特許 7301921 プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン（ＰＣＳＫ９）遺伝子関連障害を治療するための方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-06-23

(45)【発行日】2023-07-03

(54)【発明の名称】プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン（ＰＣＳＫ９）遺伝子関連障害を治療するための方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20230626BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20230626BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20230626BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20230626BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230626BHJP

   A61K 31/712 20060101ALI20230626BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20230626BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20230626BHJP

   C07K 16/40 20060101ALN20230626BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20230626BHJP

   A61K 39/395 20060101ALN20230626BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00 ZNA

A61P3/06

A61K31/713

A61K47/54

A61P43/00 111

A61K31/712

A61K31/7125

C12N15/113 130Z

C07K16/40

C12N15/13

A61K39/395 N

A61K39/395 D

【請求項の数】 25

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2021144546

(22)【出願日】2021-09-06

(62)【分割の表示】P 2018510350の分割

【原出願日】2016-08-25

(65)【公開番号】P2022000433

(43)【公開日】2022-01-04

【審査請求日】2021-10-04

(31)【優先権主張番号】62/209,526

(32)【優先日】2015-08-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】505369158

【氏名又は名称】アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＡＬＮＹＬＡＭ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(72)【発明者】

【氏名】ケビン・フィッツジェラルド

【審査官】六笠 紀子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１５／０７７１５４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２００９－５０８４７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００９－５２１４７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１４／０８９３１３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】The Lancet，2013年10月03日，383(9911)，p.60-68

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ３１／３３－３３／４４

Ａ６１Ｐ ３／０６

Ａ６１Ｋ ４７／５４

Ａ６１Ｋ ４５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

皮下投与のための医薬組成物を含む注射デバイスであって、ここで前記組成物が、２７５ｍｇ～３２５ｍｇの二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤またはその塩の一定用量を含み、
ここで前記二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＣｆｓａＡｆＡｆＡｆｇＣｆａＡｆａＡｆｃＡｆｇＧｆｕＣｆｕａｇｓａｓａ－３’（配列番号６８８）を含み、かつ前記センス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓｕｓａｇａｃＣｆｕＧｆｕｄＴｕｕｇｃｕｕｕｕｇｕ－３’（配列番号６８７）を含み、
ここで、式中、ａ、ｇ、ｃおよびｕはそれぞれ２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、ＣｆおよびＵｆはそれぞれ２’－フルオロＡ、Ｇ、ＣおよびＵであり；ｄＴは２’－デオキシチミジンであり；かつｓはホスホロチオエート結合であり、かつ
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤がＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）３リガンドに結合される、ここで、（ＧａｌＮＡｃ）３リガンドが、

【化1】

である、注射デバイス。

【請求項2】

前記センス鎖が５’－ｃｓｕｓａｇａｃＣｆｕＧｆｕｄＴｕｕｇｃｕｕｕｕｇｕＬ９６－３’のヌクレオチド配列（配列番号６８３）を含み、かつ前記アンチセンス鎖が５’－ａｓＣｆｓａＡｆＡｆＡｆｇＣｆａＡｆａＡｆｃＡｆｇＧｆｕＣｆｕａｇｓａｓａ－３’（配列番号６８８）のヌクレオチド配列を含み、
ここで式中、ａ、ｇ、ｃおよびｕはそれぞれ２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、ＣｆおよびＵｆはそれぞれ２’－フルオロＡ、Ｇ、ＣおよびＵであり；ｄＴは２’－デオキシチミジンであり；かつｓはホスホロチオエート結合であり、かつＬ９６は

【化2】

であり、
Ｌ９６が、以下の模式図に示されるセンス鎖の３’末端に結合され、

【化3】

ここでＸがＯである、
請求項１に記載の注射デバイス。

【請求項3】

前記（ＧａｌＮＡｃ）３リガンドが、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤の前記センス鎖の３’末端に結合される、請求項１に記載の注射デバイス。

【請求項4】

前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、以下の模式図

【化4】

（式中、ＸはＯである）に示される通りの前記（ＧａｌＮＡｃ）３リガンドに結合される、請求項１に記載の注射デバイス。

【請求項5】

前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が塩形態である、請求項１に記載の注射デバイス。

【請求項6】

前記組成物が非緩衝溶液で前記二本鎖ＲＮＡｉ剤またはその塩を含む、請求項１に記載の注射デバイス。

【請求項7】

前記非緩衝溶液が、生理食塩水または水である、請求項６に記載の注射デバイス。

【請求項8】

前記組成物が緩衝液中で前記二本鎖ＲＮＡｉ剤またはその塩を含む、請求項１に記載の注射デバイス。

【請求項9】

前記緩衝液が、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、もしくはリン酸塩またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項８に記載の注射デバイス。

【請求項10】

前記緩衝液が、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である、請求項９に記載の注射デバイス。

【請求項11】

前記医薬組成物が、ヒト対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する方法における使用のための医薬組成物である、請求項１に記載の注射デバイス。

【請求項12】

前記ヒト対象が高コレステロール血症を有する、請求項１１に記載の注射デバイス。

【請求項13】

前記医薬組成物が、ヒト対象の血清における低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬｃ）のレベルを低下させる方法における使用のための医薬組成物である、請求項１に記載の注射デバイス。

【請求項14】

前記医薬組成物が、心血管疾患に関連する１つ以上のリスク因子を有するヒト対象の血清における低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬｃ）のレベルを低下させる方法における使用のためのものであり、ここで、前記１つ以上のリスク因子が、糖尿病、冠動脈心疾患（ＣＨＤ）または無冠動脈のアテローム動脈硬化症の過去の個人歴、心血管疾患の家族歴、タバコ使用、高血圧症、および／または肥満を含む、
請求項１に記載の注射デバイス。

【請求項15】

前記ヒト対象が、動脈硬化症、冠動脈疾患、心臓弁疾患、不整脈、心不全、高血圧、起立性低血圧、ショック、心内膜炎、大動脈およびその分枝の疾患、末梢血管系の障害、心臓発作、心筋症、および先天性心疾患からなる群から選択される心血管疾患に関連する１つ以上のリスク因子を有する、請求項１４に記載の注射デバイス。

【請求項16】

前記医薬組成物が、ヒト対象における高脂血症を治療する方法における使用のための医薬組成物である、請求項１に記載の注射デバイス。

【請求項17】

前記高脂血症が高コレステロール血症である、請求項１６に記載の注射デバイス。

【請求項18】

前記医薬組成物が３００ｍｇの前記二本鎖ＲＮＡｉ剤またはその塩の一定用量を含む、請求項１に記載の注射デバイス。

【請求項19】

前記医薬組成物が３００ｍｇの前記二本鎖ＲＮＡｉ剤またはその塩の一定用量を含み、前記組成物が四半期ごとに１回で投与される医薬組成物である、請求項１に記載の注射デバイス。

【請求項20】

前記医薬組成物が３００ｍｇの前記二本鎖ＲＮＡｉ剤またはその塩の一定用量を含み、前記組成物が６か月ごとに１回投与される医薬組成物である、請求項１に記載の注射デバイス。

【請求項21】

前記組成物が、維持段階が続く負荷段階を含む投与計画において投与される医薬組成物である、請求項１に記載の注射デバイス。

【請求項22】

負荷段階中に投与される用量が、維持段階中に投与される用量と同じである、請求項２１に記載の注射デバイス。

【請求項23】

前記医薬組成物が、維持段階中に６か月ごとに１回投与される医薬組成物である、請求項２２に記載の注射デバイス。

【請求項24】

３００ｍｇの前記二本鎖ＲＮＡｉ剤またはその塩の一定用量を含む前記医薬組成物が負荷段階中に投与されるものであり、かつ前記二本鎖ＲＮＡｉ剤またはその塩の同一の一定用量を含む前記組成物が維持段階中に６か月ごとに１回投与される、請求項１に記載の注射デバイス。

【請求項25】

ａ）請求項１～２４のいずれか一項に記載の注射デバイス、および
ｂ）使用説明書、
を含む、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本願は、２０１５年８月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／２０９，５２６号明細書に対する優先権の利益を主張し、その内容全体は参照により本明細書中に援用される。

【0002】

本願は、２０１２年１２月５日に出願された米国仮特許出願第６１／７３３，５１８号明細書；２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７９３，５３０号明細書；２０１３年１０月４日に出願された米国仮特許出願第６１／８８６，９１６号明細書；２０１３年１０月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／８９２，１８８号明細書；２０１３年１２月５日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７３３４９号明細書；および２０１５年６月５日に出願された米国特許出願第１４／６５０，１２８号明細書に関する。前述の特許出願の各々の内容全体はここで参照により本明細書中に援用される。

【0003】

配列表
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されている配列表を含み、ここでその全体が参照により援用される。２０１６年８月２４日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１２１３０１－０４４２０＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、サイズが１８８，２１８バイトである。

【背景技術】

【0004】

プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）は、サブチリシンセリンプロテアーゼファミリーのメンバーである。他の８つの哺乳動物サブチリシンプロテアーゼＰＣＳＫ１～ＰＣＳＫ８（ＰＣ１／３、ＰＣ２、フューリン、ＰＣ４、ＰＣ５／６、ＰＡＣＥ４、ＰＣ７、およびＳ１Ｐ／ＳＫＩ－１とも称される）は、分泌経路における多種多様なタンパク質を処理し、多様な生物学的過程における役割を担うプロタンパク質転換酵素である（（非特許文献１）、（非特許文献２）、（非特許文献３）、（非特許文献４）、および（非特許文献５））。

【0005】

ＰＣＳＫ９は、コレステロール代謝における役割を担うことが提唱されている。コレステロール生合成酵素および低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）と同様、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの発現は、マウスにおける食事性コレステロール摂食により下方制御され（非特許文献６）、ＨｅｐＧ２細胞内でスタチンにより上方制御され（非特許文献７）、またステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）トランスジェニックマウスにおいて上方制御される（非特許文献８）。さらに、ＰＣＳＫ９のミスセンス変異が、常染色体優性高コレステロール血症（Ｈｃｈｏｌａ３）の形態に関連することが見出されている（（非特許文献９）、（非特許文献１０）、（非特許文献１１））。一塩基多型（ＳＮＰ）が日本人集団におけるコレステロールレベルに関連していることから、ＰＣＳＫ９は、一般集団におけるＬＤＬコレステロールレベルを決定する上での役割も担うことがある（非特許文献１２）。

【0006】

常染色体優性高コレステロール血症（ＡＤＨ）は、患者が総およびＬＤＬコレステロールレベルの上昇、腱黄色腫、および早発性アテローム動脈硬化症を呈する単一遺伝子性疾患である（非特許文献１３）。ＡＤＨおよび劣性形態の常染色体劣性高コレステロール血症（ＡＲＨ）の病態形成（非特許文献１４）は、肝臓によるＬＤＬ取り込みにおける異常に起因する。ＡＤＨは、ＬＤＬ取り込みを阻止するＬＤＬＲ突然変異、またはＬＤＬＲに結合するＬＤＬ上のタンパク質、アポリポタンパク質Ｂにおける突然変異に起因する場合がある。ＡＲＨは、ＬＤＬＲ－ＬＤＬ複合体のそのクラスリンとの相互作用を介したエンドサイトーシスにとって必要であるＡＲＨタンパク質における突然変異に起因する。したがって、ＰＣＳＫ９突然変異がＨｃｈｏｌａ３ファミリーにおける原因となる場合、ＰＣＳＫ９が受容体媒介性ＬＤＬ取り込みにおける役割を担う可能性が高いように思われる。

【0007】

過剰発現試験では、ＬＤＬＲレベル、ひいては肝臓によるＬＤＬ取り込みを制御する上でのＰＣＳＫ９における役割が示される（（非特許文献１５）、（非特許文献１６）、（非特許文献１７））。マウスにおける３または４日間のマウスまたはヒトＰＣＳＫ９のアデノウイルス媒介性過剰発現は、総およびＬＤＬコレステロールレベルの上昇をもたらし；この効果はＬＤＬＲノックアウト動物において認められない（（非特許文献１５）、（非特許文献１６）、（非特許文献１７））。さらに、ＰＣＳＫ９の過剰発現は、ＬＤＬＲ ｍＲＮＡレベル、ＳＲＥＢＰタンパク質レベル、またはＳＲＥＢＰタンパク質核対細胞質比に影響することなく、肝臓ＬＤＬＲタンパク質における激減をもたらす。

【0008】

高コレステロール血症自体が無症候性である一方、血清コレステロールの長期にわたる上昇がアテローム動脈硬化症を引き起こし得る。数十年の期間にわたり、慢性的に上昇する血清コレステロールは、関与する動脈の進行性狭窄またはさらに完全閉鎖をもたらし得る、動脈におけるアテローム性プラークの形成に寄与する。さらに、より小さいプラークが、破裂し、血餅の形成を引き起こし、血流を閉塞させ、例えば心筋梗塞および／または脳卒中をもたらすことがある。狭窄または閉塞の形成が緩徐である場合、組織および臓器への血液供給は漸減し、臓器機能が障害されるようになる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【文献】Ｂｅｒｇｅｒｏｎ，Ｆ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２４，１－２２

【文献】Ｇｅｎｓｂｅｒｇ，Ｋ．，（１９９８）Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．９，１１－１７

【文献】Ｓｅｉｄａｈ，Ｎ．Ｇ．（１９９９）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．８４８，４５－６２

【文献】Ｔａｙｌｏｒ，Ｎ．Ａ．，（２００３）ＦＡＳＥＢ Ｊ．１７，１２１５－１２２７

【文献】Ｚｈｏｕ，Ａ．，（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２０７４５－２０７４８

【文献】Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｋ．Ｎ．，（２００３）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４４，２１０９－２１１９

【文献】Ｄｕｂｕｃ，Ｇ．，（２００４）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２４，１４５４－１４５９

【文献】Ｈｏｒｔｏｎ，Ｊ．Ｄ．，（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００，１２０２７－１２０３２

【文献】Ａｂｉｆａｄｅｌ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３４，１５４－１５６

【文献】Ｔｉｍｍｓ，Ｋ．Ｍ．，（２００４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１１４，３４９－３５３

【文献】Ｌｅｒｅｎ，Ｔ．Ｐ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．６５，４１９－４２２

【文献】Ｓｈｉｏｊｉ，Ｋ．，（２００４）Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４９，１０９－１１４

【文献】Ｒａｄｅｒ，Ｄ．Ｊ．，（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１，１７９５－１８０３

【文献】Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｃ．，（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１４，１２１－１２７

【文献】Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｋ．Ｎ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１，７１００－７１０５

【文献】Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，４８８６５－４８８７５

【文献】Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｗ．，（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，５０６３０－５０６３８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

したがって、当該技術分野では、ＰＣＳＫ９関連疾患、例えば高脂血症、例えば高コレステロール血症に対する有効な治療への必要性が存在する。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明は、少なくとも部分的には、化学修飾を含む二本鎖ＲＮＡｉ剤が単回用量でＰＣＳＫ９の発現を阻害するような例外的な効力および耐久性を示すという驚くべき発見に基づく。具体的には、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子、例えばヒトＰＣＳＫ９遺伝子のヌクレオチド３５４４～３６２３（配列番号１のヌクレオチド３５４４～３６２３）、例えば配列番号１のヌクレオチド３６０１～３６２３（ＧａｌＮＡｃリガンドを含む）を標的にするＲＮＡｉ剤が、単回一定用量、例えば約３００ｍｇ～約５００ｍｇの一定用量で、ＰＣＳＫ９遺伝子の活性を発現停止させる上で例外的に有効でありかつ耐久性があることが本明細書中で示される。

【0012】

したがって、本発明は、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための方法、およびＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害または低減することから利益を受けることになる障害、例えばＰＣＳＫ９の発現によって媒介される障害、例えば高脂血症、例えば高コレステロール血症を有する対象を、ＰＣＳＫ９遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介性切断をもたらすｉＲＮＡ組成物を用いて治療するための方法を提供する。

【0013】

一態様では、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための本発明の方法、およびＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害または低減することから利益を受けることになる障害、例えばＰＣＳＫ９の発現によって媒介される障害、例えば高脂血症、例えば高コレステロール血症を有する対象を治療するための方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を約２５ｍｇ～約８００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列とは３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含み、かつアンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列とは３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含み、ここでセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、センス鎖は３’末端で付着されたリガンドに結合される。

【0014】

一態様では、本発明は、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を約２５ｍｇ～約８００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド３５４４～３６２３とは３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含む相補性領域を含み、それにより対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する。

【0015】

別の態様では、本発明は、対象における低密度リポタンパク質（ＬＤＬｃ）のレベルを低下させる方法であって、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を約２５ｍｇ～約８００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド３５４４～３６２３とは３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含む相補性領域を含み、それにより対象におけるＬＤＬｃのレベルを低下させる、方法を提供する。

【0016】

別の態様では、本発明は、ＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる障害を有する対象を治療する方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を約２５ｍｇ～約８００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド３５４４～３６２３とは３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含む相補性領域を含み、それによりＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる障害を有する対象を治療する。

【0017】

さらに別の態様では、本発明は、高脂血症を有する対象を治療する方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を約２５ｍｇ～約８００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド３５４４～３６２３とは３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含む相補性領域を含み、それにより高コレステロール血症を有する対象を治療する。

【0018】

一定用量は、週１回、２週ごとに１回、月１回、四半期ごとに１回、または半年ごとの間隔で対象に投与されてもよい。

【0019】

一実施形態では、対象に約２５ｍｇ～約５０ｍｇの一定用量が週１回投与される。別の実施形態では、対象に約５０ｍｇ～約１００ｍｇの一定用量が２週ごとに１回投与される。別の実施形態では、対象に約１００ｍｇ～約２００ｍｇの一定用量が月１回投与される。さらに別の実施形態では、対象に約３００ｍｇ～約８００ｍｇの一定用量が四半期ごとに１回投与される。別の実施形態では、対象に約３００ｍｇ～約８００ｍｇの一定用量が半年ごとに投与される。

【0020】

本発明はまた、ＲＮＡｉ剤が負荷段階および維持段階を含む投与計画で投与される方法を提供する。

【0021】

したがって、一態様では、本発明は、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を負荷段階とその後の維持段階を含む投与計画で対象に投与するステップを含み、ここで負荷段階は、ＲＮＡｉ剤を約２００ｍｇ～約６００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、また維持段階は、ＲＮＡｉ剤を約２５ｍｇ～約１００ｍｇの一定用量で月に約１回対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド３５４４～３６２３とは３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含む相補性領域を含み、それにより対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する。

【0022】

別の態様では、本発明は、対象における低密度リポタンパク質（ＬＤＬｃ）のレベルを低下させる方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を負荷段階とその後の維持段階を含む投与計画で対象に投与するステップを含み、ここで負荷段階は、ＲＮＡｉ剤を約２００ｍｇ～約６００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、また維持段階は、ＲＮＡｉ剤を約２５ｍｇ～約１００ｍｇの一定用量で月１回対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド３５４４～３６２３とは３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含む相補性領域を含み、それにより対象におけるＬＤＬｃのレベルを低下させる。

【0023】

別の態様では、本発明は、ＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる障害を有する対象を治療する方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を負荷段階とその後の維持段階を含む投与計画で対象に投与するステップを含み、ここで負荷段階は、ＲＮＡｉ剤を約２００ｍｇ～約６００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、また維持段階は、ＲＮＡｉ剤を約２５ｍｇ～約１００ｍｇの一定用量で月１回対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド３５４４～３６２３とは３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含む相補性領域を含み、それによりＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる障害を有する対象を治療する。

【0024】

さらに別の態様では、本発明は、高脂血症を有する対象を治療する方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を負荷段階とその後の維持段階を含む投与計画で対象に投与するステップを含み、ここで負荷段階は、ＲＮＡｉ剤を約２００ｍｇ～約６００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、また維持段階は、ＲＮＡｉ剤を約２５ｍｇ～約１００ｍｇの一定用量で月１回対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド３５４４～３６２３とは３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含む相補性領域を含み、それにより高脂血症を有する対象を治療する。

【0025】

二本鎖ＲＮＡｉ剤は、対象の皮下に、例えば皮下注射により、または筋肉内に投与されてもよい。

【0026】

一実施形態では、アンチセンス鎖は、表１で提示される非修飾ヌクレオチド配列のいずれか１つからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、配列番号１のヌクレオチド３６０１～３６２３を標的にする。一実施形態では、配列番号１のヌクレオチド３６０１～３６２３を標的にする作用物質はＡＤ－６０２１２である。

【0027】

一実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＡＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＵＣＵＡＧＡＡ－３’（配列番号６８５）を含む。

【0028】

一実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＣＵＡＧＡＣＣＵＧＵＴＵＵＧＣＵＵＵＵＧＵ－３’（配列番号６８６）を含む。

【0029】

一実施形態では、二本鎖リボ核酸ＲＮＡｉ剤は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。

【0030】

一実施形態では、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべては、修飾ヌクレオチドである。別の実施形態では、アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては、修飾ヌクレオチドである。さらに別の実施形態では、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては、修飾ヌクレオチドである。

【0031】

一実施形態では、センス鎖のヌクレオチドのすべては、修飾ヌクレオチドである。別の実施形態では、アンチセンス鎖のヌクレオチドのすべては、修飾ヌクレオチドである。さらに別の実施形態では、センス鎖のヌクレオチドのすべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドのすべては、修飾ヌクレオチドである。

【0032】

一態様では、本発明は、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を約２５ｍｇ～約８００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＡＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＵＣＵＡＧＡＡ－３’（配列番号６８５）を含み、かつセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＣＵＡＧＡＣＣＵＧＵＴＵＵＧＣＵＵＵＵＧＵ－３’（配列番号６８６）を含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、それにより対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する。

【0033】

別の態様では、本発明は、対象における低密度リポタンパク質（ＬＤＬｃ）のレベルを低下させる方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を約２５ｍｇ～約８００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＡＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＵＣＵＡＧＡＡ－３’（配列番号６８５）を含み、かつセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＣＵＡＧＡＣＣＵＧＵＴＵＵＧＣＵＵＵＵＧＵ－３’（配列番号６８６）を含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、それにより対象におけるＬＤＬｃのレベルを低下させる。

【0034】

別の態様では、本発明は、ＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる障害を有する対象を治療する方法であって、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を約２５ｍｇ～約８００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＡＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＵＣＵＡＧＡＡ－３’（配列番号６８５）を含み、かつセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＣＵＡＧＡＣＣＵＧＵＴＵＵＧＣＵＵＵＵＧＵ－３’（配列番号６８６）を含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、それによりＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる障害を有する対象を治療する、方法を提供する。

【0035】

さらに別の態様では、本発明は、高脂血症を有する対象を治療する方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を約２５ｍｇ～約８００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＡＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＵＣＵＡＧＡＡ－３’（配列番号６８５）を含み、かつセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＣＵＡＧＡＣＣＵＧＵＴＵＵＧＣＵＵＵＵＧＵ－３’（配列番号６８６）を含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、それにより高脂血症を有する対象を治療する。

【0036】

一態様では、本発明は、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を約２５ｍｇ～約８００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップと、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片を治療有効量で対象に投与するステップと、を含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＡＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＵＣＵＡＧＡＡ－３’（配列番号６８５）を含み、かつセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＣＵＡＧＡＣＣＵＧＵＴＵＵＧＣＵＵＵＵＧＵ－３’（配列番号６８６）を含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、それにより対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する。

【0037】

別の態様では、本発明は、対象における低密度リポタンパク質（ＬＤＬｃ）のレベルを低下させる方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を約２５ｍｇ～約８００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップと、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片を治療有効量で対象に投与するステップと、を含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＡＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＵＣＵＡＧＡＡ－３’（配列番号６８５）を含み、かつセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＣＵＡＧＡＣＣＵＧＵＴＵＵＧＣＵＵＵＵＧＵ－３’（配列番号６８６）を含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、それにより対象におけるＬＤＬｃのレベルを低下させる。

【0038】

別の態様では、本発明は、ＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる障害を有する対象を治療する方法であって、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を約２５ｍｇ～約８００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップと、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片を治療有効量で対象に投与するステップと、を含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＡＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＵＣＵＡＧＡＡ－３’（配列番号６８５）を含み、かつセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＣＵＡＧＡＣＣＵＧＵＴＵＵＧＣＵＵＵＵＧＵ－３’（配列番号６８６）を含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、それによりＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる障害を有する対象を治療する、方法を提供する。

【0039】

さらに別の態様では、本発明は、高脂血症を有する対象を治療する方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を約２５ｍｇ～約８００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップと、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片を治療有効量で対象に投与するステップと、を含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＡＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＵＣＵＡＧＡＡ－３’（配列番号６８５）を含み、かつセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＣＵＡＧＡＣＣＵＧＵＴＵＵＧＣＵＵＵＵＧＵ－３’（配列番号６８６）を含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、それにより高脂血症を有する対象を治療する。

【0040】

一定用量は、週１回、２週ごとに１回、月１回、四半期ごとに１回、または半年ごとの間隔で対象に投与されてもよい。

【0041】

一実施形態では、対象に約２５ｍｇ～約５０ｍｇの一定用量で週１回投与される。別の実施形態では、対象に約５０ｍｇ～約１００ｍｇの一定用量で２週ごとに１回投与される。別の実施形態では、対象に約１００ｍｇ～約２００ｍｇの一定用量で月１回投与される。さらに別の実施形態では、対象に約３００ｍｇ～約８００ｍｇの一定用量で四半期ごとに１回投与される。別の実施形態では、対象に約３００ｍｇ～約８００ｍｇの一定用量で半年ごとに投与される。

【0042】

一態様では、本発明は、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を負荷段階とその後の維持段階を含む投与計画で対象に投与するステップを含み、ここで負荷段階は、ＲＮＡｉ剤を約２００ｍｇ～約６００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、また維持段階は、ＲＮＡｉ剤を約２５ｍｇ～約１００ｍｇの一定用量で四半期ごとに１回対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＡＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＵＣＵＡＧＡＡ－３’（配列番号６８５）を含み、かつセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＣＵＡＧＡＣＣＵＧＵＴＵＵＧＣＵＵＵＵＧＵ－３’（配列番号６８６）を含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、それにより対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する。

【0043】

別の態様では、本発明は、対象における低密度リポタンパク質（ＬＤＬｃ）のレベルを低下させる方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を負荷段階とその後の維持段階を含む投与計画で対象に投与するステップを含み、ここで負荷段階は、ＲＮＡｉ剤を約２００ｍｇ～約６００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、また維持段階は、ＲＮＡｉ剤を約２５ｍｇ～約１００ｍｇの一定用量で四半期ごとに１回対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＡＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＵＣＵＡＧＡＡ－３’（配列番号６８５）を含み、かつセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＣＵＡＧＡＣＣＵＧＵＴＵＵＧＣＵＵＵＵＧＵ－３’（配列番号６８６）を含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、それにより対象におけるＬＤＬｃのレベルを低下させる。

【0044】

別の態様では、本発明は、ＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる障害を有する対象を治療する方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を負荷段階とその後の維持段階を含む投与計画で対象に投与するステップを含み、ここで負荷段階は、ＲＮＡｉ剤を約２００ｍｇ～約６００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、また維持段階は、ＲＮＡｉ剤を約２５ｍｇ～約１００ｍｇの一定用量で四半期ごとに１回対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＡＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＵＣＵＡＧＡＡ－３’（配列番号６８５）を含み、かつセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＣＵＡＧＡＣＣＵＧＵＴＵＵＧＣＵＵＵＵＧＵ－３’（配列番号６８６）を含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、それによりＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる障害を有する対象を治療する。

【0045】

さらに別の態様では、本発明は、高脂血症を有する対象を治療する方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を負荷段階とその後の維持段階を含む投与計画で対象に投与するステップを含み、ここで負荷段階は、ＲＮＡｉ剤を約２００ｍｇ～約６００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、また維持段階は、ＲＮＡｉ剤を約２５ｍｇ～約１００ｍｇの一定用量で四半期ごとに１回対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＡＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＵＣＵＡＧＡＡ－３’（配列番号６８５）を含み、かつセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＣＵＡＧＡＣＣＵＧＵＴＵＵＧＣＵＵＵＵＧＵ－３’（配列番号６８６）を含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、それにより高脂血症を有する対象を治療する。

【0046】

一態様では、本発明は、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を負荷段階とその後の維持段階を含む投与計画で対象に投与するステップと、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片を治療有効量で対象に投与するステップと、を含み、ここで負荷段階は、ＲＮＡｉ剤を約２００ｍｇ～約６００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、また維持段階は、ＲＮＡｉ剤を約２５ｍｇ～約１００ｍｇの一定用量で四半期ごとに１回対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＡＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＵＣＵＡＧＡＡ－３’（配列番号６８５）を含み、かつセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＣＵＡＧＡＣＣＵＧＵＴＵＵＧＣＵＵＵＵＧＵ－３’（配列番号６８６）を含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、それにより対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する。

【0047】

別の態様では、本発明は、対象における低密度リポタンパク質（ＬＤＬｃ）のレベルを低下させる方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を負荷段階とその後の維持段階を含む投与計画で対象に投与するステップと、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片を治療有効量で対象に投与するステップと、を含み、ここで負荷段階は、ＲＮＡｉ剤を約２００ｍｇ～約６００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、また維持段階は、ＲＮＡｉ剤を約２５ｍｇ～約１００ｍｇの一定用量で四半期ごとに１回対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＡＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＵＣＵＡＧＡＡ－３’（配列番号６８５）を含み、かつセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＣＵＡＧＡＣＣＵＧＵＴＵＵＧＣＵＵＵＵＧＵ－３’（配列番号６８６）を含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、それにより対象におけるＬＤＬｃのレベルを低下させる。

【0048】

別の態様では、本発明は、ＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる障害を有する対象を治療する方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を負荷段階とその後の維持段階を含む投与計画で対象に投与するステップと、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片を治療有効量で対象に投与するステップと、を含み、ここで負荷段階は、ＲＮＡｉ剤を約２００ｍｇ～約６００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、また維持段階は、ＲＮＡｉ剤を約２５ｍｇ～約１００ｍｇの一定用量で四半期ごとに１回対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＡＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＵＣＵＡＧＡＡ－３’（配列番号６８５）を含み、かつセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＣＵＡＧＡＣＣＵＧＵＴＵＵＧＣＵＵＵＵＧＵ－３’（配列番号６８６）を含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、それによりＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる障害を有する対象を治療する。

【0049】

さらに別の態様では、本発明は、高脂血症を有する対象を治療する方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を負荷段階とその後の維持段階を含む投与計画で対象に投与するステップと、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片を治療有効量で対象に投与するステップと、を含み、ここで負荷段階は、ＲＮＡｉ剤を約２００ｍｇ～約６００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、また維持段階は、ＲＮＡｉ剤を約２５ｍｇ～約１００ｍｇの一定用量で四半期ごとに１回対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＡＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＵＣＵＡＧＡＡ－３’（配列番号６８５）を含み、かつセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＣＵＡＧＡＣＣＵＧＵＴＵＵＧＣＵＵＵＵＧＵ－３’（配列番号６８６）を含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、それにより高脂血症を有する対象を治療する。

【0050】

一実施形態では、対象はヒトである。

【0051】

一実施形態では、ＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる障害は、高脂血症、例えば高コレステロール血症である。

【0052】

一実施形態では、高脂血症は、高コレステロール血症である。

【0053】

二本鎖ＲＮＡｉ剤は、対象の皮下に、例えば皮下注射により、または筋肉内に投与されてもよい。

【0054】

一実施形態では、センス鎖は、５’－ｃｓｕｓａｇａｃＣｆｕＧｆｕｄＴｕｕｇｃｕｕｕｕｇｕ－３’のヌクレオチド配列（配列番号６８７）を含み、かつアンチセンス鎖は、５’－ａｓＣｆｓａＡｆＡｆＡｆｇＣｆａＡｆａＡｆｃＡｆｇＧｆｕＣｆｕａｇｓａｓａ－３’のヌクレオチド配列（配列番号６８８）を含む（式中、Ａ、Ｇ、ｃおよびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、ＣｆまたはＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、ＣまたはＵであり；ｄＴは２’－デオキシチミジンであり；かつｓはホスホロチオエート結合である）（ＡＤ－６０２１２）。

【0055】

一実施形態では、二本鎖リボ核酸ＲＮＡｉ剤は、リガンドをさらに含む。

【0056】

一実施形態では、リガンドは、二本鎖リボ核酸ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の３’末端に結合される。

【0057】

一実施形態では、リガンドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である。

【0058】

一実施形態では、リガンドは、

【化1】

である。

【0059】

一実施形態では、二本鎖リボ核酸ＲＮＡｉ剤は、以下の模式図

【化2】

（式中、ＸはＯまたはＳである）に示される通りのリガンドに結合される。一実施形態では、ＸはＯである。

【0060】

一実施形態では、ＰＣＳＫ９の発現は、少なくとも約３０％阻害される。

【0061】

一実施形態では、本発明の方法は、対象のＬＤＬＲ遺伝子型または表現型を判定するステップをさらに含む。

【0062】

一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤を投与する結果、対象における血清コレステロールが減少し、かつ／またはＰＣＳＫ９タンパク質の蓄積が減少する。

【0063】

一実施形態では、本発明の方法は、対象における血清コレステロールレベルを測定するステップをさらに含む。

【0064】

一実施形態では、本発明の方法は、追加的な治療薬、例えばスタチンおよび／または抗ＰＣＳＫ９抗体を対象に投与するステップをさらに含む。一実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、アリロクマブ（プラルエント）、エボロクマブ（レパーサ）、およびボコシズマブからなる群から選択される。

【0065】

一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、医薬組成物として投与される。

【0066】

ＲＮＡｉ剤は、非緩衝溶液、例えば生理食塩水または水で投与されるか、または緩衝液とともに投与されてもよい。一実施形態では、緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、もしくはリン酸塩またはそれらの任意の組み合わせを含む。別の実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。

【0067】

一態様では、本発明は、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を約２５ｍｇ～約８００ｍｇの単回一定用量で対象に投与するステップと、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片を治療有効量で対象に投与するステップと、を含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、５’－ｃｓｕｓａｇａｃＣｆｕＧｆｕｄＴｕｕｇｃｕｕｕｕｇｕ－３’のヌクレオチド配列（配列番号６８７）を含み、かつアンチセンス鎖は、５’－ａｓＣｆｓａＡｆＡｆＡｆｇＣｆａＡｆａＡｆｃＡｆｇＧｆｕＣｆｕａｇｓａｓａ－３’のヌクレオチド配列（配列番号６８８）を含み（式中、Ａ、Ｇ、ｃおよびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、ＣｆまたはＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、ＣまたはＵであり；ｄＴは２’－デオキシチミジンであり；かつｓはホスホロチオエート結合である）（ＡＤ－６０２１２）、それにより対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する。

【0068】

別の態様では、本発明は、対象における低密度リポタンパク質（ＬＤＬｃ）のレベルを低下させる方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を約２５ｍｇ～約８００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップと、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片を治療有効量で対象に投与するステップと、を含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、５’－ｃｓｕｓａｇａｃＣｆｕＧｆｕｄＴｕｕｇｃｕｕｕｕｇｕ－３’のヌクレオチド配列（配列番号６８７）を含み、かつアンチセンス鎖は、５’－ａｓＣｆｓａＡｆＡｆＡｆｇＣｆａＡｆａＡｆｃＡｆｇＧｆｕＣｆｕａｇｓａｓａ－３’のヌクレオチド配列（配列番号６８８）を含み（式中、Ａ、Ｇ、ｃおよびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、ＣｆまたはＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、ＣまたはＵであり；ｄＴは２’－デオキシチミジンであり；かつｓはホスホロチオエート結合である）（ＡＤ－６０２１２）、それにより対象におけるＬＤＬｃのレベルを低下させる。

【0069】

別の態様では、本発明は、ＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる障害を有する対象を治療する方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を約２５ｍｇ～約８００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップと、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片を治療有効量で対象に投与するステップと、を含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、５’－ｃｓｕｓａｇａｃＣｆｕＧｆｕｄＴｕｕｇｃｕｕｕｕｇｕ－３’のヌクレオチド配列（配列番号６８７）を含み、かつアンチセンス鎖は、５’－ａｓＣｆｓａＡｆＡｆＡｆｇＣｆａＡｆａＡｆｃＡｆｇＧｆｕＣｆｕａｇｓａｓａ－３’のヌクレオチド配列（配列番号６８８）を含み（式中、Ａ、Ｇ、ｃおよびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、ＣｆまたはＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、ＣまたはＵであり；ｄＴは２’－デオキシチミジンであり；かつｓはホスホロチオエート結合である）（ＡＤ－６０２１２）、それによりＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる障害を有する対象を治療する。

【0070】

さらに別の態様では、本発明は、高脂血症を有する対象を治療する方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を約２５ｍｇ～約８００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップと、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片を治療有効量で対象に投与するステップと、を含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、５’－ｃｓｕｓａｇａｃＣｆｕＧｆｕｄＴｕｕｇｃｕｕｕｕｇｕ－３’のヌクレオチド配列（配列番号６８７）を含み、かつアンチセンス鎖は、５’－ａｓＣｆｓａＡｆＡｆＡｆｇＣｆａＡｆａＡｆｃＡｆｇＧｆｕＣｆｕａｇｓａｓａ－３’のヌクレオチド配列（配列番号６８８）を含み（式中、Ａ、Ｇ、ｃおよびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、ＣｆまたはＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、ＣまたはＵであり；ｄＴは２’－デオキシチミジンであり；かつｓはホスホロチオエート結合である）（ＡＤ－６０２１２）、それにより高脂血症を有する対象を治療する。

【0071】

一実施形態では、対象に約２００ｍｇ～約８００ｍｇの一定用量が四半期ごとに１回投与される。別の実施形態では、対象に約２００ｍｇ～約８００ｍｇの一定用量が半年ごとに投与される。

【0072】

一態様では、本発明は、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を負荷段階とその後の維持段階を含む投与計画で対象に投与するステップと、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片を治療有効量で対象に投与するステップと、を含み、ここで負荷段階は、ＲＮＡｉ剤を約２００ｍｇ～約６００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、また維持段階は、ＲＮＡｉ剤を約２５ｍｇ～約８００ｍｇの一定用量で四半期ごとに１回対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、５’－ｃｓｕｓａｇａｃＣｆｕＧｆｕｄＴｕｕｇｃｕｕｕｕｇｕ－３’のヌクレオチド配列（配列番号６８７）を含み、かつアンチセンス鎖は、５’－ａｓＣｆｓａＡｆＡｆＡｆｇＣｆａＡｆａＡｆｃＡｆｇＧｆｕＣｆｕａｇｓａｓａ－３’のヌクレオチド配列（配列番号６８８）を含み（式中、Ａ、Ｇ、ｃおよびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、ＣｆまたはＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、ＣまたはＵであり；ｄＴは２’－デオキシチミジンであり；かつｓはホスホロチオエート結合である）（ＡＤ－６０２１２）、それにより対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する。

【0073】

別の態様では、本発明は、対象における低密度リポタンパク質（ＬＤＬｃ）のレベルを低下させる方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を負荷段階とその後の維持段階を含む投与計画で対象に投与するステップと、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片を治療有効量で対象に投与するステップと、を含み、ここで負荷段階は、ＲＮＡｉ剤を約２００ｍｇ～約６００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、また維持段階は、ＲＮＡｉ剤を約２５ｍｇ～約１００ｍｇの一定用量で四半期ごとに１回対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、５’－ｃｓｕｓａｇａｃＣｆｕＧｆｕｄＴｕｕｇｃｕｕｕｕｇｕ－３’のヌクレオチド配列（配列番号６８７）を含み、かつアンチセンス鎖は、５’－ａｓＣｆｓａＡｆＡｆＡｆｇＣｆａＡｆａＡｆｃＡｆｇＧｆｕＣｆｕａｇｓａｓａ－３’のヌクレオチド配列（配列番号６８８）を含み（式中、Ａ、Ｇ、ｃおよびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、ＣｆまたはＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、ＣまたはＵであり；ｄＴは２’－デオキシチミジンであり；かつｓはホスホロチオエート結合である）（ＡＤ－６０２１２）、それにより対象におけるＬＤＬｃのレベルを低下させる。

【0074】

さらに別の態様では、本発明は、ＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる障害を有する対象を治療する方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を負荷段階とその後の維持段階を含む投与計画で対象に投与するステップと、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片を治療有効量で対象に投与するステップと、を含み、ここで負荷段階は、ＲＮＡｉ剤を約２００ｍｇ～約６００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、また維持段階は、ＲＮＡｉ剤を約２５ｍｇ～約１００ｍｇの一定用量で四半期ごとに１回対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、５’－ｃｓｕｓａｇａｃＣｆｕＧｆｕｄＴｕｕｇｃｕｕｕｕｇｕ－３’のヌクレオチド配列（配列番号６８７）を含み、かつアンチセンス鎖は、５’－ａｓＣｆｓａＡｆＡｆＡｆｇＣｆａＡｆａＡｆｃＡｆｇＧｆｕＣｆｕａｇｓａｓａ－３’のヌクレオチド配列（配列番号６８８）を含み（式中、Ａ、Ｇ、ｃおよびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、ＣｆまたはＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、ＣまたはＵであり；ｄＴは２’－デオキシチミジンであり；かつｓはホスホロチオエート結合である）（ＡＤ－６０２１２）、それによりＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる障害を有する対象を治療する。

【0075】

別の態様では、本発明は、高脂血症を有する対象を治療する方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を負荷段階とその後の維持段階を含む投与計画で対象に投与するステップと、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片を治療有効量で対象に投与するステップと、を含み、ここで負荷段階は、ＲＮＡｉ剤を約２００ｍｇ～約６００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、また維持段階は、ＲＮＡｉ剤を約２５ｍｇ～約１００ｍｇの一定用量で四半期ごとに１回対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、５’－ｃｓｕｓａｇａｃＣｆｕＧｆｕｄＴｕｕｇｃｕｕｕｕｇｕ－３’のヌクレオチド配列（配列番号６８７）を含み、かつアンチセンス鎖は、５’－ａｓＣｆｓａＡｆＡｆＡｆｇＣｆａＡｆａＡｆｃＡｆｇＧｆｕＣｆｕａｇｓａｓａ－３’のヌクレオチド配列（配列番号６８８）を含み（式中、Ａ、Ｇ、ｃおよびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、ＣｆまたはＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、ＣまたはＵであり；ｄＴは２’－デオキシチミジンであり；かつｓはホスホロチオエート結合である）（ＡＤ－６０２１２）、それにより高脂血症を有する対象を治療する。

【0076】

一実施形態では、対象に維持用量が約２００ｍｇ～約８００ｍｇの一定用量として四半期ごとに１回投与される。別の実施形態では、対象に維持用量が約２００ｍｇ～約８００ｍｇの一定用量として半年ごとに投与される。

【0077】

一実施形態では、二本鎖リボ核酸ＲＮＡｉ剤は、リガンドをさらに含む。

【0078】

一実施形態では、リガンドは、二本鎖リボ核酸ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の３’末端に結合される。

【0079】

一実施形態では、リガンドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である。

【0080】

一実施形態では、リガンドは、

【化3】

である。

【0081】

一実施形態では、二本鎖リボ核酸ＲＮＡｉ剤は、以下の模式図

【化4】

（式中、ＸはＯまたはＳである）に示される通りのリガンドに結合される。一実施形態では、ＸはＯである。

【0082】

一実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体、またはその抗原結合断片は、アリロクマブ（プラルエント）、エボロクマブ（レパーサ）、およびボコシズマブからなる群から選択される。

【0083】

一実施形態では、本方法は、追加的な治療薬、例えばスタチンを対象に投与するステップをさらに含む。

【0084】

一態様では、本発明は、本発明の方法を実行するためのキットを提供する。キットは、ＲＮＡｉ剤、および使用説明書、また任意選択的には、ＲＮＡｉ剤を対象に投与するための手段を含む。

【0085】

本発明は、以下の詳細な説明および図面により、さらに例示される。

【図面の簡単な説明】

【0086】

【図1】ＡＤ－６０２１２を単回一定用量で受ける対象における、ベースラインに対するパーセント平均ＰＣＳＫ９ノックダウンとして示される、ＰＣＳＫ９タンパク質レベルのノックダウンを示すグラフである。

【図2】ＡＤ－６０２１２を単回一定用量で受ける対象における、ベースラインに対するパーセント平均ＬＣＬ－Ｃ低下として示される、ＬＤＬ－ｃレベルの低下を示すグラフである。

【図3】ＡＤ－６０２１２を多回一定用量で受ける対象における、ベースラインに対するパーセント平均ＰＣＳＫ９ノックダウンとして示される、ＰＣＳＫ９タンパク質レベルのノックダウンを示すグラフである。

【図4】ＡＤ－６０２１２を多回一定用量で受ける対象における、ベースラインに対するパーセント平均ＬＣＬ－Ｃ低下として示される、ＬＤＬ－ｃレベルの低下を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0087】

本発明は、少なくとも部分的には、化学修飾を含む二本鎖ＲＮＡｉ剤が単回用量でＰＣＳＫ９の発現を阻害するような例外的な効力および耐久性を示すという驚くべき発見に基づく。具体的には、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子、例えばヒトＰＣＳＫ９遺伝子のヌクレオチド３５４４～３６２３（配列番号１のヌクレオチド３５４４～３６２３）、例えば配列番号１のヌクレオチド３６０１～３６２３（ＧａｌＮＡｃリガンドを含む）を標的にするＲＮＡｉ剤が、単回一定用量、例えば約３００ｍｇ～約５００ｍｇの一定用量で、ＰＣＳＫ９遺伝子の活性を発現停止させる上で例外的に有効でかつ耐久性があることが本明細書中で示される。

【0088】

したがって、本発明は、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための方法、およびＰＣＳＫ９の発現を阻害または低減することから利益を受けることになる障害、例えばＰＣＳＫ９の発現によって媒介される障害、例えば高脂血症、例えば高コレステロール血症を有する対象を、ＰＣＳＫ９遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介性切断をもたらすｉＲＮＡ組成物を用いて治療するための方法を提供する。

【0089】

以下の詳細な説明は、ＰＣＳＫ９遺伝子発現を阻害するｉＲＮＡを含有する組成物を作成して利用する方法、ならびこの遺伝子の発現の阻害および／または低下から利益を受ける疾患および障害を有する対象を治療するための組成物、使用、および方法を開示する。

【0090】

Ｉ．定義
本発明がより容易に理解されるように、特定の用語を最初に定義する。これに加えて、パラメータの値または値範囲が列挙される場合は常に、列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図されることに留意すべきである。

【0091】

冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の１つまたは２つ以上（すなわち少なくとも１つ）の文法的目的に言及するために、本明細書で使用される。一例として「因子（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの因子、または例えば複数の因子などの２つ以上の因子を意味する。

【0092】

「含む」という用語は、本明細書では、「をはじめとするが、これに限定されるものではない」という用語を意味するために使用され、またそれと区別なく使用される。

【0093】

「または」という用語は、本明細書では、文脈上、明確に別の意味でない限り、「および／または」という用語を意味するために使用され、またそれと区別なく使用される。例えば、「センス鎖またはアンチセンス鎖」は、「センス鎖もしくはアンチセンス鎖またはセンス鎖およびアンチセンス鎖」として理解される。

【0094】

用語「約」は、当該技術分野で許容される典型的範囲内を意味するように本明細書で用いられる。例えば、「約」は、平均からの約２標準偏差として理解され得る。特定の実施形態では、約は＋１０％を意味する。特定の実施形態では、約は＋５％を意味する。約が一連の数またはある範囲の前にあるとき、「約」が一連の数の各々または範囲を修飾し得ると理解される。

【0095】

ある数または一連の数に先立つ用語「少なくとも」は、文脈から明らかであるように、用語「少なくとも」に隣接する数、および論理的に包含され得るすべての後続する数または整数を含むように理解される。例えば、核酸分子中のヌクレオチドの数は整数でなければならない。例えば、「２１のヌクレオチド核酸分子の少なくとも１８のヌクレオチド」は、１８、１９、２０、または２１のヌクレオチドが指定される特性を有することを意味する。少なくともが一連の数またはある範囲の前に存在するとき、「少なくとも」が一連の数の各々または範囲を修飾し得ると理解される。

【0096】

本明細書で用いられるとき、「以下」または「未満」は、文脈からの論理として、０に至る、その語句に隣接する値および論理的により低い値または整数として理解される。例えば、「２以下のヌクレオチド」のオーバーハングを有する二本鎖は、２、１、または０のヌクレオチドオーバーハングを有する。「以下」が一連の数またはある範囲の前に存在するとき、「以下」が一連の数の各々または範囲を修飾し得ると理解される。

【0097】

本明細書で用いられるとき、「ＰＣＳＫ９」は、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型遺伝子またはタンパク質を指す。ＰＣＳＫ９は、ＦＨ３、ＨＣＨＯＬＡ３、ＮＡＲＣ－１、またはＮＡＲＣｌとしても公知である。ＰＣＳＫ９という用語は、ヒトＰＣＳＫ９（そのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、例えばジェンバンク受入番号ＧＩ：２９９５２３２４９（配列番号１）中に見出されることがある）；マウスＰＣＳＫ９（そのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、例えばジェンバンク受入番号ＧＩ：１６３６４４２５７中に見出されることがある）；ラットＰＣＳＫ９（そのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、例えばジェンバンク受入番号ＧＩ：７７０２０２４９中に見出されることがある）を含む。

【0098】

ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ配列のさらなる例が、公的に利用可能なデータベース、例えば、ジェンバンク、ＵｎｉＰｒｏｔ、およびＯＭＩＭを用いて容易に利用可能である。

【0099】

一実施形態では、対象は、ヒト、例えば、本明細書に記載の通り、ＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる疾患、障害もしくは状態について治療または評価を受けているヒト；ＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる疾患、障害もしくは状態に対するリスクがあるヒト；ＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる疾患、障害もしくは状態を有するヒト；および／またはＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる疾患、障害もしくは状態に対して治療を受けているヒトである。

【0100】

本明細書で用いられるとき、用語「治療する」または「治療」は、検出可能または検出不能にかかわらず、限定はされないが、ＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる障害に関連した１つ以上の症状の軽減または寛解、またはかかる障害の進行に対する緩徐化または復帰を含む、有利であるかまたは所望される結果を指す。例えば、高脂血症との関連では、治療は、血清脂質レベルの低下、例えば低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬｃ）の低下を含んでもよい。「治療」はまた、治療の不在下での予想される生存と比べての生存の延長を意味し得る。

【0101】

本明細書で用いられるとき、「予防」または「予防する」は、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現における減少から利益を受けることになるその疾患、障害もしくは状態に関連して用いられるとき、対象が、ＰＣＳＫ９の発現によって媒介される疾患、障害もしくは状態に伴う症状、例えば、心血管疾患、例えば冠動脈疾患（ＣＡＤ）（冠動脈心疾患（ＣＨＤ）としても公知）、または一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）もしくは脳卒中などの症状を発症する可能性における低下を指す。かかる症状を発症する可能性は、例えば、ＰＣＳＫ９の発現によって媒介される疾患、障害もしくは状態、例えば高コレステロール血症における１つ以上のリスク因子（例えば、糖尿病、ＣＨＤまたは無冠動脈のアテローム動脈硬化症（例えば、腹部大動脈瘤、末梢動脈疾患、および頸動脈狭窄）の過去の個人歴、例えば５０歳未満の男性近親者または６０歳未満の女性近親者における心血管疾患の家族歴、タバコ使用、高血圧症、および／または肥満（ＢＭＩ≧３０））を有する個体が、例えば冠動脈疾患を発症しないか、または例えば同じリスク因子を有しかつ本明細書に記載のような治療を受けていない集団に対して重症度がより低い冠動脈疾患を発症するかのいずれかであるとき、低下する。疾患、障害もしくは状態を発症しないこと、またはかかる疾患、障害もしくは状態に伴う症状の発症における低下（例えば、その疾患または障害に対して臨床的に認められた規模で少なくとも約１０％）、または（例えば、数日、数週、数か月または数年）遅延した後発症状を呈することは、有効な予防であると考えられる。予防は、２回以上用量の投与を必要とし得る。

【0102】

交換可能に用いられる用語「ＰＣＳＫ９関連疾患」および「ＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる障害」は、本明細書で用いられるとき、ＰＣＳＫ９遺伝子またはタンパク質に関連した任意の疾患、障害もしくは状態を含むように意図される。かかる疾患は、例えば、ＰＣＳＫ９タンパク質の過剰生成、ＰＣＳＫ９遺伝子の突然変異、ＰＣＳＫ９タンパク質の異常な切断、ＰＣＳＫ９と他のタンパク質または他の内因性もしくは外因性物質との異常な相互作用に起因することがある。例示的なＰＣＳＫ９関連疾患は、脂血症、例えば高脂血症、および他の形態の脂質不均衡、例えば高コレステロール血症、高中性脂肪血症およびこれらの障害に関連する病態、例えばＣＨＤおよびアテローム動脈硬化症を含む。

【0103】

本明細書で用いられるとき、用語「高コレステロール血症」は、対象の血清中に高レベルのコレステロール、例えば少なくとも約２４０ｍｇ／ｄＬの総コレステロールが存在する場合の高脂血症の形態（血液中の脂質レベルの上昇）を指す。

【0104】

本明細書で用いられるとき、用語「心血管疾患」は、例えば、動脈硬化症、冠動脈疾患（または動脈の狭窄）、心臓弁疾患、不整脈、心不全、高血圧、起立性低血圧、ショック、心内膜炎、大動脈およびその分枝の疾患、末梢血管系の障害、心臓発作、心筋症、および先天性心疾患を含む、心臓または血管を冒す疾患を指す。

【0105】

「治療有効量」は、本明細書で用いられるとき、ＰＣＳＫ９関連疾患を治療するために患者に投与されるとき、（例えば、既存の疾患または疾患の１つ以上の症状を軽減、寛解または維持することにより）疾患の治療をもたらすのに十分であるＲＮＡｉ剤の量を含むように意図される。「治療有効量」は、ＲＮＡｉ剤、作用物質がいかに投与されるか、疾患およびその重症度および病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、ＰＣＳＫ９発現によって媒介される病理学的過程の段階、（もしあれば）先行治療もしくは併用治療のタイプ、ならびに治療されるべき患者の他の個体特性に応じて変動してもよい。

【0106】

「予防有効量」は、本明細書で用いられるとき、ＰＣＳＫ９関連疾患の症状をまだ経ていないかまたは呈していないが、その疾患に罹りやすい可能性がある対象に投与されるとき、疾患または疾患の１つ以上の症状を予防または寛解するのに十分であるＲＮＡｉ剤の量を含むことが意図される。疾患を寛解することは、疾患の経過を緩徐化することまたは後発性疾患（ｌａｔｅｒ－ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）の重症度を低減することを含む。「予防有効量」は、ＲＮＡｉ剤、作用物質がいかに投与されるか、疾患リスクの程度、および病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、（もしあれば）先行治療もしくは併用治療のタイプ、ならびに治療されるべき患者の他の個体特性に応じて変動してもよい。

【0107】

「治療有効量」または「予防有効量」はまた、任意の治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比で幾らかの所望される局所的または全身的効果をもたらすＲＮＡｉ剤の量を含む。本発明の方法で用いられるＲＮＡｉ剤は、かかる治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比をもたらすのに十分な量で投与されてもよい。

【0108】

本明細書の用法では、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシング産物であるｍＲＮＡをはじめとする、ＰＣＳＫ９遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続部分を指す。一実施形態（ｅｍｂｏｄｍｅｎｔ）では、配列の標的部分は、ＰＣＳＫ９遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の部分またはその近辺における、ｉＲＮＡ指向切断のための基質としての役割を果たすのに、少なくとも十分長い。

【0109】

標的配列は、例えば約１５～３０ヌクレオチド長などの約９～３６ヌクレオチド長であってもよい。例えば、標的配列は、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４，２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチドなど、約１５～３０ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、標的配列は、約１９～約３０ヌクレオチド長である。他の実施形態では、標的配列は、約１９～約２５ヌクレオチド長である。さらに他の実施形態では、標的配列は、約１９～約２３ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、標的配列は、約２１～約２３ヌクレオチド長である。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。

【0110】

本明細書の用法では、「配列を含んでなる鎖」という用語は、標準ヌクレオチド命名法を使用して、言及される配列によって記載されるヌクレオチド鎖を含んでなる、オリゴヌクレオチドを指す。

【0111】

「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」、および「Ｕ」は、通常、塩基としてそれぞれグアニン、シトシン、アデニン、チミジン、およびウラシルを含有するヌクレオチドをそれぞれ表す。しかし「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語はまた、以下でさらに詳述されるような修飾ヌクレオチドにも、または代替置換部分にも言及し得るものと理解される（例えば表Ｂを参照されたい）。当業者は、このような置換部分を有するヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変更することなく、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルをその他の部分で置き換え得ることを十分承知している。制限を意図しない例として、塩基としてイノシンを含んでなるヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対形成し得る。したがってウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明で取り上げるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列中で、例えばイノシンを含有するヌクレオチドで置き換え得る。別の実施例では、アデニンおよびシトシンは、オリゴヌクレオチドのどこでも、それぞれグアニンおよびウラシルで置換され得て、標的ｍＲＮＡとＧ－Ｕゆらぎ塩基対を形成する。このような置換部分を含有する配列は、本発明で取り上げる組成物および方法に適する。

【0112】

「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、「ＲＮＡ干渉剤」という用語は、本明細書で同義的に使用され、本明細書定義で定義されるＲＮＡを含有して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を通じたＲＮＡ転写物の標的切断を媒介する薬剤を指す。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている過程を通じて、ｍＲＮＡの配列特異的分解を誘発する。ｉＲＮＡは、例えば哺乳類対象などの対象内の細胞などの細胞内で、ＰＣＳＫ９発現を調節し、例えば阻害する。

【0113】

一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤としては、例えばＰＣＳＫ９標的ｍＲＮＡ配列などの標的ＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を誘導する一本鎖ＲＮＡが挙げられる。理論による拘束は望まないが、細胞に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、ダイサーとして知られているＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによって、ｓｉＲＮＡに分解されると考えられる（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。リボヌクレアーゼ－ＩＩＩ様酵素であるダイサーは、ｄｓＲＮＡをプロセスして、特徴的な２塩基３’オーバーハングがある１９～２３塩基対の短い干渉ＲＮＡにする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。次にｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、１つまたは複数のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二本鎖を巻き戻し、相補的アンチセンス鎖が標的認識を誘導できるようにする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡとの結合に際して、ＲＩＳＣ内の１つまたは複数のエンドヌクレアーゼが標的を切断し、サイレンシングを誘発する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。したがって、一態様では、本発明は、細胞内で生成されて、ＲＩＳＣ複合体形成を促進し、標的遺伝子、すなわちＰＣＳＫ９遺伝子のサイレンシングをもたらす一本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に関する。したがって「ｓｉＲＮＡ」という用語はまた、上述したようなＲＮＡｉに言及するために、本明細書で使用される。

【0114】

別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、標的ｍＲＮＡを阻害するために、細胞または生物に導入された「一本鎖ｓｉＲＮＡ」であってもよい。一本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼのアルゴノート２に結合し、それは次に標的ｍＲＮＡを切断する。一本鎖ｓｉＲＮＡは、一般に１５～３０個のヌクレオチドであり、化学的に修飾されている。一本鎖ｓｉＲＮＡのデザインおよび試験は、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第８，１０１，３４８号明細書、およびＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０：８８３－８９４に記載される。本明細書に記載されるあらゆるアンチセンスヌクレオチド配列は、本明細書に記載される一本鎖ｓｉＲＮＡとして、またはＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０：８８３－８９４に記載される方法で化学的に修飾して、使用してもよい。

【0115】

別の実施形態では、本発明の組成物、使用、および方法で使用される「ｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡであり、本明細書で「二本鎖ＲＮＡｉ剤」、「二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子」、「ｄｓＲＮＡ剤」または「ｄｓＲＮＡ」と称される。「ｄｓＲＮＡ」という用語は、標的ＲＮＡ、すなわちＰＣＳＫ９遺伝子に関して「センス」および「アンチセンス」配向を有すると言及される、２本の逆平行で実質的に相補的な核酸鎖を含んでなる、二本鎖構造を有するリボ核酸分子複合体を指す。本発明のいくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、本明細書でＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉと称される転写後遺伝子サイレンシング機序を通じて、例えばｍＲＮＡなどの標的ＲＮＡ分解を引き起こす。

【0116】

一般に、ｄｓＲＮＡ分子の各鎖のヌクレオチドの大部分はリボヌクレオチドであるが、本明細書で詳述される通り、各鎖または両鎖はまた、１つ以上の非リボヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドを含み得る。さらに、本願中で用いられる通り、「ＲＮＡｉ剤」は化学修飾を有するリボヌクレオチドを含んでもよく；ＲＮＡｉ剤は複数のヌクレオチドに実質的修飾を含んでもよい。かかる修飾は、本明細書に開示されるかまたは当該技術分野で公知である修飾のあらゆるタイプを含んでもよい。任意のかかる修飾は、ｓｉＲＮＡ型分子中で用いられるとき、本明細書および特許請求の範囲を意図して「ＲＮＡｉ剤」によって包含される。

【0117】

二本鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を通じた所望の標的ＲＮＡ特異的分解を可能にするあらゆる長さであってもよく、約９～３６塩基対長さなどの範囲であってもよく、例えば約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６塩基対長さなどの約１５～３０塩基対長さ、例えば約１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４，２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対長さなどである。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。

【0118】

二本鎖構造を形成する２本の鎖は、より大型のＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、またはそれらは別のＲＮＡ分子であってもよい。２本の鎖が１つのより大型の分子の部分であり、したがって二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端と、それぞれの他方の鎖の５’末端との間が中断されていないヌクレオチド鎖によって結合される場合、結合ＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と称される。ヘアピンループは、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含んでなり得て；いくつかの実施形態では、ヘアピンループは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２３以上の不対ヌクレオチドを含んでなり得る。一部の実施形態では、ヘアピンループは、１０以下のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、ヘアピンループは、８以下の不対ヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、ヘアピンループは、４～１０の不対ヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、ヘアピンループは、４～８のヌクレオチドであり得る。

【0119】

ｄｓＲＮＡの２本の実質的に相補的な鎖が、別のＲＮＡ分子によって構成されている場合、これらの分子は共有結合的に連結され得るが、必ずしもそうである必要はない。２本の鎖が、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端と、それぞれの他方の鎖の５’末端との間で、中断されていないヌクレオチド鎖以外の手段によって共有結合される場合、結合構造は「リンカー」と称される。ＲＮＡ鎖は、同じまたは異なるヌクレオチド数を有してもよい。最大塩基対数は、ｄｓＲＮＡの最短鎖中のヌクレオチド数から、二本鎖中に存在するあらゆるオーバーハングを差し引いた数である。二本鎖構造に加えて、ＲＮＡｉは、１つまたは複数のヌクレオチドオーバーハングを含んでなってもよい。ＲＮＡｉ剤の一実施形態では、少なくとも１つの鎖は、少なくとも１つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。別の実施形態では、少なくとも１つの鎖は、少なくとも２つのヌクレオチド、例えば、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５のヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉ剤の少なくとも１つの鎖は、少なくとも１つのヌクレオチドの５’オーバーハングを含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの鎖は、少なくとも２つのヌクレオチド、例えば、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５のヌクレオチドの５’オーバーハングを含む。さらに他の実施形態では、ＲＮＡｉ剤の１つの鎖の３’および５’末端の両方は、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【0120】

一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、ｄｓＲＮＡ剤であり、それらの各鎖は、標的ＲＮＡ配列、すなわちＰＣＳＫ９標的ｍＲＮＡ配列と相互作用する１９～２３のヌクレオチドを含む。理論によって拘束されたくないが、細胞に導入される長い二本鎖ＲＮＡは、ダイサーとして知られるＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによりｓｉＲＮＡに分解される（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。ダイサーのリボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素は、ｄｓＲＮＡを処理して、２塩基の３’オーバーハングを特徴とする１９～２３塩基対の短い干渉ＲＮＡをもたらす（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１） Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。次に、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中に組み込まれ、ここでは１つ以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二本鎖を巻き戻し、相補的なアンチセンス鎖が標的認識を導くことを可能にする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１） Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡへの結合時、ＲＩＳＣ内部の１つ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断し、サイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。

【0121】

別の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡ配列、例えばＰＣＳＫ９標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して標的ＲＮＡの切断を誘導する、２４～３０のヌクレオチドのｄｓＲＮＡである。理論によって拘束されたくないが、細胞に導入される長い二本鎖ＲＮＡは、ダイサーとして知られるＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによりｓｉＲＮＡに分解される（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。ダイサーのリボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素は、ｄｓＲＮＡを処理して、２塩基の３’オーバーハングを特徴とする１９～２３塩基対の短い干渉ＲＮＡをもたらす（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１） Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。次に、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中に組み込まれ、ここでは１つ以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二本鎖を巻き戻し、相補的なアンチセンス鎖が標的認識を導くことを可能にする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１） Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡへの結合時、ＲＩＳＣ内部の１つ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断し、サイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。

【0122】

本明細書で用いられるとき、用語「ヌクレオチドオーバーハング」は、ｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡの二本鎖構造から突出する少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。例えば、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて拡張するか、またはその逆であるとき、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含み得；あるいはオーバーハングは、少なくとも２つのヌクレオチド、少なくとも３つのヌクレオチド、少なくとも４つのヌクレオチド、少なくとも５つのヌクレオチドまたはそれより多くを含み得る。ヌクレオチドオーバーハングは、ヌクレオチド／ヌクレオシドアナログ、例えばデオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含み得るかまたはそれらからなり得る。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖またはそれらの任意の組み合わせに存在し得る。さらに、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端または両末端に存在し得る。

【0123】

ｄｓＲＮＡの一実施形態では、少なくとも１つの鎖は、少なくとも１つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。別の実施形態では、少なくとも１つの鎖は、少なくとも２つのヌクレオチド、例えば、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５のヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉ剤の少なくとも１つの鎖は、少なくとも１つのヌクレオチドの５’オーバーハングを含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの鎖は、少なくとも２つのヌクレオチド、例えば、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５のヌクレオチドの５’オーバーハングを含む。さらに他の実施形態では、ＲＮＡｉ剤の１つの鎖の３’および５’末端の両方は、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【0124】

特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端および／または５’末端に、１～１０のヌクレオチド、例えば、０～３、１～３、２～４、２～５、４～１０、５～１０、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０のヌクレオチドのオーバーハングを有する。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、３’末端および／または５’末端に、１～１０のヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０のヌクレオチドのオーバーハングを有する。別の実施形態では、オーバーハング中のヌクレオチドの１つ以上は、ヌクレオシドチオリン酸と置き換えられる。

【0125】

特定の実施形態では、センス鎖またはアンチセンス鎖、または双方におけるオーバーハングは、１０より長いヌクレオチド、例えば、１～３０ヌクレオチド長、２～３０ヌクレオチド長、１０～３０ヌクレオチド長、もしくは１０～１５ヌクレオチド長の拡張された長さを含み得る。特定の実施形態では、拡張されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖上に存在する。特定の実施形態では、拡張されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖の３’末端上に存在する。特定の実施形態では、拡張されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖の５’末端上に存在する。特定の実施形態では、拡張されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖上に存在する。特定の実施形態では、拡張されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖の３’末端上に存在する。特定の実施形態では、拡張されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖の５’末端上に存在する。特定の実施形態では、オーバーハング中のヌクレオチドの１つ以上は、ヌクレオシドチオリン酸と置き換えられる。特定の実施形態では、オーバーハングは、オーバーハングが生理学的条件下で安定であるヘアピン構造を形成する能力があるように自己相補的部分を含む。

【0126】

「平滑化された」または「平滑末端化された」は、二本鎖ＲＮＡｉ剤のその末端に不対ヌクレオチドが存在しない、すなわちヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。「平滑末端化された」ＲＮＡｉ剤は、その全長にわたり二本鎖である、すなわち分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないｄｓＲＮＡである。本発明のＲＮＡｉ剤は、一方の末端にヌクレオチドオーバーハングを有するＲＮＡｉ剤（すなわち１つのオーバーハングと１つの平滑末端を有する作用物質）または両末端にヌクレオチドオーバーハングを有するＲＮＡｉ剤を含む。

【0127】

用語「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」は、標的配列、例えばＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡに実質的に相補的な領域を含むｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書で用いられるとき、用語「相補性領域」は、本明細書で定義される通り、配列、例えば標的配列、例えばＰＣＳＫ９ヌクレオチド配列に実質的に相補的であるアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性領域の標的配列に対する相補性が完全でない場合、ミスマッチは分子の内部または末端領域内に存在し得る。一般に、最も許容的なミスマッチは、末端領域内、例えば、ｉＲＮＡの５’末端および／または３’末端の５、４、３、２、もしくは１つのヌクレオチド中に存在する。一実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖内にヌクレオチドミスマッチを含む。別の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、センス鎖内にヌクレオチドミスマッチを含む。一実施形態では、ヌクレオチドミスマッチは、例えばｉＲＮＡの３’末端から５、４、３、２、もしくは１つ目のヌクレオチド中に存在する。別の実施形態では、ヌクレオチドミスマッチは、例えばｉＲＮＡの３’末端ヌクレオチド中に存在する。

【0128】

用語「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」は、本明細書で用いられるとき、その用語が本明細書中で定義されるように、アンチセンス鎖の領域に実質的に相補的である領域を含むｉＲＮＡの鎖を指す。

【0129】

本明細書で用いられるとき、用語「切断領域」は、切断部位に直に隣接して位置する領域を指す。切断部位は、切断が生じる標的上の部位である。一部の実施形態では、切断領域は、切断部位のいずれかの端上に、またそれに直に隣接して３つの塩基を含む。一部の実施形態では、切断領域は、切断部位のいずれかの端上に、またそれに直に隣接して２つの塩基を含む。一部の実施形態では、切断部位は、特にアンチセンス鎖のヌクレオチド１０および１１によって結合される部位に生じ、かつ切断領域は、ヌクレオチド１１、１２および１３を含む。

【0130】

本明細書の用法では、特に断りのない限り、「相補的」という用語は、第２のヌクレオチド配列との関連で第１のヌクレオチド配列を記述するのに使用される場合、当業者に理解されるであろうように、第１のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、特定条件下で、第２のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして、二本鎖構造を生成する能力を指す。このような条件は、例えばストリンジェントな条件であり得て、ストリンジェントな条件としては、４００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．４の４０ｍＭのＰＩＰＥＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２～１６時間と、それに続く洗浄が挙げられる（例えば“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。生物中で遭遇し得る生理学的に妥当な条件などのその他の条件が、適用され得る。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終用途に従って、２つの配列の相補性試験に最適な条件の組を判定することができる。

【0131】

例えば本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ内などのｉＲＮＡ内の相補配列は、片方または双方のヌクレオチド配列全長にわたる、第１のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、第２のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの塩基対合を含む。このような配列は、本明細書で互いに「完全に相補的」と称し得る。しかし本明細書で第１の配列が第２の配列に関して「実質的に相補的」と称される場合、２つの配列は完全に相補的であり得て、またはそれらは最大で３０塩基対の二本鎖のハイブリダイゼーションに際して、例えばＲＩＳＣ経路を通じた遺伝子発現の阻害などのそれらの最終用途に最も妥当な条件下でハイブリダイズする能力を保ちながら、１つまたは複数であるが概して５、４、３または２以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしハイブリダイゼーションに際して、１つまたは複数の一本鎖オーバーハングを形成するように、２つのオリゴヌクレオチドがデザインされる場合、このようなオーバーハングは、相補性の判定に関してミスマッチと見なされないものとする。例えば２１ヌクレオチド長の１つのオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドとを含んでなり、より長いオリゴヌクレオチドがより短いオリゴヌクレオチドと完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含んでなるｄｓＲＮＡは、本明細書に記載される目的では、なおも「完全に相補的」と称される。

【0132】

「相補的」配列は、本明細書の用法ではまた、それらのハイブリダイズ能力に関する上の要件が満たされる限りにおいて、非ワトソン・クリック塩基対および／または非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対も含み、またはそれから完全に形成され得る。このような非ワトソン・クリック塩基対としては、Ｇ：Ｕゆらぎ塩基対またはフーグスティーン型塩基対が挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0133】

本明細書では、「相補的」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」という用語は、それらが使用される文脈から理解されるであろうように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖間の、またはｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖と標的配列間の塩基整合に関して使用し得る。

【0134】

本明細書の用法では、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の「少なくとも一部と実質的に相補的」なポリヌクレオチドは、対象ｍＲＮＡ（例えばＰＣＳＫ９をコードするｍＲＮＡ）の連続部分と、実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えばポリヌクレオチドは、配列が、ＰＣＳＫ９をコードするｍＲＮＡの非中断部分と実質的に相補的であれば、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。

【0135】

一般に、各鎖のヌクレオチドの大部分はリボヌクレオチドであるが、本明細書で詳細に記載されるように、片方または双方の鎖はまた、例えばデオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドなどの１つまたは複数の非リボヌクレオチドも含み得る。さらに「ｉＲＮＡ」としては、化学修飾のあるリボヌクレオチドが挙げられる。このような修飾としては、本明細書で開示され、または当該技術分野で公知の全てのタイプの修飾が挙げられる。本明細書および特許請求の目的で、あらゆるこのような修飾は、ｉＲＮＡ分子における用法では「ｉＲＮＡ」に包含される。

【0136】

本発明の一態様では、本発明の方法および組成物において用いられる作用物質は、アンチセンス阻害機構を介して標的ｍＲＮＡを阻害する一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子である。一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡ内部の配列に相補的である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡと塩基対合し、翻訳機構を物理的に妨害することにより化学量論的様式で翻訳を阻害することができ、Ｄｉａｓ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １：３４７－３５５を参照のこと。一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、約１５～約３０ヌクレオチド長であり、標的配列に相補的な配列を有してもよい。例えば、一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、本明細書に記載のアンチセンス配列のいずれか１つからの少なくとも約１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくはそれより多い隣接ヌクレオチドである配列を含んでもよい。

【0137】

ＩＩ．本発明の方法
本発明は、対象におけるプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本発明はまた、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を下方制御することにより調節され得る疾患および状態を治療または予防するための治療および予防方法を提供する。例えば、本明細書に記載の組成物は、脂質血症、例えば高脂血症および他の形態の脂質不均衡、例えば高コレステロール血症、高中性脂肪血症およびこれらの障害に関連する病態、例えば心疾患および循環系疾患を治療するために用いることができる。ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を下方制御することにより調節され得る他の疾患および状態は、限定はされないが、ニーマンピック病、テイ・サックス病、リソソーム酸リパーゼ欠損症、およびゴーシェ病を含むリソソーム貯蔵疾患を含む。本方法は、本発明のＲＮＡｉ剤を治療有効量または予防有効量で対象に投与するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、ＰＣＳＫ９ ｉＲＮＡ剤を有効量でヘテロ接合性ＬＤＬＲ遺伝子型を有する患者に投与するステップを含む。

【0138】

ＰＣＳＫ９がＬＤＬ受容体のレベルを制御し、次いでコレステロールリッチＬＤＬ粒子を血漿から除去することから、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現低下の効果は、好ましくは、哺乳動物の血液中、より詳細には血清中でのＬＤＬｃ（低密度リポタンパク質コレステロール）レベルの低下をもたらす。一部の実施形態では、ＬＤＬｃレベルは、治療前レベルと比べて、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくはそれより多く低下する。したがって、本発明はまた、対象の血清中の低密度コレステロール（ＬＤＬｃ）のレベルを低下させるための方法を提供する。

【0139】

本発明の特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、一定用量として対象に投与される。「一定用量」（例えば、ｍｇ単位の用量）は、ｉＲＮＡ剤のある用量が、任意の具体的な対象に関連する要素、例えば体重と無関係に、すべての対象に用いられることを意味する。他の実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤は、対象に体重に基づく用量として投与される。「体重に基づく用量」（例えば、ｍｇ／ｋｇ単位の用量）は、対象の体重に応じて変化することになるｉＲＮＡ剤の用量である。

【0140】

特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、約１００ｍｇ～約７００ｍｇ、約１５０ｍｇ～約７００ｍｇ、約２００ｍｇ～約７００ｍｇ、約２５０ｍｇ～約７００ｍｇ、約３００ｍｇ～約７００ｍｇ、約３５０ｍｇ～約７００ｍｇ、約４００ｍｇ～約７００ｍｇ、約４５０ｍｇ～約７００ｍｇ、約５００ｍｇ～約７００ｍｇ、約５５０ｍｇ～約７００ｍｇ、約６００～約７００ｍｇ、約６５０～約７００ｍｇ、約１００ｍｇ～約６５０ｍｇ、約１５０ｍｇ～約６５０ｍｇ、約２００ｍｇ～約６５０ｍｇ、約２５０ｍｇ～約６５０ｍｇ、約３００ｍｇ～約６５０ｍｇ、約３５０ｍｇ～約６５０ｍｇ、約４００ｍｇ～約６５０ｍｇ、約４５０ｍｇ～約６５０ｍｇ、約５００ｍｇ～約６５０ｍｇ、約５５０ｍｇ～約６５０ｍｇ、約６００～約６５０ｍｇ、約１００ｍｇ～約６００ｍｇ、約１５０ｍｇ～約６００ｍｇ、約２００ｍｇ～約６００ｍｇ、約２５０ｍｇ～約６００ｍｇ、約３００ｍｇ～約６００ｍｇ、約３５０ｍｇ～約６００ｍｇ、約４００ｍｇ～約６００ｍｇ、約４５０ｍｇ～約６００ｍｇ、約５００ｍｇ～約６００ｍｇ、約５５０ｍｇ～約６００ｍｇ、約１００ｍｇ～約５５０ｍｇ、約１５０ｍｇ～約５５０ｍｇ、約２００ｍｇ～約５５０ｍｇ、約２５０ｍｇ～約５５０ｍｇ、約３００ｍｇ～約５５０ｍｇ、約３５０ｍｇ～約５５０ｍｇ、約４００ｍｇ～約５５０ｍｇ、約４５０ｍｇ～約５５０ｍｇ、約５００ｍｇ～約５５０ｍｇ、約１００ｍｇ～約５００ｍｇ、約１５０ｍｇ～約５００ｍｇ、約２００ｍｇ～約５００ｍｇ、約２５０ｍｇ～約５００ｍｇ、約３００ｍｇ～約５００ｍｇ、約３５０ｍｇ～約５００ｍｇ、約４００ｍｇ～約５００ｍｇ、もしくは約４５０ｍｇ～約５００ｍｇの一定用量、例えば、約１００ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１７５ｍｇ、２００ｍｇ、約２２５ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２７５ｍｇ、約３００ｍｇ、約３２５ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３７５ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２５ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４７５ｍｇ、約５００ｍｇ、約５２５ｍｇ、約５５０ｍｇ、約５７５ｍｇ、約６００ｍｇ、約６２５ｍｇ、約６５０ｍｇ、約６７５ｍｇ、もしくは約７００ｍｇの一定用量として対象に投与される。前述の列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であるように意図される。

【0141】

投与は、例えば定期的に反復されてもよい。例えば、一定用量が、週１回、２週ごとに１回、月１回、四半期ごとに１回、または半年ごとの間隔で６か月もしくは１年もしくはそれより長い期間、すなわち慢性投与として対象に投与されてもよい。

【0142】

一実施形態では、対象に約２５ｍｇ～約５０ｍｇの一定用量が週１回投与される。別の実施形態では、対象に約５０ｍｇ～約１００ｍｇの一定用量が２週ごとに１回投与される。別の実施形態では、対象に約１００ｍｇ～約２００ｍｇの一定用量が月１回投与される。さらに別の実施形態では、対象に約３００ｍｇ～約６００ｍｇの一定用量が四半期ごとに１回投与される。別の実施形態では、対象に約３００ｍｇ～約６００ｍｇの一定用量が半年ごとに（すなわち年２回）投与される。

【0143】

したがって、一態様では、本発明は、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、本発明の二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤、例えばｄｓＲＮＡ（例えば、本発明のｄｓＲＮＡを含む医薬組成物）を対象に投与するステップを含み、ここで全部で約２００ｍｇ～約６００ｍｇの二本鎖ＲＮＡｉ剤が、四半期ごとまたは半年ごとに対象に投与され、また二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド３５４４～３６２３とは３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含む相補性領域を含む。

【0144】

別の態様では、本発明は、対象における低密度リポタンパク質（ＬＤＬｃ）のレベルを低下させる方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を対象に投与するステップを含み、ここで全部で約２００ｍｇ～約６００ｍｇの二本鎖ＲＮＡｉ剤が、四半期ごとまたは半年ごとに対象に投与され、また二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド３５４４～３６２３とは３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含む相補性領域を含み、それにより対象におけるＬＤＬｃのレベルを低下させる。

【0145】

別の態様では、本発明は、ＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる障害、例えば高脂血症、例えば高コレステロール血症を有する対象を治療する方法を提供する。本方法は、本発明の二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤、例えばｄｓＲＮＡ（例えば、本発明のｄｓＲＮＡを含む医薬組成物）を対象に投与するステップを含み、ここで全部で約２００ｍｇ～約６００ｍｇの二本鎖ＲＮＡｉ剤が、四半期ごとまたは半年ごとに対象に投与され、また二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド３５４４～３６２３とは３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含む相補性領域を含む。

【0146】

さらに別の態様では、本発明は、高脂血症、例えば高コレステロール血症を有する対象を治療する方法を提供する。本方法は、本発明の二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤、例えばｄｓＲＮＡ（例えば、本発明のｄｓＲＮＡを含む医薬組成物）を対象に投与するステップを含み、ここで全部で約２００ｍｇ～約６００ｍｇの二本鎖ＲＮＡｉ剤が、四半期ごとまたは半年ごとに対象に投与され、また二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド３５４４～３６２３とは３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含む相補性領域を含む。

【0147】

上で示されるように、対象へのＲＮＡｉ剤の投与は、定期的に、例えば、週１回、２週ごとに１回、月１回、四半期ごとに１回、または半年ごとの間隔で反復されてもよい。

【0148】

したがって、一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、間隔が密である投与の「負荷段階」を含み、それにＲＮＡｉ剤がより長い間隔で投与される「維持段階」が後続してもよいような投与計画で投与される。例えば、毎週または隔週で１か月間の投与後、投与は毎月１回で６か月間または１年間またはそれより長い期間、すなわち慢性投与として反復され得る。

【0149】

一実施形態では、負荷段階は、１週目の間でのＲＮＡｉ剤の単回投与を含む。別の実施形態では、負荷段階は、最初の２週間にわたるＲＮＡｉ剤の単回投与を含む。さらに別の実施形態では、負荷段階は、１月目の間でのＲＮＡｉ剤の単回投与を含む。

【0150】

特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、負荷段階中、約１００ｍｇ～約７００ｍｇ、約１５０ｍｇ～約７００ｍｇ、約２００ｍｇ～約７００ｍｇ、約２５０ｍｇ～約７００ｍｇ、約３００ｍｇ～約７００ｍｇ、約３５０ｍｇ～約７００ｍｇ、約４００ｍｇ～約７００ｍｇ、約４５０ｍｇ～約７００ｍｇ、約５００ｍｇ～約７００ｍｇ、約５５０ｍｇ～約７００ｍｇ、約６００～約７００ｍｇ、約６５０～約７００ｍｇ、約１００ｍｇ～約６５０ｍｇ、約１５０ｍｇ～約６５０ｍｇ、約２００ｍｇ～約６５０ｍｇ、約２５０ｍｇ～約６５０ｍｇ、約３００ｍｇ～約６５０ｍｇ、約３５０ｍｇ～約６５０ｍｇ、約４００ｍｇ～約６５０ｍｇ、約４５０ｍｇ～約６５０ｍｇ、約５００ｍｇ～約６５０ｍｇ、約５５０ｍｇ～約６５０ｍｇ、約６００～約６５０ｍｇ、約１００ｍｇ～約６００ｍｇ、約１５０ｍｇ～約６００ｍｇ、約２００ｍｇ～約６００ｍｇ、約２５０ｍｇ～約６００ｍｇ、約３００ｍｇ～約６００ｍｇ、約３５０ｍｇ～約６００ｍｇ、約４００ｍｇ～約６００ｍｇ、約４５０ｍｇ～約６００ｍｇ、約５００ｍｇ～約６００ｍｇ、約５５０ｍｇ～約６００ｍｇ、約１００ｍｇ～約５５０ｍｇ、約１５０ｍｇ～約５５０ｍｇ、約２００ｍｇ～約５５０ｍｇ、約２５０ｍｇ～約５５０ｍｇ、約３００ｍｇ～約５５０ｍｇ、約３５０ｍｇ～約５５０ｍｇ、約４００ｍｇ～約５５０ｍｇ、約４５０ｍｇ～約５５０ｍｇ、約５００ｍｇ～約５５０ｍｇ、約１００ｍｇ～約５００ｍｇ、約１５０ｍｇ～約５００ｍｇ、約２００ｍｇ～約５００ｍｇ、約２５０ｍｇ～約５００ｍｇ、約３００ｍｇ～約５００ｍｇ、約３５０ｍｇ～約５００ｍｇ、約４００ｍｇ～約５００ｍｇ、または約４５０ｍｇ～約５００ｍｇの一定用量、例えば、約１００ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１７５ｍｇ、２００ｍｇ、約２２５ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２７５ｍｇ、約３００ｍｇ、約３２５ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３７５ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２５ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４７５ｍｇ、約５００ｍｇ、約５２５ｍｇ、約５５０ｍｇ、約５７５ｍｇ、約６００ｍｇ、約６２５ｍｇ、約６５０ｍｇ、約６７５ｍｇ、もしくは約７００ｍｇの一定用量として対象に投与される。前述の列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であるように意図される。

【0151】

一実施形態では、維持段階は、ある用量のＲＮＡｉ剤の月１回、２か月ごとに１回、３か月ごとに１回、４か月ごとに１回、５か月ごとに１回、または６か月ごとに１回での対象への投与を含む。特定の一実施形態では、維持用量は、対象に月１回投与される。

【0152】

１回もしくは多回の維持用量は、初期用量以下、例えば初期用量の半分であり得る。例えば、維持用量は、月１回対象に投与される約２５ｍｇ～約１００ｍｇ、例えば、約２５ｍｇ～約７５ｍｇ、約２５ｍｇ～約５０ｍｇ、または約５０ｍｇ～約７５ｍｇ、例えば、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、もしくは約１００ｍｇであってもよい。前述の列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であるように意図される。

【0153】

これらのスケジュールのいずれもが、任意選択的には、１回以上反復されてもよい。反復回数は、所望される効果の達成、例えばＰＣＳＫ９遺伝子の抑制、および／または治療的もしくは予防的効果の達成、例えば血清コレステロールレベルの低下もしくは高コレステロール血症の症状の軽減に依存してもよい。治療後、患者は、彼／彼女の状態における変化について監視され得る。ＲＮＡｉ剤の用量は、患者が現在の用量レベルに有意に応答しない事象では増加させてもよく、または用量は、病態の症状の軽減が認められる場合、病態が消失している場合、または望ましくない副作用が認められる場合、減少させてもよい。

【0154】

したがって、一態様では、本発明は、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を負荷段階とその後の維持段階を含む投与計画で対象に投与するステップを含み、ここで負荷段階は、ＲＮＡｉ剤を約２００ｍｇ～約６００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、また維持段階は、ＲＮＡｉ剤を約２５ｍｇ～約１００ｍｇの一定用量で月に約１回対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド３５４４～３６２３とは３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含む相補性領域を含み、それにより対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する。

【0155】

別の態様では、本発明は、対象における低密度リポタンパク質（ＬＤＬｃ）のレベルを低下させる方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を負荷段階とその後の維持段階を含む投与計画で対象に投与するステップを含み、ここで負荷段階は、ＲＮＡｉ剤を約２００ｍｇ～約６００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、また維持段階は、ＲＮＡｉ剤を約２５ｍｇ～約１００ｍｇの一定用量で月１回対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド３５４４～３６２３とは３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含む相補性領域を含み、それにより対象におけるＬＤＬｃのレベルを低下させる。

【0156】

別の態様では、本発明は、ＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる障害を有する対象を治療する方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を負荷段階とその後の維持段階を含む投与計画で対象に投与するステップを含み、ここで負荷段階は、ＲＮＡｉ剤を約２００ｍｇ～約６００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、また維持段階は、ＲＮＡｉ剤を約２５ｍｇ～約１００ｍｇの一定用量で月１回対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド３５４４～３６２３とは３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含む相補性領域を含み、それによりＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる障害を有する対象を治療する。

【0157】

さらに別の態様では、本発明は、高脂血症を有する対象を治療する方法を提供する。本方法は、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を負荷段階とその後の維持段階を含む投与計画で対象に投与するステップを含み、ここで負荷段階は、ＲＮＡｉ剤を約２００ｍｇ～約６００ｍｇの一定用量で対象に投与するステップを含み、また維持段階は、ＲＮＡｉ剤を約２５ｍｇ～約１００ｍｇの一定用量で月１回対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド３５４４～３６２３とは３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含む相補性領域を含み、それにより高脂血症を有する対象を治療する。

【0158】

一実施形態では、本発明の方法にて用いられる二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖はヌクレオチド配列５’－ＡＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＵＣＵＡＧＡＡ－３’（配列番号６８５）を含み、かつセンス鎖はヌクレオチド配列５’－ＣＵＡＧＡＣＣＵＧＵＴＵＵＧＣＵＵＵＵＧＵ－３’（配列番号６８６）を含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドである。

【0159】

本明細書で用いられるとき、「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物を含む。対象は、トランスジェニック生物を含んでもよい。最も好ましくは、対象はヒト、例えばＰＣＳＫ９関連疾患に罹患するかまたは罹患しやすいヒトである。

【0160】

本方法および本発明の使用は、本明細書に記載の組成物を、標的ＰＣＳＫ９遺伝子の発現が、延長された期間、例えば約８０日間、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、もしくは約１８０日間、またはより長い期間にわたり減少するように投与するステップを含む。

【0161】

遺伝子発現における減少は、当該技術分野で公知の任意の方法により評価され得る。例えば、ＰＣＳＫ９の発現における減少は、当業者にとってルーチン的な方法、例えばノーザンブロッティング、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いてＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを測定することにより、当業者にとってルーチン的な方法、例えばウエスタンブロッティング、免疫学的技法を用いてＰＣＳＫ９のタンパク質レベルを測定することにより、かつ／または、ＰＣＳＫ９の生物学的活性、例えば、総コレステロールレベル、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ）レベル、非ＨＤＬレベル、超低密度リポタンパク質コレステロール（ＶＬＤＬ）レベル、中性脂肪レベル、Ｌｐ（ａ）レベル、およびリポタンパク質粒径などの１つ以上の血清脂質パラメータに対する効果などを測定することにより、判定されてもよい。

【0162】

本方法および本発明の使用に従うｄｓＲＮＡの投与は、ＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる障害を有する患者におけるかかる疾患または障害の重症度、徴候、症状、および／またはマーカの減少をもたらすことがある。これに関連する「減少」は、かかるレベルにおける統計学的に有意な減少を意味する。減少は、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは約１００％であり得る。

【0163】

疾患の治療または予防の有効性は、例えば、疾患の進行、疾患の寛解、症状の重症度、血清脂質レベル（例えば、ＬＤＬｃレベル）、生活の質、治療効果を維持するのに要求される薬剤の用量、疾患マーカのレベルまたは予防のために治療もしくは標的化されている所与の疾患に適した任意の他の測定可能なパラメータを測定することにより評価され得る。かかるパラメータのいずれか１つ、またはパラメータの任意の組み合わせを測定することにより治療または予防の有効性を監視することは、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、高脂血症の治療の有効性は、例えばＬＤＬｃレベルの定期的監視により評価されてもよい。その後の読み取りと初期の読み取りとの比較により、その治療が有効であるか否かの指示が医師に提供される。かかるパラメータのいずれか１つ、またはパラメータの任意の組み合わせを測定することにより治療または予防の有効性を監視することは、十分に当業者の能力の範囲内である。

【0164】

治療または予防的効果は、疾患状態の１つ以上のパラメータにて統計学的に有意な改善があるとき、または通常であれば想定されないような症状を増悪または発症させないことにより、明白である。例として、疾患の測定可能なパラメータにおける少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％もしくはそれより多くの好ましい変化は、有効な治療を意味し得る。所与のｉＲＮＡ剤またはその薬剤の製剤化における有効性についても、当該技術分野で公知の、所与の疾患における実験動物モデルを用いて判断され得る。実験動物モデルを用いる場合、マーカまたは症状における統計学的に有意な減少が認められるとき、治療の有効性が証明される。

【0165】

あるいは、有効性は、臨床的に認められた疾患重症度の評価尺度に基づく診断の当業者によって判定されるように、疾患の重症度における減少により測定され得る。例えば適切な規模を用いて測定される疾患の重症度の低下をもたらす任意の正の変化は、本明細書に記載のようなｉＲＮＡまたはｉＲＮＡ製剤を用いての適切な治療を表す。

【0166】

一般に、ｉＲＮＡ剤は、免疫系を活性化せず、例えば、それはサイトカインレベル、例えばＴＮＦ－αまたはＩＦＮ－αレベルを増加させない。例えば、アッセイ、例えば試験管内ＰＢＭＣアッセイ、例えば本明細書に記載のものにより測定されるとき、ＴＮＦ－αまたはＩＦＮ－αのレベルにおける上昇は、対照ｄｓＲＮＡ、例えばＰＣＳＫ９を標的化しないｄｓＲＮＡで治療される対照細胞の３０％未満、２０％、または１０％である。

【0167】

別の実施形態では、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬｃ）レベルが、所定の最低レベルに達するかまたはそれを超える、例えば７０ｍｇ／ｄＬ、１３０ｍｇ／ｄＬ、１５０ｍｇ／ｄＬ、２００ｍｇ／ｄＬ、３００ｍｇ／ｄＬ、または４００ｍｇ／ｄＬを超えるとき、投与が施され得る。

【0168】

減少したＰＣＳＫ９遺伝子の効果は、好ましくは、哺乳動物の血液中、より詳細には血清中のＬＤＬｃ（低密度リポタンパク質コレステロール）レベルにおける減少をもたらす。一部の実施形態では、ＬＤＬｃレベルは、治療前レベルと比べて、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくはそれより多く減少する。

【0169】

本発明の方法の一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９の発現は、延長された持続期間、例えば、少なくとも１週、２週、３週、もしくは４週またはより長期にわたり減少する。例えば、場合によっては、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現は、本明細書に記載のｉＲＮＡ剤の投与により、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、もしくは５０％抑制される。一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９遺伝子は、ｉＲＮＡ剤の投与により、少なくとも約６０％、７０％、もしくは８０％抑制される。一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９遺伝子は、二本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、少なくとも約８５％、９０％、もしくは９５％抑制される。

【0170】

本明細書のＲＮＡｉ剤は、限定はされないが、皮下、静脈内、筋肉内、眼内、気管支内、胸膜内、腹腔内、動脈内、リンパ管、脳脊髄、およびそれらの任意の組み合わせを含む、当該技術分野で公知の任意の投与様式を用いて、対象に投与されてもよい。好ましい実施形態では、作用物質は、皮下に投与される。

【0171】

一部の実施形態では、投与は、デポー注射を介する。デポー注射は、ＲＮＡｉ剤を、延長された期間にわたり一貫した方法で放出し得る。したがって、デポー注射は、所望される効果、例えばＰＣＳＫ９の所望される阻害、または治療的もしくは予防的効果を得るのに要求される投与頻度を減少させ得る。デポー注射はまた、より一貫した血清濃度を提供し得る。デポー注射は、皮下注射または筋肉内注射を含んでもよい。好ましい実施形態では、デポー注射は皮下注射である。

【0172】

一部の実施形態では、投与は、ポンプを介する。ポンプは、外部ポンプまたは外科的に移植されるポンプであってもよい。特定の実施形態では、ポンプは、皮下に移植される浸透圧ポンプである。他の実施形態では、ポンプは、注入ポンプである。注入ポンプは、静脈内、皮下、動脈、または硬膜外注入のために用いられてもよい。好ましい実施形態では、注入ポンプは、皮下注入ポンプである。他の実施形態では、ポンプは、ＲＮＡｉ剤を肝臓に送達する外科的に移植されるポンプである。

【0173】

他の投与様式は、硬膜外、脳内、脳室内、経鼻投与、動脈内、心臓内、骨内注入、くも膜下腔内、および硝子体内、および肺内を含む。投与様式は、局所性または全身性治療が所望されるか否かに基づき、また治療対象の領域に基づき、選択されてもよい。投与の経路および部位は、標的化を増強するように選択されてもよい。

【0174】

ｉＲＮＡは、ある期間にわたり、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは約２５分間にわたり、静脈内注入により投与され得る。投与は、例えば定期的に、例えば、毎週、隔週（すなわち２週ごと）で１か月間、２か月間、３か月間、４か月間もしくはそれより長期間、反復されてもよい。初期治療計画後、治療はより低い頻度ベースで施され得る。例えば、毎週または隔週で３か月間の投与後、投与は、月１回で６か月間または１年間もしくはそれより長期間、反復され得る。

【0175】

ｉＲＮＡの投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿または他の区画におけるＰＣＳＫ９レベルを、少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは少なくとも約９９％またはそれより多く、低下させ得る。

【0176】

ｉＲＮＡの完全用量での投与前、患者は、より少ない用量、例えば５％の注入で投与され、有害作用、例えばアレルギー反応について監視され得る。別の例では、患者は、望まれない免疫刺激作用、例えばサイトカイン（例えば、ＴＮＦ－αまたはＩＮＦ－α）レベルの増加について監視され得る。

【0177】

ＰＣＳＫ９の発現に対する阻害効果のおかげで、本発明に従う組成物またはそれから調製される医薬組成物は、生活の質を高め得る。

【0178】

本発明のｉＲＮＡは、「ネイキッド」形態で、または「遊離ｉＲＮＡ」として投与されてもよい。ネイキッドｉＲＮＡは、医薬組成物の不在下で投与される。ネイキッドｉＲＮＡは、好適な緩衝液中に存在してもよい。緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、またはリン酸塩、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。一実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。ｉＲＮＡを含有する緩衝液のｐＨおよびモル浸透圧濃度は、対象への投与に適するように調節され得る。

【0179】

あるいは、本発明のｉＲＮＡは、医薬組成物、例えばｄｓＲＮＡリポソーム製剤として投与されてもよい。

【0180】

本発明は、例えば、ＰＣＳＫ９発現の低減および／または阻害から利益を受けることになる対象、例えば高脂血症、例えば高コレステロール血症を有する対象を治療するためのｉＲＮＡまたはその医薬組成物を、他の医薬品および／または他の治療方法、例えば公知の医薬品および／または公知の治療方法、例えばこれらの障害を治療するために現在用いられているものなどと組み合わせて用いるための方法および用途をさらに提供する。ｓｉＲＮＡおよび追加的な治療薬は、例えば非経口的に、同じ組成物中で組み合わせて投与され得るか、または追加的な治療薬は、別個の組成物の一部としてまたは本明細書に記載の別の方法により投与され得る。

【0181】

追加的な治療薬の例として、脂質障害、例えば高コレステロール血症、アテローム動脈硬化症または脂質異常症を治療することで知られる作用物質を含む。例えば、本発明において特徴的なｓｉＲＮＡは、例えば、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（例えば、スタチン）、フィブラート、胆汁酸捕捉剤、ナイアシン、抗血小板薬、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗剤（例えば、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ’ｓ Ｃｏｚａａｒ（登録商標）などのロサルタンカリウム）、アシルＣｏＡコレステロールアセチルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤、コレステロール吸収阻害剤、コレステロールエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害剤、ミクロソーム中性脂肪輸送タンパク質（ＭＴＴＰ）阻害剤、コレステロール調節物質、胆汁酸調節物質、ペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）作動薬、遺伝子に基づく治療、複合血管保護剤（例えばＡＧＩ－１０６７、Ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃｓ製）、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、アスピリンもしくはアスピリン様の化合物、ＩＢＡＴ阻害剤（例えばＳ－８９２１、Ｓｈｉｏｎｏｇｉ製）、スクアレンシンターゼ阻害剤、または単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）－Ｉ阻害剤とともに投与され得る。例示的なＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤として、アトルバスタチン（ＰｆｉｚｅｒのＬｉｐｉｔｏｒ（登録商標）／Ｔａｈｏｒ／Ｓｏｒｔｉｓ／Ｔｏｒｖａｓｔ／Ｃａｒｄｙｌ）、プラバスタチン（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ ＳｑｕｉｂｂのＰｒａｖａｃｈｏｌ、ＳａｎｋｙｏのＭｅｖａｌｏｔｉｎ／Ｓａｎａｐｒａｖ）、シンバスタチン（ＭｅｒｃｋのＺｏｃｏｒ（登録商標）／Ｓｉｎｖａｃｏｒ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＩｎｇｅｌｈｅｉｍのＤｅｎａｎ，ＢａｎｙｕのＬｉｐｏｖａｓ）、ロバスタチン（ＭｅｒｃｋのＭｅｖａｃｏｒ／Ｍｅｖｉｎａｃｏｒ、ＢｅｘａｌのＬｏｖａｓｔａｔｉｎａ，Ｃｅｐａ；Ｓｃｈｗａｒｚ ＰｈａｒｍａのＬｉｐｏｓｃｌｅｒ）、フルバスタチン（ＮｏｖａｒｔｉｓのＬｅｓｃｏｌ（登録商標）／Ｌｏｃｏｌ／Ｌｏｃｈｏｌ、ＦｕｊｉｓａｗａのＣｒａｎｏｃ、ＳｏｌｖａｙのＤｉｇａｒｉｌ）、セリバスタチン（ＢａｙｅｒのＬｉｐｏｂａｙ／ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅのＢａｙｃｏｌ）、ロスバスタチン（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａのＣｒｅｓｔｏｒ（登録商標））、およびピチバスタチン（イタバスタチン／リシバスタチン）（Ｎｉｓｓａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｋｏｗａ Ｋｏｇｙｏ，Ｓａｎｋｙｏ，およびＮｏｖａｒｔｉｓ）が挙げられる。例示的なフィブラートとして、例えば、ベザフィブラート（例えば、ＲｏｃｈｅのＢｅｆｉｚａｌ（登録商標）／Ｃｅｄｕｒ（登録商標）／Ｂｅｚａｌｉｐ（登録商標）、ＫｉｓｓｅｉのＢｅｚａｔｏｌ）、クロフィブラート（例えば、ＷｙｅｔｈのＡｔｒｏｍｉｄ－Ｓ（登録商標））、フェノフィブラート（例えば、ＦｏｕｒｎｉｅｒのＬｉｐｉｄｉｌ／Ｌｉｐａｎｔｉｌ、ＡｂｂｏｔｔのＴｒｉｃｏｒ（登録商標）、ＴａｋｅｄａのＬｉｐａｎｔｉｌ、ジェネリック薬品）、ゲムフィブロジル（例えば、ＰｆｉｚｅｒのＬｏｐｉｄ／Ｌｉｐｕｒ）およびシプロフィブラート（Ｓａｎｏｆｉ－ＳｙｎｔｈｅｌａｂｏのＭｏｄａｌｉｍ（登録商標））が挙げられる。例示的な胆汁酸捕捉剤として、例えば、コレスチラミン（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ ＳｑｕｉｂｂのＱｕｅｓｔｒａｎ（登録商標）およびＱｕｅｓｔｒａｎ Ｌｉｇｈｔ（商標））、コレスチポール（例えば、ＰｈａｒｍａｃｉａのＣｏｌｅｓｔｉｄ）、ならびにコレセベラン（Ｇｅｎｚｙｍｅ／ＳａｎｋｙｏのＷｅｌＣｈｏｌ（商標））が挙げられる。例示的なナイアシン治療薬として、例えば即時放出製剤、例えば、ＡｖｅｎｔｉｓのＮｉｃｏｂｉｄ、Ｕｐｓｈｅｒ－ＳｍｉｔｈのＮｉａｃｏｒ、ＡｖｅｎｔｉｓのＮｉｃｏｌａｒ、およびＳａｎｗａｋａｇａｋｕのＰｅｒｙｃｉｔが挙げられる。ナイアシン持続放出製剤として、例えば、Ｋｏｓ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＮｉａｓｐａｎおよびＵｐｓｈｅｒ－ＳｍｉｔｈのＳＩｏ－Ｎｉａｃｉｎが挙げられる。例示的な抗血小板薬として、例えば、アスピリン（例えば、Ｂａｙｅｒのアスピリン）、クロピドグレル（Ｓａｎｏｆｉ－Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ／Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ ＳｑｕｉｂｂのＰｌａｖｉｘ）、ならびにチクロピジン（例えば、Ｓａｎｏｆｉ－ＳｙｎｔｈｅｌａｂｏのＴｉｃｌｉｄおよびＤａｉｉｃｈｉのＰａｎａｌｄｉｎｅ）が挙げられる。ＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡとの組み合わせに有用な他のアスピリン様化合物として、例えば、Ａｓａｃａｒｄ（Ｐｈａｒｍａｃｉａの徐放性アスピリン）およびＰａｍｉｃｏｇｒｅｌ（Ｋａｎｅｂｏ／Ａｎｇｅｌｉｎｉ Ｒｉｃｅｒｃｈｅ／ＣＥＰＡ）が挙げられる。例示的なアンジオテンシン転換酵素阻害剤として、例えば、ラミプリル（例えば、ＡｖｅｎｔｉｓのＡｌｔａｃｅ）およびエナラプリル（例えば、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．のＶａｓｏｔｅｃ）が挙げられる。例示的なアシルＣｏＡコレステロールアセチルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤として、例えば、アバシマイブ（Ｐｆｉｚｅｒ）、エフルシマイブ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ Ｐｉｅｒｒｅ Ｆａｂｒｅ／Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＣＳ－５０５（ＳａｎｋｙｏおよびＫｙｏｔｏ）、およびＳＭＰ－７９７（Ｓｕｍｉｔｏ）が挙げられる。例示的なコレステロール吸収阻害剤として、例えば、エゼチミブ（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ－Ｐｌｏｕｇｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｚｅｔｉａ（登録商標））およびパマケシド（Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。例示的なＣＥＴＰ阻害剤として、例えば、トルセトラピブ（ＣＰ－５２９４１４とも称される、Ｐｆｉｚｅｒ）、ＪＴＴ－７０５（Ｊａｐａｎ Ｔｏｂａｃｃｏ）、およびＣＥＴｉ－Ｉ（Ａｖａｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）が挙げられる。例示的なミクロソーム中性脂肪輸送タンパク質（ＭＴＴＰ）阻害剤として、例えば、インプリタピド（Ｂａｙｅｒ）、Ｒ－１０３７５７（Ｊａｎｓｓｅｎ）、およびＣＰ－３４６０８６（Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。他の例示的なコレステロール調節物質として、例えば、ＮＯ－１８８６（Ｏｔｓｕｋａ／ＴＡＰ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、ＣＩ－１０２７（Ｐｆｉｚｅｒ）、およびＷＡＹ－１３５４３３（Ｗｙｅｔｈ－Ａｙｅｒｓｔ）が挙げられる。

【0182】

例示的な胆汁酸調節物質として、例えば、ＨＢＳ－１０７（Ｈｉｓａｍｉｔｓｕ／Ｂａｎｙｕ）、Ｂｔｇ－５１１（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ）、ＢＡＲＩ－１４５３（Ａｖｅｎｔｉｓ）、Ｓ－８９２１（Ｓｈｉｏｎｏｇｉ）、ＳＤ－５６１３（Ｐｆｉｚｅｒ）、およびＡＺＤ－７８０６（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）が挙げられる。例示的なペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）作動薬として、例えば、テサグリタザール（ＡＺ－２４２）（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ネトグリタゾン（ＭＣＣ－５５５）（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ／Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＧＷ－４０９５４４（Ｌｉｇａｎｄ Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＧＷ－５０１５１６（Ｌｉｇａｎｄ Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＬＹ－９２９（Ｌｉｇａｎｄ ＰｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓおよびＥｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ－４６５６０８（Ｌｉｇａｎｄ ＰｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓおよびＥｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ－５１８６７４（Ｌｉｇａｎｄ ＰｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓおよびＥｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、およびＭＫ－７６７（ＭｅｒｃｋおよびＫｙｏｒｉｎ）が挙げられる。例示的な遺伝子に基づく治療薬として、例えば、ＡｄＧＷＥＧＦ１２１．１０（ＧｅｎＶｅｃ）、ＡｐｏＡｌ（ＵＣＢＰｈａｒｍａ／Ｇｒｏｕｐｅ Ｆｏｕｒｎｉｅｒ）、ＥＧ－００４（Ｔｒｉｎａｍ）（Ａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、およびＡＴＰ結合カセット輸送体Ａ１（ＡＢＣＡ１）（ＣＶ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／Ｉｎｃｙｔｅ、Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｘｅｎｏｎ）が挙げられる。例示的な糖タンパク質Ｉｌｂ／ＩＩＩａ阻害剤として、例えば、ロキシフィバン（ＤＭＰ７５４とも称される、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ガントフィバン（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ／Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ）、およびクロマフィバン（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が挙げられる。例示的なスクワレン合成酵素阻害剤として、例えば、ＢＭＳ－１８８４９４１（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＣＰ－２１０１７２（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＣＰ－２９５６９７（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＣＰ－２９４８３８（Ｐｆｉｚｅｒ）、およびＴＡＫ－４７５（Ｔａｋｅｄａ）が挙げられる。例示的なＭＣＰ－Ｉ阻害剤として、例えばＲＳ－５０４３９３（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が挙げられる。抗アテローム性動脈硬化剤ＢＯ－６５３（Ｃｈｕｇａｉ Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、およびニコチン酸誘導体ナイクリン（Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ Ｐｈａｒｍａｃｕｔｉｃａｌｓ）もまた、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡとの組み合わせ投与に適する。ＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡとの投与に適した例示的な併用療法として、例えば、アドビコール（Ｋｏｓ Ｐｈａｒｍａｃｕｔｉｃａｌｓ製のナイアシン／ロバスタチン）、アムロジピン／アトルバスタチン（Ｐｆｉｚｅｒ）、ならびにエゼチミブ／シンバスタチン（例えば、Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ－Ｐｌｏｕｇｈ Ｐｈａｒｍａｃｕｔｉｃａｌｓによるバイトリン（登録商標）１０／１０錠、１０／２０錠、１０／４０錠、および１０／８０錠）が挙げられる。高コレステロール血症の治療用でかつＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡとの組み合わせ投与に適した薬剤として、例えば、ロバスタチン、ナイアシンアルトプレブ（登録商標）持続放出錠剤（ＡｎｄｒｘＬａｂｓ）、ロバスタチンカデュエット（登録商標）錠剤（Ｐｆｉｚｅｒ）、ベシル酸アムロジピン、アトルバスタチンカルシウムクレストール（登録商標）錠剤（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ロスバスタチンカルシウムレスコール（登録商標）カプセル（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルバスタチンナトリウムレスコール（登録商標）（Ｒｅｌｉａｎｔ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルバスタチンナトリウムリピトール（登録商標）錠剤（Ｐａｒｋｅ－Ｄａｖｉｓ）、アトルバスタチンカルシウムロフィブラ（登録商標）カプセル（Ｇａｔｅ）、ナイアスパン持続放出錠剤（Ｋｏｓ）、ナイアシンプラバコール錠（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、プラバスタチンナトリウムトリコール（登録商標）錠剤（Ａｂｂｏｔｔ）、フェノフィブラートバイトリン（登録商標）１０／１０錠（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ－Ｐｌｏｕｇｈ Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、エゼチミブ、シンバスタチンＷｅｌＣｈｏｌ（商標）錠剤（Ｓａｎｋｙｏ）、塩酸コレセベラムゼチーア（登録商標）錠剤（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）、エゼチミブゼチーア（登録商標）錠剤（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ－Ｐｌｏｕｇｈ Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、およびエゼチミブゾコール（登録商標）錠剤（Ｍｅｒｃｋ）が挙げられる。

【0183】

一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、エゼチミブ／シンバスタチンの組み合わせ（例えば、バイトリン（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ－Ｐｌｏｕｇｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））と組み合わせて投与される。

【0184】

別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、抗ＰＣＳＫ９抗体と組み合わせて投与される。本発明の併用療法にて用いられる例示的な抗ＰＣＳＫ９抗体として、例えば、アリロクマブ（プラルエント）、エボロクマブ（レパーサ）、ボコシズマブ（ＰＦ－０４９５０６１５、ＲＮ３１６、ＲＮ－３１６、Ｌ１Ｌ３；Ｐｆｉｚｅｒ、Ｒｉｎａｔ）、ロデルシズマブ（ＬＦＵ７２０、ｐＪＧ０４；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ラルパンシズマブ（ｒａｌｐａｎｃｉｚｕｍａｂ）（ＲＮ３１７、ＰＦ－０５３３５８１０；Ｐｆｉｚｅｒ、Ｒｉｎａｔ）、ＲＧ７６５２（ＭＰＳＫ３１６９Ａ、ＹＷ５０８．２０．３３ｂ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＬＹ３０１５０１４（Ｌｉｌｌｙ）、ＬＰＤ１４６２（ｈ１Ｆ１１；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ－Ｐｌｏｕｇｈ）、ＡＸ１（ＡＸ１８９、１Ｂ２０、１Ｄ０５；Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ）、ＡＬＤ３０６（Ａｌｄｅｒ）；ｍＡｂ１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、およびＩｇ１－ＰＡ４（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕ．）が挙げられる。

【0185】

一実施形態では、ｉＲＮＡ剤が患者に投与され、次に追加的な治療薬が患者に投与される（またはその逆である）。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤および追加的な治療薬が同時に投与される。

【0186】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載のｉＲＮＡ剤を投与する方法について最終利用者、例えば介護者または対象に指示する方法を特徴とする。本方法は、任意選択的には、最終利用者に１回以上の用量のｉＲＮＡ剤を提供し、かつ最終利用者にｉＲＮＡ剤を本明細書に記載の投与計画で投与するように指示し、それにより最終利用者に指示することを含む。

【0187】

一態様では、本発明は、患者がＬＤＬの低下、ＨＤＬを低下させない条件でのＬＤＬの低下、ＡｐｏＢの低下、または総コレステロールの低下を必要とすることに基づいて患者を選択することにより、患者を治療する方法を提供する。本方法は、ｓｉＲＮＡを、例えばＨＤＬレベルを実質的に低下させない条件で患者のＬＤＬレベルまたはＡｐｏＢレベルを低下させるのに十分な量で患者に投与するステップを含む。

【0188】

遺伝的素因は、標的遺伝子に関連した疾患、例えば高脂血症の発症における役割を担う。したがって、ｓｉＲＮＡを必要とする患者は、家族歴を取るか、または例えば１つ以上の遺伝子マーカまたは変異体についてスクリーニングすることにより同定され得る。高脂血症に関与する遺伝子の例として、限定はされないが、例えば、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）、アポリポタンパク質（ＡｐｏＡｌ、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＥなど）、コレステリルエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、肝リパーゼ（ＬＩＰＣ）、内皮リパーゼ（ＥＬ）、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）が挙げられる。

【0189】

医療提供者、例えば、医師、看護師、または家族は、本発明のｉＲＮＡ剤を処方または投与する前に家族歴を取ることができる。さらに、遺伝子型または表現型を判定するため、試験が実施されてもよい。例えば、ＰＣＳＫ９ ｄｓＲＮＡが患者に投与される前にＰＣＳＫ９の遺伝子型および／または表現型を同定するため、患者からのサンプル、例えば血液サンプルに対してＤＮＡ試験が実施されてもよい。別の実施形態では、関連の遺伝子型および／または表現型、例えばＬＤＬＲ遺伝子型を同定するため、試験が実施される。ＬＤＬＲ遺伝子を有する遺伝子変異体の例は、当該技術分野で、例えば参照により援用される以下の公開：Ｃｏｓｔａｎｚａ ｅｔ ａｌ（２００５）Ａｍ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１５；１６１（８）：７１４－２４；Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．Ｊａｎ；４５（ｌ）：２２－８，Ｅｐｕｂ ２００７ Ａｕｇ ３１；およびＢｏｅｓ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ ４４：１３６－１６０，Ｅｐｕｂ ２００８ Ｎｏｖ１７にて見出すことができる。

【0190】

本発明は、細胞、例えば対象、例えばヒト対象内部の細胞においてプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）の発現を阻害する方法をさらに提供する。

【0191】

したがって、本発明は、細胞内でのＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、細胞を、ＲＮＡｉ剤、例えば二本鎖ＲＮＡｉ剤と、細胞内でのＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するのに有効な量で接触させるステップを含み、それにより細胞内でのＰＣＳＫ９の発現を阻害する。

【0192】

細胞を二本鎖ＲＮＡｉ剤と接触させるステップは、試験管内または生体内で行われてもよい。細胞を生体内でＲＮＡｉ剤と接触させるステップは、対象、例えばヒト対象内部の細胞または細胞群をＲＮＡｉ剤と接触させることを含む。試験管内および生体内での接触方法の組み合わせもまた可能である。接触させるステップは、上で考察のように、直接的であってもまたは間接的であってもよい。さらに、細胞を接触させるステップは、本明細書に記載されるかまたは当該技術分野で公知である任意のリガンドを含む標的化リガンドを介して行われてもよい。好ましい実施形態では、標的化リガンドは、炭水化物部分、例えばＧａｌＮＡｃ３リガンド、またはＲＮＡｉ剤を目的の部位、例えば対象の肝臓に導く任意の他のリガンドである。

【0193】

用語「阻害する」は、本明細書で用いられるとき、「低減する」、「サイレンシング」、「下方制御する」および他の類似用語と交換可能に用いられ、かつ任意のレベルの阻害を含む。

【0194】

語句「ＰＣＳＫ９の発現を阻害する」は、任意のＰＣＳＫ９遺伝子（例えば、マウスＰＣＳＫ９遺伝子、ラットＰＣＳＫ９遺伝子、サルＰＣＳＫ９遺伝子、またはヒトＰＣＳＫ９遺伝子など）およびＰＣＳＫ９遺伝子の変異体または突然変異体の発現の阻害を指すように意図される。したがって、ＰＣＳＫ９遺伝子は、野生型ＰＣＳＫ９遺伝子、突然変異体ＰＣＳＫ９遺伝子、または遺伝子操作された細胞、細胞群、もしくは生物との関連でのトランスジェニックＰＣＳＫ９遺伝子であってもよい。

【0195】

「ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する」は、ＰＣＳＫ９遺伝子の任意のレベルの阻害、例えばＰＣＳＫ９遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を含む。ＰＣＳＫ９遺伝子の発現は、ＰＣＳＫ９遺伝子発現に関連した任意の変数のレベル、またはそのレベルにおける変化、例えば、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベル、ＰＣＳＫ９タンパク質レベル、または脂質レベルに基づいて評価されてもよい。このレベルは、例えば対象由来のサンプルを含む、個体の細胞または細胞群にて評価されてもよい。

【0196】

阻害は、対照レベルと比べてのＰＣＳＫ９の発現に関連した１つ以上の変数の絶対的または相対的レベルにおける低下により評価されてもよい。対照レベルは、当該技術分野で利用される任意のタイプの対照レベル、例えば投与前ベースラインレベル、または対照（例えば、緩衝液のみの対照または不活性剤対照など）で治療されないかまたは治療される類似の対象、細胞、もしくはサンプルから決定されるレベルであってもよい。

【0197】

本発明の方法の一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％阻害される。

【0198】

ＰＣＳＫ９遺伝子の発現の阻害は、ＰＣＳＫ９遺伝子が転写され、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現が阻害されるように、（例えば、１つもしくは複数の細胞を本発明のＲＮＡｉ剤と接触させることにより、または本発明のＲＮＡｉ剤を細胞が存在するかもしくは存在した対象に投与することにより）治療されている第１の細胞または細胞群（かかる細胞は例えば対象由来のサンプル中に存在してもよい）によって発現されるｍＲＮＡの量の、第１の細胞もしくは細胞群と実質的に同一であるがそのように治療されていない第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比べたときの減少によって示されてもよい。好ましい実施形態では、阻害は、以下の式：

【数1】

を用いて、処置細胞内でのｍＲＮＡのレベルを対照細胞内でのｍＲＮＡのレベルの百分率として表すことにより評価される。

【0199】

あるいは、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現の阻害は、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現、例えばＰＣＳＫ９タンパク質の発現に機能的に関連するパラメータ、例えば脂質レベル、コレステロールレベル、例えばＬＤＬｃレベルの低下の観点で評価されてもよい。ＰＣＳＫ９遺伝子サイレンシングは、ＰＣＳＫ９を発現する任意の細胞内で、構成的にまたはゲノム工学により、また当該技術分野で公知の任意のアッセイにより判定されてもよい。肝臓は、ＰＣＳＫ９発現の主要な部位である。他の顕著な発現部位として、膵臓、腎臓、および腸が含まれる。

【0200】

ＰＣＳＫ９タンパク質の発現の阻害は、細胞または細胞群によって発現されるＰＣＳＫ９タンパク質のレベル（例えば、対象由来のサンプル中で発現されるタンパク質のレベル）における低下によって示されてもよい。ｍＲＮＡ抑制の評価について上で説明される通り、治療された細胞または細胞群におけるタンパク質発現レベルの阻害は、同様に対照細胞または細胞群におけるタンパク質のレベルの百分率として表されてもよい。

【0201】

ＰＣＳＫ９遺伝子の発現の阻害を評価するために用いられてもよい対照細胞または細胞群は、本発明のＲＮＡｉ剤とまだ接触されていない細胞または細胞群を含む。例えば、対照細胞または細胞群は、対象のＲＮＡｉ剤による治療に先立つ個体対象（例えば、ヒトまたは動物対象）に由来してもよい。

【0202】

細胞または細胞群によって発現されるＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡのレベルは、ｍＲＮＡの発現を評価するための当該技術分野で公知の任意の方法を用いて測定されてもよい。一実施形態では、サンプル中のＰＣＳＫ９の発現のレベルは、転写されたポリヌクレオチド、またはその一部、例えばＰＣＳＫ９遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより測定される。ＲＮＡは、ＲＮＡ抽出技術を用いて、例えば、フェノール／グアニジンイソチオシアン酸抽出（ＲＮＡｚｏｌ Ｂ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）またはＰＡＸｇｅｎｅ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）などを用いて、細胞から抽出されてもよい。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的なアッセイ形式は、核ランオンアッセイ、ＲＴ－ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイ（Ｍｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：７０３５）、ノーザンブロッティング、原位置ハイブリダイゼーション、およびマイクロアレイ分析を含む。

【0203】

一実施形態では、ＰＣＳＫ９の発現レベルは、核酸プローブを用いて測定される。用語「プローブ」は、本明細書で用いられるとき、特定のＰＣＳＫ９に選択的に結合する能力がある任意の分子を指す。プローブは、当業者によって合成され得るか、または適切な生物学的製剤から誘導され得る。プローブは、標識されることに特化して設計されてもよい。プローブとして利用可能な分子の例として、限定はされないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、および有機分子が挙げられる。

【0204】

単離されたｍＲＮＡは、限定はされないが、サザンまたはノーザン解析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析およびプローブアレイを含む、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにて用いることができる。ｍＲＮＡレベルを測定するための一方法は、単離されたｍＲＮＡを、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡとハイブリダイズ可能な核酸分子（プローブ）と接触させることを含む。一実施形態では、ｍＲＮＡは、固体表面上に固定化され、プローブと接触されるが、それは例えば、単離されたｍＲＮＡをアガロースゲル上で走らせ、そのｍＲＮＡをゲルから膜、例えばニトロセルロースへ移すことによる。他の実施形態では、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップアレイで、プローブが固体表面上に固定化され、ｍＲＮＡがプローブと接触される。当業者は、公知のｍＲＮＡ検出方法を、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡのレベルを測定するような用途に容易に適応させることができる。

【0205】

サンプル中のＰＣＳＫ９の発現レベルを測定するための代替方法は、サンプル中の例えばｍＲＮＡの（ｃＤＮＡを調製するための）核酸増幅および／または逆転写酵素、例えばＲＴ－ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，１９８７、米国特許第４，６８３，２０２号明細書に示される実験実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９－１９３）、自己持続配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４－１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３－１１７７）、Ｑ－Ｂｅｔａレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８５４，０３３号明細書）または任意の他の核酸増幅方法によるもの、それに続く当業者に周知の技術を用いた増幅分子の検出のプロセスを含む。これらの検出スキームは、核酸分子の検出において、かかる分子が極めて少ない数で存在する場合、特に有用である。本発明の特定の態様では、ＰＣＳＫ９の発現のレベルは、定量蛍光発生ＲＴ－ＰＣＲ（すなわちＴａｑＭａｎ（商標）システム）により測定される。

【0206】

ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの発現レベルは、膜ブロット（例えば、ノーザン、サザン、ドットなどのハイブリダイゼーション分析において用いられる）、またはマイクロウェル、サンプルチューブ、ゲル、ビーズまたは線維（または結合核酸を含む任意の固体支持体）を用いて監視されてもよい。米国特許第５，７７０，７２２号明細書、米国特許第５，８７４，２１９号明細書、米国特許第５，７４４，３０５号明細書、米国特許第５，６７７，１９５号明細書および米国特許第５，４４５，９３４号明細書（参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。ＰＣＳＫ９発現レベルの測定はまた、溶液中での核酸プローブの使用を含んでもよい。

【0207】

好ましい実施形態では、ｍＲＮＡ発現のレベルは、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイまたはリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて評価される。これらの方法の使用は、本明細書中に提示される実施例で説明および例示される。

【0208】

ＰＣＳＫ９タンパク質発現のレベルは、タンパク質レベルの測定用の当該技術分野で公知の任意の方法を用いて測定されてもよい。かかる方法は、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散クロマトグラフィー、流体もしくはゲル沈降反応、吸収分光学、比色アッセイ、分光光度アッセイ、フローサイトメトリー、免疫拡散（一重または二重）、免疫電気泳動、ウエスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイなどを含む。

【0209】

用語「サンプル」は、本明細書で用いられるとき、対象から単離される類似の体液、細胞、または組織の収集物、ならびに対象内部に存在する体液、細胞、または組織を指す。生体液の例として、血液、血清および漿膜液、血漿、リンパ液、尿、脳脊髄液、唾液、眼液などが挙げられる。組織サンプルは、組織、臓器または局所領域に由来するサンプルを含んでもよい。例えば、サンプルは、特定臓器、臓器の一部、またはそれら臓器内部の体液もしくは細胞に由来してもよい。特定の実施形態では、サンプルは、肝臓（例えば、全肝臓または肝臓の特定セグメントまたは肝臓における特定タイプの細胞、例えば肝細胞など）に由来してもよい。好ましい実施形態では、「対象に由来するサンプル」は、対象から採取される血液または血漿を指す。さらなる実施形態では、「対象に由来するサンプル」は、対象に由来する肝組織を指す。

【0210】

本発明の方法の一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤が対象内部の特定部位に送達されるように対象に投与される。ＰＣＳＫ９の発現の阻害は、対象内部の特定部位からの体液もしくは組織に由来するサンプル中でのＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡもしくはＰＣＳＫ９タンパク質のレベルまたはレベルにおける変化の測定を用いて評価されてもよい。好ましい実施形態では、その部位は肝臓である。その部位はまた、上述部位のいずれか１つからの細胞のサブセクションまたはサブグループであってもよい。その部位はまた、特定タイプの受容体を発現する細胞を含んでもよい。

【0211】

ＩＩＩ．本発明の方法にて用いられるｉＲＮＡ
本明細書に記載されるのは、細胞、例えば、ＰＣＳＫ９関連障害、例えば高脂血症、例えば高コレステロール血症を有する対象、例えば哺乳動物、例えばヒトの内部の細胞においてＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡｉ剤を用いるための方法である。

【0212】

したがって、本発明は、特許請求される方法にて用いるための生体内で標的遺伝子（すなわちＰＣＳＫ９遺伝子）の発現を阻害する能力がある二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。

【0213】

一実施形態では、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡは、修飾されず、例えば、当該技術分野で公知でありかつ本明細書に記載される化学修飾および／または複合を含まない。別の実施形態では、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡは、安定性または他の有利な特性を増強するように化学修飾される。本発明の特定の態様では、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的すべてが修飾される。例えば、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべてが修飾ヌクレオチドであり、かつ／またはアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべてが修飾ヌクレオチドであり、かつ／またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の双方のヌクレオチドの実質的すべてが修飾ヌクレオチドである。本発明の他の実施形態では、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドのすべてが修飾される。例えば、センス鎖のヌクレオチドのすべてが修飾ヌクレオチドであり、かつ／またはアンチセンス鎖のヌクレオチドのすべてが修飾ヌクレオチドであり、かつ／またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の双方のヌクレオチドのすべてが修飾ヌクレオチドである。「ヌクレオチドの実質的すべてが修飾される」本発明のｉＲＮＡは、修飾が大部分であっても全部でなく、５以下、４、３、２、または１の非修飾ヌクレオチドを含み得る。

【0214】

ｄｓＲＮＡは、ＰＣＳＫ９遺伝子発現中に形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である、相補性領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補性領域は、約３０ヌクレオチド以下の長さ（例えば約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、または１８ヌクレオチド以下の長さ）である。ＰＣＳＫ９遺伝子を発現する細胞との接触に際して、ｉＲＮＡは、ＰＣＳＫ９遺伝子（例えばヒトＰＣＳＫ９遺伝子）の発現を、例えばＰＣＲまたは分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）ベースの方法による、または例えばウエスタンブロット法またはフローサイトメトリー技術を使用する免疫蛍光分析などのタンパク質ベースの方法によるアッセイで、少なくとも約１０％阻害する。

【0215】

ｄｓＲＮＡは相補的な２本のＲＮＡ鎖を含み、それらはその中でｄｓＲＮＡが使用される条件下でハイブリダイズして二本鎖構造を形成する。ｄｓＲＮＡの１本の鎖（アンチセンス鎖）は相補性領域を含み、それは標的配列と実質的に相補的であり、一般に完全に相補的である。標的配列は、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列に由来し得る。他方の鎖（センス鎖）は、適切な条件下で組み合わせると、２本の鎖がハイブリダイズして二本鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖と相補的な領域を含む。本明細書の他の箇所に記載されるように、そして当該技術分野で公知のように、ｄｓＲＮＡの相補配列はまた、別個のオリゴヌクレオチド上にあるものとは対照的に、単一核酸分子の自己相補領域として含有され得る。

【0216】

一般に、二本鎖構造は、例えば１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対長さなどの１５～３０塩基対長さである。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。

【0217】

同様に、標的配列の相補性領域は、例えば１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチド長など１５～３０ヌクレオチド長である。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。

【0218】

いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約１５～約２０ヌクレオチド長、または約２５～約３０ヌクレオチド長である。一般にｄｓＲＮＡは、ダイサー酵素の基質の役割を果たすのに十分長い。例えば約２１～２３ヌクレオチド長より長いｄｓＲＮＡが、ダイサーの基質の役割を果たしてもよいことは、当該技術分野で周知である。当業者は認識するであろうように、切断標的とされるＲＮＡの標的領域は、ほとんどの場合、より大型のＲＮＡ分子の一部であり、それはｍＲＮＡ分子であることが多い。該当する場合、ｍＲＮＡ標的の「部分」は、ＲＮＡｉ指向切断（すなわちＲＩＳＣ経路を通じた切断）の基質となるのに十分長い、ｍＲＮＡ標的の連続配列である。

【0219】

特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、ＰＣＳＫ９遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に対して実質的に相補的である少なくとも１９の隣接ヌクレオチドの領域を伴うより長い長さ、例えば最大で６６のヌクレオチド、例えば、３６～６６、２６～３６、２５～３６、３１～６０、２２～４３、２７～５３ヌクレオチド長を含み得るＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含んでもよい。より長い長さのアンチセンス鎖を伴うこれらのｄｓＲＮＡ剤は、好ましくは、センス鎖およびアンチセンス鎖が１８～３０の隣接ヌクレオチドの二本鎖を形成する、２０～６０ヌクレオチド長の第２のＲＮＡ鎖（センス鎖）を含む。

【0220】

当業者は、例えば約１０～３６、１１～３６、１２～３６、１３～３６、１４～３６、１５～３６、９～３５、１０～３５、１１～３５、１２～３５、１３～３５、１４～３５、１５～３５、９～３４、１０～３４、１１～３４、１２～３４、１３～３４、１４～３４、１５～３４、９～３３、１０～３３、１１～３３、１２～３３、１３～３３、１４～３３、１５～３３、９～３２、１０～３２、１１～３２、１２～３２、１３～３２、１４～３２、１５～３２、９～３１、１０～３１、１１～３１、１２～３１、１３～３２、１４～３１、１５～３１、１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４，２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対などの約９～３６塩基対の二本鎖領域などの二本鎖領域が、ｄｓＲＮＡの主要機能部分であることもまた認識するであろう。

【0221】

したがって一実施形態では、それが例えば、所望のＲＮＡを切断に標的化する１５～３０塩基対の機能性二本鎖にプロセシングされる範囲内で、３０塩基対を超える二本鎖領域を有するＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子複合体は、ｄｓＲＮＡである。したがって当業者は、一実施形態では、ｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることを認識するであろう。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、天然ｍｉＲＮＡでない。別の実施形態では、ＰＣＳＫ９発現を標的化するのに有用なｉＲＮＡ剤は、より大型のｄｓＲＮＡの切断によって標的細胞内で生成されない。

【0222】

本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、例えば１、２、３、または４ヌクレオチドなどの１つまたは複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含み得る。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、それらの平滑末端相当物と比較して、意外にも優れた阻害特性を有し得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド／ヌクレオシドをはじめとする、ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含んでなり得て、またはそれからなる。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはそのあらゆる組み合わせ上にあり得る。さらにオーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端、または双方の末端上に存在し得る。特定の実施形態では、より長い拡張されたオーバーハングが存在し得る。

【0223】

ｄｓＲＮＡは、以下でさらに考察されるように、例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販されるものなどの自動ＤＮＡ合成機を使用して、当該技術分野で公知の標準法によって合成し得る。

【0224】

本発明のｉＲＮＡ化合物は、二段階法を使用して調製されてもよい。最初に、二本鎖ＲＮＡ分子の個々の鎖が、別々に調製される。次に、構成要素鎖がアニールされる。ｓｉＲＮＡ化合物の個々の鎖は、溶液相または固相有機または双方を使用して調製し得る。有機合成は、非天然または修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド鎖を容易に調製し得る利点を提供する。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、溶液相または固相有機合成または双方を使用して調製し得る。

【0225】

一態様では、本発明のｄｓＲＮＡは、センス配列とアンチセンス配列の少なくとも２つのヌクレオチド配列を含む。センス鎖は、表１で提供される配列群から選択され、センス鎖に対応するアンチセンス鎖は、表１の配列群から選択される。この態様では、２配列の一方は２配列の他方に相補的であり、配列の１つは、ＰＣＳＫ９遺伝子発現中に生じるｍＲＮＡ配列と実質的に相補的である。したがってこの態様では、ｄｓＲＮＡは、２つのオリゴヌクレオチドを含み、１つのオリゴヌクレオチドは、表１のセンス鎖と説明され、第２のオリゴヌクレオチドは、表１のセンス鎖に対応するアンチセンス鎖と説明される。一実施形態では、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、別々のオリゴヌクレオチド上に含有される。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、単一オリゴヌクレオチド上に含有される。

【0226】

表１の配列の一部は、修飾および／または共役配列と説明されるが、例えば本発明のｄｓＲＮＡなどの本発明のｉＲＮＡのＲＮＡは、未修飾、非共役、および／または説明されるものとは異なって修飾されおよび／または共役している、表１に記載される配列のいずれか１つを含んでなってもよいものと理解される。

【0227】

当業者は、例えば２１塩基対などの約２０～２３塩基対の二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘発するのに特に効果的であるとして支持されていることを十分承知している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ ２００１，２０：６８７７－６８８８）。しかし他の当業者らは、より短いまたはより長いＲＮＡ二本鎖構造もまた、同様に効果的であり得ることを見出している。（Ｃｈｕ ａｎｄ Ｒａｎａ（２００７）ＲＮＡ １４：１７１４－１７１９；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３：２２２－２２６）。上述の実施形態では、表１で提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質のために、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、最低限２１ヌクレオチド長の少なくとも１本の鎖を含み得る。片方または両方の末端の数個のヌクレオチドのみが抜けている、表１の配列の１つを有するより短い二本鎖が、上で説明したｄｓＲＮＡと比較して同様に効果的であり得ることは、合理的に予想され得る。したがって表３、４、５、６、１８、１９、２０、２１および２３のいずれか１つの配列の１つに由来する、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の連続ヌクレオチドの配列を有して、ＰＣＳＫ９遺伝子発現を阻害する能力が、完全長配列を含んでなるｄｓＲＮＡと、約５、１０、１５、２０、２５、または３０％の以下異なるｄｓＲＮＡは、本発明の範囲内であることが意図される。

【0228】

さらに表１で提供されるＲＮＡは、ＲＩＳＣ媒介切断に対する感受性が高いＰＣＳＫ９転写物中の部位を同定する。したがって本発明は、これらの配列の１つ内を標的とするｉＲＮＡをさらに特徴とする。本明細書の用法では、ｉＲＮＡが、特定部位内のどこかで転写物の切断を促進する場合、ｉＲＮＡはＲＮＡ転写物のその特定部位内を標的にすると言われる。このようなｉＲＮＡは、一般に、ＰＣＳＫ９遺伝子中の選択配列に隣接する領域からの追加的なヌクレオチド配列と連結する、表１で提供される配列の１つからの約１５個の連続ヌクレオチドを含む。

【0229】

標的配列は、一般に約１５～３０ヌクレオチド長であるが、この範囲内の特定の配列が、あらゆる所与の標的ＲＮＡの切断を誘導する適合性には、幅広い多様性がある。本明細書で提示される様々なソフトウェアパッケージおよびガイドラインは、あらゆる所与の遺伝子標的の最適標的配列を同定するためのガイダンスを提供するが、標的ＲＮＡ配列に、所与のサイズの「ウィンドウ」または「マスク」（非限定的例として２１個のヌクレオチド）を実際にまたは比喩的に（例えばコンピュータシミュレーションによるものをはじめとする）配置させて、標的配列の役割を果たし得るサイズ範囲の配列を同定する、経験的アプローチもまた取り得る。配列「ウィンドウ」を最初の標的配列位置の１ヌクレオチド上流または下流に連続的に移動することで、選択されたあらゆる所与の標的サイズについて完全な可能な配列の組が同定されるまで、次の潜在的標的配列が同定され得る。このプロセスは、同定された配列の系統的合成、および（本明細書に記載されまたは当該技術分野で公知のアッセイを使用した）至適に機能する配列を同定する試験と相まって、ｉＲＮＡ剤で標的化した場合に、標的遺伝子発現の最良の阻害を媒介するＲＮＡ配列を同定し得る。したがって例えば表１中で同定される配列が、効果的な標的配列を表す一方で、所与の配列の１ヌクレオチド上流または下流に、連続的に「ウィンドウを歩行させる」ことにより、同等またはより良い阻害特性がある配列を同定することで、阻害効率のさらなる最適化を達成し得ることが検討される。

【0230】

さらにヌクレオチドを体系的に付加または除去して、より長いまたはより短い配列を作成し、その位置から、標的ＲＮＡよりも長いまたはより短いサイズのウィンドウを歩行させることで、これらの作成された配列を試験することにより、例えば表１中で同定される、あらゆる配列のさらなる最適化を達成し得ることが検討される。この場合もやはり、この新しい標的候補を作成するアプローチと、当該技術分野で公知のおよび／または本明細書に記載される阻害アッセイにおける、これらの標的配列に基づくｉＲＮＡの有効性の試験とを組み合わせることにより、阻害効率にさらなる改善をもたらし得る。なおもさらに、例えば本明細書に記載されまたは当該技術分野で公知の修飾ヌクレオチドの導入、オーバーハングの付加またはその変更、または当該技術分野で公知のおよび／または本明細書で考察されるその他の修飾によって、発現阻害物質として分子をさらに最適化する（例えば血清安定性または循環半減期増大、熱安定増大、膜貫通送達促進、特定位置または細胞型の標的化、サイレンシング経路酵素との相互作用増大、エンドソームからの放出増大など）ことで、このような最適化配列を調節し得る。

【0231】

本明細書に記載されるｉＲＮＡは、標的配列との１つまたは複数のミスマッチを含有し得る。一実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、３個以下のミスマッチを含有する。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチの範囲は、相補性領域の中心に位置しないことが好ましい。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチは、相補性領域の５’または３’末端のいずれかから、最後の５ヌクレオチド内に限定されることが好ましい。例えばＰＣＳＫ９遺伝子領域に相補的な２３ヌクレオチドｉＲＮＡ剤鎖では、ＲＮＡ鎖は、一般に、中心的な１３ヌクレオチド内にいかなるミスマッチも含有しない。本明細書に記載される方法または当該技術分野で公知の方法を使用して、標的配列とのミスマッチを含有するｉＲＮＡが、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現の阻害に効果的かどうかを判定し得る。ＰＣＳＫ９遺伝子の発現の阻害における、ミスマッチがあるｉＲＮＡの有効性の検討は、特にＰＣＳＫ９遺伝子の特定の相補性領域が、集団内で多型配列バリエーションを有することが知られている場合に、重要である。

【0232】

本発明で取り上げる核酸は、参照によって本明細書に援用する、“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されるものなどの当該技術分野で確立された方法によって、合成および／または修飾し得る。例えば修飾としては、例えば５’末端修飾（リン酸化、共役結合、逆転結合）または３’末端修飾（共役結合、ＤＮＡヌクレオチド、逆転結合など）などの末端修飾；例えば安定化塩基での、不安定化塩基での、または拡大パートナーのレパートリーと塩基対形成する塩基での置換、塩基除去（脱塩基ヌクレオチド）、または共役結合塩基などの塩基修飾；糖修飾（例えば２’位または４’位における）または糖置換；リン酸ジエステル結合の修飾または置換をはじめとする主鎖修飾が挙げられる。本明細書に記載される実施形態で有用なｉＲＮＡ化合物の特定の例としては、修飾主鎖を含有するＲＮＡ、または天然ヌクレオシド間結合を含有しないＲＮＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。修飾主鎖を有するＲＮＡとしては、特に主鎖中にリン原子を有しないものが挙げられる。本明細書の目的では、そして当該技術分野で時に言及されるように、それらのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有しない修飾ＲＮＡもまた、オリゴヌクレオシドであると見なされる。いくつかの実施形態では、修飾ｉＲＮＡは、そのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有する。

【0233】

修飾ＲＮＡ主鎖としては、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートをはじめとするメチルおよびその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートをはじめとするホスホロアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびノルマル３’－５’結合、それらの２’－５’連結アナログを有するボラノホスフェート、および隣接するヌクレオシド単位対が３’－５’から５’－３’、または２’－５’から５’－２’に連結する、逆転極性を有するボラノホスフェートが挙げられる。様々な塩、混合塩、および遊離酸形態もまた挙げられる。

【0234】

上記リン含有結合の調製を教示する、代表的な米国特許としては、その全体がそれぞれ参照によって本明細書によりここに援用される、米国特許第３，６８７，８０８号明細書；米国特許第４，４６９，８６３号明細書；米国特許第４，４７６，３０１号明細書；米国特許第５，０２３，２４３号明細書；米国特許第５，１７７，１９５号明細書；米国特許第５，１８８，８９７号明細書；米国特許第５，２６４，４２３号明細書；米国特許第５，２７６，０１９号明細書；米国特許第５，２７８，３０２号明細書；米国特許第５，２８６，７１７号明細書；米国特許第５，３２１，１３１号明細書；米国特許第５，３９９，６７６号明細書；米国特許第５，４０５，９３９号明細書；米国特許第５，４５３，４９６号明細書；米国特許第５，４５５，２３３号明細書；米国特許第５，４６６，６７７号明細書；米国特許第５，４７６，９２５号明細書；米国特許第５，５１９，１２６号明細書；米国特許第５，５３６，８２１号明細書；米国特許第５，５４１，３１６号明細書；米国特許第５，５５０，１１１号明細書；米国特許第５，５６３，２５３号明細書；米国特許第５，５７１，７９９号明細書；米国特許第５，５８７，３６１号明細書；米国特許第５，６２５，０５０号明細書；米国特許第６，０２８，１８８号明細書；米国特許第６，１２４，４４５号明細書；米国特許第６，１６０，１０９号明細書；米国特許第６，１６９，１７０号明細書；米国特許第６，１７２，２０９号明細書；米国特許第６、２３９，２６５号明細書；米国特許第６，２７７，６０３号明細書；米国特許第６，３２６，１９９号明細書；米国特許第６，３４６，６１４号明細書；米国特許第６，４４４，４２３号明細書；米国特許第６，５３１，５９０号明細書；米国特許第６，５３４，６３９号明細書；米国特許第６，６０８，０３５号明細書；米国特許第６，６８３，１６７号明細書；米国特許第６，８５８，７１５号明細書；米国特許第６，８６７，２９４号明細書；米国特許第６，８７８，８０５号明細書；米国特許第７，０１５，３１５号明細書；米国特許第７，０４１，８１６号明細書；米国特許第７，２７３，９３３号明細書；米国特許第７，３２１，０２９号明細書；および米国特許第ＲＥ３９４６４号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0235】

その中にリン原子を含まない修飾ＲＮＡ主鎖は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合によって形成された主鎖を有する。これらとしては、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖を有するもの；および混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ_２構成成分を有するその他のものが挙げられる。

【0236】

上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する、代表的な米国特許としては、その全体がそれぞれ参照によって本明細書によりここに援用される、米国特許第５，０３４，５０６号明細書；米国特許第５，１６６，３１５；５，１８５，４４４号明細書；米国特許第５，２１４，１３４号明細書；米国特許第５，２１６，１４１号明細書；米国特許第５，２３５，０３３号明細書；米国特許第５，６４，５６２号明細書；米国特許第５，２６４，５６４号明細書；米国特許第５，４０５，９３８号明細書；米国特許第５，４３４，２５７号明細書；米国特許第５，４６６，６７７号明細書；米国特許第５，４７０，９６７号明細書；米国特許第５，４８９，６７７号明細書；米国特許第５，５４１，３０７号明細書；米国特許第５，５６１，２２５号明細書；米国特許第５，５９６，０８６号明細書；米国特許第５，６０２，２４０号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第５，６１０，２８９号明細書；米国特許第５，６１８，７０４号明細書；米国特許第５，６２３，０７０号明細書；米国特許第５，６６３，３１２号明細書；米国特許第５，６３３，３６０号明細書；米国特許第５，６７７，４３７号明細書；および米国特許第５，６７７，４３９号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0237】

別の実施形態では、適切なＲＮＡ模倣物がｉＲＮＡ中での使用のために検討され、その中では、糖およびヌクレオシド間結合の双方、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格が、新しいグループで置換されている。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。このような１つのオリゴマー化合物であり、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物中では、ＲＮＡの糖主鎖が、アミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置換されている。核酸塩基は保持されて、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子と直接または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；米国特許第５，７１４，３３１号明細書；および米国特許第５，７１９，２６２号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに本発明のｉＲＮＡ中で使用するのに適するＰＮＡ化合物は、例えばＮｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７－１５００に記載される。

【0238】

本発明で取り上げるいくつかの実施形態は、ホスホロチオエート主鎖があるＲＮＡ、および特に先述の米国特許第５，４８９，６７７号明細書の－－ＣＨ_２－－ＮＨ－－ＣＨ_２－、－－ＣＨ_２－－Ｎ（ＣＨ_３）－－Ｏ－－ＣＨ_２－－［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られている］、－－ＣＨ_２－－Ｏ－－Ｎ（ＣＨ_３）－－ＣＨ_２－－、－－ＣＨ_２－－Ｎ（ＣＨ_３）－－Ｎ（ＣＨ_３）－－ＣＨ_２－－、および－－Ｎ（ＣＨ_３）－－ＣＨ_２－－ＣＨ_２－－［天然リン酸ジエステル主鎖は－－Ｏ－－Ｐ－－Ｏ－－ＣＨ_２－－として表される］であるヘテロ原子主鎖がある、および先述の米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミド主鎖がある、オリゴヌクレオシドとを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で取り上げるＲＮＡは、先述の米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノ主鎖構造を有する。

【0239】

修飾ＲＮＡはまた、１つまたは複数の置換糖部分を含有し得る。例えば本明細書で取り上げるｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡは、２’位に、ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルの１つを含み得て、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、またはＣ_２～Ｃ_１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な適切な修飾としては、Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）．_ｎＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２、およびＯ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３）］_２（式中、ｎおよびｍは１～約１０である）が挙げられる。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２’位に以下の１つを含む：Ｃ_１～Ｃ_１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ－アルカリールまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカアリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物、ｉＲＮＡの薬物動態特性を改善する基、またはｉＲＮＡの薬力学的特性を改善する基、および同様の特性を有するその他の置換基。いくつかの実施形態では、修飾は、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしてもまた知られている）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６－５０４）、すなわちアルコキシ－アルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、以下に本明細書の実施例で記載されるように、２’－ＤＭＡＯＥとしてもまた知られている、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２基、および、２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野で２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても公知である）、すなわち２’－Ｏ－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_２）_２である。

【0240】

その他の修飾としては、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ_３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）、および２’－フルオロ（２’－Ｆ）が挙げられる。同様の修飾はまた、具体的には３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位、または２’－５’結合ｄｓＲＮＡ中、および５’末端ヌクレオチドの５’位など、ｉＲＮＡのＲＮＡ上のその他の位置でも行い得る。ｉＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。上記修飾糖構造の調製を教示する、代表的な米国特許としては、特定のものは本出願と所有者が共通である、米国特許第４，９８１，９５７号明細書；米国特許第５，１１８，８００号明細書；米国特許第５，３１９，０８０号明細書；米国特許第５，３５９，０４４号明細書；米国特許第５，３９３，８７８号明細書；米国特許第５，４４６，１３７号明細書；米国特許第５，４６６，７８６号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５１９，１３４号明細書；米国特許第５，５６７，８１１号明細書；米国特許第５，５７６，４２７号明細書；米国特許第５，５９１，７２２号明細書；米国特許第５，５９７，９０９号明細書；米国特許第５，６１０，３００号明細書；米国特許第５，６２７，０５３号明細書；米国特許第５，６３９，８７３号明細書；米国特許第５，６４６，２６５号明細書；米国特許第５，６５８，８７３号明細書；米国特許第５，６７０，６３３号明細書；および米国特許第５，７００，９２０号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。上記のそれぞれの内容全体を参照によって本明細書によりここに援用する。

【0241】

ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基」と称されることが多い）修飾または置換を含み得る。本明細書の用法では、「未修飾」または「天然」核酸塩基としては、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、デオキシ－チミン（ｄＴ）；５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）；５－ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２－アミノアデニン；アデニンおよびグアニンの６－メチルおよびその他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよびその他のアルキル誘導体；２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン；５－ハロウラシルおよびシトシン；５－プロピニルウラシルおよびシトシン；６－アゾウラシル、シトシン、およびチミン；５－ウラシル（プソイドウラシル）；４－チオウラシル；８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよびその他の８置換アデニンおよびグアニン；５－ハロ、具体的には５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、およびその他の５置換ウラシルおよびシトシン；７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン；８－アザグアニンおよび８－アザアデニン；７－デアザグアニンおよび７－ダアザアデニン（ｄａａｚａａｄｅｎｉｎｅ）；および３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンなどのその他の合成および天然核酸塩基が挙げられる。さらに核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号明細書で開示されるもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８で開示されるもの；Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８－８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０で開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されるもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９－３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３によって開示されるものが挙げられる。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明で取り上げるオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用である。これらとしては、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、および５－プロピニルシトシンをはじめとする、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、およびＮ－２、Ｎ－６および０－６置換プリンが挙げられる。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６～１．２℃増大させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８）、模範的な塩基置換であり、なおもより特に、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合にそうである。

【0242】

上記の特定の修飾核酸塩基ならびにその他の修飾核酸塩基の調製を教示する、代表的な米国特許としては、その内容全体をそれぞれ参照によって本明細書によりここに援用する、上記の米国特許第３，６８７，８０８号明細書、米国特許第４，８４５，２０５号明細書；米国特許第５，１３０，３０号明細書；米国特許第５，１３４，０６６号明細書；米国特許第５，１７５，２７３号明細書；米国特許第５，３６７，０６６号明細書；米国特許第５，４３２，２７２号明細書；米国特許第５，４５７，１８７号明細書；米国特許第５，４５９，２５５号明細書；米国特許第５，４８４，９０８号明細書；米国特許第５，５０２，１７７号明細書；米国特許第５，５２５，７１１号明細書；米国特許第５，５５２，５４０号明細書；米国特許第５，５８７，４６９号明細書；米国特許第５，５９４，１２１、５，５９６，０９１号明細書；米国特許第５，６１４，６１７号明細書；米国特許第５，６８１，９４１号明細書；米国特許第５，７５０，６９２号明細書；米国特許第６，０１５，８８６号明細書；米国特許第６，１４７，２００号明細書；米国特許第６，１６６，１９７号明細書；米国特許第６，２２２，０２５号明細書；米国特許第６，２３５，８８７号明細書；米国特許第６，３８０，３６８号明細書；米国特許第６，５２８，６４０号明細書；米国特許第６，６３９，０６２号明細書；米国特許第６，６１７，４３８号明細書；米国特許第７，０４５，６１０号明細書；米国特許第７，４２７，６７２号明細書；および米国特許第７，４９５，０８８号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0243】

ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つ以上の二環式糖部分を含むように修飾され得る。「二環式糖」は、２つの原子の架橋によって修飾されたフラノシル環である。「二環式ヌクレオシド」（「ＢＮＡ」）は、糖環の２つの炭素原子を接続する架橋を含む糖部分を有し、それにより二環式環系を形成するヌクレオシドである。特定の実施形態では、架橋は、糖環の４’－炭素と２’－炭素とを接続する。したがって、一部の実施形態では、本発明の作用物質は、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）を含むように修飾され得るｉＲＮＡのＲＮＡを含んでもよい。ロックド核酸は、リボース部分が２’および４’炭素を接続する余分な架橋を含むような修飾リボース部分を有するヌクレオチドである。換言すれば、ＬＮＡは、４’－ＣＨ_２－Ｏ－２’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造は、リボースを３’末端の構造的立体配座に有効に「ロックする」。固定化核酸のｓｉＲＮＡへの付加は、血清中でのｓｉＲＮＡの安定性を高め、オフターゲット効果を低減することが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１）：４３９－４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ Ｃａｎｃ Ｔｈｅｒ ６（３）：８３３－８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５－３１９３）。

【0244】

本発明のポリヌクレオチドにおいて用いられる二環式ヌクレオシドの例として、限定はされないが、４’および２’リボシル環原子の間に架橋を含むヌクレオシドが挙げられる。特定の実施形態では、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド剤は、４’から２’への架橋を含む１つ以上の二環式ヌクレオシドを含む。かかる４’から２’に架橋された二環式ヌクレオシドの例として、限定はされないが、４’－（ＣＨ_２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）；４’－（ＣＨ_２）－Ｓ－２’；４’－（ＣＨ_２）２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）；４’－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ－２’（「束縛エチル」または「ｃＥｔ」とも称される）および４’－ＣＨ（ＣＨ_２ＯＣＨ_３）－Ｏ－２’（およびそのアナログ；例えば米国特許第７，３９９，８４５号明細書を参照）；４’－Ｃ（ＣＨ_３）（ＣＨ_３）－Ｏ－２’（およびそのアナログ；例えば米国特許第８，２７８，２８３号明細書を参照）；４’－ＣＨ_２－Ｎ（ＯＣＨ_３）－２’（およびそのアナログ；例えば米国特許第８，２７８，４２５号明細書を参照）；４’－ＣＨ_２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ_３）－２’（例えば米国特許出願公開第２００４／０１７１５７０号明細書を参照）；４’－ＣＨ_２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’（式中、ＲはＨ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、または保護基）（例えば米国特許第７，４２７，６７２号明細書を参照）；４’－ＣＨ_２－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ_３）－２’（例えば、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８－１３４を参照）；および４’－ＣＨ_２－Ｃ（＝ＣＨ_２）－２’（およびそのアナログ；例えば米国特許第８，２７８，４２６号明細書を参照）が挙げられる。前述の各々の内容全体はここで参照により本明細書中に援用される。

【0245】

ロックド核酸ヌクレオチドの調製について教示するさらなる代表的な米国特許および米国特許出願公開として、限定はされないが、以下、すなわち、米国特許第６，２６８，４９０号明細書；米国特許第６，５２５，１９１号明細書；米国特許第６，６７０，４６１号明細書；米国特許第６，７７０，７４８号明細書；米国特許第６，７９４，４９９号明細書；米国特許第６，９９８，４８４号明細書；米国特許第７，０５３，２０７号明細書；米国特許第７，０３４，１３３号明細書；米国特許第７，０８４，１２５号明細書；米国特許第７，３９９，８４５号明細書；米国特許第７，４２７，６７２号明細書；米国特許第７，５６９，６８６号明細書；米国特許第７，７４１，４５７号明細書；米国特許第８，０２２，１９３号明細書；米国特許第８，０３０，４６７号明細書；米国特許第８，２７８，４２５号明細書；米国特許第８，２７８，４２６号明細書；米国特許第８，２７８，２８３号明細書；米国特許出願公開第２００８／００３９６１８号明細書；および米国特許出願公開第２００９／００１２２８１号明細書が挙げられ、それら各々の内容全体はここで参照により本明細書中に援用される。

【0246】

前述の二環式ヌクレオシドのいずれかは、例えばα－Ｌ－リボフラノースおよびβ－Ｄ－リボフラノースを含む１つ以上の立体化学的糖配置を有するように調製され得る（国際公開第９９／１４２２６号パンフレットを参照）。

【0247】

ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つ以上の束縛エチルヌクレオチドを含むように修飾され得る。本明細書で用いられるとき、「束縛エチルヌクレオチド」または「ｃＥｔ」は、４’－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ－２’架橋を含む二環式糖部分を含むロックド核酸である。一実施形態では、束縛エチルヌクレオチドは、本明細書中で「Ｓ－ｃＥｔ」と称されるＳ立体配置をなす。

【0248】

本発明のｉＲＮＡはまた、１つ以上の「立体構造的に制限されたヌクレオチド」（「ＣＲＮ」）を含んでもよい。ＣＲＮは、リボースのＣ２’およびＣ４’炭素またはリボースのＣ３およびＣ５’炭素を接続するリンカーを伴うヌクレオチドアナログである。ＣＲＮは、リボース環を安定な立体配置にロックし、ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーション親和性を増加させる。リンカーは、酸素を安定性および親和性にとって最適な位置に配置し、リボース環のパッカリングの低減をもたらすのに十分な長さを有する。

【0249】

特定の上記のＣＲＮの調製について教示する代表的な公開として、限定はされないが、米国特許第出願公開第２０１３／０１９０３８３号明細書；およびＰＣＴ公開の国際公開第２０１３／０３６８６８号パンフレット（それら各々の内容全体はここで参照により本明細書中に援用される）が挙げられる。

【0250】

本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの１つ以上はまた、ヒドロキシメチル置換ヌクレオチドを含んでもよい。「ヒドロキシメチル置換ヌクレオチド」は、非環式２’－３’－セコ－ヌクレオチド（「非ロックド核酸」（「ＵＮＡ」）修飾とも称される）である。

【0251】

ＵＮＡの調製について教示する代表的な米国公開として、限定はされないが、米国特許第８，３１４，２２７号明細書；および米国特許出願公開第２０１３／００９６２８９号明細書；米国特許出願公開第２０１３／００１１９２２号明細書；および米国特許出願公開第２０１１／０３１３０２０号明細書（それら各々の内容全体はここで参照により本明細書中に援用される）が挙げられる。

【0252】

本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの他の修飾は、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖上の５’リン酸または５’リン酸模倣物、例えば５’末端リン酸またはリン酸模倣物を含む。好適なリン酸模倣物は、例えば米国特許出願公開第２０１２／０１５７５１１号明細書（その内容全体は参照により本明細書中に援用される）に開示されている。

【0253】

ＲＮＡ分子末端に対する潜在的安定化修飾としては、Ｎ－（アセチルアミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ）、Ｎ－（カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６）、Ｎ－（アセチル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ）、チミジン－２’－０－デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ－（アミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－アミノ）、２－ドコサノイル－ウリジン－３”－リン酸、逆転塩基ｄＴ（ｉｄＴ）などが挙げられる。この修飾の開示は、国際公開第２０１１／００５８６１号パンフレットにある。

【0254】

Ａ．モチーフを含む修飾ｉＲＮＡ
本発明の特定の態様では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、例えば米国特許出願公開第２０１４／０３１５８３５号明細書およびＰＣＴ公開の国際公開第２０１３／０７５０３５号パンフレット（それら各々の内容全体は参照により本明細書中に援用される）に開示されるような化学修飾を有する作用物質を含む。本明細書および米国特許出願公開第２０１４／０３１５８３５号明細書およびＰＣＴ公開の国際公開第２０１３／０７５０３５号パンフレットに示されるように、３つの連続ヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つ以上のモチーフを、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖、特に切断部位またはその近傍に導入することにより、優位な結果が得られることがある。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、それ以外では完全に修飾されてもよい。これらのモチーフの導入により、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の（もしあれば）修飾パターンが中断される。ＲＮＡｉ剤は、任意選択的には、例えばセンス鎖上でＧａｌＮＡｃ誘導体リガンドと結合されてもよい。得られるＲＮＡｉ剤は、優位な遺伝子サイレンシング活性を示す。

【0255】

より具体的には、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖が、ＲＮＡｉ剤の少なくとも１本の鎖の切断部位またはその近傍で３つの連続ヌクレオチド上に３つの同一修飾のモチーフを１つ以上有するように完全に修飾されるとき、ＲＮＡｉ剤の遺伝子サイレンシング活性が優位に増強されたことが意外にも発見されている。

【0256】

したがって、本発明は、生体内で標的遺伝子（すなわちＰＣＳＫ９遺伝子）の発現を阻害する能力がある二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。ＲＮＡｉ剤の各鎖は、１２～３０ヌクレオチド長の範囲であってもよい。例えば、各鎖は、１４～３０ヌクレオチド長、１７～３０ヌクレオチド長、２５～３０ヌクレオチド長、２７～３０ヌクレオチド長、１７～２３ヌクレオチド長、１７～２１ヌクレオチド長、１７～１９ヌクレオチド長、１９～２５ヌクレオチド長、１９～２３のヌクレオチド長、１９～２１ヌクレオチド長、２１～２５ヌクレオチド長、もしくは２１～２３ヌクレオチド長の間であってもよい。

【0257】

センス鎖およびアンチセンス鎖は、典型的には本明細書中で「ＲＮＡｉ剤」とも称される二本鎖としての二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を形成する。ＲＮＡｉ剤の二本鎖領域は、１２～３０ヌクレオチド対長であってもよい。例えば、二本鎖領域は、１４～３０ヌクレオチド対長、１７～３０ヌクレオチド対長、２７～３０ヌクレオチド対長、１７～２３ヌクレオチド対長、１７～２１ヌクレオチド対長、１７～１９ヌクレオチド対長、１９～２５ヌクレオチド対長、１９～２３のヌクレオチド対長、１９～２１ヌクレオチド対長、２１～２５ヌクレオチド対長、または２１～２３ヌクレオチド対長の間であり得る。別の例では、二本鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、および２７ヌクレオチド長から選択され得る。

【0258】

一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、鎖の一方または双方の３’末端、５’末端、または両末端に１つ以上のオーバーハング領域および／またはキャッピング基を含んでもよい。オーバーハングは、１～６ヌクレオチド長、例えば２～６ヌクレオチド長、１～５ヌクレオチド長、２～５ヌクレオチド長、１～４ヌクレオチド長、２～４ヌクレオチド長、１～３ヌクレオチド長、２～３ヌクレオチド長、または１～２ヌクレオチド長であり得る。オーバーハングは、鎖の一方が他方より長いことの結果、または同じ長さの２本の鎖がねじれ形であることの結果であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成し得るか、または標的化されている遺伝子配列に対して相補的であり得るか、または別の配列であり得る。第１鎖および第２鎖はまた、例えば、ヘアピンを形成するのに付加的塩基により、または他の非塩基リンカーにより、連結され得る。

【0259】

一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のオーバーハング領域内のヌクレオチドは各々独立して、修飾または非修飾ヌクレオチド、例えば限定はされないが、２’－糖修飾、例えば、２－Ｆ、２’－Ｏ－メチル、チミジン（Ｔ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびそれらの任意の組み合わせであり得る。例えば、ＴＴは、いずれかの鎖上のいずれかの末端におけるオーバーハング配列であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成し得るか、または標的化されている遺伝子配列に対して相補的であり得るか、または別の配列であり得る。

【0260】

ＲＮＡｉ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖または両鎖での５’－または３’－オーバーハングは、リン酸化されてもよい。一部の実施形態では、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートを有する２つのヌクレオチドを含み、ここで２つのヌクレオチドは同じかまたは異なる可能性がある。一実施形態では、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、または両鎖の３’末端に存在する。一実施形態では、この３’－オーバーハングは、アンチセンス鎖内に存在する。一実施形態では、この３’－オーバーハングは、センス鎖内に存在する。

【0261】

ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉの干渉活性をその全体的安定性に影響することなく強化し得る単一のオーバーハングのみを含んでもよい。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の３’末端、または代替的にアンチセンス鎖の３’末端に位置してもよい。ＲＮＡｉはまた、アンチセンス鎖の５’末端（またはセンス鎖の３’末端）にまたはその逆として位置する平滑末端を有してもよい。一般に、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端は平滑である。理論によって拘束されたくないが、アンチセンス鎖の５’末端での非対称平滑末端およびアンチセンス鎖の３’末端でのオーバーハングでは、ガイド鎖をＲＩＳＣプロセスに負荷することが好ましい。

【0262】

一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、１９ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｄｅｄ ｂｌｕｎｔｍｅｒ）であり、ここでセンス鎖は、５’末端から７、８、９位の３つの連続ヌクレオチド上に３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位の３つの連続ヌクレオチド上に３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。

【0263】

別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、２０ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖であり、ここでセンス鎖は、５’末端から８、９、１０位の３つの連続ヌクレオチド上に３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位の３つの連続ヌクレオチド上に３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。

【0264】

さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、２１ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖であり、ここでセンス鎖は、５’末端から９、１０、１１位の３つの連続ヌクレオチド上に３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位の３つの連続ヌクレオチド上に３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。

【0265】

一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、２１のヌクレオチドセンス鎖および２３のヌクレオチドアンチセンス鎖を含み、ここでセンス鎖は、５’末端から９、１０、１１位の３つの連続ヌクレオチド上に３つの２’－Ｆ修飾のモチーフを少なくとも１つ含み；アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位の３つの連続ヌクレオチド上に３つの２’－Ｏ－メチル修飾のモチーフを少なくとも１つ含み、ここでＲＮＡｉ剤の一方の末端は平滑である一方、他方の末端は２ヌクレオチドオーバーハングを含む。好ましくは、２ヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端に存在する。２ヌクレオチドオーバーハングがアンチセンス鎖の３’末端に存在するとき、３つのヌクレオチド末端間に２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合が存在してもよく、ここで３つのうちの２つのヌクレオチドはオーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドはオーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。一実施形態では、ＲＮＡｉ剤はさらに、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の５’末端の双方で、３つのヌクレオチド末端間に２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合を有する。一実施形態では、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖におけるすべてのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。一実施形態では、各残基は独立して、例えば交互モチーフにおいて、２’－Ｏ－メチルまたは３’－フルオロで修飾される。任意選択的には、ＲＮＡｉ剤は、リガンド（好ましくはＧａｌＮＡｃ_３）をさらに含む。

【0266】

一実施形態では、ＲＮＡｉ剤はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここでセンス鎖は２５～３０ヌクレオチド残基長であり、第１鎖の５’末端ヌクレオチド（１位）から始まる１～２３位は少なくとも８つのリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は３６～６６ヌクレオチド残基長であり、二本鎖を形成するため、センス鎖の３’末端ヌクレオチドから始まる１～２３位と対合される位置に少なくとも８つのリボヌクレオチドを含み；ここでアンチセンス鎖の少なくとも３’末端ヌクレオチドはセンス鎖と対合されず、また最大で６つの連続する３’末端ヌクレオチドはセンス鎖と対合されず、それにより１～６のヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し；ここでアンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と対合されない１０～３０の連続ヌクレオチドを含み、それにより１０～３０のヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し；ここで少なくともセンス鎖の５’末端および３’末端のヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖が最大の相補性に向けて整列されるとき、アンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対合され、それによりセンス鎖とアンチセンス鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し；また二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるとき、標的遺伝子の発現を減少させるため、アンチセンス鎖はアンチセンス鎖長の少なくとも１９のリボヌクレオチドに沿う標的ＲＮＡに対して十分に相補的であり；またセンス鎖は、３つの連続ヌクレオチド上に３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、ここでモチーフの少なくとも１つは切断部位またはその近傍に存在する。アンチセンス鎖は、切断部位またはその近傍で３つの連続ヌクレオチド上に３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。

【0267】

一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここでＲＮＡｉ剤は、少なくとも２５、最大で２９ヌクレオチドの長さを有する第１鎖および５’末端から１１、１２、１３位で３つの連続ヌクレオチド上に３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを有する最大で３０ヌクレオチドの長さを有する第２鎖を含み；ここで第１鎖の３’末端および第２鎖の５’末端は平滑末端を形成し、第２鎖はその３’末端で第１鎖よりも１～４のヌクレオチド分長く、ここで二本鎖領域は少なくとも２５ヌクレオチド長である領域であり、またＲＮＡｉ剤が哺乳動物細胞に導入されるときに標的遺伝子の発現を減少させるため、第２鎖は第２鎖長の少なくとも１９のヌクレオチドに沿って標的ｍＲＮＡに対して十分に相補的であり、またここでＲＮＡｉ剤のダイサー切断は、第２鎖の３’末端を含むｓｉＲＮＡを優先的にもたらし、それにより哺乳動物における標的遺伝子の発現を減少させる。任意選択的には、ＲＮＡｉ剤は、リガンドをさらに含む。

【0268】

一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３つの連続ヌクレオチド上に３つの同一修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの１つは、センス鎖における切断部位に存在する。

【0269】

一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖もまた、３つの連続ヌクレオチド上に３つの同一修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの１つは、アンチセンス鎖における切断部位またはその近傍で存在する。

【0270】

１７～２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有するＲＮＡｉ剤においては、アンチセンス鎖の切断部位は、典型的には５’末端から１０、１１および１２位辺りである。したがって、３つの同一修飾のモチーフは、アンチセンス鎖の９、１０、１１位；１０、１１、１２位；１１、１２、１３位；１２、１３、１４位；または１３、１４、１５位に存在してもよく、カウントはアンチセンス鎖の５’末端から最初のヌクレオチドから開始するか、またはカウントはアンチセンス鎖の５’末端から二本鎖領域内部の最初の対合ヌクレオチドから開始する。アンチセンス鎖内の切断部位はまた、５’末端からのＲＮＡｉの二本鎖領域の長さに応じて変化してもよい。

【0271】

ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、鎖の切断部位での３つの連続ヌクレオチド上に３つの同一修飾の少なくとも１つのモチーフを有してもよく；またアンチセンス鎖は、鎖の切断部位またはその近傍での３つの連続ヌクレオチド上に３つの同一修飾の少なくとも１つのモチーフを有してもよい。センス鎖およびアンチセンス鎖がｄｓＲＮＡ二本鎖を形成するとき、センス鎖およびアンチセンス鎖は、センス鎖上の３つのヌクレオチドの１つのモチーフおよびアンチセンス鎖上の３つのヌクレオチドの１つのモチーフが少なくとも１つのヌクレオチド重複を有するように、すなわち、センス鎖内のモチーフの３つのヌクレオチドの少なくとも１つがアンチセンス鎖内のモチーフの３つのヌクレオチドの少なくとも１つと塩基対を形成するように整列され得る。あるいは、少なくとも２つのヌクレオチドが重複してもよく、または３つすべてのヌクレオチドが重複してもよい。

【0272】

一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３つの連続ヌクレオチド上に３つの同一修飾の２つ以上のモチーフを含んでもよい。第１のモチーフは、鎖の切断部位またはその近傍に存在してもよく、他方のモチーフは、ウィング修飾（ｗｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）であってもよい。用語「ウィング修飾」は、本明細書中で、同じ鎖の切断部位またはその近傍のモチーフから分離される鎖のもう一方の部分に存在するモチーフを指す。ウィング修飾は、第１のモチーフに隣接するかまたは少なくとも１つ以上のヌクレオチドによって分離される。それらモチーフが互いに直に隣接するとき、モチーフの化学は互いに異なり、それらモチーフが１つ以上のヌクレオチドにより分離されるとき、化学は同じかまたは異なる可能性がある。２つ以上のウィング修飾が存在してもよい。例えば、２つのウィング修飾が存在するとき、各ウィング修飾は、切断部位もしくはその近傍に存在する第１のモチーフに対する１つの末端またはリードモチーフのいずれかの側に存在してもよい。

【0273】

センス鎖同様、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、鎖の切断部位またはその近傍に存在するモチーフの少なくとも１つとともに、３つの連続ヌクレオチド上に３つの同一修飾の２つ以上のモチーフを含んでもよい。このアンチセンス鎖はまた、センス鎖上に存在してもよいウィング修飾と同様に整列化された１つ以上のウィング修飾を含んでもよい。

【0274】

一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖上のウィング修飾は、典型的には、鎖の３’末端、５’末端または両末端に最初の１つもしくは２つの末端ヌクレオチドを含まない。

【0275】

別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖上のウィング修飾は、典型的には、鎖の３’末端、５’末端または両末端の二本鎖領域内部に最初の１つもしくは２つの対合ヌクレオチドを含まない。

【0276】

ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖が各々、少なくとも１つのウィング修飾を含むとき、ウィング修飾は、二本鎖領域の同じ末端上に含まれ、かつ１つ、２つもしくは３つのヌクレオチドの重複を有してもよい。

【0277】

ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖が各々、少なくとも２つのウィング修飾を含むとき、センス鎖およびアンチセンス鎖は、１つの鎖からの２つの修飾が各々、１つ、２つもしくは３つのヌクレオチドの重複を有する二本鎖領域の一方の末端に含まれ；１つの鎖からの２つの修飾が各々、１つ、２つもしくは３つのヌクレオチドの重複を有する二本鎖領域の他方の末端に含まれ；１つの鎖の２つの修飾が、二本鎖領域内に１つ、２つもしくは３つのヌクレオチドの重複を有するリードモチーフの各側に含まれるように整列され得る。

【0278】

一実施形態では、モチーフの一部のヌクレオチドを含む、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖におけるすべてのヌクレオチドは修飾されてもよい。各ヌクレオチドは、同じまたは異なる修飾で修飾されてもよく、その修飾は、非結合リン酸酸素および／または１つ以上の結合リン酸酸素の一方または両方の１つ以上の変更；リボース糖の成分、例えばリボース糖の２’ヒドロキシルの変更；リン酸部分の「デホスホ」リンカーでの大量の置換；天然塩基の修飾または置換；およびリボース－リン酸骨格の置換または修飾を含み得る。

【0279】

核酸がサブユニットのポリマーであることから、例えば、塩基、またはリン酸部分、またはリン酸部分の非連結Ｏの修飾といった修飾の多くは、核酸内部で反復される位置に存在する。場合によっては、修飾は核酸中のあらゆる対象位置で存在することになるが、多くの場合、そうならない。例として、修飾は、３’もしくは５’末端位置に限って存在してもよく、末端領域内、例えば末端ヌクレオチド上のある位置または鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチド中に限って存在してもよい。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、またはその双方において存在してもよい。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域内に限って存在してもよく、またはＲＮＡの一本鎖領域内に限って存在してもよい。例えば、非連結Ｏ位置でのホスホロチオエート修飾は、一末端または両末端に限って存在してもよく、末端領域内、例えば末端ヌクレオチド上のある位置または鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチド中に限って存在してもよく、または二本鎖および一本鎖領域内、特に末端で存在してもよい。５’末端は、リン酸化され得る。

【0280】

例えば、安定性を増強させるか、オーバーハング中に特定塩基を含めるか、または一本鎖オーバーハング中、例えば５’もしくは３’オーバーハング中、または双方に修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代替物を含めることは可能であり得る。例えば、オーバーハング中にプリンヌクレオチドを含めることが望ましい可能性がある。一部の実施形態では、３’もしくは５’オーバーハング中の塩基の全部もしくは一部が、例えば本明細書に記載の修飾で修飾されてもよい。修飾は、例えばリボース糖の２’位での当該技術分野で公知の修飾による修飾の使用、例えば核酸塩基のリボ糖に代わるデオキシリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）もしくは２’－Ｏ－メチル修飾の使用、およびリン酸基における修飾、例えばホスホロチオエート修飾を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。

【0281】

一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立してＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、または２’－フルオロで修飾される。それらの鎖は、２つ以上の修飾を含み得る。一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立して２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで修飾される。

【0282】

少なくとも２つの異なる修飾は、典型的にはセンス鎖およびアンチセンス鎖上に存在する。それら２つの修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾、またはその他であってもよい。

【0283】

一実施形態では、Ｎ_ａおよび／またはＮ_ｂは、交互パターンの修飾を含む。用語「交互モチーフ」は、本明細書で用いられるとき、１つ以上の修飾を有するモチーフであって、各修飾が１本の鎖の交互ヌクレオチド上に存在するものを指す。交互ヌクレオチドは、１つ置きのヌクレオチドごとに１つまたは３つのヌクレオチドごとに１つ、または類似パターンを指してもよい。例えば、Ａ、ＢおよびＣの各々がヌクレオチドに対する１つの修飾タイプを表す場合、交互モチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ…」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ…」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ…」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ…」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ…」、または「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ…」などであり得る。

【0284】

交互モチーフ内に含まれる修飾のタイプは、同じであってもまたは異なってもよい。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの各々がヌクレオチドに対する１つの修飾タイプを表す場合、交互パターン、すなわち１つ置きのヌクレオチドに対する修飾は、同じであってもよいが、センス鎖またはアンチセンス鎖の各々は、例えば「ＡＢＡＢＡＢ…」、「ＡＣＡＣＡＣ…」、「ＢＤＢＤＢＤ…」または「ＣＤＣＤＣＤ…」など、交互モチーフ内部の幾つかの修飾の可能性から選択され得る。

【0285】

一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、センス鎖上の交互モチーフにおける修飾パターンが、アンチセンス鎖上の交互モチーフにおける修飾パターンに対して変化することを含む。センス鎖のヌクレオチドの修飾基がアンチセンス鎖のヌクレオチドの異なる修飾基に対応し、またその逆もいえるような変化であってもよい。例えば、センス鎖がｄｓＲＮＡ二本鎖におけるアンチセンス鎖と対合するとき、二本鎖領域内部で、センス鎖内の交互モチーフは鎖の５’－３’から「ＡＢＡＢＡＢ」で開始してもよく、またアンチセンス鎖内の交互モチーフは鎖の５’－３’から「ＢＡＢＡＢＡ」で開始してもよい。別の例として、二本鎖領域内部で、センス鎖内の交互モチーフは鎖の５’－３’から「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」で開始してもよく、またアンチセンス鎖内の交互モチーフは鎖の５’－３’から「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」で開始してもよく、それによりセンス鎖とアンチセンス鎖との間に修飾パターンの完全な変化または部分的変化が存在する。

【0286】

一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、最初のセンス鎖上の２’－Ｏ－メチル修飾および２’－Ｆ修飾の交互モチーフのパターンが、最初のアンチセンス鎖上の２’－Ｏ－メチル修飾および２’－Ｆ修飾の交互モチーフのパターンに対して変化を有する、すなわちセンス鎖上の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドがアンチセンス鎖上の２’－Ｆ修飾ヌクレオチドと塩基対合し、またその逆もいえることを含む。センス鎖の１位は２’－Ｆ修飾で開始してもよく、またアンチセンス鎖の１位は２’－Ｏ－メチル修飾で開始してもよい。

【0287】

センス鎖および／またはアンチセンス鎖に対する３つの連続ヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つ以上のモチーフの導入により、センス鎖および／またはアンチセンス鎖内に存在する最初の修飾パターンが中断される。センス鎖および／またはアンチセンス鎖に対して３つの連続ヌクレオチド上に３つの同一修飾の１つ以上のモチーフを導入することによる、センスおよび／またはアンチセンス鎖の修飾パターンのこの中断は、意外にも標的遺伝子に対する遺伝子サイレンシング活性を増強する。

【0288】

一実施形態では、３つの連続ヌクレオチド上の３つの同一修飾のモチーフが鎖のいずれかに導入されるとき、モチーフに隣接するヌクレオチドの修飾は、モチーフの修飾と異なる修飾である。例えば、モチーフを含む配列の一部は「…Ｎ_ａＹＹＹＮ_ｂ…」であり、ここで「Ｙ」は、３つの連続ヌクレオチド上の３つの同一修飾のモチーフの修飾を表し、かつ「Ｎ_ａ」および「Ｎ_ｂ」は、Ｙの修飾と異なる、モチーフ「ＹＹＹ」に隣接するヌクレオチドに対する修飾を表し、またここでＮ_ａおよびＮ_ｂは、同じまたは異なる修飾であり得る。あるいは、Ｎ_ａおよび／またはＮ_ｂは、ウィング修飾が存在するとき、存在してもまたは不在であってもよい。

【0289】

ＲＮＡｉ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合をさらに含んでもよい。ホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖または両鎖の、鎖の任意の位置における任意のヌクレオチド上に存在してもよい。例えば、ヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖上のすべてのヌクレオチド上に存在してもよい；各ヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖上に交互パターンで存在してもよい；またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、両方のヌクレオチド間結合修飾を交互パターンで含んでもよい。センス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じでもまたは異なってもよく、またセンス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンに対して変化を有してもよい。一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、６～８のホスホロチオエートのヌクレオチド間結合を含む。一実施形態では、アンチセンス鎖は、５’末端での２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合および３’末端での２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合を含み、またセンス鎖は、５’末端または３’末端のいずれかに少なくとも２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合を含む。

【0290】

一実施形態では、ＲＮＡｉは、オーバーハング領域内にホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合を有する２つのヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチド間結合修飾はまた、オーバーハングヌクレオチドを二本鎖領域内部の末端の対合ヌクレオチドと連結するために設けられてもよい。例えば、少なくとも２、３、４、もしくはすべてのオーバーハングヌクレオチドは、ホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合を通じて連結されてもよく、任意選択的には、オーバーハングヌクレオチドをオーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドと連結する、追加的なホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合が存在してもよい。例えば、末端の３つのヌクレオチド間に少なくとも２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合が存在してもよく、ここで３つのうちの２つのヌクレオチドはオーバーハングヌクレオチドであり、かつ３つ目はオーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。これら末端の３つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端、センス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の５’末端、および／またはアンチセンス鎖の５’末端に存在してもよい。

【0291】

一実施形態では、２ヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端に存在し、かつ末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合が存在し、ここで３つのうちの２つのヌクレオチドはオーバーハングヌクレオチドであり、かつ第３のヌクレオチドはオーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。任意選択的には、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の５’末端の双方で、末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合をさらに有してもよい。

【0292】

一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、標的との、二本鎖内部に、またはそれらの組み合わせにてミスマッチを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域内または二本鎖領域内に存在してもよい。塩基対は、解離または融解を促進するその傾向に基づいて順位付けされてもよい（例えば、最も簡単な手法は、特定の対合の会合または解離の自由エネルギーについて、その対合を個別の対合に基づいて検討することであるが、酷似または類似の分析もまた用いることができる）。解離を促進する観点では、Ａ：ＵはＧ：Ｃよりも好ましく；Ｇ：ＵはＧ：Ｃよりも好ましく；かつＩ：ＣはＧ：Ｃよりも好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば非基準もしくは基準以外の対合（本明細書中の他の箇所で記載の通り）は、基準（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対合よりも好ましく；またユニバーサル塩基を含む対合は、基準の対合よりも好ましい。

【0293】

一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、二本鎖の５’末端でのアンチセンス鎖の解離を促進するため、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃ、およびミスマッチ対、例えば非基準もしくは基準以外の対合またはユニバーサル塩基を含む対合の群から独立して選択される、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内部の最初の１、２、３、４、もしくは５つの塩基対の少なくとも１つを含む。

【0294】

一実施形態では、アンチセンス鎖における５’末端からの二本鎖領域内部の１位のヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、およびｄＴからなる群から選択される。あるいは、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内部の最初の１、２もしくは３つの塩基対の少なくとも１つはＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内部の最初の塩基対はＡＵ塩基対である。

【0295】

別の実施形態では、センス鎖の３’末端でのヌクレオチドはデオキシ－チミン（ｄＴ）である。別の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端でのヌクレオチドはデオキシ－チミン（ｄＴ）である。一実施形態では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端上にデオキシ－チミンヌクレオチド、例えば２つのｄＴヌクレオチドの短い配列が存在する。

【0296】

一実施形態では、センス鎖配列は、式（Ｉ）：
５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－（ＺＺＺ）_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’（Ｉ）
（式中、
ｉおよびｊは、各々独立して０または１であり；
ｐおよびｑは、各々独立して０～６であり；
各Ｎ_ａは、独立して０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含み；
各Ｎ_ｂは、独立して０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎ_ｐおよびｎ_ｑは、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；
Ｎ_ｂおよびＹは、同じ修飾を有さず；かつ
ＸＸＸ、ＹＹＹおよびＺＺＺは、各々独立して３つの連続ヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つのモチーフを表す）
によって表されてもよい。好ましくは、ＹＹＹは、すべての２’－Ｆ修飾ヌクレオチドである。

【0297】

一実施形態では、Ｎ_ａおよび／またはＮ_ｂは、交互パターンの修飾を含む。

【0298】

一実施形態では、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。例えば、ＲＮＡｉ剤が１７～２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有するとき、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在し得（例えば、６、７、８、７、８、９、８、９、１０、９、１０、１１、１０、１１、１２もしくは１１、１２、１３位に存在し得）、ここでカウントは５’末端から最初のヌクレオチドで開始するか、または任意選択的には、カウントは５’末端から二本鎖領域内部の最初の対合ヌクレオチドで開始する。

【0299】

一実施形態では、ｉは１でｊは０か、またはｉは０でｊは１か、またはｉおよびｊは双方とも１である。したがって、センス鎖は、以下の式：
５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－ＺＺＺ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’（Ｉｂ）；
５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＸＸＸ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’（Ｉｃ）；または
５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＸＸＸ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－ＺＺＺ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’（Ｉｄ）
によって表され得る。

【0300】

センス鎖が式（Ｉｂ）によって表されるとき、Ｎ_ｂは、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２もしくは０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａは、独立して２～２０、２～１５、もしくは２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。

【0301】

センス鎖が式（Ｉｃ）によって表されるとき、Ｎ_ｂは、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２もしくは０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａは、独立して２～２０、２～１５、もしくは２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。

【0302】

センス鎖が式（Ｉｄ）によって表されるとき、各Ｎ_ｂは、独立して０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２もしくは０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎ_ｂは、０、１、２、３、４、５もしくは６である。各Ｎ_ａは、独立して２～２０、２～１５、もしくは２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。Ｘ、ＹおよびＺの各々は、互いに同じであってもまたは異なってもよい。

【0303】

他の実施形態では、ｉが０でｊが０であり、かつセンス鎖は、式：
５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＹＹＹ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’（Ｉａ）
によって表されてもよい。

【0304】

センス鎖が式（Ｉａ）によって表されるとき、各Ｎ_ａは、独立して２～２０、２～１５、もしくは２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。

【0305】

一実施形態では、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖配列は、式（ＩＩ）：
５’ｎ_ｑ’－Ｎ_ａ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）_ｋ－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）_ｌ－Ｎ’_ａ－ｎ_ｐ’３’ （ＩＩ）
（式中、
ｋおよびｌは、各々独立して０または１であり；
ｐ’およびｑ’は、各々独立して０～６であり；
各Ｎ_ａ’は、独立して０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含み；
各Ｎ_ｂ’は、独立して０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎ_ｐ’およびｎ_ｑ’は、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；
ここでＮ_ｂ’およびＹ’は、同じ修飾を有さず；かつ
Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立して３つの連続ヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つのモチーフを表す）
によって表されてもよい。

【0306】

一実施形態では、Ｎ_ａ’および／またはＮ_ｂ’は、交互パターンの修飾を含む。

【0307】

Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。例えば、ＲＮＡｉ剤が１７～２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有するとき、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の９、１０、１１位；１０、１１、１２位；１１、１２、１３位；１２、１３、１４位；または１３、１４、１５位に存在し得、ここでカウントは５’末端から最初のヌクレオチドで開始するか、または任意選択的には、カウントは５’末端から二本鎖領域内部の最初の対合ヌクレオチドで開始する。好ましくは、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、１１、１２、１３位に存在する。

【0308】

一実施形態では、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、すべての２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドである。

【0309】

一実施形態では、ｋが１でｌが０、またはｋが０でｌが１、またはｋおよびｌの双方が１である。

【0310】

したがって、アンチセンス鎖は、以下の式：
５’ｎ_ｑ’－Ｎ_ａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ａ’－ｎ_ｐ’３’（ＩＩｂ）；
５’ｎ_ｑ’－Ｎ_ａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－ｎ_ｐ’３’（ＩＩｃ）；または
５’ｎ_ｑ’－Ｎ_ａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎ_ａ’－ｎ_ｐ’３’（ＩＩｄ）
によって表され得る。

【0311】

アンチセンス鎖が式（ＩＩｂ）によって表されるとき、Ｎ_ｂ’は、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２もしくは０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａ’は、独立して２～２０、２～１５、もしくは２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

【0312】

アンチセンス鎖が式（ＩＩｃ）によって表されるとき、Ｎ_ｂ’は、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２もしくは０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａ’は、独立して２～２０、２～１５、もしくは２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

【0313】

アンチセンス鎖が式（ＩＩｄ）によって表されるとき、各Ｎ_ｂ’は、独立して０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２もしくは０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａ’は、独立して２～２０、２～１５、もしくは２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎ_ｂは、０、１、２、３、４、５もしくは６である。

【0314】

他の実施形態では、ｋが０でｌが０であり、かつアンチセンス鎖は、式：
５’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’３’（Ｉａ）
によって表されてもよい。

【0315】

アンチセンス鎖が式（ＩＩａ）として表されるとき、各Ｎ_ａ’は、独立して２～２０、２～１５、もしくは２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｘ’、Ｙ’およびＺ’の各々は、互いに同じであってもまたは異なってもよい。センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立して、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－ヒドロキシル、または２’－フルオロで修飾されてもよい。例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立して２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで修飾される。各Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は、特に２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾を表してもよい。

【0316】

一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、二本鎖領域が２１ｎｔであるとき、鎖の９、１０および１１位に存在するＹＹＹモチーフを含んでもよく、カウントは５’末端から最初のヌクレオチドで開始するか、または任意選択的には、カウントは５’末端から二本鎖領域内部の最初の対合ヌクレオチドで開始し、またＹは２’－Ｆ修飾を表す。センス鎖は、二本鎖領域のその反対の末端にウィング修飾としてＸＸＸモチーフまたはＺＺＺモチーフをさらに含んでもよく；ＸＸＸおよびＺＺＺは、各々独立して２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表す。

【0317】

一実施形態では、アンチセンス鎖は、鎖の１１、１２、１３位に存在するＹ’Ｙ’Ｙ’モチーフを含んでもよく、カウントは５’末端から最初のヌクレオチドから開始するか、または任意選択的には、カウントは５’末端から二本鎖領域内部の最初の対合ヌクレオチドで開始し、またＹ’は２’－Ｏ－メチル修飾を表す。アンチセンス鎖は、二本鎖領域のその反対の末端にウィング修飾としてＸ’Ｘ’Ｘ’モチーフまたはＺ’Ｚ’Ｚ’モチーフをさらに含んでもよく；Ｘ’Ｘ’Ｘ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立して２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表す。

【0318】

上の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、および（Ｉｄ）のいずれか１つによって表されるセンス鎖は各々、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、および（ＩＩｄ）のいずれか１つによって表されているアンチセンス鎖と二本鎖を形成する。

【0319】

したがって、本発明の方法において用いられるＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでもよく、各鎖は１４～３０ヌクレオチドを有し、ＲＮＡｉ二本鎖は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－（ＺＺＺ）_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
アンチセンス：３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）_ｋ－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）_ｌ－Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’５’
（ＩＩＩ）
（式中、
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、各々独立して０または１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’は、各々独立して０～６であり；
各Ｎ_ａおよびＮ_ａ’は、独立して０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含み；
各Ｎ_ｂおよびＮ_ｂ’は、独立して０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ここで各ｎ_ｐ’、ｎ_ｐ、ｎ_ｑ’、およびｎ_ｑは各々、存在または不在の場合があり、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；かつ
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立して３つの連続ヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つのモチーフを表す）
によって表される。

【0320】

一実施形態では、ｉが０でｊが０；またはｉが１でｊが０；またはｉが０でｊが１；またはｉおよびｊが双方とも０；またはｉおよびｊが双方とも１である。別の実施形態では、ｋが０でｌが０；またはｋが１でｌが０；ｋが０でｌが１；またはｋおよびｌが双方とも０；またはｋおよびｌが双方とも１である。

【0321】

ＲＮＡｉ二本鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖の例示的な組み合わせは、以下の式：
５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＹＹＹ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ａ’ｎ_ｑ’５’
（ＩＩＩａ）
５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－ＺＺＺ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎ_ａ’ｎ_ｑ’５’
（ＩＩＩｂ）
５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＸＸＸ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’５’
（ＩＩＩｃ）
５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＸＸＸ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－ＺＺＺ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ’５’
（ＩＩＩｄ）
を含む。

【0322】

ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩａ）によって表されるとき、各Ｎ_ａは、独立して２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

【0323】

ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｂ）によって表されるとき、各Ｎ_ｂは、独立して１～１０、１～７、１～５または１～４の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａは、独立して２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

【0324】

ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｃ）として表されるとき、各Ｎ_ｂ、Ｎ_ｂ’は、独立して０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２もしくは０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａは、独立して２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

【0325】

ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）として表されるとき、各Ｎ_ｂ、Ｎ_ｂ’は、独立して０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａ、Ｎ_ａ’は、独立して２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｎ_ａ、Ｎ_ａ’、Ｎ_ｂおよびＮ_ｂ’の各々は、独立して交互パターンの修飾を含む。

【0326】

式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）におけるＸ、ＹおよびＺの各々は、互いに同じであってもまたは異なってもよい。

【0327】

ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表されるとき、Ｙヌクレオチドの少なくとも１つは、Ｙ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成してもよい。あるいは、Ｙヌクレオチドの少なくとも２つは、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成する；またはＹヌクレオチドの３つ全部はすべて、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。

【0328】

ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｂ）または（ＩＩＩｄ）によって表されるとき、Ｚヌクレオチドの少なくとも１つは、Ｚ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成してもよい。あるいは、Ｚヌクレオチドの少なくとも２つは、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成する；またはＺヌクレオチドの３つ全部はすべて、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。

【0329】

ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｃ）または（ＩＩＩｄ）として表されるとき、Ｘヌクレオチドの少なくとも１つは、Ｘ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成してもよい。あるいは、Ｘヌクレオチドの少なくとも２つは、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成する；またはＸヌクレオチドの３つ全部はすべて、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。

【0330】

一実施形態では、Ｙヌクレオチド上の修飾はＹ’ヌクレオチド上の修飾と異なり、Ｚヌクレオチド上の修飾はＺ’ヌクレオチド上の修飾と異なり、かつ／またはＸヌクレオチド上の修飾はＸ’ヌクレオチド上の修飾と異なる。

【0331】

一実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表されるとき、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾である。別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表されるとき、Ｎａ修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎ_ｐ’＞０であり、かつ少なくとも１つのｎ_ｐ’は隣接ヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結される。さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表されるとき、Ｎａ修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎ_ｐ’＞０であり、かつ少なくとも１つのｎ_ｐ’は隣接ヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結され、またセンス鎖は、二価または三価分岐リンカー（下記）を介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体に結合される。別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表されるとき、Ｎａ修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎ_ｐ’＞０であり、かつ少なくとも１つのｎ_ｐ’は隣接ヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結され、またセンス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、かつセンス鎖は、二価または三価分岐リンカーを介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体に結合される。

【0332】

一実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩａ）によって表されるとき、Ｎａ修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎ_ｐ’＞０であり、かつ少なくとも１つのｎ_ｐ’は隣接ヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結され、またセンス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、かつセンス鎖は、二価または三価分岐リンカーを介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体に結合される。

【0333】

一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表される少なくとも２つの二本鎖を含む多量体であり、ここで二本鎖はリンカーによって接続される。リンカーは、切断可能であるかまたは切断不能であり得る。任意選択的には、多量体は、リガンドをさらに含む。二本鎖の各々は、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的化し得る；または二本鎖の各々は、２つの異なる標的部位で同じ遺伝子を標的化し得る。

【0334】

一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表される３、４、５、６もしくはそれより多い二本鎖を含む多量体であり、ここで二本鎖はリンカーによって接続される。リンカーは、切断可能であるかまたは切断不能であり得る。任意選択的には、多量体は、リガンドをさらに含む。二本鎖の各々は、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的化し得る；または二本鎖の各々は、２つの異なる標的部位で同じ遺伝子を標的化し得る。

【0335】

一実施形態では、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表される２つのＲＮＡｉ剤は、５’末端、および３’末端の一方もしくは両方で互いに連結され、また任意選択的には、リガンドに結合される。作用物質の各々は、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的化し得る；または作用物質の各々は、２つの異なる標的部位で同じ遺伝子を標的化し得る。

【0336】

様々な公開では、本発明の方法にて使用可能な多量体ＲＮＡｉ剤についての記載がある。かかる公開は、国際公開第２００７／０９１２６９号パンフレット、米国特許第７８５８７６９号明細書、国際公開第２０１０／１４１５１１号パンフレット、国際公開第２００７／１１７６８６号パンフレット、国際公開第２００９／０１４８８７号パンフレットおよび国際公開第２０１１／０３１５２０号パンフレット（それら各々の内容全体はここで参照により本明細書中に援用される）を含む。

【0337】

下記にさらに詳述される通り、１つ以上の炭水化物部分のＲＮＡｉ剤への結合を含むＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤の１つ以上の特性を最適化し得る。多くの場合、炭水化物部分は、ＲＮＡｉ剤の修飾サブユニットに結合されることになる。例えば、ｄｓＲＮＡ剤の１つ以上のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖は、別の部分、例えば炭水化物リガンドが結合した非炭水化物（好ましくは環状）担体で置換され得る。サブユニットのリボース糖がそのように置換されているリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書中でリボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と称される。環状担体は炭素環式環系であってもよく、すなわちすべての環原子は炭素原子であるか、または複素環式環系、すなわち１つ以上の環原子は、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であってもよい。環状担体は、単環式環系であってもよく、または２つ以上の環、例えば融合環を含んでもよい。環状担体は、完全飽和環系であってもよく、または１つ以上の二重結合を含んでもよい。

【0338】

リガンドは、担体によってポリヌクレオチドに付着されてもよい。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格付着点（ｂａｃｋｂｏｎｅ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｏｉｎｔ）」、好ましくは２つの「骨格付着点」、および（ｉｉ）少なくとも１つの「テザー付着点（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｏｉｎｔ）」を含む。「骨格付着点」は、本明細書で用いられるとき、官能基、例えばヒドロキシル基、または一般に、リボ核酸の骨格、例えばリン酸塩の骨格、もしくは例えば硫黄を含有する修飾リン酸塩の骨格への担体の組み込みに利用可能でありかつ適した結合を指す。「テザー付着点」（ＴＡＰ）は、一部の実施形態では、選択された部分を接続する環状担体の構成環原子、例えば炭素原子またはヘテロ原子（骨格付着点を提供する原子とは異なる）を指す。その部分は、例えば糖質、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、および多糖であり得る。任意選択的には、選択された部分は、介在テザー（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｔｅｔｈｅｒ）によって環状担体に接続される。したがって、環状担体は、しばしば、官能基、例えばアミノ基を含むか、または一般に、別の化学的実体、例えばリガンドの構成環への組み込みまたは繋留に適した結合を提供することになる。

【0339】

ＲＮＡｉ剤は、担体を介してリガンドに結合されてもよく、ここで担体は、環式基または非環式基であり得；好ましくは、環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリルおよびデカリンから選択され；好ましくは、非環式基は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択される。

【0340】

特定の具体的な実施形態では、本発明の方法にて用いられるＲＮＡｉ剤は、表３、４、５、６、１８、１９、２０、２１、および２３のいずれか１つの中に列挙される作用物質の群から選択される作用物質である。これらの作用物質は、リガンドをさらに含んでもよい。

【0341】

ＩＶ．リガンド共役ｉＲＮＡ
本発明の方法にての使用に適したｉＲＮＡのＲＮＡの別の修飾は、ｉＲＮＡの活性、細胞分布、または細胞内取り込みを高める、１つまたは複数のリガンド、部分または複合体を、ＲＮＡに化学的に連結することを伴う。このような部分としては、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３－６５５６）などの脂質部分；コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４：１０５３－１０６０）；例えばベリル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６－３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５－２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９２，２０：５３３－５３８）などのチオエーテル；例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１９９１，１０：１１１１－１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７－３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９－５４）などの脂肪族鎖；例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１－３６５４；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７－３７８３）などのリン脂質；ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９－９７３）；またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１－３６５４）；パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９－２３７）；またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３－９３７）が挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0342】

一実施形態では、リガンドは、それが組み込まれたｉＲＮＡ剤の分布、標的化または寿命を変化させる。好ましい実施形態では、リガンドは、例えばこのようなリガンドが不在である化学種と比較して、例えば分子、細胞または細胞型、例えば細胞内または器官内区画などの区画、身体の組織または器官または領域などの選択された標的に対する、改善された親和性を提供する。好ましいリガンドは、二重鎖化核酸中の二本鎖対合形成に加わらない。

【0343】

リガンドは、タンパク質（例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ：ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ：ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、またはグロブリン）；炭水化物（例えばデキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、またはヒアルロン酸）；または脂質などの天然物質を含み得る。リガンドはまた、例えば合成ポリアミノ酸などの合成ポリマーなど、組換えまたは合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例はポリアミノ酸を含み、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－マレイン酸無水物共重合体、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸共重合体、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミン四級塩、またはαらせんペプチドである。

【0344】

リガンドはまた、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質など、例えば腎細胞などの特定細胞型に結合する抗体である、細胞または組織標的化剤などの標的化基を含み得る。標的化基は、甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤プロテインＡ、ムチン炭水化物、多価乳糖、単価または多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチルグルコサミン（ｇｕｌｕｃｏｓｅａｍｉｎｅ）多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチン、またはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。特定の実施形態では、リガンドは一価または多価ガラクトースを含む。特定の実施形態では、リガンドはコレステロールを含む。

【0345】

リガンドのその他の例としては、染料、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎｅ）、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えばフェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、例えばコレステロールなどの親油性分子、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えばアンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えばＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］_２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカ、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進薬（例えばアスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えばイミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾール複合体、テトラアザ大環状化合物のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが挙げられる。

【0346】

リガンドは、例えば糖タンパク質などのタンパク質；または例えば共リガンドに特異的親和性を有する分子などのペプチド；または例えば肝臓細胞などの指定された細胞型に結合する抗体などの抗体であり得る。リガンドはまた、ホルモンおよびホルモン受容体を含んでもよい。それらはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、または多価フコースなどの非ペプチド化学種を含み得る。リガンドは、例えばリポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化因子、またはＮＦ－κＢ活性化因子であり得る。

【0347】

リガンドは、例えば細胞の微小管、微小繊維、および／または中間径フィラメントを破壊することで、例えば細胞の細胞骨格を破壊することにより、細胞へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増大させ得る薬剤などの物質であり得る。薬剤は、例えばタキソン（ｔａｘｏｎ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであり得る。

【0348】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡに付着するリガンドは、薬物動態調節因子（ＰＫ調節因子）を指す。ＰＫ調節因子としては、親油性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫ調節因子としては、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかのホスホロチオエート結合を含んでなるオリゴヌクレオチドもまた、血清タンパク質に結合することが、知られており、したがって例えば、主鎖中に複数のホスホロチオエート結合を含んでなる、約５塩基、１０塩基、１５塩基、または２０塩基オリゴヌクレオチドなどの短鎖オリゴヌクレオチドもまた、リガンドとして（例えばＰＫ調節リガンドとして）本発明に適している。これに加えて、血清成分（例えば血清タンパク質）に結合するアプタマーもまた、本明細書に記載される実施形態中で、ＰＫ調節リガンドとして使用するのに適する。

【0349】

本発明のリガンド共役オリゴヌクレオチドは、結合分子のオリゴヌクレオチド上への付加から誘導されるものなどの、ペンダント反応性官能基を有するオリゴヌクレオチドの使用によって、合成してもよい（下述）。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、多様な保護基のいずれかを有する合成されたリガンド、または付着する結合部分を有するリガンドと、直接反応させてもよい。

【0350】

本発明の複合体で使用されるオリゴヌクレオチドは、好都合に、そして慣例的に、周知の固相合成技術を通じて生成されてもよい。このような合成のための装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）をはじめとする、いくつかの供給業者によって販売される。それに加えて、または代案として、当該技術分野で公知のこのような合成のためのその他のあらゆる手段を用いてもよい。同様の技術を使用して、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのその他のオリゴヌクレオチドを調製することもまた知られている。

【0351】

本発明のリガンド共役オリゴヌクレオチド、およびリガンド分子を保有する配列特異的結合ヌクレオシド中では、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドは、標準ヌクレオチドまたはヌクレオシド前駆体、または既に結合部分を保有するヌクレオチドまたはヌクレオシド複合体前駆体、既にリガンド分子を保有するリガンド－ヌクレオチドまたはヌクレオシド－複合体前駆体、または非ヌクレオシドリガンドを保有する基本単位を使用して、適切なＤＮＡ合成機上で組み立ててもよい。

【0352】

既に結合部分を有するヌクレオチド複合体前駆体を使用する場合、配列特異的結合ヌクレオシドの合成が典型的に完了し、次にリガンド分子が結合部分と反応されて、リガンド共役オリゴヌクレオチドが生成する。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは結合ヌクレオシドは、市販されて、慣例的にオリゴヌクレオチド合成で使用される、標準ホスホラミダイトおよび非標準ホスホラミダイトに加えて、リガンド－ヌクレオシド複合体から誘導されるホスホラミダイトを使用して、自動合成装置によって合成される。

【0353】

Ａ．脂質複合体
１つの実施形態では、リガンドまたは複合体は、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清タンパク質と結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、例えば身体の非腎臓標的組織などの標的組織への複合体の分布を可能にする。例えば標的組織は、肝臓の実質細胞をはじめとする肝臓であり得る。ＨＳＡに結合し得るその他の分子もまた、リガンドとして使用し得る。例えばナプロキセンまたはアスピリンを使用し得る。脂質または脂質ベースのリガンドは、（ａ）複合体の分解耐性を増大させ得て、（ｂ）標的細胞または細胞膜の標的化またはそれへの輸送を増大させ得て、および／または（ｃ）例えばＨＳＡなどの血清タンパク質の結合を調節するのに使用し得る。

【0354】

例えば複合体の標的組織への結合を制御するなど、阻害のために、脂質ベースのリガンドを使用し得る。例えばより強力にＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓に標的化される可能性がより低く、したがって身体から除去される可能性がより低い。より弱くＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、複合体を腎臓に標的化するのに使用し得る。

【0355】

好ましい実施形態では、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合する。好ましくは、それは、複合体が好ましくは非腎臓組織に分布するように、十分な親和性でＨＳＡと結合する。しかし親和性は、ＨＳＡリガンド結合が逆転され得ない程度にまで、強力ではないことが好ましい。

【0356】

別の好ましい実施形態では、複合体が好ましくは腎臓に分布するように、脂質ベースのリガンドはＨＳＡと弱く結合し、または全く結合しない。腎細胞を標的とするその他の部分もまた、脂質ベースのリガンドに代えて、またはそれに加えて使用し得る。

【0357】

別の態様では、リガンドは、例えば増殖細胞などの標的細胞に取り込まれる、ビタミンなどの部分である。これらは、例えばがん細胞などの悪性または非悪性型などの望まれない細胞増殖によって特徴付けられる障害を治療するのに、特に有用である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが挙げられる。その他の例示的なビタミンとしては、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールなどのＢビタミン、または肝臓細胞などの標的細胞に取り込まれるその他のビタミンまたは栄養素が挙げられる。またＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も挙げられる。

【0358】

Ｂ．細胞透過剤
別の態様では、リガンドは細胞透過剤であり、好ましくはらせん細胞透過剤である。好ましくは、細胞透過剤は両親媒性である。例示的な細胞透過剤は、ｔａｔまたはアンテノペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）などのペプチドである。細胞透過剤がペプチドである場合、それはペプチジル模倣薬、逆転異性体、非ペプチドまたは偽ペプチド結合、およびＤ－アミノ酸使用をはじめとする、修飾を受け得る。らせん剤は、好ましくは親油性および疎油性相を有するα－らせん剤である。

【0359】

リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣薬（本明細書においてオリゴペプチド模倣薬とも称される）は、天然ペプチドに類似する定義された三次元構造に折り畳み可能な分子である。ペプチドおよびペプチド模倣薬のｉＲＮＡ剤への付加は、細胞認識と吸収の促進などにより、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチドまたはペプチド模倣薬部分は、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長など、約５～５０アミノ酸長であり得る。

【0360】

ペプチドまたはペプチド模倣薬は、例えば細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、束縛ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。別の代案では、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号３）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えばアミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号４））もまた、標的部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を越えて、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質をはじめとする、多数の極性分子を輸送し得る「送達」ペプチドであり得る。例えばＨＩＶ Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号５））およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）アンテナペディアタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号６））からの配列は、送達ペプチドとして機能できることが分かっている。ペプチドまたはペプチド模倣薬は、ファージ－ディスプレイライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから同定されるペプチドなどの、ＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２－８４，１９９１）。細胞標的化目的のために、組み込まれたモノマー単位を通じて、ｄｓＲＮＡ作用物質に係留されるペプチドまたはペプチド模倣体の例は、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）－ペプチド、またはＲＧＤ模倣体である。ペプチド部分は、約５アミノ酸～約４０アミノ酸長に及び得る。ペプチド部分は、安定性を増大させ、または立体構造特性を誘導するような、構造修飾を有し得る。下述の構造修飾のいずれかを使用し得る。

【0361】

本発明の組成物および方法で使用されるＲＧＤペプチドは、直鎖または環状であってもよく、例えばグリコシル化またはメチル化により修飾して、特定組織への標的化を容易にしてもよい。ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣剤（ｐｅｐｔｉｄｉｏｍｉｍｅｍｔｉｃｓ）としては、Ｄ－アミノ酸、ならびに合成ＲＧＤ模倣体が挙げられる。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的にするその他の部分を使用し得る。このリガンドの好ましい複合体は、ＰＥＣＡＭ－１またはＶＥＧＦを標的にする。

【0362】

「細胞透過性ペプチド」は、例えば細菌または真菌細胞などの微生物細胞、またはヒト細胞などの哺乳類細胞などの細胞に浸透できる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えばα－らせん直鎖ペプチド（例えばＬＬ－３７またはセクロピン（Ｃｅｒｏｐｉｎ）Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えばα－デフェンシン、β－デフェンシンまたはバクテネシン）、または１つまたは２つの主要アミノ酸（例えばＰＲ－３９またはインドリシジン）のみを含有するペプチドであり得る。細胞透過性ペプチドはまた、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。例えば細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメインおよびＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳに由来する、ＭＰＧなどの二分両親媒性ペプチドであり得る（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７－２７２４，２００３）。

【0363】

Ｃ．炭水化物複合体
本発明の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、炭水化物をさらに含んでなる。炭水化物共役ｉＲＮＡは、本明細書に記載されるような、核酸ならびに生体内治療用途に適する組成物の生体内送達に、有利である。本明細書の用法では、「炭水化物」は、各炭素原子に結合する酸素、窒素またはイオウ原子がある、少なくとも６個の炭素原子（直鎖、分枝または環状であり得る）を有する、１つまたは複数の単糖単位で構成される炭水化物それ自体；各炭素原子に結合する酸素、窒素またはイオウ原子がある、少なくとも６個の炭素原子（直鎖、分枝または環状であり得る）をそれぞれ有する、１つまたは複数の単糖単位で構成される炭水化物部分をその一部として有する化合物のいずれかである化合物を指す。代表的な炭水化物としては、糖類（単糖類、二糖類、三糖類、および約４、５、６、７、８、または９個の単糖単位を含有するオリゴ糖類）、およびデンプン、グリコーゲン、セルロース、および多糖類ガムなどの多糖類が挙げられる。特定の単糖類としては、Ｃ５以上（例えばＣ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）の糖類が挙げられ；二および三糖類としては、２または３個の単糖単位を有する糖類が挙げられる（例えばＣ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）。

【0364】

一実施形態では、本発明の組成物および方法において用いられる炭水化物複合体は、単糖である。別の実施形態では、本発明の組成物および方法において用いられる炭水化物複合体は、

【化5】

【化6】

【化7】

【化8】

からなる群から選択される。

【0365】

一実施形態では、単糖は、Ｎ－アセチルガラクトサミン、例えば

【化9】

である。

【0366】

本明細書に記載の実施形態にて用いられる別の代表的な炭水化物複合体は、限定はされないが、

【化10】

（ＸまたはＹの一方がオリゴヌクレオチドであるとき、他方は水素である）を含む。

【0367】

本発明の特定の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、本発明のｉＲＮＡ剤に一価リンカーを介して付着される。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、本発明のｉＲＮＡ剤に二価リンカーを介して付着される。本発明のさらに他の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、本発明のｉＲＮＡ剤に三価リンカーを介して付着される。

【0368】

一実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ｉＲＮＡ剤に付着された１つのＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。別の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、複数の（例えば、２、３、４、５、または６の）ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含み、各々は独立して、二本鎖ＲＮＡｉ剤の複数のヌクレオチドに複数の一価リンカーを介して付着される。

【0369】

一部の実施形態では、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の２本の鎖が、複数の不対ヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する、一方の鎖の３’末端と他方の各鎖の５’末端との間のヌクレオチドの非中断鎖によって接続された１つのより大きい分子の一部であるとき、ヘアピンループ内部の各不対ヌクレオチドは、独立して一価リンカーを介して付着されたＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含んでもよい。ヘアピンループはまた、二本鎖の一方の鎖において拡張されたオーバーハングにより形成されてもよい。

【0370】

一部の実施形態では、炭水化物複合体は、上記のような１つ以上の追加的なリガンド、例えば限定はされないが、ＰＫ修飾因子および／または細胞浸透ペプチドをさらに含む。

【0371】

本発明における使用に適した追加的な炭水化物複合体は、ＰＣＴ公開の国際公開第２０１４／１７９６２０号パンフレットおよび国際公開第２０１４／１７９６２７号パンフレット（それら各々の内容全体は参照により本明細書中に援用される）に記載されるものを含む。

【0372】

Ｄ．リンカー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される複合体またはリガンドは、切断可能または切断不能であり得る、様々なリンカーによって、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに付着し得る。

【0373】

「リンカー」または「連結基」という用語は、例えば化合物の２つの部分に共有結合するなどの、化合物の２つの部分を結合する有機部分を意味する。リンカーは、典型的に、直接結合、または酸素またはイオウなどの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＳＯ_２ＮＨなどの単位、または置換または非置換アルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘレロシクリルアルキニル（ａｌｋｙｌｈｅｒｅｒｏｃｙｃｌｙｌａｌｋｙｎｙｌ）、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘレロアリール（ａｌｋｙｎｙｌｈｅｒｅｒｏａｒｙｌ）などであるが、これに限定されるものではない原子鎖を含んでなり、その１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ_２、Ｎ（Ｒ^８）、Ｃ（Ｏ）、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換複素環（式中、Ｒ^８は水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である）によって中断されまたは終結され得る。一実施形態では、リンカーは、約１～２４個の原子、２～２４個の原子、３～２４個の原子、４～２４個の原子、５～２４個の原子、６～２４個の原子、６～１８個の原子、７～１８個の原子、７～１７この原子、８～１７個の原子、６～１６個の原子、７～１６個の原子、または、８～１６個の原子である。

【0374】

切断可能連結基は、細胞外で十分に安定しているが、標的細胞への侵入時に切断されて、リンカーがつなぎ止めている２つの部分を放出するものである。好ましい実施形態では、切断可能連結基は、標的細胞中で、または第１の標準状態下（例えば細胞内条件を模倣し、またはそれに相当するように選択し得る）で、対象の血中において、または第２の標準状態下（例えば血中または血清に見られる条件を模倣し、またはそれに相当するように選択し得る）よりも、少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍以上、または少なくとも約１００倍より迅速に切断される。

【0375】

切断可能連結基は、例えばｐＨ、酸化還元電位または分解性分子の存在などの切断作用物質の影響を受けやすい。一般に切断作用物質は、血清または血液中よりも細胞中でより一般的であり、またはより高いレベルまたは活性で見られる。このような分解性作用物質の例としては、例えば還元によって酸化還元切断可能連結基を分解し得る、細胞中に存在する、酸化または還元酵素またはメルカプタンなどの還元剤をはじめとする、特定の基質のために選択された、または基質特異性がない酸化還元剤；エステラーゼ；エンドソームまたは例えば５以下のｐＨをもたらすものなどの酸性環境をもたらし得る作用物質；一般酸、ペプチダーゼ（基質特異性であり得る）、およびホスファターゼとして作用することで、酸切断可能連結基を加水分解または分解し得る酵素が挙げられる。

【0376】

ジスルフィド結合などの切断可能連結基は、ｐＨに対する感受性が高くあり得る。ヒト血清のｐＨが７．４であるのに対し、細胞内平均ｐＨはわずかにより低く、約７．１～７．３の範囲にわたる。エンドソームは、５．５～６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、約５．０のさらにより酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能連結基を有し、それによって細胞中のリガンドから、または細胞の所望の区画へ、カチオン性脂質が放出される。

【0377】

リンカーは、特定の酵素によって切断可能な切断可能連結基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能連結基のタイプは、標的とされる細胞に左右され得る。例えば肝臓を標的化するリガンドは、エステル基を含むリンカーを通じてカチオン性脂質に連結し得る。肝細胞はエステラーゼに富み、したがってリンカーは、エステラーゼが豊富でない細胞型よりも、肝細胞中でより効率的に切断される。エステラーゼに富むその他の細胞型としては、肺、腎皮質、および精巣の細胞が挙げられる。

【0378】

ペプチド結合を含有するリンカーは、肝細胞および滑膜細胞などのペプチダーゼに富んだ細胞型を標的化する際に使用し得る。

【0379】

一般に切断可能連結基の候補の適合性は、候補連結基を切断する分解性作用物質（条件）の能力を検査することで評価し得る。切断可能連結基の候補は、血中において、またはその他の非標的組織との接触時に、切断に抵抗する能力についてもまた検査することもまた望ましい。したがって第１の条件が標的細胞中での切断を示すように選択され、第２の条件がその他の組織または例えば血液または血清などの生体液中での切断を示すように選択される、第１および第２の条件間の切断の相対的感受性を判定し得る。評価は、無細胞系中、細胞中、細胞培養中、臓器または組織培養中、または全身の動物中で実施し得る。無細胞または培養条件で最初の評価を行い、全身の動物中でのさらなる評価によって確認することが有用なこともあり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液または血清（または細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下）と比較して、細胞中（または細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下）で、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍より迅速に切断される。

【0380】

ｉ．酸化還元切断可能連結基
１つの実施形態では、切断可能連結基は、還元または酸化に際して切断される酸化還元切断可能連結基である。還元的切断可能連結基の一例は、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）である。切断可能連結基候補が、適切な「還元的切断可能連結基」か、または例えば特定のｉＲＮＡ部分および特定の標的作用物質と共に使用するのに適するかどうかを判定するために、本明細書に記載される方法に頼ることができる。例えば候補は、例えば標的細胞などの細胞中で観察される切断速度を模倣する、当該技術分野で公知の試薬を使用して、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、またはその他の還元剤とのインキュベーションによって評価し得る。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択される条件下で評価し得る。１つの候補化合物は、血中で最大で約１０％切断される。他の実施形態では、有用な候補化合物は、血液（または細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下）と比較して、細胞中（または細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下）で、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または約１００倍より迅速に分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下で標準酵素動態アッセイを使用して、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較して判定し得る。

【0381】

ｉｉ．リン酸ベースの切断可能連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、リン酸ベースの切断可能連結基を含んでなる。リン酸ベースの切断可能連結基は、リン酸基を分解または加水分解する作用物質によって切断され得る。細胞中でリン酸基を切断する作用物質の一例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの連結基の例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。

【0382】

ｉｉｉ．酸切断可能連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、酸切断可能連結基を含んでなる。酸切断可能連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態では、酸切断可能連結基は、ｐＨ約６．５以下（例えば約６．０、５．７５、５．５、５．２５、５．０以下）の酸性環境内において、または一般酸として作用し得る酵素などの作用物質によって切断される。細胞内では、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低ｐＨ細胞小器官が、酸切断可能連結基の切断環境を提供し得る。酸切断可能連結基の例としては、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸エステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。酸切断可能基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。好ましい実施形態は、炭素がエステルの酸素に付着する場合（アルコキシ基）は、アリール基、置換アルキル基、またはジメチルペンチルまたはｔ－ブチルなどの三級アルキル基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。

【0383】

ｉｖ．エステルベースの連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、エステルベースの切断可能連結基を含んでなる。エステルベースの切断可能連結基は、細胞内でエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステルベースの切断可能連結基の例としては、アルキレン、アルケニレン、およびアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。エステル切断可能連結基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。

【0384】

ｖ．ペプチドベースの切断基
さらに別の実施形態では、切断可能なリンカーは、ペプチドベースの切断可能連結基を含んでなる。ペプチドベースの切断可能連結基は、細胞内で、ペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能連結基は、アミノ酸の間に形成されて、オリゴペプチド（例えばジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドを生じる、ペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能基には、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）は含まれない。アミド基は、あらゆるアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン（ａｌｋｙｎｅｌｅｎｅ）間に形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般にアミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じるペプチド結合（すなわちアミド結合）に限定され、アミド官能基全体は含まない。ペプチドベースの切断可能連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－を有し、式中、ＲＡおよびＲＢは２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。

【0385】

一実施形態では、本発明のｉＲＮＡは、リンカーを通じて炭水化物と共役する。本発明の組成物および方法のリンカーと共役するｉＲＮＡ炭水化物の非限定的例としては、

【化11】

【化12】

（式中、
ＸまたはＹの一方はオリゴヌクレオチドであり、他方は水素である）が挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0386】

本発明の組成物および方法の特定の実施形態では、リガンドは、二価または三価の分枝リンカーを通じて付着する１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ（Ｎ－アセチルガラクトサミン）誘導体である。

【0387】

一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、
式（ＸＸＸＩＩ）～（ＸＸＸＶ）、

【化13】

（式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ、およびｑ５Ｃは、独立して、０～２０の各出現を表し、反復単位は、同一であるかまたは異なり得て；
Ｐ^２Ａ、Ｐ^２Ｂ、Ｐ^３Ａ、Ｐ^３Ｂ、Ｐ^４Ａ、Ｐ^４Ｂ、Ｐ^５Ａ、Ｐ^５Ｂ、Ｐ^５Ｃ、Ｔ^２Ａ、Ｔ^２Ｂ、Ｔ^３Ａ、Ｔ^３Ｂ、Ｔ^４Ａ、Ｔ^４Ｂ、Ｔ^４Ａ、Ｔ^５Ｂ、Ｔ^５Ｃは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ_２、ＣＨ_２ＮＨまたはＣＨ_２Ｏであり；
Ｑ^２Ａ、Ｑ^２Ｂ、Ｑ^３Ａ、Ｑ^３Ｂ、Ｑ^４Ａ、Ｑ^４Ｂ、Ｑ^５Ａ、Ｑ^５Ｂ、Ｑ^５Ｃは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、アルキレン、置換アルキレンであり、１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ_２、Ｎ（Ｒ^Ｎ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡ＣまたはＣ（Ｏ）の１つまたは複数によって中断または終結され得て；
Ｒ^２Ａ、Ｒ^２Ｂ、Ｒ^３Ａ、Ｒ^３Ｂ、Ｒ^４Ａ、Ｒ^４Ｂ、Ｒ^５Ａ、Ｒ^５Ｂ、Ｒ^５Ｃは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ_２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒ^ａ）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ（Ｒ^ａ）－ＮＨ－、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、

【化14】

またはヘテロシクリルであり；
Ｌ^２Ａ、Ｌ^２Ｂ、Ｌ^３Ａ、Ｌ^３Ｂ、Ｌ^４Ａ、Ｌ^４Ｂ、Ｌ^５Ａ、Ｌ^５ＢおよびＬ^５Ｃはリガンドを表し；すなわち各出現についてそれぞれ独立して、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖類、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖類であり；Ｒ^ａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖である）のいずれかで示される構造群から選択される、二価または三価の分枝リンカーと共役する。三価の共役ＧａｌＮＡｃ誘導体は、
式（ＸＸＸＶＩ）、

【化15】

（式中、
Ｌ^５Ａ、Ｌ^５ＢおよびＬ^５Ｃは、ＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖を表す）などの標的遺伝子の発現を阻害するために、ＲＮＡｉ剤と共に使用するのに特に有用である。

【0388】

ＧａｌＮＡｃ誘導体に共役する適切な二価および三価の分枝リンカー基の例としては、式ＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、Ｘ、およびＸＩＩＩとして、上で列挙された構造が挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0389】

ＲＮＡ複合体の調製を教示する、代表的な米国特許としては、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書によりここに援用する、米国特許第４，８２８，９７９号明細書；米国特許第４，９４８，８８２号明細書；米国特許第５，２１８，１０５号明細書；米国特許第５，５２５，４６５号明細書；米国特許第５，５４１，３１３号明細書；米国特許第５，５４５，７３０号明細書；米国特許第５，５５２，５３８号明細書；米国特許第５，５７８，７１７号明細書、米国特許第５，５８０，７３１号明細書；米国特許第５，５９１，５８４号明細書；米国特許第５，１０９，１２４号明細書；米国特許第５，１１８，８０２号明細書；米国特許第５，１３８，０４５号明細書；米国特許第５，４１４，０７７号明細書；米国特許第５，４８６，６０３号明細書；米国特許第５，５１２，４３９号明細書；米国特許第５，５７８，７１８号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第４，５８７，０４４号明細書；米国特許第４，６０５，７３５号明細書；米国特許第４，６６７，０２５号明細書；米国特許第４，７６２，７７９号明細書；米国特許第４，７８９，７３７号明細書；米国特許第４，８２４，９４１号明細書；米国特許第４，８３５，２６３号明細書；米国特許第４，８７６，３３５号明細書；米国特許第４，９０４，５８２号明細書；米国特許第４，９５８，０１３号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，２４５，０２２号明細書；米国特許第５，２５４，４６９号明細書；米国特許第５，２５８，５０６号明細書；米国特許第５，２６２，５３６号明細書；米国特許第５，２７２，２５０号明細書；米国特許第５，２９２，８７３号明細書；米国特許第５，３１７，０９８号明細書；米国特許第５，３７１，２４１号明細書、米国特許第５，３９１，７２３号明細書；米国特許第５，４１６，２０３号明細書、米国特許第５，４５１，４６３号明細書；米国特許第５，５１０，４７５号明細書；米国特許第５，５１２，６６７号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５６５，５５２号明細書；米国特許第５，５６７，８１０号明細書；米国特許第５，５７４，１４２号明細書；米国特許第５，５８５，４８１号明細書；米国特許第５，５８７，３７１号明細書；米国特許第５，５９５，７２６号明細書；米国特許第５，５９７，６９６号明細書；米国特許第５，５９９，９２３号明細書；米国特許第５，５９９，９２８および５，６８８，９４１号明細書；米国特許第６，２９４，６６４号明細書；米国特許第６，３２０，０１７号明細書；米国特許第６，５７６，７５２号明細書；米国特許第６，７８３，９３１号明細書；米国特許第６，９００，２９７号明細書；米国特許第７，０３７，６４６号明細書、米国特許第８，１０６，０２２号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0390】

所与の化合物中の全ての位置が一様に修飾される必要はなく、事実上、前述の修飾の２つ以上が、単一化合物中に、またはｉＲＮＡ内の単一ヌクレオシド中にさえ、組み込まれ得る。本発明は、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物もまた含む。

【0391】

「キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）」ｉＲＮＡ化合物または「キメラ（ｃｈｉｍｅｒａｓ）」は、本発明の文脈で、それぞれ少なくとも１つのモノマー単位から、すなわちｄｓＲＮＡ化合物の場合はヌクレオチドから構成される、２つ以上の化学的に異なる領域を含有するｉＲＮＡ化合物、好ましくはｄｓＲＮＡである。これらのｉＲＮＡは、典型的に、ｉＲＮＡに、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞内取り込みの増大、および／または標的核酸に対する結合親和性の増大を与えるように、ＲＮＡが修飾される少なくとも１つの領域を含有する。ｉＲＮＡの追加的な領域が、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断できる、酵素基質の役割を果たしてもよい。一例として、ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがってＲＮａｓｅ Ｈの活性化はＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害効率を大幅に高める。その結果、同一標的領域とハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、キメラｄｓＲＮＡが使用される場合、より短いｉＲＮＡによって、比較できる結果が得られることが多い。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、そして必要ならば当該技術分野で公知の関連核酸ハイブリダイゼーション技術によって、慣例的に検出し得る。

【0392】

場合によっては、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基によって修飾し得る。ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞内取り込みを高めるために、いくつかの非リガンド分子がｉＲＮＡに共役結合されており、このような共役結合を実施する手順は、学術文献で入手できる。このような非リガンド部分は、コレステロールなどの脂質部分（Ｋｕｂｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００７，３６５（１）：５４－６１；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、例えばヘキシル－Ｓ－トリチルチオールなどのチオエーテル（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基などの脂肪族鎖（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１１；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネートなどのリン脂質（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）を含む。このようなＲＮＡ複合体の調製を教示する代表的な米国特許は、上に列挙した。典型的な共役結合プロトコルは、配列の１つまたは複数の位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を伴う。次に適切なカップリングまたは活性化試薬を使用して、アミノ基を共役結合する分子と反応させる。共役結合反応は、溶液相中で、ＲＮＡが固体支持体になおも結合する間に、またはＲＮＡ切断に続いて実施することができる。ＨＰＬＣによるＲＮＡ複合体精製は、典型的に純粋な複合体を与える。

【0393】

ＩＶ．発明のｉＲＮＡの送達
例えばヒト対象（例えばＰＣＳＫ９発現の軽減により恩恵を受ける障害を有する対象などのそれを必要とする対象）などの対象内の細胞などの細胞への本発明のｉＲＮＡの送達は、いくつかの異なる方法で達成し得る。例えば送達は、試験管内または生体内のどちらかで、細胞を本発明のｉＲＮＡに接触させることで実施してもよい。生体内送達はまた、例えばｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡを含んでなる組成物を対象に投与することで直接実施してもよい。代案としては、生体内送達は、ｉＲＮＡをコードして発現を誘導する、１つまたは複数のベクターを投与することで、間接的に実施してもよい。これらの代替案は、下でさらに考察される。

【0394】

一般に、（試験管内または生体内で）核酸分子を送達するあらゆる方法が、本発明のｉＲＮＡで使用するために適応させ得る（例えば、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、Ａｋｈｔａｒ Ｓ．ａｎｄ Ｊｕｌｉａｎ ＲＬ．（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（５）：１３９－１４４および国際公開第９４／０２５９５号パンフレットを参照されたい）。生体内送達では、ｉＲＮＡ分子を送達するために検討すべき要素としては、例えば、送達分子の生物学的安定性、非特異的効果の防止、および標的組織中の送達分子の蓄積が挙げられる。ｉＲＮＡの非特異的効果は、例えば組織内への直接注射または移植または製剤を局所投与するなどの局所投与によって最小化し得る。治療部位への局所投与は、作用物質の局所濃度を最大化し、そうしなければ作用物質によって害を被り得る、または作用物質を分解し得る、全身組織の作用物質への曝露を限定し、ｉＲＮＡ分子のより低い総用量での投与を可能にする。いくつかの研究は、ｉＲＮＡが局所的に投与された場合に、成功裏の遺伝子産物ノックダウン示している。例えばカニクイザルにおける硝子体内注射による（Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ，ＭＪ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｒｅｔｉｎａ ２４：１３２－１３８）、およびマウスにおける網膜下注射による（Ｒｅｉｃｈ，ＳＪ．， ｅｔ ａｌ（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０－２１６）、ＶＥＧＦ ｄｓＲＮＡの眼内送達は、どちらも加齢黄斑変性の実験モデルで新血管形成を防止することを示した。これに加えて、マウスにおけるｄｓＲＮＡの直接腫瘍内注射は、腫瘍体積を低下させ（Ｐｉｌｌｅ，Ｊ．， ｅｔ ａｌ（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２６７－２７４）、腫瘍を有するマウスの生存期間を延長し得た（Ｋｉｍ，ＷＪ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：３４３－３５０；Ｌｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：５１５－５２３）。ＲＮＡ干渉は、直接注射によるＣＮＳへの（Ｄｏｒｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３２：ｅ４９；Ｔａｎ，ＰＨ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：５９－６６；Ｍａｋｉｍｕｒａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ（２００２）ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：１８；Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ，ＧＴ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２９：５２１－５２８；Ｔｈａｋｋｅｒ，ＥＲ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１７２７０－１７２７５；Ａｋａｎｅｙａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９３：５９４－６０２）、および鼻腔内投与による肺への（Ｈｏｗａｒｄ，ＫＡ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：４７６－４８４；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１０６７７－１０６８４；Ｂｉｔｋｏ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：５０－５５）局所性送達の成功が示されている。疾患を治療するために、ｉＲＮＡを全身的に投与するために、ＲＮＡは修飾され、または代案としては薬物送達系を使用して送達され得て；どちらの方法も、生体内エンド－およびエキソ－ヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの迅速な分解を防止するように作用する。ＲＮＡまたは薬学的担体の修飾はまた、標的組織へのｉＲＮＡ組成物の標的化も可能にし得て、望ましくない非特異的効果が回避される。コレステロールなどの親油性基の化学的結合によってｉＲＮＡ分子を修飾し、細胞内取り込みを高め分解を防止し得る。例えば親油性コレステロール部分に共役結合されたＡｐｏＢに対抗するｉＲＮＡがマウスに全身注射され、肝臓および空腸の双方でａｐｏＢ ｍＲＮＡノックダウンがもたらされた（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３－１７８）。ｉＲＮＡのアプタマーへの共役結合は、前立腺がんのマウスモデルにおいて腫瘍増殖を抑制し、腫瘍退縮を媒介することが示されている。（ＭｃＮａｍａｒａ，ＪＯ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１００５－１０１５）。代案の実施形態では、ｉＲＮＡは、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達系などの薬物送達システムを使用して送達され得る。正に帯電したカチオン性送達系は、ｉＲＮＡ分子（負に帯電）の結合を容易にして、負に帯電した細胞膜における相互作用もまた高めて、細胞によるｉＲＮＡの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、ｉＲＮＡに結合され、またはｉＲＮＡを包む小胞またはミセルを形成するように誘導され得る（例えばＫｉｍ ＳＨ．，ｅｔ ａｌ（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １２９（２）：１０７－１１６を参照されたい）。小胞またはミセルの形成は、全身投与した際にｉＲＮＡの分解をさらに防止する。カチオン性ｉＲＮＡ複合体を作成して投与する方法は、十分に当業者の能力の範囲内である（例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ３２７：７６１－７６６；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．，ｅｔ ａｌ（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：１２９１－１３００；Ａｒｎｏｌｄ，ＡＳ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２５：１９７－２０５を参照されたい）。ｉＲＮＡの全身性送達に有用な薬物送達系のいくつかのの非限定的例としては、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３），前出；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．，ｅｔ ａｌ（２００３），前出）、オリゴフェクトアミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、“ｓｏｌｉｄ ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ｌｉｐｉｄｐａｒｔｉｃｌｅｓ”（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＴＳ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１－１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ，ＰＹ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：３２１－３２８；Ｐａｌ，Ａ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｉｎｔ Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１０８７－１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ ＭＥ．，ｅｔ ａｌ（２００８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．８月１６日オンライン先行発表；Ａｉｇｎｅｒ，Ａ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７１６５９）、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉｕ，Ｓ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３：４７２－４８７）、およびポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ，ＤＡ．，ｅｔ ａｌ（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：６１－６７；Ｙｏｏ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１７９９－１８０４）が挙げられる。いくつかの実施形態では、全身投与のために、ｉＲＮＡはシクロデキストリンと複合体を形成する。ｉＲＮＡおよびシクロデキストリンの投与方法および医薬組成物は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する米国特許第７，４２７，６０５号明細書にある。

【0395】

Ａ．本発明のｉＲＮＡをコードするベクター
ＰＣＳＫ９遺伝子標的化ｉＲＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現され得る（例えばＣｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５－１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．国際公開第００／２２１１３号パンフレット；Ｃｏｎｒａｄ、国際公開第００／２２１１４号パンフレット；およびＣｏｎｒａｄ、米国特許第６，０５４，２９９号明細書を参照されたい）。発現は、使用される特定のコンストラクトおよび標的組織または細胞型次第で、一過性（数時間から数週間程度）または持続性（数週間から数ヶ月以上）であり得る。これらの導入遺伝子は、組み込み型または非組み込み型ベクターであり得る、直鎖コンストラクト、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入し得る。導入遺伝子はまた、それが染色体外プラスミドとして遺伝するのを可能にするよう構築し得る（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。

【0396】

個々のｉＲＮＡ鎖または鎖群は、発現ベクター上のプロモータから転写され得る。２つの別個の鎖を発現させて、例えばｄｓＲＮＡを生成させる場合、（例えば形質移入または感染によって）２つの別個の発現ベクターを標的細胞に同時導入し得る。代案としては、そのどちらも同一発現プラスミド上に位置するプロモータによって、ｄｓＲＮＡの個々の鎖を転写し得る。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステムループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって連結する逆位反復ポリヌクレオチドとして発現される。

【0397】

ｉＲＮＡ発現ベクターは、一般にＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核生物細胞に適合し、好ましくは脊椎動物細胞に適合する発現ベクターを使用して、本明細書に記載されるｉＲＮＡ発現のための組換えコンストラクトを生成し得る。真核細胞発現ベクターは当該技術分野で周知であり、いくつかの商業的供給元から入手できる。典型的にこのようなベクターは、所望の核酸断片を挿入するための都合良い制限酵素認識部位を含有させて、提供される。ｉＲＮＡ発現ベクターの送達は、静脈内または筋肉内投与などによる全身投与、患者から外植された標的細胞への投与とそれに続く患者への再導入、または所望の標的細胞に導入できるようにするあらゆる別の手段などであり得る。

【0398】

ｉＲＮＡ発現プラスミドは、カチオン性脂質担体（例えばオリゴフェクトアミン）または非カチオン性脂質ベースの担体（例えばＴｒａｎｓｉｔ－ＴＫＯ（商標））との複合体として、標的細胞に形質移入し得る。１週間以上の期間にわたって標的ＲＮＡの異なる領域を標的化する、ｉＲＮＡ媒介ノックダウンのための複数脂質形質移入もまた、本発明により検討される。ベクターの宿主細胞への成功裏の導入は、様々な既知の方法を使用してモニターし得る。例えば一過性形質移入は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光性マーカなど、レポーターによって示し得る。生体外における細胞への安定した形質移入は、形質移入細胞に、ハイグロマイシンＢ耐性などの特定環境要素（例えば抗生物質および薬剤）耐性を提供するマーカを使用して、確実にし得る。

【0399】

本明細書に記載される方法および組成物と共に利用し得るウイルスベクターシステムとしては、（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなどをはじめとするが、これに限定されるものではないレトロウイルスベクター；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）乳頭腫ウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウィルスベクター；（ｉ）例えばワクシニアウイルスベクターなどのオルソポックス、または例えばカナリア痘または鶏痘などのアビポックスなどのポックスウイルスベクター；および（ｊ）ヘルパー依存性またはガットレスアデノウイルスが挙げられるが、これに限定されるものではない。複製欠陥ウイルスもまた、有利であり得る。異なるベクターは、細胞のゲノムに組み込まれ、または組み込まれない。コンストラクトは、所望ならば、形質移入のためのウイルス配列を含み得る。代案としては、コンストラクトは、例えばＥＰＶおよびＥＢＶベクターなどのエピソーム複製ができるベクターに組み込まれ得る。ｉＲＮＡの組換え発現のためのコンストラクトは、一般に、標的細胞中のｉＲＮＡ発現を確実にするための、例えばプロモータ、エンハンサーなどの調節因子を必要とする。ベクターおよびコンストラクトについて検討されるその他の態様は、以下にさらに詳しく記載する。

【0400】

ｉＲＮＡを送達するのに有用なベクターは、所望の標的細胞または組織中のｉＲＮＡの発現に十分な調節因子（プロモータ、エンハンサーなど）を含む。調節因子は、構成的または調節／誘導性発現のいずれかを提供するように選択し得る。

【0401】

ｉＲＮＡの発現は、例えば循環グルコースレベル、またはホルモンなどの特定の生理学的制御因子に感受性の誘導性制御配列を使用して、正確に調節し得る（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＡＳＥＢ Ｊ．８：２０－２４）。細胞または哺乳類におけるｄｓＲＮＡ発現の制御に適するこのような誘導性発現系としては、例えばエクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学誘導物質、およびイソプロピル－β－Ｄ１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による調節が挙げられる。当業者は、ｉＲＮＡ導入遺伝子の意図される用途に基づいて、適切な調節／プロモータ配列を選択できる。

【0402】

ｉＲＮＡをコードする核酸配列を含有するウイルスベクターを使用し得る。例えばレトロウイルスベクターを使用し得る（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１－５９９（１９９３）を参照されたい）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングと宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必要な成分を含有する。ｉＲＮＡをコードする核酸配列は、患者への核酸の送達を容易にする、１つまたは複数のベクターにクローン化される。レトロウイルスベクターに関してより詳しくは、例えば化学療法により高い耐性を示す幹細胞を生成するために、ｍｄｒ１遺伝子を造血幹細胞に送達するレトロウイルスベクターの使用を記載する、Ｂｏｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１－３０２（１９９４）にある。遺伝子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を例証するその他の参考文献は、Ｃｌｏｗｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４－６５１（１９９４）；Ｋｉｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７－１４７３（１９９４）；Ｓａｌｍｏｎｓ ａｎｄ Ｇｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９－１４１（１９９３）；およびＧｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：１１０－１１４（１９９３）である。使用が検討されるレンチウイルスベクターとしては、例えば参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，１４３，５２０号明細書；米国特許第５，６６５，５５７号明細書；および米国特許第５，９８１，２７６号明細書に記載されるＨＩＶベースのベクターが挙げられる。

【0403】

アデノウイルもまた、本発明のｉＲＮＡの送達で使用するために検討される。アデノウイルは、例えば気道上皮に遺伝子を送達するために、特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルは気道上皮に天然で感染して、軽症の疾患を引き起こす。アデノウイルスベースの送達系その他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルは、非分裂細胞に感染できる利点を有する。Ｋｏｚａｒｓｋｙ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９９－５０３（１９９３）は、アデノウイルスベースの遺伝子療法のレビューを提示する。Ｂｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３－１０（１９９４）は、遺伝子をアカゲザルの気道上皮に移入するための、アデノウイルスベクターの使用を実証した。遺伝子療法におけるアデノウイルの使用のその他の事例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１－４３４（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６８：１４３－１５５（１９９２）；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５－２３４（１９９３）；国際公開第９４／１２６４９号パンフレット；およびＷａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５－７８３（１９９５）にある。本発明で取り上げるｉＲＮＡを発現するための適切なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法、およびベクターを標的細胞に送達する方法は、Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６－１０１０に記載される。

【0404】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ：Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）ベクターもまた、本発明のｉＲＮＡを送達するために使用され得る（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９－３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号明細書）。一実施形態では、ｉＲＮＡは、例えば、Ｕ６またはＨ１ ＲＮＡプロモータ、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータのいずれかを有する、組換えＡＡＶベクターからの２つの別個の相補的一本鎖ＲＮＡ分子として発現され得る。本発明で取り上げるｄｓＲＮＡを発現するのに適切なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法、およびベクターを標的細胞に送達する方法は、その開示全体を参照によって本明細書に援用する、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６－３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０－５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２－３８２６；米国特許第５，２５２，４７９号明細書；米国特許第５，１３９，９４１号明細書；国際公開第９４／１３７８８号パンフレット；および国際公開第９３／２４６４１号パンフレットに記載される。

【0405】

本発明のｉＲＮＡを送達するのに好適な別のウイルスベクターは、例えば、修飾ウイルスアンカラ（ＭＶＡ）またはＮＹＶＡＣなどの弱毒化ワクシニアなどのワクシニアウイルス、鶏痘またはカナリア痘などのアビポックスなどのポックスウイルスである。

【0406】

ウイルスベクターの親和性は、必要に応じて、その他のウイルスからの外被タンパク質またはその他の表面抗原でベクターをシュードタイピングすることで、または異なるウイルスからのカプシドタンパク質で置換することで、修飾し得る。例えば水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病、エボラ、モコラなどからの表面タンパク質によって、レンチウイルスベクターをシュードタイピングし得る。ＡＡＶベクターは、ベクターを遺伝子操作して、異なるカプシドタンパク質血清型を発現させることで、異なる細胞を標的化するようにできる；例えばその開示全体を参照によって本明細書に援用する、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１－８０１を参照されたい。

【0407】

ベクターの医薬品は、許容される希釈剤中のベクターを含み得て、またはその中に遺伝子送達ビヒクルが包埋される徐放マトリックスを含み得る。代案としては、例えばレトロウイルスベクターなどの完全な遺伝子送達ベクターが、組換え細胞から無傷で生成され得る場合、医薬品は遺伝子送達系を生成する１つまたは複数の細胞を含み得る。

【0408】

Ｖ．発明の医薬組成物
本発明は、本発明のｉＲＮＡを含む医薬組成物および製剤もまた含む。一実施形態では、本発明で提供されるのは、本明細書に記載されるｉＲＮＡと、薬学的に許容できる担体とを含有する医薬組成物である。

【0409】

語句「薬学的に許容できる」は、合理的なベネフィット／リスク比に適合する、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴うことなくヒト対象および動物対象の組織との接触での使用に適した、健全な医学的判断の範囲内に含まれる化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すように本明細書で用いられる。

【0410】

語句「薬学的に許容できる担体」は、本明細書で用いられるとき、対象化合物を１つの臓器または身体の一部を別の臓器または身体の一部に運搬または輸送することに関与する、薬学的に許容できる材料、組成物または媒体、例えば液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、潤滑剤、タルクマグネシウム、カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸）、または溶媒内封材（ｓｏｌｖｅｎｔ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ）を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合できており、治療中の対象に対して有害でないという意味で「許容できる」必要がある。薬学的に許容できる担体として役立ち得る材料の幾つかの例として、（１）糖、例えば、ラクトース、グルコース、およびショ糖；（２）デンプン、例えばコーンスターチおよびジャガイモデンプン；（３）セルロース、およびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）平滑剤、例えばマグネシウム状態、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク；（８）賦形剤、例えば、カカオバターおよび坐剤用ロウ；（９）油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油；（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリル酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（２２）増量剤、例えばポリペプチドおよびアミノ酸（２３）血清成分、例えば、血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬ；ならびに（２２）医薬製剤で用いられる他の非毒性の親和性物質が挙げられる。

【0411】

ｉＲＮＡを含有する医薬組成物は、ＰＣＳＫ９の発現または活性に関連する疾患または障害、例えばＰＣＳＫ９の発現における減少から利益を受けることになる疾患または障害を治療するために有用である。かかる医薬組成物は、送達様式に基づいて製剤化される。一例が、非経口送達を介する、例えば、皮下（ＳＣ）、筋肉内（ＩＭ）、または静脈内（ＩＶ）送達による全身投与のために製剤化される組成物である。別の例が、例えば脳への注入による、例えば連続ポンプ注入による脳柔組織への直接送達のために製剤化される組成物である。本発明の医薬組成物は、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するのに十分な用量で投与されてもよい。

【0412】

好ましくは、本発明の方法では、ｉＲＮＡ剤は、一定用量として対象に投与される。特定の一実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤の一定用量は、所定の体重または年齢に基づく。

【0413】

一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、約２００ｍｇ～約８５０ｍｇの間、約２００ｍｇ～約５００ｍｇの間、約２００ｍｇ～約４００ｍｇの間、約２００ｍｇ～約３００ｍｇの間、約１００ｍｇ～約８００ｍｇの間、約１００ｍｇ～約７５０ｍｇの間、約１００ｍｇ～約７００ｍｇの間、約１００ｍｇ～約６５０ｍｇの間、約１００ｍｇ～約６００ｍｇの間、約１００ｍｇ～約５５０ｍｇの間、約１００ｍｇ～約５００ｍｇの間、約２００ｍｇ～約８５０ｍｇの間、約２００ｍｇ～約８００ｍｇの間、約２００ｍｇ～約７５０ｍｇの間、約２００ｍｇ～約７００ｍｇの間、約２００ｍｇ～約６５０ｍｇの間、約２００ｍｇ～約６００ｍｇの間、約２００ｍｇ～約５５０ｍｇの間、約２００ｍｇ～約５００ｍｇの間、約３００ｍｇ～約８５０ｍｇの間、約３００ｍｇ～約８００ｍｇの間、約３００ｍｇ～約７５０ｍｇの間、約３００ｍｇ～約７００ｍｇの間、約３００ｍｇ～約６５０ｍｇの間、約３００ｍｇ～約６００ｍｇの間、約３００ｍｇ～約５５０ｍｇの間、約３００ｍｇ～約５００ｍｇの間、約４００ｍｇ～約８５０ｍｇの間、約４００ｍｇ～約８００ｍｇの間、約４００ｍｇ～約７５０ｍｇの間、約４００ｍｇ～約７００ｍｇの間、約４００ｍｇ～約６５０ｍｇの間、約４００ｍｇ～約６００ｍｇの間、約４００ｍｇ～約５５０ｍｇ、または約４００ｍｇ～約５００ｍｇの間の一定用量として投与される。

【0414】

一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、約１００ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１７５ｍｇ、２００ｍｇ、約２２５ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２７５ｍｇ、約３００ｍｇ、約３２５ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３７５ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２５ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４７５ｍｇ、約５００ｍｇ、約５２５ｍｇ、約５５０ｍｇ、約５７５ｍｇ、約６００ｍｇ、約６２５ｍｇ、約６５０ｍｇ、約６７５ｍｇ、約７００ｍｇ、約７２５ｍｇ、約７５０ｍｇ、約７７５ｍｇ、約８００ｍｇ、約８２５ｍｇ、または約８５０ｍｇの一定用量として投与される。

【0415】

一部の実施形態では、治療量のｉＲＮＡが多回用量で対象の例えば皮下または筋肉内に投与される。

【0416】

ｉＲＮＡは、約１．０ｍｌｓ、１．１ｍｌｓ、１．２ｍｌｓ、１．３ｍｌｓ、１．４ｍｌｓ、１．５ｍｌｓ、１．６ｍｌｓ、１．７ｍｌｓ、１．８ｍｌｓ、１．９ｍｌｓ、または約２．０ｍｌｓの医薬組成物などの好適体積の組成物が対象に投与されるような好適濃度での医薬組成物で製剤化されてもよい。例えば、一実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤は、対象への約１．５ｍｌｓの製剤の投与が一定用量３００ｍｇの作用物質を提供するように、約２００ｍｇ／ｍｌで好適な医薬製剤で製剤化される。

【0417】

本明細書中に記載の通り、単回用量のｉＲＮＡ剤またはかかる作用物質を含む医薬組成物は、後続用量が１週、２週、１月、２月、３月、４月、５月、または６月間隔以下で投与されるように長期持続性であり得る。

【0418】

一部の実施形態では、治療量のｉＲＮＡが反復用量で対象の例えば皮下または筋肉内に投与される。反復投与計画は、治療量のｉＲＮＡの、例えば、月１回、２か月ごとに１回、四半期ごとに１回、４か月ごとに１回、５か月ごとに１回、または半年ごとの定期的投与を含んでもよい。本発明の一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、単回用量で四半期ごとに１回（ｑＱ）投与される。本発明の他の実施形態では、本発明の医薬組成物は単回用量で半年ごと（すなわち６か月ごと）に投与される。投与は、例えば、四半期ごとに１回で６か月、１年、２年もしくはそれより長期にわたり反復され得、例えば慢性的に投与される。

【0419】

一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、負荷段階とその後の維持段階を含む投与計画で投与される。

【0420】

負荷段階は、例えば、約１００ｍｇ～約７００ｍｇ、約１５０ｍｇ～約７００ｍｇ、約２００ｍｇ～約７００ｍｇ、約２５０ｍｇ～約７００ｍｇ、約３００ｍｇ～約７００ｍｇ、約３５０ｍｇ～約７００ｍｇ、約４００ｍｇ～約７００ｍｇ、約４５０ｍｇ～約７００ｍｇ、約５００ｍｇ～約７００ｍｇ、約５５０ｍｇ～約７００ｍｇ、約６００～約７００ｍｇ、約６５０～約７００ｍｇ、約１００ｍｇ～約６５０ｍｇ、約１５０ｍｇ～約６５０ｍｇ、約２００ｍｇ～約６５０ｍｇ、約２５０ｍｇ～約６５０ｍｇ、約３００ｍｇ～約６５０ｍｇ、約３５０ｍｇ～約６５０ｍｇ、約４００ｍｇ～約６５０ｍｇ、約４５０ｍｇ～約６５０ｍｇ、約５００ｍｇ～約６５０ｍｇ、約５５０ｍｇ～約６５０ｍｇ、約６００～約６５０ｍｇ、約１００ｍｇ～約６００ｍｇ、約１５０ｍｇ～約６００ｍｇ、約２００ｍｇ～約６００ｍｇ、約２５０ｍｇ～約６００ｍｇ、約３００ｍｇ～約６００ｍｇ、約３５０ｍｇ～約６００ｍｇ、約４００ｍｇ～約６００ｍｇ、約４５０ｍｇ～約６００ｍｇ、約５００ｍｇ～約６００ｍｇ、約５５０ｍｇ～約６００ｍｇ、約１００ｍｇ～約５５０ｍｇ、約１５０ｍｇ～約５５０ｍｇ、約２００ｍｇ～約５５０ｍｇ、約２５０ｍｇ～約５５０ｍｇ、約３００ｍｇ～約５５０ｍｇ、約３５０ｍｇ～約５５０ｍｇ、約４００ｍｇ～約５５０ｍｇ、約４５０ｍｇ～約５５０ｍｇ、約５００ｍｇ～約５５０ｍｇ、約１００ｍｇ～約５００ｍｇ、約１５０ｍｇ～約５００ｍｇ、約２００ｍｇ～約５００ｍｇ、約２５０ｍｇ～約５００ｍｇ、約３００ｍｇ～約５００ｍｇ、約３５０ｍｇ～約５００ｍｇ、約４００ｍｇ～約５００ｍｇ、もしくは約４５０ｍｇ～約５００ｍｇの一定用量、例えば、約１００ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１７５ｍｇ、２００ｍｇ、約２２５ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２７５ｍｇ、約３００ｍｇ、約３２５ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３７５ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２５ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４７５ｍｇ、約５００ｍｇ、約５２５ｍｇ、約５５０ｍｇ、約５７５ｍｇ、約６００ｍｇ、約６２５ｍｇ、約６５０ｍｇ、約６７５ｍｇ、または約７００ｍｇの一定用量で、１週目の間でのＲＮＡｉ剤の単回投与、最初の２週間にわたるＲＮＡｉ剤の単回投与、または１月目の間でのＲＮＡｉ剤の単回投与を含んでもよい。前述の列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であるように意図される。

【0421】

維持段階は、ある用量のＲＮＡｉ剤の月１回、２か月ごとに１回、３か月ごとに１回、４か月ごとに１回、５か月ごとに１回、または６か月ごとに１回の対象への投与を含んでもよい。特定の一実施形態では、維持用量は、対象に月１回投与される。

【0422】

１回もしくは複数の維持用量は、初期用量に対して同じかまたはより少ない、例えば初期用量の半分であり得る。例えば、維持用量は、約２５ｍｇ～約１００ｍｇ、例えば、約２５ｍｇ～約７５ｍｇ、約２５ｍｇ～約５０ｍｇ、または約５０ｍｇ～約７５ｍｇ、例えば、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、もしくは約１００ｍｇが対象に毎月投与されてもよい。前述の列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であるように意図される。

【0423】

医薬組成物は、長期にわたり、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、および２１、２２、２３、２４、もしくは約２５分間にわたり、静脈内注入により投与され得る。投与は、例えば定期的に、例えば毎週、隔週（すなわち２週ごと）で、１か月、２か月、３か月、４か月もしくはより長期にわたり反復されてもよい。初期の治療計画に続き、より低い頻度ベースで治療が施され得る。例えば、毎週または隔週で３か月間の投与後、月１回で６か月もしくは１年もしくはより長期にわたり投与が反復され得る。

【0424】

当業者は、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の総体的な健康および／または年齢、および存在するその他の疾患をはじめとするが、これに限定されるものではない、特定の要因が、対象を効果的に治療するのに要求される用量およびタイミングに影響し得ることを理解するであろう。さらに治療有効量の組成物による対象の治療は、単回治療または一連の治療を含み得る。本発明に包含される個々のｉＲＮＡの有効投与量および生体内半減期は、本明細書の他の箇所で記載されるように、従来の手順を使用して、または適切な動物モデルを使用した生体内試験に基づいて、推定し得る。

【0425】

本発明の医薬組成物は、局所性または全身性の治療が所望されるかどうかに応じて、そして治療領域次第で、いくつかの方法で投与し得る。投与は、局所（例えば経皮パッチによる）、例えばネブライザーをはじめとする、粉末または煙霧剤の吸入または吹送による経肺；気管内、鼻腔内、経表皮および経皮、経口または非経口であってもよい。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または点滴；例えば埋め込みデバイスを通じた真皮下投与；または例えば脳実質内、クモ膜下腔内または脳室内などの頭蓋内投与が挙げられる。

【0426】

ｉＲＮＡは、肝臓（例えば肝臓の実質細胞）などの特定組織を標的化する様式で、送達され得る。

【0427】

局所投与のための医薬組成物および製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体、および粉末が挙げられる。従来の薬学的担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが、必要でありまたは望ましい可能性もある。被覆コンドーム、手袋などもまた、有用であり得る。適切な局所製剤としては、その中で、本発明で取り上げるｉＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化作用物質、および界面活性剤などの局所送達作用物質との混和材料中にあるものが挙げられる。適切な脂質およびリポソームとしては、中性（例えばジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロリホスファチジル（ｄｉｓｔｅａｒｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン）、陰性（例えばジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えばジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本発明で取り上げるｉＲＮＡは、リポソーム内にカプセル化されることができ、またはそれと、特にカチオン性リポソームと、複合体形成することができる。代案としては、ｉＲＮＡは、脂質、特にカチオン性脂質と複合体形成することができる。適切な脂肪酸およびエステルとしては、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ_１～２０アルキルエステル（例えばイソプロピルミリスチン酸ＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容可能なその塩）が挙げられるが、これに限定されるものではない。局所製剤は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳述される。

【0428】

経口投与のための組成物および製剤としては、粉末または顆粒、微小粒子、ナノ微粒子、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、サッシェ剤、錠剤またはミニ錠剤が挙げられる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤またはバインダーが望ましい可能性がある。いくつかの実施形態では、経口製剤は、その中で本発明で取り上げるＤｓＲＮＡが、１つまたは複数の浸透促進界面活性剤およびキレート化剤と併せて投与されるものである。適切な界面活性剤としては、脂肪酸および／またはエステルまたはそれらの塩、胆汁酸および／またはそれらの塩が挙げられる。適切な胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ：ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ：ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウム、およびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。適切な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容可能なその塩（例えばナトリウム）が挙げられる。いくつかの実施形態では、例えば胆汁酸／塩と組み合わされた脂肪酸／塩などの浸透促進剤の組み合わせが使用される。１つの例示的組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。浸透促進剤としては、さらにポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン－２０－セチルエーテルが挙げられる。本発明で取り上げるＤｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子をはじめとする顆粒形態で、経口的に送達されてもよく、または複合体化してマイクロまたはナノ粒子を形成してもよい。ＤｓＲＮＡ複合化剤としては、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；アクリル酸ポリアルキル、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリル酸；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリル酸；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、プルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎｓ）、セルロースおよびデンプンが挙げられる。適切な複合化剤としては、キトサン、Ｎ－トリメチルキトサン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えばｐ－アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリル酸）、ポリ（エチルシアノアクリル酸）、ポリ（ブチルシアノアクリル酸）、ポリ（イソブチルシアノアクリル酸）、ポリ（イソヘキシルシナオアクリル酸（ｉｓｏｈｅｘｙｌｃｙｎａｏａｃｒｙｌａｔｅ））、ＤＥＡＥ－メタクリレート、ＤＥＡＥ－ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ－アクリルアミド、ＤＥＡＥ－アルブミンおよびＤＥＡＥ－デキストラン、ポリアクリル酸メチル、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸）、ポリ（ＤＬ－乳酸‐コ‐グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡの経口製剤およびそれらの調製は、そのそれぞれを参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，８８７，９０６号明細書、米国特許出願公開第２００３００２７７８０号明細書、および米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳細に記載される。

【0429】

非経口、脳実質内（脳内）、クモ膜下腔内、脳室内または肝臓内投与のための組成物および製剤は無菌水溶液を含むことができ、それはまた、緩衝液と、希釈剤と、浸透促進剤、担体化合物、およびその他の薬学的に許容可能な担体または賦形剤などをはじめとするが、これに限定されるものではないその他の適切な添加剤とを含有し得る。

【0430】

本発明の医薬組成物としては、溶液、エマルション、およびリポソーム含有製剤．が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの組成物は、既製液体、自己乳化固体および自己乳化半固体をはじめとするが、これに限定されるものではない、多様な成分から生成され得る。肝臓がんなどの肝臓の障害を治療する場合、特に好ましいのは、肝臓を標的とする製剤である。

【0431】

好都合には単位剤形で提示され得る本発明の医薬製剤は、製薬産業で周知の従来の技術に従って調製され得る。このような技術は、活性成分を薬学的担体または賦形剤に組み合わせるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体または超微粒子固体担体またはその双方と一様に密接に組み合わせ、次に、必要ならば生成物を整形することで調製される。

【0432】

本発明の組成物は、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟質ゲル、坐薬、および浣腸などであるが、これに限定されるものではない、多数の可能な剤形のいずれかに調合され得る。本発明の組成物は、また、水性、非水性または混合媒体中の懸濁液として調合され得る。水性懸濁液は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランをはじめとする、懸濁液の粘度を増大させる物質をさらに含有し得る。懸濁液は、安定剤もまた含有し得る。

【0433】

Ｃ．追加的な製剤
ｉ．エマルション
本発明の組成物は、エマルションとして調製し調合し得る。エマルションは、典型的に、通常、直径が０．１μｍを超える小滴形態で、別の液体中に分散する１つの液体の不均一系である（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１を参照されたい）。エマルションは、密接に混合して互いに分散する、２つの不混和性液体相を含んでなる、二相性システムであることが多い。一般にエマルションは、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）のいずれかであり得る。水性相がバルク油性相中に微細分散して、微小滴として分散される場合、得られた組成物は、油中水型（ｗ／ｏ）エマルションと称される。代案としては、油性相がバルク水性相中に微細分散して、微小滴として分散される場合、得られた組成物は、水中油型（ｏ／ｗ）エマルションと称される。エマルションは、分散相と、水性相および油性相いずれかの中の溶液として、またはそれ自体が別個の相として存在し得る、活性薬剤とに加えて、追加的な成分を含有し得る。乳化剤、安定剤、染料、および抗酸化物質などの医薬品賦形剤はまた、必要に応じてエマルション中に存在し得る。医薬品エマルションはまた、例えば油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションなどの場合、２つを超える相を含んでなる複数エマルションであり得る。このような複合体製剤は、単純な二成分エマルションが提供しない、特定の利点を提供することが多い。その中でｏ／ｗエマルションの個々の油滴が小さな水滴を囲い込む複数エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、水の小球中に封入されて、油性連続相内で安定化される油滴システムは、ｏ／ｗ／ｏエマルションを提供する。

【0434】

エマルションは、熱力学的安定性がわずかまたは皆無であることによって、特徴付けられる。頻繁に、エマルションの分散または不連続相は、外部または連続相内に良く分散し、乳化剤または製剤粘度の手段を通じて、この形態に保たれる。エマルション様式の軟膏基剤およびクリームの場合のように、エマルション相のいずれかが、半固体または固体であり得る。エマルションを安定化する別の手段は、エマルション相のいずれかに組み込まれ得る、乳化剤の使用を伴う。乳化剤は、広義に４つのカテゴリー分類され得る：合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、および微細分散固体（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。

【0435】

表面活性剤としてもまた知られている合成界面活性剤は、エマルション製剤において幅広い用途があり、文献で概説されている（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。界面活性剤は典型的に両親媒性であり、親水性および疎水性部分を含んでなる。親水性と疎水性の比率は、界面活性剤の親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称され、製剤の調製において界面活性剤を分類し選択する上での有益な手段である。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて、異なるクラスに分類され得る：非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５を参照されたい）。

【0436】

エマルション製剤で使用される天然乳化剤としては、ラノリン、蜜蝋、リン脂質、レシチン、およびアカシアが挙げられる。無水ラノリンおよび親水性ペトロラタムなどの、水を吸い上げてｗ／ｏエマルションを形成し得るような親水特性を有する吸収基剤は、なおもそれらの半固体粘稠度を維持する。微細分散固体はまた、優れた乳化剤として、特に界面活性剤と組み合わされて、粘稠な調製品中で使用されている。これらとしては、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイトなどの非膨張性粘土、アタパルガイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、ケイ酸アルミニウムのコロイドおよびケイ酸アルミニウムマグネシウムのコロイド、顔料、および炭素またはトリステアリン酸グリセリルなどの非極性固形分が挙げられる。

【0437】

多岐にわたる非乳化材料もまたエマルション製剤に含まれて、エマルションの特性に寄与する。これらとしては、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存料、および抗酸化剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。

【0438】

親水性コロイドまたは親水コロイドとしては、多糖類（例えばアカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアーガム、カラヤガム、およびトラガカント）、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えばカルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）などの天然ガムおよび合成ポリマーが挙げられる。これらは水中に分散しまたは水中で膨張して、分散相小滴周囲に強力な界面膜を形成することで、および外部相の粘度を増大させることで、エマルションを安定化するコロイド溶液を形成する。

【0439】

エマルションは、微生物の増殖を容易に支持し得る、炭水化物、タンパク質、ステロール、およびリン脂質などのいくつかの成分を含有することが多いので、これらの製剤には保存料が組み込まれることが多い。エマルション製剤に含まれる一般に使用される保存料としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が挙げられる。抗酸化剤もまた、一般にエマルション製剤に添加されて、製剤の劣化を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどのフリーラジカルスカベンジャー；またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤；およびクエン酸、酒石酸、およびレシチンなどの抗酸化剤共力剤であり得る。

【0440】

皮膚、経口、および非経口経路を通じたエマルション製剤の適用と、それらを製造する方法については、文献で概説されている。（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。経口送達のためのエマルション製剤は、調合の容易さ、ならびに吸収および生物学的利用能の観点からの効率のために、非常に広く使用されている（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。鉱物油ベースの緩下剤、油溶性ビタミン、および高脂肪栄養剤は、一般にｏ／ｗエマルションとして経口投与されている材料の一つである。

【0441】

ｉｉ．マイクロエマルション
本発明の一実施形態では、ｉＲＮＡと核酸の組成物は、マイクロエマルションとして調合される。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性で熱力学的に安定している溶液である、水、油、および両親媒性物質のシステムと定義され得る（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５を参照されたい）。典型的に、マイクロエマルションは、最初に油を水性界面活性剤溶液に分散して、次に一般に中間鎖長のアルコールである、十分な量の第４の成分を添加し、透明なシステムを形成することで、調製されるシステムである。したがって、マイクロエマルションは、界面活性分子の界面膜によって安定化された、２つの不混和性液体の熱力学的に安定した等方的に透明な分散体として記述されている（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ １８５－２１５）。マイクロエマルションは、通常、油、水、界面活性剤、共界面活性剤、および電解質をはじめとする、３～５成分の組み合わせを通じて調製される。マイクロエマルションが、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）であるかどうかは、使用される油および界面活性剤の特性と、界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的充填とに左右される（Ｓｃｈｏｔｔ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。

【0442】

状態図を利用した現象学的アプローチは、広範に研究されており、マイクロエマルションの調合法に関する包括的知識が、当業者にもたらされている（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５を参照されたい）。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、水不溶性薬剤を自然発生的に形成される熱力学的に安定した小滴の配合物に可溶化する利点を提供する。

【0443】

マイクロエマルションの調製で使用される界面活性剤としては、単独のまたは共界面活性剤と組み合わされた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレアート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレアート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレアート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレアート（ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレアート（ＤＡＯ７５０）が挙げられるが、これに限定されるものではない。通常、エタノール、１－プロパノール、および１－ブタノールなどの短鎖アルコールである共界面活性剤は、界面活性剤塗膜に浸透することにより界面流動性を増大させるのに役立ち、その結果、界面活性剤分子間に生じる隙間に起因する不規則塗膜を作り出す。しかしマイクロエマルションは、共界面活性剤の使用なしに調製され得、アルコール非含有自己乳化マイクロエマルション系は、当該技術分野で公知である。水性相は、典型的に、水、薬剤水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコール誘導体であり得るが、これに限定されるものではない。油相としては、Ｃａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８～Ｃ１２）モノ、ジ、およびトリ－グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）グリセリド、飽和ポリグリコール化（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）Ｃ８－Ｃ１０グリセリド、植物油、およびシリコーン油などの材料が挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0444】

マイクロエマルションは、薬剤可溶化と薬剤吸収改善の観点から、特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルション（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの双方）が、ペプチドをはじめとする薬剤の経口バイオアベイラビリティを高めるために、提案されている（例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書；米国特許第７，０６３，８６０号明細書；米国特許第７，０７０，８０２号明細書；米国特許第７，１５７，０９９号明細書；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５－１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５を参照されたい）。マイクロエマルションは、薬剤可溶化改善、酵素加水分解からの薬剤保護、界面活性剤が誘発する膜の流動性と透過度の変化に起因する予想される薬剤吸収増強、調製の容易さ、固体剤形に比べた経口投与の容易さ、臨床効力改善、および毒性低下の利点をもたらす（例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書；米国特許第７，０６３，８６０号明細書；米国特許第７，０７０，８０２号明細書；米国特許第 ７，１５７，０９９号明細書；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８－１４３を参照されたい）。マイクロエマルションは多くの場合、それらの成分を周囲温度で一緒に合わせた場合に、自然発生的に形成することができる。これは、熱不安定性薬剤、ペプチドまたはｉＲＮＡを調合する場合に、特に有利となり得る。マイクロエマルションは、美容および医薬用途の双方で、活性成分の経皮送達に効果的であった。本発明のマイクロエマルション組成物および製剤は、ｉＲＮＡおよび核酸の胃腸管からの全身性吸収の増大を容易にし、ならびにｉＲＮＡおよび核酸の局所性細胞内取り込みを改善することが期待される。

【0445】

本発明のマイクロエマルションは、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、および浸透促進剤などの追加的な成分および添加剤もまた含有して、製剤の特性を改善し、本発明のｉＲＮＡおよび核酸の吸収を高め得る。本発明のマイクロエマルション中で使用される浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤の５つの広義のカテゴリーの１つに属すると分類され得る（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらの各クラスについては、上で論じた。

【0446】

ｉｉｉ．微粒子
本発明のＲＮＡｉ剤は、例えば微粒子などの粒子に組み込まれてもよい。微粒子は、噴霧乾燥によって製造し得るが、それはまた、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥、またはこれらの技術の組み合わせをはじめとする、その他の方法によって製造してもよい。

【0447】

ｉｖ．浸透促進剤
一実施形態では、本発明は、様々な浸透促進剤を用いて、核酸、特にｉＲＮＡの動物皮膚への効率的な送達をもたらす。ほとんどの薬剤は、イオン化および非イオン化形態の双方で、溶液中に存在する。しかし通常、脂質可溶性または親油性薬剤のみが、細胞膜を容易に通過する。通過する膜が浸透促進剤で処理されれば、非親油性薬剤でさえも細胞膜を通過し得ることが発見されている。細胞膜横切る非親油性薬剤の拡散を助けるのに加えて、浸透促進剤はまた、親油性薬剤の透過性を高める。

【0448】

浸透促進剤は、５つの広義のカテゴリー、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化作用物質、および非キレート化非界面活性剤の１つに属すると、分類され得る（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照されたい）。前述の浸透促進剤の各クラスについては、以下でより詳しく説明される。

【0449】

界面活性剤（または「表面活性剤」）は、水溶液に溶解すると、溶液の表面張力、または水溶液と別の液体との界面張力を低下させて、粘膜を通じたｉＲＮＡ吸収の改善をもたらす、化学物質である。胆汁塩と脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン－２０－セチルエーテル）（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照されたい）；およびＦＣ－４３などのペルフルオロ化合物エマルション．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）が挙げられる。

【0450】

浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸およびそれらの誘導体としては、例えばオレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ－デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１－モノオレオイル－ｒａｃ－グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、そのＣ_１～２０アルキルエステル（例えばメチル、イソプロピル、およびｔ－ブチル）、およびそのモノ－およびジ－グリセリド（すなわちオレアート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレアートなど）が挙げられる。（例えばＴｏｕｉｔｏｕ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３；Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１－６５４を参照されたい）。

【0451】

胆汁の生理学的役割としては、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が挙げられる（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３８，Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４－９３５を参照されたい）。様々な天然胆汁酸塩、およびそれらの合成誘導体が、浸透促進剤として作用する。したがって「胆汁酸塩」という用語は、胆汁の天然成分のいずれかならびにそれらの合成誘導体のいずれかを含む。適切な胆汁酸塩としては、例えばコール酸（またはその薬学的に許容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ：ｓｏｄｉｕｍ ｔａｕｒｏ－２４，２５－ｄｉｈｙｄｒｏｆｕｓｉｄａｔｅ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる。（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３９，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐａｇｅｓ ７８２－７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９－５８３を参照されたい）。

【0452】

本発明との関連で使用されるキレート化剤は、金属イオンと複合体を形成することによって、それを溶液から除去して、粘膜を通したｉＲＮＡ吸収の改善をもたらす化合物と定義され得る。本発明における浸透促進剤としてのそれらの使用に関して、ほとんどのＤＮＡヌクレアーゼは、触媒作用のために二価の金属イオンを要し、キレート化剤によって阻害されるので、キレート化作用物質は、デオキシリボヌクレアーゼ阻害物質の役割も果たすという追加的利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５－３３９）。 適切なキレート化作用物質としては、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ：ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えばサリチル酸ナトリウム、５－メトキシサリチル酸、およびホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ－アシル誘導体、ラウレス－９、およびβ－ジケトン（エナミン）のＮ－アミノアシル誘導体が挙げられるが、これに限定されるものではない。（例えばＫａｔｄａｒｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３；Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３－５１を参照されたい）。

【0453】

本明細書の用法では、非キレート化非界面活性剤浸透促進化合物は、キレート化作用物質としてまたは界面活性剤として有意でない活性を実証するが、それでもなお消化器粘膜を通じてｉＲＮＡの吸収を高める化合物と定義し得る（例えばＭｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３を参照されたい）。このクラスの浸透促進剤としては、例えば不飽和環式尿素、１－アルキル－および１－アルケニルアザシクロ－アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２）；およびジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非ステロイド性抗炎症剤（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１－６２６）が挙げられる。

【0454】

細胞レベルのｉＲＮＡ取り込みを高める作用物質もまた、本発明医薬およびその他の組成物に添加し得る。例えばリポフェクチンなどのカチオン性脂質（Ｊｕｎｉｃｈｉらに付与された米国特許第５，７０５，１８８号明細書）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリジンなどのポリカチオン性分子（Ｌｏｌｌｏらに付与された国際公開第９７／３０７３１号パンフレット）もまた、ｄｓＲＮＡの細胞内取り込みを高めることが知られている。市販される形質移入試薬の例としては、例えば特に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＤＭＲＩＥ－Ｃ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００ ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ Ｑ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ；Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＴＡＰ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＳＰＥＲ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、またはＦｕｇｅｎｅ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）－２０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）－５０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＴｒａｎｓＰａｓｓ^ａ Ｄ１ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、またはＨｉＦｅｃｔ（商標）（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる。

【0455】

エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール；２－ピロールなどのピロール；アゾン；およびリモネンおよびメントンなどのテルペンをはじめとするその他の作用物質が、投与された核酸の浸透を高めるのに利用され得る。

【0456】

ｖ．担体
本発明の特定の組成物は、また配合中に担体化合物が組み込まれる。本明細書の用法では、「担体化合物」または「担体」は、不活性（すなわちそれ自体は生物学的活性を有しない）であるが、例えば生物学的に活性の核酸を分解し、またはその循環からの除去を促進することで、生物学的活性を有する核酸の生物学的利用能を低下させる、生体内過程によって、核酸と認識される、核酸、またはその類似体を指し得る。核酸および担体化合物の、典型的に後者の物質の過剰量での同時投与は、恐らく通常の受容体に対する担体化合物と核酸間の競合のために、肝臓、腎臓またはその他の循環外貯蔵所で回収される核酸量の実質的低下をもたらし得る。例えば肝臓組織内の部分的ホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収は、それが、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジック（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ）または４－アセトアミド－４’－イソチオシアノ－スチルベン－２，２’－ジスルホン酸と同時投与された場合に、低下し得る（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５－１２１；Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ ＆ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７－１８３。

【0457】

ｖｉ．賦形剤
担体化合物とは対照的に、「薬学的担体」または「賦形剤」は、１つまたは複数の核酸を動物に送達するための、薬学的に許容可能な溶媒、懸濁剤またはあらゆるその他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は液体または固体であり得、核酸および所与の医薬組成物のその他の成分と組み合わせた際に、所望の嵩、粘稠度などを提供するように、計画される投与様式を念頭に置いて選択される。典型的な薬学的担体としては、結合剤（例えばα化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；増量剤（例えば乳糖およびその他の糖類、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、滑石、シリカ、二酸化ケイ素のコロイド、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えばデンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；および湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0458】

核酸と有害反応しない、経口投与に適する、薬学的に許容可能な有機または無機賦形剤を使用して、本発明の組成物を調合し得る。適切な薬学的に許容可能な担体としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0459】

核酸の局所投与のための製剤は、無菌および非無菌水性溶液、アルコールなどの共通溶剤中の非水性溶液、または液体または固体油基剤中の核酸溶液を含み得る。溶液はまた、緩衝液、希釈剤、およびその他の適切な添加剤も含有し得る。核酸有害反応しない、経口投与に適する、薬学的に許容可能な有機または無機賦形剤を使用し得る。

【0460】

適切な薬学的に許容可能な賦形剤としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘稠なパラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0461】

ｖｉｉ．その他の成分
本発明の組成物は、医薬組成物中に従来法で見られるその他の補助剤成分を、技術分野で確立されたそれらの使用レベルで、さらに含有し得る。したがって例えば組成物は、例えば、止痒剤、渋味剤、局所麻酔薬または抗炎症剤などの追加的な適合性薬理的活性材料を含有することができ、または染料、着香剤、保存料、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤などの本発明の組成物の様々な剤形を物理的に調合する上で有用な追加的材料を含有し得る。しかしこのような材料は、添加した場合に、本発明の組成物の成分の生物学的活性に過度に干渉すべきでない。製剤は滅菌され得て、所望ならば、製剤の核酸と有害に相互作用しない、例えば、潤滑剤、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧圧力に影響を及ぼす塩、緩衝液、着色料、着香料および／または芳香族物質などなどの助剤と混合される。

【0462】

水性懸濁液は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランをはじめとする、懸濁液の粘度を増大させる物質を含有し得る。懸濁液は、安定剤もまた含有し得る。

【0463】

いくつかの実施形態では、本発明で取り上げる医薬組成物は、（ａ）１つまたは複数のｉＲＮＡ化合物、および（ｂ）非ＲＮＡｉ機序によって機能し、溶血性障害の治療に有用な１つまたは複数の薬剤を含む。このような薬剤の例としては、抗炎症剤、抗脂肪症薬、抗ウイルス、および／または抗線維症薬が挙げられるが、これに限定される（ｌｍｉｔｅｄ）ものではない。それに加えて、シリマリンなどの肝臓を保護するのに一般に使用されるその他の物質もまた、本明細書に記載されるｉＲＮＡと併用し得る。肝臓疾患の治療に有用なその他の薬剤としては、テルビブジンと、エンテカビルと、テラプレビルおよび例えばＴｕｎｇらに付与された米国特許出願公開第２００５／０１４８５４８号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１６７１１６号明細書、および米国特許出願公開第２００３／０１４４２１７号明細書；およびＨａｌｅらに付与された米国特許出願公開第２００４／０１２７４８８号明細書で開示されたものなどのプロテアーゼインヒビターが挙げられる。

【0464】

このような化合物の毒性および治療効果は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死性の用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を判定するための細胞培養物または実験動物中などで、標準薬学的手順によって判定し得る。毒性および治療効果間の用量比が治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表し得る。高い治療指数を示す化合物が、好ましい。

【0465】

細胞培養アッセイと動物実験から得られるデータは、ヒトで使用するための投与範囲を策定するのに使用し得る。本発明で取り上げる組成物の投与量は、一般に、毒性がわずかまたは皆無であるＥＤ５０をはじめとする、循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明で取り上げる方法で使用されるあらゆる化合物について、最初に、治療有効用量を細胞培養アッセイから推定し得る。用量は、細胞培養中で判定される、ＩＣ５０（すなわち症状の最大半量阻害を達成する試験化合物濃度）をはじめとする、化合物の、または適切な場合には標的配列のポリペプチド産物の、循環血漿濃度範囲を達成する（例えばポリペプチド濃度の低下を達成する）ように、動物モデル中で策定されてもよい。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に判定し得る。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定し得る。

【0466】

本明細書で取り上げるｉＲＮＡは、上で考察されるそれらの投与に加えて、ＰＣＳＫ９発現によって媒介される病理過程の治療に効果的なその他の既知の作用物質と組み合わせて、投与し得る。いずれにしても処置を行う医師は、当該技術分野で公知のまたは本明細書に記載される、有効性の標準的手段を使用して観察される結果に基づいて、ｉＲＮＡ投与の量およびタイミングを調節し得る。

【0467】

ＶＩ．キット
本発明はまた、ｉＲＮＡ剤のいずれかを用い、かつ／または本発明の方法のいずれかを実施するためのキットを提供する。かかるキットは、１つ以上のＲＮＡｉ剤および使用説明書、例えば細胞内でのＰＣＳＫ９の発現を、細胞をＲＮＡｉ剤とＰＣＳＫ９の発現を阻害するのに有効な量で接触させることにより阻害するための使用説明書を含む。キットは、任意選択的には、細胞をＲＮＡｉ剤と接触させるための手段（例えば、注射デバイス）、またはＰＣＳＫ９の阻害を測定するための手段（例えば、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡまたはＰＣＳＫ９タンパク質の阻害を測定するための手段）をさらに含んでもよい。ＰＣＳＫ９の阻害を測定するためのかかる手段は、サンプル、例えば血漿サンプルなどを対象から得るための手段を含んでもよい。本発明のキットは、任意選択的には、ＲＮＡｉ剤を対象に投与するための手段または治療有効量もしくは予防有効量を決定するための手段をさらに含んでもよい。

【0468】

特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似したまたは同等の方法および材料を、本発明で取り上げるｉＲＮＡおよび方法の実施または試験で使用し得るが、適切な方法および材料は下述のとおりである。本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、配列表および図面も同様に、その内容全体を参照によって援用する。矛盾する場合は、定義を含めて本明細書が優先される。これに加えて、材料、方法、および実施例は、例証のみを意図し、制限は意図されない。

【実施例】

【0469】

実施例１．ＧａｌＮＡｃ結合オリゴヌクレオチドの合成
ヒトＰＣＳＫ９遺伝子（配列番号１）のヌクレオチド３５４４～３６２３を標的にする一連のｓｉＲＮＡ二本鎖を設計し、合成した。これらの同じ配列はまた、様々なヌクレオチド修飾を伴って合成し、三価ＧａｌＮＡｃと結合させた。修飾二本鎖のセンス鎖およびアンチセンス鎖配列を表１に示す。

【0470】

【表1】

【0471】

【表2】

【0472】

【表3】

【0473】

【表4】

【0474】

【表5】

【0475】

【表6】

【0476】

【表7】

【0477】

【表8】

【0478】

【表9】

【0479】

【表10】

【0480】

【表11】

【0481】

【表12】

【0482】

【表13】

【0483】

【表14】

【0484】

【表15】

【0485】

【表16】

【0486】

【表17】

【0487】

【表18】

【0488】

【表19】

【0489】

【表20】

【0490】

【表21】

【0491】

実施例２：ＡＤ－６０２１２の第１相臨床試験
皮下投与したＡＤ－６０２１２の安全性、耐容性、薬物動態および薬力学を評価するため、単回漸増用量（ＳＡＤ）アームおよび多回漸増用量（ＭＡＤ）アームを含む第１相無作為化単一盲検プラセボ対照試験を、スタチンの存在下または不在下で、増加した低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬｃまたはＬＤＬ－Ｃ）を有する対象において実施した。

【0492】

より具体的には、試験のＳＡＤ段階では、ベースラインＬＤＬ－Ｃ≧１００ｍｇ／ｄｌ（≧２．６ミリモル／Ｌ）および空腹時中性脂肪＜４００ｍｇ／ｄｌ（＜４．５ミリモル／Ｌ）を有する健常ボランティア対象において、単回皮下一定用量２５ｍｇ、１００ｍｇ、３００ｍｇ、５００ｍｇ、または８００ｍｇのＡＤ－６０２１２（ＡＬＮ－ＰＣＳｓｃ）がＰＣＳＫ９タンパク質とＬＤＬ－Ｃの双方を減少させる能力を試験した。試験のＭＡＤ段階では、ＡＤ－６０２１２がＰＣＳＫ９タンパク質とＬＤＬ－Ｃの双方を減少させる能力を試験するため、スクリーニング前の≧３０日間、安定用量のスタチンの存在下または不在下で、ＬＤＬ－Ｃ≧１００ｍｇ／ｄｌ、および空腹時中性脂肪＜４００ｍｇ／ｄｌ（＜４．５ミリモル／Ｌ）を有する対象を、ＡＤ－６０２１２の多回皮下注射で治療した。試験の多回投与アームにおける対象に、スタチン療法の不在下で、ＡＤ－６０２１２の一定用量１２５ｍｇを単回、週１回で４週間（１２５ｍｇ ｑＷ×４）、もしくはＡＤ－６０２１２の一定用量２５０ｍｇを単回、２週ごとに１回で１か月間（２５０ｍｇ ｑ２Ｗ×２）、もしくはＡＤ－６０２１２の一定用量３００ｍｇを単回、月１回で２か月間（３００ｍｇ ｑＭ×２）、またはスタチン療法の存在下で、ＡＤ－６０２１２の一定用量３００ｍｇを単回、月１回で２か月間（３００ｍｇ ｑＭ×２）、またはスタチン療法の不在下で、ＡＤ－６０２１２の一定用量５００ｍｇを単回、月１回で２か月間（５００ｍｇ ｑＭ×２）、またはスタチン療法の存在下で、ＡＤ－６０２１２の一定用量５００ｍｇを単回、月１回で２か月間（５００ｍｇ ｑＭ×２）投与した。

【0493】

血漿ＰＣＳＫ９タンパク質レベルを、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定し、血清ＬＤＬ－Ｃレベルを、β－定量化（Ｍｅｄｐａｃｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）により直接的に測定した。総コレステロール、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ－Ｃ）、非ＨＤＬ－Ｃ（総コレステロールからＨＤＬ－Ｃを差し引いたもの）、アポリポタンパク質Ｂ、リポタンパク質（ａ）および中性脂肪のレベルもまた測定した。

【0494】

試験のＳＡＤ段階における対象のコホート人口統計学およびベースライン特性を表２Ａに提示し、試験のＭＡＤ段階における対象のコホート人口統計学およびベースライン特性を表２Ｂに提示する。

【0495】

ＡＤ－６０２１２の非修飾センスおよびアンチセンス配列は、
センス－５’－ＣＵＡＧＡＣＣＵＧＵＴＵＵＧＣＵＵＵＵＧＵ－３’（配列番号６８６）；および
アンチセンス－５’－ＡＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＵＣＵＡＧＡＡ－３’（配列番号６８５）である。

【0496】

ＡＤ－６０２１２の修飾センスおよびアンチセンス配列は、
センス－５’－ｃｓｕｓａｇａｃＣｆｕＧｆｕｄＴｕｕｇｃｕｕｕｕｇｕ－３’（配列番号６８７）；および
アンチセンス－５’－ａｓＣｆｓａＡｆＡｆＡｆｇＣｆａＡｆａＡｆｃＡｆｇＧｆｕＣｆｕａｇｓａｓａ－３’（配列番号６８８）である。

【0497】

ＳＡＤ段階
ＡＤ－６０２１２は、ＳＡＤ段階におけるすべての用量レベルで良好な耐容性を示し、有害事象（ＡＥ）に起因する治療の中断はなく、重篤なＡＥは全く報告されなかった。

【0498】

ベースラインに対するパーセント平均ＰＣＳＫ９ノックダウンとして示される、単回投与コホートにおけるＰＣＳＫ９タンパク質レベルのノックダウンを図１に示し、ベースラインに対するパーセント平均ＬＤＬ－Ｃ低下として示される、単回投与コホートにおけるＬＤＬ－Ｃレベルの低下を図２に示す。表３は、ＳＡＤ段階における投与後８４および１８０日目の、ＰＣＳＫ９のタンパク質レベル、ＬＤＬ－Ｃのレベル、総コレステロールのレベル、ＨＤＬ－Ｃのレベル、非ＨＤＬ－Ｃのレベル、アポリポタンパク質Ｂのレベル、中性脂肪のレベル、およびアポリポタンパク質ａのレベルにおけるベースラインからの平均（ＳＤ）パーセント変化を提示する。

【0499】

データは、ＡＤ－６０２１２の投与がＰＣＳＫ９レベルを用量依存的様式で最大で３００ｍｇ低下させたことを示す。用量≧３００ｍｇは、ＰＣＳＫ９レベルにおける同様の持続的低下をもたらし、それは少なくとも６か月間にわたり維持された。ＰＣＳＫ９レベルは、２５ｍｇおよび１００ｍｇ投与コホートにおいて、１８０日目までにベースラインまで（最終３回の測定値の平均≧ベースラインの８０％）回復した。≧３００ｍｇの投与を受けた対象（ｎ＝１２）では、ＰＣＳＫ９レベルにおけるベースラインからの最大の個体の相対的低下は８９％であった（８００ｍｇ用量、１１２日目）。平均最大パーセント低下（個体の最下点での平均パーセント低下）は８２％であり、８００ｍｇ投与コホートにおいて認められた。ＡＬＮ－ＰＣＳｓｃを３００～８００ｍｇ受けた対象（ｎ＝２～６／投与群）におけるＰＣＳＫ９レベルにおけるベースラインからの変化は、治療後７±１日目から治療後１１２日目にかけての全部で１１の測定点において、プラセボ治療対象よりも有意に大きかった（Ｐ≦０．０１１）。

【0500】

データは、ＡＤ－６０２１２の投与が用量依存的なＬＤＬ－Ｃの最大で３００ｍｇの低下（そこではほぼ最大の低下が達成された）をもたらしたことをさらに示す。ＬＤＬ－Ｃの低下は、３００～８００ｍｇの用量範囲にわたり同様であった。これらの投与を受けた対象（ｎ＝１２）では、ＬＤＬ－Ｃにおけるベースラインからの最大の個体の低下は７８％であった（５００ｍｇ用量；５６日目）。平均最大および最大の最小二乗平均（ＬＳＭ）パーセント低下は５９％であり、５００および８００ｍｇコホートにおいて認められた。ＬＤＬ－Ｃレベルは、２５ｍｇおよび１００ｍｇ用量の最終投与後１８０日目までにベースラインレベルの方へ回復した。ＬＤＬ－Ｃの低下は、≧３００ｍｇの投与後少なくとも１８０日目まで維持された。ＡＬＮ－ＰＣＳｓｃを３００～８００ｍｇ受けた対象（ｎ＝３～６）におけるベースラインからのＬＤＬ－Ｃの低下は、治療後１４±２日目から治療後１１２日目にかけての全部で１０の測定値において、プラセボと比べて統計学的に有意であった（Ｐ≦０．０３７）。

【0501】

総コレステロール、非ＨＤＬ－Ｃ、アポリポタンパク質Ｂおよびリポタンパク質（ａ）の濃度における減少もまた、ＡＤ－６０２１２治療対象において記録された。これらのパラメータにおける減少は、比較の大部分におけるプラセボと比べて統計学的に有意であった。

【0502】

ＭＡＤ段階
ＡＤ－６０２１２はまた、ＭＡＤ段階におけるすべての用量レベルで良好な耐容性を示し、有害事象（ＡＥ）に起因する治療の中断はなく、重篤なＡＥは全く報告されなかった。

【0503】

ベースラインに対するパーセント平均ＰＣＳＫ９ノックダウンとして示される、多回投与コホートにおけるＰＣＳＫ９タンパク質レベルのノックダウンを図３に示し、ベースラインに対するパーセント平均ＬＤＬ－Ｃの低下として示される、多回投与コホートにおけるＬＤＬ－Ｃレベルの低下を図４に示す。表４は、ＳＡＤ段階における投与後８４および１８０日目の、ＰＣＳＫ９のタンパク質レベル、ＬＤＬ－Ｃのレベル、総コレステロールのレベル、ＨＤＬ－Ｃのレベル、非ＨＤＬ－Ｃのレベル、アポリポタンパク質Ｂのレベル、中性脂肪のレベル、およびアポリポタンパク質ａのレベルにおけるベースラインからの平均（ＳＤ）パーセント変化を提示する。

【0504】

データは、試験したすべての治療計画でのＡＤ－６０２１２の投与後、ＰＣＳＫ９タンパク質レベルが低下したことを示す。低下は、すべての多回投与コホートを通じて同様であり、その低下は、最終投与後の少なくとも６か月間維持された。公開文献（Ｋｈｅｒａ ＡＶ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ １１５：１７８－８２；Ｇｕｏ ＹＬ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｌｉｎ Ｄｒｕｇ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ ３３：８７７－８３）に合致するように、ＰＣＳＫ９のベースライン値は、安定用量のスタチンを受けた対象において高めであった。ＰＣＳＫ９における低下は、ベースラインＰＣＳＫ９レベルに依存せず、対象においてスタチン療法とは無関係に同様であった。ＰＣＳＫ９におけるベースラインからの最大の個体の低下は９４％であった（スタチンとの同時投与で５００ｍｇ ＱＭ×２、６３日目）。平均最大パーセント低下は８９％であり、スタチンとの同時投与で５００ｍｇの投与を受けた対象において認められた。単独療法（すなわちスタチンの不在下；ｎ＝３～６／投与群）としてＡＤ－６０２１２の多回投与を受けた対象におけるベースラインからのＰＣＳＫ９濃度の変化は、治療後４日目から１２６日目にかけての全部で１５の測定点において、プラセボよりも有意に大きかった（Ｐ≦０．００２）。

【0505】

データは、同様の持続的なＬＤＬ－Ｃの低下がすべての多回用量でのＡＤ－６０２１２治療計画の場合に達成されたことをさらに示す。ＬＤＬ－Ｃの低下は、ベースラインＬＤＬ－Ｃレベルに依存せず、スタチン併用療法の存在下および不在下で同様であった。最大の個体のＬＤＬ－Ｃの低下は８３％であった（スタチンとの同時投与で５００ｍｇ ＱＭ×２、２９日目）。ＬＤＬ－Ｃにおける平均最大パーセント低下は６４％であり、６０％のＬＳＭ低下がスタチンの不在下で３００ｍｇの投与を受けるコホートで認められた。すべてのＭＤコホートにおけるＬＤＬ－Ｃの低下は、少なくとも６か月間持続した。

【0506】

ＡＤ－６０２１２単独療法の対象（ｎ＝３～６）におけるベースラインからのＬＤＬ－Ｃの変化は、治療計画に応じて約８～約１７週の範囲の期間にわたり、プラセボと有意に異なった（Ｐ≦０．０５）。

【0507】

総コレステロール、非ＨＤＬ－Ｃ、アポリポタンパク質Ｂおよびリポタンパク質（ａ）の濃度における減少もまた、ＡＬＮ－ＰＣＳｓｃ治療対象において記録された。これらのパラメータにおける減少は、比較の大部分におけるプラセボと比べて統計学的に有意であった。

【0508】

要するに、ＬＤＬ－Ｃレベルを低下させるためにＰＣＳＫ９を標的にするＡＤ－６０２１２の皮下投与により、２５～８００ｍｇの単回用量、および２８日間にわたる総量５００～１０００ｍｇの２～４用量でのＭＤ投与計画において良好な耐容性が示された。

【0509】

図１および２と表３に示すように、ＡＤ－６０２１２の一定用量（≧３００ｍｇ）での単回皮下注射により、単回投与後６か月超にわたる確実なＰＣＳＫ９のノックダウンおよびＬＤＬ－Ｃの低下が得られた。単回一定用量のＡＤ－６０２１２の投与後、最大で８９％の最大ＰＣＳＫ９ノックダウンとともに８２％の平均最大ＰＣＳＫ９低下、および最大で７８％の最大低下のＬＤＬ－Ｃ低下とともに５９％の平均最大ＬＤＬ－Ｃ低下が認められた。さらに、ＬＤＬ－Ｃは、単回投与後１４０日目、有意に（Ｐ＜０．００１）平均で４４％低下した。

【0510】

図３および４と表４に示すように、ＡＤ－６０２１２の２か月の一定用量は、スタチン同時投与の存在下または不在下で、最大で９４％のＰＣＳＫ９の最大ノックダウンとともに８９％の平均最大ＰＣＳＫ９低下、および最大で８３％のＬＤＬ－Ｃの最大低下とともに６４％の平均最大ＬＤＬ－Ｃ低下をもたらした。

【0511】

これらのデータは、本明細書で示したＡＤ－６０２１２の単回用量（≧３００ｍｇ）およびすべての多回用量がＰＣＳＫ９とＬＤＬ－Ｃ双方の循環濃度の著しく持続的な減少に関連したことを示す。これらの用量では、ＰＣＳＫ９およびＬＤＬ－Ｃに対する効果が治療後の少なくとも１８０日間にわたり有意に低下した状態を維持し、故にＰＣＳＫ９の最大で７６％の低下、およびＬＤＬ－Ｃの最大で４８％の低下がＡＤ－６０２１２の最終注射後６か月経ても明白であり、また投与期間後６か月にわたり著しく少ない変動を示した。スタチン療法にＡＤ－６０２１２を加えるとき、相加的な血清ＬＤＬ－Ｃの低下が得られ、併用療法はいずれの作用物質の安全性および耐容性にも影響しなかった。

【0512】

ＳＡＤおよびＭＡＤ段階の双方におけるＡＤ－６０２１２治療対象において、総コレステロール、非ＨＤＬ－Ｃ、アポリポタンパク質Ｂおよびリポタンパク質（ａ）の濃度における減少が認められた。これらのパラメータにおける減少は、比較の大部分におけるプラセボと比べて統計学的に有意であった。

【0513】

【表22】

【0514】

【表23】

【0515】

【表24】

【0516】

【表25】

【0517】

【表26】

【0518】

【表27】

【0519】

【表28】

【0520】

【表29】

【0521】

【表30】

【0522】

【表31】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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