(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-06-23
(45)【発行日】2023-07-03
(54)【発明の名称】銅ナノクラスター、それを含む組成物、及び神経変性疾患の治療
(51)【国際特許分類】
A61K 33/34 20060101AFI20230626BHJP
A61K 31/30 20060101ALI20230626BHJP
A61K 47/62 20170101ALI20230626BHJP
A61K 47/61 20170101ALI20230626BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20230626BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20230626BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230626BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230626BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20230626BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20230626BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20230626BHJP
A61P 27/06 20060101ALI20230626BHJP
A61P 39/06 20060101ALI20230626BHJP
【ＦＩ】
A61K33/34
A61K31/30
A61K47/62
A61K47/61
A61K47/54
A61K9/14
A61P25/00
A61P25/28
A61P25/16
A61P25/14
A61P21/00
A61P27/06
A61P39/06
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2021541300
(86)(22)【出願日】2019-06-28
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-21
(86)【国際出願番号】 CN2019093451
(87)【国際公開番号】W WO2020147267
(87)【国際公開日】2020-07-23
【審査請求日】2021-09-15
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2019/071901
(32)【優先日】2019-01-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】521313935
【氏名又は名称】武漢広行科学研究有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＷＵＨＡＮ ＶＡＳＴ ＣＯＮＤＵＣＴ ＳＣＩＥＮＣＥ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ５０６， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ １， Ｏｐｔｉｃｓ Ｖａｌｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ， Ｎｏ． ３８８ Ｇａｏｘｉｎ ２ｎｄ Ｒｏａｄ， Ｄｏｎｇｈｕ Ｎｅｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ Ｗｕｈａｎ， Ｈｕｂｅｉ ４３００７０ （ＣＮ）
(74)【代理人】
【識別番号】110001139
【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人
(74)【代理人】
【識別番号】100130328
【弁理士】
【氏名又は名称】奥野 彰彦
(74)【代理人】
【識別番号】100130672
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 寛之
(72)【発明者】
【氏名】スゥン、タオレイ
(72)【発明者】
【氏名】チァン、バイソォン
【審査官】石井 裕美子
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０４４５８０５０（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０５８３４４４４（ＣＮ，Ａ）
【文献】J.Am.Chem.Soc，2018年12月，Vol.141，pp.1091-1099
【文献】Biomacromolecules，2009年，Vol.10，pp.2632-2639
【文献】J Fluoresc，2017年，Vol.27，pp.529-536
【文献】J.Exp.Med.，2012年，Vol.209，pp.837-854
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／００－３３／４４
Ａ６１Ｋ ９／００－ ９／７２
Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
神経変性疾患を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、銅ナノクラスターを含み、前記銅ナノクラスターがリガンドを含み、前記リガンドは、チミン、チミンで修飾したヒアルロン酸、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブタノイル－Ｌ－システイン、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブタノイル－Ｄ－システイン、Ｎ－アセチル－Ｄ－システイン、Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド、Ｌ－ヒスチジン－Ｌ－システインジペプチド、Ｌ－システイン－Ｌ－ヒスチジンジペプチド、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド、Ｌ－リジン－Ｌ－システイン－Ｌ－プロリントリペプチド、Ｌ－グルタチオン、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド、１－[（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル]－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、及びドデシルメルカプタンからなる群より選ばれる、医薬組成物。
【請求項2】
前記リガンドで修飾した銅ナノクラスターは、直径の範囲が０．５～３ｎｍである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記リガンドで修飾した銅ナノクラスターは、直径の範囲が０．５～２．５ｎｍである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳症、及び緑内障からなる群より選ばれる、請求項１に記載の医薬組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、神経変性疾患の技術分野に関し、特に銅ナノクラスター（ＣｕＮＣｓ）、ＣｕＮＣｓを含む組成物、及びそれらの神経変性疾患の治療における応用に関する。
【背景技術】
【0002】
神経変性疾患は、ヒトの健康への主要な脅威の１つであり、その特徴は、神経細胞の進行的損傷及び神経損失であり、これにより、運動や認知機能の低下をもたらす。一般的な神経変性疾患には、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、及び緑内障（Ｋｉｍ ２０１５；Ｌｉｕ ２０１７；ＳｉｎｇＨ２０１９）が含まれる
【0003】
神経変性疾患の発症機序は、活性酸素種（ＲＯＳ）により引き起こされる酸化ストレス（ＯＳ）により開始又は加速されると考えられる。ＲＯＳは、酸素由来の反応性分子の群として定義され、これは一般に、未成対価電子により短寿命で反応性が高い。ＲＯＳは、遊離ラジカル（スーパーオキシド、Ｏ２
－）、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）、又は非ラジカル（過酸化水素、Ｈ２Ｏ２）を含むが、これらに限定されない。それらは、生物学的系内で自然に生成され、炎症、細胞生存、及びストレッサ応答のような細胞応答、並びに心臓血管障害、筋肉機能不全、アレルギー、癌、及び神経変性疾患を含む多くの疾患に関与する面で重要な役割を果たす。それらの反応性のために、高濃度のＲＯＳは、細胞死又は酸化ストレス（ＯＳ）につながる可能性がある。ＯＳは、酸化促進剤レベルと酸化防止剤レベルとの間の不均衡により生成される条件である。神経変性疾患の複雑な発症機序は、未だ未知のことが多いが、増大したＯＳが様々な神経変性疾患における潜在的な共通病因の１つとして示唆される（Ｋｉｍ ２０１５；Ｌｉｕ ２０１７；ＳｉｎｇＨ２０１９）。
【0004】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、最も一般的な神経変性障害であり、挙動、認知及び機能が徐々に低下することを特徴とする。ＡＤの病態生理学は、主としてアミロイドβ（Ａβ）プラークの細胞外沈着及び細胞内タウ神経原線維変化（ＮＦＴ）の蓄積に関連する。ＡＤの初期段階においても、Ａβの蓄積は、ＯＳを増加させ、ミトコンドリア機能不全及びエネルギー障害につながるようである。また、ＯＳは、Ａβの産生及び凝集を悪化させ、タウタンパク質のリン酸化を促進することができ、これはＡＤの発症機序の悪質なサイクルを引き起こす可能性がある。ＲＯＳ誘導ＯＳは、ＲＯＳ過剰産生がＡＤの開始及び進行において重要な役割を果たすと考えられているので、ＡＤの発症機序において重要な因子として出現する（Ｋｉｍ ２０１５；Ｌｉｕ ２０１７；Ｃｈｅｉｇｎｏｎ（２０１８）。
【0005】
ＰＤは、主に高齢者で発症し、そして年齢とともに発症率が高くなる。保守的な見積もりによれば、世界中のＰＤ患者の数は１千万を超える。しかしながら、ＰＤの病因は未だに不明である。臨床治療に関しては、軽度及び中等度のＰＤを治療するためにいくつかの薬物が米国ＦＤＡにより承認されているが、これらの薬物は、ＰＤ患者の認知機能又は運動機能を一時的に改善することしかできない。患者が薬物をやめると、直ぐに症状がリバウンドしてしまう。現在まで、ＰＤの病理学的プロセスを停止させ又は逆転させることができる薬物が存在しない。
【0006】
ＰＤの主な病理学的特徴は、脳幹、脊髄、及び皮質におけるドーパミン作動性ニューロンの喪失と、レビー小体と呼ばれる細胞内タンパク質性封入体の存在である。レビー小体は、主にα－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）の凝集体により形成されたアミロイド線維を含む。α－ｓｙｎは、ニューロンのシナプス前膜の末端に位置する。細胞内の天然α－ｓｙｎは、高度に可溶で天然的に折り畳まれない。α－ｓｙｎのミスフォールディングは、病的条件下で起こり、かつレビー小体病変を形成するように凝集及びフィブリル化するβシート構造を生成する。ドーパミン作動性ニューロンの変性に関連する病理学的メカニズムは、ＲＯＳ又は他の遊離ラジカルの過剰蓄積と相関している。ＰＤを治癒させるための有効な手段が現在存在していないとしても、疾患の進行におけるＲＯＳ関連メカニズムに対する理解は、ＰＤ症状を軽減する可能な治療に対する重要な洞察を提供する。コエンザイムＱ１０、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、イチョウ（Ｇｉｎｋｏ ｂｉｌｏｂａ）及びポリフェノールのような抗酸化特性を有する物質が試験されているが、神経保護性におけるいずれの効力の正当な証拠も示されていない（Ｌｉｕ ２０１７；Ａｌ Ｓｈａｈｒａｎｉ ２０１８）。
【0007】
ハンチントン病（ＨＤ）は、ＨＴＴ遺伝子におけるシトシン、アデニン、グアニン（ＣＡＧ）の反復配列の不安定な伸長に関連する進行性神経変性疾患である。多くの研究は、酸化マーカーの上昇と非可逆的なニューロン損傷との間の関連性を示している。興味深いことに、ＨＤにおけるＯＳの役割が確立されたことにもかかわらず、従来の酸化防止剤を使用して疾患を治療しようとする試行は、ほとんど無効であった（Ｌｉｕ ２０１７）。
【0008】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、脊髄の前方ホーンにおける運動ニューロンの進行性喪失を特徴とする。それは、明確に定義された遺伝要素があるかどうかに応じて、家族性又は散発性のいずれかとして分類される（Ｌｉｕ ２０１７）。
【0009】
脊髄小脳運動失調症（ＳＣＡ）は、進行性神経変性を特徴とする常染色体優性疾患である。ＳＣＡに関連する一般的な症状は、運動失調性歩行、骨運動障害、構音障害及び認知障害である（Ｌｉｕ ２０１７）。
【0010】
緑内障は、視神経損傷、視野欠陥、及び視覚機能の進行性喪失を特徴とする非可逆性視神経変性疾患である。これは、白内障の次に世界での二番目多い非可逆的な、失明につながる眼疾患である。２０２０年の臨床分析データによれば、世界の緑内障患者の数は、特にアジアとアフリカにおいて７６万に達し、一方、中国の緑内障患者の数は、次いで２１００万レベルに達する。緑内障の発症機序は未知のままである。長時間の間、病理学的眼圧の上昇は、神経損傷及び緑内障を引き起こす主要な要因の１つと考えられる。緑内障の臨床治療は、主に、患者の眼圧を低下させることに基づく。しかしながら、多くの臨床的データによると、眼圧のみを制御することは、緑内障の治療の目標を達成することができない。これは、眼圧に対する制御が理想的である場合であっても、進行性視神経損傷及び網膜神経節細胞（ＲＧＣ）アポトーシスはさらに悪化する可能性があるからである。従って、高い眼圧は、緑内障関連光学神経損傷の初期の素因にすぎず、眼圧を低下させるだけで光学神経機能のさらなる喪失を防止することは困難である。上記の理由から、緑内障の治癒に対して、視神経機能の増強、視神経細胞のアポトーシス及び視神経損傷の阻止や緩和は重要である。しかしながら、臨床的には、現在、緑内障関連の視神経損傷を効果的に防止する医薬が見出されていない。研究によれば、酸化ストレス、機械的ストレス、自己免疫系異常、血糖値、炎症性分子及び異常タンパク質沈殿などのような種々の要因は、視神経損傷をもたらす可能性があることを発見した。これらの要因の中で、より注目されるのがアミロイド－β（Ａβ）のミスフォールディング、異常凝集及びフィブリル化であり、そして、細胞の内と外でのタウタンパク質は、視神経変性疾患及びＲＧＣの死の過程において重要な役割を果たしている。
【0011】
Ａβは、３９～４３個のアミノ酸残基を含むタンパク質であり、β－セクレターゼ及びγ－セクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の加水分解から生成されるものである。それは、神経損傷及び神経細胞アポトーシスに関与する重要な因子である。研究により、Ａβの神経毒性は、アルツハイマー病（ＡＤ）のような種々の神経変性疾患の形成及び発病の共通のメカニズムであることが明らかとなっており、そして関連する薬物の研究開発のための重要な標的として使用されてきた。最近の研究では、Ａβの神経毒性は、眼の神経変性疾患である緑内障においても重要な役割を果たすことがわかっている。臨床緑内障患者のＲＧＣ及び房水におけるＡβの発現は、対照群よりも有意に高い。緑内障動物モデルでは、長期高眼圧により誘導されるＲＧＣアポトーシスは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の増加、Ａβ発現及びタウタンパク質の過剰な高リン酸化に密接に関連する。一方、臨床データから、ＡＤ患者が緑内障及び視力損失を有することがより容易であることがわかっている。そして、大量のＡＰＰが合成され、ＡＤトランスジェニック動物の網膜にＡβプラーク凝集が現れる。したがって、緑内障及びＡＤは、類似のＡβメカニズムを有する可能性がある。より重要なことは、緑内障動物モデルにおいて、アポトーシスフェーズ中のＲＧＣは、Ａβと共発現され、Ａβの過剰産生を阻害することができる。Ａβ抗体又は薬物は、ＲＧＣアポトーシスを効果的に阻害し、視神経損傷を減少させることができる。これらの研究結果から、Ａβが緑内障の発病メカニズムにおいて重要な役割を果たし、視神経保護メカニズムに基づく緑内障の治療のための重要な標的であることがわかっている。
【0012】
視神経破砕損傷ラットモデルは、広く使用されている高眼圧を伴わない緑内障の動物モデルである。このモデルは、視神経上神経の完全性を維持し、視神経軸索輸送障害及び緑内障のＲＧＣ死を模擬し、臨床的緑内障損傷特性に近い。同時に、モデルは標準的な方法で準備され、操作が容易であり、明確かつ定量的な視神経損傷を引き起こすことができ、誤差が少なく、再現性の良い。このモデルは、緑内障の視神経損傷の正確なモデルであり、中国国内外においてよく承認され、緑内障の視神経損傷及びＲＧＣ損傷の病理学的メカニズムの研究及び視神経保護のための薬物のスクリーニングに広く使用されている。例えば、このモデルによれば、ジンセノサイドＲｇ１、デキサメタゾン、イチョウ、及びα－リポ酸は、いくらかの視神経保護効果を有するが、保護効果は十分なものではないことが見出された。Ａβメカニズムは、視神経損傷過程において重要な役割を果たすため、動物モデルにおいて、光学神経を保護し、視覚機能を改善しながら、Ａβ凝集及びフィブリル化を抑制することができる薬物の開発は、緑内障の予防及び治療にとって非常に重要である。
【0013】
累積的なＯＳは、いずれも老化プロセスの加速及び神経変性疾患の進行における重要な因子として知られている細胞損傷、ＤＮＡ修復システムの損傷、及びミトコンドリア機能障害を引き起こす可能性がある（Ｋｉｍ ２０１５）。神経変性疾患におけるＯＳの重要な役割を考慮すると、ＲＯＳレベルの制御は、神経変性を遅くし、関連する症状を緩和する有望な治療選択肢である。この点に関して、グルタチオン（ＧＳＨ）、ビタミンＣ、ビタミンＥ、及びコエンザイムＱ１０を含む、抗酸化特性を有する多くの化合物が、神経変性症状を減衰させる可能性について検討されているが、入り交じった結果が得られた（Ｌｉｕ ２０１７）。
【0014】
銅は、人に多くの生物学的機能に必要な希少元素である。α－ｓｙｎは、Ｃｕ２＋などのような金属イオンに対して高い親和性を示す。Ｃｕ２＋－α－ｓｙｎ相互作用は、酸化ストレスの増加と毒性オリゴマーの発生に関与する。毒性オリゴマーは、インビトロで、コンダクタンス活性を変化させる膜二重層に細孔様構造を形成し、インビボで、膜を破壊し細胞死を引き起こす可能性がある。また、銅イオンは、ドーパミン（ＤＡ）と共にα－ｓｙｎに協調的に結合されることができ、α－ｓｙｎのフィブリル化をさらに高く増強する。銅のホメオスタシスの異常調節は、すでにＰＤ患者において見出された。最近の研究では、黒質（ＳＮ）における総組織銅の低下がわかっているが、高レベルの非結合銅がＣＳＦで発見され、運動障害の原因となる恐れがある。Ｃｕ２＋の上昇は、ＰＤに関連する。上記知見に基づいて、ＰＤでの銅のホメオスタシス不全の調節を焦点とするＰＤ治療が広く評価される。ＰＤ動物モデルでの前臨床試験では、前記の銅キレート剤であるクリオキノールのＰＤ療法での使用の可能性について検討した。クリオキノールはＳＮでのニューロンの生存を増加させることがわかった。さらに、４つの異なるＰＤ動物モデルにおける銅イオン複合体であるＣｕ２＋ －ジアセチルビス（４－メチルチオセミカルバゾン）（Ｃｕ２＋（ａｔｓｍ））のインビボ評価によれば、神経保護、認知能力の改善、及び運動機能の回復がわかった（Ｇｉａｍｐｉｅｔｒｏ．Ｒら、２０１８；Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ．Ｈら、２０１２；Ｔｒｉｓｔａｎ－Ｌｏｐｅｚ．Ｌら、２０１４）。インビトロ研究は、Ｃｕ２＋－α－ｓｙｎ複合体（Ｄｕｄｚｉｋ、２０１１）及びＣｕ依存性α－ｓｙｎ細胞内凝集体（ＭｃＬｅａｒｙ、２０１８）の形成も発見した。
【0015】
銅ナノクラスタ（ＣｕＮＣｓ）は、銅原子と銅ナノ結晶との間にある物質であり、表面上の安定化配位子を有する数～数十の銅原子から構成される（Ｙａｏ２０１８）。ＣｕＮＣｓは、それらの固有のサイズ依存的光学特性及び電子特性のためにかなりの注目を集めており、従って、ナノ粒子触媒、バイオセンサー、細胞標識、及び光電子ナノデバイスのような幅広い用途に大きな見込みを示す（Ｊｉｎ、２０１６；Ｌｉｕ、２０１８）。出願人が知っている限り、神経変性疾患の治療にＣｕＮＣｓを適用することに関する報告がない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0016】
【文献】Al Shahrani M, et al. Oxidative Stress: Mechanistic Insights into Inherited Mitochondrial Disorders and Parkinson's Disease, J. Clin. Med. 2017, 6,100; doi:10.3390/jcm6110100
【文献】Cheignon C, et al. Oxidative stress and the amyloid beta peptide in Alzheimer's disease, Redox Biology, 2018, 14: 450-464
【文献】Dudzik CG, et al. Coordination features and affinity of the Cu2+ site in the α-synuclein protein of Parkinson's disease. Biochemistry.2011; 50: 1771-7
【文献】Giampietro R, et al. The Pivotal Role of Copper in Neurodegeneration: A New Strategy for the Therapy of Neurodegenerative Disorders. Mol. Pharmaceutics 2018; 15: 808-820 Jin R, et al. Atomically Precise Colloidal Metal Nanoclusters and Nanoparticles: Fundamentals and Opportunities, Chem. Rev., 2016, 116, 10346-10413
【文献】Kim GH, et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases, Exp Neurobiol. 2015, 24(4): 325-340
【文献】Kozlowski H, et al., Copper, zinc and iron in neurodegenerative diseases (Alzheimer's, Parkinson's and prion diseases). Coordination Chemistry Reviews 2012; 256: 2129- 2141
【文献】Liu Z, et al. Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases: From Molecular Mechanisms to Clinical Applications, Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2017, Article ID 2525967
【文献】Liu X, et al. Atomically Precise Copper Nanoclusters and Their Applications, Coord. Chem. Rev., 2018, 359, 112-126
【文献】Manna U, et al. Layer-by-layer self-assembly of modified hyaluronic acid/chitosan based on hydrogen bonding. Biomacromolecules.2009; 10: 2632-9
【文献】McLeary FA, et al. Dexamethasone Inhibits Copper-Induced Alpha-Synuclein Aggregation by a Metallothionein-Dependent Mechanism. Neurotox Res.2018; 33:229-238
【文献】Singh A, et al. Oxidative Stress: A Key Modulator in Neurodegenerative Diseases, Molecules, 2019, 24: 1583
【文献】Tristan-Lopez L, et al. Copper and Copper Proteins in Parkinson's Disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2014; Article ID 147251
【文献】Yang D, et al. Poly(thymine)-Templated Selective Formation of Copper Nanoparticles for Alkaline Phosphatase Analysis Aided by Alkyne-Azide Cycloaddition "Click" Reaction. ACS Appl. Nano Mater. 2018; 1: 168-174
【文献】Yao Q, et al. Toward Total Synthesis of Thiolate-Protected Metal Nanoclusters, Acc. Chem. Res.; 2018; 51; 1338-1348
【発明の概要】
【0017】
本発明は、対象の神経変性疾患を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、銅ナノクラスター（ＣｕＮＣｓ）を含み、前記ＣｕＮＣｓがリガンドを含む、医薬組成物を提供する。
【0018】
前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記リガンドで修飾したＣｕＮＣｓは、直径の範囲が０．５～３ｎｍである。
【0019】
前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記リガンドで修飾したＣｕＮＣｓは、直径の範囲が０．５～２．５ｎｍである。
【0020】
前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記リガンドは、チミン、チミンで修飾したヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）、Ｌ－システイン及びその誘導体、Ｄ－システイン及びその誘導体、システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体、及びその他のチオール含有化合物からなる群より選ばれる一つである。
【0021】
前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記Ｌ－システイン及びその誘導体が、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブタノイル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、及びＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれ、前記Ｄ－システイン及びその誘導体が、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブタノイル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、及びＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる。
【0022】
前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体は、システイン含有ジペプチド、システイン含有トリペプチド又はシステイン含有テトラペプチドである。
【0023】
前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記システイン含有ジペプチドが、Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ－ヒスチジン－Ｌ－システインジペプチド（ＨＣ）、及びＬ－システイン－Ｌ－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）からなる群より選ばれる。
【0024】
前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記システイン含有トリペプチドが、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ－リジン－Ｌ－システイン－Ｌ－プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、及びＬ－グルタチオン（ＧＳＨ）からなる群より選ばれる。
【0025】
前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記システイン含有テトラペプチドが、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、及びグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）からなる群より選ばれる。
【0026】
前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記その他のチオール含有化合物が、１－[（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル]－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、及びドデシルメルカプタンからなる群より選ばれる。
【0027】
前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記神経変性疾患が、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳症（ＳＣＡ）、及び緑内障からなる群より選ばれる。
【0028】
本発明の目的及び利点は、添付の図面と関連して、以下の好ましい実施形態の詳細な説明から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【0029】
以下、図面を参照して本発明の好適な実施の形態を説明するが、同様の符号は同様の要素を示す。
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【図4】図４は、チミンの置換度（ＤＳ）が異なるＴＭＨＡにより製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓを示す写真及びグラフを提供する。図４（ａ）及び（ｄ）は、それぞれ、チミンのＤＳが３．２％であるＴＭＨＡで製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓのＴＥＭ又はＡＦＭ画像を示す。図４（ｂ）及び（ｅ）は、チミンのＤＳが１０．５％であるＴＭＨＡで製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓのＴＥＭ又はＡＦＭ画像を示す。図４（ｃ）及び（ｆ）は、チミンのＤＳが２０．１％であるＴＭＨＡで製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓのＴＥＭ又はＡＦＭ画像を示す。図４（ｇ）及び（ｈ）は、それぞれ、ＴＭＨＡ又はＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓのＭＳスペクトルを示す。そして、図４（ｉ）及び（ｊ）は、（ｉ）ＣｕＮＣｓの全領域及び（ｊ）Ｃｕ ２ｐ領域のＸＰＳスペクトルを示す。図４では、挿入図（ｂ、ｇ、ｈ）は、それぞれ、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓ ナノワイヤー、イオン化断片及びＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの模式図であり、（ｅ、ｆ）は、単離されたナノワイヤーからなるＣｕＮＣｓである。
【0034】
【0035】
【0036】
【0037】
【0038】
【0039】
【0040】
【0041】
【0042】
【0043】
【0044】
【0045】
【0046】
【0047】
【0048】
【発明を実施するための形態】
【0049】
本発明は、本発明の特定の実施形態の以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解することができる。
【0050】
この出願において、本発明が関連する技術の状態をより完全に説明するために、刊行物が参照される場合、これらの刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0051】
スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）は、高反応性Ｏ２
－から反応性がより少ないＨ２Ｏ２及び酸素への分解を触媒する際に重要な役割を果たす。サイトゾル銅／亜鉛－ＳＯＤ （ＳＯＤ１）、ミトコンドリアマンガンＳＯＤ（ＳＯＤ２）、及び細胞外ＳＯＤ（ＳＯＤ３）は、同定されたＳＯＤの３つの異なるアイソフォームである。ＳＯＤ１とＳＯＤ２は、それぞれ、主にサイトゾルとミトコンドリアにおけるＯ２
－の除去に関与する（Ｋｉｍ ２０１５）。
【0052】
グルタチオン過酸化酵素（ＧＰＸ）は、電子供与体としてグルタチオン（ＧＳＨ）を利用してＨ２Ｏ２及び脂質過酸化物の還元を触媒する複数のイソ酵素のファミリーを含む。ＧＰＸは、サイトゾルとミトコンドリアの両方にある。哺乳動物では、セレン依存性グルタチオン過酸化酵素の５つの異なるアイソフォーム（ＧＰＸ１～４と６）、及びセレノシステインの代わりにシステインを有する３つの非セレン同族体（ＧＰＸ５、７と８）が存在する。ＧＰＸの抗酸化機能は、細胞内の各アイソフォーム及び位置に依存し、ＧＰＸ１は脳内の主要な抗酸化酵素の１つとみなされる。研究によると、ＧＰＸ１のアップレギュレーションがニューロン損傷に対する保護応答の１つであることを示唆している（Ｋｉｍ ２０１５）。
【0053】
カタラーゼは、補因子として鉄又はマンガンのいずれかを用いて、Ｈ２Ｏ２を水及び酸素へ変換させるものである。カタラーゼは、ペルオキシソームにありし、細胞質及びミトコンドリアにも見出される。カタラーゼの役割は、低レベルのＨ２Ｏ２の場合では重要でないが、より高いレベルのＨ２Ｏ２の場合ではより重要になる（Ｋｉｍ ２０１５）。
【0054】
正常な生物では、活性酸素種（ＲＯＳ）は、種々の酵素の調節を通してホメオスタシスを維持する。カタラーゼ（ＣＡＴ）は、ほとんど全ての生物中に存在する。ＣＡＴは酵素捕捉剤であり、鉄ポルフィリンに基づく接触酵素である。これは、Ｈ２Ｏ２から分子状酸素及び水への分解を促進し、生物学的防御システムにおける重要な酵素の１つである。グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）は、体内に広く存在する重要な過酸化物分解酵素である。ＧＰｘの活性中心はセレノシステインである。セレンは、ＧＳＨからＧＳＳＧへの変換を触媒し、毒性の過酸化物を非毒性のヒドロキシ化合物に還元することにより過酸化物による干渉及び損傷から細胞膜の構造及び機能を保護するＧＳＨ酵素系の成分である。スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）は、有害なスーパーオキシドラジカルを過酸化水素に変換する体中の天然に存在するスーパーオキシドラジカル捕捉剤である。過酸化水素は体に有害な酸素であるが、体内のペルオキシダーゼにより直ちに完全に無害な水に分解する。ＣＡＴは、酸化ストレス中の過剰なＨ２Ｏ２の除去を行うことが知られているが、ＧＰｘは、細胞信号におけるＨ２Ｏ２の濃度を微調整することができる。ＣＡＴ－ＧＰｘ相乗作用は、病態生理学的条件下でのＨ２Ｏ２レベルの正確な制御のために重要であることが報告されている。このようにして、３つの酵素は完全な抗酸化剤鎖を形成する。
【0055】
本発明は、活性酸素種（ＲＯＳ）による酸化ストレス（ＯＳ）により開始又は加速される神経変性疾患を治療するための組成物及び方法を提供する。前記神経変性疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳症（ＳＣＡ）、及び緑内障を含むが、これらに限定されない。
【0056】
本発明は、一つ又は複数のリガンドで修飾した銅ナノクラスター（ＣｕＮＣｓ）を提供する。特定の実施形態では、前記リガンドで修飾したＣｕＮＣｓは、直径が０．５～５ｎｍの範囲にあり、好ましくは０．５～３ｎｍの範囲にあり、より好ましくは０．５～２．５ｎｍの範囲にある。特定の実施形態では、前記リガンドは、チミン、チミンで修飾したヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）、Ｌ（Ｄ）－システイン及びＮ－イソブタノイル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブタノイル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン及びＮ－アセチル－Ｄ－システイン等のその他のシステイン誘導体、システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体（例えば、Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ－システイン Ｌ－ヒスチジン（ＣＨ）、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ－グルタチオン（ＧＳＨ）、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）及びグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）等のジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、及びその他のシステイン含有ペプチドを含むが、これらに限定されない。）、及び１－[（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル]－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン及びドデシルメルカプタンのうち一つ又は複数等のその他のチオール含有化合物を含むが、これらに限定されない。
【0057】
本発明は、神経変性疾患を有する対象を治療するための組成物を提供する。特定の実施形態では、前記組成物は、銅ナノクラスター（ＣｕＮＣｓ）と、薬理学的に許容される賦形剤とを含む。
【0058】
特定の実施形態では、前記組成物は、チミンで修飾したヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）と、薬理学的に許容される賦形剤とを含む。
【0059】
特定の実施形態では、前記組成物は、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓと、薬理学的に許容される賦形剤とを含む。
【0060】
本発明は、神経変性疾患を治療するための医薬の製造における銅ナノクラスター（ＣｕＮＣｓ）の使用を提供する。
【0061】
本発明は、神経変性疾患を治療するための医薬の製造におけるチミンで修飾したヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）の使用を提供する。
【0062】
本発明は、神経変性疾患を治療するための医薬の製造におけるＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの使用を提供する。
【0063】
本発明は、神経変性疾患を有する対象を治療する方法を提供する。
【0064】
特定の実施形態では、前記方法は、前記対象に有効用量の銅ナノクラスター（ＣｕＮＣｓ）を含む組成物を投与することを含む。
【0065】
特定の実施形態では、前記方法は、前記対象に有効用量のチミンで修飾したヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）を含む組成物を投与することを含む。
【0066】
特定の実施形態では、前記方法は、前記対象に有効用量のＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓを含む組成物を投与することを含む。
【0067】
特定の実施形態では、前記神経変性疾患を有する対象には、腹腔内注射により有効量のＣｕＮＣｓが投与される。特定の実施形態では、前記神経変性疾患を有する対象には、腹腔内注射により有効量のＴＭＨＡが投与される。特定の実施形態では、前記神経変性疾患を有する対象には、腹腔内注射により有効量のＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓが投与される。特定の実施形態では、前記有効量は、２～１００ ｍｇ ｋｇ－１の範囲にある。
【0068】
本発明は、チミンで修飾したヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）及びＴＭＨＡを合成する方法を提供する。
【0069】
ＴＭＨＡの構造は、図１（ａ）（ｉ）に示すように、式１で示され、ＨＡがグルクロン酸（ＧｌｃＡ）－Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の繰り返し単位からなり、ＧｌｃＮＡｃがチミンで修飾され、及びｎが整数であり、１０～１０,０００であり、好ましくは１０～１,０００であり、より好ましくは１０～１００である。なお、ＨＡにおけるすべてのＧｌｃＮＡｃが必ずしもチミンで修飾したものではない。ＴＭＨＡにおけるチミンの置換度（ＤＳ）とは、ＴＭＨＡの１００つの糖残基当たりのチミン分子の数と定義される。ＴＭＨＡにおけるチミンの置換度（ＤＳ）は、１～５０％の範囲にあり、好ましくは４～３０％の範囲にあり、より好ましくは５～２０％の範囲にあり、さらに好ましくは７～１６％の範囲にあり、よりさらに好ましくは８～１５％の範囲にある。
【0070】
ＴＭＨＡを合成する方法は、
【0071】
０．０５～０．０２ｗ／ｖ％の濃度でチミンの酸性水溶液を提供することと、（特定の実施形態では、前記酸性水溶液が水とＨＣｌから構成される。）
【0072】
１～５ｗｔ％の濃度でＨＡ溶液を提供することと
【0073】
ＨＡ溶液に触媒を添加することと（特定の実施形態では、前記触媒がポリリン酸エステルである。）
【0074】
ＨＡ－チミン混合物を形成するようにチミンの酸性水溶液を触媒含有ＨＡ溶液に添加することと（特定の実施形態では、チミンの酸性水溶液を滴下注入により添加する。）
【0075】
ＨＡ－チミン混合物を所定の時間加熱することと（特定の実施形態では、前記加熱は、オイルバスにおいて４５～５０℃で１２～２０時間行う。）、
【0076】
加熱されたＨＡ－チミン混合物を所定の温度まで冷却することと（特定の実施形態では、未反応のチミンを沈殿させるために、前記所定の温度は、約０℃である。）、
【0077】
冷却されたＨＡ－チミン混合物から上清液を透析することと（特定の実施形態では、未反応の試薬及び不純物を除去するために、前記透析は、分子量カットオフ８０００で、４８～９６時間行う。）、
【0078】
透析された溶液を凍結乾燥して、ＴＭＨＡを得ることと、
を含む。
を含む。
【0079】
本発明は、さらに、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓ及びＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの合成方法を提供する。
【0080】
特定の実施形態では、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの合成方法は、
【0081】
ＴＭＨＡ溶液を提供することと（特定の実施形態では、前記ＴＭＨＡ溶液が０．１ｍＭであり、ｐＨ７．０。）、
【0082】
ＴＭＨＡ溶液にＣｕＳＯ４溶液を添加することと（特定の実施形態では、前記ＣｕＳＯ４溶液が２０ｍＭであり、ｐＨ７．０、かつ、滴下により添加される。）、を含み
【0083】
それにより、前記混合物を反応させる。特定の実施形態では、前記反応は、遮光で３７℃で２０分間行って、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓ溶液を得て、前記ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓ溶液が、使用まで、遮光で４℃で保存される。
【0084】
ＵＶ光（３６５ｎｍ）照射で、明るいオレンジ色の発光が綺麗に見られ、発光ＣｕＮＣｓの形成が成功することがわかっている。
【0085】
特定の実施形態では、ＣｕとＴＭＨＡとのモル比が、１０：１～５００：１の範囲にあり、好ましくは１５：１～３００：１の範囲にあり、より好ましくは２０：１～２００：１の範囲にあり、さらに好ましくは２５：１～１００：１の範囲にあり、よりさらに好ましくは３０：１～８０：１の範囲にある。
【0086】
前記ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓは、良好に分散された直径０．５～３ｎｍの球状ナノクラスターを含有する。
【0087】
以下の実施例は、本発明の原理を説明する目的のみで提供され、それらは本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【0088】
実施例
【0089】
（１）チミンで修飾したヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）の合成
【0090】
まず、ポリリン酸エステルが触媒として製造された。ジエチルエーテル（１４．５ｍＬ）及びＣＨＣｌ３（５．６ｍＬ）を撹拌しながら五酸化リン（１０ｇ）に添加し、混合物を還流で５０℃で１２時間加熱し、透明な溶液を得た。室温までに冷却した後、溶媒を真空下で留去した。得られた無色の粘性残留物は、ポリリン酸エステルであり、さらに精製することなく、触媒として使用された。
【0091】
次に、ＴＭＨＡを以下のように合成した。チミン（２３．６ｍｇ）の透明な溶液は、０．２５ｍＬの濃縮ＨＣｌ溶液（２５％）を添加した２５ｍＬのＨ２Ｏに溶解することにより得られた。ポリリン酸エステル（１．５ｇ）を、ＨＡ溶液（５０ｍＬ、２．２ｗｔ％；ＭＷ１２０ＫＤ）に添加し、次にチミンを滴下注入し、混合物をオイルバスで５０℃まで１６時間加熱し、そして０℃まで冷却し、未反応のチミンを沈殿させた。続いて、上清液を透析バッグ（分子量カットオフ８０００）を介して７２時間透析して、いずれの未反応の試薬及び不純物を除去した。得られた溶液を凍結乾燥して、ＴＭＨＡを得た。その収率が８６％であり、置換度（ＤＳ）が１０．５％であった。最終生成物の品質は、１Ｈ ＮＭＲ及びＦＴ－ＩＲにより同定された。
【0092】
図１を参照すると、図１（ａ）（ｉｉ）は、ＴＭＨＡの合成を示す。そして、図１（ａ）（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）は、それぞれ、ＨＡ及びＴＭＨＡの典型的な外見を示す。図１（ｂ）は、それぞれ、ＴＭＨＡ（赤線）及び純粋なＨＡ（青線）のＵＶ－ｖｉｓスペクトルを示す。図１（ｃ）は、ＨＡ及びＴＭＨＡのＦＴ－ＩＲを示す。そして、図１（ｄ）は、ＨＡ及びＴＭＨＡの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。１Ｈ ＮＭＲスペクトル分析は、８０℃、４００ＭＨｚでＤ２Ｏにおいて、１０ｍｇ・ｍＬ－１の試料濃度で行われた。ＦＴＩＲ解析に関して、試料準備においてＫＢｒ結晶がマトリックスとして使用された。
【0093】
ＴＭＨＡ複合体の化学的構造は、天然ＨＡとその誘導体のスペクトルとの比較を介して、ＦＴＩＲにより定性的に検討された。これらのスペクトルは、天然ＨＡと比較して、特にＤＳがより高いＴＭＨＡ誘導体と比較して、３０００～３２００ｃｍ－１及び１３００～１８００ｃｍ－１の範囲において顕著な相違を示した。前記天然ＨＡの特徴的ピークの割り当ては、３３６０ｃｍ－１（二次Ｏ－Ｈストレッチ）、２８７３ｃｍ－１（Ｃ－Ｈストレッチ）、１６２２ｃｍ－１（アミドＩＩバンド、アセチル基のＣ－Ｏストレッチ）、１５５４ｃｍ－１（アミドＩＩバンド、Ｎ－Ｈストレッチ）、１３８０ｃｍ－１（ＣＨ２基の非対称Ｃ－Ｈストレッチ曲げ）、１３１４ｃｍ－１（第一級アルコール性基のＯ－Ｈストレッチ）、及び１０２６ｃｍ－１（架橋Ｃ－Ｏストレッチに関する骨格振動）であった。ＴＭＨＡ誘導体のスペクトルは、３つの特徴的ピークを示し、即ち、３１９５と３０７９ｃｍ－１（Ｎ－Ｈストレッチ）、１７３０ｃｍ－１（Ｃ＝Ｏストレッチ）、及び１３４０ｃｍ－１（Ｃ－Ｎストレッチ振動）であり、チミンによるＨＡの官能化を示唆している。より重要的には、ＨＡに属する第一級アルコール性基のＯ－Ｈストレッチに当たる１３１４ｃｍ－１でのバンドの消失は、ＨＡのＧｌｃＮＡｃの第一級－ＯＨ基のみがチミンと反応する、反応メカニズムを示唆している。１Ｈ ＮＭＲ解析により、修飾の成功がさらに確認された。
【0094】
（２）ＴＭＨＡを用いたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの合成
【0095】
１０ｍＬのＴＭＨＡ（ＤＳが１０．５％）溶液（０．１ｍＭ、ｐＨ７．０）を徐々に３７℃まで加熱し、ＴＭＨＡを溶解した。２ｍＬのＣｕＳＯ４（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）溶液を滴下し、遮光、３７℃でさらなる２０分間反応させた。ＵＶ光照射（３６５ｎｍ）で、明るいオレンジ色の発光が綺麗に見られ、発光ＣｕＮＣｓの形成が成功したことがわかった。最後に、使用まで、遮光で４℃で保存された。
【0096】
最適な合成条件、例えば、Ｃｕ２＋／ＴＭＨＡのモル比、ｐＨ値、反応温度、及び時間のそれぞれについて詳細に検討した。反応系に対するＣｕ２＋含有量の影響を研究するために、異なる濃度の２ｍＬのＣｕＳＯ４を、１０ｍＬのＴＭＨＡ溶液に添加し、当該反応系におけるＣｕ２＋とＴＭＨＡとのモル比が、５：１、１０：１、１５：１、２０：１、３０：１、４０：１、６０：１、８０：１、１００未満：１であった。軽く撹拌しながら遮光、３７℃で、ｐＨ７．０で２０分間反応した後、コロイド試料が得られ、発光分光計により検測された。ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの形成に対するｐＨ値の影響をよく理解するために、１．０Ｍ ＮａＯＨ又は１．０Ｍ ＨＣｌにより調整した異なるｐＨ値以外、同じ環境で一連の試験を実施した。また、反応温度（２０～７０℃）、及び反応時間（１～２５分間）の影響についても、それぞれ、検討した。発光分光計により、得られた試料を検測した。
【0097】
図２を参照すると、得られたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光強度に対する（ａ）Ｃｕ２＋とＴＭＨＡとのモル比、（ｂ）反応ｐＨ値、（ｃ）反応温度、及び（ｄ）反応時間の影響を示すグラフを提供する。図２（ａ）に示すように、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光強度は、Ｃｕ２＋とＴＭＨＡとのモル比が５から４０まで増加するとともに向上し、Ｃｕ２＋とＴＭＨＡとの比をさらに４０から１００まで増加すると、徐々に低下した。図２（ｂ）に示すように、反応ｐＨ値は、高品質のＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの形成に重要な役割を果たした。ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光強度は、反応ｐＨ値が４から７まで増加するとともに大幅に増強し、そして速やかに低下し始めた。例えば、反応ｐＨ１０で、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの発光は、蛍光分光法を介して観察することが困難となった。図２（ｃ）に示すように、２０～５０℃の反応温度は、高度な蛍光ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの形成に理想的なパラメータであった。図２（ｄ）に示すように、製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光強度は、合成時間が１分間から８分間まで延長すると、大幅に増強した。時間がさらに２５分間まで増加すると、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光強度が一定に維持された。全ての観測に基づいて、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの最高の蛍光強度は、以下の最適化された合成条件で得られることを確認した：Ｃｕ２＋とＴＭＨＡとのモル比が約４０、ｐＨ７．０溶液、そして３７℃で４時間反応した。
【0098】
（３）ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの安定性の研究
【0099】
ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの発光安定性の評価は、以下の手順に従って行われた。まず、様々な濃度のＮａＣｌ溶液（１００μＬ）をＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓ溶液（９００μＬ）と混合し、２５℃で３０分間インキュベートした。次に、５００μＬのＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓ溶液と様々な陽イオン又は陰イオン溶液（５００μＬ、２ｍＭ）とを十分に混合して、２５℃で３０分間インキュベートした。そして、ＮａＯＨ（１．０Ｍ）又はＨＣｌ（１．０Ｍ）を５ｍＬのＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓ溶液に入れて、体系ｐＨを調整し、２５℃で３０分間インキュベートした。最後に、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光スペクトルを励起波長３８５ｎｍ及び発光波長６１０ｎｍで測定した。
【0100】
図３を参照すると、得られたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光強度に対する（ａ）ＮａＣｌ濃度（０～１Ｍ）、（ｂ）共有カチオン及びアニオン、（ｃ）ｐＨ値（４～１０）、及び（ｄ）重合時間（０～５週間）の影響を示すグラフを提供する。図３（ａ）に示すように、異なる濃度（０、０．２、０．４、０．６、０．８及び１．０Ｍ）のＮａＣｌ溶液において、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光強度は変化せず、強イオン強度の環境でのＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの高い安定性を示した。より重要的には、２ｍＭのＮａ＋、Ｂａ２＋、Ｆｅ３＋、Ｇｄ３＋、Ｓｎ４＋のようなその他の遷移金属イオン、及びＣｌ－、ＣＯ３
２－、ＰＯ４
３－、Ｃ２Ｏ４
２－、Ｃ６Ｈ５Ｏ７
３－のようなアニオンをＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの溶液に添加すると、これらの選ばれたイオンは、いずれも蛍光強度に無視できるぐらいの影響を与えた（図３（ｂ））。同じような安定的な蛍光性能も、図３（ｃ）に示されている。ｐＨ値を４．０から１０．０まで調整しても、対応するＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光スペクトルに明らかな影響を与えることがない。これから明らかなように、当該緩衝系において、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓは、ｐＨ値に敏感ではないとわかった。また、空気中、室温（２５℃）で５週間重合した後、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓに沈殿、凝集や蛍光強度の低下が見られなかった（図３（ｄ））。これらの全ての結果から、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓが優れた安定性を有し、実際の応用が見込まれていることがわかった。
【0101】
（４）ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの合成に対するＴＭＨＡ中のチミンの置換度（ＤＳ）の影響
【0102】
ヒアルロン酸（ＨＡ）及びチミンは、天然生物的分子であり、チミンは、Ｃｕ２＋を十分にキレート化させる役割を果たし、ＨＡのヒドロキシル基は、金属ナノクラスターの成核と成長のための還元剤として作用する。本発明の発明者らは、チミンの置換度（ＤＳ）がＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの合成に重要な調整因子であると見出した。ｐＨ７．０溶液において、Ｃｕ２＋とＴＭＨＡとのモル比が約５０であり、そして３７℃で４時間反応させた。
【0103】
図４を参照すると、チミンの置換度（ＤＳ）が異なるＴＭＨＡにより製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓを示す写真及びグラフを提供する。図４（ａ）及び（ｄ）は、それぞれ、チミンのＤＳが３．２％であるＴＭＨＡで製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓのＴＥＭ又はＡＦＭ画像を示す。図４（ｂ）及び（ｅ）は、チミンのＤＳが１０．５％であるＴＭＨＡで製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓのＴＥＭ又はＡＦＭ画像を示す。図４（ｃ）及び（ｆ）は、チミンのＤＳが２０．１％であるＴＭＨＡで製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓのＴＥＭ又はＡＦＭ画像を示す。図４（ｇ）及び（ｈ）は、それぞれ、ＴＭＨＡ又はＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓのＭＳスペクトルを示す。そして、図４（ｉ）及び（ｊ）は、（ｉ）ＣｕＮＣｓの全領域及び（ｊ）Ｃｕ２ｐ領域のＸＰＳスペクトルを示す。図４では、挿入図（ｂ、ｇ、ｈ）は、それぞれ、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓナノワイヤー、イオン化断片及びＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの模式図であり、（ｅ、ｆ）は、ナノワイヤーで構成される単離されたＣｕＮＣｓである。
【0104】
チミンのＤＳレベルが１０．５％である場合、よく分散された、直径が０．５～３ｎｍの範囲にある、平均直径が１．６４±０．４８ｎｍである球状ＣｕＮＣｓを生成した。それに対して、より低い（３．２％）又は高い（２０．１％）レベルでは、大量のワタ状のＣｕＮＣｓは、それぞれ、直径が１．０８±０．７２ｎｍ及び１．９６±０．８３ｎｍであるものとして現れた。次に、ＴＭＨＡを未処理ＨＡに変更した以外に、同じ試験要素で試験を行う場合、酷く縮合された大分子のネットワークしか確認されなかった（図４（ｉ）及び（ｊ））。さらに予想外のは、１０．５％のＤＳにより、直径８．０５±０．４３ｎｍであるＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓナノワイヤーの一次元組立体を生成した（図４（ｂ）及び（ｅ））。チミンのＤＳが２０．１％まで増加すると、ナノワイヤーは、長さ／直径比が大きく低下したため、一部が区別できなくなった（図４（ｃ）及び（ｆ））。微調整されたＣｕＮＣｓと線形ＴＭＨＡ鋳型との共有結合により、ＣｕＮＣｓが高次アレイ、即ちＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓに自己組織化することを保証した。なお、凝集誘起発光（ＡＩＥ）に基づいて、このようなナノワイヤーは、効果的にＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光安定性及び強度を向上した（詳細は後述する）。
【0105】
（５）チミンからその他のリガンドへの置き換え
【0106】
金属のコアサイズを変更せずにナノワイヤーを形成する単独のＣｕＮＣｓをより明確的に検出するため、チミンリガンドを、より強いＣｕ－Ｓ結合を生成することにより、チオレートに置き換えた。ＧＳＨをリガンドとして予想通りＣｕＮＣｓを形成したが、その使用により、母体ナノワイヤーが容易にその構築単位、即ちＣｕＮＣｓに分解される。図５に示すように、ＧＳＨリガンドを有するＣｕＮＣｓの熱重量解析を示すグラフを提供した。ここで、リガンド交換の策略を利用して、母体ナノワイヤーをその構築単位、例えばＣｕＮＣｓに分解する。製造直後のＴＭＨＡ鋳型のＣｕＮＣｓ（１ｍＬ）を、ＧＳＨ水溶液（０．０５Ｍ、５ｍＬ）に添加し、室温で８時間撹拌した。白色沈殿は、反応が進行するともに生成した。８０００ｒｐｍで約１０分間遠心することにより、生成した上清液が回収された。エタノールの添加により、上清液からＧＳＨ安定化ＣｕＮＣｓを沈殿させ、エタノールで３回洗浄を繰り返した。最後に、生成物は、凍結乾燥され、冷蔵庫で長期間保存のために保存された。
【0107】
（６）ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの同定
【0108】
なお、中間ＤＳが１０．５％である場合、断面プロフィール解析及び多分散指数により実証されるように、完全、球状、及び均一のＣｕＮＣｓが形成される。ＨＲ－ＴＥＭ画像から細かく計算すると、０．２０７ｎｍの模様間隔距離が示され、面心格子金属Ｃｕの（１１１）結晶面と一致した。図６は、チミンのＤＳが３．２％（青）、１０．５％（赤）、及び２０．１％（緑）であるものをそれぞれ使用して得られたＣｕＮＣｓの励起（λｅｍ＝６１３ｎｍで測定される。）スペクトルを示すグラフである。
【0109】
以下では、特に断らない限り、１０．５％のＤＳでＴＭＨＡにより製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓを使用した。
【0110】
電子顕微鏡の補足として、質量分析（ＭＳ）も、クラスターサイズ解析において信頼性のあるツールであることが証明された。ここで、高解像度エレクトロスプレーイオン化ＭＳ（ＥＳＩ－ＭＳ）を利用して、サブナノメートルサイズのＣｕＮＣｓの正確な分子式を同定することを試みた。注目すべきことに、純粋なＨＡは、主として、陽イオンモードにおいてそのイオン化効率が低いため、いかなる可視イオン信号も示されなかった。対照的にＴＭＨＡの陽イオン化は、ｍ／ｚ＝１０６．１９３６で単一のピークを生成した（図（４（ｇ））。チミンからのＨＮＣＯの損失のため、[Ｃ４Ｈ５ＮＯ＋Ｎａ]＋の式に帰することができる。いくつかの測定パラメータをスクリーニングした後、ＴＨＭＡの代わりに、Ｃ４Ｈ５ＮＯがＣｕＮＣｓのイオン化においてリガンドとして作用する場合、豊富なイオン信号を放出することが容易になる。これらのパラメータは、チミンの分解を促進するために適切なエネルギーを供給するので、最適なものとして選択され、キャピラリー電圧ｃａ．４５００Ｖ、乾燥温度１５０℃であった。元素解析とｍ／ｚ＝１０４３．２５４５での最高のイオンピーク（図（４（ｈ））とを組み合わせることにより、ＣｕＮＣｓの定義式は、Ｃｕ６Ｌ５として決定された。低質量範囲の他のイオンピークも、Ｃｕ６関連化学種のフラグメントと正確に対応した。その結果から、Ｃｕ６クラスターは支配的な種であり、ＤＳが３．２％及び２０．１％である二つの対照群に対して、チミンのＤＳが１０．５％であるＴＭＨＡにより合成されたＣｕＮＣが優れた単分散性を有する。
【0111】
Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）解析により、ＣｕＮＣが、Ｃ、Ｏ、Ｎ、及びＣｕを含む全ての予想される元素から構成されたことが明らかになった。ＣｕＮＣ中の無機含有量を計算すると、２９．８重量％であった。さらに、９３２．３及び９５２．１ｅＶでの２つの強いシグナルが、Ｃｕ０の２ｐ３／２及び２ｐ１／２電子の結合エネルギーによるものである、また、サテライトシグナルがないことから、Ｃｕ２＋の欠如がわかった。なお、Ｃｕ０の２ｐ３／２結合エネルギーは、Ｃｕ＋の２ｐ３／２結合エネルギーに非常に近い。従って、製造されたＣｕＮＣｓの原子価状態は、０と＋１の間にある可能性が最も高いとなった。
【0112】
図７を参照すると、（ａ）チミンの異なるＤＳでのＰＬスペクトル（左）及び減衰プロファイル（右）、挿入図：３６５ｎｍ励起での画像；（ｂ）Ｃｕ２＋含有量に対するＴＭＨＡプローブのＰＬ応答；（ｃ）様々な金属に対する、Ｃｕ２＋のためのＴＭＨＡプローブのＰＬ及び色改変（挿入図）、を示すグラフを提供する。
【0113】
（７）Ｃｕ２＋イオンの検出のためのプローブとしてのＴＭＨＡ
【0114】
３つを健康な成人ボランティアから採取し、残りをＰＤを有する成人ボランティアから採取した５つの尿試料を、それぞれ尿中のタンパク質及び他の生物種の干渉を除去するようにアセトニトリルで希釈した。１０℃で１２,０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離した後、上清液を回収し次の実験に利用した。最初に、上清液を脱イオン水で希釈して、上清中に残存するＣｕ２＋濃度を減少させた。次いで、１００μＬの尿試料を２００μＬのＴＭＨＡ（０～４０μｇ・ｍＬ－１）と混合し、２５℃で１０分間インキュベートした後、蛍光分光法により検査された。
【0115】
なお、５６０ｎｍでの大きなＣｕナノ粒子の表面プラズモン共鳴とは光学的特徴が明らかに異なる。ＸＲＤピークのベースラインへの広がりは、ＣｕＮＣｓの小さなサイズと一致した。興味深いことに、サブナノ規模のＣｕＮＣｓは、ＤＳ依存性フォトルミネセンス（ＰＬ）特徴を有した。３８５ｎｍの励起下で、１０．５％のＤＳ誘導ナノワイヤーは、６１３ｎｍにピークを有し、５７μｓの長い寿命と、１４．８％の大きな量子収率を有する明らかな安定的な発光を示した（図（７（ａ））。より低次のＣｕＮＣｓ組立体では、これらの特性が急速に低下し、自己組織化駆動のＡＩＥを示唆している。より多くのＣｕＮＣｓが密にかつ規則的に充填されると、より安定で強いＰＬ応答が得られる。反応因子を調整することにより、本発明の清浄な合成経路は、ＴＭＨＡ（キレート化、Ｃｕ２＋を還元し、かつ自己組立体をＣｕＮＣｓナノワイヤーへの鋳型とするする。）に依存し、従来の経路で導入された不純物を消去し、顕著なＰＬ特性を得ることができた。例えば、ＴＭＨＡセンサのＰＬ強度は、直線的で、Ｃｕ２＋濃度に応じて明らかに改善されたものであり、２．２ｐｐｂの極めて低い検出限界に対応する（図（７（ｂ））。現在報告されている方法と比較して、その解析性能は、従来技術のプローブ及び米国ＥＰＡにより設定された飲料水の最大レベルに比べて、約１．５倍及び４８０倍小さいことを示した。また、図（７（ｃ）において、外来イオンに対して、光学特性はＣｕ２＋に対して選択的であった。従って、ＴＭＨＡは、高感度及び選択性を有する比色及び蛍光Ｃｕ２＋プローブとして使用することができる。
【0116】
（８）ＣｕＮＣｓの酸化防止機能
【0117】
細胞酸化防止酵素を機能的に模倣するＣｕＮＣｓの能力を研究した。予想外に、ＣｕＮＣｓは、１次反応速度論に基づいてＨ２Ｏ２を激しく分解することができた（図（８（ａ））。次に、本発明者らは、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）アッセイを介してＣｕＮＣｓのＧＰｘ様活性を研究した。種々のアッセイ条件で記録された初期速度は、図（８（ｂ）に示され、ＣｕＮＣｓのＧＰｘ様機能を直接支持した。さらに、ＣｕＮＣｓは、顕著なＳＯＤ様活性を有し、そして、スーパーオキシド源としてのＫＯ２からの大量Ｏ２が生成することから、スーパーオキシドのＨ２Ｏ２及びＯ２（図（８（ｃ））への不均化の作用原理が推定された。さらに、ＣｕＮＣｓは、細胞酸化防止剤として使用される既存の金属よりも明らかな多酵素的利点を有した（図（８（ｄ））。
【0118】
図８を参照すると、（ａ）ＣｕＮＣｓと反応するＨ２Ｏ２のＵＶ吸収、（ｂ）ＣｕＮＣｓ及び様々な対照群のＧＰｘ様活性の初期速度、（ｃ）ＣｕＮＣｓ ＳＯＤ様活性、挿入図：Ｏ２生成速度、（ｄ）ＣｕＮＣｓとその他の金属との触媒活性の比較、を示すグラフを提供する。
【0119】
（９）ＴＭＨＡによるＰＤの非侵襲的診断
【0120】
プローブとしてＴＭＨＡを用いてヒト尿液試料中のＣｕ２＋含有量を測定した。注目すべきことに、赤色蛍光がＰＤ患者からの尿液試料中のみに現れた。その高い特異性及び簡単な操作を考慮すると、ＴＭＨＡは、ＰＤについての早期診断及びリスク評価において新しい機会を開くことができた。
【0121】
図９を参照すると、ＰＤの早期診断のための尿液Ｃｕ２＋の検出を示すグラフを提供する。
【0122】
（１０）インビトロ細胞試験
【0123】
ＰＣ１２（ラット副腎髄質褐色細胞腫細胞株）、ＳＨＳＹ－５Ｙ（ヒト神経芽細胞腫細胞株）、及びＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓細胞株）細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、２ｍＭ・Ｌ－グルタミン、１００ＵｍＬ－１ペニシリン、１００μｇ・ｍＬ－１ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
【0124】
メチルチアゾリルテトラゾリウム（ＭＴＴ）アッセイを実施して、細胞生存率を測定することによりＴＭＨＡのインビトロ細胞毒性を測定した。ＭＴＴアッセイでは、ＳＨＳＹ－５Ｙ細胞をウェル当たり５０００個の生存細胞の密度で９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートして細胞付着を可能にした。次いで、この細胞を、特定の濃度で、ブランクＴＭＨＡ溶液（Ｃｕ２＋添加なし）と共にインキュベートした。その後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。培地を５ｍｇ・ｍＬ－１ＭＴＴを含有する新鮮なＤＭＥＭで置き換えた後、細胞をさらに４時間インキュベートした。ＭＴＴ溶液を除去した後、ＤＭＳＯで紫色のホルマザン結晶を溶解し、吸光度をマイクロプレートリーダー（ＦＬ ６００、Ｂｉｏ－Ｔｅｋ）上で５７０ｎｍでモニターした。結果を、３つの測定値の平均値として表した。同じ方法で、ＨＥＫ２９３細胞及びＰＣ１２細胞に対する純粋なＴＨＭＡのインビトロ細胞毒性を測定した。ＴＭＨＡは、５００μｇ・ｍＬ－１ほど高い用量で非毒性であった。
【0125】
次に、本発明者らは、ＰＤ表現型の実験的細胞モデルにおけるＴＭＨＡの細胞保護特性を調べた。このモデルは、ＭＰＴＰ（１－メチル－４－フェニル－１,２,３,６－テトラヒドロピリジン）の活性代謝物であるＭＰＰ＋（１－メチル－４－フェニルピリジニウム）を用いて、ラット副腎髄質褐色細胞腫細胞（ＰＣ１２）を処理することにより生成された。
【0126】
１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）は神経毒である。それ自体は毒性ではないが、脳に入ると、この神経毒は化合物１－メチル－４－フェニルピリジン（ＭＰＰ＋）に代謝される。ＭＰＰ＋は、黒質中のＤＡ作動性ニューロンを破壊する可能性がある。同時に、ＭＰＰ＋は、ミトコンドリア代謝の呼吸鎖中の重要な物質であるＮＡＤＨデヒドロゲナーゼと干渉することができ、細胞死及びフリーラジカルの蓄積を引き起こす。このプロセスにより引き起こされるＤＡ作動性ニューロンの大量死は、大脳皮質による運動制御に重大な影響を及ぼし、その結果、ＰＤの類似の症状をもたらす。そのため、ＭＰＴＰ及びＭＰＰ＋は、ＰＤ関連動物及び細胞モデルの確立並びにＰＤ薬物の研究及び開発において広く使用されている。
【0127】
ＰＣ１２細胞を、Ｃｕ２＋及びＴＨＭＡの非存在下又は存在下で６ウェルプレートで培養した。次いで、種々の濃度のＭＰＰ＋（０．５～４ｍＭ）を添加した。細胞の相対的生存率もＭＴＴアッセイにより決定した。４ｍＭのＭＰＰ＋は、ＰＣ１２細胞の重篤な細胞傷害性（即ち、２０％未満の細胞生存率未満）を誘発した。驚きなのは、４ｍＭ ＭＰＰ＋誘発細胞毒性は、８μＭ Ｃｕ２＋及び１０μｇ・ｍｌ－１ ＴＭＨＡ（即ち、８０％以上の細胞生存率）により完全に逆転された。細胞生存率のデータは、図（１０（ａ）（***ｐ＜０．００１）に示された。
【0128】
共焦点レーザ走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）を用いて細胞形態変化を取得した。ＣＬＳＭ上の生存細胞及び死細胞の観察のために、３'，６'－ジ（Ｏ－アセチル）－４'，５'－ビス[Ｎ，Ｎ－ビス（カルボキシメチル）アミノメチル]フルオレセイン（即ち、テトラアセトキシメチルエステル（カルセイン－ＡＭ））を用いて、生細胞を緑色蛍光（λｅｘ＝４９０ｎｍ、λｅｍ＝５１５ｎｍ）として染色し、そしてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて死細胞を赤色蛍光（λｅｘ＝５３５ｎｍ、λｅｍ＝６１７ｎｍ）として染色した。具体的には、培地を除去した後、０．１ｍｌのカルセイン－ＡＭ溶液（２０ｍＭ）及び０．１ｍｌのＰＩ溶液（２０ｍＭ）を、両方とも、培地の除去の後に添加した。１０分間インキュベートした後、２つの染色溶液を迅速に除去し、細胞をＰＢＳで２回リンスした。次いで、得られた細胞をＣＬＳＭにより可視化することができた。図１０（ｂ）は、ＰＩ色素により染色され、４ｍＭ ＭＰＰ＋、２μＭ Ｃｕ２＋、１０μｇ・ｍｌ－１ ＴＭＨＡという条件で処理された死亡（赤）細胞を示し、図１０（ｃ）は、カルセイン－ＡＭにより染色され、４ｍＭ ＭＰＰ＋、１０μＭ Ｃｕ２＋、１０μｇ・ｍｌ－１ ＴＭＨＡという条件で処理された生存（緑）細胞を示す。
【0129】
ＣＬＳＭを用いて活性酸素種（ＲＯＳ）を直接観察するために、最初にＣＬＳＭ専用培養ディスクにＰＣ１２細胞を播種し、５％ＣＯ２ガスで３７℃で一晩付着させた。１ｍＬの２'，７'－ジクロロフルオレセイン二酢酸塩（ＤＣＦＨ－ＤＡ）と約２０分間インキュベートした後、培養液を、それぞれ、以下の物質を含有する新鮮な培地（ｐＨ＝７．４）に置き換えた：（ａ）対照群としての４ｍＭのＭＰＰ＋、（ｂ）４ｍＭのＭＰＰ＋、１０ ｏｆ μｇ・ｍＬ－１ ＴＭＨＡ、（ｃ）４ｍＭのＭＰＰ＋、１０μＭのＣｕ２＋、（ｄ）４ｍＭのＭＰＰ＋、１０ μｇ・ｍＬ－１のＴＭＨＡ、２μＭのＣｕ２＋、（ｅ）４ｍＭのＭＰＰ＋、１０ μｇ・ｍＬ－１のＴＭＨＡ、４μＭのＣｕ２＋；（ｆ）４ｍＭのＭＰＰ＋、１０ μｇ・ｍＬ－１のＴＭＨＡ、６μＭのＣｕ２＋、（ｇ）４ｍＭのＭＰＰ＋、１０ μｇ・ｍＬ－１のＴＭＨＡ、８μＭのＣｕ２＋、及び（ｈ）４ｍＭのＭＰＰ＋、１０ μｇ・ｍＬ－１のＴＭＨＡ、１０μＭのＣｕ２＋。細胞は、さらに３７℃で５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした後、新鮮なＰＢＳで２回洗浄された。細胞内ＲＯＳレベルは、新たに形成されたＤＣＦ（λｅｘ＝４８８ｎｍ、λｅｍ＝５２５ｎｍ）の蛍光を検出することにより評価した。細胞内ＲＯＳレベルのデータは、図（１１（ａ）に示され、***ｐ＜０．００１であった。
【0130】
図１１（ｂ）は、４ｍＭのＭＰＰ＋、１０μｇ・ｍＬ－１ ＴＭＨＡで処理され、かつ特定の蛍光プローブＤＣＦＨ－ＤＡで染色された細胞における細胞内ＲＯＳ ＣＬＳＭ画像を示す。そして、図１１（ｃ）は、４ｍＭのＭＰＰ＋、１０μｇ・ｍＬ－１ ＴＭＨＡ、１０μＭのＣｕ２＋で処理され、かつＤＣＦＨ－ＤＡで染色された細胞における細胞内ＲＯＳのＣＬＳＭ画像を示す。ＲＯＳ特異的蛍光強度の明らかな低下からわかるように、ＴＭＨＡが細胞内上昇ＲＯＳを効率的に捕捉することができることを示した。特徴的１：２：２：１ヒドロキシルラジカルスピンにより、ＴＭＨＡ処理による細胞内ＲＯＳ誘導の減少が実証された。
【0131】
（１１）インビボ保護試験
【0132】
一般的に、１－メチル－４－フェニル－１,２,３,６－テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）の投与は、ヒトにおける散発性ＰＤと著しく類似した動物の臨床症状をもたらすことが広く受け入れられている。従って、当該の実験では、本発明者らは、ＭＰＴＰを利用して、ＰＤの動物モデルにおいてパーキンソン症状を生じさせた。簡単にまとめると、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、７群（ｎ＝５マウス／群）にランダムに分けて、即ち、空白対照群（正常生理食塩水）、高用量のＴＭＨＡ（１００ｍｇ・ｋｇ－１）、低用量のＴＭＨＡ（５０ｍｇ・ｋｇ－１）、高用量のＭＰＴＰ（３０ｍｇ・ｋｇ－１）、低用量のＭＰＴＰ（１０ｍｇ・ｋｇ－１）、ＭＰＴＰ＋ＴＭＨＡ（３０ｍｇ・ｋｇ－１＋１０ｍｇ・ｋｇ－１）及びＭＰＴＰ＋ＴＭＨＡ（３０ｍｇ・ｋｇ－１＋２０ｍｇ・ｋｇ－１）。具体的には、モデル群は、ＭＰＴＰを、少なくとも４日間連続腹腔内注射により投与して、ＰＤのマウスモデルを生成した。空白対照群及びＴＨＭＡ群は、それぞれ腹腔内注射により生理食塩水及びＴＨＭＡで治療した。ＭＰＴＰ＋ＴＭＨＡ群は、ＴＭＨＡ（用量：１０又は２０ｍｇ・ｋｇ－１）を予め腹腔内０．５時間（１日１回）注射し、次いで３０ｍｇ・ｋｇ－１のＭＰＴＰを７日間腹腔内注射した。
【0133】
水泳試験により運動機能を評価した。各動物を直径１２０ｃｍ及び高さ８０ｃｍのサイズを有する円形プールに入れた。水（２５℃）の深さは６０ｃｍであった。追跡システム（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉｌｉａｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ.,Ｌｔｄ．）を使用して１０分間隔で移動距離（ｃｍ・１０ｍｉｎ－１）及び持続時間（秒間）を記録した。回転ロッド（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ）を用いて運動の姿勢及びバランスを測定した。マウスに、１０ｒｐｍから始まり、そして３０秒間をかけて２２ｒｐｍまで加速した回転ロッド上で１５分間の３回の試験を行った。この試験間の間隔は３分間であった。各群について、ロッドからの落下時間を測定し、平均化した。図１２（ａ）は、記憶障害のマウスの移動距離及び落下待ち時間を示し、***ｐ＜０．００１であった。これらのデータは、ＴＭＨＡ治療がＭＰＴＰ処置動物の認知活動を回復することができることを示した。
【0134】
ミトコンドリアの形態の変化は、ＲＯＳにより誘発されるミトコンドリア機能不全の早期かつ重要な徴候である。ここで、本発明者らは、ミトコンドリアの形態変化を可視化するためにＴＥＭを使用した。一般に、Ｃ７５ＢＬ／６マウス由来の脳組織を、順次に冷２．５%グルタルアルデヒドを含有する０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）と２％パラホルムアルデヒドを含有する０．１ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）との混合物中で一晩固定し、その後、エポキシ樹脂に入れた。埋め込まれた試料をカプセルに装填し、３８℃で９時間重合させ、次いで６０℃で４８時間重合させた。ウルトラミクロトーム（ＲＭＣ、ＵＳＡ）を用いて薄切片を作製し、銅グリッド上に収集した。切片の適当な領域を１００ｎｍの厚さで切断し、飽和４％ウラニル酢酸／４％クエン酸鉛で切片を染色した後、透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ－２１００Ｆ）を用いて８０ｋＶで検査した。図１２（ｂ）は、高用量のＭＰＴＰ（３０ｍｇ・ｋｇ－１）で治療された動物からのミトコンドリアを示し、赤線により示すように、ミトコンドリアは、膨潤、液胞形状及び重度なクリステ破壊を示す。それに対して、図１２（ｃ）は、ＭＰＴＰ（３０ｍｇ・ｋｇ－１）＋ＴＭＨＡ（３０ｍｇ・ｋｇ－１）で治療された動物からのミトコンドリアを示し、赤線により示すように、ミトコンドリアは、正常な形態を示す。
【0135】
（１２）異なるリガンドを有する単体ＣｕＮＣｓによるα－ｓｙｎ凝集動態試験
【0136】
異なるリガンドで修飾したＣｕＮＣｓを、文献に従って製造した。チオフラビンＴ（略語：ＴｈＴ）は、アミロイドの存在を同定するために使用される高感度の蛍光マーカーである。ＴｈＴをポリペプチド又はタンパク質のモノマーと共にインキュベートすると、その蛍光は実質的に変化しない。ＴｈＴが繊維構造を有するアミロイドポリペプチド又はタンパク質に遭遇すると、それは、アミロイドポリペプチド又はタンパク質に直ちに接着し、その蛍光強度は指数関数的に増加する。従って、ＴｈＴは、ペプチド又はタンパク質のアミロイドーシスをモニターするためのメーカーとして広く使用されている。本実施形態は、ＣｕＮＣｓの存在下でα－ｓｙｎの線維化凝集の動態過程をモニターするために、ＴｈＴ蛍光標識法を採用した。具体的な実験方法は以下の通りである。
【0137】
α－ｓｙｎモノマーの前処理：凍結乾燥したα－ｓｙｎ粉末（Ｂａｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．）をＨＦＩＰ中に溶解して、１ｇ／Ｌのα－ｓｙｎ溶液を得た。シーリングの後、室温で２～４時間インキュベートし、次いで、高純度窒素を使用して、ヒュームボードにおいてＨＦＩＰを除去するように、適切な流速でブローし、乾燥したα－ｓｙｎを２００μＬのＤＭＳＯ中に溶解させ、溶液をシールし、将来の使用のために、それを最大一週間まで－２０℃の冷蔵庫に保存した。使用前に、α－ｓｙｎ ＤＭＳＯ溶液を、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）を用いて２０μＭに希釈して、α－ｓｙｎ ＰＢＳ溶液を得た。実験における全てのα－ｓｙｎ ＰＢＳ溶液は、使用直前に製造された。
【0138】
試料の製造及び検出：リガンドで修飾したＣｕＮＣｓをα－ｓｙｎ ＰＢＳ溶液に添加して、ＣｕＮＣｓ及びα－ｓｙｎをそれぞれ５ｐｐｍ及び３５μｍの最終濃度に到達させた。溶液を９６ウェルプレート中で３７℃で連続的にインキュベートし、１０分毎にマイクロプレートリーダーにより蛍光強度をモニターし、ＴｈＴの蛍光強度の変化を通してα－ｓｙｎ凝集の動態的プロセスを同定した。実験群は、リガンドで修飾したＣｕＮＣｓを使用した。リガンド対象群は、ＣｕＮＣｓと結合しないリガンド分子を使用した。空白対照群は、α－ｓｙｎのみを使用した。
【0139】
図１３を参照すると、α－ｓｙｎフィブリル化動態に対するＬ－グルタチオン（ＧＳＨ）で修飾したＣｕＮＣｓ（ＧＳＨ－ＣｕＮＣｓ）の影響を示すグラフを提供する。結果によれば、３７℃で３５μＭのα－ｓｙｎのインキュベーション工程において、ＴｈＴ標識された蛍光強度が２５時間目から急速に増加し、α－ｓｙｎ凝集及びフィブリル化が起こったことを示した。リガンド対照群の結果は、リガンドＧＳＨを単独使用することがα－ｓｙｎの凝集動態に明らかな影響をあたえることがないことを示した。ＣｕＮＣｓを添加した実験群については、ＴｈＴ標識された蛍光強度は、７０時間の実験にわたって増加することなく、ベースラインの近くに保持され、ＧＳＨで修飾したＣｕＮＣｓがα－ｓｙｎ凝集及びフィブリル化を完全に阻害することができ、その効果はＧＳＨリガンドではなくＣｕＮＣｓによることを示唆している。
【0140】
特定の実施形態では、ＣｕＮＣｓは、例えば、Ｌ（Ｄ）－システイン、Ｎ－イソブタノイル－Ｌ（Ｄ）－システイン（Ｌ（Ｄ）－ＮＩＢＣ）及びＮ－アセチル－Ｌ（Ｄ）－システイン（Ｌ（Ｄ）－ＮＡＣ）を含むその他のリガンドで修飾され、そして修飾されたＣｕＮＣｓも、同じプロトコルで研究された。異なるリガンドで修飾したＣｕＮＣｓについても同様の現象が観察され、これらのリガンド自体は、α－ｓｙｎ凝集及びフィブリル化に影響を与えず、一方、リガンドで修飾したＣｕＮＣｓは、α－ｓｙｎ凝集及びフィブリル化を完全に阻害することができるという同じ結論に至った。
【0141】
（１３）ＭＰＰ＋誘導のＰＤ細胞（ＳＨ－ｓｙ５ｙ）モデル試験
【0142】
実験は、ＣＣＫ－８法の試験結果から得られた細胞生存率を指標として使用して、ＰＤのＳＨ－ｓｙ５ｙ細胞モデルにおけるＭＰＰ＋（一般的に使用された神経毒）の毒性効果に対するリガンドで修飾したＣｕＮＣｓの耐性効果を反映して、ＰＤ特異的方法に対するそれらの神経保護効果を実証した。具体的な方法は以下のとおりである。
【0143】
１）対数増殖期におけるＳＨ－ｓｙ５ｙ細胞を摂取した。完全培地で希釈して、５×１０４／ｍＬの細胞密度を有する細胞懸濁液を形成した。２００μＬの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに入れ、インキュベータ中で３７℃、５％ＣＯ２の環境で培養した。細胞を付着させた後に試料を添加した。
【0144】
２）最終濃度を０．１ｐｐｍ、１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ及び２０ｐｐｍとするように、維持培地で製造された、異なる粒径を有するリガンドで修飾したＣｕＮＣｓ試料又はリガンドで修飾した銅ナノ粒子試料１００μＬを添加した。リガンドで修飾したＣｕＮＣｓで２時間前処理した後、異なる細胞群にＭＰＰ＋（最終濃度１ｍＭ）を添加した。これにより、ＳＨ－ｓｙ５ｙ細胞を含有しない空白対照群、ＳＨ－ｓｙ５ｙ細胞を含有するがＣｕＮＣｓ及びＭＰＰ＋を含まない陰性対照群、ＳＨ－ｓｙ５ｙ細胞及び１ｍＭ ＭＰＰ＋のみを含有する細胞対照群、ＳＨ－ｓｙ５ｙ細胞及び１００ｐｐｍのＣｕＮＣｓを含有するがＭＰＰ＋を含まない試料対照群、及びＳＨ－ｓｙ５ｙ細胞と１ｍＭ ＭＰＰ＋と対応するリガンド分子（最終濃度２０ｐｐｍ）とを含有するリガンド対照群を設置した。次いで、細胞を３７℃で２４時間培養した。培養培地を除去するために遠心分離した後、１０％ＣＣＫ－８を含む１００μＬの維持培地を各ウェルに添加し、次いで４時間インキュベートした後、各ウェルの吸光度を４５０ｎｍで測定した。吸光度は、ＭＰＰ＋病変に対するリガンドで修飾したＣｕＮＣｓの事前保護及び治療効果を反映することができる。
【0145】
図１４を参照すると、ＭＰＰ＋病変ＰＤ細胞（ＳＨ－ｓｙ５ｙ）モデルの細胞生存率に対するＣｕＮＣｓの影響を示す直方図を提供した。結果によれば、２４時間の培養後、１００ｐｐｍのＣｕＮＣｓを添加したが、ＭＰＰ＋で処理されなかった試料対照群の細胞生存率は、空白対照群（１００％として設定）に対して１１０．０±６．２％に増加し（Ｐ＜０．０１）、ＣｕＮＣｓが非毒性であることを示唆している。１ｍＭ ＭＰＰ＋を添加したが、ＣｕＮＣｓがないモデル対照群の細胞生存率は、５８．９±５．４％まで低下し（Ｐ＜０．０１、空白対照群に対して）、リガンド対照群の細胞生存率は５６．９±３．４％であり（Ｐ＜０．０１、空白対照群に対して）、リガンド自体がＭＰＰ＋病変細胞の生存率を上昇させないことを示唆している。０．１ｐｐｍ、１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ及び２０ｐｐｍのＣｕＮＣｓを添加した投与群の細胞生存率は７０．９±７．１％（Ｐ＜０．００１、モデル対照群に対して）、８９．３±４．１％（Ｐ＜０．００１、モデル対照群に対して）、９０．５±６．１％（Ｐ＜０．００１、モデル対照群に対して）、９２．８±４．８％（Ｐ＜０．００１、モデル対照群に対して）、８８．５±１．４％（Ｐ＜０．００１、モデル対照群に対して）に上昇した。この結果は、本発明により提供されるリガンドで修飾したＣｕＮＣｓが、ＰＤの神経細胞に対して著しい保護効果を有し、この効果は、リガンドでなくＣｕＮＣｓによるものであることを示唆している。
【0146】
Ｌ（Ｄ）－システイン、Ｎ－イソブタノイル－Ｌ（Ｄ）－システイン（Ｌ（Ｄ）－ＮＩＢＣ）及びＮ－アセチル－Ｌ（Ｄ）－システイン（Ｌ（Ｄ）－ＮＡＣ）等のその他のリガンドで修飾したＣｕＮＣｓについても、同じ工程を採用して実験を実施した。これらの効果は同様であり、詳細な説明を省略する。
【0147】
（１４）ＣｕＮＣｓの同定
【0148】
一つ又は複数のリガンドで修飾したＣｕＮＣｓを合成した。前記リガンドは、チミン、Ｌ（Ｄ）－システイン、及びＮ－イソブタノイル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブタノイル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン及びＮ－アセチル－Ｄ－システイン等のその他のシステイン誘導体、システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体（Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ－システインＬ－ヒスチジン（ＣＨ）、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ－グルタチオン（ＧＳＨ）、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）及びグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）等のジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、及びその他のシステイン含有ペプチドを含むが、これらに限定されない。）、及び１－[（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル]－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン及びドデシルメルカプタンのうち一つ又は複数等のその他のチオール含有化合物を含む。
【0149】
以下に、ＧＳＨで修飾したＣｕＮＣｓの特徴データを例として示す。
【0150】
１）透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による形態の観察
【0151】
試験粉末（ＧＳＨで修飾したＣｕＮＣｓ試料）を試料として、超純水に２ｍｇ／Ｌになるように溶解し、次いで、懸濁液滴法により試験試料を製造した。具体的な方法は、以下のとおりである。即ち、５μＬの試料を銅メッシュ上に滴下し、水が消失するまで自然に揮発させ、次いでＪＥＭ－２１００Ｆ ＳＴＥＭ／ＥＤＳ電界放出高分解能ＴＥＭにより試料の形態を観察した。
【0152】
図（１５）のパネルＡ及びパネルＢは、ＧＳＨで修飾したＣｕＮＣｓの典型的なＳＥＭ画像を示し、異なるＴＥＭ画像からそれらのサイズ分布を計算した。その結果、ＣｕＮＣｓが十分に分散され、それらのサイズが０．５－５．０ｎｍの範囲にあることを示した。
【0153】
２）Ｘ線光電子分光法
【0154】
Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）スペクトルを、ＥＳＣＡＬＡＢ ２５０Ｘｉ Ｘ線光電子分光計で測定した。両面導電性接着剤（３ｍｍ×３ｍｍ）をアルミニウム箔に付着させ、試験粉末を両面テープ上に均一に広げ、アルミニウム箔の層で被覆した。試料を８ＭＰａの圧力下で１分間保持した。表面上の残留粉末を除去し、次いで中心試料（１ｍｍ×１ｍｍ）をＸＰＳ試験のために切り出した。
【0155】
図１５のパネルＣは、ＣｕＮＣｓ中のＣｕ元素のＸＰＳスペクトルである。２つのピークは、それぞれ、９３１．９８及び９５１．８８ｅＶに現れ、Ｃｕの２ｐ３／２及び２ｐ１／２電子の結合エネルギーによるものである。９４２．０ｅＶ付近のＣｕ２ｐ３／２サテライトピークの不在により、Ｃｕ（ＩＩ）電子が存在しないことが確認された。Ｃｕ（０）の結合エネルギーはＣｕ（Ｉ）のそれから０．１ｅＶだけ離れたため、Ｃｕ（Ｉ）の形成を排除することは不可能であり、得られたＧＳＨで修飾したＣｕＮＣｓ中のＣｕの原子価状態は、０から＋１の間にある可能性が最も高かった。
【0156】
３）フーリエ変換赤外（ＦＴ－ＩＲ）分光法
【0157】
ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＬＳ ５５蛍光分光計でＦＴ－ＩＲスペクトルを試験した。試験粉末を超純水に溶解し、室温で測定した。走査範囲は２００～８００ｎｍであり、試料セルは１ｃｍの光路を有する標準石英キュベットであった。
【0158】
図１５のパネルＤは、ＧＳＨで修飾したＣｕＮＣｓ（上）とＧＳＨ（下）とのＦＴ－ＩＲ分光法の比較を示す。ＧＳＨは、数多くの特徴的ＩＲバンド、即ち、ＣＯＯＨ－（１３９０及び１５００ｃｍ－１）、Ｎ－Ｈストレッチ（３４１０ｃｍ－１）、及びＮＨ２基のＮ－Ｈ曲げ（１６１０ｃｍ－１）を示した。２５０３ｃｍ－１で観察されたピークは、Ｓ－Ｈストレッチ振動モードによるものである。Ｓ－Ｈストレッチ振動帯（２５０３ｃｍ－１）以外のすべての対応する特徴的ＩＲバンドは、ＧＳＨで修飾したＣｕＮＣｓに見られる。これは、Ｓ－Ｈ結合が切断されること、及び、Ｃｕ－Ｓ結合を形成することにより、ＧＳＨ分子がＣｕＮＣｓの表面に結合されることを示唆している。
【0159】
４）蛍光分光法
【0160】
試験粉末を超純水に溶解し、室温で蛍光分光法により測定した。
【0161】
図１５のパネルＥに示されるように、ＣｕＮＣｓは、３６５ｎｍでの励起ピーク下で、５９５ｎｍでピークを有する赤色発光と、約８０ｎｍの対応する半値全幅（ＦＷＨＭ）とを示す。なお、凝集誘起発光特性のため、エタノールが溶液に添加されたとき、ＣｕＮＣｓのＦＬ強度が著しく改善された。さらに、大きなストークスシフト（２３０ｎｍ）は、蛍光プローブ及びバイオイメージングのための良好な見込みを示した。
【0162】
（１５）ＣｕＮＣｓのＣＡＴ活性
【0163】
現在、ＣＡＴ活性の検出は、紫外線吸収のみにより２４０ｎｍでの過酸化水素の紫外線吸収強度が特徴づけられる。しかしながら、合成された銅クラスターは、Ｈ２Ｏ２プロセスを触媒した後に変化する可能性があるので、紫外線吸収は、３００ｎｍ未満で大きく増加する。従って、本実験は、ＣｕＮＣｓにより触媒されるＨ２Ｏ２から生成された酸素を観察することによりＣｕＮＣｓの触媒効果を確認した。本実験は、Ｈ２Ｏ２の分解により生成された気泡を観察し、従って、実験的現象は、Ｈ２Ｏ２の濃度が高いほど明らかである。実験手順は以下の通りであった。
【0164】
室温で、１０％Ｈ２Ｏ２溶液（４ｍｌ）を試験管に添加し、次いで２０００ｐｐｍのＣｕＮＣｓ溶液（２ｍｌ）を添加し、３分間触媒した。図１６に示すように、左側の試験管は、ＣｕＮＣｓが添加された試験管であり、管壁にＨ２Ｏ２の触媒分解により生成された大量のＯ２気泡を有し、右側の試験管は、等量の超純水が添加された対照群であり、明らかな気泡を有しなかった。本実験から、ＣｕＮＣｓが優れたカタラーゼ活性を有することがわかった。
【0165】
（１６）ＣｕＮＣｓのＧＰｘ活性
【0166】
銅クラスターのＧＰｘ活性を５，５'－ジチオビス－（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）発色アッセイにより研究した。ＧＰｘは、過酸化水素と還元型グルタチオン（ＧＳＨ）との反応を促進して、水及び酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を形成する。チオール含有化合物はＤＴＮＢと反応してＤＴＮＢのジスルフィド結合を切断して、２－ニトロ－５－チオ安息香酸（ＮＴＢ－）を生成することができ、これは中性又はアルカリ性のｐＨ条件下で、水中でイオン化して、ＮＴＢ２－二価アニオンを形成することができる。ＮＴＢ２－は、４１２ｎｍでの吸光度を測定することにより定量することができ、それにより、反応におけるＧＳＨの量を定量することができる。
【0167】
実験手順は以下の通りであった。
【0168】
以下の試薬を試験管に室温で順次添加した。
【0169】
（１）０．２ｍｌの一定濃度のＣｕＮＣｓ溶液（適切な量のＣｕＮＣｓをＰＢＳ緩衝液に溶解したもの）。
【0170】
（２）０．５ｍｌのＧＳＨ（１ｍＭ）（適切な量のＧＳＨ粉末をＰＢＳ緩衝液に溶解したもの）。
【0171】
（３）０．５ｍｌのＨ２Ｏ２溶液（１．５ｍＭ）
【0172】
（４）０．２ｍｌの１％クエン酸ナトリウムを含むＤＴＮＢ（１ｍＭ）（０．３ｇのクエン酸三ナトリウム二水和物をＰＢＳ緩衝液（３０ｍｌ）に溶解し、それにＤＴＮＢを溶解し、超音波処理を行ったもの）。
【0173】
試験管を穏やかに振盪することにより溶液を混合し、ＵＶスペクトルを検出した。
【0174】
ブランク群では、ＣｕＮＣｓ溶液を０．２ｍｌ ＰＢＳ緩衝液で置き換えた；実験群は、銅クラスターの濃度及び触媒時間を変化させることにより触媒効果を研究した。
【0175】
図１７ａは、異なる濃度の銅クラスター（３０ｐｐｍ、６０ｐｐｍ、９０ｐｐｍ、１２０ｐｐｍ、１５０ｐｐｍ）について室温で５分間触媒することにより得られた実験結果を示す。４１２ｎｍでのＵＶ吸収が触媒濃度の増加に従って著しく減少することが見出され、システム中のＧＳＨが触媒濃度の増加と共に減少したことがわかった。これからも、触媒の増加と伴い、より多くのＨ２Ｏ２がＧＳＨを酸化させたことを意味する。
【0176】
その後の実験の結果を観察するために、反応時間を延長した。図１７ｂは、１３分間の触媒作用後の結果を示す。銅クラスター濃度が３０ｐｐｍ及び６０ｐｐｍであると、紫外線吸収が減少し続け、触媒反応が継続していることを示し、一方、銅ナノクラスター濃度が９０ｐｐｍ以上である場合には、反応はほとんど停止し、ＧＳＨがほとんど完全に触媒されたことを示した。従って、９０ｐｐｍを選択して連続モニタリングを行った。
【0177】
図１７ｃに示すように、触媒反応が開始時に遅く、触媒速度は反応が進行するにつれて徐々に増加し、触媒反応は１１～１３分間でほとんど完了した。
【0178】
（１７）ＣｕＮＣｓのＳＯＤ活性
【0179】
ＳＯＤ活性アッセイは、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）アッセイキット（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｊｉａｎｃｈｅｎｇ Ｂｉｏ）を用いて測定した。要するに、レンゲオキシダーゼ及びキサンチンオキシダーゼを反応させてスーパーオキシドを生成し、さらにＷＳＴ－１（２－（４－ヨードフェニル）－３－（４－ニトロフェニル）－５－（２，４－ジフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム）を還元し、生成したホルマザンを４４０ｎｍの紫外スペクトルにおいて検出する。４４０ｎｍでの紫外線吸収の減少を観察するために、銅クラスターを添加することによりＳＯＤ活性を判定した。
【0180】
基質作用溶液の調製：基質原液：緩衝溶液を１：２００の比率で混合して、現在使用される基質作用溶液を調製した。
【0181】
酵素作用溶液の調製：酵素原液：酵素希釈溶液を１：１０の比率で混合して、現在使用される酵素作用溶液を調製した。
【0182】
【0183】
上記の設定によれば、９６ウェルプレート中のウェルに、（１）基質作用溶液、（２）酵素希釈溶液、（３）被験試料又は蒸留水、及び（（４）酵素作用溶液を順次に添加した。混合されたウェルをマイクロプレートリーダーで３７℃でインキュベートし、４５０ｎｍでＵＶ吸光度を読み取った。
【0184】
図１８ａは、異なる濃度のＣｕＮＣｓを用いて６０分間のインキュベーションの間、４５０ｎｍでのＵＶ吸光度を示す。図１８ａに示すように、ＣｕＮＣｓの濃度が増加したと伴い、インキュベーションの間にＵＶ吸収値が徐々に減少し、ＣｕＮＣｓの各用量に対するＵＶ吸収値は３０分後に平坦化された。これから、ＣｕＮＣｓが優れたＳＯＤ活性を有し、そのＳＯＤ活性がＣｕＮＣｓの濃度の増加と伴い増加したことがわかった。上記の結果から、２０分間のインキュベーション時間でのＵＶ吸収値を選択してＳＯＤ阻害率を計算した。図１８ｂに示すように、６０ｐｐｍ、９０ｐｐｍ、１２０ｐｐｍ、１５０ｐｐｍ、及び１８０ｐｐｍでＣｕＮＣｓのＳＯＤ阻害率は、それぞれ、１６．９％、２３．２％、３３．７％、４４．８％、及び５５．２％であった。ＳＯＤ活性は、ＳＯＤ阻害率が反応系において５０％に達する際にＳＯＤ活性単位に対応する酵素の量を意味する。従って、例えば、１５０ｐｐｍのＣｕＮＣｓは、１０．２４Ｕ／ｍｇのＳＯＤ活性を有する。
【0185】
実験結果から、合成されたＧＳＨ－ＣｕＮＣｓが、カタラーゼ（ＣＡＴ）、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）及びスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）という異なる構造及び機能を有する３つの主要抗酸化酵素の酵素活性を有することがわかった。
【0186】
（１８）Ｈ２Ｏ２誘発緑内障細胞（ＲＧＣ－５）モデル
【0187】
この実施形態では、細胞生存率を指標として用いて、Ｈ２Ｏ２により誘導される細胞毒性についてリガンド修飾銅ナノクラスター（ＣｕＮＣｓ）の効果を試験した。ｃｃｋ－８アッセイの結果によれば、ＣｕＮＣｓが網膜神経節細胞（ＲＧＣ）における酸化ストレス誘導損傷に対する神経保護効果を有することがわかった。
【0188】
対数増殖期のＲＧＣ－５細胞を完全培地（ＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン－ストレプトマイシン）で５×１０４／ｍｌの密度の細胞懸濁液に希釈し、９６ウェルプレート中１００μＬ／ウェルで接種した。細胞を５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で培養した。細胞を付着させた後、元の培養液を廃棄し、維持培地（ＤＭＥＭ培地＋２％ＦＢＳ＋１％ペニシリン－ストレプトマイシン）から調製した５０μｌの異なる濃度のＣｕＮＣｓをそれぞれのウェルに加えた。最終濃度は、それぞれ、０．５、５及び２０ｐｐｍであった（即ち、それぞれ、図１９中の５、６、７）。２時間前処理後、約５０μｌのＨ２Ｏ２（最終濃度１０５μＭ）を加えた。細胞を２４時間インキュベートし、１０％ＣＣＫ－８を各ウェルに加え、各ウェルの吸光度値を４５０ｎｍの波長で測定し、Ｈ２Ｏ２誘発損傷に対するＣｕＮＣｓの保護効果を評価した。上記実験では、細胞を処理しなかったブランク対照群、１０５μＭのＨ２Ｏ２で細胞を処理したモデル対照群、１００ｐｐｍのＣｕＮＣｓを添加したがＨ２Ｏ２を添加しなかったＣｕＮＣｓ対照群、及び２０ｐｐｍのリガンドと１０５μＭのＨ２Ｏ２を添加した配位子対照群（即ち、それぞれ、図１９中の１、２、３、４）を提供した。
【0189】
図１９に示すように、ＧＳＨで修飾したＣｕＮＣｓの実験結果を例として挙げる。その結果は、２４時間の培養後に、１００ｐｐｍのＣｕＮＣを補充したが、Ｈ２Ｏ２で処理されなかった銅クラスター対照群（即ち、群２）の細胞生存率は、ブランク対照群（即ち、群１）（１００％）に対して１０３．２±７．０％であり（Ｐ＞０．０５）、ＣｕＮＣが非毒性であったことがわかった。１００μＭ Ｈ２Ｏ２を添加したが、ＣｕＮＣを添加しなかったモデル対照群（即ち、群３）の細胞生存率は、ブランク対照群の５８．０±６．２％まで低下した（Ｐ＜０．００５）。２０ｐｐｍのＧＳＨ及び１００μｍのＨ２Ｏ２を添加したリガンド対照群（即ち、群４）の細胞生存率は、ブランク対照群の５６．５±５．９％であり（ブランク対照群との比較する場合Ｐ＜０．０１、モデル対照群と比較する場合Ｐ＞０．０５）、単独で使用したときに、リガンドが、Ｈ２Ｏ２誘発損傷細胞モデルにおける細胞生存率を増加させないことがわかった。０．５ｐｐｍ （即ち、群５）、５ｐｐｍ （即ち、群６）及び２０ｐｐｍ （即ち、群７）ＣｕＮＣｓでの投与群の細胞生存率は、６５．９±４．５％（モデル対照群と比較する場合ｐ＜０．０５）、８７．１±７．４％（モデル対照群と比較する場合ｐ＜０．０１）、及び９１．２±５．７％（モデル対照群と比較する場合ｐ＜０．０１）に増加した。
【0190】
上記の結果によれば、本発明のＣｕＮＣｓが、Ｈ２Ｏ２誘発損傷ＲＧＣ細胞モデルにおける細胞生存率を有意に改善することができ、酸化ストレスにより誘導されるＲＧＣ細胞のアポトーシスに抵抗することができる一方、ＧＳＨが、酸化ストレスにより誘導されるＲＧＣ細胞のアポトーシスに明らかな影響を及ばないことがわかった。
【0191】
他のリガンドで修飾したＣｕＮＣｓも同様の工程の後に試験されており、同様の効果を有するため、ここで説明を省略する。
【0192】
本発明を特定の実施形態を参照して説明してきたが、実施形態は例示的なものであり、本発明の範囲はそれに限定されないことが理解されるべきである。本発明に係る分野の当業者にとって、本発明の他の実施形態は自明である。このような代替実施形態は、いずれも本発明の範囲内に包含されると考えられる。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により定義され、前記の説明によりサポートされる。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15-1】
【図15-2】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
