特許 7299645 雄性不稔イネ材料の栽培におけるＯｓＤＧＤ２β遺伝子の応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-06-20

(45)【発行日】2023-06-28

(54)【発明の名称】雄性不稔イネ材料の栽培におけるＯｓＤＧＤ２β遺伝子の応用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/29 20060101AFI20230621BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20230621BHJP

   A01H 1/06 20060101ALI20230621BHJP

   A01H 3/00 20060101ALI20230621BHJP

   A01H 5/00 20180101ALI20230621BHJP

   A01H 6/46 20180101ALN20230621BHJP

【ＦＩ】

C12N15/29

C12N15/09 110

A01H1/06

A01H3/00

A01H5/00 A

A01H6/46 ZNA

【請求項の数】 2

(21)【出願番号】P 2021566352

(86)(22)【出願日】2020-07-03

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-12

(86)【国際出願番号】 CN2020100135

(87)【国際公開番号】W WO2021000936

(87)【国際公開日】2021-01-07

【審査請求日】2021-11-08

(31)【優先権主張番号】201910592941.1

(32)【優先日】2019-07-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】505072650

【氏名又は名称】浙江大学

【氏名又は名称原語表記】ＺＨＥＪＩＡＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

(74)【代理人】

【識別番号】110002516

【氏名又は名称】弁理士法人白坂

(72)【発明者】

【氏名】舒慶尭

(72)【発明者】

【氏名】叶博文

【審査官】松井 一泰

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１０９８９７８５８（ＣＮ，Ａ）

【文献】BASNET, Rasbin et al.，OsDGD2β is the sole digalactosyldiacylglycerol synthase gene highly expressed in anther, and its mutation confers male sterility in rice，Rice，2019年08月14日，12(1):66

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－ １５／９０

Ａ０１Ｈ １／００－ １７／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＯｓＤＧＤ２β遺伝子のヌクレオチド配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示し、ＯｓＤＧＤ２β遺伝子を変異させることにより、イネ葯と花粉の発育を変え、イネ変異体を雄性不稔にすることであって、ＯｓＤＧＤ２β遺伝子を変異させる前記方法には、遺伝子ノックアウト技術を使用して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示すＯｓＤＧＤ２β遺伝子に欠失変異を生成し、イネに雄性不稔特性を有させるようにすることが含まれる雄性不稔イネ変異体の生成方法。

【請求項2】

前記遺伝子ノックアウト技術にはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が含まれることを特徴とする請求項１に記載の雄性不稔イネ変異体の生成方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は２０１９年７月３日に中国特許庁に提出され、出願番号２０１９１０５９２９４１．１、発明の名称「雄性不稔イネ材料の栽培におけるＯｓＤＧＤ２β遺伝子の応用」の中国特許出願の優先権を要求し、その内容全体が参照により本出願に組み込まれている。

【0002】

本発明は、植物遺伝子工学およびイネ分子育種の技術分野、特に雄性不稔イネ材料の栽培におけるＯｓＤＧＤ２β遺伝子の応用に関する。

【背景技術】

【0003】

米は最も重要な穀物の１つであり、世界の人口の半数以上が主食として米を食べている。増大するイネの収量と品質に対する需要を満たすために、雄性不稔システムの開発は継続的な需要となっている。葯や花粉の発育に関連する遺伝子の変異は、多くの場合、異なる形態の雄性不稔につながり、これはイネの育種に役立つ資源となることが期待されている。イネの雑種強勢は、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）の３系統の不稔系統、または光熱感受性遺伝子雄性不稔（ＰＴＧＭＳ）の２系統の不稔系統によって達成できる。

【0004】

しかしながら、最近、核雄性不稔技術を使用して雑種種子を生産する別の新しいイネ育種システムが出現した。脂質とその誘導体は花粉葯の発育と繁殖に不可欠であり、脂質合成遺伝子の破壊は花粉の分解及び／又は発育不全を引き起こし、部分的または完全な雄性不稔を引き起こす可能性がある。報告によると、イネのいくつかの遺伝子は、タペータム脂質の合成と分泌に関連し、例えば、花粉の稔性にＷＤＡ１、ＤＰＷ、ＣＹＰ７０Ｂ２、Ｆａｘ１、ＯｓＣ６、ＴＤＲ、ＧＡＭＹＢなどが不可欠である。

【0005】

ガラクト脂質は高等植物グリセリドの大きなクラスであり、ＭＧＤＧとＤＧＤＧはすべての光合成生物の２種類のガラクト脂質であり、それぞれ葉緑体脂質の５０％と２０％を占めている。これらのガラクト脂質は、イネの葯や種子の発育にも関与している。植物では、ＵＤＰ－ガラクトース由来のガラクトースをジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の主鎖に付加して酵素ＭＧＤＧシンテターゼによりＭＧＤＧを形成することにより、ガラクト脂質が合成される。同様に、２番目のガラクトースはＤＧＤＧシンターゼによってＭＧＤＧに転送され、ＤＧＤＧが合成される。

【0006】

現在では、ＯｓＤＧＤ２β遺伝子に関する研究はほとんどなく、その機能はまだ不明である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、雄性不稔イネ材料の栽培におけるＯｓＤＧＤ２β遺伝子の応用を提供し、雄性不稔ＯｓＤＧＤ２β変異体は、イネ雑種育種および雑種種子生産に使用でき、雄性不稔イネ材料を栽培するための資源を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

具体的な技術的解決手段は以下のとおりである。

【0009】

本発明は、雄性不稔イネ材料の栽培におけるＯｓＤＧＤ２β遺伝子の応用を提供し、前記ＯｓＤＧＤ２β遺伝子のヌクレオチド配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示し、前記応用方法は、ＯｓＤＧＤ２β遺伝子を変異させることにより、イネ変異体を雄性不稔にすることである。

【0010】

さらに、前記応用方法は、ＯｓＤＧＤ２β遺伝子を変異させることにより、イネの葯と花粉の発育を変化させ、葯と花粉の形態、サイズ、特性を変化させ、それによってイネ変異体を雄性不稔にすることである。

【0011】

本発明は、観察を通じて、ｏｓｄｇｄｇ２β変異体が自然状態では実ることはできないことを発見した。変異体および野生型の葯、花粉およびタペータムの形態についてさらに観察すると、野生型イネの葯は明るい黄色であり、花粉は丸く、ヨウ素染色後の色は暗いが、ｏｓｄｇｄｇ２β変異体の葯は淡黄色で、葯は小さく、収縮し湾曲しており、花粉が少なく、着色もないことがわかった。また、顕微鏡観察により、開花期の野生型イネ葯では、タペータム層がほぼ退化の様相であり、野生型と比較して、ｏｓｄｇｄｇ２β変異体の花粉は未染色であるだけでなく、体積がより小さく、収縮して湾曲しており、タペータム層は厚い単層の組織のままであることがわかった。透過型電子顕微鏡により、野生型の花粉には澱粉顆粒などの成分が含まれているのに対し、変異型花粉には澱粉顆粒がまったく含まれていないことがわかった。これは、ｏｓｄｇｄｇ２β変異体が雄性不稔であることを証明している。

【0012】

ｏｓｄｇｄｇ２β変異が雌しべの稔性に影響を与えるかどうかをさらに評価するために、本発明は、変異体に対して人工除雄と袋詰めを行い、次に野生型花粉を受粉することによってｏｓｄｇｄｇ２β変異体の交雑穂が正常な実を結ぶことができることを発見し、ｏｓｄｇｄｇ２β変異体が雌性可稔であることを証明する。

【0013】

上記の実験結果は、ｏｓｄｇｄｇ２β変異体が雄性不稔性および雌性可稔性であり、イネ核雄性不稔システムの雑種育種および雑種種子生産に使用できることを証明している。

【0014】

また、本発明はまた、研究により、イネにおいて、ＤＧＤＧの合成が、それぞれＯｓＤＧＤ１α、ＯｓＤＧＤ１β、ＯｓＤＧＤ１δ、ＯｓＤＧＤ２αおよびＯｓＤＧＤ２βである５つの遺伝子によってコードされ、ＯｓＤＧＤ２βが葯で高度に発現される唯一のＤＧＤＧシンターゼ遺伝子であることを発見した。

【0015】

本発明はまた、雄性不稔イネ品種を栽培するための方法を提供する。

【0016】

ＯｓＤＧＤ２β遺伝子の標的配列を設計し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを構築するステップ（１）と、
ステップ（１）に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを含む遺伝子工学細菌を構築するステップ（２）と、
ステップ（２）に記載の遺伝子工学細菌をイネの成熟した種子カルスに転送して、再生された植物体を取得するステップ（３）と、を含む。

【発明の効果】

【0017】

従来技術と比較して、本発明は以下の有益な効果を有する。

【0018】

本発明は、ＯｓＤＧＤ２β遺伝子変異により、雄性不稔イネ材料を栽培するための新しい方法を提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のような遺伝子編集技術などによって作成されたＯｓＤＧＤ２β遺伝子欠失変異体は、雄性不稔性が安定しているが、雌性稔性やその他の特性（光合成など）に悪影響を及ぼさないため、交雑育種や雑種強勢の利用において独特の利点を持っている。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】図１は、実施例１のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用したＯｓＤＧＤ２βの標的変異である。 ここで、Ｘｉｄａｏ＃１は野生型、ｏｓｄｇｄ２β－１は１－ｂｐの欠失を持つホモ接合変異体、ｏｓｄｇｄ２β－２は、２－ｂｐの欠失と５－ｂｐの欠失が同時に存在する二重変異体であり、 Ａは標的領域を含むＯｓＤＧＤ２β遺伝子の２つの転写物、 Ｂは、ＰＡＭを含む標的領域のＤＮＡ配列とゲノム特異的なｓｇＲＮＡ配列であり、 Ｃは変異型トランケートタンパク質の模式図であり、Ｇｌｙｃｏｓ＿ｔｒａｎｓｆ＿１は固有のドメインを表す。

【図2】図２は、実施例２の開花日の野生型Ｘｉｄａｏ＃１（Ａ）と変異体ｏｓｄｇｄ２β－１（Ｂ）の稲穂の比較である。 ここで、Ａは野生型Ｘｉｄａｏ＃１、Ｂは変異体ｏｓｄｇｄ２β－１、Ｃはｏｓｄｇｄ２β－１発育不全変異体の、野生型花粉による受粉を受け入れた１５日後の実り状況である。

【図3】図３は、実施例２における１％ＩＫＩ花粉染色による内花頴除去の小穂葯の違いの観察図である。 ここで、Ｘｉｄａｏ＃１は野生型、ｏｓｄｇｄ２β－１は１－ｂｐの欠失を持つホモ接合変異体、ｏｓｄｇｄ２β－２は２－ｂｐの欠失と５－ｂｐの欠失が同時に存在する二重変異体である。

【図4】図４は、実施例２における０．５％トルイジンブルーで染色された葯の横断面顕微鏡（上）と４０００Ｘ倍率拡大での透過型電子顕微鏡（下）での観察図である。 ここで、Ｘｉｄａｏ＃１は野生型、ｏｓｄｇｄ２β－１は１－ｂｐの欠失を持つホモ接合変異体、ｏｓｄｇｄ２β－２は２－ｂｐの欠失と５－ｂｐの欠失が同時に存在する二重変異体である。Ｅは表皮、Ｔはタペータム、Ｐは花粉を表す。

【図5】図５は、実施例３の野生型錫稲１号と変異体ｏｓｄｇｄ２β－１およびｏｓｄｇｄ２β－２の葉と葯におけるＤＧＤＧ合成遺伝子の相対的な発現レベルを示している。 ここで、Ａは葉の部分、Ｂは葯の部分であり、ＯｓＤＧＤ１α、ＯｓＤＧＤ１β、ＯｓＤＧＤ１δ、ＯｓＤＧＤ２α、ＯｓＤＧＤ２βはイネのＤＧＤＧの合成遺伝子である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本発明を、特定の実施例を参照しながら以下でさらに説明し、以下は、本発明の特定の実施例に過ぎず、本発明の保護範囲はこれらに限定されない。

【0021】

実施例１ 変異体の構築と同定
１、変異体の構築
ＣＲＩＳＰＲベクターｐＨＵＮ４ｃ１２を使用してＯｓＤＧＤ２β変異を標的とするゲノム編集ベクターを構築し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｐ１．０を介してＯｓＤＧＤ２βの３番目のエクソンを標的とする特定の標的配列（ｇｅｎｏｍｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｇＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＡＧＧＴＣＡＡＴＡＧＴＴＴＧＣＡＡＴＧ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示すように）を設計し、オリゴヌクレオチド鎖（Ｄ２ｂ－Ｔ／－Ｂ）（Ｄ２ｂ－Ｔ：ＧＧＣＡＣＡＴＴＧＣＡＡＡＣＴＡＴＴＧＡＣＣＴ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示すように、Ｄ２ｂ－Ｂ：ＡＡＡＣＡＧＧＴＣＡＡＴＡＧＴＴＴＧＣＡＡＴＧ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示すように）を合成し、オリゴヌクレオチド鎖をアニーリングバッファーで結合させ、ｐＨＵＮ４ｃ１２ベクターをＢｓａＩ－ＨＦ（ＮＥＢ）で消化し、オリゴヌクレオチド二重鎖をＴ４リガーゼでライゲーションした。ライゲーションされたベクターをｐＨＵＮ４ｃ１２ｓ：ＯｓＤＧＤ２βと名付け、ＤＨ５ Ｅ． ｃｏｌｉコンピテントセルに形質転換し、挿入されたｓｇＲＮＡを、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示すように、配列決定プライマー（ｓｅｑ－Ｆ）：ＧＣＣＣＡＴＴＡＣＧＣＡＡＴＴＧＧＡＣＧによって配列決定検証した。

【0022】

組換えベクターをアグロバクテリウム（ＥＨＡ１０５）に転送し、さらにアグロバクテリウム媒介方法を用いて、さらに、ジャポニカイネ品種錫稲１号の成熟種子カルスに転送し、組換えベクターは植物ゲノムに挿入され、発現されてｓｇＲＮＡとＣａｓ９ヌクレアーゼを生成し、ｓｇＲＮＡと標的配列のペアリングによって誘導されるため、この標的植物ゲノムはＣａｓ９ヌクレアーゼによって切断されて二本鎖切断を生成し、ゲノム修復プロセスでエラーが発生し、２つのｏｓｄｇｄ２β変異体（それぞれｏｓｄｇｄ２β－１およびｏｓｄｇｄ２β－２）（図１を参照）を取得した。

【0023】

２、変異体の同定
ＣＴＡＢ法を使用してｏｓｄｇｄ２β変異体の葉のＤＮＡを抽出し、ＰＣＲプライマーＤ２ｂ－Ｆ／－Ｒを使用し、ここで、Ｄ２ｂ－Ｆ：ＴＣＡＡＧＴＴＡＴＧＧＣＡＴＴＴＴＣＣＧＴＣＴ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示すように、Ｄ２ｂ－Ｒ：ＧＣＡＣＣＣＴＴＧＡＡＧＡＡＴＧＣＴＴＧＴ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示すように、形質転換された単一の植物の標的領域を増幅して配列決定検出した。

【0024】

二対立遺伝子変異体ｏｓｄｇｄ２β－２の標的フラグメントをｐＧＥＭ（登録商標）－Ｔベクターにクローン化し、大腸菌に形質転換し、配列決定により検証した。ＥｘＰＡＳｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｒａｎｓｌａｔｅ／）翻訳ツールを使用してタンパク質配列を分析した。Ｔ０世代の変異体単一植物を植え、追跡調査のために開花後に分けつ（Ｔｉｌｌｅｒｉｎｇ）を別々に植えた。

【0025】

実施例２ 変異体の表現型の特徴
１、葯の構造と花粉の稔性に関する研究
Ｔ０世代の変異体ｏｓｄｇｄ２βおよび野生型の出穂の日に、固定液ＦＡＡ（ホルマリン／酢酸／アルコール）を含む遠心分離管に小穂を集め、室温で保存した。変異型ｏｓｄｇｄ２βと野生型の花と葯の構造を通常の顕微鏡で観察し、１％ＩＫＩで染色された花粉の稔性を複合顕微鏡で観察した。

【0026】

図２に示すように、開花期には、野生型と比較して、突然変異体の葉鞘円錐花序は完全には露出していなかった。さらに、開花時の野生型と比較して、突然変異体のほとんどの小穂の葯は露出していなかった（図２のＢ）。さらに、この変異体が雌しべの稔性に影響を与えるかどうかを評価するために、変異体を去勢し、次に雄の親として野生型と交配させた。結果は、これらの雑種の穂は正常に実を結ぶことができ、変異体は雌性可稔であることを示した（図２のＣ）。

【0027】

顕微鏡検査（図３）により、変異体の葯と花粉は野生型よりも軽い染色され、小さくなり、収縮が示された（図３のｏｓｄｇｄ２β－１とｏｓｄｇｄ２β－２）。野生型では、タペータム層はほぼ退化されたが（図３のＸｉｄａｏ＃１）、変異体では、タペータム層は依然として厚い単層組織（図３のｏｓｄｇｄ２β－１およびｏｓｄｇｄ２β－２）であった。

【0028】

２、切片処理
透視顕微鏡ＴＥＭによって２つの変異体ｏｓｄｇｄ２βと野生型葯に対して切片処理と観察を行い、具体的なステップは以下のとおりである。

【0029】

２つの変異体ｏｓｄｇｄ２βと野生型の葯を２．５％グルタルアルデヒドリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、０．１ Ｍ ｐＨ ７．０）に４時間以上浸し、１％四酸化オスミウムで２時間以上固定した後、その後、ＰＢＳですすいだ。最初に勾配エタノール（３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％）を使用し、次に純粋なアセトンを使用し、最後にライラック樹脂を使用して葯を脱水し、そして、ガラスナイフ付きウルトラミクロトームを使用して２μｍの半薄切片を取得し、０．５％トルイジンブルーで染色し、顕微鏡で観察した。ＬＥＩＣＡ ＥＭ ＵＣ７Ｕミクロトームを使用して、１００ ｎｍの超薄切片を取得し、それぞれ酢酸ウラニルとアルカリ性クエン酸鉛で５～１０分間染色し、透過型電子顕微鏡で観察した。

【0030】

透過型電子顕微鏡で花粉粒を観察したところ、野生型花粉にはでんぷん粒などの成分が含まれ（図４のＸｉｄａｏ＃１）、変異型花粉にはでんぷん粒がまったく含まれていなかった（図４のｏｓｄｇｄ２β－１およびｏｓｄｇｄ２β－２）。変異体葯のタペータムは、プログラム細胞死の遅延を示していた。

【0031】

実施例３ 遺伝子発現分析
開花日に変異体ｏｓｄｇｄ２βと野生型の葉と葯を収集し、ＲＮＡ抽出キットでトータルＲＮＡを抽出し、逆転写キットでＲＮＡを逆転写し、Ｈｉｅｆｆ^ＴＭ ｑＰＣＲ ＳＹＢＲ（登録商標）反応混合物でｑＲＴ－ＰＣＲテストを実行した。

【0032】

実験は３つの生物学的複製と３つの技術的複製を実施し、ＯｓＡｃｔｉｎを内部参照として使用し、遺伝子の相対的発現レベルを２^{－ΔΔＣｔ}分析法で計算し、プライマーを表１に示した。

【0033】

【表1】

【0034】

図５に示すように、変異体の葉と葯のＯｓＤＧＤ２βはそれぞれ約６５．２６％と８８．６２％大幅に減少し、葉の他のＤＧＤＧ合成遺伝子は、野生型のものと有意差はなく（図５のＡ）、葯では、ＯｓＤＧＤ２αを除いて、野生型とは大きな違いがあった（図５のＢ）。２つの変異体ｏｓｄｇｄ２βでは、ＯｓＤＧＤ１δ、ＯｓＤＧＤ１β、ＯｓＤＧＤ１αの発現量がそれぞれ５．９倍、２．１倍、１．８倍に増加した。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【配列表】

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