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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-06-21
(45)【発行日】2023-06-29
(54)【発明の名称】薬物送達用担体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/14 20060101AFI20230622BHJP
C07K 14/765 20060101ALI20230622BHJP
C07K 17/08 20060101ALI20230622BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20230622BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230622BHJP
【ＦＩ】
C12N15/14 ZNA
C07K14/765
C07K17/08
A61K47/64
A61P35/00
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2020521135
(86)(22)【出願日】2019-04-26
(86)【国際出願番号】 JP2019017921
(87)【国際公開番号】W WO2019225296
(87)【国際公開日】2019-11-28
【審査請求日】2022-04-22
(31)【優先権主張番号】P 2018099998
(32)【優先日】2018-05-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504159235
【氏名又は名称】国立大学法人 熊本大学
(74)【代理人】
【識別番号】100106909
【弁理士】
【氏名又は名称】棚井 澄雄
(74)【代理人】
【識別番号】100126664
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 慎吾
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100189337
【弁理士】
【氏名又は名称】宮本 龍
(72)【発明者】
【氏名】丸山 徹
(72)【発明者】
【氏名】渡邊 博志
(72)【発明者】
【氏名】異島 優
(72)【発明者】
【氏名】前田 仁志
(72)【発明者】
【氏名】水田 夕稀
(72)【発明者】
【氏名】木下 遼
【審査官】小金井 悟
(56)【参考文献】
【文献】特開２００８－４３２８５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００８－５３８５０６（ＪＰ，Ａ）
【文献】皆吉勇紀、外，第３２回日本ＤＤＳ学会学術集会プログラム予稿集，2016年06月01日，p.145
【文献】J. Drug. Target.，1994年，Vol.2, No.2，p.157-165
【文献】J. Control. Release，2001年09月11日，Vol.76, No.1-2，p.107-117
【文献】J. Antimicrob. Chemother.，1993年01月，Vol.31, No.1，p.151-159
【文献】水田夕稀、外，第３４回日本ＤＤＳ学会学術集会プログラム予稿集，2018年05月28日，p.147
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
８個以上のマンノース残基を有する高マンノース糖鎖と、前記高マンノース糖鎖と相互作用する生体適合性ポリマーが結合した、ヒト血清アルブミン変異体を含み、
前記生体適合性ポリマーは、前記ヒト血清アルブミン変異体の３４番目のシステイン残基に結合している、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）又は癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）への薬物送達用担体。
【請求項12】
８個以上のマンノース残基を有する高マンノース糖鎖と、重量平均分子量が３０，０００～５０，０００である生体適合性ポリマーが結合した、ヒト血清アルブミン変異体を含み、前記生体適合性ポリマーは、前記ヒト血清アルブミン変異体の３４番目のシステイン残基に結合している、薬物送達用担体と、抗癌剤とが結合した、癌治療剤。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、薬物送達用担体に関する。より詳細には、本発明は、薬物送達用担体、薬物送達用担体をコードする核酸及び薬物送達システムに関する。
【背景技術】
【0002】
難治性癌に対する新たな治療標的として、腫瘍組織の特徴的な間質である腫瘍微小環境が注目されている。これは腫瘍微小環境が癌の増殖、転移、悪性化や薬剤耐性の原因となるためである。
【0003】
分子標的薬を含む近年の抗癌薬の多様化と治療法は大きく進歩したものの、単剤で癌を死滅させることはできない。これは、癌微小環境における腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）や癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）等の細胞群を制御する治療戦略が確立していないためである。Ｍ２様マクロファージであるＴＡＭは、悪性腫瘍の発生初期から転移巣の形成までの過程、すなわち、癌細胞の増殖、浸潤、転移に深く関与し、腫瘍の微小環境を悪性化する治療抵抗性因子として位置付けられている。
【0004】
また、ＣＡＦは、増殖能、移動能に優れており、癌細胞の増殖、浸潤、転移過程において重要な役割を果たしているだけでなく、細胞外マトリックスの異常増殖を促進するため、抗癌剤の腫瘍浸透性の減弱化に伴う治療抵抗性を惹き起こす。更に、癌幹細胞とＣＡＦとのシグナル伝達リンクが癌幹細胞の生存に重要であることも報告されている（例えば、非特許文献１を参照。）。
【0005】
興味深いことに、癌微小環境にＣＤ２０６高発現ＴＡＭやＣＤ２８０高発現ＣＡＦが多く存在する癌組織は、悪性度が高く、治療抵抗性かつ予後不良であることが臨床所見からも実証されている。
【0006】
ところで、ヒト血清アルブミン（以下、「ＨＳＡ」という場合がある。）は単純タンパク質であり、糖鎖を有していない。これに対し、発明者らは、以前に、ＨＳＡにＮ－結合型糖鎖結合アミノ酸配列を形成するように部位特異的変異（Ｄ６３Ｎ、Ａ３２０Ｔ、Ｄ４９４Ｎ）を導入し、これを酵母で産生することで、酵母発現系に特有の高マンノース糖鎖が結合したＨＳＡ（以下、「Ｍａｎ－ＨＳＡ」という場合がある。）を作製することに初めて成功した（例えば、非特許文献２を参照。）さらに、作製したＭａｎ－ＨＳＡが、ＣＤ２０６及びＣＤ２８０標的能を有していることを、健常マウス及び線維化モデルマウスにて確認済みである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【文献】Chen W. J., et al., Cancer-associatedfibroblasts regulate the plasticity of lung cancer stemness via paracrine signalling, Nat. Commun., 5, 3472, 2014.
【文献】Hirata K., et al., Genetically engineered mannosylated-human serum albumin as a versatile carrier for liver-selective therapeutics, J. Control. Release, 145 (1), 9-16, 2010.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
腫瘍微小環境を制御し、効率良い癌治療を実現するには、ＴＡＭ／ＣＡＦの両者を同時に標的化する革新的な抗癌剤送達システムの開発が不可欠である。しかしながら、その成否の鍵を握る薬物送達用担体は存在しない。
【0009】
非特許文献２に記載されたＭａｎ－ＨＳＡを静脈内投与すると、肝常在性マクロファージであるクッパー細胞に高い移行性を示してしまう。このため、非特許文献２に記載されたＭａｎ－ＨＳＡを静脈内投与しても、腫瘍微小環境に存在するＴＡＭ／ＣＡＦまで送達することは困難である。
【0010】
本発明は、腫瘍微小環境に存在するＴＡＭ／ＣＡＦに効率よく送達することが可能な薬物送達用担体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明は以下の態様を含む。
［１］８個以上のマンノース残基を有する高マンノース糖鎖と、前記高マンノース糖鎖と相互作用する物質又は前記高マンノース糖鎖と相互作用する物質の結合部位と、が結合した、ヒト血清アルブミン変異体を含む薬物送達用担体。
［２］前記高マンノース糖鎖と相互作用する物質が、生体適合性ポリマー又はタンパク質である、［１］に記載の薬物送達用担体。
［３］前記高マンノース糖鎖と相互作用する物質の分子量が、５，０００～１００，０００である、［１］又は［２］に記載の薬物送達用担体。
［４］前記高マンノース糖鎖と相互作用する物質が生体適合性ポリマーであり、前記生体適合性ポリマーの重量平均分子量が、３０，０００～５０，０００である、[１］～［３］のいずれかに記載の薬物送達用担体。
［５］前記高マンノース糖鎖と相互作用する物質がタンパク質であり、前記高マンノース糖鎖と相互作用する物質の結合部位が、前記タンパク質が結合するアミノ酸配列からなる部位である、［１］～［３］のいずれかに記載の薬物送達用担体。
［６］前記ヒト血清アルブミン変異体が、Ｄ６３Ｎ、Ａ３２０Ｔ及びＤ４９４Ｎからなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する、［１］～［５］のいずれかに記載の薬物送達用担体。
［７］Ｄ６３Ｎ、Ａ３２０Ｔ及びＤ４９４Ｎからなる群より選択される少なくとも１つの変異を有するヒト血清アルブミン変異体と、Ｎ－結合型糖鎖結合アミノ酸配列を有しないヒト血清アルブミンとの融合タンパク質である、［６］に記載の薬物送達用担体。
［８］Ｄ６３Ｎ、Ａ３２０Ｔ及びＤ４９４Ｎからなる群より選択される少なくとも１つの変異を有するヒト血清アルブミン変異体と、抗体定常領域との融合タンパク質である、［６］に記載の薬物送達用担体。
［９］［７］又は［８］に記載の薬物送達用担体をコードする核酸。
［１０］［１］～［９］のいずれかに記載の薬物送達用担体と、薬物とが結合した、薬物送達システム。
［１１］癌治療剤、腫瘍微小環境の改善剤又は造影剤である、［１０］に記載の薬物送達システム。
［１２］８個以上のマンノース残基を有する高マンノース糖鎖と、重量平均分子量が３０，０００～５０，０００である生体適合性ポリマーが結合した、ヒト血清アルブミン変異体を含む薬物送達用担体と、抗癌剤とが結合した、癌治療剤。
［１］８個以上のマンノース残基を有する高マンノース糖鎖と、前記高マンノース糖鎖と相互作用する物質又は前記高マンノース糖鎖と相互作用する物質の結合部位と、が結合した、ヒト血清アルブミン変異体を含む薬物送達用担体。
［２］前記高マンノース糖鎖と相互作用する物質が、生体適合性ポリマー又はタンパク質である、［１］に記載の薬物送達用担体。
［３］前記高マンノース糖鎖と相互作用する物質の分子量が、５，０００～１００，０００である、［１］又は［２］に記載の薬物送達用担体。
［４］前記高マンノース糖鎖と相互作用する物質が生体適合性ポリマーであり、前記生体適合性ポリマーの重量平均分子量が、３０，０００～５０，０００である、[１］～［３］のいずれかに記載の薬物送達用担体。
［５］前記高マンノース糖鎖と相互作用する物質がタンパク質であり、前記高マンノース糖鎖と相互作用する物質の結合部位が、前記タンパク質が結合するアミノ酸配列からなる部位である、［１］～［３］のいずれかに記載の薬物送達用担体。
［６］前記ヒト血清アルブミン変異体が、Ｄ６３Ｎ、Ａ３２０Ｔ及びＤ４９４Ｎからなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する、［１］～［５］のいずれかに記載の薬物送達用担体。
［７］Ｄ６３Ｎ、Ａ３２０Ｔ及びＤ４９４Ｎからなる群より選択される少なくとも１つの変異を有するヒト血清アルブミン変異体と、Ｎ－結合型糖鎖結合アミノ酸配列を有しないヒト血清アルブミンとの融合タンパク質である、［６］に記載の薬物送達用担体。
［８］Ｄ６３Ｎ、Ａ３２０Ｔ及びＤ４９４Ｎからなる群より選択される少なくとも１つの変異を有するヒト血清アルブミン変異体と、抗体定常領域との融合タンパク質である、［６］に記載の薬物送達用担体。
［９］［７］又は［８］に記載の薬物送達用担体をコードする核酸。
［１０］［１］～［９］のいずれかに記載の薬物送達用担体と、薬物とが結合した、薬物送達システム。
［１１］癌治療剤、腫瘍微小環境の改善剤又は造影剤である、［１０］に記載の薬物送達システム。
［１２］８個以上のマンノース残基を有する高マンノース糖鎖と、重量平均分子量が３０，０００～５０，０００である生体適合性ポリマーが結合した、ヒト血清アルブミン変異体を含む薬物送達用担体と、抗癌剤とが結合した、癌治療剤。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、腫瘍微小環境に存在する腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）及び癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）に効率よく送達することが可能な薬物送達用担体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】（ａ）は、実験例２における陰イオン交換カラムクロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラムである。（ｂ）は、実験例２におけるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）の結果を示す写真である。
【図2】（ａ）及び（ｂ）は、実験例３におけるＣＤスペクトル分析の結果を示すグラフである。（ａ）は近紫外のＣＤスペクトル分析の結果であり、（ｂ）は遠紫外のＣＤスペクトル分析の結果である。
【図3】（ａ）は、実験例３におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥ後のＣＢＢ染色の結果を示す写真である。（ｂ）は、実験例３におけるＰＡＳ染色の結果を示す写真である。
【図4】実験例４において、１２５Ｉ標識した、ＨＳＡ、Ｍａｎ－ＨＳＡ、ＰＥＧ５ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ及びＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡの健常マウスモデルにおける血漿中濃度の推移を測定した結果を示すグラフである。
【図5】（ａ）は、実験例４において測定した、肝臓における各種アルブミンの存在量の推移を示す。（ｂ）は、実験例４において測定した、脾臓における各種アルブミンの存在量の推移を示す。
【図6】（ａ）は、実験例４において測定した、腎臓における各種アルブミンの存在量の推移を示す。（ｂ）は、実験例４において測定した、肺における各種アルブミンの存在量の推移を示す。（ｃ）は、実験例４において測定した、心臓における各種アルブミンの存在量の推移を示す。
【図7】実験例４において、１２５Ｉ標識した、ＨＳＡ、Ｍａｎ－ＨＳＡ、ＰＥＧ５ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ及びＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡの担癌マウスモデルにおける血漿中濃度の推移を測定した結果を示すグラフである。
【図8】実験例４において測定した、担癌マウスモデルの腫瘍組織への各種アルブミンの分布を示す。
【図9】実験例５における免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図10】実験例５において、腫瘍組織中のマクロファージによるＦＩＴＣ標識ＨＳＡ及びＦＩＴＣ標識ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡの取り込み量を測定した結果を示すグラフである。
【図11】（ａ）は、実験例６において、Ｊ７７４．１細胞によるＦＩＴＣ標識ＨＳＡ及びＦＩＴＣ標識ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡの取り込み量を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例６において、ＲＡＷ２６４．７細胞によるＦＩＴＣ標識ＨＳＡ及びＦＩＴＣ標識ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡの取り込み量を測定した結果を示すグラフである。
【図12】実験例６において、ＴＷＮＴ－１細胞によるＦＩＴＣ標識ＨＳＡ及びＦＩＴＣ標識ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡの取り込み量を測定した結果を示すグラフである。
【図13】（ａ）は、実験例７におけるＲＡＷ２６４．７細胞の細胞生存率の測定結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例７におけるＪ７７４．１細胞の細胞生存率の測定結果を示すグラフである。
【図14】実験例８におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図15】（ａ）は、Ｍｏｎｏ－ＰＥＧ－Ｍａｎ－ＨＳＡ（Ｄ４９４Ｎ）の構造を示す模式図である。（ｂ）は、ＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡＤ４９４Ｎ）の構造を示す模式図である。（ｃ）は、（Ｍａｎ－ＨＳＡＤ４９４Ｎ）－ＨＳＡの構造を示す模式図である。
【図16】実験例９における細胞生存率の測定結果を示すグラフである。
【図17】ＨＳＡ、ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ、Ｍａｎ－ＨＳＡ、ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡについて、実験例１０で測定した細胞内取り込み量と実験例９で測定した細胞傷害性それぞれの平均値をプロットした相関図である。
【図18】実験例１１で測定した担癌マウスモデルの腫瘍体積の変化を示すグラフ及び腫瘍の写真である。
【図19】実験例１２における、各腫瘍組織の顕微鏡写真である。
【図20】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１３における、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフ及び免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図21】（ａ）は、実験例１４において腫瘍内ＣＤ２６０陽性細胞（ＴＡＭ）を検出した蛍光顕微鏡写真である。（ｂ）は、実験例１４において腫瘍内ＣＤ２８０陽性細胞（ＣＡＦ）を検出した蛍光顕微鏡写真である。
【図22】（ａ）は、実験例１５におけるＴＵＮＥＬ染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。（ｂ）は、（ａ）の結果を数値化したグラフである。
【図23】（ａ）は、実験例１６におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。（ｂ）及び（ｃ）は、（ａ）の結果を数値化したグラフである。
【図24】（ａ）は、実験例１７における担癌マウスモデルの体重の経時変化を示すグラフである。（ｂ）は、実験例１７における担癌マウスモデルの各臓器の重量の測定結果を示すグラフである。
【図25】実験例１８におけるヘマトキシリン・エオシン染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図26】（ａ）は、実験例１９における白血球数の測定結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例１９における血小板数の測定結果を示すグラフである。（ｃ）は、実験例１９におけるＡＳＴ活性の測定結果を示すグラフである。（ｄ）は、実験例１９におけるＡＬＴ活性の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0014】
［薬物送達用担体］
１実施形態において、本発明は、８個以上のマンノース残基を有する高マンノース糖鎖と、前記高マンノース糖鎖と相互作用する物質又は前記高マンノース糖鎖と相互作用する物質の結合部位と、が結合した、ヒト血清アルブミン変異体を含む薬物送達用担体を提供する。本実施形態の薬物送達用担体は、８個以上のマンノース残基を有する高マンノース糖鎖と、前記高マンノース糖鎖と相互作用する物質又は前記高マンノース糖鎖と相互作用する物質の結合部位と、が結合した、ヒト血清アルブミン変異体を有効成分とするということもできる。
１実施形態において、本発明は、８個以上のマンノース残基を有する高マンノース糖鎖と、前記高マンノース糖鎖と相互作用する物質又は前記高マンノース糖鎖と相互作用する物質の結合部位と、が結合した、ヒト血清アルブミン変異体を含む薬物送達用担体を提供する。本実施形態の薬物送達用担体は、８個以上のマンノース残基を有する高マンノース糖鎖と、前記高マンノース糖鎖と相互作用する物質又は前記高マンノース糖鎖と相互作用する物質の結合部位と、が結合した、ヒト血清アルブミン変異体を有効成分とするということもできる。
【0015】
実施例において後述するように、本実施形態の薬物送達用担体は、腫瘍微小環境に存在する腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）及び癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）に効率よく送達することができる。
【0016】
本明細書において、高マンノース糖鎖とは、下記化学式（１）に示す糖鎖構造を有する糖鎖である。化学式（１）中、「Ａｓｎ」はタンパク質中のアスパラギン残基を示し、「○」はＮアセチルグルコサミン残基を示し、「◇」はマンノース残基を示し、ｎ１、ｎ２及びｎ３はそれぞれ独立に０以上の整数を示し、式（１）におけるマンノース残基の合計は８個以上である。式（１）におけるマンノース残基の合計は、ＣＤ２０６又はＣＤ２８０に認識される数であればよく、例えば９個であってもよく、例えば１０個であってもよく、例えば１１個であってもよく、例えば１２個であってもよく、例えば１３個であってもよく、例えば１４個以上であってもよい。式（１）におけるマンノース残基の合計の上限は、概ね２０個程度である。
【0017】
【化1】
【0018】
Ｎ－結合型糖鎖結合アミノ酸配列を有するタンパク質を酵母で発現させることにより、Ｎ－結合型糖鎖結合アミノ酸配列のアスパラギン残基に高マンノース糖鎖を容易に結合させることができる。
【0019】
上述したように、野生型のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は糖鎖を有していない。野生型のＨＳＡのアミノ酸配列を配列番号１に示し、ＨＳＡをコードする塩基配列を配列番号２に示す。
【0020】
本実施形態の薬物送達用担体において、ＨＳＡ変異体とは、野生型のＨＳＡに変異が導入され、Ｎ－結合型糖鎖結合アミノ酸配列を獲得したＨＳＡ変異体を意味する。
【0021】
より具体的なＨＳＡ変異体としては、Ｄ６３Ｎ、Ａ３２０Ｔ及びＤ４９４Ｎからなる群より選択される少なくとも１つの変異を有するＨＳＡ変異体が挙げられる。ＨＳＡ変異体は、上記のいずれか１つの変異を有していてもよいし、上記のいずれか２つの変異を有していてもよいし、上記の３つの全ての変異を有していてもよい。
【0022】
以下、Ｄ６３Ｎの変異を有するＨＳＡをＨＳＡＤ６３Ｎという場合がある。また、Ａ３２０Ｔの変異を有するＨＳＡをＨＳＡＡ３２０Ｔという場合がある。また、Ｄ４９４Ｎの変異を有するＨＳＡをＨＳＡＤ４９４Ｎという場合がある。
【0023】
ＨＳＡＤ６３Ｎのアミノ酸配列を配列番号３に示し、ＨＳＡＤ６３Ｎをコードする塩基配列を配列番号４に示す。また、ＨＳＡＡ３２０Ｔのアミノ酸配列を配列番号５に示し、ＨＳＡＡ３２０Ｔをコードする塩基配列を配列番号６に示す。また、ＨＳＡＤ４９４Ｎのアミノ酸配列を配列番号７に示し、ＨＳＡＤ４９４Ｎをコードする塩基配列を配列番号８に示す。ＨＳＡＤ６３Ｎ、ＨＳＡＡ３２０Ｔ及びＨＳＡＤ４９４Ｎは、自然に存在することが知られるヒト血清アルブミン変異体であり、ヒトの体内に投与しても安全であるといえる。
【0024】
本実施形態の薬物送達用担体において、高マンノース糖鎖と相互作用する物質は、生体適合性ポリマーであってもよいし、タンパク質であってもよい。
【0025】
本明細書において、生体適合性ポリマーとは、生体に投与した場合に、強い炎症反応等の悪影響を及ぼしにくいポリマーを意味する。生体適合性ポリマーは、本発明の効果が得られる限り特に制限されず、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアミノ酸、ポリアクリルアミド、ポリエーテル、ポリエステル、ポリウレタン、多糖類、これらのコポリマー等が挙げられる。
【0026】
高マンノース糖鎖と相互作用するタンパク質としては、ＨＳＡ変異体に結合することにより、ＨＳＡ変異体に結合した高マンノース糖鎖と相互作用するものであれば特に限定されず、例えばＨＳＡそのもの、抗体断片等が挙げられる。
【0027】
高マンノース糖鎖と相互作用するＨＳＡとしては、糖鎖結合部位を有しないＨＳＡが好ましく、野生型のＨＳＡであってもよい。また、抗体断片としては、抗体定常領域（Ｆｃ）が挙げられる。
【0028】
上述したように、高マンノース糖鎖が結合したＨＳＡ（Ｍａｎ－ＨＳＡ）は、ＣＤ２０６及びＣＤ２８０標的能を有している。しかしながら、実施例において後述するように、Ｍａｎ－ＨＳＡを静脈内投与すると、肝臓及び脾臓に高い移行性を示す。このため、Ｍａｎ－ＨＳＡを腫瘍微小環境に存在するＴＡＭ／ＣＡＦまで送達することは困難である。
【0029】
これに対し、実施例において後述するように、本実施形態の薬物送達用担体は、前記高マンノース糖鎖と相互作用する物質が更に結合していることにより、前記高マンノース糖鎖と相互作用し、肝臓や脾臓への移行性が抑制され、血中滞留性が向上している。この結果、腫瘍組織に送達することができ、更に、腫瘍微小環境に存在するＴＡＭ／ＣＡＦまで効率よく送達することができる。
【0030】
すなわち、本実施形態の薬物送達用担体はＭａｎ－ＨＳＡに高マンノース糖鎖と相互作用する物質が更に結合したものであるということができる。本明細書において、相互作用するとは、互いに影響しあうことを意味し、例えば、立体障害を形成すること、分子間相互作用による安定化を行うこと、水素結合を形成すること等であってよい。高マンノース糖鎖と相互作用する物質がＭａｎ－ＨＳＡの高マンノース糖鎖と相互作用することにより、ＨＳＡに結合した高マンノース糖鎖の性質が変化する。
【0031】
より具体的には、Ｍａｎ－ＨＳＡは肝臓や脾臓に高い移行性を示すが、Ｍａｎ－ＨＳＡに高マンノース糖鎖と相互作用する物質が結合することにより、Ｍａｎ－ＨＳＡの高マンノース糖鎖の性質が変化し、肝臓や脾臓への移行性が抑制され、血中滞留性が向上する。したがって、Ｍａｎ－ＨＳＡにおける高マンノース糖鎖の性質を変化させる物質は、高マンノース糖鎖と相互作用しているということもできる。
【0032】
本実施形態の薬物送達用担体において、高マンノース糖鎖と相互作用する物質は、高マンノース糖鎖を被覆するものであるということができる。あるいは、本実施形態の薬物送達用担体において、高マンノース糖鎖と相互作用する物質は、高マンノース糖鎖の存在による血中滞留性の低下を回復させる機能を有するということができる。あるいは、高マンノース糖鎖と相互作用する物質は、高マンノース糖鎖の存在による肝臓や脾臓への移行性を阻害する機能を有するということができる。
【0033】
高マンノース糖鎖と相互作用する物質の分子量の下限値は、５，０００以上であってもよく、３０，０００以上であってもよく、３５，０００以上であってもよく、４０，０００以上であってもよい。また、高マンノース糖鎖と相互作用する物質の分子量の上限値は、１００，０００以下であってもよく、８００，０００以下であってもよく、６００，０００以下であってもよく、５００，０００以下であってもよい。これらの下限値と上限値は任意に組み合わせることができる。例えば、高マンノース糖鎖と相互作用する物質の分子量は５，０００～１００，０００であってもよく、３０，０００～１００，０００であってもよく、４０，０００～１００，０００であってもよく、３５，０００～４５，０００であってもよく、４０，０００であってもよい。ここで、高マンノース糖鎖と相互作用する物質が生体適合性ポリマーである場合、上記の分子量は重量平均分子量である。
【0034】
上述したように、本実施形態の薬物送達用担体はＭａｎ－ＨＳＡに高マンノース糖鎖と相互作用する物質が更に結合したものであるということができる。
【0035】
高マンノース糖鎖と相互作用する物質は、Ｍａｎ－ＨＳＡに化学的な反応により結合させてもよいし、融合タンパク質として結合させてもよい。化学的な反応としては、ケミカルクロスリンカーを用いた反応等が挙げられる。例えば、ＨＳＡの３４番目のシステイン残基はＨＳＡ分子内に唯一存在する遊離のＳＨ基を有するシステイン残基である。
【0036】
そこで、例えば、このシステイン残基のＳＨ基に、マレイミド基を有するケミカルクロスリンカーを反応させることにより、高マンノース糖鎖と相互作用する物質を結合させてもよい。
【0037】
あるいは、本実施形態の薬物送達用担体は、前記高マンノース糖鎖と相互作用する物質がタンパク質であり、前記高マンノース糖鎖と相互作用する物質の結合部位が、前記タンパク質が結合するアミノ酸配列からなる部位であるものであってもよい。すなわち、本実施形態の薬物送達用担体は、Ｍａｎ－ＨＳＡに高マンノース糖鎖と相互作用する物質の結合部位を導入したものであってもよい。このような結合部位としては、例えばＨＳＡ結合アミノ酸配列が挙げられる。
【0038】
ＨＳＡ結合アミノ酸配列が導入されたＭａｎ－ＨＳＡをヒトに投与すると、ヒトの体内において内在性のＨＳＡがＨＳＡ結合アミノ酸配列に結合する。すなわち、投与後の生体内において、本実施形態の薬物送達用担体が完成する。この結果、Ｍａｎ－ＨＳＡに結合した内在性のＨＳＡが高マンノース糖鎖と相互作用する物質として機能し、Ｍａｎ－ＨＳＡを効率よくＴＡＭ／ＣＡＦまで送達することを可能にする。
【0039】
ＨＳＡ結合アミノ酸配列としては、例えば、下記式（２）に示すアミノ酸配列（配列番号９）が挙げられる。式（２）中、Ｘaは、Ｄ及びＥより選択され、Ｘbは、Ｄ及びＥより選択され、Ｘcは、Ａ及びＥより選択される。
ＧＶＳＤＦＹＫＫＬＩＸaＫＡＫＴＶＥＧＶＥＡＬＫＸbＸcＩ（２）
ＧＶＳＤＦＹＫＫＬＩＸaＫＡＫＴＶＥＧＶＥＡＬＫＸbＸcＩ（２）
【0040】
１実施形態において、薬物送達用担体は、Ｄ６３Ｎ、Ａ３２０Ｔ及びＤ４９４Ｎからなる群より選択される少なくとも１つの変異を有するＨＳＡ変異体と、Ｎ－結合型糖鎖結合アミノ酸配列を有しないＨＳＡとの融合タンパク質であってもよい。
【0041】
この場合、ＨＳＡ変異体とＮ－結合型糖鎖結合アミノ酸配列を有しないＨＳＡは、いずれがＮ末端側に位置していてもよい。また、ＨＳＡ変異体とＮ－結合型糖鎖結合アミノ酸配列を有しないＨＳＡとの間には適宜のリンカー配列を含めてもよい。
【0042】
ここで、Ｎ－結合型糖鎖結合アミノ酸配列を有しないＨＳＡとは、高マンノース糖鎖と相互作用するＨＳＡである。Ｎ－結合型糖鎖結合アミノ酸配列を有しないＨＳＡは、糖鎖結合部位を有しないＨＳＡが好ましく、野生型のＨＳＡであってもよい。
【0043】
このような融合タンパク質としては、ＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡ）二量体、（Ｍａｎ－ＨＳＡ）－ＨＳＡ二量体が挙げられる。
【0044】
ＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡ）は、例えばＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡＤ６３Ｎ）であってもよいし、例えば、ＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡＡ３２０Ｔ）であってもよいし、例えばＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡＤ４９４Ｎ）であってもよい。
【0045】
また、（Ｍａｎ－ＨＳＡ）－ＨＳＡは、例えば（Ｍａｎ－ＨＳＡＤ６３Ｎ）－ＨＳＡであってもよいし、例えば、（Ｍａｎ－ＨＳＡＡ３２０Ｔ）－ＨＳＡであってもよいし、例えば（Ｍａｎ－ＨＳＡＤ４９４Ｎ）－ＨＳＡであってもよい。
【0046】
また、１実施形態において、本発明は、ＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡ）融合タンパク質、又は（Ｍａｎ－ＨＳＡ）－ＨＳＡ融合タンパク質をコードする核酸を提供する。このような核酸を酵母で発現させることにより、薬物送達用担体を容易に製造することができる。
【0047】
ＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡＤ６３Ｎ）のアミノ酸配列を配列番号１０に示し、ＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡＤ６３Ｎ）をコードする塩基配列を配列番号１１に示す。また、ＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡＡ３２０Ｔ）のアミノ酸配列を配列番号１２に示し、ＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡＡ３２０Ｔ）をコードする塩基配列を配列番号１３に示す。また、ＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡＤ４９４Ｎ）のアミノ酸配列を配列番号１４に示し、ＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡＤ４９４Ｎ）をコードする塩基配列を配列番号１５に示す。
【0048】
また、（Ｍａｎ－ＨＳＡＤ６３Ｎ）－ＨＳＡのアミノ酸配列を配列番号１６に示し、（Ｍａｎ－ＨＳＡＤ６３Ｎ）－ＨＳＡをコードする塩基配列を配列番号１７に示す。また、（Ｍａｎ－ＨＳＡＡ３２０Ｔ）－ＨＳＡのアミノ酸配列を配列番号１８に示し、（Ｍａｎ－ＨＳＡＡ３２０Ｔ）－ＨＳＡをコードする塩基配列を配列番号１９に示す。また、（Ｍａｎ－ＨＳＡＤ４９４Ｎ）－ＨＳＡのアミノ酸配列を配列番号２０に示し、（Ｍａｎ－ＨＳＡＤ４９４Ｎ）－ＨＳＡをコードする塩基配列を配列番号２１に示す。
【0049】
１実施形態において、薬物送達用担体は、Ｄ６３Ｎ、Ａ３２０Ｔ及びＤ４９４Ｎからなる群より選択される少なくとも１つの変異を有するＨＳＡ変異体と、抗体定常領域との融合タンパク質であってもよい。
【0050】
抗体定常領域としては、特に限定されず、ＩｇＧ１の定常領域、ＩｇＧ２の定常領域、ＩｇＧ３の定常領域、ＩｇＧ４の定常領域、ＩｇＡ１の定常領域、ＩｇＡ２の定常領域、ＩｇＭの定常領域等を用いることができる。
【0051】
また、１実施形態において、本発明は、ＨＳＡ変異体と、抗体定常領域との融合タンパク質をコードする核酸を提供する。このような核酸を酵母で発現させることにより、薬物送達用担体を容易に製造することができる。
【0052】
［薬物送達システム］
１実施形態において、本発明は、上述した薬物送達用担体と、薬物とが結合した、薬物送達システムを提供する。実施例において後述するように、本実施形態の薬物送達システムを投与することにより、腫瘍微小環境に存在する腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）及び癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）に効率よく薬物を送達することができる。
１実施形態において、本発明は、上述した薬物送達用担体と、薬物とが結合した、薬物送達システムを提供する。実施例において後述するように、本実施形態の薬物送達システムを投与することにより、腫瘍微小環境に存在する腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）及び癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）に効率よく薬物を送達することができる。
【0053】
本実施形態の薬物送達システムは、癌治療剤、腫瘍微小環境の改善剤、造影剤等として利用することができる。本実施形態の薬物送達システムにおいて、薬物としては、抗癌剤、ＴＡＭ／ＣＡＦの性質を改変させる薬物、造影剤等が挙げられる。
【0054】
抗癌剤としては、特に限定されず、パクリタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、５－フルオロウラシル、ドセタキセル等が挙げられる。
【0055】
ＴＡＭ／ＣＡＦの性質を改変させる薬物としては、Ｍ２様マクロファージであるＴＡＭを効率良くＭ１様マクロファージに誘導することが知られているコロソリン酸、オレアノリン酸等；癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）の阻害剤であるプロパゲルマニウム等が挙げられる。
【0056】
薬物としてＴＡＭ／ＣＡＦの性質を改変させる薬物を担持させた場合、本実施形態の薬物送達システムは、腫瘍微小環境の改善剤として利用することができる。
【0057】
造影剤としては、硫酸バリウム、次炭酸ビスマス、酸化ビスマス、酸化ジルコニウム、フッ化イッテルビウム、ヨードホルム、バリウムアパタイト、チタン酸バリウム、ランタンガラス、バリウムガラス、ストロンチウムガラス等のＸ線造影剤；ヨード造影剤等のＣｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＣＴ）用造影剤；ガドリニウム製剤、超常磁性酸化鉄製剤（Ｓｕｐｅｒ Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ Ｉｒｏｎ Ｏｘｉｄｅ、ＳＰＩＯ）等のＭＲＩ用造影剤；テクネチウム９９ｍ（９９ｍＴｃ）、モリブデン９９（９９Ｍｏ）等のＳｉｎｇｌｅ ｐｈｏｔｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｃｏｍｐｕｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＳＰＥＣＴ）用放射性同位体等が挙げられる。
【0058】
薬物として造影剤を担持させた場合、本実施形態の薬物送達システムは、腫瘍微小環境を高精度に観察する造影剤として利用することができる。
【0059】
本実施形態の薬物送達システムは、ＨＳＡを薬物送達用担体として利用する。このため、ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ（ＥＰＲ）効果による「受動的ターゲティング」だけに留まらず、ＨＳＡレセプターとよばれ、内皮細胞に存在するｇｐ６０や、多くの種類の癌組織に存在するＳｅｃｒｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ Ｒｉｃｈ ｉｎ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ（ＳＰＡＲＣ）による「能動的ターゲティング」も機能する。したがって、極めて効率よく癌細胞標的能及び腫瘍癌微小環境標的能を発揮することができる。
【0060】
また、好都合なことに、ＨＳＡは多種多様な薬物を搭載可能である。このため、新規Ｍ１誘導剤やＣＡＦ阻害剤が見出された場合にも、本実施形態の薬物送達システムに適用することができ、汎用性が非常に広い。
【0061】
［癌治療剤］
１実施形態において、本発明は、８個以上のマンノース残基を有する高マンノース糖鎖と、重量平均分子量が３０，０００～５０，０００である生体適合性ポリマーが結合した、ヒト血清アルブミン変異体を含む薬物送達用担体と、抗癌剤とが結合した、癌治療剤を提供する。
１実施形態において、本発明は、８個以上のマンノース残基を有する高マンノース糖鎖と、重量平均分子量が３０，０００～５０，０００である生体適合性ポリマーが結合した、ヒト血清アルブミン変異体を含む薬物送達用担体と、抗癌剤とが結合した、癌治療剤を提供する。
【0062】
本実施形態の癌治療剤において、ヒト血清アルブミン変異体、生体適合性ポリマーについては、上述したものと同様である。また、抗癌剤としては、上述したものと同様のものが挙げられるが、パクリタキセルが好ましい。
【0063】
実施例において後述するように、本実施形態の抗癌剤は、優れた抗腫瘍効果を奏し、副作用が少ない。
【0064】
本実施形態の癌治療剤は、注射剤の剤型に製剤化されていることが好ましい。注射剤用の溶媒としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等の補助薬を含む等張液が挙げられる。注射剤用の溶媒は、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ－５０等の非イオン性界面活性剤等を含有していてもよい。
【0065】
患者への投与は、例えば、静脈内注射又は点滴静脈内注射により行われることが好ましい。本実施形態の癌治療剤の投与量は、患者の体重や年齢、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。症状により差異はあるが、１回あたり、薬物送達用担体と薬物とが結合した癌治療剤として約１～１０ｍｇ／ｋｇの投与量が適切であると考えられる。
【0066】
参考までに、献血アルブミン製剤は、約８３．３～２０８．３ｍｇ／ｋｇの投与量で投与されている。
【0067】
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、８個以上のマンノース残基を有する高マンノース糖鎖と、重量平均分子量が３０，０００～５０，０００である生体適合性ポリマーが結合した、ヒト血清アルブミン変異体を含む薬物送達用担体と、抗癌剤とが結合した、癌治療剤の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む癌の治療方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、８個以上のマンノース残基を有する高マンノース糖鎖と、重量平均分子量が３０，０００～５０，０００である生体適合性ポリマーが結合した、ヒト血清アルブミン変異体を含む薬物送達用担体と、抗癌剤とが結合した、癌治療剤の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む癌の治療方法を提供する。
【0068】
１実施形態において、本発明は、癌の治療のための、８個以上のマンノース残基を有する高マンノース糖鎖と、重量平均分子量が３０，０００～５０，０００である生体適合性ポリマーが結合した、ヒト血清アルブミン変異体を含む薬物送達用担体と、抗癌剤との結合体を提供する。
【0069】
１実施形態において、本発明は、癌治療剤の製造のための、８個以上のマンノース残基を有する高マンノース糖鎖と、重量平均分子量が３０，０００～５０，０００である生体適合性ポリマーが結合した、ヒト血清アルブミン変異体を含む薬物送達用担体の使用を提供する。薬物送達用担体には抗癌剤が結合される。
【0070】
これらの各実施形態において、ヒト血清アルブミン変異体、生体適合性ポリマーについては、上述したものと同様である。また、抗癌剤としては、上述したものと同様のものが挙げられるが、パクリタキセルが好ましい。
【実施例】
【0071】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0072】
［実験例１］
（Ｍａｎ－ＨＳＡの作製）
上述したように、野生型のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）には糖鎖結合部位が存在しない。野生型のＨＳＡのアミノ酸配列を配列番号１に示し、ＨＳＡをコードする塩基配列を配列番号２に示す。
（Ｍａｎ－ＨＳＡの作製）
上述したように、野生型のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）には糖鎖結合部位が存在しない。野生型のＨＳＡのアミノ酸配列を配列番号１に示し、ＨＳＡをコードする塩基配列を配列番号２に示す。
【0073】
まず、野生型のＨＳＡの第６３番目のアスパラギン酸残基をアスパラギン残基に改変することにより、糖鎖結合部位を有する変異体（ＨＳＡＤ６３Ｎ）の発現ベクターを作製した。また、野生型のＨＳＡの第３２０番目のアラニン残基をトレオニン残基に改変することにより、糖鎖結合部位を有する変異体（ＨＳＡＡ３２０Ｔ）の発現ベクターを作製した。また、野生型のＨＳＡの第４９４番目のアスパラギン酸残基をアスパラギン残基に改変することにより、糖鎖結合部位を有する変異体（ＨＳＡＤ４９４Ｎ）の発現ベクターを作製した。
【0074】
具体的には、プラスミドｐＰＩＣ９に野生型のＨＳＡをコードする遺伝子断片が導入された発現ベクター（ｐＰＩＣ９－ＨＳＡ）に市販のキット（商品名「ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」、アジレントテクノロジー社）を用いて変異を導入し、ＨＳＡＤ６３Ｎ、ＨＳＡＡ３２０Ｔ、ＨＳＡＤ４９４Ｎの発現ベクター（それぞれ、「ｐＰＩＣ９－ＨＳＡＤ６３Ｎ」、「ｐＰＩＣ９－ＨＳＡＡ３２０Ｔ」、「ｐＰＩＣ９－ＨＳＡＤ４９４Ｎ」という。）を作製した。
【0075】
ＨＳＡＤ６３Ｎのアミノ酸配列を配列番号３に示し、ＨＳＡＤ６３Ｎをコードする塩基配列を配列番号４に示す。また、ＨＳＡＡ３２０Ｔのアミノ酸配列を配列番号５に示し、ＨＳＡＡ３２０Ｔをコードする塩基配列を配列番号６に示す。また、ＨＳＡＤ４９４Ｎのアミノ酸配列を配列番号７に示し、ＨＳＡＤ４９４Ｎをコードする塩基配列を配列番号８に示す。
【0076】
続いて、各発現ベクターを酵母に導入し、野生型ＨＳＡ又は作製したＨＳＡ変異体を発現させた。酵母の形質転換はエレクトロポレーション法を用いて行なった。具体的には、各発現ベクターをＳａｌＩで消化し、エレクトロポレーション装置（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、ＢＩＯ－ＲＡＤ製）を用いて、ピキア酵母（ＧＳ１１５株）のＨＩＳ４遺伝子座へ相同組換えにより形質転換させた。
【0077】
形質転換したピキア酵母は、ＢＭＧＹ液体培地（１％酵母エキストラクト、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０、１．３４％酵母ニトロゲンベース、４×１０－５％ビオチン、１％グリセロール）中で４８時間培養し、その後、ＢＭＭＹ培地中で２４時間毎に１％メタノールを添加しながら９６時間培養した。続いて、６，０００×ｇで１０分間遠心分離して酵母を分離した後、培養液に３０％（ｖ／ｖ）となるように硫酸アンモニウムを添加し、遠心分離することにより、不純物を沈殿させた。続いて、回収した上清に８０％（ｖ／ｖ）となるように硫酸アンモニウムを添加してｐＨを５．５に調整し、一晩攪拌した。続いて、１５，０００×ｇ、２０分間遠心分離して目的のタンパク質（野生型ＨＳＡ又は作製したＨＳＡ変異体）を沈殿させた。沈殿したタンパク質を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶解及び透析した後、ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＸＬカラム（ＧＥヘルスケア社）に結合させ、０～５００ｍＭ ＮａＣｌの濃度勾配により溶出させた。その後、溶出液を１．５Ｍ硫酸アンモニウム／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で透析し、更にＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社）に通し、１．５～０Ｍ硫酸の濃度勾配によりタンパク質を溶出させた。
【0078】
作製した変異体ＨＳＡＤ６３Ｎ、ＨＳＡＡ３２０Ｔ、ＨＳＡＤ４９４Ｎには、２残基のＮアセチルグルコサミン及びこれに続く８～１４残基のマンノースが結合していることを質量分析により確認した。より詳細には、ＨＳＡＤ６３Ｎには１～２残基、ＨＳＡＡ３２０Ｔには２～３残基、ＨＳＡＤ４９４Ｎには１３残基のＮアセチルグルコサミン残基及びマンノース残基が結合していることが確認された。
【0079】
以下、精製したＨＳＡＤ６３Ｎ、ＨＳＡＡ３２０Ｔ、ＨＳＡＤ４９４Ｎの各タンパク質をＭａｎ－ＨＳＡという場合がある。
【0080】
［実験例２］
（Ｍｏｎｏ－ＰＥＧ－Ｍａｎ－ＨＳＡの作製）
Ｍａｎ－ＨＳＡには１ヶ所の遊離のＳＨ基が存在する。このＳＨ基にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）マレイミドを結合させることにより、１分子あたりＰＥＧ鎖が１つ結合したＭａｎ－ＨＳＡ（以下、「Ｍｏｎｏ－ＰＥＧ－Ｍａｎ－ＨＳＡ」という。）を作製した。図１５（ａ）は、Ｍｏｎｏ－ＰＥＧ－Ｍａｎ－ＨＳＡ（Ｄ４９４Ｎ）の構造を示す模式図である。図１５（ａ）中、点線の丸で囲んだ領域は高マンノース糖鎖を示す。ＰＥＧマレイミドとしては、ＰＥＧの分子量（重量平均分子量）が５，０００（５ｋ）であるものと４０，０００（４０ｋ）であるものを使用した。
（Ｍｏｎｏ－ＰＥＧ－Ｍａｎ－ＨＳＡの作製）
Ｍａｎ－ＨＳＡには１ヶ所の遊離のＳＨ基が存在する。このＳＨ基にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）マレイミドを結合させることにより、１分子あたりＰＥＧ鎖が１つ結合したＭａｎ－ＨＳＡ（以下、「Ｍｏｎｏ－ＰＥＧ－Ｍａｎ－ＨＳＡ」という。）を作製した。図１５（ａ）は、Ｍｏｎｏ－ＰＥＧ－Ｍａｎ－ＨＳＡ（Ｄ４９４Ｎ）の構造を示す模式図である。図１５（ａ）中、点線の丸で囲んだ領域は高マンノース糖鎖を示す。ＰＥＧマレイミドとしては、ＰＥＧの分子量（重量平均分子量）が５，０００（５ｋ）であるものと４０，０００（４０ｋ）であるものを使用した。
【0081】
具体的には、Ｍａｎ－ＨＳＡ（Ｄ４９４Ｎ）に、タンパク質の５倍量のＰＥＧマレイミドを加え、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４、５ｍＭ ＥＤＴＡ）中、３７℃で２４時間反応させた。続いて、限外ろ過デバイス（商品名「ビバスピン２」、ザルトリウス社）を用いて反応液を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に置換した。
【0082】
続いて、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによりＭｏｎｏ－ＰＥＧ－Ｍａｎ－ＨＳＡを精製した。図１（ａ）は陰イオン交換カラムクロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラムである。図１（ａ）に示すように、アルブミン表面の負電荷状態を反映したピークが確認された。ＰＥＧマレイミドを反応させたＭａｎ－ＨＳＡをカラムにアプライし、初めのピークが溶出された後に、緩衝液の塩濃度を０．１Ｎ ＮａＣｌに変更した。続いて、溶出されたピーク（Ｆ１、Ｆ２及びＦ３）のフラクションを回収した。続いて、０．３Ｎ ＮａＣｌまでの濃度勾配で溶出された各ピーク（Ｆ４及びＦ５）のフラクションを回収した。
【0083】
続いて、回収したフラクションＦ１～Ｆ５を１０％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離し、銀染色により染色した。図１（ｂ）はＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図１（ｂ）中、「Ｐｒｅ」は、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーで精製する前のＭｏｎｏ－ＰＥＧ－Ｍａｎ－ＨＳＡを表し、「Ｍａｎ－ＨＳＡ」は、ＰＥＧを結合させていないＭａｎ－ＨＳＡを表す。
【0084】
その結果、フラクションＦ１～Ｆ３に、高純度なＭｏｎｏ－ＰＥＧ－Ｍａｎ－ＨＳＡが精製できていることが確認された。続いて、精製したＭｏｎｏ－ＰＥＧ－Ｍａｎ－ＨＳＡをポアサイズ０．２μｍのフィルターでろ過滅菌し、４℃の冷蔵庫で保存した。
【0085】
以下、ＰＥＧの分子量５ｋのＰＥＧを結合させたＭａｎ－ＨＳＡを「ＰＥＧ５ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ」といい、ＰＥＧの分子量４０ｋのＰＥＧを結合させたＭａｎ－ＨＳＡを「ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ」という。
【0086】
［実験例３］
（物性評価）
《分子サイズ・ゼータ電位の測定》
実験例２で作製したＰＥＧ５ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ及びＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡの物性を評価した。具体的には、測定装置（商品名「ゼータサイザーナノ」、マルバーン社）を用いて分子サイズ及びゼータ電位を測定した。また、比較のために、野生型のＨＳＡ及びＭａｎ－ＨＳＡ（Ｄ４９４Ｎ）についても同様の測定を行った。
（物性評価）
《分子サイズ・ゼータ電位の測定》
実験例２で作製したＰＥＧ５ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ及びＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡの物性を評価した。具体的には、測定装置（商品名「ゼータサイザーナノ」、マルバーン社）を用いて分子サイズ及びゼータ電位を測定した。また、比較のために、野生型のＨＳＡ及びＭａｎ－ＨＳＡ（Ｄ４９４Ｎ）についても同様の測定を行った。
【0087】
下記表１に、分子サイズ及びゼータ電位の測定結果を示す。表１中、「ＨＳＡ」は野生型のＨＳＡを表し、Ｍａｎ－ＨＳＡはＭａｎ－ＨＳＡ（Ｄ４９４Ｎ）を表す。
【0088】
【表1】
【0089】
その結果、ＰＥＧの分子量依存的に分子サイズの上昇が確認された。また、ゼータ電位は、マンノースやＰＥＧの影響が認められるものの、ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡにおいてもＨＳＡの特徴である表面の負電荷を保持していることが確認された。
【0090】
《ＣＤスペクトル分析》
続いて、ＣＤスペクトル分析により、ＰＥＧ５ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ及びＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡのタンパク質の二次元／三次元構造を評価した。ＣＤスペクトル分析には分光偏光計（型式「Ｊ－８２０」、日本分光）を使用した。近紫外のＣＤスペクトル分析は、ＨＳＡ濃度を１０μＭ（リン酸緩衝液（ＰＢＳ））に調整し、１０ｍｍセルを用いて行った。測定条件は以下の通りとした。
測定波長 ：２５０～２００ｎｍ
感度 ：５００ｍｄｅｇ
スキャンスピード ：５ｎｍ／分
時定数 ：８秒
ステップ解像度 ：０．５ｎｍ
累積 ：１
続いて、ＣＤスペクトル分析により、ＰＥＧ５ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ及びＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡのタンパク質の二次元／三次元構造を評価した。ＣＤスペクトル分析には分光偏光計（型式「Ｊ－８２０」、日本分光）を使用した。近紫外のＣＤスペクトル分析は、ＨＳＡ濃度を１０μＭ（リン酸緩衝液（ＰＢＳ））に調整し、１０ｍｍセルを用いて行った。測定条件は以下の通りとした。
測定波長 ：２５０～２００ｎｍ
感度 ：５００ｍｄｅｇ
スキャンスピード ：５ｎｍ／分
時定数 ：８秒
ステップ解像度 ：０．５ｎｍ
累積 ：１
【0091】
また、遠紫外のＣＤスペクトル分析は、ＨＳＡ濃度を１０μＭ（ＰＢＳ）に調整し、１ｍｍセルを用いて行った。測定条件は以下の通りとした。
測定波長 ：３５０～２５０ｎｍ
感度 ：５００ｍｄｅｇ
スキャンスピード ：１０ｎｍ／分
時定数 ：８秒
ステップ解像度 ：０．５ｎｍ
累積 ：３
測定波長 ：３５０～２５０ｎｍ
感度 ：５００ｍｄｅｇ
スキャンスピード ：１０ｎｍ／分
時定数 ：８秒
ステップ解像度 ：０．５ｎｍ
累積 ：３
【0092】
また、比較のために、野生型のＨＳＡ及びＭａｎ－ＨＳＡ（Ｄ４９４Ｎ）についても同様の測定を行った。図２（ａ）及び（ｂ）は、ＣＤスペクトル分析の結果を示すグラフである。図２（ａ）は近紫外のＣＤスペクトル分析の結果であり、図２（ｂ）は遠紫外のＣＤスペクトル分析の結果である。その結果、ＨＳＡが本来有する二次元／三次元構造に対し、ＰＥＧ修飾は大きな変化を与えないことが確認された。
【0093】
《ＰＡＳ染色》
続いて、糖鎖を検出する際に汎用されるＰＡＳ染色により、ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡの糖鎖を検出した。比較のために、野生型のＨＳＡ及びＭａｎ－ＨＳＡ（Ｄ４９４Ｎ）についても同様の測定を行った。
続いて、糖鎖を検出する際に汎用されるＰＡＳ染色により、ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡの糖鎖を検出した。比較のために、野生型のＨＳＡ及びＭａｎ－ＨＳＡ（Ｄ４９４Ｎ）についても同様の測定を行った。
【0094】
具体的には、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った後、ゲルを５０％メタノールに一晩浸した。続いて、イオン交換水で２回洗浄後、０．５％過ヨウ素酸中で１時間振とうさせた。続いて、イオン交換水で２０分間洗浄し、シッフ試薬を１時間反応させた。続いて、シッフ試薬を取り除き、０．５５％亜硫酸水中で２時間振とうさせた。続いて、イオン交換水で２回洗浄し、バンドを観察した。
【0095】
図３（ａ）は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後のＣＢＢ染色の結果を示す写真であり、図３（ｂ）は、ＰＡＳ染色の結果を示す写真である。その結果、ＣＢＢ染色によって確認されるＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ由来のバンドと同位置にＰＡＳ染色においてもバンドが観察された。この結果から、ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡは糖鎖を有していることが確認された。
【0096】
［実験例４］
（体内動態評価）
《健常マウスモデルによる評価》
実験例２で作製したＭｏｎｏ－ＰＥＧ－Ｍａｎ－ＨＳＡの動態特性を評価するため、健常マウスに１２５Ｉ標識した、ＨＳＡ、Ｍａｎ－ＨＳＡ、ＰＥＧ５ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ及びＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡを静脈内投与し、血漿中濃度の推移及び臓器分布を検討した。
（体内動態評価）
《健常マウスモデルによる評価》
実験例２で作製したＭｏｎｏ－ＰＥＧ－Ｍａｎ－ＨＳＡの動態特性を評価するため、健常マウスに１２５Ｉ標識した、ＨＳＡ、Ｍａｎ－ＨＳＡ、ＰＥＧ５ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ及びＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡを静脈内投与し、血漿中濃度の推移及び臓器分布を検討した。
【0097】
各種アルブミンの１２５Ｉ標識は、市販のキット（商品名「ＩＯＤＯ－ＧＥＮ Ｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ」、ピアス社）を用いて行った。具体的には、まず、ＩＯＤＯ－ＧＥＮ Ｒｅａｇｅｎｔ ｃｏａｔｉｎｇ ｔｕｂｅにアルブミン４００μｇを加え、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）４０μＬと水で全量を２００μＬとした。続いて、この混合液にＮａ１２５Ｉを５μＬ添加し、３０分間室温で放置した後、ＰＤ－１０カラムを用いたゲル濾過により精製した。比活性は８００ｃｐｍ／ｎｇであった。
【0098】
健常モデルマウスとしては、ＩＣＲマウス（雄、３週齢、日本ＳＬＣ社）を１週間、５ｍＭヨウ化ナトリウム溶液を飲料水として与えることによりヨードブロックを行って予備飼育し、４週齢の時点で実験に使用した。
【0099】
各マウスを実験前日より絶食させた後、１２５Ｉ標識各種アルブミンを５ｋＢｑ／匹の用量でマウス尾静脈より急速注入した。続いて、ヘパリン処理した１ｍＬの注射筒で規定時間毎に下大静脈から約３００μＬ採血し、３０００ｒｐｍで１０分遠心分離し、血漿１００μＬを採取した。続いて、採取した血漿の放射活性をオートウェルカウンター（型式「ＡＲＣ－２０００」、アロカ社）で測定した。また、同時に各臓器の放射活性も測定した。血中滞留性は、投与直後から１２時間後まで継時的に評価した。また、臓器分布は、投与直後から３時間後まで経時的に評価した。
【0100】
図４は、１２５Ｉ標識ＨＳＡ、Ｍａｎ－ＨＳＡ、ＰＥＧ５ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ及びＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡを静脈内投与し、血漿中濃度の推移を測定した結果を示すグラフである。図４中、「＊」はＨＳＡの結果と比較してＰ＜０．０５で有意差があることを示し、「†」はＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡの結果と比較してＰ＜０．０５で有意差があることを示す。
【0101】
その結果、Ｍａｎ－ＨＳＡは、ＨＳＡと比較して、血中滞留性が有意に低下したことが確認された。また、ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡは、Ｍａｎ－ＨＳＡと比較して、血中滞留性が有意に上昇したことが確認された。また、ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡの血中滞留性は、ＨＳＡの血中滞留性と同程度であった。
【0102】
また、下記表２に、血中滞留性の評価結果に基づく体内動態パラメータを示す。表２中、「＊」はＨＳＡの結果と比較してＰ＜０．０５で有意差があることを示し、「†」はＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡの結果と比較してＰ＜０．０５で有意差があることを示す。
【0103】
【表2】
【0104】
また、図５（ａ）に肝臓における各種アルブミンの存在量の推移を示し、図５（ｂ）に脾臓における各種アルブミンの存在量の推移を示し、図６（ａ）に腎臓における各種アルブミンの存在量の推移を示し、図６（ｂ）に肺における各種アルブミンの存在量の推移を示し、図６（ｃ）に心臓における各種アルブミンの存在量の推移を示す。図５及び図６中、「＊」はＨＳＡの結果と比較してＰ＜０．０５で有意差があることを示し、「†」はＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡの結果と比較してＰ＜０．０５で有意差があることを示し、「‡」はＰＥＧ５ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡの結果と比較してＰ＜０．０５で有意差があることを示す。
【0105】
その結果、Ｍａｎ－ＨＳＡは肝臓及び脾臓に高い移行性を示すことが確認された。これに対し、ＰＥＧ５ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ及びＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡでは、肝臓及び脾臓への移行性がＭａｎ－ＨＳＡよりも抑制されたことが明らかとなった。
【0106】
《担癌マウスモデルによる評価》
続いて、担癌マウスモデルを用いて、実験例２で作製したＭｏｎｏ－ＰＥＧ－Ｍａｎ－ＨＳＡの動態特性を評価した。担癌マウスモデルとしては、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ担癌モデルマウスを使用した。
続いて、担癌マウスモデルを用いて、実験例２で作製したＭｏｎｏ－ＰＥＧ－Ｍａｎ－ＨＳＡの動態特性を評価した。担癌マウスモデルとしては、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ担癌モデルマウスを使用した。
【0107】
具体的には、Ｃ５７ＢＬ６マウス（雄、８週齢、日本ＳＬＣ社）をエーテルで麻酔し、Ｂ１６Ｆ１０細胞懸濁液（２×１０６個／１００μＬ生理食塩水）を背中側皮下に投与し、Ｂ１６Ｆ１０担癌マウスを作製した。続いて、担癌１週間後から１週間、５ｍＭヨウ化ナトリウム溶液を飲料水として与えることによりヨードブロックを行って予備飼育し、担癌１４日後（１０週齢）の時点で実験に使用した。担癌１４日後における腫瘍体積は約４００ｍｍ３であった。腫瘍体積（ｖ）は、腫瘍の短径（ａ）と長径（ｂ）を計測し、下記式（Ｆ１）により算出した。
ｖ＝０．４×ａ２ｂ （Ｆ１）
ｖ＝０．４×ａ２ｂ （Ｆ１）
【0108】
各マウスを実験前日より絶食させた後、１２５Ｉ標識各種アルブミンを５ｋＢｑ／匹の用量でマウス尾静脈より急速注入した。続いて、ヘパリン処理した１ｍＬの注射筒で規定時間毎に下大静脈から約３００μＬ採血し、３０００ｒｐｍで１０分遠心分離し、血漿１００μＬを採取した。続いて、採取した血漿の放射活性をオートウェルカウンター（型式「ＡＲＣ－２０００」、アロカ社）で測定した。また、同時に各臓器の放射活性も測定した。各種アルブミンの血漿中濃度は、投与直後、１時間後及び１２時間後に測定した。また、臓器分布は、投与直後から１２時間後に評価した。
【0109】
図７は、１２５Ｉ標識ＨＳＡ、Ｍａｎ－ＨＳＡ、ＰＥＧ５ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ及びＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡを静脈内投与し、血漿中濃度の推移を測定した結果を示すグラフである。図７中、「＊」はＨＳＡの結果と比較してＰ＜０．０５で有意差があることを示し、「＃」はＰ＜０．０５で有意差があることを示す。
【0110】
その結果、健常モデルマウスと同様に、Ｍａｎ－ＨＳＡはＨＳＡと比較して、血中滞留性が有意に低下したことが確認された。また、ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡは、投与１２時間後においてもＨＳＡより高い血中滞留性を示すことが明らかとなった。
【0111】
【0112】
その結果、Ｍａｎ－ＨＳＡと比較して、ＰＥＧ５ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ及びＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡは、腫瘍組織への移行性が上昇したことが明らかとなった。また、ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡの腫瘍組織への移行性は、Ｍａｎ－ＨＳＡ及びＰＥＧ５ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡのいずれよりも有意に高いことが明らかとなった。
【0113】
［実験例５］
（インビボにおける腫瘍内マクロファージへの移行性評価）
まず、腫瘍組織にマンノース受容体（ＣＤ２０６）発現ＴＡＭが存在するかを検討した。具体的には、実験例４と同様にして作製したＢ１６Ｆ１０メラノーマ担癌モデルマウスの腫瘍を回収して腫瘍凍結切片を作製し、マクロファージマーカーであるＦ４／８０と、Ｍ２マクロファージマーカーであるＣＤ２０６（ＭＲＣ１）の蛍光免疫染色を行った。
（インビボにおける腫瘍内マクロファージへの移行性評価）
まず、腫瘍組織にマンノース受容体（ＣＤ２０６）発現ＴＡＭが存在するかを検討した。具体的には、実験例４と同様にして作製したＢ１６Ｆ１０メラノーマ担癌モデルマウスの腫瘍を回収して腫瘍凍結切片を作製し、マクロファージマーカーであるＦ４／８０と、Ｍ２マクロファージマーカーであるＣＤ２０６（ＭＲＣ１）の蛍光免疫染色を行った。
【0114】
具体的には、まず、４％パラホルムアルデヒドを用いて、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ担癌モデルマウスから採取した腫瘍の凍結切片（５μｍ）を、４℃で１０分間固定した。続いて、４％のブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）を用いて常温下で１０分間ブロッキングした。
【0115】
続いて、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳを用いて、抗Ｆ４／８０抗体（ｃａｔ＃「１４－４８０１」、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を５０倍希釈した。また、抗ＭＲＣ１抗体（ｃａｔ＃「ＡＦ２５３５」、Ｒ＆Ｄシステムズ社）を１００倍希釈した。続いて、各抗体をブロッキングした組織切片に添加し、４℃で一晩反応させた。
【0116】
続いて、抗Ｆ４／８０抗体に対してはＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｒａｔ ＩｇＧ（ｃａｔ＃「ａｂ１５０１５７」、ａｂｃａｍ社）を５０倍希釈したものを二次抗体とし、抗ＭＲＣ１抗体に対してはＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－Ｇｏａｔ ＩｇＧ（ｃａｔ＃「Ａ－２１４４７」、インビロトジェン社）を１００倍希釈したものを二次抗体として、常温下で９０分間反応させた。
【0117】
続いて、免疫染色後の組織切片を洗浄し、マリノール（武藤化学株式会社）で封入後、蛍光顕微鏡（型式「ＢＺ－８０００」、キーエンス社）を用いて観察した。
【0118】
図９は、結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図９中、「Ｆ４／８０」は抗Ｆ４／８０抗体による染色結果であることを示し、「Ｍφ」はマクロファージを示し、「ＣＤ２０６」は抗ＣＤ２０６（ＭＲＣ１）抗体による染色結果であることを示し、「Ｍ２Ｍφ」はＭ２マクロファージを示し、「Ｍｅｒｇｅｄ」は、抗Ｆ４／８０抗体による染色結果と抗ＣＤ２０６（ＭＲＣ１）抗体による染色結果を合成した結果であることを示し、「×６０」は、倍率６０倍で観察した結果であることを示し、「×１２０」は、６０倍で撮影した写真における四角で囲んだ領域を倍率１２０倍で観察した結果であることを示し、「Ａｂｓ（－）」は一次抗体非添加群を示す。また、倍率６０倍におけるスケールバーは１０μｍを示し、倍率１２０倍におけるスケールバーは１０μｍを示し、Ａｂｓ（－）におけるスケールバーは１０μｍを示す。
【0119】
その結果、Ｆ４／８０陽性領域とＣＤ２０６陽性領域が共局在する領域（図９中、矢印で示す。）が広範囲に確認された。この結果から、腫瘍組織に存在する大部分のマクロファージがＣＤ２０６を発現するＴＡＭであることが明らかとなった。
【0120】
続いて、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ担癌モデルマウスにＦＩＴＣ標識ＨＳＡ及びＦＩＴＣ標識ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡを尾静脈投与し、ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡがＴＡＭに移行するか否かを評価した。
【0121】
まず、ＨＳＡ及び実験例２で作製したＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ（４ｍｇ／ｍＬ）各１ｍＬと、ＦＩＴＣ（１ｍｇ／ｍＬ）５００μＬをそれぞれ混合して室温で３時間インキュベートすることにより、ＦＩＴＣ標識アルブミンを作製した。続いて、限外ろ過デバイス（商品名「ビバスピン２」、ザルトリウス社）を用いて未反応のＦＩＴＣを除去した。
【0122】
続いて、実験例４と同様にして作製したＢ１６Ｆ１０メラノーマ担癌モデルマウスにＦＩＴＣ標識ＨＳＡ及びＦＩＴＣ標識ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡを、蛍光量及びタンパク質量を揃えて０．５ｍｇ／ｋｇでそれぞれ尾静脈投与した。
【0123】
続いて、投与１時間後に各マウスから腫瘍組織を回収し、腫瘍組織中のマクロファージを単離して、フローサイトメーターによりＦＩＴＣ標識ＨＳＡ及びＦＩＴＣ標識ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡの取り込み量を測定した。
【0124】
腫瘍組織中のマクロファージの単離は次のようにして行った。まず、回収した腫瘍組織をハサミで細かくミンスした。続いて、得られたペースト状の腫瘍組織に０．０５％コラゲナーゼ（ｔｙｐｅＩＶ、シグマ社）を２００μＬ加え、１，５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心処理後、沈殿物を回収した。
【0125】
続いて、得られた沈殿物を、１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ培地で懸濁し、ナイロンメッシュで裏ごしした。続いて、回収した細胞に３３％パーコールを加えて２，２００ｒｐｍ、２５℃で２０分間遠心し、最下層に沈殿する腫瘍単核球に１ｍＬ ｌｙｓｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（商品名「ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ」、シグマ社）を加えて、１，５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心した。続いて、遠心後のペレットをＤ－ＰＢＳで一度洗浄し、遠心後のペレットを再度Ｄ－ＰＢＳ ５００μＬで懸濁し、ナイロンメッシュに通して細胞塊を崩した後に、フローサイトメーター（商品名「Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター」、メルクミリポア社）によりＦＩＴＣの蛍光量を測定した。
【0126】
図１０は、蛍光強度の測定結果を示すグラフである。図１０中、「＊」はＨＳＡの結果と比較してＰ＜０．０５で有意差があることを示す。その結果、ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡはＨＳＡと比較して、腫瘍組織中のマクロファージ（ＴＡＭ）に約２倍多く移行したことが明らかとなった。
【0127】
［実験例６］
（インビトロにおけるマクロファージ及び線維芽細胞への移行性評価）
実験例２で作製したＭｏｎｏ－ＰＥＧ－Ｍａｎ－ＨＳＡのマクロファージ及び線維芽細胞への移行性を評価した。マクロファージとしては、マウスマクロファージ細胞株であるＪ７７４．１細胞及びＲＡＷ２６４．７細胞を使用した。また、線維芽細胞としては、ヒト肝星細胞株であるＴＷＮＴ－１細胞を使用した。
（インビトロにおけるマクロファージ及び線維芽細胞への移行性評価）
実験例２で作製したＭｏｎｏ－ＰＥＧ－Ｍａｎ－ＨＳＡのマクロファージ及び線維芽細胞への移行性を評価した。マクロファージとしては、マウスマクロファージ細胞株であるＪ７７４．１細胞及びＲＡＷ２６４．７細胞を使用した。また、線維芽細胞としては、ヒト肝星細胞株であるＴＷＮＴ－１細胞を使用した。
【0128】
具体的には、Ｊ７７４．１細胞、ＲＡＷ２６４．７細胞、ＴＷＮＴ－１細胞を、それぞれ３．５×１０５個／ウェルで２４ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした。続いて、各細胞の培地をＤ－ＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣ標識ＨＳＡ、ＦＩＴＣ標識Ｍａｎ－ＨＳＡ、ＦＩＴＣ標識ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ２００μｇ／ｍＬを蛍光量を揃えて添加して１５分間反応させた。続いて、Ｄ－ＰＢＳで２回洗浄し、セルスクレーパーを用いて細胞を剥がし、２，０００ｒｐｍ、５分間遠心した。続いて、遠心後のペレットを２５０μＬのＤ－ＰＢＳで懸濁し、ナイロンメッシュに通した後に、フローサイトメーター（商品名「Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター」、メルクミリポア社）によりＦＩＴＣの蛍光量を測定した。
【0129】
図１１（ａ）はＪ７７４．１細胞の蛍光強度の測定結果を示すグラフであり、図１１（ｂ）はＲＡＷ２６４．７細胞の蛍光強度の測定結果を示すグラフであり、図１２はＴＷＮＴ－１細胞の蛍光強度の測定結果を示すグラフである。図１１及び図１２中、「＊」はＨＳＡの結果と比較してＰ＜０．０５で有意差があることを示す。また、図１２中、「†」はＭａｎ－ＨＳＡの結果と比較してＰ＜０．０５で有意差があることを示す。
【0130】
その結果、Ｊ７７４．１細胞、ＲＡＷ２６４．７細胞の双方において、Ｍａｎ－ＨＳＡはＨＳＡよりも２倍以上の有意に高い移行性を示すことが確認された。また、ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡはＭａｎ－ＨＳＡと同等の高いマクロファージ移行性を示すことが明らかとなった。
【0131】
また、ＴＷＮＴ－１細胞では、Ｍａｎ－ＨＳＡはＨＳＡよりも約１．５倍の有意に高い移行性を示し、ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡはＭａｎ－ＨＳＡよりも更に有意に高い移行性を示すことが明らかとなった。
【0132】
［実験例７］
（インビトロにおけるマクロファージに対する細胞傷害性評価１）
抗癌剤であるパクリタキセル（以下「ＰＴＸ」という。）を結合させたＰＥＧ－Ｍａｎ－ＨＳＡのＴＡＭに対する細胞傷害性を検討した。
（インビトロにおけるマクロファージに対する細胞傷害性評価１）
抗癌剤であるパクリタキセル（以下「ＰＴＸ」という。）を結合させたＰＥＧ－Ｍａｎ－ＨＳＡのＴＡＭに対する細胞傷害性を検討した。
【0133】
《ＰＴＸ結合型アルブミンの作製》
まず、ＰＴＸ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）とＨＳＡ（１５０μＭ）及び実験例２で作製したＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ（１５０μＭ）を、ＰＴＸと各アルブミンのモル濃度比が１：２となるように混合し、室温で４時間インキュベートして、ＰＴＸ結合型アルブミンを作製した。
まず、ＰＴＸ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）とＨＳＡ（１５０μＭ）及び実験例２で作製したＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ（１５０μＭ）を、ＰＴＸと各アルブミンのモル濃度比が１：２となるように混合し、室温で４時間インキュベートして、ＰＴＸ結合型アルブミンを作製した。
【0134】
《Ｍ２様マクロファージの調製》
続いて、マウスマクロファージ細胞株であるＪ７７４．１細胞及びＲＡＷ２６４．７細胞に、Ｍ２分化誘導サイトカイン（ＩＬ－４／ＩＬ－１３）を添加し、２４時間インキュベートすることにより、Ｍ２様マクロファージを調製した。
続いて、マウスマクロファージ細胞株であるＪ７７４．１細胞及びＲＡＷ２６４．７細胞に、Ｍ２分化誘導サイトカイン（ＩＬ－４／ＩＬ－１３）を添加し、２４時間インキュベートすることにより、Ｍ２様マクロファージを調製した。
【0135】
具体的には、Ｊ７７４．１細胞及びＲＡＷ２６４．７細胞を、７．５×１０４個／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした。続いて、各細胞の培地をＤ－ＰＢＳで洗浄し、終濃度２０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン（ＩＬ）－４、終濃度２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１３を添加し、ＣＯ２インキュベーター内で２４時間インキュベートし、Ｍ２様マクロファージを得た。
【0136】
《細胞傷害性試験》
各Ｍ２様マクロファージに、ＤＭＥＭ（－）、ＰＴＸ結合型ＨＳＡ、ＰＴＸ結合型ＰＥＧ－Ｍａｎ－ＨＳＡ、遊離のＰＴＸをそれぞれ添加し、ＣＯ２インキュベーター内で２４時間インキュベートした。続いて、市販のキット（商品名「Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８」、同仁化学研究所）を用いて細胞生存率を測定した。
各Ｍ２様マクロファージに、ＤＭＥＭ（－）、ＰＴＸ結合型ＨＳＡ、ＰＴＸ結合型ＰＥＧ－Ｍａｎ－ＨＳＡ、遊離のＰＴＸをそれぞれ添加し、ＣＯ２インキュベーター内で２４時間インキュベートした。続いて、市販のキット（商品名「Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８」、同仁化学研究所）を用いて細胞生存率を測定した。
【0137】
Ｊ７７４．１細胞、ＲＡＷ２６４．７細胞に添加するＰＴＸの終濃度はそれぞれ３μＭ、１０μＭとした。また、細胞生存率は、ＤＭＥＭ（－）添加細胞の吸光度を１００％として算出した。
【0138】
図１３（ａ）はＲＡＷ２６４．７細胞の細胞生存率の測定結果を示すグラフであり、図１１（ｂ）はＪ７７４．１細胞の細胞生存率の測定結果を示すグラフである。図１１（ａ）及び図１１（ｂ）中、「Ｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」はＤＭＥＭ（－）添加細胞の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＨＳＡ」はＰＴＸ結合型ＨＳＡ添加細胞の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＰＥＧ－Ｍａｎ－ＨＳＡ」はＰＴＸ結合型ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ添加細胞の結果であることを示し、「Ｆｒｅｅ－ＰＴＸ」は遊離のＰＴＸ添加細胞の結果であることを示す。また、「＊」はＰＴＸ結合型ＨＳＡの結果と比較してＰ＜０．０５で有意差があることを示し、「†」は遊離のＰＴＸの結果と比較してＰ＜０．０５で有意差があることを示し、「‡」はＰＴＸ結合型ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡの結果と比較してＰ＜０．０５で有意差があることを示す（ｎ＝４）。
【0139】
その結果、Ｊ７７４．１細胞、ＲＡＷ２６４．７細胞の双方において、ＰＴＸ結合型ＨＳＡの添加ではＭ２様マクロファージを傷害できないことが確認された。一方、Ｊ７７４．１細胞、ＲＡＷ２６４．７細胞の双方において、ＰＴＸ結合型ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡの添加は、ＰＴＸ結合型ＨＳＡの添加と比較してＭ２様マクロファージに対する有意に高い細胞傷害性を示すことが明らかとなった。なお、遊離のＰＴＸの添加においても細胞傷害性が示されたが、これは遊離のＰＴＸが細胞内透過性を有するためである。
【0140】
［実験例８］
（ＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡ）二量体及び（Ｍａｎ－ＨＳＡ）－ＨＳＡ二量体の作製）
実験例２で作製したＭｏｎｏ－ＰＥＧ－Ｍａｎ－ＨＳＡにおけるＰＥＧ鎖の代わりに、ＨＳＡ分子により高マンノース糖鎖を被覆することを目的として、遺伝子工学的に野生型のＨＳＡとＭａｎ－ＨＳＡを融合させたＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡ）及び（Ｍａｎ－ＨＳＡ）－ＨＳＡの２種類の融合タンパク質をコードする遺伝子断片を作製し、プラスミドｐＰＩＣ９に導入して発現ベクターを作製した。
（ＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡ）二量体及び（Ｍａｎ－ＨＳＡ）－ＨＳＡ二量体の作製）
実験例２で作製したＭｏｎｏ－ＰＥＧ－Ｍａｎ－ＨＳＡにおけるＰＥＧ鎖の代わりに、ＨＳＡ分子により高マンノース糖鎖を被覆することを目的として、遺伝子工学的に野生型のＨＳＡとＭａｎ－ＨＳＡを融合させたＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡ）及び（Ｍａｎ－ＨＳＡ）－ＨＳＡの２種類の融合タンパク質をコードする遺伝子断片を作製し、プラスミドｐＰＩＣ９に導入して発現ベクターを作製した。
【0141】
ＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡＤ６３Ｎ）のアミノ酸配列を配列番号１０に示し、ＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡＤ６３Ｎ）をコードする塩基配列を配列番号１１に示す。また、ＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡＡ３２０Ｔ）のアミノ酸配列を配列番号１２に示し、ＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡＡ３２０Ｔ）をコードする塩基配列を配列番号１３に示す。また、ＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡＤ４９４Ｎ）のアミノ酸配列を配列番号１４に示し、ＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡＤ４９４Ｎ）をコードする塩基配列を配列番号１５に示す。
【0142】
また、（Ｍａｎ－ＨＳＡＤ６３Ｎ）－ＨＳＡのアミノ酸配列を配列番号１６に示し、（Ｍａｎ－ＨＳＡＤ６３Ｎ）－ＨＳＡをコードする塩基配列を配列番号１７に示す。また、（Ｍａｎ－ＨＳＡＡ３２０Ｔ）－ＨＳＡのアミノ酸配列を配列番号１８に示し、（Ｍａｎ－ＨＳＡＡ３２０Ｔ）－ＨＳＡをコードする塩基配列を配列番号１９に示す。また、（Ｍａｎ－ＨＳＡＤ４９４Ｎ）－ＨＳＡのアミノ酸配列を配列番号２０に示し、（Ｍａｎ－ＨＳＡＤ４９４Ｎ）－ＨＳＡをコードする塩基配列を配列番号２１に示す。
【0143】
本実験例では、ＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡ）としてＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡＤ４９４Ｎ）を、（Ｍａｎ－ＨＳＡ）－ＨＳＡとして（Ｍａｎ－ＨＳＡＤ４９４Ｎ）－ＨＳＡをピキア酵母で発現させた。
【0144】
図１５（ｂ）は、ＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡＤ４９４Ｎ）の構造を示す模式図である。また、図１５（ｃ）は、（Ｍａｎ－ＨＳＡＤ４９４Ｎ）－ＨＳＡの構造を示す模式図である。図１５（ｂ）及び（ｃ）中、点線の丸で囲んだ領域は高マンノース糖鎖を示す。
【0145】
具体的には、各発現ベクターをＳａｌＩで消化し、エレクトロポレーション装置（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、ＢＩＯ－ＲＡＤ製）を用いて、ピキア酵母（ＧＳ１１５株）のＨＩＳ４遺伝子座へ相同組換えにより形質転換させた。
【0146】
形質転換したピキア酵母は、ＢＭＧＹ液体培地（１％酵母エキストラクト、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０、１．３４％酵母ニトロゲンベース、４×１０－５％ビオチン、１％グリセロール）中で２４時間培養し、その後、ＢＭＭＹ培地中で２４時間毎に１％メタノールを添加しながら７２時間培養した。
【0147】
続いて、形質転換したピキア酵母の培養上清を１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、銀染色により染色した。また、比較のために、精製後のＨＳＡ及び精製後のＭａｎ－ＨＳＡも１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び銀染色に供した。
【0148】
図１４は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す写真である。その結果、ＨＳＡ－（Ｍａｎ－ＨＳＡ）及び（Ｍａｎ－ＨＳＡ）－ＨＳＡの理論分子量である１３６ｋＤａ付近にバンドが検出され、目的の融合タンパク質が得られたことが確認された。
【0149】
［実験例９］
（インビトロにおけるマクロファージに対する細胞傷害性評価２）
実験例７と同様にして、ＨＳＡ、ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ、Ｍａｎ－ＨＳＡ（Ｄ４９４Ｎ）、ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ（Ｄ４９４Ｎ）に抗癌剤であるパクリタキセル（以下「ＰＴＸ」という。）を結合させ、ＴＡＭを模倣したＭ２様マクロファージに対する細胞傷害性を検討した。ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡは、ＨＳＡに１ヶ所存在する遊離のＳＨ基にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）マレイミドを結合させることにより作製した。
（インビトロにおけるマクロファージに対する細胞傷害性評価２）
実験例７と同様にして、ＨＳＡ、ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ、Ｍａｎ－ＨＳＡ（Ｄ４９４Ｎ）、ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ（Ｄ４９４Ｎ）に抗癌剤であるパクリタキセル（以下「ＰＴＸ」という。）を結合させ、ＴＡＭを模倣したＭ２様マクロファージに対する細胞傷害性を検討した。ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡは、ＨＳＡに１ヶ所存在する遊離のＳＨ基にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）マレイミドを結合させることにより作製した。
【0150】
《ＰＴＸ結合型アルブミンの作製》
まず、ＰＴＸ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）と各ＨＳＡ（それぞれ１５０μＭ）を、ＰＴＸと各アルブミンのモル濃度比が１：２となるように混合し、室温で４時間インキュベートして、ＰＴＸ結合型アルブミンを作製した。
まず、ＰＴＸ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）と各ＨＳＡ（それぞれ１５０μＭ）を、ＰＴＸと各アルブミンのモル濃度比が１：２となるように混合し、室温で４時間インキュベートして、ＰＴＸ結合型アルブミンを作製した。
【0151】
《Ｍ２様マクロファージの調製》
続いて、マウスマクロファージ細胞株であるＪ７７４．１細胞に、Ｍ２分化誘導サイトカイン（ＩＬ－４／ＩＬ－１３）を添加し、２４時間インキュベートすることにより、Ｍ２様マクロファージを調製した。
続いて、マウスマクロファージ細胞株であるＪ７７４．１細胞に、Ｍ２分化誘導サイトカイン（ＩＬ－４／ＩＬ－１３）を添加し、２４時間インキュベートすることにより、Ｍ２様マクロファージを調製した。
【0152】
《細胞傷害性試験》
続いて、Ｍ２様マクロファージに、ＤＭＥＭ（－）、ＰＴＸ結合型ＨＳＡ、ＰＴＸ結合型ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ、ＰＴＸ結合型Ｍａｎ－ＨＳＡ、ＰＴＸ結合型ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ、遊離のＰＴＸをそれぞれ添加し、ＣＯ２インキュベーター内で２４時間インキュベートした。続いて、市販のキット（商品名「Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８」、同仁化学研究所）を用いて細胞生存率を測定した。
続いて、Ｍ２様マクロファージに、ＤＭＥＭ（－）、ＰＴＸ結合型ＨＳＡ、ＰＴＸ結合型ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ、ＰＴＸ結合型Ｍａｎ－ＨＳＡ、ＰＴＸ結合型ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ、遊離のＰＴＸをそれぞれ添加し、ＣＯ２インキュベーター内で２４時間インキュベートした。続いて、市販のキット（商品名「Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８」、同仁化学研究所）を用いて細胞生存率を測定した。
【0153】
ＰＴＸの終濃度はそれぞれ３μＭとした。また、細胞生存率は、ＤＭＥＭ（－）添加細胞の吸光度を１００％として算出した。
【0154】
図１６は細胞生存率の測定結果を示すグラフである。図１６中、「Ｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」はＤＭＥＭ（－）添加細胞の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＨＳＡ」はＰＴＸ結合型ＨＳＡ添加細胞の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ」はＰＴＸ結合型ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ添加細胞の結果であることを示し、「ＰＴＸ－Ｍａｎ－ＨＳＡ」はＰＴＸ結合型Ｍａｎ－ＨＳＡ添加細胞の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ」はＰＴＸ結合型ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ添加細胞の結果であることを示し、「Ｆｒｅｅ－ＰＴＸ」は遊離のＰＴＸ添加細胞の結果であることを示す。
【0155】
その結果、ＰＴＸ結合型ＨＳＡの添加ではＭ２様マクロファージを傷害できないことが確認された。一方、ＰＴＸ結合型ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡの添加は、ＰＴＸ結合型ＨＳＡの添加と比較してＭ２様マクロファージに対する有意に高い細胞傷害性を示すことが明らかとなった。なお、遊離のＰＴＸの添加においても細胞傷害性が示されたが、これは遊離のＰＴＸが細胞内透過性を有するためである。
【0156】
［実験例１０］
（インビトロにおけるマクロファージへの移行性評価）
実験例６と同様にして、ＨＳＡ、ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ、Ｍａｎ－ＨＳＡ（Ｄ４９４Ｎ）、ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ（Ｄ４９４Ｎ）のＭ２様マクロファージに対する細胞移行性（細胞内取り込み量）を検討した。Ｍ２様マクロファージとしては実験例９と同様の細胞を使用した。
（インビトロにおけるマクロファージへの移行性評価）
実験例６と同様にして、ＨＳＡ、ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ、Ｍａｎ－ＨＳＡ（Ｄ４９４Ｎ）、ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ（Ｄ４９４Ｎ）のＭ２様マクロファージに対する細胞移行性（細胞内取り込み量）を検討した。Ｍ２様マクロファージとしては実験例９と同様の細胞を使用した。
【0157】
図１７は、細胞内取り込み量と実験例９で測定した細胞傷害性それぞれの平均値をプロットした相関図である。細胞傷害性は、下記式（Ｆ２）により算出した。その結果、ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡはマンノース受容体を介して細胞内に取り込まれ、細胞傷害性を発揮する可能性が示された。
細胞傷害性（％）＝１００－細胞生存率（％） （Ｆ２）
細胞傷害性（％）＝１００－細胞生存率（％） （Ｆ２）
【0158】
［実験例１１］
（インビボにおける抗腫瘍効果の検討）
担癌マウスモデルに、ＰＢＳ、遊離のＰＴＸ、ＰＴＸ－ＨＳＡ、ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ、ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ（Ｄ４９４Ｎ）を投与し、腫瘍体積の変化を測定した。担癌マウスモデルとしては、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ担癌モデルマウスを使用した。
（インビボにおける抗腫瘍効果の検討）
担癌マウスモデルに、ＰＢＳ、遊離のＰＴＸ、ＰＴＸ－ＨＳＡ、ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ、ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ（Ｄ４９４Ｎ）を投与し、腫瘍体積の変化を測定した。担癌マウスモデルとしては、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ担癌モデルマウスを使用した。
【0159】
具体的には、Ｃ５７ＢＬ６マウス（雄、８週齢、日本ＳＬＣ社）をエーテルで麻酔し、Ｂ１６Ｆ１０細胞懸濁液（２×１０６個／１００μＬ生理食塩水）を背中側皮下に投与し、Ｂ１６Ｆ１０担癌マウスを作製した。続いて、担癌２週間後に実験を開始した。
【0160】
実験開始日（０日目）及び７日目に、遊離のＰＴＸ、ＰＴＸ－ＨＳＡ、ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ、ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡを、それぞれＰＴＸ換算で１０ｍｇ／ｋｇずつ投与した。また、対照群にはＰＢＳを投与した。続いて、腫瘍の短径（ａ）と長径（ｂ）を経時的に計測し、下記式（Ｆ１）により腫瘍体積（ｖ）を算出した。
ｖ＝０．４×ａ２ｂ （Ｆ１）
ｖ＝０．４×ａ２ｂ （Ｆ１）
【0161】
図１８は、腫瘍体積の変化を示すグラフである。図１８中、「ＰＢＳ」はＰＢＳ投与群の結果であることを示し、「ＰＴＸ」は遊離のＰＴＸ投与群の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＨＳＡ」はＰＴＸ－ＨＳＡ投与群の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ」はＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ投与群の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ」はＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ投与群の結果であることを示す。また、図１８中、「＊」はＰＢＳ投与群と比較してＰ＜０．０５で有意差があることを示し、「†」は遊離のＰＴＸ投与群と比較してＰ＜０．０５で有意差があることを示し、「‡」はＰＴＸ－ＨＳＡ投与群と比較してＰ＜０．０５で有意差があることを示す。図１８には、実験開始から１４日目に各群のマウスから摘出した腫瘍の写真も示す。スケールバーは１ｃｍを示す。
【0162】
その結果、ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡは優れた抗腫瘍効果を奏することが明らかとなった。また、抗腫瘍効果の差には、マンノース糖鎖の存在に起因する癌微小環境の改善効果が関与している可能性が考えられた。
【0163】
［実験例１２］
（癌微小環境の検討１）
実験例１１で摘出した各腫瘍組織の薄切切片を作製し、ピクロシリウスレッド染色、マッソントリクローム染色及びヘマトキシリン・エオシン染色を行った。
（癌微小環境の検討１）
実験例１１で摘出した各腫瘍組織の薄切切片を作製し、ピクロシリウスレッド染色、マッソントリクローム染色及びヘマトキシリン・エオシン染色を行った。
【0164】
図１９は、各試料の顕微鏡写真である。スケールバーは１００μｍである。図１９中、「ＨＥ染色」はヘマトキシリン・エオシン染色の結果であることを示し、「ＰＢＳ」はＰＢＳ投与群の腫瘍組織の結果であることを示し、「ＰＴＸ」は遊離のＰＴＸ投与群の腫瘍組織の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＨＳＡ」はＰＴＸ－ＨＳＡ投与群の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ」はＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ投与群の腫瘍組織の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ」はＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ投与群の腫瘍組織の結果であることを示す。また、白矢頭はコラーゲン等の線維基質を示し、黒矢頭は間質部位を示す。
【0165】
その結果、ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ投与群の腫瘍組織では、間質領域が大幅に減少したことが明らかとなった。
【0166】
［実験例１３］
（癌微小環境の検討２）
実験例１１で摘出した各腫瘍組織内の全細胞を回収し、フローサイトメトリー解析を行い、腫瘍組織内のマクロファージの割合及び腫瘍組織内の線維芽細胞の割合を解析した。マクロファージマーカーとしてはＦ４／８０を使用した。また線維芽細胞のマーカーとしてはα－ＳＭＡを使用した。
（癌微小環境の検討２）
実験例１１で摘出した各腫瘍組織内の全細胞を回収し、フローサイトメトリー解析を行い、腫瘍組織内のマクロファージの割合及び腫瘍組織内の線維芽細胞の割合を解析した。マクロファージマーカーとしてはＦ４／８０を使用した。また線維芽細胞のマーカーとしてはα－ＳＭＡを使用した。
【0167】
また、各腫瘍組織の薄切切片を免疫染色し、ＣＤ２０６及びＣＤ２８０を検出した。図２０（ａ）及び（ｂ）は、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフ及び免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。フローサイトメトリーの結果においては、縦軸はＦ４／８０又はα－ＳＭＡの染色強度を示し、横軸は前方散乱光を示す。また、グラフ中の数字はＦ４／８０陽性細胞又はα－ＳＭＡ陽性細胞の割合（％）を示す。
【0168】
図２０中、「ＰＢＳ」はＰＢＳ投与群の腫瘍組織の結果であることを示し、「ＰＴＸ」は遊離のＰＴＸ投与群の腫瘍組織の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＨＳＡ」はＰＴＸ－ＨＳＡ投与群の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ」はＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ投与群の腫瘍組織の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ」はＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ投与群の腫瘍組織の結果であることを示す。
【0169】
その結果、ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ投与群の腫瘍組織では、腫瘍内に存在する腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）及び癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）の存在量が減少したことが明らかとなった。
【0170】
［実験例１４］
（癌微小環境の検討３）
実験例１２において、ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡの投与により腫瘍組織の間質領域の減少が観察された。また、実験例１３において、ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡの投与により腫瘍内に存在する腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）及び癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）の存在量の減少が観察された。
（癌微小環境の検討３）
実験例１２において、ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡの投与により腫瘍組織の間質領域の減少が観察された。また、実験例１３において、ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡの投与により腫瘍内に存在する腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）及び癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）の存在量の減少が観察された。
【0171】
そこで、これらの効果がマンノース受容体であるＣＤ２０６及びＣＤ２８０を介したＴＡＭ及びＣＡＦの標的化による結果であるか否かを検討した。
【0172】
具体的には、実験例１１と同様の担癌マウスモデルに、実験開始日（０日目）、７日目及び１４日目に、ＰＴＸ換算で１０ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡを投与した。続いて、１４日目の投与の１時間後に腫瘍組織を摘出し、凍結切片を作製した。
【0173】
続いて、凍結切片を免疫染色し、ＣＤ２０６、ＣＤ２８０、ＨＳＡをそれぞれ蛍光顕微鏡で観察した。また、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で核を染色した。
【0174】
図２１（ａ）は腫瘍内ＣＤ２６０陽性細胞（ＴＡＭ）を検出した蛍光顕微鏡写真であり、図２１（ｂ）は腫瘍内ＣＤ２８０陽性細胞（ＣＡＦ）を検出した蛍光顕微鏡写真である。図２１（ａ）及び（ｂ）中、「ＰＢＳ」はＰＢＳ投与群の腫瘍組織の結果であることを示し、「ＰＴＸ」は遊離のＰＴＸ投与群の腫瘍組織の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＨＳＡ」はＰＴＸ－ＨＳＡ投与群の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ」はＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ投与群の腫瘍組織の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ」はＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ投与群の腫瘍組織の結果であることを示す。
【0175】
その結果、ＣＤ２０６及びＨＳＡの共局在、及び、ＣＤ２８０及びＨＳＡの共局在が検出された。図２１（ａ）中、矢頭はＣＤ２０６とＨＳＡが共局在した領域を示し、図２１（ｂ）中、矢頭はＣＤ２８０とＨＳＡが共局在した領域を示す。
【0176】
この結果は、ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡのマンノース糖鎖に起因したＴＡＭ及びＣＡＦへの標的能がＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡによる抗腫瘍効果に関与していることを示す。
【0177】
［実験例１５］
（腫瘍内細胞のアポトーシス評価）
実験例１１で摘出した各腫瘍組織の薄切切片を作製し、ＴＵＮＥＬ染色を行い、アポトーシスを評価した。
（腫瘍内細胞のアポトーシス評価）
実験例１１で摘出した各腫瘍組織の薄切切片を作製し、ＴＵＮＥＬ染色を行い、アポトーシスを評価した。
【0178】
図２２（ａ）はＴＵＮＥＬ染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは１００μｍである。また、図２２（ｂ）は図２２（ａ）の結果を数値化したグラフである。図２２（ａ）及び（ｂ）中、「ＰＢＳ」はＰＢＳ投与群の腫瘍組織の結果であることを示し、「ＰＴＸ」は遊離のＰＴＸ投与群の腫瘍組織の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＨＳＡ」はＰＴＸ－ＨＳＡ投与群の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ」はＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ投与群の腫瘍組織の結果であることを示す。
【0179】
その結果、ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ投与群の腫瘍組織では、その他の群の腫瘍組織と比較して有意に高いアポトーシスの誘導が検出された。
【0180】
［実験例１６］
（癌微小環境の検討４）
実験例１１で摘出した各腫瘍組織をウエスタンブロッティングに供し、ＣＤ２０６及びα－ＳＭＡの発現量を測定した。また、対照としてβ－アクチンの発現量を測定した。
（癌微小環境の検討４）
実験例１１で摘出した各腫瘍組織をウエスタンブロッティングに供し、ＣＤ２０６及びα－ＳＭＡの発現量を測定した。また、対照としてβ－アクチンの発現量を測定した。
【0181】
【0182】
図２３（ａ）～（ｃ）中、「ＰＢＳ」はＰＢＳ投与群の腫瘍組織の結果であることを示し、「ＰＴＸ」は遊離のＰＴＸ投与群の腫瘍組織の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＨＳＡ」はＰＴＸ－ＨＳＡ投与群の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ」はＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ投与群の腫瘍組織の結果であることを示す。図２３（ｂ）中、「＊」は遊離のＰＴＸ投与群の腫瘍組織の結果と比較してＰ＜０．０５で有意差があることを示す。
【0183】
その結果、ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ投与群の腫瘍組織では、ＴＡＭマーカーであるＣＤ２０６の有意な発現量の低下が認められた。また、ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ投与群の腫瘍組織では、ＣＡＦマーカーであるαＳＭＡの顕著な発現量の低下が認められた。
【0184】
［実験例１７］
（副作用の評価１）
実験例１１の担癌マウスモデルの体重を経時的に測定した。また、実験開始から１４日目に摘出した各臓器の重量を測定した。
（副作用の評価１）
実験例１１の担癌マウスモデルの体重を経時的に測定した。また、実験開始から１４日目に摘出した各臓器の重量を測定した。
【0185】
図２４（ａ）は体重の経時変化を示すグラフであり、図２４（ｂ）は各臓器の重量の測定結果を示すグラフである。図２４（ａ）及び（ｂ）中、「ＰＢＳ」はＰＢＳ投与群の結果であることを示し、「ＰＴＸ」は遊離のＰＴＸ投与群の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＨＳＡ」はＰＴＸ－ＨＳＡ投与群の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ」はＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ投与群の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ」はＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ投与群の結果であることを示す。
【0186】
その結果、遊離のＰＴＸ投与群、ＰＴＸ－ＨＳＡ投与群、ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ投与群、ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ投与群の体重の経時変化及び各臓器の重量には、ＰＢＳ投与群と比較して有意な差は認められなかった。
【0187】
この結果は、ＰＴＸ、ＰＴＸ－ＨＳＡ、ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ、ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡの投与には顕著な副作用が認められないことを示す。
【0188】
［実験例１８］
（副作用の評価２）
実験例１１において、実験開始から１４日目の各群の担癌マウスモデルから摘出した各臓器の薄切切片を作製し、ヘマトキシリン・エオシン染色を行った。
（副作用の評価２）
実験例１１において、実験開始から１４日目の各群の担癌マウスモデルから摘出した各臓器の薄切切片を作製し、ヘマトキシリン・エオシン染色を行った。
【0189】
図２５はヘマトキシリン・エオシン染色の結果を示す顕微鏡写真である。スケールバーは１００μｍである。図２５中、「ＰＢＳ」はＰＢＳ投与群の結果であることを示し、「ＰＴＸ」は遊離のＰＴＸ投与群の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＨＳＡ」はＰＴＸ－ＨＳＡ投与群の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ」はＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ投与群の結果であることを示す。
【0190】
その結果、遊離のＰＴＸ投与群、ＰＴＸ－ＨＳＡ投与群、ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ投与群の各臓器の組織には傷害は認められなかった。
【0191】
この結果は、ＰＴＸ、ＰＴＸ－ＨＳＡ、ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡの投与には顕著な副作用が認められないことを示す。
【0192】
［実験例１９］
（副作用の評価３）
実験例１１において、実験開始から１４日目の各群の担癌マウスモデルから採取した血液試料について、白血球数、血小板数、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）活性、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性を測定した。白血球数及び血小板数は骨髄抑制を評価する指標である。また、ＡＳＴ活性及びＡＬＴ活性は、肝臓への傷害を評価する指標である。
（副作用の評価３）
実験例１１において、実験開始から１４日目の各群の担癌マウスモデルから採取した血液試料について、白血球数、血小板数、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）活性、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性を測定した。白血球数及び血小板数は骨髄抑制を評価する指標である。また、ＡＳＴ活性及びＡＬＴ活性は、肝臓への傷害を評価する指標である。
【0193】
図２６（ａ）は白血球数の測定結果を示すグラフである。図２６（ａ）中、「ＷＢＣ」は白血球を示す。図２６（ｂ）は血小板数の測定結果を示すグラフである。図２６（ｂ）中、「ＰＬＴ」は血小板を示す。図２６（ｃ）はＡＳＴ活性の測定結果を示すグラフである。図２６（ｄ）はＡＬＴ活性の測定結果を示すグラフである。
【0194】
図２６（ａ）及び（ｂ）中、「ＰＢＳ」はＰＢＳ投与群の結果であることを示し、「ＰＴＸ」は遊離のＰＴＸ投与群の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＨＳＡ」はＰＴＸ－ＨＳＡ投与群の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ」はＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ投与群の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ」はＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ投与群の結果であることを示す。
【0195】
その結果、ＰＴＸ－ＨＳＡ投与群、ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－ＨＳＡ投与群、ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ投与群では、遊離のＰＴＸ投与群で確認される副作用が低減されたことが明らかとなった。
【0196】
また、図２６（ｃ）及び（ｄ）中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は正常マウスの結果であることを示し、「ＰＴＸ」は遊離のＰＴＸ投与群の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＨＳＡ」はＰＴＸ－ＨＳＡ投与群の結果であることを示し、「ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ」はＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ投与群の結果であることを示す。
【0197】
その結果、ＰＴＸ－ＨＳＡ投与群、ＰＴＸ－ＰＥＧ４０ｋ－Ｍａｎ－ＨＳＡ投与群
では、遊離のＰＴＸ投与群で確認される副作用が低減される傾向が認められた。
では、遊離のＰＴＸ投与群で確認される副作用が低減される傾向が認められた。
【産業上の利用可能性】
【0198】
本発明によれば、腫瘍微小環境に存在する腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）及び癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）に効率よく送達することが可能な薬物送達用担体を提供することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
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【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
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【図26】
【配列表】