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特許7301862歯周病及び関連疾患の治療に用いる細菌性グルタミニルシクラーゼの新規阻害剤
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-06-23
(45)【発行日】2023-07-03
(54)【発明の名称】歯周病及び関連疾患の治療に用いる細菌性グルタミニルシクラーゼの新規阻害剤
(51)【国際特許分類】
C07D 471/04 20060101AFI20230626BHJP
A61K 31/437 20060101ALI20230626BHJP
A61K 31/444 20060101ALI20230626BHJP
A61K 31/4545 20060101ALI20230626BHJP
A61K 31/5377 20060101ALI20230626BHJP
A61K 31/555 20060101ALI20230626BHJP
A61P 1/02 20060101ALI20230626BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230626BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20230626BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230626BHJP
C07D 519/00 20060101ALI20230626BHJP
C12N 9/10 20060101ALN20230626BHJP
【ＦＩ】
C07D471/04 107E
A61K31/437
A61K31/444
A61K31/4545
A61K31/5377
A61K31/555
A61P1/02
A61P29/00
A61P31/04
A61P43/00 105
A61P43/00 111
C07D471/04 CSP
C07D519/00 311
C12N9/10 ZNA
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2020544395
(86)(22)【出願日】2019-02-22
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-06-10
(86)【国際出願番号】 EP2019054476
(87)【国際公開番号】W WO2019162458
(87)【国際公開日】2019-08-29
【審査請求日】2022-02-03
(31)【優先権主張番号】18158343.6
(32)【優先日】2018-02-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】594102418
【氏名又は名称】フラウンホーファー－ゲゼルシャフト ツル フェルデルング デル アンゲヴァンテン フォルシュング エー ファウ
【氏名又は名称原語表記】Ｆｒａｕｎｈｏｆｅｒ－Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｚｕｒ Ｆｏｅｒｄｅｒｕｎｇ ｄｅｒ ａｎｇｅｗａｎｄｔｅｎ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ｅ．Ｖ．
【住所又は居所原語表記】Ｈａｎｓａｓｔｒａｓｓｅ ２７ｃ， Ｄ－８０６８６ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(74)【代理人】
【識別番号】100135079
【弁理士】
【氏名又は名称】宮崎 修
(72)【発明者】
【氏名】イェーガー，クリスティアン
(72)【発明者】
【氏名】リーベ，リンダ
(72)【発明者】
【氏名】ラムスベック，ダーニエル
(72)【発明者】
【氏名】リナート，ミリアム
(72)【発明者】
【氏名】ガイスラー，シュテファニー
(72)【発明者】
【氏名】ピエコッタ，アンケ
(72)【発明者】
【氏名】マイツネル，ディアヌ
(72)【発明者】
【氏名】サイニス，ホルガー
(72)【発明者】
【氏名】ブフホルツ，ミルコ
【審査官】阿久津 江梨子
(56)【参考文献】
【文献】特表２００４－５２４３１４（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１６／１７１７５５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１０－５０２６６０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平２－６９４９６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／１００１５９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】EUROPEAN COMMISSION: "Final Report Summary - TRIGGER (King of hearts, joints and lungs; periodontal pathogens as etiologic factor in RA, CVD and COPD and their impact on treatment strategies.)"， [検索日 2023.05.24], インターネット，2017年08月16日，<URL:https://cordis.europa.eu/project/id/306029/reporting>
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｄ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
Ｃ１２Ｎ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の式Ｉ【化1】
Ｒ１は独立して、Ｈ及び場合によっては置換されたアルキルからなる群より選択され；
Ｌは以下の：
【化2】
Ｒａ及びＲｂは互いに、同一か又は異なり、独立して、Ｈ、ハロ、場合によっては置換されたアルキル、場合によっては置換されたアリール、場合によっては置換されたヘテロアルキル及び場合によっては置換されたヘテロアリールからなる群から選択され、ここで、Ｒａ及びＲｂは、場合によっては共に連結されて炭素環又は複素環を形成することができ；
ここで、「場合によっては置換（された）」とは、独立して、Ｃ１～６アルキル基、Ｃ１～６ヘテロアルキル基、Ｃ１～６カルボシクリル基、Ｃ１～５ヘテロシクリル基及びＣ１～５ヘテロアリール基から選択される１つ又は複数の基による場合による置換であり、前記各基は、１つ又は複数のハロゲン原子及び／又はヒドロキシル基、ハロゲン原子、シアノ基、第一級、第二級又は第三級のアミノ基、ヒドロキシル基、及びカルボキシル基により置換されてよい）
で表される化合物、その個々の鏡像異性体、その個々のジアステレオ異性体、その水和物、その溶媒和物、その結晶形、その個々の互変異性体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項2】
以下の：前記アリールは、独立して、Ｃ６～１０ 基、又はＣ６アリール基であり；
前記ヘテロシクリルは、独立して、単環式又は二環式のＣ１～１１、Ｃ２～８、又はＣ４～５ の複素環式基であり、Ｎ、Ｓ及びＯから選択される１～４個の環式ヘテロ原子を含み；
前記アルキルは、独立して、直鎖又は分枝鎖の、開鎖のＣ１～６、Ｃ１～４、Ｃ１～３、又はＣ１～２ のアルキル基であり；
前記シクロアルキルは、独立して、環状のＣ３～６、Ｃ４～６、又はＣ５～６ のアルキル基であり；
前記アルケニルは、独立して、少なくとも１つのＣ＝Ｃ結合を含む直鎖又は分枝鎖の、開鎖又は環状のＣ２～６ 基、Ｃ２～４ 基、又はＣ２基であり；
前記ヘテロアリールは、独立して、芳香族単環式又は二環式のＣ１～１１、Ｃ２～８、又はＣ４～５ の複素環式基であり、Ｎ、Ｓ及びＯから選択される１～４個の環式ヘテロ原子を含み；かつ、
前記ヘテロアルキルは、独立して、Ｎ、Ｓ及びＯから選択される１～４個のヘテロ原子を含む直鎖又は分枝鎖の、開鎖又は環状のＣ１～５、Ｃ１～３、又はＣ１～２ のヘテロアルキル基である；
請求項１に記載の化合物、その個々の鏡像異性体、その個々のジアステレオ異性体、その水和物、その溶媒和物、その結晶形、その個々の互変異性体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項3】
以下の式Ｉａ【化3】
Ｒ１、Ｒａ、ＲｂはＨである）
で表される請求項１又は２に記載の化合物、その個々の鏡像異性体、その個々のジアステレオ異性体、その水和物、その溶媒和物、その結晶形、その個々の互変異性体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項4】
Ｒａ及びＲｂは、独立して、１Ｈ及びＤから選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物、その個々の鏡像異性体、その個々のジアステレオ異性体、その水和物、その溶媒和物、その結晶形、その個々の互変異性体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項5】
Ａが以下の構造Ｂ：【化4】
Ｒ７及びＲ８は、独立して、アルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、カルバミドイル、ホルミル、アルキルアシル及びアリールアシルから選択され、これらは各々、場合によってはさらに置換されてよく、ここで、Ｒ７及びＲ８は、場合によっては連結されて炭素環又は複素環を形成することができる）
により表される少なくとも１つの置換基により置換される、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物、その個々の鏡像異性体、その個々のジアステレオ異性体、その水和物、その溶媒和物、その結晶形、その個々の互変異性体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項6】
Ｒ７が、以下の構造Ｅ：【化5】
Ｒｃ及びＲｄは、独立して、－Ｈ、－ＣＨ３、－ＣＨ＝ＣＨ２、－ＳＯ３Ｈ及びＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨから選択され；
Ｘは、共有結合、アルキレン、アラルキレン、ヘテロアルキレン、カルボシクレン、ヘテロシクレン、ヘテロアリーレン、ヘテロアラルキレン、アミノアルキレン、アルキルアミノ及びカルボニルアルキルアミノ基から選択され、ここで、これらは各々、主鎖中に１２個までの炭素原子及び１１個までのヘテロ原子があってよく、１又はそれ以上のＣ１～６アルキル基、Ｃ１～６ヘテロアルキル基、Ｃ１～６カルボシクリル基、Ｃ１～５ヘテロシクリル基、Ｃ１～５ヘテロアリール基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、シアノ基、第一級、第二級又は第三級のアミノ基、カルボキシル基及び側鎖で置換されてよい）
により表される、請求項５に記載の化合物、その個々の鏡像異性体、その個々のジアステレオ異性体、その水和物、その溶媒和物、その結晶形、その個々の互変異性体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項7】
Ｘが以下の構造：【化6】
Ｒｅはプロテイン原性アミノ酸由来の側鎖である）
により表される、請求項６に記載の化合物、その個々の鏡像異性体、その個々のジアステレオ異性体、その水和物、その溶媒和物、その結晶形、その個々の互変異性体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項8】
Ａは、以下の構造Ｆ：【化7】
Ｒｃ及びＲｄは、独立して、－Ｈ、－ＣＨ３、－ＣＨ＝ＣＨ２、－ＳＯ３Ｈ及びＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨから選択される）
により表される置換基により置換された、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物、その個々の鏡像異性体、その個々のジアステレオ異性体、その水和物、その溶媒和物、その結晶形、その個々の互変異性体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項9】
以下の：
【化8】
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載の化合物、その個々の鏡像異性体、その個々のジアステレオ異性体、その水和物、その溶媒和物、その結晶形、その個々の互変異性体又はその薬学的に許容される塩、及び、医薬的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項11】
請求項１～９のいずれか一項に記載の化合物、その個々の鏡像異性体、その個々のジアステレオ異性体、その水和物、その溶媒和物、その結晶形、その個々の互変異性体又はその薬学的に許容される塩、又は請求項１０に記載の医薬組成物を含む、ヒト又は動物の治療に用いるための治療剤。
【請求項12】
細菌感染の治療及び／又は予防の方法において用いる請求項１０に記載の医薬組成物又は請求項１１に記載の治療剤。
【請求項13】
以下の：（ｉ）細菌感染が細菌性グルタミニルシクラーゼ（ｂａｃＱＣ）を発現する細菌により生じ、前記ｂａｃＱＣは配列番号１、２及び３からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び前記配列番号１、２及び３のいずれか１つの配列との配列相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチドであるか；
（ｉｉ）前記細菌感染は、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ及びＴａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａからなる群より選択される細菌により生じる；及び／又は、
（ｉｉｉ）請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物、その個々の鏡像異性体、その個々のジアステレオ異性体、その水和物、その溶媒和物、その結晶形、その個々の互変異性体又はその薬学的に許容される塩はバイオフィルム内の細菌増殖を選択的に阻害する；
請求項１２に記載の医薬組成物又は治療剤。
【請求項14】
急性、慢性又は再発性の歯周疾患の治療又は予防の方法に用いるための、請求項１０に記載の医薬組成物又は請求項１１に記載の治療剤。
【請求項15】
疾患が、歯垢誘発性歯肉疾患、慢性歯周炎、侵襲性歯周炎、全身性疾患の発現としての歯周炎、壊死性歯周疾患、歯周膿瘍、歯内病変に関連する歯周炎、インプラント周囲粘膜炎、インプラント周囲炎、及び歯内感染症からなる群より選択され、及び／又は、
前記化合物、その個々の鏡像異性体、その個々のジアステレオ異性体、その水和物、その溶媒和物、その結晶形、その個々の互変異性体又はその薬学的に許容される塩は、局所投与、及び／又は、非外科的方法により投与される、請求項１４に記載の医薬組成物又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細菌性グルタミニルシクラーゼ（ｂａｃＱＣ）の阻害剤として特に有用な新規化合物；当該化合物を含む医薬組成物；治療、特に歯周炎及び関連する状態の治療に用いる化合物及び／又は医薬組成物に関する。本開示はまた、細菌性グルタミニルシクラーゼを含む結晶、並びにｂａｃＱＣの結合ポケットに関連し得る、及び／又はｂａｃＱＣ阻害剤である、候補化合物を同定する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
歯周病は、世界の人口の約３０％が罹患しており、個人や社会に多大な影響を及ぼし、治療に費用がかかる。歯科医療費は、全ての疾患の中で４番目に高く、全ての医療資源の５～１０％を消費する（非特許文献１）。代表的な集団研究では、歯周疾患は広範に分布し、その有病率は１９９７年以降増加していることが示されている（非特許文献２）。ドイツの成人集団のうち、５２．７％が中等度の重度の歯周炎に罹患しており、２０．５％が重度の歯周炎に罹患していた。ドイツにおける歯周炎直接治療の医療保険支出は約１１億ユーロであり（非特許文献３）、これには二次疾患による費用は含まれていない。
【0003】
歯周炎は，多細菌性誘発による歯周組織の炎症状態をいう一般的な用語であり，心血管疾患，関節リウマチ，慢性閉塞性肺疾患，アルツハイマー病等の種々の全身性疾患との関連が強い。
【0004】
ドイツ歯科学会の勧告によれば、現在確立されている歯周炎の治療は、手技による歯肉上及び歯肉下の剥離（細菌性プラークの除去）と防腐剤の塗布（毎日の洗口による消毒）であるが、これは、口腔内のバイオフィルム全体を崩壊させて、潜在的な病原体による再コロニー化をもたらす。さらに、進行性疾患形態では、アジュバント全身性広スペクトル抗生物質療法が適用される。後者により、バイオフィルムは非選択的に破壊され、特定の作用部位、すなわち歯周ポケットで十分な治療レベルに到達するには、高用量で長期間投与しなければならない。歯周炎の標準的なアジュバント療法には、例えば、ドキシシクリン（経口）（１回あたり１×２００ｍｇ／日）を１日間全身投与し、さらに１８日間２×１００ｍｇ／日全身投与することが含まれる（非特許文献４）。その結果、経口病原体における耐性の発展が観察される。さらに、患者の腸内のマイクロバイオームが破壊され、代謝支持体及び免疫調節が喪失し、潜在的病原体による再定着が可能になる。残存するバイオフィルムの保存と共に焦点を絞った標的療法は、歯周炎及びそれに関連する状態の治療を有意な改善するであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【文献】Ｂａｔｃｈｅｌｏｒ， Ｐ． Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｄｅｎｔａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１４， ２１７， ４０５－４０９
【文献】Ｍｉｃｈｅｅｌｉｓ， Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ｖｉｅｒｔｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｍｕｎｄｇｅｓｕｎｄｈｅｉｔｓｓｔｕｄｉｅ （ＤＭＳ ＩＶ）， Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ ｐｅｒｚｔｅ－Ｖｅｒｌａｇ， Ｋｋｏｌｎ， ２００６
【文献】Ｓｔａｔｉｓｔｉｓｃｈｅｓ Ｂｕｎｄｅｓａｍｔ， ２００８
【文献】Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｌｉｃｈｅ Ｓｔｅｌｌｕｎｇｎａｈｍｅ： Ａｄｊｕｖａｎｔｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｋａ ｉｎ ｄｅｒ Ｐａｒｏｎｔｉｔｉｓｔｉｓｈｅｐｉｅ， Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｆｕｒ ＺａｈｎＭｕｎｄｕｎｄｕｎｄ Ｋｉｅｆｅｒｈｅｉｌｋｕｎｄｅ， ＤＺＺ ２００３
【文献】Ｓｏｃｒａｎｓｋｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｅｒｉｏｎｔｏｌｏｇｙ， １９９８， ２５， １３４－１４４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
歯周病原性細菌の存在は、歯周炎患者により異なる。それにもかかわらず、歯肉下プラークにおける特定の細菌種の発生が、歯周疾患の病因と密接に関連することが明らかである（非特許文献５）。
【0007】
従って、歯周疾患を誘発する病原体を選択的に標的とすることができるが、本質的には相同的なヒト標的タンパク質に対して不活性であり、好ましくは、天然に存在するバイオフィルムの残存部分を実質的に保存する歯周炎及び関連する状態の新しい治療法の開発に対する高い需要が存在する。当該治療は、患者及び医療システムに有意な改善をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【0008】
上記の観点から、本発明は、歯周疾患及び関連疾患の治療に有用な化合物及び／又は医薬組成物を同定及び提供することを目的とする。当該化合物及び／又は医薬組成物は、好ましくは、歯周疾患を誘発する病原体を選択的に標的化する機能がある。より好ましくは、天然に存在するバイオフィルムの残存部分は実質的に保存され、相同なヒト標的タンパク質は実質的に阻害されない。さらにより好ましくは、当該化合物及び／又は医薬組成物は、標的病原体に対して高いインビボ活性を示す。
【0009】
さらなる目的は、治療標的タンパク質の結晶及び／又は共結晶の調製であり、これは、例えば、構造に基づく薬物設計により、歯周疾患を誘発する病原体を標的化することができる阻害剤の同定に用いることができる。
【0010】
さらなる目的は、好ましくは当該治療標的タンパク質の阻害剤である、当該治療標的タンパク質の結合ポケットに結合し得る候補化合物の同定方法を提供することである。
【0011】
本発明のさらなる目的は、治療標的タンパク質の阻害剤、及び当該阻害剤を含む医薬組成物を提供することである。前記阻害剤は、好ましくは、選択的阻害剤、すなわち、他の細菌及び／又はヒトタンパク質標的に対して実質的に不活性である一方で、（ａ）標的細菌性病原体を選択的に殺傷又は選択的に阻害する阻害剤である。
【0012】
本発明のさらなる目的は、ヒト又は動物の体の処置のための方法、及び／又は当該方法で用いる化合物若しくは医薬組成物を提供することである。
【0013】
本発明のさらなる目的は、好ましくは病原性細菌種の増殖を選択的に殺傷又は選択的に阻害する、細菌感染の治療又は予防の方法、及び／又は当該方法で用いる化合物若しくは医薬組成物を提供することである。
【0014】
本発明のさらなる目的は、急性、慢性又は再発性の歯周疾患の治療又は予防の方法、及び／又は当該方法で用いる化合物若しくは医薬組成物化合物を提供することである。
【0015】
上記の目的による治療方法では、投与経路は局所投与又は全身投与であることが好ましく、方法は非外科的方法であることが好ましい。
【0016】
上記課題の解決策として、本開示は、以下の式Ｉ又はＩＩ：
【0017】
【化1】
（式中、Ｌ、Ａ及びＲ１は添付の特許請求の範囲で定義されたものである。）
の一つで表される化合物、その個々の鏡像異性体、その個々のジアステレオ異性体、その水和物、その溶媒和物、その結晶形態、その個々の互変異性体又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0018】
本開示は、さらに、上記で特定された化合物及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【0019】
本開示は、さらに、ヒト又は動物の身体の治療方法、細菌感染の治療及び／又は予防方法で用いる、及び急性、慢性又は再発性歯周疾患の治療及び／又は予防方法において用いる、上記で特定された化合物及び／又は上記で特定された医薬組成物を提供する。
【0020】
本開示はさらに、ＰｇＱＣ及びＴｆＱＣから選択される細菌性グルタミニルシクラーゼ（ｂａｃＱＣ）を含む結晶、並びに候補化合物、好ましくは当該ｂａｃＱＣ阻害剤をさらに含む共結晶、並びに前記結晶及び／又は共結晶を調製する方法を提供する。
【0021】
本開示はさらに、ｂａｃＱＣ、好ましくはｂａｃＱＣ阻害剤の結合ポケットに結合し得る候補化合物を同定する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】（Ａ）はヒトＱＣ（ｈＱＣ、配列番号４）及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ＰｇＱＣ、配列番号１）由来の推定細菌性グルタミニルシクラーゼ（ＱＣ、すなわちグルタミンシクロトランスフェラーゼ）のアミノ酸配列アラインメントを示し；（Ｂ）はＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（ＰｉＱＣ、配列番号３）、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ＰｇＱＣ、配列番号１）及びＴａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａ（ＴｆＱＣ、配列番号２）由来のさらなる推定ＱＣのアミノ酸配列アラインメントを示し；（Ｃ）Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ＰｇＱＣ）由来のグルタミニルシクラーゼ（すなわちグルタミンシクロトランスフェラーゼ）の全長配列（配列番号１）１－３３３３のアミノ酸のアミノ酸ナンバリングを示し；並びに（Ｄ）Ｔ．ｆｏｒｓｙｔｈｉａ（ＴｆＱＣ）由来のグルタミニルシクラーゼ（すなわちグルタミンシクロトランスフェラーゼ）の全長配列（配列番号２）のアミノ酸１－３３３のアミノ酸ナンバリングを示す。
【図2】大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳで発現された精製組換え細菌推定ＱＣのＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。
【図3】Ｈ－Ｇｌｎ－ＡＭＣのＰｇＱＣ（Ａ）、ＰｉＱＣ（Ｂ）及びＴｆＱＣ（Ｃ）触媒環化のLineweaver-Burkプロットを示す。
【図4】参照化合物ＭＷＴ－Ｓ－００４３１の存在下でのＨ－Ｇｌｎ－ＡＭＣのＰｇＱＣ触媒環化の例示的なｖ／Ｓ特性、Lineweaver-Burk及びEadie-Hofsteeプロットを示す。
【図5】ｓｅｑＰｇＱＣ－｀ＰｈｏＡ融合タンパク質を発現する透過処理された大腸菌ＣＣ１１８ ｐＧＰ１－２細胞におけるＰｈｏＡ活性を示す。
【図6】３つのグルタミニルシクラーゼ：ＰｇＱＣ（Ａ）、ＴｆＱＣ（Ｂ）、ｈＱＣ（Ｃ）、及びオーバーレイ（Ｄ）のリボン描写を示す。
【図7】結晶中の３つのグルタミニルシクラーゼ、ＰｇＱＣ（Ａ）、ＴｆＱＣ（Ｂ）、及びｈＱＣ（ＰＤＢコード３ＳＩ０）（Ｃ）の分子表面を示す。表面は親油性（緑色：親油性が高い、紫色：親水性が高い）により着色され、中心の穴は活性部位を示す。
【図8】結晶中のＰｇＱＣ（Ａ）、ＴｆＱＣ（Ｂ）、及びｈＱＣ（Ｃ）の分子表面を示し、親水性領域は濃い灰色で強調される（上図）。
【図9】ＰｇＱＣ（Ａ）、ＴｆＱＣ（Ｂ）、及びｈＱＣ（Ｃ）の分子表面を示し、親油性領域は、濃い灰色（下の図）で強調される。
【図10】ＰｇＱＣとｈＱＣの活性部位と分子表面の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【0023】
〔治療標的タンパク質（ｂａｃＱＣ）〕
Ｓｏｃｒａｎｓｋｙら（Journal of Clinical Periontology, 1998, 25 134-144）は、歯肉下プラークにおける、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａの密接に関連したグループからなる、いわゆる「レッドコンプレックス」の発生は、歯周疾患の臨床的尺度、特に、歯周ポケットの深さ及びプロービング時の出血と強く関連すると報告した。
Ｓｏｃｒａｎｓｋｙら（Journal of Clinical Periontology, 1998, 25 134-144）は、歯肉下プラークにおける、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａの密接に関連したグループからなる、いわゆる「レッドコンプレックス」の発生は、歯周疾患の臨床的尺度、特に、歯周ポケットの深さ及びプロービング時の出血と強く関連すると報告した。
【0024】
さらに、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ／ｐｅｒｉｄｏｎｔｉｃｕｍ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｃｒｏｓのメンバーが「オレンジ複合体」のメンバーによる健康な歯周組織へのコロニー形成が歯肉炎の発生と相関することが見いだされた。「オレンジ複合体」の細菌は、さらに「赤色複合体」の細菌によるコロニー形成を促進し、さらに「赤色複合体」の細菌によるコロニー形成を促進し、当該細菌は、ディープポケット及び慢性歯周炎と関連する。
【0025】
「赤色複合体」と「オレンジ色複合体」の細菌は、様々な毒素因子を分泌する。例えば、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓはジンジパイン等のシステインプロテアーゼを分泌し、Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａは唾液ＩｇＡプロテアーゼを分泌し、Ｔ．ｆｏｒｓｙｔｈｉａはグリコシダーゼを分泌することが見出された。
【0026】
本発明者らは驚くべきことに、経口病原体であるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔ．ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、及びＰ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａの分泌物中にシグナルペプチドを有する分泌タンパク質の約８０％が、シグナルペプチダーゼによりＸａａ－Ｇｌｎペプチド結合で切断されることを見出した。遊離したタンパク質のＮ末端にはｐＧｌｕ残基がある。これは、外膜を横切る成長タンパク質のトランスロケーション及び歯周病原体の成長に必須と思われるグルタミニルシクラーゼの存在を意味する。
【0027】
グルタミニルシクラーゼ（ＱＣ）（ＥＣ２．３．２．５）は、グルタミンシクロトランスフェラーゼともいい、ＮＨ３の放出下でタンパク質のＮ末端グルタミニル残基をピログルタミン酸（ｐＧｌｕ）に環化させ、ペプチドのＮ末端を修飾するアシルトランスフェラーゼである。
【0028】
【化2】
これまでに、２種類のＱＣ（Ｉ型及びＩＩ型）が定義されている。Ｉ型ＱＣは、植物、いくつかの病原性細菌及びヒト寄生虫（Huang et al., J. Mol. Biol. 2010, 401, 374-388）で認められた。パパイヤＱＣ（ｐａｐａｙａ ＱＣ）は最もよく知られているＩ型ＱＣである。この酵素は熱帯植物Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａのラテックスで最初に発見された（Messer, M. Nature 1963, 197, 1299）。この酵素は広いｐＨ範囲（ｐＨ３．５～１１）で触媒活性を示す。Ｘ線結晶解析の結果、ｐＱＣは、中心チャンネル（Wintjens, R., Belrhali, H., Clantin, B., Azarkan, M., Bompard, C., Baeyens-Volant, D., Looze, Y., and Villeret, V. J. Mol. Biol. 2006, 357, 457-470）を横断する５枚羽根のβプロペラからなるハットボックス型分子であることが明らかになった。pQCは亜鉛イオンを含むが、複素環キレート剤によって全く阻害されず（Zerhouni et al,. Biochim. Biophys. Acta 1998, 1387, 275-290）、ｐＱＣは、タンパク質分解、化学的、熱変性に対する耐性が高いと考えられる（Wintjensら、Zerhouniら）。
【0029】
ＩＩ型ＱＣは、主に哺乳類の神経内分泌組織で同定された。ＩＩ型ＱＣの中で、ヒトＱＣ（ｈＱＣ）は最も広範に研究されており、分泌経路における多数の神経ペプチド及びサイトカインの成熟に重要であることが知られている。Ｉ型ＱＣとは対照的に、ｈＱＣは化学的及び熱的変性をきわめて受けやすい。Schillingら（J. Biol. Chem. 2003, 278, 4973-49779）は、ｈＱＣがｐＨ８．５以上ｐＨ６．０以下で有意に不安定であることを示した。ｈＱＣはα／βトポロジーを採用しており（Huang et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 2005, 102, 13117-13122）、複素環キレート剤による時間依存的な阻害が示唆するように金属酵素として同定された。不活化酵素は、等モル濃度のＥＤＴＡの存在下でＺｎ２＋を添加すると完全に回復させることができる（Schillingら2003）。したがって、ＩＩ型ＱＣは金属依存性トランスフェラーゼであり、亜鉛が構造的及び安定化機能のみを担うＩ型ＱＣとは対照的に、活性部位結合金属（Ｚｎ２＋）が触媒活性に不可欠であることを示唆する。
【0030】
要するに、Ｉ型ＱＣは一般に植物、数種の細菌及び原生動物に見られ、βプロペラ構造を示し、タンパク質分解、熱及び酸に対する耐性が高く、最適な触媒活性はｐＨ３．５～１１であり、構造的Ｃａ２＋／Ｚｎ２＋イオンを有する。
【0031】
対照的に、ＩＩ型ＱＣは主に脊椎動物に見られ、α／βトポロジーを示し、タンパク質分解、熱、酸に対する耐性が低く、最適な触媒活性はｐＨ６．０～８．０であり、触媒に必須なＺｎ２＋イオンが存在する。したがって、ＩＩ型グルタミニルシクラーゼは亜鉛依存性アシルトランスフェラーゼである。
【0032】
本発明者らは驚くべきことに、ＩＩ型ＱＣが経口病原菌のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔ．ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、及びＰ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａにおいて発現することを見出した。
【0033】
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ＰｇＱＣ、配列番号１）由来のＱＣタンパク質の一次構造は、ヒトＱＣ（ｈＱＣ、配列番号４）と相同性が２５％である。さらに、Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（ＰｉＱＣ、配列番号３）及びＴ．ｆｏｒｓｙｔｈｉａ（ＴｆＱＣ、配列番号２）由来のＱＣが同定され、ＰｇＱＣとの相同性は各々４２％及び４９％であった。さらなる実験的証拠から、当該酵素が、特に、ｂａｃＱＣ活性のｐＨ及びイオン強度依存性、金属キレート剤によるＱＣ活性の阻害、ＣＤ分光分析により示されるα／βトポロジーを示唆する３つのタンパク質すべての折りたたみパターン、及びそれらの熱安定性により確認されるように、実際にＩＩ型ＱＣファミリーに属することが示される。
【0034】
本発明者らは、細菌性ＩＩ型ＱＣが、「赤色複合体」の歯周炎を発症させる細菌種の３種類のうち２種類、及び「オレンジ色複合体」の少なくとも１種類の細菌種の成長に必須であり、従って、歯周炎の疾患及び状態の治療の抗生物質特性を備える治療阻害剤の開発の標的として極めて重要であることを見出した。
【0035】
したがって、本発明の文脈において、治療標的タンパク質は細菌性グルタミニルシクラーゼ（ｂａｃＱＣ）であり、ここでｂａｃＱＣは配列番号１（ＰｇＱＣともいう）、配列番号２（ＴｆＱＣともいう）、配列番号３（ＰｉＱＣともいう）、並びに配列番号１、配列番号２及び配列番号３のいずれか１つと配列相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドとして定義される。
【0036】
ｂａｃＱＣは、本明細書の実施例にさらに記載されるように、同定、単離及び精製されることができ、歯周炎誘導病原体の選択的標的化を可能とする阻害剤の同定に用いられうる。２つ以上のアミノ酸配列を比較する目的で、２つのアミノ酸配列間の同一性の程度（「配列相同性」の比率）は、例えば、ＢＬＡＳＴ（Altschul S.F.ら、J Mol Biol.1990,215(3),403-10）等の、技術水準で公知の標準配列アラインメントアルゴリズムにより、従来の方法により決定することができる。
【0037】
〔化合物〕
本明細書に開示される候補化合物及び／又は阻害剤を同定する方法を用いることにより、本発明者らは、細菌性グルタミニルシクラーゼの強力で治療的に有効な阻害剤の設計及び調製のためのリード構造モチーフとして新規な基を同定した。前記構造モチーフは、以下に示すイミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン基（環原子の番号を含む）である：
本明細書に開示される候補化合物及び／又は阻害剤を同定する方法を用いることにより、本発明者らは、細菌性グルタミニルシクラーゼの強力で治療的に有効な阻害剤の設計及び調製のためのリード構造モチーフとして新規な基を同定した。前記構造モチーフは、以下に示すイミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン基（環原子の番号を含む）である：
【0038】
【化3】
当該構造モチーフは、ｂａｃＱＣｓの結合ポケットに位置するＺｎ２＋イオンに可逆的に結合することができる適当な金属結合基を表す。好ましくは、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン基がピリジン環の６位で置換されている場合、ｂａｃＱＣ阻害活性及び選択性は特に高くなる。
【0039】
より好ましくは、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン基に結合した基は、ベンジルアミン又は芳香族スルホンアミドのいずれかであり、各々がＮ原子を介してピリジン環に結合する。対照的に、その代わりに芳香族アミドを用いると活性が弱まることが見出されたため、これらはあまり好ましくない。換言すれば、Ｒａ及びＲｂは、好ましくは、共に＝Ｏでない。
【0040】
さらなる好ましい態様では、化合物は、以下の構造Ｅ
【0041】
【化4】
で表される部分を含む。
【0042】
この部分の存在は、金属非依存系（例えば、ヘム及びヘモグロビンの両方の受容体であるＨＡ２ドメイン）及び／又は金属依存系（例えば、上記基を認識することができるヘモフォア様ポルフィリン結合タンパク質であるＨｕｓＡ）により上記ポルフィリン部分を認識し、能動的に取り込み及び捕捉するＩＩ型グルタミニルシクラーゼ（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔ．ｆｏｒｓｙｔｈｉａ及びＰ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ等）を発現する細菌内の細胞内に、本発明による阻害化合物の取り込みを増強する。すなわち、一般式Ｉ又はＩＩの阻害剤を構造Ｅで表される部分と共役させると、病原体細胞への指向性送達が強化され、標的経口病原体に対する選択性が改善され、及び／又は当該病原体に対するインビボ抗生物質活性が改善されるが、当該効果は、構造Ｅで表される部分が、添付の特許請求の範囲において特定されるように、構造Ｅで表されるリンカーを介して阻害剤のＡ群に結合される場合に特に顕著である。
【0043】
具体的には、本開示は、以下の態様＜１＞～＜１９＞のいずれか１つの化合物を提供する。
＜１＞以下の式Ｉ又はＩＩ：
＜１＞以下の式Ｉ又はＩＩ：
【0044】
【化5】
（式中、Ａは、場合によっては置換アリール、場合によっては置換ヘテロシクリル、場合によっては置換シクロアルキル及び場合によっては置換アルケニルからなる群より選択され；
Ｒ１は独立して、Ｈ及び場合によっては置換アルキルからなる群より選択され；
Ｌは、
【0045】
【化6】
から選択され、
Ｒａ及びＲｂは、互いに同じか又は異なり、独立して、Ｈ、ハロ、場合によっては置換アルキル、場合によっては置換アリール、場合によっては置換ヘテロアルキル、及び場合によっては置換ヘテロアリールからなる群から選択され、ここで、Ｒａ及びＲｂは、場合によっては互いに連結されて炭素環又は複素環を形成することができる）
で表される化合物のうちのいずれか１つ、その個々の鏡像異性体、その個々のジアステレオ異性体、その水和物、その溶媒和物、その結晶形、その個々の互変異性体又はその薬学的に許容される塩。
【0046】
＜２＞以下の：
前記アリールは独立してＣ６～１０、好ましくはＣ６アリール基であり；
前記ヘテロシクリルは、独立して単環式又は二環式のＣ１～１１、好ましくはＣ２～８、より好ましくはＮ、Ｓ及びＯから選択される１～４個の環式ヘテロ原子を含むＣ４～５複素環式基であり；
前記アルキルは、独立して、直鎖又は分枝鎖、開鎖又は環状のＣ１～６、好ましくはＣ１～４、より好ましくはＣ１～３、さらに好ましくはＣ１～２アルキル基であり；
前記シクロアルキルは独立に環状Ｃ３～６、好ましくはＣ４～６、より好ましくはＣ５～６アルキル基であり；
前記アルケニルは、独立して、少なくとも１つのＣ＝Ｃ結合を含む直鎖又は分枝鎖、開鎖又は環状のＣ２～６、好ましくはＣ２～４、より好ましくはＣ２基であり；
前記ヘテロアリールは、独立して、芳香族単環式又は二環式のＣ１～１１、好ましくはＣ２～８、より好ましくはＣ４～５複素環式基であり、Ｎ、Ｓ及びＯから選択される１～４個の環式ヘテロ原子を含み；
前記ヘテロアルキルは、独立して、Ｎ、Ｓ及びＯから選択される１～４個のヘテロ原子を含む直鎖又は分枝鎖、開鎖又は環状のＣ１～５、好ましくはＣ１～３、より好ましくはＣ１～２ヘテロアルキル基である；＜１＞の化合物。
前記アリールは独立してＣ６～１０、好ましくはＣ６アリール基であり；
前記ヘテロシクリルは、独立して単環式又は二環式のＣ１～１１、好ましくはＣ２～８、より好ましくはＮ、Ｓ及びＯから選択される１～４個の環式ヘテロ原子を含むＣ４～５複素環式基であり；
前記アルキルは、独立して、直鎖又は分枝鎖、開鎖又は環状のＣ１～６、好ましくはＣ１～４、より好ましくはＣ１～３、さらに好ましくはＣ１～２アルキル基であり；
前記シクロアルキルは独立に環状Ｃ３～６、好ましくはＣ４～６、より好ましくはＣ５～６アルキル基であり；
前記アルケニルは、独立して、少なくとも１つのＣ＝Ｃ結合を含む直鎖又は分枝鎖、開鎖又は環状のＣ２～６、好ましくはＣ２～４、より好ましくはＣ２基であり；
前記ヘテロアリールは、独立して、芳香族単環式又は二環式のＣ１～１１、好ましくはＣ２～８、より好ましくはＣ４～５複素環式基であり、Ｎ、Ｓ及びＯから選択される１～４個の環式ヘテロ原子を含み；
前記ヘテロアルキルは、独立して、Ｎ、Ｓ及びＯから選択される１～４個のヘテロ原子を含む直鎖又は分枝鎖、開鎖又は環状のＣ１～５、好ましくはＣ１～３、より好ましくはＣ１～２ヘテロアルキル基である；＜１＞の化合物。
【0047】
＜３＞以下の式Ｉａ、ＩＩａ、Ｉｂ及びＩＩｂ：
【0048】
【化7】
（式中、Ａが、場合によっては置換アリール及び場合によっては置換ヘテロアリールから選択され；並びに、
Ｒ１、Ｒａ、ＲｂはＨである）
、好ましくはＩａのいずれかで表される、＜１＞～＜２＞のいずれか１つに記載の化合物。
【0049】
＜４＞Ｒａ及びＲｂは独立して、１Ｈ及びＤから選択される、＜１＞～＜３＞のいずれか１つに記載の化合物。
【0050】
＜５＞Ｒａ及びＲｂの一方が１Ｈであり、他方がＤである、又は各々１Ｈである、＜１＞から＜４＞のいずれか１つに記載の化合物。
＜６＞Ａは、以下の化学式Ａ－１～Ａ－７：
＜６＞Ａは、以下の化学式Ａ－１～Ａ－７：
【0051】
【化8】
（式中、Ｙは、Ｏ及びＳから選択され；
Ｒ２～Ｒ６は各々独立して、Ｈ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、（アミノアルキル）オキシ、（ヘテロアリール）オキシ、アミノ、（ジアルキル）アミノ、（モノアルキル）アミノ、（アルキル）（ヘテロアルキル）アミノ、（ジヘテロアルキル）アミノ、［（アルキル）オキシ］カルボニル及びハロアルキルからなる群から選択され、これらの各々は場合によってはさらに置換されてよい）
のいずれかで表される、＜１＞～＜５＞のいずれかの１つに記載の化合物。
【0052】
＜７＞以下の：
（ａ） Ｒ４、又は
（ｂ） Ｒ３、又は
（ｃ） Ｒ３及びＲ４
は各々独立して、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、（アミノアルキル）オキシ、（ヘテロアリール）オキシ、アミノ、（ジアルキル）アミノ、（モノアルキル）アミノ、（アルキル）（ヘテロアルキル）アミノ、（ジヘテロアルキル）アミノ、［（アルキル）オキシ］カルボニル及びハロアルキルからなる群から選択され、各々は、場合によってはさらに置換されてよく；
Ｒ２～Ｒ６の残りの１つはＨである、＜６＞に記載の化合物。
（ａ） Ｒ４、又は
（ｂ） Ｒ３、又は
（ｃ） Ｒ３及びＲ４
は各々独立して、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、（アミノアルキル）オキシ、（ヘテロアリール）オキシ、アミノ、（ジアルキル）アミノ、（モノアルキル）アミノ、（アルキル）（ヘテロアルキル）アミノ、（ジヘテロアルキル）アミノ、［（アルキル）オキシ］カルボニル及びハロアルキルからなる群から選択され、各々は、場合によってはさらに置換されてよく；
Ｒ２～Ｒ６の残りの１つはＨである、＜６＞に記載の化合物。
【0053】
＜８＞Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の少なくとも１つは独立して、以下の構造Ｂ：
【0054】
【化9】
（式中、ｎ＝１、２、３、４、５又は６であり；
Ｒ７及びＲ８は独立して、アルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、カルバミドイル、ホルミル、アルキルアシル及びアリールアシルから選択され、各々は、場合によってはさらに置換されてよく、かつ、ここで、Ｒ７及びＲ８は、場合によっては連結されて、炭素環又は複素環を形成することができる）
＜６＞～＜７＞のいずれか１つに記載の化合物。
【0055】
＜９＞Ｒ１、Ｒａ、ＲｂはＨであり；かつ、
Ａは化学式Ａ－１で表される、＜６＞～＜８＞のいずれか１つに記載の化合物。
Ａは化学式Ａ－１で表される、＜６＞～＜８＞のいずれか１つに記載の化合物。
【0056】
＜１０＞以下の構造Ｂ：
【0057】
【化10】
（式中、ｎ＝１、２、３、４、５又は６であり；かつ、
Ｒ７及びＲ８は独立して、アルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、カルバミドイル、ホルミル、アルキルアシル及びアリールアシルから選択され、これらは各々、場合によってはさらに置換されてよく、かつ、ここで、Ｒ７及びＲ８は、場合によっては連結されて、炭素環又は複素環を形成することができる）
により表される少なくとも１つの置換基により置換されている、＜１＞～＜７＞のいずれか１つに記載の化合物。
【0058】
＜１１＞Ｒ７が以下の構造Ｅ：
【0059】
【化11】
（式中、ＭはＦｅ２＋及びＦｅ３＋から選択されるか、又は存在しない；
Ｒｃ及びＲｄは独立して、－Ｈ、－ＣＨ３、－ＣＨ＝ＣＨ２、－ＳＯ３Ｈ及びＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨから選択され；かつ、
Ｘは、共有結合、アルキレン、アラルキレン、ヘテロアルキレン、カルボシクレン（carbocyclene）、ヘテロシクレン、ヘテロアリーレン、ヘテロアラルキレン、アミノアルキレン、アルキルアミノ及びカルボニルアルキルアミノ基から選択され、；ここで、これらは各々、主鎖に炭素原子が１２個まで及びヘテロ原子が１１個まであってよく、及び１又はそれ以上のＣ１～６アルキル基、Ｃ１～６ヘテロアルキル基、Ｃ１～６カルボシクリル基、Ｃ１～５ヘテロシクリル基、Ｃ１～５ヘテロアリール基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、シアノ基、第一級、第二級又は第三級のアミノ基、カルボキシル基及び側鎖で置換されてよい）
で表される、＜８＞～＜１０＞のいずれか１つに記載の化合物。
【0060】
＜１２＞Ｘは、以下の構造：
【0061】
【化12】
（式中、ｍ＝０，１，２又は３、であり、
Ｒｅはプロテイン原性アミノ酸由来の側鎖である）
で表される、＜１１＞に記載の化合物。
【0062】
＜１３＞Ａは、以下の構造Ｆ：
【0063】
【化13】
（式中、ＭはＦｅ２＋及びＦｅ３＋から選択されるか、又は存在しない；かつ、
Ｒｃ及びＲｄは独立して、－Ｈ、－ＣＨ３、－ＣＨ＝ＣＨ２、－ＳＯ３Ｈ及びＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨから選択される）
により表される置換基により置換される、＜１＞～＜１２＞のいずれか１つに記載の化合物。
【0064】
＜１４＞Ａが、＜６＞により定義され、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の少なくとも１つが、前記構造Ｆで表される、＜１３＞に記載の化合物。
【0065】
＜１５＞Ａが以下の構造Ｅ１：
【0066】
【化14】
（式中、ＭはＦｅ２＋及びＦｅ３＋から選択されるか、又は存在しない；
Ｒｃ及びＲｄは独立して、－Ｈ、－ＣＨ３、－ＣＨ＝ＣＨ２、－ＳＯ３Ｈ及びＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨから選択され；かつ、
Ｘは、共有結合、アルキレン、アラルキレン、ヘテロアルキレン、カルボシクレン（carbocyclene）、ヘテロシクレン、ヘテロアリーレン、ヘテロアラルキレン、アミノアルキレン、アルキルアミノ及びカルボニルアルキルアミノ基から選択され、；ここで、これらは各々、主鎖に炭素原子が１２個まで及びヘテロ原子が１１個まであってよく、及び１又はそれ以上のＣ１～６アルキル基、Ｃ１～６ヘテロアルキル基、Ｃ１～６カルボシクリル基、Ｃ１～５ヘテロシクリル基、Ｃ１～５ヘテロアリール基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、シアノ基、第一級、第二級又は第三級のアミノ基、カルボキシル基及び側鎖で置換されてよい）
により表される少なくとも１つの置換基で置換される、＜１＞～＜１４＞のいずれか１つに記載の化合物。
【0067】
＜１６＞Ａが、アルコキシアリール、（アルコキシ）（ハロ）アリール、（アルコキシ）ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、アミノアリール、アミノヘテロアリール、アリールアリール、アリールヘテロアリール、（アリールオキシ）アリール、（アリールオキシ）ヘテロアリール、ハロアリール、ハロヘテロアリール、（ヘテロアルキル）アリール、（ハロアルキル）アリール、（ヘテロアリール）アリール、［（ヘテロアリール）オキシ］アリール、［（アミノアルキル）オキシ］アリール、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル及びヘテロシクロアルキルからなる群から選択され、各々場合によってはさらに置換されてよい）
＜１＞～＜１５＞のいずれか１つに記載の化合物。
＜１＞～＜１５＞のいずれか１つに記載の化合物。
【0068】
＜１７＞Ａは、２－アルコキシフェニル、３－アルコキシフェニル、４－アルコキシフェニル、２，３－ジアルコキシフェニル、２，４－ジアルコキシフェニル、２，５－ジアルコキシフェニル、２，６－ジアルコキシフェニル、３，４－ジアルコキシフェニル、３，５－ジアルコキシフェニル、３，４，５－トリアルコキシフェニル、２，６－ジハロ－４－アルコキシフェニル、２－ハロ－４－アルコキシフェニル、３－ハロ－５－アルコキシフェニル、４－ハロ－３－アルコキシフェニル、２－アルキルフェニル、３－アルキルフェニル、４－アルキルフェニル、３－［（アルキル）（ヘテロアルキル）アミノ］フェニル、３－［（ジアルキル）アミノ］フェニル、３－［（ジヘテロアルキル）アミノ］フェニル、３－［（モノアルキル）アミノ］フェニル、４－［（アルキル）（ヘテロアルキル）アミノ］フェニル、４－［（ジアルキル）アミノ］フェニル、４－［（ジヘテロアルキル）アミノ］フェニル、４－［（ヘテロアリール）オキシ］フェニル、４－［（モノアルキル）アミノ］フェニル、アリールフェニル、２－（アリールオキシ）フェニル、３－（アリールオキシ）フェニル、４－（アリールオキシ）フェニル、２－ハロフェニル、３－ハロフェニル、４－ハロフェニル、２，３－ジハロフェニル、２，４－ジハロフェニル、２，５－ジハロフェニル、２，６－ジハロフェニル、３，４－ジハロフェニル、３，５－ジハロフェニル、２，３，４－トリハロフェニル、２，３，５－トリハロフェニル、３，４，５－トリハロフェニル、２，４，５－トリハロフェニル、２，４，６－トリハロフェニル、３－（ハロアルキル）フェニル、４－（ハロアルキル）フェニル、３－（Ｃ５モノヘテロアリール）フェニル、４－（Ｃ５モノヘテロアリール）フェニル、４－（Ｃ５モノヘテロアリール）フェニル、３－（Ｃ４モノヘテロアリール）フェニル、４－（Ｃ４モノヘテロアリール）フェニル、３－［（ヘテロアリール）オキシ］フェニル、４－｛［アミノ（アルキル）］オキシ｝フェニル、３－｛［アミノ（アルキル）］オキシ｝フェニル、ナフチル、フェニル、Ｃ５モノヘテロアリール、Ｃ４モノヘテロアリール、モルホリニル及びピペリジニルであり、各々は場合によってはさらに置換されてよい、＜１＞～＜１６＞のいずれか１つに記載の化合物。
【0069】
＜１８＞Ａは、２－メトキシフェニル、３－メトキシフェニル、４－プロポキシフェニル、４－メトキシフェニル、４－イソプロポキシフェニル、４－ベンジルオキシフェニル、３，４－ジメトキシフェニル、２，３－ジヒドロ－１，４－ベンゾジオキシン－６－イル、２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル、７－メトキシ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル、２，６－ジフルオロ－４－メトキシ－フェニル、３－（１－ピペリジル）フェニル、４－モルフォリノフェニル、［１，１’－ビフェニル］－３－イル、［１，１’－ビフェニル］－４－イル、３－フェノキシフェニル、４－フェノキシフェニル、２－クロロフェニル、３－クロロフェニル、４－クロロフェニル、３，４－ジクロロフェニル、３，４，５－トリフルオロフェニル、４－（２－ピリジル）フェニル、４－（２－カルバミドエチロキシ）フェニル、４－（２－アミノエトキシ）フェニル、４－（２－モルフォリノエトキシ）フェニル、フェニル、２－ピリジル、４－ピリジル、２－チエニル及び３―チエニルからなる群より選択される、＜１＞～＜１７＞のいずれか１つに記載の化合物。
【0070】
＜１９＞以下の化合物：
【0071】
【化15】
【0072】
【化16】
からなる群より選択される化合物。
【0073】
本明細書で用いられる用語「アルキル」は、特に限定されない限り、Ｃ１～１２アルキル基、適当にはＣ１～８アルキル基、例えばＣ１～６アルキル基、例えばＣ１～４アルキル基を示す。アルキル基は、直鎖又は分枝鎖であってよい。適当なアルキル基としては、例えばメチル、エチル、プロピル（例えばｎ－プロピル及びイソプロピル）、ブチル（例えばｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル及びｔｅｒｔ－ブチル）、ペンチル（例えばｎ－ペンチル）、ヘキシル（例えばｎ－ヘキシル）、ヘプチル（例えば、ｎ－ヘプチル）及びオクチル（例えば、ｎ－オクチル）が挙げられる。用語「アルキル」はまた、シクロアルキル基も含む。用語「シクロアルキル」は、特に限定されない限り、Ｃ３～１０シクロアルキル基（すなわち、３～１０環炭素原子）、より適当には、Ｃ３～８シクロアルキル基、例えばＣ３～６シクロアルキル基をいう。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル及びシクロオクチルが挙げられる。最も適当な数の環炭素原子は３～６個である。
【0074】
用語「ヘテロアルキル」は、特に限定されない限り、１又はそれ以上、好ましくは１、２又は３個の炭素原子が、Ｎ、Ｓ及びＯから選択されるヘテロ原子で置換されるアルキル基をいう。
【0075】
用語「カルボシクリル（carbocyclyl）」及び「炭素環式」は、特に限定されない限り、すべての環原子が炭素であるか、及び、３～１２個の環炭素原子、適当には３～１０個の炭素原子、より適当には３～８個の炭素原子を含む環系をいう。カルボシクリル基は、飽和又は部分的に不飽和であってよいが、芳香環を含まない。カルボシクリル基の例としては、単環式、二環式及び三環式環系、特に単環式及び二環式環系が挙げられる。他のカルボシクリル基としては、架橋環系（例えば、ビシクロ［２．２．１］ヘプテニル）が挙げられる。カルボシクリル基の特定の例はシクロアルキル基である。カルボシクリル基のさらなる例はシクロアルケニル基である。
【0076】
用語「アリール」は、特に限定されない限り、Ｃ６～１２アリール基、適当にはＣ６～１０アリール基、より適当にはＣ６～８アリール基を示す。アリール基は、少なくとも１つの芳香環（例えば、１、２又は３つの環）を含む。芳香環が１つある典型的なアリール基の例はフェニルである。芳香環が２つある典型的なアリール基の例はナフチルである。
【0077】
用語「ヘテロシクリル」及び「ヘテロシクリル」は、特に限定されない限り、１又はそれ以上の（例えば、１、２又は３）環原子がＮ、Ｓ及びＯから選択されるヘテロ原子で置換されるカルボシクリル基をいう。ヘテロシクリル基の具体例は、シクロアルキル基（例えば、シクロペンチル、又はより具体的にはシクロヘキシル）であり、１又はそれ以上の（例えば、１、２又は３、特に１又は２）環原子がＮ、Ｓ又はＯから選択されるヘテロ原子で置換される。ヘテロ原子を１つ含む例示的なヘテロシクリル基としては、ピロリジン、テトラヒドロフラン及びピペリジンがあげられ、ヘテロ原子を２つ含む例示的なヘテロシクリル基としては、モルホリン及びピペラジンがあげられる。ヘテロシクリル基のさらなる具体例は、１又はそれ以上（例えば、１、２又は３、特に１又は２、特に１）の環原子が、Ｎ、Ｓ及びＯから選択されるヘテロ原子で置換されるシクロアルケニル基（例えば、シクロヘキセニル基）である。そのような基の例は、ジヒドロピラニル（例えば、３，４-ジヒドロ-２Ｈ-ピラン-２-イル）-である。
【0078】
用語「ヘテロアリール」は、特に限定されない限り、アリール残基を示し、ここで、１又はそれ以上の（例えば、１、２、３又は４、適当には１、２又は３）環原子は、Ｎ、Ｓ及びＯから選択されるヘテロ原子、又は他の場合には、Ｎ、Ｓ及びＯヘテロアリール基から選択される１又はそれ以上（例えば、１、２、３又は４、適当には１、２又は３）環原子を含む５員芳香族環により置換される。ヘテロ原子が１つある単環式ヘテロアリール基の例としては、５員環（例えば、ピロール、フラン、チオフェン）；及び６員環（例えば、ピリジン、例えば、ピリジン－２－イル、ピリジン－３－イル及びピリジン－４－イル）が挙げられる。ヘテロ原子が２つある単環式ヘテロアリール基の例としては、５員環（例えば、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、イミダゾール、イミダゾール－１－イル、イミダゾール－２－イルイミダゾール－４－イル等のイミダゾール）；６員環（例えば、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン）が挙げられる。ヘテロ原子が３つある単環式ヘテロアリール基の例としては、１，２，３－トリアゾール及び１，２，４－トリアゾールが挙げられる。ヘテロ原子がつ４ある単環式ヘテロアリール基の例としては、テトラゾールが挙げられる。例示的な二環式ヘテロアリール基としては、インドール（例えば、インドール－６－イル）、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、キノリン、イソキノリン、イミダゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール、キナゾリン及びプリンが挙げられる。
【0079】
用語「アルコキシアリール」、「カルボキシアリール」、「シアノアリール」、「ハロアリール」、「ヒドロキシアリール」及び「ヘテロアリール」は各々、特に限定されない限り、少なくとも１つのアルコキシ、カルボキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ及びヘテロアリール基で置換されたアリール残基をいう。
【0080】
用語「アルコキシヘテロアリール」、「カルボキシヘテロアリール」、「シアノヘテロアリール」、「ハロヘテロアリール」及び「ヒドロキシヘテロアリール」は各々、特に限定されない限り、少なくとも１つのアルコキシ基、カルボキシル基、シアノ基、ハロ基及びヒドロキシ基により置換されたヘテロアリール残基をいう。
【0081】
例えば「アルコキシ」、「ハロアルキル」に含まれる用語「アルコ（ａｌｋ）」、は「アルキル」の定義により解釈されるべきである。アルコキシ基の例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ（例えば、ｎ－プロポキシ）、ブトキシ（例えば、ｎ－ブトキシ）、ペントキシ（例えば、ｎ－ペントキシ）、ヘキソキシ（例えば、ｎ－ヘキソキシ）、ヘプトキシ（例えば、ｎ－ヘプトキシ）及びオクトキシ（例えば、ｎ－オクトキシ）が挙げられる。例示的なハロアルキル基は、フルオロアルキル、例えばＣＦ３を包含し；例示的なハロアルコキシ基はフルオロアルキル、例えばＯＣＦ３を包含する。
【0082】
用語「ハロゲン」又は「ハロ」は、フッ素（Ｆ）、塩素（ＣＩ）、臭素（Ｂｒ）及びヨウ素（Ｉ）を含む。
【0083】
本明細書で用いられる用語「水素」又は「Ｈ」は、水素のすべての同位体、特にプロチウム（１Ｈ）及び重水素（２Ｈ、又はＤとして示される）を包含する。
【0084】
用語「場合によっては置換された」とは、Ｃ１～６アルキル、Ｃ１～６ヘテロアルキル、Ｃ１～６カルボシクリル、Ｃ１～５ヘテロシクリル及びＣ１～５ヘテロアリール基から独立して選択される１又は複数の基によるいかなる置換をいい、ここで、当該基は各々、１又は複数のハロゲン原子及び／又はヒドロキシル基；ハロゲン原子；シアノ基；第一級、第二級又は第三級アミノ基；ヒドロキシル基；及びカルボキシル基により置換されてよい。
【0085】
〔立体異性体〕
本発明には、請求される化合物の全ての可能な立体異性体が含まれる。
本発明には、請求される化合物の全ての可能な立体異性体が含まれる。
【0086】
本発明の化合物に少なくとも１つのキラル中心がある場合、それらはエナンチオマーとして存在し得る。化合物のキラル中心が２又はそれ以上である場合、それらはさらにジアステレオマーとして存在し得る。当該異性体及びその混合物はすべて、本発明の範囲内に包含されることが理解されるべきである。
【0087】
本発明の化合物の製造方法により立体異性体の混合物が生じる場合、当該異性体は分取クロマトグラフィー等の通常の技術により分離することができる。化合物は、ラセミ体で調製することができ、又は個々のエナンチオマーは、エナンチオ特異的合成又は分割のいずれかにより調製することができる。化合物は、例えば、（－）－ジ－ｐ－トルオイル－ｄ－酒石酸及び／又は（＋）－ジ－ｐ－トルオイル－１－酒石酸等の光学活性な酸との塩形成によるジアステレオマー対の形成、続いて分別結晶化及び遊離塩基の再生、又はキニーネ、キニジン、キノトキシン、シンコトキシン、（Ｓ）－フェニルエチルアミン、（１Ｒ，２Ｓ）－エフェドリン、（Ｒ）－フェニルグリシノール、（Ｓ）－２－アミノブタノール等の光学活性な塩基との塩形成によるジアステレオマー対の形成、続いて分別結晶化及び遊離酸の再生等の標準技術により、当該成分エナンチオマーに分離することができる。化合物は、ジアステレオマーエステル又はアミドの形成後、クロマトグラフィーによる分離及びキラル補助剤の除去でも分離され得る。あるいは、化合物は、キラルＨＰＬＣカラムを用いて分割されうる。
【0088】
〔多形結晶、溶媒和物、水和物〕
さらに、化合物の個々の結晶形態のいくつかは、多形体として存在することができ、それ自体、本発明に含まれることが意図される。さらに、化合物のいくつかは、水（すなわち、水和物）又は一般的な有機溶媒と溶媒和物を形成することができ、当該溶媒和物もまた、本発明の範囲内に包含されることが意図される。化合物（それらの塩を含む）はまた、それらの水和物の形態で得られ得るか、又はそれらの結晶化に用いられる他の溶媒を含む。遊離化合物とその塩、水和物又は溶媒和物の形態の化合物との間の密接な関係を考慮し、化合物がこの文脈で言及されるときは常に、対応する塩、溶媒和物又は多形もまた、当該状況下で可能であるか適当であるならば、意図される。
さらに、化合物の個々の結晶形態のいくつかは、多形体として存在することができ、それ自体、本発明に含まれることが意図される。さらに、化合物のいくつかは、水（すなわち、水和物）又は一般的な有機溶媒と溶媒和物を形成することができ、当該溶媒和物もまた、本発明の範囲内に包含されることが意図される。化合物（それらの塩を含む）はまた、それらの水和物の形態で得られ得るか、又はそれらの結晶化に用いられる他の溶媒を含む。遊離化合物とその塩、水和物又は溶媒和物の形態の化合物との間の密接な関係を考慮し、化合物がこの文脈で言及されるときは常に、対応する塩、溶媒和物又は多形もまた、当該状況下で可能であるか適当であるならば、意図される。
【0089】
〔互変異性体〕
本明細書中で用いられる場合、用語「互変異性体」とは、隣接する単結合及び二重結合間のプロトンの移動をいう。互変異性化の過程は可逆的である。本明細書に記載された化合物は、化合物の物理的特性の範囲内にあるいかなる可能な互変異性化をも供されることができる。
本明細書中で用いられる場合、用語「互変異性体」とは、隣接する単結合及び二重結合間のプロトンの移動をいう。互変異性化の過程は可逆的である。本明細書に記載された化合物は、化合物の物理的特性の範囲内にあるいかなる可能な互変異性化をも供されることができる。
【0090】
〔薬学的に許容される塩〕
本明細書中で用いられる、用語「薬学的に許容される」とは、ヒト及び獣医学的適用をともに包含し、例えば、用語「薬学的に許容される」は、獣医学的に許容される化合物又はヒト医学及び医療において許容される化合物を包含する。
本明細書中で用いられる、用語「薬学的に許容される」とは、ヒト及び獣医学的適用をともに包含し、例えば、用語「薬学的に許容される」は、獣医学的に許容される化合物又はヒト医学及び医療において許容される化合物を包含する。
【0091】
式Ｉで表される、医薬的に用いるのに適する化合物の塩、水和物及び溶媒和物並びにその生理学的に機能的な誘導体は、対イオン（counter-ion）又は関連溶媒が医薬として許容される。しかしながら、薬学的に許容されない対イオン又は関連溶媒がある塩、水和物及び溶媒和物であっても、例えば、他の化合物及びそれらの薬学的に許容される塩、水和物及び溶媒和物の調製における中間体として用いるため、本発明の範囲内である。
【0092】
本発明による適当な塩には、有機及び無機酸又は塩基のいずれかと共に形成される塩が含まれる。薬学的に許容される酸付加塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、クエン酸、酒石酸、リン酸、乳酸、ピルビン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、トリフェニル酢酸、スルファミン酸、スルファニル酸、コハク酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、オキサロ酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、アリールスルホン酸（例えば、ｐ－トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸又はナフタレンジスルホン酸）、サリチル酸、グルタール酸、グルコン酸、トリカルバリル酸、ケイ皮酸、置換ケイ皮酸（例えば、４－メトキシケイ酸及び４－メトキシケイ酸を含むフェニル、メチル、メトキシ又はハロで置換された）、アスコルビン酸、オレイン酸、ナフトエ酸、ヒドロキシナフトエ酸（例えば、１－又は３－ヒドロキシ－２ナフトエ酸）、ナフタレンアクリル（例えば、ナフタレン－アクリル）、安息香酸、４－メトキシ安息香酸、２－又は４－ヒドロキシ安息香酸、４－クロロ安息香酸、４－フェニル安息香酸、ベンゼンアクリル酸（例えば、１，４－ベンゼンジアクリル）、イセチオン酸、過塩素酸、プロピオン酸、グリコール酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、パモ酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サリチル酸、サッカリン酸及びトリフルオロ酢酸から形成されるものがあげられる。薬学的に許容される塩基塩には、アンモニウム塩、ナトリウム及びカリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム及びマグネシウム等のアルカリ土類金属塩、並びにジシクロヘキシルアミン及びＮ－メチル－Ｄ－グルカミン等の有機塩基との塩があげられる。
【0093】
本発明の化合物の全ての薬学的に許容される酸付加塩形態は、本発明の範囲に包含されることが意図される。
【0094】
〔医薬組成物〕
本発明による医薬組成物は、上記の化合物及び薬学的に許容される賦形剤を含む。
本発明による医薬組成物は、上記の化合物及び薬学的に許容される賦形剤を含む。
【0095】
本明細書における用語「医薬組成物」は、クレームされた化合物を治療上有効な量で含む製品、並びにクレームされた化合物の組合せから直接的又は間接的に生じるいかなる製品を包含することを意図し、本明細書において用いられる用語「賦形剤」は、担体、結合剤、崩壊剤、及び／又は、例えば、懸濁液、エリキシル剤、及び溶液等の液状経口製剤用の、及び／又は、例えば、粉末、カプセル、ゲルキャップ、及び錠剤等の固形経口製剤用のためのさらなる適当な添加剤をいう。混合物に添加することができる担体には、適当な懸濁剤、潤滑剤、フレーバー剤、甘味剤、保存剤、コーティング剤、顆粒剤、染料及び着色剤を含むが、これらに限定されない、必要かつ不活性な医薬賦形剤が含まれる。
【0096】
〔治療適用〕
本開示は、化合物、例えば、上記＜１＞～＜１９＞のいずれか１つ、及び／又はヒト又は動物の体の治療方法で用いる、上記医薬組成物を提供する。本開示はまた、ヒト又は動物の体の治療の方法を提供し、当該方法は、治療的有効量の前記化合物又は組成物を、それが必要な被験体に投与することを含む。
本開示は、さらに、細菌感染の治療又は予防の方法で用いる、上記の化合物及び／又は医薬組成物を提供する。本開示はまた、細菌感染の治療又は予防の方法を提供し、当該方法は、治療的有効量の前記化合物又は組成物を、それが必要な被験体に投与することを含む。細菌感染は、好ましくは、ＩＩ型細菌性グルタミニルシクラーゼ（ｂａｃＱＣ）を発現する細菌により生じる。より好ましくは、細菌感染は、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属及びＴａｎｎｅｒｅｌｌａ属からなる群より選択される細菌、好ましくは、種Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ及びＴａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａからなる群より選択される細菌により生じる。
本開示は、化合物、例えば、上記＜１＞～＜１９＞のいずれか１つ、及び／又はヒト又は動物の体の治療方法で用いる、上記医薬組成物を提供する。本開示はまた、ヒト又は動物の体の治療の方法を提供し、当該方法は、治療的有効量の前記化合物又は組成物を、それが必要な被験体に投与することを含む。
本開示は、さらに、細菌感染の治療又は予防の方法で用いる、上記の化合物及び／又は医薬組成物を提供する。本開示はまた、細菌感染の治療又は予防の方法を提供し、当該方法は、治療的有効量の前記化合物又は組成物を、それが必要な被験体に投与することを含む。細菌感染は、好ましくは、ＩＩ型細菌性グルタミニルシクラーゼ（ｂａｃＱＣ）を発現する細菌により生じる。より好ましくは、細菌感染は、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属及びＴａｎｎｅｒｅｌｌａ属からなる群より選択される細菌、好ましくは、種Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ及びＴａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａからなる群より選択される細菌により生じる。
【0097】
本開示による方法で用いられるｂａｃＱＣ阻害剤化合物又は医薬組成物は、好ましくは、殺傷内の、種Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ及びＴａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａからなる群より選択される細菌を選択的に殺傷し、又は選択的に増殖を阻害し、一方、バイオフィルム内の残りの細菌は、好ましくは、本質的には影響を受けない（すなわち、殺傷されるか、又はその増殖が有意に低く阻害される）。前記バイオフィルムは、好ましくは複雑なバイオフィルムであり、より好ましくは天然に存在するバイオフィルムであり、さらにより好ましくは天然に存在する口腔バイオフィルムである。
【0098】
本開示は、さらに、急性、慢性又は再発性の歯周疾患又は状態の治療又は予防の方法に用いる、ｂａｃＱＣ阻害剤化合物又は医薬組成物を提供する。歯周疾患及び歯周状態の主なカテゴリーは、歯垢誘発性歯肉疾患、慢性歯周炎、侵襲性歯周炎、全身性疾患の徴候としての歯周炎、壊死性歯周疾患、歯周膿瘍、歯内病変に関連する歯周炎、インプラント周囲粘膜炎、インプラント周囲炎、及び歯内感染のグループに分類される。本開示において、急性、慢性又は再発性歯周疾患は、好ましくは、歯垢誘発性歯肉疾患、慢性歯周炎、侵襲性歯周炎、全身性疾患の症状としての歯周炎、壊死性歯周疾患、歯周の膿瘍、歯内病変に関連する歯周炎、インプラント周囲粘膜炎、インプラント周囲炎、及び歯内感染からなる群から選択される。本開示はまた、歯垢誘発性歯肉疾患、慢性歯周炎、侵襲性歯周炎、全身性疾患の症状としての歯周炎、壊死性歯周疾患、歯周の膿瘍、歯内病変に関連する歯周炎、インプラント周囲粘膜炎、インプラント周囲炎、及び歯内感染症からなる群から好ましくは選択される急性、慢性、又は再発性歯周疾患の治療又は予防の方法を提供し、当該方法は、治療的有効量のバクＱＣ阻害剤化合物又は医薬組成物を、それが必要な被験体に投与することを含む。さらに、急性、慢性又は再発性の歯周疾患は、例えばArmitage, Ann Periodotol 1999, 4, 1-6に記載される。
【0099】
本開示の１の態様では、本開示による化合物又は医薬組成物は、好ましくは、投与経路が局所投与、及び／又は方法が非外科的方法である、上記の方法のいずれかで用いられる。別の態様では、本開示による阻害剤化合物又は医薬組成物は、好ましくは、投与経路が全身投与、及び／又は方法が非外科的方法である、上記の方法のいずれかで用いられる。
【0100】
本明細書で用いられる用語「被験体」は、治療、治療、予防、観察又は実験の対象であるか又は対象であった動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトをいう。
【0101】
本明細書で用いられる用語「治療的有効量」とは、研究者、獣医師、医師又は他の臨床医が探索する、組織系、動物又はヒトにおける生物学的又は医学的応答を誘発する活性化合物又は医薬剤の量を意味し、治療される疾患又は障害の症状の緩和を含む。
【0102】
〔タンパク質結晶〕
本開示は、細菌性グルタミニルシクラーゼ（ｂａｃＱＣｓ）の結晶を提供する。
本開示は、細菌性グルタミニルシクラーゼ（ｂａｃＱＣｓ）の結晶を提供する。
【0103】
ＰｇＱＣの結晶構造における原子配位は、本出願がその優先権を主張する２０１８年２月２３日に欧州特許庁に出願された欧州特許出願第１８１５８３４３号公報の第２１～４２頁の表１に示され、言及される。あるいは、２０１９年２月１９日に寄託されたＰＤＢ識別コード６ＱＱＬとしてＲＣＳＢタンパク質データベース（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）に示される。一実施形態では、細菌のグルタミニルシクラーゼ（ｂａｃＱＣ）を含む結晶は、ＰｇＱＣを含む結晶であり、ＰｇＱＣは、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は配列番号１に対する配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列があるか、好ましくは以下の：
－上記第１８１５８３４３号の表１又は６ＱＱＬに記載の原子配位、又はここで、上記第１８１５８３４３号の表１又は６ＱＱＬに記載のポリペプチド鎖の主鎖原子からの二乗平均平方根偏差が２Å以下である、及び／又は
－配列番号１の残基Ｇｌｎ１３３、Ａｓｐ１４９、Ｇｌｕ１８２、Ａｓｐ１８３、Ｔｙｒ１８７、Ｇｌｙ１８８、Ａｓｐ１８９、Ａｓｐ１９０、Ｔｒｐ１９３、Ｃｙｓ１９４、Ａｓｐ２１８、Ｍｅｔ２１９、Ｐｈｅ２３２、Ｇｌｙ２６３、Ａｌａ２６４、Ｌｅｕ２６５、Ｔｈｒ２６６、Ａｓｐ２６７、Ｖａｌ２７０、Ｉｌｅ２８４、Ｔｙｒ２８６、Ａｓｎ２９０、Ｇｌｕ２９１、Ｈｉｓ２９２、Ｇｌｙ２９３、Ｐｈｅ２９４、Ｔｒｐ２９８、Ｈｉｓ２９９で特定される結合ポケット；
－空間群Ｐ３１２１及びａ＝８９．９Å、ｂ＝８９．９Å、ｃ＝１６４．７Å、α＝９０°、β＝９０°及びγ＝１２０°の単位胞寸法、を有する。
－上記第１８１５８３４３号の表１又は６ＱＱＬに記載の原子配位、又はここで、上記第１８１５８３４３号の表１又は６ＱＱＬに記載のポリペプチド鎖の主鎖原子からの二乗平均平方根偏差が２Å以下である、及び／又は
－配列番号１の残基Ｇｌｎ１３３、Ａｓｐ１４９、Ｇｌｕ１８２、Ａｓｐ１８３、Ｔｙｒ１８７、Ｇｌｙ１８８、Ａｓｐ１８９、Ａｓｐ１９０、Ｔｒｐ１９３、Ｃｙｓ１９４、Ａｓｐ２１８、Ｍｅｔ２１９、Ｐｈｅ２３２、Ｇｌｙ２６３、Ａｌａ２６４、Ｌｅｕ２６５、Ｔｈｒ２６６、Ａｓｐ２６７、Ｖａｌ２７０、Ｉｌｅ２８４、Ｔｙｒ２８６、Ａｓｎ２９０、Ｇｌｕ２９１、Ｈｉｓ２９２、Ｇｌｙ２９３、Ｐｈｅ２９４、Ｔｒｐ２９８、Ｈｉｓ２９９で特定される結合ポケット；
－空間群Ｐ３１２１及びａ＝８９．９Å、ｂ＝８９．９Å、ｃ＝１６４．７Å、α＝９０°、β＝９０°及びγ＝１２０°の単位胞寸法、を有する。
【0104】
さらに好ましくは、ＰｇＱＣ結晶は、Ｘ線を２．８１～４４．９５Åの解像度まで回折させて結晶の原子配位を決定する。
【0105】
ＴｆＱＣの結晶構造における原子配位は、本出願がその優先権を主張する２０１８年２月２３日に欧州特許庁に出願された欧州特許出願第１８１５８３４３号公報の第４３～９１ページの表２に示され、ここで言及される。あるいは、２０１９年２月１９日に寄託されたＰＤＢ識別コード６ＱＲＯとしてＲＣＳＢタンパク質データベース（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）に示される。
【0106】
別の態様では、細菌のグルタミニルシクラーゼ（ｂａｃＱＣ）を含む結晶は、ＴｆＱＣを含む結晶であってよく、ＴｆＱＣは、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は配列番号２に対する配列同一性が９０％以上であり、好ましくは以下の：
－上記第１８１５８３４３号の表２又は６ＱＱＬに記載の原子配位、又は－上記第１８１５８３４３号の表２又は６ＱＱＬに記載のポリペプチド鎖の主鎖原子からの二乗平均平方根偏差が３Å以下であり、及び／又は
－配列番号２の残基Ｈｉｓ１２６、Ａｒｇ１３０、Ｈｉｓ１３５、Ｇｌｕ１８３、Ａｓｐ１８４、Ｇｌｙ１８６、Ｔｈｒ１８７、Ｇｌｙｓ１８９、Ｌｙｓ１９５、Ｐｒｏ１９６、Ａｓｐ１９７、Ｔｒｐ１９９、Ａｓｐ２２４、Ｍｅｔ２２５、Ｇｌｙ２６９、Ａｌａ２７０、Ｉｌｅ２７１、Ｖａｌ２７２、Ｇｌｎ２７６、Ｔｙｒ２７７、Ｉｌｅ２９０、Ｔｙｒ２９２、Ｇｌｎ２９７、Ｓｅｒ２９８、Ｇｌｙ２９９、Ｐｈｅ３００、Ｔｒｐ３０４、Ｈｉｓ３０５で特定される結合ポケット；及び／又は、
－空間群Ｐ１及びａ＝５６．１Å、ｂ＝７９．２Å、ｃ＝８３．１Å、α＝８９．９°、β＝９０．０°及びγ＝７１．９°の単位格子寸法、を有するアミノ酸配列であってよい。
－上記第１８１５８３４３号の表２又は６ＱＱＬに記載の原子配位、又は－上記第１８１５８３４３号の表２又は６ＱＱＬに記載のポリペプチド鎖の主鎖原子からの二乗平均平方根偏差が３Å以下であり、及び／又は
－配列番号２の残基Ｈｉｓ１２６、Ａｒｇ１３０、Ｈｉｓ１３５、Ｇｌｕ１８３、Ａｓｐ１８４、Ｇｌｙ１８６、Ｔｈｒ１８７、Ｇｌｙｓ１８９、Ｌｙｓ１９５、Ｐｒｏ１９６、Ａｓｐ１９７、Ｔｒｐ１９９、Ａｓｐ２２４、Ｍｅｔ２２５、Ｇｌｙ２６９、Ａｌａ２７０、Ｉｌｅ２７１、Ｖａｌ２７２、Ｇｌｎ２７６、Ｔｙｒ２７７、Ｉｌｅ２９０、Ｔｙｒ２９２、Ｇｌｎ２９７、Ｓｅｒ２９８、Ｇｌｙ２９９、Ｐｈｅ３００、Ｔｒｐ３０４、Ｈｉｓ３０５で特定される結合ポケット；及び／又は、
－空間群Ｐ１及びａ＝５６．１Å、ｂ＝７９．２Å、ｃ＝８３．１Å、α＝８９．９°、β＝９０．０°及びγ＝７１．９°の単位格子寸法、を有するアミノ酸配列であってよい。
【0107】
さらに好ましくは、ＴｆＱＣ結晶は、Ｘ線を２．１０～３８．２８Åの分解能まで回折させて、結晶の原子配位を決定する。
【0108】
ポリペプチド鎖の骨格原子からの二乗平均平方根偏差は、本発明によるタンパク質の構造と比較されるべき構造の構造の整列後に、ＤＡＬＩ(登録商標)プログラム（L. Holm and C. Sander, Science, 1996, vol. 273, 595-602）を用いて、等価なＣα骨格原子の構造配位からの位置の二乗平均平方根偏差として決定され得る。本明細書中で用いられる用語「結合ポケット」は、他の分子実体と安定化相互作用を開始することができる分子実体中の特定の領域（又は原子）への言及を含む。ある態様では、当該用語はまた、別の分子とのその特異的組合せに直接的に関与する高分子の反応性部分をいう。別の実施形態では、結合部位は、折りたたまれたポリペプチド内の１又はそれ以上のアミノ酸残基の三次元配列を含むか、又はそれにより定義される。最も好ましくは、本明細書中に記載されたｂａｃＱＣの結合ポケットは各々、上記ｂａｃＱＣの各々について列挙された残基の原子により規定される。
【0109】
本発明の特定の実施形態では、細菌のグルタミニルシクラーゼ（ｂａｃＱＣ）を含む結晶は、配列番号１の切断アミノ酸配列を含むポリペプチド断片、又は配列番号１の切断アミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含む結晶である。配列番号１の切断アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から１～１３２個、好ましくは１～２０個、より好ましくは２～１０個の連続したアミノ酸の欠失、及び／又は配列番号１のＣ末端から１～３４個、好ましくは１～１０個、より好ましくは２～５個の連続したアミノ酸の欠失により得られる。
【0110】
本発明の別の特定の実施形態では、細菌のグルタミニルシクラーゼ（ｂａｃＱＣ）を含む結晶は、配列番号２の切断アミノ酸配列を含むポリペプチド断片、又は配列番号２の切断アミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含む結晶である。配列番号２の切断アミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列のＮ末端から１～１２５個、好ましくは１～２１個、より好ましくは２～１０個の連続したアミノ酸の欠失、及び／又は配列番号２のＣ末端から１～２９個、好ましくは１～１０個、より好ましくは２～５個の連続したアミノ酸の欠失により得られる。
【0111】
さらに別の実施形態では、候補化合物と共に上記のｂａｃＱＣを含む共結晶が提供される。候補化合物は、好ましくはｂａｃＱＣの結合ポケットに結合される。候補化合物はさらに好ましくはｂａｃＱＣ阻害剤である。最も好ましくは、候補化合物は、＜１＞～＜１９＞のいずれか１つに明記される式Ｉ又は式ＩＩの１つによる化合物である。
【0112】
本発明による結晶及び共結晶は、好ましくは、細菌のグルタミニルシクラーゼの三次元Ｘ線回折構造を約１．９Å及び約２．８Åの分解能で決定するのに十分な品質及びサイズである。
【0113】
どちらの結晶構造もα－βヒドロラーゼの折りたたみ構造を共有し、これは７本のαへリックスで囲まれた８本のβシートにより決定される。どちらの場合も、Ｚｎイオンはそれぞれ２つのアスパラギン酸と１つのヒスチジンと四面体配位する。第４配位部位は、阻害剤のサブ構造部分として水分子、基質、又は金属結合基により占有される。小さな基とＺｎイオンとのこれらの金属相互作用は、本明細書に記載された病原体に対する抗菌剤として用いられる活性化合物の設計に不可欠である。さらに、結合部位は、ヒトの酵素とは異なる疎水性及び親水性領域により形成され、細菌の酵素に対する選択性を生み出す（図７－１０参照）。
【0114】
発明による結晶及び共結晶は、バッチ、液体ブリッジ、透析、ハンギング又はシッティングドロップ蒸気拡散等の蒸気拡散法により、以下にさらに記載するように調製することができる。
【0115】
上記で特定したｂａｃＱＣ結晶を調製する１つの好ましい方法は、以下の：
（ａ）好ましくは１５０ｍＭ ＮａＣｌの存在下で、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０等の適当な緩衝液中に、上記定義のｂａｃＱＣを含む溶液を提供する工程；
（ｂ）前記溶液を、（ｉ）ＰｇＱＣの場合は１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、２Ｍ硫酸アンモニウム、３％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ４００、又は（ｉｉ）ＴｆＱＣの場合は０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．６、２Ｍ硫酸アンモニウムを含む等量の結晶化溶液と混合する工程；かつ、
（ｃ）得られた混合物を懸垂又は座滴蒸気拡散を促進する条件下で、ｂａｃＱＣの結晶を得るのに十分な時間インキュベーションする工程、を含む。
（ａ）好ましくは１５０ｍＭ ＮａＣｌの存在下で、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０等の適当な緩衝液中に、上記定義のｂａｃＱＣを含む溶液を提供する工程；
（ｂ）前記溶液を、（ｉ）ＰｇＱＣの場合は１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、２Ｍ硫酸アンモニウム、３％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ４００、又は（ｉｉ）ＴｆＱＣの場合は０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．６、２Ｍ硫酸アンモニウムを含む等量の結晶化溶液と混合する工程；かつ、
（ｃ）得られた混合物を懸垂又は座滴蒸気拡散を促進する条件下で、ｂａｃＱＣの結晶を得るのに十分な時間インキュベーションする工程、を含む。
【0116】
候補化合物と共にｂａｃＱＣの共結晶を調製する１つの方法は、以下の：
（ａ）上記で特定したｂａｃＱＣ、好ましくはＰｇＱＣ、及び１００ｍＭ ＨＣｌに溶解した候補化合物を含む溶液を、ｂａｃＱＣ：化合物＝１：２．３のモル比で提供する工程；
（ｂ）前記溶液を、１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、２Ｍ硫酸アンモニウム、３％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ４００を含む等量の結晶化溶液と混合する工程；
（ｃ）得られた混合物を、ｂａｃＱＣ及び候補化合物の共結晶を得るのに十分な時間、懸垂又は座滴蒸気拡散を促進する条件下でインキュベーションする工程；を含む。
（ａ）上記で特定したｂａｃＱＣ、好ましくはＰｇＱＣ、及び１００ｍＭ ＨＣｌに溶解した候補化合物を含む溶液を、ｂａｃＱＣ：化合物＝１：２．３のモル比で提供する工程；
（ｂ）前記溶液を、１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、２Ｍ硫酸アンモニウム、３％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ４００を含む等量の結晶化溶液と混合する工程；
（ｃ）得られた混合物を、ｂａｃＱＣ及び候補化合物の共結晶を得るのに十分な時間、懸垂又は座滴蒸気拡散を促進する条件下でインキュベーションする工程；を含む。
【0117】
候補化合物と共にｂａｃＱＣの共結晶を調製するための別の方法は、以下の：
（ｄ）収穫され粉砕されたｂａｃＱＣ、好ましくは上記で特定されたように製造された候補化合物を含まないＴｆＱＣ結晶をシードストックとして溶液を提供する工程；
（ｅ）上記で特定されたｂａｃＱＣ、及び１００ｍＭ ＨＣｌに溶解した候補化合物を含む溶液を、ｂａｃＱＣ：化合物＝１：１．２のモル比で提供する工程；
（ｆ）前記溶液を、１Ｍ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．６又はｐＨ６．８、３２．５％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ６００、０．１Ｍ ＮａＣｌ及び１５％シードストック溶液を含む等量の結晶化溶液と混合する工程；
（ｇ）得られた混合物を、ｂａｃＱＣ及び候補化合物の共結晶を得るのに十分な時間、懸垂又は座滴蒸気拡散を促進する条件下でインキュベーションする工程；を含む。
（ｄ）収穫され粉砕されたｂａｃＱＣ、好ましくは上記で特定されたように製造された候補化合物を含まないＴｆＱＣ結晶をシードストックとして溶液を提供する工程；
（ｅ）上記で特定されたｂａｃＱＣ、及び１００ｍＭ ＨＣｌに溶解した候補化合物を含む溶液を、ｂａｃＱＣ：化合物＝１：１．２のモル比で提供する工程；
（ｆ）前記溶液を、１Ｍ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．６又はｐＨ６．８、３２．５％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ６００、０．１Ｍ ＮａＣｌ及び１５％シードストック溶液を含む等量の結晶化溶液と混合する工程；
（ｇ）得られた混合物を、ｂａｃＱＣ及び候補化合物の共結晶を得るのに十分な時間、懸垂又は座滴蒸気拡散を促進する条件下でインキュベーションする工程；を含む。
【0118】
〔候補化合物及び／又は阻害剤を同定する方法〕
本発明は、ｂａｃＱＣの結合ポケットに結合し得る候補化合物を同定する方法を提供し、以下の：
（ａ）上記又は２の第１８１５８３４３号公報の表１又は６ＱＱＬに記載の構造配位を用いて各ｂａｃＱＣの３次元モデルを生成する工程；
（ｂ）上記第１８１５８３４３号公報の表１又は６ＱＱＬによる配位により、配列番号１の残基Ｇｌｎ１３３、Ａｓｐ１４９、Ｇｌｕ１８２、Ａｓｐ１８３、Ｔｙｒ１８７、Ｇｌｙ１８８、Ａｓｐ１８９、Ａｓｐ１９０、Ｔｒｐ１９３、Ｃｙｓ１９４、Ａｓｐ２１８、Ｍｅｔ２１９、Ｐｈｅ２３２、Ｇｌｙ２６３、Ａｌａ２６４、Ｌｅｕ２６５、Ｔｈｒ２６６、Ａｓｐ２６７、Ｖａｌ２７０、Ｉｌｅ２８４、Ｔｙｒ２８６、Ａｓｎ２９０、Ｇｌｕ２９１、Ｈｉｓ２９２、Ｇｌｙ２９３、Ｐｈｅ２９４、Ｔｒｐ２９８、Ｈｉｓ２９９：１により提供される結合ポケットを分析すること工程、又は上記第１８１５８３４３号公報の表２又は６ＱＱＬによる配位により、配列番号２の残基Ｈｉｓ１２６、Ａｒｇ１３０、Ｈｉｓ１３５、Ｇｌｕ１８３、Ａｓｐ１８４、Ｇｌｙ１８６、Ｔｈｒ１８７、Ｇｌｕ１８９、Ｌｙｓ１９５、Ｐｒｏ１９６、Ａｓｐ１９７、Ｔｒｐ１９９、Ａｓｐ２２４、Ｍｅｔ２２５、Ｇｌｙ２６９、Ａｌａ２７０、Ｉｌｅ２７１、Ｖａｌ２７２、Ｇｌｎ２７６、Ｔｙｒ２７７、Ｉｌｅ２９０、Ｔｙｒ２９２、Ｇｌｎ２９７、Ｓｅｒ２９８、Ｇｌｙ２９９、Ｐｈｅ３００、Ｔｒｐ３０４、Ｈｉｓ３０５により提供される結合ポケットを分析する工程；
（ｃ）各ｂａｃＱＣの結合ポケットに結合し得る候補化合物の同定にコンピューターモデリング分析を行う工程、を含む。
本発明は、ｂａｃＱＣの結合ポケットに結合し得る候補化合物を同定する方法を提供し、以下の：
（ａ）上記又は２の第１８１５８３４３号公報の表１又は６ＱＱＬに記載の構造配位を用いて各ｂａｃＱＣの３次元モデルを生成する工程；
（ｂ）上記第１８１５８３４３号公報の表１又は６ＱＱＬによる配位により、配列番号１の残基Ｇｌｎ１３３、Ａｓｐ１４９、Ｇｌｕ１８２、Ａｓｐ１８３、Ｔｙｒ１８７、Ｇｌｙ１８８、Ａｓｐ１８９、Ａｓｐ１９０、Ｔｒｐ１９３、Ｃｙｓ１９４、Ａｓｐ２１８、Ｍｅｔ２１９、Ｐｈｅ２３２、Ｇｌｙ２６３、Ａｌａ２６４、Ｌｅｕ２６５、Ｔｈｒ２６６、Ａｓｐ２６７、Ｖａｌ２７０、Ｉｌｅ２８４、Ｔｙｒ２８６、Ａｓｎ２９０、Ｇｌｕ２９１、Ｈｉｓ２９２、Ｇｌｙ２９３、Ｐｈｅ２９４、Ｔｒｐ２９８、Ｈｉｓ２９９：１により提供される結合ポケットを分析すること工程、又は上記第１８１５８３４３号公報の表２又は６ＱＱＬによる配位により、配列番号２の残基Ｈｉｓ１２６、Ａｒｇ１３０、Ｈｉｓ１３５、Ｇｌｕ１８３、Ａｓｐ１８４、Ｇｌｙ１８６、Ｔｈｒ１８７、Ｇｌｕ１８９、Ｌｙｓ１９５、Ｐｒｏ１９６、Ａｓｐ１９７、Ｔｒｐ１９９、Ａｓｐ２２４、Ｍｅｔ２２５、Ｇｌｙ２６９、Ａｌａ２７０、Ｉｌｅ２７１、Ｖａｌ２７２、Ｇｌｎ２７６、Ｔｙｒ２７７、Ｉｌｅ２９０、Ｔｙｒ２９２、Ｇｌｎ２９７、Ｓｅｒ２９８、Ｇｌｙ２９９、Ｐｈｅ３００、Ｔｒｐ３０４、Ｈｉｓ３０５により提供される結合ポケットを分析する工程；
（ｃ）各ｂａｃＱＣの結合ポケットに結合し得る候補化合物の同定にコンピューターモデリング分析を行う工程、を含む。
【0119】
好ましくは、この方法はさらに、以下の：
（ｄ）前記候補化合物がｂａｃＱＣの触媒活性を低下させるかどうかをインビトロで検証することにより、ｂａｃＱＣの触媒活性を低下させる候補化合物をｂａｃＱＣ阻害剤として分類する工程、を含む。
（ｄ）前記候補化合物がｂａｃＱＣの触媒活性を低下させるかどうかをインビトロで検証することにより、ｂａｃＱＣの触媒活性を低下させる候補化合物をｂａｃＱＣ阻害剤として分類する工程、を含む。
【0120】
候補化合物がｂａｃＱＣの触媒活性を低下させるかどうかの検証は、例えば、以下の工程（ｄ１）～（ｄ５）：
（ｄ１）ｂａｃＱＣ及びｂａｃＱＣの基質を含む組成物を提供する工程；
（ｄ２）前記（ｃ）に記載された候補化合物を提供する工程；
（ｄ３）前記候補化合物を前記組成物と接触させる工程；
（ｄ４）ｂａｃＱＣの触媒活性をモニターする工程；
（ｄ５）ｂａｃＱＣの触媒活性に関する前記候補化合物の効果に基づいて、前記候補物質を前記ｂａｃＱＣの阻害剤として分類する工程であって、ｂａｃＱＣの触媒活性を低下させる候補化合物を、ｂａｃＱＣ阻害剤に分類する；
を含む前記ｂａｃＱＣの阻害剤を同定する方法により行うことができる。
（ｄ１）ｂａｃＱＣ及びｂａｃＱＣの基質を含む組成物を提供する工程；
（ｄ２）前記（ｃ）に記載された候補化合物を提供する工程；
（ｄ３）前記候補化合物を前記組成物と接触させる工程；
（ｄ４）ｂａｃＱＣの触媒活性をモニターする工程；
（ｄ５）ｂａｃＱＣの触媒活性に関する前記候補化合物の効果に基づいて、前記候補物質を前記ｂａｃＱＣの阻害剤として分類する工程であって、ｂａｃＱＣの触媒活性を低下させる候補化合物を、ｂａｃＱＣ阻害剤に分類する；
を含む前記ｂａｃＱＣの阻害剤を同定する方法により行うことができる。
【0121】
（工程ｄ１における）前記組成物は、好ましくは適当な緩衝液及び／又は塩成分を含む水溶液であり得る。前記基質は、好ましくは、そのＮ末端にグルタミン残基を含むペプチド又はペプチド誘導体である。前記基質は、好ましくは標識され、より好ましくは同位体標識され、最も好ましくは蛍光発生する基質である。前記蛍光発生基質は、好ましくは、ｂａｃＱＣにより触媒される反応の過程で変換後、蛍光強度が変化する。
【0122】
ＢａｃＱＣ活性をモニターする適当な蛍光発生基質は、以下のスキーム
【0123】
【化17】
で示される、Schilling, S., Hoffmann, T., Wermann, M., Heiser, U., Wasternack,C., and Demuth, H.-U. Anal. Biochem. 2002, 303, 49-56 (Schillingら2002)に記載されているＨ－Ｇｌｎ－ＡＭＣである。
【0124】
当該候補化合物は、工程（ｄ１）の組成物の残存成分の添加前、添加時、又は添加後に接触させることができる。候補化合物は、好ましくは溶液中で、より好ましくはＤＭＳＯ溶液として提供される。
【0125】
当該基質の変換は、経時的に、例えば、蛍光発生基質の切断により生成されるフルオロフォアの発光をモニターすることによりモニターされる。ｂａｃＱＣ活性は、アッセイ条件下でＡＭＣの標準曲線から測定することができる。
【0126】
ｂａｃＱＣ触媒活性は、異なる濃度の基質、ｂａｃＱＣ及び／又は候補化合物を用いて測定することができる。ｂａｃＱＣ触媒活性用の適当な尺度は、例えば、候補化合物の所定の濃度の存在下での阻害定数（Ｋｉ）、５０％残留活性（ＲＡ）、及び／又はＩＣ５０値である。
【0127】
本発明は、さらに、ｂａｃＱＣの結合ポケットに結合する候補化合物を同定する方法を提供し、当該方法は、以下の：
（ａ）候補化合物と共に上記ｂａｃＱＣを含む共結晶の３次元モデルを生成する工程；
（ｂ）当該候補化合物の原子と、配列番号１の残基Ｇｌｎ１３３、Ａｓｐ１４９、Ｇｌｕ１８２、Ａｓｐ１８３、Ｔｙｒ１８７、Ｇｌｙ１８８、Ａｓｐ１８９、Ａｓｐ１９０、Ｔｒｐ１９３、Ｃｙｓ１９４、Ａｓｐ２１８、Ｍｅｔ２１９、Ｐｈｅ２３２、Ｇｌｙ２６３、Ａｌａ２６４、Ｌｅｕ２６５、Ｔｈｒ２６６、Ａｓｐ２６７、Ｖａｌ２７０、Ｉｌｅ２８４、Ｔｙｒ２８６、Ａｓｎ２９０、Ｇｌｕ２９１、Ｈｉｓ２９２、Ｇｌｙ２９３、Ｐｈｅ２９４、Ｔｒｐ２９８、Ｈｉｓ２９９により提供される結合ポケットの原子、又は配列番号２の残基ＸＸＸＸ Ｈｉｓ１２６、Ａｒｇ１３０、Ｈｉｓ１３５、Ｇｌｕ１８３、Ａｓｐ１８４、Ｇｌｙ１８６、Ｔｈｒ１８７、Ｇｌｕ１８９、Ｌｙｓ１９５、Ｐｒｏ１９６、Ａｓｐ１９７、Ｔｒｐ１９９、Ａｓｐ２２４、Ｍｅｔ２２５、Ｇｌｙ２６９、Ａｌａ２７０、Ｉｌｅ２７１、Ｖａｌ２７２、Ｇｌｎ２７６、Ｔｙｒ２７７、Ｉｌｅ２９０、Ｔｙｒ２９２、Ｇｌｎ２９７、Ｓｅｒ２９８、Ｇｌｙ２９９、Ｐｈｅ３００、Ｔｒｐ３０４、Ｈｉｓ３０５により提供される結合ポケット原子の原子、との間の距離を分析して、前記ｂａｃＱＣの前記結合ポケットと会合する候補化合物を同定する工程、を含む。
（ａ）候補化合物と共に上記ｂａｃＱＣを含む共結晶の３次元モデルを生成する工程；
（ｂ）当該候補化合物の原子と、配列番号１の残基Ｇｌｎ１３３、Ａｓｐ１４９、Ｇｌｕ１８２、Ａｓｐ１８３、Ｔｙｒ１８７、Ｇｌｙ１８８、Ａｓｐ１８９、Ａｓｐ１９０、Ｔｒｐ１９３、Ｃｙｓ１９４、Ａｓｐ２１８、Ｍｅｔ２１９、Ｐｈｅ２３２、Ｇｌｙ２６３、Ａｌａ２６４、Ｌｅｕ２６５、Ｔｈｒ２６６、Ａｓｐ２６７、Ｖａｌ２７０、Ｉｌｅ２８４、Ｔｙｒ２８６、Ａｓｎ２９０、Ｇｌｕ２９１、Ｈｉｓ２９２、Ｇｌｙ２９３、Ｐｈｅ２９４、Ｔｒｐ２９８、Ｈｉｓ２９９により提供される結合ポケットの原子、又は配列番号２の残基ＸＸＸＸ Ｈｉｓ１２６、Ａｒｇ１３０、Ｈｉｓ１３５、Ｇｌｕ１８３、Ａｓｐ１８４、Ｇｌｙ１８６、Ｔｈｒ１８７、Ｇｌｕ１８９、Ｌｙｓ１９５、Ｐｒｏ１９６、Ａｓｐ１９７、Ｔｒｐ１９９、Ａｓｐ２２４、Ｍｅｔ２２５、Ｇｌｙ２６９、Ａｌａ２７０、Ｉｌｅ２７１、Ｖａｌ２７２、Ｇｌｎ２７６、Ｔｙｒ２７７、Ｉｌｅ２９０、Ｔｙｒ２９２、Ｇｌｎ２９７、Ｓｅｒ２９８、Ｇｌｙ２９９、Ｐｈｅ３００、Ｔｒｐ３０４、Ｈｉｓ３０５により提供される結合ポケット原子の原子、との間の距離を分析して、前記ｂａｃＱＣの前記結合ポケットと会合する候補化合物を同定する工程、を含む。
【0128】
好ましくは、当該方法はさらに、以下の：
（ｃ）前記候補化合物がｂａｃＱＣの触媒活性を低下させるかどうかをインビトロで検証し、それにより、前記ｂａｃＱＣの触媒活性を低下させる前記候補化合物をｂａｃＱＣ阻害剤として分類する工程、を含む。
（ｃ）前記候補化合物がｂａｃＱＣの触媒活性を低下させるかどうかをインビトロで検証し、それにより、前記ｂａｃＱＣの触媒活性を低下させる前記候補化合物をｂａｃＱＣ阻害剤として分類する工程、を含む。
【0129】
候補化合物がｂａｃＱＣの触媒活性を低下させるかどうかの検証には、例えば、以下の工程（ｃ１）～（ｃ５）：
（ｃ１）ｂａｃＱＣ及びｂａｃＱＣの基質を含む組成物を提供する工程；
（ｃ２）前記（ｂ）で特定された候補化合物を提供する工程；
（ｃ３）前記候補化合物を前記組成物と接触させる工程；
（ｃ４）前記ｂａｃＱＣの触媒活性をモニターする工程；
（ｃ５）前記候補化合物の効果に基づいて前記ｂａｃＱＣを阻害剤として分類する工程であって、ここで、ｂａｃＱＣの触媒活性を低下させる前記ｂａｃＱＣの触媒活性に関する候補化合物を、ｂａｃＱＣ阻害剤と分類する工程；
を含むｂａｃＱＣの阻害剤を同定する方法により行うことができる。
（ｃ１）ｂａｃＱＣ及びｂａｃＱＣの基質を含む組成物を提供する工程；
（ｃ２）前記（ｂ）で特定された候補化合物を提供する工程；
（ｃ３）前記候補化合物を前記組成物と接触させる工程；
（ｃ４）前記ｂａｃＱＣの触媒活性をモニターする工程；
（ｃ５）前記候補化合物の効果に基づいて前記ｂａｃＱＣを阻害剤として分類する工程であって、ここで、ｂａｃＱＣの触媒活性を低下させる前記ｂａｃＱＣの触媒活性に関する候補化合物を、ｂａｃＱＣ阻害剤と分類する工程；
を含むｂａｃＱＣの阻害剤を同定する方法により行うことができる。
【実施例】
【0130】
Ｉ．推定細菌性グルタミニルシクラーゼ（ｂａｃＱＣ）の同定と調製
ａ）同定
経口病原体Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔ．ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、及びＰ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａのセクレトームのバイオインフォマティクス解析（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｒａｌｇｅｎ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／）により、シグナルペプチド含有分泌タンパク質の約８０％が、シグナルペプチダーゼによりＸａａ‐Ｇｌｎペプチド結合で切断されることが示された。遊離タンパク質のＮ末端にはｐＧｌｕ残基がある。これは、外膜を横切る成長タンパク質のトランスロケーションと歯周病原体の成長に必須と思われるグルタミニルシクラーゼの存在を意味する。
ａ）同定
経口病原体Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔ．ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、及びＰ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａのセクレトームのバイオインフォマティクス解析（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｒａｌｇｅｎ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／）により、シグナルペプチド含有分泌タンパク質の約８０％が、シグナルペプチダーゼによりＸａａ‐Ｇｌｎペプチド結合で切断されることが示された。遊離タンパク質のＮ末端にはｐＧｌｕ残基がある。これは、外膜を横切る成長タンパク質のトランスロケーションと歯周病原体の成長に必須と思われるグルタミニルシクラーゼの存在を意味する。
【0131】
図１の（Ａ）は、ヒトＱＣ（ｈＱＣ、配列番号４）及びＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ＰｇＱＣ、配列番号１）由来の推定細菌ＱＣのアミノ酸配列アラインメントを示し、並びに（Ｂ）は、さらに推定ＱＣ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（ＰｉＱＣ、配列番号３）及びＴ．ｆｏｒｓｙｔｈｉａ（ＴｆＱＣ、配列番号２）及びＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ＰｇＱＣ、配列番号１）のアミノ酸配列アラインメントを示す。推定上のＰｇＱＣはヒトのＱＣとの相同性は２５％である。さらに、推定ＴｆＱＣのＰｇＱＣに対する相同性は４９％を示し、Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来のＱＣのＰｇＱＣに対する相同性は４２％を示す。灰色下線のシステイン残基は、ＰｇＱＣでは欠失するｈＱＣのジスルフィド架橋を反映する。ヒトＱＣの太字配列は、ＩＩ型ＱＣの高度に保存された残基を反映する。灰色配列は、ＰｇＱＣ及びｈＱＣの推定シグナル配列を示し、さらに典型的な金属結合モチーフＡｓｐ－Ｇｌｕ－Ｈｉｓを太字及び下線付きの文字で示す。推定金属結合モチーフは、ＴｆＱＣ及びＰｉＱＣ（Ｂ、太字）でも同定された。アラインメントは、ＥＭＢＬ－ＥＢＩＮＥＴのＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ；（＊）は単一の完全に保存された残基を有する位置を示し、（：）は非常に類似した特性のグループ間の保存を示し、（．）は弱類似の特性（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）のグループ間の保存を示す。
【0132】
ＢＬＡＳＴ分析により、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ＷＰ＿００５８７４３０１）における推定ＱＣタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が明らかにされた。当該推定ＱＣタンパク質の一次構造は、ヒトＱＣとの相同性が２５％である。さらに、推定ＱＣタンパク質は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の推定ＱＣと相同性を４２％又は４９％共有する経口病原体Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（ＷＰ＿０１４７０９２０８）及びＴ．ｆｏｒｓｙｔｈｉａ（ＷＰ＿０１４２２５０３７）のゲノムでも同定された（図１）。アミノ酸アラインメントが示すように、ヒトＱＣの保存残基は、ヒト及び他のＩＩ型ＱＣにおいてジスルフィド結合を形成する保存残基と細菌ＱＣにおいて異なるようである。しかし、ＩＩ型ＱＣの高度に保存された金属結合モチーフＡｓｐ１４４、Ｇｌｕ１８４（Ａｓｐ）及びＨｉｓ３２２（Ｗｉｎｔｊｅｎｓら、２００６）は、触媒中心を表す細菌推定ＱＣに存在するようである。当該タンパク質の一次構造は、当該タンパク質が実際のＱＣであることを示しうる。
【0133】
ｂ）調製
図２は、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳにおいて発現され、以下に詳細に記載されるように精製組換細菌推定ＱＣのＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。すなわち、３０μｇの精製タンパク質を１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥに負荷し、クーマシー染色、レーン１、PageRuler Broad Range unstained（Thermofisher Scientific）、レーン２、ＨｉｓＰｇＱＣ、レーン３、ＨｉｓＰｉＱＣ及びレーン５、ＨｉｓＴｆＱＣにより可視化した。３つの推定細菌ＱＣの理論分子量はすべて約３７ＫＤａである。
図２は、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳにおいて発現され、以下に詳細に記載されるように精製組換細菌推定ＱＣのＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。すなわち、３０μｇの精製タンパク質を１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥに負荷し、クーマシー染色、レーン１、PageRuler Broad Range unstained（Thermofisher Scientific）、レーン２、ＨｉｓＰｇＱＣ、レーン３、ＨｉｓＰｉＱＣ及びレーン５、ＨｉｓＴｆＱＣにより可視化した。３つの推定細菌ＱＣの理論分子量はすべて約３７ＫＤａである。
【0134】
ａａ）宿主株及び培地
大腸菌株ＤＨ５α又はＸＬ－１Ｂｌｕｅ（Stratagene）をクローニングに用いた。タンパク質発現に大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Novagene）を用いた。アルカリホスファターゼ活性アッセイをＣＣ１１８ ｐＧＰ１－２株で行った（Tabor, S. and Richardson, C. C. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1985, 82, 1074-1078; Manoil, C., J. J. Mekalanos and Beckwith, J. J. Bacteriol. 1990, 172(2), 515-518）。すべての大腸菌株を、２０℃、３０℃又は３７℃で示されるように、Luria-Bertani培地中で増殖させた。必要に応じて抗生物質（アンピシリン［５０～１２５ｍｇ／Ｌ］、クロラムフェニコール［１５～３０ｍｇ／Ｌ］、及びカナマイシン［２５ｍｇ／Ｌ］）を追加した。固形培地の調製には、１．５％寒天培地（Ｒｏｔｈ）を対応するブロスに添加した。
大腸菌株ＤＨ５α又はＸＬ－１Ｂｌｕｅ（Stratagene）をクローニングに用いた。タンパク質発現に大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Novagene）を用いた。アルカリホスファターゼ活性アッセイをＣＣ１１８ ｐＧＰ１－２株で行った（Tabor, S. and Richardson, C. C. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1985, 82, 1074-1078; Manoil, C., J. J. Mekalanos and Beckwith, J. J. Bacteriol. 1990, 172(2), 515-518）。すべての大腸菌株を、２０℃、３０℃又は３７℃で示されるように、Luria-Bertani培地中で増殖させた。必要に応じて抗生物質（アンピシリン［５０～１２５ｍｇ／Ｌ］、クロラムフェニコール［１５～３０ｍｇ／Ｌ］、及びカナマイシン［２５ｍｇ／Ｌ］）を追加した。固形培地の調製には、１．５％寒天培地（Ｒｏｔｈ）を対応するブロスに添加した。
【0135】
ｂｂ） 細菌ＱＣをコードするプラスミドベクターの分子クローニング
すべてのクローニング手順は、標準的な分子生物学的手法を用いて実施した。タンパク質発現は、ＰｇＱＣ（配列番号１、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の推定ＱＣ）、ＰｉＱＣ（配列番号３、Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来の推定ＱＣ）及びＴｆＱＣ（配列番号２、Ｔ．ｆｏｒｓｙｔｈｉａ由来の推定ＱＣ）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）（Novagen）への直接クローニングに不可欠なＮｈｅＩ／ＮｄｅＩ制限部位を導入するためのＰＣＲにおける鋳型としてEurofins Genomicsから購入した合成ＤＮＡ配列を用いて増幅した。ＰｇＱＣ－’ＰｈｏＡ融合タンパク質の構築に、プライマー対ｓｅｑｐｇＱＣ ＮｄｅＩ（順方向）とｓｅｑｐｇＱＣ ＸｈｏＩ（逆方向）を用いて、予測されたシグナル配列がある推定ｐｇＱＣをＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ制限部位を介してｐＥＴ２６ｂ（＋）にサブクローニングした。さらに、ｐＥＴ２６ｂ（＋）ベクターのリボソーム結合部位を含む天然シグナル配列があるｐｇＱＣを、ｐｈｏＡ発現ベクターｐＥＣＤ６３７にクローニングするため、プライマー対ｓｅｑｐｇＱＣ ＲＢＳ ＮｏｔＩ（順方向）及びｓｅｑｐｇＱＣ ＸｂａＩ（逆方向）を用いて増幅した。クローニング用の全てのプライマーはMetabionから購入し、表１に記載した。
表１．ｂａｃＱＣ構築物のクローニングに用いるオリゴヌクレオチド
すべてのクローニング手順は、標準的な分子生物学的手法を用いて実施した。タンパク質発現は、ＰｇＱＣ（配列番号１、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の推定ＱＣ）、ＰｉＱＣ（配列番号３、Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来の推定ＱＣ）及びＴｆＱＣ（配列番号２、Ｔ．ｆｏｒｓｙｔｈｉａ由来の推定ＱＣ）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）（Novagen）への直接クローニングに不可欠なＮｈｅＩ／ＮｄｅＩ制限部位を導入するためのＰＣＲにおける鋳型としてEurofins Genomicsから購入した合成ＤＮＡ配列を用いて増幅した。ＰｇＱＣ－’ＰｈｏＡ融合タンパク質の構築に、プライマー対ｓｅｑｐｇＱＣ ＮｄｅＩ（順方向）とｓｅｑｐｇＱＣ ＸｈｏＩ（逆方向）を用いて、予測されたシグナル配列がある推定ｐｇＱＣをＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ制限部位を介してｐＥＴ２６ｂ（＋）にサブクローニングした。さらに、ｐＥＴ２６ｂ（＋）ベクターのリボソーム結合部位を含む天然シグナル配列があるｐｇＱＣを、ｐｈｏＡ発現ベクターｐＥＣＤ６３７にクローニングするため、プライマー対ｓｅｑｐｇＱＣ ＲＢＳ ＮｏｔＩ（順方向）及びｓｅｑｐｇＱＣ ＸｂａＩ（逆方向）を用いて増幅した。クローニング用の全てのプライマーはMetabionから購入し、表１に記載した。
表１．ｂａｃＱＣ構築物のクローニングに用いるオリゴヌクレオチド
【0136】
【表1】
ｃｃ）Ｈｉｓ Ｔａｇ融合タンパク質又は「ＰｈｏＡ融合タンパク質」としての細菌ＱＣの発現
発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）：：ｐｇＱＣを大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳで形質転換した。カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（１５μｇ／ｍｌ）を含むLuria-Bertani培地中で、細胞密度がＯＤ６００が～０．６に達するまで３７℃で細菌を増殖させた。培養物を０．４ｍＭイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシドで誘導し、２％（ｖ／ｖ）エタノール容量を添加し、その後、２０℃で１６時間インキュベーションした。培養物を、４℃及び３９００ｇで３０分間の遠心分離により回収し、細胞ペレットを－２０°で保存した。
【0137】
ｓｅｑＰｇＱＣ－’ＰｈｏＡ融合タンパク質の発現は、組換えベクターｐＥＣＤ６３７：：ｓｅｑｐｇＱＣをヘルパープラスミドｐＧＰ１－２と共にＣＣ１１８（例えばｐｈｏＡ遺伝子が欠失）に形質転換した。培養物を３０℃で一晩接種した。さらに、一晩培養したものを新鮮なLuria-Bertani培地に最終光学密度（ＯＤ６００）～０．４で希釈し、続いて４２℃で２０分間インキュベーションしてｓｅｑＰｇＱＣ－’ＰｈｏＡ融合タンパク質の発現を誘導した。その後、培養物をさらに２時間、３０℃で接種した。最後に、分光光度計（ＢｉｏＲａｄ）を用いて光学密度ＯＤ６００を測定し、２００μｌの培養物を４℃及び１６０００ｇで１５分間遠心分離することにより回収し、ＰｈｏＡ活性を測定した。
【0138】
ｄｄ）細菌ＱＣの精製
培養物５００ｍｌの細胞ペレットを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．０、１０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ及びプロテアーゼ阻害剤カクテルミックス（完全ミニ錠、ＥＤＴＡ非含有、ロシュ）からなる２０ｍｌの緩衝液中に再懸濁した。細胞は、French Press（Thermo Scientific, Waltman,MA,USA）を３～４回通過させて破壊した。４℃、３００００ｇで３０分間遠心分離して、細胞片を除去した。上清を平衡化緩衝液で１：２に希釈し、５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐカラム（GE Healthcare）に負荷した。カラムを１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．０を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌで平衡化した。いくつかのカラム容量の平衡化緩衝液及び少なくとも２０ｍＭのイミダゾールタンパク質で洗浄後、多段階勾配を用いて溶出し、最終濃度が２５０ｍＭのイミダゾールに達したが、一方、純粋なタンパク質の大部分は約１００ｍＭのイミダゾールで既に溶出していた。全てのｂａｃＱＣ含有画分をプールし、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０（Sartorius AG）で濃縮し、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（GE Healthcare）に適用し、これを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．０で平衡化した。精製をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、タンパク質含有量を、NanoDrop2000分光光度計（Thermo Scientifc）を用いて２８０ｎｍでの吸収により、又はBradford若しくはGill及びvon Hippelの方法（Bradford, M. M. 1976 Anal Biochem 72, 248-254; Gill, S.C. and von Hippel, P.H. 1989 Anal Biochem 182, 319-326）に従って測定した。最後に精製した組換融合ｂａｃＱＣタンパク質を液体窒素中でショック凍結し、－８０℃で保存し、最終濃度５０％まで添加し、－２０℃で保存した。Ｎ末端融合タンパク質のＨｉｓタグを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２の存在下、ｐＨ８．０で１ｍｇの融合タンパク質（Thrombin cleavage Capture Kit、Novagen）当たり１ユニットのトロンビンを用いて除去し、その後、４℃で１６時間インキュベーションした。ステプタビジンアガロース（Thrombin cleavage Capture Kit、Novagen）への結合によりトロンビンを除去し、ＨｉｓＴａｇを含まないｂａｃＱＣタンパク質をスピン濾過により回収した。ＨｉＰｒｅｐ（２６／１０）ｂａｃＱＣ画分を用いたさらなる脱塩工程の後、回収して、Vivaspin20(Sartorius AG)で濃縮した。最後に、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．０中の組換えｂａｃＱＣを液体窒素中でショック凍結し、－８０℃で保存するか、グリセロールを最終濃度５０％に添加し、－２０℃で保存した。ＰｉＱＣは、ＰｇＱＣと同様に発現及び精製された。ＴｆＱＣはＰｇＱＣと同様に発現させ、ＨｉＴｒａｐ Ｔａｌｏｎカラム（GE Healthcare）を用いて精製した。
培養物５００ｍｌの細胞ペレットを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．０、１０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ及びプロテアーゼ阻害剤カクテルミックス（完全ミニ錠、ＥＤＴＡ非含有、ロシュ）からなる２０ｍｌの緩衝液中に再懸濁した。細胞は、French Press（Thermo Scientific, Waltman,MA,USA）を３～４回通過させて破壊した。４℃、３００００ｇで３０分間遠心分離して、細胞片を除去した。上清を平衡化緩衝液で１：２に希釈し、５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐカラム（GE Healthcare）に負荷した。カラムを１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．０を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌで平衡化した。いくつかのカラム容量の平衡化緩衝液及び少なくとも２０ｍＭのイミダゾールタンパク質で洗浄後、多段階勾配を用いて溶出し、最終濃度が２５０ｍＭのイミダゾールに達したが、一方、純粋なタンパク質の大部分は約１００ｍＭのイミダゾールで既に溶出していた。全てのｂａｃＱＣ含有画分をプールし、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０（Sartorius AG）で濃縮し、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（GE Healthcare）に適用し、これを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．０で平衡化した。精製をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、タンパク質含有量を、NanoDrop2000分光光度計（Thermo Scientifc）を用いて２８０ｎｍでの吸収により、又はBradford若しくはGill及びvon Hippelの方法（Bradford, M. M. 1976 Anal Biochem 72, 248-254; Gill, S.C. and von Hippel, P.H. 1989 Anal Biochem 182, 319-326）に従って測定した。最後に精製した組換融合ｂａｃＱＣタンパク質を液体窒素中でショック凍結し、－８０℃で保存し、最終濃度５０％まで添加し、－２０℃で保存した。Ｎ末端融合タンパク質のＨｉｓタグを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２の存在下、ｐＨ８．０で１ｍｇの融合タンパク質（Thrombin cleavage Capture Kit、Novagen）当たり１ユニットのトロンビンを用いて除去し、その後、４℃で１６時間インキュベーションした。ステプタビジンアガロース（Thrombin cleavage Capture Kit、Novagen）への結合によりトロンビンを除去し、ＨｉｓＴａｇを含まないｂａｃＱＣタンパク質をスピン濾過により回収した。ＨｉＰｒｅｐ（２６／１０）ｂａｃＱＣ画分を用いたさらなる脱塩工程の後、回収して、Vivaspin20(Sartorius AG)で濃縮した。最後に、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．０中の組換えｂａｃＱＣを液体窒素中でショック凍結し、－８０℃で保存するか、グリセロールを最終濃度５０％に添加し、－２０℃で保存した。ＰｉＱＣは、ＰｇＱＣと同様に発現及び精製された。ＴｆＱＣはＰｇＱＣと同様に発現させ、ＨｉＴｒａｐ Ｔａｌｏｎカラム（GE Healthcare）を用いて精製した。
【0139】
[結論]すべての推定細菌ＱＣを、シグナル配列非含有大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳでＮ末端Ｈｉｓタグ融合タンパク質として発現させ、アフィニティークロマトグラフィーにより均一に精製した。１６－４０ｍｇの組換純粋Ｈｉｓ－Ｔａｇ融合タンパク質を、約５００ｍｌの誘発された大腸菌培養物から単離した。その後、融合タンパク質のＨｉｓタグをトロンビンで切断後、当該推定細菌ＱＣの酵素的特徴付けを行った。
【0140】
ＩＩ．タンパク質の結晶化
ａ）ＰｇＱＣ結晶化
結晶学的品質の結晶を、上記のように発現させて精製したＰｇＱＣから獲得した。ＰｇＱＣは、懸垂液滴蒸気拡散法を用いて、１５℃で４０日以内に９０μＭ（２．３ｍｇ／ｍｌ）の濃度で結晶化させた。１滴の１μＬタンパク質溶液を、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、３％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ４００及び２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４からなる同量の結晶化緩衝液と混合した。結晶化プロセスに、タンパク含有液滴を、貯蔵器に含まれる５００μＬの結晶化緩衝液との蒸気平衡に置いた。
ａ）ＰｇＱＣ結晶化
結晶学的品質の結晶を、上記のように発現させて精製したＰｇＱＣから獲得した。ＰｇＱＣは、懸垂液滴蒸気拡散法を用いて、１５℃で４０日以内に９０μＭ（２．３ｍｇ／ｍｌ）の濃度で結晶化させた。１滴の１μＬタンパク質溶液を、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、３％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ４００及び２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４からなる同量の結晶化緩衝液と混合した。結晶化プロセスに、タンパク含有液滴を、貯蔵器に含まれる５００μＬの結晶化緩衝液との蒸気平衡に置いた。
【0141】
Ｘ線測定の前に、結晶を１８％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む結晶化緩衝液に急速浸漬により凍結保護した後、－１８０℃でフラッシュ凍結した。回折単結晶からのデータを、銅回転陽極源（RA Micro 007, Rigaku Europe）に取り付けたＣＣＤ検出器（SATURN 944+, Rigaku Europe）を用いて社内で収集した。その後、収集された回折データをＸＤＳＧＵＩを用いて処理し、スケーリングし、マージした。測定されたＰｇＱＣ結晶は、三方晶系空間群Ｐ３１２１に属し、セル定数は、ａ＝８９．９Å、ｂ＝８９．９Å、ｃ＝１６４．７Å、α＝９０°、β＝９０°、γ＝１２０°である。それらは不斉単位に２分子のＰｇＱＣを含み、２．８Åに回折する。
【0142】
ＰｇＱＣ構造の初期相は、ＣＣＰ４結晶学的スイート由来プログラムＰＨＡＳＥＲ ＭＲとＰＱ ５０を有する検索モデルＰｇＱＣを用いた分子置換により得られ、その際、プログラムＣＯＯＴを用いた手動再構築とＲＥＦＭＡＣ５を用いた最尤精密化の幾つかのサイクルが実行された。このモデルは、Ｒｗｏｒｋ値が０．２４２８、Ｒｆｒｅｅ値が０．３０４０４に改良された。最終的なＰｇＱＣモデルを得るためには、手動による再構築と改良のサイクルの繰り返しで十分である。
【0143】
（ｂ）ＴｆＱＣ結晶化
結晶学的品質の結晶は、上記のように発現され精製されたＴｆＱＣから得られた。このタンパク質は、１５℃で９１日以内に、シッティングドロップ蒸気拡散法を用いて９．９１ｍｇ／ｍＬ（２７９μＭ）の濃度で結晶化させた。従って、２００ｎＬのタンパク質を、２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４及び０，１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．６からなる同量の結晶化緩衝液と、５５μＬの結晶化緩衝液を含むリザーバと蒸気拡散により接触したままの液滴中で混合した。
結晶学的品質の結晶は、上記のように発現され精製されたＴｆＱＣから得られた。このタンパク質は、１５℃で９１日以内に、シッティングドロップ蒸気拡散法を用いて９．９１ｍｇ／ｍＬ（２７９μＭ）の濃度で結晶化させた。従って、２００ｎＬのタンパク質を、２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４及び０，１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．６からなる同量の結晶化緩衝液と、５５μＬの結晶化緩衝液を含むリザーバと蒸気拡散により接触したままの液滴中で混合した。
【0144】
Ｘ線測定の前に、２５％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを含む結晶化緩衝液に急速浸漬により結晶を凍結保護し、その後－１８０℃でフラッシュ凍結した。回折単結晶からの以下のデータを、銅回転陽極源（RA Micro 007, Rigaku Europe）に取り付けたＣＣＤ検出器（SATURN 944+, Rigaku Europe）を用いて社内で収集した。
【0145】
得られた回折データをＸＤＳＧＵＩプログラムを用いて処理し、スケーリングし、マージした。ＴｆＱＣ結晶は三斜晶系空間群Ｐ１に属し、細胞定数はａ＝５６．１Å、ｂ＝７９．２Å、ｃ＝８３．１Å、α＝８９．９°、β＝９０°、γ＝７１．９°である。それらは４分子のＴｆＱＣを不斉単位に含み、２．１Åに回折する。
【0146】
推定したＴｆＱＣ構造の初期相をＣＣＰ４結晶学的スイート由来のＰＨＡＳＥＲ ＭＲを用いた分子置換により得た。これらのソリューション戦略では、適当な探索モデルが生成されるに違いない。なぜなら、この時点ではＴｆＱＣのモデルは存在しなかったからである。当該モデルは、ＰＨＥＮＩＸスイートのＰｒｏｇｒａｍ ＳＣＵＬＰＴＯＲを用いる側鎖剪定により、ＰＱ５０を有するＰｇＱＣの最初のモデルから調製された。最終的なＴｆＱＣモデルは、プログラムＣＯＯＴを用いた手動再構築及びＰＨＥＮＩＸ．ＲＥＦＩＮＥを用いた最尤精緻化のサイクルを繰り返した後に得られた。Ｒｗｏｒｋ値が０．１９３８、Ｒｆｒｅｅ値が０．２４０４に絞り込まれた。
【0147】
ＩＩＩ．グルタミニルシクラーゼ活性の蛍光定量
ＱＣ活性は、（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇら、２００２に既に記載されているように）基質としてＨ－Ｇｌｎ－ＡＭＣを用いて評価した。
ＱＣ活性は、（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇら、２００２に既に記載されているように）基質としてＨ－Ｇｌｎ－ＡＭＣを用いて評価した。
【0148】
当該アッセイは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ中、ｐＨ８．０で、様々な濃度の蛍光発生基質及び０．５Ｕのピログルタミニルアミノペプチダーゼからなる。１０分間の３０℃でのインキュベーション時間の後、最終容量１２５μｌの反応混合物にｂａｃＱＣを添加することにより、反応を開始した。励起／発光波長は３８０／４６０ｎｍであり、ｂａｃＱＣ活性はアッセイ条件下でフルオロフォアＡＭＣの標準曲線から測定した。すべての測定は、FluoStar Optima(BMG Labtech)を用いて３０℃で９６ウェルマイクロタイタープレート（Fisher Scientific）で行った。動態データはＧｒａＦｉｔソフトウェア（Version 7, Erithacus software Ltd., Horley, UK）を用いて評価した。
【0149】
図３は、Ｈ－Ｇｌｎ－ＡＭＣのＰｇＱＣ（Ａ）、ＰｉＱＣ（Ｂ）及びＴｆＱＣ（Ｃ）触媒環化のLineweaver-Burkプロットを示す。挿入図は、Lineweaver-Burk評価で得られた勾配の二次プロットを示す。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ中、３０℃でｂａｃＱＣ活性測定を実施した。動態データはＧｒａＦｉｔソフトウェア（Version 7, Erithacus software Ltd., Horley, UK）を用いて評価した。細菌ＱＣの酵素パラメータを決定した（表２）。これはｈＱＣのものとは異なる（Schilling, S., Manhart, S., Hoffmann, T., Ludwig, H.-H., Wasternack, C., and Demuth, H.-U. Biol. Chem. 2003, 384, 1583-1592）。
表２：細菌ＱＣによるＨ－Ｇｌｎ－ＡＭＣの変換の速度論的パラメータ。速度論的パラメータの決定を、３０℃で５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ８及び５０ｍＭ ＮａＣｌで行った。
表２：細菌ＱＣによるＨ－Ｇｌｎ－ＡＭＣの変換の速度論的パラメータ。速度論的パラメータの決定を、３０℃で５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ８及び５０ｍＭ ＮａＣｌで行った。
【0150】
【表2】
[結論]精製組換えタンパク質の酵素活性を、基質としてＨ－Ｇｌｎ－ＡＭＣを用いた蛍光測定アッセイを用いて試験した。Ｈ－Ｇｌｎ－ＡＭＣを基質として、当該細菌タンパク質をターンオーバーした結果、ＲＦＵが増加し、反応速度が高まった（図３）。基質としてのＨ－Ｇｌｎ－ＡＭＣに対するＰｇＱＣ及びＰｉＱＣの親和性は、この基質に対するｈＱＣの親和性の約１０分の１である。ＴｆＱＣのＫｍ値は、実際にはｈＱＣのＫｍ値の２０倍である。さらに、細菌タンパク質の効率は、ＰｉＱＣがＰｇＱＣ又はＴｆＱＣと比較して代謝回転数が２倍高いｈＱＣの効率と類似するようである。
【0151】
ＩＶ．11細菌のグルタミニルシクラーゼ活性の阻害剤アッセイ
阻害剤試験の試料組成物は、推定阻害化合物の添加を除き、上記と同様であった。これにより、反応混合物中に１％又は２％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯが存在した。阻害定数は、１／４Ｋｍ～２Ｋｍの異なる濃度のＨ－Ｇｌｎ－ＡＭＣを用いて決定し、細菌ＱＣの最終濃度は２５ｎＭ～５０ｎＭの範囲であった。ＧｒａＦｉｔソフトウェア（Version 7, Erithacus software Ltd., Horley, UK）を用いて、一連の進行曲線を競合阻害の一般式に適合させることにより、阻害定数を評価した。
阻害剤試験の試料組成物は、推定阻害化合物の添加を除き、上記と同様であった。これにより、反応混合物中に１％又は２％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯが存在した。阻害定数は、１／４Ｋｍ～２Ｋｍの異なる濃度のＨ－Ｇｌｎ－ＡＭＣを用いて決定し、細菌ＱＣの最終濃度は２５ｎＭ～５０ｎＭの範囲であった。ＧｒａＦｉｔソフトウェア（Version 7, Erithacus software Ltd., Horley, UK）を用いて、一連の進行曲線を競合阻害の一般式に適合させることにより、阻害定数を評価した。
【0152】
図４は、参照化合物ＭＷＴ－Ｓ－００４３１（（３，５－ジクロロフェニル－１，４，６，７－テトラヒドロ－５Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－５－イル）メタノン）の（●）１μＭ、（□）０．５μＭ、（□）０．２５μＭ、（△）０．１２５μＭ及び（▲）０．０６３μＭの存在下でのH-Gln-AMC (A) の PgQC 触媒環化反応の例示的な v/S 特性、Lineweaver-Burk および Eadie-Hofstee プロットを示す。（○）は、阻害剤を含まない反応を表す。定量は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．０及び１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中、３０℃で行った。表３に示す速度論的パラメータを得た。
表３：参照化合物ＭＷＴ－Ｓ－００４３１の存在下におけるＰｇＱＣによるＨ－Ｇｌｎ－ＡＭＣの変換阻害の速度論的パラメーター
表３：参照化合物ＭＷＴ－Ｓ－００４３１の存在下におけるＰｇＱＣによるＨ－Ｇｌｎ－ＡＭＣの変換阻害の速度論的パラメーター
【0153】
【表3】
Ｖ．化合物によるグルタミニルシクラーゼの阻害
以下の化合物を、以下の合成方法の説明に記載されているように合成した。（上記のように単離及び精製された）ＰｇＱＣ、ＴｆＱＣ、ＰｉＱＣ及びｈＱＣの阻害に関する平均Ｋｉ値を、上記の阻害剤アッセイを用いて測定し、以下に示す。Ｋｉは上記のように測定された平均Ｋｉ値、Ｓｔｄ（Ｋｉ）はＫｉの標準偏差を表す。
表４：ｂａｃＱＣ阻害剤によるＰｇＱＣ、ＴｆＱＣ、ＰｉＱＣ及びｈＱＣの阻害
【0154】
【表4】
【0155】
【表5】
【0156】
【表6】
[結論]本発明の化合物は全て、細菌のグルタミニルシクラーゼに対して阻害活性を示す。上記の結果は、当該化合物及び／又はその医薬組成物が歯周疾患及び関連疾患の治療に有用であることを示す。特に、当該化合物及び／又はその医薬組成物は、歯周疾患を誘発する病原体（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔ．ｆｏｒｓｙｔｈｉａ及びＰ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）を選択的に標的化できる一方で、ヒト酵素には本質的に不活性である。
【0157】
さらに、天然に存在するバイオフィルムの残存部が実質的に保存されるべき場合が見出された。さらにより好ましくは、当該化合物及び／又は医薬組成物は、標的病原体に対して高いインビボ活性を示すはずである。
【0158】
さらに、前記病原体がバイオフィルム（例えば、複雑なバイオフィルム、天然のバイオフィルム、又は天然の経口バイオフィルム）内に埋め込まれた場合、バイオフィルム内の残りの細菌は、好ましくは、本発明による化合物に実質的に影響を受けない（すなわち、殺傷される、又はその増殖が有意に小さく阻害される）ことが見出された。
【0159】
上記の実験データから分かるように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジンコアが６位で置換される場合（すなわち、実施例２のように、式Ｉによる）、５位で置換される場合（すなわち、実施例１のように、フロムラＩＩによる）とは対照的に、特に高い阻害活性を達成することができる。それにもかかわらず、いずれの場合も、ｈＱＣヒト酵素に対する有意なｂａｃＱＣ阻害活性及びＰｇＱＣに対する選択性が観察された（表５）。
表５．実施例１及び２の化合物の阻害パラメータの比較
表５．実施例１及び２の化合物の阻害パラメータの比較
【0160】
【表7】
最後に、ＰｉＱＣと他の２つのｂａｃＱＣとの間の比較的高度の相同性（図１に示すように）を考慮すると、本発明の方法を用いると、ＰｇＱＣ及び／又はＴｆＱＣの阻害剤として同定された化合物は、有意なＰｉＱＣ活性を示すことも期待できる（上記の表６の実験データにより証明されるように）。
【0161】
ＶＩ．ｓｅｑＱＣ－’ＰｈｏＡ活性の測定
図５は、ｓｅｑＱＣ－’ＰｈｏＡ融合タンパク質を発現する透過処理した大腸菌ＣＣ１１８ ｐＧＰ１－２細胞におけるＰｈｏＡ活性を示す。天然の推定シグナル配列含有ＰｇＱＣを、ｐＥＣＤ６３７においてクローニングし、ｓｅｑＰｇＱＣ－’ＰｈｏＡ融合タンパク質を作製した。得られたベクターを大腸菌株ＣＣ１１８ ｐＧＰ１－２で形質転換した。融合タンパク質の発現は、培養物を４２℃で２０分間インキュベーションすることにより開始した。誘導された培養物のＰｈｏＡ活性は、上記の通りに測定した（Pribyl, T., Topologie des CzcCBA-Efflux-Komplexes aus Ralstonia metallidurans CH34. Dissertation, 2001, Martin-Luther-University Halle-Wittenberg）。黒色バーは、ｓｅｑＰｇＱＣ－｀ＰｈｏＡを発現する細胞のＰｈｏＡ活性を示し、斜線バーは、｀ＢｌａＭ－｀ＰｈｏＡ’を発現する細胞のＰｈｏＡ活性を示し、陽性対照として機能し、インサートなしで発現されたベクターを陰性対照として用いた（黒色バー）。
図５は、ｓｅｑＱＣ－’ＰｈｏＡ融合タンパク質を発現する透過処理した大腸菌ＣＣ１１８ ｐＧＰ１－２細胞におけるＰｈｏＡ活性を示す。天然の推定シグナル配列含有ＰｇＱＣを、ｐＥＣＤ６３７においてクローニングし、ｓｅｑＰｇＱＣ－’ＰｈｏＡ融合タンパク質を作製した。得られたベクターを大腸菌株ＣＣ１１８ ｐＧＰ１－２で形質転換した。融合タンパク質の発現は、培養物を４２℃で２０分間インキュベーションすることにより開始した。誘導された培養物のＰｈｏＡ活性は、上記の通りに測定した（Pribyl, T., Topologie des CzcCBA-Efflux-Komplexes aus Ralstonia metallidurans CH34. Dissertation, 2001, Martin-Luther-University Halle-Wittenberg）。黒色バーは、ｓｅｑＰｇＱＣ－｀ＰｈｏＡを発現する細胞のＰｈｏＡ活性を示し、斜線バーは、｀ＢｌａＭ－｀ＰｈｏＡ’を発現する細胞のＰｈｏＡ活性を示し、陽性対照として機能し、インサートなしで発現されたベクターを陰性対照として用いた（黒色バー）。
【0162】
ＰｈｏＡ活性は、発色基質ｐ－ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）（Pribyl,2001）を用いて上記のように増殖させた培養物から測定した。従って、ＯＤ６００が既知である２００μｌの細胞懸濁液を、４℃で１０分間、１３０００ｒｐｍで回収した。細胞ペレットを、０．５ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４及び１ｍＭヨードアセトアミド中で洗浄した。得られた細胞ペレットを、１ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２及び１ｍＭのヨードアセトアミド中に再懸濁した。次いで、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ５０μｌ及びクロロホルム５０μｌを混合物に添加し、続いて３７℃で５分間インキュベーションした。次いで、１００μｌの基質溶液（１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．４％（ｗ／ｖ）ＰＮＰＰ）の添加により反応を開始した。反応混合物をさらに、溶液が黄色になるまで３７℃でインキュベーションした。次いで、１２０μｌの１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０の添加により反応を停止した。黄色発色に要する時間は、特異的な酵素的ＰｈｏＡ活性を規定した。細胞破片を遠心分離（１３０００ｒｐｍ、２０分）により除去し、４２０ｎｍでの光学密度を上清で測定した。ＰｈｏＡ活性はLambert-Beerの法則に従って測定した。空ベクターｐＥＣＤ６３７含有大腸菌ＣＣ１１８ ｐＧＰ１－２培養物を陰性対照として用い、ｐＥＣＤ６１９含有大腸菌ＣＣ１１８ ｐＧＰ１－２（Pribyl, 2001）を陽性対照として用いた。このプラスミドは｀ｐｈｏＡドメインの下流にある短い形態のβ‐ラクタマーゼ（‘ｂｌａＭ）含有シグナル配列をコードする。
【0163】
[結論]ＰｇＱＣのオープンリーディングフレームのインシリコ分析は、推定シグナル配列を明らかにした。これは、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓにおける細胞質外でのＰｇＱＣの局在を示す。アルカリホスファターゼ（ＰｈｏＡ）含有ＰｇＱＣ包含「ネイティブ」シグナル配列のＣ末端融合物を構築し、ＰｇＱＣの「自然」局在性を検討した。アルカリホスファターゼとの融合は、ペリプラズムに局在する場合にのみ活性がある。ｓｅｑＰｇＱＣ－‘ＰｈｏＡの発現により、６３８．５Ｕ／ｌ±５０．９の高ホスファターゼ活性が得られた（図５）。これは、ＰｇＱＣがペリプラズムに局在することを示す。
【0164】
ＶＩＩ．合成方法の説明
ａ）５－置換イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジンアミンの合成
６－クロロピリジン－２，３－ジアミンを高温でオルトギ酸トリエチルで処理して、５－クロロイミダゾ［４，５－ｂ］ピリジンを獲得する工程（Ａ１）；その後、適当なＰｄ－触媒及び塩基の存在下で、工程Ａ１からの生成物を各アミンと交差カップリングさせて、対応する５－置換イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジンアミンを獲得する工程（Ａ２）、を含む一般的な方法により、５－置換イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジンアミンを調製した。
ａ）５－置換イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジンアミンの合成
６－クロロピリジン－２，３－ジアミンを高温でオルトギ酸トリエチルで処理して、５－クロロイミダゾ［４，５－ｂ］ピリジンを獲得する工程（Ａ１）；その後、適当なＰｄ－触媒及び塩基の存在下で、工程Ａ１からの生成物を各アミンと交差カップリングさせて、対応する５－置換イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジンアミンを獲得する工程（Ａ２）、を含む一般的な方法により、５－置換イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジンアミンを調製した。
【0165】
実施例１の化合物は、下記のスキーム１に示すように、上記の方法により調製された。
【0166】
【化18】
スキーム１：実施例１の調製用合成スキーム
〔実施例１〕Ｎ－ベンジルミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－５－アミン
工程Ａ１：５－クロロイミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン
６－クロロピリジン－２，３－ジアミン（７１８ｍｇ、５ミリモル）のメタノール（１０ｍｌ）及びオルトギ酸トリエチル（１０ｍｌ）溶液を３時間加熱還流した。揮発性物質を蒸発させ、残渣をＣＨＣｌ３－ＭｅＯＨ勾配を用いるシリカ上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収量：５４０ｍｇ（５８％）；ＥＳＩ－ＭＳｍ／ｚ１５１．１［Ｍ＋Ｈ］＋
工程Ａ２：Ｎ－ベンジリミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－５－アミン
５－クロロ［４，５－ｂ］ピリジン（２０７ｍｇ、１．１ミリモル、１当量）、DavePhos（１０ｍｇ、０．０２６４ミリモル、０．２５当量）及びＰｄ２（ｄｂａ）３（９ｍｇ、０．０１１ミリモル、０．１当量）を、アルゴン雰囲気下、乾燥ＴＨＦ（１５ｍｌ）に溶解した。ＬｉＮ（ＴＭＳ）２（ＴＨＦ中１Ｍ、２．４ｍｌ、２．４ミリモル、２．２当量）及びベンジルアミン（１４４μｌ、１．３ミリモル、１．２当量）を添加し、混合物を６５℃で１８時間撹拌した。室温に冷却した後、混合物を水性ＨＣｌ（５Ｎ）により酸性化し、撹拌をさらに１０分間続けた。反応混合物を飽和水性ＮａＨＣＯ３に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（３×２５ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層をＭｇＣＯ３上で乾燥し、蒸発乾固した。残渣を半分取ＨＰＬＣで精製した。収率：９０ｍｇ（２４％）；
【0167】
【化19】
ｂ）６－置換イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジンアミンの合成
６－置換イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジンアミンは、以下の工程：２－クロロ－３，５－ジニトロピリジンを適当な溶媒又は溶媒混合物中でアンモニアで処理して３，５－ジニトロピリジン－２－アミンを獲得する工程（Ｂ１）；工程Ｂ１で得られた生成物を（ＮＨ４）２Ｓで処理して５－ニトロピリジン－２，３－ジアミンを獲得する工程（Ｂ２）；工程Ｂ２で得られた生成物をトリエチルオルトギ酸で処理して６－ニトロイミダゾ［４，５－ｂ］ピリジンを獲得する工程（Ｂ３）；工程Ｂ３で得られた生成物を適当な還元剤で処理してイミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミンを得る工程（Ｂ４）；その後、工程Ｂ４で得られた生成物を、ＮａＢＨ４等の適当な還元剤の存在下で各アルデヒドで処理して、対応するＮ－アリクリミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミンを得る工程（Ｂ５）を含む一般的な方法により調製した。
【0168】
上記の一般的な方法による合成経路は、下記のスキーム２に例示される。
【0169】
【化20】
スキーム２：６－置換イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジンアミンの合成スキーム
ａａ）イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミンの合成
工程Ｂ１：３，５－ジニトロピリジン－２－アミン
エタノール（１５０ｍｌ）中の２－クロロ－３，５－ジニトロピリジン（５ｇ、２４．６ミリモル、１当量）の溶液を、ＮＨ３水溶液（７ｍｌ、１２３ミリモル、５当量）で０℃で滴下処理した。完全に添加した後、混合物を周囲温度で１時間撹拌した。固体生成物を濾過により回収して乾燥させた。化合物はさらに精製せずに用いた。収量：４．１７ｇ（９２％）
工程Ｂ２：５－ニトロピリジン－２，３－ジアミン
３，５－ジニトロピリジン－２－アミン（３．９ｇ、２１．２ミリモル、１当量）のメタノール（８０ｍＬ）溶液を２０％水性（ＮＨ４）２Ｓ（３６．１ｍＬ、１０６ミリモル、５当量）で処理し、１時間加熱還流した。冷却後、固体を濾過により回収して乾燥させた。化合物はさらに精製せずに用いた。収量：３．２ｇ（９８％）；
【0170】
【化21】
工程３：６－ニトロイミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン
メタノール（１４ｍｌ）及びオルトギ酸トリエチル（１４ｍｌ）中の５－ニトロピリジン－２，３－ジアミン（２．７ｇ、１７．５ミリモル）の溶液を、マイクロ波中１５０℃で１０分間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をさらに精製せずに用いた。収量：２．６４ｇ（９２％）；ＥＳＩ－ＭＳｍ／ｚ：１６５．１［Ｍ＋Ｈ］＋、ＨＰＬＣ（勾配Ａ）：ｒｔ６．２１分、１００％
工程４：イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン
６－ニトロイミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン（１２４０ｍｇ、７．５ミリモル、１当量）の水性塩酸（１０％）溶液をＳｎＣｌ２（５０７６ｍｇ、２２．５ミリモル、３当量）で処理し、マイクロ波中１００℃に３０分間加熱した。室温に冷却した後、混合物を水性ＮａＯＨ（１Ｍ）により塩基性化し、蒸発させた。残渣をＭｅＯＨ中に懸濁し、濾過した。濾液を蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ勾配、０．５％ＮＨ３）により精製した。収率：９９３ｍｇ（９８％）；ＥＳＩ－ＭＳｍ／ｚ：１３５．２［Ｍ＋Ｈ］＋；ＨＰＬＣ（勾配Ａ）：ｒｔ１．４７分、１００％
ｂｂ）Ｎ－アリクリミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミンの一般的合成法
工程５：Ｎ－アリクリミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン
イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（１当量）及び各アルデヒド（１当量）をＥｔＯＨ（５ｍｌ）に溶解し、室温で４時間撹拌した。ＮａＢＨ４（１．５当量）を添加し、撹拌を一晩続けた。反応を水を用いてクエンチし、ＥｔＯＡｃ（３×２０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、蒸発させた。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ勾配）で精製した。
【0171】
以下の６－置換イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジンアミンの実施例を、上記の方法を用いて調製した。
【0172】
〔実施例２〕Ｎ－ベンジリミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン
化合物は、上記のように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（５０ｍｇ、０．４ミリモル）及びベンズアルデヒド（３８μｌ、０．４ミリモル）から出発して合成された。収量：３０ｍｇ（３６％）；
化合物は、上記のように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（５０ｍｇ、０．４ミリモル）及びベンズアルデヒド（３８μｌ、０．４ミリモル）から出発して合成された。収量：３０ｍｇ（３６％）；
【0173】
【化22】
〔実施例３〕Ｎ－（３，４，５－トリフルオロベンジル）イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン
化合物は、上記のように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（６７ｍｇ、０．５ミリモル）及び３，４，５－トリフルオロベンズアルデヒド（８０ｍｇ、０．５ミリモル）から出発して合成された。収量：７４ｍｇ（５３％）；
【0174】
【化23】
〔実施例４〕Ｎ－（４－クロロベンジル）イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン
化合物は、上記のように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（５０ｍｇ、０．４ミリモル）及び４－クロロベンズアルデヒド（５２ｍｇ、０．４ミリモル）から出発して合成した。収量：４８ｍｇ（５０％）；
【0175】
【化24】
〔実施例５〕Ｎ－（３－クロロベンジル）イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン
化合物は、上記のように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（５０ｍｇ、０．４ミリモル）及び３－クロロベンズアルデヒド（４２μｌ、０．４ミリモル）から出発して合成した。収量：７０ｍｇ（７３％）；
【0176】
【化25】
〔実施例６〕Ｎ－（３－メトキシベンジル）イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン
化合物は、上記のように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（５０ｍｇ、０．４ミリモル）及び３－メトキシベンズアルデヒド（４６μｌ、０．４ミリモル）から出発して合成した。収量：４０ｍｇ（４２％）；
【0177】
【化26】
〔実施例７〕Ｎ－（４－メトキシベンジル）イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン
化合物は、上記のように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（５０ｍｇ、０．４ミリモル）及び３－メトキシベンズアルデヒド（４６μｌ、０．４ミリモル）から出発して合成した。収量：２５ｍｇ（２６％）；
【0178】
【化27】
〔実施例８〕Ｎ－（３－チエニルメチル）イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン
化合物は、上記のように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（５０ｍｇ、０．４ミリモル）及びチオフェン－３－カルボアルデヒド（３３μｌ、０．４ミリモル）から出発して合成した。収量：６０ｍｇ（７０％）；
【0179】
【化28】
〔実施例９〕Ｎ－（３－（１－ピペリジル）ベンジル）イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン
化合物は、上記のように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（５０ｍｇ、０．４ミリモル）及び３－（１－ピペリジル）ベンズアルデヒド（７１ｍｇ、０．４ミリモル）から出発して合成された。収量：５６ｍｇ（４９％）；
【0180】
【化29】
〔実施例１０〕Ｎ－（２－ピリジルメチル）イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン
化合物は、上記のように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（５０ｍｇ、０．４ミリモル）及びピリジン－２－カルボアルデヒド（３５μｌ、０．４ミリモル）から出発して合成した。収量：６ｍｇ（７％）；
【0181】
【化30】
〔実施例１１〕Ｎ－（３－ピリジルメチル）イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン
化合物は、上記のように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（５０ｍｇ、０．４ミリモル）及びピリジン－３－カルボアルデヒド（３５μｌ、０．４ミリモル）から出発して合成した。収量：１５ｍｇ（１８％）；
【0182】
【化31】
〔実施例１２〕Ｎ－（２，３－ジヒドロ－１，４－ベンゾジオキシン－６－イル－メチル）イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン
化合物は、上記のように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（５０ｍｇ、０．４ミリモル）及び１，４－ベンゾジオキサン－６－カルボアルデヒド（６１ｍｇ、０．４ミリモル）から出発して合成した。収量：２１ｍｇ（２０％）；
【0183】
【化32】
〔実施例１３〕Ｎ－（３，４－ジメトキシベンジル）イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン化合物は、上記のように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（１３４ｍｇ、１ミリモル）及び３，４－ジメトキシベンズアルデヒド（１６６ｍｇ、１ミリモル）から出発して合成された。収量：９０ｍｇ（３２％）；
【0184】
【化33】
〔実施例１４〕Ｎ－（３，４－ジクロロベンジル）イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン
化合物は、上記のように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（５０ｍｇ、０．４ミリモル）及び３，４－ジクロロベンズアルデヒド（６５ｍｇ、０．４ミリモル）から出発して合成した。収量：７５ｍｇ（６９％）；
【0185】
【化34】
〔実施例１５〕Ｎ－（４－プロポキシベンジル）イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン
化合物は、上記のように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（１３４ｍｇ、１ミリモル）及び４－プロポキシベンズアルデヒド（１５８μｌ、１ミリモル）から出発して合成された。収量：１１０ｍｇ（３９％）；
【0186】
【化35】
〔実施例１６〕Ｎ－（４－（２－アミノエトキシ）ベンジル）イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン
化合物は、上記のように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（２６８ｍｇ、２ミリモル）及びＮ－Ｂｏｃ－（４－（２－アミノエトキシ）ベンズアルデヒド（５３１ｍｇ、２ミリモル）から出発して合成し、次いで、ＴＦＡ／ＤＣＭ（１：１，２ｍｌ）及びＴＩＳ（１００μｌ）を用いてＢｏｃ－脱保護し、半分取ＨＰＬＣにより精製した。収量：５３ｍｇ（９％）；
【0187】
【化36】
〔実施例１７〕１－（２－（４－（（イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－イルアミノ）メチル）－フェノキシ）エチル）グアニジン
ＤＭＦ中のＮ－（４－（２－アミノエトキシ）ベンジル）イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン＊ＴＦＡ（４１ｍｇ、０．０８ミリモル、１当量）の溶液を、Ｎ，Ｎ’－ビス（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｓ－メチルイソチオ尿素（２３ｍｇ、０．０８ミリモル、１当量）、ＤＭＡＰ（１ｍｇ、０．００８ミリモル、０．１当量）及びＴＥＡ（３３μｌ、０．２４ミリモル、３当量）で処理した。混合物を室温で１６時間撹拌し、水でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（３×２０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層をＭｇＣＯ３上で乾燥し、蒸発させた。Ｂｏｃ脱保護を、ＴＦＡ／ＤＣＭ（１：１、２ｍｌ）及びＴＩＳ（１００μｌ）を用いて実施した。揮発性物質を蒸発させ、残渣を半分取ＨＰＬＣで精製した。収量：１８ｍｇ（４１％）；
【0188】
【化37】
〔実施例１８〕Ｎ－［（４－イソプロポキシフェニル）メチル］－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン
化合物は、上記のように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（６７ｍｇ、０．５ミリモル）及び４－イソプロポキシベンズアルデヒド（７８μｌ、０．５ミリモル）から出発して合成された。収量：６ｍｇ（４％）；
【0189】
【化38】
〔実施例１９〕Ｎ－［（３－フェノキシフェニル）メチル］－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン
化合物は、上記のように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（５０ｍｇ、０．４ミリモル）及び３－フェノキシベンズアルデヒド（６４μｌ、０．４ミリモル）から出発して合成した。収量：１９ｍｇ（１６％）；
【0190】
【化39】
〔実施例２０〕Ｎ－［（４－ベンジルオキシフェニル）メチル］－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン
化合物は、上記のように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（５０ｍｇ、０．４ミリモル）及び３－ベンジルオキシベンズアルデヒド（７９ｍｇ、０．４ミリモル）から出発して合成した。収量：４７ｍｇ（３８％）；
【0191】
【化40】
〔実施例２１〕Ｎ－［（４－ビフェニル）メチル］－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン
化合物は、上記のように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（５０ｍｇ、０．４ミリモル）及び４－ビフェニルカルボキシアルデヒド（６８ｍｇ、０．４ミリモル）から出発して合成した。収量：３０ｍｇ（２７％）；
【0192】
【化41】
〔実施例２２〕Ｎ－［（２，６－ジフルオロ－４－メトキシ－フェニル）メチル］－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン
化合物は、上記のように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（６７ｍｇ、０．５ミリモル）及び２，６－ジフルオロ－４－メトキシベンズアルデヒド（８６ｍｇ、０．４ミリモル）から出発して合成された。収率：７７ｍｇ（５３％）；
【0193】
【化42】
〔実施例２３〕Ｎ－［（７－メトキシ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）メチル］－３Ｈ－イミダゾ－［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン
化合物は、上記のように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（６０ｍｇ、０．４５ミリモル）及び５－メトキシピペロナール（８１ｍｇ、０．４５ミリモル）から出発して合成した。収量：４４ｍｇ（３３％）；
【0194】
【化43】
〔実施例２４〕Ｎ－［（２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）メチル］－３Ｈ－イミダゾ－［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン
化合物は、上記のように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（６７ｍｇ、０．５ミリモル）及び２，２－ジフルオロ－１，３－ベンゾジオキソール－５－カルボキシアルデヒド（９３ｍｇ、０．５ミリモル）から出発して合成された。収量：６０ｍｇ（４０％）；
【0195】
【化44】
〔実施例２５〕Ｎ－［［４－（２－ピリジル）フェニル］メチル］－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン
化合物は、上記のように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（６７ｍｇ、０．５ミリモル）及び４－（２－ピリジル）ベンズアルデヒド（９２ｍｇ、０．５ミリモル）から出発して合成された。収量：２５ｍｇ（１７％）；
【0196】
【化45】
〔実施例２６〕Ｎ－［［４－（２－モルホリノエトキシ）フェニル］メチル］－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン
化合物は、上記のように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（６７ｍｇ、０．５ミリモル）及び４－（２－モルホリノエトキシ）ベンズアルデヒド（１１８ｍｇ、０．５ミリモル）から出発して合成された。収率：２１ｍｇ（１２％）；
【0197】
【化46】
〔実施例２７〕Ｎ－［（４－モルホリノフェニル）メチル］－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン
化合物は、上記のように、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（６７ｍｇ、０．５ミリモル）及び４－（４－モルホリニル）ベンズアルデヒド（９６ｍｇ、０．５ミリモル）から出発して合成された。収量：４２ｍｇ（２６％）；
【0198】
【化47】
ｃｃ）Ｎ－ベンジリミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン－ポルフィリン結合体の合成の一般的手順
工程Ｃ１：
イミダゾ［４、５‐ｂ］ピリジン‐６‐アミン（１当量）をＭｅＯＨ又はＥｔＯＨ（ｃ＝０．０５～０．０８Ｍ）に溶解した。各アルデヒドを添加し、混合物を、ＴＬＣが出発物質の完全なターンオーバーを示すまで室温で撹拌した。それぞれ、ＮａＢＨ４（１．５当量）（Ｒａ／ｂ＝１Ｈの場合）又はＮａＢＤ４（１．７当量）（Ｒａ／ｂ＝Ｄの場合）を慎重に添加し、一晩撹拌を続けた。揮発性物質を蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（Ａｌ２Ｏ３、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ勾配）により精製した。
精製した生成物をＭｅＯＨ（ｃ＝０．０６～０．１２Ｍ）に溶解し、新しく調製したＭｅＯＨ（１６当量）中の１Ｍ ＨＣｌで処理した。室温で３時間撹拌した後、揮発性物質を蒸発させ、残渣はさらに精製せずに用いた。
【0199】
【化48】
スキーム３：Ｎ－ベンジリミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン－ポルフィリン結合体の合成のための例示的合成スキーム
工程Ｃ２：
工程Ｃ１により得られたＮ－［［４－（２－アミノエトキシ）フェニル］－メチル］－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン又はＮ－［［４－（２－アミノエトキシ）－フェニル］ジデュテリオ－メチル］－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－アミン（１当量）をジメチルホルムアミド（ｃ＝０．１～０．１３Ｍ）に溶解し、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ（１．２当量）、ＴＢＴＵ（１．２当量）及びＤＩＰＥＡ（４当量）を添加し、混合物を室温で４－５時間撹拌した。水を添加し、ＥｔＯＡｃ（３×１００ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、蒸発させた。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（Ａｌ２Ｏ３、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ勾配）により精製した。
【0200】
工程Ｃ３：
工程Ｃ２（１当量）により得られた各生成物をジメチルホルムアミド（ｃ＝０．０３Ｍ）に溶解し、ＤＢＵ（１当量）で処理し、室温で３０～４０分間撹拌した。適当なポルフィリン（１．２当量）、ＨＯＢｔ（１．２当量）、ＴＢＴＵ（１当量）及びＤＩＰＥＡ（４当量）をジメチルホルムアミドに溶解し、室温で５０分間予め混合し、溶液に添加した。混合物を室温で一晩撹拌した。ＴＦＡ／ＤＣＭ（１：１ｖ／ｖ、１０ｍｌ）の添加により反応を慎重に停止し、撹拌を４５分間続けた。揮発性物質を蒸発させ、粗混合物を直接半分取ＨＰＬＣにかけた。
工程Ｃ２（１当量）により得られた各生成物をジメチルホルムアミド（ｃ＝０．０３Ｍ）に溶解し、ＤＢＵ（１当量）で処理し、室温で３０～４０分間撹拌した。適当なポルフィリン（１．２当量）、ＨＯＢｔ（１．２当量）、ＴＢＴＵ（１当量）及びＤＩＰＥＡ（４当量）をジメチルホルムアミドに溶解し、室温で５０分間予め混合し、溶液に添加した。混合物を室温で一晩撹拌した。ＴＦＡ／ＤＣＭ（１：１ｖ／ｖ、１０ｍｌ）の添加により反応を慎重に停止し、撹拌を４５分間続けた。揮発性物質を蒸発させ、粗混合物を直接半分取ＨＰＬＣにかけた。
【0201】
〔実施例２８〕３－［（１Ｚ、４Ｚ、９Ｚ、１５Ｚ）－１８－［３－［［（１Ｓ）－５－アミノ－１－［２－［４－［（３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－イルアミノ）メチル］フェノキシ］－エチルカルバモイル］ペンチル］アミノ］－３－オキソ－プロピル］－３，８，１３，１７－テトラメチル－２１，２３－ジヒドロポルフィリン－２－イル］－プロパン酸
【0202】
【化49】
〔実施例２９〕３－［（４Ｚ、１０Ｚ、１５Ｚ、１９Ｚ）－１８－［３－［［（１Ｓ）－５－アミノ－１－［２－［４－［ｄｉｄｅｕｔｅｒｉｏ－（１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－６－イルアミノ）－メチル］フェノキシ］エチルカルバモイル］ペンチル］アミノ］－３－オキソ－プロピル］－３，８，１３，１７－テトラメチル－２２，２４－ジヒドロ－ポルフィリン－２－イル］プロパン酸
【0203】
【化50】
Ｃ）分析方法
ＨＰＬＣ：分析ＨＰＬＣシステムは、ＬＵＮＡ ＲＰ １８（５μｍ）、分析カラム（長さ：１２５ｍｍ、直径：４ｍｍ）、及び報告波長がλ＝２１４ｎｍであるダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を利用するＭｅｒｃｋ‐Ｈｉｔａｃｈｉデバイス（モデルＬａＣｈｒｏｍ）から構成された。化合物を１ｍＬ／分の流速で勾配を用いて分析し、溶離剤（Ａ）がアセトニトリルであり、溶離剤（Ｂ）が水であり、両者とも０．０４％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含み、次の勾配のいずれかを適用した：勾配Ａ：０分～５％（Ａ）、１５分～６０％（Ａ）、２０分～９５％（Ａ）、３０分～９５％（Ａ）、３１分～５％（Ａ）、３５分～５％（Ａ）
勾配Ｂ：０分～１％（Ａ）、５分～１％（Ａ）、２０分～２０％（Ａ）、３０分～９５％（Ａ）、３４分～９５％（Ａ）、３５分～１％（Ａ）、３７分～１％（Ａ）
すべての報告された化合物の純度は、２１４ｎｍでのピーク面積の比率により決定された。
【0204】
質量分析：ＳＣＩＥＸ ＡＰＩ １２００分光計（Perkin Elmer）又は式ＣＭＳ（アドバイス）を用いて、ＥＳＩ及びＡＰＣＩ－Ｍａｓｓスペクトルを得た。
【0205】
ＮＭＲ分光法：１Ｈ ＮＭＲスペクトルをAgilent DD2 400MHz分光計で記録した。化学シフトは、テトラメチルシランからの百万分率（ｐｐｍ）ダウンフィールドで表される。分割パターンは、ｓ（一重項）、ｄ（二重項）、ｄｄ（二重項）、ｔ（三重項）、ｍ（多重項）及びｂｒ（広いシグナル）と指定されている。
【産業上の利用可能性】
【0206】
本発明による結晶及び共結晶は、治療標的タンパク質（細菌性グルタミニルシクラーゼ、ｂａｃＱＣ）の結晶であり、ｂａｃＱＣの結合ポケットに関連し得る候補化合物を同定する方法を用いて、歯周炎誘発病原体の選択的標的法が可能な阻害剤の同定に、特異的かつ実質的に用いることができる。したがって、結晶は、特定の疾患、例えば歯周炎の治療に関連し、従って、産業上の利用可能性に影響されやすい。
【0207】
本発明によるｂａｃＱＣの結合ポケットに関連し得る及び／又はｂａｃＱＣ阻害剤である候補化合物を同定する方法は、歯周炎の発生に対するｂａｃＱＣ酵素の薬学的関連性及び本明細書で示される歯周病原体の成長に対するそれらが必須であることを考慮すると、工業的に適用可能である。
【0208】
ｂａｃＱＣの結合ポケットと会合し得る、及び／又はｂａｃＱＣ阻害剤である候補化合物を同定する方法により同定された化合物を含む、本発明による化合物、並びに本発明による医薬組成物はまた、ヒト又は動物の体の治療方法、特に細菌感染の治療又は予防の方法、例えばＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ及びＴａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａからなる群から選択される細菌により生じる細菌感染、及び／又は急性、慢性又は再発性歯周疾患、例えば歯周炎の治療又は予防の方法で用いられるため、産業上の利用可能性がある。
【0209】
本結果をもたらした研究活動は、欧州連合の支援を受けたものである。
【図1(A)】
【図1(B)】
【図1(C)】
【図1(D)】
【図2】
【図3(A)】
【図3(B)】
【図3(C)】
【図4】
【図5】
【図6(A)】
【図6(B)】
【図6(C)】
【図6(D)】
【図7(A)】
【図7(B)】
【図7(C)】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】