知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-06-23
(45)【発行日】2023-07-03
(54)【発明の名称】部位特異的タウリン酸化に基づく診断法及び治療方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20230626BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20230626BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68 ZNA
C07K14/47
【請求項の数】
20
(21)【出願番号】P 2020561809
(86)(22)【出願日】2019-05-03
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-09-02
(86)【国際出願番号】 US2019030725
(87)【国際公開番号】W WO2019213612
(87)【国際公開日】2019-11-07
【審査請求日】2022-04-28
(31)【優先権主張番号】62/666,504
(32)【優先日】2018-05-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/666,509
(32)【優先日】2018-05-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】597025806
【氏名又は名称】ワシントン・ユニバーシティ
【氏名又は名称原語表記】Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
(74)【代理人】
【識別番号】100101454
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 卓二
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】ニコラ・バルテルミー
(72)【発明者】
【氏名】ランドール・ジョン・ベイトマン
(72)【発明者】
【氏名】エリック・マクデイド
【審査官】海野 佳子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／０５３７３９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１６－５３５２８３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５３５６９０（ＪＰ，Ａ）
【文献】NICOLAS R. BARTHELEMY; ET AL，TAU HYPERPHOSPHORYLATION ON T217 IN CEREBROSPINAL FLUID IS SPECIFICALLY ASSOCIATED TO AMYLOID-β PATHOLOGY，BIORXIV，2017年11月30日，P1-41，https://www.biorxiv.org/content/10.1101/226977v1
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
無症候性対象を分類する方法であって、以下、（ａ）前記対象から得られた単離タウ試料を用意し、（ｉ）Ｔ２１７及びＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１及びＴ２０５、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化を測定すること；ならびに
（ｂ）Ｔ２１７またはＴ１８１でのタウリン酸化が平均より少なくとも１．５σ高く、かつＴ２０５でのタウリン酸化が平均より１．５σ未満高い場合に、前記対象を、アルツハイマー病による軽度認知障害の発症までの年数に関して分類すること、ただし、σは、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団において測定された、Ｔ２１７及びＴ２０５、Ｔ１８１及びＴ２０５、またはＴ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、
を含む、前記方法。
【請求項2】
Ｔ２１７でのタウリン酸化が平均より少なくとも１．５σ高く、かつＴ２０５でのタウリン酸化が平均より１．５σ未満高い場合に、前記対象は、分類される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
（ｉ）Ｔ２１７でのタウリン酸化が平均より少なくとも１．７５σ高く、かつＴ２０５でのタウリン酸化が平均より１．７５σ未満高い、（ｉｉ）Ｔ２１７でのタウリン酸化が平均より少なくとも１．８σ高く、かつＴ２０５でのタウリン酸化が平均より１．８σ未満高い、または（ｉｉｉ）Ｔ２１７でのタウリン酸化が平均より少なくとも１．９σ高く、かつＴ２０５でのタウリン酸化が平均より１．９σ未満高い場合に、前記対象は、分類される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
Ｔ２１７でのタウリン酸化が平均より少なくとも２σ高く、かつＴ２０５でのタウリン酸化が平均より２σ未満高い場合に、前記対象は、分類される、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
Ｔ１８１でのタウリン酸化が平均より少なくとも１．５σ高く、かつＴ２０５でのタウリン酸化が平均より１．５σ未満高い場合に、前記対象は、分類される、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
（ｉ）Ｔ１８１でのタウリン酸化が平均より少なくとも１．７５σ高く、かつＴ２０５でのタウリン酸化が平均より１．７５σ未満高い、（ｉｉ）Ｔ１８１でのタウリン酸化が平均より少なくとも１．８σ高く、かつＴ２０５でのタウリン酸化が平均より１．８σ未満高い、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１でのタウリン酸化が平均より少なくとも１．９σ高く、かつＴ２０５でのタウリン酸化が平均より１．９σ未満高い場合に、前記対象は、分類される、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
Ｔ１８１でのタウリン酸化が平均より少なくとも２σ高く、かつＴ２０５でのタウリン酸化が平均より２σ未満高い場合に、前記対象は、分類される、請求項５に記載の方法。
【請求項8】
Ｔ１８１及びＴ２１７でのタウリン酸化が平均より少なくとも１．５σ高く、かつＴ２０５でのタウリン酸化が平均より１．５σ未満低い場合に、前記対象は、分類される、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
（ｉ）Ｔ１８１及びＴ２１７でのタウリン酸化が平均より少なくとも１．７５σ高く、かつＴ２０５でのタウリン酸化が平均より１．７５σ未満高い、（ｉｉ）Ｔ１８１及びＴ２１７でのタウリン酸化が平均より少なくとも１．８σ高く、かつＴ２０５でのタウリン酸化が平均より１．８σ未満高い、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１及びＴ２１７でのタウリン酸化が少なくとも１．９σであり、かつＴ２０５でのタウリン酸化が１．９σ未満である場合に、前記対象は、分類される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
Ｔ１８１及びＴ２１７でのタウリン酸化が平均より少なくとも２σ高く、かつＴ２０５でのタウリン酸化が平均より２σ未満高い場合に、前記対象は、分類される、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
前記対象は、１０～２５年のうちにアルツハイマー病による軽度認知障害を発症するとして分類される、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記対象は、１０～２０年のうちにアルツハイマー病による軽度認知障害を発症するとして分類される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
対象のために治療薬を選択する方法であって、該方法は、
（ａ）対象から得られた単離タウ試料を用意し、単離タウ試料中の、Ｔ２０５およびＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７、またはＴ２０５、Ｔ１８１、およびＴ２１７でのタウリン酸化を測定すること；ならびに
（ｂ）アミロイド沈着が増加するのを防ぐ治療薬を選択することであって、ここで対象から得られた単離タウ試料は、平均より少なくとも１．５σ高いＴ１８１でのタウリン酸化及び／または平均より少なくとも１．５σ高いＴ２１７でのタウリン酸化、および平均より１．５σ未満高いＴ２０５でのタウリン酸化を含有する、選択することを含み、
ただし、σは、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団において測定された残基でのタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。
【請求項14】
対象から得られた単離試料が、（ｉ）平均より少なくとも１．５σ高いＴ２１７でのタウリン酸化及び平均より少なくとも１．５σ低いＴ２０５でのタウリン酸化；（ｉｉ）平均より少なくとも１．５σ高いＴ１８１でのタウリン酸化及び平均より少なくとも１．５σ低いＴ２０５でのタウリン酸化；または（ｉｉｉ）平均より少なくとも１．５σ高いＴ１８１及びＴ２１７でのタウリン酸化及び平均より少なくとも１．５σ低いＴ２０５５でのタウリン酸化を含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
対象から得られた単離試料が、（ｉ）平均より少なくとも１．５σ高いＴ２１７及びＴ２０５でのタウリン酸化；（ｉｉ）平均より少なくとも１．５σ高いＴ１８１及びＴ２０５でのタウリン酸化；または（ｉｉｉ）平均より少なくとも１．５σ高いＴ１８１、Ｔ２０５及びＴ２１７でのタウリン酸化を含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
治療薬が、ガンマ－セクレターゼ阻害剤、ベータ－セクレターゼ阻害剤、抗Ａｂ抗体、抗タウ抗体、ｐ３８アルファＭＡＰＫ阻害剤、受動免疫療法、活性ワクチン、タウタンパク質凝集阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ活性化剤、ホスファターゼ阻害剤、ＡＰＰ産生の選択的阻害剤及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項17】
無症候性対象を治療する方法のための薬剤の製造における抗Ａβ抗体の使用であって、ここで抗Ａβ抗体の投与前に対象から得られた単離タウ試料中の残基Ｔ２１７及び／または残基Ｔ１８１でのタウリン酸化が平均より少なくとも１．５σ高い、使用。
【請求項18】
Ｔ１１１、Ｔ１５３、Ｔ２０５、Ｓ２０８、またはＴ２３１から選択される残基でのタウリン酸化が、抗Ａβ抗体の投与後に対象から得られた単離タウ試料において測定される、請求項１７に記載の使用。
【請求項19】
投与前に対象から得られた単離タウ試料中の残基Ｔ２０５でのタウリン酸化が、平均より少なくとも１．５σ高い、請求項１７または１８に記載の使用。
【請求項20】
投与前に対象から得られた単離タウ試料中の残基Ｔ２０５でのタウリン酸化が、平均より少なくとも１．５σ低い、請求項１７または１８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年５月３日出願の米国仮出願第６２／６６６，５０４号、及び２０１８年５月３日出願の米国仮出願第６２／６６６，５０９号の優先権を主張し、これらの開示は、本明細書中参照として援用される。
本出願は、２０１８年５月３日出願の米国仮出願第６２／６６６，５０４号、及び２０１８年５月３日出願の米国仮出願第６２／６６６，５０９号の優先権を主張し、これらの開示は、本明細書中参照として援用される。
【0002】
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所により授与されたＮＳ０６５６６７及びＮＳ０９５７７３の下、政府支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所により授与されたＮＳ０６５６６７及びＮＳ０９５７７３の下、政府支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【0003】
配列表の参照
本出願は、配列表を含み、この配列表は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを経由してＡＳＣＩＩフォーマットで提出されており、そのまま全体が本明細書により参照として援用される。ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年５月３日に作成されており、ファイル名は６２３２１７＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、ファイルサイズは２４ＫＢバイトである。
本出願は、配列表を含み、この配列表は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを経由してＡＳＣＩＩフォーマットで提出されており、そのまま全体が本明細書により参照として援用される。ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年５月３日に作成されており、ファイル名は６２３２１７＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、ファイルサイズは２４ＫＢバイトである。
【背景技術】
【0004】
微小管結合タンパク質タウ（ＭＡＰＴまたはタウ）は、ニューロンの形態及び生理機能において重要な役割を果たす。タウは、その全長タンパク質に６種の異なるアイソフォームが存在し、アセチル化、グリコシル化、及びリン酸化をはじめとする複数の翻訳後修飾を受けることが可能である。リン酸化は、軸索安定化におけるタウの正常機能を調節するのに重要であり、８０を超える異なる残基で生じる可能性がある。しかしながら、タウの過剰なリン酸化は、タウが凝集して細胞内不溶性対らせん状細線維（ＰＨＦ）及び神経原線維変化（ＮＦＴ）になる可能性を上昇させるようである。ＰＨＦ及びＮＦＴは、主に過剰リン酸化タウからなる。
【0005】
大脳皮質の細胞内神経原線維変化は、アルツハイマー病（ＡＤ）を決定付ける病理学的特徴であり、細胞外アミロイドβ（Ａβ）プラークの出現からかなり遅れて臨床症候が発症することと相関している。細胞外アミロイドβプラークは、症候が発症する前、最長２０年前から発達しはじめる。ＡＤでは、可溶性ｐ－タウ及び非リン酸化タウが脳脊髄液（ＣＳＦ）中で２倍に増加する。こうした変化は、タウ及びＮＦＴをＣＳＦに受動的に放出するニューロン死（神経変性）の効果を反映していると提唱されてきた。しかしながら、顕著なＮＦＴ病態及び神経変性を伴う他のタウオパチー（例えば、進行性核上麻痺、前頭側頭葉変性症－タウ）では、可溶性ｐ－タウ及びタウ総量のＣＳＦレベルは上昇しない。これらの知見は、Ａβが、ＡＤ独自のタウオパチーを招くプロセスの引き金を引いている可能性を示唆し、この考えは、細胞モデル及び動物モデルにより支持される。この概念は、ヒトにおいて、アミロイドプラークの存在下、可溶性タウの能動産生が増加することによりさらに支持される。
【0006】
タウは、ＡＤ病態の特徴を構成し、凝集型または溶解型で測定可能であるものの、この重要な神経タンパク質の翻訳後修飾が、ヒトにおいて、どのようにＮＦＴ及び神経変性の発生を招くのかについての理解には、重大な空白が残っている。例えば、タウとアミロイドβプラークとの関連は不明である。同様に、もしあるとしたら、どのような病態生理学的変化がＡＤの発症前及び臨床段階中にタウに生じるのかということも不明である。そのため、もし可能だとしたら、どの程度タウを利用して、ＡＤと関連した症候の発症前に対象を段階分けする及び治療決定を誘導することができるかも不明である。
【0007】
したがって、タウリン酸化を定量する改善された方法が、当該分野で依然として必要とされている。
【発明の概要】
【0008】
１つの態様において、本開示は、対象を、アルツハイマー病（ＡＤ）による軽度認知障害（ＭＣＩ）へのコンバージョンリスクが高いと診断する方法を包含する。本方法は、（ａ）対象から得られた単離タウ試料を用意し、単離タウ試料中の、Ｔ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基でのタウリン酸化を測定すること、及び任意選択でタウ総量を測定すること；ならびに（ｂ）測定されたリン酸化レベル（複数可）が、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団における平均から有意に逸脱している場合に、対象を、ＡＤによるＭＣＩへのコンバージョンリスクが高いと診断すること、を含む。Ｔ１８１、Ｔ２０５、及び／またはＴ２１７でのタウリン酸化測定を使用し、任意選択でタウ総量の測定を併用することに代えて、あるいは、これに加えて、測定されたリン酸化レベル（複数可）から計算された比、または測定されたリン酸化レベル（複数可）及びタウ総量から計算された比を使用する場合がある。測定されたリン酸化レベル（複数可）から計算された比は、ｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２０５、ｐ－Ｔ２１７とｐ－Ｔ２０５、またはｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２１７の間の比である場合がある。測定されたリン酸化レベル（複数可）及びタウ総量から計算された比は、ｐ－Ｔ１８１とタウ総量、ｐ－Ｔ２０５とタウ総量、またはｐ－Ｔ２１７とタウ総量の間の比である場合がある。比以外の数学演算も、使用する場合がある。
【0009】
別の態様において、本開示は、アルツハイマー病（ＡＤ）による軽度認知障害（ＭＣＩ）の発症前に対象を段階分けする方法を包含する。本方法は、（ａ）対象から得られた単離タウ試料を用意し、単離タウ試料中の、Ｔ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基でのタウリン酸化を測定すること、及び任意選択でタウ総量を測定すること；ならびに（ｂ）測定されたリン酸化レベル（複数可）が、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団における平均から有意に逸脱している場合に、対象を、ＡＤによるＭＣＩの発症までにある特定の年数が存在すると診断すること、を含む。Ｔ１８１、Ｔ２０５、及び／またはＴ２１７でのタウリン酸化測定を使用し、任意選択でタウ総量の測定を併用する代わりに、またはこれに加えて、測定されたリン酸化レベル（複数可）から計算された比、または測定されたリン酸化レベル（複数可）及びタウ総量から計算された比を使用する場合がある。測定されたリン酸化レベル（複数可）から計算された比は、ｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２０５、ｐ－Ｔ２１７とｐ－Ｔ２０５、またはｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２１７の間の比である場合がある。測定されたリン酸化レベル（複数可）及びタウ総量から計算された比は、ｐ－Ｔ１８１とタウ総量、ｐ－Ｔ２０５とタウ総量、またはｐ－Ｔ２１７とタウ総量の間の比である場合がある。比以外の数学演算も、使用する場合がある。
【0010】
別の態様において、本開示は、アルツハイマー病（ＡＤ）症候の発症後に対象を段階分けする方法を包含する。本方法は、（ａ）対象から得られた単離タウ試料を用意し、単離タウ試料中の、Ｔ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基でのタウリン酸化を測定すること、及び任意選択でタウ総量を測定すること；ならびに（ｂ）測定されたリン酸化レベル（複数可）が、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団における平均から有意に逸脱している場合に、対象を、ＡＤによるＭＣＩの発症からある特定の年数が経過していると診断すること、を含む。Ｔ１８１、Ｔ２０５、及び／またはＴ２１７でのタウリン酸化測定を使用し、任意選択でタウ総量の測定を併用する代わりに、またはこれに加えて、測定されたリン酸化レベル（複数可）から計算された比、または測定されたリン酸化レベル（複数可）及びタウ総量から計算された比を使用する場合がある。測定されたリン酸化レベル（複数可）から計算された比は、ｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２０５、ｐ－Ｔ２１７とｐ－Ｔ２０５、またはｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２１７の間の比である場合がある。測定されたリン酸化レベル（複数可）及びタウ総量から計算された比は、ｐ－Ｔ１８１とタウ総量、ｐ－Ｔ２０５とタウ総量、またはｐ－Ｔ２１７とタウ総量の間の比である場合がある。比以外の数学演算も、使用する場合がある。
【0011】
別の態様において、本開示は、治療を必要としている対象を治療するための方法を包含する。本方法は、（ａ）対象から得られた単離タウ試料を用意し、単離タウ試料中の、Ｔ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基でのタウリン酸化を測定すること、及び任意選択でタウ総量を測定すること；ならびに（ｂ）測定されたリン酸化レベル（複数可）が、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団における平均から有意に逸脱している場合に、対象に、医薬組成物を投与すること、を含む。Ｔ１８１、Ｔ２０５、及び／またはＴ２１７でのタウリン酸化測定を使用し、任意選択でタウ総量の測定を併用する代わりに、またはこれに加えて、測定されたリン酸化レベル（複数可）から計算された比、または測定されたリン酸化レベル（複数可）及びタウ総量から計算された比を使用する場合がある。測定されたリン酸化レベル（複数可）から計算された比は、ｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２０５、ｐ－Ｔ２１７とｐ－Ｔ２０５、またはｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２１７の間の比である場合がある。測定されたリン酸化レベル（複数可）及びタウ総量から計算された比は、ｐ－Ｔ１８１とタウ総量、ｐ－Ｔ２０５とタウ総量、またはｐ－Ｔ２１７とタウ総量の間の比である場合がある。比以外の数学演算も、使用する場合がある。
【0012】
別の態様において、本開示は、対象を臨床試験に登録するための方法を包含する。本方法は、（ａ）対象から得られた単離タウ試料を用意し、単離タウ試料中の、Ｔ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基でのタウリン酸化を測定すること、及び任意選択でタウ総量を測定すること；ならびに（ｂ）測定されたリン酸化レベル（複数可）が、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団における平均から有意に逸脱している場合に、対象を臨床試験に登録すること、を含む。Ｔ１８１、Ｔ２０５、及び／またはＴ２１７でのタウリン酸化測定を使用し、任意選択でタウ総量の測定を併用する代わりに、またはこれに加えて、測定されたリン酸化レベル（複数可）から計算された比、または測定されたリン酸化レベル（複数可）及びタウ総量から計算された比を使用する場合がある。測定されたリン酸化レベル（複数可）から計算された比は、ｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２０５、ｐ－Ｔ２１７とｐ－Ｔ２０５、またはｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２１７の間の比である場合がある。測定されたリン酸化レベル（複数可）及びタウ総量から計算された比は、ｐ－Ｔ１８１とタウ総量、ｐ－Ｔ２０５とタウ総量、またはｐ－Ｔ２１７とタウ総量の間の比である場合がある。比以外の数学演算も、使用する場合がある。
【0013】
本発明の他の態様及び反復を、以下でより詳しく記載する。
【0014】
本出願のファイルは、カラー写真を少なくとも１枚含む。カラー写真を含めた本特許出願公報の写しは、請求に応じて、必要な手数料の支払いがあり次第、特許庁から提供されることになる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】最長ヒトタウアイソフォーム（２Ｎ４Ｒ）及びタウ抗体のエピトープの図である。Ｎ末端、ミッドドメイン、ＭＴＢＲ、及びＣ末端は、このアイソフォームに関しては同定されており、他のタウアイソフォーム（例えば、２Ｎ３Ｒ、１Ｎ４Ｒ、１Ｎ３Ｒ、０Ｎ４Ｒ、及び０Ｎ３Ｒ）に関しては予測可能な形で変化する。
【図2】並列反応モニタリング実験の原理を示す図である。
【図3】１０３－１２６（０Ｎアイソフォーム）のモノリン酸化タウ配列のＰＲＭスクリーニングから得られたデータを示す。未修飾ペプチド１０３－１２６の近くで溶出し、Ｔ１１１（ａ）、Ｓ１１３（ｂ）、またはＴ１２３（ｃ）でのリン酸化が予想される一連の断片を含有する独自のＬＣ－ＭＳ／ＭＳパターンが同定された。各ｐ－タウペプチドに由来するｙイオン断片として仮定されるものを配列に下線で示す。３種の推定モノリン酸化ペプチドの同時溶出の可能性を解析した。リン酸基を持たないイオン断片ｙ１５は、残基Ｔ１１１でリン酸化したペプチド（ｙ１５（ａ））に特異的であり、リン酸基を持つｙ８断片は、残基Ｔ１２３でのｐ－タウペプチド（ｙ８（ｃ））に特異的である。対応する抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）が、検出限度よりは高いものの少量で検出され、このことは、２種の対応するモノリン酸化タウペプチドの同定を支持する。反対に、リン酸基を持つｙ１５断片、これはｐＴ１１１及びｐＳ１１３に共通し（ｙ１５（ａ＋ｂ））、ならびにリン酸基を持たないｙ８断片、これはｐＳ１１３及びｐＴ１２３に共通するが（ｙ８（ｂ＋ｃ））、これらは、はるかに量が多い。これらのシグナルの違いは、パターンの主要種として、残基Ｓ１１３でモノリン酸化したタウペプチド（ｂ）の存在を支持する。
【図4】６つのリン酸化可能部位を有するモノリン酸化タウ配列６８－１２６（１Ｎアイソフォーム）のＰＲＭスクリーニングから得られたデータを示す。３つのリン酸化部位は、図３で記載したとおり、残基１０３－１２６を有するペプチドに共通する（ｄ～ｆ）。６つのＬＣ－ＭＳパターンが同定された。リン酸基を有するＹ２８断片は、ｐＳ６８（ａ）またはｐＴ６９（ｂ）に共通するが、これは、２つのＬＣ－ＭＳパターン４及び５で見られた。このことは、２種のリン酸化ペプチドが存在することを実証するが、対応するＬＣ－ＭＳパターンは、イオン断片ｙ２９を検出してｐＳ６８とｐＴ６９の区別をつけないことには、厳密に帰属させることができない。ｐＴ７１（ｃ）及びｐＴ１１１（ｄ）に対応する特異的断片は、それぞれ、ＬＣ－ＭＳパターン６及び１に見られる。ｐＳ１１３（ｅ）及びｐＴ１２３（ｆ）の特異的断片（リン酸基を持つｙ１５）は、ＬＣ－ＭＳパターン２に見られる。このパターンは、リン酸基を持つｙ１０断片及び持たないｙ１０断片の両方を含んでおり、このことは、これら２種のリン酸化ペプチドが同時溶出することを示唆する。リン酸基を持たないｙ１０はリン酸基を持つｙ１０に比べて大きなシグナルであることから、ｐＴ１２３の度合いは、ｐＳ１１３より低いように思われる。ＬＣ－ＭＳパターン３は、非リン酸化ペプチドについて見られるとおり、パターン４のリン酸化ペプチド由来の少量の配座異性体またはＬＣアーチファクトに起因する。
【図5】モノリン酸化タウ配列４５－６７（１Ｎ及び２Ｎアイソフォーム）のＰＲＭスクリーニングから得られたデータを示す。配座異性体由来の強いシグナルは、非リン酸化ペプチドＬＣ－ＭＳパターンの前で同定された。したがって、リン酸化ペプチドの対応するＬＣ－ＭＳパターンもＬＣにより分離可能な配座異性体を有することが予想された。実際、ＰＲＭスキャン解釈の結果、この配列においてｐＴ５０（ｂ）が主要リン酸化部位として検出された（パターン２）。パターン１も同様な断片化のフィンガープリントを持つが、これは、ｐＴ５０の配座異性体に帰属された。ｐＳ４６（ａ）も、シグナルをｐＴ５０（ｂ）から区別することができるが、検出されなかったため、このリン酸化が存在しない、または少量であって、同様な非特異的断片を共有する他のリン酸化ペプチドと同時溶出した可能性を示唆している。ＬＣ－ＭＳパターン３の同時溶出したｙ９、リン酸基を持たないｙ１５、及びリン酸基を持つｙ１７は、残基Ｔ５２（ｃ）でのリン酸化と同定された。パターン４／６及びパターン５／７は、それぞれ、配座異性体の対とされた。すなわち、２種のリン酸化ペプチドは、分離不可能であった。これらのパターンで見られた断片は、Ｓ６１（ｅ）、Ｔ６３（ｆ）、及びＳ６４（ｇ）残基のうち１箇所でのリン酸化に一致した。ＭＳ／ＭＳ強度は、これらの部位を同定するには不十分であったが、これら３箇所のうち少なくとも２箇所は、この配列においてリン酸化されているようであった。さらに、リン酸基を持たないｙ９断片が少量、パターン７のショルダーで見られ、これは、残基Ｓ５６（ｄ）での少量のリン酸化に帰属することができた。
【図6】モノリン酸化タウ配列８８－１２６（２Ｎアイソフォーム）のＰＲＭスクリーニングから得られたデータを示す。この配列にはリン酸化可能な部位が６箇所あり、６つのＬＣ－ＭＳパターンが同定された。パターン１及びパターン２に見られる断片は、それぞれ、残基Ｔ１１１（ｄ）及び残基Ｓ１１３（ｅ）でのリン酸化ペプチドに一致した。残基Ｔ１２３（ｆ）でのリン酸化ペプチドによる特異的断片は見られなかった。パターン４及びパターン６は、残基Ｔ１０１（ｂ）または残基Ｔ１０２（ｃ）でのリン酸化に一致するｙ２９断片の低シグナルを含んでいたが、これらを区別することができる特異的断片は検出されなかった。パターン３及びパターン５は、パターン４及びパターン６に見られる断片を共有していたが、その量は少なく、Ｎ末端の残基Ｇ１０９でのリン酸化残基の位置にあった。このことは、さらなるリン酸化ペプチド、あり得るとしたら残基Ｔ９５（ａ）でのリン酸化ペプチド、あるいはパターン４及びパターン６に見られるペプチドの大量配座異性体の存在を示している可能性がある。
【図7】リン酸化可能な部位が４箇所あるモノリン酸化タウ配列６８－８７のＰＲＭスキャンを示す。３つのＬＣ－ＭＳパターンが検出された。パターン２及びパターン３は、残基Ｓ６８（ａ）または残基Ｔ６９（ｂ）でのリン酸化と一致した。パターン１は、Ｔ７１（ｃ）及びＴ７６（ｄ）でのリン酸化ペプチド２種が同時溶出して存在することに対応する断片を両方とも含んでいた。パターン１中のリン酸基を持つｙ１４ ＸＩＣと持たないｙ１４ ＸＩＣの比較は、ｐＴ７１（ｃ）の方がｐＴ７６（ｄ）より多いことを示す。
【図8A】脳ｐ－タウタンパク質のミッドドメイン及びＣ末端におけるリン酸化部位の検出を示す。
【図8B】脳ｐ－タウタンパク質のミッドドメイン及びＣ末端におけるリン酸化部位の検出を示す。
【図8C】脳ｐ－タウタンパク質のミッドドメイン及びＣ末端におけるリン酸化部位の検出を示す。
【図8D】脳ｐ－タウタンパク質のミッドドメイン及びＣ末端におけるリン酸化部位の検出を示す。
【図8E】脳ｐ－タウタンパク質のミッドドメイン及びＣ末端におけるリン酸化部位の検出を示す。
【図8F】脳ｐ－タウタンパク質のミッドドメイン及びＣ末端におけるリン酸化部位の検出を示す。
【図8G】脳ｐ－タウタンパク質のミッドドメイン及びＣ末端におけるリン酸化部位の検出を示す。
【図8H】脳ｐ－タウタンパク質のミッドドメイン及びＣ末端におけるリン酸化部位の検出を示す。
【図8I】脳ｐ－タウタンパク質のミッドドメイン及びＣ末端におけるリン酸化部位の検出を示す。
【図8J】脳ｐ－タウタンパク質のミッドドメイン及びＣ末端におけるリン酸化部位の検出を示す。
【図8K】脳ｐ－タウタンパク質のミッドドメイン及びＣ末端におけるリン酸化部位の検出を示す。
【図8L】脳ｐ－タウタンパク質のミッドドメイン及びＣ末端におけるリン酸化部位の検出を示す。
【図9A】タウ配列１９５－２０９（配列番号３８）及びタウ配列２１２－２２１（配列番号６４）由来のリン酸化ペプチドプロファイルが、可溶性脳画分、正常ＣＳＦ、及びＡＤのＣＳＦのタウタンパク質の間で可変であることを示す。脳可溶性タウ抽出物は、対応するＣＳＦタウレベルとおおよそ一致するように表示どおりに希釈されている。１９５－２０９でのリン酸化ペプチド：脳ライセートでは、２種のリン酸化ペプチドｐＳ１９９及びｐＳ２０２の同時溶出に対応する１つのシグナルが観察される。ＣＳＦでは、２つの追加シグナルが観察される。断片の分析により、左側のシグナルはｐＴ２０５に帰属させることができた。ＡＤのＣＳＦでは、この２つのシグナルは増大して、特異的断片の同定が可能になり、右側のシグナルがｐＳ２０８に帰属された。２１２－２２１でのリン酸化ペプチド：同様なＭＳ強度を持つ２つのシグナルは、ｐＴ２１７及びｐＳ２１４に対応するもので、これらは脳ライセートで同定される。ＣＳＦでは、ｐＴ２１７に対応するシグナルが最も強いが、ｐＳ２１４は検出限界に近く、脳抽出物との比較において、これらの相対存在量が劇的に変化していることを示す。ＡＤのＣＳＦでは、ｐＴ２１７は、特異的高リン酸化により顕著に増加している。
【図9B】タウ配列１９５－２０９（配列番号３８）及びタウ配列２１２－２２１（配列番号６４）由来のリン酸化ペプチドプロファイルが、可溶性脳画分、正常ＣＳＦ、及びＡＤのＣＳＦのタウタンパク質の間で可変であることを示す。脳可溶性タウ抽出物は、対応するＣＳＦタウレベルとおおよそ一致するように表示どおりに希釈されている。１９５－２０９でのリン酸化ペプチド：脳ライセートでは、２種のリン酸化ペプチドｐＳ１９９及びｐＳ２０２の同時溶出に対応する１つのシグナルが観察される。ＣＳＦでは、２つの追加シグナルが観察される。断片の分析により、左側のシグナルはｐＴ２０５に帰属させることができた。ＡＤのＣＳＦでは、この２つのシグナルは増大して、特異的断片の同定が可能になり、右側のシグナルがｐＳ２０８に帰属された。２１２－２２１でのリン酸化ペプチド：同様なＭＳ強度を持つ２つのシグナルは、ｐＴ２１７及びｐＳ２１４に対応するもので、これらは脳ライセートで同定される。ＣＳＦでは、ｐＴ２１７に対応するシグナルが最も強いが、ｐＳ２１４は検出限界に近く、脳抽出物との比較において、これらの相対存在量が劇的に変化していることを示す。ＡＤのＣＳＦでは、ｐＴ２１７は、特異的高リン酸化により顕著に増加している。
【図9C】タウ配列１９５－２０９（配列番号３８）及びタウ配列２１２－２２１（配列番号６４）由来のリン酸化ペプチドプロファイルが、可溶性脳画分、正常ＣＳＦ、及びＡＤのＣＳＦのタウタンパク質の間で可変であることを示す。脳可溶性タウ抽出物は、対応するＣＳＦタウレベルとおおよそ一致するように表示どおりに希釈されている。１９５－２０９でのリン酸化ペプチド：脳ライセートでは、２種のリン酸化ペプチドｐＳ１９９及びｐＳ２０２の同時溶出に対応する１つのシグナルが観察される。ＣＳＦでは、２つの追加シグナルが観察される。断片の分析により、左側のシグナルはｐＴ２０５に帰属させることができた。ＡＤのＣＳＦでは、この２つのシグナルは増大して、特異的断片の同定が可能になり、右側のシグナルがｐＳ２０８に帰属された。２１２－２２１でのリン酸化ペプチド：同様なＭＳ強度を持つ２つのシグナルは、ｐＴ２１７及びｐＳ２１４に対応するもので、これらは脳ライセートで同定される。ＣＳＦでは、ｐＴ２１７に対応するシグナルが最も強いが、ｐＳ２１４は検出限界に近く、脳抽出物との比較において、これらの相対存在量が劇的に変化していることを示す。ＡＤのＣＳＦでは、ｐＴ２１７は、特異的高リン酸化により顕著に増加している。
【図9D】タウ配列１９５－２０９（配列番号３８）及びタウ配列２１２－２２１（配列番号６４）由来のリン酸化ペプチドプロファイルが、可溶性脳画分、正常ＣＳＦ、及びＡＤのＣＳＦのタウタンパク質の間で可変であることを示す。脳可溶性タウ抽出物は、対応するＣＳＦタウレベルとおおよそ一致するように表示どおりに希釈されている。１９５－２０９でのリン酸化ペプチド：脳ライセートでは、２種のリン酸化ペプチドｐＳ１９９及びｐＳ２０２の同時溶出に対応する１つのシグナルが観察される。ＣＳＦでは、２つの追加シグナルが観察される。断片の分析により、左側のシグナルはｐＴ２０５に帰属させることができた。ＡＤのＣＳＦでは、この２つのシグナルは増大して、特異的断片の同定が可能になり、右側のシグナルがｐＳ２０８に帰属された。２１２－２２１でのリン酸化ペプチド：同様なＭＳ強度を持つ２つのシグナルは、ｐＴ２１７及びｐＳ２１４に対応するもので、これらは脳ライセートで同定される。ＣＳＦでは、ｐＴ２１７に対応するシグナルが最も強いが、ｐＳ２１４は検出限界に近く、脳抽出物との比較において、これらの相対存在量が劇的に変化していることを示す。ＡＤのＣＳＦでは、ｐＴ２１７は、特異的高リン酸化により顕著に増加している。
【図9E】タウ配列１９５－２０９（配列番号３８）及びタウ配列２１２－２２１（配列番号６４）由来のリン酸化ペプチドプロファイルが、可溶性脳画分、正常ＣＳＦ、及びＡＤのＣＳＦのタウタンパク質の間で可変であることを示す。脳可溶性タウ抽出物は、対応するＣＳＦタウレベルとおおよそ一致するように表示どおりに希釈されている。１９５－２０９でのリン酸化ペプチド：脳ライセートでは、２種のリン酸化ペプチドｐＳ１９９及びｐＳ２０２の同時溶出に対応する１つのシグナルが観察される。ＣＳＦでは、２つの追加シグナルが観察される。断片の分析により、左側のシグナルはｐＴ２０５に帰属させることができた。ＡＤのＣＳＦでは、この２つのシグナルは増大して、特異的断片の同定が可能になり、右側のシグナルがｐＳ２０８に帰属された。２１２－２２１でのリン酸化ペプチド：同様なＭＳ強度を持つ２つのシグナルは、ｐＴ２１７及びｐＳ２１４に対応するもので、これらは脳ライセートで同定される。ＣＳＦでは、ｐＴ２１７に対応するシグナルが最も強いが、ｐＳ２１４は検出限界に近く、脳抽出物との比較において、これらの相対存在量が劇的に変化していることを示す。ＡＤのＣＳＦでは、ｐＴ２１７は、特異的高リン酸化により顕著に増加している。
【図9F】タウ配列１９５－２０９（配列番号３８）及びタウ配列２１２－２２１（配列番号６４）由来のリン酸化ペプチドプロファイルが、可溶性脳画分、正常ＣＳＦ、及びＡＤのＣＳＦのタウタンパク質の間で可変であることを示す。脳可溶性タウ抽出物は、対応するＣＳＦタウレベルとおおよそ一致するように表示どおりに希釈されている。１９５－２０９でのリン酸化ペプチド：脳ライセートでは、２種のリン酸化ペプチドｐＳ１９９及びｐＳ２０２の同時溶出に対応する１つのシグナルが観察される。ＣＳＦでは、２つの追加シグナルが観察される。断片の分析により、左側のシグナルはｐＴ２０５に帰属させることができた。ＡＤのＣＳＦでは、この２つのシグナルは増大して、特異的断片の同定が可能になり、右側のシグナルがｐＳ２０８に帰属された。２１２－２２１でのリン酸化ペプチド：同様なＭＳ強度を持つ２つのシグナルは、ｐＴ２１７及びｐＳ２１４に対応するもので、これらは脳ライセートで同定される。ＣＳＦでは、ｐＴ２１７に対応するシグナルが最も強いが、ｐＳ２１４は検出限界に近く、脳抽出物との比較において、これらの相対存在量が劇的に変化していることを示す。ＡＤのＣＳＦでは、ｐＴ２１７は、特異的高リン酸化により顕著に増加している。
【図10A】ｐＴ１５３、ｐＴ１７５、及びｐＴ２３１リン酸化ペプチドが、ＣＳＦ中で同定されることを示す。ＡＱＵＡ内部標準シグナルは、ｐＴ１７５及びｐＴ２３１のために示してある。ｐＴ１５３の断片化パターンは、未修飾のものと同様である。
【図10B】ｐＴ１５３、ｐＴ１７５、及びｐＴ２３１リン酸化ペプチドが、ＣＳＦ中で同定されることを示す。ＡＱＵＡ内部標準シグナルは、ｐＴ１７５及びｐＴ２３１のために示してある。ｐＴ１５３の断片化パターンは、未修飾のものと同様である。
【図10C】ｐＴ１５３、ｐＴ１７５、及びｐＴ２３１リン酸化ペプチドが、ＣＳＦ中で同定されることを示す。ＡＱＵＡ内部標準シグナルは、ｐＴ１７５及びｐＴ２３１のために示してある。ｐＴ１５３の断片化パターンは、未修飾のものと同様である。
【図10D】ｐＴ１５３、ｐＴ１７５、及びｐＴ２３１リン酸化ペプチドが、ＣＳＦ中で同定されることを示す。ＡＱＵＡ内部標準シグナルは、ｐＴ１７５及びｐＴ２３１のために示してある。ｐＴ１５３の断片化パターンは、未修飾のものと同様である。
【図10E】ｐＴ１５３、ｐＴ１７５、及びｐＴ２３１リン酸化ペプチドが、ＣＳＦ中で同定されることを示す。ＡＱＵＡ内部標準シグナルは、ｐＴ１７５及びｐＴ２３１のために示してある。ｐＴ１５３の断片化パターンは、未修飾のものと同様である。
【図10F】ｐＴ１５３、ｐＴ１７５、及びｐＴ２３１リン酸化ペプチドが、ＣＳＦ中で同定されることを示す。ＡＱＵＡ内部標準シグナルは、ｐＴ１７５及びｐＴ２３１のために示してある。ｐＴ１５３の断片化パターンは、未修飾のものと同様である。
【図10G】ｐＴ１５３、ｐＴ１７５、及びｐＴ２３１リン酸化ペプチドが、ＣＳＦ中で同定されることを示す。ＡＱＵＡ内部標準シグナルは、ｐＴ１７５及びｐＴ２３１のために示してある。ｐＴ１５３の断片化パターンは、未修飾のものと同様である。
【図10H】ｐＴ１５３、ｐＴ１７５、及びｐＴ２３１リン酸化ペプチドが、ＣＳＦ中で同定されることを示す。ＡＱＵＡ内部標準シグナルは、ｐＴ１７５及びｐＴ２３１のために示してある。ｐＴ１５３の断片化パターンは、未修飾のものと同様である。
【図10I】ｐＴ１５３、ｐＴ１７５、及びｐＴ２３１リン酸化ペプチドが、ＣＳＦ中で同定されることを示す。ＡＱＵＡ内部標準シグナルは、ｐＴ１７５及びｐＴ２３１のために示してある。ｐＴ１５３の断片化パターンは、未修飾のものと同様である。
【図11】Ｓ１１３リン酸化と比べたＴ１１１でのリン酸化存在量が、脳中よりもＣＳＦ中で高いことを示す。脳及びＣＳＦの両方で、タウ配列１０３－１２６での全てのモノリン酸化ペプチドに共通するＭＳ／ＭＳ断片ｙ１８が検出される。ｐＳ１１３（ｂ）由来のｙ１５断片の相対存在量は、脳抽出物に比較して、ＣＳＦ中で顕著に少ない。逆に、ｐＴ１１１（ａ）由来のｙ１５断片は、ＣＳＦ中に豊富に存在し、ＡＤのＣＳＦタウレベルに一致するように希釈された脳可溶性抽出物中では検出不能である。
【図12】タウリン酸化の相対存在量が、生体抽出物に依存し、タンパク質配列にわたり変化することを示す。タウリン酸化存在量を、正常脳ライセート、正常ＣＳＦ、及びＡＤのＣＳＦから、ＨＪ８．５及びタウ１を用いた免疫捕獲により抽出してＭＳにより測定することにより比較したもの。円の面積は、リン酸化部位の存在量に比例する。赤色及び緑色は、それぞれ、基準にした脳可溶性画分プロファイル（青色）に対する増加及び減少を示す。タウは、ＣＳＦ中では、Ｃ末端でトランケートされており、このことは、リン酸化部位のＣ末端クラスターが検出されないことを説明づける。Ｔ２０５及びＳ２０８でのリン酸化は、ＣＳＦに特異的である（脳可溶性画分の赤字Ｘ－上段）。
【図13】タウリン酸化部位が、脳、正常ＣＳＦ、及びＡＤのＣＳＦで異なって修飾されることを示す。測定は、対応する非リン酸化部位に対するリン酸化シグナルの相対存在量である（ＨＪ８．５＋タウ１ ＩＰ－ＭＳ）。脳の結果は、ＣＳＦタウレベルに一致するように、５００×～８０００×倍で希釈したライセートで得たものである。Ｔ２０５及びＳ２０８でのリン酸化は、脳組織では検出不能である。Ｔ１１１でのリン酸化は、５００倍希釈ライセートでは検出不能であるが、１０倍希釈ライセートでは検出され、これは０．０２％の存在量に相当する。凡例：＊＊は、ｐ＝０．０１レベルでの有意性を示し、＊は、ｐ＝０．０５レベルでの有意性を示す。
【図14A】ＩＰ－ＭＳにより測定したリン酸化比に対する抗体効果を示す。タウＮ末端突出ドメイン（タウ１３もしくはＨＪ８．５）またはミッドドメイン（ＨＪ８．７、タウ１、もしくはタウ５）に対する抗体を用いて、脳ライセートプール、非ＡＤ（ｎ＝１）プール、及びＡＤのＣＳＦ（ｎ＝１）プールから、並行して免疫沈降させた。主要ＣＳＦ部位で測定したリン酸化比のレーダープロット（ｌｏｇ１０尺度）を、脳ライセート（図１４Ａ、左パネル）、非ＡＤのＣＳＦ（図１４Ａ、中央パネル）、及びＡＤのＣＳＦ（図１４Ａ、右パネル）について示す。ｐＴ１８１／Ｔ１８１、ｐＴ２３１／Ｔ２３１でのタウリン酸化比の測定は、試験した抗体にわたり一致している。ＰＳ１９９／Ｓ１９９は、他の抗体に比べてタウ１またはタウ１＋ＨＪ８．５を用いることにより減少する。
【図14B】ＩＰ－ＭＳにより測定したリン酸化比に対する抗体効果を示す。タウＮ末端突出ドメイン（タウ１３もしくはＨＪ８．５）またはミッドドメイン（ＨＪ８．７、タウ１、もしくはタウ５）に対する抗体を用いて、脳ライセートプール、非ＡＤ（ｎ＝１）プール、及びＡＤのＣＳＦ（ｎ＝１）プールから、並行して免疫沈降させた。タウ１またはタウ１＋ＨＪ８．５ＩＰによるｐＳ１９９の回収の低さは、試験した他の抗体に比べて、ｐＳ１９９／Ｓ１９９比の測定の過少評価をもたらす。タウ１３、ＨＪ８．５、及びＨＪ８．７抗体は、脳とＣＳＦの間にｐＳ１９９リン酸化比の有意な変化がないことを示す。脳に比べて、ＣＳＦのｐＳ２０２／Ｓ２０２低リン酸化
【図14C】ＩＰ－ＭＳにより測定したリン酸化比に対する抗体効果を示す。タウＮ末端突出ドメイン（タウ１３もしくはＨＪ８．５）またはミッドドメイン（ＨＪ８．７、タウ１、もしくはタウ５）に対する抗体を用いて、脳ライセートプール、非ＡＤ（ｎ＝１）プール、及びＡＤのＣＳＦ（ｎ＝１）プールから、並行して免疫沈降させた。脳に比べて、ＣＳＦのｐＳ２０２／Ｓ２０２低リン酸化（図１４Ｃ）及びｐＴ２１７／ｐＴ２１７高リン酸化（図１４Ｄ）は、ＩＰ－ＭＳに使用された抗体とは無関係に明らかである。図１４Ｂ～Ｄの凡例は、同一であり、図１４Ｃに示す－脳（青色）、非ＡＤのＣＳＦ（緑色）、及びＡＤのＣＳＦ（赤色）。
【図14D】ＩＰ－ＭＳにより測定したリン酸化比に対する抗体効果を示す。タウＮ末端突出ドメイン（タウ１３もしくはＨＪ８．５）またはミッドドメイン（ＨＪ８．７、タウ１、もしくはタウ５）に対する抗体を用いて、脳ライセートプール、非ＡＤ（ｎ＝１）プール、及びＡＤのＣＳＦ（ｎ＝１）プールから、並行して免疫沈降させた。脳に比べて、ＣＳＦのｐＳ２０２／Ｓ２０２低リン酸化（図１４Ｃ）及びｐＴ２１７／ｐＴ２１７高リン酸化（図１４Ｄ）は、ＩＰ－ＭＳに使用された抗体とは無関係に明らかである。
【図15】ＣＳＦのインキュベーションがタウでのリン酸化率測定に影響を及ぼさないことを示す。
【図16A】アミロイドプラークが、タウ高リン酸化と強く相関しているが、リン酸化の部位によって異なることを示す。被験者を、Ａβ ＰｉＢ－ＰＥＴ（ＳＵＶＲカットオフは１．２５）に基づきＡβ病態を有するとして分類した際のタウ総量（青色、ＡＵＣ＝０．６２）及び部位特異的リン酸化比の受信者動作特性であり、ｐ－Ｔ２１７（黄色線）は、Ａβ病態とのほぼ完璧な関連性を示し（ＡＵＣ＝０．９７）、続いてｐ－Ｔ１８１（ＡＵＣ＝０．８９）、そしてｐ－Ｔ２０５（ＡＵＣ＝０．７４）である。
【図16B】アミロイドプラークが、タウ高リン酸化と強く相関しているが、リン酸化の部位によって異なることを示す。ｐ－Ｔ２１７（図１６Ｂ）、ｐ－Ｔ１８１、（図１６Ｃ）、ｐ－Ｓ２０２（図１６Ｄ）、ｐ－Ｔ２０５（図１６Ｅ）の標準化（ｚスコア）リン酸化比、及びタウ総量（図１６Ｆ）レベルを、Ａβ ＰｉＢ－ＰＥＴ四分位（ｎ＝４５、４７、２８、３０）により示し、変異保持者についてはＡβ ＰｉＢ－ＰＥＴレベルが上昇しているリン酸化の部位特異的差異を強調してある：ｐ－Ｔ２１７及びｐ－Ｔ１８１は、増加が最大であり、最初にＡβ ＰｉＢ－ＰＥＴ量が増加し、それが遅くなって、Ａβ ＰｉＢ－ＰＥＴのレベルは最高を維持する。一方、ｐ－Ｔ２０５及びタウ総量は、増加し続けることを実証する。ｐ－Ｓ２０２については、Ａβ ＰｉＢ－ＰＥＴ四分位の最高値において最低値に比べて、リン酸化に有意な減少が存在する；＊＊＊－Ｐ値＜０．００１、＊＊－Ｐ値＜０．０１、ウィルコクソン二標本検定に基づく；正中線は、中央値を表し、上部及び下部のノッチ＝中央値＋／－１．５８＊四分位範囲／平方根（ｎ－観測値）、上部及び下部のヒゲ＝上部／下部ヒンジ以上／以下の最大観測値＋１．５８＊ＩＱＲ。
【図16C】アミロイドプラークが、タウ高リン酸化と強く相関しているが、リン酸化の部位によって異なることを示す。ｐ－Ｔ２１７（図１６Ｂ）、ｐ－Ｔ１８１、（図１６Ｃ）、ｐ－Ｓ２０２（図１６Ｄ）、ｐ－Ｔ２０５（図１６Ｅ）の標準化（ｚスコア）リン酸化比、及びタウ総量（図１６Ｆ）レベルを、Ａβ ＰｉＢ－ＰＥＴ四分位（ｎ＝４５、４７、２８、３０）により示し、変異保持者についてはＡβ ＰｉＢ－ＰＥＴレベルが上昇しているリン酸化の部位特異的差異を強調してある：ｐ－Ｔ２１７及びｐ－Ｔ１８１は、増加が最大であり、最初にＡβ ＰｉＢ－ＰＥＴ量が増加し、それが遅くなって、Ａβ ＰｉＢ－ＰＥＴのレベルは最高を維持する。一方、ｐ－Ｔ２０５及びタウ総量は、増加し続けることを実証する。ｐ－Ｓ２０２については、Ａβ ＰｉＢ－ＰＥＴ四分位の最高値において最低値に比べて、リン酸化に有意な減少が存在する；＊＊＊－Ｐ値＜０．００１、＊＊－Ｐ値＜０．０１、ウィルコクソン二標本検定に基づく；正中線は、中央値を表し、上部及び下部のノッチ＝中央値＋／－１．５８＊四分位範囲／平方根（ｎ－観測値）、上部及び下部のヒゲ＝上部／下部ヒンジ以上／以下の最大観測値＋１．５８＊ＩＱＲ。
【図16D】アミロイドプラークが、タウ高リン酸化と強く相関しているが、リン酸化の部位によって異なることを示す。ｐ－Ｔ２１７（図１６Ｂ）、ｐ－Ｔ１８１、（図１６Ｃ）、ｐ－Ｓ２０２（図１６Ｄ）、ｐ－Ｔ２０５（図１６Ｅ）の標準化（ｚスコア）リン酸化比、及びタウ総量（図１６Ｆ）レベルを、Ａβ ＰｉＢ－ＰＥＴ四分位（ｎ＝４５、４７、２８、３０）により示し、変異保持者についてはＡβ ＰｉＢ－ＰＥＴレベルが上昇しているリン酸化の部位特異的差異を強調してある：ｐ－Ｔ２１７及びｐ－Ｔ１８１は、増加が最大であり、最初にＡβ ＰｉＢ－ＰＥＴ量が増加し、それが遅くなって、Ａβ ＰｉＢ－ＰＥＴのレベルは最高を維持する。一方、ｐ－Ｔ２０５及びタウ総量は、増加し続けることを実証する。ｐ－Ｓ２０２については、Ａβ ＰｉＢ－ＰＥＴ四分位の最高値において最低値に比べて、リン酸化に有意な減少が存在する；＊＊＊－Ｐ値＜０．００１、＊＊－Ｐ値＜０．０１、ウィルコクソン二標本検定に基づく；正中線は、中央値を表し、上部及び下部のノッチ＝中央値＋／－１．５８＊四分位範囲／平方根（ｎ－観測値）、上部及び下部のヒゲ＝上部／下部ヒンジ以上／以下の最大観測値＋１．５８＊ＩＱＲ。
【図16E】アミロイドプラークが、タウ高リン酸化と強く相関しているが、リン酸化の部位によって異なることを示す。ｐ－Ｔ２１７（図１６Ｂ）、ｐ－Ｔ１８１、（図１６Ｃ）、ｐ－Ｓ２０２（図１６Ｄ）、ｐ－Ｔ２０５（図１６Ｅ）の標準化（ｚスコア）リン酸化比、及びタウ総量（図１６Ｆ）レベルを、Ａβ ＰｉＢ－ＰＥＴ四分位（ｎ＝４５、４７、２８、３０）により示し、変異保持者についてはＡβ ＰｉＢ－ＰＥＴレベルが上昇しているリン酸化の部位特異的差異を強調してある：ｐ－Ｔ２１７及びｐ－Ｔ１８１は、増加が最大であり、最初にＡβ ＰｉＢ－ＰＥＴ量が増加し、それが遅くなって、Ａβ ＰｉＢ－ＰＥＴのレベルは最高を維持する。一方、ｐ－Ｔ２０５及びタウ総量は、増加し続けることを実証する。ｐ－Ｓ２０２については、Ａβ ＰｉＢ－ＰＥＴ四分位の最高値において最低値に比べて、リン酸化に有意な減少が存在する；＊＊＊－Ｐ値＜０．００１、＊＊－Ｐ値＜０．０１、ウィルコクソン二標本検定に基づく；正中線は、中央値を表し、上部及び下部のノッチ＝中央値＋／－１．５８＊四分位範囲／平方根（ｎ－観測値）、上部及び下部のヒゲ＝上部／下部ヒンジ以上／以下の最大観測値＋１．５８＊ＩＱＲ。
【図16F】アミロイドプラークが、タウ高リン酸化と強く相関しているが、リン酸化の部位によって異なることを示す。ｐ－Ｔ２１７（図１６Ｂ）、ｐ－Ｔ１８１、（図１６Ｃ）、ｐ－Ｓ２０２（図１６Ｄ）、ｐ－Ｔ２０５（図１６Ｅ）の標準化（ｚスコア）リン酸化比、及びタウ総量（図１６Ｆ）レベルを、Ａβ ＰｉＢ－ＰＥＴ四分位（ｎ＝４５、４７、２８、３０）により示し、変異保持者についてはＡβ ＰｉＢ－ＰＥＴレベルが上昇しているリン酸化の部位特異的差異を強調してある：ｐ－Ｔ２１７及びｐ－Ｔ１８１は、増加が最大であり、最初にＡβ ＰｉＢ－ＰＥＴ量が増加し、それが遅くなって、Ａβ ＰｉＢ－ＰＥＴのレベルは最高を維持する。一方、ｐ－Ｔ２０５及びタウ総量は、増加し続けることを実証する。ｐ－Ｓ２０２については、Ａβ ＰｉＢ－ＰＥＴ四分位の最高値において最低値に比べて、リン酸化に有意な減少が存在する；＊＊＊－Ｐ値＜０．００１、＊＊－Ｐ値＜０．０１、ウィルコクソン二標本検定に基づく；正中線は、中央値を表し、上部及び下部のノッチ＝中央値＋／－１．５８＊四分位範囲／平方根（ｎ－観測値）、上部及び下部のヒゲ＝上部／下部ヒンジ以上／以下の最大観測値＋１．５８＊ＩＱＲ。
【図16G】アミロイドプラークが、タウ高リン酸化と強く相関しているが、リン酸化の部位によって異なることを示す。無症候性変異保持者（ｎ＝１３９）に関する皮質と皮質下の間のＡβ ＰｉＢ－ＰＥＴ ＳＵＶＲ及び部位特異的リン酸化の二変量相関である。色表示は、相関性が正の相関（黄色～赤色）及び負の相関（青色）であることを表す；全ての相関性は、偽陽性率を乗り越えて統計上有意な値を示し（ｐ＜０．０５）、上から下に向かって相関性が高い順に並べられている。
【図17A】異なるリン酸化タウ部位の長期的変化が、疾患特異的な段階でありＡＤが進行するにつれて反対方向に変化することを示す。（図１７Ａ）ｐ－Ｔ２１７、（図１７Ｂ）ｐ－Ｔ１８１、（図１７Ｃ）タウ総量、（図１７Ｄ）ｐ－Ｔ２０５、及び（図１７Ｅ）ｐ－Ｓ２０２のリン酸化比の個別、ｚ変換、長期的変化を、変異保持者（黒色＝無症候性変異保持者、（ｎ＝１５２）、赤色＝症候性変異保持者（７７））、及び非保持者（青色、（ｎ＝１４１））について、症候発生までの推定年数（ＥＹＯ）にわたり示す。垂直の破線は、予想される症候発症時点であり、緑色の線は、各ｐ－タウアイソフォームの変化率が、非保持者よりも変異保持者の方で大きくなった場合のモデル推定時間を表す。
【図17B】異なるリン酸化タウ部位の長期的変化が、疾患特異的な段階でありＡＤが進行するにつれて反対方向に変化することを示す。（図１７Ａ）ｐ－Ｔ２１７、（図１７Ｂ）ｐ－Ｔ１８１、（図１７Ｃ）タウ総量、（図１７Ｄ）ｐ－Ｔ２０５、及び（図１７Ｅ）ｐ－Ｓ２０２のリン酸化比の個別、ｚ変換、長期的変化を、変異保持者（黒色＝無症候性変異保持者、（ｎ＝１５２）、赤色＝症候性変異保持者（７７））、及び非保持者（青色、（ｎ＝１４１））について、症候発生までの推定年数（ＥＹＯ）にわたり示す。垂直の破線は、予想される症候発症時点であり、緑色の線は、各ｐ－タウアイソフォームの変化率が、非保持者よりも変異保持者の方で大きくなった場合のモデル推定時間を表す。
【図17C】異なるリン酸化タウ部位の長期的変化が、疾患特異的な段階でありＡＤが進行するにつれて反対方向に変化することを示す。（図１７Ａ）ｐ－Ｔ２１７、（図１７Ｂ）ｐ－Ｔ１８１、（図１７Ｃ）タウ総量、（図１７Ｄ）ｐ－Ｔ２０５、及び（図１７Ｅ）ｐ－Ｓ２０２のリン酸化比の個別、ｚ変換、長期的変化を、変異保持者（黒色＝無症候性変異保持者、（ｎ＝１５２）、赤色＝症候性変異保持者（７７））、及び非保持者（青色、（ｎ＝１４１））について、症候発生までの推定年数（ＥＹＯ）にわたり示す。垂直の破線は、予想される症候発症時点であり、緑色の線は、各ｐ－タウアイソフォームの変化率が、非保持者よりも変異保持者の方で大きくなった場合のモデル推定時間を表す。
【図17D】異なるリン酸化タウ部位の長期的変化が、疾患特異的な段階でありＡＤが進行するにつれて反対方向に変化することを示す。（図１７Ａ）ｐ－Ｔ２１７、（図１７Ｂ）ｐ－Ｔ１８１、（図１７Ｃ）タウ総量、（図１７Ｄ）ｐ－Ｔ２０５、及び（図１７Ｅ）ｐ－Ｓ２０２のリン酸化比の個別、ｚ変換、長期的変化を、変異保持者（黒色＝無症候性変異保持者、（ｎ＝１５２）、赤色＝症候性変異保持者（７７））、及び非保持者（青色、（ｎ＝１４１））について、症候発生までの推定年数（ＥＹＯ）にわたり示す。垂直の破線は、予想される症候発症時点であり、緑色の線は、各ｐ－タウアイソフォームの変化率が、非保持者よりも変異保持者の方で大きくなった場合のモデル推定時間を表す。
【図17E】異なるリン酸化タウ部位の長期的変化が、疾患特異的な段階でありＡＤが進行するにつれて反対方向に変化することを示す。（図１７Ａ）ｐ－Ｔ２１７、（図１７Ｂ）ｐ－Ｔ１８１、（図１７Ｃ）タウ総量、（図１７Ｄ）ｐ－Ｔ２０５、及び（図１７Ｅ）ｐ－Ｓ２０２のリン酸化比の個別、ｚ変換、長期的変化を、変異保持者（黒色＝無症候性変異保持者、（ｎ＝１５２）、赤色＝症候性変異保持者（７７））、及び非保持者（青色、（ｎ＝１４１））について、症候発生までの推定年数（ＥＹＯ）にわたり示す。垂直の破線は、予想される症候発症時点であり、緑色の線は、各ｐ－タウアイソフォームの変化率が、非保持者よりも変異保持者の方で大きくなった場合のモデル推定時間を表す。
【図17F】異なるリン酸化タウ部位の長期的変化が、疾患特異的な段階でありＡＤが進行するにつれて反対方向に変化することを示す。各リン酸化部位についてのモデル推定長期変化率であり、非保持者の変化率に対して標準化されており、アミロイドＰＥＴ（赤色）及び認知低下（黄色）と併せてＥＹＯにわたりプロットされている；塗潰し円は、各変数について非保持者に対して保持者の変化率が最初に異なった時点を表す。これは、ＡＤスペクトルの過程にわたるｐ－タウアイソフォームについての変化パターン及びアミロイドプラークの成長とｐ－Ｔ２１７における増加との間の密接な関連性を強調し、プラークは、－２１ＥＹＯで増加を開始し、ｐ－Ｔ２１７（黒色）の高リン酸化は－２１ＥＹＯで開始し、これら２つの部位でのリン酸化率の減少は、認知の低下（黄色線）を伴う。対照的に、ｐ－Ｔ２０５（紫色）は疾患の進行全体を通じて増加を続け、タウ総量レベル（灰色）は症候発症時点の近辺では増加率が上昇する。
【図18A】リン酸化タウ部位が、脳の代謝低下及び萎縮と異なって関連することを示す。無症候性変異保持者（ｎ＝１５２）における皮質及び皮質下の萎縮と部位特異的リン酸化比の間の二変量相関は、ｐ－Ｔ２０５及びｐ－Ｔ２１７のリン酸化の増加を実証し、ｐ－Ｔ１８１については、関連はそれより小さい。タウ総量レベルは、複数の皮質及び皮質下領域においてより多くの萎縮と関連する。
【図18B】リン酸化タウ部位が、脳の代謝低下及び萎縮と異なって関連することを示す。無症候性変異保持者（ｎ＝１４３）におけるＦＤＧ－ＰＥＴにより測定した皮質及び皮質下の脳代謝と部位特異的リン酸化比の間の二変量相関は、ｐ－Ｔ２０５のリン酸化の増加がほとんどの皮質及び皮質下領域の減少と関連するが、他のｐ－タウ部位またはタウについてはそうではないことを実証する。
【図19A】ｐ－Ｔ２１７、ｐ－Ｔ１８１、及びｐ－Ｔ２０５でのリン酸化の減少が、認知症及び認知低下と関連することを示す。変異保持者について、ｐ－タウアイソフォーム及びタウ総量の個別推定年次変化率（ｙ軸）は、全般的な認知機能の年次変化と相関していた。直線は、単純線形回帰を表し、網掛け部分は、９５％信頼区間を表す。各点は、測定間の個別レベル相関を表す。線形回帰は、認知症なし（黒色、ｎ＝４７）及び認知症あり（赤色、ｎ＝２５）に対して当てはめを行なった。ｐ－Ｔ２１７（図１９Ａ）、ｒ＝０．４３（ｐ＝０．０２）、ｐ－Ｔ１８１（図１９Ｂ）、ｒ＝０．７２（ｐ＜．００１）、及びｐ－Ｔ２０５（図１９Ｃ）、ｒ＝０．４１（ｐ＝０．０３）におけるリン酸化率の低下は、症候発症後の認知低下と関連した（赤色）。タウ総量については、認知との逆相関を示唆する傾向が存在したが（図１９Ｄ）、これは有意ではなかった。
【図19B】ｐ－Ｔ２１７、ｐ－Ｔ１８１、及びｐ－Ｔ２０５でのリン酸化の減少が、認知症及び認知低下と関連することを示す。変異保持者について、ｐ－タウアイソフォーム及びタウ総量の個別推定年次変化率（ｙ軸）は、全般的な認知機能の年次変化と相関していた。直線は、単純線形回帰を表し、網掛け部分は、９５％信頼区間を表す。各点は、測定間の個別レベル相関を表す。線形回帰は、認知症なし（黒色、ｎ＝４７）及び認知症あり（赤色、ｎ＝２５）に対して当てはめを行なった。ｐ－Ｔ２１７（図１９Ａ）、ｒ＝０．４３（ｐ＝０．０２）、ｐ－Ｔ１８１（図１９Ｂ）、ｒ＝０．７２（ｐ＜．００１）、及びｐ－Ｔ２０５（図１９Ｃ）、ｒ＝０．４１（ｐ＝０．０３）におけるリン酸化率の低下は、症候発症後の認知低下と関連した（赤色）。タウ総量については、認知との逆相関を示唆する傾向が存在したが（図１９Ｄ）、これは有意ではなかった。
【図19C】ｐ－Ｔ２１７、ｐ－Ｔ１８１、及びｐ－Ｔ２０５でのリン酸化の減少が、認知症及び認知低下と関連することを示す。変異保持者について、ｐ－タウアイソフォーム及びタウ総量の個別推定年次変化率（ｙ軸）は、全般的な認知機能の年次変化と相関していた。直線は、単純線形回帰を表し、網掛け部分は、９５％信頼区間を表す。各点は、測定間の個別レベル相関を表す。線形回帰は、認知症なし（黒色、ｎ＝４７）及び認知症あり（赤色、ｎ＝２５）に対して当てはめを行なった。ｐ－Ｔ２１７（図１９Ａ）、ｒ＝０．４３（ｐ＝０．０２）、ｐ－Ｔ１８１（図１９Ｂ）、ｒ＝０．７２（ｐ＜．００１）、及びｐ－Ｔ２０５（図１９Ｃ）、ｒ＝０．４１（ｐ＝０．０３）におけるリン酸化率の低下は、症候発症後の認知低下と関連した（赤色）。タウ総量については、認知との逆相関を示唆する傾向が存在したが（図１９Ｄ）、これは有意ではなかった。
【図19D】ｐ－Ｔ２１７、ｐ－Ｔ１８１、及びｐ－Ｔ２０５でのリン酸化の減少が、認知症及び認知低下と関連することを示す。変異保持者について、ｐ－タウアイソフォーム及びタウ総量の個別推定年次変化率（ｙ軸）は、全般的な認知機能の年次変化と相関していた。直線は、単純線形回帰を表し、網掛け部分は、９５％信頼区間を表す。各点は、測定間の個別レベル相関を表す。線形回帰は、認知症なし（黒色、ｎ＝４７）及び認知症あり（赤色、ｎ＝２５）に対して当てはめを行なった。ｐ－Ｔ２１７（図１９Ａ）、ｒ＝０．４３（ｐ＝０．０２）、ｐ－Ｔ１８１（図１９Ｂ）、ｒ＝０．７２（ｐ＜．００１）、及びｐ－Ｔ２０５（図１９Ｃ）、ｒ＝０．４１（ｐ＝０．０３）におけるリン酸化率の低下は、症候発症後の認知低下と関連した（赤色）。タウ総量については、認知との逆相関を示唆する傾向が存在したが（図１９Ｄ）、これは有意ではなかった。
【図20】タウＰＥＴが、ＤＩＡＤ変異保持者において症候発症近辺で増加することを示す。変異保持者（赤色、ｎ＝１２）及び非保持者（青色、ｎ＝９）についての皮質標準化単位値比（ＳＵＶＲ）の平均を、ｙ軸、これらの被験者の症候発症までの推定年数（ＥＹＯ）を、ｘ軸に取り、タウＰＥＴの時点に先行して長期的ＣＳＦ評価を行う。プロットは、変異保持者について、推定症候発症時点（ＥＹＯ＝０）まで、タウＰＥＴの上昇はほとんどないことを示す。この図は、ＡＶ－１４５１により検出される神経原線維変化（ＮＦＴ）病態が、複数の可溶性ホスホタウ部位の増加よりかなり遅れて生じることを示し、これらの可溶性タウマーカーが、ＮＦＴ病態のマーカーらしく見えるものの、どちらかといえば、ＡＤ病態に特徴的な過剰リン酸化不溶性タウ沈着の発生の素因である可能性を示唆する。
【図21A】タウ及びタウリン酸化部位における長期的変化が、優性遺伝性ＡＤにおける神経原線維タウ（タウＰＥＴ）と異なって関連することを示す。リン酸化及びタウ総量の個別推定変化率（ｙ軸）をタウ－ＰＥＴスキャンの時間（ｘ軸）に対して示す。垂直線は、１．２２というＳＵＶＲであり、ＮＦＴタウＰＥＴ（複数の皮質及び辺縁領域の合成）が、非保持者に比べて上昇したとみなされる時点の控えめな推定を表す。プロットは、可溶性タウ及びｐ－Ｔ２０５の増加が、凝集タウのレベルの高さと関連し、一方で、ｐ－Ｔ２１７及びｐ－Ｔ１８１でのリン酸化率は、凝集タウのレベルが上昇するにつれて低下することを示唆する。これらの知見は、部位が異なればタウ及びリン酸化のレベルの上昇も異なることを示し、場合によっては、過剰リン酸化凝集体の負荷がタウ病態の拡散とともに増大することで可溶性ｐ－タウが隔絶されることを示す可能性がある。これらは、凝集タウの増加とともに、可溶性タウレベルも上昇し、このレベルは、凝集タウ病態の負荷がより重くなることと併せて受動的または能動的放出のいずれかを表す可能性があることも示唆する。
【図21B】タウ及びタウリン酸化部位における長期的変化が、優性遺伝性ＡＤにおける神経原線維タウ（タウＰＥＴ）と異なって関連することを示す。リン酸化及びタウ総量の個別推定変化率（ｙ軸）をタウ－ＰＥＴスキャンの時間（ｘ軸）に対して示す。垂直線は、１．２２というＳＵＶＲであり、ＮＦＴタウＰＥＴ（複数の皮質及び辺縁領域の合成）が、非保持者に比べて上昇したとみなされる時点の控えめな推定を表す。プロットは、可溶性タウ及びｐ－Ｔ２０５の増加が、凝集タウのレベルの高さと関連し、一方で、ｐ－Ｔ２１７及びｐ－Ｔ１８１でのリン酸化率は、凝集タウのレベルが上昇するにつれて低下することを示唆する。これらの知見は、部位が異なればタウ及びリン酸化のレベルの上昇も異なることを示し、場合によっては、過剰リン酸化凝集体の負荷がタウ病態の拡散とともに増大することで可溶性ｐ－タウが隔絶されることを示す可能性がある。これらは、凝集タウの増加とともに、可溶性タウレベルも上昇し、このレベルは、凝集タウ病態の負荷がより重くなることと併せて受動的または能動的放出のいずれかを表す可能性があることも示唆する。
【図21C】タウ及びタウリン酸化部位における長期的変化が、優性遺伝性ＡＤにおける神経原線維タウ（タウＰＥＴ）と異なって関連することを示す。リン酸化及びタウ総量の個別推定変化率（ｙ軸）をタウ－ＰＥＴスキャンの時間（ｘ軸）に対して示す。垂直線は、１．２２というＳＵＶＲであり、ＮＦＴタウＰＥＴ（複数の皮質及び辺縁領域の合成）が、非保持者に比べて上昇したとみなされる時点の控えめな推定を表す。プロットは、可溶性タウ及びｐ－Ｔ２０５の増加が、凝集タウのレベルの高さと関連し、一方で、ｐ－Ｔ２１７及びｐ－Ｔ１８１でのリン酸化率は、凝集タウのレベルが上昇するにつれて低下することを示唆する。これらの知見は、部位が異なればタウ及びリン酸化のレベルの上昇も異なることを示し、場合によっては、過剰リン酸化凝集体の負荷がタウ病態の拡散とともに増大することで可溶性ｐ－タウが隔絶されることを示す可能性がある。これらは、凝集タウの増加とともに、可溶性タウレベルも上昇し、このレベルは、凝集タウ病態の負荷がより重くなることと併せて受動的または能動的放出のいずれかを表す可能性があることも示唆する。
【図21D】タウ及びタウリン酸化部位における長期的変化が、優性遺伝性ＡＤにおける神経原線維タウ（タウＰＥＴ）と異なって関連することを示す。リン酸化及びタウ総量の個別推定変化率（ｙ軸）をタウ－ＰＥＴスキャンの時間（ｘ軸）に対して示す。垂直線は、１．２２というＳＵＶＲであり、ＮＦＴタウＰＥＴ（複数の皮質及び辺縁領域の合成）が、非保持者に比べて上昇したとみなされる時点の控えめな推定を表す。プロットは、可溶性タウ及びｐ－Ｔ２０５の増加が、凝集タウのレベルの高さと関連し、一方で、ｐ－Ｔ２１７及びｐ－Ｔ１８１でのリン酸化率は、凝集タウのレベルが上昇するにつれて低下することを示唆する。これらの知見は、部位が異なればタウ及びリン酸化のレベルの上昇も異なることを示し、場合によっては、過剰リン酸化凝集体の負荷がタウ病態の拡散とともに増大することで可溶性ｐ－タウが隔絶されることを示す可能性がある。これらは、凝集タウの増加とともに、可溶性タウレベルも上昇し、このレベルは、凝集タウ病態の負荷がより重くなることと併せて受動的または能動的放出のいずれかを表す可能性があることも示唆する。
【図21E】タウ及びタウリン酸化部位における長期的変化が、優性遺伝性ＡＤにおける神経原線維タウ（タウＰＥＴ）と異なって関連することを示す。リン酸化及びタウ総量の個別推定変化率（ｙ軸）をタウ－ＰＥＴスキャンの時間（ｘ軸）に対して示す。垂直線は、１．２２というＳＵＶＲであり、ＮＦＴタウＰＥＴ（複数の皮質及び辺縁領域の合成）が、非保持者に比べて上昇したとみなされる時点の控えめな推定を表す。プロットは、可溶性タウ及びｐ－Ｔ２０５の増加が、凝集タウのレベルの高さと関連し、一方で、ｐ－Ｔ２１７及びｐ－Ｔ１８１でのリン酸化率は、凝集タウのレベルが上昇するにつれて低下することを示唆する。これらの知見は、部位が異なればタウ及びリン酸化のレベルの上昇も異なることを示し、場合によっては、過剰リン酸化凝集体の負荷がタウ病態の拡散とともに増大することで可溶性ｐ－タウが隔絶されることを示す可能性がある。これらは、凝集タウの増加とともに、可溶性タウレベルも上昇し、このレベルは、凝集タウ病態の負荷がより重くなることと併せて受動的または能動的放出のいずれかを表す可能性があることも示唆する。
【図22】アルツハイマー病において、タウ病態が各異なる段階を通じて発展することを示す図である。決定論的アルツハイマー病変異を有する被験者の群において異なる可溶性タウ種４種及び不溶性タウを測定することにより、本発明者らは、３５年の過程（ｘ軸）にわたり、疾患の段階及び他の測定可能なバイオマーカーに基づいて、タウ関連変化が進展（ｙ軸）及び異なっていくことを示す。Ａ．始まりは線維性アミロイド病態の発生であり、位置２１７（紫色）及び１８１（青色）でのリン酸化が増加し始める。Ｂ．神経機能障害（代謝変化に基づく）の増加とともに、位置２０５（緑色）でのリン酸化が可溶性タウ（橙色）と併せて増加し始める。Ｃ．最後に、神経変性（脳萎縮及び認知低下に基づく）の発症とともに、タウＰＥＴタングル（赤色）が発生し始める一方で、２１７及び１８１でのリン酸化は減少し始める。合わせると、これは、疾患の過程にわたる可溶性及び凝集タウの動的な多岐にわたるパターンならびにアミロイド病態との密接な関連性を強調する。
【図23A】ＣＳＦ中のリン酸化タウアイソフォームの定量を示す。ＣＳＦ中のタウリン酸化ペプチド及び対応する未修飾ペプチドの並列反応モニタリング（ＰＲＭ）分析から得られた抽出イオンクロマトグラムの合計である。ｍｉｃｒｏＬＣシステムを用いたＴ１８１モニタリングである。Ｃｐｓ＝１秒あたりのカウント数。
【図23B】ＣＳＦ中のリン酸化タウアイソフォームの定量を示す。ＣＳＦ中のタウリン酸化ペプチド及び対応する未修飾ペプチドの並列反応モニタリング（ＰＲＭ）分析から得られた抽出イオンクロマトグラムの合計である。ｎａｎｏＬＣシステムを用いたＳ１９９、Ｓ２０２、Ｔ２０５（枠内シグナルと同時溶出）、及びＴ２１７モニタリングである。内在シグナル（青色実線）、１５Ｎ標識ペプチド（赤色点線）、ＡＱＵＡペプチド（緑色点線）。Ｃｐｓ＝１秒あたりのカウント数。
【図23C】ＣＳＦ中のリン酸化タウアイソフォームの定量を示す。ＣＳＦ中のタウリン酸化ペプチド及び対応する未修飾ペプチドの並列反応モニタリング（ＰＲＭ）分析から得られた抽出イオンクロマトグラムの合計である。特異的なＰＲＭ遷移を示しており、ペプチド断片のＢｉｅｍａｎｎ命名法に従っており、これにより、ｐＳ１９９、ｐＳ２０２、またはｐＴ２０５を保有する３種の同時溶出したモノリン酸化ペプチドの同定が可能であった。Ｃｐｓ＝１秒あたりのカウント数。
【図24A】Ｔ２１７でのＣＳＦタウリン酸化がアミロイドーシス状態と関連することを示す。認知低下がないまたは軽度であるアミロイド陰性対照に比べて、アミロイドーシスを有する（ＰｉＢ－ＰＥＴ及びＣＳＦのＡβ４２／４０比が陽性）被験者において、Ｔ２１７リン酸化が有意に増加する。
【図24B】Ｔ２１７でのＣＳＦタウリン酸化がアミロイドーシス状態と関連することを示す。ＭＳによるＴ２１７、Ｔ１８１のリン酸化率及びＥＬＩＳＡによるＴ１８１リン酸化率を用いて、アミロイド陰性被験者とは分けてアミロイド陽性被験者を診断するためのＲＯＣ曲線。
【図24C】Ｔ２１７でのＣＳＦタウリン酸化がアミロイドーシス状態と関連することを示す。ｐＴ２１７／Ｔ２１７比の比較は、アミロイドーシスを有する被験者におけるＴ２１７での特異的リン酸化を実証する。
【図24D】Ｔ２１７でのＣＳＦタウリン酸化がアミロイドーシス状態と関連することを示す。図２４Ｄ～Ｅ：ＭＳにより測定したＴ２１７リン酸化とＣＳＦのＡβ４２／４０変化との比較、及びＰｉＢ－ＰＥＴにより測定したアミロイドプラーク沈着との比較。Ｔ２１７高リン酸化の程度は、ＣＳＦのＡβ４０に対するＡβ４２の減少と相関しない。５つの矛盾する事例（橙色三角、ＰｉＢ－ＰＥＴ及びＴ２１７高リン酸化は陽性だがＣＳＦのＡβは陰性）は全て、アミロイド状態を定義するために選択した閾値０．１２よりわずかに高かったことから、これらはＣＳＦアミロイドアッセイの感度不十分に起因する可能性が示唆される。
【図24E】Ｔ２１７でのＣＳＦタウリン酸化がアミロイドーシス状態と関連することを示す。図２４Ｄ～Ｅ：ＭＳにより測定したＴ２１７リン酸化とＣＳＦのＡβ４２／４０変化との比較、及びＰｉＢ－ＰＥＴにより測定したアミロイドプラーク沈着との比較。ＰｉＢ－ＰＥＴ負荷量（ＦＢＰ全皮質平均）は、アミロイド陽性被験者におけるＴ２１７リン酸化状態と相関している。ＰｉＢによるアミロイド陽性をアミロイド陰性と区別するカットオフ値は０．１８である。
【図25】Ｔ２１７でのＣＳＦタウリン酸化が、認知状態とは無関係であり、発症前ＡＤにおいて有意に修飾されていることを示す。左パネル：Ｔ２１７リン酸化と臨床的認知症重症度判定尺度（ＣＤＲ－ＳＢ）により測定した認知プロファイルの間に相関性は存在しない。右パネル：認知低下のない（ＣＤＲ－ＳＢ＝０）被験者のうち、アミロイド陽性群では、Ｔ２１７がすでに有意に高リン酸化している。
【発明を実施するための形態】
【0016】
中枢神経系においてタウタンパク質が凝集して神経原線維変化になることは、アルツハイマー病（ＡＤ）をはじめとするある特定の神経変性疾患の一因となっている。タウ不安定化の機構はまだ完全には解明されていないものの、タウ凝集においてタウタンパク質が過剰リン酸化されることがわかっている。本出願人らは、特定アミノ酸残基でのタウリン酸化を定量するある特定の方法を使用することで、ＡＤ過程を、その臨床上無症候段階から症候段階まで縦断して追跡することが可能であることを発見した。図２２は、本出願人らの方法により作成された、ＡＤによるＭＣＩの発症までの年数及びある特定の病態生理学的変化に関する、Ｔ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７で測定可能なタウリン酸化の動的パターンを示す。本開示は、特定アミノ酸残基でのタウリン酸化を定量する方法を用いることによる、アルツハイマー病による軽度認知障害の発症までの時間の予測、治療の決定の誘導、臨床試験の対象の選択、及びある特定の治療介入の臨床効果の評価を行う方法を包含する。本発明の他の態様及び反復を、以下でより詳しく説明する。
【0017】
Ｉ．定義
本発明を、より容易に理解できるように、ある特定の用語を最初に定義する。特に定義されない限り、本明細書中使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の実施形態が属する分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中記載されるものと同様な、修飾された、または等価な多くの方法及び材料が、過度の実験を行うことなく、本発明の実施形態の実施に使用可能であるが、好適な材料及び方法を、本明細書中記載する。本発明の実施形態の説明及び特許請求において、以下の用語を、以下に記載される定義に従って使用する。
本発明を、より容易に理解できるように、ある特定の用語を最初に定義する。特に定義されない限り、本明細書中使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の実施形態が属する分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中記載されるものと同様な、修飾された、または等価な多くの方法及び材料が、過度の実験を行うことなく、本発明の実施形態の実施に使用可能であるが、好適な材料及び方法を、本明細書中記載する。本発明の実施形態の説明及び特許請求において、以下の用語を、以下に記載される定義に従って使用する。
【0018】
「約」という用語は、本明細書中使用される場合、任意の定量可能な変数に関して起こり得る数量の変動、例えば、典型的な測定技法及び装置を通じて起こり得るものを示し、変数として、質量、体積、時間、距離、及び量が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、実世界で使用される固体及び液体の取り扱い手順を考慮すると、組成物の作成または方法の実行などに使用された製造、原料、または成分純度における違いによると思われるある特定の故意ではない誤り及び変動が存在する。「約」という用語は、これらの変動も包含し、変動は、最大で±５％になることが可能であるが、±４％、３％、２％、１％などであることも可能である。「約」という用語により修飾されているか否かに関わらず、特許請求の範囲は、記載される量の等価物を包含する。
【0019】
抗体は、本明細書中使用される場合、当該分野で理解されるとおりの完全抗体、すなわち、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなるものであることも、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子であることも可能であり、抗体様分子として、抗体断片、例えば、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体、Ｆｖ、及び一本鎖Ｆｖが挙げられるが、これらに限定されない。抗体という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、及びヒト化抗体も示す。様々な抗体系構築物及び断片の調製及び使用の技法は、当該分野で周知である。抗体の調製及びキャラクタライズの手段も、当該分野で周知である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８８を参照；これはそのまま全体が本明細書中参照として援用される）。
【0020】
本明細書中使用される場合、「アプタマー」という用語は、生化学活性、分子認識、または結合特性に関して有用な生物活性を有するポリヌクレオチドを示し、一般的にはＲＮＡまたはＤＮＡである。通常、アプタマーは、特定エピトープ（領域）で標的分子に結合するなどの分子活性を有する。ポリペプチドへの結合において特異的であるアプタマーは、合成されたもの、及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ進化法により同定されたものであってもよいことが、一般に受け入れられている。アプタマーの調製及びキャラクタライズの手段は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ進化法によるものも含めて、当該分野で周知である。例えば、ＵＳ７，９３９，３１３を参照、これはそのまま全体が本明細書中参照として援用される。
【0021】
「Ａβ」という用語は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれる巨大なタンパク質のカルボキシ末端の領域に由来するペプチドを示す。ＡＰＰをコードする遺伝子は、２１番染色体に存在する。毒性効果を有する可能性があるＡβの形態は多数存在する：Ａβペプチドは、典型的には、３７～４３アミノ酸配列長であるが、それらの全長を変化させるトランケーション及び修飾を受けている可能性がある。Ａβペプチドは、可溶性及び不溶性コンパートメント中で、単量体型、オリゴマー型、または凝集型で、細胞内または細胞外に見られる可能性があり、他のタンパク質または分子と複合体形成することができる。Ａβの有害または毒性効果は、上記のありとあらゆる形態、ならびに具体的に記載されない他のものに起因する可能性がある。例えば、２種のそのようなＡβアイソフォームとして、Ａβ４０及びＡβ４２が挙げられる；Ａβ４２アイソフォームは、特に原線維形成性または不溶性であり、疾患状態と関連する。「Ａβ」という用語は、典型的には、複数のＡβ種を示し、個々のＡβ種を区別しない。特定のＡβ種は、ペプチドの大きさにより同定され、例えば、Ａβ４２、Ａβ４０、Ａβ３８などである。
【0022】
本明細書中使用される場合、「Ａβ４２／Ａβ４０値」という用語は、対象から得られた試料中のＡβ４０濃度に対する、同試料中のＡβ４２濃度の比を意味する。
【0023】
「Ａβアミロイドーシス」は、臨床的には、脳中のＡβ沈着のエビデンスと定義される。Ａβアミロイドーシスを有することが臨床上確定した対象は、本明細書中、「アミロイド陽性」と称され、一方βアミロイドーシスを有さないことが臨床上確定した対象は、「アミロイド陰性」と称される。「Ａβアミロイドーシス」は、現行技法により検出可能になる前から存在するようである。それにもかかわらず、Ａβアミロイドーシスの指標として当該分野で認められているものが存在する。本開示の時点では、Ａβアミロイドーシスは、典型的には、アミロイドイメージング（例えば、ＰｉＢ ＰＥＴ、フロルベタピル、または当該分野で既知である他の撮像法）により、または脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＡβ４２減少もしくはＣＳＦのＡβ４２／４０比の低下により同定される。平均皮質結合能（ＭＣＢＰ）スコアが＞０．１８である［１１Ｃ］ＰＩＢ－ＰＥＴ画像法は、免疫沈降及び質量分析法（ＩＰ／ＭＳ）による脳脊髄液（ＣＳＦ）Ａβ４２濃度が約１ｎｇ／ｍｌであることから、Ａβアミロイドーシスの指標である。これらの値、または当該分野で既知である他の値を、単独でまたは組み合わせて用いることで、Ａβアミロイドーシスを臨床上確定させることができる。例えば、Ｋｌｕｎｋ Ｗ Ｅ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ５５（３） ２００４， Ｆａｇａｎ Ａ Ｍ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ， ２００６， ５９（３）， Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ｅｔ． ａｌ， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ， ２０１５， ７８（３）： ４３９－４５３、またはＪｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｕｃ． Ｍｅｄ．， ２０１３， ５４（７）： １０１１－１０１３を参照、これらはそれぞれ、そのまま全体が本明細書により参照として援用される。Ａβアミロイドーシスを有する対象は、症候性である場合もそうでない場合もあり、症候性の対象は、Ａβアミロイドーシスと関連した疾患についての臨床基準を満たす場合も満たさない場合もある。Ａβアミロイドーシスと関連した症候の限定ではなく例として、認知機能障害、行動変化、言語機能異常、情動制御不全、てんかん発作、認知症、及び神経系構造または機能の障害を挙げることができる。Ａβアミロイドーシスと関連した疾患として、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳アミロイド血管症、レビー小体認知症、及び封入体筋炎が挙げられるが、これらに限定されない。Ａβアミロイドーシスを有する対象は、Ａβアミロイドーシスと関連した疾患を発症するリスクが高い。
【0024】
「Ａβアミロイドーシスの臨床兆候」とは、当該分野で既知であるＡβ沈着の尺度を示す。Ａβアミロイドーシスの臨床兆候として、アミロイドイメージング（例えば、ＰｉＢ ＰＥＴ、フロルベタピル、または当該分野で既知である他の撮像法）により、または脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＡβ４２減少もしくはＡβ４２／４０比の低下により同定されるＡβ沈着を挙げることができるが、これらに限定されない。例えば、Ｋｌｕｎｋ ＷＥ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ５５（３） ２００４、及びＦａｇａｎ ＡＭ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ５９（３） ２００６を参照、これらはそれぞれ、そのまま全体が本明細書により参照として援用される。Ａβアミロイドーシスの臨床兆候として、Ａβ代謝測定、詳細にはＡβ４２代謝単独での測定または他のＡβ異型（例えばＡβ３７、Ａβ３８、Ａβ３９、Ａβ４０、及び／または全Ａβ）の代謝の測定との比較も挙げることができ、そのような測定は、米国特許シリアル番号第１４／３６６，８３１号、第１４／５２３，１４８号、及び第１４／７４７，４５３号に記載されるとおりであり、これらはそれぞれ、そのまま全体が本明細書により参照として援用される。さらなる方法が、Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ． Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ＆ Ｄｅｍｅｎｔｉａ ２００７ Ｖｏｌ．７， ｐｐ．１７０－１７９；ＭｃＫｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ＆ Ｄｅｍｅｎｔｉａ ２００７ Ｖｏｌ．７， ｐｐ．２６３－２６９；及びＳｐｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ． Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ＆ Ｄｅｍｅｎｔｉａ ２００７ Ｖｏｌ．７， ｐｐ．２８０－２９２に記載されており、これらはそれぞれ、そのまま全体が本明細書により参照として援用される。重要なことは、Ａβアミロイドーシスの臨床兆候を有する対象は、Ａβ沈着と関連した症候を有する場合も有さない場合もあることである。とはいえ、Ａβアミロイドーシスの臨床兆候を有する対象は、Ａβアミロイドーシスと関連した疾患を発症するリスクが高い。
【0025】
「アミロイドイメージングの候補」とは、アミロイドイメージングが臨床上正当である可能性がある個体であると臨床医により同定された対象を示す。限定ではなく例として、アミロイドイメージングの候補は、Ａβアミロイドーシスの臨床兆候を１つまたは複数、Ａβプラーク関連症候を１つまたは複数、あるいはＣＡＡ関連症候を１つまたは複数、あるいはそれらの組み合わせを持つ対象の場合がある。臨床医は、そのような対象の臨床ケアを指示するためにそのような対象に対してアミロイドイメージングを推奨する場合がある。別の限定ではなく例として、アミロイドイメージングの候補は、Ａβアミロイドーシスと関連した疾患の臨床試験の被験者候補（対照群または試験群いずれかの対象）の場合がある。
【0026】
「Ａβプラーク関連症候」または「ＣＡＡ関連症候」は、それぞれ、アミロイド線維と呼ばれる規則的に配列した線維性凝集体で構成されたアミロイドプラークまたはＣＡＡの形成により引き起こされた、あるいはそれに関連した任意の症候を示す。Ａβプラーク関連症候の例として、ニューロン変性、認知機能障害、記憶障害、行動変化、情動制御不全、てんかん発作、神経系構造または機能の障害、及びアルツハイマー病もしくはＣＡＡの発症または悪化のリスク上昇を挙げることができるが、これらに限定されない。ニューロン変性として、ニューロンの構造変化（毒性タンパク質、タンパク質凝集体などの細胞内蓄積などの分子変化、及び軸索もしくは樹状突起の形状または長さの変化、ミエリン鞘組成の変化、ミエリン鞘の喪失などマクロレベルでの変化を含む）、ニューロンの機能変化、ニューロンの機能消失、ニューロン死、またはそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。認知機能障害として、記憶、注意力、集中、言語、抽象的思考、創造力、実行機能、計画、及び整理の困難が挙げられるが、これらに限定されない。行動変化として、乱暴な動作または言葉、衝動性、抑制性の低下、無関心、開始の減少、人格の変化、アルコール、タバコ、または薬物の乱用、及び他の中毒関連挙動を挙げることができるが、これらに限定されない。情動制御不全として、抑うつ、不安、狂躁、易刺激性、及び感情失禁を挙げることができるが、これらに限定されない。てんかん発作として、全身性強直間代発作、複雑部分発作、及び非てんかん性、心因性てんかん発作を挙げることができるが、これらに限定されない。神経系構造または機能の障害として、水頭症、パーキンソニズム、睡眠障害、精神病、バランス及び協調の障害を挙げることができるが、これらに限定されない。この障害として、運動障害、例えば、不全単麻痺、不全片麻痺、四肢不全麻痺、運動失調、バリズム、及び振戦を挙げることができる。この障害として、嗅覚、触覚、味覚、視覚、及び聴覚を含む感覚の消失または機能障害も挙げることができる。そのうえさらに、この障害として、自律神経系障害、例えば、腸及び膀胱の機能障害、性機能障害、血圧及び体温の調節不全などを挙げることができる。最後に、この障害として、視床下部及び脳下垂体の機能障害に起因するホルモン性障害、例えば、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体ホルモン、卵胞刺激ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、プロラクチン、その他多数のホルモン及び修飾因子の欠乏ならびに調節不全を挙げることができる。
【0027】
本明細書中使用される場合、「対象」という用語は、哺乳類、好ましくはヒトを示す。哺乳類として、ヒト、霊長類、家畜、齧歯類、及びペットが挙げられるが、これらに限定されない。対象は、医療ケアまたは治療を待っている場合があり、医療ケアまたは治療を受けている場合があり、あるいは医療ケアまたは治療を受けたことがある場合がある。
【0028】
本明細書中使用される場合、「健康な対照群」、「正常群」、または「健康な」対照由来の試料という用語は、定性的または定量的検査結果に基づき、臨床医により、Ａβアミロイドーシス、またはＡβアミロイドーシスと関連した臨床疾患（アルツハイマー病を含むがこれに限定されない）を罹患していないと診断された、対象または対象の群を意味する。「正常」対象は、通常、評価対象の個体と年齢がほぼ同じであり、そのような対象として対象と同じ年齢の対象及び年齢差が５～１０年の範囲内の対象が挙げられるが、これらに限定されない。
【0029】
本明細書中使用される場合、「血液試料」という用語は、血液、好ましくは抹消（または循環）血液由来の生体試料を示す。血液試料は、全血、血漿、または血清であることが可能であるが、血漿が典型的には好適である。
【0030】
「アイソフォーム」という用語は、本明細書中使用される場合、同一タンパク質変異体の複数の異なる形態のいずれかを示し、タンパク質をコードするｍＲＮＡの選択的スプライシング、タンパク質の翻訳後修飾、タンパク質のタンパク質分解性プロセシング、遺伝的変異、及び体細胞組換えにより生じる。「アイソフォーム」及び「変異体」という用語は、同義で使用される。
【0031】
本明細書中特に記載がない限り、「タウタンパク質」または「タウ」という用語は、全長、トランケーション型、または翻訳後修飾型を問わず、全てのタウアイソフォームを包含する。ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、魚類、ウシ、カエル、ヤギ、及びニワトリをはじめとする多くの動物において、これらに限定されるものではないが、タウは、遺伝子ＭＡＰＴによりコードされる。ヒトでは、ＭＡＰＴのエクソン２、３、及び１０の選択的スプライシングにより発生する６種のタウアイソフォームが存在する。これらのアイソフォームは、長さが３５２～４４１アミノ酸の範囲にわたる。エクソン２及び３は、それぞれＮ末端における２９アミノ酸挿入断片（Ｎと称する）をコードし、全長ヒトタウアイソフォームは、両方の挿入断片を有する（２Ｎ）、１つの挿入断片を有する（１Ｎ）、または挿入断片を有さないことが可能である。全ての全長ヒトタウアイソフォームは、微小管結合ドメインの３回反復配列（Ｒと称する）も有する。Ｃ末端にエクソン１０を含む場合、エクソン１０によりコードされた４番目の微小管結合ドメインが含まれることになる。したがって、全長ヒトタウアイソフォームは、微小管結合ドメインの４回反復配列（エクソン１０が含まれる）を含む、または微小管結合ドメインの３回反復配列（エクソン１０が含まれない）を含むことが可能である。ヒトタウは、翻訳後修飾されている場合もされていない場合もある。例えば、タウが、リン酸化、ユビキチン化、グリコシル化、及び糖化される可能性があることは、当該分野で既知である。したがって、「ヒトタウ」という用語は、（２Ｎ、３Ｒ）、（２Ｎ、４Ｒ）、（１Ｎ、３Ｒ）、（１Ｎ、４Ｒ）、（０Ｎ、３Ｒ）、及び（０Ｎ、４Ｒ）アイソフォーム、それらのＮ及び／またはＣ末端トランケーション型種であるアイソフォーム、ならびに全ての翻訳後修飾型アイソフォームを包含する。タウをコードする遺伝子の選択的スプライシングは、他の動物でも同様に起こる。遺伝子がＭＡＰＴとして同定されていない動物では、相同体が当該分野で周知である方法により同定される可能性がある。
【0032】
脳におけるタウ沈着と関連した疾患は、「タウオパチー」と称することができる。当該分野で既知であるタウオパチーとして、進行性核上麻痺、ボクサー認知症、慢性外傷性脳障害、染色体１７に関連した前頭側頭葉型認知症及びパーキンソニズム、Ｌｙｔｉｃｏ－Ｂｏｄｉｇ病、グアムのパーキンソン認知症複合、タングル優位型認知症、神経節細胞膠種及び神経節細胞腫、髄膜血管腫症、亜急性硬化性全脳炎、鉛脳症、結節性硬化症、Ｈａｌｌｅｒｖｏｒｄｅｎ－Ｓｐａｔｚ病、リポフスチン沈着症、ピック病、大脳皮質基底核変性症、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、前頭側頭葉変性症、アルツハイマー病、及び前頭側頭葉型認知症が挙げられるが、これらに限定されない。
【0033】
「平均から有意に逸脱している」は、少なくとも１標準偏差分、好ましくは少なくとも１．３標準偏差分、より好ましくは少なくとも１．５標準偏差分、またはさらにより好ましくは少なくとも２標準偏差分、平均より高いまたは低い値を示す。
【0034】
「Ａβ及びタウ治療薬」という語句は、ＡβアミロイドーシスまたはＡＤを発症するリスクがある対象、Ａβアミロイドーシスを有すると診断された対象、タウオパチーを有すると診断された対象、またはＡＤを有すると診断された対象用であることを意図した、あるいはそのような対象で用いられる、任意の造影剤または治療薬を集合的に示す。
【0035】
ＩＩ．単離タウ試料でのタウ総量及びタウリン酸化の測定
本開示の方法は、対象から得られた単離タウ試料を用意すること、及び１つまたは複数のアミノ酸残基でタウリン酸化を測定し、及び任意選択でタウ総量を測定することを含む。
本開示の方法は、対象から得られた単離タウ試料を用意すること、及び１つまたは複数のアミノ酸残基でタウリン酸化を測定し、及び任意選択でタウ総量を測定することを含む。
【0036】
（ａ）単離タウ試料
単離タウ試料は、本明細書中使用される場合、タウを含む組成物を示し、タウは、対象から得られた血液または脳脊髄液（ＣＳＦ）から精製されたものである。対象は、哺乳類、好ましくはヒトである。ＣＳＦは、留置ＣＳＦカテーテルを用いてまたは用いずに腰椎穿刺により得ることができる。対象から同時に収集された複数の血液またはＣＳＦ試料をプールすることができる。血液は、静脈内カテーテルを用いてまたは用いずに静脈穿刺により、あるいは指先穿刺（またはそれらの等価物）により収集することができる。いったん収集したら、血液またはＣＳＦ試料は、当該分野で既知である方法により処理することができる（例えば、全細胞及び細胞片を除去するための遠心、分析検査前の検体を安定化及び保存するように設計された添加剤の使用など）。血液またはＣＳＦ試料は、直ちに使用される場合もあれば、無期限に凍結貯蔵される場合もある。
単離タウ試料は、本明細書中使用される場合、タウを含む組成物を示し、タウは、対象から得られた血液または脳脊髄液（ＣＳＦ）から精製されたものである。対象は、哺乳類、好ましくはヒトである。ＣＳＦは、留置ＣＳＦカテーテルを用いてまたは用いずに腰椎穿刺により得ることができる。対象から同時に収集された複数の血液またはＣＳＦ試料をプールすることができる。血液は、静脈内カテーテルを用いてまたは用いずに静脈穿刺により、あるいは指先穿刺（またはそれらの等価物）により収集することができる。いったん収集したら、血液またはＣＳＦ試料は、当該分野で既知である方法により処理することができる（例えば、全細胞及び細胞片を除去するための遠心、分析検査前の検体を安定化及び保存するように設計された添加剤の使用など）。血液またはＣＳＦ試料は、直ちに使用される場合もあれば、無期限に凍結貯蔵される場合もある。
【0037】
本開示の単離タウ試料では、タウは、血液またはＣＳＦから部分的または完全にのいずれかで精製されている。血液またはＣＳＦからタウを精製する方法は、当該分野で既知であり、そのような方法として、選択的沈殿、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及びアフィニティー精製が挙げられるが、これらに限定されない。適切な方法により、血液またはＣＳＦからリン酸化タウ及び非リン酸化タウの両方を濃縮する。
【0038】
例示の実施形態において、本開示の単離タウ試料は、アフィニティー精製により血液またはＣＳＦから精製されたタウを含む。アフィニティー精製は、固定リガンドに対する関心対象のタンパク質の特異的結合性質により、その関心対象のタンパク質を精製する方法を示す。典型的には、固定リガンドは、固体支持体、例えば、ビーズ、樹脂、組織培養プレートなどに結合させたリガンドである。適切なリガンドは、リン酸化タウ及び非リン酸化タウの両方と特異的に結合する。１つの例において、適切なリガンドは、タウのミッドドメイン内のエピトープと結合することができる。別の例において、適切なリガンドは、タウのＮ末端内、好ましくはタウの１番～３５番アミノ酸のエピトープと結合することができる。別の例において、適切なリガンドは、タウのＭＴＢＲ内のエピトープと結合することができる。別の例において、適切なリガンドは、タウのＣ末端内のエピトープと結合することができる。なおさらなる実施形態において、タウは、２種以上の固定リガンドを用いて血液またはＣＳＦからアフィニティー精製することができる。１つの例において、ある固定リガンドは、タウのＮ末端内のエピトープと結合し、別の固定リガンドは、タウのミッドドメイン内のエピトープと結合する。別の例において、ある固定リガンドは、タウのＭＴＢＲ内のエピトープと結合し、別の固定リガンドは、タウのミッドドメイン内のエピトープと結合する。別の例において、ある固定リガンドは、タウのＣ末端内のエピトープと結合し、別の固定リガンドは、タウのミッドドメイン内のエピトープと結合する。別の例において、ある固定リガンドは、タウのＣ末端内のエピトープと結合し、別の固定リガンドは、タウのＮ末端内のエピトープと結合する。別の例において、ある固定リガンドは、タウのＭＴＢＲ内のエピトープと結合し、別の固定リガンドは、タウのＮ末端内のエピトープと結合する。別の例において、ある固定リガンドは、タウのＭＴＢＲ内のエピトープと結合し、別の固定リガンドは、タウのＣ末端内のエピトープと結合する。上記実施形態のそれぞれにおいて、リガンドは、抗体またはアプタマーである場合がある。適切な抗体の限定ではなく例を、図１に示す。
【0039】
単離タウ試料は、直ちに使用される場合もあれば、当該分野で既知である方法により無期限に貯蔵される場合もある。
【0040】
（ｂ）１つまたは複数のアミノ酸残基でのタウリン酸化
タウ中の特定アミノ酸（すなわち「部位」）でのリン酸化は、リン酸化タウ（ｐ－タウ）アイソフォームをもたらす。本開示の方法は、タウの１つまたは複数の特定アミノ酸でのリン酸化について化学量論的に測定する手段を提供する。実施形態によっては、本明細書中の方法は、Ｔ１１１、Ｓ１１３、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７、及びＴ２３１から選択される１つまたは複数の残基でのタウリン酸化を測定することを含む。実施形態によっては、本明細書中の方法は、Ｔ１１１、Ｔ１８１、Ｔ２０５、Ｓ２０８、Ｓ２１４、Ｔ２１７、及びＴ２３１から選択される１つまたは複数の残基でのタウリン酸化を測定することを含む。他の実施形態において、本明細書中の方法は、Ｔ１８１、Ｓ２１４、及びＴ２１７から選択される１つまたは複数の残基でのタウリン酸化を測定することを含む。他の実施形態において、本明細書中の方法は、Ｔ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７から選択される１つまたは複数の残基でのタウリン酸化を測定することを含む。他の実施形態において、本明細書中の方法は、Ｓ１９９を含む１つまたは複数の残基でのタウリン酸化を測定することを含む。他の実施形態において、本明細書中の方法は、Ｓ２０２を含む１つまたは複数の残基でのタウリン酸化を測定することを含む。他の実施形態において、本明細書中の方法は、Ｓ１９９を含む１つまたは複数の残基でのタウリン酸化を測定することを含む。他の実施形態において、本明細書中の方法は、Ｔ１８１を含む１つまたは複数の残基でのタウリン酸化を測定することを含む。他の実施形態において、本明細書中の方法は、Ｔ２０５を含む１つまたは複数の残基でのタウリン酸化を測定することを含む。他の実施形態において、本明細書中の方法は、Ｔ２１７を含む１つまたは複数の残基でのタウリン酸化を測定することを含む。他の実施形態において、本明細書中の方法は、Ｔ１５３及びＴ１７５を含む２つ以上の残基でのタウリン酸化を測定することを含む。他の実施形態において、本明細書中の方法は、Ｔ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７から選択される２つ以上の残基でのタウリン酸化を測定することを含む。他の実施形態において、本明細書中の方法は、Ｔ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７を含む３つ以上の残基でのタウリン酸化を測定することを含む。
タウ中の特定アミノ酸（すなわち「部位」）でのリン酸化は、リン酸化タウ（ｐ－タウ）アイソフォームをもたらす。本開示の方法は、タウの１つまたは複数の特定アミノ酸でのリン酸化について化学量論的に測定する手段を提供する。実施形態によっては、本明細書中の方法は、Ｔ１１１、Ｓ１１３、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７、及びＴ２３１から選択される１つまたは複数の残基でのタウリン酸化を測定することを含む。実施形態によっては、本明細書中の方法は、Ｔ１１１、Ｔ１８１、Ｔ２０５、Ｓ２０８、Ｓ２１４、Ｔ２１７、及びＴ２３１から選択される１つまたは複数の残基でのタウリン酸化を測定することを含む。他の実施形態において、本明細書中の方法は、Ｔ１８１、Ｓ２１４、及びＴ２１７から選択される１つまたは複数の残基でのタウリン酸化を測定することを含む。他の実施形態において、本明細書中の方法は、Ｔ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７から選択される１つまたは複数の残基でのタウリン酸化を測定することを含む。他の実施形態において、本明細書中の方法は、Ｓ１９９を含む１つまたは複数の残基でのタウリン酸化を測定することを含む。他の実施形態において、本明細書中の方法は、Ｓ２０２を含む１つまたは複数の残基でのタウリン酸化を測定することを含む。他の実施形態において、本明細書中の方法は、Ｓ１９９を含む１つまたは複数の残基でのタウリン酸化を測定することを含む。他の実施形態において、本明細書中の方法は、Ｔ１８１を含む１つまたは複数の残基でのタウリン酸化を測定することを含む。他の実施形態において、本明細書中の方法は、Ｔ２０５を含む１つまたは複数の残基でのタウリン酸化を測定することを含む。他の実施形態において、本明細書中の方法は、Ｔ２１７を含む１つまたは複数の残基でのタウリン酸化を測定することを含む。他の実施形態において、本明細書中の方法は、Ｔ１５３及びＴ１７５を含む２つ以上の残基でのタウリン酸化を測定することを含む。他の実施形態において、本明細書中の方法は、Ｔ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７から選択される２つ以上の残基でのタウリン酸化を測定することを含む。他の実施形態において、本明細書中の方法は、Ｔ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７を含む３つ以上の残基でのタウリン酸化を測定することを含む。
【0041】
本出願人らは、タウリン酸化部位を発見するために、並列反応モニタリング（ＰＲＭ）を用いた高感度かつ特異的質量分析（ＭＳ）法を開発し、最初に単離タウタンパク質中のリン酸化部位の存在量を定量した。しかしながら、本開示は、タウの部位特異的リン酸化を定量評価する特定の方法のいずれか１つに限定されない。適切な方法は、単一アミノ酸のリン酸化状態においてのみ異なるタウアイソフォームを識別し、異なるアミノ酸でリン酸化されたｐ－タウアイソフォームを識別し、タウ総量の全体的な変化とは無関係に特定部位で生じるリン酸化の変化を定量することができなくてはならない。タウ総量の全体的な変化とは無関係に特定部位で生じるリン酸化の化学量論的変化を定量する３つのアプローチを、例において詳細に説明する：１）リン酸化ペプチド異性体間での相対比較、これは、同一配列を共有するリン酸化ペプチドそれぞれの相対存在量の推定に使用することができる；２）タウタンパク質由来の任意のペプチドを基準として用いてリン酸化ペプチドを正規化する；及び３）リン酸化ペプチド及び非リン酸化ペプチドそれぞれについて合成標識化内部基準を用い絶対定量化する、各リン酸化ペプチドの絶対定量値を、タウタンパク質由来の任意のペプチドについて得られた任意の絶対定量値で正規化する。これら３つのアプローチは全て、各部位での相対的リン酸化変化を比較するために内部正規化を利用する。当該分野で既知である他の方法も、利用可能である。
【0042】
例示の実施形態において、タウの部位特異的リン酸化は、高分解能質量分析により測定される。質量分析器の適切な種類は、当該分野で既知である。そのような質量分析器として、四重極型、飛行時間型、イオントラップ及びＯｒｂｉｔｒａｐ型、ならびに異なる種類の質量分析計を１つの構造に組み合わせたハイブリッド型質量分析器（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｔｒｉｂｒｉｄ（登録商標）質量分析器）が挙げられるが、これらに限定されない。ＭＳ分析の前に、単離タウ試料のさらなる加工処理を行う場合がある。例えば、タウをタンパク分解性消化に供する場合がある。適切なプロテアーゼとして、トリプシン、Ｌｙｓ－Ｎ、Ｌｙｓ－Ｃ、及びＡｒｇ－Ｎが挙げられるが、これらに限定されない。アフィニティー精製を用いて単離タウ試料を製造する場合、消化は、タウを固定リガンドから溶出させた後、またはタウが結合している間に、起こる場合がある。１つまたは複数のクリーンアップ工程後、消化されたタウペプチドは、高分解能質量分析器と連動した液体クロマトグラフィーシステムにより分離させることができる。クロマトグラフィーシステムは、所望のＬＣ－ＭＳパターンを精製するように定法実験により最適化することができる。部位特異的タウリン酸化を定量分析するのに多彩なＬＣ－ＭＳ技法を使用することができる。限定ではなく例として、選択反応モニタリング、並列反応モニタリング、選択イオンモニタリング、及びデータ非依存性解析が挙げられる。上記のとおり、部位特異的タウリン酸化の全ての定量評価は、タウ総量の全体的な変化を説明するものでなければならない。例示の実施形態において、実施例において概要の記載された質量分析プロトコルが使用される。
【0043】
（ｃ）タウ総量
「タウ総量」は、本明細書中使用される場合、所定の試料中の全タウアイソフォームを示す。タウは、可溶性及び不溶性区画中に、単量体型または凝集型で、秩序立ったまたは無秩序な構造で、細胞内または細胞外に見つけることができ、他のタンパク質または分子と複合体形成している場合がある。したがって、生体試料の原料（例えば、脳組織、ＣＳＦ、血液など）及び生体試料の任意の下流加工は、所定の試料中のタウアイソフォームの総量に影響を及ぼすことになる。
「タウ総量」は、本明細書中使用される場合、所定の試料中の全タウアイソフォームを示す。タウは、可溶性及び不溶性区画中に、単量体型または凝集型で、秩序立ったまたは無秩序な構造で、細胞内または細胞外に見つけることができ、他のタンパク質または分子と複合体形成している場合がある。したがって、生体試料の原料（例えば、脳組織、ＣＳＦ、血液など）及び生体試料の任意の下流加工は、所定の試料中のタウアイソフォームの総量に影響を及ぼすことになる。
【0044】
タウ総量は、非修飾タウペプチドの存在量をモニタリングすることにより測定可能である。各リン酸化タウ部位について、関心対象のリン酸化ペプチドと共通のアミノ酸配列を共有するタウペプチドを優先的に用いて、タウ総量レベルを測定することができるが、タウ配列由来の任意のペプチドが使用可能である。タウペプチド測定は、質量分析により行うことができ、測定の精度は、参照として標識化内部標準を用いることにより改善可能である。あるいは、タウ総量は、イムノアッセイまたは他のタウ濃度定量法により測定可能である。
【0045】
ＩＩＩ．ＡＤによるＭＣＩの発症前に対象を診断して対象のＡＤの段階を診断する方法
本開示の１つの態様は、対象を、アルツハイマー病による軽度認知障害へのコンバージョンリスクが高いと診断する方法、及び任意選択でＡＤによるＭＣＩの発症までの年数に関して対象の段階を診断するまたは分類する方法を包含する。アルツハイマー病（ＡＤ）による軽度認知障害（ＭＣＩ）は、ＡＤの症候性の認知症発症前段階を示す。この度合いの認知障害は、その年齢では正常ではないというもので、したがって、加齢に伴う記憶障害及び加齢に伴う認知低下などの構成要件に当てはまらない。ＡＤによるＭＣＩは、臨床診断であり、ＡＤによるＭＣＩの診断の臨床基準は、当該分野で既知である。例えば、Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ． Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ＆ Ｄｅｍｅｎｔｉａ， ２０１１， ７（３）：２７０－２７９を参照。対象の認知障害の度合いを客観的に評価するには、認知機能テストが最適である。ＭＣＩを有する対象の認知機能テストのスコアは、典型的には、文化的に適切な規範データにおいて（すなわち、利用可能な場合は、障害のあるドメイン（複数可）に関して）対象の年齢及び教育に一致する同等者についての平均より１～１．５標準偏差分低い。ＭＣＩの指摘は、臨床的認知症評価（ＣＤＲ）尺度で全般的評価が０．５であることにより支持される場合が多い。ＣＤＲは、認知症の症候の重篤度を定量するために用いられる数値尺度である。他の適切な認知機能テストも当該分野で既知である。認知障害の重篤度を評価する適切なテストが存在するものの、当該分野では、高い信頼度である年数でＡＤによるＭＣＩを発症する対象を同定するテストが必要とされている。
本開示の１つの態様は、対象を、アルツハイマー病による軽度認知障害へのコンバージョンリスクが高いと診断する方法、及び任意選択でＡＤによるＭＣＩの発症までの年数に関して対象の段階を診断するまたは分類する方法を包含する。アルツハイマー病（ＡＤ）による軽度認知障害（ＭＣＩ）は、ＡＤの症候性の認知症発症前段階を示す。この度合いの認知障害は、その年齢では正常ではないというもので、したがって、加齢に伴う記憶障害及び加齢に伴う認知低下などの構成要件に当てはまらない。ＡＤによるＭＣＩは、臨床診断であり、ＡＤによるＭＣＩの診断の臨床基準は、当該分野で既知である。例えば、Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ． Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ＆ Ｄｅｍｅｎｔｉａ， ２０１１， ７（３）：２７０－２７９を参照。対象の認知障害の度合いを客観的に評価するには、認知機能テストが最適である。ＭＣＩを有する対象の認知機能テストのスコアは、典型的には、文化的に適切な規範データにおいて（すなわち、利用可能な場合は、障害のあるドメイン（複数可）に関して）対象の年齢及び教育に一致する同等者についての平均より１～１．５標準偏差分低い。ＭＣＩの指摘は、臨床的認知症評価（ＣＤＲ）尺度で全般的評価が０．５であることにより支持される場合が多い。ＣＤＲは、認知症の症候の重篤度を定量するために用いられる数値尺度である。他の適切な認知機能テストも当該分野で既知である。認知障害の重篤度を評価する適切なテストが存在するものの、当該分野では、高い信頼度である年数でＡＤによるＭＣＩを発症する対象を同定するテストが必要とされている。
【0046】
１つの実施形態において、対象を、ＡＤによるＭＣＩへのコンバージョンリスクが高いと診断する方法は、（ａ）対象から得られた単離タウ試料を用意し、単離タウ試料中の、Ｔ１１１、Ｓ１１３、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７、及びＴ２３１から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基でのタウリン酸化を測定すること、及び任意選択でタウ総量を測定すること；ならびに（ｂ）測定されたリン酸化レベル（複数可）が、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団における平均から有意に逸脱している場合に、対象を、ＡＤによるＭＣＩへのコンバージョンリスクが高いと診断すること、を含む場合がある。別の実施形態において、対象を、ＡＤによるＭＣＩへのコンバージョンリスクが高いと診断する方法は、（ａ）対象から得られた第一及び第二単離タウ試料を用意し、各単離タウ試料中の、Ｔ１１１、Ｓ１１３、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７、及びＴ２３１から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基でのタウリン酸化を測定すること、及び任意選択でタウ総量を測定すること；（ｂ）測定された各残基での部位特異的リン酸化の変化、及び任意選択でタウ総量の変化を計算すること；ならびに（ｃ）計算された変化（複数可）が、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団における平均から有意に逸脱している場合に、対象を、ＡＤによるＭＣＩへのコンバージョンリスクが高いと診断すること、を含む場合がある。「平均から有意に逸脱している」は、平均より、少なくとも１標準偏差分、好ましくは少なくとも１．３標準偏差分、より好ましくは少なくとも１．５標準偏差分、またはさらにより好ましくは少なくとも２標準偏差分大きいまたは小さい値を示す（すなわち、それぞれ、１σ、１．３σ、１．５σ、または１．５σ、ただし、σは、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団で測定された正規分布により定義される標準偏差である）。閾値（例えば、平均より少なくとも１標準偏差分大きいまたは小さい値）を使用することに加えて、実施形態によっては、平均より高いまたは低い変化の程度を用いて、対象を診断する場合がある。単離タウ試料は、無症候性の場合もそうでない場合もある対象から得ることができる。「無症候性対象」は、ＡＤの兆候または症候をなにも示していない対象を示す。もっとも、対象は、ＡＤの兆候または症候（例えば、記憶喪失、物の置き忘れ、気分または挙動の変動など）を呈している場合もあるが、軽度認知障害の臨床診断に十分な認知または機能障害を示していない。さらなる実施形態において、対象は、優性遺伝性アルツハイマー病を引き起こすことが既知である遺伝子変異の１つを保有している場合がある。代替実施形態において、対象は、優性遺伝性アルツハイマー病を引き起こすことが既知である遺伝子変異の１つを保有していない場合がある。特定の家族性関連を持たないアルツハイマー病は、孤発性アルツハイマー病と称する。
【0047】
本開示の別の態様は、対象のアルツハイマー病の段階を診断する方法を包含する。様々な実施形態において、「ＡＤの段階」は、ＡＤによるＭＣＩの発症から経過した時間の長さ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月など。）と定義することができる。ＡＤの臨床診断基準は存在するものの、所定の対象について症候発症の時点についての臨床的設定は不明である、またはＭＣＩとＡＤのどちらであるか診断に疑問が残ることは一般的である。そのため、当該分野には、対象のＡＤの段階を客観的に診断する検査が必要とされている。
【0048】
１つの実施形態において、対象のＡＤの段階を診断する方法は、（ａ）対象から得られた単離タウ試料を用意し、単離タウ試料中の、Ｔ１１１、Ｓ１１３、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７、及びＴ２３１から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基でのタウリン酸化を測定すること、及び任意選択でタウ総量を測定すること；ならびに（ｂ）測定されたリン酸化レベル（複数可）が、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団における平均から有意に逸脱している場合に、対象のＡＤの段階を診断すること、を含む場合がある。別の実施形態において、ＡＤによるＭＣＩの発症前に対象を診断する方法は、（ａ）対象から得られた第一及び第二単離タウ試料を用意し、各単離タウ試料中の、Ｔ１１１、Ｓ１１３、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７、及びＴ２３１から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基でのタウリン酸化を測定すること、及び任意選択でタウ総量を測定すること；（ｂ）測定された各残基での部位特異的リン酸化の変化、及び任意選択でタウ総量の変化を計算すること；ならびに（ｃ）計算された変化（複数可）が、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団における平均から有意に逸脱している場合に、対象を、ＡＤによるＭＣＩの発症までにある特定の年数が存在すると診断すること、を含む場合がある。「平均から有意に逸脱している」は、平均より、少なくとも１標準偏差分、好ましくは少なくとも１．３標準偏差分、より好ましくは少なくとも１．５標準偏差分、またはさらにより好ましくは少なくとも２標準偏差分大きいまたは小さい値を示す（すなわち、それぞれ、１σ、１．３σ、１．５σ、または１．５σ、ただし、σは、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団で測定された正規分布により定義される標準偏差である）。閾値（例えば、平均より少なくとも１標準偏差分大きいまたは小さい値）を使用することに加えて、実施形態によっては、平均より高いまたは低い変化の程度を用いて、対象を診断する場合がある。単離タウ試料は、ＡＤによるＭＣＩ、認知症、もしくはＡＤと診断されている場合もそうでない場合もある対象から得ることができる。さらなる実施形態において、対象は、優性遺伝性アルツハイマー病を引き起こすことが既知である遺伝子変異の１つを保有している場合がある。代替実施形態において、対象は、優性遺伝性アルツハイマー病を引き起こすことが既知である遺伝子変異の１つを保有していない場合がある。
【0049】
部位特異的タウリン酸化の測定を使用し、任意選択でタウ総量の測定を併用することに代えて、またはこれに加えて、上記実施形態のいずれかにおいて、測定されたリン酸化レベル（複数可）から計算された比、または測定されたリン酸化レベル（複数可）及びタウ総量から計算された比が使用される場合がある。両方のアプローチを例で詳細に記載する。比以外の数学演算も使用される場合がある。例えば、例では、部位特異的タウリン酸化値が、様々な統計モデル（例えば、線形回帰、ＬＭＥ曲線、ＬＯＥＳＳ曲線など）で、他の既知のバイオマーカー（例えばＡＰＯＥε４状態、年齢、性別、認知テストスコア、機能テストスコアなど）と併せて使用される。測定値の選択及び数学演算の選択を最適化することで、方法の特異性を最大化することができる。例えば、診断精度は、ＲＯＣ曲線の曲線下面積により評価することができ、実施形態によっては、０．７以上というＲＯＣのＡＵＣ値を、閾値として設定する（例えば、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５など）。
【0050】
ヒトの脳アミロイドプラークは、アミロイド－ポジトロン断層撮影法（ＰＥＴ）を定法としてこれにより測定される。例えば、皮質Ａβプラークの１１Ｃ－ピッツバーグ化合物Ｂ（ＰｉＢ）ＰＥＴ画像法は、Ａβプラーク病態の検出に一般的に使用される。皮質ＰｉＢ－ＰＥＴの標準取込値比（ＳＵＶＲ）は、信頼性を持って有意な皮質Ａβプラークを同定し、対象をＰＩＢ陽性（ＳＵＶＲ≧１．２５）または陰性（ＳＵＶＲ＜１．２５）に分類するのに使用される。したがって、上記実施形態において、ＰＥＴ画像法により測定して脳アミロイドプラークがなかった対照集団は、皮質ＰｉＢ－ＰＥＴ ＳＵＶＲが１．２５未満である対照の集団を示すことができる。ＰｉＢ結合の他の値（例えば、平均皮質結合能）または皮質領域以外の関心対象領域の分析もまた、対象をＰＩＢ陽性または陰性に分類するのに使用可能である。他のＰＥＴ造影剤も使用可能である。
【0051】
ＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定して脳アミロイドプラークがなかった対照集団は、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ， ２０１５に記載されるとおり、質量分析により測定した場合にＡβ４２／４０測定が０．１２未満である対照の集団を示すことができる。
【0052】
例示の実施形態において、対象をＡＤによるＭＣＩへのコンバージョンリスクが高いと診断する、または対象のＡＤ段階を診断する方法は、（ａ）対象から得られた単離タウ試料を用意し、単離タウ試料中の、Ｔ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基でのタウリン酸化を測定すること、及び任意選択でタウ総量を測定すること；ならびに（ｂ）測定されたリン酸化レベル（複数可）が、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団における平均から有意に逸脱している場合に、対象をＡＤによるＭＣＩへのコンバージョンリスクが高いと診断する、またはＡＤによるＭＣＩの発症まである特定の年数が存在すると診断する、または対象のＡＤ段階を診断する、を含む場合がある。図２２は、単離タウ試料中のＴ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７で測定可能なタウリン酸化の動的パターンを、ＡＤによるＭＣＩの発症までの年数に関して示す。平均から有意に逸脱したＴ２１７でのリン酸化レベルが最初に生じるのは、ＡＤによるＭＣＩの発症の約２１年前である；平均から有意に逸脱したＴ１８１でのリン酸化が最初に生じるのは、ＡＤによるＭＣＩの発症の約１９年前である；平均から有意に逸脱したタウ総量の増加が最初に生じるのは、ＡＤによるＭＣＩの発症の約１７年前である；及び平均から有意に逸脱したＴ２０５でのリン酸化レベルが最初に生じるのは、ＡＤによるＭＣＩの発症の約１３年前である。症候の発症（例えば、ＡＤによるＭＣＩ）に際して、Ｔ２１７及びＴ１８１でのリン酸化レベルはプラトーであり、それから減少する。
【0053】
上記のとおり、追加の数学演算が、Ｔ１８１、Ｔ２０５、及び／またはＴ２１７でのリン酸化の測定値で行われる場合があり、そのような操作として、測定されたリン酸化レベル（複数可）間の比及び測定されたリン酸化レベル（複数可）とタウ総量の間の比が挙げられるが、これらに限定されない。測定されたリン酸化レベル（複数可）から計算された比は、ｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２０５、ｐ－Ｔ２１７とｐ－Ｔ２０５、またはｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２１７の間の比である場合がある。測定されたリン酸化レベル（複数可）とタウ総量から計算された比は、ｐ－Ｔ１８１とタウ総量、ｐ－Ｔ２０５とタウ総量、またはｐ－Ｔ２１７とタウ総量の間の比である場合がある。
【0054】
１つの例において、本開示の方法は、（ａ）対象から得られた単離タウ試料を用意し、（ｉ）Ｔ２１７及びＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１及びＴ２０５、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化を測定すること；ならびに（ｂ）Ｔ２１７及び／またはＴ１８１でのタウリン酸化が約１．５σ以上であり、かつＴ２０５でのタウリン酸化が約１．５σ以下である場合に、対象は、ＡＤによるＭＣＩの発症まであと約１０～約２５年、または約１０～約２０年であると診断することを含み、ただし、σは、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団で測定されたＴ２１７及びＴ２０５、Ｔ１８１及びＴ２０５、またはＴ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。様々な実施形態において、Ｔ２１７でのタウリン酸化及び／またはＴ１８１でのタウリン酸化は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２σ、または２σ超の場合がある。他の実施形態において、Ｔ２１７でのタウリン酸化及び／またはＴ１８１でのタウリン酸化は、約１．８５σ、約１．９σ、約１．９５σ、約２σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σ、または２．５σ超の場合がある。上記実施形態のそれぞれにおいて、Ｔ２０５でのタウリン酸化は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．５１σ、約１．５５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２．０σ、または２．０σ未満の場合がある。あるいは、Ｔ２０５でのタウリン酸化は、約２．０σ、約２．０５σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σ、または２．５σ未満の場合がある。さらなる例において、Ｔ２１７でのタウリン酸化及び／またはＴ１８１でのタウリン酸化は、約２σ以上の場合があり、かつＴ２０５でのタウリン酸化は、約２σ以下の場合がある。閾値（例えば、平均より少なくとも１標準偏差分高いまたは低い）の使用に加えて、実施形態によっては、対象を診断するのに、平均より大きいまたは小さい変化の程度を用いる場合がある。なおさらなる実施形態において、Ｔ２０５でのタウリン酸化及びＴ１８１及び／またはＴ２１７でのタウリン酸化の測定されたレベルを様々な数学演算に用いて、それぞれ自身に比べて予測力を改善することができる。例えば、比（複数可）を、測定されたリン酸化レベルから計算することができる。比以外の数学演算も使用可能である。
【0055】
別の例において、本開示の方法は、（ａ）対象から得られた単離タウ試料を用意し、タウ総量及び（ｉ）Ｔ２１７及びＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１及びＴ２０５、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化を測定すること；ならびに（ｂ）タウ総量に対するＴ２１７でのタウリン酸化の比及び／またはタウ総量に対するＴ１８１でのタウリン酸化の比が約１．５σ以上であり、かつタウ総量に対するＴ２０５でのタウリン酸化の比が約１．５σ以下である場合に、対象は、ＡＤによるＭＣＩの発症まであと約１０～約２５年、または約１０～約２０年であると診断することを含み、ただし、σは、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団で測定されたタウ総量ならびにＴ２１７及びＴ２０５、Ｔ１８１及びＴ２０５、またはＴ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。様々な実施形態において、タウ総量に対するＴ２１７でのタウリン酸化の比及び／またはタウ総量に対するＴ１８１でのタウリン酸化の比は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２σ、または２σ超である場合がある。他の実施形態において、タウ総量に対するＴ２１７でのタウリン酸化の比及び／またはタウ総量に対するＴ１８１でのタウリン酸化の比は、約１．８５σ、約１．９σ、約１．９５σ、約２σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σ、または２．５σ超である場合がある。上記実施形態のそれぞれにおいて、タウ総量に対するＴ２０５でのタウリン酸化の比は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５０σ、約１．５５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２．０σ、または２σ未満である場合がある。あるいは、タウ総量に対するＴ２０５でのタウリン酸化の比は、約２．０σ、約２．０５σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σ、または２．５σ未満である場合がある。さらなる例において、タウ総量に対するＴ２１７でのタウリン酸化の比及び／またはタウ総量に対するＴ１８１でのタウリン酸化の比は、約２σ以上である場合があり、かつタウ総量に対するＴ２０５でのタウリン酸化の比は、約２σ以下である場合がある。閾値（例えば、平均より少なくとも１標準偏差分高いまたは低い）の使用に加えて、実施形態によっては、対象を診断するのに、平均より大きいまたは小さい変化の程度を用いる場合がある。
【0056】
別の例において、本開示の方法は、（ａ）対象から得られた単離タウ試料を用意し、（ｉ）Ｔ１８１及びＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ２１７及びＴ２０５、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２１７、及びＴ２０５でのタウリン酸化を測定すること；ならびに（ｂ）（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化が約１．５σ以上である場合に、対象は、ＡＤによるＭＣＩの発症まであと約１５年以下、または約１０年以下であると診断することを含み、ただし、σは、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団で測定されたＴ２１７及びＴ２０５、Ｔ１８１及びＴ２０５、またはＴ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。様々な実施形態において、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２σ、または２σ超である場合がある。他の実施形態において、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化は、約１．８５σ、約１．９σ、約１．９５σ、約２σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σ、または２．５σ超である場合がある。さらなる例において、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化は、約２σ以上の場合がある。閾値（例えば、平均より少なくとも１標準偏差分高いまたは低い）の使用に加えて、実施形態によっては、対象を診断するのに、平均より大きいまたは小さい変化の程度を用いる場合がある。なおさらなる実施形態において、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化の測定されたレベルを様々な数学演算に用いて、それぞれ自身に比べて予測力を改善することができる。例えば、比（複数可）を、測定されたリン酸化レベルから計算することができる。比以外の数学演算も使用可能である。
【0057】
別の例において、本開示の方法は、（ａ）対象から得られた単離タウ試料を用意し、タウ総量及び（ｉ）Ｔ１８１及びＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ２１７及びＴ２０５、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２１７、及びＴ２０５でのタウリン酸化を測定すること；ならびに（ｂ）タウ総量に対する（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化の比が約１．５σ以上である場合に、対象は、ＡＤによるＭＣＩの発症まであと約１５年以下、または約１０年以下であると診断することを含み、ただし、σは、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団で測定されたタウ総量ならびにＴ２１７及びＴ２０５、Ｔ１８１及びＴ２０５、またはＴ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。様々な実施形態において、タウ総量に対する（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化の比は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２σ、または２σ超である場合がある。他の実施形態において、タウ総量に対する（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化の比は、約１．８５σ、約１．９σ、約１．９５σ、約２σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σ、または２．５σ超である場合がある。さらなる例において、タウ総量に対する（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化の比は、約２σ以上である場合がある。閾値（例えば、平均より少なくとも１標準偏差分高いまたは低い）の使用に加えて、実施形態によっては、対象を診断するのに、平均より大きいまたは小さい変化の程度を用いる場合がある。
【0058】
別の例において、本開示の方法は、（ａ）対象から得られた第一及び第二単離タウ試料、を用意し、「第一」及び「第二」は、試料が収集された順序を示し、（ｉ）Ｔ１８１及びＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ２１７及びＴ２０５、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２１７、及びＴ２０５でのタウリン酸化を測定すること；（ｂ）測定された各残基での部位特異的リン酸化の変化、及び任意選択でタウ総量の変化を計算すること；ならびに（ｃ）Ｔ１８１及び／またはＴ２１７でのリン酸化レベルが低下または一定を保ち、かつＴ２０５でのリン酸化レベル及び任意選択でタウ総量が上昇した場合に、対象のＡＤの段階を診断すること、を含む。第一及び第二単離タウ試料は、日付、週、または月をまたいで収集される場合がある。典型的には、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化も、両方の試料について約１．５σ以上となり、ただし、σは、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団で測定されたＴ２１７及びＴ２０５、Ｔ１８１及びＴ２０５、またはＴ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。なおさらなる実施形態において、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化の測定されたレベルを様々な数学演算に用いて、それぞれ自身に比べて予測力を改善することができる。例えば、比（複数可）を、測定されたリン酸化レベルから計算することができる。比以外の数学演算も使用可能である。
【0059】
別の例において、本開示の方法は、（ａ）対象から得られた第一及び第二単離タウ試料を用意し、「第一」及び「第二」は、試料が収集された順序を示し、タウ総量及び（ｉ）Ｔ１８１及びＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ２１７及びＴ２０５、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２１７、及びＴ２０５でのタウリン酸化を測定すること；（ｂ）測定された各残基での部位特異的リン酸化の変化、及びタウ総量の変化を計算すること；ならびに（ｃ）Ｔ１８１及び／またはＴ２１７でのリン酸化レベルが低下または一定を保ち、Ｔ２０５でのリン酸化レベルが低下または一定を保ち、かつタウ総量が増加している場合に、対象のＡＤの段階を診断すること、を含む。第一及び第二単離タウ試料は、日付、週、または月をまたいで収集される場合がある。典型的には、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化も、両方の試料について約１．５σ以上となり、ただし、σは、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団で測定されたＴ２１７及びＴ２０５、Ｔ１８１及びＴ２０５、またはＴ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。なおさらなる実施形態において、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化の測定されたレベルを様々な数学演算に用いて、それぞれ自身に比べて予測力を改善することができる。例えば、比（複数可）を、測定されたリン酸化レベルから計算することができる。比以外の数学演算も使用可能である。
【0060】
タウリン酸化及びタウ総量を測定する方法は、第ＩＩ章に記載されており、参照することでこの章に援用される。例えば、実施例５～９に詳細を記載するプロトコルを使用すると、Ｔ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化は、ＣＳＦから精製された単離タウ試料で測定した場合、ＰＥＴ画像法により測定して脳アミロイドプラークがなかった対照集団において、ｐタウ／タウ比のパーセンテージで示して、それぞれ、２１．７±２．３、０．３４±０．１３、及び１．２±０．６６である（表２、変異非保持者の欄を参照）。したがって、変異非保持者で見られる平均より標準偏差の２倍高い（すなわち２σ）とは、ｐ－Ｔ１８１／Ｔ１８１、ｐ－Ｔ２０５／Ｔ２０５、及びｐ－Ｔ２１７／Ｔ２１７でそれぞれ、４３．４、０．６８、及び２．４である。しかしながら、当業者ならわかるだろうが、絶対値は、プロトコルならびに絶対定量化に使用された内部標準の原料／仕様に応じて変化する可能性がある。
【0061】
好適な実施形態において、単離タウ試料は、アフィニティー精製により血液またはＣＳＦから精製されたタウを含み、タウリン酸化は質量分析により測定される。別の好適な実施形態において、単離タウ試料は、タウのミッドドメイン内のエピトープと特異的に結合するリガンド、及び任意選択でタウのＮ末端内のエピトープと特異的に結合する第二リガンドを用いて、アフィニティー精製により血液またはＣＳＦから精製されたタウを含み、タウリン酸化は高分解能質量分析により測定される。別の好適な実施形態において、単離タウ試料は、タウのミッドドメイン内のエピトープと特異的に結合するリガンド、及び任意選択でタウのＭＴＢＲまたはＣ末端内のエピトープと特異的に結合する第二リガンドを用いて、アフィニティー精製により血液またはＣＳＦから精製されたタウを含み、タウリン酸化は高分解能質量分析により測定される。例示の実施形態において、実施例で概要を記載した質量分析プロトコルが用いられる。
【0062】
ＩＶ．治療方法
本開示の別の態様は、治療を必要としている対象を治療するための方法である。「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、本明細書中使用される場合、医療ケアを必要としている対象に対する、訓練を受けたまたは資格を持った専門家による医療ケアの提供を示す。医療ケアは、診断検査、治療的処置、及び／または予防もしくは防止的手段の場合がある。治療的及び予防的処置の目的は、望ましくない生理的変化または疾患／障害を、予防または減速（低減）することである。治療的及び予防的処置の有益なまたは望ましい臨床結果として、症候の軽減、疾患の範囲の縮小、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患進行を遅らせるまたは遅くすること、病状の寛解または緩和、及び緩解（一部または全部を問わず）が挙げられるが、これらに限定されず、これらは検出可能であるか不可能であるかを問わない。「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、治療を受けなかった場合に予測されるものと比較した場合に長くなった生存率も意味することができる。治療を必要としている者として、疾患、症状、または障害をすでに有する者、ならびに疾患、症状、または障害を有する傾向がある者、または疾患、症状、または障害を予防すべきである者が挙げられる。実施形態によっては、治療を受ける対象は、無症候性である。「無症候性対象」は、本明細書中使用される場合、ＡＤの兆候または症候をなにも示していない対象を示す。他の実施形態において、対象は、ＡＤの兆候または症候（例えば、記憶喪失、物の置き忘れ、気分または挙動の変動など）を呈している場合があるが、アルツハイマー病による軽度認知障害と臨床診断するのに十分な認知または機能障害を示していない。「アルツハイマー病による軽度認知障害」という語句は、第ＩＶ章で定義する。症候性対象でも無症候性対象でも、Ａβアミロイドーシスを有する場合がある；しかしながら、Ａβアミロイドーシスの事前の所見は、治療の必要条件ではない。なおさらなる実施形態において、対象は、ＡＤを有すると診断される場合がある。上記実施形態のいずれかにおいて、対象は、優性遺伝性アルツハイマー病を引き起こすことが既知である遺伝子変異の１つを保有している場合がある。代替実施形態において、対象は、優性遺伝性アルツハイマー病を引き起こすことが既知である遺伝子変異の１つを保有していない場合がある。
本開示の別の態様は、治療を必要としている対象を治療するための方法である。「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、本明細書中使用される場合、医療ケアを必要としている対象に対する、訓練を受けたまたは資格を持った専門家による医療ケアの提供を示す。医療ケアは、診断検査、治療的処置、及び／または予防もしくは防止的手段の場合がある。治療的及び予防的処置の目的は、望ましくない生理的変化または疾患／障害を、予防または減速（低減）することである。治療的及び予防的処置の有益なまたは望ましい臨床結果として、症候の軽減、疾患の範囲の縮小、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患進行を遅らせるまたは遅くすること、病状の寛解または緩和、及び緩解（一部または全部を問わず）が挙げられるが、これらに限定されず、これらは検出可能であるか不可能であるかを問わない。「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、治療を受けなかった場合に予測されるものと比較した場合に長くなった生存率も意味することができる。治療を必要としている者として、疾患、症状、または障害をすでに有する者、ならびに疾患、症状、または障害を有する傾向がある者、または疾患、症状、または障害を予防すべきである者が挙げられる。実施形態によっては、治療を受ける対象は、無症候性である。「無症候性対象」は、本明細書中使用される場合、ＡＤの兆候または症候をなにも示していない対象を示す。他の実施形態において、対象は、ＡＤの兆候または症候（例えば、記憶喪失、物の置き忘れ、気分または挙動の変動など）を呈している場合があるが、アルツハイマー病による軽度認知障害と臨床診断するのに十分な認知または機能障害を示していない。「アルツハイマー病による軽度認知障害」という語句は、第ＩＶ章で定義する。症候性対象でも無症候性対象でも、Ａβアミロイドーシスを有する場合がある；しかしながら、Ａβアミロイドーシスの事前の所見は、治療の必要条件ではない。なおさらなる実施形態において、対象は、ＡＤを有すると診断される場合がある。上記実施形態のいずれかにおいて、対象は、優性遺伝性アルツハイマー病を引き起こすことが既知である遺伝子変異の１つを保有している場合がある。代替実施形態において、対象は、優性遺伝性アルツハイマー病を引き起こすことが既知である遺伝子変異の１つを保有していない場合がある。
【0063】
１つの実施形態において、上記のとおり対象を治療するための方法は、（ａ）対象から得られた単離タウ試料を用意し、単離タウ試料中の、Ｔ１１１、Ｓ１１３、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７、及びＴ２３１から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基でのタウリン酸化を測定すること、及び任意選択でタウ総量を測定すること；ならびに（ｂ）測定されたリン酸化レベル（複数可）が、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団における平均から有意に逸脱している場合に、対象に医薬組成物を投与すること、を含む場合がある。別の実施形態において、上記のとおり対象を治療するための方法は、（ａ）対象から得られた第一及び第二単離タウ試料を用意し、各単離タウ試料中の、Ｔ１１１、Ｓ１１３、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７、及びＴ２３１から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基でのタウリン酸化を測定すること、及び任意選択でタウ総量を測定すること；（ｂ）測定された各残基での部位特異的リン酸化の変化、及び任意選択でタウ総量の変化を計算すること；ならびに（ｃ）計算された変化（複数可）が、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団における平均から有意に逸脱している場合に、対象に医薬組成物を投与すること、を含む場合がある。「平均から有意に逸脱している」は、平均より、少なくとも１標準偏差分、好ましくは少なくとも１．３標準偏差分、より好ましくは少なくとも１．５標準偏差分、またはさらにより好ましくは少なくとも２標準偏差分大きいまたは小さい値を示す（すなわち、それぞれ、１σ、１．３σ、１．５σ、または１．５σ、ただし、σは、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団で測定された正規分布により定義される標準偏差である）。閾値（例えば、平均より少なくとも１標準偏差分大きいまたは小さい）を使用することに加えて、実施形態によっては、平均より高いまたは低い変化の程度を用いて、対象を診断する場合がある。
【0064】
任意選択でタウ総量の測定を併用する部位特異的タウリン酸化の測定の使用に代えてまたはそれに加えて、上記実施形態のいずれかにおいて、測定されたリン酸化レベル（複数可）から計算された比、または測定されたリン酸化レベル（複数可）及びタウ総量から計算された比が使用される場合がある。測定されたリン酸化レベル（複数可）から計算された比は、ｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２０５、ｐ－Ｔ２１７とｐ－Ｔ２０５、またはｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２１７の間の比である場合がある。測定されたリン酸化レベル（複数可）及びタウ総量から計算された比は、ｐ－Ｔ１８１とタウ総量、ｐ－Ｔ２０５とタウ総量、またはｐ－Ｔ２１７とタウ総量の間の比である場合がある。比以外の数学演算も使用される場合がある。例えば、例では、部位特異的タウリン酸化値が、様々な統計モデル（例えば、線形回帰、ＬＭＥ曲線、ＬＯＥＳＳ曲線など）で、他の既知のバイオマーカー（例えば、ＡＰＯＥε４状態、年齢、性別、認知テストスコア、機能テストスコアなど）と併せて使用される。
【0065】
ＡβアミロイドーシスまたはＡＤを発症するリスクがある対象、Ａβアミロイドーシスを有すると診断された対象、タウオパチーを有すると診断された対象、またはＡＤを有すると診断された対象用であることを意図した、あるいはそのような対象で用いられる、多くの造影剤または治療薬は、特定の病態生理学的変化を標的としている。例えば、Ａβ標的治療薬は、一般に、Ａβ産生を減少させる、Ａβ凝集と拮抗する、または脳Ａβクリアランスを増加させるように設計される；タウ標的治療薬は、一般に、タウリン酸化パターンを改変する、タウ凝集と拮抗する、またはＮＦＴクリアランスを増加させるように設計される；様々な治療薬は、ＣＮＳ炎症または脳インスリン抵抗性を低下させるように設計されている；などである。これら種々の作用剤の有効性は、本明細書中開示される方法により測定した場合に、Ｔ１１１、Ｓ１１３、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７、及びＴ２３１である特定のタウリン酸化レベルを有する対象に作用剤を投与することにより、改善される可能性がある。
【0066】
例示の実施形態において、ＡβアミロイドーシスまたはＡＤを発症するリスクがある対象、Ａβアミロイドーシスを有すると診断された対象、タウオパチーを有すると診断された対象、またはＡＤを有すると診断された対象用であることを意図した、あるいはそのような対象で用いられる、造影剤及び治療薬（本明細書中、まとめて「Ａβ及びタウ治療薬」と称する）の有効性は、本明細書中開示される、及び例えば図２２に示される方法により測定した場合に、Ｔ１８１、Ｔ２０５、及び／またはＴ２１７である特定のタウリン酸化レベルを有する対象にＡβ及びタウ治療薬を投与することにより、改善される可能性がある。例えば、Ｔ２１７でのタウリン酸化が約１．５σ以上であり、かつＴ１８１及びＴ２０５でのタウリン酸化が約１．５σ以下である場合、好適な治療薬として、対象がアミロイド陽性になるのを防ぐように設計されたものを挙げることができる（例えば、Ａβ産生を減少させる、Ａβ凝集と拮抗するように設計されたアミロイド標的治療薬など）。別の例として、Ｔ２１７及び／またはＴ１８１でのタウリン酸化が約１．５σ以上であり、かつＴ２０５でのタウリン酸化が約１．５σ以下である場合、好適な治療薬として、アミロイド沈着が増加するのを防ぐ、または対象の既存プラーク負荷を減少させるように設計されたものを挙げることができる。別の例として、Ｔ２１７、Ｔ１８１、及びＴ２０５でのタウリン酸化が約１．５σ以上である場合、好適な治療薬として、アミロイド沈着が増加するのを防ぐ、対象の既存プラーク負荷を減少させる、タウ凝集を防ぐ、またはＮＦＴを標的とするように設計されたものを挙げることができる。別の例として、Ｔ２１７、Ｔ１８１、及びＴ２０５でのタウリン酸化が約１．５σ以上であり、かつＴ２１７またはＴ１８１でのタウリン酸化がプラトーであるまたは減少しており、かつタウ総量及び／またはＴ２０５でのタウリン酸化が増加している場合、好適な治療薬として、アミロイド沈着が増加するのを防ぐ、対象の既存プラーク負荷を減少させる、タウ凝集を防ぐ、またはＮＦＴを標的とするように設計されたもの、ならびにＡＤを有する対象専用のものを挙げることができる。本明細書中開示される詳細は、他の標的（例えば、ＣＮＳ炎症、ＡｐｏＥなど）に対して設計された治療薬を投与するためにも同様に使用可能であり、そのような標的として以下の段落で同定されるものが挙げられるが、それらに限定されない。
【0067】
１つの例において、本開示は、ＡＤによるＭＣＩへのコンバージョンリスクが高い対象を治療するための方法を提供し、本方法は、（ａ）対象から得られた単離タウ試料を用意し、（ｉ）Ｔ２１７及びＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１及びＴ２０５、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化を測定すること；ならびに（ｂ）Ｔ２１７及び／またはＴ１８１でのタウリン酸化が約１．５σ以上であり、かつＴ２０５でのタウリン酸化が約１．５σ以下である場合に、対象に医薬組成物を投与すること、を含み、ただし、σは、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団で測定されたＴ２１７及びＴ２０５、Ｔ１８１及びＴ２０５、またはＴ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。様々な実施形態において、Ｔ２１７でのタウリン酸化及び／またはＴ１８１でのタウリン酸化は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２σ、または２σ超である場合がある。他の実施形態において、Ｔ２１７でのタウリン酸化及び／またはＴ１８１でのタウリン酸化は、約１．８５σ、約１．９σ、約１．９５σ、約２σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σ、または２．５σ超である場合がある。上記実施形態のそれぞれにおいて、Ｔ２０５でのタウリン酸化は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．５１σ、約１．５５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２．０σ、または２．０σ未満である場合がある。あるいは、Ｔ２０５でのタウリン酸化は、約２．０σ、約２．０５σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σ、または２．５σ未満である場合がある。さらなる例において、Ｔ２１７でのタウリン酸化及び／またはＴ１８１でのタウリン酸化は、約２σ以上であり、かつＴ２０５でのタウリン酸化は、約２σ以下である場合がある。閾値（例えば、平均より少なくとも１標準偏差分大きいまたは小さい）を使用することに加えて、実施形態によっては、平均より高いまたは低い変化の程度を、対象の治療基準として使用する場合がある。なおさらなる実施形態において、Ｔ２０５でのタウリン酸化の測定されたレベル及びＴ１８１及び／またはＴ２１７でのタウリン酸化の測定されたレベルを様々な数学演算に用いて、それぞれ自身に比べて予測力を改善することができる。例えば、比（複数可）を、測定されたリン酸化レベルから計算することができる。比以外の数学演算も使用可能である。
【0068】
別の例において、本開示は、ＡＤによるＭＣＩへのコンバージョンリスクが高い対象を治療するための方法を提供し、本方法は、（ａ）対象から得られた単離タウ試料を用意し、タウ総量及び（ｉ）Ｔ２１７及びＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１及びＴ２０５、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化を測定すること；ならびに（ｂ）タウ総量に対するＴ２１７でのタウリン酸化の比及び／またはタウ総量に対するＴ１８１でのタウリン酸化の比が約１．５σ以上であり、かつタウ総量に対するＴ２０５でのタウリン酸化の比が約１．５σ以下である場合に、対象に医薬組成物を投与すること、を含み、ただし、σは、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団で測定された、タウ総量ならびにＴ２１７及びＴ２０５、Ｔ１８１及びＴ２０５、またはＴ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。様々な実施形態において、タウ総量に対するＴ２１７でのタウリン酸化の比及び／またはタウ総量に対するＴ１８１でのタウリン酸化の比は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２σ、または２σ超である場合がある。他の実施形態において、タウ総量に対するＴ２１７でのタウリン酸化の比及び／またはタウ総量に対するＴ１８１でのタウリン酸化の比は、約１．８５σ、約１．９σ、約１．９５σ、約２σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σ、または２．５σ超である場合がある。上記実施形態のそれぞれにおいて、タウ総量に対するＴ２０５でのタウリン酸化の比は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５０σ、約１．５５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２．０σ、または２σ未満である場合がある。あるいは、タウ総量に対するＴ２０５でのタウリン酸化の比は、約２．０σ、約２．０５σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σ、または２．５σ未満である場合がある。さらなる例において、タウ総量に対するＴ２１７でのタウリン酸化の比及び／またはタウ総量に対するＴ１８１でのタウリン酸化の比は、約２σ以上である場合があり、かつタウ総量に対するＴ２０５でのタウリン酸化の比は、約２σ以下である場合がある。閾値（例えば、平均より少なくとも１標準偏差分大きいまたは小さい値）を使用することに加えて、実施形態によっては、平均より高いまたは低い変化の程度を、対象の治療基準として使用する場合がある。
【0069】
別の例において、本開示は、ＡＤによるＭＣＩへのコンバージョンリスクが高い対象を治療するための方法を提供し、本方法は、（ａ）対象から得られた単離タウ試料を用意し、（ｉ）Ｔ１８１及びＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ２１７及びＴ２０５、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２１７、及びＴ２０５でのタウリン酸化を測定すること；ならびに（ｂ）（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化が約１．５σ以上である場合に、対象に医薬組成物を投与すること、を含み、ただし、σは、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団で測定された、Ｔ２１７及びＴ２０５、Ｔ１８１及びＴ２０５、またはＴ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。様々な実施形態において、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２σ、または２σ超である場合がある。他の実施形態において、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化は、約１．８５σ、約１．９σ、約１．９５σ、約２σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σ、または２．５σ超である場合がある。さらなる例において、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化は、約２σ以上である場合がある。閾値（例えば、平均より少なくとも１標準偏差分大きいまたは小さい）を使用することに加えて、実施形態によっては、平均より高いまたは低い変化の程度を、対象の治療基準として使用する場合がある。なおさらなる実施形態において、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化の測定されたレベルを、様々な数学演算に用いて、それぞれ自身に比べて予測力を改善することができる。例えば、比（複数可）を、測定されたリン酸化レベルから計算することができる。比以外の数学演算も使用可能である。
【0070】
別の例において、本開示は、ＡＤによるＭＣＩへのコンバージョンリスクが高い対象を治療する方法を提供し、本方法は、（ａ）対象から得られた単離タウ試料を用意し、タウ総量及び（ｉ）Ｔ１８１及びＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ２１７及びＴ２０５、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２１７、及びＴ２０５でのタウリン酸化を測定すること；ならびに（ｂ）タウ総量に対する（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化の比が約１．５σ以上である場合に、対象に医薬組成物を投与すること、を含み、ただし、σは、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団で測定された、タウ総量ならびにＴ２１７及びＴ２０５、Ｔ１８１及びＴ２０５、またはＴ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。様々な実施形態において、タウ総量に対する（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化の比は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２σ、または２σ超である場合がある。他の実施形態において、タウ総量に対する（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化の比は、約１．８５σ、約１．９σ、約１．９５σ、約２σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σ、または２．５σ超である場合がある。さらなる例において、タウ総量に対する（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化の比は、約２σ以上である場合がある。閾値（例えば、平均より少なくとも１標準偏差分大きいまたは小さい）を使用することに加えて、実施形態によっては、平均より高いまたは低い変化の程度を、対象の治療基準として使用する場合がある。
【0071】
別の例において、本開示は、ＡＤの症候を有する対象を治療するための方法を提供し、本方法は、（ａ）対象から得られた第一及び第二単離タウ試料を用意し、「第一」及び「第二」は、試料が収集された順序を示し、（ｉ）Ｔ１８１及びＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ２１７及びＴ２０５、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２１７、及びＴ２０５でのタウリン酸化を測定すること；（ｂ）測定された各残基での部位特異的リン酸化の変化、及び任意選択でタウ総量の変化を測定すること；ならびに（ｃ）Ｔ１８１及び／またはＴ２１７でのリン酸化レベルが低下または一定を保ち、Ｔ２０５でのリン酸化レベル及び任意選択でタウ総量が増加している場合に、対象に医薬組成物を投与すること、を含む。第一及び第二単離タウ試料は、日付、週、または月をまたいで収集される場合がある。典型的には、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化も、両方の試料で約１．５σ以上になり、ただし、σは、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団で測定された、Ｔ２１７及びＴ２０５、Ｔ１８１及びＴ２０５、またはＴ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。なおさらなる実施形態において、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化の測定されたレベルを、様々な数学演算に用いて、それぞれ自身に比べて予測力を改善することができる。例えば、比（複数可）を、測定されたリン酸化レベルから計算することができる。比以外の数学演算も使用可能である。
【0072】
別の例において、本開示は、ＡＤの症候を有する対象を治療するための方法を提供し、本方法は、（ａ）対象から得られた第一及び第二単離タウ試料を用意し、「第一」及び「第二」は、試料が収集された順序を示し、タウ総量ならびに（ｉ）Ｔ１８１及びＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ２１７及びＴ２０５、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２１７、及びＴ２０５でのタウリン酸化を測定すること；（ｂ）測定された各残基での部位特異的リン酸化の変化、及びタウ総量の変化を計算すること；ならびに（ｃ）Ｔ１８１及び／またはＴ２１７でのリン酸化レベルが低下または一定を保ち、Ｔ２０５でのリン酸化レベルが低下または一定を保ち、及びタウ総量が増加している場合に、対象に医薬組成物を投与すること、を含む。第一及び第二単離タウ試料は、日付、週、または月をまたいで収集される場合がある。典型的には、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化も、両方の試料で約１．５σ以上になり、ただし、σは、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団で測定された、Ｔ２１７及びＴ２０５、Ｔ１８１及びＴ２０５、またはＴ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。なおさらなる実施形態において、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化の測定されたレベルを、様々な数学演算に用いて、それぞれ自身に比べて予測力を改善することができる。例えば、比（複数可）を、測定されたリン酸化レベルから計算することができる。比以外の数学演算も使用可能である。
【0073】
上記実施形態のそれぞれにおいて、医薬組成物は、造影剤を含む場合がある。造影剤の限定ではなく例として、機能性造影剤（例えばフルオロデオキシグルコースなど）及び分子造影剤（例えば、ピッツバーグ化合物Ｂ、フロルベタベン、フロルベタピル、フルテメタモル、放射性核種標識化抗体など）が挙げられる。
【0074】
あるいは、医薬組成物は、活性医薬成分を含む場合がある。活性医薬成分の限定ではなく例として、コリンエステラーゼ阻害剤、Ｎ－メチルＤ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、抗鬱薬（例えば、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、非定型抗鬱薬、アミノケトン、選択的セロトニン及びノルエピネフリン再取り込み阻害剤、三環系抗鬱薬など）、ガンマ－セクレターゼ阻害剤、ベータ－セクレターゼ阻害剤、抗Ａβ抗体（抗原結合断片、バリアント、またはそれらの誘導体を含む）、抗タウ抗体（抗原結合断片、バリアント、またはそれらの誘導体を含む）、幹細胞、栄養補助食品（例えばリチウム水、オメガ３脂肪酸＋リポ酸、長鎖トリグリセリド、ゲニステイン、レスベラトロール、クルクミン、及びブドウ種子エキスなど）、セロトニン受容体６のアンタゴニスト、ｐ３８アルファＭＡＰＫ阻害剤、組換え顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、受動免疫療法、活性ワクチン（例えばＣＡＤ１０６、ＡＦ２０５１３など）、タウタンパク質凝集阻害剤（例えばＴＲｘ０２３７、塩化メチルチオニニウムなど）、血糖制御を改善する治療薬（例えば、インスリン、エキセナチド、リラグルチドピオグリタゾンなど）、抗炎症剤、ホスホジエステラーゼ９Ａ阻害剤、シグマ１受容体アゴニスト、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ活性化剤、ホスファターゼ阻害剤、アンジオテンシン受容体遮断薬、ＣＢ１及び／またはＣＢ２エンドカンナビノイド受容体部分アゴニスト、β－２アドレナリン受容体アゴニスト、ニコチン性アセチルコリン受容体アゴニスト、５－ＨＴ２Ａ逆作動薬、アルファ２ｃアドレナリン受容体アンタゴニスト、５－ＨＴ１Ａ及び１Ｄ受容体アゴニスト、グルタミニルペプチドシクロトランスフェラーゼ阻害剤、ＡＰＰ産生の選択的阻害剤、モノアミンオキシダーゼＢ阻害剤、グルタミン酸受容体アンタゴニスト、ＡＭＰＡ受容体アゴニスト、神経成長因子賦活薬、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、神経栄養剤、ムスカリンＭ１受容体アゴニスト、ＧＡＢＡ受容体修飾薬、ＰＰＡＲガンマアゴニスト、微小管タンパク質修飾薬、カルシウムチャネル遮断薬、降圧薬、スタチン、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【0075】
別の代替形態において、医薬組成物は、キナーゼ阻害剤を含む場合がある。適切なキナーゼ阻害剤は、サウザンドアンドワンアミノ酸キナーゼ（ＴＡＯＫ）、ＣＤＫ、ＧＳＫ－３β、ＭＡＲＫ、ＣＤＫ５、Ｆｙｎ、５’アデノシン一リン酸活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）、カルシウムカルモジュリンキナーゼＩＩ、サイクリン依存性キナーゼ５（ｃｄｋ５）、カゼインキナーゼ１（ＣＫ１）、カゼインキナーゼ２（ＣＫ２）、サイクリックＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）、二重特異性チロシンリン酸化制御型キナーゼ１Ａ（ＤＹＲＫ１Ａ）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３（ＧＳＫ－３）、ＪＮＫ、ＬＲＲＫ２、微小管親和性調節キナーゼ（ＭＡＲＫ）、ＭＳＫ１、ｐ３５／４１、ｐ４２／ｐ４４分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＥＲＫｓ１／２）、ｐ３８分裂促進因子活性化キナーゼ（ｐ３８ＭＡＰＫ）、ｐ７０Ｓ６キナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、ＰＫＢ／ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）、タンパク質キナーゼＮ（ＰＫＮ）、前立腺由来ステリル２０様キナーゼ１アルファ／ベータ、９０ｋＤａリボソームＳ６キナーゼ（ＲＳＫ１／２）（ＰＳＫ１／ＴＡＯＫ２）、前立腺由来ステリル２０様キナーゼ２（ＰＳＫ２／ＴＡＯＫ１）、ストレス活性化タンパク質キナーゼ（ＳＡＰＫ）１ガンマ、ＳＡＰＫ２ａ、ＳＡＰＫ２ｂ、ＳＡＰＫ３、ＳＡＰＫ４、ＳＧＫ１、ＳＲＰＫ２、またはタウチューブリンキナーゼ１／２（ＴＴＢＫ１／２）を阻害する場合がある。
【0076】
さらに別の代替形態において、医薬組成物は、ホスファターゼ活性化剤を含む場合がある。限定ではなく例として、ホスファターゼ活性化剤は、タンパク質ホスファターゼ１、２Ａ、２Ｂ、または５の活性を高める場合がある。
【0077】
タウリン酸化及びタウ総量の測定法は、第ＩＩ章に記載されており、参照することでこの章に援用される。好適な実施形態において、単離タウ試料は、アフィニティー精製により血液またはＣＳＦから精製されたタウを含み、タウリン酸化は、質量分析により測定される。別の好適な実施形態において、単離タウ試料は、タウのミッドドメイン内のエピトープと特異的に結合するリガンドを用い、任意選択でタウのＮ末端内のエピトープと特異的に結合する第二リガンドを併用して、アフィニティー精製により血液またはＣＳＦから精製されたタウを含み、タウリン酸化は、高分解能質量分析により測定される。別の好適な実施形態において、単離タウ試料は、タウのミッドドメイン内のエピトープと特異的に結合するリガンドを用い、任意選択でタウのＭＴＢＲまたはＣ末端内のエピトープと特異的に結合する第二リガンドを併用して、アフィニティー精製により血液またはＣＳＦから精製されたタウを含み、タウリン酸化は、高分解能質量分析により測定される。例示の実施形態において、実施例に概要を記載した質量分析プロトコルが使用される。
【0078】
Ｖ．臨床試験
本開示の別の態様は、対象を臨床試験に登録する、詳細にはＡβまたはタウ治療薬の臨床試験に登録するための方法であり、ただし臨床試験の他の基準が全て満たされているものとする。１つの実施形態において、対象を臨床試験に登録するための方法は、（ａ）対象から得られた単離タウ試料を用意し、単離タウ試料中の、Ｔ１１１、Ｓ１１３、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７、及びＴ２３１から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基でのタウリン酸化を測定すること、及び任意選択でタウ総量を測定すること；ならびに（ｂ）測定されたリン酸化レベル（複数可）が、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団における平均から有意に逸脱している場合に、対象を臨床試験に登録すること、を含む場合がある。別の実施形態において、対象を臨床試験に登録するための方法は、（ａ）対象から得られた第一及び第二単離タウ試料を用意し、各単離タウ試料中の、Ｔ１１１、Ｓ１１３、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７、及びＴ２３１から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基でのタウリン酸化を測定すること、及び任意選択でタウ総量を測定すること；（ｂ）測定された各残基での部位特異的リン酸化の変化、及び任意選択でタウ総量の変化を計算すること；ならびに（ｃ）計算された変化（複数可）が、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団における平均から有意に逸脱している場合に、対象を臨床試験に登録すること、を含む場合がある。「ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団」という語句は、第ＩＶ章で定義されている。「平均から有意に逸脱している」は、平均より、少なくとも１標準偏差分、好ましくは少なくとも１．３標準偏差分、より好ましくは少なくとも１．５標準偏差分、またはさらにより好ましくは少なくとも２標準偏差分大きいまたは小さい値を示す（すなわち、それぞれ、１σ、１．３σ、１．５σ、または１．５σ、ただし、σは、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団で測定された正規分布により定義される標準偏差である）。閾値（例えば、平均より少なくとも１標準偏差分大きいまたは小さい）を使用することに加えて、実施形態によっては、平均より高いまたは低い変化の程度を、対象の登録基準として使用する場合がある。
本開示の別の態様は、対象を臨床試験に登録する、詳細にはＡβまたはタウ治療薬の臨床試験に登録するための方法であり、ただし臨床試験の他の基準が全て満たされているものとする。１つの実施形態において、対象を臨床試験に登録するための方法は、（ａ）対象から得られた単離タウ試料を用意し、単離タウ試料中の、Ｔ１１１、Ｓ１１３、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７、及びＴ２３１から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基でのタウリン酸化を測定すること、及び任意選択でタウ総量を測定すること；ならびに（ｂ）測定されたリン酸化レベル（複数可）が、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団における平均から有意に逸脱している場合に、対象を臨床試験に登録すること、を含む場合がある。別の実施形態において、対象を臨床試験に登録するための方法は、（ａ）対象から得られた第一及び第二単離タウ試料を用意し、各単離タウ試料中の、Ｔ１１１、Ｓ１１３、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７、及びＴ２３１から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基でのタウリン酸化を測定すること、及び任意選択でタウ総量を測定すること；（ｂ）測定された各残基での部位特異的リン酸化の変化、及び任意選択でタウ総量の変化を計算すること；ならびに（ｃ）計算された変化（複数可）が、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団における平均から有意に逸脱している場合に、対象を臨床試験に登録すること、を含む場合がある。「ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団」という語句は、第ＩＶ章で定義されている。「平均から有意に逸脱している」は、平均より、少なくとも１標準偏差分、好ましくは少なくとも１．３標準偏差分、より好ましくは少なくとも１．５標準偏差分、またはさらにより好ましくは少なくとも２標準偏差分大きいまたは小さい値を示す（すなわち、それぞれ、１σ、１．３σ、１．５σ、または１．５σ、ただし、σは、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団で測定された正規分布により定義される標準偏差である）。閾値（例えば、平均より少なくとも１標準偏差分大きいまたは小さい）を使用することに加えて、実施形態によっては、平均より高いまたは低い変化の程度を、対象の登録基準として使用する場合がある。
【0079】
任意選択でタウ総量の測定を併用する部位特異的タウリン酸化の測定の使用に代えてまたはそれに加えて、上記実施形態のいずれかにおいて、測定されたリン酸化レベル（複数可）から計算された比、または測定されたリン酸化レベル（複数可）及びタウ総量から計算された比を使用する場合がある。測定されたリン酸化レベル（複数可）から計算された比は、ｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２０５、ｐ－Ｔ２１７とｐ－Ｔ２０５、またはｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２１７の間の比である場合がある。測定されたリン酸化レベル（複数可）及びタウ総量から計算された比は、ｐ－Ｔ１８１とタウ総量、ｐ－Ｔ２０５とタウ総量、またはｐ－Ｔ２１７とタウ総量の間の比である場合がある。比以外の数学演算も使用される場合がある。例えば、例では、部位特異的タウリン酸化値が、様々な統計モデル（例えば、線形回帰、ＬＭＥ曲線、ＬＯＥＳＳ曲線など）で、他の既知のバイオマーカー（例えばＡＰＯＥε４状態、年齢、性別、認知テストスコア、機能テストスコアなど）と併せて使用される。
【0080】
Ａβ及びタウ治療薬の臨床試験の計画は、本明細書中開示される方法により大いに支援される可能性がある。多くの臨床試験は、ＡＤ症候の発症前に生じる特定病態生理学的変化を標的とする造影剤または治療薬の有効性を試験するように計画される。第Ｖ章において前述したとおり、こうした様々な作用剤の有効性は、本明細書中開示及び例示される方法により測定した場合にある特定の部位特異的タウリン酸化レベルを有する対象に、その作用剤を投与することにより改善される可能性がある。同様に、臨床試験がＡＤの症候を有する対象（例えば、ＡＤによるＭＣＩの発症後）を登録することも、有効性がＡＤの特定段階と関連するかどうかを判断する目的で、登録者のＡＤ状態を正確に段階分けすることが可能であることによって利益を受けると思われる。したがって、対象を臨床試験に、詳細には臨床試験の治療群に登録する前に本明細書中記載されるとおりにタウリン酸化レベルを測定することは、臨床試験の規模が小さくなる及び／または成績が改善されるという結果になる可能性がある。場合によっては、本明細書中記載される方法は、治療薬のコンパニオン診断として開発及び使用される可能性がある。
【0081】
例示の実施形態において、対象を臨床試験に登録するための方法は、（ａ）対象から得られた単離タウ試料を用意し、単離タウ試料中の、Ｔ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基でのタウリン酸化を測定すること、及び任意選択でタウ総量を測定すること；ならびに（ｂ）測定されたリン酸化レベル（複数可）が、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団における平均から有意に逸脱している場合に、対象を臨床試験に登録すること、を含む場合がある。別の実施形態において、対象を臨床試験に登録するための方法は、（ａ）対象から得られた第一及び第二単離タウ試料を用意し、各単離タウ試料中の、Ｔ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基でのタウリン酸化を測定すること、及び任意選択でタウ総量を測定すること；（ｂ）測定された各残基での部位特異的リン酸化の変化、及び任意選択でタウ総量の変化を計算すること；ならびに（ｃ）計算された変化（複数可）が、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団における平均から有意に逸脱している場合に、対象を臨床試験に登録すること、を含む場合がある。「ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団」という語句は、第ＩＶ章で定義されている。「平均から有意に逸脱している」は、平均より、少なくとも１標準偏差分、好ましくは少なくとも１．３標準偏差分、より好ましくは少なくとも１．５標準偏差分、またはさらにより好ましくは少なくとも２標準偏差分大きいまたは小さい値を示す（すなわち、それぞれ、１σ、１．３σ、１．５σ、または１．５σ、ただし、σは、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団で測定された正規分布により定義される標準偏差である）。閾値（例えば、平均より少なくとも１標準偏差分大きいまたは小さい）を使用することに加えて、実施形態によっては、平均より高いまたは低い変化の程度を、対象の登録基準として使用する場合がある。
【0082】
１つの例において、本開示は、対象を臨床試験に登録するための方法を提供し、本方法は、（ａ）対象から得られた単離タウ試料を用意し、単離タウ試料中の、（ｉ）Ｔ２１７及びＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１及びＴ２０５、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化を測定すること；ならびに（ｂ）Ｔ２１７及び／またはＴ１８１でのタウリン酸化が約１．５σ以上であり、かつＴ２０５でのタウリン酸化が約１．５σ以下である場合に、対象に医薬組成物を投与すること、を含み、ただし、σは、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団で測定されたＴ２１７及びＴ２０５、Ｔ１８１及びＴ２０５、またはＴ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。様々な実施形態において、Ｔ２１７でのタウリン酸化及び／またはＴ１８１でのタウリン酸化は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２σ、または２σ超である場合がある。他の実施形態において、Ｔ２１７でのタウリン酸化及び／またはＴ１８１でのタウリン酸化は、約１．８５σ、約１．９σ、約１．９５σ、約２σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σ、または２．５σ超である場合がある。上記実施形態のそれぞれにおいて、Ｔ２０５でのタウリン酸化は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．５１σ、約１．５５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２．０σ、または２．０σ未満である場合がある。あるいは、Ｔ２０５でのタウリン酸化は、約２．０σ、約２．０５σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σ、または２．５σ未満である場合がある。さらなる例において、Ｔ２１７でのタウリン酸化及び／またはＴ１８１でのタウリン酸化は、約２σ以上であり、かつＴ２０５でのタウリン酸化は、約２σ以下である場合がある。閾値（例えば、平均より少なくとも１標準偏差分大きいまたは小さい）を使用することに加えて、実施形態によっては、平均より高いまたは低い変化の程度を、対象の登録基準として使用する場合がある。なおさらなる実施形態において、Ｔ２０５ならびにＴ１８１及び／またはＴ２１７でのタウリン酸化の測定されたレベルを、様々な数学演算に用いて、それぞれ自身に比べて予測力を改善することができる。例えば、比（複数可）を、測定されたリン酸化レベルから計算することができる。比以外の数学演算も使用可能である。
【0083】
別の例において、本開示は、対象を臨床試験に登録するための方法を提供し、本方法は、（ａ）対象から得られた単離タウ試料を用意し、タウ総量及び（ｉ）Ｔ２１７及びＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１及びＴ２０５、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化を測定すること；ならびに（ｂ）タウ総量に対するＴ２１７でのタウリン酸化の比及び／またはタウ総量に対するＴ１８１でのタウリン酸化の比が約１．５σ以上であり、かつタウ総量に対するＴ２０５でのタウリン酸化の比が約１．５σ以下である場合に、対象に医薬組成物を投与すること、を含み、ただし、σは、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団で測定されたタウ総量ならびにＴ２１７及びＴ２０５、Ｔ１８１及びＴ２０５、またはＴ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。様々な実施形態において、タウ総量に対するＴ２１７でのタウリン酸化の比及び／またはタウ総量に対するＴ１８１でのタウリン酸化の比は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２σ、または２σ超である場合がある。他の実施形態において、タウ総量に対するＴ２１７でのタウリン酸化の比及び／またはタウ総量に対するＴ１８１でのタウリン酸化の比は、約１．８５σ、約１．９σ、約１．９５σ、約２σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σ、または２．５σ超である場合がある。上記実施形態のそれぞれにおいて、タウ総量に対するＴ２０５でのタウリン酸化の比は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５０σ、約１．５５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２．０σ、または２σ未満である場合がある。あるいは、タウ総量に対するＴ２０５でのタウリン酸化の比は、約２．０σ、約２．０５σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σ、または２．５σ未満である場合がある。さらなる例において、タウ総量に対するＴ２１７でのタウリン酸化の比及び／またはタウ総量に対するＴ１８１でのタウリン酸化の比は、約２σ以上である場合があり、かつタウ総量に対するＴ２０５でのタウリン酸化の比は、約２σ以下である場合がある。閾値（例えば、平均より少なくとも１標準偏差分大きいまたは小さい）を使用することに加えて、実施形態によっては、平均より高いまたは低い変化の程度を、対象の登録基準として使用する場合がある。
【0084】
別の例において、本開示は、対象を臨床試験に登録するための方法を提供し、本方法は、（ａ）対象から得られた単離タウ試料を用意し、（ｉ）Ｔ１８１及びＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ２１７及びＴ２０５、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２１７、及びＴ２０５でのタウリン酸化を測定すること；ならびに（ｂ）（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化が約１．５σ以上である場合に、対象に医薬組成物を投与すること、を含み、ただし、σは、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団で測定されたＴ２１７及びＴ２０５、Ｔ１８１及びＴ２０５、またはＴ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。様々な実施形態において、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２σ、または２σ超である場合がある。他の実施形態において、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化は、約１．８５σ、約１．９σ、約１．９５σ、約２σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σ、または２．５σ超である場合がある。さらなる例において、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化は、約２σ以上である場合がある。閾値（例えば、平均より少なくとも１標準偏差分大きいまたは小さい）を使用することに加えて、実施形態によっては、平均より高いまたは低い変化の程度を、対象の登録基準として使用する場合がある。なおさらなる実施形態において、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化の測定されたレベルを、様々な数学演算に用いて、それぞれ自身に比べて予測力を改善することができる。例えば、比（複数可）を、測定されたリン酸化レベルから計算することができる。比以外の数学演算も使用可能である。
【0085】
別の例において、本開示は、対象を臨床試験に登録するための方法を提供し、本方法は、（ａ）対象から得られた単離タウ試料を用意し、タウ総量及び（ｉ）Ｔ１８１及びＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ２１７及びＴ２０５、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２１７、及びＴ２０５でのタウリン酸化を測定すること；ならびに（ｂ）タウ総量に対する（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化の比が約１．５σ以上である場合に、対象に医薬組成物を投与すること、を含み、ただし、σは、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団で測定されたタウ総量ならびにＴ２１７及びＴ２０５、Ｔ１８１及びＴ２０５、またはＴ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。様々な実施形態において、タウ総量に対する（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化の比は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２σ、または２σ超である場合がある。他の実施形態において、タウ総量に対する（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化の比は、約１．８５σ、約１．９σ、約１．９５σ、約２σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σ、または２．５σ超である場合がある。さらなる例において、タウ総量に対する（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化の比は、約２σ以上である場合がある。閾値（例えば、平均より少なくとも１標準偏差分大きいまたは小さい）を使用することに加えて、実施形態によっては、平均より高いまたは低い変化の程度を、対象の登録基準として使用する場合がある。
【0086】
別の例において、本開示は、対象を臨床試験に登録するための方法を提供し、本方法は、（ａ）対象から得られた第一及び第二単離タウ試料を用意し、「第一」及び「第二」は、試料が収集された順序を示し、（ｉ）Ｔ１８１及びＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ２１７及びＴ２０５、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２１７、及びＴ２０５でのタウリン酸化を測定すること；（ｂ）測定された各残基での部位特異的リン酸化の変化、及び任意選択でタウ総量の変化を計算すること；ならびに（ｃ）Ｔ１８１及び／またはＴ２１７でのリン酸化レベルが低下または一定を保ち、Ｔ２０５でのリン酸化レベル及び任意選択でタウ総量が増加している場合に、対象を臨床試験に登録すること、を含む。第一及び第二単離タウ試料は、日付、週、または月をまたいで収集される場合がある。典型的には、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化も、両方の試料で約１．５σ以上になり、ただし、σは、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団で測定された、Ｔ２１７及びＴ２０５、Ｔ１８１及びＴ２０５、またはＴ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。なおさらなる実施形態において、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化の測定されたレベルを、様々な数学演算に用いて、それぞれ自身に比べて予測力を改善することができる。例えば、比（複数可）を、測定されたリン酸化レベルから計算することができる。比以外の数学演算も使用可能である。
【0087】
別の例において、本開示は、対象を臨床試験に登録するための方法を提供し、本方法は、（ａ）対象から得られた第一及び第二単離タウ試料を用意し、「第一」及び「第二」は、試料が収集された順序を示し、タウ総量及び（ｉ）Ｔ１８１及びＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ２１７及びＴ２０５、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２１７、及びＴ２０５でのタウリン酸化を測定すること；（ｂ）測定された各残基での部位特異的リン酸化の変化、及びタウ総量の変化を計算すること；ならびに（ｃ）Ｔ１８１及び／またはＴ２１７でのリン酸化レベルが低下または一定を保ち、Ｔ２０５でのリン酸化レベルが低下または一定を保ち、かつタウ総量が増加している場合に、対象を臨床試験に登録すること、を含む。第一及び第二単離タウ試料は、日付、週、または月をまたいで収集される場合がある。典型的には、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化も、両方の試料で約１．５σ以上になり、ただし、σは、ＰＥＴ画像法により測定して及び／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定によって脳アミロイドプラークがなかった対照集団で測定された、Ｔ２１７及びＴ２０５、Ｔ１８１及びＴ２０５、またはＴ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。なおさらなる実施形態において、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特定部位でのタウリン酸化の測定されたレベルを、様々な数学演算に用いて、それぞれ自身に比べて予測力を改善することができる。例えば、比（複数可）を、測定されたリン酸化レベルから計算することができる。比以外の数学演算も使用可能である。
【0088】
タウリン酸化及びタウ総量の測定法は、第ＩＩ章に記載されており、参照することでこの章に援用される。例えば、実施例５～９に詳細を記載するプロトコルを使用すると、Ｔ１８１、Ｔ２０５、及びＴ２１７でのタウリン酸化は、ＣＳＦから精製された単離タウ試料で測定した場合、ＰＥＴ画像法により測定して脳アミロイドプラークがなかった対照集団において、それぞれ、２１．７±２．３、０．３４±０．１３、及び１．２±０．６６である（表２、変異非保持者の欄を参照）。したがって、変異非保持者で見られる平均より標準偏差の２倍高い（すなわち２σ）とは、ｐ－Ｔ１８１、ｐ－Ｔ２０５、及びｐ－Ｔ２１７でそれぞれ、４３．４、０．６８、及び２．４、である。しかしながら、当業者ならわかるだろうが、絶対値は、プロトコルに応じて変化する可能性がある。
【0089】
好適な実施形態において、単離タウ試料は、アフィニティー精製により血液またはＣＳＦから精製されたタウを含み、タウリン酸化は、質量分析により測定される。別の好適な実施形態において、単離タウ試料は、タウのミッドドメイン内のエピトープと特異的に結合するリガンドを用い、任意選択でタウのＮ末端内のエピトープと特異的に結合する第二リガンドを併用して、アフィニティー精製により血液またはＣＳＦから精製されたタウを含み、タウリン酸化は、高分解能質量分析により測定される。別の好適な実施形態において、単離タウ試料は、タウのミッドドメイン内のエピトープと特異的に結合するリガンドを用い、任意選択でタウのＭＴＢＲまたはＣ末端内のエピトープと特異的に結合する第二リガンドを併用して、アフィニティー精製により血液またはＣＳＦから精製されたタウを含み、タウリン酸化は、高分解能質量分析により測定される。例示の実施形態において、実施例に概要を記載した質量分析プロトコルが使用される。
【0090】
上記実施形態のそれぞれにおいて、対象は、臨床試験の治療群に登録される場合がある。「治療」は、第Ｖ章で定義されている。臨床試験の治療群に登録された対象には、医薬組成物が投与される場合がある。実施形態によっては、医薬組成物は、造影剤を含む場合がある。造影剤の限定ではなく例として、機能性造影剤（例えばフルオロデオキシグルコースなど）及び分子造影剤（例えば、ピッツバーグ化合物Ｂ、フロルベタベン、フロルベタピル、フルテメタモル、放射性核種標識化抗体など）が挙げられる。あるいは、医薬組成物は、活性医薬成分を含む場合がある。活性医薬成分の限定ではなく例として、コリンエステラーゼ阻害剤、Ｎ－メチルＤ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、抗鬱薬（例えば、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、非定型抗鬱薬、アミノケトン、選択的セロトニン及びノルエピネフリン再取り込み阻害剤、三環系抗鬱薬など）、ガンマセクレターゼ阻害剤、ベータセクレターゼ阻害剤、抗Ａβ抗体（抗原結合断片、バリアント、またはそれらの誘導体を含む）、抗タウ抗体（抗原結合断片、バリアント、またはそれらの誘導体を含む）、幹細胞、栄養補助食品（例えばリチウム水、オメガ３脂肪酸＋リポ酸、長鎖トリグリセリド、ゲニステイン、レスベラトロール、クルクミン、及びブドウ種子エキスなど）、セロトニン受容体６のアンタゴニスト、ｐ３８アルファＭＡＰＫ阻害剤、組換え顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、受動免疫療法、活性ワクチン（例えばＣＡＤ１０６、ＡＦ２０５１３など）、タウタンパク質凝集阻害剤（例えばＴＲｘ０２３７、塩化メチルチオニニウムなど）、血糖制御を改善する治療薬（例えば、インスリン、エキセナチド、リラグルチドピオグリタゾンなど）、抗炎症剤、ホスホジエステラーゼ９Ａ阻害剤、シグマ１受容体アゴニスト、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ活性化剤、ホスファターゼ阻害剤、アンジオテンシン受容体遮断薬、ＣＢ１及び／またはＣＢ２エンドカンナビノイド受容体部分アゴニスト、β２アドレナリン受容体アゴニスト、ニコチン性アセチルコリン受容体アゴニスト、５－ＨＴ２Ａ逆作動薬、アルファ２ｃアドレナリン受容体アンタゴニスト、５－ＨＴ１Ａ及び１Ｄ受容体アゴニスト、グルタミニルペプチドシクロトランスフェラーゼ阻害剤、ＡＰＰ産生の選択的阻害剤、モノアミンオキシダーゼＢ阻害剤、グルタミン酸受容体アンタゴニスト、ＡＭＰＡ受容体アゴニスト、神経成長因子賦活薬、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、神経栄養剤、ムスカリンＭ１受容体アゴニスト、ＧＡＢＡ受容体修飾薬、ＰＰＡＲ－ガンマアゴニスト、微小管タンパク質修飾薬、カルシウムチャネル遮断薬、降圧薬、スタチン、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例示の実施形態において、医薬組成物は、キナーゼ阻害剤を含む場合がある。適切なキナーゼ阻害剤は、サウザンドアンドワンアミノ酸キナーゼ（ＴＡＯＫ）、ＣＤＫ、ＧＳＫ－３β、ＭＡＲＫ、ＣＤＫ５、またはＦｙｎを阻害する場合がある。別の例示の実施形態において、医薬組成物は、ホスファターゼ活性化剤を含む場合がある。限定ではなく例として、ホスファターゼ活性化剤は、タンパク質ホスファターゼ２Ａの活性を高める場合がある。
【0091】
上記実施形態のそれぞれにおいて、対象は症候性である場合もそうでない場合もある。「無症候性対象」は、本明細書中使用される場合、ＡＤの兆候または症候をなにも示していない対象を示す。あるいは、対象は、ＡＤの兆候または症候（例えば、記憶喪失、物の置き忘れ、気分または挙動の変動など）を呈している場合があるが、軽度認知障害と臨床診断するのに十分な認知または機能障害を示していない。症候性対象でも無症候性対象でも、Ａβアミロイドーシスを有する場合がある；しかしながら、Ａβアミロイドーシスの事前の所見は、治療の必要条件ではない。なおさらなる実施形態において、対象は、ＡＤを有する場合がある。上記実施形態のいずれかにおいて、対象は、優性遺伝性アルツハイマー病を引き起こすことが既知である遺伝子変異の１つを保有している場合がある。代替実施形態において、対象は、優性遺伝性アルツハイマー病を引き起こすことが既知である遺伝子変異の１つを保有していない場合がある。
【0092】
以下の実施例は、本発明の好適な実施形態を実証するために含められている。当業者ならわかるはずだが、以下の実施例に開示される技法は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者らにより発見された技法を表す。しかしながら、当業者なら、本開示に照らして、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態に変更を加えることができ、それでもなお、類似または同様な結果を得ることができることがわかるはずである。したがって、記載されるまたは添付の図面に示される全ての内容は、例示として解釈されるべきであり、限定する意味で解釈されるべきではない。
【実施例】
【0093】
以下の実施例は、本発明の様々な反復を例示している。
【0094】
実施例１ 正常な非ＡＤヒト脳におけるタウタンパク質のリン酸化部位
正常な可溶性の脳のタウのリン酸化部位を特定するために、健康な対照由来の抽出物を、リン酸化タウ及び非リン酸化タウの両方を濃縮する、タウ－１及びＨＪ８．５タウ抗体を用いた免疫捕獲により精製した。脳のタウのイソ型のトリプシン消化により、長く、十分に疎水性でＬＣ－ＭＳで検出することができる２７種の未修飾ペプチドが生成した（Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）。２５種のペプチドが、潜在的なリン酸化部位としてセリン及び／またはスレオニンを含有していた。数種のペプチドが複数の潜在的なリン酸化部位（４～９ヶ所）を含有しており、このことから、本発明者らは、ＬＣ分離中に異なるモノリン酸化ペプチドが一緒に共溶出する可能性があると考えるに至った。この後、上述のＰＲＭスクリーニング法をこれらのペプチドに適用した。
正常な可溶性の脳のタウのリン酸化部位を特定するために、健康な対照由来の抽出物を、リン酸化タウ及び非リン酸化タウの両方を濃縮する、タウ－１及びＨＪ８．５タウ抗体を用いた免疫捕獲により精製した。脳のタウのイソ型のトリプシン消化により、長く、十分に疎水性でＬＣ－ＭＳで検出することができる２７種の未修飾ペプチドが生成した（Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）。２５種のペプチドが、潜在的なリン酸化部位としてセリン及び／またはスレオニンを含有していた。数種のペプチドが複数の潜在的なリン酸化部位（４～９ヶ所）を含有しており、このことから、本発明者らは、ＬＣ分離中に異なるモノリン酸化ペプチドが一緒に共溶出する可能性があると考えるに至った。この後、上述のＰＲＭスクリーニング法をこれらのペプチドに適用した。
【0095】
タウ配列中のプロジェクションドメイン（１０３～１２６）の分析の結果により、重なり合った複雑なＬＣ－ＭＳ／ＭＳパターンで溶出する複数のｐ－タウペプチドの存在が明らかになった（図３～７）。本発明者らは、タウタンパク質の最短のイソ型である０Ｎイソ型から３個所のリン酸化部位を特定した。ＬＣシステムには、当該の３種のリン酸化ペプチドを識別するだけの分離能はなかったが、断片の同定及び対応する強度を用いて、残基Ｓ１１３の１つの主要なリン酸化部位と、残基Ｔ１１１及びＴ１２３の２つの副次的なリン酸化部位とから構成されるシグナルであることを解き明かした（図３）。対照的に、より長い１Ｎ及び２Ｎイソ型からタウ配列をＰＲＭスクリーニングする際には、特に同一ペプチド配列内に複数の潜在的なモノリン酸化部位が予測される場合、リン酸化ペプチドの溶出パターンを単純化するために、さらにクロマトグラフィー分離を行うことが必要であった（図４～６）。本発明者らは、ＬＣ分離により、差示的にリン酸化された残基を含有する、共溶出した、半特異的なＭＳ／ＭＳ断片を同定することができた。ただし、本発明者らは、ＬＣアーチファクトに起因する可能性のある少数のシグナルも特定しており、これらのシグナルは、恐らく溶液中における同一のペプチドの２種の立体配座に起因するものと思われる（図５）。この影響は、未修飾ペプチド及びリン酸化ペプチドの両方の、アミノ酸残基４５～６７を含有するペプチド配列（０Ｎイソ型において）にとって重要であり（図５）、配列６８～１２６（１Ｎ）及び８８～１２６（２Ｎ）に関してはあまり一般的ではなかった（図４及び６）。
【0096】
ペプチド配列６８～１２６（１Ｎ）及び８８～１２６（２Ｎ）において、残基Ｓ１１３、Ｔ１１１、及びＴ１２３におけるリン酸化が確認された。すべての場合において、Ｓ１１３のシグナルは上記３種のうち最大であり、リン酸化率は０．２～０．５％であった（図４及び図６、表１）。ペプチド配列４５～６７（１Ｎ及び２Ｎイソ型で共有）上で、残基Ｔ５０、Ｔ５２、及びＳ５６におけるリン酸化が明確に特定された。同一のペプチド上で、ＬＣ－ＭＳシグナルにより、３つの残基（Ｓ６１、Ｔ６３、及びＳ６４）のうちの少なくとも２つがリン酸化されていることが示された（図５）。残基Ｓ４６における潜在的なリン酸化を特定する特異的なシグナルは見られなかった。配列６８～１２６（１Ｎ）及び６８～８７（２Ｎ）中の残基Ｓ６８及びＴ６９におけるリン酸化が裏付けられたが、それらのＬＣ－ＭＳパターンを識別する特異的断片は検出されなかった。同じ１Ｎ及び２Ｎペプチド配列上で、Ｔ７１におけるリン酸化レベルがより低いことが認められた。２Ｎに特異的な、Ｔ７６、Ｔ１０１、及びＴ１０２残基上でのリン酸化も特定された（図８にまとめている）。
【0097】
既報の、トリプシン切断部位の後に位置するリン酸化残基（部位Ｔ１７５、Ｔ１８１、Ｓ２１２、Ｔ２３１、及びＳ３９６）（Ｈａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９８）のスクリーニングのために、トリプシン未切断（ｔｒｙｐｓｉｎ ｍｉｓｓｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ）の導入も考慮した。本発明者らによるＰＲＭスクリーニングによって、Ｈａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．により正常な脳組織について既報のリン酸化タウペプチドに対応するＬＣ－ＭＳパターンを検出することに成功した（Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、及びＳ４０４、図８）。対応するＬＣ－ＭＳシグナルは高く、正常なヒト脳について既報のｐ－タウペプチドの量が最も多い可能性が高いことを示唆している。本発明者らによるＳ１９９とＳ２０２のリン酸化の比較では、Ｓ２０２におけるリン酸化が大幅に多いことが一般的であることが示された（図８）。抗Ｔａｕ１抗体を使用してタウの抽出を行い、１９２～１９９アミノ酸配列上の非リン酸化エピトープと連結させることで、抽出物中のＳ１９９リン酸化の回収率が低いことを説明することができる。本発明者らは、この抽出物中においてＳ２０２及びＳ４０４のリン酸化が多く起こることを前提として、配列１９５～２０９及び３８６～４０６由来のジリン酸化ペプチドの存在を探索した。本発明者らは、Ｓ２０２／Ｓ１９９及びＳ２０２／Ｓ１９８における２ヶ所でのリン酸化に対応する特異的断片を含む２つのＬＣ－ＭＳパターン、及び３９６／４０４における２ヶ所でのリン酸化に対応する１つのＬＣ－ＭＳパターンを検出した（図８）。
【0098】
さらに脳抽出物中の可溶性タウのスクリーニングを行うことにより、Ｔ１７５、Ｓ２１４、Ｔ２１７、Ｔ２３１、及びＳ３９６のリン酸化残基に対応する、量がより少ない他のモノリン酸化ペプチドの存在が証明された。モノリン酸化ペプチド配列１８１～１９０をスクリーニングした際に、Ｓ１８４またはＳ１８５においてリン酸化されたペプチドに対応する断片由来のシグナルも低レベルで検出された（図８）。長い配列４０７～４３８上でのモノリン酸化の探索により、残基Ｓ４０９及びＳ４１６におけるリン酸化、及び残基Ｓ４１２／Ｓ４１３／Ｔ４１４の群における少なくとも１つのリン酸化と一致するパターンが見出された。
【0099】
全体として、本発明者らは、ＰＲＭスクリーニング法を使用して、正常な非ＡＤの脳から抽出した可溶性タウ画分中で検出可能な最低２９ヶ所の一意的なリン酸化部位を特定した（表１）。上記リン酸化部位の２５ヶ所は、一意的なＬＣ－ＭＳシグナルに明確に帰属することができ、４ヶ所のさらなるリン酸化部位は、正確なＬＣ－ＭＳパターンには帰属されないが、それらの存在が証明された。これらの部位は３つのクラスター上に位置していた。すなわち、Ｎ末端のプロジェクションドメイン中に最低１４ヶ所、当該配列の中央のプロリン・リッチドメイン上に１０ヶ所、そしてＣ末端上に６個のリン酸化部位が位置していた（図１４）。
【表1-1】
【表1-2】
【0100】
実施例２ ＣＳＦ中のタウタンパク質上のリン酸化部位
脳のタウの消化物と比較して、タウ特異的抗体及び消化を用いたＣＳＦのタウの精製では、主としてタンパク質配列のミッドドメイン（残基１５０～２２１）由来の検出可能なペプチドが生成した。タウのＮ末端に由来するペプチドは、程度は比較的低いが検出可能であり、微小管結合リピート（ＭＴＢＲ）ドメインまたはＣ末端に由来する配列はほとんど検出することができなかった（Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１６；Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。このシグナル回収率の違いは、ニューロンからの放出の際のタウのトランケーションに起因する可能性がある（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。このミッドドメインのペプチド回収率は、現在のＰＲＭ法を用いて対応する少量のリン酸化イソ型を監視するのに十分であった。逆に、ＭＴＢＲドメイン及びＣ末端ドメイン中のリン酸化ペプチドを検出するには、ＭＳ法の大幅な技術的な進歩が必要となろう。
脳のタウの消化物と比較して、タウ特異的抗体及び消化を用いたＣＳＦのタウの精製では、主としてタンパク質配列のミッドドメイン（残基１５０～２２１）由来の検出可能なペプチドが生成した。タウのＮ末端に由来するペプチドは、程度は比較的低いが検出可能であり、微小管結合リピート（ＭＴＢＲ）ドメインまたはＣ末端に由来する配列はほとんど検出することができなかった（Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１６；Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。このシグナル回収率の違いは、ニューロンからの放出の際のタウのトランケーションに起因する可能性がある（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。このミッドドメインのペプチド回収率は、現在のＰＲＭ法を用いて対応する少量のリン酸化イソ型を監視するのに十分であった。逆に、ＭＴＢＲドメイン及びＣ末端ドメイン中のリン酸化ペプチドを検出するには、ＭＳ法の大幅な技術的な進歩が必要となろう。
【0101】
正常な対照のＣＳＦ由来のタウのリン酸化ペプチドのＰＲＭスクリーニングによって、脳の可溶性タウと同様に、Ｔ１８１（図示せず）、Ｓ１９９、Ｓ２０２、及びＴ２１７（図９）の数ヶ所のリン酸化部位が特定された。ｐＳ２１４に対応する低いシグナルも検出された（図９）。ＣＳＦ抽出物においてｐＴ２０５に対応する特異的断片化パターンが特定され、クロマトグラフィーによりｐＳ１９９／ｐＳ２０２シグナルから分離された。（図９）。
【0102】
本発明者らは、ＣＳＦのタウにおいてさらなるリン酸化部位を検出する可能性を高めるために、軽度～中程度の認知症のＡＤ患者由来のＣＳＦプールを分析した。本発明者らは、ＡＤのＣＳＦプールは、高い濃度のタウだけでなく、高いレベルのリン酸化タウも含有すると予想した。ＡＤのＣＳＦにおいて、正常なＣＳＦ中に見られるものと同様のリン酸化残基（Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｔ２１７、及びＴ２３１）が検出された。さらに、これまでに脳由来のタウにおいて検出され、正常なＣＳＦにおいては検出されなかったｐＳ１１３及びｐＴ１７５に対応するシグナルがＡＤのＣＳＦ中で検出された（図９、図１０）。Ｓ２０２／Ｓ１９９リン酸化ペプチドに由来する特異的断片及び他のものとは異なる保持時間を含むＬＣ－ＭＳ／ＭＳパターンにより、Ｓ２０８においてリン酸化された新たなペプチドの同定が可能になった。本発明者らは、正常なＣＳＦ中のｐＳ２０８を再検討した際に、これに対応する少量のシグナルを検出した。残基Ｔ１５３においてリン酸化された新たなペプチドと一致するＬＣ－ＭＳ／ＭＳパターンが、対応する非リン酸化ペプチドのレベルと近いレベルで検出された（図１０）。脳抽出物のデータを慎重に再検討したところ、この部位に対応するシグナルは存在量が少ないことが示唆された。最後に、本発明者らは、ＡＤのＣＳＦ中の０Ｎイソ型由来の１０３～１２６アミノ酸配列上のリン酸化に対応する特異的なシグナルを見出したが、該シグナルは、Ｔ１１１がこのペプチド上の主要なリン酸化部位である一方、Ｓ１１３はほとんどリン酸化されないことを示している（図１１）。全体として、ＣＳＦのタウ中に１２ヶ所のリン酸化部位が検出され、それらのうちの２ヶ所は脳ライセート中では検出できなかった（図１２）。
【0103】
実施例３ ＣＳＦのｐ－タウの存在量の測定値は脳中のｐ－タウの存在量と比較して違いが際立つ
脳において、調べたリン酸化部位の中でＳ４０４が最も高度にリン酸化されていた（ｐＳ４０４／Ｓ４０４＝１１０％、すなち、Ｓ４０４の５２％がリン酸化される）。したがって、他の高度にリン酸化された部位、Ｓ２０２及びＴ１８１（それぞれ９．７％及び９．５％）と比較して、半分を超える脳のタウがＳ４０４においてリン酸化されていた。Ｓ１９９の１．３％がリン酸化されたが、この値は、抽出に用いたＴａｕ１抗体がその対応するリン酸化されたエピトープに結合することができない（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， １９９３）ことに起因して、過小評価されている可能性がある。Ｓ４０４以外のＣ末端部位上でのリン酸化は約１％であることが判明した。Ｎ末端では、Ｔ５２、Ｓ６８／Ｔ６９、Ｔ５０、及びＳ１１３も、約０．５％～２％の範囲の量でリン酸化されていた。他の検出された部位のリン酸化レベルは大幅に低い（＜０．５％）ように思われた。
脳において、調べたリン酸化部位の中でＳ４０４が最も高度にリン酸化されていた（ｐＳ４０４／Ｓ４０４＝１１０％、すなち、Ｓ４０４の５２％がリン酸化される）。したがって、他の高度にリン酸化された部位、Ｓ２０２及びＴ１８１（それぞれ９．７％及び９．５％）と比較して、半分を超える脳のタウがＳ４０４においてリン酸化されていた。Ｓ１９９の１．３％がリン酸化されたが、この値は、抽出に用いたＴａｕ１抗体がその対応するリン酸化されたエピトープに結合することができない（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， １９９３）ことに起因して、過小評価されている可能性がある。Ｓ４０４以外のＣ末端部位上でのリン酸化は約１％であることが判明した。Ｎ末端では、Ｔ５２、Ｓ６８／Ｔ６９、Ｔ５０、及びＳ１１３も、約０．５％～２％の範囲の量でリン酸化されていた。他の検出された部位のリン酸化レベルは大幅に低い（＜０．５％）ように思われた。
【0104】
ＣＳＦのタウにおいてｐＴ２０５及びｐＳ２０８が一意的に検出され、脳のタウにおいては検出されないことに加えて、脳のタウにおいて検出された特定の他のリン酸化部位の相対的なリン酸化の存在量は、対照のＣＳＦのタウと比較して変化した（図１３）。脳と比較して、ＣＳＦのタウのリン酸化は、部位ｐＳ１９９、ｐＳ２０２、及びｐＳ２１４において有意に低かった（それぞれ、１／６に減少、ｐ＝０．００８；１／５に減少、ｐ＝０．０１６；及び１／２に減少、ｐ＝０．０１６）。逆に、ＣＳＦのタウのリン酸化は、０Ｎ由来の部位ｐＴ２１７、ｐＴ２３１、及びｐＴ１１１において有意に高かった（それぞれ、４倍増加、ｐ＝０．０１６；７倍増加、ｐ＝０．０１６；及び１６倍増加）。ｐＴ１８１の存在量はＣＳＦ中と脳中で同様であった（約１０％）。ＡＤのＣＳＦ中で測定した場合、ｐＴ１７５は低いままであった（脳における０．１％と比較して０．１～０．２％）。
【0105】
脳のタウとＣＳＦのタウではトランケーションのパターンが異なる。すなわち、脳のタウのイソ型は主として完全長である一方、ＣＳＦのタウのイソ型はトランケートされている。ＩＰ後に回収された脳のタウのイソ型及びＣＳＦのタウのイソ型ならびに対応するペプチドは、免疫沈降に使用される抗体に依存する（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。同様に、タウを免疫沈降させるために使用する抗体は、タウのリン酸化の回収率に影響を与える可能性がある。このｐ－タウの回収率に対する影響を評価するために、本発明者らは、タウ１＋ＨＪ８．５の組み合わせに加えて、種々の抗体（タウ１３、ＨＪ８．５、ＨＪ８．７、タウ１、及びタウ５）を用いて、リン酸化率に対するＩＰ－ＭＳの結果を比較した（図１４）。タウ１またはタウ１＋ＨＪ８．５を脳及び脳脊髄液中で用いた場合には、ｐＳ１９９／Ｓ１９９比の有意な減少が観測された。このことは、Ｎ末端とミッドドメインとの間のＣＳＦトランケーションが、脳に比較して、ｐＳ１９９のリン酸化の測定に影響を与える可能性があることを示唆している。脳及びＣＳＦ中で他の抗体を用いて測定したｐＳ１９９／Ｓ１９９比は比較的類似しているように思われた。興味深いことに、ｐＳ１９９に関してはある程度の反応性がなおも観測され、ＣＳＦ中では反応性が低く、このことは、タウ１の結合が非選択的である、但しＳ１９９のリン酸化は報告されているタウ１エピトープ（１９２～１９９）の端部には存在することを示唆している。
【0106】
剖検までの死後の期間（ＰＭＩ）中にホスファターゼ活性が脳抽出物中で測定したタウのリン酸化を減少させる可能性があることから、本発明者らは、ＣＳＦ及び脳抽出物中で一般的に見られるリン酸化率に対するＰＭＩの影響を調べた。ＰＭＩの範囲が５～１６時間の被験者から採取したタウ病態のない１０名の脳の試料（中前頭回）を分析した。最初に分析した脳抽出物のいずれについても、ＰＭＩは１６時間を超えてはいなかった。ＰＭＩと、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２１４、Ｔ２１７、Ｔ２３１、及びＳ４０４部位で測定したリン酸化率との間に有意な関連性は見られなかった（スピアマン検定、９５％信頼区間、表示せず）。
【0107】
実施例４ ＣＳＦ中におけるＡＤ特異的ｐ－タウの変化
ＡＤにおいて一般的に報告されているＣＳＦのｐ－タウの増加は、２つの潜在的な作用、すなわち、１）タウのリン酸化の状態に関係なくタウの全体的な増加、または２）特定の部位における高リン酸化の増加の結果である可能性がある。非リン酸化タウを用いてｐ－タウのシグナルまたはレベルを正規化すると、タウ総量の全体的な変化とは独立に生じる、特定の部位におけるリン酸化の化学量論の変化（すなわち、正常なＣＳＦのタウまたは脳のタウと比較しての高リン酸化または低リン酸化）を定量化することができる。本発明者らが最近実証したように、ＡＤにおいては可溶性タウの産生が増加し、該産生はアミロイドプラークと相関している。したがって、量だけでなく、リン酸化の比率を制御することが理解の鍵となる。ＡＤのＣＳＦ中において、ｐＴ１８１、ｐＴ２１７、ｐＴ２３１、ｐＴ２０５、ｐＳ２０８、及びｐＳ２１４が、０Ｎ特異的ｐＴ１１１と同様に高リン酸化された（図１３）。ｐＴ１５３及びｐＴ１７５は非ＡＤにおいては検出されず、ＡＤにおいてはわずかに増加している可能性がある。非ＡＤと比較して有意な高リン酸化を示す部位は、ｐＴ１８１（ｐ＝０．０１０）、ｐＳ２１４（ｐ＝０．００５）、及びｐＴ２１７（ｐ＝０．００３）であった。ｐＴ１８１、ｐＳ２１４、及びｐＴ２１７は、それぞれ約１．２倍、１．６倍、及び４倍のリン酸化の増加を示した。興味深いことに、すべての監視対象部位が高リン酸化さたわけではない。すなわち、ｐＳ１９９／Ｓ１９９は有意に変化しておらず、ｐＳ２０２／Ｓ２０２は有意に低く（ｐ＝０．０３０）、約１／１．２に減少した。
ＡＤにおいて一般的に報告されているＣＳＦのｐ－タウの増加は、２つの潜在的な作用、すなわち、１）タウのリン酸化の状態に関係なくタウの全体的な増加、または２）特定の部位における高リン酸化の増加の結果である可能性がある。非リン酸化タウを用いてｐ－タウのシグナルまたはレベルを正規化すると、タウ総量の全体的な変化とは独立に生じる、特定の部位におけるリン酸化の化学量論の変化（すなわち、正常なＣＳＦのタウまたは脳のタウと比較しての高リン酸化または低リン酸化）を定量化することができる。本発明者らが最近実証したように、ＡＤにおいては可溶性タウの産生が増加し、該産生はアミロイドプラークと相関している。したがって、量だけでなく、リン酸化の比率を制御することが理解の鍵となる。ＡＤのＣＳＦ中において、ｐＴ１８１、ｐＴ２１７、ｐＴ２３１、ｐＴ２０５、ｐＳ２０８、及びｐＳ２１４が、０Ｎ特異的ｐＴ１１１と同様に高リン酸化された（図１３）。ｐＴ１５３及びｐＴ１７５は非ＡＤにおいては検出されず、ＡＤにおいてはわずかに増加している可能性がある。非ＡＤと比較して有意な高リン酸化を示す部位は、ｐＴ１８１（ｐ＝０．０１０）、ｐＳ２１４（ｐ＝０．００５）、及びｐＴ２１７（ｐ＝０．００３）であった。ｐＴ１８１、ｐＳ２１４、及びｐＴ２１７は、それぞれ約１．２倍、１．６倍、及び４倍のリン酸化の増加を示した。興味深いことに、すべての監視対象部位が高リン酸化さたわけではない。すなわち、ｐＳ１９９／Ｓ１９９は有意に変化しておらず、ｐＳ２０２／Ｓ２０２は有意に低く（ｐ＝０．０３０）、約１／１．２に減少した。
【0108】
ＣＳＦを１６時間インキュベートすることによりリン酸化比のロバスト性を評価した。インキュベーションは、非ＡＤのＣＳＦとＡＤのＣＳＦとの間で観測されたタウのリン酸化比の差に対して有意な影響を与えなかった（図１５）。さらに、インキュベーション後にＣＳＦ中でスパイクした組換え１５Ｎ－タウのリン酸化が検出されないことにより、ＣＳＦのタウ上にキナーゼ活性はないことを確認した（図示せず）。
【0109】
実施例１～４に関する考察
ｐ－タウ測定におけるＰＲＭの技術的進歩－現在までの最も包括的な、正常な脳組織及びＣＳＦにおけるｐ－タウの定性及び定量分析を記載する。本発明者らの手法は、少量がリン酸化される潜在的な部位を捕捉していなかった可能性がある、タウのリン酸化に関するこれまでのＤＤＡ法による研究とは対照的である。しかしながら、本発明者らの手法は、高感度のＰＲＭモードでのターゲットＭＳを用いて、少量のリン酸化を検出及び定量化する。リン酸化部位の特定は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳパターンを注意深く手動で判読し、試験対象の各リン酸化ペプチドの特異的なイオン断片の共溶出を識別することに依拠している。以前の研究において、脳のタウのリン酸化については、主としてＰＨＦ由来の高リン酸化タウに富む不溶性抽出物において試験が行われており、これまでの最も詳細な研究では、正常なヒトタウタンパク質中に９ヶ所のリン酸化部位が報告されている（Ｈａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００７）。本発明者らの詳細なＰＲＭデータ解析により、２９個を超えるリン酸化残基が検出され、それらの大部分は存在量が非常に少ないものであった。実際、既報の９ヶ所の部位は、当該タンパク質中の最も存在量の多い修飾の中にあった。ＰＲＭ分析を脳と比較して大幅に少ない量で存在する正常なＣＳＦのタウに適用した結果、最初に９ヶ所のリン酸化部位が検出され、ＡＤのＣＳＦ中でさらに３ヶ所の部位が検出された。
ｐ－タウ測定におけるＰＲＭの技術的進歩－現在までの最も包括的な、正常な脳組織及びＣＳＦにおけるｐ－タウの定性及び定量分析を記載する。本発明者らの手法は、少量がリン酸化される潜在的な部位を捕捉していなかった可能性がある、タウのリン酸化に関するこれまでのＤＤＡ法による研究とは対照的である。しかしながら、本発明者らの手法は、高感度のＰＲＭモードでのターゲットＭＳを用いて、少量のリン酸化を検出及び定量化する。リン酸化部位の特定は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳパターンを注意深く手動で判読し、試験対象の各リン酸化ペプチドの特異的なイオン断片の共溶出を識別することに依拠している。以前の研究において、脳のタウのリン酸化については、主としてＰＨＦ由来の高リン酸化タウに富む不溶性抽出物において試験が行われており、これまでの最も詳細な研究では、正常なヒトタウタンパク質中に９ヶ所のリン酸化部位が報告されている（Ｈａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００７）。本発明者らの詳細なＰＲＭデータ解析により、２９個を超えるリン酸化残基が検出され、それらの大部分は存在量が非常に少ないものであった。実際、既報の９ヶ所の部位は、当該タンパク質中の最も存在量の多い修飾の中にあった。ＰＲＭ分析を脳と比較して大幅に少ない量で存在する正常なＣＳＦのタウに適用した結果、最初に９ヶ所のリン酸化部位が検出され、ＡＤのＣＳＦ中でさらに３ヶ所の部位が検出された。
【0110】
本発明者らは、検出されたリン酸化部位の数が有意に増加したことに加えて、高感度ＰＲＭスクリーニングにより、全体のタウ濃度とは独立に、タウのリン酸化率または化学量論を定量的に評価することを可能にする方法を示した。この概念は見過ごされがちであるが、ＣＳＦのｐ－タウの絶対濃度が、全体的なタウのイソ型濃度の増加のみに起因し、相対的なリン酸化タウの存在量の変化には起因しないで増加する可能性がある場合、ＡＤにおける変化を評価する上で重要である。本研究のリン酸化率測定によって初めて、タンパク質全体にわたって、種々のコンパートメント中（細胞内である脳対細胞外であるＣＳＦ）で、及び種々の病的状態（ＡＤ対非ＡＤ）において、リン酸化率の変化の程度及び分布の比較（高リン酸化対低リン酸化）が可能になった。
【0111】
ＰＲＭスクリーニングプロセスのいくつかの注意点としては、検出の処理速度が低いこと、及びｐ－タウ種または本研究において仮定していない他の翻訳後修飾（ＰＴＭ）が失われる危険性がある。ＭＳデータからの同定をより広い検証または臨床コホートにさらに使用して、スケジュール化したＬＣ－ＭＳ法を設計し、多重化及び処理速度を向上させることができる（Ｇｉｌｌｅｔｔｅ ａｎｄ Ｃａｒｒ， ２０１３）。ＡｓｐＮなどの他のプロテアーゼによって、トリプシン消化物とは異なる一組のタウペプチド及びｐ－タウペプチドが与えられる場合があり、これによりタウのより広い範囲、すなわちＣ末端ドメインの網羅が可能になる（Ｈａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９８；Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ． ２０１８）。本研究では考慮していない２ヶ所または３ヶ所でリン酸化されたタウペプチドをさらにスクリーニングすることによって、上記探索をさらに精細化することができるが、部位のリン酸化の生物学的調整がない限り、上記リン酸化タウペプチドの存在量はごくわずかである。
【0112】
タウのプロジェクションドメイン上のリン酸化部位のクラスターの特定－本発明者らは、別のスプライシング依存性ペプチドを含むタウのＮ末端プロジェクションドメイン上に、これまで報告されていないリン酸化残基のクラスターを見出した。興味深いことに、このドメインは、ヒト脳の不溶性画分中のＰＨＦにおいて広範囲にリン酸化されることがこれまで知られていなかった（Ｆｕｎｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１４；Ｈａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００７；Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１６；Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）。このクラスターは、マウス脳中のマウスタウタンパク質について実施された最近の包括的な研究（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）においても広範にはキャラクタライズされていなかった。これらの食い違いは、わずかな特異的なＭＳ／ＭＳ断片及び／またはＬＣ上での微妙な保持時間のシフトによってのみ識別可能なリン酸化ペプチドの複雑な混合物をキャラクタライズすることの困難さに帰される可能性がある。例えば、Ｓ４６は、正常なヒトタウ中のこのドメインにおいて既報の唯一のリン酸化部位である（Ｈａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９８）。しかしながら、本発明者らはこの種に関する特異的なシグナルを検出しておらず、この種は、探索アルゴリズムによって、類似する断片化パターンを共有する、隣接するＴ５０またはＴ５２のリン酸化部位と混同された可能性がある。この点に関して、各リン酸化部位に対応するＬＣ－ＭＳ／ＭＳパターンを明確に解釈かつ解読するには手動での精査が不可欠である。この食い違いの別の可能性のある説明としては、ＭＴＢＲドメイン、ミッドドメイン、及びＣ末端と比較して、ＰＨＦ中のＮ末端ドメインの存在量が比較的に少ない（Ｍａｉｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）ことである可能性がある。
【0113】
このＮ末端プロジェクションドメインは最近、隣接する微小管（ＭＴＢＲドメインを介してタウに連結している）が互いに接近するのを妨げる反発バリアの主要な成分の一部として帰属された（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）。この配列は多数の酸性残基を含有しており、リン酸化の増加は全体的な酸性度の増加に寄与し、上記反発バリアを強める可能性がある。エクソン２－３の選択的スプライシングによって誘導される可変量のＮ末端伸長ととともに、タウのリン酸化は、タウ／タウＮ末端相互作用及び微小管の分子間距離を調節する可能性がある。
【0114】
脳対ＣＳＦにおける異なるｐ－タウプロファイルの生物学的意義－タウは主として微小管の安定性に機能する細胞内タンパク質であり、従来から神経損傷または細胞死の際に専ら細胞外に放出されると考えられていた。しかし、最近の研究では、タウは生理学的及び病理学的条件下で規制された形態で分泌されることが示唆されている（Ｋａｒｃｈ ｅｔ ａｌ． ２０１２；Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。本発明者らは最近、可溶性の脳のタウ及びＣＳＦのタウのプロファイルを、並行してニューロンモデルにおける細胞内及び細胞外のタウプロファイルならびに代謝と比較することによって、タウ分泌がトランケートされたタウ及びｐ－タウを含むタウのイソ型の異なる代謝回転時間を伴う能動的なプロセスであることを示した（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。脳とＣＳＦの間でのｐ－タウプロファイルの比較により、この能動的な分泌とタウのリン酸化との関連性を理解することにより、ＡＤの病因についての可能性のある識見を得られる。
【0115】
本発明者らは、ＣＳＦ中で濃縮されたｐ－タウのイソ型は、微小管に対する親和性が低く、分泌される可能性が高いと推測している。逆に、ＣＳＦ中で希薄化されたｐ－タウのイソ型は、ニューロン内に留まる及び／または切断を回避する傾向が高くなる可能性がある。本発明者らの結果は、ＣＳＦ中では脳抽出物と比較して、Ｔ２１７、Ｔ２３１、Ｔ１５３、及びＴ１１１などのいくつかのリン酸化残基が有意に濃縮されていることを示している。すべてが、プロリン指向性の部位であり、ＧＳＫ－３βプロテインキナーゼの潜在的な基質であり、キナーゼ依存性の調節を受ける可能性がある。ｐＳ２１４は、ｐＴ２１７とは異なり、ＣＳＦ中においては脳に比較して上昇してはいなかった。このｐＴ２１７のｐＳ２１４に対する細胞外濃縮は、本発明者らが以前これらのイソ型について細胞内で特定した動態学的な違い（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）と一致し、ｐＴ２１７の代謝回転時間は非リン酸化タウ及びタウ－ｐＳ２１４よりも短い。あるいは、脳抽出物中のタウ部位の一部に対して観測された、ＣＳＦとの比較におけるリン酸化の減少は、ＰＭＩ中に生じる部分的な脱リン酸化にも起因する可能性がある（Ｍａｔｓｕｏ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。かかる減少は５～１６時間のＰＭＩの範囲内では観測されなかったが、死亡とこの調査した期間との間のリン酸化比の変化を排除することはできない。質量分析によって脳生検由来のこれらのタウ部位の脱リン酸化の動態学を評価することは、将来のＣＳＦ／脳の比較結果に対するこの現象の影響に対処するのに役立つこととなろう。脳のタウのリン酸化の測定に影響を及ぼす潜在的な脳ホスファターゼによるバイアスを考慮することによって、死後に採取される脳抽出物よりもＣＳＦのタウのリン酸化状態の方が、インビボでのニューロン中のタウのリン酸化状態を反映している可能性がより高いということが裏付けられることとなろう。しかしながら、ＣＳＦのタウのトランケーションのために、インビボでのＣＳＦ中のタウのリン酸化の監視は、主としてタウのミッドドメイン中で検出される部位に限定されることとなる。
【0116】
逆に、ＣＳＦ中ではｐＳ２０２が有意に低く、ＡＤにおいてはｐＳ１９９及びｐＳ２０２が上昇しておらず、このことは、これらのリン酸化によってタウのニューロン内への隔離が促進されている可能性があることを示している。Ｔ１８１はＣＳＦ及び脳中で等しくリン酸化される。ｐＴ２０５及びｐＳ２０８は専らＣＳＦのタウ中で検出され、脳中の可溶性タウタンパク質では検出されなかった。このことは、Ｓ２０２、Ｔ２０５、及びＳ２０８における３ヶ所でのリン酸化が、脳中のタウ凝集のブラーク・ステージをキャラクタライズするために一般的に使用される抗ＡＴ８抗体（Ｍａｌｉａ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）によって認識される（Ｂｒａａｋ ａｎｄ Ｂｒａａｋ．， １９９５）ことを考慮すると興味深い。実際、ＭＳによってＰＨＦ中でｐＳ２０８が検出された（Ｈａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。本発明者らの研究において、正常な可溶性の脳のタウ中にはｐＴ２０５及びｐＳ２０８は存在せず、これにより正常な脳のタウ中でＡＴ８の免疫反応性が検出される可能性はないことが確認された。さらに、最近の研究では、ｐＴ２０５及びｐＳ２０８が、ｐＳ２０２とともにタウの自己凝集につながる複数の組み合わせでのリン酸化パターンとして関係しているとされている（Ｄｅｓｐｒｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）。ＡＤにおいて、ＣＳＦ中にｐＴ２０５及びｐＳ２０８が排他的に存在すること、ならびに両方の部位でリン酸化率がさらに高まっていることは、ニューロンが病因となる傾向のあるこれらのｐ－タウ種を細胞から除去する潜在的な保護的クリアランスの機序を示している可能性がある。ＡＤの脳中で濃縮されたＡＴ８陽性神経原線維変化において、ｐＳ２０２がｐＴ２０５及びｐＳ２０８とともに凝集すると、ＡＤのＣＳＦにおいてｐＳ２０２が同時に減少することは、関連するイソ型の隔離の増加にも対応している可能性がある。あるいは、脳抽出物において、ｐＴ２０５及びｐＳ２０８上でのリン酸化が存在しないことは、ＰＭＩの間に生じるホスファターゼによるそれらの特異的な分解に起因する可能性がある。脳生検から採取したタウについて報告された、ＡＴ８の反応性の急速な消失（＜３時間）はこの考えを裏付けている（Ｍａｔｓｕｏ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。したがって、ｐＴ２０５及びｐＳ２０８を効率的に標的とするかかるホスファターゼ活性は、ニューロンにおけるＡＴ８陽性物質の長い半減期を妨げる更なる機序と見なすこともできる。したがって、ＡＤのＣＳＦ中で見られるｐＴ２０５及びｐＳ２０８の増加は、この保護的機序の潜在的に病理学的な低下の可能性を示しているのであろう。最後に、ＡＤの脳中で濃縮されたＡＴ８陽性神経原線維変化において、ｐＳ２０２がｐＴ２０５及びｐＳ２０８ととともに凝集すると、ＡＤのＣＳＦにおいてｐＳ２０２が同時に減少することは、関連するイソ型の隔離の増加にも対応している可能性がある。
【0117】
本発明者らは、正常な脳由来の可溶性画分中でＭＴＢＲドメイン由来のリン酸化残基を確証的に検出することはできなかった。ＭＴＢＲドメイン上のリン酸化部位は、タウの微小管に対する親和性を低下させるとされている（Ｂｉｅｒｎａｔ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。正常なタウ中にかかるリン酸化が存在しないことは、ＰＨＦ中に見られるこれらの修飾が異常であることを裏付ける可能性がある（Ｈａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。ＭＴＢＲドメインはタウのトランケーション後に細胞内で分解した可能性が高く、したがって、この研究で用いた免疫捕獲法では回収されなかったことから、ＣＳＦのタウのトランケーションによってインビボでのリン酸化の変化の試験は制限される（Ｋａｎｍｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。
【0118】
ＡＤバイオマーカーとしてのＣＳＦのｐ－タウ率－本発明者らは、検出されたリン酸化部位の数が有意に増加したことに加えて、全体のタウ濃度とは独立に、タウのリン酸化率または化学量論を定量化することが可能な方法を示した。この概念は見過ごされがちであるが、ＣＳＦのｐ－タウの絶対濃度が全タウの濃度（すなわちｐＴ１８１）の増加のみに起因し、相対的なリン酸化率自体の増加には起因しないで増加する可能性がある場合、ＡＤにおけるＣＳＦのタウのリン酸化の変化を評価する上で重要である。この研究のリン酸化率測定によって初めて、タンパク質全体にわたって、種々のコンパートメント中（細胞内である脳対細胞外であるＣＳＦ）で、及び種々の病的状態（ＡＤ対非ＡＤ）において、リン酸化率の変化の程度及び分布の比較（高リン酸化対低リン酸化）が可能になった。将来的にこの方法を用いて、免疫化学を使用して最近実施されたように（Ｎｅｄｄｅｎｓ ｅｔ ａｌ． ２０１８）、脳領域及びブラーク・ステージの全体にわたる多数の部位におけるＡＤの脳のリン酸化の変化を調べることができる可能性がある。
【0119】
本発明者らは本研究において、ＡＤのＣＳＦ中のタウは一般に、非ＡＤのＣＳＦと比較して高リン酸化されることを示した。しかしながら、高リン酸化の程度は部位依存的である。Ｔ１１１、Ｔ２０５、Ｓ２０８、及びＴ２１７はＴ１８１よりも高リン酸化されており、Ｔ１８１はＡＤのｐ－タウバイオマーカーとして使用される最も一般的に測定される標的である（Ｆａｇａｎ ｅｔ ａｌ． ２００９）。本発明者らは、専らＡＤのＣＳＦ中で見られるＴ１５３のリン酸化も特定した。興味深いことに、ＡＤのＣＳＦ中で高リン酸化されていることが判明している部位は、脳と比較して正常なＣＳＦ中で既に有意に増加している部位に対応している（すなわち、Ｔ１１１、Ｔ２０５、Ｓ２０８、及びＴ２１７、ならびに程度はより低いがＴ２３１）。このことは、ＡＤ病態が、タウのＣＳＦ中への放出中に特定のｐ－タウのイソ型が濃縮されることに寄与する細胞機序を悪化させることを示していよう。全体として、これらの部位上で見られるこの大きな変化により、本発明者らは、これらの部位をＡＤ検出のための敏感なバイオマーカーとして使用することを想定する。本発明者らの研究は限られた数のＣＳＦプールに依存しており、将来より大きなＣＳＦコホートに対して研究を行えば、ｐ－タウの変化と疾患の経過にわたる脳アミロイドーシス及びタウの凝集との潜在的な関係をいっそう確立することになろう。また、ＰＳＰ、ＣＢＤ、及びＦＴＤなどのＡＤ以外のタウオパチーにおいて、何らかの特定のｐ－タウプロファイルの変化があるかどうかを問うことも可能である。あるいは、この方法は、インビボ及びインビトロにおいて異なるキナーゼの活性を追跡するために使用することもでき、また、異常なタウ代謝を標的とする新薬を評価するための有望なツールを提供する可能性もある。
【0120】
実施例１～４の方法
脳の可溶性タウの抽出－被験者が関与する脳及びＣＳＦの研究は、ｔｈｅ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ及びｔｈｅ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒによる認可を受けた。全ての被験者から、研究に加わる前に書面によるインフォームドコンセントを得た。脳の可溶性タウを既報（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）のように抽出した。簡単に説明すると、既報（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）に記載のアミロイド及びタウの病態がない対照由来の冷凍したヒト脳組織をＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）のＫｎｉｇｈｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ （ＡＤＲＣ）から入手した。サルコシル可溶性タウを、文献（Ｈａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９８）に報告されているように、推定上のタウ凝集体から超遠心分離によって分離し、プールした。冷凍したヒト脳（２００～４００ｍｇ、前頭部）を、氷上のＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、ホスファターゼ阻害剤カクテル３、Ｒｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤、ｐＨ７．４、最終的に３．２５ｍＬ／ｍｇ－組織）中で均質化した。ホモジネートを４℃、１１，０００×ｇで６０分間遠心分離した。上清を１％ サルコシル中で６０分間可溶化し、１００，０００×ｇで２時間遠心分離した。サルコシル可溶性画分をプールし、５０ｕＬの画分を０．５％ ヒト血漿で１０倍希釈し、その後免疫沈降を行った。脳／ＣＳＦの比較のために、免疫精製前に脳ライセートプールを５００～８０００倍希釈してＣＳＦのタウレベルに合わせた。
脳の可溶性タウの抽出－被験者が関与する脳及びＣＳＦの研究は、ｔｈｅ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ及びｔｈｅ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒによる認可を受けた。全ての被験者から、研究に加わる前に書面によるインフォームドコンセントを得た。脳の可溶性タウを既報（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）のように抽出した。簡単に説明すると、既報（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）に記載のアミロイド及びタウの病態がない対照由来の冷凍したヒト脳組織をＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）のＫｎｉｇｈｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ （ＡＤＲＣ）から入手した。サルコシル可溶性タウを、文献（Ｈａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９８）に報告されているように、推定上のタウ凝集体から超遠心分離によって分離し、プールした。冷凍したヒト脳（２００～４００ｍｇ、前頭部）を、氷上のＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、ホスファターゼ阻害剤カクテル３、Ｒｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤、ｐＨ７．４、最終的に３．２５ｍＬ／ｍｇ－組織）中で均質化した。ホモジネートを４℃、１１，０００×ｇで６０分間遠心分離した。上清を１％ サルコシル中で６０分間可溶化し、１００，０００×ｇで２時間遠心分離した。サルコシル可溶性画分をプールし、５０ｕＬの画分を０．５％ ヒト血漿で１０倍希釈し、その後免疫沈降を行った。脳／ＣＳＦの比較のために、免疫精製前に脳ライセートプールを５００～８０００倍希釈してＣＳＦのタウレベルに合わせた。
【0121】
ＣＳＦのタウの抽出－ヒトＣＳＦを、アミロイド陰性かつ認知が正常な（ＣＤＲ＝０）対照（ｎ＝４７、年齢６０歳超）及びアミロイド陽性かつＣＤＲ＞０のＡＤ患者（ｎ＝３３、年齢６０歳超）を含む８０名の被験者のコホートからプールした。上記対照群及びＡＤ群から５００ｕＬのＣＳＦアリコートのそれぞれ５つ及び７つのプールを形成した。最初の採取時に、ＣＳＦを１，０００×ｇで１０分間遠沈して細胞片を除去し、直ちに－８０℃で冷凍した。実験中にプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した。タウを、一部変更を加えた上で既報（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）のように、免疫沈降及び脱塩した。簡単に説明すれば、ＣＮＢｒ活性化セファロースビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ １７－０４３０－０１）を、ビーズｇ当り３ｍｇの抗体の濃度で、抗体タウ１及びＨＪ８．５と別個に架橋した。試料を、試料ｍＬ当り、それぞれの目的の配列について、１０ｆｍｏｌのリン酸化タウ及び１００ｆｍｏｌの非リン酸化タウに相当するＡＱＵＡペプチド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でスパイクする。タウ及びｐ－タウの濃度は、これらの内部標準を用いて計算する。可溶性タウは、界面活性剤（１％ ＮＰ－４０）、カオトロピック試薬（５ｍＭ グアニジン）、及びプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ）中で免疫沈降させた。セファロースビーズに結合させた抗タウ１及びＨＪ８．５抗体を、不活化セファロースビーズ中でそれぞれ１０倍及び５倍希釈し、３０ｕＬの抗体ビーズの５０％スラリーを上記溶液ととともに室温で９０分間回転させた。上記ビーズを２５ｍＭ 重炭酸トリエチルアンモニウムバッファー（ＴＥＡＢＣ， Ｆｌｕｋａ １７９０２）中で３回洗浄した。結合したタウをビーズ上で４００ｎｇのＭＳグレードのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｖ５１１１）を用い、３７℃で１６時間消化した。消化物をＴｏｐＴｉｐ Ｃ１８（Ｇｌｙｇｅｎ， ＴＴ２Ｃ１８．９６）上に担持し、脱塩し、製造元の指示に従って溶出させた。溶出したペプチドを真空遠心分離（ＣｅｎｔｒｉＶａｐ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ Ｌａｂｃｏｎｃｏ）で乾燥し、２５ｕＬの２％ アセトニトリル及び０．１％ ギ酸のＭＳグレード水の溶液中に再懸濁させた。
【0122】
質量分析－上記ペプチド再懸濁液の５ｕＬアリコートをｎａｎｏ－Ａｃｑｕｉｔｙ ＬＣに注入してＭＳ分析を行った。ｎａｎｏ－Ａｃｑｕｉｔｙ ＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍｉｌｆｏｒｄ， ＭＡ）にはＨＳＳ Ｔ３ ７５ｕｍ×１００ｕｍ、１．８ｕｍカラムを取り付けてあり、流速０．５ｕＬ／分の溶液Ａ及びＢの勾配を用いてペプチドを分離した。溶液Ａは０．１％ ギ酸のＭＳグレードの水の溶液で構成し、溶液Ｂは０．１％ ギ酸のアセトニトリル溶液で構成した。２％～２０％の溶液Ｂの勾配で２８分間、次いで２０％～４０％の溶液Ｂの勾配でさらに１３分間、ペプチドをカラムから溶出させた後、さらに３分間で８５％の溶液Ｂまで上昇させてカラムを洗浄した。Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ ＬｕｍｏｓにＮａｎｏｓｐｒａｙ Ｆｌｅｘエレクトロスプレーイオン源（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳ ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）を装着した。１０ｕｍ ＳｉｌｉｃａＴｉｐエミッター（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ， Ｗｏｂｕｒｎ， Ｍａ）からイオン源中にスプレーされたペプチドイオンが四重極を標的とし、この四重極において分離された。次に、これらをＨＣＤによって断片化し、Ｏｒｂｉｔｒａｐでイオン断片を検出した（分解能６０，０００、質量範囲１５０～１２００ｍ／ｚ）。ペプチドプロファイリングのための親水性ペプチド（ＳＳＲｃａｌｃ＜９、すべてロイシンなし）の監視を、ＨＳＳ Ｔ３ ３００ｕｍ×１００ｕｍ、１．８ｍｍカラム上、４ｕｌ／分の流速、２％～１２％の溶液Ｂの勾配を行う溶出、及び３０ｍｍＳｉｌｉｃａＴｉｐエミッター上で動作するスプレーで実施した。
【0123】
ｐ－タウペプチド検出のためのＰＲＭの原理－ヒト脳の可溶性画分などのタウが濃縮された生物学的抽出物由来のタンパク質の消化によって、仮定するリン酸化部位を含有するタウペプチドを生成させた。これらのペプチドを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｌｕｍｏｓなどの四重極－Ｏｒｂｉｔｒａｐ装置を使用したターゲットＭＳ分析によってスクリーニングする。それぞれのリン酸化ペプチドについて、前駆体質量、衝突エネルギー、または予想保持時間などのターゲットＭＳパラメータの選択をインシリコで行い、当該試料中における存在量が大幅に多い対応する未修飾ペプチドについて測定した生物物理学的特性を用いて精密化した。リン酸化ペプチドを検出するために、仮定する前駆体質量を含む質量ウィンドウを選択するように四重極を設定する。前駆体の衝突後、Ｏｒｂｉｔｒａｐ中で、クロマトグラフィーの溶出時間全体にわたって生成したすべての断片を同時に測定する。潜在的にリン酸化されるペプチドは、得られたデータの後解析で探索することができる。Ｓｋｙｌｉｎｅソフトウェア（ＭａｃＣｏｓｓ Ｌａｂ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＷＡ）を使用してＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータを抽出した。スクリーニングされている仮定するペプチドは、予測されるＭＳ／ＭＳ断片から抽出される質量の厳密な共溶出によって構成されるＬＣ－ＭＳ／ＭＳフィンガープリントとして検出される（図２）。従来のＤＤＡまたはターゲットＭＳ法に対する本ＰＲＭ法の利点は、ＭＳ機器装置を可能な範囲で最高の感度の構成で使用し、検出能力を維持することができる点である。
【0124】
スクリーニング時の四重極－Ｏｒｂｉｔｒａｐ装置の最大感度は少量のイオン断片を検出するために不可欠であり、リン酸化部位の位置の特定ととともにリン酸化ペプチドの同定を容易にする。ＰＲＭ測定の感度は、主としてＯｒｂｉｔｒａｐアナライザー中に移送された対象である標的由来のイオンの数に依存する。この数は、１つのＭＳ／ＨＲＭＳスキャンを取得するために用いられる充填時間を長くすることによって増加した。この充填時間は、イオンビームからイオントラップ装置に標的である前駆体質量を蓄積させるために費やす時間に対応する。次いで蓄積した前駆体を断片化し、生成した断片をＯｒｂｉｔｒａｐ中に移送して分析する。したがって、充填時間は、クロマトグラフィーのシグナルを記述するのに十分なデータポイントを取得するのに十分なＭＳスキャン速度（すなわち、クロマトグラフピーク当り８～１５スキャン）の必要性によって制限される最大値に設定される。調査した各リン酸化ペプチドに対するＰＲＭスクリーニングの充填時間は通常１秒に設定した。
【0125】
充填時間はトラップが飽和する危険性によっても制限される。このトラップ飽和は、同一のスキャン内でサンプリングされるイオンが多過ぎて、これがＯｒｂｉｔｒａｐに移送される場合に発生し、空間電荷の影響によって質量測定が不正確になる。かかる飽和を回避するために、マトリクス上の標的を濃縮する適切な試料精製（免疫精製）とともに、狭い前駆体分離（０．７Ｄａ）を選択して、潜在的な近同重体干渉（ｎｅａｒ－ｉｓｏｂａｒｉｃ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）の寄与の可能性を低減した。
【0126】
ＰＲＭによる検出実験の特異性は、ＬＣ－Ｑ Ｏｒｂｉｔｒａｐシステムの分解能に依存する。分解能は種々の分析パラメータによって向上させることができ、最終的な目標は、標的ペプチドの干渉のないＬＣ－ＭＳ／ＭＳフィンガープリントを得ることである。これにより、誤検出シグナルによるあいまいな断片の帰属の危険性が制限される。ｐ－タウを優先的に濃縮する試料の精製によっても、少量のリン酸化タウペプチドの検出における特異性を向上させることができる。クロマトグラフピーク容量及び分離能が高いと共溶出の可能性が制限される。前駆体に対する四重極分離ウィンドウが狭いと、ＭＳ／ＭＳスペクトル上での干渉の確率が低下し、同時に上記のトラップ飽和の危険性が制限される。Ｏｒｂｉｔｒａｐの高い解像度及びアナライザーの較正によりデータ処理中に質量断片を正確に抽出することが可能になり、これによりトランジション干渉の危険性が制限される（Ｇａｌｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１２；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）。Ｏｒｂｉｔｒａｐ解像度の選択（６０ｋ）は、より多くの取得時間を要する高解像度と、クロマトグラフィーの取得と両立する妥当なスキャン速度との間のバランスである。
【0127】
タウの部位特異的リン酸化率の定量評価－本発明者らは、脳及びＣＳＦ由来のタウにおける特定部位のリン酸化の相対的な量を定量的に評価するために、検出されたそれぞれの部位のリン酸化の程度を測定した。本発明者らはこの目的のために、以下の３種の方法を用いた。１）リン酸化ペプチド異性体間の相対比較：トランジションイオン由来のシグナルの比較を用いて、各リン酸化部位を特定する。これにより、同一の配列を共有する各リン酸化ペプチドの相対存在量を推定することができる。２）リン酸化ペプチドの非リン酸化ペプチドを基準とした正規化：各リン酸化ペプチドに特異的なＬＣ－ＭＳ／ＭＳトランジションを、非リン酸化ペプチドからの対応するトランジションと比較する。得られた各リン酸化部位の比をタンパク質配列全体にわたって比較することができる。この方法は、非リン酸化ペプチドとリン酸化ペプチドの間の断片化効率の違いによってバイアスされる可能性がある。この方法は、リン酸化部位がトリプシン未切断の一部である場合には適用することできない。３）各リン酸化ペプチド及び非リン酸化ペプチドの標識した合成内部標準（例えばＡＱＵＡ）を使用した絶対的定量：リン酸化及び非リン酸化標準由来のシグナルを用いて内部での比率を明らかにする。この方法は、比較する各ペプチドの断片化特異性を考慮に入れるが、それぞれの監視対象の種のペプチド合成を要する。
【0128】
この研究においては、トリプシン未切断を含むリン酸化部位を除いて、上記第二の方法を利用してリン酸化率を計算した。本発明者らはまた、合成リン酸化ペプチドが入手可能であった場合の、脳及びＣＳＦ抽出物の両方に存在した１組の限定されたリン酸化部位（すなわち、Ｔ１７５、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｔ２０５、Ｔ２１７、及びＴ２３１）、ならびに脳のみに存在した１つの部位（Ｓ４０４）に、上記第３の方法（ＡＱＵＡ正規化）も適用した（表１）。ＡＱＵＡ測定に関しては、脳抽出物を、ＣＳＦのタウのレベルと同等となるように５００～８０００倍希釈した。この希釈により、脳中とＣＳＦ中におけるタウペプチドレベルに対するＡＱＵＡ内部標準の大幅に異なる比率から生じる可能性のあるマトリクス効果が最小限に抑えられた。上記第一の方法は、多数のリン酸化残基を含有するｐ－タウ配列に由来する複雑なＬＣ－ＭＳ／ＭＳパターンの初期の段階での解釈に使用した。
【0129】
統計学－特に指定がない限り、データは平均値±ＳＤとして表す。データの正規分布を確認した後、タウのリン酸化率を比較するために、一元配置分散分析に続いて事後解析（チューキー検定）を実施した。更なる統計学的解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．のＧｒａｐｈＰａｄバージョン８．０．１（２４４）を使用して完了した。関連性のある群間の統計学的有意性は、両側、対応のないマン・ホイットニーｔ検定によって判定した。有意性は０．０１及び０．０５レベルで評価した。
【0130】
実施例１～４の引用文献
Ａｌｏｎｓｏ， Ａ． ｄｅｌ Ｃ．， Ｚａｉｄｉ， Ｔ．， Ｎｏｖａｋ， Ｍ．， Ｇｒｕｎｄｋｅ－Ｉｑｂａｌ， Ｉ．， ａｎｄ Ｉｑｂａｌ， Ｋ． （２００１）． Ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ τ ｉｎｔｏ ｔａｎｇｌｅｓ ｏｆ ｐａｉｒｅｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｆｉｌａｍｅｎｔｓ／ｓｔｒａｉｇｈｔ ｆｉｌａｍｅｎｔｓ． ＰＮＡＳ ９８， ６９２３－６９２８． ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２１１１９２９８．
Ａｌｏｎｓｏ， Ａ． ｄｅｌ Ｃ．， Ｚａｉｄｉ， Ｔ．， Ｎｏｖａｋ， Ｍ．， Ｇｒｕｎｄｋｅ－Ｉｑｂａｌ， Ｉ．， ａｎｄ Ｉｑｂａｌ， Ｋ． （２００１）． Ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ τ ｉｎｔｏ ｔａｎｇｌｅｓ ｏｆ ｐａｉｒｅｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｆｉｌａｍｅｎｔｓ／ｓｔｒａｉｇｈｔ ｆｉｌａｍｅｎｔｓ． ＰＮＡＳ ９８， ６９２３－６９２８． ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２１１１９２９８．
【0131】
Ａｕｇｕｓｔｉｎａｃｋ， Ｊ． Ｃ．， Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ａ．， Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ， Ｅ．－Ｍ．， ａｎｄ Ｈｙｍａｎ， Ｂ． Ｔ． （２００２）． Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｕ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ １０３， ２６－３５． ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００４０１０１００４２３．
【0132】
Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ， Ｎ． Ｒ．， Ｆｅｎａｉｌｌｅ， Ｆ．， Ｈｉｒｔｚ， Ｃ．， Ｓｅｒｇｅａｎｔ， Ｎ．， Ｓｃｈｒａｅｎ－Ｍａｓｃｈｋｅ， Ｓ．， Ｖｉａｌａｒｅｔ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （２０１６）． Ｔａｕ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ ｂｙ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｔ Ｈｉｇｈ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｖｅｒａｇｅ Ｐｒｏｖｉｄｅｓ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ Ｉｔｓ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ． Ｊ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ． １５， ６６７－６７６． ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｊｐｒｏｔｅｏｍｅ．５ｂ０１００１．
【0133】
Ｂｉｅｒｎａｔ， Ｊ．， Ｇｕｓｔｋｅ， Ｎ．， Ｄｒｅｗｅｓ， Ｇ．， Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ， Ｅ．－， ａｎｄ Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ， Ｅ． （１９９３）． Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｒ２６２ ｓｔｒｏｎｇｌｙ ｒｅｄｕｃｅｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔａｕ ｔｏ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ： Ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＰＨＦ－ｌｉｋｅ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ｂｉｎｄｉｎｇ． Ｎｅｕｒｏｎ １１， １５３－１６３． ｄｏｉ：１０．１０１６／０８９６－６２７３（９３）９０２７９－Ｚ．
【0134】
Ｂｒａａｋ， Ｈ．， ａｎｄ Ｂｒａａｋ， Ｅ． （１９９５）． Ｓｔａｇｉｎｇ ｏｆ ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｃｈａｎｇｅｓ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇ １６， ２７１－２７８． ｄｏｉ：１０．１０１６／０１９７－４５８０（９５）０００２１－６．
【0135】
Ｃｈｕｎｇ， Ｐ． Ｊ．， Ｓｏｎｇ， Ｃ．， Ｄｅｅｋ， Ｊ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｈ． Ｐ．， Ｌｉ， Ｙ．， Ｃｈｏｉ， Ｍ． Ｃ．， ｅｔ ａｌ． （２０１６）． Ｔａｕ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ｂｕｎｄｌｅ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ ｆａｓｃｉｃｌｅｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｘｏｎ ｉｎｉｔｉａｌ ｓｅｇｍｅｎｔ． Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ７， １２２７８． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１２２７８．
【0136】
Ｄｅｓｐｒｅｓ， Ｃ．， Ｂｙｒｎｅ， Ｃ．， Ｑｉ， Ｈ．， Ｃａｎｔｒｅｌｌｅ， Ｆ．－Ｘ．， Ｈｕｖｅｎｔ， Ｉ．， Ｃｈａｍｂｒａｕｄ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ． （２０１７）． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｔａｕ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ｔｈａｔ ｄｒｉｖｅｓ ｉｔｓ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ． ＰＮＡＳ １１４， ９０８０－９０８５． ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１７０８４４８１１４．
【0137】
Ｆｕｎｋ， Ｋ． Ｅ．， Ｔｈｏｍａｓ， Ｓ． Ｎ．， Ｓｃｈａｆｅｒ， Ｋ． Ｎ．， Ｃｏｏｐｅｒ， Ｇ． Ｌ．， Ｌｉａｏ， Ｚ．， Ｃｌａｒｋ， Ｄ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （２０１４）． Ｌｙｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｓ ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｕ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ａｎｄ ａ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｏｆ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ４６２， ７７－８８． ｄｏｉ：１０．１０４２／ＢＪ２０１４０３７２．
【0138】
Ｇａｌｌｉｅｎ， Ｓ．， Ｂｏｕｒｍａｕｄ， Ａ．， Ｋｉｍ， Ｓ． Ｙ．， ａｎｄ Ｄｏｍｏｎ， Ｂ． （２０１４）． Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐａｒａｌｌｅｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １００， １４７－１５９． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｐｒｏｔ．２０１３．１０．０２９．
【0139】
Ｇａｌｌｉｅｎ， Ｓ．， Ｄｕｒｉｅｚ， Ｅ．， Ｃｒｏｎｅ， Ｃ．， Ｋｅｌｌｍａｎｎ， Ｍ．， Ｍｏｅｈｒｉｎｇ， Ｔ．， ａｎｄ Ｄｏｍｏｎ， Ｂ． （２０１２）． Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １１， １７０９－１７２３． ｄｏｉ：１０．１０７４／ｍｃｐ．Ｏ１１２．０１９８０２．
【0140】
Ｇｉｌｌｅｔｔｅ， Ｍ． Ａ．， ａｎｄ Ｃａｒｒ， Ｓ． Ａ． （２０１３）． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０， ２８－３４． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２３０９．
【0141】
Ｈａｎｇｅｒ， Ｄ． Ｐ．， Ｂｅｔｔｓ， Ｊ． Ｃ．， Ｌｏｖｉｎｙ， Ｔ． Ｌ．， Ｂｌａｃｋｓｔｏｃｋ， Ｗ． Ｐ．， ａｎｄ Ａｎｄｅｒｔｏｎ， Ｂ． Ｈ． （１９９８ａ）． Ｎｅｗ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｉｎ ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｔａｕ （ｐａｉｒｅｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｆｉｌａｍｅｎｔ－ｔａｕ） ｆｒｏｍ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｒａｉｎ ｕｓｉｎｇ ｎａｎｏｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ７１， ２４６５－２４７６．
【0142】
Ｈａｎｇｅｒ， Ｄ． Ｐ．， Ｂｅｔｔｓ， Ｊ． Ｃ．， Ｌｏｖｉｎｙ， Ｔ． Ｌ． Ｆ．， Ｂｌａｃｋｓｔｏｃｋ， Ｗ． Ｐ．， ａｎｄ Ａｎｄｅｒｔｏｎ， Ｂ． Ｈ． （１９９８ｂ）． Ｎｅｗ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ Ｓｉｔｅｓ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｉｎ Ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ Ｔａｕ （Ｐａｉｒｅｄ Ｈｅｌｉｃａｌ Ｆｉｌａｍｅｎｔ－Ｔａｕ） ｆｒｏｍ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｂｒａｉｎ Ｕｓｉｎｇ Ｎａｎｏｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７１， ２４６５－２４７６． ｄｏｉ：１０．１０４６／ｊ．１４７１－４１５９．１９９８．７１０６２４６５．ｘ．
【0143】
Ｈａｎｇｅｒ， Ｄ． Ｐ．， Ｂｙｅｒｓ， Ｈ． Ｌ．， Ｗｒａｙ， Ｓ．， Ｌｅｕｎｇ， Ｋ．－Ｙ．， Ｓａｘｔｏｎ， Ｍ． Ｊ．， Ｓｅｅｒｅｅｒａｍ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２００７）． Ｎｏｖｅｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ Ｓｉｔｅｓ ｉｎ Ｔａｕ ｆｒｏｍ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｂｒａｉｎ Ｓｕｐｐｏｒｔ ａ Ｒｏｌｅ ｆｏｒ Ｃａｓｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ １ ｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８２， ２３６４５－２３６５４． ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ７０３２６９２００．
【0144】
Ｈａｓｅｇａｗａ， Ｍ．， Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ－Ｋａｗａｓｈｉｍａ， Ｍ．， Ｔａｋｉｏ， Ｋ．， Ｓｕｚｕｋｉ， Ｍ．， Ｔｉｔａｎｉ， Ｋ．， ａｎｄ Ｉｈａｒａ， Ｙ． （１９９２）． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｔａｕ ｉｎ ｔｈｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｒａｉｎ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７， １７０４７－１７０５４．
【0145】
Ｉｑｂａｌ， Ｋ．， Ａｌｏｎｓｏ， Ａ． ｄｅｌ Ｃ．， Ｃｈｅｎ， Ｓ．， Ｃｈｏｈａｎ， Ｍ． Ｏ．， Ｅｌ－Ａｋｋａｄ， Ｅ．， Ｇｏｎｇ， Ｃ．－Ｘ．， ｅｔ ａｌ． （２００５）． Ｔａｕ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｔａｕｏｐａｔｈｉｅｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １７３９， １９８－２１０． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂａｄｉｓ．２００４．０９．００８．
【0146】
Ｋａｎｍｅｒｔ， Ｄ．， Ｃａｎｔｌｏｎ， Ａ．， Ｍｕｒａｔｏｒｅ， Ｃ． Ｒ．， Ｊｉｎ， Ｍ．， Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ， Ｔ． Ｔ．， Ｌｅｅ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ． （２０１５）． Ｃ－Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ Ｆｏｒｍｓ ｏｆ Ｔａｕ， Ｂｕｔ Ｎｏｔ Ｆｕｌｌ－Ｌｅｎｇｔｈ Ｔａｕ ｏｒ Ｉｔｓ Ｃ－Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ， Ａｒｅ Ｒｅｌｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ Ｎｅｕｒｏｎｓ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ３５， １０８５１－１０８６５． ｄｏｉ：１０．１５２３／ＪＮＥＵＲＯＳＣＩ．０３８７－１５．２０１５．
【0147】
Ｋａｒｃｈ， Ｃ． Ｍ．， Ｊｅｎｇ， Ａ． Ｔ．， ａｎｄ Ｇｏａｔｅ， Ａ． Ｍ． （２０１２）． Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔａｕ Ｌｅｖｅｌｓ Ａｒｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｂｙ Ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｔａｕ Ｔｈａｔ Ｉｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｔａｕｏｐａｔｈｉｅｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８７， ４２７５１－４２７６２． ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１２．３８０６４２．
【0148】
Ｋｏｐｋｅ， Ｅ．， Ｔｕｎｇ， Ｙ． Ｃ．， Ｓｈａｉｋｈ， Ｓ．， Ａｌｏｎｓｏ， Ａ． Ｃ．， Ｉｑｂａｌ， Ｋ．， ａｎｄ Ｇｒｕｎｄｋｅ－Ｉｑｂａｌ， Ｉ． （１９９３）． Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｕ． Ａｂｎｏｒｍａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｎ－ｐａｉｒｅｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｐｏｏｌ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８， ２４３７４－２４３８４．
【0149】
Ｌｉｕ， Ｗ．－Ｋ．， Ｍｏｏｒｅ， Ｗ． Ｔ．， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｒ． Ｔ．， Ｈａｌｌ， Ｆ． Ｌ．， ａｎｄ Ｙｅｎ， Ｓ．－Ｈ． （１９９３）． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏ－ ａｎｄ ｕｎｐｈｏｓｐｈｏ－ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ａ ｓｕｂｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｕ ｍｏｌｅｃｕｌｅ， ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４， ３７１－３７６． ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｎｒ．４９０３４０３１５．
【0150】
Ｍａｉｒ， Ｗ．， Ｍｕｎｔｅｌ， Ｊ．， Ｔｅｐｐｅｒ， Ｋ．， Ｔａｎｇ， Ｓ．， Ｂｉｅｒｎａｔ， Ｊ．， Ｓｅｅｌｅｙ， Ｗ． Ｗ．， ｅｔ ａｌ． （２０１６）． ＦＬＥＸＩＴａｕ： Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｔａｕ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ８８， ３７０４－３７１４． ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ａｎａｌｃｈｅｍ．５ｂ０４５０９．
【0151】
Ｍａｌｉａ， Ｔ． Ｊ．， Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ， Ａ．， Ｅｒｎｓｔ， Ｒ．， Ｗｕ， Ｓ．－Ｊ．， Ｌａｃｙ， Ｅ． Ｒ．， Ｌｉｕ， Ｘ．， ｅｔ ａｌ． （２０１６）． Ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｔａｕ ｂｙ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｔａｕ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＡＴ８． Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ８４， ４２７－４３４． ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｒｏｔ．２４９８８．
【0152】
Ｍａｔｓｕｏ， Ｅ．Ｓ．， Ｓｈｉｎ， Ｒ－Ｗ．， Ｂｉｌｌｉｎｇｓｌｅｙ， Ｍ．Ｌ．， Ｖａｎ ｄｅＶｏｏｒｄｅ， Ａ．， Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ， Ｍ．， Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ， Ｊ．Ｑ．， ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｂｉｏｐｓｙ－ｄｅｒｉｖｅｄ ａｄｕｌｔ ｂｒａｉｎ ｔａｕ ｉｓ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ａｔ ｍａｎｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｓｉｔｅｓ ａｓ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｉｒｅｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｔａｕ． Ｎｅｕｒｏｎ １３， ９８９－１００２．
【0153】
Ｍｏｒｒｉｓ， Ｍ．， Ｋｎｕｄｓｅｎ， Ｇ． Ｍ．， Ｍａｅｄａ， Ｓ．， Ｔｒｉｎｉｄａｄ， Ｊ． Ｃ．， Ｉｏａｎｏｖｉｃｉｕ， Ａ．， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， Ａ． Ｌ．， ｅｔ ａｌ． （２０１５）． Ｔａｕ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ． Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １８， １１８３－１１８９． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎ．４０６７．
【0154】
Ｎｅｄｄｅｎｓ， Ｊ．， Ｔｅｍｍｅｌ， Ｍ．， Ｆｌｕｎｋｅｒｔ， Ｓ．， Ｋｅｒｓｃｈｂａｕｍｅｒ， Ｂ．， Ｈｏｅｌｌｅｒ Ｃ．， Ｌｏｅｆｆｌｅｒ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． （２０１８）． Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔａｕ ｓｉｔｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｇｉｃａ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ６， ５２． ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ４０４７８－０１８－０５５７－６
【0155】
Ｐｅｔｅｒｓｏｎ， Ａ． Ｃ．， Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｊ． Ｄ．， Ｂａｉｌｅｙ， Ｄ． Ｊ．， Ｗｅｓｔｐｈａｌｌ， Ｍ． Ｓ．， ａｎｄ Ｃｏｏｎ， Ｊ． Ｊ． （２０１２）． Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｍａｓｓ Ａｃｃｕｒａｃｙ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ， Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １１， １４７５－１４８８． ｄｏｉ：１０．１０７４／ｍｃｐ．Ｏ１１２．０２０１３１．
【0156】
Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｃ． Ｌ．， Ｍｉｔｒａ， Ｖ．， Ｈａｎｓｓｏｎ， Ｋ．， Ｂｌｅｎｎｏｗ， Ｋ．， Ｇｏｂｏｍ， Ｊ．， Ｚｅｔｔｅｒｂｅｒｇ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ． （２０１６）． Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ Ｔａｕ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ Ｔａｕ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ ｂｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｐｒｏｖｉｄｅｓ Ｎｅｗ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ５５， ３０３－３１３． ｄｏｉ：１０．３２３３／ＪＡＤ－１６０６３３．
【0157】
Ｓａｔｏ， Ｃ．， Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ， Ｎ． Ｒ．， Ｍａｗｕｅｎｙｅｇａ， Ｋ． Ｇ．， Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ， Ｂ． Ｗ．， Ｇｏｒｄｏｎ， Ｂ． Ａ．， Ｊｏｃｋｅｌ－Ｂａｌｓａｒｏｔｔｉ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （２０１８）． Ｔａｕ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｎｅｕｒｏｎ ９７， １２８４－１２９８．ｅ７． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２０１８．０２．０１５．
【0158】
Ｓｃｈｏｌｌ， Ｍ．， Ｌｏｃｋｈａｒｔ， Ｓ． Ｎ．， Ｓｃｈｏｎｈａｕｔ， Ｄ． Ｒ．， Ｏ’Ｎｅｉｌ， Ｊ． Ｐ．， Ｊａｎａｂｉ， Ｍ．， Ｏｓｓｅｎｋｏｐｐｅｌｅ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ． （２０１６）． ＰＥＴ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ｔａｕ Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ａｇｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ． Ｎｅｕｒｏｎ ８９， ９７１－９８２． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２０１６．０１．０２８．
【0159】
Ｔｈｏｍａｓ， Ｓ． Ｎ．， Ｆｕｎｋ， Ｋ． Ｅ．， Ｗａｎ， Ｙ．， Ｌｉａｏ， Ｚ．， Ｄａｖｉｅｓ， Ｐ．， Ｋｕｒｅｔ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （２０１２）． Ｄｕａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ＰＨＦ－ｔａｕ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｌｙｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｂｉｑｕｉｔｙｌａｔｉｏｎ： ａ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｐｐｒｏａｃｈ． Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ １２３， １０５－１１７． ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００４０１－０１１－０８９３－０．
【0160】
Ｖｉｌｌｅｍａｇｎｅ， Ｖ． Ｌ．， Ｆｏｄｅｒｏ－Ｔａｖｏｌｅｔｔｉ， Ｍ． Ｔ．， Ｍａｓｔｅｒｓ， Ｃ． Ｌ．， ａｎｄ Ｒｏｗｅ， Ｃ． Ｃ． （２０１５）． Ｔａｕ ｉｍａｇｉｎｇ： ｅａｒｌｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ． Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １４， １１４－１２４． ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ１４７４－４４２２（１４）７０２５２－２．
【0161】
Ｗａｎｇ， Ｙ．， ａｎｄ Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ， Ｅ． （２０１６）． Ｔａｕ ｉｎ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １７， ２２－３５． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｎ．２０１５．１．
【0162】
Ｙａｍａｄａ， Ｋ．， Ｈｏｌｔｈ， Ｊ． Ｋ．， Ｌｉａｏ， Ｆ．， Ｓｔｅｗａｒｔ， Ｆ． Ｒ．， Ｍａｈａｎ， Ｔ． Ｅ．， Ｊｉａｎｇ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ． （２０１４）． Ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔａｕ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． ２１１， ３８７-３９３． ｄｏｉ：１０．１０８４／ｊｅｍ．２０１３１６８５．
【0163】
実施例５ 脳アミロイドの病態はタウの高リン酸化の部位特異的な違いと関連性がある
皮質ＰｉＢ－ＰＥＴの標準取込値比（ＳＵＶＲ）は、信頼性をもって有意な皮質Ａβプラークを識別し、対象をＰＩＢ陽性（アミロイド＋、ＳＵＶＲ≧１．２５）または陰性（アミロイド－、ＳＵＶＲ＜１．２５）として分類するために用いられる。本発明者らは、アミロイドプラークと可溶性タウ種の関係を調査するために、皮質ＰｉＢ－ＰＥＴのＳＵＶＲを、ＣＳＦのタウの総量及び複数の部位におけるＣＳＦのタウのリン酸化（すなわち、タウの非リン酸化部位に対するリン酸化部位の比）と比較した（図１６Ａ）。変異保持者（ＭＣ）を、皮質Ａβプラークを有する（すなわち、アミロイド＋）として分類するためのＴｈｒ２１７におけるタウのリン酸化（ｐ－Ｔ２１７）の曲線下面積（ＡＵＣ）は９７．２％（０．９４、０．９９の９５％信頼区間（ＣＩ））；Ｔｈｒ１８１におけるタウのリン酸化（ｐ－Ｔ１８１）のＡＵＣは８９．１％（ＣＩ ０．８３、０．９４）；Ｔｈｒ２０５におけるタウのリン酸化（ｐ－Ｔ２０５）のＡＵＣは７４．５％（ＣＩ ０．６９、０．８２）であり；タウ総量のＡＵＣは７２％（ＣＩ ０．６５、０．７９）であった。これらのデータは、有意な原線維性Ａβ陽性プラークの初期段階において、特定の部位におけるリン酸化の増加が既に開始しており、やがてこれら２つのプロセスを結びつけることを示している。これらのデータはまた、Ｔ２１７の非リン酸化に対するリン酸化の比の増加が、原線維性Ａβプラーク病態に関する高感度の診断マーカーとして役立つことも示している。
皮質ＰｉＢ－ＰＥＴの標準取込値比（ＳＵＶＲ）は、信頼性をもって有意な皮質Ａβプラークを識別し、対象をＰＩＢ陽性（アミロイド＋、ＳＵＶＲ≧１．２５）または陰性（アミロイド－、ＳＵＶＲ＜１．２５）として分類するために用いられる。本発明者らは、アミロイドプラークと可溶性タウ種の関係を調査するために、皮質ＰｉＢ－ＰＥＴのＳＵＶＲを、ＣＳＦのタウの総量及び複数の部位におけるＣＳＦのタウのリン酸化（すなわち、タウの非リン酸化部位に対するリン酸化部位の比）と比較した（図１６Ａ）。変異保持者（ＭＣ）を、皮質Ａβプラークを有する（すなわち、アミロイド＋）として分類するためのＴｈｒ２１７におけるタウのリン酸化（ｐ－Ｔ２１７）の曲線下面積（ＡＵＣ）は９７．２％（０．９４、０．９９の９５％信頼区間（ＣＩ））；Ｔｈｒ１８１におけるタウのリン酸化（ｐ－Ｔ１８１）のＡＵＣは８９．１％（ＣＩ ０．８３、０．９４）；Ｔｈｒ２０５におけるタウのリン酸化（ｐ－Ｔ２０５）のＡＵＣは７４．５％（ＣＩ ０．６９、０．８２）であり；タウ総量のＡＵＣは７２％（ＣＩ ０．６５、０．７９）であった。これらのデータは、有意な原線維性Ａβ陽性プラークの初期段階において、特定の部位におけるリン酸化の増加が既に開始しており、やがてこれら２つのプロセスを結びつけることを示している。これらのデータはまた、Ｔ２１７の非リン酸化に対するリン酸化の比の増加が、原線維性Ａβプラーク病態に関する高感度の診断マーカーとして役立つことも示している。
【0164】
次に、本発明者らは、Ａβプラーク総負荷とリン酸化との関係を調査するために、ＰｉＢ－ＰＥＴ ＳＵＶＲ四分位数による４ヶ所のリン酸化部位の平均標準化リン酸化比及びタウ総量レベルを比較した（図１６Ｂ）。Ｓｅｒ２０２（ｐ－Ｓ２０２）を除くすべてのリン酸化部位は、より大きなＡβプラーク病態を伴うリン酸化の増加を示した。他の３ヶ所の部位間の違いも見出した。ｐ－Ｔ２１７及びｐ－Ｔ１８１は、プラークが始まると最大の増加を示した（四分位数２～３）が、これらの増加の大きさはプラークの負荷が大きくなるにつれて減少し；対照的に、ｐ－Ｔ２０５におけるリン酸化及びタウ総量レベルの増加はＡβプラークとともに成長し続けた。これらの結果は、ＡＤにおけるタウのリン酸化の増加に最初につながる事象が、おそらくリン酸化部位特異的である別個のキナーゼ及びホスファターゼの調節を介して、Ａβプラーク病態との関連性がある可能性が高いことを示唆している。さらに、上記データは、ｐ－Ｔ２１７が原線維性Ａβプラーク病態の代理バイオマーカーとして機能し、Ａβ関連のタウ処理の潜在的に特有のシグネチャーを特定する可能性を示唆している。重要なことに、変異非保有者（ＮＣ）の中で、Ｔ２１７においてリン酸化の増加を示した被験者はＰｉＢ＋（ＳＵＶＲ＞１．２５、ｎ＝４）であった被験者のみであった。
【0165】
次に、本発明者らは、ＰｉＢ－ＰＥＴ ＳＵＶＲにより測定した特定のタウのリン酸化部位とアミロイドプラーク沈着の皮質及び皮質下領域との間の相関を調査することにより、部位特異的なタウのリン酸化が脳のＡβプラーク病態の解剖学的分布と関連性があるかどうかを評価した（図１６Ｃ）。Ｔ２１７、Ｔ１８１、及びＴ２０５におけるリン酸化は脳全体のＡβプラークと正の相関があったが、Ｓ２０２におけるリン酸化は負の相関であった。初期のアミロイドプラーク沈着の領域である楔前部において、タウのイソ型との相関を、年齢、性別、及び症候発症までの推定年数（ＥＹＯ）を制御する２変量回帰の強度に基づいて比較し、多重比較に合せて調整した。本発明者らは、ｐ－Ｔ２１７（β＝０．６８、ｐ＜１０－３０）、ｐ－Ｔ１８１（β＝０．４６、ｐ＜１０－６）、ｐ－Ｔ２０５（β＝０．４１、ｐ＜１０－５）、及びタウ総量（β＝０．３５、ｐ＜０．００１）であり、Ａβプラークと正の相関をもつ相関の順位を見出した。対照的に、ｐ－Ｓ２０２は逆相関（β＝－０．４７、ｐ＜１０－７）をもち、このことは、この部位におけるリン酸化はＡβ病態の増加に伴って低下することを示唆している。これらの関係は、神経変性のエビデンスがほとんどない時点における発症前のＭＣに存在し、ＣＳＦにおけるリン酸化タウの増加は瀕死状態のニューロンからの受動的な放出の結果ではなく、Ａβプラーク病態の存在と関連性がある能動的なプロセスである可能性が高い２２。
【0166】
実施例６ 病期及び疾患進行はタウの高リン酸化及び長期的な変化率の部位特異的な違いと関連性がある
ＤＩＡＤの疾患発症の確実性及び症候発症の予測可能性によって、ＥＹＯ（すなわち、変異を有する他の個人の発症年齢と比較した評価時の個人の年齢）に基づく個人の病期診断が可能になる９、１０、３０。次に、本発明者らは、ＣＳＦのタウのリン酸化のパターンに時間的な違いがあるかどうかを判定した。ＥＹＯに基づいて、ＭＣとＮＣの間のリン酸化の量及び変化率の経時的な違いを推定することによってこれを行った。２つの重要な知見があった。第一に、タウ総量及び特定の部位におけるリン酸化の増加が目立たない程度で生じるというエビデンスがあった。－２１ＥＹＯ付近でＴ２１７のリン酸化が発生し、その後－１９ＥＹＯ付近でのＴ１８１のリン酸化、次いで－１７ＥＹＯ付近でのタウ総量の増加、次いで－１３ＥＹＯ付近でのＴ２０５のリン酸化が続いた（図１７Ａ～Ｆ）。上記初期のＴ２１７におけるリン酸化の増加及び、程度はより小さいがＴ１８１における増加は、Ａβプラークが増加し始めたのと同様の時間（－１９ＥＹＯ）に発生した。第二に、Ｔ２１７とＴ１８１とのリン酸化の比は症候発症時期の近傍で有意に低下し始めた一方、Ｔ２０５におけるリン酸化は上昇を維持し、タウ総量レベルは増加し続けた。注目すべきは、すべての非リン酸化ペプチドの濃度が疾患進行に伴って増加し（データ未表示）、このことは、Ｔ２１７とＴ１８１とのリン酸化比の低下が、これらの部位に特異的に跨る非リン酸化ペプチドの不均衡な上昇の結果ではないことを示唆している。Ｓ２０２については、疾患の経過にわたってリン酸化に有意な変化はなかった（図１７Ｅ）。これらの結果は、タウのリン酸化が部位ごとに差次的に起こり、病期によって特定の部位で増加または減少することを示している。これらの部位特異的な変化は、以前に認識されたものよりもより動的である可溶性タウの変化の連鎖であること、及びタウのリン酸化の状態または比率は単調に増加しないことを示唆している。Ａβアミロイドプラークの出現及び臨床的な悪化の開始は、２０年ほど間が離れており、可溶性タウのリン酸化が変化する段階の２つの重要な分界を示している。
ＤＩＡＤの疾患発症の確実性及び症候発症の予測可能性によって、ＥＹＯ（すなわち、変異を有する他の個人の発症年齢と比較した評価時の個人の年齢）に基づく個人の病期診断が可能になる９、１０、３０。次に、本発明者らは、ＣＳＦのタウのリン酸化のパターンに時間的な違いがあるかどうかを判定した。ＥＹＯに基づいて、ＭＣとＮＣの間のリン酸化の量及び変化率の経時的な違いを推定することによってこれを行った。２つの重要な知見があった。第一に、タウ総量及び特定の部位におけるリン酸化の増加が目立たない程度で生じるというエビデンスがあった。－２１ＥＹＯ付近でＴ２１７のリン酸化が発生し、その後－１９ＥＹＯ付近でのＴ１８１のリン酸化、次いで－１７ＥＹＯ付近でのタウ総量の増加、次いで－１３ＥＹＯ付近でのＴ２０５のリン酸化が続いた（図１７Ａ～Ｆ）。上記初期のＴ２１７におけるリン酸化の増加及び、程度はより小さいがＴ１８１における増加は、Ａβプラークが増加し始めたのと同様の時間（－１９ＥＹＯ）に発生した。第二に、Ｔ２１７とＴ１８１とのリン酸化の比は症候発症時期の近傍で有意に低下し始めた一方、Ｔ２０５におけるリン酸化は上昇を維持し、タウ総量レベルは増加し続けた。注目すべきは、すべての非リン酸化ペプチドの濃度が疾患進行に伴って増加し（データ未表示）、このことは、Ｔ２１７とＴ１８１とのリン酸化比の低下が、これらの部位に特異的に跨る非リン酸化ペプチドの不均衡な上昇の結果ではないことを示唆している。Ｓ２０２については、疾患の経過にわたってリン酸化に有意な変化はなかった（図１７Ｅ）。これらの結果は、タウのリン酸化が部位ごとに差次的に起こり、病期によって特定の部位で増加または減少することを示している。これらの部位特異的な変化は、以前に認識されたものよりもより動的である可溶性タウの変化の連鎖であること、及びタウのリン酸化の状態または比率は単調に増加しないことを示唆している。Ａβアミロイドプラークの出現及び臨床的な悪化の開始は、２０年ほど間が離れており、可溶性タウのリン酸化が変化する段階の２つの重要な分界を示している。
【0167】
実施例７ 疾患進行の神経画像検査マーカーはタウの高リン酸化における部位特異的な違いと関連性がある
家族歴を用いて症候の発症を推定すること（ＥＹＯ）に加えて、疾患進行のさまざまな要素、例えば脳の萎縮及び代謝の低下を追跡する神経画像検査の測定値を用いて、ＤＩＡＤの疾患進行を推定することもできる。これらの測定値は、発症前の異なる期間に変化し、脳代謝の低下（［Ｆ１８］フルオロデオキシグルコース ［ＦＤＧ］－ＰＥＴにより測定）は症候発症の最長で１８年前に起こり、脳の萎縮（ＭＲＩにより判定）は症候発症の最長で１３年前に起こることが明らかになっている２８，３１～３３。これにより、これらのバイオマーカーが同様に特定の部位におけるタウのリン酸化と相関するかという疑問が生じる。これを調べるために、本発明者らは、性別、年齢、及びＥＹＯを制御する、リン酸化部位及びタウ総量と３４ヶ所の皮質脳領域及び６ヶ所の皮質下脳領域の画像検査の測定値との間の２変量クロスセクション相関付けを行った。本発明者らは、疾患進行の最も早い段階で何らかの関連性を特定するために、無症候性のＭＣに解析を集中させた。Ｓ２０２におけるタウのリン酸化状態は、疾患進行にわたって変化がないとの前提で、これらの解析には含めなかった。
家族歴を用いて症候の発症を推定すること（ＥＹＯ）に加えて、疾患進行のさまざまな要素、例えば脳の萎縮及び代謝の低下を追跡する神経画像検査の測定値を用いて、ＤＩＡＤの疾患進行を推定することもできる。これらの測定値は、発症前の異なる期間に変化し、脳代謝の低下（［Ｆ１８］フルオロデオキシグルコース ［ＦＤＧ］－ＰＥＴにより測定）は症候発症の最長で１８年前に起こり、脳の萎縮（ＭＲＩにより判定）は症候発症の最長で１３年前に起こることが明らかになっている２８，３１～３３。これにより、これらのバイオマーカーが同様に特定の部位におけるタウのリン酸化と相関するかという疑問が生じる。これを調べるために、本発明者らは、性別、年齢、及びＥＹＯを制御する、リン酸化部位及びタウ総量と３４ヶ所の皮質脳領域及び６ヶ所の皮質下脳領域の画像検査の測定値との間の２変量クロスセクション相関付けを行った。本発明者らは、疾患進行の最も早い段階で何らかの関連性を特定するために、無症候性のＭＣに解析を集中させた。Ｓ２０２におけるタウのリン酸化状態は、疾患進行にわたって変化がないとの前提で、これらの解析には含めなかった。
【0168】
ＭＲＩ－高リン酸化は無症候性ＭＣの皮質の厚さと逆相関していた。すなわち、ｐ－Ｔ２０５は、脳全体を通じて皮質及び皮質下の厚さの減少と最も強い関連性があった（図１８Ａ）一方、ｐ－Ｔ２１７とタウ総量レベルとの局所的関連性はより少なく、相関性は弱かった。ｐ－Ｔ１８１における高リン酸化と皮質萎縮との包括的相関性は最も低く、頭頂葉内側及び頭頂葉外側ならびに前頭葉内側背内側に限定されていた。このことは、－１３ＥＹＯにおけるｐ－Ｔ２０５の初期上昇が皮質萎縮の根本的な病因論と関係している可能性があることを示唆しており、本発明者らはこれまでに、皮質萎縮が楔前部においておおよそ－１３ＥＹＯに開始されることを明らかにしている２８。
【0169】
ＦＤＧ ＰＥＴ－皮質萎縮に加えて、ニューロン及びグリアにおけるグルコース代謝の低下はＡＤの疾患進行と関連性がある。したがって、本発明者らは皮質または皮質下の代謝障害とタウのリン酸化の間に明確な関連性があるかどうかを試験した。無症候性ＭＣにおいて、Ｔ２０５におけるリン酸化が、ＦＤＧ－ＰＥＴによって測定した皮質及び皮質下領域全体のグルコース代謝低下と相関していた（図１８Ｂ）。無症候性ＭＣにおいて、他のｐ－タウ部位またはタウ総量レベルに関して特定された関連性は最小限のものであった。
【0170】
まとめると、これらの結果は、神経画像検査によって測定される、神経障害及び神経変性につながる、無症候性の疾患進行中に潜在するプロセスがｐ－Ｔ２０５と最も密接に相関していることを示している。最近の研究において、ｆｙｎキナーゼ経路を介した、Ａβ誘導シナプス後細胞毒性に応答する、シナプス後終末におけるｐ－Ｔ２０５に対する保護的役割が特定されている３４。本明細書において見出された関連性は、シナプス機能が低下した場合にはＴ２０５におけるリン酸化の増加をもたらす保護プロセスを表す可能性がある。しかしながら、時間の経過とともに、高リン酸化はタウの凝集の素因となる可能性がある。他方で、Ｔ１８１及びＴ２１７おけるリン酸化は、皮質のＡβプラーク病態の存在とより強い関連性があるように思われ、潜在的には、Ｔ２０５の高リン酸化及び可溶性の非リン酸化タウレベルの上昇の上流で発生する可能性がある。
【0171】
実施例８ 認知低下はタウの高リン酸化における部位特異的な違いと特異的かつ差次的な関連性がある
これまでの研究において、ＡＤ認知症は新皮質Ａβ病態よりも新皮質ＮＦＴ病態と密接な関連性があることが明らかになってはいるが３５、なおも可溶性タウと認知の関係は不明確なままである。したがって、本発明者らは、臨床転帰と比較した、経時的な可溶性タウのリン酸化比及びタウ総量レベルの長期的変化を評価した３６。本発明者らは、転帰としての神経心理学的コンポジットにおける長期的な認知パフォーマンス、ならびに予測因子としてのＣＳＦのタウの測定値の変化（個々の線形混合効果モデル由来）、時間、及びそれらの交互作用を含む混合効果モデルを実行し、年齢、性別、教育、及び家族関係に合せて調整した。本発明者らはこの分析のためにすべてのＭＣ（症候性及び無症候性）を試験し、リン酸化部位と臨床的及び認知的低下との間の差次的な影響を見出した。非リン酸化タウは認知の悪化に伴って単調に増加し、Ｔ２１７及びＴ１８１におけるリン酸化は認知の悪化に伴って減少した一方、ｐＴ２０５は、認知の低下との比較において変化を示さなかった。
これまでの研究において、ＡＤ認知症は新皮質Ａβ病態よりも新皮質ＮＦＴ病態と密接な関連性があることが明らかになってはいるが３５、なおも可溶性タウと認知の関係は不明確なままである。したがって、本発明者らは、臨床転帰と比較した、経時的な可溶性タウのリン酸化比及びタウ総量レベルの長期的変化を評価した３６。本発明者らは、転帰としての神経心理学的コンポジットにおける長期的な認知パフォーマンス、ならびに予測因子としてのＣＳＦのタウの測定値の変化（個々の線形混合効果モデル由来）、時間、及びそれらの交互作用を含む混合効果モデルを実行し、年齢、性別、教育、及び家族関係に合せて調整した。本発明者らはこの分析のためにすべてのＭＣ（症候性及び無症候性）を試験し、リン酸化部位と臨床的及び認知的低下との間の差次的な影響を見出した。非リン酸化タウは認知の悪化に伴って単調に増加し、Ｔ２１７及びＴ１８１におけるリン酸化は認知の悪化に伴って減少した一方、ｐＴ２０５は、認知の低下との比較において変化を示さなかった。
【0172】
Ｔ２１７及びＴ１８１のリン酸化比が減少するにつれて、認知低下が加速した（ｔ値２．３５、ｐ＝０．０２及び２．１１、ｐ＝０．０４）（表３及び図１９）。このことは、Ｔ２１７及びＴ１８１のリン酸化の減少が、可溶性タウの増加よりも大きく、認知機能低下の重要なマーカーであることを示すことを示唆している。
【0173】
これらの知見は、ＣＳＦのｐ－タウの継続的な上昇に認知機能障害との関連性があるという現在のパラダイムに異を唱えている。本研究において、本発明者らは、２つの一般的なパターンを明らかにした。すなわち、一部の部位に関しては、認知低下が始まるにつれてリン酸化が有意に減少したのに対して、他の部位は、疾患進行に伴って継続的な増加を示すか、または変化を示さなかった（図１９における増加率と減少率を参照のこと）。さらに、本発明者らが特定した、他の疾患進行マーカー（Ａβプラーク、脳の萎縮及び代謝）とタウ総量レベル及び異なる部位におけるリン酸化との関連性によって、ＡＤにおけるタウのリン酸化に至るプロセスが多因子性である可能性が高く、等価ではないことがさらに強調される。
【0174】
実施例９ 非リン酸化タウの増加はタウＰＥＴによる皮質ＮＦＴと相関するが標準的なリン酸化タウ種は相関しない
最近のＤＩＡＤ被験者に対するタウＰＥＴ（１８Ｆ ＡＶ－１４５１、すなわちフロタウシピル（ｆｌｏｒｔａｕｃｉｐｉｒ））による研究では、ＮＦＴの増加は臨床症状の発症後にのみ生じることが示唆されている３７、３８。本発明者らは、可溶性ｐ－タウはＮＦＴ病態のマーカーである一方で、可溶性の非リン酸化タウは神経変性の尺度として瀕死のニューロンから受動的に放出される１４との仮説を検証した。本発明者らは、タウＰＥＴを実施した時点につながるＣＳＦのタウとｐ－タウのイソ型との長期的変化の間の関係を調査した。限られた数の被験者（１０名のＭＣ及び４名のＮＣ）において、ＣＳＦ試料を取得してから７２時間以内に１回のタウＰＥＴスキャンを実施した。これらの個人に関してはＣＳＦ試料を以前の往訪（１～３年以内）の際にも得ており、これにより、可溶性タウの測定値の長期的変化によってタウＰＥＴレベルを予測することができるかを、本発明者らが評価することが可能になった。
最近のＤＩＡＤ被験者に対するタウＰＥＴ（１８Ｆ ＡＶ－１４５１、すなわちフロタウシピル（ｆｌｏｒｔａｕｃｉｐｉｒ））による研究では、ＮＦＴの増加は臨床症状の発症後にのみ生じることが示唆されている３７、３８。本発明者らは、可溶性ｐ－タウはＮＦＴ病態のマーカーである一方で、可溶性の非リン酸化タウは神経変性の尺度として瀕死のニューロンから受動的に放出される１４との仮説を検証した。本発明者らは、タウＰＥＴを実施した時点につながるＣＳＦのタウとｐ－タウのイソ型との長期的変化の間の関係を調査した。限られた数の被験者（１０名のＭＣ及び４名のＮＣ）において、ＣＳＦ試料を取得してから７２時間以内に１回のタウＰＥＴスキャンを実施した。これらの個人に関してはＣＳＦ試料を以前の往訪（１～３年以内）の際にも得ており、これにより、可溶性タウの測定値の長期的変化によってタウＰＥＴレベルを予測することができるかを、本発明者らが評価することが可能になった。
【0175】
第一に、本発明者らは、ＭＣの皮質ＮＦＴレベルが症候発症の時期の近傍でのみ増加することを確認し（図２０）、このことは、ＤＩＡＤ ＭＣにおいては、タウ凝集体が増加し始めると臨床的な悪化が始まることを示唆している。第二に、本発明者らは、ＣＳＦの非リン酸化タウの長期的増加は、皮質タウＰＥＴ（ｐ＝０．０３）値の上昇と関連性があることを見出した（表４）。Ｔ２０５のリン酸化の増加がタウＰＥＴのレベルがより高くなることと関連性があるという傾向があり、逆に、Ｔ２１７、Ｔ１８１、及びＳ２０２のリン酸化の減少がタウＰＥＴのレベルの増加と関連性があるという傾向があった（図２１）。まとめると、これらの知見は、ｐ－タウではなくＣＳＦ中の非リン酸化タウの増加がＮＦＴ病態の拡がりとより密接に結びついていることを示唆している。対照的に、凝集したタウが増加すると可溶性ｐ－タウ種は減少し、このことは、隔離のプロセスが高リン酸化された凝集体によることを表している可能性がある。
【表2-1】
【表2-2】
【表3】
【表4】
【0176】
実施例５～９に関する考察
タウはＡＤ病態の特徴を構成し、凝集した形態または可溶性の形態で測定することができるが、この重要な神経タンパク質の翻訳後修飾がヒトにおけるＮＦＴの発生及び神経変性にどのようにつながるか２についての本発明者らの解釈に重大な空白部が残っている。本明細書では、本発明者らは、ＣＳＦ中のタウのリン酸化のパターンがＡＤ進行の過程でどのように変化するかを示す。本発明者らは、ＤＩＡＤにおいては、タウのリン酸化及び中枢神経系中への放出のプロセスは、１）Ａβプラーク負荷（ＰｉＢ－ＰＥＴにより測定）が定着する（発症前の数十年間）と開始し、その後ほぼ２０年の期間にわたって展開し、その間、タウタンパク質の異なるリン酸化部位が、疾患進行の異なるマーカーを伴う別個の段階でリン酸化される；ならびに２）認知機能低下及び凝集タウの上昇（タウＰＥＴにより測定）の時期の近傍で、部位依存的な形態で有意に減少する動的なプロセスであることの実証を、既存の臨床文献に追加する。まとめると、これらの結果は、可溶性のリン酸化／非リン酸化タウペプチドを定量化するこの方法が、前臨床段階から症候性段階にわたるＡＤプロセスを追跡し、この疾患におけるリン酸化タウ病態のシグネチャーを提供することができることを示している。さらに、これらの結果は、ＤＩＡＤ、及びおそらくＡＤ全般におけるタウ／ｐ－タウの役割とされているものに異を唱え、Ａβ病態をタウの高リン酸化、及び瀕死のニューロンの放出の結果ではなく能動的な細胞による放出と結び付ける、動物を用いた研究からの知見２１、２３、２５、３９をヒトにおいて再現している。
タウはＡＤ病態の特徴を構成し、凝集した形態または可溶性の形態で測定することができるが、この重要な神経タンパク質の翻訳後修飾がヒトにおけるＮＦＴの発生及び神経変性にどのようにつながるか２についての本発明者らの解釈に重大な空白部が残っている。本明細書では、本発明者らは、ＣＳＦ中のタウのリン酸化のパターンがＡＤ進行の過程でどのように変化するかを示す。本発明者らは、ＤＩＡＤにおいては、タウのリン酸化及び中枢神経系中への放出のプロセスは、１）Ａβプラーク負荷（ＰｉＢ－ＰＥＴにより測定）が定着する（発症前の数十年間）と開始し、その後ほぼ２０年の期間にわたって展開し、その間、タウタンパク質の異なるリン酸化部位が、疾患進行の異なるマーカーを伴う別個の段階でリン酸化される；ならびに２）認知機能低下及び凝集タウの上昇（タウＰＥＴにより測定）の時期の近傍で、部位依存的な形態で有意に減少する動的なプロセスであることの実証を、既存の臨床文献に追加する。まとめると、これらの結果は、可溶性のリン酸化／非リン酸化タウペプチドを定量化するこの方法が、前臨床段階から症候性段階にわたるＡＤプロセスを追跡し、この疾患におけるリン酸化タウ病態のシグネチャーを提供することができることを示している。さらに、これらの結果は、ＤＩＡＤ、及びおそらくＡＤ全般におけるタウ／ｐ－タウの役割とされているものに異を唱え、Ａβ病態をタウの高リン酸化、及び瀕死のニューロンの放出の結果ではなく能動的な細胞による放出と結び付ける、動物を用いた研究からの知見２１、２３、２５、３９をヒトにおいて再現している。
【0177】
因果関係については今後の研究において取り組む必要があるが、ｐ－Ｔ２１７、ｐ－Ｔ１８１、及びＰｉＢ－ＰＥＴが同時に増加することは、ＡＤにおけるタウの広範なリン酸化のレベルがＡβ病態と密接に結びついていることを示唆している。この仮説は、ｐ－タウのイソ型が、Ａβプラークの存在下で増加する能動的なプロセスにおいて細胞から放出されることを示す２２、最近のＡＤ遺伝子導入マウスにおける研究２０、２１、２３、３４、４０及び安定同位体標識動態論（ＳＩＬＫ）における研究と一致している。本発明者らの結果によって、Ａβ病態が可溶性タウペプチド濃度及びリン酸化パターンの明確な変化と結び付き、ｐ－タウの有意な上昇がＡＤにおいては生じるが他の神経変性タウオパチーでは起こらない現象１６、１７が解明される。これらの知見はまた、臨床症状の発症前の早期のＡＤ病態のバイオマーカーのみならず、潜在的な治療標的に対する重要な洞察も生み出す。
【0178】
最近の研究により、体細胞ＮＦＴの定着のかなり以前に生じる、Ａβ遺伝子導入マウスのＡＤの脳からのＮＦＴ分離物によって誘導される神経突起タウ凝集体（ジストロフィー性神経突起中の対らせん状細線維）の増加及び拡がりが明らかになっている２０。ｐ－Ｔ２１７及びｐ－Ｔ１８１のごく初期の増加は、Ａβプラークに反応したこの「初期の」タウ凝集を反映している可能性があり、上記増加によって、ＰｉＢ ＰＥＴと、本発明者らが特定したこれらのイソ型との全般的な関連性の説明がつく可能性がある。さらに、上記増加が有意な神経変性の何年も前に生じることから、その増加によって、ｐ－タウのこの早期の上昇中に臨床症状が見られないことがよりうまく説明される可能性がある。またこの研究により、ｐ－Ｔ２１７が、アミロイドを標的とする治療薬の治療応答の指標としての有望な用途をもつ、ごく初期のバイオマーカーとして提案される。これは、効果的な治療薬を識別するために疾患進行の代理マーカーが不可欠である予防研究において、特に重要である場合がある。
【0179】
本明細書では、可溶性タウ及びｐ－タウの診断上の役割に関するいくつかの一般的な仮定に疑問を投げかける。具体的には、現在のＡＤの診断の枠組みにおいては、ＡＤに特異的な及び非特異的な病態を表すバイオマーカー（例えば、Ａβ、ｐ－タウ、及びタウ）の存在が強調される１４。この診断の枠組み内では、可溶性ｐ－タウ及び非リン酸化タウは多くの場合、変性しつつあるニューロンから受動的に放出されると仮定され、ｐ－タウは凝集したＮＦＴと関連付けられ、非リン酸化タウは軸索変性と関連付けられる。これに替えて、本発明者らのＤＩＡＤにおける結果は、ＡＤタウオパチーを可溶性タウのリン酸化状態（リン酸化の比）の変化として定義してもよいことを示唆している。さらに、特定のリン酸化部位の状態変化のタイミング（推定される症候発症の２１～１３年前）を考慮すると、上記結果は、リン酸化の増加は、病態のマーカーではあるが、必ずしもタウ関連毒性または細胞体ＮＦＴのマーカーではないことを示唆してもいる。実際、本発明者らの結果は、ｐＴ２１７及びｐＴ１８１に関しては、ＮＦＴ病態が急速に増加しているときには、増加し続ける３７よりもむしろ、リン酸化の劇的な減少が見られる。これについて可能性のある説明の１つは、可溶性／凝集Ａβについて観測されたもの４１と同様であり、すなわち、凝集タウの劇的な増加によって、リン酸化タウが脳内に隔離され、ＣＳＦレベルが低下するというものである。しかしながら、タンパク質恒常性機序によるタウの減少を除外することはできない。どちらの場合にしても、Ｔ２１７またはＴ１８１のリン酸化比と長期的な認知機能低下の間の負の相関に関する本発明者らの知見は、疾患進行におけるこの事象の重要性を強調するものである。この低下の原因を解明することで、可溶性タウとニューロンの機能障害との間の関連性、及びＡＤの予後におけるＣＳＦのｐ－タウ／タウの使用についての理解が深まる可能性がある。
【0180】
タウのリン酸化におけるキナーゼの役割を考えると、この酵素群は現在、ＡＤ治療薬の潜在的な標的と見なされている４３。本発明者らが本明細書において、ｐ－タウのすべての形態に疾患進行のマーカーとの関連性があるわけではなく、一部は実際にそのことに対して逆に作用する場合もあることを明らかにしてきたことから、ｐ－タウの変化につながる特定のキナーゼ／ホスファターゼ活性は、少なくともこの疾患のプロセスの早期においては、有害でない場合もある。
【0181】
要約すると、本発明者らは本明細書において、常染色体優性変異に関連するＡＤでは、ＣＳＦのタウの高リン酸化がごく早期に起こり、かつこの高リン酸化は異なる病期で部位特異的な変化のパターンを示すことを実証してきた。これらの知見の背後に内在する機序は、この疾患の理解及びタウ指向性のＡＤ治療薬にとって重要な意味をもつこととなろう。
【0182】
実施例５～９の材料及び方法
被験者－ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２、またはＡＰＰに遺伝子変異が確認された家族からＤＩＡＤ変異を受け継ぐ危険性が少なくとも５０％ある被験者は、ｔｈｅ Ｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ研究（ＤＩＡＮ， ＮＩＡ Ｕ１９ ＡＧ０３２４３８）（ｄｉａｎ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ；ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ｎｕｍｂｅｒ ＮＣＴ００８６９８１７）４４に登録した。すべての手順はｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ （ＩＲＢ） ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによる認可を受け、研究が行われている地域のＩＲＢ及びＥｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓに準拠した。ＤＩＡＤ変異の有無は、適当なエクソンのＰＣＲに基づく増幅及びそれに続いてサンガー配列決定法を用いて判定した。被験者は研究のために往訪する度に、包括的な臨床評価、認知検査、神経画像検査、及びＣＳＦの調査を受けた。ただし、それぞれの被験者がそれぞれの往訪時にすべての研究手順を完了していない場合もある。研究の構成及び評価の詳細は既刊行物１０、４４に記載されている。フォローアップの間隔は、各被験者の臨床状態（正常または障害）及び症候発症までの推定年数（ＥＹＯ）によって決定され、年１回～３年毎の範囲であった。データは品質管理されたデータ（２００９年１月２６日～２０１７年６月３０日の不規則な結果及び欠落データの年毎の品質評価）から取得し、３７０名の被験者が含まれていた（長期的ＣＳＦ評価を行った被験者はｎ＝１５０であり、往訪と往訪の間隔は中央値で２．８年））。
被験者－ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２、またはＡＰＰに遺伝子変異が確認された家族からＤＩＡＤ変異を受け継ぐ危険性が少なくとも５０％ある被験者は、ｔｈｅ Ｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ研究（ＤＩＡＮ， ＮＩＡ Ｕ１９ ＡＧ０３２４３８）（ｄｉａｎ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ；ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ｎｕｍｂｅｒ ＮＣＴ００８６９８１７）４４に登録した。すべての手順はｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ （ＩＲＢ） ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによる認可を受け、研究が行われている地域のＩＲＢ及びＥｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓに準拠した。ＤＩＡＤ変異の有無は、適当なエクソンのＰＣＲに基づく増幅及びそれに続いてサンガー配列決定法を用いて判定した。被験者は研究のために往訪する度に、包括的な臨床評価、認知検査、神経画像検査、及びＣＳＦの調査を受けた。ただし、それぞれの被験者がそれぞれの往訪時にすべての研究手順を完了していない場合もある。研究の構成及び評価の詳細は既刊行物１０、４４に記載されている。フォローアップの間隔は、各被験者の臨床状態（正常または障害）及び症候発症までの推定年数（ＥＹＯ）によって決定され、年１回～３年毎の範囲であった。データは品質管理されたデータ（２００９年１月２６日～２０１７年６月３０日の不規則な結果及び欠落データの年毎の品質評価）から取得し、３７０名の被験者が含まれていた（長期的ＣＳＦ評価を行った被験者はｎ＝１５０であり、往訪と往訪の間隔は中央値で２．８年））。
【0183】
症候発症までの推定年数（ＥＹＯ）－優性遺伝性ＡＤではほぼ１００％の浸透率があり、変異保持者の症候発症年齢は、各変異に関して及び各家族内で比較的一貫している。これにより、症候発症までの推定年数（ＥＹＯ）を示すことができる。ＥＹＯは次のように定義した。すなわち、各被験者に対して、親の最も早い症候発症時の年齢を半構造化面接によって確定した。次に、各変異に関する親の発症時の年齢を、ＤＩＡＮ及びＤＩＡＤコホートの既刊行物の症候発症の値を組み合わせた値からなるデータベースに入力した。これらの値を用いて、各変異に固有の発症の平均年齢を計算した２９。上記変異に固有の発症年齢を各被験者の臨床評価時の年齢から減じて、個人のＥＹＯを規定した。特定の変異の発症の平均年齢が不明な場合、親のまたは代理の発症年齢を用いてＥＹＯを規定した２９。ＣＤＲ＞０によって評価した、ベースライン時に症候性であった被験者については、実際の症候発症の報告年齢を各臨床評価の年齢から減じてＥＹＯを規定した。
【0184】
臨床評価－各被験者に対して、試験パートナー（ｓｔｕｄｙ ｐａｒｔｎｅｒ）の使用を含む標準化臨床評価を実施した。臨床的認知症評価尺度（ＣＤＲ）を用いて認知症病期を示した。被験者を、認知が正常（ＣＤＲ＝０）もしくは非常に軽度の認知症（ＣＤＲ＝０．５）、軽度認知症（ＣＤＲ＝１）、または中程度の認知症（ＣＤＲ＝２）４５と評価した。評価を行う臨床医に対して遺伝的状態を盲検化していた。それぞれの往訪時に、全般的な認知機能、記憶、注意力、遂行機能、視空間機能、及び言語を評価する包括的な神経心理学的バッテリーを実施した４６。本発明者らは、これらの検査から、ＥＹＯ及びＣＤＲの範囲全体の低下を確実に検出する認知コンポジットを開発した４７。上記コンポジットは、エピソード記憶、複雑性注意、及び処理速度、ならびに全般的な認知機能のスクリーニングを含む検査（Ｍｉｎｉ Ｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｅ Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ）に基づくｚスコアの平均値を表す。
【0185】
ＣＳＦのタウの分析－ＣＳＦを、非外傷性Ｓｐｒｏｔｔｅ脊髄針（２２Ｇａ）を用いた標準的な腰椎穿刺手順（Ｌ４／Ｌ５）により２本の１３ｍｌポリプロピレン管中に採取した。ＣＳＦをドライアイス上、直立した状態で急速冷凍した。米国で採取した試料は、ドライアイス上で、夜間にＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡのＤＩＡＮバイオマーカー中核研究室（ＤＩＡＮ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｃｏｒｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に輸送した一方、世界の拠点で採取した試料は、－８０℃で保存し、四半期毎にドライアイス上で輸送した。到着後、各試料を解凍し、１本のポリプロピレン管中にまとめ、ポリプロピレン製微小遠沈管（カタログ番号０５－５３８－６９Ｃ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＮＹ， ＵＳＡ）に分割し（各５００μｌ）、その後、これらを再度ドライアイス上で急速冷凍し、－８０℃で保存した。
【0186】
解凍した各ＣＳＦ試料を、１５Ｎ－４４１タウ内部標準（試料当り２．５ｎｇ）、５０ｍＭ グアニジン、１０％ ＮＰ－４０、及び１０Ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む２５ｍｌの溶液と混合した。タウを、タウ１（タウエピトープ１９２～１９９）及びＨＪ８．５（タウエピトープ２７～３５）抗体と架橋した２０ｍｌのセファロースビーズとともに、室温で２時間、回転下でのインキュベーションを用いた免疫捕獲によって抽出した。ビーズを遠心分離し、次いで１ｍｌの２５ｍＭ ＴＥＡＢＣで３回すすいだ。試料を３７℃で終夜、４００ｎｇのトリプシンＧｏｌｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）で消化した。ＡＱＵＡペプチド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）をスパイクして、各試料中の標識リン酸化ペプチド当り５ｆｍｏｌ及び標識非修飾ペプチド当り５０ｆｍｏｌの量を得た。このペプチド混合物をＴｏｐＴｉｐ Ｃ１８チップにロードし、０．１％ ギ酸（ＦＡ）溶液で洗浄し、６０％ ＡＣＮ ０．１％ ＦＡ溶液で溶出させた。Ｓｐｅｅｄｖａｃを使用して溶出液を乾燥し、乾燥試料を－８０℃で保存し、その後分析した。試料を２５μｌの２％ ＡＣＮ ０．１％ ＦＡ溶液中に再懸濁した。抽出物を、ＨＣＤ断片化を用いたＰａｒａｌｌｅｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇを使用したＮａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＨＲＭＳによって分析した。ＮａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳの実験は、Ｆｕｓｉｏｎ Ｔｒｉｂｒｉｄ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＳａｎＪｏｓｅ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と連結したｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ， Ｍｉｌｄｆｏｒｄ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して実施した。各試料について５μｌを注入した。ペプチドの分離をＷａｔｅｒｓ ＨＳＳ Ｔ３カラム（７５μｍ×１００ｍｍ、１８μｍ）上、６０℃、２４分で実行した。移動相は、（Ａ）０．１％ ギ酸水溶液及び（Ｂ）０．１％ ギ酸アセトニトリル溶液であった。使用した勾配は、０分～：０．５％のＢ；７．５分～：５％のＢ；２２分～：１８％のＢであり；次いで、カラムを９５％のＢで２分間すすいだ。流速を７．５分間７００ｎｌ／分に設定し、次いでその後の分析では４００ｎｌ／分に設定した。データは、２２００Ｖのスプレー電圧（Ｎａｎｏｓｐｒａｙ Ｆｌｅｘ Ｉｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び２７０℃に設定したイオントランスファーチューブでの陽イオンモードで取得した。ＳレンズＲＦ電圧は６０Ｖに設定した。ＭＳ／ＨＲＭＳトランジションはＳｋｙｌｉｎｅソフトウェア（ＭａｃＣｏｓｓ ｌａｂ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を使用して抽出した。ＣＳＦのタウのリン酸化レベルは、測定した、内在の非リン酸化ペプチドとタンパク質内部標準の１５Ｎ標識ペプチドとのＭＳ／ＨＲＭＳトランジション間の比を用いて計算した。Ｔ１８１、Ｓ２０２、Ｔ２０５、及びＴ２１７のリン酸化の比は、リン酸化ペプチドと対応する非リン酸化ペプチドからのＭＳ／ＨＲＭＳトランジションの比を用いて測定した。内在する各リン酸化／非リン酸化ペプチドの比は、対応するＡＱＵＡリン酸化／非リン酸化ペプチド内部標準のＭＳ／ＨＲＭＳトランジション上で測定した比を用いて正規化した。
【0187】
脳画像検査－アミロイド沈着、グルコース代謝、タウ（ＮＦＴ）ＰＥＴ、及び皮質の厚さ／皮質下の容積は、それぞれ１１Ｃ－ＰｉＢ－ＰＥＴ、１８Ｆ－ＦＤＧ－ＰＥＴ、１８Ｆ－ＡＶ－１４５１（別名フロタウシピル）、及び容積測定Ｔ１強調ＭＲＩスキャンを用いて評価した。すべてのＤＩＡＮ部位のデータ収集における一貫性を確保するための標準的な手順２８を使用した。１１Ｃ－ＰｉＢ－ＰＥＴスキャンは、約１３ｍＣｉのＰｉＢをボーラス注入した後に７０分間の動的スキャンを行うことから構成され、４０～７０分のタイムフレームから領域の標準取込値比（ＳＵＶＲ）を求めた。１８Ｆ－ＦＤＧ－ＰＥＴスキャンは、約５ｍＣｉのボーラス注入後３０分で開始し、３０分間続けた。１８Ｆ－ＡＶ－１４５１データは、ボーラス注入後の８０～１００分のウィンドウから取得し、ＳＵＶＲに変換した。Ｔ１ ＭＲシーケンスは、３Ｔスキャナー（パラメータ：ＴＲ＝２３０００、ＴＥ＝２．９５、及び１．０×１．０×１２ｍｍ３の解像度）で取得したａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ－ｐｒｅｐａｒｅｄ ｒａｐｉｄ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｃｈｏ （ＭＰＲＡＧＥ）であった。
【0188】
ＦｒｅｅＳｕｒｆｅｒソフトウェア（ｓｕｒｆｅｒ．ｎｍｒ．ｍｇｈ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／）を使用して、３４ヶ所の皮質及び６ヶ所の皮質下の対象領域（ＲＯＩ）からＰＩＢ及びＦＤＧ ＳＵＶＲを得た。ＳＵＶＲは、参照領域として小脳灰白質を用いて処理し、ＲＯＩデータは、ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍａｔｒｉｘ（ＧＴＭ）フレームワークにおいて領域の点広がり関数（ＲＳＦ）４８を用いて、部分容積効果に関する補正を行った。
【0189】
統計学的解析－被験者のベースライン特性を、連続変数については平均値±ＳＤ、カテゴリー変数についてはｎ（列パーセント）としてまとめた。ベースラインで規定した無症候性ＭＣ、症候性ＭＣ、及びＮＣ間の違いを比較するためのＰ値は、連続変数についての一般的な線形混合効果モデル（ＬＭＥ）及びカテゴリー変数についてのロジスティックリンクを備えた一般化線形混合効果モデルを使用して得られる。すべてのモデルは、同一家族内の被験者間の転帰の測定値の相関性を考慮するために、ランダムな家族効果を取り入れた。ベースラインの皮質ＰｉＢ ＰＥＴ ＳＵＶＲのカットポイントは、ＭＣとＮＣの間の皮質ＰｉＢ ＰＥＴの長期的な変化率の差が、最初に０とは有意に異なるように選択される。
【0190】
各ＲＯＩに対して２変量ＬＭＥを用いて、すべての無症候性ＭＣ（ＣＤＲ＝０、ｎ＝１５２）において、タウのさまざまなリン酸化部位の、ＰｉＢ、ＦＤＧ、及び皮質の厚さ／皮質下の容積とのクロスセクション相関を評価した。上記モデルには、家族レベルでのＥＹＯ、教育、性別、ランダムインターセプトの固定効果が含まれていた。２変量ＬＭＥは、単純相関の推定方法（ピアソンまたはスピアマン相関）と比較して、ＥＹＯなどの共変量に合せて調整することができるのみならず、家族クラスター内の相関を考慮することもできる４９、５０。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法５１を用いて相関を検定するためのＰ値を補正して、多重検定に起因する偽陽性率を制御した。
【0191】
長期的なフォローアップにわたる個人内の年間変化率に関して、ＬＭＥを用いて各バイオマーカーの最良の線形不偏予測量を推定し、次いでこれらをベースラインＥＹＯに対してプロットして、バイオマーカーの軌跡を検討した。次いで、適当である場合には、線形または線形スプライン混合効果モデルを用いて、ＭＣの各バイオマーカーのベースラインレベル及び変化率がＮＣと有意に異なるようになるベースラインＥＹＯポイントを判定した。線形スプライン混合効果モデルの詳細は最近の刊行物に記載されている９。線形または線形スプライン混合効果モデルには、変異群（ＭＣまたはＮＣ）、ベースラインＥＹＯ、ベースラインからの経過時間、及びそれらの間のすべての可能性のある１次のまたは２次の交互作用の固定効果が含まれる。性別、教育年数、ＡＰＯＥ ε４の状態を共変量と見なしたが、有意であった効果のみをモデルに保持した。上記モデルに含まれるランダム効果としては、頻回の測定値に起因する対象内相関を考慮するための、家族クラスターのランダムインターセプト、個人のランダムインターセプト、及び非構造化共分散行列でのランダム勾配がある。次いで、ベースラインでの平均値レベルの調整された差とＭＣとＮＣの間の変化率の差を、モデルに由来する近似ｔ検定を用いて検定し、差が有意となった最初のＥＹＯポイントを判定した。
【0192】
ＥＹＯの範囲全体にわたるタウ総量、タウのリン酸化部位、皮質ＰｉＢ、及び全般的な認知機能の間の変化率の違いを視覚化するために、ＭＣの測定値をまず、ＮＣの平均及び標準偏差を用いて標準化した。次いで、ＬＭＥを用いて各ＭＣに関する各測定値の変化率を計算し、ＬＯＥＳＳ曲線を近似して、ＥＹＯに対する標準化した変化率の軌跡を視覚的に表した。
【0193】
ＬＭＥを用いて、長期的な認知機能低下の予測におけるベースラインのタウ総量及びｐ－タウの有用性を評価した。上記モデルの固定効果には、変異群、ベースラインの年齢、性別、ＡＰＯＥ ε４の状態、時間、及びそれらの間のすべての可能性のある１次のまたは２次の交互作用の固定効果が含まれる。上記モデルのランダム効果には、家族クラスターのランダムインターセプト、個人のランダムインターセプト、及び非構造化共分散行列でのランダム勾配が含まれる。
【0194】
線形回帰を用いて、タウＰＥＴを行った時点につながる及びその時点を含むＭＣ及びＮＣのタウならびにリン酸化タウの位置の年間変化率が、タウＰＥＴ ＳＵＶＲを予測し、年齢の効果を制御できるかどうかを調べた。被験者の数が限られていたため、家族クラスターは含まれていなかった。
【0195】
すべての解析はＳＡＳ ９．４（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．， Ｃａｒｙ， ＮＣ）を使用して実施した。ｐ値＜０．０５を統計学的に有意であると見なした。
【0196】
実施例５～９の引用文献
Ｇｏｅｄｅｒｔ， Ｍ．， Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ， Ｍ． Ｇ．， Ｊａｋｅｓ， Ｒ．， Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ， Ｄ． ＆ Ｃｒｏｗｔｈｅｒ， Ｒ． Ａ． Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｕ： ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎｅｕｒｏｎ ３， ５１９－５２６， ｄｏｉ：１０．１０１６／０８９６－６２７３（８９）９０２１０－９ （１９８９）．
Ｇｏｅｄｅｒｔ， Ｍ．， Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ， Ｍ． Ｇ．， Ｊａｋｅｓ， Ｒ．， Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ， Ｄ． ＆ Ｃｒｏｗｔｈｅｒ， Ｒ． Ａ． Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｕ： ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎｅｕｒｏｎ ３， ５１９－５２６， ｄｏｉ：１０．１０１６／０８９６－６２７３（８９）９０２１０－９ （１９８９）．
【0197】
Ｇｒｕｎｄｋｅ－Ｉｑｂａｌ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ａｂｎｏｒｍａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｕ （ｔａｕ） ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ８３， ４９１３－４９１７， ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．８３．１３．４９１３ （１９８６）．
【0198】
Ｗａｎｇ， Ｙ． ＆ Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ， Ｅ． Ｔａｕ ｉｎ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １７， ５－２１， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｎ．２０１５．１ （２０１６）．
【0199】
Ｋｉｍｕｒａ， Ｔ．， Ｓｈａｒｍａ， Ｇ．， Ｉｓｈｉｇｕｒｏ， Ｋ． ＆ Ｈｉｓａｎａｇａ， Ｓ．－ｉ． Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｔａｕ Ｂａｒ Ｃｏｄｅ： Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｉｓｏｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｔａｕ ａｎｄ Ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｔａｕｏｐａｔｈｙ． Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２， ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｎｉｎｓ．２０１８．０００４４ （２０１８）．
【0200】
Ｃｒｏｗｔｈｅｒ， Ｒ． Ａ． Ｓｔｒａｉｇｈｔ ａｎｄ ｐａｉｒｅｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｆｉｌａｍｅｎｔｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｈａｖｅ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｕｎｉｔ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ８８， ２２８８－２２９２， ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．８８．６．２２８８ （１９９１）．
【0201】
Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ， Ａ． Ｗ． Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔａｕ ｆｉｌａｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎａｔｕｒｅ ５４７， １８５， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２３００２ （２０１７）．
【0202】
Ｐｒｉｃｅ， Ｊ． Ｌ．， Ｄａｖｉｓ， Ｐ． Ｂ．， Ｍｏｒｒｉｓ， Ｊ． Ｃ． ＆ Ｗｈｉｔｅ， Ｄ． Ｌ． Ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｎｇｌｅｓ， ｐｌａｑｕｅｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ａｇｉｎｇ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｇｉｎｇ １２， ２９５－３１２ （１９９１）．
【0203】
Ｑｉａｎ， Ｊ．， Ｈｙｍａｎ， Ｂ． Ｔ． ＆ Ｂｅｔｅｎｓｋｙ， Ｒ． Ａ． Ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ Ｔａｎｇｌｅ Ｓｔａｇｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒａｔｅ ｏｆ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｓｙｍｐｔｏｍｓ： Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ ａｎ Ａｕｔｏｐｓｙ Ｃｏｈｏｒｔ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｄｅｓｉｇｎ． ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ ７４， ５４０－５４８， ｄｏｉ：１０．１００１／ｊａｍａｎｅｕｒｏｌ．２０１６．５９５３ （２０１７）．
【0204】
ＭｃＤａｄｅ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ９１， ｅ１２９５－ｅ１３０６， ｄｏｉ：１０．１２１２／ｗｎｌ．００００００００００００６２７７ （２０１８）．
【0205】
Ｂａｔｅｍａｎ， Ｒ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６７， ７９５－８０４， ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１２０２７５３ （２０１２）．
【0206】
Ｆａｇａｎ， Ａ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｔａｕ／ｂｅｔａ－ａｍｙｌｏｉｄ（４２） ｒａｔｉｏ ａｓ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｄｅｃｌｉｎｅ ｉｎ ｎｏｎｄｅｍｅｎｔｅｄ ｏｌｄｅｒ ａｄｕｌｔｓ． Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ ６４， ３４３－３４９， ｄｏｉ：１０．１００１／ａｒｃｈｎｅｕｒ．６４．３．ｎｏｃ６０１２３ （２００７）．
【0207】
Ｔｏｌｅｄｏ， Ｊ． Ｂ．， Ｘｉｅ， Ｓ． Ｘ．， Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ， Ｊ． Ｑ． ＆ Ｓｈａｗ， Ｌ． Ｍ． Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ＣＳＦ Ｔａｕ ａｎｄ Ａｂｅｔａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｕｐ ｔｏ ４８ ｍｏｎｔｈｓ ｉｎ ＡＤＮＩ． Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ １２６， ６５９－６７０， ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００４０１－０１３－１１５１－４ （２０１３）．
【0208】
Ｖａｎｄｅｒｍｅｅｒｅｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｕ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｗｉｔｈ ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓａｎｄｗｉｃｈ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ６１， １８２８－１８３４ （１９９３）．
【0209】
Ｊａｃｋ， Ｃ． Ｒ．， Ｊｒ． ｅｔ ａｌ． ＮＩＡ－ＡＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ： Ｔｏｗａｒｄ ａ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｅｍｅｎｔ １４， ５３５－５６２， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｌｚ．２０１８．０２．０１８ （２０１８）．
【0210】
Ｊａｃｋ， Ｃ． Ｒ．， Ｊｒ． ｅｔ ａｌ． Ａ／Ｔ／Ｎ： Ａｎ ｕｎｂｉａｓｅｄ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ８７， ５３９－５４７， ｄｏｉ：１０．１２１２／ｗｎｌ．００００００００００００２９２３ （２０１６）．
【0211】
Ｈｕ， Ｗ． Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｒｅｄｕｃｅｄ ＣＳＦ ｐ－Ｔａｕ１８１ ｔｏ Ｔａｕ ｒａｔｉｏ ｉｓ ａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ＦＴＬＤ－ＴＤＰ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ８１， １９４５－１９５２， ｄｏｉ：１０．１２１２／０１．ｗｎｌ．００００４３６６２５．６３６５０．２７ （２０１３）．
【0212】
Ｈａｍｐｅｌ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｔａｕ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ： ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｓｔｕｄｙ． Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ６１， ９５－１０２， ｄｏｉ：１０．１００１／ａｒｃｈｐｓｙｃ．６１．１．９５ （２００４）．
【0213】
Ｐｒｉｃｅ， Ｊ． Ｌ． ＆ Ｍｏｒｒｉｓ， Ｊ． Ｃ． Ｔａｎｇｌｅｓ ａｎｄ ｐｌａｑｕｅｓ ｉｎ ｎｏｎｄｅｍｅｎｔｅｄ ａｇｉｎｇ ａｎｄ ‘‘ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ’’ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ４５， ３５８－３６８ （１９９９）．
【0214】
Ｉｔｔｎｅｒ， Ｌ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔａｕ Ｍｅｄｉａｔｅｓ Ａｍｙｌｏｉｄ－β Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ． Ｃｅｌｌ １４２， ３８７－３９７， ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１０．０６．０３６ （２０１０）．
【0215】
Ｃｏｈｅｎ， Ａ． Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｅａｒｌｙ ｓｔｒｉａｔａｌ ａｍｙｌｏｉｄ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ Ｄｏｗｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｎｄ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｌａｔｅ－ｏｎｓｅｔ ａｍｙｌｏｉｄ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ． Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ＆ ｄｅｍｅｎｔｉａ ： ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｌｚ．２０１８．０１．００２ （２０１８）．
【0216】
Ｍａｉａ， Ｌ． Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ａｍｙｌｏｉｄ－β ａｎｄ Ｔａｕ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ ｏｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５， １９４ｒｅ１９２－１９４ｒｅ１９２ （２０１３）．
【0217】
Ｓａｔｏ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｔａｕ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｎｅｕｒｏｎ ９８， ８６１－８６４， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２０１８．０４．０３５ （２０１８）．
【0218】
Ｓｃｈｅｌｌｅ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｕ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｏｆ ＡＰＰ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＢＡＣＥ１ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ． Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ＆ Ｄｅｍｅｎｔｉａ： Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ １３， ７０１－７０９， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｌｚ．２０１６．０９．００５ （２０１７）．
【0219】
Ｚｅｍｐｅｌ， Ｈ．， Ｔｈｉｅｓ， Ｅ．， Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ， Ｅ． ＆ Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ， Ｅ． Ｍ． Ａｂｅｔａ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ ｃａｕｓｅ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ Ｃａ（２＋） ｅｌｅｖａｔｉｏｎ， ｍｉｓｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｔａｕ ｉｎｔｏ ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ， Ｔａｕ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ ａｎｄ ｓｐｉｎｅｓ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３０， １１９３８－１１９５０， ｄｏｉ：１０．１５２３／ｊｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３５７－１０．２０１０ （２０１０）．
【0220】
Ｓａｍａｎ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｅｘｏｓｏｍｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔａｕ Ｉｓ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｉｎ Ｔａｕｏｐａｔｈｙ Ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ Ｉｓ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｉｎ Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ ｉｎ Ｅａｒｌｙ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８７， ３８４２－３８４９， ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１１．２７７０６１ （２０１２）．
【0221】
Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ， Ｎ． Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｔａｕ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ ｂｙ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｔ Ｈｉｇｈ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｖｅｒａｇｅ Ｐｒｏｖｉｄｅｓ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ Ｉｔｓ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ １５， ６６７－６７６， ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｊｐｒｏｔｅｏｍｅ．５ｂ０１００１ （２０１６）．
【0222】
Ｊｉｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｓｏｌｕｂｌｅ ａｍｙｌｏｉｄ β－ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｍｅｒｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｃｏｒｔｅｘ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｉｎｄｕｃｅ Ｔａｕ ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｒｉｔｉｃ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０８， ５８１９－５８２４ （２０１１）．
【0223】
Ｇｏｒｄｏｎ， Ｂ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｓｐａｔｉａｌ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｉｍａｇｉｎｇ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｆｒｏｍ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｗｉｔｈ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ： ａ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｓｔｕｄｙ． Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １７， ２４１－２５０， ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ１４７４－４４２２（１８）３００２８－０ （２０１８）．
【0224】
Ｒｙｍａｎ， Ｄ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｓｙｍｐｔｏｍ ｏｎｓｅｔ ｉｎ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ： ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ８３， ２５３－２６０， ｄｏｉ：１０．１２１２／ＷＮＬ．０００００００００００００５９６ （２０１４）．
【0225】
Ｆｌｅｉｓｈｅｒ， Ａ． Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ ａｇｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ １ Ｅ２８０Ａ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｋｉｎｄｒｅｄ： ａ ｃｒｏｓｓ－ｓｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｙ． ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ ７２， ３１６－３２４， ｄｏｉ：１０．１００１／ｊａｍａｎｅｕｒｏｌ．２０１４．３３１４ （２０１５）．
【0226】
Ｂｅｎｚｉｎｇｅｒ， Ｔ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｒｅｇｉｏｎａｌ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｍａｇｉｎｇ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １１０， Ｅ４５０２－４５０９， ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３１７９１８１１０ （２０１３）．
【0227】
Ｑｕｉｒｏｚ， Ｙ． Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｒｔｉｃａｌ ａｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｐｒｅｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ １ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｃａｒｒｉｅｒｓ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ８４， ５５６－５６１， ｄｏｉ：１０．１１３６／ｊｎｎｐ－２０１２－３０３２９９ （２０１３）．
【0228】
Ｒｉｄｈａ， Ｂ． Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｔｒｏｐｈｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｆａｍｉｌｉａｌ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ： ａ ｓｅｒｉａｌ ＭＲＩ ｓｔｕｄｙ． Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ ５， ８２８－８３４， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｓ１４７４－４４２２（０６）７０５５０－６ （２００６）．
【0229】
Ｉｔｔｎｅｒ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｕ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｍｙｌｏｉｄ－β ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｍｉｃｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５４， ９０４－９０８ （２０１６）．
【0230】
Ａｒｒｉａｇａｄａ， Ｐ． Ｖ．， Ｇｒｏｗｄｏｎ， Ｊ． Ｈ．， Ｈｅｄｌｅｙ－Ｗｈｙｔｅ， Ｅ． Ｔ． ＆ Ｈｙｍａｎ， Ｂ． Ｔ． Ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ｓｅｎｉｌｅ ｐｌａｑｕｅｓ ｐａｒａｌｌｅｌ ｄｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４２， ６３１－６３１， ｄｏｉ：１０．１２１２／ｗｎｌ．４２．３．６３１ （１９９２）．
【0231】
Ｂａｔｅｍａｎ， Ｒ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ＤＩＡＮ－ＴＵ Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｔｒｉａｌ： Ａｄａｐｔｉｖｅ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ． Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｅｍｅｎｔ １３， ８－１９， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｌｚ．２０１６．０７．００５ （２０１７）．
【0232】
Ｑｕｉｒｏｚ， Ｙ． Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ａｍｙｌｏｉｄ ａｎｄ Ｔａｕ Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｙｏｕｎｇ Ａｄｕｌｔｓ Ｗｉｔｈ Ａｕｔｏｓｏｍａｌ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ． ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ ７５， ５４８－５５６， ｄｏｉ：１０．１００１／ｊａｍａｎｅｕｒｏｌ．２０１７．４９０７ （２０１８）．
【0233】
Ｇｏｒｄｏｎ， Ｂ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｔａｕ ＰＥＴ ｉｎ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ： ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ， ｄｅｍｅｎｔｉａ ａｎｄ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ． Ｂｒａｉｎ ： ａ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ Ａｃｃｅｐｔｅｄ ｆｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ （２０１９）．
【0234】
Ｈｅ， Ｚ． ｅｔ ａｌ． Ａｍｙｌｏｉｄ－ｂｅｔａ ｐｌａｑｕｅｓ ｅｎｈａｎｃｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｂｒａｉｎ ｔａｕ－ｓｅｅｄｅｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ ｂｙ ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ ｎｅｕｒｉｔｉｃ ｐｌａｑｕｅ ｔａｕ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｍｅｄ ２４， ２９－３８， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４４４３ （２０１８）．
【0235】
Ｂｕｅｒｇｅｒ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． ＣＳＦ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｔａｕ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｎｅｏｃｏｒｔｉｃａｌ ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｂｒａｉｎ ： ａ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １２９， ３０３５－３０４１， ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｒａｉｎ／ａｗｌ２６９ （２００６）．
【0236】
Ｐｏｔｔｅｒ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ Ｖｉｖｏ Ａｍｙｌｏｉｄ－β４２ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｅｘｃｈａｎｇｅ， ａｎｄ Ｌｏｓｓ ｉｎ Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｒｒｉｅｒｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５， １８９ｒａ１７７－１８９ｒａ１７７ （２０１３）．
【0237】
Ｙａｍａｄａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ Ｒｅｖｅａｌｓ Ａｇｅ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｆ Ｂｒａｉｎ Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｔａｕ Ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ Ｐ３０１Ｓ Ｈｕｍａｎ Ｔａｕ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ３１， １３１１０－１３１１７， ｄｏｉ：１０．１５２３／ｊｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５６９－１１．２０１１ （２０１１）．
【0238】
Ｍｅｄｉｎａ， Ｍ． ＆ Ａｖｉｌａ， Ｊ． Ｆｕｒｔｈｅｒ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔａｕ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｅｘｐｅｒｔ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ １５， １１５－１２２， ｄｏｉ：１０．１５８６／１４７３７１７５．２０１５．１０００８６４ （２０１５）．
【0239】
Ｍｏｒｒｉｓ， Ｊ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ： Ｔｈｅ Ｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ２， ９７５－９８４， ｄｏｉ：１０．４１５５／ｃｌｉ．１２．９３ （２０１２）．
【0240】
Ｍｏｒｒｉｓ， Ｊ． Ｃ． Ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｍｅｎｔｉａ Ｒａｔｉｎｇ （ＣＤＲ）： ｃｕｒｒｅｎｔ ｖｅｒｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｃｏｒｉｎｇ ｒｕｌｅｓ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４３， ２４１２－２４１４ （１９９３）．
【0241】
Ｓｔｏｒａｎｄｔ， Ｍ．， Ｂａｌｏｔａ， Ｄ． Ａ．， Ａｓｃｈｅｎｂｒｅｎｎｅｒ， Ａ． Ｊ． ＆ Ｍｏｒｒｉｓ， Ｊ． Ｃ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｃｏｈｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ （ＤＩＡＮ）． Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌｏｇｙ ２８， １９－２９， ｄｏｉ：１０．１０３７／ｎｅｕ０００００３０ （２０１４）．
【0242】
Ｌｉｍ， Ｙ． Ｙ． ｅｔ ａｌ． ＢＤＮＦ Ｖａｌ６６Ｍｅｔ ｍｏｄｅｒａｔｅｓ ｍｅｍｏｒｙ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ， ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔａｕ ｉｎ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｂｒａｉｎ ： ａ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １３９， ２７６６－２７７７， ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｒａｉｎ／ａｗｗ２００ （２０１６）．
【0243】
Ｓｕ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｐａｒｔｉａｌ ｖｏｌｕｍｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｍｙｌｏｉｄ ｉｍａｇｉｎｇ． Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｅ １０７， ５５－６４， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｉｍａｇｅ．２０１４．１１．０５８ （２０１５）．
【0244】
Ｌｕｏ， Ｊ．， Ｄ’Ａｎｇｅｌｏ， Ｇ．， Ｇａｏ， Ｆ．， Ｄｉｎｇ， Ｊ． ＆ Ｘｉｏｎｇ， Ｃ． Ｂｉｖａｒｉａｔｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ ｉｎ ｆａｍｉｌｙ－ｔｙｐｅ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｓｔｕｄｉｅｓ． Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ５７， １０８４－１１０９， ｄｏｉ：ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｍｊ．２０１４００１３１ （２０１５）．
【0245】
Ｘｉｏｎｇ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｍｏｎｇ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ Ａｄｕｌｔ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ Ｓｔｕｄｙ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ８６， １４９９－１５０６， ｄｏｉ：１０．１２１２／ＷＮＬ．００００００００００００２５９３ （２０１６）．
【0246】
Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ， Ｙ．， ａｎｄ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ， Ｙ． ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｎｄ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｅｓｔｉｎｇ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ， ２８９－３００ （１９９５）．
【0247】
実施例１０
アルツハイマー病（ＡＤ）は、世界的に認知症の主要な原因である。ＡＤの診断及び治療は、特定のかつ初期のバイオマーカーが存在しない場合は、今もなお極めて困難である。最近の脳脊髄液（ＣＳＦ）バイオマーカー及び脳陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）画像検査の開発により、アミロイドＡβプラーク及び神経原線維高リン酸化タウ変化の病的ＡＤの脳の病態を検出するための有益なツールが提供された。現在、ＡＤ患者のＣＳＦプロファイルは、アミロイドベータ４２（Ａβ４２）の減少及び標準的なイムノアッセイで測定したタウ総量及びリン酸化タウ（ｐ－タウ１８１）の増加を特徴としている。このプロファイルにより、ＡＤと非ＡＤの病態を区別し、認知症状や病訴の何年も前にＡＤプロセスを検出することができる。しかしながら、ＣＳＦのタウ及びｐ－タウの変化はＡＤに固有ではない。ｐ－タウ１８１の増加は、濃縮体形成による高リン酸化の結果として解釈されてきたが、ＣＳＦのｐ－タウは、タウ総量と同時に増加する。脳の研究により多くの部位でのタウのリン酸化が示されているが、ＣＳＦにおけるこれらのさらなるリン酸化部位の診断妥当性（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ）性は十分な取り組みがなされてはいない。質量分析（ＭＳ）に基づく方法は、該方法によりリン酸化ペプチド及びそれらの対応する未修飾の相当物を独立に定量化することが可能になることから、イムノアッセイよりも、特定の部位のリン酸化レベルの変化をタウ総量レベルとは独立に評価するのに適している。したがって、リン酸化ペプチドと非リン酸化ペプチドの勾配の間の相関を比較して、リン酸化の比率を評価することができる。本発明者らは、ＣＳＦ中のリン酸化タウイソ型を定量化するために、当該タンパク質配列のミッドドメイン中のタウのリン酸化ペプチドを標的とする革新的なターゲット高解像度ＭＳ（ＨＲＭＳ）法を用いた。上記ミッドドメインはＣＳＦ中で最も存在量が多いドメインであり、脳のタウ及びＡＤタウの凝集体中で、多数の部位においてリン酸化される。
アルツハイマー病（ＡＤ）は、世界的に認知症の主要な原因である。ＡＤの診断及び治療は、特定のかつ初期のバイオマーカーが存在しない場合は、今もなお極めて困難である。最近の脳脊髄液（ＣＳＦ）バイオマーカー及び脳陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）画像検査の開発により、アミロイドＡβプラーク及び神経原線維高リン酸化タウ変化の病的ＡＤの脳の病態を検出するための有益なツールが提供された。現在、ＡＤ患者のＣＳＦプロファイルは、アミロイドベータ４２（Ａβ４２）の減少及び標準的なイムノアッセイで測定したタウ総量及びリン酸化タウ（ｐ－タウ１８１）の増加を特徴としている。このプロファイルにより、ＡＤと非ＡＤの病態を区別し、認知症状や病訴の何年も前にＡＤプロセスを検出することができる。しかしながら、ＣＳＦのタウ及びｐ－タウの変化はＡＤに固有ではない。ｐ－タウ１８１の増加は、濃縮体形成による高リン酸化の結果として解釈されてきたが、ＣＳＦのｐ－タウは、タウ総量と同時に増加する。脳の研究により多くの部位でのタウのリン酸化が示されているが、ＣＳＦにおけるこれらのさらなるリン酸化部位の診断妥当性（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ）性は十分な取り組みがなされてはいない。質量分析（ＭＳ）に基づく方法は、該方法によりリン酸化ペプチド及びそれらの対応する未修飾の相当物を独立に定量化することが可能になることから、イムノアッセイよりも、特定の部位のリン酸化レベルの変化をタウ総量レベルとは独立に評価するのに適している。したがって、リン酸化ペプチドと非リン酸化ペプチドの勾配の間の相関を比較して、リン酸化の比率を評価することができる。本発明者らは、ＣＳＦ中のリン酸化タウイソ型を定量化するために、当該タンパク質配列のミッドドメイン中のタウのリン酸化ペプチドを標的とする革新的なターゲット高解像度ＭＳ（ＨＲＭＳ）法を用いた。上記ミッドドメインはＣＳＦ中で最も存在量が多いドメインであり、脳のタウ及びＡＤタウの凝集体中で、多数の部位においてリン酸化される。
【0248】
本発明者らは、認知機能的に正常な個人と、ＣＳＦ Ａβ４２／４０比及びＰＥＴ－ＰＩＢ画像検査に基づくアミロイドの状態によって層別化した軽度認知障害の患者からなるコホートを用いて、ＣＳＦ中の、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｔ２０５、及びＴ２１７におけるタウのリン酸化を分析した。この検証により、本発明者らは、ＡＤ診断のためのＣＳＦ ｐＴ２１７の可能性を強調し、ｐＴ２１７と疾患の初期段階でのタウの修飾の基礎となるアミロイドーシスとの相関を確立することが可能になった。
【0249】
被験者－Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ２０１５により既報であり、ＣＳＦ及びアミロイドＰｉＢ－ＰＥＴデータが利用可能な、ｔｈｅ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ ＡＤＲＣ研究から、認知機能が正常な（ＣＤＲ＝０）または軽度認知機能障害のある８６名の被験者を募った。ＰｉＢ－ＰＥＴ（カットオフとして使用した０．１８超で陽性と見なした）及びＭＳによって測定したＣＳＦのＡβ４２／Ａβ４０比（カットオフとして使用した０．１２未満で病的と見なした）の結果によれば、このコホートには、２９名のアミロイド陽性及び４７名のアミロイド陰性の被験者、ならびにＰＥＴ－ＰＩＢとＣＳＦプロファイルとの間で相克的な結果となった１０例（５例のＰｉＢ－ＰＥＴ（＋）／ＣＳＦ（－）及び５例のＰｉＢ－ＰＥＴ（－）／ＣＳＦ（＋）アミロイドーシスプロファイル）が含まれていた。７種のＣＳＦ試料をｎ＝２で及び１種をｎ＝３で抽出して、変動性を評価した。
【0250】
免疫沈降を用いたＣＳＦのタウの精製－Ａβ免疫沈降及び－８０℃での保存後に得た８００μｌのＣＳＦ上清をタウ分析に使用した。解凍した上清に１５Ｎタウ内部標準（試料当り５ｎｇ）をスパイクし、タウ１免疫沈降を用いて抽出した。この試料に５ｍＭ グアニジン、１％ ＮＰ－４０、及びプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加し、試料を室温で３時間、タウ１抗体と架橋したセファロースビーズ２０μｌと混合した。ビーズを沈殿させ、次いで０．５Ｍ グアニジン及び２５ｍＭ ＴＥＡＢＣですすいだ。試料を４００ｎｇのトリプシンで消化した。ＡＱＵＡペプチド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）をスパイクして、試料当りの標識リン酸化ペプチド当り１０ｆｍｏｌ及び標識ペプチド当り１００ｆｍｏｌの個々の量を得た。探索コホート（ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｃｏｈｏｒｔ）で用いた未切断ペプチドの代わりにＡＱＵＡ ＴＰＳＬＰｐＴＰＰＴＲ（ｐＴ２１７）を用いた。トリプシン切断ペプチドをＴｏｐＴｉｐ Ｃ１８チップにロードし、０．１％ ＦＡ溶液で洗浄し、６０％ ＡＣＮ ０．１％ ＦＡ溶液で溶出させた。Ｓｐｅｅｄｖａｃで溶出液を乾燥した。試料を－８０℃で保存した。ＬＣ－ＭＳ分析の前に、試料を２５μｌの２％ ＡＣＮ ０．１％ ＦＡ溶液中に再懸濁した。抽出物をｎａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＨＲＭＳによって分析した。
【0251】
タウペプチド及びリン酸化ペプチドの定量（検証）－１５Ｎ標識ペプチドを使用した安定同位体希釈ＭＳ定量法を用いて、未修飾ペプチドの絶対レベルを計算した。ＡＱＵＡの非リン酸化及びリン酸化ペプチド相当物に対して得られた面積比を、対応する内因性ペプチドについて測定した面積比と比較する１点較正によって、各部位のリン酸化率を計算した。未修飾ペプチドレベルの対応物と相当する部位のリン酸化率を組み合わせることによって、リン酸化ペプチドレベルを計算した。
【0252】
統計学－回帰直線の傾きの比較を含む統計学的解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（７．０）を使用して実施した。ノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定を用いて、調査した群全体から得られた数値間の統計学的有意性を計算した。ノンパラメトリックなスピアマンの順位相関係数ρを用いて、２つの一連の数値間の相関を評価した。統計学的有意性はｐ＜０．０５で定義した。
【0253】
ＣＳＦのタウリン酸化ペプチドの定量（結果）－Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ Ｓａｉｎｔ ＬｏｕｉｓのＫｎｉｇｈｔ ＡＤ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ （ＡＤＲＣ）における、認知に関する病訴のないまたは軽度認知障害がある８６名の被験者からなるコホートで、ＡＤにおけるＴ２１７でのタウのリン酸化の増加を検出した。被験者は、ＰｉＢ－ＰＥＴ及びＭＳによって測定したＣＳＦのＡβ４２／Ａβ４０比の結果と一致して、２９名のアミロイド陽性、４７名のアミロイド陰性の被験者、及びＰＥＴ－ＰＩＢとＣＳＦのプロファイルの間で相克的な結果となった１０例に層別化された。アッセイの感度を向上させるために、タウ１抗体による免疫精製を実施した。リン酸化及び非リン酸化ペプチドの両方の同位体標識バージョンを用いて、部位のリン酸化率を測定した。タウ１抗体によって回収されなかったｐＳ１９９含有ペプチドを除いて、すべての試料で標的としたすべてのリン酸化ペプチドが検出された。このコホートにおいて、本発明者らは、疾患の初期段階でのｐＴ２１７バイオマーカーの陽性診断の妥当性を確認した。ｐＴ２１７／Ｔ２１７比によってアミロイド陽性群とアミロイド陰性群が明確に分離された（図２４Ｂ及び図２４Ｃ、ＡＵＣ ０．９９９）。さらに、ｐＴ１８１／Ｔ１８１比の測定値によって、アミロイド陽性群とアミロイド陰性群が区別された（図２４Ｂ、ＡＵＣ ０．９５６）。Ｔ２１７とＴ１８１のリン酸化比も相関しており（ｒ＝０．５２４、ｐ＝０．０００２）、このことは、これらの部位のリン酸化が共通の経路に由来する可能性があることを示唆している。ただし、ｐＴ１８１の診断感度はｐＴ２１７の診断感度よりも低かった。どちらのリン酸化比も、ＥＬＩＳＡによって測定したｐ－タウ（１８１）及びｔ－タウレベルよりもより良好な弁別子であった（それぞれＡＵＣ ０．８７４及び０．９３２）。
【0254】
Ｔ２１７の高リン酸化、アミロイドの病態、及び認知機能の状態の間の相関（結果）－次に、本発明者らは、この新たなバイオマーカーとアミロイドプロセスの間の相関を判定した。ＡＤＲＣコホートの結果は、Ｔ２１７の高リン酸化とアミロイドの状態の間に強い関連性があることを示唆した。重要なことに、Ｔ２１７のリン酸化率は、ＦＢＰ Ｔｏｔａｌ Ｃｏｒｔｉｃａｌ Ｍｅａｎによって測定したＰｉＢ－ＰＥＴの程度と有意に相関していた（図２４Ｅ、ｒ＝０．６０、ｐ＝０．００１）。さらに、上述の、ＰｉＢ－ＰＥＴ（＋）／ＣＳＦ（－）のアミロイドーシスプロファイルの、競合する５例ケースはすべて、Ｔ２１７で高リン酸化されていた（図２４Ｄ、Ｅ）。対照的に、Ｔ２１７のリン酸化とＣＳＦのＡβ４２／Ａβ４０比の間には有意な相関が見られなかった。対応するＣＳＦのＡβ４２／Ａβ４０のＭＳ比が定量化の閾値に近かったことから（０．１２±０．０２、図２４Ｅ）、ＰｉＢ－ＰＥＴとＣＳＦのＡβ４２／Ａβ４０の不一致は、ＣＳＦのアミロイドのアッセイの感度が不十分なためであった可能性がある。上述の、逆のＰｉＢ－ＰＥＴ（－）／ＣＳＦ（＋）のアミロイドーシスの５名の被験者のうち、２名が高リン酸化Ｔ２１７を示した（図２４Ｄ、Ｅ）。このことは、タウの高リン酸化によって強調されるこれらの例では、アミロイドプラーク沈着物が検出される前に、ＣＳＦのＡβの有意な変化が生じている可能性があることを示唆している。ＣＳＦのＡβ４２／Ａβ４０比をＴ２１７のリン酸化率の組み合わせにより、ＰｉＢ－ＰＥＴデータがなく、ＣＳＦのＡβ４２／Ａβ４０比の値が閾値よりわずかに高い（０．１２±２０％）中程度の範囲の場合であっても、アミロイド陽性の被験者が確実に識別される。認知に関する病訴のない被験者（ＣＤＲ－ＳＢ＝０）の中では、Ｔ２１７のリン酸化によって、アミロイド陽性の被験者（ｎ＝９）をアミロイド陰性の被験者（ｎ＝２６、ＡＵＣ １．００、図２５）から完全に区別することができ、さらに、このマーカーが前臨床のＡＤ被験者を確実に識別することができることを裏付けた。しかしながら、この集団において、ＣＤＲ－ＳＢで測定した全般的な認知能力とＴ２１７のリン酸化率との間に相関は観測されなかった（図２５）。
【0255】
考察－本発明者らは、低い存在量のリン酸化タウペプチド及びそれらのＣＳＦ中の未修飾の対応物を同時に測定する革新的なターゲットＨＲＭＳ法を用いて、アミロイドの変化と同時に起こり、かつＣＳＦのタウ濃度の増加とは異なる、ＣＳＦのタウのリン酸化率の変化の直接的なエビデンスを初めて提示する。この手法によって、根底にある異常な代謝を示す高リン酸化及び低リン酸化を評価する、ＡＤ固有のタウのリン酸化率の研究が可能になる。
【0256】
本研究の最も際立った結果は、２つの独立し、十分にキャラクタライズされたコホートにおいて調査した、前臨床、軽度、及び中程度のＡＤ被験者由来のＣＳＦのタウ中のＴ２１７の高度に特異的な高リン酸化である。ＡＤタウオパチーの前に発生する可能性が高いアミロイドの病態とＴ２１７におけるタウの高リン酸化とは、病期全体を通して強い関連性があった。このことは、アミロイドーシスがタウのリン酸化の変化と関連性を有する可能性があるという仮説を裏付けている。この研究において、Ａβ－アミロイドーシスを有し、かつＴ２１７のリン酸化が正常な被験者がいないことは、このタウのリン酸化部位がアミロイドプロセスの後に続く可能性があることを示唆している。Ｔ２１７の高リン酸化は、ＡＤの病態生理学的プロセスにおける重要な役割を果たす可能性があり、その役割は他のタウのバイオマーカーとは異なっていた。本発明者らのコホートでは、ＥＬＩＳＡによって評価したＣＳＦのタウまたはｐ－タウのレベルの増加は、アミロイドーシスの状態の識別においてｐＴ２１７／Ｔ２１７比よりも有効性が低かった。これらのＡＤタウのバイオマーカーの特異性によって、最終的には臨床的ＡＤへと進行する個人における認知機能低下の危険性の予測が改善される可能性がある。したがって、アミロイドーシスバイオマーカーをｐＴ２１７／Ｔ２１７比の測定値と組み合わせてＡＤを検出することにより、前臨床ＡＤの診断が劇的に改善されるはずである。Ｔ２１７の高リン酸化は、ＣＳＦ中のアミロイドマーカーよりもＰｉＢ－ＰＥＴ負荷で測定したアミロイドプラークと高い相関があるが、タウの修飾は、原線維プラークの存在によってのみ引き起こされるわけではない。脳アミロイド負荷がなく、Ｔ２１７の高リン酸化があり、かつＣＳＦのＡβ４２／４０が低い上述の２名の被験者（図２４Ｅ）については、ＰｉＢ－ＰＥＴによって検出されないが、ＣＳＦのＡβ４２レベルの低下には寄与するびまん性プラークまたはＡβオリゴマー形成のみの症例である可能性がある。
【0257】
ｐＴ１８１がクリニックにおいてＡＤマーカーとして広範に使用されるのは、必ずしもその高い特異性ではなく、高いレベルの検出性に負う可能性が高い。ｐＴ１８１の測定値によって、非ＡＤ認知症と比較して、ＡＤにおけるｐＴ１８１のリン酸化の化学量論のわずかな変化が強調される。Ｔ１８１のリン酸化率の増加は、検証コホートで調査した、十分にキャラクタライズされたアミロイド陽性群においてよりいっそう明らかであった。両方の研究において、ＥＬＩＳＡによるｔ－タウとｐ－タウ１８１を組み合わせた比では、Ｔ１８１で起こるリン酸化比の変化を実証することができず、このことによってＥＬＩＳＡでこれらの変化を正確に監視することの限界が強調された。したがって、ＡＤのＣＳＦにおいて広く報告されているｐＴ１８１の増加は、主としてＴ１８１のリン酸化の化学量論の有意な変化というよりはむしろ、同時に起こるタウイソ型レベルの増加に起因する。アミロイドＡβの病態はＴ１８１における高リン酸化を誘発するが、結果として生じる変化は、Ｔ２１７において観測される相対的な増加と比較して、特異性が低いかまたは有意性が低いように思われる。
【0258】
ＡＤのＣＳＦ中のＳ１９９、Ｓ２０２、及びＴ２０５で観測されたリン酸化化学量論の変化は、ＡＤの脳で以前に観測されたタウのリン酸化の特定の変化を反映している可能性がある。実際、ｐＳ２０２及びｐＴ２０５は、ＡＴ８抗体によって認識される二重リン酸化エピトープの一部である。ＡＴ８はＡＤの脳の解剖で見られるタウ凝集体に結合し、ＡＴ８免疫反応性凝集体の程度はタウオパチーの重症度（ブラーク・ステージ）と相関する。ＡＴ８は、正常なタウまたはＣＳＦ中で測定されるＡＤに関連するタウに対する反応性をもたない。さらに、Ｓ１９９を含有する非リン酸化エピトープで正常なタウに結合するタウ１抗体は、ＡＤのタウ凝集体に対する親和性がない。まとめると、これらの知見は、ＡＤの脳由来のタウ凝集体中において、同時に起こりかつ存在量の多いＳ１９９、Ｓ２０２、及びＴ２０５の高リン酸化を裏付ける。ただし、ＡＤにおいてタウの凝集を促進するようなリン酸化タウイソ型の固有の特性については論争が存在する。軽度及び中程度のＡＤのＣＳＦ中で観測されるＳ１９９及びＳ２０２のリン酸化の量の減少は、凝集体中の対応するリン酸化タウイソ型の蓄積と一致している。さらに、主として中程度のＡＤのＣＳＦにおいてＴ２０５のリン酸化が検出されることは、アミロイド関連タウオパチーの根底にある病理学的機序におけるこの部位の重要な役割を示唆している。Ｓ２０２／Ｔ２０５リン酸化の変化は、前臨床及び軽度のＡＤの被験者で構成される第二のコホートにおいては検出されなかった（データ表示せず）。
【0259】
本知見は、ＡＤアミロイドーシスとＴ２１７及び、程度はより低いが、Ｔ１８１におけるタウの高リン酸化の間の相互作用を示唆している可能性がある。これらの部位は共にプロリン指向性セリン／スレオニンキナーゼＧＳＫ－３の基質であり、ＡβオリゴマーによるＧＳＫ－３の活性化は、アミロイドペプチドとタウのリン酸化の間のリンクとして提案されている。アミロイドーシスの患者におけるこれら２つのＧＳＫ－３部位での一般的かつ比較的相関の高い高リン酸化はかかる機序と一致する可能性がある。タウＰＥＴにより測定したタウ凝集体を含むＣＳＦ及び脳中のタウのリン酸化率を比較するために設計されたさらなる研究は、ＡＤの病態生理に新たな洞察をもたらす可能性があり、新規な治療方法を特定する可能性がある。これらの知見は、ＡＤのアミロイドプラークとタウオパチーの間の特定のリンクに向いており、ＡＤに至る分子事象の連鎖における潜在的なリンクを提供する。したがって、ＡＤプロセス内のｐＴ２１７の特異性を考えると、ｐＴ２１７は、将来の治療薬開発の重要な標的、及びこの異常なタウ代謝を制限する抗アミロイド薬の潜在的な効果を追跡するための興味深いツールを表している可能性がある。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図8F】
【図8G】
【図8H】
【図8I】
【図8J】
【図8K】
【図8L】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図9F】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図10F】
【図10G】
【図10H】
【図10I】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図16E】
【図16F】
【図16G】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図17D】
【図17E】
【図17F】
【図18A】
【図18B】
【図19A】
【図19B】
【図19C】
【図19D】
【図20】
【図21A】
【図21B】
【図21C】
【図21D】
【図21E】
【図22】
【図23A】
【図23B】
【図23C】
【図24A】
【図24B】
【図24C】
【図24D】
【図25】
【配列表】