特許 7299586 生体試料中のエチルアミン定量法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-06-20

(45)【発行日】2023-06-28

(54)【発明の名称】生体試料中のエチルアミン定量法

(51)【国際特許分類】

   G01N 30/88 20060101AFI20230621BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20230621BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20230621BHJP

   G01N 30/06 20060101ALI20230621BHJP

   G01N 30/26 20060101ALI20230621BHJP

   G01N 30/72 20060101ALI20230621BHJP

   G01N 30/86 20060101ALI20230621BHJP

【ＦＩ】

G01N30/88 E

G01N27/62 V

G01N33/50 B

G01N30/06 E

G01N30/26 A

G01N30/26 E

G01N30/72 C

G01N30/86 J

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2018248169

(22)【出願日】2018-12-28

(65)【公開番号】P2020106494

(43)【公開日】2020-07-09

【審査請求日】2021-12-21

(73)【特許権者】

【識別番号】591122956

【氏名又は名称】株式会社ＬＳＩメディエンス

(73)【特許権者】

【識別番号】504145342

【氏名又は名称】国立大学法人九州大学

(74)【代理人】

【識別番号】110002860

【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】大久保 信宏

(72)【発明者】

【氏名】二宮 利治

【審査官】黒田 浩一

(56)【参考文献】

【文献】特開２０００－３２９７４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開昭６３－２２１８０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１７－１８７３２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０００－０５５８９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５１９２２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１０－５０４３５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開昭５９－０３５１４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１８／００５９０７５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２０１７－０７８７２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】Lisa Scheid et al.，Kinetics of L-Theanine Uptake and Metabolism in Healthy Participants Are Comparable after Ingestion of L-Theanine via Capsules and Green Tea，The Journal of Nutrition，2012年，pp.2091-2096

【文献】角田誠，第２回アミノ酸分析の新しい潮流 １質量分析を利用したアミノ酸分析，和光純薬時報，Vol.86 No.4，2018年10月15日，pp.9-11，https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/journal/docs/jiho864.pdf

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３０／００－３０／９６

Ｇ０１Ｎ ２７／６２

Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体試料中のエチルアミンを定量する方法であって、
（ｉ）前記生体試料中のエチルアミンを誘導体化試薬としてダンシルクロリドと反応させる工程、
（ｉｉ）液体クロマトグラフィーにより前記生体試料中の誘導体化されたエチルアミンを分離する工程、及び、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）の工程で分離された生体試料に由来する誘導体化されたエチルアミンを質量分析計で分析する工程、
を含む方法。

【請求項2】

前記工程（ｉｉ）において、ギ酸アンモニウム、アセトニトリル及びギ酸を含有する移動相を用いる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記工程（ｉｉ）が、移動相中でのアセトニトリルの濃度を増大させる工程を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記工程（ｉｉ）が、移動相中でのアセトニトリルの濃度を第１のアセトニトリル濃度から第２のアセトニトリル濃度まで増大させる工程を含み、
前記第１のアセトニトリル濃度が０％以上であり、
前記第２のアセトニトリル濃度が３０％～７０％である、
請求項２又は３に記載の方法。

【請求項5】

前記工程（ｉｉ）が、移動相中でのギ酸アンモニウムの濃度を減少させる工程を含む、請求項２～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記工程（ｉｉ）が、移動相中でのギ酸の濃度を０．０３％～０．０６５％まで増大させる工程を含む、請求項２～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記生体試料が、前記工程（ｉ）の前に除タンパク法により前処理される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記質量分析計が、四重極型、四重極タンデム型、イオントラップ型、イオントラップ四重極ハイブリッド型、磁場偏向型、飛行時間型及び四重極飛行時間ハイブリッド型からなる群より選択されるいずれかのタイプである、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記質量分析計により検出されたエチルアミン由来のピーク面積値を内部標準物質由来のピーク面積値で除したピーク面積比に基づいて、前記エチルアミンを定量する、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、液体クロマトグラフ－質量分析計を用いて、生体試料中のエチルアミンを検出し、定量する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

茶は、古くから世界中で習慣的に飲用されており、現在では世界人口の３分の２以上によって消費されていると推計されている。これは、製法の違いにより多くの種類が存在するため、香りや味等を楽しむ嗜好品として幅広く飲用されているほかに、様々な健康増進作用を有することが理由として挙げられる。

【0003】

茶、特に緑茶に含まれる主な成分として、カテキンを含むポリフェノール、アルカロイド、アミノ酸、食物繊維、脂質、臭気成分、ビタミン及びミネラル等が知られているが、その中でも、アミノ酸の一種であるテアニンは、健康増進作用を有する成分の１つとして注目されている。テアニンは、グルタミン酸の側鎖のカルボキシル基とエチルアミンがアミド結合した構造から成る。ヒトが茶を飲用すると、テアニンは速やかに体内に吸収され、大部分はグルタミン酸とエチルアミンに加水分解されるが、一部は赤血球に取り込まれる（非特許文献１）。

【0004】

テアニンの効能に関する研究では、降圧作用（非特許文献２）、抗うつ作用（非特許文献３）及び睡眠の質の改善作用（非特許文献４）等が報告されているが、これらはテアニンを投与した際に現れる感情や生理現象の変化を観察している研究であり、生体試料中のテアニンは測定されていない。

【0005】

テアニンが測定されている報告例がほとんど無い理由として、テアニンの血中半減期が非常に短いことが考えられる。茶の飲用後におけるテアニンの体内動態に関する報告によると、茶の摂取から１２時間以内に、テアニンの大部分が血中から消失すると考えられるため（非特許文献１）、摂取後なるべく間を置かずに採血する必要がある。このことが、テアニンを測定する上での障壁になっていると推察される。

【0006】

現在までに、テアニンの分析法はいくつか報告されているが、特許文献１及び特許文献２において報告されている方法は、いずれも茶成分を抽出した試料や標準溶液を混合して得られた試料を測定した方法である。これらの方法では、生体試料中に含まれる様々な物質が、テアニンの濃度測定に影響を及ぼす可能性があるため、生体試料中のテアニンの測定に適していないと考えられる。非特許文献１において報告されている方法は、ヒト血漿中のテアニンを測定しているが、茶の摂取から１２時間以上経過後に採取した検体では、感度不足のためテアニンを検出できなくなると推察される。近年の分析手法の発達により、高感度検出が可能な質量分析計（ＭＳ）を使用した分析法の報告もあるが（特許文献３）、前述の方法と同様に、標準溶液を混合して得られた試料を測定したものにすぎず、また、多成分を同時に測定する方法であり、テアニンに対する感度は不十分と考えられる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【文献】特開平０１－２４０８５５号公報

【文献】特開２００７－１５５４６５号公報

【文献】国際公開第２００５／１１６６２９号

【非特許文献】

【0008】

【文献】Scheid L, Ellinger S, Alteheld B, Herholz H, Ellinger J, Henn T, Helfrich HP, Stehle P (2012) Kinetics of L-theanine uptake and metabolism in healthy participants are comparable after ingestion of L-theanine via capsules and green tea. The Journal of Nutrition 142(12), 2091-2096

【文献】Yoto A, Motoki M, Murao S, Yokogoshi H (2012) Effects of L-theanine or caffeine intake on changes in blood pressure under physical and psychological stresses. Journal of Physiological Anthropology 31:28

【文献】Hidese S, Ota M, Wakabayashi C, Noda T, Ozawa H, Okubo T, Kunugi H (2017) Effects of chronic l-theanine administration in patients with major depressive disorder: an open-label study. Acta Neuropsychiatrica 29(2), 72-79

【文献】Lyon MR, Kapoor MP, Juneja LR (2011) The effects of L-theanine (Suntheanine(R)) on objective sleep quality in boys with attention deficit hyperactivity disorder (ADHD): a randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial. Alternative Medicine Review 16(4), 348-354

【文献】Zotou A, Notou M (2012) Study of the naphthalene-2,3-dicarboxaldehyde pre-column derivatization of biogenic mono- and diamines in mixture and fluorescence-HPLC determination. Analytical and Bioanalytical Chemistry 403(4), 1039-1048

【文献】Hlabangana L, Hernandez-Cassou S, Saurina J (2006) Determination of biogenic amines in wines by ion-pair liquid chromatography and post-column derivatization with 1,2-naphthoquinone-4-sulphonate. Journal of Chromatography A 1130(1), 130-136

【文献】Furst P, Pollack L, Graser TA, Godel H, Stehle P (1990) Appraisal of four pre-column derivatization methods for the high-performance liquid chromatographic determination of free amino acids in biological materials. Journal of Chromatography A 499(19), 557-569

【文献】Parshintsev J, Ronkko T, Helin A, Hartonen K, Riekkola ML (2015) Determination of atmospheric amines by on-fiber derivatizationsolid-phase microextraction with 2,3,4,5,6-pentafluorobenzylchloroformate and 9-fluorenylmethoxycarbonyl chloride. Journal of Chromatography A 1376, 46-52

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

これらの理由により、茶成分のテアニンを直接分析することは、茶の摂取状況の把握やテアニンに関するより詳細な研究を行うための手段として、必ずしも適切ではないと考えられる。また、簡便性や迅速性を前提とする臨床検査に用いるには障壁が高い。

【0010】

そこで、本発明者らは、テアニンの代謝物であるエチルアミンに注目した。エチルアミンの血中半減期は、テアニンと比較して有意に長く、茶の摂取から２４時間経過後でも血中で検出される（非特許文献１）。それゆえ、茶を摂取した直後に採取した試料だけでなく、茶を摂取した量や頻度が不明な試料においても、客観的に茶の摂取状況を把握するためには、テアニンよりも体内での滞留時間が長いエチルアミンを測定対象とする方がより望ましいと考えられる。

【0011】

これまでの報告によると、エチルアミンは、チーズ（非特許文献５）やワイン（非特許文献６）等にも含まれているが、それらに含まれるエチルアミンの量は、茶と比較して少ないため、日常的に茶を摂取する文化がある日本人において、茶の摂取量と血中のエチルアミンの量に正の相関関係がある可能性は十分に考えられる。茶に限らず、チーズやワインの摂取量と体内のエチルアミンの量との関係を研究する場合、それらに含まれるエチルアミンの量が少ない分、さらに高感度な分析法が必要になると予測される。

【0012】

それゆえ、生体試料中のエチルアミンを、簡便、迅速かつ高感度に測定する方法が必要とされるが、テアニン同様にそのような方法は存在しない。例えば、非特許文献１及び非特許文献７において報告されているＯ－フタルアルデヒド誘導体化によるヒト血漿中エチルアミン分析法の定量下限値は約５ｎｇ／ｍＬであり、十分な感度を有しているとは言い難い。このような分析法では、エチルアミンは本当に存在しないのか、分析法の感度不足により検出されないのか、判然としない。

【0013】

また、他の分析法において、最も高感度な分析法の定量下限値は１．７２ｎｇ／ｍＬであるが（非特許文献８）、大気中のエチルアミンを測定対象としている方法であり、生体試料中のエチルアミンの測定には未対応である。すなわち、現在報告されている測定系では、エチルアミンの生体試料中濃度や体内動態を正確に把握することができず、結果としてテアニンに関する研究も進展しない。

【0014】

したがって、本発明の目的は、簡便、迅速かつ高感度に生体試料中のエチルアミン濃度を定量できる分析法を確立することによって、茶あるいはテアニンの摂取状況を把握するという要望を達成できる測定系を提供することである。

【0015】

なお、本明細書において、測定とは、検出、分析、定量等と同義で用いるものとする。また、試料とは、検体と同義で用いるものとする。

【課題を解決するための手段】

【0016】

本発明者らは、前記の問題点を解決すべく鋭意検討した結果、生体試料に有機溶媒を添加して、撹拌、遠心分離後、上清の一部をダンシルクロリド及び炭酸水素ナトリウムと混合し、加熱、放冷した試料を液体クロマトグラフ－トリプル四重極型質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）で測定することで、生体試料中のエチルアミンを高感度に定量できることを見出した。本発明は、この知見に基づいて成し遂げられたものである。

【0017】

すなわち、本発明は以下を提供する：
［１］ 生体試料中のエチルアミンを定量する方法であって、
（ｉ）前記生体試料中のエチルアミンを誘導体化試薬と反応させる工程、
（ｉｉ）液体クロマトグラフィーにより前記生体試料中の誘導体化されたエチルアミンを分離する工程、及び、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）の工程で分離された生体試料に由来する誘導体化されたエチルアミンを質量分析計で分析する工程、
を含む方法。
［２］ 前記工程（ｉｉ）において、ギ酸アンモニウム、アセトニトリル及びギ酸を含有する移動相を用いる、［１］に記載の方法。
［３］ 前記工程（ｉｉ）が、移動相中でのアセトニトリルの濃度を増大させる工程を含む、［２］に記載の方法。
［４］ 前記工程（ｉｉ）が、移動相中でのアセトニトリルの濃度を第１のアセトニトリル濃度から第２のアセトニトリル濃度まで増大させる工程を含み、
前記第１のアセトニトリル濃度が０％以上であり、
前記第２のアセトニトリル濃度が３０％～７０％である、
［２］又は［３］に記載の方法。
［５］ 前記工程（ｉｉ）が、移動相中でのギ酸アンモニウムの濃度を減少させる工程を含む、［２］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］ 前記工程（ｉｉ）が、移動相中でのギ酸の濃度を０．０３％～０．０６５％まで増大させる工程を含む、［２］～［４］のいずれかに記載の方法。
［７］ 前記誘導体化試薬が、オルトフタルアルデヒド、フルオレサミン、ナフタレン－
２，３－ジカルボキシアルデヒド、ダンシルクロリド、３，５－ジニトロベンゾイルクロリド、ベンゼンスルホニルクロリド、２，３，４，５，６－ペンタフルオロベンジルクロロホルメート、９－フルオレニルメチルクロロホルメート、９－フルオレニルメトキシカルボニルクロリド、３，４－ジヒドロ－６，７－ジメトキシ－４－メチル－３－オキソキノキサリン－２－カルボニルクロリド、６－アミノキノリル－Ｎ－ヒドロキシスクシニルイミド、４－フルオロ－７－ニトロベンゾフラザン、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン、フルオレセインイソチオシアネート、７－フルオロ－４－(Ｎ，Ｎ－ジメチルアミ
ノスルホニル)ベンゾフラザン及び１，２－ナフトキノン－４－スルホナートからなる群
より選択されるいずれかの物質である、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］ 前記生体試料が、前記工程（ｉ）の前に除タンパク法により前処理される、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］ 前記質量分析計が、四重極型、四重極タンデム型、イオントラップ型、イオントラップ四重極ハイブリッド型、磁場偏向型、飛行時間型及び四重極飛行時間ハイブリッド型からなる群より選択されるいずれかのタイプである、［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］ 前記質量分析計により検出されたエチルアミン由来のピーク面積値を内部標準物質由来のピーク面積値で除したピーク面積比に基づいて、前記エチルアミンを定量する、［１］～［９］のいずれかに記載の方法。

【発明の効果】

【0018】

本発明により、従来のエチルアミンの分析法と比較して、生体試料中のエチルアミン濃度を正確かつ高感度（例えば０．４００ｎｇ／ｍＬ）の感度で定量することが可能となる。さらに、迅速な測定が可能（例えば測定時間は１検体あたり２．８分）であるため、短時間で多検体を測定することが可能となる。

【0019】

また、後述するように、本発明を利用して茶の摂取状況が不明な検体を測定する際に、感度不足により測定値が定量下限値未満となる検体を大幅に減少させることができる。

【0020】

これにより、例えば、後ろ向きコホート研究において、茶の摂取状況が不明なヒト血中のエチルアミン濃度と、検体採取から数年後における各種疾患の罹患率等を調査することで、未だ知られていない茶の効能を明らかにする等、臨床研究への応用が期待される。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】図１は、ヒト血清を前処理後、ダンシル化されたエチルアミン（ａ）及び内部標準物質（以下、単に「ＩＳ」と記載することがある）のエチルアミン－ｄ３（ｂ）をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで測定した際のクロマトグラムを示す図である。

【図2】図２は、ヒト血清にエチルアミン標準溶液（ヒト血清中０．５ｎｇ／ｍＬ相当）を添加した試料を前処理後、ダンシル化されたエチルアミンをＬＣ－ＭＳ／ＭＳで測定した際のクロマトグラムを示す図である。

【図3】図３は、ヒト血清１０００検体のエチルアミン測定値を示したヒストグラム（～１０ｎｇ／ｍＬまで）を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

以下において、本発明の実施形態について詳細に説明するが、利用方法の態様については、これに限定されるものではない。

【0023】

本発明は、生体試料中のエチルアミン定量法である。具体的には、ダンシルクロリド等の誘導体化試薬によりエチルアミン及びＩＳを誘導体化する工程と、誘導体化後の溶液を用いて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによりエチルアミンを定量する工程を含む。本発明は、好ましくは、さらに、生体試料において夾雑物を除去する工程を含む。

【0024】

［生体試料］
本明細書において、生体試料として、エチルアミンを含有し得る生体試料であれば限定されないが、例えば、ヒト、サル等の霊長目、イヌ等のネコ目、ブタ等の偶蹄目、ウサギ等の重歯目、マウス若しくはラット等の齧歯目から得られた試料を用いることができる。生体試料の種類は、限定されないが、例えば、全血、血漿、血清、唾液、尿、便、喀痰、精液、涙、鼻汁、膣、鼻、直腸、咽頭並びに尿道のスワブ、排出物、分泌物及びバイオプシー組織試料等が挙げられるが、具体的には、血清、血漿又は尿であることが好ましい。本発明において、生体試料は、採取されたものをそのまま使用することができるが、当業者であれば必要に応じて水や生理食塩水による希釈、ホモジナイズする等、必要に応じて処理を加えて使用することができ、その条件は適宜設定することができる。

【0025】

以下、生体試料を有機溶媒で前処理して除タンパク（タンパク質除去）した後、エチルアミン及びＩＳをダンシルクロリドにより誘導体化して、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで測定する条件を例に記載をするが、本発明はこれに限定されるものではない。

【0026】

［前処理］
生体試料に含まれる夾雑物は、妨害ピークやシグナル強度に対するイオンサプレッションやエンハンスメント（マトリックス効果）の原因となるため、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで測定する前に、適宜前処理を実施して除去することが望ましい。前処理方法は、生体試料から夾雑物を除去でき、ダンシル化されたエチルアミン及びＩＳがＬＣ－ＭＳ／ＭＳで測定できれば特に制限はない。例えば、生体試料から夾雑物を除去する方法として、希釈、濃縮、凍結、融解、加熱、乾燥、破砕、懸濁、滅菌、固形分の除去、除タンパク法、液液抽出法又は固相抽出法等が挙げられる。本発明において、前処理方法は、エチルアミン及びＩＳの分析法として後述する液体クロマトグラフ（以下、単に「ＬＣ」と記載することがある）、ＭＳとそれらを使用した分析の諸条件、及び夾雑物の種類等に応じて適宜選択できる。当該前処理方法は、常法に基づいて行うことができる。また、当該前処理は、単独の方法で実施してもよく、適宜複数の方法を組み合わせて実施してもよい。

【0027】

具体的な前処理方法として、例えば、除タンパク法を用いることができる。除タンパク法には、限定されないが、例えば、過塩素酸、トリクロロ酢酸若しくはメタリン酸等の酸の添加、アセトン、アセトニトリル、メタノール若しくはエタノール等の有機溶媒の添加、加熱、冷却、限外ろ過又は超遠心分離等の方法が挙げられる。また、除タンパク法は、単独で用いても２種類以上を組み合わせて用いても、エチルアミンの測定値に影響を与えないものであればよい。

【0028】

本発明において、後述する誘導体化反応における影響を考慮し、除タンパク法の種類を決定することができる。例えば、採取された生体試料に、水、ＩＳ及びメタノールを添加し、撹拌、遠心分離後、上清の一部又は全部を回収する（工程１）。この工程で、血清とメタノールを混合することにより、血清中のタンパク質が変性して沈殿する。

【0029】

前処理における回収率が低いと、定量感度が低下し、測定の精度も落ちる。また、夾雑物の除去が不十分な場合には、エチルアミンと誘導体化試薬の反応効率も低下するだけでなく、マトリックス効果の影響を受けやすくなる。そのため、回収率の向上と夾雑物の除去を両立できる前処理方法が好ましい。

【0030】

［誘導体化反応］
本発明において、誘導体化反応を実施することで、生体試料中のエチルアミンを高感度かつ選択的に定量することが可能となる。ここでいう誘導体化とは、分析対象であるエチルアミンの分離能の改善や、イオン化効率を高め検出感度を向上させるために実施される
工程であって、当業者であればエチルアミンの構造と性質を考慮して、誘導体化試薬を適宜選択して使用することができる。

【0031】

エチルアミンは構造中にプロトン化しやすいアミノ基を有するため、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定において、ポジティブモードにより高感度な検出が期待される。一般的に、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法を使用した測定において、感度を決定付ける要件として、クロマトグラフィーの移動相のｐＨ、塩濃度及び有機溶媒濃度等の条件が挙げられるが、移動相のｐＨを酸性にすることによって、ＥＳＩ法でプロトン化が促進され、高感度化が期待される。

【0032】

しかし一方で、酸性の溶媒を使用した場合、エチルアミンは極性の高さゆえに、クロマトグラフィーによる分離時に汎用される逆相カラムへの保持力が弱まるというデメリットがある。その結果、試料中の夾雑物との分離が不十分となり、妨害ピークやマトリックス効果の影響を受ける可能性が高まる。

【0033】

そこで、本発明者らは、エチルアミンを誘導体化することで、良好に定量できることを見出した。誘導体化試薬として、例えば、オルトフタルアルデヒド、フルオレサミン、ナフタレン－２，３－ジカルボキシアルデヒド、ダンシルクロリド、３，５－ジニトロベンゾイルクロリド、ベンゼンスルホニルクロリド、２，３，４，５，６－ペンタフルオロベンジルクロロホルメート、９－フルオレニルメチルクロロホルメート、９－フルオレニルメトキシカルボニルクロリド、３，４－ジヒドロ－６，７－ジメトキシ－４－メチル－３－オキソキノキサリン－２－カルボニルクロリド、６－アミノキノリル－Ｎ－ヒドロキシスクシニルイミド、４－フルオロ－７－ニトロベンゾフラザン、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン、フルオレセインイソチオシアネート、７－フルオロ－４－(Ｎ，Ｎ－ジ
メチルアミノスルホニル)ベンゾフラザン及び１，２－ナフトキノン－４－スルホナート
等が知られているが、上述した以外の誘導体化試薬であっても、当業者であれば、誘導体化試薬の特質とエチルアミンの極性、分子量又は（光、熱、酸素、ｐＨ等に対する）安定性等の化学的性質測定を考慮し、誘導体化試薬を選択することができる。

【0034】

これらの誘導体化試薬は、プレカラム誘導体化試薬であってもポストカラム誘導体化試薬であっても使用することができるが、臨床検査等の多検体処理や自動化等の事情を考慮して、ポストカラム誘導体化試薬を選択してもよい。

【0035】

以下では、誘導体化試薬としてダンシルクロリドを使用した場合を例に説明をするが、本発明はこれに限定されるものではない。
誘導体化反応工程として、例えば、工程１により得られた上清に、ダンシルクロリド溶液及びアルカリ性の試薬又は溶液を添加する（工程２）。添加するアルカリ性の試薬としては、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム若しくは水酸化ナトリウム等、又はそれらを溶解させた溶液を使用してもよい。具体的には、炭酸水素ナトリウムが好ましい。炭酸水素ナトリウムを添加することで、混合溶液はアルカリ性になり、エチルアミン及びＩＳのダンシル化反応を促進させることができる。添加するアルカリ性の試薬又は溶液の濃度やｐＨ等の条件は、当業者であれば適宜設定することができる。

【0036】

工程２により得られた混合溶液を加熱し、放冷後、撹拌する（工程３）。加熱することで、エチルアミン及びＩＳがダンシルクロリドと速やかに反応し、ダンシル化されたエチルアミン及びＩＳが生成する。工程３により得られた反応溶液は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析することができる。

【0037】

［分析］
ＬＣとＭＳの構成は、ダンシル化されたエチルアミン及びＩＳがＬＣにより夾雑物から
分離され、ＭＳにより測定できれば特に制限はない。ＬＣとＭＳは、互いに直列に接続されていてもよいし、それぞれ独立していてもよい。本発明の方法に用いられる装置としては、例えば、ＬＣとＭＳを直列につないで構成されたＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いることができる。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いることにより、ＬＣにより分離されたダンシル化されたエチルアミン及びＩＳを、続けてＭＳで分析することができる。

【0038】

［分離工程］
本発明の方法においては、工程３により得られたダンシル化されたエチルアミンと、ダンシル化された生体試料由来のエチルアミン以外のアミノ官能基含有化合物を含む夾雑物を液体クロマトグラフィーにより分離する（工程４）。

【0039】

ＬＣは、送液ポンプ、脱気ユニット、オートサンプラ及びカラムオーブンを備えるものが好ましく、システムコントローラや検出器が接続されていてもよい。ＬＣとして、例えば、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）を用いることができる。ＨＰＬＣによる分離条件は、本明細書の記載及び常法に基づいて、当業者であれば適宜条件を設定できる。なお、ＬＣとして、ＨＰＬＣより迅速に高感度で分離分析が可能な、超高速液体クロマトグラフ（ＵＨＰＬＣ）を用いてもよい。ＵＨＰＬＣによる分離条件は、ＨＰＬＣの条件設定を行う場合の検討と同様に行うことができ、当業者であれば適宜条件を設定できる。

【0040】

クロマトグラフィーに用いる移動相は、ダンシル化されたエチルアミン及びＩＳが夾雑物から分離され、ＭＳにより測定できれば特に制限はない。例えば、ｐＨを一定に保ちうること、有機溶媒と混合しても安定であること、試料成分と不必要な反応を起こさないこと、化学修飾基の切断や担体の溶解といったカラムの固定相や装置を劣化させないものであること、あるいは不揮発性の塩によりＭＳでの測定を阻害しないこと等の条件を満たすものが好ましく、これらの溶液を単独で使用しても２種類以上を組み合わせて使用してもよい。

【0041】

移動相の組成、塩濃度及びｐＨは、ダンシル化されたエチルアミン及びＩＳの性状や夾雑物の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。例えば、移動相の組成、塩濃度及びｐＨが、ダンシル化されたエチルアミンのイオン化効率を高めるように設定されるのが好ましい。また、イオン化された割合を示すイオンカウントを使用して、移動相の組成、塩濃度及びｐＨを設定することもできる。また、移動相の組成、塩濃度及びｐＨは、ダンシル化されたエチルアミン及びＩＳが妨害ピークやマトリックス効果の影響を受けないように設定されるのが好ましい。

【0042】

移動相として、例えば、Ａ液（水系）とＢ液（有機溶媒系）の２種類を使用することが好ましい。Ａ液には、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、水酸化アンモニウム、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、トリエチルアミン、テトラヒドロフラン、又は有機溶媒等が含まれてもよい。具体的には、ギ酸アンモニウム水溶液が好ましい。Ｂ液には、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、又はアセトニトリル等を使用してもよく、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、水酸化アンモニウム、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、トリエチルアミン、テトラヒドロフラン、又は水等が含まれてもよい。具体的には、アセトニトリル／ギ酸が好ましい。

【0043】

以下、Ａ液（水系）としてギ酸アンモニウム水溶液を、Ｂ液（有機溶媒系）としてアセトニトリル／ギ酸を用いた態様を例として説明するが、本発明は本態様に限定されるものではない。
２種類以上の移動相を組み合わせて使用する場合、総流量に対する各移動相の含有率を適宜変化させてもよい。比率の変化速度は一定であってよく、そうでなくてもよい。また
、比率は増減を繰り返してもよい。アセトニトリル及びギ酸は、分離工程の全期間において移動相に含有されていてもよく、そうでなくてもよい。変化は、連続的な変化（グラジエント）であってもよく、断続的な変化（ステップワイズ）であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。グラジエント又はステップワイズの条件は、ダンシル化されたエチルアミン及びＩＳの性状や夾雑物の種類等の諸条件に応じて適宜設定することができる。

【0044】

移動相の流速は、例えば、０．１～１．５ｍＬ／ｍｉｎの範囲で設定することができる。具体的には、０．２～１．０ｍＬ／ｍｉｎが好ましく、０．７ｍＬ／ｍｉｎがより好ましい。

【0045】

グラジエント条件は、例えば、以下に記載の条件のように設定することができる。すなわち、移動相中のアセトニトリル濃度（ｖ／ｖ％）が、第１の濃度（Ｍ１）から第２の濃度（Ｍ２）まで徐々に増大するよう、アセトニトリル濃度にグラジエントをかけることができる。Ｍ１及びＭ２は、ダンシル化されたエチルアミン及びＩＳの性状や夾雑物の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。Ｍ１は、例えば、０％以上、１０％以上又は２０％以上であってよく、３０％未満であってよい。Ｍ２は、例えば、３０％以上又は４０％以上であってよく、７０％以下又は６５％以下であってよい。具体的には、例えば、移動相中のアセトニトリル濃度が３０～６５％まで徐々に増大するよう、アセトニトリル濃度にグラジエントをかけてよい。アセトニトリル濃度の変化速度は、一定であってもよく、そうでなくてもよい。アセトニトリル濃度は、Ｍ１からＭ２に変化するまでに、増減を繰り返してもよい。

【0046】

アセトニトリル濃度は、Ｍ２に到達した後、さらに変化してもよい。例えば、アセトニトリル濃度は、Ｍ２に到達した後、さらに増大してもよく、減少してもよく、増減を繰り返してもよい。例えば、アセトニトリル濃度は、Ｍ２に到達した後、再度Ｍ１に変化するまでに増減を繰り返してもよい。具体的には、例えば、Ｍ２に到達した後、９５％まで増加させ、続けて３０％まで減少してもよい。

【0047】

また、例えば、ダンシル化されたジメチルアミン等、ダンシル化されたエチルアミン及びＩＳの測定に影響を与える可能性がある物質との溶出時間の重複を避けるために、グラジエント条件を適宜設定することができる。

【0048】

分離工程は、移動相中のギ酸濃度（ｖ／ｖ％）を増減させる工程を含んでいてよい。すなわち、例えば、移動相中のギ酸濃度が、第１の濃度（Ａ１）から第２の濃度（Ａ２）まで徐々に増大するよう、ギ酸濃度にグラジエントをかけることができる。Ａ１及びＡ２は、ダンシル化されたエチルアミン及びＩＳの性状や夾雑物の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。Ａ１及びＡ２は、例えば、０～０．１％の範囲内で設定することができる。具体的には、例えば、移動相中のギ酸濃度が０．０３～０．０６５％まで徐々に増大するよう、ギ酸濃度にグラジエントをかけてよい。ギ酸濃度の変化速度は、一定であってもよく、そうでなくてもよい。ギ酸濃度は、増減を繰り返してもよい。ギ酸濃度は、Ａ２に到達した後、さらに変化してもよい。例えば、ギ酸濃度は、Ａ２に到達した後、さらに減少してもよく、増大してもよく、増減を繰り返してもよい。

【0049】

濃度のグラジエントは、組成の異なる２種又はそれ以上の溶液を、比率を変化させながら混合することができる。溶液の組み合わせは、所望のグラジエントが形成されるよう、適宜選択することができる。

【0050】

グラジエントは、アセトニトリル及びギ酸の両濃度にまとめてかけてよい。例えば、ギ酸を含有しアセトニトリルを含有しない第１の溶液と、アセトニトリルを含有しギ酸を含
有しない第２の溶液とを、比率を変化させながら混合することで、アセトニトリル及びギ酸の両濃度にグラジエントをかけることができる。第１の溶液としては、例えば、ギ酸そのものやギ酸含有水溶液が挙げられる。第２の溶液としては、アセトニトリルそのものやアセトニトリル含有水溶液が挙げられる。

【0051】

２種又はそれ以上の溶液を混合して移動相を調製する場合、当該２種又はそれ以上の溶液中のアセトニトリル及びギ酸の濃度は、混合後の移動相中のアセトニトリル及びギ酸の濃度が上記例示した移動相中のアセトニトリル及びギ酸の濃度となるよう、混合比率に応じて適宜設定することができる。例えば、ギ酸含有水溶液とアセトニトリルを混合して移動相として用いる場合、ギ酸含有水溶液中のギ酸濃度（ｖ／ｖ％）は、０．０５％以上又は０．１％以上であってよく、０．４％以下又は０．２％以下であってよい。具体的には、例えば、０．１～０．２％であってよい。

【0052】

分離工程は、移動相中でのギ酸アンモニウムの濃度（ｍＭ）を減少させる工程を含んでいてよい。すなわち、例えば、移動相中のギ酸アンモニウム濃度が、第１の濃度（Ｂ１）から第２の濃度（Ｂ２）まで徐々に減少するよう、ギ酸アンモニウム濃度にグラジエントをかけることができる。Ｂ１及びＢ２は、ダンシル化されたエチルアミン及びＩＳの性状や夾雑物の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。Ｂ１及びＢ２は、例えば、１～１０ｍＭの範囲内で設定することができる。具体的には、例えば、移動相中のギ酸アンモニウム濃度が３．５～７．０ｍＭまで徐々に減少するよう、ギ酸アンモニウム濃度にグラジエントをかけてよい。ギ酸アンモニウム濃度の変化速度は、一定であってもよく、そうでなくてもよい。ギ酸アンモニウム濃度は、増減を繰り返してもよい。ギ酸アンモニウム濃度は、Ｂ２に到達した後、さらに変化してもよい。例えば、ギ酸濃度は、Ｂ２に到達した後、さらに減少してもよく、増大してもよく、増減を繰り返してもよい。

【0053】

クロマトグラフィーに使用する分離カラムは、ダンシル化されたエチルアミン及びＩＳと夾雑物が分離され、ＭＳにより測定できれば特に制限はない。例えば、シリカゲル担体にＣ３０のアルキル鎖が化学結合した充填剤、オクタデシル基（Ｃ１８）が化学結合した充填剤、オクチル基（Ｃ８）が化学結合した充填剤、ブチル基（Ｃ４）が化学結合した充填剤又はフェニル基（Ｐｈ）が化学結合した充填剤等のカラムを用いることができる。具体的には、Ｃ１８が化学結合した充填剤を使用したカラムを用いてもよい。充填剤の粒子径は、５．０μｍ以下であってよく、２．０μｍ以下が好ましく、１．８μｍがより好ましい。カラムの長さは、３００ｍｍ以下であってよく、１５０ｍｍ以下が好ましく、５０ｍｍがより好ましい。カラムの内径は、１０ｍｍ以下であってよく、４．６ｍｍ以下が好ましく、２．１ｍｍがより好ましい。

【0054】

分離カラムを夾雑物から保護するために、分離カラムのインレット側にガードカラムを接続してもよい。ガードカラムは分離カラムと同じ充填剤及び内径並びに分離カラムより短い長さが好ましいが、これに限定されるものではない。

【0055】

カラムオーブンにより、分離カラム及びガードカラムに温度をかけてもよい。設定温度は、ダンシル化されたエチルアミン及びＩＳと夾雑物の分離、移動相の種類、流速及び測定機器にかかる圧力等に応じて適宜設定することができる。例えば、２０～６０℃であってよく、具体的には、３０℃であってよい。

【0056】

［分析工程］
本発明の方法においては、工程４で分離された生体試料に由来する誘導体化されたエチルアミンを質量分析計で分析する（工程５）。ＭＳによる測定条件は、本明細書の記載及び常法に基づいて、当業者であれば適宜条件を設定できる。

【0057】

ＭＳは、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間型、また、これらのハイブリッド型等の公知のＭＳであれば使用でき、具体的には、トリプル四重極型質量分析計がより好ましい。トリプル四重極型質量分析計は、イオン源、四重極（Ｑ１）、コリジョンセル、四重極（Ｑ３）及び検出器を備えたＭＳである。測定対象物質は、イオン源でイオン化され、プリカーサーイオンとなる。特定の質量電荷比（ｍ／ｚ）のイオンのみＱ１を通過し、コリジョンセルに充填されたアルゴン等の不活性化ガスに衝突することでプロダクトイオンが生成する。生じたプロダクトイオンのうち、特定のｍ／ｚのイオンのみＱ３を通過し、検出器によって検出される。イオン化法は、ＥＳＩ法、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）法、高速原子衝撃（ＦＡＢ）法、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）法及び音速イオン化（ＳＳＩ）法等が挙げられるが、特にＥＳＩ法が好ましい。測定モードは、ポジティブモード及びネガティブモードがあるが、特にポジティブモードが好ましい。ＥＳＩ法のポジティブモードでは、プロトン付加体、アンモニウム付加体、ナトリウム付加体又はカリウム付加体等が生成するが、特にプロトン付加体を検出するのが好ましい。スキャンタイプは、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）と選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）があるが、特にＭＲＭが好ましい。

【0058】

ダンシル化されたエチルアミン及びＩＳを、トリプル四重極型質量分析計を用いてポジティブモードでイオン化し、ＥＳＩ法及びＭＲＭにより測定する場合、プリカーサーイオンは、プロトン付加体を選択することができる。具体的には、ダンシル化されたエチルアミン及びＩＳのプリカーサーイオンは、それぞれ２７９．１±０．５及び２８２．１±０．５に設定することが好ましい。ダンシル化されたエチルアミンのプロダクトイオンは、１１５．１±０．５、１２８．１±０．５、１５６．１±０．５、１５７．１±０．５、又は２６４．１±０．５等が使用できる。ダンシル化されたＩＳのプロダクトイオンは、１１５．１±０．５、１５６．１±０．５、１５７．１±０．５、２５２．１±０．５、又は２６４．１±０．５等が使用できる。具体的には、ダンシル化されたエチルアミン及びＩＳ共に、１５６．１±０．５に設定することが好ましい。

【0059】

その他の設定条件として、Ｄｗｅｌｌ ｔｉｍｅ、Ｑ１ ＰｒｅＢｉａｓ、コリジョンエナジー（ＣＥ）、Ｑ３ ＰｒｅＢｉａｓ、Ｑ１分解能（Ｑ１ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）、Ｑ３分解能（Ｑ３ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ネブライザーガスとその流量、ヒーティングガスとその流量、インターフェイス温度、脱溶媒ライン温度、ヒートブロック温度、ドライングガスとその流量及び衝突誘起解離（ＣＩＤ）ガスとそのガス圧等が挙げられるが、当業者であれば適宜設定することができる。測定機器の種類により呼称が異なるものも、本発明で使用可能な条件に含まれる。

【0060】

本発明において、測定対象物質は、エチルアミンの水素、炭素及び窒素の一部又は全部に^２Ｈ、^１３Ｃ又は^１５Ｎの同位体元素が導入された類縁体も含むことができる。これらの化合物の定量には、外部標準法又は内部標準法が利用できる。測定対象物質が定量出来れば特に制限はないが、注入量、前処理操作又は測定における誤差を防ぐことができるため、内部標準法の利用が好ましい。例えば、質量分析により得られたクロマトグラムにおいて、エチルアミン由来のピーク面積値を内部標準物質由来のピーク面積値で除したピーク面積比に基づいて、前記エチルアミンを定量することができる。

【0061】

ＩＳは試料中に含まれていない成分で、妨害ピークやマトリックス効果の原因となる成分と完全に分離でき、測定対象物質に近い性質や構造を有する化合物が好ましい。例えば、エチルアミンの類縁体を使用することができ、具体的には、エチルアミン－ｄ３がより好ましい。使用するＩＳは当業者であれば適宜選択できる。

【実施例】

【0062】

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定する
ものではない。

【0063】

《実施例１：ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ条件》
すべての定量実験は、イオン源にＥＳＩユニットを用いたＬＣＭＳ－８０５０（島津製作所社製）で実施した。ＬＣは、システムコントローラ（ＣＢＭ－２０Ａ）、２台の送液ポンプ（共にＬＣ－３０ＡＤ）、脱気ユニット（ＤＧＵ－２０Ａ５Ｒ）、オートサンプラ（ＳＩＬ－３０ＡＣＭＰ）及びカラムオーブン（ＣＴＯ－２０ＡＣ）で構成されたシステムを使用した。このシステムを、ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ ＬＣＭＳ ｖｅｒｓｉｏｎ
５．８２ ＳＰ１を用いて制御した。

【0064】

ダンシル化されたエチルアミン及びＩＳと夾雑物の分離は、分離カラムとしてＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｔ３ Ｃｏｌｕｍｎ（５０ｍｍ×２．１ｍｍ ｉ．ｄ．，１．８μｍ)、ガードカラムとしてＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｔ３ ＶａｎＧｕ
ａｒｄ Ｐｒｅ－Ｃｏｌｕｍｎ（５ｍｍ×２．１ｍｍ ｉ．ｄ．，１．８μｍ)のカラム（いずれもＷａｔｅｒｓ社製）を使用し、カラム温度は３０℃に設定した。

【0065】

移動相は、Ａ液に１０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液、Ｂ液にアセトニトリル／ギ酸（１０００／１，ｖ／ｖ）を使用した。移動相の流速は、０．７ｍＬ／ｍｉｎとし、グラジエント条件を以下：０～２．２０分まで、３０％Ｂ～６５％Ｂ；２．２０～２．２１分まで、６５％Ｂ～９５％Ｂ；２．２１～２．７０分まで、９５％Ｂ均一；２．７０～２．７１分まで、９５％Ｂ～３０％Ｂ；２．７１～２．８０分まで、３０％Ｂ均一；のように設定した。

【0066】

ニードル洗浄溶媒は、メタノール／水（１／１，ｖ／ｖ）を使用した。

【0067】

オートサンプラは４℃に設定し、サンプル注入量は１μＬとした。測定モードはポジティブモードに設定し、ダンシル化されたエチルアミン及びＩＳはＭＲＭで測定した。

【0068】

ＭＳの各種パラメーターを以下：ネブライザーガス流量（窒素ガス）、３Ｌ／ｍｉｎ；ヒーティングガス流量（空気）、１０Ｌ／ｍｉｎ；ドライングガス流量（窒素ガス）、１０Ｌ／ｍｉｎ；インターフェイス温度、４００℃；ヒートブロック温度、４００℃；脱溶媒ライン温度、２５０℃；ＣＩＤガス（アルゴンガス）圧、２７０ｋＰａ；のように設定した。

【0069】

内標準物質にはエチルアミン－ｄ３を使用した。ダンシル化されたエチルアミン（ＤＮＳ－ＥＡ）及びＩＳ（ＤＮＳ－ＩＳ）の各種パラメーターをそれぞれ表１に示すように設定した。

【0070】

【表1】

【0071】

《実施例２：標準溶液の調製》
エチルアミンとＩＳのストック溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を水にて調製した。エチルアミンのストック溶液を水で段階的に希釈し、濃度が２、５、１０、２５、５０、１２５、２００及び２５０ｎｇ／ｍＬのエチルアミン標準溶液を調製した。ＩＳのストック溶液も同様
に水で希釈し、２０ｎｇ／ｍＬのＩＳ標準溶液を調製した。５、５０及び２００ｎｇ／ｍＬのエチルアミン標準溶液は、測定の精度管理サンプルの調製にも使用した。これらの標準溶液は、使用するまで４℃で保存し、使用時には室温に戻した。

【0072】

《実施例３：前処理操作及び測定》
ヒト血清５０μＬ（検量線用試料及び精度管理サンプル調製時には水５０μＬ）を１．５ｍＬのポリプロピレン製チューブに分取し、水１０μＬ（検量線用試料調製時には２、５、１０、２５、５０、１２５、２００及び２５０ｎｇ／ｍＬのエチルアミン標準溶液１０μＬ、精度管理サンプル調製時には５、５０及び２００ｎｇ／ｍＬのエチルアミン標準溶液１０μＬ）、ＩＳ標準溶液（２０ｎｇ／ｍＬ）１０μＬ及びメタノール２００μＬを添加した。ミキサーで５秒間撹拌後、４℃で２０，０００×ｇで３分間遠心分離し、上清１５０μＬを別の１．５ｍＬのポリプロピレン製チューブに移した。

【0073】

このチューブに、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液７５μＬと２ｍｇ／ｍＬダンシルクロリドのアセトン溶液１５０μＬを添加し、６５℃で３０分間加熱することにより、エチルアミンとＩＳをダンシル化した。この反応溶液を室温まで放冷した後、測定用バイアルに全量移した。

【0074】

このバイアルから１μＬをＬＣ－ＭＳ／ＭＳに注入し、ダンシル化されたエチルアミン及びＩＳを測定した。ヒト血清を前処理後、ダンシル化したエチルアミン及びＩＳをＬＣ－ＭＳ／ＭＳで測定した際のクロマトグラムを図１に、ヒト血清にエチルアミン標準溶液（ヒト血清中０．５ｎｇ／ｍＬ相当）を添加した試料を前処理後、ダンシル化されたエチルアミンをＬＣ－ＭＳ／ＭＳで測定した際のクロマトグラムを図２に示す。

【0075】

ダンシル化されたエチルアミンのダンシル化されたＩＳに対するピーク面積比をエチルアミンの添加濃度に対して一次回帰して得られた直線を検量線とし、ヒト血清中のエチルアミンを定量した。検量線の定量下限値は、０．４００ｎｇ／ｍＬであり、１／Ｘ^２の重み付け（Ｘ：ヒト血清中エチルアミン濃度）を用いた。
本発明により構築したヒト血清中のエチルアミン定量法により、血清中のエチルアミンが正確に測定できる。

【0076】

《実施例４：ヒト血清中のエチルアミン定量結果》
本発明により構築したヒト血清中のエチルアミン定量法を用いて、あらかじめ採取後、冷凍保管していたヒト血清１０００検体を測定した際のエチルアミン測定値のヒストグラムを図３に示す。その結果、全体の９１．０％である９１０検体でエチルアミン濃度を定量できた。

【0077】

また、測定されたエチルアミン濃度の内訳は、０．４００～１．００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲が１９０件（１９．０％）、１．０１～２．００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲が１９１件（１９．１％）、２．０１～３．００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲が１２１件（１２．１％）、３．０１～４．００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲が８６件（８．６％）及び４．０１～５．００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲が６０件（６．０％）の分布であった。

【0078】

ヒト血清中エチルアミンの濃度が５．００ｎｇ／ｍＬ以下の検体は７３８件であり、全体の７３．８％に相当する。従来の生体試料中のエチルアミン分析法を使用した場合には、これらの検体は定量下限値未満となり、茶あるいはテアニンの摂取状況を把握できないことが明らかとなった。

【産業上の利用可能性】

【0079】

本発明により、血清試料等に存在しているエチルアミンの濃度を、簡便、迅速かつ高感
度に定量することが可能となった。これにより、茶を摂取する習慣と各種疾患の罹患率を調査する後ろ向きコホート研究において、新しい知見が得られる可能性がある。本発明の用途はこれに限らず、茶の効能を調査する研究等での貢献が期待される。

【図1】

【図2】

【図3】