▶ ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-06-22
(45)【発行日】2023-06-30
(54)【発明の名称】成体多能性幹細胞の調製、拡大および使用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20230623BHJP
C12N 5/0735 20100101ALI20230623BHJP
C12N 5/074 20100101ALI20230623BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20230623BHJP
C12N 5/0797 20100101ALI20230623BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230623BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230623BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230623BHJP
A61K 35/545 20150101ALI20230623BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
C12N5/0735
C12N5/074
C12N5/0775
C12N5/0797
C12N5/10
A61P25/28
A61P43/00 105
A61P43/00 101
A61K35/545
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2019554507
(86)(22)【出願日】2018-04-03
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-04-30
(86)【国際出願番号】 US2018025846
(87)【国際公開番号】W WO2018187298
(87)【国際公開日】2018-10-11
【審査請求日】2021-03-17
(31)【優先権主張番号】62/481,554
(32)【優先日】2017-04-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】515158308
【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(74)【代理人】
【識別番号】110000877
【氏名又は名称】弁理士法人ＲＹＵＫＡ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】リ、シャオウェイ
(72)【発明者】
【氏名】フ、ミン
(72)【発明者】
【氏名】ロレンツ、ハーマン ピーター
【審査官】大久保 智之
(56)【参考文献】
【文献】Experimental Hematology，2007年，Vol.35，pp.1872-1883
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／００－２８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１０００個の細胞を含む組成物であって、前記細胞の少なくとも５０％は、直径が５μｍ未満であるＣＤ４５＋細胞であり、
前記ＣＤ４５＋細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＣＤ３４，Ｏｃｔ ４、ＳＳ
ＥＡ１、およびＮａｎｏｇを発現し、ＡＢＣＧ２およびＥ－カドヘリンを発現しない、
組成物。
【請求項2】
前記ＣＤ４５＋細胞が、Ｓｃａ１が陽性であるとさらに特徴付けられる、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記細胞の少なくとも７５％がＣＤ４５＋細胞である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
前記細胞の少なくとも９５％がＣＤ４５＋細胞である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項5】
少なくとも１００００個の細胞を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
前記細胞の２０％未満が赤血球である、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
前記ＣＤ４５＋細胞の直径が３μｍ未満である、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
前記ＣＤ４５＋細胞の直径が約２μｍ～約３μｍである、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
前記ＣＤ４５＋細胞が、Ｌｉｎが陰性であるとさらに特徴付けられる、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
前記ＣＤ４５＋細胞が、少なくとも約２０：１、または少なくとも約１５：１、または少なくとも約１０：１、または少なくとも約５：１の比で小ＲＮＡおよびリボソームＲＮ
Ａを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項11】
前記ＣＤ４５＋細胞が、少なくとも約９：１、または少なくとも約８：１、または少なくとも約７：１、または少なくとも約６：１、または少なくとも約５：１である核対細胞
質比（ｖ／ｖ）を有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項12】
前記ＣＤ４５＋細胞が、ＣＤ１５０、ｃ－ｋｉｔ、Ｔｈｙ１．１（ＣＤ９０．１）、Ｖａｓａ、ＣＤ１３３およびＣＤ１０５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカ
ーをさらに発現する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項13】
前記ＣＤ４５＋細胞が、ＣＤ４１、Ｌｉｎ、およびＣＤ１８４からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを発現しない、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組
成物。
【請求項14】
前記ＣＤ４５＋細胞が、１つまたは複数の因子を含む培地によって活性化され得、活性化された前記細胞がＡＢＣＧ２を発現する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組
成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本開示に組み込まれる、２０１７年４月４日に提出された米国仮出願シリアル番号６２／４８１５５４の米国特許法第１１９条（ｅ）の下での利益を主張する。
本出願は、その内容全体が参照により本開示に組み込まれる、２０１７年４月４日に提出された米国仮出願シリアル番号６２／４８１５５４の米国特許法第１１９条（ｅ）の下での利益を主張する。
【背景技術】
【0002】
幹細胞の同定および特徴付けは、再生医療の主要な焦点である。幹細胞は、組織恒常性を維持するために必要な分裂終了細胞を生存させ、製造する能力を保証する特性である自己複製が可能である。幹細胞は、自己複製能力に加えて、特定の組織、器官系または生物全体の恒常性を維持するために必要な細胞型のいくつかまたは全てに分化する能力を有する。
【0003】
幹細胞が単離される発達段階は、通常、それがどの細胞型に分化することができるかを決定する。例えば、胚盤胞の内部細胞塊から単離された胚性幹（ＥＳ）細胞は多能性であり、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）のいずれかに分化することができる。しかしながら、種々の成体組織（例えば、骨髄、脂肪組織、血液等）に見られる成体または体性幹細胞は、典型的には、分化に関してより制限されているため、多能性、寡能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）または単能性とみなされる。成体幹細胞には、造血幹細胞（ＨＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、内皮幹細胞（ＥＳＣ）、乳腺幹細胞（ＭａＳＣ）、腸幹細胞（ＩＳＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、成体嗅覚幹細胞（ＯＳＣ）、神経堤幹細胞（ＮＣＳＣ）および精巣幹細胞（ＴＳＣ）などのいくつかの種類が含まれる。人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣとしても知られている）は、特定の多能性関連遺伝子セットまたは「リプログラミング因子」を導入することによって体細胞から直接生成することができる多能性幹細胞の一種である。他の種類の幹細胞も報告されており、その存在についてはまだ議論の余地がある。
【0004】
３０年以上にわたり、白血病およびリンパ腫などの状態のがん患者を処置するために骨髄が使用されてきた。これは、広く実施されている幹細胞療法の唯一の形態である。胚性幹細胞に関して、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の研究は、ヒト胚の破壊、または少なくとも操作を伴うため、倫理的および政治的に議論の余地がある。ｈＥＳＣの腫瘍形成能もまた、ｈＥＳＣを使用する細胞療法の臨床的ハードルである。さらに、患者に適合した胚性幹細胞株を作成することは今まで実行可能ではなかった。ｉＰＳＣに関しては、体細胞をリプログラミングしてｉＰＳＣを製造することにより、ｈＥＳＣ研究に特有の倫理的課題が回避される。しかしながら、ｉＰＳＣの製造には遺伝子改変／修飾が必要であり、これは何らかの形でがんとも関連している。例えば、組換えタンパク質を使用したｉＰＳＣの非遺伝的製造方法は、一般に効率が低い。よって、ｉＰＳＣ技術は、治療的移植が安全であるとみなされている段階にまだ進んでいない。成体幹細胞に関しては、研究および治療でのそれらの使用は議論の余地があると考えられていない。しかしながら、多能性幹細胞とは異なり、成体幹細胞は一定の種類または「系統」に制限されている。その結果、成体幹細胞療法には、必要とされる特定の系統の幹細胞源が必要であり、要求される数までそれらを収集および／または培養することが課題である。
【0005】
したがって、遺伝子操作を必要としない成体組織からの多能性幹細胞の同定、およびそれらをインビトロで培養するためのプロトコルの確立は、組織修復および再生の実用的な細胞療法への道を開くだろう。成体組織から単離されたこのような多能性幹細胞はまた、慢性および加齢関連疾患において未だ満たされていない医療ニーズのための新たな治療法も提供する。
【0006】
細胞培養系は、幹細胞の調査および開発のための強力な資産となるだろう。この分野での最大の課題の１つは、インビトロでの幹細胞の迅速な拡大および効率的かつ正確な分化を可能にするモデルを確立することである。このようなモデルは、一定の培養条件下で標的化され制御可能な分化を受けることができる大量の均質な細胞を提供する能力を有さなければならない。現在、治療要件を満たす多能性幹細胞の一般的に受け入れられている持続可能な細胞培養モデルはない。さらに、現在の多能性幹細胞は、臨床応用および治療用途での現在の多能性幹細胞の使用を妨げる、単離、インビトロ拡大および／または分化誘導などの方法に様々な課題および欠点を有する。
【0007】
したがって、遺伝子操作なしで成体組織からインビトロで迅速に拡大することができ、分化効率が高く、非腫瘍原性である多能性幹細胞を同定する必要がある。また、細胞療法のためのインビトロで多能性幹細胞を培養するためのプロトコルの確立も必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
成体組織からの拡大可能な多能性幹細胞の同定、およびそれらをインビトロで培養するためのプロトコルの確立は、組織修復および再生の実用的な細胞療法への道を開くだろう。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本開示は、少なくとも１０００個の細胞を含む組成物を提供し、細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ４５を発現し、直径が５μｍ未満であるＣＤ４５＋細胞である。いくつかの態様では、ＣＤ４５＋細胞が、ＣＤ３４が陽性であり、ＡＢＣＧ２が陰性であるとさらに特徴付けられる。いくつかの態様では、細胞の２０％未満が赤血球である。いくつかの態様では、ＣＤ４５＋細胞が、Ｌｉｎが陰性であるとさらに特徴付けられる。いくつかの態様では、ＣＤ４５＋細胞が、ＣＤ４４、ＣＤ１５０、Ｓｃａ１、ｃ－ｋｉｔ、Ｔｈｙ１．１（ＣＤ９０．１）、Ｏｃｔ ４、ＳＳＥＡ１、Ｎａｎｏｇ、Ｖａｓａ、ＣＤ１３３およびＣＤ１０５からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーをさらに発現する。いくつかの態様では、ＣＤ４５＋細胞が、ＣＤ４１、Ｌｉｎ、Ｅ－カドヘリンおよびＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを発現しない。いくつかの態様では、ＣＤ４５＋細胞が、１つまたは複数の因子を含む培地によって活性化され得、活性化細胞がＡＢＣＧ２を発現する。
【0010】
本明細書に開示される組成物を調製する方法であって、（１）血液試料から赤血球の少なくとも一部を除去することと、（２）試料から血小板の少なくとも一部を除去することと、（３）試料を４００ｘｇ～３０００ｘｇで遠心分離することと、（４）本明細書に開示される組成物を含むペレットを得ることとを含む方法も提供される。いくつかの態様では、ステップ（３）で、試料を少なくとも３０００ｘｇの速度で遠心分離する。
【0011】
初代肝細胞、ヒト肝芽腫（ＨｅｐＧ２）細胞、肝細胞細胞株およびマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）細胞株からなる群から選択される少なくとも１つと接触している、またはこれによって馴化された培地で複数の哺乳動物細胞を培養することを含む、細胞を培養する方法も提供される。いくつかの態様では、肝細胞細胞株が、ＡＭＬ１２、ＨｅｐａＲＧまたはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、哺乳動物細胞が、（ａ）直径が５μｍ未満であり、（ｂ）ＣＤ４５を発現する。いくつかの態様では、細胞が、ＣＤ３４が陽性であり、ＡＢＣＧ２が陰性であるとさらに特徴付けられる。いくつかの態様では、哺乳動物細胞が１つまたは複数の種類の幹細胞を含む。
【0012】
本開示はさらに、ＣＤ３４およびＡＢＣＧ２を発現し、ＣＤ４５を発現しない単離哺乳動物細胞を提供する。いくつかの態様では、哺乳動物細胞が、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇおよび／またはケラチン上皮が陽性であり、Ｌｉｎが陰性であるとさらに特徴付けられる。いくつかの態様では、哺乳動物細胞が、ＣＤ１１７、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、Ｓｃａ１、ＣＤ３１、ＣＤ１８４、ネスチンおよびオステオカルシンからなる群から選択される１つまたは複数のマーカーをさらに発現する。いくつかの態様では、哺乳動物細胞が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４０ａ、Ｅ－カドヘリンおよびＬｉｎからなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを発現しない。本明細書に開示される細胞の集団も提供される。
【0013】
また、（ａ）直径が５μｍ未満であり、（ｂ）ＣＤ４５を発現し、（ｃ）ＡＢＣＧ２を発現しない細胞から誘導される幹細胞であって、ＡＢＣＧ２を発現し、（ａ）ＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋、（ｂ）ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－、（ｃ）ＣＤ３４－／ＣＤ４５＋または（ｄ）ＣＤ３４－／ＣＤ４５－とさらに特徴付けられる幹細胞も提供される。本開示の実施形態はまた、本明細書に開示される幹細胞から分化した細胞も提供する。
【0014】
薬学的に許容される担体または賦形剤中に本明細書に開示される幹細胞を含む組成物も提供される。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体または賦形剤中に本明細書に開示される分化細胞を含む組成物も提供される。それを必要とする対象の疾患または状態を処置する方法であって、有効量の本明細書に開示される組成物を対象に投与することを含む方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】血液から単離された休眠小細胞の電子顕微鏡画像を示す図である。
【0016】
【図2】インビトロで最大７日間の休眠小細胞およびそれから誘導された活性化幹細胞の核染色、ならびに７日目の細胞におけるＧＦＰ発現を示す図である。
【0017】
【図3A】休眠小細胞およびそれから誘導された活性化幹細胞におけるＡＢＣＧ２発現を示す図である。
【0018】
【図3B】休眠小細胞として単離され、特徴付けられたＣＤ３４およびＣＤ４５を発現する細胞集団を示す図である。
【0019】
【図4】対照としての肝細胞細胞系と比較した、休眠小細胞およびそれから誘導された活性化幹細胞におけるｓＲＮＡとｒＲＮＡの比を示す図である。
【0020】
【図5】活性化／発達系における休眠小細胞の成長および拡大、ならびに幹細胞コロニーの形成を示す図である。
【0021】
【図6】幹細胞コロニーからのＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞の精製集団のインビトロ細胞培養物を示す図である。
【0022】
【図7】精製幹細胞集団がＣＤ３４マーカーを発現するが、ＣＤ４５を発現しないことを示す図である。
【0023】
【図8】精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞集団が分化し、神経細胞特異的マーカーを発現することができることを示す図である。
【0024】
【図9】精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞集団が上皮マーカーを発現することができることを示す図である。
【0025】
【図10】精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞集団が分化し、骨組織特異的染色を発現することができることを示す図である。
【0026】
【図11】精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞集団が分化し、心筋細胞特異的マーカーを発現することができることを示す図である。
【0027】
【図12】精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞集団が分化し、肝細胞および胆管上皮特異的マーカーを発現することができることを示す図である。
【0028】
【図13】精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞集団で処置した場合の野生型マウスにおける皮膚創傷のより速い治癒率を示す図である。
【0029】
【図14】対照マウスの瘢痕組織と比較した、処置マウスの新たな機能的皮膚の成長を示す図である。
【0030】
【図15】精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞集団で処置した場合の糖尿病マウスにおける皮膚創傷のより速い治癒率を示す図である。
【0031】
【図16】対照マウスのかろうじて閉鎖した創傷と比較した、糖尿病マウスにおける１６日間の処置後の新たな皮膚の成長を示す図である。
【0032】
【図17】精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞集団から誘導された骨組織の成長を示す図である。
【0033】
【図18】精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞集団の移植後にＣＣｌ４によって引き起こされた肝損傷の修復を示す図である。
【0034】
【図19】活性化／発達系との共培養において血液から単離された休眠小細胞の代替細胞培養物を示す図である。
【0035】
【図20】活性化／発達系と共培養された幹細胞における肝細胞特異的マーカーの発現を示す図である。
【0036】
【図21】共培養系から得られた幹細胞を使用した肝損傷の処置を示す図である。
【0037】
【図22】活性化幹細胞の増殖マーカー、成長因子およびサイトカインの発現を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0038】
本開示を通して、種々の刊行物、特許、および公開特許明細書が本明細書で参照される。これらの刊行物、特許および公開特許明細書の開示は、全体が参照により本開示に組み込まれる。
【0039】
組成物および方法を記載する前に、これらは変化し得るので、本発明は記載される特定の方法論、プロトコル、細胞株、アッセイおよび試薬に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明することを意図しており、添付の特許請求の範囲に示される本発明の範囲を限定することを決して意図しないことも理解されたい。
【0040】
本発明の実施は、特に指示しない限り、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの従来技術を使用し、これらは当業者の技能の範囲内である。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ編（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、シリーズＡｕｓｕｂｅｌら編（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、シリーズＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９１）ＰＣＲ １：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９５）ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９９９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２００５）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第５版、Ｇａｉｔ編（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、米国特許第４６８３１９５号明細書、ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６））、Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｍａｋｒｉｄｅｓ編（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ、ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ロンドン）、Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇら編（１９９６）Ｗｅｉｒ'ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００２））、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９８７））、シリーズＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５））、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９９９）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８７））、Ｚｉｇｏｖａ、ＳａｎｂｅｒｇおよびＳａｎｃｈｅｚ－Ｒａｍｏｓ編（２００２）Ｎｅｕｒａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓを参照されたい。
【0041】
範囲を含む、全ての数値指定、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度および分子量は、適切な場合は０．１または１単位で（＋）または（－）変化する近似値である。全ての数値指定の前に「約」という用語が付いていることが常に明示的に述べられているわけではないが、理解されるべきである。「約」という用語には、適切な場合は「Ｘ＋０．１もしくは１」または「Ｘ－０．１もしくは１」などの「Ｘ」のわずかな増加に加えて、正確な値「Ｘ」も含まれる。本明細書に記載される試薬は単に例示であり、その等価物は当技術分野で知られていることも常に明示的に述べられているわけではないが、理解されるべきである。
【0042】
１．定義
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語は以下の意味を有する。
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語は以下の意味を有する。
【0043】
明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明確に別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、それらの混合物を含む複数の細胞を含む。
【0044】
本明細書で使用される場合、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、組成物および方法が列挙された要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味することを意図している。「～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、組成物および方法を定義するために使用される場合、述べられた目的のために、組み合わせにとって本質的に重要な他の要素を除外することを意味する。したがって、本明細書に定義される要素から本質的になる組成物は、主張される１つまたは複数の基本的および新規な特性に実質的に影響を及ぼさない他の材料またはステップを除外しない。「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、他の成分の微量元素および実質的な方法ステップ以上を除外することを意味するものとする。これらの遷移用語の各々によって定義される実施形態は、本開示の範囲内にある。
【0045】
本明細書で使用される場合、「単離」という用語は、細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体または１つもしくは複数のその断片が通常天然で会合している構成成分、細胞などから分離されることを意味する。例えば、単離ポリヌクレオチドは、通常その天然または自然環境、例えば染色体上で会合している３'および５'連続ヌクレオチドから分離される。当業者に明らかであるように、非天然ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体または１つもしくは複数のその断片は、天然に存在する対応物と区別するために「単離」を必要としない。単離細胞は、異なる表現型または遺伝子型の組織または細胞から分離された細胞である。
【0046】
本明細書で使用される場合、「幹細胞」は、培養中に無期限に分裂し、特殊化細胞を生じさせる能力を有する細胞を定義する。幹細胞の種類の非限定的な例としては、体性（成体）幹細胞、胚性幹細胞、単為生殖幹細胞（Ｃｉｂｅｌｌｉら（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９５（５５５６）、８１９、米国特許出願公開第２０１０００６９２５１号明細書および同第２００８０２９９０９１号明細書参照）および／または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞もしくはｉＰＳＣ）が挙げられる。体性幹細胞は、分化組織に見られる未分化細胞であり、自身を再生し（クローナル）、（一定の制限付きで）分化して、起源を持つ組織の全ての特殊化細胞型を生成することができる。胚性幹細胞は、多種多様な特殊化細胞型になる可能性を有する胚由来の原始（未分化）細胞である。胚性幹細胞の非限定的な例としては、シンガポールのＥＳＩから入手可能なＨＥＳ２（ＥＳ０２としても知られる）細胞株、およびウィスコンシン州マディソンのＷｉＣｅｌｌから入手可能なＨ１またはＨ９（ＷＡ０１としても知られる）細胞株が挙げられる。追加の行はＮＩＨレビュー申請中である。例えば、ｇｒａｎｔｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｔｅｍ＿ｃｅｌｌｓ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／ｃｕｒｒｅｎｔ．ｈｔｍ（最終アクセス日は２０１７年３月１３日）を参照されたい。多能性胚性幹細胞は、それだけに限らないが、Ｏｃｔ－４、アルカリホスファターゼ、ＣＤ３０、ＴＤＧＦ－１、ＧＣＴＭ－２、Ｇｅｎｅｓｉｓ、生殖細胞核因子、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４を含むマーカーを使用することによって、他の種類の細胞と区別することができる。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、１つまたは複数の幹細胞特異的遺伝子の発現を誘導することによって製造される、非多能性細胞、典型的には成体体細胞から人工的に誘導される幹細胞である。ｉＰＳＣは、それだけに限らないが、オクタマー転写因子のファミリー、例えばＯｃｔ－３／４、Ｓｏｘ遺伝子のファミリー、例えばＳｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５およびＳｏｘ１８、Ｋｌｆ遺伝子のファミリー、例えばＫｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４およびＫｌｆ５、Ｍｙｃ遺伝子のファミリー、例えばｃ－ｍｙｃおよびＬ－ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ遺伝子のファミリー、例えば、オクタマー－４（ＯＣＴ４）、ＮＡＮＯＧおよびＲＥＸ１、またはＬＩＮ２８を含む特定の遺伝子を発現する。ｉＰＳＣの例は、Ｔａｋａｈａｓｈｉら（２００７）Ｃｅｌｌ ａｄｖａｎｃｅ ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ２００７年１１月２０日、Ｔａｋａｈａｓｈｉ＆Ｙａｍａｎａｋａ（２００６）Ｃｅｌｌ １２６ ６６３～７６、Ｏｋｉｔａら（２００７）Ｎａｔｕｒｅ ４４８ ２６０～２６２、Ｙｕら（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｄｖａｎｃｅ ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ２００７年１１月２０日およびＮａｋａｇａｗａら（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖａｎｃｅ ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ２００７年１１月３０日に記載されている。
【0047】
本明細書で使用される場合、「伝播する」という用語は、細胞または細胞集団の表現型を成長または変化させることを意味する。「成長する」または「拡大する」という用語は、支持培地、栄養素、成長因子、支持細胞、または所望の数の細胞もしくは細胞型を得るために必要な任意の化学化合物もしくは生物学的化合物の存在下での細胞の増殖を指す。一実施形態では、細胞の成長／拡大が組織の再生をもたらす。
【0048】
本明細書で使用される場合、「培養」という用語は、種々の種類の培地上または培地内での細胞または生物のインビトロ伝播を指す。培養で成長した細胞の子孫は、親細胞と完全に同一ではない場合がある（すなわち、形態学的、遺伝的または表現型的に）ことが理解される。「拡大」とは、細胞の増殖または分裂を意味する。
【0049】
本明細書で使用される場合および以下により詳細に示されるように、「馴化培地」は、サイトカイン、成長因子、ホルモン、細胞外マトリックス、ならびに細胞成長、発達および分化を促進するいくつかの材料などの細胞因子を培地に提供する成熟細胞を用いて培養された培地である。
【0050】
本明細書で使用される場合、「分化」という用語は、非特殊化細胞が皮膚、心臓、肝臓または筋肉細胞などの特殊化細胞の特徴を獲得する過程を記載するものである。「分化誘導」とは、特定の細胞型への分化を誘導するための幹細胞培養条件の操作を指す。「脱分化」とは、細胞の系統内であまり拘束されていない位置に戻る細胞を定義する。本明細書で使用される場合、「分化するまたは分化した」という用語は、細胞の系統内のより拘束された（「分化した」）位置をとる細胞を定義する。
【0051】
本明細書で使用される場合、細胞の「系統」は、細胞の遺伝、すなわち、その先祖および子孫を定義する。細胞の系統は、細胞を発達および分化の遺伝的スキーム内に配置する。本明細書で使用される場合、「中胚葉（または外胚葉または内胚葉）系統に分化する細胞」は、それぞれ特定の中胚葉（または外胚葉または内胚葉）系統に拘束される細胞を定義する。中胚葉系統に分化する、または特定の中胚葉細胞を生じさせる細胞の例としては、それだけに限らないが、脂肪生成細胞、平滑筋原性細胞、軟骨形成細胞、心原性細胞、皮膚原性細胞、造血細胞、血液新生細胞、筋原性細胞、腎原性細胞、尿生殖原性細胞、骨原性細胞、心膜原性細胞または間質細胞が挙げられる。外胚葉系統に分化する細胞の例としては、それだけに限らないが、表皮細胞、神経原性細胞および神経膠原性細胞が挙げられる。内胚葉系統に分化する細胞の例としては、それだけに限らないが、膵臓、肝臓、肺、胃、腸および甲状腺を生じさせる細胞が挙げられる。
【0052】
本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞」という用語は、（ｉ）未分化状態でインビトロで無期限に増殖可能であり、（ｉｉ）長期間の培養を通して正常な核型を維持し、（ｉｉｉ）長期間の培養後でさえも、３つ全ての胚性胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）の誘導体に分化する可能性を維持する細胞を指す。現在利用可能な多能性幹細胞の非限定的な例としては、胚性幹細胞およびｉＰＳＣが挙げられる。本明細書で使用される場合、「胚様」幹細胞という用語は、胚性幹細胞の多能性特性を有する、組織、器官または血液から誘導される細胞を指す。
【0053】
本明細書で使用される場合、「多系統幹細胞」または「多能性幹細胞」という用語は、それ自体および別個の発達系統からの少なくとも２つのさらなる分化した子孫細胞を再生する幹細胞を指す。系統は、同じ胚葉（すなわち、中胚葉、外胚葉または内胚葉）から、または異なる胚葉からのものであり得る。多系統幹細胞の分化からの異なる発達系統を有する２つの子孫細胞の例は、筋原性細胞および脂肪生成細胞である（共に中胚葉起源であるが、異なる組織を生じる）。別の例は、神経原性細胞（外胚葉起源）および脂肪生成細胞（中胚葉起源）である。
【0054】
本明細書で使用される場合、「自己複製可能」という用語は、細胞特性の実質的な変化なしに、いくつかの継代にわたって自己複製することができる細胞を指す。一態様では、継代数が、少なくとも約５、あるいは少なくとも１０、あるいは少なくとも約１５、２０、３０、５０または１００である。
【0055】
本明細書で使用される場合、「実質的に均質な」という用語は、細胞の約５０％超、あるいは約６０％超、あるいは７０％超、あるいは７５％超、あるいは８０％超、あるいは８５％超、あるいは９０％超、あるいは９５％超、あるいは９９％超が同じまたは類似の表現型である細胞の集団を記載するものである。表現型は、事前に選択された細胞表面マーカーまたは他のマーカーによって決定することができる。
【0056】
本明細書で使用される場合、目的の細胞の「精製集団」という用語は、その天然の環境に存在する実質的に全ての他の細胞から単離された細胞集団を指すが、細胞の混合物中の目的の細胞の割合がその天然の環境で見られるよりも大きい。例えば、他の細胞および細胞型も濃縮集団に存在する場合でも、精製細胞集団は、目的の細胞の濃縮集団を表す。いくつかの実施形態では、精製細胞集団が、混合細胞集団の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または約１００％を表し、但し、目的の細胞が精製前の集団よりも大きな「精製」集団の総細胞集団の割合を構成する。
【0057】
本明細書で使用される場合、「細胞集団」という用語は、表現型および／または遺伝子型が同一（クローナル）または非同一である２つ以上の細胞の集合を指す。
【0058】
本明細書で使用される場合、「細胞コロニー」または「コロニー」という用語は、細胞成長の結果として形成される密接に関連する細胞のグループ化を指す。これらの用語は、コロニーを構成する細胞の数とは無関係に使用される。
【0059】
本明細書で使用される場合、「休眠細胞」という用語は、成長または分化を受けることができるより前に活性化される必要がある休眠状態または静止状態にある細胞を包含することを意図している。
【0060】
本明細書で使用される場合、「休眠小細胞」という用語は、成長および／または分化を受けることができるより前に活性化される必要がある休眠状態または静止状態にある細胞を包含することを意図している。休眠小細胞は、典型的には直径が５μｍ未満である。
【0061】
本明細書で使用される場合、休眠細胞の「活性化」という用語は、細胞の休眠状態における測定可能な形態学的、表現型および／または機能的変化を指す。このような活性化は、典型的には、活性化細胞の特定のマーカーの発現と同時に起こる。一実施形態では、活性化が細胞成長および／または発達の変化と同時に起こる。
【0062】
本明細書で使用される場合、「活性化幹細胞」という用語は、活性化状態にあり、特定の条件下で成長および／または分化を受けることができる幹細胞を包含することを意図している。
【0063】
本明細書で使用される場合、「組成物」という用語は、活性剤と別の担体、例えば化合物または組成物、不活性剤（例えば検出可能な薬剤もしくは標識）または活性剤、例えばアジュバント、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバントなどの組み合わせを包含することを意図している。担体には、薬学的賦形剤および添加剤タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、および炭水化物（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖およびオリゴ糖を含む糖類、アルジトール、アルドン酸、エステル化糖などの誘導体化糖など、ならびに多糖類または糖ポリマー）も含まれ、これらは単独でまたは組み合わせて存在することができ、単独でまたは組み合わせて１～９９．９９重量または体積％を構成する。例示的なタンパク質賦形剤には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどの血清アルブミンが含まれる。代表的なアミノ酸／抗体成分は、緩衝能で機能することもでき、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどを含む。炭水化物賦形剤も本発明の範囲内にあることが意図されており、その例としては、それだけに限らないが、単糖類、例えばフルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ－マンノース、ソルボースなど、二糖類、例えばラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど、多糖類、例えばラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなど、およびアルジトール、例えばマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）およびミオイノシトールが挙げられる。一定の実施形態では、組成物が、細胞集団または細胞の混合物を含む。一定の実施形態では、組成物が、フィルム、ゲル、パッチ、３－Ｄ構造または液体溶液として製剤化される。
【0064】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、示される材料が、処置される疾患または状態およびそれぞれの投与経路を考慮に入れて、合理的に賢明な医師に患者への材料の投与を回避させるような特性を有さないことを示す。例えば、このような材料は本質的に無菌であることが一般的に要求される。
【0065】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体（または媒体）」という用語は、「生物学的に適合性の担体（または媒体）」という用語と互換的に使用され得、治療的に投与される細胞および他の薬剤と適合性であるだけでなく、健全な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の合併症なしでヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適してもいる、試薬、細胞、化合物、材料、組成物および／または剤形を指す。本発明で使用するのに適した薬学的に許容される担体には、液体、半固体（例えば、ゲル）および固体材料（例えば、細胞足場およびマトリックス、チューブシートおよび当技術分野で知られており、本明細書により詳細に記載される他のこのような材料）が含まれる。これらの半固体および固体材料は、体内での分解に耐えるように設計することも（非生分解性）、体内で分解するように設計することも（生分解性、生体侵食性）できる。生分解性材料は、さらに生体吸収性（ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ）または生体吸収性（ｂｉｏａｂｓｏｒｂａｂｌｅ）であり得る、すなわち、体液に溶解し、吸収され（水溶性インプラントが一例である）、分解され、最終的には、他の材料への変換または分解および自然な経路を通した排除によって、体内から排除され得る。局所使用の場合、薬学的に許容される担体は、クリーム、軟膏、ゼリー、ゲル、溶液、懸濁液等の製造に適している。このような担体は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた局所投与について、当技術分野で慣用的である。これらの製剤は、場合により希釈剤、安定剤および／またはアジュバントなどの追加の薬学的に許容される成分を含んでもよい。
【0066】
本明細書で使用される場合、「溶液」という用語は、当技術分野で周知の溶液、懸濁液、乳濁液、ドロップ、軟膏、液体洗浄剤、スプレーおよびリポソームを指す。いくつかの実施形態では、液体溶液が、少量の酸または塩基を添加した場合にｐＨの変化に抵抗する水性ｐＨ緩衝剤を含有する。
【0067】
本明細書で使用される場合、「ｐＨ緩衝剤」という用語は、少量の酸または塩基を添加した場合にｐＨの変化に抵抗する水性緩衝液を指す。ｐＨ緩衝液は、典型的には弱酸とその共役塩基の混合物またはその逆を含む。例えば、ｐＨ緩衝液には、リン酸塩、例えばリン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム二水和物、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素ナトリウム十二水和物、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウムおよびリン酸水素二カリウム、ホウ酸およびホウ酸塩、例えばホウ酸ナトリウムおよびホウ酸カリウム、クエン酸およびクエン酸塩、例えばクエン酸ナトリウムおよびクエン酸二ナトリウム、酢酸塩、例えば酢酸ナトリウムおよび酢酸カリウム、炭酸塩、例えば炭酸ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウム等が含まれ得る。ｐＨ調整剤には、例えば、塩酸、乳酸、クエン酸、リン酸および酢酸などの酸、ならびに水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウムなどのアルカリ塩基が含まれ得る。いくつかの実施形態では、ｐＨ緩衝剤が、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液（すなわち、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびいくつかの製剤では、塩化カリウムおよびリン酸カリウムを含有する）である。
【0068】
本明細書で使用される場合、「製剤化された」または「製剤化」という用語は、１つまたは複数の医薬有効成分を含む異なる物質を組み合わせて剤形を製造する過程を指す。一定の実施形態では、２つ以上の医薬有効成分を単一剤形もしくは組合せ投与単位に共製剤化することができる、または別々に製剤化し、その後組合せ投与単位に組み合わせることができる。徐放性製剤は、長期間にわたって体内で治療剤をゆっくり放出するよう設計された製剤である一方、即時放出製剤は、短期間にわたって体内で治療剤を迅速に放出するよう設計された製剤である。
【0069】
本明細書で使用される場合、「処置する」という用語は、損傷または介入の前、間および／または後に、疾患または障害の１つまたは複数の臨床症状を予防、治癒、逆転、減弱、緩和、最小化、阻害、抑制および／または停止することを指す。
【0070】
本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」という用語は、本明細書に記載される医薬組成物でまたは方法によって処置されるマウス、イヌ、ウマ、ウシ、サルまたはヒトなどの哺乳動物を含む動物を指す。
【0071】
本明細書で使用される場合、「送達」という用語は、その所望の治療効果を安全に達成するために必要に応じて体内に医薬組成物を輸送するための経路、アプローチ、製剤、技術および系を指す。送達経路は、それだけに限らないが、血管内経路、静脈内経路、動脈内経路、筋肉内経路、皮膚経路、皮下経路、経皮経路、皮内経路および表皮内経路を含む任意の適切な経路であり得る。いくつかの実施形態では、有効量の組成物が、患者の皮膚に施用する、または皮膚に送達するために製剤化される。いくつかの実施形態では、有効量の組成物が、患者の血流に送達するために製剤化される。
【0072】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、インビトロまたはインビボでの細胞成長および／または分化を含む意図した結果をもたらすため、あるいはそれを必要とする患者の疾患、障害または状態を処置するために有効な、本明細書に記載される組成物、細胞集団または他の薬剤などの組成物または試薬の濃度または量を指す。投与される細胞の数は、医薬生物学者および／または処置する医師によく知られている数ある因子の中でも、それだけに限らないが、処置されるサイズまたは総体積／表面積を含む処置される障害の詳細、ならびに処置される領域の位置に対する投与部位の近接性に応じて変化することが理解されるだろう。
【0073】
本明細書で使用される場合、「有効な期間（または時間）」および「有効な条件」という用語は、意図した結果、例えば予め決定された細胞型への細胞の分化を達成するために薬剤または組成物に必要なまたは好ましい期間または他の制御可能な条件（例えば、インビトロ方法の温度、湿度）を指す。
【0074】
本明細書で使用される場合、「対照」または「対照群」という用語は、比較目的で実験で使用される代替の対象または試料を指す。対照は「陽性」または「陰性」であり得る。
【0075】
本明細書で使用される場合、「同時に」という用語は、同時（すなわち、併せた）投与を指す。一実施形態では、投与が、その任意の固体形態を含む２つ以上の医薬有効成分が一度に一緒に送達されるような共投与である。
【0076】
本明細書で使用される場合、「連続的に」という用語は、別個の（すなわち、異なる時間での）投与を指す。一実施形態では、投与が、その任意の固体形態を含む２つ以上の医薬有効成分が異なる時間に別々に送達されるようにずらされる。
【0077】
本明細書で使用される場合、「標的組織」または「標的器官」という用語は、対象への投与後の、本明細書に開示される幹細胞および／または本明細書に開示される幹細胞から誘導される分化細胞の蓄積を意図した部位を指す。例えば、本明細書に開示される方法は、いくつかの実施形態では、（例えば虚血または他の損傷により）損傷を受けた標的組織または標的器官を伴う。
【0078】
本明細書で使用される場合、「自家移植（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｒ）」、「自家移植（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」、「自家移植（ａｕｔｏｇｒａｆｔ）」などの用語は、細胞ドナーが細胞置換療法のレシピエントでもある処置を指す。「同種移植（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ）」、「同種移植（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」、「同種移植（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）」などの用語は、細胞ドナーが細胞置換療法のレシピエントと同じ種のものであるが、同じ個体ではない処置を指す。ドナーの細胞がレシピエントと組織適合性で一致している細胞移植は、時々、同系移植と呼ばれる。異種移植（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ）、異種移植（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）などの用語は、細胞ドナーが細胞置換療法のレシピエントとは異なる種のものである処置を指す。
【0079】
本明細書で使用される場合、「ＡＢＣＧ２」または「ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体Ｇ２」という用語は、ＡＢＣＧ／ホワイトサブファミリーに属するＡＢＣＧファミリーの半輸送体を指し、遺伝子記号ＡＢＣＧ２を有する。ＡＢＣＧ２は、ＭＸＲ（ミトキサントロン耐性タンパク質、Ｍｉｙａｋｅら、１９９９）、ＢＣＲＰ（乳がん耐性タンパク質、Ｄｏｙｌｅら、１９９８）、またはＡＢＣＰ（胎盤特異的ＡＢＣ輸送体、Ａｌｌｉｋｍｅｔｓら、１９９８）としても知られている。ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）データベースは、ヒト（例えば、ＡＡＧ５２９８２）、マウス（ＮＭ＿０１１９２０．３）、ラット（ＢＡＣ７６３９６．１）、ネコ（ＸＰ＿０１９６８４８１３．１）、イヌ（ＮＰ＿００１０４１４８６．１）、ブタ（ＮＰ＿９９９１７５．１）、ウシ（ＮＰ＿００１０３２５５５．２）などのＡＢＣＧ２のアミノ酸および核酸配列を開示している。
【0080】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ３４」という用語は、一定の造血幹細胞および非造血幹細胞に見られ、遺伝子記号ＣＤ３４を有する細胞表面マーカーを指す。ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）データベースは、ヒト（例えば、ＡＡＢ２５２２３）、マウス（ＮＰ＿５９８４１５）、ラット（ＸＰ＿２２３０８３）、ネコ（ＮＰ＿００１００９３１８）、ブタ（ＭＰ＿９９９２５１）、ウシ（ＮＰ＿７７６４３４）などのＣＤ３４のアミノ酸および核酸配列を開示している。
【0081】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ４５」という用語は、白血球共通抗原（ＬＣＡ）としても知られ、遺伝子記号ＰＴＰＲＣを有するチロシンホスファターゼを指す。この遺伝子は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）寄託番号ＮＰ＿００２８２９（ヒト）、ＮＰ＿０３５３４０（マウス）、ＮＰ＿６１２５１６（ラット）、ＸＰ＿００２８２９（イヌ）、ＸＰ＿５９９４３１（ウシ）およびＡＡＲ１６４２０（ブタ）に対応している。いくつかの魚種およびいくつかの非ヒト霊長類のものを含む、追加のＣＤ４５ホモログのアミノ酸配列もＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）データベースに存在する。
【0082】
本明細書で使用される場合、「系統マーカー」または「Ｌｉｎ」という用語は、細胞系統に特徴的な分子、例えば細胞表面マーカー、ｍＲＮＡまたは内部タンパク質を指す。系統陽性（Ｌｉｎ＋）細胞は、成熟細胞系統マーカーを発現する細胞の混合物を指す。系統陰性（Ｌｉｎ－）細胞には、幹細胞および前駆細胞が含まれるが、これらは分化した成熟細胞ではない。一態様では、「Ｌｉｎ」がマーカーのパネルを指す。本明細書で使用されるマウス系統パネルは、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球／マクロファージ、顆粒球、ＮＫ細胞および赤血球などの主要な造血細胞系統からの細胞と反応することができる。本明細書で使用される場合、ＦＩＴＣ抗マウス系統抗体カクテルは、マウス骨髄中の造血前駆細胞のフローサイトメトリー同定用に設計されている。カクテルの成分には、抗マウスＣＤ３ｅ、クローン１４５－２Ｃ１１、抗マウスＬｙ－６Ｇ／Ｌｙ－６Ｃ、クローンＲＢ６－８Ｃ５、抗マウスＣＤ１１ｂ、クローンＭ１／７０、抗マウスＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、クローンＲＡ３－６Ｂ２、抗マウスＴＥＲ－１１９／赤血球細胞、クローンＴｅｒ－１１９が含まれる。ＦＩＴＣ抗マウス系統アイソタイプ対照カクテルは、等価な濃度のアイソタイプが一致した陰性対照免疫グロブリンを含有する。
【0083】
本明細書で使用される場合、「ケラチン上皮マーカー」という用語は、ＣＫ５、ＣＫ６、ＣＫ８を含むマーカーのパネルを指す。
【0084】
２．休眠小細胞の単離
哺乳動物対象の末梢血の一定の比較的小さな細胞を活性化すると多能性幹細胞になることができることが、本発明者らの驚くべき、期待される発見である。多能性は、３つの胚葉全てに分化する細胞の能力で示されている。さらに、本明細書で開発された新たな活性化および発達系により、多能性幹細胞を、インビトロで迅速かつ有効に拡大することができる。さらに、血液から誘導される多能性幹細胞は、倫理的および政治的に議論の余地があると考えられておらず、遺伝子操作を必要としない。本技術のさらに別の利点は、多能性幹細胞が非腫瘍原性であることが示されている。したがって、本開示技術は、組織修復および再生の実用的な細胞療法への道を開き、慢性および加齢関連疾患において未だ満たされていない医療ニーズのための新たな治療法も提供する。
哺乳動物対象の末梢血の一定の比較的小さな細胞を活性化すると多能性幹細胞になることができることが、本発明者らの驚くべき、期待される発見である。多能性は、３つの胚葉全てに分化する細胞の能力で示されている。さらに、本明細書で開発された新たな活性化および発達系により、多能性幹細胞を、インビトロで迅速かつ有効に拡大することができる。さらに、血液から誘導される多能性幹細胞は、倫理的および政治的に議論の余地があると考えられておらず、遺伝子操作を必要としない。本技術のさらに別の利点は、多能性幹細胞が非腫瘍原性であることが示されている。したがって、本開示技術は、組織修復および再生の実用的な細胞療法への道を開き、慢性および加齢関連疾患において未だ満たされていない医療ニーズのための新たな治療法も提供する。
【0085】
一実施形態では、本開示は、ＣＤ４５を発現し、直径が５μｍ未満である細胞が濃縮された細胞集団を提供する。このような細胞は、本明細書で「ＣＤ４５＋細胞」または「休眠小細胞」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、組成物または細胞集団が、合計で少なくとも１００個の細胞、１０００個の細胞、１００００個の細胞または１０００００個の細胞を含み、これらの少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％が休眠小細胞である。いくつかの実施形態では、休眠小細胞の全てが、哺乳動物対象の血液試料から得られる。いくつかの実施形態では、組成物が、赤血球および白血球などの血球を比較的低い割合でさらに含む（例えば、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％または０．１％未満）。
【0086】
いくつかの実施形態では、組成物中の休眠小細胞が、無傷のものと壊れたものの両方を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団中の無傷の休眠小細胞の数と壊れた休眠小細胞の数の比が１：１未満、少なくとも約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１または１５：１である。
【0087】
いくつかの実施形態では、休眠小細胞が、直径が約２μｍ、あるいは約２．５μｍ、あるいは約３μｍ、あるいは約３．５μｍ、あるいは約４μｍ、あるいは約４．５μｍ、あるいは約５μｍ、あるいは約２～３μｍの間、あるいは約２～４μｍの間、あるいは約２～５μｍの間、あるいは５μｍ未満、あるいは４μｍ未満、あるいは３μｍ未満である。いくつかの実施形態では、単離休眠小細胞が、非常に高い核－細胞質比（ｖ／ｖ、Ｎ：Ｃ比またはＮ／Ｃとも呼ばれる）を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される休眠小細胞の核－細胞質比が、少なくとも９：１、あるいは少なくとも８：１、あるいは少なくとも７：１、あるいは少なくとも６：１、あるいは少なくとも５：１であり得る。インビトロで通常の細胞培養培地（例えば、２０％ＦＢＳを含むα－ＭＥＭ）に播種した場合、いくつかの実施形態では、休眠小細胞が増殖せず、数日で老化する。いくつかの実施形態では、休眠小細胞の単離集団が、マーカーＣＤ３４とＣＤ４５の両方を発現し、マーカーＡＢＣＧ２を発現しない。いくつかの実施形態では、休眠小細胞が、Ｌｉｎ－であるとさらに特徴付けられる。
【0088】
いくつかの実施形態では、休眠小細胞が、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に対して高い比の小ＲＮＡ（マイクロＲＮＡを含むｓＲＮＡ）を有し得る。いくつかの実施形態では、小ＲＮＡとリボソームＲＮＡの比が、少なくとも２２：１、あるいは少なくとも２０：１、あるいは少なくとも１８：１、あるいは少なくとも１５：１、あるいは少なくとも１２：１、あるいは少なくとも１０：１、あるいは少なくとも９：１、あるいは少なくとも８：１、あるいは少なくとも７：１、あるいは少なくとも６：１、あるいは少なくとも５：１である。ミトコンドリアマーカー（例えば、ＣＯＸ ＩＶ）、小胞体（ＥＲ）マーカー（例えば、カルネキシン）およびリボソームマーカー（例えば、ＲＰＳ３）の低レベルまたは最小限の発現はまた、いくつかの態様では、幹細胞の単離集団が休眠中／静止状態であることを示し得る。
【0089】
休眠小細胞を、細胞表面マーカーおよび細胞内マーカー、例えば以下の表１に示されるものを使用して分析することができる。
【表1】
【0090】
いくつかの実施形態では、単離休眠小細胞が、１つまたは複数の初期幹細胞マーカー（例えば、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ１、Ｖａｓａ）を発現する。いくつかの実施形態では、休眠小細胞が、造血マーカー（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＣＤ１５０）およびＭＳＣマーカー（例えば、ＣＤ４４、ＣＤ１０５、Ｓｃａ１、ＣＤ９０．１）の群の１つまたは複数のマーカーを発現する。いくつかの実施形態では、休眠小細胞の単離集団が、表１で同定されるマーカーのうち１つまたは複数を発現する。一態様では、表１で同定されるマーカーのうち２つ、あるいは３つ、あるいは４つ、あるいは５つが存在し、全てのマーカーが存在するまで増加する。いくつかの実施形態では、休眠小細胞が、Ｅ－カドヘリン、ＣＤ１８４および／またはＣＤ４１を発現しない。
【0091】
いくつかの実施形態では、血液試料から本明細書に開示される休眠小細胞を単離する方法が提供される。休眠小細胞は、細胞の単離を可能にする任意の手段によって末梢血から単離することができる。例えば、本明細書に開示される方法は、血液試料から血液細胞および血小板の少なくとも一部を除去することと、試料を遠心分離して休眠小細胞を含むペレットを得ることとを含み得る。他の態様では、本方法は、１つまたは複数の同定マーカーに基づく細胞選別および細胞単離方法を含み得る。例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を使用して、休眠小細胞を選別および単離することができる。いくつかの実施形態では、他の方法を使用して本明細書に開示される休眠小細胞を単離することができる。いくつかの単離手順の例を、以下の実施例１で提供する。
【0092】
一態様では、休眠小細胞の単離方法が、（１）血液試料から赤血球の少なくとも一部を除去することと、（２）試料から血小板の少なくとも一部を除去することと、（３）試料を４００ｘｇ～３０００ｘｇで遠心分離することと、（４）本明細書に開示される休眠小細胞を含むペレットを得ることとを含む。いくつかの態様では、ステップ（３）の試料が、約４００ｘｇ、あるいは約５００ｘｇ、あるいは約８００ｘｇ、あるいは約１０００ｘｇ、あるいは約１２００ｘｇ、あるいは約１５００ｘｇ、あるいは約１８００ｘｇ、あるいは約２０００ｘｇ、あるいは約２２００ｘｇ、あるいは約２５００ｘｇ、あるいは約２８００ｘｇ、あるいは約３０００ｘｇ、あるいは約３５００ｘｇ、あるいは約４０００ｘｇ、あるいは約４５００ｘｇ、あるいは約５０００ｘｇ、あるいは約５５００ｘｇ、あるいは約６０００ｘｇ、あるいは約６５００ｘｇ、あるいは約７０００ｘｇ、あるいは約７５００ｘｇ、あるいは約８０００ｘｇ、あるいは約９０００ｘｇ、あるいは約１００００ｘｇ、あるいは１００００ｘｇ超で遠心分離され得る。
【0093】
いくつかの実施形態では、幹細胞の１つまたは複数の特定のマーカーに基づいて幹細胞の特定の濃縮集団を単離する方法が提供される。例えば、本方法を使用して、（例えば、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳによって）ＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋／ＡＢＣＧ２－／Ｌｉｎ－細胞が濃縮された細胞集団を単離することができる。別の例では、本方法を使用して、ＣＤ３４＋／ＡＢＣＧ２－細胞が濃縮された細胞集団を単離することができる。他の実施形態では、本方法を使用して、特定のマーカー（例えば、本明細書に開示される休眠小細胞を同定するためのマーカー）の一定の組み合わせを有する細胞が濃縮された細胞集団を単離することができる。
【0094】
いくつかの実施形態では、組織が本明細書に開示される生存可能な休眠小細胞を含有する限り、休眠小細胞を他の供給源／組織から単離してもよい。いくつかの実施形態では、休眠小細胞が、任意の年齢の対象から単離され得る。いくつかの実施形態では、休眠小細胞がいつでも対象から単離され得る。いくつかの実施形態では、休眠小細胞を、それだけに限らないが、ウマ、イヌ、ブタ、ウシ、マウス、サルおよびヒトなどの動物から単離することができる。
【0095】
３．活性化および発達
休眠小細胞の単離集団をインビトロで活性化および培養するために、活性化／発達系が確立されている。いくつかの実施形態では、活性化／発達系が、初代肝細胞、ヒト肝芽腫（ＨｅｐＧ２）細胞、肝細胞細胞株およびマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）細胞株から選択される１つまたは複数の細胞型／細胞株を含む。肝細胞細胞株の非限定的な例としては、ＡＭＬ１２およびＨｅｐａＲＧが挙げられる。いくつかの実施形態では、活性化／発達系が、他の種類の肝芽腫細胞および／または他の種類の胚線維芽細胞細胞株を含み得る。いくつかの実施形態では、活性化／発達系が、他の種類の細胞および／または細胞株を含み得る。いくつかの態様では、活性化／発達系が、上記の細胞／細胞株のうち少なくとも１つ、あるいは少なくとも２つ、あるいは少なくとも３つ、あるいは少なくとも４つを含み得る。
休眠小細胞の単離集団をインビトロで活性化および培養するために、活性化／発達系が確立されている。いくつかの実施形態では、活性化／発達系が、初代肝細胞、ヒト肝芽腫（ＨｅｐＧ２）細胞、肝細胞細胞株およびマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）細胞株から選択される１つまたは複数の細胞型／細胞株を含む。肝細胞細胞株の非限定的な例としては、ＡＭＬ１２およびＨｅｐａＲＧが挙げられる。いくつかの実施形態では、活性化／発達系が、他の種類の肝芽腫細胞および／または他の種類の胚線維芽細胞細胞株を含み得る。いくつかの実施形態では、活性化／発達系が、他の種類の細胞および／または細胞株を含み得る。いくつかの態様では、活性化／発達系が、上記の細胞／細胞株のうち少なくとも１つ、あるいは少なくとも２つ、あるいは少なくとも３つ、あるいは少なくとも４つを含み得る。
【0096】
一態様では、活性化／発達系が、少なくとも初代肝細胞、ＨｅｐＧ２細胞、肝細胞細胞株およびＭＥＦ細胞株の細胞混合物を含む。別の態様では、活性化／発達系が、少なくとも初代肝細胞、ＨｅｐＧ２細胞および肝細胞細胞株の細胞混合物を含む。別の態様では、活性化／発達系が、少なくとも初代肝細胞、ＨｅｐＧ２細胞およびＭＥＦ細胞株の細胞混合物を含む。別の態様では、活性化／発達系が、少なくとも初代肝細胞、肝細胞細胞株およびＭＥＦ細胞株の細胞混合物を含む。別の態様では、活性化／発達系が、少なくともＨｅｐＧ２細胞、肝細胞細胞株およびＭＥＦ細胞株の細胞混合物を含む。別の態様では、活性化／発達系が、少なくとも初代肝細胞およびＨｅｐＧ２細胞の細胞混合物を含む。別の態様では、活性化／発達系が、少なくとも初代肝細胞および肝細胞細胞株の細胞混合物を含む。別の態様では、活性化／発達系が、少なくとも初代肝細胞およびＭＥＦ細胞株の細胞混合物を含む。別の態様では、活性化／発達系が、少なくともＨｅｐＧ２細胞および肝細胞細胞株の細胞混合物を含む。別の態様では、活性化／発達系が、少なくともＨｅｐＧ２細胞およびＭＥＦ細胞株の細胞混合物を含む。別の態様では、活性化／発達系が、少なくとも肝細胞細胞株およびＭＥＦ細胞株の細胞混合物を含む。別の態様では、活性化／発達系が、少なくとも初代肝細胞を含む。別の態様では、活性化／発達系が、少なくともＨｅｐＧ２細胞を含む。別の態様では、活性化／発達系が、少なくとも肝細胞細胞株を含む。別の態様では、活性化／発達系が、少なくともＭＥＦ細胞株を含む。
【0097】
一実施形態では、インビトロで休眠小細胞を活性化および培養する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、休眠小細胞を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌプレートを使用して、本明細書に開示される細胞または細胞混合物と共培養することができる。例えば、細胞または上記の細胞／細胞株の細胞混合物を調製し、マイトマイシンＣで処置して、細胞を有糸分裂的に不活性化することができる。次いで、細胞／細胞混合物を共培養培地の細胞培養プレートの底に播種することができる。休眠小細胞の単離集団をＴｒａｎｓｗｅｌｌ膜に播種して、細胞／細胞混合物と共培養することができる。共培養培地は、５～５０％のＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むα－ＭＥＭ培地を含み得る。例えば、共培養培地は、約５％、あるいは約１０％、あるいは約１５％、あるいは約２０％、あるいは約２５％、あるいは約３０％、あるいは約３５％、あるいは約４０％、あるいは約４５％、あるいは約５０％のＦＢＳを含むα－ＭＥＭ培地を含み得る。いくつかの実施形態では、他の培養培地を本明細書に開示される方法で使用してもよい。場合により、他の試薬および因子を共培養培地に添加してもよい。
【0098】
別の態様では、馴化培地を使用して休眠小細胞を活性化および培養する方法が本明細書で提供される。いくつかの態様では、培養培地を、活性化／発達系で使用する前に、上記の細胞または細胞／細胞株の混合物で馴化してもよい。例えば、上記の細胞／細胞混合物を細胞培養培地に懸濁し、次いで、細胞培養皿／プレートに播種することができる。細胞／細胞混合物を培養するための細胞培養培地は、５～５０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭを含み得る。例えば、培地は、約５％、あるいは約１０％、あるいは約１５％、あるいは約２０％、あるいは約２５％、あるいは約３０％、あるいは約３５％、あるいは約４０％、あるいは約４５％、あるいは約５０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭを含み得る。いくつかの実施形態では、他の培養培地を本明細書に開示される方法で使用してもよい。場合により、他の試薬および因子を培地に添加してもよい。馴化培地は、細胞培養皿／プレートから回収することができ、培地中の残りの細胞を除去した後（例えば、遠心分離および／または濾過により）、培地を使用して単離休眠小細胞を培養することができる。回収した馴化培地を、休眠小細胞を培養するために、上記の共培養培地と混合してもよい。例えば、培地混合物の総体積に基づいて、本明細書に開示される馴化培地は、約５％（ｖ／ｖ）、あるいは約１０％、あるいは約１５％、あるいは約２０％、あるいは約２５％、あるいは約３０％、あるいは約３５％、あるいは約４０％、あるいは約４５％、あるいは約５０％、あるいは約５５％、あるいは約６０％、あるいは約６５％、あるいは約７０％、あるいは約７５％、あるいは約８０％、あるいは約８５％、あるいは約９０％、あるいは約９５％であり得る。場合により、他の試薬および因子を培地の混合物に添加してもよい。
【0099】
本開示の実施形態はまた、本明細書に開示される休眠小細胞から誘導される活性化幹細胞の集団も提供する。活性化幹細胞は、上記の活性化／発達系で休眠小細胞を有効な期間培養することによって得ることができる。いくつかの態様では、休眠小細胞を活性化するのに有効な培養時間には、それだけに限らないが、少なくとも１時間、あるいは少なくとも２時間、あるいは少なくとも４時間、あるいは少なくとも１２時間、あるいは少なくとも１日間、あるいは少なくとも２日間、あるいは少なくとも３日間、あるいは少なくとも４日間、あるいは少なくとも５日間、あるいは少なくとも８日間、あるいは少なくとも１０日間、あるいは少なくとも１２日間、あるいは少なくとも１５日間、あるいは少なくとも１８日間、あるいは少なくとも２０日間が含まれ得る。細胞培養培地は、１日毎、あるいは２日毎、あるいは３日毎、あるいは４日毎、あるいは５日以上毎に交換してもよい。いくつかの実施形態では、活性化幹細胞が、休眠小細胞を他の培養系、培養培地、または条件で有効な期間培養することによって得られ得る。いくつかの実施形態では、活性化幹細胞が、異なるマーカーセットによって特徴付けられる細胞の種々の亜集団を含む高度に不均一な細胞混合物として特徴付けられる。
【0100】
いくつかの実施形態では、他の細胞培養培地および／または細胞培養条件を使用して、本明細書に開示される幹細胞を活性化および／または培養することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される活性化／発達系で使用される細胞培養培地および／または細胞培養条件を使用して、他の種類の細胞および／または他の種類の幹細胞を培養することができる。例えば、活性化／発達系で使用される細胞培養培地および／または細胞培養条件を使用して、胚性幹（ＥＳ）細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、内皮幹細胞（ＥＳＣ）、乳腺幹細胞（ＭａＳＣ）、腸幹細胞（ＩＳＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、成体嗅覚幹細胞（ＯＳＣ）、神経堤幹細胞（ＮＣＳＣ）、および精巣幹細胞（ＴＳＣ）、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からなる群から選択される細胞のうち１つまたは複数を培養することができる。
【0101】
いくつかの実施形態では、活性化幹細胞が、休眠小細胞では発現されないＡＢＣＧ２を発現する。いくつかの態様では、核酸染色（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２）が、活性化／発達系で培養された活性化幹細胞の外側に徐々に拡散するが、休眠小細胞の核酸染色は本明細書に開示される通常の培養培地では拡散しない。いくつかの実施形態では、休眠小細胞で高い、リボソームＲＮＡに対する低分子ＲＮＡの比が、幹細胞の活性化後に有意に減少する。いくつかの実施形態では、活性化幹細胞が、１：４未満、あるいは１：５未満、あるいは１：６未満、あるいは１：７未満、あるいは１：８、あるいは１：９未満、あるいは１：１０未満の小ＲＮＡとリボソームＲＮＡの比を有し得る。いくつかの実施形態では、活性化幹細胞が、休眠小細胞と比較して、ＣＯＸ ＩＶ、ＲＰＳ３およびカルネキシンのレベルが実質的に増加し得る。
【0102】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－、ＣＤ３４－／ＣＤ４５＋および／またはＣＤ３４－／ＣＤ４５－であるいくつかの亜集団にさらに特徴付けることができる、ＡＢＣＧ２＋である活性化幹細胞の集団も本明細書で提供される。一実施形態では、活性化幹細胞の集団の少なくとも約５０％、あるいは少なくとも約５５％、あるいは少なくとも約６０％、あるいは少なくとも約６６％、あるいは少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約７５％、あるいは少なくとも約８０％、あるいは少なくとも約８５％、あるいは少なくとも約９０％、あるいは少なくとも約９５％、あるいは少なくとも約９９％がＣＤ３４＋／ＣＤ４５－である。一態様では、活性化幹細胞の５０％未満、あるいは４５％未満、あるいは４０％未満、あるいは３５％未満、あるいは３０％未満、あるいは２５％未満、あるいは２０％未満、あるいは１５％未満、あるいは１０％未満、あるいは５％未満、あるいは２％未満、あるいは１％未満、あるいは０．５％未満がＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋、ＣＤ３４－／ＣＤ４５＋、ＣＤ３４－／ＣＤ４５－またはこれらの任意の組み合わせである。
【0103】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される活性化幹細胞の亜集団のうち１つまたは複数が、インビトロで活性化／発達系で迅速に拡大することができる。いくつかの実施形態では、活性化幹細胞の亜集団の倍加時間が変化し得る。いくつかの実施形態では、活性化／発達系における活性化幹細胞の亜集団のうち１つまたは複数の倍加時間が、５０時間超、あるいは５０時間未満、あるいは４５時間未満、あるいは４０時間未満、あるいは３５時間未満、あるいは３０時間未満、あるいは２５時間未満、あるいは約２０～約５０時間の間、あるいは約２０～約４０時間の間、あるいは約２０～約３０時間の間であり得る。いくつかの実施形態では、活性化幹細胞の亜集団のうち１つまたは複数が、インビトロで他の細胞培養系および／または他の培養条件下で拡大することができる。
【0104】
本明細書に開示される休眠小細胞から誘導される活性化幹細胞の亜集団を精製する方法も本明細書で提供される。一態様では、本明細書に開示される休眠小細胞から誘導されるＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋活性化幹細胞の亜集団を精製する方法が提供される。一態様では、本明細書に開示される休眠小細胞から誘導されるＣＤ３４＋／ＣＤ４５－活性化幹細胞の亜集団を精製する方法が提供される。一態様では、本明細書に開示される休眠小細胞から誘導されるＣＤ３４－／ＣＤ４５＋活性化幹細胞の亜集団を精製する方法が提供される。一態様では、本明細書に開示される休眠小細胞から誘導されるＣＤ３４－／ＣＤ４５－活性化幹細胞の亜集団を精製する方法が提供される。一態様では、本明細書に開示される休眠小細胞から誘導されるＣＤ３４＋活性化幹細胞の亜集団を精製する方法が提供される。一態様では、本明細書に開示される休眠小細胞から誘導されるＣＤ３４－活性化幹細胞の亜集団を精製する方法が提供される。一態様では、本明細書に開示される休眠小細胞から誘導されるＣＤ４５＋活性化幹細胞の亜集団を精製する方法が提供される。一態様では、本明細書に開示される休眠小細胞から誘導されるＣＤ４５－活性化幹細胞の亜集団を精製する方法が提供される。一態様では、本明細書に開示される休眠小細胞から誘導される一定のマーカーセットを有する活性化幹細胞の亜集団を精製する方法が提供される。
【0105】
一実施形態では、活性化／発達系で一定期間（例えば、１０～２０日間）培養した後、１つまたは複数の細胞コロニーが発達する。通常の培地（例えば、２０％ＦＢＳを含むα－ＭＥＭ培地）で培養された休眠小細胞は、いくつかの態様では成長も拡大もせず、細胞コロニーに発達しない。
【0106】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される休眠小細胞から誘導される細胞コロニーを単離する方法が本明細書で提供される。例えば、クローニングシリンダーを使用して細胞コロニーを拾い上げることができる。あるいは、細胞コロニーを、トリプシン処理し、細胞培養プレート／皿からコロニーを剥離することによって、単離することができる。他の方法を使用して細胞コロニーを単離することもできることを理解すべきである。単離幹細胞コロニー中の幹細胞の少なくとも６０％、あるいは少なくとも７０％、あるいは少なくとも８０％、あるいは少なくとも９５％、あるいは少なくとも９９％がＣＤ３４＋／ＣＤ４５－であることが（例えば、ＦＡＣＳによって）同定されている。一態様では、単離幹細胞コロニー中の幹細胞の少なくとも９０％がＣＤ３４＋／ＣＤ４５－である。
【0107】
本明細書に開示される単離コロニーから活性化幹細胞の集団を精製する方法も提供される。一態様では、単離幹細胞コロニー中の細胞の少なくとも約６０％、あるいは少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８０％、あるいは少なくとも約９０％、あるいは少なくとも約９５％、あるいは少なくとも約９９％、あるいは少なくとも約９９．９％がＣＤ３４＋／ＣＤ４５－である。いくつかの実施形態では、コロニー中の細胞が、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞に加えて、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋、ＣＤ３４－／ＣＤ４５＋および／またはＣＤ３４－／ＣＤ４５－であり得る細胞の亜集団を含み得る。一態様では、単離幹細胞コロニー中の細胞の約４０％未満、あるいは約３０％未満、あるいは約２０％未満、あるいは約１０％未満、あるいは約５％未満、あるいは約２％未満、あるいは約１％未満がＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋、ＣＤ３４－／ＣＤ４５＋、ＣＤ３４－／ＣＤ４５－またはこれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、細胞の総数に基づいて、精製細胞集団の約４０％未満、あるいは約３０％未満、あるいは約２０％未満、あるいは約１０％未満、あるいは約５％未満、あるいは約２％未満、あるいは約１％未満、あるいは約０．１％未満がＣＤ３４＋／ＣＤ４５－ではない。いくつかの実施形態では、ＭＡＣＳまたはＦＡＣＳなどの方法を使用して、活性化幹細胞から特定の集団または濃縮細胞集団を精製することができる。いくつかの実施形態では、他の方法を使用して、活性化幹細胞から特定の集団または濃縮細胞集団を精製することができる。
【0108】
いくつかの実施形態では、活性化幹細胞の単一細胞希釈を行い、次いで、本明細書に開示される活性化／発達系で培養することができる。一定期間（例えば、約１０～２０日間）後に、単一細胞から誘導された１つまたは複数のコロニーを発達させることができる。単一細胞から誘導される細胞コロニーは、胚様体様（ＥＢ様）構造を有する（図６、Ｄ）。一態様では、単一細胞コロニー中の細胞の実質的に１００％がＣＤ３４＋／ＣＤ４５－である。一態様では、単一細胞コロニー中の細胞の少なくとも約９０％、あるいは少なくとも約９５％、あるいは少なくとも約９９％、あるいは少なくとも約９９．９％がＣＤ３４＋／ＣＤ４５－である。
【0109】
本明細書に開示される単離細胞コロニーまたは単一細胞コロニーからＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞集団を精製する方法も本明細書で提供される。一実施形態では、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞集団を、例えばＭＡＣＳまたはＦＡＣＳを使用して精製することができる。精製方法は、以下の実施例２で提供される。他の方法を使用して細胞コロニーからＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞集団を精製することもできることを理解すべきである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法または他の方法を使用して、コロニーから他の細胞集団を精製することができる。
【0110】
精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞は、直径が約２０～３０μｍで、休眠小細胞よりも大きい。例えば、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞は、直径が２０μｍ未満、あるいは約２０μｍ、あるいは約２２μｍ、あるいは約２４μｍ、あるいは約２６μｍ、あるいは約２８μｍ、あるいは約３０μｍ、あるいは３０μｍ超であり得る。精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞は、約５：１、あるいは約６：１、あるいは約７：１、あるいは約８：１、あるいは約９：１の比較的高い核－細胞質比でさらに特徴付けられる。一態様では、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞の核が、総細胞容積の少なくとも約５０％、あるいは少なくとも約６０％、あるいは少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８０％、あるいは少なくとも約９０％である。精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞は、通常の細胞培養培地（例えば、２０％ＦＢＳを含むα－ＭＥＭ）中、インビトロで迅速に（例えば、約２６時間の倍加時間で）拡大することができる。他の態様では、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞の倍加時間が他の培養条件で変化し得る。いくつかの態様では、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞が、接着細胞培養物および／または懸濁細胞培養物としてインビトロで培養され得る。精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞が細胞培養皿／プレートに接着し、コンフルエントに達すると、細胞配置は上皮細胞培養物に似ている（図６、ＡおよびＢ）。
【0111】
一態様では、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞を、以下の表２に列挙されるマーカーによってさらに分析する。いくつかの実施形態では、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞が、表２で同定されるマーカーのうち１つまたは複数を発現する。一態様では、表２で同定されるマーカーのうち２つ、あるいは３つ、あるいは４つ、あるいは５つが存在し、全てのマーカーが存在するまで増加する。他の確認抗原を表２に例示し、以下に記載する。
【表2】
【0112】
いくつかの態様では、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞が、初期マーカー（例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｖａｓａ、ＳＳＥＡ１）、造血マーカー（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ１１７）、ＭＳＣマーカー（例えば、ＣＤ４４、ＣＤ７３、Ｔｈｙ１．１（ＣＤ９０．１）、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、Ｓｃａ１）、上皮マーカー（例えば、ケラチン上皮、ＣＫ１８、ＣＫ１９）、神経幹細胞マーカー（例えば、ネスチン）、骨芽細胞マーカー（例、オステオカルシン）、内皮マーカー（例えば、ＣＤ３１）、細胞遊走マーカー（例えば、ＣＤ１８４）、細胞インテグリンマーカー（例えば、ＣＤ２９）、多型幹細胞（例えば、ニューロン、ＨＳＣ、内皮）マーカー（例えば、ＣＤ１３３）の群の１つまたは複数のマーカーを発現し得る。
【0113】
いくつかの実施形態では、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞集団が、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＡＢＣＧ２、ＣＤ１１７、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０．１、ＣＤ１０５、Ｓｃａ１、ＣＤ３１、ＣＤ１８４、ケラチン上皮、ネスチンおよびオステオカルシンの１つまたは複数のマーカーを発現する。一態様では、マーカーの２つ、あるいは３つ、あるいは４つ、あるいは５つ、ならびに全てのマーカーＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＡＢＣＧ２、ＣＤ１１７、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０．１、ＣＤ１０５、Ｓｃａ１、ＣＤ３１、ＣＤ１８４、ケラチン上皮、ネスチンおよびオステオカルシンまで存在する。一態様では、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞が、少なくともＡＢＣＧ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＣＤ１１７、ＣＤ２９、ＣＤ４４、Ｓｃａ１、ＣＤ３１、ＣＤ１８４、ＣＤ１３３、ケラチン上皮、ネスチンおよびオステオカルシンを発現する。一態様では、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞が、少なくともＡＢＣＧ２、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＣＤ１９、ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ３１、ＣＤ１８４、ＣＫ１８、ネスチンおよびオステオカルシンを発現する。一態様では、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞が、少なくともＡＢＣＧ２、ＳＳＥＡ１、ＣＤ１４、ＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ３１、ＣＤ１８４、ＣＫ１９、ネスチンおよびオステオカルシンを発現する。一態様では、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞が、少なくともＡＢＣＧ２、Ｎａｎｏｇ、ＣＤ１１７、ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ３１、ＣＤ１８４、ケラチン上皮、ネスチンおよびオステオカルシンを発現する。一態様では、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞が、少なくともＡＢＣＧ２、Ｎａｎｏｇ、ＣＤ１１７、ＣＤ９０、ＣＤ３１、ＣＤ１３３、ネスチンおよびオステオカルシンを発現する。
【0114】
いくつかの実施形態では、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞が、Ｌｉｎ－であるとさらに特徴付けられる。いくつかの実施形態では、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ４５、ＬｉｎおよびＣＤ１４０ａのうち１つまたは複数が陰性であると同定される。いくつかの実施形態では、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ４５、ＬｉｎおよびＣＤ１４０ａの少なくとも１つ、あるいは少なくとも２つ、あるいは少なくとも３つ、あるいは少なくとも４つ、あるいは少なくとも５つ、または全部までを発現しない。
【0115】
初期胚段階マーカー（例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｖａｓａ、ＳＳＥＡ１）の発現は、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞が初期段階にあることを示す。ケラチン上皮マーカーの発現も、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞で観察される。ケラチン上皮マーカーは、初期胚段階のエピブラスト細胞で発現されるが、成体血液細胞では発現されないことが知られている。
【0116】
４．活性化幹細胞の分化
精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞集団を、その多能性、例えば適切な培養条件および培地を使用して３つ全ての胚葉（外胚葉、中胚葉および内胚葉）の細胞型に分化する能力によって同定することもできる。細胞の分化状態の確認は、当業者に知られている細胞型特異的マーカーの同定によって行うことができる。
精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞集団を、その多能性、例えば適切な培養条件および培地を使用して３つ全ての胚葉（外胚葉、中胚葉および内胚葉）の細胞型に分化する能力によって同定することもできる。細胞の分化状態の確認は、当業者に知られている細胞型特異的マーカーの同定によって行うことができる。
【0117】
本開示は、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞集団の外胚葉系統への分化を誘導する方法を提供する。精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞集団から誘導される外胚葉系統の分化細胞の組成物または集団も提供される。一態様では、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞が、外胚葉系統の細胞型の少なくとも１つに分化することができる。例えば、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞は、神経細胞および上皮細胞に分化することができる。別の態様では、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞が、外胚葉系統の細胞型の少なくとも２つ、少なくとも３つおよび全部までに分化することができる。外胚葉系統に分化する細胞の非限定的な例としては、それだけに限らないが、上皮細胞、神経原性細胞、および神経膠原性細胞が挙げられる。
【0118】
他の態様では、本明細書に開示される休眠小細胞から誘導される活性化幹細胞集団の外胚葉系統への分化を誘導する方法も提供される。本明細書に開示される休眠小細胞から誘導される活性化幹細胞集団から誘導される外胚葉系統の分化細胞の組成物または集団も提供される。他の態様では、本明細書に開示される休眠小細胞から誘導される活性化幹細胞集団の種々の亜集団の外胚葉系統への分化を誘導する方法も提供される。本明細書に開示される休眠小細胞から誘導される活性化幹細胞集団の種々の亜集団から誘導される外胚葉系統の分化細胞の組成物または集団も提供される。他の態様では、本明細書に開示される活性化幹細胞の亜集団の外胚葉系統への分化を誘導する方法も提供される。本明細書に開示される活性化幹細胞の亜集団から誘導される外胚葉系統の分化細胞の組成物または集団も提供される。
【0119】
本開示は、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞集団の中胚葉系統への分化を誘導する方法を提供する。精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞集団から誘導される中胚葉系統の分化細胞の組成物または集団も提供される。別の態様では、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞が、中胚葉系統の細胞型の少なくとも１つに分化することができる。例えば、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞は、心筋細胞および骨芽細胞に分化することができる。別の態様では、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞が、中胚葉系統の細胞型の少なくとも２つ、あるいは少なくとも３つ、あるいは少なくとも４つおよび全部までに分化することができる。中胚葉系統に分化する細胞の非限定的な例としては、それだけに限らないが、脂肪生成細胞、平滑筋原性細胞、軟骨形成細胞、心原性細胞、皮膚原性細胞、造血細胞、血液新生細胞、筋原性細胞、腎原性細胞、尿生殖原性細胞、骨原性細胞、心膜原性細胞または間質細胞が挙げられる。
【0120】
他の態様では、本明細書に開示される休眠小細胞から誘導される活性化幹細胞集団の中胚葉系統への分化を誘導する方法も提供される。本明細書に開示される休眠小細胞から誘導される活性化幹細胞集団から誘導される中胚葉系統の分化細胞の組成物または集団も提供される。他の態様では、本明細書に開示される休眠小細胞から誘導される活性化幹細胞集団の種々の亜集団の中胚葉系統への分化を誘導する方法も提供される。本明細書に開示される休眠小細胞から誘導される活性化幹細胞集団の種々の亜集団から誘導される中胚葉系統の分化細胞の組成物または集団も提供される。他の態様では、本明細書に開示される活性化幹細胞の亜集団の中胚葉系統への分化を誘導する方法も提供される。本明細書に開示される活性化幹細胞の亜集団から誘導される中胚葉系統の分化細胞の組成物または集団も提供される。
【0121】
本開示は、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞集団の内胚葉系統への分化を誘導する方法を提供する。精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞集団から誘導される内胚葉系統の分化細胞の組成物または集団も提供される。一態様では、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞が、内胚葉系統の細胞型の少なくとも１つに分化することができる。例えば、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞は、肝細胞に分化することができる。別の態様では、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞が、内胚葉系統の細胞型の少なくとも２つ、あるいは少なくとも３つ、あるいは少なくとも４つ、あるいは少なくとも５つおよび全部までに分化することができる。内胚葉系統に分化する細胞の非限定的な例としては、それだけに限らないが、膵臓、肝臓、肺、胃、腸および甲状腺の細胞が挙げられる。
【0122】
他の態様では、本明細書に開示される休眠小細胞から誘導される活性化幹細胞集団の内胚葉系統への分化を誘導する方法も提供される。本明細書に開示される休眠小細胞から誘導される活性化幹細胞集団から誘導される内胚葉系統の分化細胞の組成物または集団も提供される。他の態様では、本明細書に開示される休眠小細胞から誘導される活性化幹細胞集団の種々の亜集団の内胚葉系統への分化を誘導する方法も提供される。本明細書に開示される休眠小細胞から誘導される活性化幹細胞集団の種々の亜集団から誘導される内胚葉系統の分化細胞の組成物または集団も提供される。他の態様では、本明細書に開示される活性化幹細胞の亜集団の内胚葉系統への分化を誘導する方法も提供される。本明細書に開示される活性化幹細胞の亜集団から誘導される内胚葉系統の分化細胞の組成物または集団も提供される。
【0123】
５．使用方法
本開示は、本明細書に開示される活性化幹細胞を使用して、それを必要とする対象の疾患を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される活性化幹細胞から誘導される分化細胞を使用して、それを必要とする対象の疾患を処置する方法が提供される。再生医療には、損傷した細胞、組織または器官の修復、交換または再生を助けるよう設計された治療法が含まれる。本明細書に開示される方法は、生成医療における細胞療法に使用され得る。
本開示は、本明細書に開示される活性化幹細胞を使用して、それを必要とする対象の疾患を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される活性化幹細胞から誘導される分化細胞を使用して、それを必要とする対象の疾患を処置する方法が提供される。再生医療には、損傷した細胞、組織または器官の修復、交換または再生を助けるよう設計された治療法が含まれる。本明細書に開示される方法は、生成医療における細胞療法に使用され得る。
【0124】
いくつかの態様では、本明細書に開示される方法および組成物を使用して、変性疾患、増殖性障害、遺伝性疾患、損傷および／または臓器不全などの疾患または状態を処置することができる。疾患または状態の非限定的な例としては、神経変性障害、神経障害、例えば認知障害および気分障害、聴覚疾患、例えば難聴、骨粗鬆症、心血管疾患、糖尿病、代謝障害、呼吸器疾患、薬物感受性状態、眼疾患、例えば黄斑変性、免疫学的障害、血液疾患、腎臓病、増殖性障害、遺伝性障害、外傷、脳卒中、臓器不全または四肢の喪失が挙げられる。疾患の他の例としては、神経変性障害、神経障害、眼疾患、気分障害、呼吸器疾患、聴覚疾患、心血管疾患、免疫障害、血液疾患、代謝障害、腎臓病、増殖性障害、遺伝性障害、自己免疫疾患、薬物感受性状態、認知障害、うつ病、難聴、骨粗鬆症、糖尿病、黄斑変性、肥満、アレキサンダー病、アルパース病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病、カナバン病、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、ＨＩＶ関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、レビー小体型認知症、マシャド・ジョセフ病、多発性硬化症、多系統萎縮症、ナルコレプシー、神経ボレリア症、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッヘル病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、悪性貧血に続発する脊髄の亜急性連合変性症、統合失調症、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、脊髄癆、後天性免疫不全、白血病、リンパ腫、過敏症（アレルギー）、重度の複合免疫不全、急性播種性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、セリアック病、真皮筋炎、１型糖尿病、２型糖尿病、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病、紅斑性狼瘡、重症筋無力症、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、関節リウマチ、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（ｔｅｍｐｏｒａｌ ａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、動脈瘤、狭心症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、心筋症、石灰大動脈弁疾患（ＣＡＶＤ）、脳血管障害（脳卒中）、脳血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心不全、心筋炎、弁疾患冠動脈、心筋症、拡張機能障害、心内膜炎、高血圧、肥大型心筋症、僧帽弁逸脱、心筋梗塞、静脈血栓塞栓症、酸性リパーゼ病、アミロイドーシス、バース症候群、ビオチニダーゼ欠損症、カミチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠損症ＩＩ型、橋中心髄鞘崩壊症、筋ジストロフィー、ファーバー病、グルコース－６－リン酸脱水素酵素欠損症、ガングリオシドーシス、トリメチルアミン尿症、レッシュ・ナイハン症候群、脂質蓄積症、代謝性ミオパチー、メチルマロン酸尿症、ミトコンドリア筋症、ムコ多糖症、ムコリピドーシス、ムコリピドーシス、ムコ多糖症、多発性ＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症、非ケトーシス型高グリシン血症、ポンペ病、プロピオン酸血症、糖原病Ｉ型、尿素サイクル異常症、高シュウ酸尿症、シュウ酸症、癌腫、肉腫、胚細胞腫瘍、芽球性腫瘍、前立腺がん、肺がん、結腸直腸がん、膀胱がん、皮膚黒色腫、乳がん、子宮内膜がんおよび卵巣がんが挙げられる。
【0125】
一態様では、本明細書に開示される活性化幹細胞またはそれから誘導される分化細胞を使用して、それを必要とする対象の皮膚創傷を処置する方法が提供される。一態様では、本明細書に開示される活性化幹細胞またはそれから誘導される分化細胞を使用して、それを必要とする対象の肝損傷を処置する方法が提供される。一態様では、本明細書に開示される活性化幹細胞またはそれから誘導される分化細胞を使用して、それを必要とする対象の骨損傷または状態（例えば、関節炎、骨粗鬆症等）を処置する方法が提供される。一態様では、本明細書に開示される活性化幹細胞またはそれから誘導される分化細胞を使用して、それを必要とする対象の神経損傷またはニューロン変性疾患を処置する方法が提供される。一態様では、本明細書に開示される活性化幹細胞またはそれから誘導される分化細胞を使用して、それを必要とする対象の心組織損傷または心不全を処置する方法が提供される。一態様では、本明細書に開示される活性化幹細胞またはそれから誘導される分化細胞を使用して、それを必要とする対象の慢性疾患、例えば糖尿病を処置する方法が提供される。
【0126】
一態様では、本明細書に開示される活性化または分化細胞の自家移植の方法が提供される。一態様では、本明細書に開示される活性化または分化細胞の同種移植の方法が提供される。一態様では、本明細書に開示される活性化または分化細胞の同系移植の方法が提供される。
【0127】
実施例
実施例１
血液からの休眠小細胞の単離
以下の方法を使用して、マウスの末梢血から本明細書に開示される休眠小細胞を単離した。末梢血を、４～１０週齢で収集されたＦＶＢ－Ｔｇ（ＣＡＧ－ｌｕｃ－ｅＧＦＰ）Ｌ２Ｇ８５Ｃｈｃｏ／Ｊ（Ｌ２Ｇ）雄または雌マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊａｘ．ｏｒｇ）から回収した。ｌｕｃ－ｅＧＦＰ導入遺伝子を、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を発現するＣＡＧプロモーター（ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンハイブリッドプロモーターを備えたヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターエンハンサー）によって指示する。末梢血を回収するため、３％イソフルラン（Ｂｕｔｌｅｒ Ｓｃｈｅｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ、ＣＡ）が供給されたチャンバーでマウスを麻酔し、次いで、眼窩後静脈を通して１００μｌの生理食塩水に希釈した４Ｕのヘパリンを注射した。５分後、血液を各マウスの眼窩後洞を通して回収し、１００μｌの生理食塩水中１Ｕのヘパリンを含有する１．５ｍｌのマイクロ遠心管に入れた。各マウスから回収した血液は、常に約１ｍｌ～１．５ｍｌであった。
実施例１
血液からの休眠小細胞の単離
以下の方法を使用して、マウスの末梢血から本明細書に開示される休眠小細胞を単離した。末梢血を、４～１０週齢で収集されたＦＶＢ－Ｔｇ（ＣＡＧ－ｌｕｃ－ｅＧＦＰ）Ｌ２Ｇ８５Ｃｈｃｏ／Ｊ（Ｌ２Ｇ）雄または雌マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊａｘ．ｏｒｇ）から回収した。ｌｕｃ－ｅＧＦＰ導入遺伝子を、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を発現するＣＡＧプロモーター（ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンハイブリッドプロモーターを備えたヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターエンハンサー）によって指示する。末梢血を回収するため、３％イソフルラン（Ｂｕｔｌｅｒ Ｓｃｈｅｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ、ＣＡ）が供給されたチャンバーでマウスを麻酔し、次いで、眼窩後静脈を通して１００μｌの生理食塩水に希釈した４Ｕのヘパリンを注射した。５分後、血液を各マウスの眼窩後洞を通して回収し、１００μｌの生理食塩水中１Ｕのヘパリンを含有する１．５ｍｌのマイクロ遠心管に入れた。各マウスから回収した血液は、常に約１ｍｌ～１．５ｍｌであった。
【0128】
赤血球を溶解するために、１ｍｌの回収血液を９ｍｌの溶解バッファー（例えば、８．３ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、１ｇ／ＬのＫＨＣＯ３および３．７ｇ／ＬのＥＤＴＡ）と混合した。次いで、懸濁液を３０００ｘｇで４℃で１０分間遠心分離した。ペレットを洗浄し、３ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。血小板を枯渇させるために、細胞懸濁液を、１：４．４希釈のＰＢＳを含むＯｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を含有するチューブに移して密度１．０６３にした。有核細胞懸濁液を回収し、３５０ｇで４℃で１５分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットをさらに分析するために１０ｍｌのＰＢＳまたは培養培地（例えば、２０％ＦＢＳを含むα－ＭＥＭ）に再懸濁した。
【0129】
細胞計数を行うと、再懸濁ペレット中の細胞数は８０００００～１００００００個／ｍｌの間であった。壊れた幹細胞の割合は２５％未満であった。単離幹細胞を電子顕微鏡（ＥＭ）で観察した。単離休眠小細胞の直径は５μｍ未満であった。例えば、単離休眠小細胞の直径は約２．５μｍと測定された（図１）。単離幹細胞の核酸を、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を使用して染色した。結果は、単離幹細胞が非常に高い核－細胞質比、例えば約９：１を有することを示した（図２）。通常の培地（例えば、２０％ＦＢＳを含むα－ＭＥＭ）で５～１０日間培養した場合、単離休眠小細胞は成長せず、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２核酸染色は細胞膜の外側に拡散しなかった（図２）。免疫蛍光（ＩＦ）および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析を使用して、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋およびＡＢＣＧ２－（図３Ａおよび図３Ｂ）として特徴付けられた、単離休眠小細胞によって発現される細胞マーカーを試験した。
【0130】
Ｔｒｉｚｏｌ試薬法を使用して、単離休眠小細胞と対照細胞（野生型肝細胞）から全ＲＮＡを抽出し、次いで、ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅで処置して汚染されたＤＮＡを除去した。Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）のマイクロフルイディクスベースのプラットフォームを使用して全ＲＮＡを分析して、ｓＲＮＡおよびｒＲＮＡのレベルを検出および分析した。結果は、休眠小細胞の単離集団では、肝細胞細胞株（例えば、ＡＭＬ１２）の約１：１０の比と比較して、ｓＲＮＡとｒＲＮＡの比が約２２：１であることを示した（図４）。ＣＯＸ ＩＶ（ミトコンドリア内膜タンパク質）、カルネキシン（ＥＲ内在分子シャペロン）およびＲＰＳ３（リボソームマーカー）のレベルも試験した。結果は、単離休眠小細胞が非常に低レベルのＣＯＸ ＩＶおよびカルネキシンを発現し、ＲＰＳ３のレベルが最小であることを示した。結果は、単離幹細胞が休眠状態にあることを示した。
【0131】
休眠小細胞を、ＦＡＣＳを介して種々の幹細胞マーカーの発現についても試験した。結果は、休眠小細胞が、ＣＤ３４およびＣＤ４５以外に、マーカーＣＤ４４、ＣＤ１５０、Ｓｃａ１、ｃ－ｋｉｔ、Ｔｈｙ１．１（ＣＤ９０．１）、Ｏｃｔ ４、ＳＳＥＡ１、Ｎａｎｏｇ、Ｖａｓａ、ＣＤ１３３およびＣＤ１０５のいくつかまたは全てを発現していることを示した。休眠小細胞は、Ｌｉｎが陰性であるとさらに特徴付けられた。さらに、休眠小細胞は、ＣＤ４１、ＣＤ１８４およびＥ－カドヘリンのいくつかまたは全部を発現しなかった。
【0132】
実施例２
休眠小細胞の活性化およびインビトロでの発達
以下の方法を使用して、上記の実施例１に記載される血液から得られた休眠小細胞を活性化および培養した。
休眠小細胞の活性化およびインビトロでの発達
以下の方法を使用して、上記の実施例１に記載される血液から得られた休眠小細胞を活性化および培養した。
【0133】
インビトロで休眠小細胞を活性化および培養するために、初代肝細胞、ヒト肝芽腫（ＨｅｐＧ２）細胞、肝細胞細胞株（例えば、ＡＭＬ１２、ＨｅｐａＲＧ等）およびマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）細胞株のうち１つまたは複数を含む材料を使用して、活性化／発達系を調製した。他の試薬および因子を活性化／発達系に添加してもよい。活性化／発達系は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌｓを使用した共培養系であってもよいし、以下に記載される馴化培地を使用してもよい。
【0134】
インビトロでの活性化
共培養系については、上記の細胞／細胞株のうち１つまたは複数を含む細胞または細胞混合物を調製した。例えば、細胞混合物は、細胞の総数に基づいて、約６５～９０％の上記の肝細胞細胞株および約３５～１０％の初代肝細胞を含んでいた。細胞混合物をマイトマイシンＣで２時間処置して、細胞を有糸分裂的に不活性化した。次いで、細胞混合物を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２の６ウェルプレートに接種した。接種約１６時間後に、細胞がウェルに接着し、約８０％コンフルエントになった。次いで、単離休眠小細胞をＴｒａｎｓｗｅｌｌ（２４ｍｍインサート、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク）の上部チャンバーに入れ、２０％ＦＢＳを含むα－ＭＥＭの共培養培地中で上記の細胞混合物と共培養した。単離休眠小細胞を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜（０．４μｍ孔径）によって不活性化細胞混合物から分離した。約１０～２０日間、上下両方のチャンバーで同じ培養培地を使用し、１日おきに交換した。
共培養系については、上記の細胞／細胞株のうち１つまたは複数を含む細胞または細胞混合物を調製した。例えば、細胞混合物は、細胞の総数に基づいて、約６５～９０％の上記の肝細胞細胞株および約３５～１０％の初代肝細胞を含んでいた。細胞混合物をマイトマイシンＣで２時間処置して、細胞を有糸分裂的に不活性化した。次いで、細胞混合物を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２の６ウェルプレートに接種した。接種約１６時間後に、細胞がウェルに接着し、約８０％コンフルエントになった。次いで、単離休眠小細胞をＴｒａｎｓｗｅｌｌ（２４ｍｍインサート、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク）の上部チャンバーに入れ、２０％ＦＢＳを含むα－ＭＥＭの共培養培地中で上記の細胞混合物と共培養した。単離休眠小細胞を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜（０．４μｍ孔径）によって不活性化細胞混合物から分離した。約１０～２０日間、上下両方のチャンバーで同じ培養培地を使用し、１日おきに交換した。
【0135】
あるいは、インビトロで単離休眠小細胞を培養するために使用することができる馴化培地を調製した。例えば、上記の細胞または細胞混合物を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に懸濁し、細胞培養皿に播種した。２日毎に培地を細胞培養皿から回収し、次いで、細胞が１００％コンフルエンスに達するまで新しい培地を細胞培養皿に添加した。異なる時間に回収した培地を混合することができ、短期貯蔵の場合は－２０°Ｃで、長期貯蔵の場合は－８０°Ｃで貯蔵することができる。使用前に、馴化培地を３０００ｘｇで遠心分離して、培地中の残りの細胞をペレット化した。馴化培地を０．２２μｍフィルターで濾過して、残りの細胞を除去することもできる。次いで、馴化培地を通常の培養培地（例えば、２０％ＦＢＳを含むα－ＭＥＭ）と約１：３～約３：１の比（ｖ／ｖ）で混合した。単離休眠小細胞を、上記の培地混合物に穏やかに再懸濁し、次いで、培養皿またはプレートに播種した。培地を１日おきに交換してもよい。細胞培養物を、細胞成長および細胞コロニーの形成について、顕微鏡下で毎日観察した。
【0136】
活性化幹細胞を、上記の活性化／発達系で４～１２時間培養した後、種々のマーカーの発現について試験した。未分化細胞のマーカーであり、休眠小細胞では発現されないＡＢＣＧ２が、活性化幹細胞で発現されることが観察された（図３Ａ）。ＲＮＡ分析により、活性化幹細胞における小ＲＮＡとリボソームＲＮＡの比が約１：６であり、休眠小細胞における比よりも有意に低いことが示された（図４）。活性化幹細胞を活性化／発達系で１５日間まで培養すると、活性化幹細胞のＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２核酸染色が細胞膜の外側に徐々に拡散することが観察された（図２）。活性化幹細胞のサイズも、休眠小細胞よりも大きくなった。活性化幹細胞が、以下の表３に示されるように、高レベルのＣＯＸ ＩＶ、ＲＰＳ３およびカルネキシンを発現することがさらに示された。ＡＢＣＧ２の発現は、活性化幹細胞が未分化幹細胞であることを示した。ミトコンドリアマーカーであるＣＯＸ ＩＶの発現上昇は、休眠小細胞が覚醒したことを示した。リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）マーカーであるＲＰＳ３の高発現は、細胞の代謝が活発であることを示した。ＥＲマーカーであるカルネキシンの発現は、活性化幹細胞の輸送系が忙しいことを示した。これらの結果は、以前は休眠状態であった幹細胞が活性化／発達系で活性化され、細胞機能および活動が再開したことを示した。
【表3】
【0137】
ＦＡＣＳを使用して上記の活性化幹細胞のマーカーを同定した。活性化／発達系の活性化幹細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－、ＣＤ３４－／ＣＤ４５＋および／またはＣＤ３４－／ＣＤ４５－である亜集団に特徴付けられた。
【0138】
活性化幹細胞の亜集団の濃縮および特徴付け
以下の方法を使用して、ＣＤ３４＋である活性化幹細胞が濃縮された亜集団を得た。上記の共培養系で単離休眠小細胞を共培養した２週間後、ＣＤ３４＋細胞画分を、製造業者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって推奨されるプロトコルに従ってＭＡＣＳによって濃縮した。手短に言えば、トリプシン処理細胞を抗ＣＤ３４（ラット）抗体と３０分間インキュベートし、引き続いて抗ラットマイクロビーズと４℃で１５分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を５００μｌの分離バッファーに再懸濁し、ＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）にアプライした。濃縮および拡大された細胞を、ＦＡＣＳによってＣＤ３４陽性ならびに他の表面マーカー（例えば、ＣＤ４５、ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＣＤ３８、ＣＤ３、Ｌｉｎ、Ｓｃａ－１、Ｔｈｙ１．１、ｃ－ｋｉｔ）について分析した。アイソタイプＩｇＧを陰性対照として使用した。ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、オレゴン）を使用してデータを分析した。あるいは、ＦＡＣＳを使用して、１つまたは複数の特定のマーカーを有する細胞の亜集団を選別および単離することもできた。同様の方法を使用して、１つまたは複数の他のマーカーで特徴付けられた細胞の濃縮亜集団、例えばＣＤ４５＋細胞の亜集団、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋細胞の亜集団、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞の亜集団、ＣＤ３４－／ＣＤ４５＋細胞の亜集団、またはＣＤ３４－／ＣＤ４５－細胞の亜集団を得ることができる。
以下の方法を使用して、ＣＤ３４＋である活性化幹細胞が濃縮された亜集団を得た。上記の共培養系で単離休眠小細胞を共培養した２週間後、ＣＤ３４＋細胞画分を、製造業者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって推奨されるプロトコルに従ってＭＡＣＳによって濃縮した。手短に言えば、トリプシン処理細胞を抗ＣＤ３４（ラット）抗体と３０分間インキュベートし、引き続いて抗ラットマイクロビーズと４℃で１５分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を５００μｌの分離バッファーに再懸濁し、ＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）にアプライした。濃縮および拡大された細胞を、ＦＡＣＳによってＣＤ３４陽性ならびに他の表面マーカー（例えば、ＣＤ４５、ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＣＤ３８、ＣＤ３、Ｌｉｎ、Ｓｃａ－１、Ｔｈｙ１．１、ｃ－ｋｉｔ）について分析した。アイソタイプＩｇＧを陰性対照として使用した。ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、オレゴン）を使用してデータを分析した。あるいは、ＦＡＣＳを使用して、１つまたは複数の特定のマーカーを有する細胞の亜集団を選別および単離することもできた。同様の方法を使用して、１つまたは複数の他のマーカーで特徴付けられた細胞の濃縮亜集団、例えばＣＤ４５＋細胞の亜集団、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋細胞の亜集団、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞の亜集団、ＣＤ３４－／ＣＤ４５＋細胞の亜集団、またはＣＤ３４－／ＣＤ４５－細胞の亜集団を得ることができる。
【0139】
免疫蛍光染色
標準的な手順を使用して間接免疫蛍光染色を行った。手短に言えば、厚さ５μｍの再水和パラフィンまたは固定凍結組織切片を１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングし（３０分）、ＰＢＳで３回洗浄した。切片を特定の一次抗体および蛍光コンジュゲート二次抗体で染色した。試料を、シーラントを含有するＤＡＰＩ（４，６－ジアミノ－２－フェニルインドール二塩酸塩、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でマウントした。マウスＩｇＧおよびウサギＩｇＧ抗体を陰性対照として使用した。染色した切片をＬｅｉｃａ ＤＭＲＡ顕微鏡で観察した。
標準的な手順を使用して間接免疫蛍光染色を行った。手短に言えば、厚さ５μｍの再水和パラフィンまたは固定凍結組織切片を１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングし（３０分）、ＰＢＳで３回洗浄した。切片を特定の一次抗体および蛍光コンジュゲート二次抗体で染色した。試料を、シーラントを含有するＤＡＰＩ（４，６－ジアミノ－２－フェニルインドール二塩酸塩、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でマウントした。マウスＩｇＧおよびウサギＩｇＧ抗体を陰性対照として使用した。染色した切片をＬｅｉｃａ ＤＭＲＡ顕微鏡で観察した。
【0140】
細胞コロニーの単離および精製
単離休眠小細胞を活性化／発達系で１０～２０日間培養し、顕微鏡下で１つまたは複数の細胞コロニーを観察した（図５）。次いで、クローニングシリンダーを使用して、またはコロニーをトリプシン処理および剥離することによって、細胞コロニーを単離した。ＦＡＣＳ分析により、単離コロニーの幹細胞の少なくとも９０％がＣＤ３４＋／ＣＤ４５－であることが示された（図７）。ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞が濃縮された亜集団を、製造業者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって推奨されるプロトコルに従って、ＭＡＣＳによって単離細胞コロニーから精製した。例えば、単離コロニーの細胞を抗ＣＤ４５抗体と３０分間インキュベートし、引き続いて抗ラットマイクロビーズと４℃で１５分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を５００μｌの分離バッファーに再懸濁し、ＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）にアプライした。ＣＤ４５枯渇細胞集団を回収し、抗ＣＤ３４抗体と３０分間さらにインキュベートし、引き続いて抗ラットマイクロビーズと４℃で１５分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を５００μｌの分離バッファーに再懸濁し、ＭＡＣＳカラムにアプライした。ＣＤ３４＋細胞集団を回収し、これはＣＤ３４＋／ＣＤ４５－として特徴付けられた。あるいは、単離コロニーの細胞を、抗ＣＤ３４および抗ＣＤ４５抗体で標識した。次いで、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を行って、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞集団を選別および回収した。
単離休眠小細胞を活性化／発達系で１０～２０日間培養し、顕微鏡下で１つまたは複数の細胞コロニーを観察した（図５）。次いで、クローニングシリンダーを使用して、またはコロニーをトリプシン処理および剥離することによって、細胞コロニーを単離した。ＦＡＣＳ分析により、単離コロニーの幹細胞の少なくとも９０％がＣＤ３４＋／ＣＤ４５－であることが示された（図７）。ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞が濃縮された亜集団を、製造業者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって推奨されるプロトコルに従って、ＭＡＣＳによって単離細胞コロニーから精製した。例えば、単離コロニーの細胞を抗ＣＤ４５抗体と３０分間インキュベートし、引き続いて抗ラットマイクロビーズと４℃で１５分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を５００μｌの分離バッファーに再懸濁し、ＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）にアプライした。ＣＤ４５枯渇細胞集団を回収し、抗ＣＤ３４抗体と３０分間さらにインキュベートし、引き続いて抗ラットマイクロビーズと４℃で１５分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を５００μｌの分離バッファーに再懸濁し、ＭＡＣＳカラムにアプライした。ＣＤ３４＋細胞集団を回収し、これはＣＤ３４＋／ＣＤ４５－として特徴付けられた。あるいは、単離コロニーの細胞を、抗ＣＤ３４および抗ＣＤ４５抗体で標識した。次いで、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を行って、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞集団を選別および回収した。
【0141】
精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞は、顕微鏡で観察すると、概ね紡錘形または卵形であり、核－細胞質比が高く（例えば、約５～８：１）（図６、ＡおよびＢ）、直径が約２０～３０μｍであった。精製幹細胞はＧＦＰを発現し（図６、Ａ）、２０％ＦＢＳを含むα－ＭＥＭ中で迅速に（例えば、約２６時間の倍加時間で）拡大することができた。精製幹細胞は、接着細胞培養物および／または懸濁細胞培養物でインビトロで培養され得る。細胞培養皿／プレートに接着した精製幹細胞がコンフルエントに達すると、細胞配置は上皮細胞培養物に似ていた（図６、Ｂ）。活性化幹細胞の単一細胞希釈を行った。上記の馴化培地で培養すると、単一細胞から生じたコロニーを得ることができ、これは胚様体様（ＥＢ様）構造を有していた（図６、ＣおよびＤ）。
【0142】
免疫蛍光（ＩＦ）染色を使用して、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞集団を幹細胞マーカーについてさらに試験した。結果は、精製細胞集団がまた、１つまたは複数の初期マーカー（例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｖａｓａ、ＳＳＥＡ１）、造血マーカー（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ１１７）、ＭＳＣマーカー（例えば、ＣＤ４４、ＣＤ７３、Ｔｈｙ１．１（ＣＤ９０．１）、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、Ｓｃａ１）、上皮マーカー（例えば、ケラチン上皮、ＣＫ１８、ＣＫ１９）、神経幹細胞マーカー（例えば、ネスチン）、骨芽細胞マーカー（例、オステオカルシン）、内皮マーカー（例えば、ＣＤ３１）、細胞遊走マーカー（例えば、ＣＤ１８４）、細胞インテグリンマーカー（例えば、ＣＤ２９）、多型幹細胞（例えば、ニューロン、ＨＳＣ、内皮）マーカー（例えば、ＣＤ１３３）を発現することも示した。精製細胞集団は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３およびＣＤ１４０ａのうち１つまたは複数が陰性であるとさらに特徴付けられた。
【0143】
実施例３
活性化幹細胞の分化の誘導
以下の方法を使用して、実施例２で論じられる活性化幹細胞の分化を誘導した。コロニーからの精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞集団の多能性分化能を試験した。
活性化幹細胞の分化の誘導
以下の方法を使用して、実施例２で論じられる活性化幹細胞の分化を誘導した。コロニーからの精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞集団の多能性分化能を試験した。
【0144】
外胚葉
ニューロン誘導体（例、ニューロン、オリゴデンドロサイト、グリア細胞）への分化の可能性を試験するために、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞（２４ウェルプレートで３０００個／ウェル）を細胞培養皿／プレートに播種し、１０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ－２および２０ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦ（全ての成長因子がＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、米国製）を補足したＮｅｕｒｏＣｕｌｔ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、カナダ）でインキュベートした。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を陰性対照群で使用した。培地を２日毎に交換した。ニューロン塊およびニューロスフェアが、約２週間後に形成された（図８、ＡおよびＥ～Ｇ）。神経細胞特異的マーカーネスチンおよびβ３－チューブリンの発現が分化細胞で観察された（図８、Ｂ～Ｄ）。ネスチンおよびβ３－チューブリンが陽性である神経細胞を含む神経細胞の束の形成も観察された（図８、Ｈ）。結果は、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞が外胚葉層由来の神経細胞に分化することができることを示した。
ニューロン誘導体（例、ニューロン、オリゴデンドロサイト、グリア細胞）への分化の可能性を試験するために、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞（２４ウェルプレートで３０００個／ウェル）を細胞培養皿／プレートに播種し、１０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ－２および２０ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦ（全ての成長因子がＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、米国製）を補足したＮｅｕｒｏＣｕｌｔ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、カナダ）でインキュベートした。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を陰性対照群で使用した。培地を２日毎に交換した。ニューロン塊およびニューロスフェアが、約２週間後に形成された（図８、ＡおよびＥ～Ｇ）。神経細胞特異的マーカーネスチンおよびβ３－チューブリンの発現が分化細胞で観察された（図８、Ｂ～Ｄ）。ネスチンおよびβ３－チューブリンが陽性である神経細胞を含む神経細胞の束の形成も観察された（図８、Ｈ）。結果は、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞が外胚葉層由来の神経細胞に分化することができることを示した。
【0145】
皮膚も外胚葉層に由来する。ＩＦ染色を使用して、活性化幹細胞の表皮マーカーを試験した。精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞は、ケラチン上皮マーカー、ＣＫ１８およびＣＫ１９を発現すると特徴付けられた（図９）。パンケラチン（ｐａｎ－ｋｅｒａｔｉｎ）の発現（抗パンサイトケラチン抗体、マウスモノクローナルＣ－１１を使用）も精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞で観察され、ＣＤ３４染色と重複していた（図９）。ＥｐＣａｍ、上皮細胞接着分子も、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞で発現しており、ＧＦＰシグナルと重複していた。よって、結果は、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞が上皮細胞マーカーを発現し、皮膚細胞に分化する可能性を有していることを示した。
【0146】
中胚葉
骨芽細胞（中胚葉）への分化の可能性を試験するために、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞（１皿当たり１０００個、３０００個および５０００個）を細胞培養皿に播種し、骨芽細胞分化培地（ＯＤＭ）で２週間インキュベートした。ＯＤＭは、１０％ＦＢＳ、１Ｘペニシリン－ストレプトマイシン、０．１μＭデキサメタゾン、１０ｍＭ β－グリセロールリン酸、５０μＭアスコルビン酸を含有するα－ＭＥＭを含み得る。５０００個の精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞を、陰性対照群の１０％ＦＢＳを含有するα－ＤＭＥＭに播種した。培地を２日毎に交換した。２週間後、皿を洗浄し、１０％ホルマリンで固定し、次いで、骨組織特異的染料であるアリザリンレッドで染色した。結果は、ＯＤＭで培養したＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞の皿に骨化中心様構造の形成およびアリザリンレッドの陽性染色を示した（図１０、ＡおよびＢ）。対照群ではこのような骨化構造は形成されず、アリザリンレッド染色は陰性であった（図１０、ＡおよびＢ）。よって、結果は、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞が中胚葉層からの細胞である骨芽細胞に分化することができることを示した。
骨芽細胞（中胚葉）への分化の可能性を試験するために、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞（１皿当たり１０００個、３０００個および５０００個）を細胞培養皿に播種し、骨芽細胞分化培地（ＯＤＭ）で２週間インキュベートした。ＯＤＭは、１０％ＦＢＳ、１Ｘペニシリン－ストレプトマイシン、０．１μＭデキサメタゾン、１０ｍＭ β－グリセロールリン酸、５０μＭアスコルビン酸を含有するα－ＭＥＭを含み得る。５０００個の精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞を、陰性対照群の１０％ＦＢＳを含有するα－ＤＭＥＭに播種した。培地を２日毎に交換した。２週間後、皿を洗浄し、１０％ホルマリンで固定し、次いで、骨組織特異的染料であるアリザリンレッドで染色した。結果は、ＯＤＭで培養したＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞の皿に骨化中心様構造の形成およびアリザリンレッドの陽性染色を示した（図１０、ＡおよびＢ）。対照群ではこのような骨化構造は形成されず、アリザリンレッド染色は陰性であった（図１０、ＡおよびＢ）。よって、結果は、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞が中胚葉層からの細胞である骨芽細胞に分化することができることを示した。
【0147】
中胚葉の別の細胞型である心筋細胞への分化の可能性をさらに試験するために、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞（約１００００個）を細胞培養皿に播種し、心筋細胞分化培地（ＣＤＭ）で２週間インキュベートした。２０％ＦＢＳを含有するα－ＤＭＥＭを陰性対照群で使用した。培地を２日毎に交換した。２週間後、細胞をＣＤ３４、デスミン（筋幹細胞マーカー）、コネキシン４３（心筋細胞特異的マーカー）、およびトロポニンＩ（心筋細胞特異的マーカー）で染色した。マーカーデスミン、コネキシン４３およびトロポニンＩの全てが陽性であり、ＣＤ３４と重複していた（図１１）。よって、結果は、精製幹細胞が、中胚葉層からの細胞である心筋細胞に分化することができることを示した。
【0148】
内胚葉
肝細胞（内胚葉）への分化の可能性を試験するために、精製幹細胞を細胞培養皿に播種し、肝細胞分化培地（ＨＤＭ）で２週間インキュベートした。２０％ＦＢＳを含有するα－ＤＭＥＭを陰性対照群で使用した。培地を２日毎に交換した。２週間後、細胞をアルブミンおよびＣＫ１８（特定の肝細胞マーカー）、およびＣＫ１９（胆管上皮マーカー）で染色した。マーカーアルブミン、ＣＫ１８およびＣＫ１９の全てが陽性であった（図１２）。さらなる試験により、アルブミン染色がＣＤ３４染色と重複することが示された。よって、結果は、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞が肝細胞様および胆道様上皮細胞に分化することができることを示した。
肝細胞（内胚葉）への分化の可能性を試験するために、精製幹細胞を細胞培養皿に播種し、肝細胞分化培地（ＨＤＭ）で２週間インキュベートした。２０％ＦＢＳを含有するα－ＤＭＥＭを陰性対照群で使用した。培地を２日毎に交換した。２週間後、細胞をアルブミンおよびＣＫ１８（特定の肝細胞マーカー）、およびＣＫ１９（胆管上皮マーカー）で染色した。マーカーアルブミン、ＣＫ１８およびＣＫ１９の全てが陽性であった（図１２）。さらなる試験により、アルブミン染色がＣＤ３４染色と重複することが示された。よって、結果は、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－幹細胞が肝細胞様および胆道様上皮細胞に分化することができることを示した。
【0149】
実施例４
皮膚創傷の処置
実施例２で論じられる活性化幹細胞の集団を使用して、以下の方法を使用して皮膚創傷を処置した。
皮膚創傷の処置
実施例２で論じられる活性化幹細胞の集団を使用して、以下の方法を使用して皮膚創傷を処置した。
【0150】
フィブリンゲル足場および３－Ｄ構築物の調製
フィブリノーゲンおよびトロンビンのストック溶液を解凍し、１．５ｍｌチューブ内で最終濃度１２．５ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンおよび２．５Ｕ／ｍｌのトロンビンとＣａＣｌ２（最終濃度、４５ｍＭ）を混合することによって、フィブリンゲルを製作した。２００μｌの混合物を２４ウェルプレートに穏やかに分注した。フィブリノーゲン内容物に、３７℃で２時間、フィブリンゲル足場を形成させた。活性化幹細胞（例えば、濃縮ＣＤ３４＋細胞集団、またはコロニーから精製されたＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞集団、または他の亜集団）を、２４ウェルプレート上のフィブリンゲル足場の上部に１ウェル当たり５×１０５個で播種し、次いで、１ウェルあたり２ｍｌの１％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ、ＢｉｏＷｅｓｔ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含有するα－ＭＥＭで一晩培養した。次いで、細胞／足場３－Ｄ構築物を移植に備えた。実験の前に、フローサイトメトリーも行って、細胞／足場３－Ｄ構築物の培養細胞を特徴付けた。
フィブリノーゲンおよびトロンビンのストック溶液を解凍し、１．５ｍｌチューブ内で最終濃度１２．５ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンおよび２．５Ｕ／ｍｌのトロンビンとＣａＣｌ２（最終濃度、４５ｍＭ）を混合することによって、フィブリンゲルを製作した。２００μｌの混合物を２４ウェルプレートに穏やかに分注した。フィブリノーゲン内容物に、３７℃で２時間、フィブリンゲル足場を形成させた。活性化幹細胞（例えば、濃縮ＣＤ３４＋細胞集団、またはコロニーから精製されたＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞集団、または他の亜集団）を、２４ウェルプレート上のフィブリンゲル足場の上部に１ウェル当たり５×１０５個で播種し、次いで、１ウェルあたり２ｍｌの１％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ、ＢｉｏＷｅｓｔ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含有するα－ＭＥＭで一晩培養した。次いで、細胞／足場３－Ｄ構築物を移植に備えた。実験の前に、フローサイトメトリーも行って、細胞／足場３－Ｄ構築物の培養細胞を特徴付けた。
【0151】
全層皮膚創傷の処置
皮膚調製後、２０匹の１０週齢野生型ＦＶＢ雄マウスに、イソフルラン麻酔下で６ｍｍの生検パンチ（Ａｃｕｅｒｍ Ｉｎｃ．、Ｆｏｒｔ Ｌａｕｄｅｒｄａｌｅ、ＦＬ）を使用して、中央背部皮膚に直径６ｍｍの全層切除創傷をつけた。
皮膚調製後、２０匹の１０週齢野生型ＦＶＢ雄マウスに、イソフルラン麻酔下で６ｍｍの生検パンチ（Ａｃｕｅｒｍ Ｉｎｃ．、Ｆｏｒｔ Ｌａｕｄｅｒｄａｌｅ、ＦＬ）を使用して、中央背部皮膚に直径６ｍｍの全層切除創傷をつけた。
【0152】
創傷収縮を阻害するために、厚さ１．６ｍｍのシリコンシート（Ｐｒｅｓｓ－ｔｏ－Ｓｅａｌ Ｓｉｌｉｃｏｎｅ Ｓｈｅｅｔ ＪＴＲ－Ｓ－２．０、Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏ－Ｌａｂｓ、Ｂｅｎｄ、ＯＲ）から作られたドーナツ型スプリント（内径１０ｍｍ、外径１４ｍｍ）を創傷領域の周囲に配置し、６－０ナイロン縫合糸（６－０Ｅｔｈｉｌｏｎ Ｎｙｌｏｎ Ｓｕｔｕｒｅ、Ｅｔｈｉｃｏｎ ＬＬＣ．、Ｃｏｒｎｅｌｉａ、ＧＡ）を使用して、８つの断続縫合で固定した。次いで、上記の細胞／足場３－Ｄ構築物（約５０００００個細胞／単位）を創傷床に移植した（ｎ＝５）。幹細胞を含まないフィブリンゲル（足場のみ）も対照として創傷床に移植した（ｎ＝５）。整形滅菌プラスチックカバースリップ（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）をスプリントの上に置き、半密封包帯（（Ｔｅｇａｄｅｒｍ Ｆｉｌｍ ９５０６Ｗ、３Ｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ）を動物の体幹周りに一周施用した。
【0153】
皮膚創傷治癒分析
創傷を生成した後、固定距離からデジタルカメラ（Ｓｏｎｙ ｃｙｂｅｒ－ｓｈｏｔ ＤＳＣ－ＴＸ７、ニューヨーク、ＮＹ、米国）を使用して創傷の写真画像を毎日撮影した。創傷面積の大まかな評価を得るために、元の創傷面積に対する現在の創傷の割合を計算することによって、創傷面積を分析した。創傷面積がゼロにほぼ等しくなったら、創傷を完全に閉じているとみなした。
創傷を生成した後、固定距離からデジタルカメラ（Ｓｏｎｙ ｃｙｂｅｒ－ｓｈｏｔ ＤＳＣ－ＴＸ７、ニューヨーク、ＮＹ、米国）を使用して創傷の写真画像を毎日撮影した。創傷面積の大まかな評価を得るために、元の創傷面積に対する現在の創傷の割合を計算することによって、創傷面積を分析した。創傷面積がゼロにほぼ等しくなったら、創傷を完全に閉じているとみなした。
【0154】
マウスを処置後１５日目（Ｄ１５）およびＤ２３にＣＯ２によって安楽死させた。皮膚創傷領域および隣接組織（約２．５ｃｍ）を収集し、１０％（ｖ／ｖ）緩衝ホルムアルデヒド中４°Ｃで１６時間超固定した、または液体窒素で瞬間凍結し、次いでパラフィン包埋または凍結切片処理した。標本を厚さ５μｍの切片にスライスし、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色して、局所細胞変性および炎症を調べた。マッソン三色コラーゲン染色を行って、創傷領域の組織線維症を評価した。考慮した組織学的パラメータは、創傷閉鎖率、再上皮化、真皮再生、線維性沈着および炎症であった。皮膚付属器の再生を、創傷床の毛包または皮脂腺の数を計数することによって評価した。いくつかのパラフィン皮膚切片（５μｍ）を、免疫組織化学（ＩＨＣ）または免疫蛍光（ＩＦ）のためにさらに処理した。
【0155】
糖尿病性皮膚創傷モデル
糖尿病マウス（ＦＶＢ（Ｃｇ）－Ｔｇ（Ｉｎｓ２－ＣＡＬＭ１）２６Ｏｖｅ Ｔｇ（Ｃｒｙａａ－ＴＡｇ）１Ｏｖｅ／ＰｎｅＪ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を使用して、上記の細胞／足場３－Ｄ構築物の創傷治癒効果を試験した。皮膚調製後、１２月齢の６匹の糖尿病マウスに、イソフルラン麻酔下で外科用ハサミを使用して、背部皮膚上に１．５ｃｍｘ１．５ｃｍ全層皮膚創傷をつけた。次いで、上記の細胞／足場３－Ｄ構築物（約５０００００個細胞／単位）を創傷床に移植した。幹細胞を含まないフィブリンゲル（足場のみ）も対照として創傷床に移植した。創傷を生成した後、固定距離からデジタルカメラ（Ｓｏｎｙ ｃｙｂｅｒ－ｓｈｏｔ ＤＳＣ－ＴＸ７、ニューヨーク、ＮＹ、米国）を使用して創傷の写真画像を５０日間毎日撮影した。創傷面積の大まかな評価を得るために、元の創傷面積に対する現在の創傷の割合を計算することによって、創傷面積を分析した。創傷面積がゼロにほぼ等しくなったら、創傷を完全に閉じているとみなした。
糖尿病マウス（ＦＶＢ（Ｃｇ）－Ｔｇ（Ｉｎｓ２－ＣＡＬＭ１）２６Ｏｖｅ Ｔｇ（Ｃｒｙａａ－ＴＡｇ）１Ｏｖｅ／ＰｎｅＪ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を使用して、上記の細胞／足場３－Ｄ構築物の創傷治癒効果を試験した。皮膚調製後、１２月齢の６匹の糖尿病マウスに、イソフルラン麻酔下で外科用ハサミを使用して、背部皮膚上に１．５ｃｍｘ１．５ｃｍ全層皮膚創傷をつけた。次いで、上記の細胞／足場３－Ｄ構築物（約５０００００個細胞／単位）を創傷床に移植した。幹細胞を含まないフィブリンゲル（足場のみ）も対照として創傷床に移植した。創傷を生成した後、固定距離からデジタルカメラ（Ｓｏｎｙ ｃｙｂｅｒ－ｓｈｏｔ ＤＳＣ－ＴＸ７、ニューヨーク、ＮＹ、米国）を使用して創傷の写真画像を５０日間毎日撮影した。創傷面積の大まかな評価を得るために、元の創傷面積に対する現在の創傷の割合を計算することによって、創傷面積を分析した。創傷面積がゼロにほぼ等しくなったら、創傷を完全に閉じているとみなした。
【0156】
マウスを処置後５５日目（Ｄ５５）にＣＯ２によって安楽死させた。皮膚創傷領域および隣接組織（約２．５ｃｍ）を収集し、１０％（ｖ／ｖ）緩衝ホルムアルデヒド中４°Ｃで１６時間超固定した、または液体窒素で瞬間凍結し、次いでパラフィン包埋または凍結切片処理した。標本を厚さ５μｍの切片にスライスし、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色して、局所細胞変性および炎症を調べた。マッソン三色染色を行って、創傷領域の組織線維症を評価した。考慮した組織学的パラメータは、創傷閉鎖率、再上皮化、真皮再生、線維性沈着および炎症であった。結果はまた、再生された表皮層が滑らかであり、コラーゲンの分布が正常な皮膚の分布に類似していることを示した。皮下組織（例えば、脂肪組織）の構造および分布は明確で、正常な皮膚の構造と類似であった。筋組織の新生も観察された。
【0157】
統計分析
Ｊａｖａ（登録商標）ベースの画像処理プログラムである画像分析ソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ、米国国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用して、画像を分析して創傷閉鎖率の割合、瘢痕面積の割合を計算した。コラーゲン沈着分析は、ＩｍａｇｅＪの測定設定でカラーチャネルを分割する方法により、赤色領域（細胞構造領域）÷青色領域（コラーゲン沈着）に基づいた。対応のある両側スチューデントｔ検定を使用して２つの群を比較して統計分析を行った。ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意とみなした。
Ｊａｖａ（登録商標）ベースの画像処理プログラムである画像分析ソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ、米国国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用して、画像を分析して創傷閉鎖率の割合、瘢痕面積の割合を計算した。コラーゲン沈着分析は、ＩｍａｇｅＪの測定設定でカラーチャネルを分割する方法により、赤色領域（細胞構造領域）÷青色領域（コラーゲン沈着）に基づいた。対応のある両側スチューデントｔ検定を使用して２つの群を比較して統計分析を行った。ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意とみなした。
【0158】
結果
創傷治癒における活性化幹細胞の治療可能性を決定するために、半固体フィブリンゲル足場上に活性化幹細胞を含む三次元（３－Ｄ）構築物を作製した。構築物を、Ｌ２Ｇマウスからのドナー細胞と同じ系統バックグラウンドを有するＦＶＢマウス上に作成された全層切除皮膚創傷に施用した。移植前の２４時間、既製のフィブリンゲルに播種したＧＦＰ＋幹細胞は、細胞がしっかりと成長し、フィブリンゲル上でコンフルエントになることを示した。
創傷治癒における活性化幹細胞の治療可能性を決定するために、半固体フィブリンゲル足場上に活性化幹細胞を含む三次元（３－Ｄ）構築物を作製した。構築物を、Ｌ２Ｇマウスからのドナー細胞と同じ系統バックグラウンドを有するＦＶＢマウス上に作成された全層切除皮膚創傷に施用した。移植前の２４時間、既製のフィブリンゲルに播種したＧＦＰ＋幹細胞は、細胞がしっかりと成長し、フィブリンゲル上でコンフルエントになることを示した。
【0159】
処置群（細胞／足場３－Ｄ構築物を含む）は、閉鎖時間、瘢痕面積および線維組織沈着の有意な減少を示した（図１３）。形態学的画像分析により、３－Ｄ構築物による処置が、早くも創傷後３日目に創傷閉鎖を有意に改善し、創傷後６日目でより自明になることが明らかになった（図１３、Ａ）。累積画像分析により、対照群と比較して、処置後３、５、７および９日目に創傷治癒の統計学的に有意な改善が明らかになった。３－Ｄ構築物で処置した全ての創傷が１０日目に閉鎖していたが、対照群の創傷は１５日目まで開いていた（図１３、Ａ）。
【0160】
組織学的評価により、屠殺最終日（２３日目）で、対照群と比較して処置群の動物の創傷で再上皮化の増強が起こったことが明らかになった。６日目で、創傷表面積または瘢痕領域が対照群と比較して有意に小さかった（図１３、Ｂ）。処置群の創傷ではより高い細胞活性も観察され、これらの再生領域での細胞再生の増強が示唆された。全ての処置動物の皮膚が、表皮および真皮のほぼ正常な組織学的構造を示した（図１４）。点線は創傷領域の輪郭を示した。３－Ｄ構築物が創傷表面にくっついていた。三色染色により、３－Ｄ構築物の下に多くの新生付属器が存在し、皮脂腺および毛包構造が創傷床に成長し、処置マウスの創傷領域に存在することが示された（図１４）。
【0161】
糖尿病皮膚創傷モデルにおいて、結果は、細胞／足場３－Ｄ構築物で処置された糖尿病マウスの皮膚創傷がＤ１６～Ｄ１９で完全に閉鎖したことを示した（図１５）。対照群（足場のみ）の皮膚創傷はＤ５０まで閉鎖しなかった。組織学的評価により、屠殺最終日（５５日目）で、対照群と比較して処置群のマウスの創傷で再上皮化の増強が起こったことが明らかになった（図１６）。処置マウスの皮膚は、表皮層、皮下組織および筋組織を伴う、皮膚の正常な組織構造に近いものを示した。比較すると、対照群の創傷は、皮下組織および筋組織のないケラチン化表皮層によってのみ閉鎖された（図１６）。
【0162】
実施例５
人工骨モデル
以下の方法を使用して、精製幹細胞を使用して、インビトロで人工骨組織を発達させた。精製多能性幹細胞を骨基質に播種し、骨芽細胞分化培地（ＯＤＭ）を添加し、２週間培養した。２週間の最後に、ミネラル沈着が観察された（図１７、Ａ）。３週目に、いくつかの分化骨芽細胞が互いに結合して骨化中心様構造を形成した（図１７、Ｂ、矢印で示す）。４週間後、骨組織が成長し、一次骨基質からおよびそれを超えて広がった（図１７、Ｃ、点線より上）。結果は、精製幹細胞が骨組織に成長し、マトリックス上に人工骨を形成することができることを示した。
人工骨モデル
以下の方法を使用して、精製幹細胞を使用して、インビトロで人工骨組織を発達させた。精製多能性幹細胞を骨基質に播種し、骨芽細胞分化培地（ＯＤＭ）を添加し、２週間培養した。２週間の最後に、ミネラル沈着が観察された（図１７、Ａ）。３週目に、いくつかの分化骨芽細胞が互いに結合して骨化中心様構造を形成した（図１７、Ｂ、矢印で示す）。４週間後、骨組織が成長し、一次骨基質からおよびそれを超えて広がった（図１７、Ｃ、点線より上）。結果は、精製幹細胞が骨組織に成長し、マトリックス上に人工骨を形成することができることを示した。
【0163】
実施例６
肝損傷の処置
実施例３に記載される精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞集団を使用して、以下の方法を使用して肝臓損傷を処置した。
肝損傷の処置
実施例３に記載される精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞集団を使用して、以下の方法を使用して肝臓損傷を処置した。
【0164】
肝臓損傷モデルを確立するために、２０匹の８週齢成体レシピエント野生型ＦＶＢマウスに、オリーブ油で１：１希釈したＣＣｌ４の１回腹膜注射（１．２ｍｌ／ｋｇ）を行った。ＣＣｌ４投与の１日後、実験マウスを無作為に選択し、後眼窩洞を通して１５０μｌの生理食塩水に懸濁させた２．５ｘ１０５個の精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞を含む１回の静脈注射を受けさせた（ｎ＝１０）。対照マウスを、同じ経路で１５０μｌの生理食塩水で処置した（ｎ＝１０）。全てのマウスを、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞の移植後７日目に屠殺した。マウスの内臓を収集し、１０％緩衝ホルマリンで固定した。肝臓組織試料を、急速凍結およびパラフィン包埋のために分離した。
【0165】
結果は、中心小葉領域の肝細胞が、正常な肝臓と比較して、７日目に対照マウスの肝臓で、核濃縮、核崩壊および核溶解を伴う液胞、水腫および脂肪変性を示すことを示した（図１８、ＡおよびＢ）。対照的に、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞で処置されたマウスは、中心静脈領域でほぼ正常な構造を持つ完全な再生を示した（図１８、Ｃ）。これらの結果は、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞を使用した処置がＣＣｌ４損傷を著しく減弱させ、肝臓再生を大いに促進することを示唆した。炎症細胞は、精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞を使用した処置後、再生された肝臓領域および周囲の組織に浸潤せず、拒絶も免疫応答もほとんど生じないことを示唆した。
【0166】
蛍光顕微鏡検査により、ＣＣｌ４損傷の標的である中心静脈領域にかなりの数のＧＦＰ＋細胞が示された（図１８、Ｄ、ＥおよびＦ）。移植されたＧＦＰ＋細胞は、アルブミンおよび増殖マーカーＫｉ－６７を発現していた。これらの結果は、移植された精製ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－細胞が宿主肝臓に受け入れられ、一過性ではないが、構造的にも機能的にも損傷領域を活発に増殖および再増殖させることを示唆した。肝臓組織のＰＣＲ分析により、移植された肝臓に少なくとも３か月間、ＧＦＰ遺伝子が長期間存在することが示された。肝腫瘍形成の肉眼的証拠も組織学的証拠も、全ての時点で処置肝臓で発見されなかった。
【0167】
実施例７
幹細胞を培養する代替方法および肝損傷の処置
代替方法を使用して、血液から単離された休眠小細胞を活性化および培養し、活性化幹細胞を肝損傷の処置に使用した。
幹細胞を培養する代替方法および肝損傷の処置
代替方法を使用して、血液から単離された休眠小細胞を活性化および培養し、活性化幹細胞を肝損傷の処置に使用した。
【0168】
幹細胞の単離および共培養
ＦＶＢ－Ｔｇ（ＣＡＧ－ｌｕｃ－ｅＧＦＰ）Ｌ２Ｇ８５Ｃｈｃｏ／Ｊ（Ｌ２Ｇ）雄マウスを８週齢で収集した（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）。ｌｕｃ－ｅＧＦＰ導入遺伝子を、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を発現するＣＡＧプロモーター（ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンハイブリッドプロモーターを備えたヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターエンハンサー）によって指示する。３％イソフルラン（Ｂｕｔｌｅｒ Ｓｃｈｅｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ、ＣＡ）が供給されたチャンバーでマウスを完全に麻酔し、次いで、１００μｌの生理食塩水に希釈した３Ｕのヘパリンを注射した。ヘパリン化毛細管を使用して、各マウスから後眼窩洞を通して血液を回収した。５０ｍｌチューブ中で溶解バッファー（８．３ｇ／ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１ｇ／ｌ ＫＨＣＯ３、３．７ｇ／ｌ ＥＤＴＡ１０：１）を全血に添加し、引き続いて３０００ｇで４℃で１０分間高速遠心分離することによって、赤血球を枯渇させた。ペレットを３ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。血小板を枯渇させるために、細胞懸濁液を、１：４．４希釈のＰＢＳを含むＯｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配培地を含有するチューブに移して密度１．０６３にした。有核細胞懸濁液を回収し、３５０ｇで４℃で１５分間遠心分離した。ペレットを、さらなる蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析のためにＰＢＳに再懸濁した、またはインビトロ試験のために培養培地（２０％ＦＢＳ、１３ｍｇの抗生物質－抗真菌薬、２０ｍｇのゲンタマイシンを含むａ－ＭＥＭ）に再懸濁した。ＡＭＬ１２肝細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を３０ｍｇ／ｌのマイトマイシンＣで２時間前処置した。次いで、有糸分裂的に不活性化したＡＭＬ１２肝細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中６ウェルプレートに接種した。接種約１６時間後に、ＡＭＬ１２細胞が培養ウェルの底部チャンバーに接着し、約８０％コンフルエントになった。０．５ｍｌの血液から誘導された有核細胞懸濁液をＴｒａｎｓｗｅｌｌ（２４ｍｍインサート、０．４ｍｍ孔径、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）の上部チャンバーに入れた。培養培地を一日おきに交換した。
ＦＶＢ－Ｔｇ（ＣＡＧ－ｌｕｃ－ｅＧＦＰ）Ｌ２Ｇ８５Ｃｈｃｏ／Ｊ（Ｌ２Ｇ）雄マウスを８週齢で収集した（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）。ｌｕｃ－ｅＧＦＰ導入遺伝子を、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を発現するＣＡＧプロモーター（ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンハイブリッドプロモーターを備えたヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターエンハンサー）によって指示する。３％イソフルラン（Ｂｕｔｌｅｒ Ｓｃｈｅｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ、ＣＡ）が供給されたチャンバーでマウスを完全に麻酔し、次いで、１００μｌの生理食塩水に希釈した３Ｕのヘパリンを注射した。ヘパリン化毛細管を使用して、各マウスから後眼窩洞を通して血液を回収した。５０ｍｌチューブ中で溶解バッファー（８．３ｇ／ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１ｇ／ｌ ＫＨＣＯ３、３．７ｇ／ｌ ＥＤＴＡ１０：１）を全血に添加し、引き続いて３０００ｇで４℃で１０分間高速遠心分離することによって、赤血球を枯渇させた。ペレットを３ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。血小板を枯渇させるために、細胞懸濁液を、１：４．４希釈のＰＢＳを含むＯｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配培地を含有するチューブに移して密度１．０６３にした。有核細胞懸濁液を回収し、３５０ｇで４℃で１５分間遠心分離した。ペレットを、さらなる蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析のためにＰＢＳに再懸濁した、またはインビトロ試験のために培養培地（２０％ＦＢＳ、１３ｍｇの抗生物質－抗真菌薬、２０ｍｇのゲンタマイシンを含むａ－ＭＥＭ）に再懸濁した。ＡＭＬ１２肝細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を３０ｍｇ／ｌのマイトマイシンＣで２時間前処置した。次いで、有糸分裂的に不活性化したＡＭＬ１２肝細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中６ウェルプレートに接種した。接種約１６時間後に、ＡＭＬ１２細胞が培養ウェルの底部チャンバーに接着し、約８０％コンフルエントになった。０．５ｍｌの血液から誘導された有核細胞懸濁液をＴｒａｎｓｗｅｌｌ（２４ｍｍインサート、０．４ｍｍ孔径、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）の上部チャンバーに入れた。培養培地を一日おきに交換した。
【0169】
磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）およびＦＡＣＳ分析
マイトマイシンＣ処置ＡＭＬ１２細胞との３週間の共培養後、拡大細胞を磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）で精製して、ＣＤ３４陽性細胞を濃縮した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。手短に言えば、培養細胞をトリプシン処理し、抗ＣＤ３４ラット抗体と３０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、４℃で３０分間抗ラットマイクロビーズとインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を５００μｌの分離バッファーに再懸濁し、ＭＡＣＳカラムにアプライした。元の画分、陰性画分および陽性画分の細胞を計数し、上記のＴｒａｎｓｗｅｌｌ膜上に播種した。拡大細胞を、ＦＡＣＳによってＣＤ３４陽性ならびにＣＤ４５、Ｓｃａ－１、Ｔｈｙ１．１、ｃ－ｋｉｔおよびＣＤ４１を含む様々な表面マーカーについて分析した。核を４９，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）またはＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用してデータを分析した。
マイトマイシンＣ処置ＡＭＬ１２細胞との３週間の共培養後、拡大細胞を磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）で精製して、ＣＤ３４陽性細胞を濃縮した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。手短に言えば、培養細胞をトリプシン処理し、抗ＣＤ３４ラット抗体と３０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、４℃で３０分間抗ラットマイクロビーズとインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を５００μｌの分離バッファーに再懸濁し、ＭＡＣＳカラムにアプライした。元の画分、陰性画分および陽性画分の細胞を計数し、上記のＴｒａｎｓｗｅｌｌ膜上に播種した。拡大細胞を、ＦＡＣＳによってＣＤ３４陽性ならびにＣＤ４５、Ｓｃａ－１、Ｔｈｙ１．１、ｃ－ｋｉｔおよびＣＤ４１を含む様々な表面マーカーについて分析した。核を４９，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）またはＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用してデータを分析した。
【0170】
肝損傷モデルおよび細胞移植
２０匹の８週齢成体レシピエント野生型ＦＶＢマウスに、オリーブ油で１：１希釈したＣＣｌ４の１回腹膜注射（１．２ｍｌ／ｋｇ）を行った。ＣＣｌ４投与の１日後、実験マウスを無作為に選択し、後眼窩洞を通して１５０μｌの生理食塩水に懸濁させた、共培養肝細胞から精製した２．５ｘ１０５個のＣＤ３４＋細胞集団細胞を含む１回の静脈注射を受けさせた（ｎ＝１０）。対照マウスを、同じ経路で１５０μｌの生理食塩水で処置した（ｎ＝１０）。全てのマウスを、精製ＣＤ３４＋細胞集団の移植後７日目に屠殺した。実験室での測定のために血液を回収した。マウスの内臓を収集し、１０％緩衝ホルマリンで固定した。肝臓組織試料を、急速凍結およびパラフィン包埋のために分離した。細胞分化転換の機構を試験するために、ｍＴ／ｍＧマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）をアルブミン－Ｃｒｅトランスジェニックマウス（Ｋａｒｌ Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ博士、Ｓｔａｎｆｏｒｄ、ＣＡの提供）と交配した。
２０匹の８週齢成体レシピエント野生型ＦＶＢマウスに、オリーブ油で１：１希釈したＣＣｌ４の１回腹膜注射（１．２ｍｌ／ｋｇ）を行った。ＣＣｌ４投与の１日後、実験マウスを無作為に選択し、後眼窩洞を通して１５０μｌの生理食塩水に懸濁させた、共培養肝細胞から精製した２．５ｘ１０５個のＣＤ３４＋細胞集団細胞を含む１回の静脈注射を受けさせた（ｎ＝１０）。対照マウスを、同じ経路で１５０μｌの生理食塩水で処置した（ｎ＝１０）。全てのマウスを、精製ＣＤ３４＋細胞集団の移植後７日目に屠殺した。実験室での測定のために血液を回収した。マウスの内臓を収集し、１０％緩衝ホルマリンで固定した。肝臓組織試料を、急速凍結およびパラフィン包埋のために分離した。細胞分化転換の機構を試験するために、ｍＴ／ｍＧマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）をアルブミン－Ｃｒｅトランスジェニックマウス（Ｋａｒｌ Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ博士、Ｓｔａｎｆｏｒｄ、ＣＡの提供）と交配した。
【0171】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）およびＲＮＡ分析
ＤＮＡを、ＧＥＮＪＥＴ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ精製キット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、リトアニア）を使用して、共培養幹細胞、ｅＧＦＰマウス、または移植マウス肝臓の新鮮または凍結肝臓組織から抽出した。Ｔｒｉｚｏｌ試薬法を使用して、３週間目でＭＡＣＳ選別、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２陽性、新鮮もしくは培養幹細胞または対照細胞（いかなる処置もしていない培養ＡＭＬ１２細胞）から総ＲＮＡを抽出し、次いで、ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅで処置して汚染ＤＮＡを除去した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、反応体積１００μｌ当たり４μｇの全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを得た。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および逆転写ＰＣＲを、標準プロトコルおよび１０００ｎｇの鋳型ＤＮＡまたはｃＤＮＡ、１０ｍＭの各プライマー、およびＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、２０μｌの反応体積で行った。１８Ｓ ｒＲＮＡを内部対照遺伝子として使用した。
ＤＮＡを、ＧＥＮＪＥＴ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ精製キット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、リトアニア）を使用して、共培養幹細胞、ｅＧＦＰマウス、または移植マウス肝臓の新鮮または凍結肝臓組織から抽出した。Ｔｒｉｚｏｌ試薬法を使用して、３週間目でＭＡＣＳ選別、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２陽性、新鮮もしくは培養幹細胞または対照細胞（いかなる処置もしていない培養ＡＭＬ１２細胞）から総ＲＮＡを抽出し、次いで、ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅで処置して汚染ＤＮＡを除去した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、反応体積１００μｌ当たり４μｇの全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを得た。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および逆転写ＰＣＲを、標準プロトコルおよび１０００ｎｇの鋳型ＤＮＡまたはｃＤＮＡ、１０ｍＭの各プライマー、およびＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、２０μｌの反応体積で行った。１８Ｓ ｒＲＮＡを内部対照遺伝子として使用した。
【0172】
ウエスタンブロット分析
共培養細胞およびＡＭＬ１２細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＲＩＰＡバッファーで溶解し、氷上で１５分間インキュベートした。溶解物を遠心分離し、上清をタンパク質定量後のウエスタンブロット分析に使用した。細胞溶解物を電気泳動によりニトロセルロース膜に移した。洗浄後、タンパク質をローディングした膜を粉乳とインキュベートして、非特異的結合をブロッキングした。一次抗体のインキュベーションでは、内部量を制御するために、ウサギ抗アルブミン抗体およびβ－アクチン抗体を４℃で一晩使用した。洗浄後、膜をＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体とインキュベートし、化学発光増強によって可視化した（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）。使用した抗体は、Ａ６、ａ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルブミン、β－アクチン、ＣＤ１１７（ｃ－ｋｉｔ）、ＣＤ３４、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＣＤ２９（インテグリンβ１）、Ｋｉ－６７、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、Ｓｃａ－１、Ｔｈｙ１．１（ＣＤ９０．１）およびＤＮＡ抗体を標的化した。
共培養細胞およびＡＭＬ１２細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＲＩＰＡバッファーで溶解し、氷上で１５分間インキュベートした。溶解物を遠心分離し、上清をタンパク質定量後のウエスタンブロット分析に使用した。細胞溶解物を電気泳動によりニトロセルロース膜に移した。洗浄後、タンパク質をローディングした膜を粉乳とインキュベートして、非特異的結合をブロッキングした。一次抗体のインキュベーションでは、内部量を制御するために、ウサギ抗アルブミン抗体およびβ－アクチン抗体を４℃で一晩使用した。洗浄後、膜をＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体とインキュベートし、化学発光増強によって可視化した（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）。使用した抗体は、Ａ６、ａ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルブミン、β－アクチン、ＣＤ１１７（ｃ－ｋｉｔ）、ＣＤ３４、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＣＤ２９（インテグリンβ１）、Ｋｉ－６７、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、Ｓｃａ－１、Ｔｈｙ１．１（ＣＤ９０．１）およびＤＮＡ抗体を標的化した。
【0173】
組織学的および免疫学的染色
パラフィン包埋組織標本をスライドガラス上で厚さ５μｍに切断し、脱パラフィンし、再水和した。新たに単離した細胞、共培養幹細胞および培養ＡＭＬ１２細胞を、スライドガラス上にサイトスピンした、またはＴｒａｎｓｗｅｌｌ膜で直接試験した。組織または細胞スライドおよびＴｒａｎｓｗｅｌｌ膜を、ヘマトキシリンおよびエオシンまたは過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）で染色した。ＩＨＣおよびＩＦ染色について以下の通り簡単に説明する。スライドに、０．０１Ｍクエン酸バッファー、ｐＨ６．０で電子レンジで５分間の抗原回収を受けさせ、引き続いて０．０３％Ｈ２Ｏ２と３０分間インキュベートして内因性ペルオキシダーゼをブロッキングした。スライドおよび膜を１％ウマ血清と３０分間インキュベートして非特異的結合をブロッキングし、一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、スライドをＩＨＣのビオチン化二次抗体またはＩＦの蛍光色素コンジュゲート抗体で処置した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ抗マウス、抗ウサギまたは抗ラットＩｇＧ１抗体（１ｍｇ／ｍｌ）を抗体対照として使用した。ＩＦ染色スライドをＤＡＰＩでマウントし、共焦点顕微鏡によって分析した。ＩＨＣ試料をＡＢＣ複合体とインキュベートし、次いで、ＤＡＢで展開した。二重染色を、ＤＡＢ（茶色染色）およびニッケル／ＤＡＢ（濃青色または灰色染色）で展開した。抗体の特異性を確認するために、各試験について陽性対照、陰性対照およびブランク対照を含む多様な対照群を設定した。画像を、Ｌｅｉｃａ ＤＭＲＡ顕微鏡（ライカ、Ｈｅｅｒｂｒｕｇｇ、スイス）で観察した。
パラフィン包埋組織標本をスライドガラス上で厚さ５μｍに切断し、脱パラフィンし、再水和した。新たに単離した細胞、共培養幹細胞および培養ＡＭＬ１２細胞を、スライドガラス上にサイトスピンした、またはＴｒａｎｓｗｅｌｌ膜で直接試験した。組織または細胞スライドおよびＴｒａｎｓｗｅｌｌ膜を、ヘマトキシリンおよびエオシンまたは過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）で染色した。ＩＨＣおよびＩＦ染色について以下の通り簡単に説明する。スライドに、０．０１Ｍクエン酸バッファー、ｐＨ６．０で電子レンジで５分間の抗原回収を受けさせ、引き続いて０．０３％Ｈ２Ｏ２と３０分間インキュベートして内因性ペルオキシダーゼをブロッキングした。スライドおよび膜を１％ウマ血清と３０分間インキュベートして非特異的結合をブロッキングし、一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、スライドをＩＨＣのビオチン化二次抗体またはＩＦの蛍光色素コンジュゲート抗体で処置した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ抗マウス、抗ウサギまたは抗ラットＩｇＧ１抗体（１ｍｇ／ｍｌ）を抗体対照として使用した。ＩＦ染色スライドをＤＡＰＩでマウントし、共焦点顕微鏡によって分析した。ＩＨＣ試料をＡＢＣ複合体とインキュベートし、次いで、ＤＡＢで展開した。二重染色を、ＤＡＢ（茶色染色）およびニッケル／ＤＡＢ（濃青色または灰色染色）で展開した。抗体の特異性を確認するために、各試験について陽性対照、陰性対照およびブランク対照を含む多様な対照群を設定した。画像を、Ｌｅｉｃａ ＤＭＲＡ顕微鏡（ライカ、Ｈｅｅｒｂｒｕｇｇ、スイス）で観察した。
【0174】
肝臓でのＧＦＰ発現の原位置イメージング
肝臓標本を冷生理食塩水（４°Ｃ、１０ｍｌ）で洗い流し、アルデヒド架橋によって引き起こされる自己蛍光を回避するために、固定せずにＣｒｙｏ－ＯＣＴ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ、東京、日本）に直接包埋した。肝組織におけるＧＦＰシグナルの蛍光を、蛍光顕微鏡法によって測定した。
肝臓標本を冷生理食塩水（４°Ｃ、１０ｍｌ）で洗い流し、アルデヒド架橋によって引き起こされる自己蛍光を回避するために、固定せずにＣｒｙｏ－ＯＣＴ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ、東京、日本）に直接包埋した。肝組織におけるＧＦＰシグナルの蛍光を、蛍光顕微鏡法によって測定した。
【0175】
統計分析
対応のある両側スチューデントｔ検定を使用して２つの群を比較して統計分析を行った。Ｊａｖａ（登録商標）ベースの画像処理プログラムであるＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用して、画像分析を行った。ｐ＜０．０５の場合、差を有意とみなした。
対応のある両側スチューデントｔ検定を使用して２つの群を比較して統計分析を行った。Ｊａｖａ（登録商標）ベースの画像処理プログラムであるＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用して、画像分析を行った。ｐ＜０．０５の場合、差を有意とみなした。
【0176】
結果
Ｌ２Ｇまたは野生型ＦＶＢマウスの末梢血から新たに単離された有核細胞のＦＡＣＳ分析により、赤血球溶解および血小板枯渇後の高度に不均一な細胞混合物が示された。ＣＤ３４陽性細胞のごく一部がＣＤ４５を共発現する（２つのプールされたマウス画分で０．０４％）。Ｌ２Ｇ（ＧＦＰ＋）マウスの末梢血からの有核（ＤＡＰＩ＋）細胞混合物は、ＡＭＬ１２肝細胞との共培養中に迅速に拡大した（図１９）。しかしながら、ＡＭＬ１２細胞との共培養なしの細胞混合物は増殖せず、老化し、共培養細胞と比較すると５日目までにＧＦＰ発現が喪失した（図１９）。
Ｌ２Ｇまたは野生型ＦＶＢマウスの末梢血から新たに単離された有核細胞のＦＡＣＳ分析により、赤血球溶解および血小板枯渇後の高度に不均一な細胞混合物が示された。ＣＤ３４陽性細胞のごく一部がＣＤ４５を共発現する（２つのプールされたマウス画分で０．０４％）。Ｌ２Ｇ（ＧＦＰ＋）マウスの末梢血からの有核（ＤＡＰＩ＋）細胞混合物は、ＡＭＬ１２肝細胞との共培養中に迅速に拡大した（図１９）。しかしながら、ＡＭＬ１２細胞との共培養なしの細胞混合物は増殖せず、老化し、共培養細胞と比較すると５日目までにＧＦＰ発現が喪失した（図１９）。
【0177】
ＭＡＣＳによって濃縮した後、ＣＤ３４＋細胞優勢群（＞９０％）は、経時的に肝臓環境でより迅速に拡大した。ＦＡＣＳ分析により、拡大細胞がＣＤ３４を発現するだけでなく、ＣＤ４５、ｃ－ｋｉｔ、Ｓｃａ－１およびＴｈｙ１．１も発現するが、血小板の分子マーカーであるＣＤ４１は発現しないことが示された。ブロモデオキシウリジン標識は、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋細胞の倍加時間が約４８時間であることを示した。
【0178】
経時的なＡＭＬ１２共培養中の拡大細胞の顕著な形態学的変化が観察された。共培養細胞は、４週間の共培養後、核－細胞質比が減少し、細長い平らな多角形になる。共培養細胞は、ａ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＫ８、ＣＫ１９およびＣＫ１８などの肝細胞のマーカーの多様なパネルを発現した。肝内幹細胞の特異的マーカーであるＡ６は、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）およびＣＫ１９と共発現された。同じ共培養細胞における肝上皮マーカーＣＫ８またはＣＫ１８とＣＤ３４の共発現は、肝上皮分化が起こっていることを示唆した。いくつかの共培養細胞は、ＰＣＮＡとＡ６の共局在を示し、原始肝細胞様細胞の活発な増殖を示唆した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜上で原位置で成長している共培養細胞のＣＤ４５陽性は、その造血起源を示した。肝核因子１ａ（ＨＮＦ１ａ）、ＣＹＰ３Ａ１６およびＣＹＰ１Ｂ１などの肝特異的転写因子および肝代謝機能関連チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）遺伝子は、ＡＭＬ１２肝細胞と比較して共培養細胞で活性化された。
【0179】
肝環境の誘導下で、造血細胞から肝上皮化アルブミン発現細胞への共培養細胞の分化転換プロセスが観察された。予想どおり、ｍＴ／ｍＧマウスから新たに単離された有核細胞は全てＴｏｍａｔｏ赤色導入遺伝子を発現した（図２０、Ａ）。ＡＭＬ１２細胞との共培養中、アルブミン／Ｃｒｅ導入遺伝子が７日目までに発現したので、いくつかの細胞は緑色蛍光に変換された（図２０、ＢおよびＣ）。ほとんどの細胞は徐々に緑色に変わり、経時的にＧＦＰを発現した。肝機能分化の重要な調節因子であるＣＤ２９は、ＧＦＰ＋細胞で発現された（図２０、Ｄ）。陽性ＰＡＳ染色は、アルブミン発現（図２０、Ｆ）に加えて、グリコーゲンを合成および貯蔵する細胞の機能的活性を示唆した（図２０、Ｅ）。精製ＣＤ３４＋細胞の成長状態を、細胞増殖マーカーであるＫｉ－６７を使用して調査した。いくつかの細胞は、アルブミン発現を伴う増殖活性（Ｋｉ－６７）を示した（図２０、Ｇ）。免疫ブロット法は、共培養細胞で経時的なアルブミン発現増加を示した（図２０、Ｈ）。
【0180】
急性肝損傷マウスモデルを、高用量ＣＣｌ４注射によって作成した。ＣＣｌ４の注射後１日目から、各マウスは毎日１～２ｇの体重（ＢＷ）を失った。共培養細胞（対照として生理食塩水で処置）を使用した処置なしのマウスのＢＷは、マウスが７日目に屠殺されるまで減少し続け、肝損傷の悪化と一致した（図２１、Ａ）。２匹のマウス（死亡率２０％）が、ＣＣｌ４注射後２日目および３日目に死亡した。対照マウスはまた、急性肝損傷に特徴的な炎症性肝腫大のために、ＢＷに対する肝臓重量の比が高かった（図２１、Ｂ）。対照的に、共培養細胞で処置された全てのマウスは生存し、顕著な回復パターンを示した。ＢＷは１日または２日間減少し、引き続いて安定したまたはベースラインまでＢＷが増加した。失われたＢＷは、ＣＣｌ４注射後５日目（または共培養細胞での処置後４日目）までに、全ての処置マウスで回復されていた。ＣＣｌ４投与後１日目で全てのマウスの血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベルの正常の３５０倍を超える増加が観察され（図２１、Ｃ）、重度の肝細胞損傷を示していた。屠殺日（７日目）に、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）レベル、ＡＳＴ／ＡＬＴの比、および尿素レベルは、処置マウスと比較して対照マウスで有意に高かった（図２１、ＤおよびＥ）。局所壊死の分析により、処置マウス肝臓と対照マウス肝臓の間の壊死細胞数に基づいて処置マウスに有意差が示された（ｐ＜０．００１、図２１、Ｆ）。
【0181】
一貫して、組織学的分析により、対照マウス肝臓におけるＣＣｌ４肝毒性に特徴的な小葉中心壊死が示された。中心小葉領域の肝細胞は、正常な肝臓と比較して、７日目に対照マウスの肝臓で、核濃縮、核崩壊および核溶解を伴う液胞、水腫および脂肪変性を示した。対照的に、共培養細胞で処置されたマウスは、中心静脈領域でほぼ正常な構造を持つ完全な再生を示した。これらの結果は、共培養細胞を使用した処置がＣＣｌ４損傷を著しく減弱させ、肝臓再生を大いに促進することを示唆した。炎症細胞は、共培養細胞を使用した処置後、再生された肝臓領域および周囲の組織に浸潤せず、拒絶も免疫応答もほとんど生じないことを示唆した。
【0182】
蛍光顕微鏡検査により、ＣＣｌ４損傷の標的である中心静脈領域にかなりの数のＧＦＰ＋細胞が示された。移植されたＧＦＰ＋細胞は、アルブミンおよび増殖マーカーＫｉ－６７を発現していた。これらの結果は、移植された共培養細胞が宿主肝臓に受け入れられ、一過性ではないが、構造的にも機能的にも損傷領域を活発に増殖および再増殖させることを示唆した。肝臓組織のＰＣＲ分析により、移植された肝臓に少なくとも３か月間、ＧＦＰ遺伝子が長期間存在することが示された。肝腫瘍形成の肉眼的証拠も組織学的証拠も、全ての時点で処置肝臓で発見されなかった。
【0183】
実施例８
増殖マーカー、成長因子およびサイトカインの発現
以下の方法を使用して、活性化幹細胞の増殖マーカー、成長因子およびサイトカインの発現レベルを評価した。ＲＴ－ＰＣＲを行って、サイクリンＤ－１（増殖マーカー）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１、成長ホルモンの効果を媒介するホルモン）、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ、ＩＧＦ－１の受容体）および成長因子ならびにサイトカイン、例えばトランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ－α）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）およびＮｏｔｃｈ－１の発現レベルを検出した。１８Ｓ ｒＲＮＡを内部対照として使用した。成長因子およびサイトカインのレベルを、ＩＦおよび他の方法によっても評価した。
増殖マーカー、成長因子およびサイトカインの発現
以下の方法を使用して、活性化幹細胞の増殖マーカー、成長因子およびサイトカインの発現レベルを評価した。ＲＴ－ＰＣＲを行って、サイクリンＤ－１（増殖マーカー）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１、成長ホルモンの効果を媒介するホルモン）、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ、ＩＧＦ－１の受容体）および成長因子ならびにサイトカイン、例えばトランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ－α）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）およびＮｏｔｃｈ－１の発現レベルを検出した。１８Ｓ ｒＲＮＡを内部対照として使用した。成長因子およびサイトカインのレベルを、ＩＦおよび他の方法によっても評価した。
【0184】
結果を図２２に示した。サイクリンＤ－１の高い発現レベルが示され、活性化幹細胞が急速に増殖していることを示した。ＩＧＦ－１とその受容体ＩＧＦ－１Ｒの両方の発現は、活性化幹細胞の増殖が自己分泌機構によって調節され得ることを示した。活性化幹細胞がＴＧＦ－α、ＶＥＧＦおよびＮｏｔｃｈ－１を発現することも示された。ＩＦ結果はまた、活性化幹細胞における肝細胞成長因子（ＨＧＦ）および線維芽細胞成長因子９（ＦＧＦ９）の発現も示した。
【0185】
実施例９
腫瘍形成能試験
以下の方法を使用して活性化幹細胞の腫瘍形成能を評価した。５匹の１０週齢ヌードマウスに、１００万個の活性化幹細胞を皮下注射した。５匹の１０週齢ヌードマウスに、１００万個の活性化幹細胞を含む腎被膜注射を行った。注射後１日目（Ｄ１）に、ルシフェラーゼアッセイを行って、活性化幹細胞を原位置で追跡した。注射後３か月間、継続的な観察を行った。３か月の最後に、ヌードマウスを屠殺して、腫瘍形成効果を評価し、注射された活性化幹細胞を原位置で位置を確認した。病理学的方法を使用して、ヌードマウスの全身の組織および器官を調べた。結果は、活性化幹細胞が全身で非腫瘍原性であることを示した。
腫瘍形成能試験
以下の方法を使用して活性化幹細胞の腫瘍形成能を評価した。５匹の１０週齢ヌードマウスに、１００万個の活性化幹細胞を皮下注射した。５匹の１０週齢ヌードマウスに、１００万個の活性化幹細胞を含む腎被膜注射を行った。注射後１日目（Ｄ１）に、ルシフェラーゼアッセイを行って、活性化幹細胞を原位置で追跡した。注射後３か月間、継続的な観察を行った。３か月の最後に、ヌードマウスを屠殺して、腫瘍形成効果を評価し、注射された活性化幹細胞を原位置で位置を確認した。病理学的方法を使用して、ヌードマウスの全身の組織および器官を調べた。結果は、活性化幹細胞が全身で非腫瘍原性であることを示した。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
