐＴｕｒｂｏＦＰ６３５－Ｎベクター（Ｅｖｒｏｇｅｎ、ロシア）と一緒に、ＨＥＫ２９３ＮＴ系細胞に同時形質移入した。形質移入は、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ形質移入試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、製造者が推奨する手順に従って行った。形質移入の２４時間後に、３－ヒドロキシヒスピジンを最終濃度６６０μｇ／ｍＬ以下で培地に添加し、Ｌｅｉｃａ ＤＭ６０００顕微鏡を２０倍対物レンズで用いて、細胞ルミネセンスを分析した。細胞は透過光において、緑色チャネルと赤色チャネルで可視化し、蛍光を検出した（図６）。ヒト細胞におけるシロヒカリタケのルシフェラーゼの発現により、スペクトルの緑色領域で別個の光シグナルが生じた。細胞に対するルシフェラーゼ発現の毒性の徴候は示されなかった。

【実施例9】

【0144】

シロヒカリタケのルシフェラーゼを用いたタンパク質の標識
実施例３に従って得られたシロヒカリタケのルシフェラーゼをコードするヒト化核酸を、細胞質βアクチンおよびヒトフィブリラリンをコードする核酸に動作可能に融合（インフレームでクローニング）させた。得られたコンストラクトを、実施例３に従ってｐｍＫａｔｅ２－ケラチンベクターにクローニングした。形質移入の２４時間後に、３－ヒドロキシヒスピジンを最終濃度６６０μｇ／ｍＬ以下で培地に添加した。記録した生物発光は、対応する細胞タンパク質に特有の細胞内局在パターンと一致した。

【実施例10】

【0145】

シロヒカリタケのルシフェラーゼを用いた小器官の標識
ヒト細胞での発現に最適化され、実施例３に従って得られたシロヒカリタケのルシフェラーゼの配列の多様体を、以下の細胞内局在化シグナルにインフレームで動作可能に融合させた：ヒトチトクロームオキシダーゼのサブユニット７のミトコンドリア標的シグナル（ＭＴＳ）；ヒトβ１－４ガラクトシルトランスフェラーゼのＮ末端８１アミノ酸によってコードされたシグナル［非特許文献５１］；ペルオキシソーム標的シグナル［非特許文献５２～５４］；ＳＶ４０ Ｔ抗原の核局在化シグナル（ＮＬＳ）のコピー３つ［非特許文献５７、５８］。シロヒカリタケのルシフェラーゼを有するキメラコンストラクトを発現するプラスミドを有するＨｅＬａ Ｋｙｏｔｏ細胞を形質移入することで、細胞内でキメラタンパク質を対応小器官に効果的に移植できた。形質移入の２４時間後に、３－ヒドロキシヒスピジンを最終濃度６６０μｇ／ｍＬで培地に添加し、生物発光を検出した。

【実施例11】

【0146】

生物全体における細胞の標識
サイトメガロウイルスプロモーターの制御下にあるシロヒカリタケのルシフェラーゼのコード配列を含むベクターを実施例３に従って得た。さらに、キタアメリカホタルのルシフェラーゼをコードするヒト化ヌクレオチド配列を合成し、同じベクターにクローニングした。

【0147】

得られたコンストラクトを用いて、ＣＴ２６細胞（ハツカネズミがん細胞）を形質移入した。シロヒカリタケのルシフェラーゼを発現する細胞を、マウスの背中の左側に皮下注射し、キタアメリカホタルのルシフェラーゼを発現する細胞を、マウスの背中の右側に同じように注射した。注射の１０分後、菌類ルシフェリン（０．５ｍｇ）およびキタアメリカホタルルシフェリン（０．５ｍｇ）の混合物を腹腔内に注射した。次いで、マウスの生物発光を、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＣＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて視覚化した。シロヒカリタケのルシフェラーゼを発現する腫瘍は２０００００００ｃｕの発光強度を示し、キタアメリカホタルのルシフェラーゼを発現する腫瘍は２１００００００ｃｕの発光強度を示した（図９）。

【0148】

シロヒカリタケのルシフェラーゼのｍＲＮＡは、ＳＰ６ ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ、アメリカ）のＳＰ６ポリメラーゼを用いて、ルシフェラーゼ遺伝子を含む、Ａｃｃ６５Ｉで線状化したｐＣＳ２＋ベクターのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって得た。さらに、ｍＲＮＡをＣｌｅａｎＲＮＡ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｋｉｔ（Ｅｖｒｏｇｅｎ）で精製し、アフリカツメガエル２細胞胚の割球の両方に、各割球につき５００ｐｇのｍＲＮＡを注射した。視覚化のために、６６０μｇ／ｍＬのルシフェリン溶液を初期原腸胚期（１０．５期）の胚の胞胚腔に注射した。ローダミン染色後の胚ルミネセンスを、神経胚形成時（１６～１７期）にＬｅｉｃａ ＤＭ６０００顕微鏡を５倍対物レンズで用いて、顕微鏡の緑色および赤色蛍光検出チャネルで検出した（図１０）。生物発光信号は胚の神経組織で検出された。

【実施例12】

【0149】

ポリクローナル抗体の調製
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示される膜貫通領域が欠如したシロヒカリタケのルシフェラーゼのコード配列を、合成によって二重鎖ＤＮＡとして得て、ｐＱＥ－３０発現ベクター（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）にクローニングし、得られる組み換えタンパク質のＮ末端にＨｉｓタグが付加されるようにした。大腸菌での発現後、組み換えタンパク質を変性条件下で金属親和性ＴＡＬＯＮ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて精製した。フロイントアジュバントで乳化した精製タンパク質製剤を、１ヵ月おきにウサギの免疫化に用いた。免疫化の１０日後または１１日後にウサギの血液を採取した。得られたポリクローナル抗血清の活性を、ＥＬＩＳＡ法およびウエスタン免疫ブロット法を用いて組み換えタンパク質によって示した。

【実施例13】

【0150】

トランスジェニック植物を得る
シロヒカリタケのルシフェラーゼのコード配列は、ニセツリガネゴケ細胞（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）などでの発現に最適化した。次いで、イネのａｋｔＩ遺伝子のプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスの５’－非翻訳領域、ルシフェラーゼのコード配列、終止コドン、およびアグロバクテリウムツメファシエンスＯＳＣ遺伝子のターミネーター配列を含む転写ユニットをｉｎ ｓｉｌｉｃｏで作製した。得られた配列を合成し、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ［非特許文献５７］法を用いて、高度に発現されたコケ遺伝子（Ｐｐ３ｃ１６＿６４４０Ｖ３．１およびＰｐ３ｃ１６＿６４６０Ｖ３．１）の配列間のニセツリガネゴケのゲノムＤＮＡの遺伝子座と一致するＤＮＡ断片間でｐＬａｎｄ＃１発現ベクターにクローニングした。ｐＬａｎｄ＃１ベクターは、同じＤＮＡ遺伝子座領域に相補的なＣａｓ９ヌクレアーゼのガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の配列も有する。

【0151】

プラスミドＤＮＡ調整品は、［非特許文献５８］に記載されるポリエチレングリコール形質転換手順に従って、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列を含む発現ベクターと一緒にヒメツリガネゴケプロトプラストに同時形質転換した。次いで、プロトプラストを５０ｒｐｍで振とうしながら暗所で２日間、ＢＣＤ培地でインキュベートし、細胞壁を再生させた。次いで、プロトプラストを寒天とＢＣＤ培地を含むペトリ皿に移し、１６時間照明下で１週間増殖させた。形質転換させたコケのコロニーをＰＣＲで外部のゲノムプライマーからスクリーニングしてゲノムへの遺伝子コンストラクトの組み込みを評価し、新しいペトリ皿に移して同じ照明条件下で３０日間増殖させた。

【0152】

得られたコケ配偶体を、濃度６６０μｇ／ｍＬの３－ヒドロキシヒスピジンを含むＢＣＤ培地に浸漬し、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で分析した。トランスジェニック植物試料はすべて、３－ヒドロキシヒスピジンを含む同じ溶液にインキュベートした野生型対照植物のシグナル強度よりも少なくとも２桁大きな強度で生物発光を示した。

【実施例14】

【0153】

トランスジェニック動物を得る
シロヒカリタケのルシフェラーゼの遺伝子を含むトランスジェニック魚（ゼブラフィッシュ［Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ］）を、［非特許文献５９］に記載される方法に従って作製した。トランスジェニック動物を作製するために、Ｔ７バクテリオファージポリメラーゼプロモーターの制御下でガイドＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼのｍＲＮＡの配列を有するＤＮＡ断片を合成した。得られた断片を使って、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ Ｔ７キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、アメリカ）の試薬を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行い、合成したＲＮＡは、ＲＮＡ単離キット（Ｅｖｒｏｇｅｎ、ロシア）を用いて精製した。シロヒカリタケのルシフェラーゼの遺伝子を含む、ｋｒｔｔ１ｃ１９ｅゼブラフィッシュ遺伝子の５０個のヌクレオチド配列が隣接するドナーベクター配列も合成により得た。ドナーベクター、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡは、注射緩衝液（４０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、０．５％フェノールレッドを添加した２４０ ｍＭ ＫＣｌ）に溶解し、約１～２ｎＬの量をゼブラフィッシュ胚の１－２細胞に注射した。７０個の胚のうち約５０個が注射後に生き残り、受精４日後に通常の発達を示した。

【0154】

生物発光信号を記録するために、［非特許文献６０］に記載されている手順に従って、３－ヒドロキシヒスピジン溶液をゼブラフィッシュの幼生に静脈注射した。生物発光はＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて記録した。測定後、ゲノムＤＮＡを幼生から単離し、ゲノムへのルシフェラーゼ遺伝子の組み込みを検証した。シロヒカリタケのルシフェラーゼの遺伝子が正確にゲノムに組み込まれた幼生はすべて、３－ヒドロキシヒスピジン溶液注射後の野生型魚のシグナル強度よりも少なくとも１桁大きな強度で生物発光を示した。

【0155】

本明細書に記載するすべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が参照により援用されることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に援用される。各刊行物の引用は、例示として提供されるものであり、本発明を理解するのに有用であり得る。具体的または黙示的に参照される任意の刊行物が先行技術であることを認めるものではない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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