7299339 ＧＤＰ－フコースの調製のための酵素法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-06-19

(45)【発行日】2023-06-27

(54)【発明の名称】ＧＤＰ－フコースの調製のための酵素法

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/32 20060101AFI20230620BHJP

   C12N 9/12 20060101ALN20230620BHJP

   C12N 9/10 20060101ALN20230620BHJP

   C12N 9/02 20060101ALN20230620BHJP

   C12N 9/00 20060101ALN20230620BHJP

   C12N 15/53 20060101ALN20230620BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20230620BHJP

   C12N 15/52 20060101ALN20230620BHJP

   C12N 11/14 20060101ALN20230620BHJP

【ＦＩ】

C12P19/32 Z ZNA

C12N9/12

C12N9/10

C12N9/02

C12N9/00

C12N15/53

C12N15/54

C12N15/52 Z

C12N11/14

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2021558743

(86)(22)【出願日】2020-03-31

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-06-16

(86)【国際出願番号】 EP2020059182

(87)【国際公開番号】W WO2020201315

(87)【国際公開日】2020-10-08

【審査請求日】2023-03-30

(31)【優先権主張番号】19166549.6

(32)【優先日】2019-04-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】501497655

【氏名又は名称】マックス プランク ゲゼルシャフト ツゥアー フェデルゥン デル ヴィッセンシャフテン エー フォー

(74)【代理人】

【識別番号】110000578

【氏名又は名称】名古屋国際弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】マホウア レザ

(72)【発明者】

【氏名】レクサー トーマス エフ．テー．

【審査官】千葉 直紀

(56)【参考文献】

【文献】韓国公開特許第１０－２０１０－００８８７５０（ＫＲ，Ａ）

【文献】特開２００１－１１２４８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００２－０００２８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表平７－５００２４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第９６／３７６０３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開平１０－２０１４８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】Biotechnology and Bioengineering，2018年，Vol. 115，pp. 192-205

【文献】Journal of Biotechnology，2017年，Vol. 264，pp. 1-7

【文献】ChemCatChem，2021年，Vol. 13，pp. 1981-1989

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｐ、Ｃ１２Ｎ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法であって、次のステップ：

【化1】

Ａ）
（ｉ）次の式

【化2】

によって表されるグアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、およびＤ－マンノースの場合ＮＡＤＰＨを含む溶液を提供すること、および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること、
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、ＮＡＤＰＨ、および共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む、方法。

【請求項2】

前記溶液は、
グアノシンおよびＬ－フコース、および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼの酵素セット、
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記溶液は、
グアノシンおよびＤ－マンノース、および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、および（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ、およびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼ、およびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれかを含む酵素セット、
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記酵素セットは、ピロホスファターゼをさらに含む、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記酵素セットは、固体支持体に共固定化される、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記酵素セットは、細胞溶解物から固体支持体に共固定化される、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

ステップＡ）において提供される前記溶液中のグアノシンおよびＬ－フコースの濃度、またはグアノシンおよびＤ－マンノースの濃度は、０．２ｍＭ～５，０００ｍＭの範囲である、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースは、単一の反応混合物において生成される、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記共溶媒の量は、ステップＡ）において提供される前記溶液の総体積に基づいて０．０１ｖｏｌ％～３０ｖｏｌ％である、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記共溶媒は、ジメチルスルホキシドである、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記方法は、次のステップ
フコシルトランスフェラーゼの存在下および受容体の非存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースからＬ－フコースを生成すること、または
グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを８０～１００℃の範囲の温度で加熱することによりＬ－フコースを生成すること
をさらに含む、請求項１および請求項３から請求項１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

Ｃ）グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを単離すること
のステップをさらに含む、請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

Ｄ）フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコース、および糖、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子から、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースと、前記糖、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子における利用可能なヒドロキシル基との間で、Ｏ－グリコシド結合を形成することにより、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチドまたは小分子を生成すること
のステップをさらに含む、請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記酵素セットは、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼ、およびグルタメートデヒドロゲナーゼのいずれか１つをさらに含む、請求項１および請求項３から請求項１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記酵素セットは、グアニレートキナーゼをさらに含む、請求項１４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

［発明の分野］
本発明は、単一の反応混合物において低コストの基質であるグアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからＧＤＰ－フコースを生成するための酵素触媒工程に関する。前記工程は、連続的でも、またはフェッドバッチ様式で、半連続的に操作されることができる。さらに、前記工程は、例えば、母乳オリゴ糖、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質または糖ペプチドなどのグリカンを含むフコシル化分子および生体分子を生成するために適合させることができる。

【0002】

［発明の背景］
グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコース（ＧＤＰ－フコースまたはＧＤＰ－Ｆｕｃ）は、多くの生物工学的応用および食品技術の重要な基質である。グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコース（ＧＤＰ－フコースまたはＧＤＰ－Ｆｕｃ）は、自己免疫疾患を治療するために使用される抗炎症抗体のコアフコシル化のための基質である。さらに、ＧＤＰ－フコースは、炭水化物ワクチンの生産、および個別化医療の成長分野において、すなわち薬物送達のためのグリコナノ材料の調製に必要である。乳幼児の食物（母乳）において、糖の大部分がフコシル化オリゴサッカリドであるので、乳幼児のために合成的に生産された乳製品にフコシル化糖を含むことが高く求められている。

【0003】

しかしながら、ＧＤＰ－フコースの高い需要にもかかわらず（１年当たりトンのオーダー）、研究者でさえ、ＧＤＰ－フコースの入手可能性は非常に限られている。今まで、低エンドトキシンＧＤＰ－フコースの価格は１グラムあたり３，０００ユーロを超える。ＧＤＰ－フコースの高い価格のため、基礎および応用研究活動が妨げられるだけでなく、工業的応用も妨げられる。

【0004】

ＧＤＰ－フコースを合成するためのバイオプロセス工学戦略は、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）工程およびインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）工程に分類されることができ、微生物は、代謝の一部として細胞内または細胞外のいずれかでＧＤＰ－フコースを生成するために代謝的に操作される。しかしながら、低収量、高レベルの不必要な副産物、細胞株の設計のために必要な時間、および複雑なスケールアップは欠点である。特に乳幼児食の規制面を考慮すると、遺伝子組み換え生物（ＧＭＯ）の適用は、承認工程を大幅に遅らせることができる。

【0005】

ＧＤＰ－フコースは、生体触媒的（酵素的）工程を使用することによってインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で生成することもできる（ＡＰＭＩＳ ２００６，１１４，５３９－５４８を参照）。例えば、二機能性酵素Ｌ－フコースピロホスホリラーゼ（ＦＫＰ）を使用してＬ－フコースおよびグアノシントリホスフェートからのＧＤＰ－フコースの酵素的合成は、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．によって報告される。（Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１０５（４）：６３６－６４６）。Ｗｉｔｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９７，６２，２１４４－２１４７）は、ホスホアミダイト化学を使用して、フコース－１－ホスフェートおよびグアノシン５’－モノホスホモルホリデートからのＧＤＰ－フコースの合成を記述する。Ｔｏｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６，２７１（４４），２７２７４－２７２７９）は、ホモ二量体のＮＡＤＰ（Ｈ）－結合タンパク質ＦＸについて、ホモ二量体のＮＡＤＰ（Ｈ）－結合タンパク質ＦＸは、複合エピメラーゼおよびＮＡＤＰＨ依存性還元酵素活性を明らかに触媒し、したがってＧＤＰ－４－ケト－６－Ｄ－デオキシマンノースをＧＤＰ－Ｌ－フコースへ変換することを報告する。Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８，２７３（１４），８１９３－８２０２）は、組み換えヒトＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＦＸタンパク質を使用してＧＤＰ－マンノースからのＧＤＰ－フコースのインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）調製を説明する。Ｌａｕ ｅｔ ａｌは、ＧＤＰ－Ｄ－マンノースからのＧＤＰ－Ｌ－フコースの生合成について報告し、合成に関与する酵素ＧＤＰ－フコースシンターゼを調査した。酵素は、ＧＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－Ｄ－マンノースをＧＤＰ－Ｌ－フコースに変換する（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，１７５９３－１７６０２）。Ｒｅｘｅｒ ｅｔ ａｌ．は、大腸菌で発現されたグルコキナーゼ（Ｇｌｋ）、ホスホマンノムターゼ（ＭａｎＢ）、マンノース－１－ホスフェート－グアニリルトランスフェラーゼ（ＭａｎＣ）、無機ピロホスファターゼ（ＰｍＰｐＡ）、および１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１Ｄ－Ｐｐｋ２）の多酵素カスケードによってマンノースからのＧＤＰ－マンノースのワンポット合成を報告する。（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２０１８，１１５，１９２－２０５）。低コストおよび容易に入手できる基質から出発して、費用効率の高い方法でＧＤＰ－フコースを生産する方法が長い間必要とされている。

【0006】

したがって、本発明の目的は、ＧＤＰ－フコースを調製するための費用効率の高い、効率的な方法を提供することである。
本発明の目的は、独立請求項の教示によって解決される。本発明のさらに有利な特徴、態様および詳細は、本出願の従属請求項、明細書、図、および例から明らかである。

【0007】

［発明の説明］
生化学において、ヌクレオチド糖は、単糖の活性型としてよく知られており、グリコシル化反応において、ヌクレオチド糖はグリコシル供与体として作用することが知られている。グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）は、活性化されたヌクレオチド糖から求核性グリコシル受容体分子へのサッカリド部分の転移を触媒する酵素である。したがって、生化学において、グリコシル化反応はグリコシルトランスフェラーゼによって触媒される。

【0008】

グリコシル供与体として作用するために、それぞれの単糖は、例えばヌクレオチド糖、特にウリジンジホスフェート、グアノシンジホスフェートまたはシトシンジホスフェートなどに由来するヌクレオチドジホスホ糖の形態のように、非常にエネルギーの高い形態で存在することが不可欠である。よく知られているヌクレオチド糖の例は、ＵＤＰ－グルコース、ＵＤＰ－ガラクトース、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ－ＧａｌＮａｃ、ＵＤＰ－キシロース、ＵＤＰ－グルクロン酸、ＧＤＰ－マンノースおよびＧＤＰ－フコースである。単純な単糖の活性化ヌクレオチド糖への変換は、ヌクレオシドトリホスフェート（ＮＴＰ）とグリコシル一リンモノホスフェートとの酵素触媒反応によって達成されることができることはよく知られており、ここで、グリコシルモノホスフェートは、アノマー炭素にホスフェート基を含む。

【0009】

ヌクレオシドジホスホ（ＮＤＰ）－単糖を得るために、使用される単糖は、グリコシルモノホスフェート誘導体に変換される必要がある。一般に、前記反応は、所望の単糖１－ホスフェートを得るために、ホスホトランスフェラーゼ、および更に必要な場合にホスホムターゼのような特異的酵素を適用することによって達成されることができる。ホスホトランスフェラーゼは、リン酸化反応を触媒するＥＣ番号２．７に分類される酵素である。ホスホトランスフェラーゼは、それらの受容体分子に従ってさらに分類される。例えば、ＥＣ ２．７．１に基づくホスホトランスフェラーゼは、受容体としてアルコール基を有するホスホトランスフェラーゼである。ホスホムターゼは、イソメラーゼ、すなわちホスフェート基の内部転移を触媒することができる酵素である。ホスホムターゼは、ホスホトランスフェラーゼを介した基質のリン酸化の場合に必要とされ、Ｄ－マンノースまたはＤ－グルコースの場合に、例えばそれぞれマンノース－６－ホスフェートまたはグルコース－６－ホスフェートになるように、単糖６－ホスフェートをもたらす。それぞれのホスホムターゼは、その後、ホスフェート基の内部移動を触媒し、その結果、マンノース－６－ホスフェートの、それぞれ、マンノース－１－ホスフェート、またはグルコース－６－ホスフェートへの変換をもたらす。

【0010】

キナーゼは、ホスホトランスフェラーゼファミリーの一部を形成する酵素である。キナーゼは、高エネルギーのホスフェート供与分子から特定の基質へのホスフェート基の転移を触媒する酵素である。この工程は、リン酸化として知られており、ここで、基質はホスフェート基を獲得し、高エネルギーのアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）分子はホスフェート基を供与する。このエステル交換は、リン酸化された基質およびＡＤＰを生成する。したがって、単糖１－ホスフェートを得るためにフコキナーゼまたはＮ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼのような適切なキナーゼを適用して、Ｌ－フコースからのフコース－１－ホスフェート、またはＤ－マンノースからのマンノース－１－ホスフェートをそれぞれ得ることも可能である。

【0011】

ヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用すると、ヌクレオシドトリホスフェート（ＮＴＰ）および単糖１－ホスフェートを、それぞれヌクレオシドジホスフェート（ＮＤＰ）－単糖に変換することができる。ヌクレオチジルトランスフェラーゼは、リン含有基のトランスフェラーゼ酵素であり、ＥＣ番号２．７．７に分類される。種々の天然に存在するヌクレオチドについて、ヌクレオチド特異的ヌクレオチジルトランスフェラーゼは当技術分野で知られており、例えば、ウリジルトランスフェラーゼはウリジル基を転移し、アデニルトランスフェラーゼはアデニリル基を転移し、グアニリルトランスフェラーゼはグアニリル基を転移し、シチジルトランスフェラーゼはシチジル基を転移し、チミジリルトランスフェラーゼはチミジリル基を転移する。したがって、ヌクレオチジルトランスフェラーゼは、単糖１－ホスフェートとヌクレオシドトリホスフェートとの反応、例えば、ＧＤＰ－フコースを得るためにフコース－１－ホスフェートとグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）との反応、またはＧＤＰ－マンノースを得るためにマンノース－１－ホスフェートとグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）との反応、を触媒するのに適している。ＧＤＰ－フコースおよびＧＤＰ－マンノースの場合、グアニリルトランスフェラーゼは、グアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）との反応を触媒するのに適している。

【0012】

天然に存在するＧＤＰ－単糖に関連するグアノシンジホスフェート（ＧＤＰ）－単糖は、ＧＤＰ－マンノースおよびＧＤＰ－フコースである。ＧＤＰ－単糖を得るための上述の一般的な反応スキームを、グアノシントリホスフェート、並びにＧＤＰ－マンノースの場合、マンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）、およびＧＤＰ－フコースの場合、フコース－１－ホスフェート（Ｆｕｃ－１－Ｐ）を用いて、所望のＧＤＰ－マンノースまたはＧＤＰ－フコースをそれぞれ得るための反応を触媒する特異的なグアニリルトランスフェラーゼと共に行うことができる。

【0013】

しかしながら、ヌクレオシドジホスフェート（ＮＤＰ）－単糖を得るための酵素触媒反応スキームの１つの欠点は、出発材料、特にそれぞれのヌクレオシドトリホスフェートが非常に高価であるので、ＮＤＰ－単糖、特にＧＤＰ－フコースまたはＧＤＰ－マンノースの合成経路は、コストの大きい合成をもたらすという事実に基づく。ＧＤＰ－フコースについて既に上述されたように、ＧＤＰ－フコースまたはＧＤＰ－マンノースのようなヌクレオシドジホスフェート単糖を調製するために費用効果が高く効率的な方法を当技術分野において提供する必要があり、特に低コストで容易に入手できる出発材料からＧＤＰ－フコースを調製するために費用効果が高く効率的な方法を提供する必要がある。

【0014】

ＧＤＰ－単糖に関して、ＧＤＰ－フコースおよびＧＤＰ－マンノースは哺乳類において天然に存在する活性化されたＧＤＰ－糖に関連する。したがって、グアノシンは適切なヌクレオチドとして特定されており、Ｌ－フコースおよびＤ－マンノースはＧＤＰ－フコースの調製のために適した単糖として特定されている。酵素触媒反応に関して、少なくとも適切な酵素を提供しなければならないことは明らかであるべきである。したがって、本発明者らは、グアノシン、および例えば、Ｌ－フコースまたはＤ－マンノースなどの容易に入手可能な単糖を、酵素的ワンポットカスケード反応におけるＧＤＰ－フコースの生成のための適切な出発物質として特定している。

【0015】

グアノシンおよびＬ－フコース、またはグアノシンおよびＤ－マンノースから出発してＧＤＰ－フコースの生体触媒的生成工程は、これまで確立されていなかった。

【0016】

ＧＤＰ－フコースを調製するための費用効果が高く効率的な方法を提供するために、グアノシンおよびＬ－フコースは、図１に示されるように、酵素的カスケード反応でＧＤＰ－フコースを生成するための適切な出発物質として特定され、図１は、（ａ）Ｌ－フコースおよびアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ；触媒量）からのフコース－１－ホスフェート（Ｆｕｃ－１－Ｐ）の形成、（ｂ）グアノシンおよびポリホスフェートからのグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）の形成、および（ｃ）フコース－１－ホスフェートとグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）とを反応させてＧＤＰ－フコースにする反応、からなる。ＧＤＰ－フコースは、Ｌ－フコースおよびグアノシンから、グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼの存在下で、適切な緩衝液中で生成され得ると想定された（図２）。

【0017】

さらに、グアノシンおよびＤ－マンノースは、図３に示されるように、酵素的カスケード反応でＧＤＰ－フコースを生成するための適切な出発物質として特定され、図３は、（ａ）Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）からのマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）の形成、（ｂ）グアノシンおよびポリホスフェートからのグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）の形成、および（ｃ）マンノース－１－ホスフェートとグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）とを反応させてＧＤＰ－マンノースにする反応、および（ｄ）ＧＤＰ－マンノースのＧＤＰ－フコースへの変換、からなる。ＧＤＰ－フコースは、Ｄ－マンノースおよびグアノシンから、グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、並びにグルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース、４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ、またはＮ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ、のいずれかの存在下で、適切な緩衝液中で、生成され得ると想定された。

【0018】

しかしながら、Ｌ－フコースおよびグアノシンから、またはＤ－マンノースおよびグアノシンから、酵素的カスケード反応においてＧＤＰ－フコースを生成する試みは成功せず、ＧＤＰ－フコースの形成は観察されなかった（実施例３）。

【0019】

驚くべきことに、本発明者らは、ジメチルスルホキシドなどの共溶媒中でグアノシンを可溶化することにより、グアノシンとおよびＬ－フコースからのＧＤＰ－フコースへのほぼ完全な変換が、すでに３時間後に達成されることを見出したた（実施例２）。さらに、共溶媒は、ＧＤＰ－フコースの調製に使用される酵素の活性に影響を与えなかった。力価は、共溶媒を使用することによって達成される基質の溶解度を超える。さらに、本発明者らは、ジメチルスルホキシドなどの共溶媒中にグアノシンを可溶化することにより、グアノシンおよびＤ－マンノースからＧＤＰ－フコースへのほぼ完全な変換が達成されることを明らかにしている。さらに、共溶媒は、グアノシンおよびＤ－マンノースからのＧＤＰ－フコースの調製において使用される酵素の活性に影響を与えなかった。

【0020】

例えば、本発明の方法は、本明細書に記述されているように、高価なグアノシントリホスフェート出発材料を避けることができ、より単純なヌクレオシドグアノシンに置き換えることができ、そのことはＧＤＰ－フコースを調製するために費用効果が高く効率的な方法をもたらすので、ＬフコースおよびグアノシントリホスフェートからのＧＤＰ－フコースの酵素的合成について当技術分野で知られている上述の方法よりも有益である。

【0021】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：

【0022】

【化1】

Ａ）
（ｉ）次の式

【0023】

【化2】

によって表されるグアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒を含む、
溶液を提供すること；および

【0024】

グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0025】

本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：

【0026】

【化3】

Ａ）
（ｉ）次の式

【0027】

【化4】

によって表されるグアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、およびＤ－マンノースの場合、ＮＡＤＰＨを含む、
溶液を提供すること；および

【0028】

グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、ＮＡＤＰＨおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0029】

好ましい実施形態において、本発明は、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：

【0030】

【化5】

Ａ）
（ｉ）次の式

【0031】

【化6】

によって表されるグアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む、
溶液を提供すること；および

【0032】

（ａ）グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびグルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0033】

好ましい実施形態において、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：

【0034】

【化7】

Ａ）
（ｉ）次の式

【0035】

【化8】

によって表されるグアノシンおよびＬ－フコースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒を含む、
溶液を提供すること；および

【0036】

グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0037】

代替的に表現すると、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒を含む、
溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、および共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0038】

代替的に表現すると、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコース；
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒；
を含む溶液を提供すること；および
次のグアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素を提供すること；
Ｂ）酵素、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0039】

さらに、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコース；
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒；
を含む溶液を提供すること；および
次のグアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素を提供すること；
Ｂ）酵素、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含み、
ここで、グアノシンのグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースへの変換は、３時間後に少なくとも７８％である。

【0040】

本発明に係るグアノシンおよびＬ－フコースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを調製するステップＢ）は
（ａ）Ｌ－フコースおよびアデノシントリホスフェートから、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼによって触媒されてフコース－１－ホスフェート（Ｆｕｃ－１－Ｐ）を形成すること、
（ｂ）グアノシン、アデノシントリホスフェート、およびポリホスフェートから、グアノシンキナーゼおよびポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）を形成すること；および
（ｃ）Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼの存在下で、フコース－１－ホスフェートをグアノシントリホスフェートと反応させてＧＤＰ－フコースにすること、
を含む。

【0041】

明らかに、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）は、同時にまたは連続して実行され得る。さらに、それらの順序を（ｂ） →（ａ）→（ｃ）に戻してもよい。

【0042】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコース；
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒；
を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）
（ａ）Ｌ－フコースおよびアデノシントリホスフェートから、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼによって触媒されてフコース－１－ホスフェートを形成すること、
（ｂ）グアノシン、アデノシントリホスフェート、およびポリホスフェートから、グアノシンキナーゼおよびポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシントリホスフェートを形成すること；および
（ｃ）Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼの存在下で、フコース－１－ホスフェートをグアノシントリホスフェートと反応させてＧＤＰ－フコースにすること、
によって酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0043】

より具体的には、本発明に係るグアノシンおよびフコースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを調製するステップＢ）は、
（ａ）Ｌ－フコースおよびアデノシントリホスフェートから、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼによって触媒されてフコース－１－ホスフェート（Ｆｕｃ－１－Ｐ）を形成すること、
（ｂ１）グアノシン、およびアデノシントリホスフェートから、グアノシンキナーゼによって触媒されてグアノシンモノホスフェート（ＧＭＰ）を形成すること；
（ｂ２）グアノシンモノホスフェートおよびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）を形成すること；および
（ｃ）Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼの存在下で、フコース－１－ホスフェートをグアノシントリホスフェートと反応させてＧＤＰ－フコースにすること、
を含む。

【0044】

明らかに、ステップ（ａ）は、ステップ（ｂ１）または（ｂ２）の前に、同時に、後に実行され得る。したがって、ステップの順序を（ｂ１） →（ｂ２）→（ａ）→（ｃ）に戻してもよい。

【0045】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコース；
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒；
を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）
（ａ）Ｌ－フコースおよびアデノシントリホスフェートから、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼによって触媒されてフコース－１－ホスフェートを形成すること、
（ｂ１）グアノシン、およびアデノシントリホスフェートから、グアノシンキナーゼによって触媒されてグアノシンモノホスフェートを形成すること；
（ｂ２）グアノシンモノホスフェートおよびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシントリホスフェートを形成すること；および
（ｃ）Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼの存在下で、フコース－１－ホスフェートをグアノシントリホスフェートと反応させてＧＤＰ－フコースにすること、
によって酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0046】

さらにより具体的には、本発明に係るグアノシンおよびフコースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを調製するステップＢ）は、
（ａ）Ｌ－フコースおよびアデノシントリホスフェートから、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼによって触媒されてフコース－１－ホスフェート（Ｆｕｃ－１－Ｐ）を形成すること、
（ｂ１）グアノシン、およびアデノシントリホスフェートから、グアノシンキナーゼによって触媒されてグアノシンモノホスフェート（ＧＭＰ）を形成すること；
（ｂ２’）グアノシンモノホスフェートおよびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシンジホスフェート（ＧＤＰ）を形成すること；
（ｂ２’’）グアノシンジホスフェートおよびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）を形成すること；および
（ｃ）Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼの存在下で、フコース－１－ホスフェートをグアノシントリホスフェートと反応させてＧＤＰ－フコースにすること、
を含む。

【0047】

明らかに、ステップ（ａ）は、ステップ（ｂ１）、（ｂ２’）および（ｂ２’’）の前に、同時に、後に実行され得る。したがって、ステップの順序を（ｂ１） →（ｂ２’）→（ｂ２’’）→（ａ）→（ｃ）に戻してもよい。

【0048】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコース；
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒；
を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）
（ａ）Ｌ－フコースおよびアデノシントリホスフェートから、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼによって触媒されてフコース－１－ホスフェートを形成すること、
（ｂ１）グアノシン、およびアデノシントリホスフェートから、グアノシンキナーゼによって触媒されてグアノシンモノホスフェートを形成すること；
（ｂ２’）グアノシンモノホスフェートおよびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシンジホスフェートを形成すること；
（ｂ２’’）グアノシンジホスフェートおよびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシントリホスフェートを形成すること；および
（ｃ）Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼの存在下で、フコース－１－ホスフェートをグアノシントリホスフェートと反応させてＧＤＰ－フコースにすること、
によって、酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0049】

本発明に係るグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－α－Ｄ－マンノースを調製するステップＢ）は、
（ａ）Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること、
または
Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、グルコキナーゼによって触媒されてマンノース－６－ホスフェート（Ｍａｎ－６－Ｐ）を形成すること、およびマンノース－６－ホスフェートから、ホスホマンノムターゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること、
（ｂ）グアノシン、アデノシントリホスフェート、およびポリホスフェートから、グアノシンキナーゼおよびポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）を形成すること；および
（ｃ）Ｄ－マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼの存在下で、マンノース－１－ホスフェートをグアノシントリホスフェートと反応させてＧＤＰ－マンノースにすること、
を含む。

【0050】

本発明に係るグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを調製するステップＢ）は、
（ａ）Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること、
または
Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、グルコキナーゼによって触媒されてマンノース－６－ホスフェート（Ｍａｎ－６－Ｐ）を形成すること、およびマンノース－６－ホスフェートから、ホスホマンノムターゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること、
（ｂ）グアノシン、アデノシントリホスフェート、およびポリホスフェートから、グアノシンキナーゼおよびポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）を形成すること；および
（ｃ）Ｄ－マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼの存在下で、マンノース－１－ホスフェートをグアノシントリホスフェートと反応させてＧＤＰ－マンノースにすること、
（ｄ）ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼによって触媒されてＧＤＰ－マンノースからＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースを形成すること；および
（ｅ）ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼによって触媒されてＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースおよびＮＡＤＰＨからＧＤＰ－フコースを形成すること、
を含む。

【0051】

明らかに、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）は、同時に、または連続的に実行され得る。さらに、ステップの順序を（ｂ） →（ａ）→（ｃ）に戻してもよい。

【0052】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノース；
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒；
を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼおよび（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリル－トランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか
、を含む酵素セットを提供すること、
Ｂ）
（ａ）Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること、
または
Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、グルコキナーゼによって触媒されてマンノース－６－ホスフェート（Ｍａｎ－６－Ｐ）を形成すること、およびマンノース－６－ホスフェートから、ホスホマンノムターゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること、
（ｂ）グアノシン、アデノシントリホスフェート、およびポリホスフェートから、グアノシンキナーゼおよびポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）を形成すること；および
（ｃ）Ｄ－マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼの存在下で、マンノース－１－ホスフェートをグアノシントリホスフェートと反応させてＧＤＰ－マンノースにすること、
（ｄ）ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼによって触媒されてＧＤＰ－マンノースからＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースを形成すること；および
（ｅ）ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼによって触媒されてＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースおよびＮＡＤＰＨからＧＤＰ－フコースを形成すること、
によって、酵素のセット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0053】

より具体的には、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを調製する本発明に係るステップＢ）は、
（ａ）Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること、
または
Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、グルコキナーゼによって触媒されてマンノース－６－ホスフェート（Ｍａｎ－６－Ｐ）を形成すること、およびマンノース－６－ホスフェートから、ホスホマンノムターゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること、
（ｂ１）グアノシン、およびアデノシントリホスフェートから、グアノシンキナーゼによって触媒されてグアノシンモノホスフェート（ＧＭＰ）を形成すること；
（ｂ２）グアノシンモノホスフェート、およびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）を形成すること
（ｃ）Ｄ－マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼの存在下で、マンノース－１－ホスフェートをグアノシントリホスフェートと反応させてＧＤＰ－マンノースにすること、
（ｄ）ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼによって触媒されてＧＤＰ－マンノースからＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースを形成すること；および
（ｅ）ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼによって触媒されてＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースおよびＮＡＤＰＨからＧＤＰ－フコースを形成すること、
を含む。

【0054】

明らかに、ステップ（ａ）は、ステップ（ｂ１）または（ｂ２）の前に、同時に、または後に実行され得る。したがって、ステップの順序を（ｂ１） →（ｂ２） →（ａ）→（ｃ）に戻してもよい。

【0055】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノース；
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒；
を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼおよび（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリル－トランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか
、を含む酵素セットを提供すること、
Ｂ）
（ａ）Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること、
または
Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、グルコキナーゼによって触媒されてマンノース－６－ホスフェート（Ｍａｎ－６－Ｐ）を形成すること、およびマンノース－６－ホスフェートから、ホスホマンノムターゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること、
（ｂ１）グアノシン、およびアデノシントリホスフェートから、グアノシンキナーゼによって触媒されてグアノシンモノホスフェート（ＧＭＰ）を形成すること；
（ｂ２）グアノシンモノホスフェート、およびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）を形成すること；および
（ｃ）Ｄ－マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼの存在下で、マンノース－１－ホスフェートをグアノシントリホスフェートと反応させてＧＤＰ－マンノースにすること、
（ｄ）ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼによって触媒されてＧＤＰ－マンノースからＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースを形成すること；および
（ｅ）ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼによって触媒されてＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースおよびＮＡＤＰＨからＧＤＰ－フコースを形成すること、
によって、酵素のセット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0056】

更により具体的には、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを調製する本発明に係るステップＢ）は、
（ａ）Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること、
または
Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、グルコキナーゼによって触媒されてマンノース－６－ホスフェート（Ｍａｎ－６－Ｐ）を形成すること、およびマンノース－６－ホスフェートから、ホスホマンノムターゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること、
（ｂ１）グアノシン、およびアデノシントリホスフェートから、グアノシンキナーゼによって触媒されてグアノシンモノホスフェート（ＧＭＰ）を形成すること；
（ｂ２’）グアノシンモノホスフェート、およびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシンジホスフェート（ＧＤＰ）を形成すること、
（ｂ２’’）グアノシンジホスフェート、およびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）を形成すること；および
（ｃ）Ｄ－マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼの存在下で、マンノース－１－ホスフェートをグアノシントリホスフェートと反応させてＧＤＰ－マンノースにすること、
（ｄ）ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼによって触媒されてＧＤＰ－マンノースからＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースを形成すること；および
（ｅ）ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼによって触媒されてＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースおよびＮＡＤＰＨからＧＤＰ－フコースを形成すること、
を含む。

【0057】

明らかに、ステップ（ａ）は、ステップ（ｂ１）、（ｂ２’）、および（ｂ２’’）の前に、同時に、または後に実行され得る。したがって、ステップの順序を（ｂ１） →（ｂ２’） →（ｂ２’’）→（ａ）→（ｃ）に戻してもよい。

【0058】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノース；
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒；
を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼおよび（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリル－トランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること、
Ｂ）
（ａ）Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること、
または
Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、グルコキナーゼによって触媒されてマンノース－６－ホスフェート（Ｍａｎ－６－Ｐ）を形成すること、およびマンノース－６－ホスフェートから、ホスホマンノムターゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること、
（ｂ１）グアノシン、およびアデノシントリホスフェートから、グアノシンキナーゼによって触媒されてグアノシンモノホスフェート（ＧＭＰ）を形成すること；
（ｂ２’）グアノシンモノホスフェート、およびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシンジホスフェート（ＧＤＰ）を形成すること、
（ｂ２’’）グアノシンジホスフェート、およびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）を形成すること；および
（ｃ）Ｄ－マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼの存在下で、マンノース－１－ホスフェートをグアノシントリホスフェートと反応させてＧＤＰ－マンノースにすること、
（ｄ）ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼによって触媒されてＧＤＰ－マンノースからＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースを形成すること；および
（ｅ）ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼによって触媒されてＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースおよびＮＡＤＰＨからＧＤＰ－フコースを形成すること、
によって、酵素のセット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0059】

ＧＤＰ－フコースを生成するための本発明の方法は、従来技術に記述された方法に比べて以下の重要な利点を有する：
・出発材料に関する大幅なコスト削減、すなわち、高価なＧＤＰまたはＧＴＰは必要ない、
・方法は継続的な方法で行われることができるので、年間１トン規模のＧＤＰ－フコースを潜在的に提供できる、
・無細胞工程により、有害なＧＭＯ態様（調節、標識）を回避する、
・無細胞抽出物を直接使用でき、生体触媒精製の費用がない、
・酵素は、低コストで市販されており、すぐに使用できる固体支持体に固定化されることができる、
・グアノシンに関してほぼ定量的な収率を得る、
・高い拡張性は、本発明の方法を産業用適用ために有用にする。

【0060】

グアノシンを可溶化するための少量の共溶媒の添加により、本発明者は、高い変換率でグアノシンからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースへの多酵素カスケード反応を確立することができた。好ましくは、共溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－プロパノール、イソブタノール、ｎ－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、アセトニトリル、アセトンおよびジメチルスルホキシド、を含む群から選択される有機溶媒である。好ましくは、共溶媒は、例えば、ジメチルスルホキシドまたはジメチルホルムアミドなどの極性非プロトン性溶媒である。好ましくは、共溶媒は酵素活性を阻害しない。より好ましくは、共溶媒はジメチルスルホキシドである。

【0061】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコース；
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒；
を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼおよびＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニルトランスフェラーゼを含む酵素セットを提供すること、
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下で、グアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含み、
ここで、グアノシンを可溶化するための共溶媒は、ジメチルスルホキシドである。

【0062】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノース；
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒；
を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼおよび（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリル－トランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること、
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下で、グアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含み、
ここで、グアノシンを可溶化するための共溶媒は、ジメチルスルホキシドである。

【0063】

［発明の詳細な説明］
定義
本明細書で使用される用語「ポリホスフェート」は、６個以上のホスフェート（ＰＯ_４）四面体の角（ｃｏｒｎｅｒ）共有によって生成された様々なＰ－Ｏ－Ｐ結合を含む任意の塩に関し、長鎖の形成につながる。用語「ポリＰ_ｎ」は同義語として使用され、ここで、ｎは、ホスフェート残基の数の平均鎖長を表し、例えば、ポリＰ_２５は、約２５個のホスフェート残基を有するポリホスフェートに関し、およびポリＰ_１４は、約１４個のホスフェート残基を有するポリホスフェートに関する。

【0064】

本明細書で使用される用語「グアノシンキナーゼ」または「イノシンキナーゼ」は、グアノシンキナーゼ活性を有するポリペプチドに関し、すなわち、グアノシンキナーゼは、アデノシントリホスフェートの存在下で、グアノシンのグアノシン５’－モノホスフェートへの反応を触媒する。グアノシンキナーゼは、ＥＣクラス２．７．１．７３に属する。

【0065】

本明細書で使用される用語「ポリホスフェートキナーゼ」は、ポリホスフェートキナーゼ活性を有するポリペプチドに関し、すなわち、ポリホスフェートキナーゼは、次の反応を触媒する：

【0066】

【化9】

【0067】

ここで、Ｎは、例えばグアノシン、アデノシン、ウリジンなどのヌクレオチドであり、ＮＭＰはヌクレオシドモノホスフェートであり、ＮＤＰはヌクレオシドジホスフェートであり、ＮＴＰはヌクレオシドトリホスフェートである。

【0068】

グアノシンの場合、ポリホスフェートキナーゼは次の反応を触媒する：

【0069】

【化10】

【0070】

ポリホスフェートキナーゼはＥＣクラス２．７．４．１に属する。本明細書に記述される本発明の方法において使用されるポリホスフェートキナーゼ酵素の代表物は、ポリホスフェートキナーゼ１（ＰＰＫ１）、ポリホスフェートキナーゼ２（ＰＰＫ２）、２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２Ｄ－ＰＰＫ２）１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１Ｄ－ＰＰＫ２）、ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）、およびグアニレートキナーゼ（ＥＣクラス２．７．４．８）を含むが、これらに限定されない。

【0071】

本明細書で使用される用語「Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ」は、Ｌ－フコキナーゼ活性、およびＬ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ活性を有する二官能性ポリペプチド、すなわち、次の反応を触媒するポリペプチドに関する：

【0072】

【化11】

【0073】

Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼは、ＥＣクラス２．７．１．５２および２．７．７．３０に属する。
一方はＬ－フコキナーゼ活性を有し、および他方は、Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ活性を有する、２つの別々の官能性ポリペプチドも、本発明の方法に適し得るということが明らかになるべきである。

【0074】

本明細書に使用される用語「ピロホスファターゼ」は、ピロホスファターゼ活性を有するポリペプチド、すなわち、次の反応を触媒するポリペプチドに関する：

【0075】

【化12】

【0076】

ここで、ＰＰｉはピロホスフェートに関し、Ｐｉはホスフェートに関する。
ピロホスファターゼは、ＥＣクラス３．６．１．１に属する。
本明細書に使用される用語「グルコキナーゼ」は、キナーゼ活性を有するポリペプチド、すなわち、次の反応を触媒するキナーゼに関する：

【0077】

【化13】

【0078】

グルコキナーゼはＥＣクラス２．７．１．１に属する。
本明細書に使用される用語「ホスホマンノムターゼ」は、ホスホマンノムターゼ活性を有するポリペプチド、すなわち、次の反応を触媒するホスホマンノムターゼに関する：

【0079】

【化14】

【0080】

ホスホマンノムターゼは、ＥＣクラス５．４．２．８に属する。
本明細書に使用される用語「Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ」は、キナーゼ活性を有するポリペプチド、すなわち、次の反応を触媒するポリペプチドに関する：

【0081】

【化15】

【0082】

Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼは、ＥＣクラス２．７．１．１６２に属する。
本明細書に使用される用語「マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ」は、Ｄ－マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、すなわち、次の反応を触媒するポリペプチドに関する：

【0083】

【化16】

【0084】

マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼは、ＥＣクラス２．７．７．１３に属する。
本明細書で使用される用語「ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼ」は、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド、すなわち、次の反応を触媒するポリペプチドに関する：

【0085】

【化17】

【0086】

ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼは、ＥＣクラス４．２．１．４７に属する。
本明細書に使用される用語「ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ」は、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ活性を有するポリペプチド、すなわち、次の反応を触媒するポリペプチドに関する：

【0087】

【化18】

【0088】

ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼは、ＥＣクラス１．１．１．２７１に属し、次の同義語および略語ＧＤＰ－４－ケト－６－デオキシマンノース－３，５－エピメラーゼ－４－レダクターゼ（ＷＣＡＧ）、ＧＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－Ｄ－マンノースエピメラーゼ－レダクターゼ、ＧＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－Ｄ－マンノースエピメラーゼ／レダクターゼ、ＧＤＰＦｕｃシンターゼ、ＧＥＲ、ＧＦＳ、ＧＭＥＲ、グアノシンジホスホフコースシンテターゼ、を有する。

【0089】

本明細書で使用される用語「共溶媒」は、水へのグアノシンの溶解度を増加または増強する有機化合物または有機化合物の混合物、特に有機溶媒または異なる溶媒の混合物に関する。当業者は、適切な共溶媒がグアノシンについて高い溶解性を有する溶媒であることを容易に想像することができ、適切な共溶媒はメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－プロパノール、イソブタノール、ｎ－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、アセトニトリル、アセトン、またはジメチルスルホキシドを含む。好ましくは、共溶媒は、例えばジメチルスルホキシドまたはジメチルホルムアミドなどの極性非プロトン性溶媒である。特に好ましい共溶媒はジメチルスルホキシドである。

【0090】

本明細書で使用される「サッカリド」は、モノサッカリド、ジサッカリド、トリサッカリド、テトラサッカリド、ペンタサッカリド、ヘキササッカリド、ヘプタサッカリド、オクタサッカリド．．．、オリゴサッカリド、グリカンおよびポリサッカリドに関するが、これらに限定されない。サッカリドは、好ましくは：Ｄ－アラビノース、Ｄ－リキソース、Ｄ－リボース、Ｄ－キシロース、Ｌ－アラビノース、Ｌ－リキソース、Ｌ－リボース、Ｌ－キシロース、Ｄ－リブロース、Ｄ－キシルロース、Ｌ－リブロース、Ｌ－キシルロース、Ｄ－デオキシリボース、Ｌ－デオキシリボース、Ｄ－エリトロース、Ｄ－スレオース、Ｌ－グリセロ－Ｄ－マンノ－ヘプトース、Ｄ－グリセロ－Ｄ－マンノ－ヘプトース、Ｄ－アロース、Ｄ－アルトロース、Ｄ－グルコース、Ｄ－マンノース、Ｄ－グロース、Ｄ－イドース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－タロース、Ｄ－プシコース、Ｄ－フルクトース、Ｄ－ソルボース、Ｄ－タガトース、６－デオキシ－Ｌ－アルトロース、６－デオキシ－Ｄ－タロース、Ｄ－フコース、Ｌ－フコース、Ｄ－ラムノース、Ｌ－ラムノース、Ｄ－キノボース、オリボース、チベロス、アスカリロース、アベクオース、パラトース、デジトキソース、コリトース、Ｄ－グルコサミン、Ｄ－ガラクトサミン、Ｄ－マンノサミン、Ｄ－アロサミン、ｌ－アルトロサミン、Ｄ－グロサミン、Ｌ－イドサミン、Ｄ－タロサミン、Ｎ－アセチル－ｄ－グルコサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－マンノサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－アロサミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－アルトロサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルサミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－イドサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－タロサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－フコサミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－フコサミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－ラムノサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－キノボサミン、Ｄ－グルクロン酸、Ｄ－ガラクツロン酸、Ｄ－マンヌロン酸、Ｄ－アルロン酸、Ｌ－アルトルロン酸、Ｄ－グルロン酸、Ｌ－グルロン酸、Ｌ－イズロン酸、Ｄ－タルロン酸、ノイラミン酸、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｎ－グリコリルノイラミン酸、アピオース、バシロサミン、テベトース、アコフリオース、シマロース、ムラミン酸、Ｎ－アセチルムラミン酸、Ｎ－グリコリルノイラ酸、３－デオキシ－リキソ－ヘプツロサル酸、ケトデオキシオクトン酸、およびケトデオキシノノン酸から選択される単糖単位を含む。好ましくは、単糖単位は：
α－Ｄ－リボピラノース、α－Ｄ－アラビノピラノース、α－Ｄ－キシロピラノース、α－Ｄ－リキソピラノース、α－Ｄ－アロピラノース、α－Ｄ－アルトロピラノース、α－Ｄ－グルコピラノース、α－Ｄ－マンピラノース、α－Ｄ－グルコピラノース、α－Ｄ－イドピラノース、α－Ｄ－ガラクトピラノース、α－Ｄ－タロピラノース、α－Ｄ－プシコピラノース、α－Ｄ－フルクトピラノース、α－Ｄ－ソルボピラノース、α－Ｄ－タガトピラノース、α－Ｄ－リボフラノース、α－Ｄ－アラビノフラノース、α－Ｄ－キシロフラノース、α－Ｄ－リキソフラノース、α－Ｄ－アロフラノース、α－Ｄ－アルトロフラノース、α－Ｄ－グルコフラノース、α－Ｄ－マンノフラノース、α－Ｄ－グロフラノース、α－Ｄ－イドフラノース、α－Ｄ－ガラクトフラノース、α－Ｄ－タロフラノース、α－Ｄ－プシコフラノース、α－Ｄ－フルクトフラノース、α－Ｄ－ソルボフラノース、α－Ｄ－タガトフラノース、α－Ｄ－キシルロフラノース、α－Ｄ－リブロフラノース、α－Ｄ－スレオフラノース、α－Ｄ－ラムノピラノース、α－Ｄ－エリスロフラノース、α－Ｄ－グルコサミン、α－Ｄ－グルコピラヌロン酸、β－Ｄ－リボピラノース、β－Ｄ－アラビノピラノース、β－Ｄ－キシロピラノース、β－Ｄ－リキソピラノース、β－Ｄ－アロピラノース、β－Ｄ－アルトロピラノース、β－Ｄ－グルコピラノース、β－Ｄ－マンピラノース、β－Ｄ－グルコピラノース、β－Ｄ－イドピラノース、β－Ｄ－ガラクトピラノース、β－Ｄ－タロピラノース、β－Ｄ－プシコピラノース、β－Ｄ－フルクトピラノース、β－Ｄ－ソルボピラノース、β－Ｄ－タガトピラノース、β－Ｄ－リボフラノース、β－Ｄ－アラビフラノース、β－Ｄ－キシロフラノース、β－Ｄ－リキソフラノース、β－Ｄ－ラムノピラノース、β－Ｄ－アロフラノース、β－Ｄ－アルトロフラノース、β－Ｄ－グルコフラノース、β－Ｄ－マンノフラノース、β－Ｄ－グロフラノース、β－Ｄ－イドフラノース、β－Ｄ－ガラクトフラノース、β－Ｄ－タロフラノース、β－Ｄ－プシコフラノース、β－Ｄ－フルクトフラノース、β－Ｄ－ソルボフラノース、β－Ｄ－タガトフラノース、β－Ｄ－キシルロフラノース、β－Ｄ－リブロフラノース、β－Ｄ－スレオフラノース、β－Ｄ－エリスロフラノース、β－Ｄ－グルコサミン、β－Ｄ－グルコピラヌロン酸、α－Ｌ－リボピラノース、α－Ｌ－アラビノピラノース、α－Ｌ－キシロピラノース、α－Ｌ－リキソピラノース、α－Ｌ－アロピラノース、α－Ｌ－アルトロピラノース、α－Ｌ－グルコピラノース、α－Ｌ－マンピラノース、α－Ｌ－グルコピラノース、α－Ｌ－イドピラノース、α－Ｌ－ガラクトピラノース、α－Ｌ－タロピラノース、α－Ｌ－プシコピラノース、α－Ｌ－フルクトピラノース、α－Ｌ－ソルボピラノース、α－Ｌ－タガトピラノース、α－Ｌ－ラムノピラノース、α－Ｌ－リボフラノース、α－Ｌ－アラビノフラノース、α－Ｌ－キシロフラノース、α－Ｌ－リキソフラノース、α－Ｌ－アロフラノース、α－Ｌ－アルトロフラノース、α－Ｌ－グルコフラノース、α－Ｌ－マンノフラノース、α－Ｌ－グロフラノース、α－Ｌ－イドフラノース、α－Ｌ－ガラクトフラノース、α－Ｌ－タロフラノース、α－Ｌ－プシコフラノース、α－Ｌ－フルクトフラノース、α－Ｌ－ソルボフラノース、α－Ｌ－タガトフラノース、α－Ｌ－キシルロフラノース、α－Ｌ－リブロフラノース、α－Ｌ－スレオフラノース、α－Ｌ－エリスロフラノース、α－Ｌ－グルコサミン、α－Ｌ－グルコピラヌロン酸、β－Ｌ－リボピラノース、β－Ｌ－アラビノピラノース、β－Ｌ－キシロピラノース、β－Ｌ－リキソピラノース、β－Ｌ－アロピラノース、β－Ｌ－アルトロピラノース、β－Ｌ－グルコピラノース、β－Ｌ－マンピラノース、β－Ｌ－グルコピラノース、β－Ｌ－イドピラノース、β－Ｌ－ガラクトピラノース、β－Ｌ－タロピラノース、β－Ｌ－プシコピラノース、β－Ｌ－フルクトピラノース、β－Ｌ－ソルボピラノース、β－Ｌ－タガトピラノース、β－Ｌ－リボフラノース、β－Ｌ－アラビノフラノース、β－Ｌ－キシロフラノース、β－Ｌ－リキソフラノース、β－Ｌ－アロフラノース、β－Ｌ－アルトロフラノース、β－Ｌ－グルコフラノース、β－Ｌ－マンノフラノース、β－Ｌ－グロフラノース、β－Ｌ－イドフラノース、β－Ｌ－ガラクトフラノース、β－Ｌ－タロフラノース、β－Ｌ－プシコフラノース、β－Ｌ－フルクトフラノース、β－Ｌ－ソルボフラノース、β－Ｌ－タガトフラノース、β－Ｌ－キシルロフラノース、β－Ｌ－リブロフラノース、β－Ｌ－スレオフラノース、β－Ｌ－エリスロフラノース、β－Ｌ－グルコサミン、β－Ｌ－グルコピラヌロン酸、およびβ－Ｌ－ラムノピラノース、を含む、またはからなるα－およびβ－Ｄ／Ｌ－炭水化物の群に属する。

【0091】

サッカリドは更に、アミド、カーボネート、カルバメート、カルボニル、チオカルボニル、カルボキシ、チオカルボキシ、エステル、チオエステル、エーテル、エポキシ、ヒドロキシアルキル、アルキレニル、フェニレン、アルケニル、イミノ、イミド、イソ尿素、チオカルバメート、チオ尿素および／または尿素部分を有するように任意に修飾される。

【0092】

本明細書で使用される用語「糖ペプチド」は、ペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖に共有結合された炭水化物部分を含むペプチドに関する。炭水化物部分は、側鎖を形成し、およびセリンまたはスレオニン残基のヒドロキシ基に結合したＯ－グリコシド、またはアスパラギン残基のアミド窒素に結合したＮ－グリコシドのいずれかである。

【0093】

本明細書で使用される用語「糖タンパク質」は、ポリペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖に共有結合された炭水化物部分を含むポリペプチドに関する。炭水化物部分は側鎖を形成し、セリンまたはスレオニン残基のヒドロキシ基に結合したＯ－グリコシド、またはアスパラギン残基のアミド窒素に結合したＮ－グリコシドのいずれかである。

【0094】

本明細書で使用される用語「タンパク質」は、非グリコシル化タンパク質およびグリコシル化タンパク質を含み、ポリペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖に共有結合された炭水化物部分を含む、または欠くポリペプチドに関する。

【0095】

本明細書で使用される用語「ペプチド」は、非グリコシル化ペプチドおよびグリコシル化ペプチドを含み、ペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖に共有結合された炭水化物部分を含む、または欠くペプチドに関する。

【0096】

補酵素再生
ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼは、ＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－α－Ｄ－マンノースからのＧＤＰ－フコースの形成において補酵素ＮＡＤＰＨを消費する。したがって、本明細書に記述の本発明の方法において、明確に述べられていないが、ＧＤＰ－フコースは、補酵素ＮＡＤＰＨの存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから生成される。

【0097】

補酵素ＮＡＤＰＨおよび補酵素ＮＡＤＰ^＋は、非常に高価であるので、補酵素ＮＡＤＰＨおよび補酵素ＮＡＤＰ^＋を、触媒量で保ち、費用効率の高い工程を開発するために、システムにおいて再生すると有利である。

【0098】

ＮＡＤＰＨの再生に使用できる酵素は：
ホスファイトデヒドロゲナーゼＥＣ番号１．２０．１．１：

【0099】

【化19】

グルコースデヒドロゲナーゼＥＣ番号１．１．１．４７または１．１．１．１１８：

【0100】

【化20】

グリセロールデヒドロゲナーゼＥＣ番号１．１．１．７２：

【0101】

【化21】

グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）ＥＣ番号１．１．１．４９：

【0102】

【化22】

グルタメートデヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）ＥＣ番号１．４．１．４：

【0103】

【化23】

である。

【0104】

したがって、好ましい実施形態において、酵素セットは、ＮＡＤＰＨ再生に使用できる上記の酵素の１つ、すなわち、ホスファイトデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスファイトデヒドロゲナーゼまたはグルタメートデヒドロゲナーゼをさらに含む。より好ましくは、酵素セットは、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびグルタメートデヒドロゲナーゼから選択される酵素をさらに含む。

【0105】

したがって、本発明は、グアノシン、およびＬ－フコースまたはＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含む、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、およびＤ－マンノースの場合ＮＡＤＰＨを含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれかを含み；およびホスファイトデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼ、およびグルタメートデヒドロゲナーゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒のセットの存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、ＮＡＤＰＨ、および共溶媒のセットの存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0106】

好ましい実施形態において、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、ＮＡＤＰＨ、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、および（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれかを含む酵素セット；およびホスファイトデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼ、およびグルタメートデヒドロゲナーゼから選択される酵素、を提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、ＮＡＤＰＨ、および共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0107】

特に好ましい実施形態において、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、ＮＡＤＰＨ、Ｌ－グルタメートおよびグアノシンを可溶化するための共溶媒を含む、
溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、グルタメートデヒドロゲナーゼ、および（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、ＮＡＤＰＨ、Ｌ－グルタメートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0108】

特に好ましい実施形態において、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、ＮＡＤＰＨ、Ｄ－グルコースおよびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、グルコース－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼ、および（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、ＮＡＤＰＨ、Ｄ－グルコースおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0109】

本明細書で使用される用語「固体支持体」は、酵素または他の試薬が直接的に、または固定基を有するリンカーを介して結合されてもよく、または固定化されてもよく、過剰な試薬、可溶性反応生成物、副生成物、または溶媒から酵素を容易に分離することを可能にする（洗浄、濾過、遠心分離などによって）不溶性の官能基化された材料に関する。固体支持体は、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミドなどの有機重合体、並びにそれらの共重合体およびグラフトから構成されることができる。固体支持体は、例えば、ガラス、シリカ、制御された細孔ガラス（ＣＰＧ）、逆相シリカ、または金もしくは白金などの金属などの無機物であることもできる。固体支持体は、磁性粒子からなることもできる。酵素固定化のための適切な支持材料の概要については、Ｚｄａｒｔａ ｅｔ ａｌ．Ｃａｔａｌｙｓｔｓ ２０１８，８，９２，およびＤａｔｔａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０１３ ３：１－９を参照する。

【0110】

固体支持体の形態は、ビーズ、モノリス、球体、粒子、粒子床、繊維マット、顆粒、ゲル、膜、中空繊維膜、混合マトリックス膜または面の形態であることができる。面は、平面、実質的に平面、または非平面であることができる。固体支持体は、多孔性または非多孔性であることができ、膨潤または非膨潤特性を有することができる。固体支持体を、ウェル、窪み、または他の容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）、容器（ｖｅｓｓｅｌ）、特徴、または位置の形で構成することができる。

【0111】

驚くべきことに、本発明者は、グアノシンをジメチルスルホキシドなどの共溶媒に可溶化することにより、グアノシンのＧＤＰ－フコースへのほぼ完全な変換が、すでに３時間後に達成されることを明らかにしている（実施例２）。さらに、共溶媒は、ＧＤＰ－フコースの調製において使用される酵素の活性に影響を与えなかった。共溶媒として、水または緩衝液におけるグアノシンの溶解度を増加または増強する任意の化合物が適している。

【0112】

好ましくは、共溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－プロパノール、イソブタノール、ｎ－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、アセトニトリル、アセトンおよびジメチルスルホキシドを含む群から選択される有機溶媒である。好ましくは、共溶媒は、ジメチルスルホキシドまたはジメチルホルムアミドなどの極性非プロトン性溶媒である。より好ましくは、共溶媒はジメチルスルホキシドである。したがって、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含む、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含み、
ここで、グアノシンを可溶化するための共溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－プロパノール、イソブタノール、ｎ－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、アセトニトリル、アセトンおよびジメチルスルホキシドを含む群から選択される。

【0113】

好ましくは、共溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－プロパノール、イソブタノール、ｎ－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、アセトニトリル、アセトンおよびジメチルスルホキシドを含む群から選択される有機溶媒である。より好ましくは、共溶媒は、ジメチルスルホキシドである。したがって、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含み、
ここで、グアノシンを可溶化するための共溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－プロパノール、イソブタノール、ｎ－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、アセトニトリル、アセトンおよびジメチルスルホキシドを含む群から選択される。

【0114】

好ましくは、グアノシンを可溶化するための共溶媒の量は、グアノシンの可溶化を可能にするためにできるだけ低く維持される。したがって、好ましくは、共溶媒の量は、本明細書に記載の本発明の方法のステップＡ）において提供される溶液にグアノシンを完全に可溶化するのに十分である。あるいは、共溶媒の量は、本明細書に記述される本発明の方法のステップＡ）において提供される溶液に少なくとも半分の量のグアノシンを可溶化するのに十分である。

【0115】

さらに、共溶媒の量は、ステップＡ）において提供される溶液の総体積に基づいて、０．０１ｖｏｌ％から３０ｖｏｌ％の間である。より好ましくは、共溶媒の量は、ステップＡ）において提供される溶液の総体積に基づいて、０．０５ｖｏｌ％から２５ｖｏｌ％の間である。さらにより好ましくは、共溶媒の量は、ステップＡ）において提供される溶液の総体積に基づいて、０．１ｖｏｌ％から１５ｖｏｌ％の間である。より好ましくは、共溶媒の量は、ステップＡ）において提供される溶液の総体積に基づいて、０．１ｖｏｌ％から１０ｖｏｌ％の間である。最も好ましくは、共溶媒の量は、ステップＡ）において提供される溶液の総体積に基づいて、１ｖｏｌ％から５ｖｏｌ％の間である。

【0116】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含み、
ここで、グアノシンを可溶化するための共溶媒の量は、ステップＡ）において提供される溶液の総体積に基づいて、１ｖｏｌ％から５ｖｏｌ％の間である。

【0117】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含み、
ここで、グアノシンを可溶化するための共溶媒の量は、ステップＡ）において提供される溶液の総体積に基づいて、１ｖｏｌ％から５ｖｏｌ％の間である。

【0118】

一実施形態において、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含み、
ここで、共溶媒は、ジメチルスルホキシドであり、共溶媒の量は、ステップＡ）において提供される溶液の総体積に基づいて、１ｖｏｌ％から５ｖｏｌ％の間である。

【0119】

一実施形態において、グアノシンおよびＬ－フコースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含み、
ここで、共溶媒は、ジメチルスルホキシドであり、共溶媒の量は、ステップＡ）において提供される溶液の総体積に基づいて、１ｖｏｌ％から５ｖｏｌ％の間である。

【0120】

溶解度が増加すると、より高濃度の反応混合物を実現できるので、工程コストを減少させる。したがって、ステップＡ）において提供される溶液中のグアノシンおよびＬ－フコースの濃度は、好ましくは、０．０１ｍＭから１００，０００ｍＭの範囲である。より好ましくは、グアノシンおよびＬ－フコースの濃度は、好ましくは、０．０５ｍＭから５０，０００ｍＭの範囲である。より好ましくは、グアノシンおよびＬ－フコースの濃度は、好ましくは、０．１ｍＭから１０，０００ｍＭの範囲である。より好ましくは、グアノシンおよびＬ－フコースの濃度は、好ましくは、０．２ｍＭから５，０００ｍＭの範囲である。

【0121】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含み、
ここで、ステップＡ）において提供される溶液中のグアノシンおよびＬ－フコースの濃度は、０．２ｍＭから５，０００ｍＭの範囲である。

【0122】

溶解度が増加すると、より高濃度の反応混合物を実現できるので、工程コストを減少させる。したがって、ステップＡ）において提供される溶液中のグアノシンおよびＤ－マンノースの濃度は、好ましくは、０．０１ｍＭから１００，０００ｍＭの範囲である。より好ましくは、グアノシンおよびＤ－マンノースの濃度は、好ましくは、０．０５ｍＭから５０，０００ｍＭの範囲である。より好ましくは、グアノシンおよびＤ－マンノースの濃度は、好ましくは、０．１ｍＭから１０，０００ｍＭの範囲である。より好ましくは、グアノシンおよびＤ－マンノースの濃度は、好ましくは、０．２ｍＭから５，０００ｍＭの範囲である。

【0123】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、および（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含み、
ここで、ステップＡ）において提供される溶液中のグアノシンおよびＤ－マンノースの濃度は、０．２ｍＭから５，０００ｍＭの範囲である。

【0124】

好ましくは、酵素セット中の酵素の濃度は、ステップＡ）において提供される溶液の総体積に基づいて、０．０００１ｍｇ／ｍＬから１００ｍｇ／ｍＬの間である。

【0125】

フコース－１－ホスフェートとグアノシントリホスフェートとを反応させてＧＤＰ－フコースにする反応における副生成物、およびマンノース－１－ホスフェートとグアノシントリホスフェートとを反応させてＧＤＰ－マンノースにする反応における副生成物として、ピロホスフェート（ＰＰｉ）が形成される。ピロホスフェートは水溶液中で不安定であるが、無機ホスフェート（Ｐｉ）にゆっくり加水分解する。高濃度のピロホスフェートは、ＧＤＰ－フコース形成に関与するＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼおよびマンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ酵素の活性も低下させ得る。酵素ピロホスファターゼは、ピロホスフェートのホスフェートへの加水分解を触媒することができ、それにより、不可逆的なＧＤＰ－フコース／ＧＤＰ－マンノース形成を効果的に行う。したがって、本発明の好ましい実施形態において、酵素セットは、ピロホスファターゼをさらに含む。

【0126】

グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびピロホスファターゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0127】

本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、およびピロホスファターゼを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0128】

言い換えると、グアノシンおよびＬ－フコースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する本発明の方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、およびピロホスファターゼを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）
（ａ）Ｌ－フコースおよびアデノシントリホスフェートから、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼによって触媒されてフコース－１－ホスフェートを形成すること、
（ｂ１）グアノシン、およびアデノシントリホスフェートから、グアノシンキナーゼによって触媒されてグアノシンモノホスフェートを形成すること；
（ｂ２’）グアノシンモノホスフェートおよびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシンジホスフェートを形成すること；
（ｂ２’’）グアノシンジホスフェートおよびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシントリホスフェートを形成すること、
（ｃ’）Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼの存在下で、フコース－１－ホスフェートをグアノシントリホスフェートと反応させてＧＤＰ－フコースおよびピロホスフェートにすること、
（ｃ’’）ピロホスファターゼの存在下でピロホスフェートをホスフェートに変換すること、
によって、酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0129】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、および（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、およびピロホスファターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼおよびピロホスファターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）
（ａ）Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること、
または
Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、グルコキナーゼによって触媒されてマンノース－６－ホスフェート（Ｍａｎ－６－Ｐ）を形成すること、およびマンノース－６－ホスフェートから、ホスホマンノムターゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること、
（ｂ１）グアノシン、およびアデノシントリホスフェートから、グアノシンキナーゼによって触媒されてグアノシンモノホスフェート（ＧＭＰ）を形成すること；
（ｂ２’）グアノシンモノホスフェート、およびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシンジホスフェート（ＧＤＰ）を形成すること、
（ｂ２’’）グアノシンジホスフェート、およびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）を形成すること；および
（ｃ’）Ｄ－マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼの存在下で、マンノース－１－ホスフェートをグアノシントリホスフェートと反応させてＧＤＰ－マンノースにすること、
（ｃ’’）ピロホスファターゼの存在下でピロホスフェートをホスフェートに変換すること、
（ｄ）ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼによって触媒されてＧＤＰ－マンノースからＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースを形成すること；および
（ｅ）ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼによって触媒されてＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースおよびＮＡＤＰＨからＧＤＰ－フコースを形成すること、
によって、酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0130】

好ましくは、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する本発明の方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびピロホスファターゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含み、
ここで、共溶媒は、ジメチルスルホキシドである。

【0131】

好ましくは、グアノシンおよびＬ－フコースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する本発明の方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み；
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、およびピロホスファターゼを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含み、
ここで、共溶媒は、ジメチルスルホキシドである。

【0132】

好ましくは、本明細書に記述の本発明の方法において使用されるピロホスファターゼは、無機ピロホスファターゼである。好ましくは、ピロホスファターゼは、パスツレラ マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄｅ）（ＰｍＰｐＡ）由来の無機ピロホスファターゼである。

【0133】

ポリホスフェートは、水性媒体に最初に溶解された金属イオン（例えば、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｆｅ２^＋／３＋など）と安定した水溶性の複合体を形成することができる。この効果は金属イオン封鎖と呼ばれ、結合した金属イオンが反応、特に酵素反応に関与するのを防ぐ。したがって、隔離された金属イオン、特にＭｇ^２＋およびＭｎ^２＋は、本明細書に記述の本発明の方法に関与する酵素の補因子として作用することができない。特定の金属イオンを隔離する特定のポリホスフェートの能力は、ポリホスフェートの鎖長の増加とともに減少するので、長鎖ポリホスフェートが本発明において好ましい。より好ましくは、少なくとも１４個のホスフェート残基を有するポリホスフェートである。最も好ましくは、少なくとも２５個のホスフェート残基を有するポリホスフェートである。

【0134】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含み、
ここで、ポリホスフェートは、少なくとも２５個のホスフェート残基を有する長鎖ポリホスフェートである。

【0135】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み；
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含み、
ここで、ポリホスフェートは、少なくとも２５個のホスフェート残基を有する長鎖ポリホスフェートである。

【0136】

好ましくは、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含み、
ここで、ポリホスフェートは、少なくとも２５個のホスフェート残基を有する長鎖ポリホスフェートであり、共溶媒は、ジメチルスルホキシドである。

【0137】

好ましくは、グアノシンおよびＬ－フコースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み；
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、および任意にピロホスファターゼを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含み、
ここで、ポリホスフェートは、少なくとも２５個のホスフェート残基を有する長鎖ポリホスフェートであり、共溶媒は、ジメチルスルホキシドである。

【0138】

好ましくは、酵素は、他の基質と共に単一の反応混合物中に存在する。混合物は、均一（溶液）または不均一であり得る 酵素は、固体支持体に固定化されていてもよく、または固定化されていなくてもよい。したがって、グアノシン５'－ジホスホ－β－Ｌ－フコースは、本発明の方法の更なる態様に従って、単一の反応混合物中で生成される。

【0139】

したがって、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒を含み；および
（ｉｉｉ）グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼのいずれかを含む酵素セット、を含む混合物を提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0140】

したがって、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、並びにＤ－マンノースの場合、ＮＡＤＰＨを含み；および
（ｉｉｉ）グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼのいずれかを含む酵素セット、を含む混合物を提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、ＮＡＤＰＨおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0141】

したがって、グアノシンおよびＬ－フコースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、
（ｉｉｉ）グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、を含む混合物を提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0142】

さらに、グアノシンおよびＬ－フコースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒；および
（ｉｉｉ）グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、を含む溶液を提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0143】

言い換えると、グアノシンおよびＬ－フコースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒；および
（ｉｉｉ）グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む少なくとも３つの酵素、を含む混合物を提供すること；
Ｂ）少なくとも３つの酵素、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0144】

好ましくは、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒；および
（ｉｉｉ）グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、任意にピロホスファターゼ、および（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼのいずれか、を含む酵素セット、を含む溶液を提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含み、
ここで、共溶媒は、ジメチルスルホキシドである。

【0145】

好ましくは、グアノシンおよびＬ－フコースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒；および
（ｉｉｉ）グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、任意にピロホスファターゼを含む酵素セット、を含む溶液を提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含み、
ここで、共溶媒は、ジメチルスルホキシドである。

【0146】

グアノシンおよびＤ－マンノースからＧＤＰ－フコースを合成するにはＮＡＤＰＨを必要とする。高価なＮＡＤＰＨがカスケードにおいて再利用される場合、カスケードは特に経済的である。さらに、ＮＡＤＰ^＋からＮＡＤＰＨを継続的に再利用することにより、反応平衡をＧＤＰ－フコースへ動かすことができる。

【0147】

次の酵素のいずれかを、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨの再利用のために適用することができる：ホスファイトデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧｌｃＤＨ）、グルコース－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、およびグルタメートデヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）。

【0148】

したがって、好ましい実施形態において、酵素セットは、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼ、およびグルタメートデヒドロゲナーゼのいずれかをさらに含む。

【0149】

本発明は、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、および
（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、並びにグルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼ、およびグルタメートデヒドロゲナーゼから選択される酵素；または
（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、並びにグルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼ、およびグルタメートデヒドロゲナーゼから選択される酵素のいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒、好ましくは、共溶媒はジメチルスルホキシドの存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0150】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、ＮＡＤＰＨ、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、および
（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、並びにグルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼ、およびグルタメートデヒドロゲナーゼのいずれか；または
（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、並びにグルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼ、およびグルタメートデヒドロゲナーゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）
（ａ）Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること、
または
Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、グルコキナーゼによって触媒されてマンノース－６－ホスフェート（Ｍａｎ－６－Ｐ）を形成すること、およびマンノース－６－ホスフェートから、ホスホマンノムターゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること、
（ｂ１）グアノシン、およびアデノシントリホスフェートから、グアノシンキナーゼによって触媒されてグアノシンモノホスフェート（ＧＭＰ）を形成すること；
（ｂ２’）グアノシンモノホスフェート、およびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシンジホスフェート（ＧＤＰ）を形成すること、
（ｂ２’’）グアノシンジホスフェート、およびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）を形成すること；および
（ｃ’）Ｄ－マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼの存在下で、マンノース－１－ホスフェートをグアノシントリホスフェートと反応させてＧＤＰ－マンノースにすること、
（ｄ）ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼによって触媒されてＧＤＰ－マンノースからＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースを形成すること；
（ｅ）ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼによって触媒されてＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースおよびＮＡＤＰＨからＧＤＰ－フコースを形成すること；および
（ｆ）グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼ、およびグルタメートデヒドロゲナーゼのいずれかによって触媒されて、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨを再生すること
によって、
酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒、好ましくは、ジメチルスルホキシド、の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0151】

好ましくは、本発明は、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、および（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、ピロホスファターゼ、並びにグルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼ、およびグルタメートデヒドロゲナーゼのいずれか；または
（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、ピロホスファターゼ、並びにグルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼ、およびグルタメートデヒドロゲナーゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒、好ましくは、共溶媒は、ジメチルスルホキシド、の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0152】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、ＮＡＤＰＨ、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、および
（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、ピロホスファターゼ、並びにグルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼ、およびグルタメートデヒドロゲナーゼのいずれか；または
（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、ピロホスファターゼ、並びにグルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼ、およびグルタメートデヒドロゲナーゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）
（ａ）Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること、
または
Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、グルコキナーゼによって触媒されてマンノース－６－ホスフェート（Ｍａｎ－６－Ｐ）を形成すること、およびマンノース－６－ホスフェートから、ホスホマンノムターゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること；
（ｂ１）グアノシン、およびアデノシントリホスフェートから、グアノシンキナーゼによって触媒されてグアノシンモノホスフェート（ＧＭＰ）を形成すること；
（ｂ２’）グアノシンモノホスフェート、およびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシンジホスフェート（ＧＤＰ）を形成すること、
（ｂ２’’）グアノシンジホスフェート、およびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）を形成すること；および
（ｃ’）Ｄ－マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼの存在下で、マンノース－１－ホスフェートをグアノシントリホスフェートと反応させてＧＤＰ－マンノースにすること、
（ｃ’’）ピロホスファターゼの存在下でピロホスフェートをホスフェートに変換すること、
（ｄ）ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼによって触媒されてＧＤＰ－マンノースからＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースを形成すること；および
（ｅ）ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼによって触媒されてＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースおよびＮＡＤＰＨからＧＤＰ－フコースを形成すること；および
（ｆ）グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼ、およびグルタメートデヒドロゲナーゼのいずれかによって触媒されて、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨを再生すること
によって、
酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒、好ましくは、ジメチルスルホキシド、の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0153】

グアノシンおよびＤ－マンノースからのＧＤＰ－フコースを合成することにおいて、ＧＤＰはグアニレートキナーゼ（ＧＭＫ）によってＧＭＰからインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で生成されてもよい。

【0154】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、グアニレートキナーゼ（ＧＭＫ）、および
（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ；または
（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、のいずれかを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒、好ましくは、共溶媒はジメチルスルホキシド、の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含む。

【0155】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、ＮＡＤＰＨおよびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、グアニレートキナーゼ（ＧＭＫ）、および
（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ；または
（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、ピロホスファターゼ、のいずれかを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）
（ａ）Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること、
または
Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、グルコキナーゼによって触媒されてマンノース－６－ホスフェート（Ｍａｎ－６－Ｐ）を形成すること、およびマンノース－６－ホスフェートから、ホスホマンノムターゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること；
（ｂ１）グアノシン、およびアデノシントリホスフェートから、グアノシンキナーゼによって触媒されてグアノシンモノホスフェート（ＧＭＰ）を形成すること；
（ｂ２’）グアノシンモノホスフェート、およびポリホスフェートから、グアニレートキナーゼ（ＧＭＫ）によって触媒されてグアノシンジホスフェート（ＧＤＰ）を形成すること、
（ｂ２’’）グアノシンジホスフェート、およびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）を形成すること；および
（ｃ’）Ｄ－マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼの存在下で、マンノース－１－ホスフェートをグアノシントリホスフェートと反応させてＧＤＰ－マンノースにすること、
（ｄ）ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼによって触媒されてＧＤＰ－マンノースからＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースを形成すること；および
（ｅ）ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼによって触媒されてＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースおよびＮＡＤＰＨからＧＤＰ－フコースを形成すること、
によって、
酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、ＮＡＤＰＨおよび共溶媒、好ましくは、ジメチルスルホキシド、の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0156】

好ましくは、本発明は、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、ＮＡＤＰＨおよびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、グアニレートキナーゼ（ＧＭＫ）、および
（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ；または
（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、ピロホスファターゼ、のいずれかを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒、好ましくは、共溶媒はジメチルスルホキシド、の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0157】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、ＮＡＤＰＨおよびグアノシンを可溶化するための共溶媒を含む
溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、グアニレートキナーゼ（ＧＭＫ）、および
（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、ピロホスファターゼ；または
（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、ピロホスファターゼ、のいずれかを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）
（ａ）Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること、
または
Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、グルコキナーゼによって触媒されてマンノース－６－ホスフェート（Ｍａｎ－６－Ｐ）を形成すること、およびマンノース－６－ホスフェートから、ホスホマンノムターゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること；
（ｂ１）グアノシン、およびアデノシントリホスフェートから、グアノシンキナーゼによって触媒されてグアノシンモノホスフェート（ＧＭＰ）を形成すること；
（ｂ２’）グアノシンモノホスフェート、およびポリホスフェートから、グアニレートキナーゼ（ＧＭＫ）によって触媒されてグアノシンジホスフェート（ＧＤＰ）を形成すること、
（ｂ２’’）グアノシンジホスフェート、およびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）を形成すること；および
（ｃ’）Ｄ－マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼの存在下で、マンノース－１－ホスフェートをグアノシントリホスフェートと反応させてＧＤＰ－マンノースにすること、
（ｃ’’）ピロホスファターゼの存在下でピロホスフェートをホスフェートに変換すること、
（ｄ）ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼによって触媒されてＧＤＰ－マンノースからＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースを形成すること；および
（ｅ）ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼによって触媒されてＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースおよびＮＡＤＰＨからＧＤＰ－フコースを形成すること、
によって、
酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、ＮＡＤＰＨおよび共溶媒、好ましくは、ジメチルスルホキシド、の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含む。

【0158】

好ましくは、本発明は、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、グアニレートキナーゼ（ＧＭＫ）、および
（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、並びにグルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼ、およびグルタメートデヒドロゲナーゼのいずれか；または
（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、並びにグルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼ、およびグルタメートデヒドロゲナーゼのいずれか；
を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒、好ましくは、共溶媒はジメチルスルホキシド、の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0159】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、ＮＡＤＰＨおよびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、グアニレートキナーゼ（ＧＭＫ）、および
（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、並びにグルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼ、およびグルタメートデヒドロゲナーゼのいずれか；または
（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、並びにグルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼ、およびグルタメートデヒドロゲナーゼのいずれか、
を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）
（ａ）Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること、
または
Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、グルコキナーゼによって触媒されてマンノース－６－ホスフェート（Ｍａｎ－６－Ｐ）を形成すること、およびマンノース－６－ホスフェートから、ホスホマンノムターゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること；
（ｂ１）グアノシン、およびアデノシントリホスフェートから、グアノシンキナーゼによって触媒されてグアノシンモノホスフェート（ＧＭＰ）を形成すること；
（ｂ２’）グアノシンモノホスフェート、およびポリホスフェートから、グアニレートキナーゼ（ＧＭＫ）によって触媒されてグアノシンジホスフェート（ＧＤＰ）を形成すること、
（ｂ２’’）グアノシンジホスフェートおよびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）を形成すること；および
（ｃ’）Ｄ－マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼの存在下で、マンノース－１－ホスフェートをグアノシントリホスフェートと反応させてＧＤＰ－マンノースにすること；
（ｄ）ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼによって触媒されてＧＤＰ－マンノースからＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースを形成すること；
（ｅ）ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼによって触媒されてＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースおよびＮＡＤＰＨからＧＤＰ－フコースを形成すること；および
（ｆ）グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼ、およびグルタメートデヒドロゲナーゼのいずれかによって触媒されて、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨを再生すること
によって、
酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、および共溶媒、好ましくは、ジメチルスルホキシド、の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0160】

さらに好ましくは、本発明は、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、グアニレートキナーゼ（ＧＭＫ）、および
（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、ピロホスファターゼ、並びにグルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼ、およびグルタメートデヒドロゲナーゼのいずれか；または
（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、ピロホスファターゼ、並びにグルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼ、およびグルタメートデヒドロゲナーゼのいずれか、
を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、および共溶媒、好ましくは、共溶媒はジメチルスルホキシド、の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0161】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、ＮＡＤＰＨおよびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、グアニレートキナーゼ（ＧＭＫ）、および
（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、ピロホスファターゼ、並びにグルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼ、およびグルタメートデヒドロゲナーゼのいずれか；または
（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、ピロホスファターゼ、並びにグルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼ、およびグルタメートデヒドロゲナーゼのいずれか；
を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）
（ａ）Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること、
または
Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、グルコキナーゼによって触媒されてマンノース－６－ホスフェート（Ｍａｎ－６－Ｐ）を形成すること、およびマンノース－６－ホスフェートから、ホスホマンノムターゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること；
（ｂ１）グアノシン、およびアデノシントリホスフェートから、グアノシンキナーゼによって触媒されてグアノシンモノホスフェート（ＧＭＰ）を形成すること；
（ｂ２’）グアノシンモノホスフェート、およびポリホスフェートから、グアニレートキナーゼ（ＧＭＫ）によって触媒されてグアノシンジホスフェート（ＧＤＰ）を形成すること、
（ｂ２’’）グアノシンジホスフェート、およびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）を形成すること；および
（ｃ’）Ｄ－マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼの存在下で、マンノース－１－ホスフェートをグアノシントリホスフェートと反応させてＧＤＰ－マンノースにすること、
（ｃ’’）ピロホスファターゼの存在下でピロホスフェートをホスフェートに変換すること、
（ｄ）ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼによって触媒されてＧＤＰ－マンノースからＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースを形成すること；および
（ｅ）ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼによって触媒されてＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースおよびＮＡＤＰＨからＧＤＰ－フコースを形成すること；および
（ｆ）グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼ、およびグルタメートデヒドロゲナーゼのいずれかによって触媒されて、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨを再生すること
によって、
酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、および共溶媒、好ましくは、ジメチルスルホキシド、の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含む。

【0162】

本明細書に記述のグアノシンおよびＤ－マンノースからＧＤＰ－フコースを生成するための本発明の方法における副産物ＮＡＤＰ^＋の再利用のために、より少量のＮＡＤＰＨが、ステップＡ）において提供される溶液において必要とされる。したがって、一実施形態において、ＮＡＤＰＨのＤ－マンノースに対するモル比は、０．０１～０．５、より好ましくは０．０２～０．５、より好ましくは０．０３～０．４、より好ましくは０．０３～０．３、および最も好ましくは０．０５～０．２である。一実施形態において、ＮＡＤＰＨのＤ－マンノースに対するモル比は０．０５である。一実施形態において、ＮＡＤＰＨのＤ－マンノースに対するモル比は０．１である。一実施形態において、ＮＡＤＰＨのＤ－マンノースに対するモル比は０．２である。一実施形態において、ＮＡＤＰＨのＤ－マンノースに対するモル比は０．５である。

【0163】

ＧＤＰ－フコースを生成するための本発明の方法は、固定化された酵素のセットを用いて実施することもできる。酵素は、その後、例えば、固体支持体が酵素の活性、基質特異性、立体選択性、および／または他の特性を保持するように固体支持体に固定化される。適切な固体支持体は、例えば、ビーズ、モノリス、球体、粒子、粒子床、繊維マット、顆粒、ゲル、膜、中空繊維膜、混合マトリックス膜、面または他の固相材料である。一実施形態において、各酵素、すなわち、グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、および任意にピロホスファターゼは、固体支持体上に固定化される。更なる実施形態において、各酵素、すなわち、グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ、任意にピロホスファターゼ、任意にグアニレートキナーゼ、並びに任意にグルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびグルメートデヒドロゲナーゼから選択される酵素は、固体支持体上に固定化される。更なる実施形態において、各酵素、すなわち、グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼ、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ、任意にピロホスファターゼ、任意にグアニレートキナーゼ、並びにグルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびグルタメートデヒドロゲナーゼから選択される酵素は、固体支持体上に固定化される。

【0164】

一実施形態において、酵素セットのうちのいくつかの酵素のみが、固体支持体上に固定化される。更なる実施形態において、グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼまたはポリホスフェートキナーゼの組み合わせ、例えば、１Ｄおよび２Ｄ－ｐｐｋ２およびｐｐｋ３など、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、および任意にピロホスファターゼ、を含む酵素のセットから選択される一つの酵素のみが、固体支持体上に固定化される。さらに他の実施形態において、グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、および任意にピロホスファターゼを含む酵素セットから選択される少なくとも１つの酵素は、固体支持体上に固定化される。好ましくは、ポリホスフェートキナーゼは、固体支持体上に固定化される。好ましくは、グアノシンキナーゼは、固体支持体上に固定化される。好ましくは、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼは、固体支持体上に固定化される。好ましくは、ピロホスファターゼは、固体支持体上に固定化される。

【0165】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法にも関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含み、
ここで、酵素セットは、固体支持体上に結合、または固定化される。

【0166】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法にも関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含み、
ここで、酵素セットは、固体支持体上に結合、または固定化される。

【0167】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法にも関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、および（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、ＮＡＤＰＨおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含み、
ここで、酵素セットは、固体支持体上に結合、または固定化される。

【0168】

さらに、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、ピロホスファターゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含み、
ここで、酵素セットは、固体支持体上に結合、または固定化される。

【0169】

さらに、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、およびピロホスファターゼを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含み、
ここで、酵素セットは、固体支持体上に固定化される。

【0170】

さらに、本発明は、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、ピロホスファターゼ、および（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、および共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含み、
ここで、酵素セットは、固体支持体上に固定化される。

【0171】

本発明は更に、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含み、
ここで、酵素セットの少なくとも一つの酵素は、固体支持体上に固定化される。

【0172】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法にも関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含み、
ここで、酵素セットの少なくとも一つの酵素は、固体支持体上に固定化される。

【0173】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法にも関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびグルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、またはＮ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、および共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含み、
ここで、酵素セットの少なくとも一つの酵素は、固体支持体上に固定化される。

【0174】

好ましくは、本明細書に記述される本発明の方法において使用される酵素は、固体支持体上に共固定化される。限られた空間内に連続的に作用する酵素の固定化は、基質の拡散時間の劇的な減少のため、変換の触媒効率を向上させる。さらに、基質のインサイチュ（ｉｎ－ｓｉｔｕ）形成は、動的な増強につながる高い局所濃度を生成し、実質的なコスト削減に相当する可能性がある。共固定化は、通常、固体支持体上に固定化する前に酵素を混合することによって達成される。

【0175】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法にも関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含み、
ここで、酵素セットは、固体支持体上に共固定化される。

【0176】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法にも関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含み、
ここで、酵素セットは、固体支持体上に共固定化される。

【0177】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法にも関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、並びにグルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、またはＮ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、および共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含み、
ここで、酵素セットは、固体支持体上に共固定化される。

【0178】

本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法にも関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む固体支持体上に共固定化された酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む固体支持体上に共固定化された酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含む。

【0179】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法にも関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、を含む固体支持体上に共固定化された酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含む。

【0180】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法にも関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、並びにグルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、またはＮ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ、を含む固体支持体上に共固定化された酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、および共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含む。

【0181】

本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法にも関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む固体支持体上に共固定化された酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む固体支持体上に共固定化された酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含み、
ここで、共溶媒は、ジメチルスルホキシドである。

【0182】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法にも関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む固体支持体上に共固定化された酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含み、
ここで、共溶媒は、ジメチルスルホキシドである。

【0183】

したがって、本発明は、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法にも関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、並びにグルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、またはＮ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ、を含む固体支持体上に共固定化された酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、および共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含み、
ここで、共溶媒は、ジメチルスルホキシドである。

【0184】

本発明は更に、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む固体支持体上に共固定化された酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む固体支持体上に共固定化された酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含み、
ここで、固体支持体は、ビーズ、モノリス、球体、粒子、粒子床、繊維マット、顆粒、ゲル、膜、中空繊維膜、混合マトリックス膜、または面の形態を有する。

【0185】

当該実施形態において、固定化酵素は、グアノシンおよびＬ－フコースからのグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースの生成を促進することができ、反応が完了した後、固定化酵素は容易に保持され（例えば、ビーズを保持することによってビーズ上で酵素は固定化される）、その後、後続の実行において再使用または再利用される。当該固定化された生体触媒工程は、更なる効率性およびコスト削減を可能にする。さらに、本発明の方法を、ステップＡ）の供給溶液を、固体支持体上に固定化された酵素セットを含む反応器に通すことによって、連続的に行うことができる。

【0186】

したがって、一実施形態において、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む供給溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む固体支持体上に固定化された酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む固体支持体上に固定化された酵素セットを提供すること、ここで固定化された酵素セットを含む固体支持体は、化学反応器に位置しており；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、固定化された酵素セットを含む固体支持体を有する反応器を介して、ステップＡ）からの供給溶液を連続的に通すことによって、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含む。

【0187】

さらに、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む供給溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む固体支持体上に共固定化された酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む固体支持体上に共固定化された酵素セットを提供すること、ここで、共固定化された酵素セットを含む固体支持体は、化学反応器に位置しており；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、共固定化された酵素セットを含む固体支持体を有する化学反応器を介して、ステップＡ）からの供給溶液を連続的に通すことによって、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
を含み、
ここで、共溶媒はジメチルスルホキシドである。

【0188】

したがって、グアノシンおよびＬ－フコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む供給溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、を含む固体支持体上に共固定化された酵素セットを提供すること、ここで、共固定化された酵素セットを含む固体支持体は、化学反応器に位置しており、
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、共固定化された酵素セットを含む固体支持体を持っている化学反応器を介して、ステップＡ）からの供給溶液を連続的に通すことによって、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含み、
ここで、共溶媒は、ジメチルスルホキシドである。

【0189】

したがって、グアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ Ｄ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む供給溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、並びに（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む固体支持体上に共固定化された酵素セットを提供すること、ここで、共固定化された酵素セットを含む固体支持体は、化学反応器に位置しており、
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、および共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、共固定化された酵素セットを含む固体支持体を有する化学反応器を介して、ステップＡ）からの供給溶液を連続的に通すことによって、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含み、
ここで、共溶媒は、ジメチルスルホキシドである。

【0190】

酵素固定化の方法は、当該技術分野でよく知られている。酵素は、例えば、吸着、共有結合、イオン結合、金属結合、架橋または結晶化など、非共有結合的にまたは共有結合的に結合されることができる。酵素を固体支持体（例えば、樹脂、膜、ビーズ、ガラスなど）に共役および固定化するための様々な方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、Ｙｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００７，４２，８９５；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００７，７６，８４３；Ｋｏｓｚｅｌｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２０１０，６３，３９；Ｔｒｕｐｐｏ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２０１１，１５，１０３３；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２００８）；Ｍａｔｅｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，２００２，１８，６２９；およびＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃ．Ｍ．Ｎｉｅｍｅｙｅｒ ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００４）、などに記述される。

【0191】

本明細書に記述される本発明の方法において使用される酵素は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌からの組換え方法によって調製されることができる。細胞溶解から得られた酵素含有溶液は、通常、遠心分離され、濾過されて細胞残屑を除去し、固体支持体上に酵素を固定化するために直接使用されることができる。したがって、更なる精製ステップまたは単離ステップは必要なく、粗細胞溶解物を、酵素が酵素活性、基質特異性、立体選択性および／または他の特性を保持するように酵素を固体支持体に固定化するために使用することができる。

【0192】

したがって、本発明は更に、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む固体支持体上に固定化された酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む固体支持体上に固定化された酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含み、
ここで、細胞溶解物からの酵素セットは、固体支持体上に固定化される。

【0193】

さらに、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む固体支持体上に固定化された酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む固体支持体上に固定化された酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含み、
ここで、細胞溶解物からの酵素セットは、固体支持体上に固定化される。

【0194】

さらに、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、任意にピロホスファターゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む固体支持体上に共固定化された酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む固体支持体上に共固定化された酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含み、
ここで、細胞溶解物からの酵素セットは、固体支持体上に共固定化される。

【0195】

さらに、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、任意にピロホスファターゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む固体支持体上に共固定化された酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む固体支持体上に共固定化された酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含み、ここで、細胞溶解物からの酵素セットは、固体支持体上に共固定化され、および共溶媒は、ジメチルスルホキシドである。

【0196】

さらに、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、任意にピロホスファターゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含み、
ここで、細胞溶解物からの酵素セットのうち少なくとも一つの酵素は、固体支持体上に共固定化される。

【0197】

本発明の方法において使用される酵素を固定化するのに有用な固体支持体は、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、エチレンジアミン官能基を有するポリメタクリレート、エポキシ官能基を有するポリアクリル酸、アニオン性／アミノＣ６スペーサー官能基を有するポリアクリル酸、アニオン性／三級アミン官能基を有するポリアクリル酸、アニオン性／四級アミン官能基を有するポリスチレン、カチオン性／スルホン官能基を有するポリスチレン、カルボン酸エステル官能基を有するポリアクリル酸、フェニル官能基を有するポリスチレン、オクタデシル官能基を有するポリメタクリレート、スチレン／メチル官能基を有するポリスチレン、Ｎｉ－ＮＴＡ官能基を有する磁性シリカ粒子、または磁鉄鉱コアとＮｉ－ＮＴＡ官能基を有するデキストラン殻とを有する磁性ナノ粒子、を含むビーズまたは樹脂を含むが、これらに限定されない。本発明の方法において使用される酵素を固定化するのに有用な例示的な固体支持体は、セパビーズ（レジンディオン社（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ））：ＥＣ－ＥＰ、ＥＰ４０３／Ｍ、ＥＣ－ＨＦＡ、ＥＣ－ＥＡ／ＭおよびＥＣ－ＨＡ；イムモビーズ（ｉｍｍｏｂｅａｄｓ）（キラルビジョン社（ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ））ＩＢ－ＣＯＶ１、ＩＢ－ＣＯＶ２、ＩＢ－ＣＯＶ３、ＩＢ－ＡＮＩ１、ＩＢ－ＡＮＩ２、ＩＢ－ＡＮＩ３、ＩＢ－ＡＮＩ４、ＩＢ－ＣＡＴ１、ＩＢ－ＡＤＳ１、ＩＢ－ＡＤＳ２、ＩＢ－ＡＤＳ３、およびＩＢ－ＡＤＳ４；ユーパージット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）（ローム社（Ｒｏｈｍ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ））および磁性粒子（マイクロモッド社（ｍｉｃｒｏｍｏｄ ＧｍｂＨ）：ナノ－マグ（Ｎａｎｏ－ｍａｇ）、サイキャスター（Ｓｉｃａｓｔａｒ）－６およびサイキャスター（Ｓｉｃａｓｔａｒ）－１．５、を含むが、これらに限定されない。

【0198】

好ましくは、固体支持体は：セパビーズ（レジンディオン社（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ））：ＥＣ－ＥＰ、ＥＰ４０３／Ｍ、ＥＣ－ＥＡ／ＭおよびＥＣ－ＨＡ；イムモビーズ（ｉｍｍｏｂｅａｄｓ）（キラルビジョン社（ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ））ＩＢ－ＣＯＶ１、ＩＢ－ＣＯＶ２、ＩＢ－ＣＯＶ３、ＩＢ－ＡＮＩ１、ＩＢ－ＣＡＴ１、ＩＢ－ＡＤＳ１、ＩＢ－ＡＤＳ２、ＩＢ－ＡＤＳ３、およびＩＢ－ＡＤＳ４；ユーパージット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）（ローム社（Ｒｏｈｍ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ））および磁性粒子（マイクロモッド社（ｍｉｃｒｏｍｏｄ ＧｍｂＨ）：ナノ－マグ（Ｎａｎｏ－ｍａｇ）、サイキャスター（Ｓｉｃａｓｔａｒ）－６およびサイキャスター（Ｓｉｃａｓｔａｒ）－１．５、から選択される樹脂またはビーズからなる。

【0199】

したがって、本発明は更に、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む固体支持体上に固定化された酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む固体支持体上に固定化された酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含み、
ここで、固体支持体は：セパビーズ：ＥＣ－ＥＰ、ＥＰ４０３／Ｍ、ＥＣ－ＥＡ／ＭおよびＥＣ－ＨＡ；イムモビーズ（ｉｍｍｏｂｅａｄｓ）：ＩＢ－ＣＯＶ１、ＩＢ－ＣＯＶ２、ＩＢ－ＣＯＶ３、ＩＢ－ＡＮＩ１、ＩＢ－ＣＡＴ１、ＩＢ－ＡＤＳ１、ＩＢ－ＡＤＳ２、ＩＢ－ＡＤＳ３、およびＩＢ－ＡＤＳ４；ユーパージット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）および磁性粒子：ナノ－マグ（Ｎａｎｏ－ｍａｇ）、サイキャスター（Ｓｉｃａｓｔａｒ）－６およびサイキャスター（Ｓｉｃａｓｔａｒ）－１．５、から選択される樹脂またはビーズからなる。

【0200】

更に、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に更に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む固体支持体上に固定化された酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む固体支持体上に固定化された酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含み、
ここで、固体支持体は：セパビーズ：ＥＣ－ＥＰ、ＥＰ４０３／Ｍ、ＥＣ－ＥＡ／ＭおよびＥＣ－ＨＡ；イムモビーズ（ｉｍｍｏｂｅａｄｓ）：ＩＢ－ＣＯＶ１、ＩＢ－ＣＯＶ２、ＩＢ－ＣＯＶ３、ＩＢ－ＡＮＩ１、ＩＢ－ＣＡＴ１、ＩＢ－ＡＤＳ１、ＩＢ－ＡＤＳ２、ＩＢ－ＡＤＳ３、およびＩＢ－ＡＤＳ４；ユーパージット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）および磁性粒子：ナノ－マグ（Ｎａｎｏ－ｍａｇ）、サイキャスター（Ｓｉｃａｓｔａｒ）－６およびサイキャスター（Ｓｉｃａｓｔａｒ）－１．５、から選択される樹脂またはビーズから成り；および
ここで、共溶媒は、ジメチルスルホキシドである。

【0201】

更に、本発明は、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に更に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む固体支持体上に固定化された酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む固体支持体上に固定化された酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、を含み、
ここで、固体支持体は、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、エチレンジアミン官能基を有するポリメタクリレート、エポキシ官能基を有するポリアクリル酸、アニオン性／アミノＣ６スペーサー官能基を有するポリアクリル酸、アニオン性／三級アミン官能基を有するポリアクリル酸、アニオン性／四級アミン官能基を有するポリスチレン、カチオン性／スルホン官能基を有するポリスチレン、カルボン酸エステル官能基を有するポリアクリル酸、フェニル官能基を有するポリスチレン、オクタデシル官能基を有するポリメタクリレート、スチレン／メチル官能基を有するポリスチレン、Ｎｉ－ＮＴＡ官能基を有する磁性シリカ粒子、または磁鉄鉱コアとＮｉ－ＮＴＡ官能基を有するデキストラン殻とを有する磁性ナノ粒子、を含むビーズまたは樹脂からなる。

【0202】

本発明の更なる実施形態において、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、付加的なステップＣ）：
Ｃ）グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを単離すること
を含む。

【0203】

本発明の更なる実施形態において、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、付加的なステップＣ）：
Ｃ）グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを、イオン交換クロマトグラフィーによって単離すること
を含む。

【0204】

したがって、本発明は更に、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
Ｃ）グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを単離すること、
を含む。

【0205】

したがって、本発明は更に、グアノシンおよびＬ－フコースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法に関し、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること；および
Ｃ）グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを単離すること、
を含む。

【0206】

好ましくは、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか；およびピロホスファターゼ、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
Ｃ）グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを単離すること、
を含む。

【0207】

好ましくは、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＬ－フコースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ；およびピロホスファターゼを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
Ｃ）グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを単離すること、
を含む。

【0208】

好ましくは、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、任意にピロホスファターゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
Ｃ）グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを単離すること、
を含み、
ここで、酵素セットのうちの少なくとも一つの酵素は、固体支持体上に固定化される。

【0209】

好ましくは、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか；および任意にピロホスファターゼ、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
Ｃ）グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを単離すること、
を含む。

【0210】

好ましくは、グアノシンおよびＬ－フコースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ；および任意にピロホスファターゼを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること；および
Ｃ）グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを単離すること、
を含む。

【0211】

好ましくは、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、任意にピロホスファターゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む共固定化された酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む共固定化された酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること；および
Ｃ）グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを単離すること、
を含み、
ここで、細胞溶解物からの酵素セットは、固体支持体上に共固定化される。

【0212】

好ましくは、グアノシンおよびＬ－フコースから、またはグアノシンおよびＤ－マンノースからグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか；およびピロホスファターゼを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
Ｃ）グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを単離すること、
を含み、
ここで、共溶媒は、ジメチルスルホキシドである。

【0213】

好ましくは、共溶媒の量は、ステップＡ）において提供される溶液の総体積に基づいて、０．０１ｖｏｌ％から３０ｖｏｌ％である。好ましくは、共溶媒はジメチルスルホキシドであり、ジメチルスルホキシドの量は、ステップＡ）において提供される溶液の総体積に基づいて、０．０１ｖｏｌ％から３０ｖｏｌ％である。

【0214】

好ましくは、ポリホスフェートは、少なくとも２５個のホスフェート残基を有する長鎖ポリホスフェートである。
好ましくは、ステップＡ）において提供される溶液のグアノシンおよびＬ－フコースの濃度、またはグアノシンおよびＤ－マンノースの濃度は、０．２ｍＭから５，０００ｍＭの範囲である。

【0215】

好ましくは、グアノシンおよびＬ－フコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成する方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ；および任意にピロホスファターゼを含む酵素セット提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること；および
Ｃ）グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを単離すること、
を含み、
ここで、共溶媒は、ジメチルスルホキシドである。

【0216】

好ましくは、共溶媒の量は、ステップＡ）において提供される溶液の総体積に基づいて、０．０１ｖｏｌ％から３０ｖｏｌ％である。好ましくは、共溶媒はジメチルスルホキシドであり、ジメチルスルホキシドの量は、ステップＡ）において提供される溶液の総体積に基づいて、０．０１ｖｏｌ％から３０ｖｏｌ％である。

【0217】

好ましくは、ポリホスフェートは、少なくとも２５個のホスフェート残基を有する長鎖ポリホスフェートである。
好ましくは、ステップＡ）において提供される溶液のグアノシンおよびＬ－フコースの濃度は、０．２ｍＭから５，０００ｍＭの範囲である。

【0218】

フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチド、およびフコシル化小分子、例えば、ステビアなど。

【0219】

本発明の更なる態様において、本明細書に記載の本発明の方法は、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチドまたはフコシル化小分子、例えば、ステビアなど、を生成するために有用である。

【0220】

したがって、本発明の一実施形態において、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチドまたはフコシル化小分子、を生成するため方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、および
Ｄ）フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースおよびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子から、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースとサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子の利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチド、またはフコシル化小分子、を生成すること、
を含む。

【0221】

したがって、本発明の一実施形態において、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチドまたはフコシル化小分子、を生成するため方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、およびＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること；および
Ｄ）フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースおよびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子から、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースとサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子の利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチド、またはフコシル化小分子、を生成すること、を含む。

【0222】

したがって、本発明の一実施形態において、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチドまたはフコシル化小分子、を生成するため方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびマンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること；および
Ｄ）フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースおよびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子から、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースとサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子の利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチド、またはフコシル化小分子、を生成すること、を含む。

【0223】

本発明の一実施形態において、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチドまたはフコシル化小分子、を生成するため方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること；および
Ｃ）グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを単離すること；および
Ｄ）フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースおよびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子から、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースとサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子の利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチド、またはフコシル化小分子、を生成すること、を含む。

【0224】

本発明の一実施形態において、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチドまたはフコシル化小分子、を生成するため方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること；
Ｃ）グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを単離すること；および
Ｄ）フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースおよびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子から、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースとサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子の利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチド、またはフコシル化小分子、を生成すること、を含む。

【0225】

本発明の一実施形態において、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチドまたはフコシル化小分子、を生成するため方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、および（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびマンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること；
Ｃ）グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを単離すること；および
Ｄ）フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースおよびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子から、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースとサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子の利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチド、またはフコシル化小分子、を生成すること、を含む。

【0226】

フコシルトランスフェラーゼは、ＧＤＰ－フコースとサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子の利用可能なヒドロキシル基との反応を触媒することによって、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチドまたはフコシル化小分子、および副産物としてのグアノシンジホスフェート（ＧＤＰ）を形成する。ステップＢ）、特にステップ（ｂ２’）で形成された中間生成物であるＧＤＰは、その後、再使用または再利用されることができる。

【0227】

したがって、本発明の一実施形態において、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチドまたはフコシル化小分子、を生成するため方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、およびＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）
（ａ）Ｌ－フコースおよびアデノシントリホスフェートから、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼによって触媒されてフコース－１－ホスフェートを形成すること、
（ｂ１）グアノシン、およびアデノシントリホスフェートから、グアノシンキナーゼによって触媒されてグアノシンモノホスフェートを形成すること；
（ｂ２’）グアノシンモノホスフェートおよびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシンジホスフェートを形成すること
（ｂ２’’）グアノシンジホスフェートおよびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシントリホスフェートを形成すること；および
（ｃ）Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼの存在下で、フコース－１－ホスフェートをグアノシントリホスフェートと反応させてＧＤＰ－フコースにすること；
によって、酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること；
Ｄ）フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースおよびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子から、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースとサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子の利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチド、またはフコシル化小分子、を生成すること；および
Ｅ）グアノシントリホスフェートを形成するためにインサイチュ（ｉｎ－ｓｉｔｕ）形成されたグアノシンジホスフェートを再利用すること、
を含む。

【0228】

したがって、本発明の一実施形態において、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチドまたはフコシル化小分子、を生成するため方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、および（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、およびピロホスファターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）
（ａ）Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること
または
Ｄ－マンノースおよびアデノシントリホスフェートから、グルコキナーゼによって触媒されてマンノース－６－ホスフェート（Ｍａｎ－６－Ｐ）を形成すること、およびマンノース－６－ホスフェートから、ホスホマンノムターゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）を形成すること
（ｂ１）グアノシン、およびアデノシントリホスフェートから、グアノシンキナーゼによって触媒されてグアノシンモノホスフェート（ＧＭＰ）を形成すること；
（ｂ２’）グアノシンモノホスフェートおよびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシンジホスフェート（ＧＤＰ）を形成すること
（ｂ２’’）グアノシンジホスフェートおよびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されてグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）を形成すること；および
（ｃ’）Ｄ－マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼの存在下で、マンノース－１－ホスフェートをグアノシントリホスフェートと反応させてＧＤＰ－マンノースにすること
（ｃ’’）ピロホスファターゼの存在下でピロホスフェートをホスフェートに変換すること、
（ｄ）ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼによって触媒されてＧＤＰ－マンノースからＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースを形成すること；および
（ｅ）ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼによって触媒されてＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースおよびＮＡＤＰＨからＧＤＰ－フコースを形成すること、
によって、酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること；
Ｄ）フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースおよびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子から、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースとサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子の利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチド、またはフコシル化小分子、を生成すること；および
Ｅ）グアノシントリホスフェートを形成するためにインサイチュ（ｉｎ－ｓｉｔｕ）形成されたグアノシンジホスフェートを再利用すること、
を含む。

【0229】

本明細書に記述の本発明のフコシル化法における副産物グアノシンジホスフェートの再利用のために、より少量のグアノシンがステップＡ）において提供される溶液で必要とされる。したがって、一実施形態において、グアノシンのＬ－フコースに対するモル比、またはグアノシンのＤ－マンノースに対するモル比は、０．０１～０．５、より好ましくは０．０２～０．５、より好ましくは０．０３～０．４、より好ましくは０．０３～０．３、および最も好ましくは０．０５～０．２である。一実施形態において、グアノシンのＬ－フコースに対するモル比、またはグアノシンのＤ－マンノースに対するモル比は、０．０５である。一実施形態において、グアノシンのＬ－フコースに対するモル比、またはグアノシンのＤ－マンノースに対するモル比は、０．１である。一実施形態において、グアノシンのＬ－フコースに対するモル比、またはグアノシンのＤ－マンノースに対するモル比は、０．２である。一実施形態において、グアノシンのＬ－フコースに対するモル比、またはグアノシンのＤ－マンノースに対するモル比は、０．５である。

【0230】

好ましくは、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチドまたはフコシル化小分子、を生成するため方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
Ｄ）フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－ｌ－フコースおよびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子から、グアノシン５’－ジホスホ－β－ｌ－フコースとサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子の利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチド、またはフコシル化小分子、を生成すること、
Ｆ）フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチド、またはフコシル化小分子、を単離すること、を含む。

【0231】

好ましくは、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチドまたはフコシル化小分子、を生成するため方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、およびＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること；
Ｄ）フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－ｌ－フコースおよびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子から、グアノシン５’－ジホスホ－β－ｌ－フコースとサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子の利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチド、またはフコシル化小分子、を生成すること；および
Ｆ）フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチド、またはフコシル化小分子、を単離すること、を含む。

【0232】

好ましくは、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチドまたはフコシル化小分子、を生成するため方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
Ｃ）グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを単離すること；および
Ｄ）フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－ｌ－フコースおよびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子から、グアノシン５’－ジホスホ－β－ｌ－フコースとサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子の利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチド、またはフコシル化小分子、を生成すること、を含み、
ここで、共溶媒は、ジメチルスルホキシドである。

【0233】

好ましくは、共溶媒の量は、ステップＡ）において提供される溶液の総体積に基づいて、０．０１ｖｏｌ％から３０ｖｏｌ％である。好ましくは、共溶媒はジメチルスルホキシドであり、ジメチルスルホキシドの量は、ステップＡ）において提供される溶液の総体積に基づいて、０．０１ｖｏｌ％から３０ｖｏｌ％である。

【0234】

好ましくは、ポリホスフェートは、少なくとも２５個のホスフェート残基を有する長鎖ポリホスフェートである。
好ましくは、ステップＡ）において提供される溶液のグアノシンおよびＬ－フコースの濃度、またはグアノシンおよびＤ－マンノースの濃度は、０．２ｍＭから５，０００ｍＭの範囲である。

【0235】

好ましくは、酵素セット中の酵素の濃度は、ステップＡ）において提供される溶液の総体積に基づいて、０．０００１ｍｇ／ｍＬから１００ｍｇ／ｍＬの間である。

【0236】

好ましくは、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチドまたはフコシル化小分子、を生成するため方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、およびＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること；および
Ｄ）フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－ｌ－フコースおよびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子から、グアノシン５’－ジホスホ－β－ｌ－フコースとサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子の利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチド、またはフコシル化小分子、を生成すること
、を含み、
ここで、共溶媒は、ジメチルスルホキシドである。

【0237】

好ましくは、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチドまたはフコシル化小分子、を生成するため方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、および（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびマンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること；および
Ｄ）フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－ｌ－フコースおよびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子から、グアノシン５’－ジホスホ－β－ｌ－フコースとサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子の利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチド、またはフコシル化小分子、を生成すること、を含み、
ここで、共溶媒は、ジメチルスルホキシドである。

【0238】

好ましくは、共溶媒の量は、ステップＡ）において提供される溶液の総体積に基づいて、０．０１ｖｏｌ％から３０ｖｏｌ％である。好ましくは、共溶媒はジメチルスルホキシドであり、ジメチルスルホキシドの量は、ステップＡ）において提供される溶液の総体積に基づいて、０．０１ｖｏｌ％から３０ｖｏｌ％である。

【0239】

好ましくは、ポリホスフェートは、少なくとも２５個のホスフェート残基を有する長鎖ポリホスフェートである。
好ましくは、ステップＡ）において提供される溶液のグアノシンおよびＬ－フコースの濃度は、０．２ｍＭから５，０００ｍＭの範囲である。

【0240】

好ましくは、酵素セット中の酵素の濃度は、ステップＡ）において提供される溶液の総体積に基づいて、０．０００１ｍｇ／ｍＬから１００ｍｇ／ｍＬの間である。

【0241】

好ましくは、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチドまたはフコシル化小分子、を生成するため方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか；およびピロホスファターゼを含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
Ｃ）グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを単離すること；および
Ｄ）フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－ｌ－フコースおよびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子から、グアノシン５’－ジホスホ－β－ｌ－フコースとサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子の利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチド、またはフコシル化小分子、を生成すること、を含む。

【0242】

好ましくは、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチドまたはフコシル化小分子、を生成するため方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、およびピロホスファターゼ、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること；および
Ｄ）フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－ｌ－フコースおよびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子から、グアノシン５’－ジホスホ－β－ｌ－フコースとサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子の利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチド、またはフコシル化小分子、を生成すること
、を含む。

【0243】

好ましくは、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチドまたはフコシル化小分子、を生成するため方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること；および
Ｄ）フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－ｌ－フコースおよびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子から、グアノシン５’－ジホスホ－β－ｌ－フコースとサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子の利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチド、またはフコシル化小分子、を生成すること、を含み、
ここで、酵素セットのうちの少なくとも一つの酵素は、固体支持体上に固定化される。

【0244】

一実施形態において、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチドまたはフコシル化小分子、を生成するため方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、および任意にピロホスファターゼ、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること；および
Ｄ）フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－ｌ－フコースおよびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子から、グアノシン５’－ジホスホ－β－ｌ－フコースとサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子の利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチド、またはフコシル化小分子、を生成すること
、を含み、
ここで、酵素セットのうちの少なくとも一つの酵素は、固体支持体上に固定化される。

【0245】

一実施形態において、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチドまたはフコシル化小分子を生成するため方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、並びにグルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、またはＮ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること；および
Ｄ）フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－ｌ－フコースおよびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子から、グアノシン５’－ジホスホ－β－ｌ－フコースとサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子の利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、フコシル化サッカリド、フコシル化糖ペプチド、フコシル化糖タンパク質、フコシル化タンパク質、フコシル化ペプチド、またはフコシル化小分子を生成すること、を含み、
ここで、酵素セットのうちの少なくとも一つの酵素は、固体支持体上に固定化される。

【0246】

一実施形態において、フコシル化ミルクサッカリドは、本明細書に記述の本発明の方法によって生成される。したがって、一実施形態において、本発明の方法は次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、およびＬ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびフコースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること；および
Ｄ）フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースおよびミルクサッカリドから、グアノシン５’－ジホスホ－β－ｌ－フコースとミルクサッカリドの利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、フコシル化ミルクサッカリドを生成すること、を含む。

【0247】

一実施形態において、フコシル化ミルクサッカリドは、本明細書に記述の本発明の方法によって生成される。したがって、一実施形態において、本発明の方法は次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
Ｄ）フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースおよびミルクサッカリドから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースとミルクサッカリドの利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、フコシル化ミルクサッカリドを生成すること、を含む。

【0248】

好ましくは、フコシル化ミルクサッカリドは、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトース、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩおよびラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩを含む群から選択される（図６参照）。

【0249】

好ましい実施形態では、２’－フコシルラクトースは、本明細書に記載の本発明の方法によって生成される（図１０）。したがって、一実施形態において、本発明の方法は次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
Ｄ）フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースおよびラクトースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースとラクトースの利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、２’－フコシルラクトースを生成すること、を含む。

【0250】

好ましい実施形態において、２’－フコシルラクトースは、本明細書に記述の本発明の方法によって生成される。したがって、一実施形態において、本発明の方法は次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
Ｄ）１型ガラクトシド－アルファ－（１，２）－フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースおよびラクトースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースとラクトースの利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、２’－フコシルラクトースを生成すること、を含む。

【0251】

好ましい実施形態において、２’－フコシルラクトースを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
Ｄ）１型ガラクトシド－アルファ－（１，２）－フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースおよびラクトースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースとラクトースの利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、２’－フコシルラクトースを生成すること；および
Ｅ）グアノシントリホスフェートを形成するためにインサイチュ（ｉｎ－ｓｉｔｕ）形成されたグアノシンジホスフェートを再利用すること、を含む。

【0252】

好ましい実施形態において、３－フコシルラクトースは、本明細書に記述の本発明の方法によって生成される（図１８および図１９）。したがって、一実施形態において、本発明の方法は次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
Ｄ）フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースおよびラクトースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースとラクトースの利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、３－フコシルラクトースを生成すること、を含む。

【0253】

好ましい実施形態において、３－フコシルラクトースは、本明細書に記述の本発明の方法によって生成される。したがって、一実施形態において、本発明の方法は次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
Ｄ）３／４－フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースおよびラクトースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースとラクトースの利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、３－フコシルラクトースを生成すること、を含む。

【0254】

好ましい実施形態において、３－フコシルラクトースは、本明細書に記述の本発明の方法によって生成される。したがって、一実施形態において、本発明の方法は次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、および（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
Ｄ）３／４－フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースおよびラクトースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースとラクトースの利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、３－フコシルラクトースを生成すること、を含む。

【0255】

好ましい実施形態において、３－フコシルラクトースを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＬ－フコースを含み、またはグアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびＬ－フコースの場合、Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼを含む酵素セット、またはＤ－マンノースの場合、（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、もしくは（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＬ－フコースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
Ｄ）３／４－フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースおよびラクトースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースとラクトースの利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、３－フコシルラクトースを生成すること；および
Ｅ）グアノシントリホスフェートを形成するためにインサイチュ（ｉｎ－ｓｉｔｕ）形成されたグアノシンジホスフェートを再利用すること、を含む。

【0256】

本明細書に記載の本発明のフコシル化法における副産物グアノシンジホスフェートの再利用のために、より少量のグアノシンがステップＡ）において提供される溶液で必要とされる。したがって、一実施形態において、グアノシンのＬ－フコースに対するモル比、またはグアノシンのＤ－マンノースに対するモル比は、０．０１～０．５、より好ましくは０．０２～０．５、より好ましくは０．０３～０．４、より好ましくは０．０３～０．３、および最も好ましくは０．０５～０．２である。一実施形態において、グアノシンのＬ－フコースに対するモル比、またはグアノシンのＤ－マンノースに対するモル比は、０．０５である。一実施形態において、グアノシンのＬ－フコースに対するモル比、またはグアノシンのＤ－マンノースに対するモル比は、０．１である。一実施形態において、グアノシンのＬ－フコースに対するモル比、またはグアノシンのＤ－マンノースに対するモル比は、０．２である。一実施形態において、グアノシンのＬ－フコースに対するモル比、またはグアノシンのＤ－マンノースに対するモル比は、０．５である。

【0257】

好ましい実施形態において、本発明の方法は次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、ＮＡＤＰＨ、Ｌ－グルタメート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、グルタメートデヒドロゲナーゼ、および（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
Ｄ）３／４－フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースおよびラクトースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースとラクトースの利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、３－フコシルラクトースを生成すること、
Ｅ）グアノシントリホスフェートを形成するためにインサイチュ（ｉｎ－ｓｉｔｕ）形成されたグアノシンジホスフェートを再利用すること、
Ｆ）グルタメートデヒドロゲナーゼによって触媒されてインサイチュ（ｉｎ－ｓｉｔｕ）形成されたＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨを再生成すること、を含む。

【0258】

好ましい実施形態において、本発明の方法は次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、ＮＡＤＰＨ、Ｄ－グルコース、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、グルコース－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼ、および（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、ＮＡＤＰＨ、Ｄ－グルコースおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、または酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
Ｄ）３／４－フコシルトランスフェラーゼの存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースおよびラクトースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースとラクトースの利用可能なヒドロキシル基との間のＯ－グリコシド結合を形成することによって、３－フコシルラクトースを生成すること、
Ｅ）グアノシントリホスフェートを形成するためにインサイチュ（ｉｎ－ｓｉｔｕ）形成されたグアノシンジホスフェートを再利用すること、
Ｆ）グルタメートデヒドロゲナーゼによって触媒されてインサイチュ（ｉｎ－ｓｉｔｕ）形成されたＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨを再生成すること、を含む。

【0259】

本明細書に記述のグアノシンおよびＤ－マンノースからＧＤＰ－フコースを生成するための本発明の方法における副産物ＮＡＤＰ^＋の再利用のために、より少量のＮＡＤＰＨがステップＡ）において提供される溶液で必要とされる。したがって、一実施形態において、ＮＡＤＰＨのＤ－マンノースに対するモル比は、０．０１～０．５、より好ましくは０．０２～０．５、より好ましくは０．０３～０．４、より好ましくは０．０３～０．３、および最も好ましくは０．０５～０．２である。一実施形態において、ＮＡＤＰＨのＤ－マンノースに対するモル比は、０．０５である。一実施形態において、ＮＡＤＰＨのＤ－マンノースに対するモル比は、０．１である。一実施形態において、ＮＡＤＰＨのＤ－マンノースに対するモル比は、０．２である。一実施形態において、ＮＡＤＰＨのＤ－マンノースに対するモル比は、０．５である。

【0260】

Ｌ－フコースの生産
Ｌ－フコースは（非常に大きな規模において）高価な糖と見なすことができるため、Ｄ－マンノースからのＬ－フコースの合成は、本発明の方法でさらに提供される。第一のＧＤＰ－フコースは、本明細書に記述されているように、Ｄ－マンノースおよびグアノシンから生成される。トランスフェラーゼは可逆的に機能することができるため、その後、任意の受容体を添加せずにフコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．３４４またはＥＣ２．４．１．６９）またはフコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５１）を添加することによって、ＧＤＰ－フコースは加水分解されてフコースになるであろう。反応スキームを図９に示す。したがって、Ｌ－フコースを、例えば、Ｄ－マンノースおよびグアノシンなどの低コストの基質から生成することができる。

【0261】

あるいは、Ｌ－フコースは、実施例１０に記述されるように、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを、８０℃から１００℃の範囲の温度で加熱することによって単に生成される。好ましくは、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを、この温度で０．５～３時間、好ましくは０．５～２時間、より好ましくは０．５～１．５時間、最も好ましくは１時間加熱する。

【0262】

したがって、一実施形態において、Ｌ－フコースは、グアノシンおよびＤ－マンノースから出発して本明細書に記述されるような本発明の方法によって生成される。したがって、一実施形態において、本発明の方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、および（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
Ｄ）フコシルトランスフェラーゼの存在下で、および受容体の非存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースから、Ｌ－フコースを生成すること；またはグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを、８０℃から１００℃の範囲の温度で加熱することによって、Ｌ－フコースを生成すること、を含む。

【0263】

したがって、一実施形態において、Ｌ－フコースは、グアノシンおよびＤ－マンノースから出発して本明細書に記述されるような本発明の方法によって生成される。したがって、一実施形態において、本発明の方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、および（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
Ｄ）１型ガラクトシド－アルファ－（１，２）－フコシルトランスフェラーゼの存在下で、および受容体の非存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースから、Ｌ－フコースを生成すること；またはグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを、８０℃から１００℃の範囲の温度で加熱することによって、Ｌ－フコースを生成すること、を含む。

【0264】

したがって、一実施形態において、本発明の方法は、次のステップ：
Ａ）
（ｉ）グアノシンおよびＤ－マンノースを含み
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート、およびグアノシンを可溶化するための共溶媒、を含む溶液を提供すること；および
グアノシンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、および（ａ）グルコキナーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース－シンターゼ、または（ｂ）Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ、マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼのいずれか、を含む酵素セットを提供すること；
Ｂ）酵素セット、ポリホスフェート、アデノシントリホスフェートおよび共溶媒の存在下でグアノシンおよびＤ－マンノースから、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを生成すること、
Ｄ）１型ガラクトシド－アルファ－（１，２）－フコシルトランスフェラーゼの存在下で、および受容体の非存在下で、グアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースから、Ｌ－フコースを生成すること、またはグアノシン５’－ジホスホ－β－Ｌ－フコースを、８０℃から１００℃の範囲の温度で加熱することによって、Ｌ－フコースを生成すること、および
Ｅ）グアノシントリホスフェートを形成するためにインサイチュ（ｉｎ－ｓｉｔｕ）形成されたグアノシンジホスフェートを再利用すること、を含む。

【0265】

本明細書に記述の本発明のフコシル化方法における副産物グアノシンジホスフェートの再利用のために、より少量のグアノシンがステップＡ）において提供される溶液で必要とされる。したがって、一実施形態において、グアノシンのＬ－フコースに対するモル比、またはグアノシンのＤ－マンノースに対するモル比は、０．０１～０．５、より好ましくは０．０２～０．５、より好ましくは０．０３～０．４、より好ましくは０．０３～０．３、および最も好ましくは０．０５～０．２である。一実施形態において、グアノシンのＬ－フコースに対するモル比、またはグアノシンのＤ－マンノースに対するモル比は、０．０５である。一実施形態において、グアノシンのＬ－フコースに対するモル比、またはグアノシンのＤ－マンノースに対するモル比は、０．１である。一実施形態において、グアノシンのＬ－フコースに対するモル比、またはグアノシンのＤ－マンノースに対するモル比は、０．２である。一実施形態において、グアノシンのＬ－フコースに対するモル比、またはグアノシンのＤ－マンノースに対するモル比は、０．５である。

【0266】

本明細書で使用される用語「受容体」は、フコシルトランスフェラーゼによってフコシル化されることができる、すなわち、本明細書に記述されるようにフコシルトランスフェラーゼによって触媒される反応において基質として作用する、サッカリド、ペプチドまたはタンパク質を含む任意の分子または高分子に関する。したがって、受容体は、水性媒体中でフコシルトランスフェラーゼによるＧＤＰ－フコースの加水分解を防ぐ。特に、受容体は求核性であるグリコシル受容体である。好ましくは、グルコシル受容体は、ＧＤＰ－フコースのフコシル部分と共有グリコシド結合を形成することができる、酸素－、炭素－、窒素－、または硫黄－に基づく求核基を有する。

【0267】

上述の本発明の方法のいずれかにおいて、好ましくは、グルコキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載のアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、ホスホマンノムターゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載のアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載のアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、マンノース－１－ホスフェートグアニルトランスフェラーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載のアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載のアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載のアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、Ｌ－フコキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載のアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、グアノシンキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載のアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、ポリホスフェートキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（２Ｄ－ＰＰＫ２）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（ＰＰＫ３）に記載のアミノ酸配列の少なくとも８５％のいずれかを含み、ピロホスファターゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に記載のアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、グアニレートキナーゼ（ＧＭＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に記載のアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、グルタメートデヒドロゲナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に記載のアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に記載のアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、グルコースデヒドロゲナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に記載のアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、フコシルトランスフェラーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６（３／４ＦＴ）に記載のアミノ酸配列の少なくとも８５％を含む。

【0268】

更に好ましくは、上述の本発明の方法のいずれかにおいて、グルコキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載のアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、ホスホマンノムターゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載のアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載のアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、マンノース－１－ホスフェートグアニルトランスフェラーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載のアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載のアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載のアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、Ｌ－フコキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載のアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、グアノシンキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載のアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、ポリホスフェートキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（２Ｄ－ＰＰＫ２）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（ＰＰＫ３）に記載のアミノ酸配列の少なくとも９０％のいずれかを含み、ピロホスファターゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に記載のアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、グアニレートキナーゼ（ＧＭＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に記載のアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、グルタメートデヒドロゲナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に記載のアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に記載のアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、グルコースデヒドロゲナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に記載のアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、フコシルトランスフェラーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６（３／４ＦＴ）に記載のアミノ酸配列の少なくとも９０％を含む。

【0269】

より好ましくは、上述の本発明の方法のいずれかにおいて、グルコキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載のアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、ホスホマンノムターゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載のアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載のアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、マンノース－１－ホスフェートグアニルトランスフェラーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載のアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載のアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載のアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、Ｌ－フコキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載のアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、グアノシンキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載のアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、ポリホスフェートキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（２Ｄ－ＰＰＫ２）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（ＰＰＫ３）に記載のアミノ酸配列の少なくとも９５％のいずれかを含み、ピロホスファターゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に記載のアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、グアニレートキナーゼ（ＧＭＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に記載のアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、グルタメートデヒドロゲナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に記載のアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に記載のアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、グルコースデヒドロゲナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に記載のアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、フコシルトランスフェラーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６（３／４ＦＴ）に記載のアミノ酸配列の少なくとも９５％を含む。

【0270】

更により好ましくは、上述の本発明の方法のいずれかにおいて、グルコキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載のアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、ホスホマンノムターゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載のアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載のアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、マンノース－１－ホスフェートグアニルトランスフェラーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載のアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載のアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載のアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、Ｌ－フコキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載のアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、グアノシンキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載のアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、ポリホスフェートキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（２Ｄ－ＰＰＫ２）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（ＰＰＫ３）に記載のアミノ酸配列の少なくとも９８％のいずれかを含み、ピロホスファターゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に記載のアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、グアニレートキナーゼ（ＧＭＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に記載のアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、グルタメートデヒドロゲナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に記載のアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に記載のアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、グルコースデヒドロゲナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に記載のアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、フコシルトランスフェラーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６（３／４ＦＴ）に記載のアミノ酸配列の少なくとも９８％を含む。

【0271】

最も好ましくは、上述の本発明の方法のいずれかにおいて、グルコキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載のアミノ酸配列を含み、ホスホマンノムターゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載のアミノ酸配列を含み、Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載のアミノ酸配列を含み、マンノース－１－ホスフェートグアニルトランスフェラーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載のアミノ酸配列を含み、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載のアミノ酸配列を含み、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載のアミノ酸配列を含み、Ｌ－フコキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載のアミノ酸配列を含み、グアノシンキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載のアミノ酸配列を含み、ポリホスフェートキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（２Ｄ－ＰＰＫ２）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（ＰＰＫ３）に記載のアミノ酸配列のいずれかを含み、ピロホスファターゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に記載のアミノ酸配列を含み、グアニレートキナーゼ（ＧＭＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に記載のアミノ酸配列を含み、グルタメートデヒドロゲナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に記載のアミノ酸配列を含み、グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に記載のアミノ酸配列を含み、グルコースデヒドロゲナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に記載のアミノ酸配列を含み、フコシルトランスフェラーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６（３／４ＦＴ）に記載のアミノ酸配列を含む。

【図面の簡単な説明】

【0272】

【図1】ＧＤＰ－フコースを生成するための本発明の方法の反応経路を示し、（ａ）Ｌ－フコースおよびＡＴＰからのフコース－１－ホスフェート（Ｆｕｃ－１－Ｐ）の形成、（ｂ）グアノシンおよびポリホスフェートからのグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）の形成、および（ｃ）フコース－１－ホスフェートとグアノシントリホスフェートとを反応させてＧＤＰ－フコースにすること、からなる。

【図2】ＧＤＰ－フコースを生成するための本発明の方法の例示的な反応スキームを示し、（ａ）フコキナーゼ（９）によって触媒されるＬ－フコースおよびＡＴＰからのフコース－１－ホスフェート（Ｆｕｃ－１－Ｐ）の形成、（ｂ）グアノシンキナーゼ／イノシンキナーゼ（７）およびポリホスフェートキナーゼ（８）によって触媒されるグアノシンおよびポリホスフェートからのグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）の形成、および（ｃ）フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（９）によって触媒されて、フコース－１－ホスフェートとグアノシントリホスフェートとを反応させてＧＤＰ－フコースにすること、からなる。

【図3】ＧＤＰ－フコースを生成するための本発明の方法の例示的な反応スキームを示し、（ａ）グルコキナーゼ（１）およびホスホマンノムターゼ（２）、またはＮ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ（３）のいずれかによって触媒されるＤ－マンノースおよびＡＴＰからのマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）の形成、（ｂ）グアノシンキナーゼ／イノシンキナーゼ（７）およびポリホスフェートキナーゼ（８）によって触媒されるグアノシンおよびポリホスフェートからのグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）の形成、および（ｃ）マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（４）によって触媒されてマンノース－１－ホスフェートとグアノシントリホスフェートとを反応させてＧＤＰ－マンノースにすること、および（ｄ）ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ（５）によって触媒されるＧＤＰ－マンノースからのＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースの形成、および（ｅ）ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ（６）によって触媒されるＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースおよびＮＡＤＰＨからのＧＤＰ－フコースの形成、からなる。

【図4A】本発明の方法によって調製された様々な時点でのＧＤＰ－フコースの濃度を示す（実施例３を参照）。

【図4B】固定化酵素を使用して本発明の方法によって調製された様々な時点でのＧＤＰ－フコースの濃度を示す（実施例５を参照）。

【図5A】ｔ＝０での出発材料のクロマトグラムを示す。

【図5B】４８時間後の反応混合物のクロマトグラムを示す。

【図6】例示的なフコシル化ミルクサッカリドを示す。

【図7】４℃で２４時間インキュベーション後の、固体支持体上に結合された酵素の量を示す（実施例４を参照）。

【図8】固定化酵素と２４時間３０℃で反応させた後に形成されたＧＤＰ－フコースの量を示す（実施例４を参照）。

【図9】グアノシンおよびＤ－マンノースからＬ－フコースを生成するための本発明の方法の例示的な反応スキームを示し、（ａ）グルコキナーゼ（１）およびホスホマンノムターゼ（２）、またはＮ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ（３）のいずれかによって触媒されるＤ－マンノースおよびＡＴＰからのマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）の形成、（ｂ）グアノシンキナーゼ／イノシンキナーゼ（７）およびポリホスフェートキナーゼ（８）によって触媒されるグアノシンおよびポリホスフェートからのグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）の形成、および（ｃ）マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェートとグアノシントリホスフェートとを反応させてＧＤＰ－マンノースにすること、および（ｄ）ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼによって触媒されるＧＤＰ－マンノースからのＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースの形成、および（ｅ）ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼによって触媒されるＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースおよびＮＡＤＰＨからのＧＤＰ－フコースの形成、および受容体分子の非存在下で１型ガラクトシド－アルファ－（１，２）－フコシルトランスフェラーゼによって触媒されるＧＤＰ－Ｌ－フコースからのＬ－フコースの形成、からなる。

【図10】グアノシンおよびＤ－マンノースから２’－フコシルラクトースを生成するための本発明の方法の例示的な反応スキームを示し、（ａ）グルコキナーゼ（１）およびホスホマンノムターゼ（２）、またはＮ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ（３）のいずれかによって触媒されるＤ－マンノースおよびＡＴＰからのマンノース－１－ホスフェート（Ｍａｎ－１－Ｐ）の形成、（ｂ）グアノシンキナーゼ／イノシンキナーゼ（７）およびポリホスフェートキナーゼ（８）によって触媒されるグアノシンおよびポリホスフェートからのグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）の形成、および（ｃ）マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼによって触媒されてマンノース－１－ホスフェートとグアノシントリホスフェートとを反応させてＧＤＰ－マンノースにすること、および（ｄ）ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼによって触媒されるＧＤＰ－マンノースからのＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースの形成、および（ｅ）ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼによって触媒されるＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－アルファ－Ｄ－マンノースおよびＮＡＤＰＨからのＧＤＰ－フコースの形成、および１型ガラクトシドアルファ－（１，２）―フコシルトランスフェラーゼによって触媒されるＧＤＰ－Ｌ－フコースおよびラクトースからの２’－フコシルラクトースの形成、からなる。

【図11A】（Ａ１）実施例６－Ａ１において行われたＧＤＰ－マンノースからＧＤＰ－フコースへの反応カスケード、および（Ａ２）実施例６－Ａ２において行われたグルコースおよびＧ６ＰＤＨの存在下でのＧＤＰ－マンノースからＧＤＰ－フコースへの反応カスケードを示す。反応は、ＮＡＤＰＨ再利用がＧＤＰ－フコースの側に向かって多酵素反応平衡を促進することができることを実証するために行われた。

【図11B】（Ａ３）実施例６－Ａ３において行われたグルタメートおよびＧＬＤＨの存在下でのマンノースおよびＧＴＰからＧＤＰ－フコースへの反応カスケード、を示す。反応は、ＮＡＤＰＨ再利用がＧＤＰ－フコースの側に向かって多酵素反応平衡を促進することができることを実証するために行われた。

【図12】一晩インキュベーション後の反応Ａ１、Ａ２、およびＡ３における反応アリコートのクロマトグラムを示す。クロマトグラム（Ａ１）は、反応平衡がＧＤＰ－マンノースの側に向かっていることを示す。ＮＡＤＰＨ再利用が実行されると、反応平衡はＧＤＰ－フコースに向かって促進されることができる（Ａ２およびＡ３を参照）。

【図13】実施例７において行われたマンノースおよびグアノシンからＧＤＰ－フコースへの反応カスケードからの反応カスケードを示す。

【図14】イオンクロマトグラフィーによって測定された実施例７の反応における反応時間的経過を示す。

【図15】実施例８において行われたマンノースおよびグアノシンからＧＤＰ－フコースへの反応カスケードを示す。

【図16】イオンクロマトグラフィーによって測定された実施例８の反応における反応時間的経過を示す。

【図17】実施例９において行われたマンノースおよびグアノシンから３－フコシルラクトースへの反応カスケードを示す。

【図18】マンノースおよびグアノシンからの３－フコシルラクトースの合成を示す。４８時間の反応時間後に採取した反応アリコート（黒）、および３－フコシルラクトース標準試料の反応クロマトグラムを示す。ピークを、アンペロメトリー検出によって検出した。

【図19】グアノシンおよびフコースからの３－フコシルラクトースの合成を示す（実施例９の反応Ｄ２）。４８時間の反応時間後に採取された反応アリコートのクロマトグラム。ピークを電流測定検出によって検出した。

【図20】Ｄ－マンノースからのＬ－フコースの生成を示す。実施例８における試料の反応物を９５℃で１時間加熱した（実施例１０を参照）。加熱された試料のアリコートを採取し、電流測定検出を伴うイオンクロマトグラフィーによって測定し（黒）、フコース標準（Ｆｕｃ）に対して比較された。

【発明を実施するための形態】

【0273】

以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。実施例に開示される技術は、本発明の実施において良好に機能するために発明者によって発見された技術を表し、したがって、当該実施のための好ましい様式を構成すると見なされることができることを当業者によって理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮して、多くの変更を特定の実施形態において行うことができ、それらは開示され、本発明の精神および範囲から逸脱することなく依然として同様の、または類似の結果を得ることを理解すべきである。

【0274】

本発明の様々な態様における更なる修正および代替的な実施形態は、この明細書を考慮して当業者には明らかになるであろう。したがって、この明細書は、例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実施する一般的な方法を当業者に教示することを目的としている。本明細書に示され、および記述される本発明の形態は、実施形態の例として解釈されるべきであることが理解されるべきである。要素および材料は、本明細書に例示および記述されているものに代替されてもよく、部分および工程を逆にしてもよく、本発明の特定の特徴を独立して利用してもよく、全ては、本発明のこの明細書の利益を有した後、当業者に明らかになるであろう。以下の特許請求の範囲に記載されているように、変更は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記述される要素で行われてもよい。

【0275】

［実施例］
略語および頭字語
ＡＤＰ アデノシン５’－ジホスフェート
ＡＴＰ アデノシン５’－トリホスフェート
Ｆｕｃ Ｌ－フコース
ＧＳＫ グアノシンキナーゼ
ＧＤＰ グアノシン５’－ジホスフェート
ＧＤＨ グルコースデヒドロゲナーゼ；グルコース－１－デヒドロゲナーゼ
ＧＬＤＨ グルタメートデヒドロゲナーゼ
Ｇ６ＰＤＨ グルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼ
ＧＭＤ ＧＤＰ－Ｄ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ
ＧＭＫ グアニレートキナーゼ
ＧＭＰ グアノシン５’－モノホスフェート
ＧＬＫ グルコキナーゼ
ＧＴＰ グアノシン５’－トリホスフェート
ＧＵＯ グアノシン
Ｌａｃ Ｄ－ラクトース
Ｍａｎ Ｄ－マンノース
ＭａｎＢ ホスホマンノムターゼ
ＭａｎＣ マンノース－１－ホスフェートグアニルトランスフェラーゼ
ＮＡＤＰ ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート
ＮＡＤＰＨ 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート
ＮＡＨＫ Ｎ－アセチルヘキソサミン－１－キナーゼ
ポリＰ ポリホスフェート
ＰＰｉ ピロホスフェート
Ｐｉ ホスフェート
ＰＰＫ２ ポリホスフェートキナーゼ２
ＰＰＫ３ ポリホスフェートキナーゼ３
２Ｄ－ＰＰＫ２ ２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２
ＦＫＰ Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ
ＰｍＰｐＡ パスツレラ ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）無機ピロホスファターゼ（ＰＰＡ）
ＷＣＡＧ ＧＤＰ－４－ケト－６－デオキシマンノース－３，５－エピメラーゼ－４－レダクターゼ
３／４ＦＴ α－１－３／４－フコシルトランスフェラーゼ
化学物質および試薬
特に明記しない限り、全ての化学物質および試薬は、シグマ－アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）から得られ、入手可能な最高の純度であった。固体支持体を、レジンディオン社（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ）、キラルビジョン社（ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ）、ローム社（Ｒｏｈｍ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ）、およびマイクロモッド社（ｍｉｃｒｏｍｏｄ ＧｍｂＨ）から得た。

【0276】

実施例１：酵素の調製
酵素ＧＳＫ、ＰＰＫ２、ＦＫＰ、およびＰｍＰｐＡをコードする遺伝子を、表１に記載される標準的な発現ベクターにクローン化した。発現ベクターを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ゴールド（ＤＥ３）に形質転換した。

【0277】

【表1】

【0278】

形質転換体は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加した５００ｍｌの容量のＬＢ培地（溶原性ブロス）でバッフルを備えた１Ｌ振とうフラスコで培養された。培養物を、３７℃でＯＤ_６００＝０．８まで培養した。発現を、培養物に最終濃度０．５ｍＭを有するＩＰＴＧを添加することによって誘導した。発現時間は２０℃で１２～１８時間後に終了した。バイオマスを、６，０００×ｇで１０分間遠心分離することにより、培地から分離した。各酵素の発現の成功を、標準的な操作手順（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ １９７０，２２７，６８０－６８５）に従ってＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。湿潤バイオマスを、－２０℃で保存した。

【0279】

精製のために、一般的に、３０ｍｌの平衡緩衝液を、３ｇの凍結バイオマスに加えた。平衡緩衝液は、ｐＨ７．５でｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル：１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ ＭｎＳＯ_４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、および５ｖｏｌ％グリセロールを含む。撹拌下、４℃で解凍した後、細胞を、氷上で中間冷却しながら、１，０００バールの高圧ホモジナイザー（エマルジフレックス（Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ） Ｃ５、アベスティン社（Ａｖｅｓｔｉｎ Ｉｎｃ．），オタワ，カナダ）に４回通過させることによって破壊した。遠心分離（４５分，２０，０００×ｇ）後、上清を、アマルシャム バイオサインスズ社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ウプサラ，スウェーデン）のＮｉ^２＋セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標）高性能クロマトグラフィー材料を含む平衡化固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラム（１０ｍｌＣＶ）に適用した。結合していないタンパク質を、平衡化緩衝液を使用して洗い流した。固定化されたタンパク質を、溶出バッファーを使用して１ｍｌ画分に溶出した。最後に、酵素溶液を、メルク ミリポア社（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（ダルムシュタット，ドイツ）の５０ｋＤａカットオフを有する遠心フィルターユニットアミコン（登録商標）ウルトラ－１５によって濃縮した。酵素の損失は、限外濾過中に観察されなかった。酵素を、－２０℃で５０％グリセロール中に保存した。タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用してブラッドフォード分析によって測定した（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９７６，７２（１），２４８－２５４）。

【0280】

実施例２：ＧＤＰ－フコースの均一な調製
精製された酵素（表１）を、グアノシン、Ｌ－フコース、ＡＴＰ、ポリホスフェート、およびＨＥＰＥＳ緩衝液と共に混合し、表２に記載されている濃度にした。実験は低結合タンパク質バイアルで実施した。グアノシンは、混合物に添加する前に、６ｖｏｌ％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に可溶化した。反応を、サーモミキサーで、３０℃で実施した。

【0281】

【表2】

【0282】

ほぼ３時間後、基質（グアノシン）のＧＤＰ－フコースへの９０％の変換が得られた（図４Ａを参照）。他の最終生成物は検出されなかった（４８時間後の反応混合物のクロマトグラムを示す図５Ｂを参照）。

【0283】

実施例３：ＧＤＰ－フコースの失敗した合成
ＧＤＰ－フコースの合成を、実施例２に記述されたように行ったが、ＤＭＳＯを添加しなかった。反応を、サーモミキサーで、３０℃で実施し、得られた反応混合物は濁ったままであった。３時間後、基質（グアノシン）のＧＤＰ－フコースへの変換は観察されなかった。

【0284】

この実施例は、２つの酵素経路の単なる組み合わせがＧＤＰ－フコースを提供しないことを示す。
実施例４：固体支持体への酵素の固定化
酵素の複数回の使用を可能にするために、酵素を固体支持体上に固定化した。

【0285】

高圧均質化によって実施例１で得られた細胞溶解物を遠心分離し、濾過し、細胞残屑を除去した。樹脂：セパビーズ（レジンディオン社（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ））、ＥＣ－ＥＰ、ＥＰ４０３／Ｍ、ＥＣ－ＨＦＡ、ＥＣ－ＥＡ／ＭおよびＥＣ－ＨＡ；イムモビーズ（ｉｍｍｏｂｅａｄｓ）（キラルビジョン社（ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ））ＩＢ－ＣＯＶ１、ＩＢ－ＣＯＶ２、ＩＢ－ＣＯＶ３、ＩＢ－ＡＮＩ１、ＩＢ－ＡＮＩ２、ＩＢ－ＡＮＩ３、ＩＢ－ＡＮＩ４、ＩＢ－ＣＡＴ１、ＩＢ－ＡＤＳ１、ＩＢ－ＡＤＳ２、ＩＢ－ＡＤＳ３、およびＩＢ－ＡＤＳ４、ユーパージット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）（ローム社（Ｒｏｈｍ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ））および磁性粒子（マイクロモッド社（ｍｉｃｒｏｍｏｄ ＧｍｂＨ）、ナノ－マグ（Ｎａｎｏ－ｍａｇ）、サイキャスター（Ｓｉｃａｓｔａｒ）－６およびサイキャスター（Ｓｉｃａｓｔａｒ）－１．５を、酵素と共に４℃で２４時間インキュベーションした。

【0286】

タンパク質分析を、ＢＣＡ分析によって行った。総結合タンパク質の結果を図７に示す。
固定化後、酵素を負荷された樹脂を、実施例１に記述されるように緩衝液を用いて洗浄した。樹脂を、表３に示される反応物の溶液と共に、３０℃で２４時間インキュベーションした。

【0287】

【表3】

【0288】

図８に示されるように、ＧＤＰ－フコースの形成を、全ての負荷された樹脂で観察した。
実施例５：磁性粒子上でのＧＤＰ－フコースの不均一な調製
この限りでは、１３５ｍＬのＦＫＰ、４５ｍＬのＰｍＰｐＡ、９０ｍＬのＧＳＫおよび９０ｍＬの２Ｄ－ＰＰＫ２の発酵ブロス（実施例１を参照）を合わせ、１０ｍＭイミダゾールを含む２５ｍＬの緩衝液（実施例１に記述される）中に溶解し、０．５ ｍＬの酵素混合物を得て、酵素混合物を、１２．５ｍｇのサイキャスター（Ｓｉｃａｓｔａｒ）－６磁性樹脂と共にインキュベーションした。１０℃で１時間インキュベーションした後、樹脂を、緩衝液を用いて洗浄し、バイアル内で０．２５ｍＬの試薬溶液と共に混合した（表４参照）。混合物を、３０℃で４８時間インキュベーションした。

【0289】

【表4】

【0290】

４８時間後、基質（グアノシン）からＧＤＰ－フコースへのほぼ定量的な変換（９８％）を得た（図４Ｂを参照）。
実施例６：ＮＡＤＰＨの再利用
ワンポット反応を実施し（表５の反応Ａ１の反応条件を参照）、ＧＤＰ－マンノースからＧＤＰ－フコースへのＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼ（ＧＭＤ，Ｅ．Ｃ．４．２．１．４７）およびＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ（ｗｃａＧ，Ｅ．Ｃ．１．１．１．２７１）触媒反応の平衡は、ＧＤＰ－マンノースの側にあることを示した（図１１－Ａ１および図１２－Ａ１を参照）。この実験において、最初に、酵素を表５に記述される量までバイアルに調剤した。緩衝液、補因子、ＧＤＰ－Ｍａｎ、ＮＡＤＰＨを、この順序で、表５に記述される濃度まで添加した。反応を、１．５ｍＬエッペンドルフバイアルで、３７℃および５５０ｒｐｍで、エッペンドルフサーモミキサーコンフォートで実行した。アリコートを、様々な時点で採取し、および９０℃で３分間加熱することによってクエンチし、イオン交換クロマトグラフィーによって測定した。平衡はＧＤＰ－Ｍａｎ側にあると見ることが可能である（図１２－Ａ１を参照）。

【0291】

反応の平衡をＧＤＰ－Ｆｕｃに向けて推進するために、他の反応への結合を（ＮＡＤＰ^＋が常に除去される方法で）設計する必要がある。反応Ａ２において、酵素Ｇｌｋ、ＰＰＫ３、およびグルコース－６－ホスフェート－デヒドロゲナーゼ（メルク社（Ｍｅｒｃｋ）から購入－１０１６５８７５００１）（Ｇ６ＰＤＨ，Ｅ．Ｃ：１．１．１．４９）を、ＮＡＰＤＨを再利用するために使用し、ＧＤＰ－フコースの収量を増加させた。この実験において、最初に、酵素を表６に記述される量までバイアルに調剤した。酵素の添加後、緩衝液、補因子、ＧＤＰ－Ｍａｎ、ＮＡＤＰＨ、グルコース、ＡＴＰ、およびポリホスフェートを、この順序で、表６に記述される濃度まで添加した。反応を、１．５ｍＬエッペンドルフバイアルで、３７℃および５５０ｒｐｍで、エッペンドルフサーモミキサーコンフォートで実行した。アリコートを、様々な時点で採取し、および９０℃で３分間加熱することによってクエンチし、その後、イオン交換クロマトグラフィーによって測定した。再利用のために、安価な基質のグルコースおよびポリホスフェートを基質として使用する（図１１－Ａ２および図１２－Ａ２を参照）。

【0292】

他の実験を、ＮＡＤＰＨの再生、およびＧＤＰ－Ｆｕｃへの平衡の変更のために、Ｍａｎ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、およびポリホスフェート、並びにＬ－グルタメートから、ＧＤＰ－Ｆｕｃを生成するために行った。この実験において、最初に、酵素を表７に記述される量までバイアルに調剤した。酵素の添加後、緩衝液、補因子、Ｍａｎ、ＧＴＰ、ＡＴＰ、およびＬ－グルタメート、並びにポリホスフェートを、この順序で、表７に記述される濃度まで添加した。反応を、１．５ｍＬエッペンドルフバイアルで、３７℃および５５０ｒｐｍで、エッペンドルフサーモミキサーコンフォートで実行した。アリコートを、様々な時点で採取し、および９０℃で３分間加熱することによってクエンチし、その後、イオン交換クロマトグラフィーによって測定した。反応Ａ３（表７の反応Ａ３の反応条件を参照）において、グルタメートデヒドロゲナーゼ（メルク社（Ｍｅｒｃｋ）から購入－１０１９７７３４００１）（ＧＬＤＨ，Ｅ．Ｃ．１．４．１．４）を、Ｌ－グルタメートおよび水からＮＡＤＰＨを再利用するために使用した。（図１１－Ａ３および図１２－Ａ３を参照）。

【0293】

【表5】

【0294】

【表6】

【0295】

【表7】

【0296】

実施例７：Ｇｌｋを使用したＤ－マンノースからのＧＤＰ－フコースの合成
ワンポット酵素反応を、図１３に示されるカスケードを介してマンノースからのＧＤＰ－フコース合成を立証するために実施した。この実験において、最初に、酵素を表８に記述される量までバイアルに調剤した。酵素の添加後、緩衝液、補因子、マンノース、ＡＴＰ、Ｌ－グルタメート、ＮＡＤＰＨ、グアノシン（ＤＭＳＯを含むストックから）およびポリホスフェートを、この順序で、表８に記述される濃度まで添加した。反応を、１．５ｍＬエッペンドルフバイアルで、３７℃および５５０ｒｐｍで、エッペンドルフサーモミキサーコンフォートで実行した。アリコートを、様々な時点で採取し、および９０℃で３分間加熱することによってクエンチし、その後、イオン交換クロマトグラフィーによって測定した。実施例７における反応の反応時間的経過を、図１４に示されるイオン交換クロマトグラフィーによって測定する。

【0297】

【表8】

【0298】

実施例８：ＮａｈＫを使用したＤ－マンノースからのＧＤＰ－フコースの合成
ワンポット酵素反応を、図１５に示されるカスケードを介してマンノースからのＧＤＰ－フコース合成を実証するために実施した。この実験において、最初に、酵素を表９に記述される量までバイアルに調剤した。酵素の添加後、緩衝液、補因子、マンノース、ＡＴＰ、Ｌ－グルタメート、ＮＡＤＰＨ、グアノシン（ストックはＤＭＳＯで調製された）およびポリホスフェートを、この順序で、表９に記述される濃度まで添加した。反応を、１．５ｍＬエッペンドルフバイアルで、３７℃および５５０ｒｐｍで、エッペンドルフサーモミキサーコンフォートで実行した。アリコートを、様々な時点で採取し、および９０℃で３分間加熱することによってクエンチし、その後、イオン交換クロマトグラフィーによって測定した。実施例８における反応の反応時間的経過を、図１６に示されるイオン交換クロマトグラフィーによって測定する。

【0299】

【表9】

【0300】

実施例９：３－フコシルラクトースの合成
ＧＤＰ－フコース生成のためのカスケードは、分子または生体分子、例えば、母乳オリゴサッカリドおよび治療的タンパク質をフコシル化するために、フコシルトランスフェラーゼと結合することができる。結合は、ワンポット反応で実行される（図１７参照）。反応を実施し、ここでＧＤＰ－フコースカスケードは、Ｄ－マンノースから出発して３－フコシルラクトースを生成するために、３／４－フコシルトランスフェラーゼと結合した（反応Ｄ１；図１８参照）。この実験において、最初に、酵素を表１０に記述される量までバイアルに調剤した。酵素の添加後、緩衝液、補因子、マンノース、ＡＴＰ、Ｌ－グルタメート、ＮＡＤＰＨ、ラクトース、グアノシン（ストックはＤＭＳＯで調製された）およびポリホスフェートを、この順序で、表１０に記述される濃度まで添加した。反応を、１．５ｍＬエッペンドルフバイアルで、３７℃および５５０ｒｐｍで、エッペンドルフサーモミキサーコンフォートで行った。アリコートを採取し、および９０℃で３分間加熱することによってクエンチし、その後、イオン交換クロマトグラフィーによって測定した。他の実験を、３－フコシルラクトセインを生成するために行い、ここでＧＤＰ－Ｆｕｃはグアノシン、Ｌ－フコースから生成された（反応Ｄ２；図１９を参照）。この実験において、最初に、酵素を表１１に記述される量まで添加した。酵素の添加後、緩衝液、補因子、Ｌ－フコース、ＡＴＰ、ラクトース、グアノシン（ストックはＤＭＳＯで調製された）およびポリホスフェートを、この順序で、表１１に記述される濃度まで添加した。反応を、１．５ｍＬエッペンドルフバイアルで、３７℃および５５０ｒｐｍで、エッペンドルフサーモミキサーコンフォートで行った。アリコートを採取し、および９０℃で３分間加熱することによってクエンチし、その後、イオン交換クロマトグラフィーによって測定した。

【0301】

【化24】

【0302】

【表10】

【0303】

【表11】

【0304】

実施例１０：Ｄ－マンノースからのＬ－フコースの生成
実施例７および実施例８に記述されるカスケードを、Ｄ－マンノースおよびグアノシンからＬ－フコースを生成するために使用することができる。実施例８の反応物を９５℃で１時間加熱した。加熱後に採取されたアリコートを、イオンクロマトグラフィーによって測定した（図２０参照）。

【0305】

次の表の配列を含む配列リストを、本出願に添付する：

【0306】

【表12】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【配列表】

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