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特許7302763人工組換え染色体およびその使用

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-06-26

(45)【発行日】2023-07-04

(54)【発明の名称】人工組換え染色体およびその使用

(51)【国際特許分類】

C12N 5/18 20060101AFI20230627BHJP

C12N 15/09 20060101ALI20230627BHJP

C12N 15/87 20060101ALI20230627BHJP

C12N 5/073 20100101ALI20230627BHJP

A01K 67/027 20060101ALI20230627BHJP

【ＦＩ】

C12N5/18 ZNA

C12N15/09 100

C12N15/87 Z

C12N5/073

A01K67/027

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2019572716

(86)(22)【出願日】2019-11-12

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-05-23

(86)【国際出願番号】 KR2019015351

(87)【国際公開番号】W WO2020209458

(87)【国際公開日】2020-10-15

【審査請求日】2022-05-02

(31)【優先権主張番号】62/833,489

(32)【優先日】2019-04-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【早期審査対象出願】

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】519461646

【氏名又は名称】ヒューマブカンパニーリミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000877

【氏名又は名称】弁理士法人ＲＹＵＫＡ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】オー、チャンキュ

(72)【発明者】

【氏名】パク、スンイク

(72)【発明者】

【氏名】カン、ホジン

(72)【発明者】

【氏名】チョイ、アエジン

【審査官】大久保智之

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１８／０７９８５７（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ５／００－２８

Ｃ１２Ｎ１５／００－９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１つの人工組換え染色体を含むトランスジェニックマウス細胞を作製するための方法であって、
ｉ）ヒト天然セントロメア、ヒト免疫グロブリン遺伝子（Ｉｇ遺伝子）、およびヒト天然テロメアを含む第１のヒト染色体を含むヒト細胞を調整する段階と、
ｉｉ）操作されたヒト細胞を作製するために、前記ヒト細胞を処理する段階であって、
前記ヒト細胞は、第１のリコンビナーゼ認識配列（第１のＲＲＳ）と第２のリコンビナーゼ認識配列（第２のＲＲＳ）との間に位置する前記ヒトＩｇ遺伝子を含む第１の操作されたヒト染色体を含み、
前記第１のＲＲＳおよび前記第２のＲＲＳは、それぞれ、前記第１の操作されたヒト染色体の前記ヒト天然セントロメアと前記ヒト天然テロメアとの間に位置する、段階と、
ｉｉｉ）操作された前記ヒト細胞を処理して、前記第１の操作されたヒト染色体を含む第１のヒトミクロセルを作製する段階と、
ｉｖ）マウス天然セントロメア、マウスＩｇ遺伝子、およびマウス天然テロメアを含む第１のマウス染色体を含むマウス細胞を調整する段階と、
ｖ）操作されたマウス細胞を作製するために、前記マウス細胞を処理する段階であって、
前記マウス細胞は、第３のリコンビナーゼ認識配列（第３のＲＲＳ）と、第４のリコンビナーゼ認識配列（第４のＲＲＳ）との間に位置する前記マウスＩｇ遺伝子を含む第２の操作されたマウス染色体を含み、
前記第３のＲＲＳおよび前記第４のＲＲＳは、それぞれ、前記第２の操作されたマウス染色体の前記マウス天然セントロメアと前記マウス天然テロメアとの間に位置し、
前記第１のＲＲＳは前記第３のＲＲＳと対合することができ、前記第２のＲＲＳは前記第４のＲＲＳと対合することができる、段階と、
ｖｉ）前記操作されたマウス細胞を前記第１のヒトミクロセルと接触させて、前記第１の操作されたヒト染色体と、前記第２の操作されたマウス染色体とを含む融合細胞を作製する段階と、
ｖｉｉ）部位特異的リコンビナーゼ（ＳＳＲ）を前記融合細胞に適用することにより、前記融合細胞において、第３の操作された組換え染色体を含む前記トランスジェニックマウス細胞が作製されるように、前記第１の操作されたヒト染色体の前記ヒトＩｇ遺伝子と、前記第２の操作されたマウス染色体の前記マウスＩｇ遺伝子との間の染色体交換が引き起こされる段階であって、
前記第３の操作された組換え染色体は、前記マウス天然セントロメア、前記マウス天然テロメア、および前記マウス天然セントロメアと前記マウス天然テロメアとの間に位置する前記ヒトＩｇ遺伝子を含み、
前記第３の操作された組換え染色体は、前記マウスＩｇ遺伝子を含まず、前記第３の操作された組換え染色体は、前記第３のＲＲＳと前記第４のＲＲＳとの間に位置する前記マウスＩｇ遺伝子を除いて、前記第２の操作されたマウス染色体の他の内因性遺伝子を含む、段階と、
を有する、方法。

【請求項2】

前記第１のＲＲＳは、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＰバリアントから選択される１つであり、および、
前記第３のＲＲＳは、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＰバリアントから選択される１つである、
請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第２のＲＲＳは、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＰバリアントから選択される１つであり、および、
前記第４のＲＲＳは、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＰバリアントから選択される１つである、
請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記ＳＳＲはＣｒｅリコンビナーゼである、請求項２または３に記載の方法。

【請求項5】

前記第１のＲＲＳは、ＦＲＴ、ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ＩＴＲ、およびそれらのバリアントから選択される１つであり、および、
前記第３のＲＲＳは、ＦＲＴ、ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ＩＴＲ、およびそれらのバリアントから選択される１つである、
請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記第２のＲＲＳは、ＦＲＴ、ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ＩＴＲ、およびそれらのバリアントから選択される１つであり、および、
前記第４のＲＲＳは、ＦＲＴ、ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ＩＴＲ、およびそれらのバリアントから選択される１つである、
請求項１または５に記載の方法。

【請求項7】

前記ＳＳＲは、フリッパーゼ（ＦＬＰ）、インテグラーゼ、およびトランスポザーゼから選択される１つである、請求項５または６に記載の方法。

【請求項8】

前記第３の操作された組換え染色体を含む前記トランスジェニックマウス細胞は、有糸分裂または減数分裂を経ることができる、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記第３の操作された組換え染色体を含む前記トランスジェニックマウス細胞は、前記ヒトＩｇ遺伝子を発現するように構成される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

少なくとも１つの人工組換え染色体を含むトランスジェニックマウス細胞を使用してトランスジェニックマウスを作製するための方法であって、
ｉ）ヒト天然セントロメア、ヒト免疫グロブリン遺伝子（Ｉｇ遺伝子）、およびヒト天然テロメアを含む第１のヒト染色体を含むヒト細胞を調整する段階と、
ｉｉ）操作されたヒト細胞を作製するために、前記ヒト細胞を処理する段階であって、
前記ヒト細胞は、第１のリコンビナーゼ認識配列（第１のＲＲＳ）と第２のリコンビナーゼ認識配列（第２のＲＲＳ）との間に位置する前記ヒトＩｇ遺伝子を含む第１の操作されたヒト染色体を含み、
前記第１のＲＲＳおよび前記第２のＲＲＳは、それぞれ、前記第１の操作されたヒト染色体の前記ヒト天然セントロメアと前記ヒト天然テロメアとの間に位置する、段階と、
ｉｉｉ）操作された前記ヒト細胞を処理して、前記第１の操作されたヒト染色体を含む第１のヒトミクロセルを作製する段階と、
ｉｖ）マウス天然セントロメア、マウスＩｇ遺伝子、およびマウス天然テロメアを含む第１のマウス染色体を含むマウス細胞を調整する段階と、
ｖ）操作されたマウス細胞を作製するために、前記マウス細胞を処理する段階であって、
前記マウス細胞は、第３のリコンビナーゼ認識配列（第３のＲＲＳ）と、第４のリコンビナーゼ認識配列（第４のＲＲＳ）との間に位置する前記マウスＩｇ遺伝子を含む第２の操作されたマウス染色体を含み、
前記第３のＲＲＳおよび前記第４のＲＲＳは、それぞれ、前記第２の操作されたマウス染色体の前記マウス天然セントロメアと前記マウス天然テロメアとの間に位置し、
前記第１のＲＲＳは前記第３のＲＲＳと対合することができ、前記第２のＲＲＳは前記第４のＲＲＳと対合することができる、段階と、
ｖｉ）前記操作されたマウス細胞を前記第１のヒトミクロセルと接触させて、前記第１の操作されたヒト染色体と、前記第２の操作されたマウス染色体とを含む融合細胞を作製する段階と、
ｖｉｉ）部位特異的リコンビナーゼ（ＳＳＲ）を前記融合細胞に適用することにより、前記融合細胞において、第３の操作された組換え染色体を含む前記トランスジェニックマウス細胞が作製されるように、前記第１の操作されたヒト染色体の前記ヒトＩｇ遺伝子と、前記第２の操作されたマウス染色体の前記マウスＩｇ遺伝子との間の染色体交換が引き起こされる段階であって、
前記第３の操作された組換え染色体は、前記マウス天然セントロメア、前記マウス天然テロメア、および前記マウス天然セントロメアと前記マウス天然テロメアとの間に位置する前記ヒトＩｇ遺伝子を含み、
前記第３の操作された組換え染色体は、前記マウスＩｇ遺伝子を含まず、前記第３の操作された組換え染色体は、前記第３のＲＲＳと前記第４のＲＲＳとの間に位置する前記マウスＩｇ遺伝子を除いて、前記第２の操作されたマウス染色体の他の内因性遺伝子を含む、段階と、
ｖｉｉｉ）子孫を作製するために、前記第３の操作された組換え染色体を含むキメラ胚盤胞を代理母の子宮に移植する段階であって、
ここで、前記キメラ胚盤胞は、前記第３の操作された組換え染色体を含む前記トランスジェニックマウス細胞を胚盤胞に注入することによって作製される、段階とを含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書における開示は、人工組換え染色体およびその使用に関し、より詳細には、２つ以上の染色体の組換えによって生成される人工組換え染色体、およびそれを含む細胞を使用するトランスジェニック動物の作製に関する。

【背景技術】

【0002】

トランスジェニック動物は、外因性タンパク質をコードするＤＮＡを発現することによって、または内因性遺伝子を不活性化することによって、遺伝子工学の発展に寄与することがある。

【0003】

トランスジェニック動物を作製するためには、一般に、外因性タンパク質をコードするＤＮＡを動物細胞のゲノムに挿入し、それにより生成される細胞を使用して動物が作製される。ここで、外因性タンパク質をコードするＤＮＡを動物細胞のゲノムに挿入するために、外因性タンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを使用し、ベクターを作製するために、外因性タンパク質をコードするＤＮＡをクローニングする。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

トランスジェニック動物を作製するには、一般に、外因性タンパク質をコードするＤＮＡを動物細胞のゲノムに挿入し、それにより生成される細胞を使用して動物が作製される。ここで、外因性タンパク質をコードするＤＮＡを動物細胞のゲノムに挿入するために、外因性タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを使用し、ベクターを作製するために、外因性タンパク質をコードするＤＮＡをクローニングする。この方法では、外因性タンパク質をコードするＤＮＡのサイズに従って、１つまたは２つ以上のベクターを使用する。たとえば、外因性タンパク質をコードするＤＮＡのサイズが数十キロベース以上である場合、外因性タンパク質をコードするＤＮＡは断片化され、次いで複数のベクターを使用して挿入される。１つのベクターではなく複数のベクターを使用してＤＮＡが挿入される場合、外因性タンパク質をコードする完全長ＤＮＡが挿入される細胞の収量効率が低減する問題がある。

【0005】

上述の問題を解決するために、本発明は、挿入されることになる遺伝子のサイズに関わらず、挿入されることになる遺伝子を動物細胞のゲノムに効率的に挿入する方法を提供することを対象とする。

【0006】

本発明はまた、人工組換え染色体およびそれを作製する方法を提供することを対象とする。

【0007】

本発明はまた、人工組換え染色体を含む細胞およびそれを作製する方法を提供することを対象とする。

【0008】

本発明はまた、人工組換え染色体を含む細胞を使用してトランスジェニック動物を作製する方法を提供することを対象とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

技術的問題を解決するために、本明細書における開示の一態様は、別個のクローニングなしで、動物細胞のゲノムに挿入されることになる完全長遺伝子（コード領域、非コード領域など）を挿入する方法を提供する。本明細書における開示の別の態様は、上記のように生成されるトランスジェニック動物細胞を使用してトランスジェニック動物を作製する方法を提供する。

【0010】

本明細書における開示の態様によれば、本発明は、１つまたは複数の人工組換え染色体を含む細胞を作製する方法を提供する。

【0011】

一実施形態において、１つまたは複数の人工組換え染色体を含む細胞を作製する方法は、
ｉ）第１の標的細胞および第２の標的細胞を調製する段階と、
ｉｉ）第２の標的細胞を使用して１個または複数のミクロセルを作製する段階と、
ｉｉｉ）第１の標的細胞および１個または複数のミクロセルを使用して融合細胞を作製する段階と、
ｉｖ）部位特異的リコンビナーゼ（ＳＳＲ）で融合細胞を処理することによって、人工組換え染色体を含む細胞を作製する段階とを含んでもよい。

【0012】

第１の標的細胞は、第１の標的染色体を含んでもよい。

【0013】

第２の標的細胞は、第２の標的染色体を含んでもよい。

【0014】

ここで、第１の標的染色体は、第１の部分、第１のリコンビナーゼ認識配列（第１のＲＲＳ）および第１の断片を含んでもよい。第１のＲＲＳは、第１の部分と第１の断片との間に位置してもよい。

【0015】

ここで、第２の標的染色体は、第２の部分、第２のリコンビナーゼ認識配列（第２のＲＲＳ）、および第２の断片を含んでもよい。第２のＲＲＳは、第２の部分と第２の断片との間に位置してもよい。

【0016】

１個または複数のミクロセルは、第２の標的染色体またはその断片を含んでもよい。

【0017】

ここで、第２の標的染色体の断片は、第２のＲＲＳおよび第２の断片を含んでもよい。

【0018】

融合細胞は、第１の標的染色体および第２の標的染色体、または第１の標的染色体および第２の標的染色体の断片を含んでもよい。

【0019】

ＳＳＲは、第１の標的染色体に存在する第１のＲＲＳと第２の標的染色体に存在する第２のＲＲＳとの対合を認識することによって組換えを誘導してもよい。

【0020】

ここで、第１の標的染色体に存在する第１の断片は、組換えによって、第２の標的染色体に存在する第２の断片と交換されてもよい。

【0021】

それによって、第１の部分および第２の断片を有する第１の人工組換え染色体が作製されてもよい。

【0022】

ここで、第１の人工組換え染色体を含む細胞は、第２の標的染色体を含まない場合がある。

【0023】

１つまたは複数の人工組換え染色体を含む細胞は、第２の人工組換え染色体をさらに含んでもよい。ここで、第２の人工組換え染色体は、第２の部分および第１の断片を含んでもよい。

【0024】

第１の部分は、第１の標的染色体の両側に位置するテロメア末端のうち一方を含んでもよい。ここで、第１の断片は、第１の標的染色体の両側に位置するテロメア末端のうち他方を含んでもよい。

【0025】

第２の部分は、第２の標的染色体の両側に位置するテロメア末端のうち一方を含んでもよい。ここで、第２の断片は、第２の標的染色体の両側に位置するテロメア末端のうち他方を含んでもよい。

【0026】

第１のＲＲＳは、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＰバリアントから選択される１つであってもよく、第２のＲＲＳは、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＰバリアントから選択される１つであってもよい。ここで、第１のＲＲＳは、第２のＲＲＳと対合することができてもよい。ここで、ＳＳＲはＣｒｅリコンビナーゼであってもよく、ＳＳＲは第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳを認識することができてもよい。

【0027】

代替的には、第１のＲＲＳは、ＦＲＴ、ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ＩＴＲ、およびそれらのバリアントから選択される１つであってもよく、第２のＲＲＳは、ＦＲＴ、ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ＩＴＲ、およびそれらのバリアントから選択される１つであってもよい。ここで、第１のＲＲＳは、第２のＲＲＳと対合することができてもよい。ここで、ＳＳＲは、フリッパーゼ（ＦＬＰ）、インテグラーゼ、およびトランスポザーゼから選択される１つであってもよく、ＳＳＲは第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳを認識することができてもよい。

【0028】

１つまたは複数の人工組換え染色体を含む細胞は、体細胞分裂（有糸分裂）または減数分裂を経てもよい。

【0029】

別の実施形態において、１つまたは複数の人工組換え染色体を含む細胞を作製するための方法は、
ｉ）第１の標的細胞および第２の標的細胞を調製する段階と、
ｉｉ）第２の標的細胞を使用して１個または複数のミクロセルを作製する段階と、
ｉｉｉ）第１の標的細胞および１個または複数のミクロセルを使用して融合細胞を作製する段階と、
ｉｖ）部位特異的リコンビナーゼ（ＳＳＲ）で融合細胞を処理することによって、人工組換え染色体を含む細胞を作製する段階とを含んでもよい。

【0030】

第１の標的細胞は、第１の標的染色体を含んでもよい。

【0031】

ここで、第１の標的染色体は、第１の部分、第１のリコンビナーゼ認識配列（第１のＲＲＳ）、第１の断片、第２のリコンビナーゼ認識配列（第２のＲＲＳ）および第２の部分を含んでもよい。

【0032】

ここで、第１の部分は、第１の標的染色体の両側に位置するテロメア末端のうち一方を含んでもよく、第２の部分は、第１の標的染色体の両側に位置するテロメア末端のうち他方を含んでもよい。

【0033】

ここで、第１の断片は、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置してもよい。

【0034】

第２の標的細胞は、第２の標的染色体を含んでもよい。

【0035】

ここで、第２の標的染色体は、第３の部分、第３のリコンビナーゼ認識配列（第３のＲＲＳ）、第２の断片、第４のリコンビナーゼ認識配列（第４のＲＲＳ）、および第４の部分を含んでもよい。

【0036】

ここで、第３の部分は、第２の標的染色体の両側に位置するテロメア末端のうち一方を含んでもよく、第４の部分は、第２の標的染色体の両側に位置するテロメア末端のうち他方を含んでもよい。

【0037】

ここで、第２の断片は、第３のＲＲＳと第４のＲＲＳとの間に位置してもよい。

【0038】

１個または複数のミクロセルは、第２の標的染色体またはその断片を含んでもよい。

【0039】

ここで、第２の標的染色体の断片は、第３のＲＲＳ、第２の断片、および第４のＲＲＳを含んでもよい。

【0040】

融合細胞は、第１の標的染色体および第２の標的染色体、または第１の標的染色体および第２の標的染色体の断片を含んでもよい。

【0041】

ＳＳＲは、第１の標的染色体に存在する第１のＲＲＳと第２の標的染色体に存在する第３のＲＲＳとの対合、および第１の標的染色体に存在する第２のＲＲＳと第２の標的染色体に存在する第４のＲＲＳとの対合を認識することによって組換えを誘導してもよい。

【0042】

ここで、第１の標的染色体に存在する第１の断片は、組換えによって、第２の標的染色体に存在する第２の断片と交換されてもよい。

【0043】

それによって、第１の部分、第２の断片、および第２の部分を含む第１の人工組換え染色体が作製されてもよい。

【0044】

ここで、第１の人工組換え染色体を含む細胞は、第２の標的染色体を含まない場合がある。

【0045】

１つまたは複数の人工組換え染色体を含む細胞は、第２の人工組換え染色体をさらに含んでもよい。ここで、第２の人工組換え染色体は、第３の部分、第１の断片、および第４の部分を含んでもよい。

【0046】

第１の部分は、第１の標的染色体のセントロメアを含んでもよい。代替的には、第１の断片は、第１の標的染色体のセントロメアを含んでもよい。

【0047】

第３の部分は、第２の標的染色体のセントロメアを含んでもよい。第２の断片は、第２の標的染色体のセントロメアを含んでもよい。

【0048】

第１のＲＲＳは、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＰバリアントから選択される１つであってもよく、第３のＲＲＳは、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＰバリアントから選択される１つであってもよい。ここで、第１のＲＲＳは、第３のＲＲＳと対合することができてもよい。

【0049】

第２のＲＲＳは、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＰバリアントから選択される１つであってもよく、第４のＲＲＳは、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＰバリアントから選択される１つであってもよい。ここで、第２のＲＲＳは、第４のＲＲＳと対合することができてもよい。

【0050】

ここで、ＳＳＲはＣｒｅリコンビナーゼであってもよい。

【0051】

代替的には、第１のＲＲＳは、ＦＲＴ、ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ＩＴＲ、およびそれらのバリアントから選択される１つであってもよく、第３のＲＲＳは、ＦＲＴ、ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ＩＴＲ、およびそれらのバリアントから選択される１つであってもよい。ここで、第１のＲＲＳは、第３のＲＲＳと対合することができてもよい。

【0052】

第２のＲＲＳは、ＦＲＴ、ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ＩＴＲ、およびそれらのバリアントから選択される１つであってもよく、第４のＲＲＳは、ＦＲＴ、ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ＩＴＲ、およびそれらのバリアントから選択される１つであってもよい。ここで、第２のＲＲＳは、第４のＲＲＳと対合することができてもよい。

【0053】

ここで、ＳＳＲは、フリッパーゼ（ＦＬＰ）、インテグラーゼ、およびトランスポザーゼから選択される１つであってもよい。

【0054】

１つまたは複数の人工組換え染色体を含む細胞は、体細胞分裂（有糸分裂）または減数分裂を経てもよい。

【0055】

本明細書における開示の別の態様によれば、本発明は、１つまたは複数の人工組換え染色体を含む細胞を使用して、トランスジェニック非ヒト動物を作製する方法を提供する。

【0056】

一実施形態において、１つまたは複数の人工組換え染色体を含む細胞を使用してトランスジェニック非ヒト動物を作製するための方法は、
ｉ）第１の標的細胞および第２の標的細胞を調製する段階と、
ｉｉ）第２の標的細胞を使用して１個または複数のミクロセルを作製する段階と、
ｉｉｉ）第１の標的細胞および１個または複数のミクロセルを使用して融合細胞を作製する段階と、
ｉｖ）部位特異的リコンビナーゼ（ＳＳＲ）で融合細胞を処理することによって、人工組換え染色体を含む細胞を作製する段階と、
ｖ）子孫を作製するために、第１の人工組換え染色体を含むキメラ胚盤胞を代理母の子宮に移植する段階とを含んでもよい。

【0057】

第１の標的細胞は、胚性幹細胞であってもよい。

【0058】

第１の標的細胞は、第１の標的染色体を含んでもよい。第２の標的細胞は、第２の標的染色体を含んでもよい。

【0059】

【0060】

【0061】

１個または複数のミクロセルは、第２の標的染色体またはその断片を含んでもよい。ここで、第２の標的染色体の断片は、第２のＲＲＳおよび第２の断片を含んでもよい。

【0062】

融合細胞は、第１の標的染色体および第２の標的染色体、または第１の標的染色体および第２の標的染色体の断片を含んでもよい。

【0063】

【0064】

ここで、第１の標的染色体に存在する第１の断片は、第２の標的染色体に存在する第２の断片と交換されてもよい。

【0065】

それによって、第１の部分および第２の断片を含む第１の人工組換え染色体が作製されてもよい。

【0066】

ここで、第１の人工組換え染色体を含む細胞は、第２の標的染色体を含まない場合がある。

【0067】

キメラ胚盤胞は、第１の人工染色体を含む細胞を胚盤胞に注入することによって作製してもよい。

【0068】

別の実施形態において、１つまたは複数の人工組換え染色体を含む細胞を使用してトランスジェニック非ヒト動物を作製するための方法は、
ｉ）第１の標的細胞および第２の標的細胞を調製する段階と、
ｉｉ）第２の標的細胞を使用して１個または複数のミクロセルを作製する段階と、
ｉｉｉ）第１の標的細胞および１個または複数のミクロセルを使用して融合細胞を作製する段階と、
ｉｖ）部位特異的リコンビナーゼ（ＳＳＲ）で融合細胞を処理することによって、人工組換え染色体を含む細胞を作製する段階と、
ｖ）子孫を作製するために、第１の人工組換え染色体を含むキメラ胚盤胞を代理母の子宮に移植する段階とを含んでもよい。

【0069】

第１の標的細胞は、胚性幹細胞であってもよい。

【0070】

第１の標的細胞は、第１の標的染色体を含んでもよい。第２の標的細胞は、第２の標的染色体を含んでもよい。

【0071】

第１の標的染色体は、第１の部分、第１のリコンビナーゼ認識配列（第１のＲＲＳ）、第１の断片、第２のリコンビナーゼ認識配列（第２のＲＲＳ）、および第２の部分を含んでもよい。

【0072】

【0073】

ここで、第１の断片は、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置してもよい。

【0074】

第２の標的染色体は、第３の部分、第３のリコンビナーゼ認識配列（第３のＲＲＳ）、第２の断片、第４のリコンビナーゼ認識配列（第４のＲＲＳ）、および第４の部分を含んでもよい。

【0075】

【0076】

ここで、第２の断片は、第３のＲＲＳと第４のＲＲＳとの間に位置してもよい。

【0077】

１個または複数のミクロセルは、第２の標的染色体またはその断片を含む。ここで、第２の標的染色体の断片は、第３のＲＲＳ、第２の断片、および第４のＲＲＳを含んでもよい。

【0078】

融合細胞は、第１の標的染色体および第２の標的染色体、または第１の標的染色体および第２の標的染色体の断片を含んでもよい。

【0079】

【0080】

ここで、第１の標的染色体に存在する第１の断片は、第２の標的染色体に存在する第２の断片と交換されてもよい。

【0081】

それによって、第１の部分、第２の断片、および第２の部分を含む第１の人工組換え染色体が作製されてもよい。

【0082】

ここで、第１の人工組換え染色体を含む細胞は、第２の標的染色体を含まない場合がある。

【0083】

キメラ胚盤胞は、第１の人工染色体を含む細胞を胚盤胞に注入することによって作製してもよい。

【発明の効果】

【0084】

本明細書によって開示される技術によれば、以下の効果が示される。

【0085】

第１に、人工組換え染色体およびそれを作製する方法を提供することができる。さらに、より大きい外因性ＤＮＡセグメントを含む人工組換え染色体を提供することができる。

【0086】

第２に、人工組換え染色体を含む細胞、およびそれを作製する方法を提供することができる。さらに、より大きい外因性ＤＮＡセグメントを標的染色体に提供することによって、人工組換え染色体を含む細胞、およびそれを調製する方法を提供することができる。

【0087】

第３に、人工組換え染色体を含む細胞を使用してトランスジェニック動物を作製する方法を提供することができる。さらに、より大きい外因性ＤＮＡセグメントを標的染色体に提供することによって、人工組換え染色体を含む細胞を使用してトランスジェニック動物を作製する方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0088】

【図1】例示的な実施形態によるフローチャートである。

【0089】

【図2】標的染色体からの人工組換え染色体の作製を例示する概略図である。

【図3】標的染色体からの人工組換え染色体の作製を例示する概略図である。

【図4】標的染色体からの人工組換え染色体の作製を例示する概略図である。

【図5】標的染色体からの人工組換え染色体の作製を例示する概略図である。

【図6】標的染色体からの人工組換え染色体の作製を例示する概略図である。

【図7】標的染色体からの人工組換え染色体の作製を例示する概略図である。

【図8】標的染色体からの人工組換え染色体の作製を例示する概略図である。

【図9】標的染色体からの人工組換え染色体の作製を例示する概略図である。

【図10】標的染色体からの人工組換え染色体の作製を例示する概略図である。

【0090】

【図11】第１の非標的供給源染色体に第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡを提供することによって、第１の標的染色体の作製を例示する概略図である。

【0091】

【図12】第２の非標的供給源染色体に第３のドナーＤＮＡおよび第４のドナーＤＮＡを提供することによって、第２の標的染色体の作製を例示する概略図である。

【0092】

【図13】第１の標的染色体および第２の標的染色体からの第１の人工組換え染色体および第２の人工組換え染色体の作製を例示する概略図である。

【0093】

【図14】第１の人工組換え染色体からの最終の人工組換え染色体の作製を例示する概略図である。

【0094】

【図15】第１の非標的供給源染色体に第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡを提供することによって、第１の標的染色体の作製を例示する概略図である。

【0095】

【図16】第１の標的染色体の標的遺伝子の逆位を例示する概略図である。

【0096】

【図17】第２の非標的供給源染色体に第３のドナーＤＮＡおよび第４のドナーＤＮＡを提供することによって、第２の標的染色体の作製を例示する概略図である。

【0097】

【図18】第２の標的染色体の標的遺伝子の逆位を例示する概略図である。

【0098】

【図19】第１の標的染色体および第２の標的染色体からの第１の人工組換え染色体および第２の人工組換え染色体の作製を例示する概略図である。

【0099】

【図20】第１の人工組換え染色体からの最終の人工組換え染色体の作製を例示する概略図である。

【0100】

【図21】例示的な実施形態による標的染色体のＤＮＡ構造に関する概略図である。

【図22】例示的な実施形態による標的染色体のＤＮＡ構造に関する概略図である。

【図23】例示的な実施形態による標的染色体のＤＮＡ構造に関する概略図である。

【図24】例示的な実施形態による標的染色体のＤＮＡ構造に関する概略図である。

【0101】

【図25】例示的な実施形態による標的細胞を選択した結果を例示する。

【図26】例示的な実施形態による標的細胞を選択した結果を例示する。

【0102】

【図27】例示的な実施形態によるミクロセルを例示する。

【0103】

【図28】例示的な実施形態による融合細胞を調製するプロセスを例示する。

【0104】

【図29】例示的な実施形態による標的染色体を含む融合細胞を例示する。

【0105】

【図30】例示的な実施形態による人工組換え染色体を含む融合細胞を例示する。

【0106】

【図31】例示的な実施形態による、人工組換え染色体を含む融合細胞と標的染色体を含む融合細胞との比較を例示する。

【図32】例示的な実施形態による、人工組換え染色体を含む融合細胞と標的染色体を含む融合細胞との比較を例示する。

【図33】例示的な実施形態による、人工組換え染色体を含む融合細胞と標的染色体を含む融合細胞との比較を例示する。

【0107】

【図34】例示的な実施形態による、人工組換え染色体を含む融合細胞を選択し、人工組換え染色体を確認した結果を例示する。

【図35】例示的な実施形態による、人工組換え染色体を含む融合細胞を選択し、人工組換え染色体を確認した結果を例示する。

【発明を実施するための形態】

【0108】

別に定義されていない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書において説明される方法および物質と同様または均等の方法および物質を、本発明の実践または実験において使用することができるが、好適な方法および材料を以下に説明する。本明細書において言及されるすべての公報、出願特許、特許、および他の参考文献は、それらの全体を参照により引用される。さらに、物質、方法、および実施例は、単に説明のためであって、限定されることは意図されない。

【0109】

以下に、本発明を説明する。

【0110】

本明細書における開示は、人工組換え染色体、およびそれを含む細胞の作製に関する。

【0111】

トランスジェニック動物は、人工的な形質が導入された動物であり、様々な疾病、ならびに治療剤の機序および開発の研究のために使用される。トランスジェニック動物を作製するために、トランスジェニック動物を作製する方法は、動物細胞に所望の形質を導入するプロセスを含む。この目的のために現在では、クローニングベクターを使用する方法が用いられる。

【0112】

クローニングベクターを使用する方法は、トランスジェニック動物において、発現されることが望ましい所望の形質、すなわち標的遺伝子をクローニングし、人工的に作製されたベクターを動物細胞に送達して遺伝子をゲノムに挿入する方法である。そのような方法では、プラスミド、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）を使用する。ＢＡＣまたはＹＡＣは、プラスミドと比較してより大きい断片（１５０～３５０ｋｂｐ）を運ぶことができるＤＮＡ構築物であり、形質転換のために広く使用されている。特に、ＢＡＣまたはＹＡＣが、プラスミドと比較して比較的より大きい断片を運ぶことができるという利点に起因して、大きい標的遺伝子の形質導入のために使用される。

【0113】

しかしながら、大きい標的遺伝子のためには、複数のＢＡＣまたはＹＡＣが必要とされる。たとえば、ヒト抗体を産生するマウスを作製する場合、そのマウスを作製するために、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子が導入されるマウス細胞を作製する必要がある。この目的のために、サイズが１２５０キロベース（ｋｂ）のヒト免疫グロブリン重（ＩＧＨ）遺伝子をクローニングする形質転換ベクターを作製する必要がある。形質転換ベクターがＢＡＣである場合、異なるＤＮＡ断片をそれぞれが有する、少なくとも４～９個のＢＡＣが作製される。それによって作製されたＢＡＣは、マウス細胞に順次導入され、ゲノムに挿入される。すなわち、第１のＢＡＣがマウス細胞に導入されてゲノムに挿入され、第１のＢＡＣ挿入マウス細胞が選択される。第２のＢＡＣが、選択されたマウス細胞に導入されてゲノムに挿入され、第２のＢＡＣ挿入マウス細胞が選択される。標的遺伝子、すなわち完全長ヒトＩＧＨ遺伝子（全ＤＮＡ）がゲノムに挿入されるマウス細胞を選択するために、上で説明されるプロセスを繰り返すことが必要である。そのような繰り返されるプロセスは、完全長標的遺伝子が挿入されるマウス細胞の収量を低減する要因である。さらに、形質導入および選択の繰り返しが原因となる時間消費およびコスト消費などの問題が生じる。その上、複数のＢＡＣを作出する時間およびコストはかなり大きい。

【0114】

これらの問題を解決するために、本発明は、染色体間の組換えを使用する形質転換技術を開発した。

【0115】

本明細書における開示は、ＢＡＣおよびＹＡＣなどの形質転換ベクターを使用する従来のシステムが、染色体間の組換えによって人工組換え染色体を作製することによって取って替わられ得ることを示す。

【0116】

本明細書において開示される方法では、ＢＡＣまたはＹＡＣの代わりに染色体を使用する形質導入（形質転換）法を説明する。従来の方法において使用されてきたＢＡＣまたはＹＡＣの代わりに染色体を使用する形質転換法は、１つの染色体の動物細胞への導入および組換えによって、動物のゲノムに標的遺伝子を挿入し、形質転換（形質導入）された動物細胞を作出することである。

【0117】

本明細書において開示される染色体を使用する形質転換法は、３つのステップに大きく分けられてもよい。

【0118】

第１のステップは、標的遺伝子すなわち形質導入（形質転換）のための遺伝子を含む染色体、および組換えに必要とされる要素を含めるために、標的遺伝子が挿入されることになる染色体を、人工的に操作することである。このプロセスは、標的遺伝子を含む染色体を有するドナー細胞、および標的遺伝子が挿入されることになる染色体を有するレシピエント細胞において、実施してもよい。組換えに必要とされる要素は、リコンビナーゼを使用する組換えまたは相同組換えを可能にする因子であってもよい。たとえば、リコンビナーゼが使用される場合、リコンビナーゼによって認識される部位は、組換えに必要とされる要素であると見なされてもよい。一例において、Ｃｒｅリコンビナーゼが使用される場合、組換えに必要とされる要素はｌｏｘＰであってもよい。別の例において、フリッパーゼ（ＦＬＰ）リコンビナーゼが使用される場合、組換えに必要とされる要素はＦＲＴであってもよい。このプロセスの目的は、リコンビナーゼによって認識され得る部位、または染色体間の組換えにおける相同組換えのための相同的な部位を提供することである。プロセスは、標的遺伝子を含む染色体に含まれる、組換えに必要とされる要素、および標的遺伝子が挿入されることになる染色体に含まれる、組換えに必要とされる要素の、位置および対合を考慮して設計されるべきである。位置は、標的遺伝子の挿入位置と高度に関連付けられていてもよく、対合は組換えの成功および組換えの種類を決定してもよい。上で説明されるプロセスを通して、組換えに必要とされる要素が挿入された標的遺伝子を含む染色体を有する細胞（ドナー細胞）、および組換えに必要とされる要素が挿入される染色体を有する細胞（レシピエント細胞）が作製される。ここで、ドナー細胞の染色体に含まれる、組換えに必要とされる要素は、レシピエント細胞の染色体に含まれる、組換えに必要とされる要素と対合される。

【0119】

第２のステップは、ミクロセルの作製およびそれを使用する細胞融合に対する。このプロセスでは、先のプロセスにおいて作製される細胞（ドナー細胞）を使用し、このプロセスにおいて作製されるミクロセルは、組換えに必要とされる要素が挿入された標的遺伝子を含む染色体を有する。代替的には、このプロセスにおいて作製されるミクロセルは、組換えに必要とされる要素が挿入された標的遺伝子を含む染色体の断片を有し、ここで、断片は、組換えに必要とされる要素が挿入された標的遺伝子を含む。このプロセスは、当技術分野で従来公知の、ミクロセル仲介染色体トランスファー（ＭＭＣＴ）を用いて実施してもよい。ＭＭＣＴは、染色体をドナー細胞からレシピエント細胞にトランスファーするために一般に用いられる技術である（ＴｈｏｒｆｉｎｎＥｇｅｅｔａｌ．、１９７４；ＴｈｏｒｆｉｎｎＥｇｅｅｔａｌ．、１９７７）。プロセスによって作製されるミクロセルは、染色体または染色体断片を含み、染色体または染色体断片は、人工クローニングによって複製されたプラスミドなどのクローニングベクターではない。さらに、染色体または染色体断片は、組換えに必要とされる要素を含み、当該要素は、レシピエント細胞に含まれる、組換えに必要とされる要素と対合される。作製されるミクロセルは、レシピエント細胞と融合される。このプロセスによって、組換えに必要とされる要素が挿入された標的遺伝子を含むドナー細胞の染色体は、ミクロセルの融合によってレシピエント細胞に導入される（トランスファーされる）。

【0120】

第３のステップは、リコンビナーゼまたは相同組換えを使用して、人工組換え染色体を有する細胞を作製することである。このプロセスは、先のプロセスにおいて作製された細胞、すなわちリコンビナーゼまたは相同組換えによって誘導された因子での細胞融合によって作製された融合細胞を、処理することによって、染色体間の組換えを誘導することである。このプロセスにおいて、リコンビナーゼが処理される場合、リコンビナーゼによって認識される部位、すなわち組換えに必要とされる要素を有する染色体間の組換えが誘導される。換言すれば、組換えに必要とされる要素を含む標的遺伝子を有する染色体と、組換えに必要とされる要素を有する、標的遺伝子が挿入されることになる染色体との間の組換えが、誘導される。結果として、２つの染色体間の組換えに起因して、標的遺伝子の転座によって新規な人工組換え染色体が生成される。ここで、生成される人工組換え染色体は、所望の形質（標的遺伝子）が挿入されることになる染色体に、標的遺伝子が挿入される染色体である。換言すれば、生成される人工組換え染色体は、染色体間の組換えによって、ドナー細胞の染色体の一部（すなわち、標的遺伝子）をレシピエント細胞の染色体（すなわち、標的遺伝子が挿入されることになる染色体）に挿入することによって生成される染色体である。トランスジェニック動物は、人工組換え染色体を有する細胞を使用して作製されてもよい。

【0121】

上で説明される例を使用して説明されるように、ヒト抗体を産生するマウスを作製する場合、サイズが１２５０ｋｂのヒトＩＧＨ遺伝子がマウス細胞に導入されなくてはならない。本明細書において開示される染色体を使用する形質転換法を用いる場合、ヒトＩＧＨ遺伝子、すなわちヒト染色体１４を含む染色体がマウス細胞に導入される。ここで、ヒトＩＧＨ遺伝子を含む染色体は、組換えに必要とされる要素を、標的遺伝子、すなわちヒトＩＧＨ遺伝子の両端に含むように、人工的に操作された染色体である。ヒト染色体１４をマウス細胞に導入または送達するために、ミクロセル仲介染色体トランスファー（ＭＭＣＴ）を使用してもよい。ミクロセルおよびマウス細胞が融合される融合細胞は、ＭＭＣＴによって作製され、マウス細胞およびヒト染色体１４の全染色体を含む。導入されたヒト染色体１４と、標的遺伝子が挿入されることが望ましい染色体（たとえば、マウスＩＧＨ遺伝子を含むマウス染色体１２）との間の組換えは、融合細胞を組換え酵素で処理することによって誘導される。ここで、標的遺伝子が挿入されることが望ましい染色体（たとえば、マウスＩＧＨ遺伝子を含むマウス染色体１２）は、ヒト染色体１４のような、標的遺伝子が挿入されることが望ましい遺伝子座（たとえば、マウスＩＧＨ遺伝子の両末端）で組換えに必要とされる要素を含むように、人工的に操作される染色体である。組換え誘導プロセスによって、ヒト染色体１４のヒトＩＧＨ遺伝子は、標的遺伝子が挿入されることが望ましい遺伝子座（たとえば、マウスＩＧＨ遺伝子座）に挿入されるか、または当該遺伝子座で置き換えられる。挿入に関して、ヒトＩＧＨ遺伝子はマウスＩＧＨ遺伝子座位の上流または下流に挿入されてもよい。置き換えに関して、マウスＩＧＨ遺伝子座に位置するマウスＩＧＨ遺伝子は、ヒトＩＧＨ遺伝子で置き換えられてもよい。組換え（挿入または置き換え）は、組換えに必要とされる要素の設計に従って異なってもよい。上述の実施形態は、単に例であり、標的遺伝子は選択的に修飾され、多様化され得る。

【0122】

本明細書において開示される、染色体を使用する形質転換法は、人工クローニングのステップなしで細胞に存在する染色体を使用し、ＢＡＣおよびＹＡＣなどの形質転換ベクターを使用する従来システムとの技術的な違いを有する。さらに、本明細書において開示される、染色体を使用する形質転換法は、標的遺伝子、特に大きい標的遺伝子が導入される場合にＢＡＣおよびＹＡＣなどの形質転換ベクターを使用する連続的な導入の数を著しく低減することによって、従来技術の問題（効率、時間、コストなど）を解決することができる新規の技術である。

【0123】

本明細書において開示される、染色体を使用する形質転換法によれば、導入されることになる遺伝子、すなわち標的遺伝子の全配列はクローニングされない。ゲノムに１つの標的遺伝子を導入するために、本明細書において開示される、染色体を使用する形質転換法によれば、細胞融合に続いて、融合細胞は、染色体の組換えのためにリコンビナーゼ（または相同組換えによって誘導される因子）で処理され、ミクロセルとさらには融合されない。しかしながら、２つ以上の標的遺伝子があり、各標的遺伝子が異なる染色体上に位置している場合、染色体を使用する形質転換法は、各標的遺伝子をゲノムに導入することによって行われ、この時、染色体を使用する形質転換法によって生成される第１の標的遺伝子が導入される細胞に第２の標的遺伝子を導入するために、ミクロセルを融合するステップがさらに実施される。

【0124】

以下に、本明細書において開示される、染色体を使用する形質転換法、すなわち、人工組換え染色体を作製する方法を詳細に説明する。

【0125】

本明細書における開示の一態様は、人工組換え染色体に関する。

【0126】

「人工組換え染色体」は、２つ以上の供給源細胞から提供される２つ以上の染色体が部分的に組み換えられた染色体を指す。さらに、人工組換え染色体はまた、２つ以上の供給源細胞から提供される２つ以上の染色体が部分的に組み換えられた染色体の複製によって生成される染色体を含む。一例において、人工組換え染色体は、第１の供給源細胞から提供される染色体および第２の供給源細胞から提供される染色体が、部分的に組み換えられた染色体であってもよい。ここで、第１の供給源細胞から提供される染色体は、第１の供給源染色体であってもよく、第１の供給源染色体は、第１の供給源細胞に含まれてもよい。ここで、第２の供給源細胞から提供される染色体は、第２の供給源染色体であってもよく、第２の供給源染色体は、第２の供給源細胞に含まれてもよい。

【0127】

少なくとも１つまたは複数の人工組換え染色体を含む細胞は、「組換え細胞」と呼ばれる。ここで、組換え細胞は、少なくとも１つまたは複数の人工組換え染色体、および少なくとも１つまたは複数の供給源染色体を含む。

【0128】

「供給源染色体」は、人工組換え染色体を作製するために提供される染色体を指す。供給源染色体は、天然の染色体と人工的に操作された染色体の両方を含む。天然の染色体は、天然に存在する染色体であり、いかなる人工的な修飾もないインタクトな染色体である。たとえば、ヒト神経細胞は、４６個の天然に存在する染色体を有する。人工的に操作された染色体は、天然の染色体を人工的に修飾することによって作製された染色体を指す。ここで、人工的な修飾は、天然の染色体を構成する１つまたは複数のヌクレオチドの削除、挿入、もしくは置換、またはそれらの組み合わせを含む。人工的に操作された染色体は、以下に説明する標的染色体、当該染色体を作製するプロセスにおいて生成される染色体、および標的染色体を作製する目的以外での人工的な修飾を含む染色体のすべてを含む。たとえば、標的染色体を作製する目的以外で、人工的な修飾を含む染色体は、外因性タンパク質をその発現のためにコードする外因性核酸が挿入された染色体であってもよい。

【0129】

「供給源細胞」は、供給源染色体を含む細胞を指す。供給源細胞は、天然の染色体を含む細胞と、人工的に操作された染色体を含む細胞との両方を含んでもよい。ここで、人工的に操作された染色体を含む細胞は、標的染色体を含む標的細胞、当該細胞を作製するプロセスにおいて生成される細胞、および標的染色体を作製する目的以外での人工的な修飾を有する染色体を含む細胞のすべてを含む。さらに、本発明において、人工組換え染色体以外の染色体を含む細胞、すなわち人工組換え染色体を含まない細胞も、供給源細胞と呼ばれてもよい。［人工組換え染色体］

【0130】

人工組換え染色体は、第１の供給源染色体から提供される染色体配列の一部と第２の供給源染色体から提供される全染色体配列とを組み換えることによって作製される染色体であってもよい。

【0131】

人工組換え染色体は、第１の供給源染色体から提供される全染色体配列と第２の供給源染色体から提供される染色体配列の一部とを組み換えることによって作製される染色体であってもよい。

【0132】

人工組換え染色体は、第１の供給源染色体から提供される全染色体配列と第２の供給源染色体から提供される全染色体配列とを組み換えることによって作製される染色体であってもよい。

【0133】

人工組換え染色体は、第１の供給源染色体から提供される染色体配列の一部と第２の供給源染色体の染色体配列の一部とを組み換えることによって作製される染色体であってもよい。

【0134】

第１の供給源染色体は、第１の供給源細胞に含まれてもよい。

【0135】

第２の供給源染色体は、第２の供給源細胞に含まれてもよい。

【0136】

第１の供給源染色体は、第１の供給源細胞に由来してもよい。

【0137】

第２の供給源染色体は、第２の供給源細胞に由来してもよい。

【0138】

第１の供給源染色体は、第１の供給源細胞に含まれ、第２の供給源染色体は、第２の供給源細胞に含まれてもよい。この場合、第１の供給源細胞および第２の供給源細胞は、同じ種類の細胞であってもよい。たとえば、第１の供給源細胞および第２の供給源細胞は、マウス線維芽細胞であってもよく、個別の細胞として存在してもよい。第１の供給源染色体は、第２の供給源染色体と異なってもよい。代替的には、第１の供給源染色体および第２の供給源染色体は、相同染色体であってもよい。

【0139】

第１の供給源細胞および第２の供給源細胞は、同じ個体に由来してもよい。

【0140】

第１の供給源細胞および第２の供給源細胞は、異なる個体に由来してもよい。ここで、異なる個体は、同種および異種の個体を含んでもよい。

【0141】

供給源細胞は、ヒト細胞に由来してもよい。

【0142】

供給源細胞は、非ヒト細胞に由来してもよい。たとえば、非ヒト細胞は、マウス細胞、ラット細胞、げっ歯類細胞、ゴーラル細胞、ウシ細胞、または有蹄動物細胞に由来してもよいが、本発明はそれらに限定されない。

【0143】

供給源細胞は、体細胞に由来してもよい。たとえば、体細胞は、たとえば、線維芽細胞（線維芽の細胞）であってもよいが、本発明はそれらに限定されない。

【0144】

供給源細胞は、免疫細胞に由来してもよい。たとえば、免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、好塩基球、または好酸球であってもよいが、本発明はそれらに限定されない。

【0145】

供給源細胞は、生殖細胞に由来してもよい。たとえば、生殖細胞は、精子、精母細胞、精原幹細胞、卵子、卵母細胞、卵原幹細胞、または受精卵であってもよいが、本発明はそれらに限定されない。

【0146】

供給源細胞は、幹細胞に由来してもよい。たとえば、幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、成体幹細胞、臍帯血幹細胞、精原幹細胞、または卵原幹細胞に由来してもよいが、本発明はそれらに限定されない。

【0147】

１つの例示的な実施形態において、人工組換え染色体は、第１の断片および第２の断片を含んでもよい。

【0148】

第１の断片は、第１の供給源細胞の第１の供給源染色体の一部であってもよい。

【0149】

ここで、第１の断片は、第１のテロメアを含んでもよい。第１のテロメアは、第１の供給源染色体の両方のテロメアのうち一方であってもよい。

【0150】

ここで、第１の供給源細胞は、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、げっ歯類細胞、ゴーラル細胞、ウシ細胞、または有蹄動物細胞であってもよい。

【0151】

第２の断片は、第２の供給源細胞の第２の供給源染色体の一部であってもよい。

【0152】

ここで、第２の断片は、セントロメアおよび第２のテロメアを含んでもよい。セントロメアは、第２の供給源染色体のセントロメアであってもよい。第２のテロメアは、第２の供給源染色体の両方のテロメアのうち一方であってもよい。

【0153】

ここで、第２の供給源細胞は、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、げっ歯類細胞、ゴーラル細胞、ウシ細胞、または有蹄動物細胞であってもよい。

【0154】

ここで、第２の供給源細胞および第１の供給源細胞は、異種の個体に由来してもよい。たとえば、第１の供給源細胞がヒト細胞である場合、第２の供給源細胞は、マウス細胞であってもよい。

【0155】

代替的には、第２の供給源細胞および第１の供給源細胞は、同種の個体に由来してもよい。たとえば、第１の供給源細胞がヒト細胞である場合、第２の供給源細胞は、ヒト細胞であってもよい。

【0156】

第１の断片および第２の断片は、リン酸ジエステル結合によって接続されてもよい。

【0157】

人工組換え染色体は、異種の個体に由来する２つのテロメアを有してもよい。

【0158】

人工組換え染色体は、異なる長さを有する２つのテロメアを有してもよい。

【0159】

ここで、人工組換え染色体は、第１の供給源染色体と同じでない場合があり、人工組換え染色体は、第２の供給源染色体と同じでない場合がある。

【0160】

別の例示的な実施形態において、人工組換え染色体は、第１の断片、第２の断片、および第３の断片を含んでもよい。

【0161】

第１の断片は、第１の供給源細胞の第１の供給源染色体の一部であってもよい。

【0162】

【0163】

第２の断片は、第２の供給源細胞の第２の供給源染色体の一部であってもよい。

【0164】

ここで、第２の断片は、セントロメアおよび第１のテロメアを含んでもよい。セントロメアは、第２の供給源染色体のセントロメアであってもよい。第１のテロメアは、第２の供給源染色体の両方のテロメアのうち一方であってもよい。

【0165】

第３の断片は、第２の供給源細胞の第２の供給源染色体の一部であってもよい。

【0166】

ここで、第３の断片は、第２のテロメアを含んでもよい。第２のテロメアは、第２の供給源染色体の両方のテロメアのうち一方であってもよい。

【0167】

【0168】

【0169】

【0170】

第１の断片および第２の断片は、リン酸ジエステル結合によって接続されてもよい。

【0171】

第１の断片および第３の断片は、リン酸ジエステル結合によって接続されてもよい。

【0172】

人工組換え染色体は、［第２の断片］－［第１の断片］－［第３の断片］の配列からなってもよい。

【0173】

ここで、第１の断片は、逆位の形を有してもよい。ここで、逆位の形は、第１の供給源染色体に存在する第１の断片の逆位であってもよい。この場合、人工組換え染色体を含む細胞において、第１の断片に含まれる遺伝子は、タンパク質として発現しない場合がある。代替的には、人工組換え染色体を含む細胞は、第１の供給源染色体を含む第１の供給源細胞と比較して、第１の断片に含まれる遺伝子の発現パターンが異なっていてもよい。

【0174】

人工組換え染色体は、両方のテロメアが同じ個体に由来してもよい。

【0175】

ここで、人工組換え染色体は、第１の供給源染色体と同じでない場合があり、人工組換え染色体は、第２の供給源染色体と同じでない場合がある。

【0176】

さらに別の例示的な実施形態において、人工組換え染色体は、第１の断片、第２の断片、および第３の断片を含んでもよい。

【0177】

第１の断片は、第１の供給源細胞の第１の供給源染色体の一部であってもよい。

【0178】

ここで、第１の断片は、セントロメアを含んでもよい。セントロメアは、第１の供給源染色体のセントロメアであってもよい。

【0179】

【0180】

第２の断片は、第２の供給源細胞の第２の供給源染色体の一部であってもよい。

【0181】

ここで、第２の断片は、第１のテロメアを含んでもよい。第１のテロメアは、第２の供給源染色体の両方のテロメアのうち一方であってもよい。

【0182】

第３の断片は、第２の供給源細胞の第２の供給源染色体の一部であってもよい。

【0183】

ここで、第３の断片は、第２のテロメアを含んでもよい。第２のテロメアは、第２の供給源染色体の両方のテロメアのうち一方であってもよい。

【0184】

【0185】

【0186】

【0187】

第１の断片および第２の断片は、リン酸ジエステル結合によって接続されてもよい。

【0188】

第１の断片および第３の断片は、リン酸ジエステル結合によって接続されてもよい。

【0189】

人工組換え染色体は、［第２の断片］－［第１の断片］－［第３の断片］の配列からなってもよい。

【0190】

【0191】

人工組換え染色体は、両方のテロメアが同じ個体に由来してもよい。

【0192】

ここで、人工組換え染色体は、第１の供給源染色体と同じでない場合があり、人工組換え染色体は、第２の供給源染色体と同じでない場合がある。

【0193】

さらに別の例示的な実施形態において、人工組換え染色体は、第１の断片、第２の断片、および第３の断片を含んでもよい。

【0194】

第１の断片は、第１の供給源細胞の第１の供給源染色体の一部であってもよい。

【0195】

ここで、第１の断片は、第１のテロメアを含んでもよい。第１のテロメアは、第１の供給源染色体の両方のテロメアのうち一方であってもよい。

【0196】

【0197】

第２の断片は、第２の供給源細胞の第２の供給源染色体の一部であってもよい。

【0198】

ここで、第２の断片は、セントロメアを含んでもよい。セントロメアは、第２の供給源染色体のセントロメアであってもよい。

【0199】

【0200】

第３の断片は、第３の供給源細胞の第３の供給源染色体の一部であってもよい。

【0201】

ここで、第３の断片は、第２のテロメアを含んでもよい。第２のテロメアは、第３の供給源染色体の両方のテロメアのうち一方であってもよい。

【0202】

ここで、第３の供給源細胞は、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、げっ歯類細胞、ゴーラル細胞、ウシ細胞、または有蹄動物細胞であってもよい。

【0203】

ここで、第３の供給源細胞は、第１の供給源細胞および第２の供給源細胞に対して異種の個体に由来してもよい。たとえば、第１の供給源細胞および第２の供給源細胞がヒト細胞である場合、第３の供給源細胞は、マウス細胞であってもよい。代替的には、たとえば、第１の供給源細胞がヒト細胞であり、第２の供給源細胞がマウス細胞である場合、第３の供給源細胞は、ラット細胞であってもよい。

【0204】

代替的には、第３の供給源細胞および第１の供給源細胞が異種の個体に由来し、第３の供給源細胞および第２の供給源細胞が同種の個体に由来する。たとえば、第１の供給源細胞がヒト細胞であり、第２の供給源細胞がマウス細胞である場合、第３の供給源細胞は、マウス細胞であってもよい。

【0205】

代替的には、第３の供給源細胞および第１の供給源細胞が同種の個体に由来し、第３の供給源細胞および第２の供給源細胞が異種の個体に由来する。たとえば、第１の供給源細胞がマウス細胞であり、第２の供給源細胞がラット細胞である場合、第３の供給源細胞は、マウス細胞であってもよい。

【0206】

第１の断片および第２の断片は、リン酸ジエステル結合によって接続されてもよい。

【0207】

第２の断片および第３の断片は、リン酸ジエステル結合によって接続されてもよい。

【0208】

人工組換え染色体は、［第１の断片］－［第２の断片］－［第３の断片］の配列からなってもよい。

【0209】

ここで、第２の断片は、逆位の形を有してもよい。ここで、逆位の形は、第２の供給源染色体に存在する第２の断片の逆位であってもよい。この場合、人工組換え染色体を含む細胞において、第２の断片に含まれる遺伝子は、タンパク質として発現しない場合がある。代替的には、人工組換え染色体を含む細胞は、第２の供給源染色体を含む第２の供給源細胞と比較して、第２の断片に含まれる遺伝子の発現パターンが異なっていてもよい。

【0210】

人工組換え染色体は、テロメアの両端が同じ個体に由来してもよい。

【0211】

代替的には、人工組換え染色体は、異種の個体に由来する２つのテロメアを有してもよい。人工組換え染色体は、異なる長さを有する２つのテロメアを有してもよい。

【0212】

ここで、人工組換え染色体は、第１の供給源染色体、第２の供給源染色体、または第３の供給源染色体と同じではない。

【0213】

本明細書における開示の別の態様は、人工組換え染色体を作製する方法に関する。

【0214】

人工組換え染色体は、供給源染色体から作製されてもよい。

【0215】

供給源染色体は、人工的に操作された染色体であってもよい。

【0216】

人工的に操作された染色体は、標的染色体であってもよい。

【0217】

「標的染色体」は、組換えのために、天然の染色体上に１つまたは複数の構成要素をさらに含む染色体を意味する。一例において、標的染色体は、天然の染色体上に１つまたは複数のリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）をさらに含む染色体であってもよい。別の例において、標的染色体は、天然の染色体上に、１つまたは複数の、染色体交換のための人工配列（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｓｅｑｕｅｎｃｅｓｆｏｒｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｅｘｃｈａｎｇｅ）（ＡＳＣＥ）をさらに含む染色体であってもよい。

【0218】

標的染色体は、天然の染色体から作製されてもよい。

【0219】

供給源染色体に関する説明は、上記と同じである。

【0220】

一例において、第１の標的染色体は、第１の天然の染色体から作製されてもよい。第１の標的染色体は、第１の天然の染色体上に１つまたは複数のＲＲＳを含んでもよい。第１の標的染色体は、第１の天然の染色体上に１つまたは複数のＡＳＣＥを含んでもよい。

【0221】

別の例において、第２の標的染色体は、第２の天然の染色体から作製されてもよい。第２の標的染色体は、第２の天然の染色体上に１つまたは複数のＲＲＳを含んでもよい。第２の標的染色体は、第２の天然の染色体上に１つまたは複数のＡＳＣＥを含んでもよい。

【0222】

「リコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）」は、部位特異的リコンビナーゼによって、組換え部位を提供することができる核酸配列を意味する。一例において、ＲＲＳは、ｌｏｘＰ部位またはそのバリアント（表１）であってもよい。別の例において、ＲＲＳは、ＦＲＴ部位またはそのバリアントであってもよい。一例において、ＲＲＳは、ａｔｔＰ／ａｔｔＢまたはそのバリアントであってもよい。別の例において、ＲＲＳは、逆位末端反復（ＩＴＲ）配列またはそのバリアントであってもよく、当該配列またはそのバリアントは、１つまたは複数のトランスポザーゼによって認識される。しかしながら、ＲＲＳはそれらに限定されない。

【0223】

天然の染色体から標的染色体を構築するために、部位特異的組換えシステムが用いられてもよい。部位特異的組換えシステムは、ＲＲＳに作用するＳＳＲを使用するシステムであり、当技術分野で公知である。部位特異的組換えシステムは、Ｃｒｅ－ｌｏｘを含んでもよい。部位特異的組換えシステムは、ＦＬＰ／ＦＲＴを含んでもよい。部位特異的組換えシステムは、φＣ３１インテグラーゼ－ａｔｔＰ／ａｔｔＢを含んでもよい。部位特異的組換えシステムは、トランスポゾンＩＴＲを含んでもよい。しかしながら、ＲＲＳおよびＳＳＲ媒介部位特異的組換えシステムは、それらに限定されず、様々な種類のリコンビナーゼ、インテグラーゼ、リゾルバーゼ、またはトランスポザーゼがＳＳＲとして使用され、ＳＳＲに応じて、ＲＲＳが様々な形態に修飾され、設計され得る。

【0224】

ＲＲＳは、公知の配列であってもよい。一例において、ＲＲＳは、ｌｏｘＰまたはそのバリアントであってもよい。

【0225】

たとえば、ｌｏｘＰバリアントは、Ｌｏｘｍ２／７１、Ｌｏｘｍ２／６６、Ｌｏｘ７１、およびＬｏｘ６６のうち１つまたは複数であってもよい。ｌｏｘＰバリアントのＤＮＡ配列は、以下の表１に開示される。以下に、配列番号をＳＥＱＩＤＮＯとして列挙する。
［表１］
ｌｏｘＰバリアントのＤＮＡ配列

【表1】

【0226】

ＲＲＳは、公知の配列であってもよい。別の例において、ＲＲＳは、ＦＲＴ部位またはそのバリアントであってもよい。

【0227】

さらに別の例において、ＲＲＳは、ａｔｔＰ／ａｔｔＢまたはそのバリアントであってもよい。さらに別の例において、ＲＲＳは、ＩＴＲ配列またはそのバリアントであってもよく、当該配列またはそのバリアントは、トランスポザーゼによって認識される。ここで、ＩＴＲは、トランスポゾンＩＴＲであってもよく、トランスポゾンＩＴＲはトランスポゾン末端反復（ＴＲ）配列を含んでもよい。たとえば、トランスポゾンＩＴＲ配列は、ピギーバック末端反復（ＰＢ－ＴＲ）含んでもよい。

【0228】

ＲＲＳおよびそのバリアントのＤＮＡ配列は、以下の表２に列挙される。
［表２］
ＲＲＳのＤＮＡ配列

【表2】

【0229】

「染色体交換のための人工配列（ＡＳＣＥ）」は、相同組換え（ＨＲ）によって、組換え部位を提供することができる核酸配列を意味する。ＡＳＣＥは人工配列であってもよい。ＡＳＣＥは、標的染色体に含まれる人工配列であってもよい。たとえば、第１の標的染色体は、第１のＡＳＣＥを含んでもよい。第２の標的染色体は、第２のＡＳＣＥを含んでもよい。ここで、第１の標的染色体に含まれる第１のＡＳＣＥおよび第２の標的染色体に含まれる第２のＡＳＣＥは、次の相同組換えにおいて使用されてもよい。

【0230】

天然の染色体から標的染色体を構築するために、相同組換えが用いられてもよい。相同組換えは、染色体の二本鎖切断（ＤＳＢ）および／または一本鎖切断（ＳＳＢ）によって実施されてもよい。ＳＳＢおよび／またはＤＳＢは、天然に生じてもよい。ＳＳＢおよび／またはＤＳＢは、染色体切断物質（染色体における異常の原因となる物質）によって生じさせてもよい。染色体切断物質は、電離放射線、ＵＶ、Ｘ線、γ線、反応性酸素種、または特定の化学物質であってもよい。特定の化学物質は、たとえば、ブレオマイシン、ヒドロキシウレア、カンプトテシン、４－ニトロキノリン１－酸化物（４－ＮＱＯ）、シスプラチン、またはＥＭＳまたはＭＭＳなどのメチル化剤であってもよいが、本発明はそれらに限定されない。ＳＳＢおよび／またはＤＳＢは、操作されたヌクレアーゼによって生じさせてもよい。たとえば、ＳＳＢおよび／またはＤＳＢは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）のうち、いずれか１つまたは複数によって生じさせてもよい。

【0231】

１つの例示的な実施形態において、人工組換え染色体は、少なくとも２つ以上の標的染色体によって作製されてもよい。

【0232】

少なくとも２つ以上の標的染色体は、第１の標的染色体および第２の標的染色体を含んでもよい。

【0233】

ここで、第１の標的染色体は、１つまたは複数のＲＲＳを含んでもよい。

【0234】

ここで、第２の標的染色体は、１つまたは複数のＲＲＳを含んでもよい。

【0235】

ここで、第１の標的染色体に含まれるＲＲＳおよび第２の標的染色体に含まれるＲＲＳは、部位特異的リコンビナーゼ（ＳＳＲ）によって認識されてもよい。ここで、第１の標的染色体に含まれるＲＲＳおよび第２の標的染色体に含まれるＲＲＳは、互いと対合されてもよい。

【0236】

人工組換え染色体は、第１の標的染色体の一部および第２の標的染色体の一部を含んでもよい。

【0237】

ここで、人工組換え染色体は、第１の標的染色体に含まれるＲＲＳおよび第２の標的染色体に含まれるＲＲＳの対合を使用する部位特異的組換えによって生成されてもよい。

【0238】

一例において、第１の標的染色体が［第１の断片］－［第１のＲＲＳ］－［第２の断片］からなり、第２の標的染色体が［第３の断片］－［第２のＲＲＳ］－［第４の断片］からなる場合、人工組換え染色体は、［第１の断片］－［第３の断片］、［第１の断片］－［第４の断片］、［第３の断片］－［第２の断片］、または［第２の断片］－［第４の断片］からなってもよい。

【0239】

代替的には、人工組換え染色体は、［第１の断片］－［第１のＲＲＳ］－［第３の断片］、［第１の断片］－［第１のＲＲＳ］－［第４の断片］、［第３の断片］－［第１のＲＲＳ］－［第２の断片］、または［第２の断片］－［第１のＲＲＳ］－［第４の断片］からなってもよい。

【0240】

代替的には、人工組換え染色体は、［第１の断片］－［第２のＲＲＳ］－［第３の断片］、［第１の断片］－［第２のＲＲＳ］－［第４の断片］、［第３の断片］－［第２のＲＲＳ］－［第２の断片］、または［第２の断片］－［第２のＲＲＳ］－［第４の断片］からなってもよい。

【0241】

代替的には、人工組換え染色体は、［第１の断片］－［第３のＲＲＳ］－［第３の断片］、［第１の断片］－［第３のＲＲＳ］－［第４の断片］、［第３の断片］－［第３のＲＲＳ］－［第２の断片］、または［第２の断片］－［第３のＲＲＳ］－［第４の断片］からなってもよい。ここで、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳの組換えによって生成されるＲＲＳであってもよく、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳと同じでない場合がある。

【0242】

別の例において、第１の標的染色体が［第１の断片］－［第１のＲＲＳ］－［第２の断片］－［第２のＲＲＳ］－［第３の断片］からなり、第２の標的染色体が［第４の断片］－［第３のＲＲＳ］－［第５の断片］－［第４のＲＲＳ］－［第６の断片］からなる場合、人工組換え染色体は、［第１の断片］－［第５の断片］－［第３の断片］、または［第４の断片］－［第２の断片］－［第６の断片］からなってもよい。

【0243】

代替的には、人工組換え染色体は、［第１の断片］－［第１のＲＲＳ］－［第５の断片］－［第２のＲＲＳ］－［第３の断片］、［第１の断片］－［第１のＲＲＳ］－［第５の断片］－［第４のＲＲＳ］－［第３の断片］、［第１の断片］－［第３のＲＲＳ］－［第５の断片］－［第２のＲＲＳ］－［第３の断片］、［第１の断片］－［第３のＲＲＳ］－［第５の断片］－［第４のＲＲＳ］－［第３の断片］、［第４の断片］－［第１のＲＲＳ］－［第２の断片］－［第２のＲＲＳ］－［第６の断片］、［第４の断片］－［第１のＲＲＳ］－［第２の断片］－［第４のＲＲＳ］－［第６の断片］、［第４の断片］－［第３のＲＲＳ］－［第２の断片］－［第２のＲＲＳ］－［第６の断片］、または［第４の断片］－［第３のＲＲＳ］－［第２の断片］－［第４のＲＲＳ］－［第６の断片］からなってもよい。

【0244】

代替的には、人工組換え染色体は、［第１の断片］－［第５のＲＲＳ］－［第５の断片］－［第２のＲＲＳ］－［第３の断片］、［第１の断片］－［第５のＲＲＳ］－［第５の断片］－［第４のＲＲＳ］－［第３の断片］、［第４の断片］－［第５のＲＲＳ］－［第２の断片］－［第２のＲＲＳ］－［第６の断片］、または［第４の断片］－［第５のＲＲＳ］－［第２の断片］－［第４のＲＲＳ］－［第６の断片］からなってもよい。ここで、第５のＲＲＳは、第１のＲＲＳおよび第３のＲＲＳの組換えによって生成されるＲＲＳであってもよく、第１のＲＲＳおよび第３のＲＲＳと同じでない場合がある。

【0245】

代替的には、人工組換え染色体は、［第１の断片］－［第１のＲＲＳ］－［第５の断片］－［第６のＲＲＳ］－［第３の断片］、［第１の断片］－［第３のＲＲＳ］－［第５の断片］－［第６のＲＲＳ］－［第３の断片］、［第４の断片］－［第１のＲＲＳ］－［第２の断片］－［第６のＲＲＳ］－［第６の断片］、または［第４の断片］－［第３のＲＲＳ］－［第２の断片］－［第６のＲＲＳ］－［第６の断片］からなってもよい。ここで、第６のＲＲＳは、第２のＲＲＳおよび第４のＲＲＳの組換えによって生成されるＲＲＳであってもよく、第２のＲＲＳおよび第４のＲＲＳと同じでない場合がある。

【0246】

代替的には、人工組換え染色体は、［第１の断片］－［第５のＲＲＳ］－［第５の断片］－［第６のＲＲＳ］－［第３の断片］、または［第４の断片］－［第５のＲＲＳ］－［第２の断片］－［第６のＲＲＳ］－［第６の断片］からなってもよい。ここで、第５のＲＲＳは、第１のＲＲＳおよび第３のＲＲＳの組換えによって生成されるＲＲＳであってもよく、第１のＲＲＳおよび第３のＲＲＳと同じでない場合がある。ここで、第６のＲＲＳは、第２のＲＲＳおよび第４のＲＲＳの組換えによって生成されるＲＲＳであってもよく、第２のＲＲＳおよび第４のＲＲＳと同じでない場合がある。

【0247】

別の例示的な実施形態において、人工組換え染色体は、少なくとも２つ以上の標的染色体によって作製されてもよい。

【0248】

少なくとも２つ以上の標的染色体は、第１の標的染色体および第２の標的染色体を含んでもよい。

【0249】

ここで、第１の標的染色体は、１つまたは複数のＡＳＣＥを含んでもよい。

【0250】

ここで、第２の標的染色体は、１つまたは複数のＡＳＣＥを含んでもよい。

【0251】

ここで、第１の標的染色体に含まれるＡＳＣＥは、第２の標的染色体に含まれる配列と相同的な配列であってもよい。

【0252】

人工組換え染色体は、第１の標的染色体の一部および第２の標的染色体の一部を含んでもよい。

【0253】

ここで、人工組換え染色体は、第１の標的染色体に含まれるＡＳＣＥおよび第２の標的染色体に含まれるＡＳＣＥの相同性を使用する相同組換えによって生成されてもよい。

【0254】

一例において、第１の標的染色体が［第１の断片］－［第１のＡＳＣＥ］－［第２の断片］－［第２のＡＳＣＥ］－［第３の断片］からなり、第２の標的染色体が［第４の断片］－［第３のＡＳＣＥ］－［第５の断片］－［第４のＡＳＣＥ］－［第６の断片］からなる場合、人工組換え染色体は、［第１の断片］－［第５の断片］－［第３の断片］、または［第４の断片］－［第２の断片］－［第６の断片］からなってもよい。

【0255】

代替的には、人工組換え染色体は、［第１の断片］－［第１のＡＳＣＥ］－［第５の断片］－［第２のＡＳＣＥ］－［第３の断片］、［第１の断片］－［第１のＡＳＣＥ］－［第５の断片］－［第４のＡＳＣＥ］－［第３の断片］、［第１の断片］－［第３のＡＳＣＥ］－［第５の断片］－［第２のＡＳＣＥ］－［第３の断片］、［第１の断片］－［第３のＡＳＣＥ］－［第５の断片］－［第４のＡＳＣＥ］－［第３の断片］、［第４の断片］－［第１のＡＳＣＥ］－［第２の断片］－［第２のＡＳＣＥ］－［第６の断片］、［第４の断片］－［第１のＡＳＣＥ］－［第２の断片］－［第４のＡＳＣＥ］－［第６の断片］、［第４の断片］－［第３のＡＳＣＥ］－［第２の断片］－［第２のＡＳＣＥ］－［第６の断片］、または［第４の断片］－［第３のＡＳＣＥ］－［第２の断片］－［第４のＡＳＣＥ］－［第６の断片］からなってもよい。

【0256】

本明細書における開示のさらに別の態様は、１つまたは複数の人工組換え染色体を含む細胞を作製する方法に関する。

【0257】

１つまたは複数の人工組換え染色体を含む細胞を作製する方法では、細胞融合を用いてもよい。

【0258】

「細胞融合」は、２個以上の細胞間の融合、および／または１個または複数の細胞と１個または複数の細胞類似体との間の融合を意味する。ここで、融合は、２個以上の細胞間の合体（または混合）によって１個の細胞を作製すること、および／または１個または複数の細胞と１個または複数の細胞類似体との間の合体（または混合）によって１個の細胞を作製することであってもよい。ここで、細胞類似体は、ゲノムの一部または全染色体の一部を含むが、通常の体細胞分裂（有糸分裂）または減数分裂を経ない、細胞または細胞由来物質であってもよい。

【0259】

細胞融合により、融合細胞を作製してもよい。

【0260】

「融合細胞」は、供給源細胞が１つまたは複数の染色体または染色体断片を有するように作製される細胞を意味する。ここで、１つまたは複数の染色体または染色体断片は、供給源細胞中に天然に存在しない、さらに加えられる染色体または染色体断片である。ここで、１つまたは複数の染色体または染色体断片は、供給源染色体、供給源染色体の断片、人工組換え染色体、または人工組換え染色体の断片であってもよい。

【0261】

「融合細胞」は、１つまたは複数の供給源染色体または供給源染色体断片が供給源細胞に含まれる細胞であってもよい。ここで、１つまたは複数の供給源染色体または供給源染色体断片は、供給源細胞中に天然に存在しない、供給源細胞にさらに加えられる染色体または染色体断片であってもよい。

【0262】

たとえば、ヒト線維芽細胞が供給源細胞である場合、融合細胞は、１つまたは複数のマウス線維芽細胞由来染色体を含む、ヒト線維芽細胞融合細胞であってもよい。ここで、ヒト線維芽細胞融合細胞は、ヒト線維芽細胞、すなわち供給源細胞とは異なるゲノムを有してもよく、また、マウス線維芽細胞とは異なるゲノムを有してもよい。ここで、ヒト線維芽細胞融合細胞は、２ｎ（４６）個のヒト線維芽細胞由来染色体および１つのマウス線維芽細胞由来染色体を含んでもよい。代替的には、ヒト線維芽細胞融合細胞は、２ｎ－１（４５）個のヒト線維芽細胞由来染色体および１つのマウス線維芽細胞由来染色体を含んでもよい。

【0263】

融合細胞は、１つまたは複数の組換え染色体が供給源細胞に含まれる細胞であってもよい。ここで、１つまたは複数の組換え染色体は、融合細胞における染色体間の組換えによって作製されてもよい。ここで、組換え染色体は、人工組換え染色体であってもよい。

【0264】

たとえば、マウス胚性幹細胞（ＥＳＣ）が供給源細胞である場合、融合細胞は、ヒト線維芽細胞に由来する１つまたは複数の染色体を含むマウス融合ＥＳＣであってもよい。ここで、マウス融合ＥＳＣは、マウスＥＳＣ、すなわち供給源細胞とは異なるゲノムを有してもよく、また、ヒト線維芽細胞とは異なるゲノムを有してもよい。ここで、マウス融合ＥＳＣは、２ｎ（４０）個のマウスＥＳＣ由来染色体および１つのヒト線維芽細胞由来染色体を含んでもよい。代替的には、マウス融合ＥＳＣは、２ｎ－１（３９）個のマウスＥＳＣ由来染色体、および１つのヒト線維芽細胞由来染色体を含んでもよい。代替的には、マウス融合ＥＳＣは、２ｎ－１（３９）個のマウスＥＳＣ由来染色体、および２つの組換え染色体を含んでもよく、ここで、２つの組換え染色体は、１つのマウスＥＳＣ由来染色体と１つのヒト線維芽細胞由来染色体との組換えによって生成されてもよい。代替的には、マウス融合ＥＳＣは、２ｎ－１（３９）個のマウスＥＳＣ由来染色体、および１つの組換え染色体を含んでもよく、ここで、１つの組換え染色体は、１つのマウスＥＳＣ由来染色体と１つのヒト線維芽細胞由来染色体との組換えによって生成されてもよい。

【0265】

融合細胞は、２ｎ＋１個の染色体を有する動物細胞であってもよい。

【0266】

融合細胞は、２ｎ個の染色体を有する動物細胞であってもよい。ここで、２ｎ個の染色体は、少なくとも１つの人工組換え染色体を含んでもよい。

【0267】

融合細胞は、１つまたは複数の人工組換え染色体を含む細胞であってもよい。

【0268】

融合細胞は、通常の体細胞分裂（有糸分裂）または減数分裂を経てもよい。

【0269】

融合細胞は、ｎ＋１個の染色体を有する動物生殖細胞であってもよい。

【0270】

融合細胞は、ｎ個の染色体を有する動物生殖細胞であってもよい。ここで、ｎ個の染色体は、少なくとも１つの人工組換え染色体を含んでもよい。

【0271】

融合細胞は、１つまたは複数の人工組換え染色体を含む細胞を含んでもよい。

【0272】

人工組換え染色体に関する説明は、上記と同じである。

【0273】

１つの例示的な実施形態において、１つまたは複数の人工組換え染色体を含む細胞を作製する方法は、
ｉ）標的細胞の作製と、ｉｉ）標的細胞を使用する、ミクロセルの作製と、ｉｉｉ）ミクロセルを使用する、融合細胞の作製と、ｉｖ）融合細胞を使用する、人工組換え染色体を含む細胞の作製とを含んでもよい。

【0274】

ステップｉ）において作製される標的細胞は、２つ以上の標的細胞を含んでもよい。

【0275】

ここで、２つ以上の標的細胞は、ドナー細胞およびレシピエント細胞を含む場合がある。

【0276】

ステップｉｉ）で使用される標的細胞は、ドナー細胞であってもよい。

【0277】

ステップｉｉｉ）で使用されるミクロセルは、レシピエント細胞と融合されてもよい。

【0278】

各ステップは、以下で詳細に説明される。
ｉ）標的細胞の作製

【0279】

ステップｉ）において作製される標的細胞は、２つ以上の標的細胞を含んでもよい。

【0280】

２つ以上の標的細胞は、ドナー細胞およびレシピエント細胞を含んでもよい。ドナー細胞は、１つまたは複数の標的染色体を含む細胞であってもよく、レシピエント細胞は、１つまたは複数の標的染色体を含む細胞であってもよい。ここで、ドナー細胞に含まれる標的染色体は、レシピエント細胞に含まれる標的染色体と会合していてもよい。この会合は、ドナー細胞に含まれる標的染色体とレシピエント細胞に含まれる標的染色体との間の組換えを誘導することができる構成要素間の、対合または相補的結合の可能性である場合がある。

【0281】

ここで、構成要素は、ＲＲＳまたはＡＳＣＥであってもよく、ＲＲＳまたはＡＳＣＥは上述されている。

【0282】

会合は、ドナー細胞に含まれる標的染色体に存在するＲＲＳとレシピエント細胞に含まれる標的染色体に存在するＲＲＳとの対合であってもよい。

【0283】

たとえば、ドナー細胞に含まれる標的染色体は１つまたは複数のＲＲＳ（たとえば、第１のＲＲＳ）を含み、レシピエント細胞に含まれる標的染色体は１つまたは複数のＲＲＳ（たとえば、第２のＲＲＳ）を含む。ここで、ドナー細胞に含まれる標的染色体のＲＲＳ（たとえば、第１のＲＲＳ）、およびレシピエント細胞に含まれる標的染色体のＲＲＳ（たとえば、第２のＲＲＳ）は、互いに対合されるように設計されてもよい。

【0284】

別の例において、ドナー細胞に含まれる標的染色体は、２つ以上のＲＲＳ（たとえば、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳ）を含み、レシピエント細胞に含まれる標的染色体は、２つ以上のＲＲＳ（たとえば、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳ）を含み、ドナー細胞に含まれる標的染色体の１つのＲＲＳ（たとえば、第１のＲＲＳ）およびレシピエント細胞に含まれる標的染色体の２つのＲＲＳ（たとえば、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳ）の一方は、互いに対合されるように設計される必要があり、さらに、ドナー細胞に含まれる標的染色体の他のＲＲＳ（たとえば、第２のＲＲＳ）およびレシピエント細胞に含まれる標的染色体の２つのＲＲＳ（たとえば、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳ）の他方は、互いに対合されるように設計される必要がある。

【0285】

会合は、ドナー細胞に含まれる標的染色体に存在するＡＳＣＥとレシピエント細胞に含まれる標的染色体に存在するＡＳＣＥとの相補的結合であってもよい。

【0286】

ステップｉ）において、標的細胞、すなわちドナー細胞およびレシピエント細胞が作製されてもよい。

【0287】

以下に説明する方法に従って、ドナー細胞およびレシピエント細胞は、独立して作製されてもよい。

【0288】

「標的細胞」は、１つまたは複数の標的染色体を含む細胞である、供給源細胞の１つの種類を意味する。

【0289】

標的細胞は、少なくとも１つの標的染色体を含んでもよい。

【0290】

標的細胞は、１つまたは複数の天然の染色体を含んでもよい。

【0291】

標的染色体の説明は、上述のとおりである。

【0292】

天然の染色体の説明は、上述のとおりである。

【0293】

標的細胞は、ヒト細胞に由来してもよい。標的細胞は、非ヒト細胞に由来してもよい。たとえば、非ヒト細胞は、マウス細胞、ラット細胞、げっ歯類細胞、ゴーラル細胞、ウシ細胞、または有蹄動物細胞に由来してもよいが、本発明はそれらに限定されない。

【0294】

標的細胞は、体細胞に由来してもよい。たとえば、体細胞は、たとえば線維芽細胞であってもよいが、本発明はそれらに限定されない。

【0295】

標的細胞は、免疫細胞に由来してもよい。たとえば、免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、好塩基球、または好酸球であってもよいが、本発明はそれらに限定されない。

【0296】

標的細胞は、生殖細胞に由来してもよい。たとえば、標的細胞は、精子、精母細胞、精原幹細胞、卵子、卵母細胞、卵原幹細胞、または受精卵であってもよいが、本発明はそれらに限定されない。

【0297】

標的細胞は、幹細胞に由来してもよい。たとえば、幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、成体幹細胞、臍帯血幹細胞、精原幹細胞、または卵原幹細胞に由来してもよいが、本発明はそれらに限定されない。

【0298】

標的細胞は、天然の染色体、および／または標的染色体を作製する目的以外での人工的な修飾を有する染色体を含む細胞から作製されてもよい。

【0299】

天然の染色体、および／または標的染色体を作製する目的以外での人工的な修飾を有する染色体を含む細胞は、供給源細胞の１つの種類であり、供給源細胞の説明は上述のとおりである。天然の染色体、および／または標的染色体を作製する目的以外での人工的な修飾を有する染色体を含む細胞は、非標的供給源細胞として以下に開示されており、天然の染色体、および／または標的染色体を作製する目的以外での人工的な修飾を有する染色体は、非標的供給源染色体として以下に開示される。

【0300】

標的細胞は、非標的供給源細胞から作製されてもよい。

【0301】

たとえば、第１の標的細胞は、第１の非標的供給源細胞から作製されてもよい。第１の標的細胞は、第１の非標的供給源細胞に含まれる１つおよび／または２つ以上の非標的供給源染色体の、標的染色体との置換によって作製されてもよい。

【0302】

たとえば、第２の標的細胞は、第２の非標的供給源細胞から作製されてもよい。第２の標的細胞は、第２の非標的供給源細胞に含まれる１つおよび／または２つ以上の非標的供給源染色体の、標的染色体との置換によって作製されてもよい。

【0303】

標的細胞は、非標的供給源細胞にドナーＤＮＡを提供することによって作製されてもよい。

【0304】

ドナーＤＮＡは、少なくとも１つのＲＲＳ、および非標的供給源染色体に対する少なくとも１つの相同腕を含んでもよい。

【0305】

たとえば、ドナーＤＮＡは、表１に開示されるＬｏｘＰバリアントのうちいずれか１つ、および非標的供給源染色体に対する相同腕を含む配列であってもよい。

【0306】

ドナーＤＮＡは、少なくとも１つのＡＳＣＥ、および非標的供給源染色体に対する少なくとも１つの相同腕を含む配列であってもよい。

【0307】

ドナーＤＮＡは、選択マーカー遺伝子をさらに含んでもよい。ドナーＤＮＡには、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子が存在する。選択マーカー遺伝子は、蛍光性タンパク質遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、ＦＩＳＨ標的配列、またはそれらの逆位の遺伝子であってもよい。蛍光性タンパク質遺伝子およびそれの逆位の遺伝子は、公知の配列であってもよい。たとえば、蛍光性タンパク質遺伝子は、ＧＦＰ遺伝子、ＹＦＰ遺伝子、ＲＦＰ遺伝子、およびｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子のうち、いずれか１つまたは複数であってもよいが、本発明はそれらに限定されない。抗生物質耐性遺伝子およびそれの逆位の遺伝子は、公知の配列であってもよい。たとえば、抗生物質耐性遺伝子は、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、およびｐｕｒｏΔＴＫ遺伝子のうち、いずれか１つまたは複数であってもよいが、本発明はそれらに限定されない。ＦＩＳＨ標的配列およびそれの逆位の遺伝子は、公知の配列であってもよい。

【0308】

ドナーＤＮＡは、トランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。トランスポゾンは、ピギーバックであってもよい。たとえば、トランスポゾンＩＴＲ配列は、表２に列挙されるピギーバック右（３'）ＩＴＲ配列、および／またはピギーバック左（５'）ＩＴＲ配列であってもよい。トランスポゾンＩＴＲはトランスポゾン末端反復（ＴＲ）配列を含んでもよい。たとえば、トランスポゾンＩＴＲ配列は、ピギーバック末端反復（ＰＢ－ＴＲ）含んでもよい。

【0309】

たとえば、ドナーＤＮＡは、非標的供給源染色体に対する相同腕に隣接する位置にトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。

【0310】

たとえば、ドナーＤＮＡは、ＲＲＳまたはＡＳＣＥに隣接する位置にトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。

【0311】

ドナーＤＮＡは、公知のトランスフェクション法を用いて非標的供給源細胞に提供されてもよい。たとえば、トランスフェクション法では、ウイルス性トランスフェクション法、試薬トランスフェクション法、または物理的トランスフェクション法を用いてもよい。ウイルス性トランスフェクション法では、たとえば、レンチウイルスを使用してもよい。試薬トランスフェクション法では、たとえば、リン酸カルシウム、カチオン性脂質、ＤＥＡＥ－デキストラン、またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用してもよい。物理的トランスフェクション法では、たとえば、エレクトロポレーションを使用してもよい。さらに、トランスフェクション法では、リポソームを使用してもよいが、本発明はそれらに限定されない。

【0312】

ドナーＤＮＡは、非標的供給源染色体の標的配列に挿入されてもよい。

【0313】

標的配列は、ＲＲＳまたはＡＳＣＥ挿入のために提供される非標的供給源染色体上の配列であってもよく、配列は、遺伝子座位および／または非遺伝子配列である。標的配列は、ｉｎｓｉｌｉｃｏ設計によって決定されてもよい。

【0314】

一例において、ＲＲＳまたはＡＳＣＥは、非標的供給源染色体に存在する標的遺伝子の上流に挿入されてもよい。したがって、ＲＲＳまたはＡＳＣＥを提供するドナーＤＮＡは、標的遺伝子の上流にある１つの領域に対する相同腕を含んでもよい。

【0315】

一例において、ＲＲＳまたはＡＳＣＥは、非標的供給源染色体に存在する標的遺伝子の下流に挿入されてもよい。したがって、ＲＲＳまたはＡＳＣＥを提供するドナーＤＮＡは、標的遺伝子の下流にある１つの領域に対する相同腕を含んでもよい。

【0316】

ドナーＤＮＡは、相同組換えによって非標的供給源染色体の標的配列に挿入されてもよい。

【0317】

相同組換えを標的配列に対して実施するために、ＳＳＢおよび／またはＤＳＢを生成するステップが含まれてもよい。ＳＳＢおよび／またはＤＳＢは、天然に生じてもよい。ＳＳＢおよび／またはＤＳＢは、染色体切断物質（染色体における異常の原因となる物質）によって生じさせてもよい。染色体切断物質は、電離放射線、ＵＶ、Ｘ線、γ線、反応性酸素種、または特定の化学物質であってもよい。特定の化学物質は、たとえば、ブレオマイシン、ヒドロキシウレア、カンプトテシン、４－ニトロキノリン１－酸化物（４－ＮＱＯ）、シスプラチン、またはＥＭＳまたはＭＭＳなどのメチル化剤であってもよいが、本発明はそれらに限定されない。ＳＳＢおよび／またはＤＳＢは、操作されたヌクレアーゼによって生じさせてもよい。たとえば、ＳＳＢおよび／またはＤＳＢは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）のうち、いずれか１つまたは複数によって生じさせてもよい。

【0318】

上で説明される方法によって作製される標的細胞は、少なくとも１つの標的染色体を含んでもよい。

【0319】

ここで、標的染色体は、ドナーＤＮＡの組成に従って、様々な仕方で生成されてもよい。

【0320】

一例において、ドナーＤＮＡが単一のＲＲＳを含む場合、標的染色体は、単一のＲＲＳを含む標的染色体であってもよい。

【0321】

別の例において、ドナーＤＮＡが２つ以上のＲＲＳを含む場合、標的染色体は、２つ以上のＲＲＳを含む標的染色体であってもよい。

【0322】

さらに別の例において、ドナーＤＮＡが単一のＲＲＳおよび選択マーカー遺伝子を含む場合、標的染色体は、単一のＲＲＳおよび選択マーカー遺伝子を含む標的染色体であってもよい。

【0323】

さらに別の例において、ドナーＤＮＡが単一のＲＲＳおよびトランスポゾンＩＴＲ配列を含む場合、標的染色体は、単一のＲＲＳおよびトランスポゾンＩＴＲ配列を含む標的染色体であってもよい。

【0324】

さらに別の例において、ドナーＤＮＡが単一のＲＲＳ、選択マーカー遺伝子、およびトランスポゾンＩＴＲ配列を含む場合、標的染色体は、単一のＲＲＳ、選択マーカー遺伝子、およびトランスポゾンＩＴＲ配列を含む標的染色体であってもよい。

【0325】

さらに別の例において、ドナーＤＮＡが２つ以上のＲＲＳ、選択マーカー遺伝子、およびトランスポゾンＩＴＲ配列を含む場合、標的染色体は、２つ以上のＲＲＳ、選択マーカー遺伝子、およびトランスポゾンＩＴＲ配列を含む標的染色体であってもよい。

【0326】

一例において、ドナーＤＮＡが単一のＡＳＣＥを含む場合、標的染色体は、単一のＡＳＣＥを含む標的染色体であってもよい。

【0327】

別の例において、ドナーＤＮＡが２つ以上のＡＳＣＥを含む場合、標的染色体は、２つ以上のＡＳＣＥを含む標的染色体であってもよい。

【0328】

さらに別の例において、ドナーＤＮＡが単一のＡＳＣＥおよび選択マーカー遺伝子を含む場合、標的染色体は、単一のＡＳＣＥおよび選択マーカー遺伝子を含む標的染色体であってもよい。

【0329】

さらに別の例において、ドナーＤＮＡが単一のＡＳＣＥおよびトランスポゾンＩＴＲ配列を含む場合、標的染色体は、単一のＡＳＣＥおよびトランスポゾンＩＴＲ配列を含む標的染色体であってもよい。

【0330】

さらに別の例において、ドナーＤＮＡが単一のＡＳＣＥ、選択マーカー遺伝子、およびトランスポゾンＩＴＲ配列を含む場合、標的染色体は、単一のＡＳＣＥ、選択マーカー遺伝子、およびトランスポゾンＩＴＲ配列を含む標的染色体であってもよい。

【0331】

さらに別の例において、ドナーＤＮＡが２つ以上のＡＳＣＥ、選択マーカー遺伝子、およびトランスポゾンＩＴＲ配列を含む場合、標的染色体は、２つ以上のＡＳＣＥ、選択マーカー遺伝子、およびトランスポゾンＩＴＲ配列を含む標的染色体であってもよい。
ｉ－１）単一のＲＲＳが挿入された染色体を含む細胞

【0332】

本明細書で開示される例示的な実施形態によれば、標的染色体を含む標的細胞、およびそれを作製する方法を提供することができる。標的染色体は、単一のＲＲＳを含んでもよい。

【0333】

単一のＲＲＳは、人工組換え染色体の生成において使用されるＲＲＳであってもよい。

【0334】

ＲＲＳおよび標的染色体の説明は、上述のとおりである。

【0335】

単一のＲＲＳを含む標的染色体を含む標的細胞は、ＲＲＳを含むドナーＤＮＡを非標的供給源細胞に提供することによって作製されてもよい。

【0336】

ドナーＤＮＡは、単一のＲＲＳ、および非標的供給源染色体に対する相同腕を有するドナーＤＮＡであってもよい。

【0337】

たとえば、ドナーＤＮＡは、表１に列挙されるＬｏｘＰバリアントのうちいずれか１つ、および非標的供給源染色体に対する相同腕を含む配列であってもよい。ここで、ＬｏｘＰバリアントは、人工組換え染色体の生成において使用されてもよい。

【0338】

ここで、ドナーＤＮＡは、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。選択マーカー遺伝子およびトランスポゾンＩＴＲ配列の説明は、上述のとおりである。

【0339】

ここで、ドナーＤＮＡは、追加のＲＲＳをさらに含んでもよい。ここで、追加のＲＲＳは、人工組換え染色体の生成において使用されないＲＲＳであってもよい。

【0340】

たとえば、ドナーＤＮＡは、表１に列挙されるＬｏｘＰバリアントのうちいずれか１つ、ＦＲＴ、トランスポゾンＩＴＲ、抗生物質耐性遺伝子、および非標的供給源染色体に対する相同腕を含む配列であってもよい。ここで、ＦＲＴおよびトランスポゾンＩＴＲは、人工組換え染色体の生成において使用されない追加のＲＲＳであるＲＲＳであってもよい。

【0341】

ドナーＤＮＡは、公知のトランスフェクション法を用いて非標的供給源細胞に提供されてもよい。トランスフェクション法の説明は、上述のとおりである。

【0342】

単一のＲＲＳを含む標的染色体を含む標的細胞は、非標的供給源細胞に提供されるドナーＤＮＡによって作製されてもよい。非標的供給源細胞に提供されるドナーＤＮＡは、非標的供給源染色体の標的配列に挿入され、標的染色体へと変えられてもよい。標的染色体を含む細胞は、標的細胞である。

【0343】

標的細胞を作製するために、単一のＲＲＳを有するドナーＤＮＡは、非標的供給源細胞にトランスフェクションされてもよい。

【0344】

ドナーＤＮＡは、単一のＲＲＳ、および非標的供給源染色体に対する相同腕を含んでもよい。

【0345】

単一のＲＲＳは、人工組換え染色体の生成において使用されるＲＲＳであってもよい。

【0346】

【0347】

【0348】

１つの例示的な実施形態において、１つの標的染色体を有する標的細胞は、１つのドナーＤＮＡを使用して作製されてもよい。

【0349】

ここで、標的細胞は、ドナー細胞であってもよい。

【0350】

ドナーＤＮＡは、表１に列挙されるＬｏｘＰバリアントから選択されるいずれか１つ、および非標的供給源染色体に対する相同腕を含む配列であってもよい。

【0351】

ここで、相同腕は、非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0352】

ドナーＤＮＡは、非標的供給源細胞に導入されてもよい。ここで、ドナーＤＮＡは、非標的供給源細胞に含まれる非標的供給源染色体に対する相同腕を有してもよい。

【0353】

【0354】

【0355】

標的染色体は、ドナーＤＮＡに含まれるＬｏｘＰバリアントを含んでもよい。

【0356】

ここで、標的染色体は、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。

【0357】

ここで、標的染色体は、追加のＲＲＳをさらに含んでもよい。

【0358】

ドナー細胞に対するレシピエント細胞は、１つのドナーＤＮＡを使用して作製されてもよい。ここで、ドナーＤＮＡは、ドナー細胞の作製において使用されるドナーＤＮＡに含まれるＬｏｘＰバリアントと対合され得るＬｏｘＰバリアント、および非標的供給源染色体に対する相同腕を含む配列であってもよい。

【0359】

別の例示的な実施形態において、２つ以上の標的染色体を有する標的細胞は、２つ以上のドナーＤＮＡを使用して作製されてもよい。

【0360】

ここで、標的細胞は、ドナー細胞であってもよい。

【0361】

２つ以上のドナーＤＮＡは、第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡを含んでもよい。

【0362】

第１のドナーＤＮＡは、表１に列挙されるＬｏｘＰバリアントから選択される１つ、および第１の非標的供給源染色体に対する相同腕を含む配列であってもよい。ここで、相同腕は、第１の非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0363】

第２のドナーＤＮＡは、表１に列挙されるＬｏｘＰバリアントから選択される１つ、および第２の非標的供給源染色体に対する相同腕を含む配列であってもよい。ここで、相同腕は、第２の非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0364】

第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡは、非標的供給源細胞に導入されてもよい。ここで、第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡはそれぞれ、非標的供給源細胞に含まれる第１の非標的供給源染色体および第２の非標的染色体に対する相同腕を有してもよい。

【0365】

ここで、第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡの各々は、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。選択マーカー遺伝子およびトランスポゾンＩＴＲ配列の説明は、上述のとおりである。

【0366】

ここで、第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡの各々は、追加のＲＲＳをさらに含んでもよい。ここで、追加のＲＲＳは、人工組換え染色体の生成において使用されないＲＲＳであってもよい。

【0367】

２つ以上の標的染色体は、第１の標的染色体および第２の標的染色体を含んでもよい。

【0368】

ここで、第１の標的染色体は、第１のドナーＤＮＡに含まれるＬｏｘＰバリアントを含んでもよい。

【0369】

ここで、第２の標的染色体は、第２のドナーＤＮＡに含まれるＬｏｘＰバリアントを含んでもよい。

【0370】

ここで、第１のドナーＤＮＡに含まれるＬｏｘＰバリアントは、第２のドナーＤＮＡに含まれるＬｏｘＰバリアントと同じであっても異なっていてもよい。

【0371】

ここで、第１の標的染色体および第２の標的染色体の各々は、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。

【0372】

ここで、第１の標的染色体および第２の標的染色体の各々は、追加のＲＲＳをさらに含んでもよい。

【0373】

ドナー細胞に対するレシピエント細胞は、２つ以上のドナーＤＮＡ（第３のドナーＤＮＡおよび第４のドナーＤＮＡ）を使用して作製されてもよい。ここで、第３のドナーＤＮＡは、ドナー細胞の作製において使用される第１のドナーＤＮＡに含まれるＬｏｘＰバリアントと対合され得るＬｏｘＰバリアント、および非標的供給源染色体に対する相同腕を含む配列であってもよい。ここで、第４のドナーＤＮＡは、ドナー細胞の作製において使用される第２のドナーＤＮＡに含まれるＬｏｘＰバリアントと対合され得るＬｏｘＰバリアント、および非標的供給源染色体に対する相同腕を含む配列であってもよい。

【0374】

２つ以上の異なる標的細胞を作製するために、第１のＲＲＳを有する第１のドナーＤＮＡは、第１の非標的供給源細胞にトランスフェクションされてもよい。さらに、第２のＲＲＳを有する第２のドナーＤＮＡは、第２の非標的供給源細胞にトランスフェクションされてもよい。

【0375】

単一のＲＲＳは、人工組換え染色体の生成において使用されるＲＲＳであってもよい。

【0376】

第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡの各々は、非標的供給源染色体に対する相同腕を含んでもよい。

【0377】

ここで、第１のドナーＤＮＡは、第１のＲＲＳ、および第１の非標的供給源染色体に対する相同腕を有してもよい。相同腕は、第１の非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0378】

第２のドナーＤＮＡは、第２のＲＲＳ、および第２の非標的供給源染色体に対する相同腕を有してもよい。相同腕は、第２の非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0379】

【0380】

【0381】

１つの例示的な実施形態において、２つ以上の標的細胞は、２つ以上のドナーＤＮＡを使用して作製されてもよい。

【0382】

２つ以上のドナーＤＮＡは、第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡを含んでもよい。

【0383】

第１のドナーＤＮＡは、表１に列挙されるＬｏｘＰバリアントから選択されるいずれか１つ、および第１の非標的供給源染色体に対する相同腕を含む配列であってもよい。ここで、相同腕は、第１の非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0384】

第２のドナーＤＮＡは、表１に列挙されるＬｏｘＰバリアントから選択される１つ、および第２の非標的供給源染色体に対する相同腕を含む配列であってもよい。ここで、相同腕は、第２の非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。ここで、選択されたＬｏｘＰバリアントは、第１のドナーＤＮＡに含まれるＬｏｘＰバリアントと対合されてもよい。

【0385】

【0386】

【0387】

第１のドナーＤＮＡは、第１の非標的供給源細胞に導入されてもよい。第２のドナーＤＮＡは、第２の非標的供給源細胞に導入されてもよい。ここで、第１のドナーＤＮＡは、第１の非標的供給源細胞に含まれる第１の非標的供給源染色体に対する相同腕を有してもよい。第２のドナーＤＮＡは、第２の非標的供給源細胞に含まれる第２の非標的供給源染色体に対する相同腕を有してもよい。

【0388】

２つ以上の標的細胞は、第１の標的細胞および第２の標的細胞を含んでもよい。

【0389】

ここで、第１の標的細胞は、ドナー細胞であってもよく、第２の標的細胞は、レシピエント細胞であってもよい。

【0390】

ここで、第１の標的細胞は、第１のドナーＤＮＡに含まれるＬｏｘＰバリアントを含む第１の標的染色体を含んでもよい。

【0391】

ここで、第２の標的細胞は、第２のドナーＤＮＡに含まれるＬｏｘＰバリアントを含む第２の標的染色体を含んでもよい。

【0392】

【0393】

ここで、第１のドナーＤＮＡに含まれるＬｏｘＰバリアントは、第２のドナーＤＮＡに含まれるＬｏｘＰバリアントと対合されてもよい。

【0394】

【0395】

ここで、第１の標的染色体および第２の標的染色体の各々は、追加のＲＲＳをさらに含んでもよい。
ｉ－２）２つのＲＲＳが挿入された染色体を含む細胞

【0396】

本明細書で開示される別の例示的な実施形態によれば、標的染色体を含む標的細胞、およびそれを作製する方法を提供することができる。標的染色体は、２つ以上のＲＲＳを含んでもよい。

【0397】

２つ以上のＲＲＳは、人工組換え染色体の生成において使用されるＲＲＳであってもよい。

【0398】

ＲＲＳおよび標的染色体の説明は、上述のとおりである。

【0399】

２つ以上のＲＲＳを含む標的染色体を含む標的細胞は、ＲＲＳを有するドナーＤＮＡを非標的供給源細胞に提供することによって作製されてもよい。

【0400】

【0401】

２つ以上のＲＲＳを含む標的染色体を含む標的細胞は、非標的供給源細胞に提供されるドナーＤＮＡによって作製されてもよい。非標的供給源細胞に提供されるドナーＤＮＡは、非標的供給源染色体の標的配列に挿入され、標的染色体へと変えられてもよい。標的染色体を含む細胞は、標的細胞であってもよい。

【0402】

標的細胞を作製するために、２つ以上のＲＲＳを有するドナーＤＮＡは、非標的供給源細胞にトランスフェクションされてもよい。

【0403】

２つ以上のＲＲＳは、人工組換え染色体の生成において使用されるＲＲＳであってもよい。

【0404】

ドナーＤＮＡは、２つ以上のＲＲＳ、および非標的供給源染色体に対する相同腕を含んでもよい。

【0405】

【0406】

【0407】

１つの例示的な実施形態において、１つの標的染色体を有する標的細胞は、１つのドナーＤＮＡを使用して作製されてもよい。

【0408】

ここで、標的細胞は、ドナー細胞であってもよい。

【0409】

ドナーＤＮＡは、２つ以上のＲＲＳを含んでもよい。

【0410】

２つ以上のＲＲＳは、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳを含んでもよい。

【0411】

ここで、第１のＲＲＳは、表１に列挙されるＬｏｘＰバリアントから選択されてもよい。

【0412】

ここで、第２のＲＲＳは、表１に列挙されるＬｏｘＰバリアントから選択されてもよい。

【0413】

ここで、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳは、同じであっても、互いと異なっていてもよい。

【0414】

ドナーＤＮＡは、非標的供給源染色体に対する２つ以上の相同腕を含む配列を含んでもよい。

【0415】

２つ以上の相同腕は、第１の相同腕および第２の相同腕を含んでもよい。

【0416】

ここで、第１の相同腕は、非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0417】

ここで、第２の相同腕は、非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0418】

ここで、第１の相同腕は、第２の相同腕とは異なる配列を有してもよい。

【0419】

ドナーＤＮＡは、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。選択マーカー遺伝子およびトランスポゾンＩＴＲ配列の説明は、上述のとおりである。

【0420】

【0421】

ドナーＤＮＡは、非標的供給源細胞に導入されてもよい。ここで、ドナーＤＮＡは、非標的供給源細胞に含まれる非標的供給源染色体に対する２つ以上の相同腕を有してもよい。

【0422】

標的染色体は、ドナーＤＮＡに含まれる、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳを含んでもよい。

【0423】

ここで、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳは、同じであっても、互いと異なっていてもよい。

【0424】

標的染色体は、２つ以上のＬｏｘＰバリアントを含んでもよい。

【0425】

ここで、標的染色体は、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。

【0426】

ここで、標的染色体は、追加のＲＲＳをさらに含んでもよい。

【0427】

ドナー細胞に対するレシピエント細胞は、１つまたは複数のドナーＤＮＡを使用して作製されてもよい。ここで、ドナーＤＮＡは、ドナー細胞の作製において使用されるドナーＤＮＡに含まれる第１のＲＲＳと対合され得る第３のＲＲＳ、および非標的供給源染色体に対する相同腕を含む配列であってもよい。さらに、ドナーＤＮＡは、ドナー細胞の作製において使用されるドナーＤＮＡに含まれる第２のＲＲＳと対合され得る第４のＲＲＳ、および非標的供給源染色体に対する相同腕を含む配列であってもよい。

【0428】

別の例示的な実施形態において、１つの標的染色体を有する標的細胞は、２つ以上のドナーＤＮＡを使用して作製されてもよい。

【0429】

ここで、標的細胞は、ドナー細胞であってもよい。

【0430】

２つ以上のドナーＤＮＡは、第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡを含んでもよい。

【0431】

第１のドナーＤＮＡは、表１に列挙されるＬｏｘＰバリアントから選択される１つ、および非標的供給源染色体に対する第１の相同腕を含む配列であってもよい。

【0432】

第２のドナーＤＮＡは、表１に列挙されるＬｏｘＰバリアントから選択される１つ、および非標的供給源染色体に対する第２の相同腕を含む配列であってもよい。

【0433】

ここで、第１の相同腕は、非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0434】

ここで、第２の相同腕は、非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0435】

ここで、第１の相同腕は、第２の相同腕とは異なる配列を有してもよい。

【0436】

第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡの各々は、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。選択マーカー遺伝子およびトランスポゾンＩＴＲ配列の説明は、上述のとおりである。

【0437】

第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡの各々は、追加のＲＲＳをさらに含んでもよい。ここで、追加のＲＲＳは、人工組換え染色体の生成において使用されないＲＲＳであってもよい。

【0438】

第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡは、非標的供給源細胞に導入されてもよい。ここで、第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡの各々は、非標的供給源細胞に含まれる非標的供給源染色体に対する相同腕を有してもよい。

【0439】

標的染色体は、２つ以上のＬｏｘＰバリアントを含んでもよい。

【0440】

ここで、２つ以上のＬｏｘＰバリアントのうち一方は、第１のドナーＤＮＡに含まれるＬｏｘＰバリアントであってもよい。２つ以上のＬｏｘＰバリアントのうち他方は、第２のドナーＤＮＡに含まれるＬｏｘＰバリアントであってもよい。

【0441】

【0442】

標的染色体は、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。

【0443】

ここで、標的染色体は、追加のＲＲＳをさらに含んでもよい。

【0444】

【0445】

さらに別の例示的な実施形態において、２つ以上の標的染色体を有する標的細胞は、２つ以上のドナーＤＮＡを使用して作製されてもよい。

【0446】

ここで、標的細胞は、ドナー細胞であってもよい。

【0447】

２つ以上のドナーＤＮＡは、第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡを含んでもよい。

【0448】

第１のドナーＤＮＡは、２つ以上のＲＲＳを含んでもよい。ここで、２つ以上のＲＲＳは、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳを含んでもよい。

【0449】

第２のドナーＤＮＡは、２つ以上のＲＲＳを含んでもよい。ここで、２つ以上のＲＲＳは、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳを含んでもよい。

【0450】

ここで、第１のＲＲＳは、表１に列挙されるＬｏｘＰバリアントから選択されてもよい。

【0451】

ここで、第２のＲＲＳは、表１に列挙されるＬｏｘＰバリアントから選択されてもよい。

【0452】

ここで、第３のＲＲＳは、表１に列挙されるＬｏｘＰバリアントから選択されてもよい。

【0453】

ここで、第４のＲＲＳは、表１に列挙されるＬｏｘＰバリアントから選択されてもよい。

【0454】

ここで、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳのすべては、同じであっても、互いと異なっていてもよい。代替的には、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳは、部分的に同じであっても、互いと異なっていてもよい。たとえば、第１のＲＲＳおよび第３のＲＲＳは同じであってもよく、第２のＲＲＳおよび第４のＲＲＳは第１のＲＲＳと異なっていてもよい。代替的には、第１のＲＲＳおよび第４のＲＲＳは同じであってもよく、第２のＲＲSおよび第３のＲＲＳは同じであってもよい。代替的には、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳのすべてが、互いと異なっていてもよい。代替的には、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳのすべてが、同じであってもよい。

【0455】

第１のドナーＤＮＡは、第１の非標的供給源染色体に対する２つ以上の相同腕を含む配列を含んでもよい。ここで、２つ以上の相同腕は、第１の相同腕および第２の相同腕を含んでもよい。

【0456】

ここで、第１の相同腕は、第１の非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0457】

ここで、第２の相同腕は、第１の非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0458】

ここで、第１の相同腕は、第２の相同腕とは異なる配列を有してもよい。

【0459】

第２のドナーＤＮＡは、第２の非標的供給源染色体に対する２つ以上の相同腕を含む配列を含んでもよい。ここで、２つ以上の相同腕は、第３の相同腕および第４の相同腕を含んでもよい。

【0460】

ここで、第３の相同腕は、第２の非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0461】

ここで、第４の相同腕は、第２の非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0462】

ここで、第３の相同腕は、第４の相同腕とは異なる配列を有してもよい。

【0463】

【0464】

【0465】

第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡは、非標的供給源細胞に導入されてもよい。ここで、第１のドナーＤＮＡは、非標的供給源細胞に含まれる第１の非標的供給源染色体に対する相同腕を有してもよい。第２のドナーＤＮＡは、非標的供給源細胞に含まれる第２の非標的供給源染色体に対する相同腕を有してもよい。

【0466】

２つ以上の標的染色体は、第１の標的染色体および第２の標的染色体を含んでもよい。

【0467】

ここで、第１の標的染色体は、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳを含んでもよい。ここで、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳは、同じであっても、互いと異なっていてもよい。

【0468】

ここで、第２の標的染色体は、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳを含んでもよい。ここで、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳは、同じであっても、互いと異なっていてもよい。

【0469】

第１の標的染色体は、２つ以上のＬｏｘＰバリアントを含んでもよい。

【0470】

第２の標的染色体は、２つ以上のＬｏｘＰバリアントを含んでもよい。

【0471】

【0472】

ここで、第１の標的染色体および第２の標的染色体の各々は、追加のＲＲＳをさらに含んでもよい。

【0473】

ドナー細胞に対するレシピエント細胞は、２つ以上のドナーＤＮＡ（第３のドナーＤＮＡおよび第４のドナーＤＮＡ）を使用して作製されてもよい。ここで、第３のドナーＤＮＡは、ドナー細胞の作製において使用される第１のドナーＤＮＡに含まれる第１および第２のＲＲＳそれぞれと対合され得る第５のＲＲＳおよび第６のＲＲＳ、および非標的供給源染色体に対する相同腕を含む配列であってもよい。ここで、第４のドナーＤＮＡは、ドナー細胞の作製において使用される第２のドナーＤＮＡに含まれる第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳそれぞれと対合され得る第７のＲＲＳおよび第８のＲＲＳ、および非標的供給源染色体に対する相同腕を含む配列であってもよい。

【0474】

２つ以上の異なる標的細胞を作製するために、２つ以上のＲＲＳを有する第１のドナーＤＮＡは、第１の非標的供給源細胞にトランスフェクションされてもよい。さらに、２つ以上のＲＲＳを有する第２のドナーＤＮＡは、第２の非標的供給源細胞にトランスフェクションされてもよい。

【0475】

２つ以上のＲＲＳは、人工組換え染色体の生成において使用されるＲＲＳであってもよい。

【0476】

第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡの各々は、非標的供給源染色体に対する相同腕を含んでもよい。

【0477】

第１のドナーＤＮＡは、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、および第１の非標的供給源染色体に対する相同腕を有してもよい。

【0478】

第２のドナーＤＮＡは、第３のＲＲＳ、第４のＲＲＳ、および第２の非標的供給源染色体に対する相同腕を有してもよい。

【0479】

【0480】

【0481】

１つの例示的な実施形態において、２つ以上の標的細胞は、２つ以上のドナーＤＮＡを使用して作製されてもよい。

【0482】

２つ以上のドナーＤＮＡは、第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡを含んでもよい。

【0483】

第１のドナーＤＮＡは、２つ以上のＲＲＳを含んでもよい。ここで、２つ以上のＲＲＳは、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳを含んでもよい。

【0484】

第２のドナーＤＮＡは、２つ以上のＲＲＳを含んでもよい。ここで、２つ以上のＲＲＳは、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳを含んでもよい。

【0485】

ここで、第１のＲＲＳは、表１に列挙されるＬｏｘＰバリアントから選択されてもよい。

【0486】

ここで、第２のＲＲＳは、表１に列挙されるＬｏｘＰバリアントから選択されてもよい。

【0487】

ここで、第３のＲＲＳは、表１に列挙されるＬｏｘＰバリアントから選択されてもよい。

【0488】

ここで、第４のＲＲＳは、表１に列挙されるＬｏｘＰバリアントから選択されてもよい。

【0489】

ここで、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳのすべては、同じであっても、互いと異なっていてもよい。代替的には、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳのすべては、部分的に同じであっても、互いと異なっていてもよい。たとえば、第１のＲＲＳおよび第４のＲＲＳは同じであってもよく、第２のＲＲＳおよび第３のＲＲＳは第１のＲＲＳと異なっていてもよい。代替的には、第２のＲＲＳおよび第４のＲＲＳは同じであってもよく、第１のＲＲＳおよび第３のＲＲＳは同じであってもよい。代替的には、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳのすべてが、互いと異なっていてもよい。代替的には、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳのすべてが、同じであってもよい。

【0490】

【0491】

ここで、第１の相同腕は、第１の非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0492】

ここで、第２の相同腕は、第１の非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0493】

ここで、第１の相同腕は、第２の相同腕とは異なる配列であってもよい。

【0494】

【0495】

ここで、第３の相同腕は、第２の非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0496】

ここで、第４の相同腕は、第２の非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0497】

ここで、第３の相同腕は、第４の相同腕とは異なる配列を有してもよい。

【0498】

【0499】

ここで、第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡの各々は、追加のＲＲＳを含んでもよい。ここで、追加のＲＲＳは、人工組換え染色体の生成において使用されないＲＲＳであってもよい。

【0500】

【0501】

２つ以上の標的細胞は、第１の標的細胞および第２の標的細胞を含んでもよい。

【0502】

ここで、第１の標的細胞は、ドナー細胞であってもよく、第２の標的細胞は、レシピエント細胞であってもよい。

【0503】

ここで、第１の標的細胞は、第１および第２のＲＲＳを含む第１の標的染色体を含んでもよい。

【0504】

ここで、第２の標的細胞は、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳを含む第２の標的染色体を含んでもよい。第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳのうち一方と対合されてもよく、第４のＲＲＳは、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳの他方と対合されてもよい。

【0505】

【0506】

ここで、第１の標的染色体および第２の標的染色体の各々は、追加のＲＲＳをさらに含んでもよい。
ｉ－３）単一のＡＳＣＥが挿入された染色体を含む細胞

【0507】

本明細書で開示される例示的な実施形態によれば、標的染色体を含む標的細胞、およびそれを作製する方法を提供することができる。標的染色体は、単一のＡＳＣＥを含んでもよい。

【0508】

ＡＳＣＥおよび標的染色体の説明は、上述のとおりである。

【0509】

単一のＡＳＣＥを含む標的染色体を含む標的細胞は、ＡＳＣＥを有するドナーＤＮＡを非標的供給源細胞に提供することによって作製されてもよい。

【0510】

【0511】

単一のＡＳＣＥを有する標的染色体を含む標的細胞は、非標的供給源細胞に提供されるドナーＤＮＡを使用して作製されてもよい。非標的供給源細胞に提供されるドナーＤＮＡは、非標的供給源染色体の標的配列に挿入され、標的染色体へと変えられてもよい。標的染色体を含む細胞は、標的細胞である。

【0512】

標的細胞を作製するために、単一のＡＳＣＥを有するドナーＤＮＡは、非標的供給源細胞にトランスフェクションされてもよい。

【0513】

ドナーＤＮＡは、単一のＡＳＣＥ、および非標的供給源染色体に対する相同腕を含んでもよい。

【0514】

単一のＡＳＣＥは、人工組換え染色体の生成において使用されるＡＳＣＥであってもよい。

【0515】

【0516】

【0517】

１つの例示的な実施形態において、１つの標的染色体を有する標的細胞は、１つのドナーＤＮＡを使用して作製されてもよい。

【0518】

ドナーＤＮＡは、単一のＡＳＣＥ、および非標的供給源染色体に対する相同腕を含む配列であってもよい。

【0519】

【0520】

【0521】

【0522】

標的染色体は、ドナーＤＮＡに含まれる単一のＡＳＣＥを含んでもよい。

【0523】

ここで、標的染色体は、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。

【0524】

ここで、標的染色体は、追加のＲＲＳをさらに含んでもよい。

【0525】

別の１つの例示的な実施形態において、２つ以上の標的染色体を有する標的細胞は、２つ以上のドナーＤＮＡを使用して作製されてもよい。

【0526】

２つ以上のドナーＤＮＡは、第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡを含んでもよい。

【0527】

第１のドナーＤＮＡは、第１のＡＳＣＥ、および第１の非標的供給源染色体に対する相同腕を含む配列であってもよい。ここで、相同腕は、第１の非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0528】

第２のドナーＤＮＡは、第２のＡＳＣＥ、および第２の非標的供給源染色体に対する相同腕を含む配列であってもよい。ここで、相同腕は、第２の非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0529】

ここで、第１のＡＳＣＥは、第２のＡＳＣＥと同じであっても、異なっていてもよい。

【0530】

第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡの各々は、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾンＩＴＲをさらに含んでもよい。選択マーカー遺伝子およびトランスポゾンＩＴＲ配列の説明は、上述のとおりである。

【0531】

【0532】

第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡは、非標的供給源細胞に導入されてもよい。ここで、第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡの各々は、非標的供給源細胞に含まれる第１の非標的供給源染色体および第２の非標的供給源染色体に対するそれぞれの相同腕を有してもよい。

【0533】

２つ以上の標的染色体は、第１の標的染色体および第２の標的染色体を含んでもよい。

【0534】

ここで、第１の標的染色体は、第１のＡＳＣＥを含んでもよい。

【0535】

ここで、第２の標的染色体は、第２のＡＳＣＥを含んでもよい。

【0536】

【0537】

ここで、第１の標的染色体および第２の標的染色体の各々は、追加のＲＲＳをさらに含んでもよい。

【0538】

２つ以上の異なる標的細胞を作製するために、第１のＡＳＣＥを有する第１のドナーＤＮＡは、第１の非標的供給源細胞にトランスフェクションされてもよい。さらに、第２のＡＳＣＥを有する第２のドナーＤＮＡは、第２の非標的供給源細胞にトランスフェクションされてもよい。

【0539】

第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡの各々は、非標的供給源染色体に対する相同腕を含んでもよい。

【0540】

第１のドナーＤＮＡは、第１のＡＳＣＥ、および第１の非標的供給源染色体に対する相同腕を有してもよい。

【0541】

第２のドナーＤＮＡは、第２のＡＳＣＥ、および第２の非標的供給源染色体に対する相同腕を有してもよい。

【0542】

【0543】

【0544】

１つの例示的な実施形態において、２つ以上の標的細胞は、２つ以上のドナーＤＮＡを使用して作製されてもよい。

【0545】

２つ以上のドナーＤＮＡは、第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡを含んでもよい。

【0546】

【0547】

【0548】

ここで、第１のＡＳＣＥは、第２のＡＳＣＥと同じであっても、異なっていてもよい。

【0549】

【0550】

【0551】

第１のドナーＤＮＡは、第１の非標的供給源細胞に導入されてもよい。第２のドナーＤＮＡは、第２の非標的供給源細胞に導入されてもよい。ここで、第１のドナーＤＮＡは、第１の非標的供給源細胞中の第１の非標的供給源染色体に対する相同腕を有してもよい。第２のドナーＤＮＡは、第２の非標的供給源細胞中の第２の非標的供給源染色体に対する相同腕を有してもよい。

【0552】

２つ以上の標的細胞は、第１の標的細胞および第２の標的細胞を含んでもよい。

【0553】

ここで、第１の標的細胞は、第１のＡＳＣＥを有する第１の標的染色体を含んでもよい。

【0554】

ここで、第２の標的細胞は、第２のＡＳＣＥを有する第２の標的染色体を含んでもよい。

【0555】

【0556】

ここで、第１の標的染色体および第２の標的染色体は、追加のＲＲＳをさらに含んでもよい。
ｉ－４）二重のＡＳＣＥが挿入された染色体を含む細胞

【0557】

本明細書で開示される別の例示的な実施形態によれば、標的染色体を含む標的細胞、およびそれを作製する方法を提供することができる。標的染色体は、２つ以上のＡＳＣＥを含んでもよい。

【0558】

２つ以上のＡＳＣＥは、人工組換え染色体の生成において使用されるＡＳＣＥであってもよい。

【0559】

ＡＳＣＥおよび標的染色体の説明は、上述のとおりである。

【0560】

２つ以上のＡＳＣＥを有する標的染色体を含む標的細胞は、ＡＳＣＥを有するドナーＤＮＡを非標的供給源細胞に提供することによって作製されてもよい。

【0561】

【0562】

２つ以上のＡＳＣＥを有する標的染色体を含む標的細胞は、非標的供給源細胞に提供されるドナーＤＮＡを使用して作製されてもよい。非標的供給源細胞に提供されるドナーＤＮＡは、非標的供給源染色体の標的配列に挿入され、標的染色体へと変えられてもよい。標的染色体を含む細胞は、標的細胞である。

【0563】

標的細胞を作製するために、２つ以上のＡＳＣＥを有するドナーＤＮＡは、非標的供給源細胞にトランスフェクションされてもよい。

【0564】

ドナーＤＮＡは、２つ以上のＡＳＣＥ、および非標的供給源染色体に対する相同腕を含んでもよい。

【0565】

２つ以上のＡＳＣＥは、人工組換え染色体の生成において使用されるＡＳＣＥであってもよい。

【0566】

【0567】

【0568】

１つの例示的な実施形態において、１つの標的染色体を有する標的細胞は、１つのドナーＤＮＡを使用して作製されてもよい。

【0569】

ドナーＤＮＡは、２つ以上のＡＳＣＥを含んでもよい。

【0570】

２つ以上のＡＳＣＥは、第１のＡＳＣＥおよび第２のＡＳＣＥを含んでもよい。

【0571】

ここで、第１のＡＳＣＥおよび第２のＡＳＣＥは、同じであっても、互いと異なっていてもよい。

【0572】

ドナーＤＮＡは、非標的供給源染色体に対する２つ以上の相同腕を含む配列を含んでもよい。

【0573】

２つ以上の相同腕は、第１の相同腕および第２の相同腕を含んでもよい。

【0574】

ここで、第１の相同腕は、非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0575】

ここで、第２の相同腕は、非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0576】

ここで、第１の相同腕は、第２の相同腕とは異なる配列を有してもよい。

【0577】

【0578】

【0579】

【0580】

標的染色体は、ドナーＤＮＡに含まれる、第１のＡＳＣＥおよび第２のＡＳＣＥを含んでもよい。

【0581】

ここで、第１のＡＳＣＥおよび第２のＡＳＣＥは、同じであっても、互いと異なっていてもよい。

【0582】

標的染色体は、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。

【0583】

標的染色体は、追加のＲＲＳをさらに含んでもよい。

【0584】

別の例示的な実施形態において、１つの標的染色体を有する標的細胞は、２つ以上のドナーＤＮＡを使用して作製されてもよい。

【0585】

２つ以上のドナーＤＮＡは、第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡを含んでもよい。

【0586】

第１のドナーＤＮＡは、第１のＡＳＣＥ、および非標的供給源染色体に対する第１の相同腕を含む配列であってもよい。

【0587】

第２のドナーＤＮＡは、第２のＡＳＣＥ、および非標的供給源染色体に対する第２の相同腕を含む配列であってもよい。

【0588】

ここで、第１のＡＳＣＥおよび第２のＡＳＣＥは、同じであっても、互いと異なっていてもよい。

【0589】

ここで、第１の相同腕は、非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0590】

ここで、第２の相同腕は、非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0591】

ここで、第１の相同腕は、第２の相同腕とは異なる配列を有してもよい。

【0592】

【0593】

【0594】

【0595】

標的染色体は、２つ以上のＡＳＣＥを含んでもよい。

【0596】

ここで、２つ以上のＡＳＣＥのうち一方は、第１のドナーＤＮＡに含まれる第１のＡＳＣＥであってもよい。２つ以上のＡＳＣＥのうち他方は、第２のドナーＤＮＡに含まれる第２のＡＳＣＥであってもよい。

【0597】

標的染色体は、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。

【0598】

標的染色体は、追加のＲＲＳをさらに含んでもよい。

【0599】

さらに別の例示的な実施形態において、２つ以上の標的染色体を有する標的細胞は、２つ以上のドナーＤＮＡを使用して作製されてもよい。

【0600】

２つ以上のドナーＤＮＡは、第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡを含んでもよい。

【0601】

第１のドナーＤＮＡは、２つ以上のＡＳＣＥを含んでもよい。２つ以上のＡＳＣＥは、第１のＡＳＣＥおよび第２のＡＳＣＥを含んでもよい。

【0602】

第２のドナーＤＮＡは、２つ以上のＡＳＣＥを含んでもよい。ここで、２つ以上のＡＳＣＥは、第３のＡＳＣＥおよび第４のＡＳＣＥを含んでもよい。

【0603】

ここで、第１のＡＳＣＥ、第２のＡＳＣＥ、第３のＡＳＣＥ、および第４のＡＳＣＥのすべては、同じであっても、互いと異なっていてもよい。代替的には、第１のＡＳＣＥ、第２のＡＳＣＥ、第３のＡＳＣＥ、および第４のＡＳＣＥは、部分的に同じであっても、互いと異なっていてもよい。たとえば、第１のＡＳＣＥおよび第３のＡＳＣＥは同じであってもよく、第２のＡＳＣＥおよび第４のＡＳＣＥは第１のＡＳＣＥと異なっていてもよい。代替的には、第１のＡＳＣＥおよび第４のＡＳＣＥは同じであってもよく、第２のＡＳＣＥおよび第３のＡＳＣＥは同じであってもよい。代替的には、第１のＡＳＣＥ、第２のＡＳＣＥ、第３のＡＳＣＥ、および第４のＡＳＣＥのすべてが、互いと異なっていてもよい。代替的には、第１のＡＳＣＥ、第２のＡＳＣＥ、第３のＡＳＣＥ、および第４のＡＳＣＥのすべてが、同じであってもよい。

【0604】

【0605】

ここで、第１の相同腕は、第１の非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0606】

ここで、第２の相同腕は、第１の非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0607】

ここで、第１の相同腕は、第２の相同腕とは異なる配列を有してもよい。

【0608】

【0609】

ここで、第３の相同腕は、第２の非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0610】

ここで、第４の相同腕は、第２の非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0611】

ここで、第３の相同腕は、第４の相同腕とは異なる配列を有してもよい。

【0612】

【0613】

【0614】

第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡは、非標的供給源細胞に導入されてもよい。ここで第１のドナーＤＮＡは、非標的供給源細胞に含まれる第１の非標的供給源染色体に対する相同腕を有してもよい。第２のドナーＤＮＡは、非標的供給源細胞に含まれる第２の非標的染色体に対する相同腕を有してもよい。

【0615】

２つ以上の標的染色体は、第１の標的染色体および第２の標的染色体を含んでもよい。

【0616】

ここで、第１の標的染色体は、第１のＡＳＣＥおよび第２のＡＳＣＥを含んでもよい。ここで、第１のＡＳＣＥおよび第２のＡＳＣＥは、同じであっても、互いと異なっていてもよい。

【0617】

ここで、第２の標的染色体は、第３のＡＳＣＥおよび第４のＡＳＣＥを含んでもよい。ここで、第３のＡＳＣＥおよび第４のＡＳＣＥは、同じであっても、互いと異なっていてもよい。

【0618】

【0619】

ここで、第１の標的染色体および第２の標的染色体の各々は、追加のＲＲＳをさらに含んでもよい。

【0620】

【0621】

２つ以上のＡＳＣＥは、人工組換え染色体の生成において使用されるＡＳＣＥであってもよい。

【0622】

第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡの各々は、非標的供給源染色体に対する相同腕を含んでもよい。

【0623】

第１のドナーＤＮＡは、第１のＡＳＣＥ、第２のＡＳＣＥ、および第１の非標的供給源染色体に対する相同腕を有してもよい。

【0624】

第２のドナーＤＮＡは、第３のＡＳＣＥ、第４のＡＳＣＥ、および第２の非標的供給源染色体に対する相同腕を有してもよい。

【0625】

【0626】

【0627】

１つの例示的な実施形態において、２つ以上の標的細胞は、２つ以上のドナーＤＮＡを使用して作製されてもよい。

【0628】

２つ以上のドナーＤＮＡは、第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡを含んでもよい。

【0629】

第１のドナーＤＮＡは、２つ以上のＡＳＣＥを含んでもよい。２つ以上のＡＳＣＥは、第１のＡＳＣＥおよび第２のＡＳＣＥを含んでもよい。

【0630】

【0631】

ここで、第１のＡＳＣＥ、第２のＡＳＣＥ、第３のＡＳＣＥ、および第４のＡＳＣＥのすべては、同じであっても、互いと異なっていてもよい。代替的には、第１のＡＳＣＥ、第２のＡＳＣＥ、第３のＡＳＣＥ、および第４のＡＳＣＥは、部分的に同じであっても、互いと異なっていてもよい。たとえば、第１のＡＳＣＥおよび第４のＡＳＣＥは同じであってもよく、第２のＡＳＣＥおよび第３のＡＳＣＥは第１のＡＳＣＥと異なっていてもよい。代替的には、第２のＡＳＣＥおよび第４のＡＳＣＥは同じであってもよく、第１のＡＳＣＥおよび第３のＡＳＣＥは同じであってもよい。代替的には、第１のＡＳＣＥ、第２のＡＳＣＥ、第３のＡＳＣＥ、および第４のＡＳＣＥのすべてが、互いと異なっていてもよい。代替的には、第１のＡＳＣＥ、第２のＡＳＣＥ、第３のＡＳＣＥ、および第４のＡＳＣＥは、同じであってもよい。

【0632】

【0633】

ここで、第１の相同腕は、第１の非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0634】

ここで、第２の相同腕は、第１の非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0635】

ここで、第１の相同腕は、第２の相同腕とは異なる配列を有してもよい。

【0636】

【0637】

ここで、第３の相同腕は、第２の非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0638】

ここで、第４の相同腕は、第２の非標的供給源染色体の配列の一部に相同的である配列であってもよい。

【0639】

ここで、第３の相同腕は、第４の相同腕とは異なる配列を有してもよい。

【0640】

【0641】

【0642】

第１のドナーＤＮＡは、第１の非標的供給源細胞に導入されてもよい。第２のドナーＤＮＡは、第２の非標的供給源細胞に導入されてもよい。ここで、第１のドナーＤＮＡは、第１の非標的供給源細胞に含まれる第１の非標的供給源染色体に対する相同腕を有してもよい。第２のドナーＤＮＡは、第２の非標的細胞に含まれる第２の非標的供給源染色体に対する相同腕を有してもよい。

【0643】

２つ以上の標的細胞は、第１の標的細胞および第２の標的細胞を含んでもよい。

【0644】

ここで、第１の標的細胞は、第１のＡＳＣＥおよび第２のＡＳＣＥを含む第１の標的染色体を含んでもよい。

【0645】

ここで、第２の標的細胞は、第３のＡＳＣＥおよび第４のＡＳＣＥを含む第２の標的染色体を含んでもよい。

【0646】

【0647】

ここで、第１の標的染色体および第２の標的染色体の各々は、追加のＲＲＳをさらに含んでもよい。

【0648】

標的細胞を作製するための例において、レシピエント細胞を作製するために、第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡを使用して、ＥＳＣから標的胚性幹細胞（ＥＳＣ）を作製してもよい。

【0649】

第１のドナーＤＮＡは、ＥＳＣのゲノムのＩｇ軽鎖（ＩｇＬ）遺伝子座の可変領域（すべてのＶセグメントおよびＪセグメントを含む）の５'末端を標的とするために使用される第１の相同腕、ピギーバック末端反復（ＰＢ－ＴＲ）、プロモーター、ｌｏｘｍ２／６６（第１のＲＲＳ）、第１の抗生物質耐性遺伝子、およびＥＳＣのゲノムにおけるＩｇＬ遺伝子座の可変領域の５'末端を標的とするために使用される第２の相同腕を含んでもよい。

【0650】

第２のドナーＤＮＡは、ＥＳＣのゲノムのＩｇＬ遺伝子座の可変領域（すべてのＶセグメントおよびＪセグメントを含む）の３'末端を標的とするために使用される第３の相同腕、プロモーター、第２の抗生物質耐性遺伝子（ゼオシン耐性遺伝子）、ｌｏｘ７１（第２のＲＲＳ）、およびＥＳＣのゲノムにおけるＩｇＬ遺伝子座の可変領域の３'末端を標的とするために使用される第４の相同腕を含んでもよい。

【0651】

第１のドナーＤＮＡがＥＳＣのゲノムに挿入される細胞は、第１の抗生物質によって選択されてもよい。

【0652】

第２のドナーＤＮＡがＥＳＣのゲノムに挿入される細胞は、第２の抗生物質を使用して選択されてもよい。

【0653】

ここで、第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡは、順次に、ランダムに、または同時に、ＥＳＣに導入されてもよい。

【0654】

ここで、第１のドナーＤＮＡおよび第２のドナーＤＮＡのすべてが挿入されるゲノムを有する細胞は、第１の抗生物質および第２の抗生物質を使用して選択されてもよい。上述のように生成される、選択される細胞、すなわち第１の抗生物質および第２の抗生物質によって選択される細胞は、標的ＥＳＣであってもよい。

【0655】

さらに、ドナー細胞を作製するために、線維芽細胞から標的線維芽細胞を作製するための第３のドナーＤＮＡおよび第４のドナーＤＮＡが使用される。

【0656】

第３のドナーＤＮＡは、線維芽細胞のゲノムのＩｇ軽鎖（ＩｇＬ）遺伝子座の可変領域（すべてのＶセグメントおよびＪセグメントを含む）の５'末端を標的とするために使用される第１の相同腕、プロモーター、蛍光性タンパク質をコードする遺伝子、ｌｏｘ６６（第３のＲＲＳ）、および線維芽細胞のゲノムにおけるＩｇＬ遺伝子座の可変領域の５'末端を標的とするために使用される第２の相同腕を含んでもよい。

【0657】

第４のベクターは、線維芽細胞のゲノムのＩｇＬ遺伝子座の可変領域（すべてのＶセグメントおよびＪセグメントを含む）の３'末端を標的とするために使用される第３の相同腕、プロモーター、抗生物質耐性遺伝子、ｌｏｘｍ２／７１（第４のＲＲＳ）、および線維芽細胞のゲノムにおけるＩｇＬ遺伝子座の可変領域の３'末端を標的とするために使用される第４の相同腕を含んでもよい。

【0658】

第３のドナーＤＮＡが線維芽細胞のゲノムに挿入される細胞は、蛍光性タンパク質によって選択されてもよい。

【0659】

第４のドナーＤＮＡが線維芽細胞のゲノムに挿入される細胞は、抗生物質によって選択されてもよい。

【0660】

ここで、第３のドナーＤＮＡおよび第４のドナーＤＮＡは、順次に、ランダムに、または同時に、線維芽細胞に導入されてもよい。

【0661】

ここで、第３のドナーＤＮＡおよび第４のドナーＤＮＡのすべてが挿入されるゲノムを有する細胞は、蛍光性タンパク質および抗生物質を使用して選択されてもよい。上述のように生成される、選択される細胞、すなわち、蛍光性タンパク質および抗生物質によって選択される細胞は、標的線維芽細胞であってもよい。

【0662】

作製されるレシピエント細胞のＩｇ軽鎖（ＩｇＬ）遺伝子座を含む染色体は、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳを含んでもよい。さらに、作製されるドナー細胞のＩｇＬ遺伝子座を含む染色体は、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳを含んでもよい。

【0663】

ここで、第１のＲＲＳは、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳのうち一方と対合されてもよく、第２のＲＲＳは、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳの他方と対合されてもよい。

【0664】

上述の例は、単に説明のためであり、各構成要素（非標的細胞、ドナーＤＮＡ、標的染色体、および標的細胞（ドナー細胞およびレシピエント細胞）など）は、目的に従って様々な仕方で、修正または改変されてもよい。
ｉｉ）ミクロセルの作製

【0665】

「ミクロセル」は、１つの細胞を、人工的な操作、特定の試薬、または特定の条件に暴露させることによって２つ以上に分離された部分のいずれか１つを意味する。さらに、ミクロセルは、１つまたは複数の染色体または染色体断片を含むが、体細胞分裂（有糸分裂）または減数分裂を経ない、細胞類似体を意味する。一例において、ミクロセルは、１つの動物細胞を２つ以上の細胞または細胞類似体に分割することによって得られるいずれか１つであってもよい。別の例において、ミクロセルは、１つの動物細胞を染色体の数、すなわち２ｎ以上に分割することによって得られるいずれか１つであってもよい。たとえば、動物細胞がヒト線維芽細胞である場合、ミクロセルは、ヒト線維芽細胞を染色体の数、すなわち２ｎ（４６）以上に分割することによって得られるいずれか１つであってもよい。この場合、ヒト線維芽細胞は、４６以上のミクロセルに分割されてもよい。

【0666】

ミクロセルは、１つまたは複数の染色体または染色体断片を含んでもよい。

【0667】

ここで、１つまたは複数の染色体または染色体断片は、供給源染色体、または供給源染色体断片であってもよい。

【0668】

ミクロセルは、通常の体細胞分裂または減数分裂を経ることができない細胞類似体であってもよい。

【0669】

ミクロセルは、細胞の細胞質の一部を有してもよい。

【0670】

ミクロセルは、細胞の細胞膜の一部を有してもよい。

【0671】

ミクロセルは、細胞の核質の一部を有してもよい。

【0672】

本明細書で開示される一態様に従って、標的細胞をミクロセルに分割する方法を提供することができる。

【0673】

「細胞をミクロセルに分割すること」は、１個または複数の細胞を使用する、ミクロセルの作製を意味する。ここで、細胞をミクロセルに分割することは、１つの細胞を、複数の細胞または細胞類似体に作製することである。ミクロセルの説明は、上述のとおりである。

【0674】

標的細胞の説明は、上述のとおりである。

【0675】

ここで、標的細胞は、ドナー細胞であってもよい。

【0676】

標的細胞からミクロセルを作製する方法では、公知の方法を使用してもよい。当該方法は、文献［ＴｈｏｒｆｉｎｎＥｇｅｅｔａｌ．、１９７４；ＴｈｏｒｆｉｎｎＥｇｅｅｔａｌ．、１９７７］に開示されている。

【0677】

１つの例示的な実施形態において、ミクロセルは、標的細胞を微小管阻害剤で処理することによる、微小核化細胞を作製するための微小核形成；および微小核化細胞を微小繊維阻害剤で処理した後に遠心分離することによる、ミクロセルを作製するための脱核によって、作製されてもよい。

【0678】

ここで、標的細胞は、ドナー細胞であってもよい。

【0679】

ここで、微小管阻害剤は、微小管の伸長を阻害する物質であってもよい。たとえば、微小管阻害剤は、コルヒチン、ノコダゾール、およびコルセミドのうちいずれか１つまたは複数であってもよい。

【0680】

ここで、微小繊維阻害剤は、微小繊維の伸長を阻害する物質であってもよい。たとえば、微小繊維阻害剤は、サイトカラシンＢであってもよい。

【0681】

ここで、遠心分離は、パーコール勾配法で実施されてもよい。

【0682】

標的細胞の核膜は、微小核形成によって、２つ以上の小さい小胞へと分割されてもよい。

【0683】

標的細胞の細胞膜は、脱核によって、２つ以上の小さい小胞へと分離されてもよい。

【0684】

上述のように形成されるミクロセルは、標的染色体または標的染色体断片を含んでもよい。ここで、標的染色体または標的染色体断片は、少なくとも１つまたは複数のＲＲＳを含んでもよい。代替的には、標的染色体または標的染色体断片は、少なくとも１つまたは複数のＡＳＣＥを含んでもよい。ここで、ＲＲＳは、ミクロセルが融合される標的細胞に含まれる標的染色体上に位置するＲＲＳと対合されてもよい。ここで、ＡＳＣＥは、ミクロセルが融合される標的細胞に含まれる標的染色体上に位置するＡＳＣＥと相補的結合を形成してもよい。

【0685】

たとえば、ミクロセルは、第１のＲＲＳを含む標的染色体を含んでもよい。ここで、第１のＲＲＳは、ミクロセルが融合される標的細胞に含まれる標的染色体上に位置する第２のＲＲＳと対合されてもよい。

【0686】

別の例において、ミクロセルは、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳを含む標的染色体を含んでもよい。ミクロセルが融合される標的細胞は、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳを含む標的染色体を有してもよい。ここで、第１のＲＲＳは、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳのうち一方と対合されてもよく、第２のＲＲＳは、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳの他方と対合されてもよい。
ｉｉ－１）ＲＲＳが挿入された染色体を含むミクロセル

【0687】

本明細書で開示される１つの例示的な実施形態によれば、標的染色体を含むミクロセル、およびそれを作製する方法を提供することができる。標的染色体は、単一のＲＲＳを含んでもよい。標的染色体は、２つ以上のＲＲＳを含んでもよい。

【0688】

ＲＲＳおよび標的染色体は、上述されている。

【0689】

ＲＲＳを有する標的染色体を含むミクロセルは、標的細胞から作製されてもよい。標的細胞は、ＲＲＳを有する標的染色体を含む標的細胞であってもよい。ＲＲＳを有する標的染色体は、上述されている。

【0690】

例示的な実施形態によれば、ミクロセルは、標的細胞から作製されてもよい。標的細胞は、ＲＲＳを含む標的染色体を含んでもよい。ここで、標的細胞は、ドナー細胞であってもよい。

【0691】

ミクロセルは、ＲＲＳを有する標的染色体を含む標的細胞を微小管阻害剤で処理することによる、微小核化細胞を作製するための微小核形成；および微小核化細胞を微小繊維阻害剤で処理した後に遠心分離することによる、ミクロセルを作製するための脱核によって、作製されてもよい。

【0692】

【0693】

ここで、微小繊維阻害剤は、微小繊維の伸長を阻害する物質であってもよい。たとえば、微小繊維阻害剤は、サイトカラシンＢであってもよい。

【0694】

ここで、遠心分離は、パーコール勾配法で実施されてもよい。

【0695】

ミクロセルは、１つまたは複数の非標的染色体またはその断片を含んでもよい。

【0696】

ミクロセルは、ＲＲＳを有する標的染色体およびその断片を含んでもよい。ここで、ミクロセルは、１つまたは複数の非標的染色体またはその断片をさらに含んでもよい。

【0697】

別の例示的な実施形態によれば、ミクロセルは、１つの染色体またはその断片を含むミクロセルとして作製されてもよい。染色体は、ＲＲＳを有する標的染色体であってもよい。染色体は、非標的供給源染色体であってもよい。

【0698】

１つの染色体またはその断片を含むミクロセルは、ＲＲＳを有する標的染色体を含む標的細胞を微小管阻害剤で処理することによる、微小核化細胞を作製するための微小核形成；微小核化細胞を微小繊維阻害剤で処理した後に遠心分離することによる、ミクロセルを作製するための脱核；およびミクロセルのろ過によって、作製されてもよい。

【0699】

ここで、標的細胞は、ドナー細胞であってもよい。

【0700】

ここで、微小管阻害剤は、微小管の伸長を阻害するための物質であってもよい。たとえば、微小管阻害剤は、コルヒチン、ノコダゾール、およびコルセミドのうちいずれか１つまたは複数であってもよい。

【0701】

ここで、微小繊維阻害剤は、微小繊維の伸長を阻害する物質であってもよい。たとえば、微小繊維阻害剤は、サイトカラシンＢであってもよい。

【0702】

ここで、遠心分離は、パーコール勾配法で実施されてもよい。

【0703】

ここで、ろ過は、ろ過膜を使用して実施されてもよい。

【0704】

ろ過膜の細孔サイズは、３～１０μｍであってもよい。

【0705】

ろ過膜の細孔サイズは、５～８μｍであってもよい。

【0706】

さらに別の例示的な実施形態によれば、ミクロセルは、２つの染色体およびその断片を含むミクロセルとして作製されてもよい。２つの染色体は、ＲＲＳを有する標的染色体および／または非標的供給源染色体を含んでもよい。

【0707】

２つの染色体およびその断片を含むミクロセルは、ＲＲＳを有する２つ以上の標的染色体を含む標的細胞を微小管阻害剤で処理することによる、微小核化細胞を作製するための微小核形成；微小核化細胞を微小繊維阻害剤で処理した後に遠心分離することによる、ミクロセルを作製するための脱核；およびミクロセルのろ過によって、作製されてもよい。

【0708】

ここで、標的細胞は、ドナー細胞であってもよい。

【0709】

【0710】

ここで、微小繊維阻害剤は、微小繊維の伸長を阻害する物質であってもよい。たとえば、微小繊維阻害剤は、サイトカラシンＢであってもよい。

【0711】

ここで、遠心分離は、パーコール勾配法で実施されてもよい。

【0712】

ここで、ろ過は、ろ過膜を使用して実施されてもよい。

【0713】

ろ過膜の細孔サイズは、８～１５μｍであってもよい。

【0714】

さらに別の例示的な実施形態によれば、ミクロセルは、３つの染色体またはその断片を含むミクロセルとして作製されてもよい。３つの染色体は、ＲＲＳを有する標的染色体および／または非標的供給源染色体を含んでもよい。

【0715】

３つの染色体またはその断片を含むミクロセルは、ＲＲＳを有する２つ以上の標的染色体を含む標的細胞を微小管阻害剤で処理することによる、微小核化細胞を作製するための微小核形成；微小核化細胞を微小繊維阻害剤で処理した後に遠心分離することによる、ミクロセルを作製するための脱核；およびミクロセルのろ過によって、作製されてもよい。

【0716】

ここで、標的細胞は、ドナー細胞であってもよい。

【0717】

【0718】

ここで、微小繊維阻害剤は、微小繊維の伸長を阻害する物質であってもよい。たとえば、微小繊維阻害剤は、サイトカラシンＢであってもよい。

【0719】

ここで、遠心分離は、パーコール勾配法で実施されてもよい。

【0720】

ここで、ろ過は、ろ過膜を使用して実施されてもよい。

【0721】

ろ過膜の細孔サイズは、１２～２０μｍであってもよい。

【0722】

ミクロセルに含まれる染色体の数は、開示される例示的な実施形態に限定されない。ミクロセルに含まれる染色体の数は、ろ過膜の細孔サイズによって選択されてもよい。
ｉｉ－２）ＡＳＣＥが挿入された染色体を含むミクロセル

【0723】

本明細書で開示される１つの例示的な実施形態によれば、標的染色体を含むミクロセル、およびそれを作製する方法を提供することができる。標的染色体は、単一のＡＳＣＥを含んでもよい。標的染色体は、２つ以上のＡＳＣＥを含んでもよい。

【0724】

ＡＳＣＥおよび標的染色体は、上述されている。

【0725】

ＡＳＣＥを有する標的染色体を含むミクロセルは、標的細胞から作製されてもよい。標的細胞は、ＡＳＣＥを有する標的染色体を含む標的細胞であってもよい。ＡＳＣＥを有する標的染色体は、上述されている。ここで、標的細胞は、ドナー細胞であってもよい。

【0726】

例示的な実施形態によれば、ミクロセルは、標的細胞から作製されてもよい。標的細胞は、ＡＳＣＥを有する標的染色体を含んでもよい。ここで、標的細胞は、ドナー細胞であってもよい。

【0727】

ミクロセルは、ＡＳＣＥを有する標的染色体を含む標的細胞を微小管阻害剤で処理することによる、微小核化細胞を作製するための微小核形成；および微小核化細胞を微小繊維阻害剤で処理した後に遠心分離することによる、ミクロセルを作製するための脱核によって、作製されてもよい。

【0728】

【0729】

ここで、微小繊維阻害剤は、微小繊維の伸長を阻害する物質であってもよい。たとえば、微小繊維阻害剤は、サイトカラシンＢであってもよい。

【0730】

ここで、遠心分離は、パーコール勾配法で実施されてもよい。

【0731】

ミクロセルは、１つまたは複数の非標的染色体またはその断片を含んでもよい。

【0732】

ミクロセルは、ＡＳＣＥを有する標的染色体またはその断片を含んでもよい。ここで、ミクロセルは、１つまたは複数の非標的染色体またはその断片をさらに含んでもよい。

【0733】

別の例示的な実施形態によれば、ミクロセルは、１つの染色体またはその断片を含むミクロセルとして作製されてもよい。染色体は、ＡＳＣＥを有する標的染色体であってもよい。染色体は、非標的供給源染色体であってもよい。

【0734】

１つの染色体またはその断片を含むミクロセルは、ＡＳＣＥを有する標的染色体を含む標的細胞を微小管阻害剤で処理することによる、微小核化細胞を作製するための微小核形成；微小核化細胞を微小繊維阻害剤で処理した後に遠心分離することによる、ミクロセルを作製するための脱核；およびミクロセルのろ過によって、作製されてもよい。

【0735】

ここで、標的細胞は、ドナー細胞であってもよい。

【0736】

【0737】

ここで、微小繊維阻害剤は、微小繊維の伸長を阻害する物質であってもよい。たとえば、微小繊維阻害剤は、サイトカラシンＢであってもよい。

【0738】

ここで、遠心分離は、パーコール勾配法で実施されてもよい。

【0739】

ここで、ろ過は、ろ過膜を使用して実施されてもよい。

【0740】

ろ過膜の細孔サイズは、３～１０μｍであってもよい。

【0741】

ろ過膜の細孔サイズは、５～８μｍであってもよい。

【0742】

さらに別の例示的な実施形態によれば、ミクロセルは、２つの染色体およびその断片を含むミクロセルとして作製されてもよい。２つの染色体は、ＡＳＣＥを有する標的染色体および／または非標的供給源染色体を含んでもよい。

【0743】

２つの染色体およびその断片を含むミクロセルは、ＡＳＣＥを有する２つ以上の標的染色体を含む標的細胞を微小管阻害剤で処理することによる、微小核化細胞を作製するための微小核形成；微小核化細胞を微小繊維阻害剤で処理した後に遠心分離することによる、ミクロセルを作製するための脱核；およびミクロセルのろ過によって、作製されてもよい。

【0744】

ここで、標的細胞は、ドナー細胞であってもよい。

【0745】

【0746】

ここで、微小繊維阻害剤は、微小繊維の伸長を阻害する物質であってもよい。たとえば、微小繊維阻害剤は、サイトカラシンＢであってもよい。

【0747】

ここで、遠心分離は、パーコール勾配法で実施されてもよい。

【0748】

ここで、ろ過は、ろ過膜を使用して実施されてもよい。

【0749】

ろ過膜の細孔サイズは、８～１５μｍであってもよい。

【0750】

１つの例示的な実施形態によれば、ミクロセルは、３つの染色体またはその断片を含むミクロセルとして作製されてもよい。３つの染色体は、ＡＳＣＥを有する標的染色体および／または非標的供給源染色体を含んでもよい。

【0751】

３つの染色体またはその断片を含むミクロセルは、ＡＳＣＥを有する２つ以上の標的染色体を含む標的細胞を微小管阻害剤で処理することによる、微小核化細胞を作製するための微小核形成；微小核化細胞を微小繊維阻害剤で処理した後に遠心分離することによる、ミクロセルを作製するための脱核；およびミクロセルのろ過によって、作製されてもよい。

【0752】

ここで、標的細胞は、ドナー細胞であってもよい。

【0753】

【0754】

ここで、微小繊維阻害剤は、微小繊維の伸長を阻害する物質であってもよい。たとえば、微小繊維阻害剤は、サイトカラシンＢであってもよい。

【0755】

ここで、遠心分離は、パーコール勾配法で実施されてもよい。

【0756】

ここで、ろ過は、ろ過膜を使用して実施されてもよい。

【0757】

ろ過膜の細孔サイズは、１２～２０μｍであってもよい。

【0758】

ミクロセルに含まれる染色体の数は、開示される実施形態に限定されない。ミクロセルに含まれる染色体の数は、ろ過膜の細孔サイズによって選択されてもよい。

【0759】

ミクロセルの作製のための例において、標的線維芽細胞は、コルセミドで処理されてもよい。ここで、微小核化細胞は、コルセミド処理による微小核形成の誘導に従って作製されてもよい。

【0760】

ミクロセルは、作製された微小核化細胞をサイトカラシンＢで処理すること、および遠心分離を実施することによって単離されてもよい。

【0761】

上で説明されるプロセスによって、ミクロセルは、標的線維芽細胞から作製され、得られてもよい。

【0762】

上述の例は、単に例であり、各構成要素（標的細胞、またはミクロセルなど）は、目的に従って様々な仕方で、修飾または改変されてもよい。
ｉｉｉ）ミクロセルを使用する、融合細胞の作製

【0763】

本明細書で開示される一態様において、第１の融合細胞、およびそれを作製する方法を提供することができる。

【0764】

第１の融合細胞は、供給源細胞に加えて、１つまたは複数の染色体またはその断片を追加的に有する細胞であってもよい。

【0765】

ここで、第１の融合細胞は、供給源細胞を構成する染色体の総数より多い、複数の染色体を有する細胞であってもよい。たとえば、供給源細胞の染色体の総数が、２ｎ（４０）である場合、第１の融合細胞は、２ｎ＋１（４１）個の染色体を有する細胞であってもよい。この場合、第１の融合細胞は、供給源細胞の染色体の総数（２ｎ、すなわち４０）および１つの追加の染色体を有する細胞であってもよい。

【0766】

第１の融合細胞は、少なくとも１つの標的染色体を含んでもよい。ここで、標的染色体は、第１の融合細胞に追加的に含まれる染色体であってもよい。

【0767】

第１の融合細胞は、少なくとも２つの標的染色体を含んでもよい。ここで、２つ以上の標的染色体のうち１つは、第１の融合細胞に存在する供給源細胞の全染色体のうちの１つであってもよい。２つ以上の標的染色体のうち他方は、第１の融合細胞に追加的に含まれる染色体であってもよい。

【0768】

第１の融合細胞は、少なくとも２つの標的染色体を含んでもよい。ここで、２つ以上の標的染色体は、第１の融合細胞に追加的に含まれる染色体であってもよい。この場合、第１の融合細胞は、供給源細胞中の２つ以上の追加の染色体を有する細胞であってもよく、第１の融合細胞は、供給源細胞の全染色体、および２つ以上の追加の染色体を有する細胞であってもよい。

【0769】

第１の融合細胞は、１個または複数の供給源細胞と１個または複数のミクロセルとの融合によって作製されてもよい。ミクロセルと供給源細胞との融合によって第１の融合細胞を作製する方法では、公知の方法を使用してもよい。当該方法は、文献［ＦｏｕｒｎｉｅｒＲＥｅｔａｌ１９７７；ＭｃＮｅｉｌｌＣＡｅｔａｌ１９８０］に開示されている。例として、Ｔｏｍｉｚｕｋａｅｔａｌ．、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ、１６：１３３（１９９７）が参照される。

【0770】

第１の融合細胞は、標的細胞と１個または複数のミクロセルとの細胞融合によって作製されてもよい。

【0771】

ここで、標的細胞は、レシピエント細胞であってもよい。

【0772】

ここで、１個または複数のミクロセルは、ドナー細胞から作製されてもよい。

【0773】

標的細胞（第１の標的細胞）およびミクロセルの説明は、上述のとおりである。

【0774】

ミクロセルは、標的細胞（第２の標的細胞）を使用して作製されてもよい。

【0775】

ここで、第１の標的細胞は、第２の標的細胞と同じ個体に由来してもよい。

【0776】

ここで、第１の標的細胞および第２の標的細胞は、異なる個体に由来してもよい。異なる個体は、同種および異種の個体の両方を含む。

【0777】

たとえば、第１の標的細胞は、マウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）であってもよい。ここで、第２の標的細胞は、ヒト線維芽細胞であってもよい。

【0778】

たとえば、第１の標的細胞は、マウスＥＳ細胞であってもよい。ここで、第２の標的細胞は、マウス線維芽細胞であってもよい。

【0779】

ミクロセルは、１つまたは複数の標的染色体またはその断片を含んでもよい。ここで、１つまたは複数の標的染色体またはその断片は、１つまたは複数のＲＲＳを含んでもよい。代替的には、１つまたは複数の標的染色体またはその断片は、１つまたは複数のＡＳＣＥを含んでもよい。ここで、１つまたは複数のＲＲＳは、第１の標的細胞に含まれる１つまたは複数のＲＲＳと対合されてもよい。代替的には、１つまたは複数のＡＳＣＥは、第１の標的細胞に含まれる１つまたは複数のＡＳＣＥと相補的結合を形成してもよい。

【0780】

複数のミクロセルがある場合、少なくとも１つのミクロセルは、１つまたは複数の標的染色体またはその断片を含んでもよい。ここで、１つまたは複数の標的染色体またはその断片は、１つまたは複数のＲＲＳを含んでもよい。代替的には、１つまたは複数の標的染色体またはその断片は、１つまたは複数のＡＳＣＥを含んでもよい。ここで、１つまたは複数のＲＲＳは、第１の標的細胞に含まれる１つまたは複数のＲＲＳと対合されてもよい。代替的には、１つまたは複数のＡＳＣＥは、第１の標的細胞に含まれる１つまたは複数のＡＳＣＥと相補的結合を形成してもよい。

【0781】

１つの例示的な実施形態において、第１の融合細胞は、標的細胞（第１の標的細胞）と第１のミクロセルとの細胞融合によって作製されてもよい。ここで、第１のミクロセルは、１つまたは複数の標的染色体またはその断片を含んでもよい。ここで、１つまたは複数の標的染色体またはその断片は、１つまたは複数のＲＲＳ（第１のＲＲＳ）を含んでもよい。標的細胞（第１の標的細胞）は、１つまたは複数のＲＲＳ（第２のＲＲＳ）を有する標的染色体を含んでもよい。ここで、第１のＲＲＳは、第２のＲＲＳと対合されてもよい。

【0782】

別の例示的な実施形態において、第１の融合細胞は、標的細胞（第１の標的細胞）と第１のミクロセルとの細胞融合によって作製されてもよい。ここで、第１のミクロセルは、１つまたは複数の標的染色体またはその断片を含んでもよい。ここで、１つまたは複数の標的染色体またはその断片は、２つ以上のＲＲＳ（第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳ）を含んでもよい。標的細胞（第１の標的細胞）は、２つ以上のＲＲＳ（第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳ）を含む標的染色体を含んでもよい。ここで、第１のＲＲＳは、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳのうち一方と対合されてもよく、第２のＲＲＳは、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳのうち他方と対合されてもよい。

【0783】

別の例示的な実施形態において、第１の融合細胞は、標的細胞（第１の標的細胞）、第１のミクロセル、および第２のミクロセルの細胞融合によって作製されてもよい。ここで、第１のミクロセルは、１つまたは複数の標的染色体またはその断片を含んでもよい。第２のミクロセルは、１つまたは複数の非標的供給源染色体またはその断片を含んでもよい。ここで、１つまたは複数の標的染色体またはその断片は、１つまたは複数のＲＲＳ（第１のＲＲＳ）を含んでもよい。標的細胞（第１の標的細胞）は、１つまたは複数のＲＲＳ（第２のＲＲＳ）を含む標的染色体を含んでもよい。ここで、第１のＲＲＳは、第２のＲＲＳと対合されてもよい。

【0784】

さらに別の例示的な実施形態において、第１の融合細胞は、標的細胞（第１の標的細胞）、第１のミクロセル、および第２のミクロセルの細胞融合によって作製されてもよい。ここで、第１のミクロセルは、１つまたは複数の標的染色体またはその断片を含んでもよい。第２のミクロセルは、１つまたは複数の標的染色体またはその断片を含んでもよい。この場合、第１のミクロセルに含まれる標的染色体は、第２のミクロセルに含まれる標的染色体と同じであっても、異なっていてもよい。ここで、第１のミクロセルに含まれる標的染色体は、１つまたは複数のＲＲＳ（第１のＲＲＳ）を含んでもよい。標的細胞（第１の標的細胞）は、１つまたは複数のＲＲＳ（第２のＲＲＳ）を含む標的染色体を含んでもよい。ここで、第１のＲＲＳは、第２のＲＲＳと対合されてもよい。

【0785】

さらに別の例示的な実施形態において、第１の融合細胞は、標的細胞（第１の標的細胞）、第１のミクロセル、第２のミクロセル、第３のミクロセル、および第ｎのミクロセルの細胞融合によって作製されてもよい。ここで、第１のミクロセル、第２のミクロセル、第３のミクロセル、および第ｎのミクロセルのうち１つまたは複数のミクロセルは、１つまたは複数の標的染色体またはその断片を含んでもよい。

【0786】

例示的な実施形態によれば、第１の融合細胞を作製する方法は、標的細胞（第１の標的細胞）と１個または複数のミクロセルとを互いに接触させること；ならびに標的細胞およびミクロセルを、正に荷電した界面活性物質で処理することによって実施される細胞融合を含んでもよい。

【0787】

標的細胞の説明は、上述のとおりである。

【0788】

標的細胞（第１の標的細胞）は、１つまたは複数の標的染色体を含んでもよい。

【0789】

ミクロセルは、標的細胞（第２の標的細胞）を使用して作製されてもよい。ミクロセルの説明は、上述のとおりである。

【0790】

ここで、第１の標的細胞は、第２の標的細胞と同じ個体に由来してもよい。

【0791】

ここで、第１の標的細胞および第２の標的細胞は、異なる個体に由来してもよい。異なる個体は、同種および異種の個体の両方を含む。

【0792】

たとえば、第１の標的細胞は、マウスＥＳ細胞であってもよい。ここで、第２の標的細胞は、ヒト線維芽細胞であってもよい。

【0793】

たとえば、第１の標的細胞は、マウスＥＳ細胞であってもよい。ここで、第２の標的細胞は、マウス線維芽細胞であってもよい。

【0794】

ミクロセルは、１つまたは複数の標的染色体またはその断片を含んでもよい。

【0795】

複数のミクロセルがある場合、少なくとも１つのミクロセルは、１つまたは複数の標的染色体またはその断片を含んでもよい。

【0796】

標的細胞（第１の標的細胞）と１個または複数のミクロセルとを互いに接触させることは、標的細胞（第１の標的細胞）および１個または複数のミクロセルを、同じ培地または緩衝液中に位置させることであってもよい。

【0797】

正に荷電した界面活性物質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であってもよい。

【0798】

複数のミクロセルがある場合、複数のミクロセルの各々は順次、標的細胞（第１の標的細胞）と細胞融合されてもよい。

【0799】

複数のミクロセルがある場合、複数のミクロセルは一度に、標的細胞（第１の標的細胞）と細胞融合されてもよい。

【0800】

複数のミクロセルがある場合、複数のミクロセルはランダムに、標的細胞（第１の標的細胞）と細胞融合されてもよい。

【0801】

別の例示的な実施形態によれば、第１の融合細胞を作製する方法は、標的細胞（第１の標的細胞）と１個または複数のミクロセルとを互いに接触させること；ならびにミクロセルおよび標的細胞（第１の標的細胞）をマイトジェンおよび正に荷電した界面活性物質で処理することによって実施される細胞融合を含んでもよい。

【0802】

標的細胞の説明は、上述のとおりである。

【0803】

標的細胞（第１の標的細胞）は、１つまたは複数の標的染色体を含んでもよい。

【0804】

ミクロセルは、標的細胞（第２の標的細胞）を使用して作製されてもよい。ミクロセルの説明は、上述のとおりである。

【0805】

ここで、第１の標的細胞は、第２の標的細胞と同じ個体に由来してもよい。

【0806】

ここで、第１の標的細胞および第２の標的細胞は、異なる個体に由来してもよい。異なる個体は、同種および異種の個体の両方を含んでもよい。

【0807】

たとえば、第１の標的細胞は、マウスＥＳ細胞であってもよい。ここで、第２の標的細胞は、ヒト線維芽細胞であってもよい。

【0808】

たとえば、第１の標的細胞は、マウスＥＳ細胞であってもよい。ここで、第２の標的細胞は、マウス線維芽細胞であってもよい。

【0809】

ミクロセルは、１つまたは複数の標的染色体またはその断片を含んでもよい。

【0810】

複数のミクロセルがある場合、少なくとも１つのミクロセルは、１つまたは複数の標的染色体またはその断片を含んでもよい。

【0811】

【0812】

マイトジェンは、フィトヘマグルチニン－Ｐ（ＰＨＡ－Ｐ）であってもよい。

【0813】

正に荷電した界面活性物質はＰＥＧであってもよい。

【0814】

複数のミクロセルがある場合、複数のミクロセルの各々は順次、標的細胞（第１の標的細胞）と細胞融合されてもよい。

【0815】

複数のミクロセルがある場合、複数のミクロセルは一度に、標的細胞（第１の標的細胞）と細胞融合されてもよい。

【0816】

複数のミクロセルがある場合、複数のミクロセルはランダムに、標的細胞（第１の標的細胞）と細胞融合されてもよい。
ｉｉｉ－１）ＲＲＳが挿入された染色体を含む第１の融合細胞

【0817】

本明細書で開示される例示的な実施形態によれば、２つ以上の標的染色体を含む第１の融合細胞、およびそれを作製する方法を提供することができる。

【0818】

２つ以上の標的染色体は、少なくとも１つのＲＲＳを各々が有する標的染色体であってもよい。

【0819】

２つ以上の標的染色体は、第１の標的染色体および第２の標的染色体であってもよい。

【0820】

第１の標的染色体は、少なくとも１つのＲＲＳを含む標的染色体であってもよい。

【0821】

第２の標的染色体は、少なくとも１つのＲＲＳを含む標的染色体であってもよい。

【0822】

一例において、第１の標的染色体は第１のＲＲＳを含んでもよく、第２の標的染色体は第２のＲＲＳを含んでもよい。ここで、第１のＲＲＳは、第２のＲＲＳと同じであっても、異なっていてもよい。

【0823】

別の例において、第１の標的染色体は、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳを含んでもよく、第２の標的染色体は、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳを含んでもよい。ここで、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳのすべては、同じであっても、互いと異なっていてもよい。代替的には、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳは、部分的に同じであっても、互いと異なっていてもよい。

【0824】

【0825】

第１の融合細胞は、第１の標的染色体および第２の標的染色体を含んでもよい。

【0826】

第１の標的染色体は、第１の標的細胞から提供されてもよい。第２の標的染色体は、ミクロセルから提供されてもよい。ここで、ミクロセルは、第２の標的染色体を含む第２の標的細胞を使用して作製されてもよい。この場合、第１の融合細胞は、第１の標的細胞の全染色体、および第２の標的染色体を有する融合細胞であってもよい。

【0827】

代替的には、第１の標的染色体は、ミクロセルから提供されてもよい。第２の標的染色体は、第２の標的細胞から提供されてもよい。ここで、ミクロセルは、第１の標的染色体を含む第１の標的細胞を使用して作製されてもよい。この場合、第１の融合細胞は、第２の標的細胞の全染色体、および第１の標的染色体を有する融合細胞であってもよい。

【0828】

標的染色体、標的細胞、およびミクロセルの説明は、上述のとおりである。

【0829】

例示的な実施形態によれば、２つ以上の標的染色体を含む第１の融合細胞を作製する方法は、第１の標的細胞と１個または複数のミクロセルとを互いに接触させること；ならびに第１の標的細胞およびミクロセルを、正に荷電した界面活性物質で処理することによって実施される細胞融合を含んでもよい。

【0830】

第１の標的細胞は、１つまたは複数の標的染色体を含んでもよい。

【0831】

第１の標的細胞は、第１の標的染色体を含んでもよい。

【0832】

ここで、第１の標的染色体は、少なくとも１つのＲＲＳを含んでもよい。

【0833】

ここで、第１の標的染色体に含まれる１つまたは複数のＲＲＳは、表１に列挙されるＬｏｘＰバリアントから選択される１つまたは複数であってもよい。

【0834】

ミクロセルは、第２の標的細胞を使用して作製されてもよい。ここで、第２の標的細胞は、１つまたは複数の標的染色体を含んでもよい。第２の標的細胞は、第２の標的染色体を含んでもよい。

【0835】

ここで、第１の標的細胞は、第２の標的細胞と同じ個体に由来してもよい。

【0836】

ここで、第１の標的細胞および第２の標的細胞は、異なる個体に由来してもよい。異なる個体は、同種および異種の個体の両方を含んでもよい。

【0837】

たとえば、第１の標的細胞は、マウスＥＳ細胞であってもよい。ここで、第２の標的細胞は、ヒト線維芽細胞であってもよい。

【0838】

たとえば、第１の標的細胞は、マウスＥＳ細胞であってもよい。ここで、第２の標的細胞は、マウス線維芽細胞であってもよい。

【0839】

ミクロセルは、１つまたは複数の標的染色体またはその断片を含んでもよい。ここで、ミクロセルは、第２の標的染色体またはその断片を含んでもよい。

【0840】

ここで、第２の標的染色体は、少なくとも１つのＲＲＳを含んでもよい。

【0841】

ここで、第２の標的染色体に含まれる１つまたは複数のＲＲＳは、表１に列挙されるＬｏｘＰバリアントから選択される１つまたは複数であってもよい。

【0842】

ここで、第２の標的染色体に含まれる１つまたは複数のＲＲＳは、第１の標的染色体に含まれる１つまたは複数のＲＲＳと同じであっても、異なっていてもよい。

【0843】

ここで、第２の標的染色体に含まれる１つまたは複数のＲＲＳは、第１の標的染色体に含まれる１つまたは複数のＲＲＳと対合されてもよい。

【0844】

【0845】

第１の標的細胞と１個または複数のミクロセルとを互いに接触させることは、標的細胞および１個または複数のミクロセルを、同じ培地または緩衝液中に位置させることであってもよい。

【0846】

正に荷電した界面活性物質はＰＥＧであってもよい。

【0847】

第１の標的細胞およびミクロセルを、正に荷電した界面活性物質で処理するステップにおいて、当該細胞は、マイトジェンでさらに処理されてもよい。

【0848】

マイトジェンは、ＰＨＡ－Ｐであってもよい。

【0849】

別の例示的な実施形態によれば、２つ以上の標的染色体を含む第１の融合細胞を作製する方法は、第１の標的細胞と１個または複数のミクロセルとを互いに接触させること；ならびに第１の標的細胞およびミクロセルを、正に荷電した界面活性物質で処理することによって実施される細胞融合を含んでもよい。

【0850】

第１の標的細胞は、１つまたは複数の標的染色体を含んでもよい。

【0851】

第１の標的細胞は、第１の標的染色体を含んでもよい。

【0852】

ここで、第１の標的染色体は、少なくとも２つ以上のＲＲＳを含んでもよい。

【0853】

ここで、２つ以上のＲＲＳは、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳであってもよい。

【0854】

ここで、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳの各々は、表１に列挙されるＬｏｘＰバリアントから選択される１つまたは複数であってもよい。

【0855】

ここで、第１のＲＲＳは、第２のＲＲＳと同じであっても、異なっていてもよい。

【0856】

【0857】

ここで、第１の標的細胞は、第２の標的細胞と同じ個体に由来してもよい。

【0858】

ここで、第１の標的細胞および第２の標的細胞は、異なる個体に由来してもよい。異なる個体は、同種および異種の個体の両方を含む。

【0859】

たとえば、第１の標的細胞は、マウスＥＳ細胞であってもよい。ここで、第２の標的細胞は、ヒト線維芽細胞であってもよい。

【0860】

たとえば、第１の標的細胞は、マウスＥＳ細胞であってもよい。ここで、第２の標的細胞は、マウス線維芽細胞であってもよい。

【0861】

【0862】

ここで、第２の標的染色体は、少なくとも２つのＲＲＳを含んでもよい。

【0863】

ここで、２つ以上のＲＲＳは、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳを含んでもよい。

【0864】

ここで、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳの各々は、表１に列挙されるＬｏｘＰバリアントから選択される１つまたは複数であってもよい。

【0865】

ここで、第３のＲＲＳは、第４のＲＲＳと同じであっても、異なっていてもよい。

【0866】

ここで、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳおよび／または第２のＲＲＳと対合されてもよい。

【0867】

ここで、第４のＲＲＳは、第１のＲＲＳおよび／または第２のＲＲＳと対合されてもよい。

【0868】

【0869】

【0870】

正に荷電した界面活性物質はＰＥＧであってもよい。

【0871】

【0872】

マイトジェンは、ＰＨＡ－Ｐであってもよい。
ｉｉｉ－２）ＡＳＣＥが挿入された染色体を含む第１の融合細胞

【0873】

【0874】

２つ以上の標的染色体は、少なくとも１つのＡＳＣＥを各々が有する標的染色体であってもよい。

【0875】

２つ以上の標的染色体は、第１の標的染色体および第２の標的染色体であってもよい。

【0876】

第１の標的染色体は、少なくとも１つのＡＳＣＥを含む標的染色体であってもよい。

【0877】

第２の標的染色体は、少なくとも１つのＡＳＣＥを含む標的染色体であってもよい。

【0878】

一例において、第１の標的染色体は第１のＡＳＣＥを含んでもよく、第２の標的染色体は第２のＡＳＣＥを含んでもよい。ここで、第１のＡＳＣＥは、第２のＡＳＣＥと同じであっても、異なっていてもよい。

【0879】

別の例において、第１の標的染色体は、第１のＡＳＣＥおよび第２のＡＳＣＥを含んでもよく、第２の標的染色体は、第３のＡＳＣＥおよび第４のＡＳＣＥを含んでもよい。ここで、第１のＡＳＣＥ、第２のＡＳＣＥ、第３のＡＳＣＥ、および第４のＡＳＣＥのすべては、同じであっても、互いと異なっていてもよい。代替的には、第１のＡＳＣＥ、第２のＡＳＣＥ、第３のＡＳＣＥ、および第４のＡＳＣＥは、部分的に同じであっても、互いと異なっていてもよい。

【0880】

【0881】

第１の融合細胞は、第１の標的染色体および第２の標的染色体を含んでもよい。

【0882】

【0883】

【0884】

標的染色体、標的細胞、およびミクロセルの説明は、上述のとおりである。

【0885】

【0886】

第１の標的細胞は、１つまたは複数の標的染色体を含んでもよい。

【0887】

第１の標的細胞は、第１の標的染色体を含んでもよい。

【0888】

ここで、第１の標的染色体は、少なくとも１つのＡＳＣＥを含んでもよい。

【0889】

【0890】

ここで、第１の標的細胞は、第２の標的細胞と同じ個体に由来してもよい。

【0891】

ここで、第１の標的細胞および第２の標的細胞は、異なる個体に由来してもよい。異なる個体は、同種および異種の個体の両方を含んでもよい。

【0892】

たとえば、第１の標的細胞は、マウスＥＳ細胞であってもよい。ここで、第２の標的細胞は、ヒト線維芽細胞であってもよい。

【0893】

たとえば、第１の標的細胞は、マウスＥＳ細胞であってもよい。ここで、第２の標的細胞は、マウス線維芽細胞であってもよい。

【0894】

【0895】

ここで、第２の標的染色体は、少なくとも１つのＡＳＣＥを含んでもよい。

【0896】

ここで、第２の標的染色体に含まれる１つまたは複数のＡＳＣＥは、第１の標的染色体に含まれる１つまたは複数のＡＳＣＥと同じであっても、異なっていてもよい。

【0897】

ここで、第２の標的染色体に含まれる１つまたは複数のＡＳＣＥは、第１の標的染色体に含まれる１つまたは複数のＡＳＣＥと相補的結合を形成してもよい。

【0898】

【0899】

【0900】

正に荷電した界面活性物質はＰＥＧであってもよい。

【0901】

【0902】

マイトジェンは、ＰＨＡ－Ｐであってもよい。

【0903】

【0904】

第１の標的細胞は、１つまたは複数の標的染色体を含んでもよい。

【0905】

第１の標的細胞は、第１の標的染色体を含んでもよい。

【0906】

第１の標的染色体は、少なくとも２つ以上のＡＳＣＥを含んでもよい。

【0907】

ここで、２つ以上のＡＳＣＥは、第１のＡＳＣＥおよび第２のＡＳＣＥであってもよい。

【0908】

ここで、第１のＡＳＣＥは、第２のＡＳＣＥと同じであっても、異なっていてもよい。

【0909】

【0910】

ここで、第１の標的細胞は、第２の標的細胞と同じ個体に由来してもよい。

【0911】

ここで、第１の標的細胞および第２の標的細胞は、異なる個体に由来してもよい。異なる個体は、同種および異種の個体の両方を含む。

【0912】

たとえば、第１の標的細胞は、マウスＥＳ細胞であってもよい。ここで、第２の標的細胞は、ヒト線維芽細胞であってもよい。

【0913】

たとえば、第１の標的細胞は、マウスＥＳ細胞であってもよい。ここで、第２の標的細胞は、マウス線維芽細胞であってもよい。

【0914】

【0915】

ここで、第２の標的染色体は、少なくとも２つのＡＳＣＥを含んでもよい。

【0916】

ここで、２つ以上のＡＳＣＥは、第３のＡＳＣＥおよび第４のＡＳＣＥを含んでもよい。

【0917】

ここで、第３のＡＳＣＥは、第４のＡＳＣＥと同じであっても、異なっていてもよい。

【0918】

ここで、第３のＡＳＣＥは、第１のＡＳＣＥおよび／または第２のＡＳＣＥと相補的結合を形成してもよい。

【0919】

ここで、第４のＡＳＣＥは、第１のＡＳＣＥおよび／または第２のＡＳＣＥと相補的結合を形成してもよい。

【0920】

第１の標的染色体および第２の標的染色体の各々は、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。

【0921】

【0922】

正に荷電した界面活性物質はＰＥＧであってもよい。

【0923】

第１の標的細胞およびミクロセルを、正に荷電した界面活性物質で処理するステップにおいて、細胞は、マイトジェンでさらに処理されてもよい。

【0924】

マイトジェンは、ＰＨＡ－Ｐであってもよい。

【0925】

融合細胞を作製する例において、細胞融合は、特定の比でミクロセルと標的細胞とを混合することによって実施されてもよい。

【0926】

ここで、特定の比（ミクロセル：標的細胞）は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、または１：１０であってもよい。代替的には、特定の比は、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、または１０：１であってもよい。

【0927】

ここで、特定の比は、目的に従って変動してもよい。たとえば、２ｎ＋３個の染色体を有する融合細胞を作製する場合と比較して、２ｎ＋１個の染色体を有する融合細胞の作製において、標的細胞の量に基づくミクロセルの量はより小さくてもよい。

【0928】

ここで、特定の比は、目的、細胞融合時間、融合細胞単離などを含む様々な因子を考慮して、任意の比に設定してもよい。

【0929】

上述の例は、単に例であり、各構成要素（標的細胞、ミクロセル、融合細胞など）は、目的に従って、様々に修飾または改変されてもよい。
ｉｖ）融合細胞を使用する、人工組換え染色体を含む細胞の作製

【0930】

本明細書で開示される態様によれば、人工組換え染色体を含む細胞、およびそれを作製する方法を提供することができる。

【0931】

人工組換え染色体は、上述のとおりである。

【0932】

人工組換え染色体を含む細胞は、上で説明される第１の融合細胞を使用して作製されてもよい。

【0933】

第１の融合細胞は、２つ以上の標的染色体を含んでもよい。

【0934】

ここで、２つ以上の標的染色体は、第１の標的染色体および第２の標的染色体であってもよい。

【0935】

【0936】

人工組換え染色体は、第１の標的染色体と第２の標的染色体との組換えによって作製されてもよい。

【0937】

一例において、第１の標的染色体（１）が第１の部分（１１）および第１の断片（１２）を含み、第２の標的染色体（２）が第２の部分（２１）および第２の断片（２２）を含む場合、人工組換え染色体は、第１の部分（１１）および第２の断片（２２）を含む第１の人工組換え染色体（３）であってもよい。代替的には、人工組換え染色体は、第２の部分（２１）および第１の断片（１２）を含む人工組換え染色体（４）であってもよい（図２および図９）。

【0938】

別の例において、第１の標的染色体（１）が、第１の部分（１１）、および両端において断片（１２）を含み、第２の標的染色体（２）が、第２の部分（２１）、および両端において断片（２２）を含む場合、人工組換え染色体は、第１の部分（１１）、および第２の標的染色体の両端において断片（２２）を含む第１の人工組換え染色体（３）であってもよい。代替的には、人工組換え染色体は、第２の部分（２１）、および第１の標的染色体の両端において断片（１２）を含む、人工組換え染色体（４）を含んでもよい（図３）。

【0939】

さらに別の例において、第１の標的染色体（１）が両端を有する部分（１１）、および第１の断片（１２）を含み、第２の標的染色体（２）が両端を有する部分（２１）および第２の断片（２２）を含む場合、人工組換え染色体は、第１の標的染色体の両端を有する部分（１１）、および第２の断片（２２）を含む第１の人工組換え染色体（３）であってもよい。代替的には、人工組換え染色体は、第２の標的染色体の両端を有する部分（２１）、および第２の断片（１２）を含む、人工組換え染色体（４）を含んでもよい（図４および図７）。

【0940】

別の例において、第１の標的染色体（１）が、両端を含む部分（１１）、第１の部分（１３）、第１の断片（１２）、および第２の断片（１４）を含み、第２の標的染色体（２）が両端を含む部分（２１）、第２の部分（２３）、第３の断片（２２）、および第４の断片（２４）を含む場合、人工組換え染色体は、第１の標的染色体の両端を含む部分（１１）、第３の断片（２２）、第１の部分（１３）、および第４の断片（２４）を含む第１の人工組換え染色体（３）であってもよい。代替的には、人工組換え染色体は、第２の標的染色体の両端を含む部分（２１）、第１の断片（１２）、第２の部分（２３）、および第２の断片（１４）を含む人工組換え染色体（４）であってもよい（図５および図６）。

【0941】

別の例において、第１の標的染色体（１）が両端を含む部分（１１）および第１の断片（１２）を含み、第２の標的染色体（２）が第１の部分（２１）および第２の部分（２２）を含む場合、人工組換え染色体は、第１の部分（２１）、第１の断片（１２）、および第２の部分（２２）を含む人工組換え染色体（４）であってもよい（図８）。

【0942】

別の例において、第１の標的染色体（１）が両端を含む部分（１１）、および第１の断片（１２）を含み、第２の標的染色体（２）が両端を含む部分（２１）、および第２の断片（２２）を含む場合、人工組換え染色体は、第１の標的染色体の両端を含む部分（１１）、および逆位の第２の断片（２２）を含む第１の人工組換え染色体（３）であってもよい。ここで、逆位の第２の断片は、第２の標的染色体（２）に存在する第２の断片（２２）の逆位によって得られてもよい。この場合、第１の人工組換え染色体を含む細胞において、逆位の第２の断片に含まれる遺伝子は、タンパク質として発現されない場合がある。代替的には、第１の人工組換え染色体を含む細胞は、第２の標的染色体を含む第１の融合細胞と比較して、第２の断片に含まれる遺伝子の発現パターンが異なっていてもよい。代替的には、人工組換え染色体は、第２の標的染色体の両端を含む部分（２１）、および逆位の第１の断片（１２）を含む人工組換え染色体（４）であってもよい。ここで、逆位の第１の断片は、第１の標的染色体（１）に存在する第１の断片（１２）の逆位によって得られてもよい。この場合、第２の人工組換え染色体を含む細胞において、逆位の第１の断片に含まれる遺伝子は、タンパク質として発現されない場合がある。代替的には、第２の人工組換え染色体を含む細胞は、第１の融合細胞と比較して、第１の断片に含まれる遺伝子の発現パターンが異なっていてもよい（図１０）。

【0943】

人工組換え染色体は、ＲＲＳおよび／またはＡＳＣＥをさらに含んでもよい。

【0944】

人工組換え染色体は、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。
［ｉｖ－１）ＲＲＳ－ＳＳＲ媒介染色体交換］

【0945】

本明細書で開示される例示的な実施形態によれば、ＲＲＳ－ＳＳＲ媒介染色体交換法を使用する人工組換え染色体を含む細胞、およびそれを作製する方法を提供することができる（図１３から図１９）。

【0946】

人工組換え染色体を含む細胞は、上で説明される第１の融合細胞を使用して作製されてもよい。

【0947】

第１の融合細胞は、２つ以上の標的染色体を含んでもよい。

【0948】

２つ以上の標的染色体は、第１の標的染色体および第２の標的染色体を含んでもよい。

【0949】

ここで、第１の標的染色体は、１つまたは複数のＲＲＳを含んでもよい。

【0950】

ここで、第２の標的染色体は、１つまたは複数のＲＲＳを含んでもよい。

【0951】

ここで、第１の標的染色体に含まれる１つまたは複数のＲＲＳは、第２の標的染色体に含まれる１つまたは複数のＲＲＳと同じであっても、異なっていてもよい。

【0952】

ここで、第１の標的染色体に含まれる１つまたは複数のＲＲＳは、第２の標的染色体に含まれる１つまたは複数のＲＲＳと対合されてもよい。

【0953】

ここで、ＲＲＳは、公知の配列であってもよい。一例において、ＲＲＳは、表１に列挙されるＬｏｘＰバリアントから選択される１つであってもよい。

【0954】

ここで、対合は、２つ以上のＬｏｘＰバリアントの対であってもよく、対合は、ＳＳＲによって認識されてもよい。

【0955】

一例において、２つ以上のＬｏｘＰバリアントの対は、Ｌｏｘ７１およびＬｏｘ６６を含んでもよい。

【0956】

一例において、２つ以上のＬｏｘＰバリアントの対は、Ｌｏｘｍ２／７１およびＬｏｘｍ２／６６を含んでもよい。

【0957】

一例において、Ｌｏｘｍ２／７１およびＬｏｘｍ２／６６の対合は、ＳＳＲによって認識されてもよい。

【0958】

一例において、Ｌｏｘ７１およびＬｏｘ６６の対合は、ＳＳＲによって認識されてもよい。

【0959】

第１の標的染色体および第２の標的染色体は、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。

【0960】

人工組換え染色体は、１つまたは複数のＲＲＳを含んでもよい。

【0961】

人工組換え染色体は、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。

【0962】

１つの例示的な実施形態において、人工組換え染色体を含む細胞を作製する方法は、第１の融合細胞をＳＳＲで処理することを含んでもよい。

【0963】

第１の融合細胞の説明は、上述のとおりである。

【0964】

第１の融合細胞は、２つ以上の標的染色体を含んでもよい。

【0965】

２つ以上の標的染色体は、第１の標的染色体および第２の標的染色体を含んでもよい。

【0966】

ここで、第１の標的染色体は、１つまたは複数のＲＲＳ（第１のＲＲＳ）、第１の断片、および第１の部分を含んでもよい。

【0967】

ここで、第２の標的染色体は、１つまたは複数のＲＲＳ（第２のＲＲＳ）、第２の断片、および第２の部分を含んでもよい。

【0968】

一例において、第１のＲＲＳは、Ｌｏｘ７１およびＬｏｘ６６のうち一方であってもよい。ここで、第２のＲＲＳは、Ｌｏｘ７１およびＬｏｘ６６のうち他方であってもよい。たとえば、第１のＲＲＳがＬｏｘ７１である場合、第２のＲＲＳはＬｏｘ６６であってもよい。

【0969】

別の例において、第１のＲＲＳは、Ｌｏｘｍ２／７１およびＬｏｘｍ２／６６のうち一方であってもよい。ここで、第２のＲＲＳは、Ｌｏｘｍ２／７１およびＬｏｘｍ２／６６のうち他方であってもよい。たとえば、第１のＲＲＳがＬｏｘｍ２／７１である場合、第２のＲＲＳはＬｏｘｍ２／６６であってもよい。

【0970】

ここで、第１のＲＲＳは、第２のＲＲＳと対合されてもよい。

【0971】

ここで、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとが対合される部位は、ＳＳＲによって認識されてもよい。

【0972】

第１の標的染色体および第２の標的染色体の各々は、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。

【0973】

第１の融合細胞をＳＳＲで処理することは、第１の融合細胞にＳＳＲをタンパク質の形で導入または送達することであってもよい。

【0974】

ここで、タンパク質の形での導入または送達は、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、一過性の細胞圧縮もしくは圧搾（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｃｅｌｌｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎｏｒｓｑｕｅｅｚｉｎｇ）（たとえば、［Ｌｅｅ，ｅｔａｌ，（２０１２）ＮａｎｏＬｅｔｔ．，１２，６３２２－６３２７］において説明される）、脂質媒介トランスフェクション法、ナノ粒子、リポソーム、ペプチド媒介送達、またはそれらの組み合わせによって実施されてもよい。

【0975】

代替的には、第１の融合細胞をＳＳＲで処理することは、ＳＳＲをコードする核酸配列を有するベクターを第１の融合細胞に導入または送達することであってもよい。

【0976】

ここで、ベクターは、ウイルス性ベクターまたは組換えウイルス性ベクターであってもよい。ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、または単純ヘルペスウイルスであってもよいが、本発明はそれらに限定されない。

【0977】

ここで、ベクターの導入または送達は、公知のトランスフェクション法を用いて非標的供給源細胞にベクターを提供することであってもよい。たとえば、トランスフェクション法では、ウイルス性トランスフェクション法、試薬トランスフェクション法、または物理的トランスフェクション法を用いてもよい。ウイルス性トランスフェクション法では、たとえば、レンチウイルスを使用してもよい。試薬トランスフェクション法では、たとえば、リン酸カルシウム、カチオン性脂質、ＤＥＡＥ－デキストラン、またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用してもよい。物理的トランスフェクション法では、たとえば、エレクトロポレーションを使用してもよい。さらに、トランスフェクション法では、リポソームを使用してもよいが、本発明はそれらに限定されない。

【0978】

ＳＳＲは、染色体交換を誘導してもよい。

【0979】

一例において、ＳＳＲはＣｒｅリコンビナーゼであってもよい。Ｃｒｅリコンビナーゼのアミノ酸配列は、以下の表３に開示される。しかしながら、以下の表３に開示されるＣｒｅリコンビナーゼは、Ｌｏｘ７１およびＬｏｘ６６のためのＣｒｅリコンビナーゼの例であるが、本発明はそれらに限定されない。しかしながら、以下の表３に開示されるＣｒｅリコンビナーゼは、Ｌｏｘｍ２／７１およびＬｏｘｍ２／６６のためのＣｒｅリコンビナーゼの例であるが、本発明はそれらに限定されない。
［表３］
Ｃｒｅリコンビナーゼのアミノ酸配列

【表3】

【0980】

上で説明される方法によって作製される人工組換え染色体を含む細胞は、少なくとも１つまたは複数の人工組換え染色体を含んでもよい。

【0981】

ここで、１つまたは複数の人工組換え染色体は、第１の断片および第２の部分を含む第１の人工組換え染色体であってもよい。ここで、第１の人工組換え染色体は、第１のＲＲＳおよび／または第２のＲＲＳをさらに含んでもよい。代替的には、第１の人工組換え染色体は、第３のＲＲＳを含んでもよい。第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの組換えによって作製されるＲＲＳであってもよい。

【0982】

代替的には、１つまたは複数の人工組換え染色体は、第２の断片および第１の部分を含む第２の人工組換え染色体であってもよい。ここで、第２の人工組換え染色体は、第１のＲＲＳおよび／または第２のＲＲＳをさらに含んでもよい。代替的には、第２の人工組換え染色体は第３のＲＲＳを含んでもよい。第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの組換えによって作製されるＲＲＳであってもよい。

【0983】

ここで、１つまたは複数の人工組換え染色体は、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。

【0984】

別の例示的な実施形態において、人工組換え染色体を含む細胞を作製する方法は、第１の融合細胞をＳＳＲで処理することを含んでもよい。

【0985】

第１の融合細胞の説明は、上述のとおりである。

【0986】

第１の融合細胞は、２つ以上の標的染色体を含んでもよい。

【0987】

２つ以上の標的染色体は、第１の標的染色体および第２の標的染色体を含んでもよい。

【0988】

ここで、第１の標的染色体は、２つ以上のＲＲＳ（第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳ）、第１の断片、第１の部分、および第２の部分を含んでもよい。一例において、第１の標的染色体は、［第１の部分］－［第１のＲＲＳ］－［第１の断片］－［第２のＲＲＳ］－［第２の部分］からなってもよい。

【0989】

ここで、第２の標的染色体は、２つ以上のＲＲＳ（第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳ）、第２の断片、第３の部分、および第４の部分を含んでもよい。一例において、第２の標的染色体は、［第３の部分］－［第３のＲＲＳ］－［第２の断片］－［第４のＲＲＳ］－［第４の部分］からなってもよい。

【0990】

一例において、第１のＲＲＳは、Ｌｏｘ７１およびＬｏｘ６６のうち一方であってもよい。ここで、第３のＲＲＳまたは第４のＲＲＳは、Ｌｏｘ７１およびＬｏｘ６６のうち他方であってもよい。たとえば、第１のＲＲＳがＬｏｘ７１である場合、第３のＲＲＳはＬｏｘ６６であってもよい。代替的には、第１のＲＲＳがＬｏｘ７１である場合、第４のＲＲＳはＬｏｘ６６であってもよい。

【0991】

別の例において、第２のＲＲＳは、Ｌｏｘｍ２／７１およびＬｏｘｍ２／６６のうち一方であってもよい。ここで、第３のＲＲＳまたは第４のＲＲＳは、Ｌｏｘｍ２／７１およびＬｏｘｍ２／６６のうち他方であってもよい。たとえば、第２のＲＲＳがＬｏｘｍ２／７１である場合、第３のＲＲＳはＬｏｘｍ２／６６であってもよい。代替的には、第２のＲＲＳがＬｏｘｍ２／７１である場合、第４のＲＲＳはＬｏｘｍ２／６６であってもよい。

【0992】

ここで、第１のＲＲＳは、第３のＲＲＳまたは第４のＲＲＳと対合されてもよい。

【0993】

ここで、第２のＲＲＳは、第３のＲＲＳまたは第４のＲＲＳと対合されてもよい。

【0994】

たとえば、第１のＲＲＳは、第３のＲＲＳと対合されてもよく、第２のＲＲＳは、第４のＲＲＳと対合されてもよい。代替的には、第１のＲＲＳは、第４のＲＲＳと対合されてもよく、第２のＲＲＳは、第３のＲＲＳと対合されてもよい。

【0995】

ここで、第１のＲＲＳが、第３のＲＲＳまたは第４のＲＲＳと対合される部位は、ＳＳＲによって認識されてもよい。

【0996】

ここで、第２のＲＲＳが、第３のＲＲＳまたは第４のＲＲＳと対合される部位は、ＳＳＲによって認識されてもよい。

【0997】

第１の標的染色体および第２の標的染色体の各々は、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。

【0998】

第１の融合細胞をＳＳＲで処理することは、タンパク質、または第１の融合細胞にＳＳＲをコードする核酸配列の形で、第１の融合細胞にＳＳＲを導入または送達することであってもよい。ここで、導入または送達の説明は、上述のとおりである。

【0999】

ＳＳＲは、染色体交換を誘導してもよい。

【1000】

一例において、ＳＳＲはＣｒｅリコンビナーゼであってもよい。

【1001】

上で説明される方法によって作製される人工組換え染色体を含む細胞は、少なくとも１つまたは複数の人工組換え染色体を含んでもよい。

【1002】

ここで、１つまたは複数の人工組換え染色体は、第３の部分、第１の断片、および第４の部分を含む第１の人工組換え染色体であってもよい。ここで、第１の人工組換え染色体は、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、第３のＲＲＳ、および／または第４のＲＲＳをさらに含んでもよい。代替的には、第１の人工組換え染色体は、第５のＲＲＳを含んでもよい。第５のＲＲＳは、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳのうち対合される２つのＲＲＳの組換えによって作製されるＲＲＳであってもよい。

【1003】

代替的には、１つまたは複数の人工組換え染色体は、第１の部分、第２の断片、および第２の部分を含む第２の人工組換え染色体であってもよい。ここで、第２の人工組換え染色体は、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、第３のＲＲＳ、および／または第４のＲＲＳをさらに含んでもよい。代替的には、第２の人工組換え染色体は第５のＲＲＳを含んでもよい。第５のＲＲＳは、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳのうち対合される２つのＲＲＳの組換えによって作製されるＲＲＳであってもよい。

【1004】

ここで、１つまたは複数の人工組換え染色体は、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。

【1005】

さらに別の例示的な実施形態において、人工組換え染色体を含む細胞を作製する方法は、第１の融合細胞をＳＳＲで処理することを含んでもよい。

【1006】

第１の融合細胞の説明は、上述のとおりである。

【1007】

第１の融合細胞は、２つ以上の標的染色体を含んでもよい。

【1008】

２つ以上の標的染色体は、第１の標的染色体および第２の標的染色体を含んでもよい。

【1009】

【1010】

ここで、第１の断片は、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳをさらに含んでもよい。この場合において、第３のＲＲＳは、第４のＲＲＳと対合されてもよい。

【1011】

ここで、第２の標的染色体は、２つ以上のＲＲＳ（第５のＲＲＳおよび第６のＲＲＳ）、第２の断片、第３の部分、および第４の部分を含んでもよい。一例において、第２の標的染色体は、［第３の部分］－［第５のＲＲＳ］－［第２の断片］－［第６のＲＲＳ］－［第４の部分］からなってもよい。

【1012】

ここで、第２の断片は、第７のＲＲＳおよび第８のＲＲＳをさらに含んでもよい。この場合において、第７のＲＲＳは、第８のＲＲＳと対合されてもよい。

【1013】

一例において、第１のＲＲＳは、Ｌｏｘ７１およびＬｏｘ６６のうち一方であってもよい。ここで、第６のＲＲＳは、Ｌｏｘ７１およびＬｏｘ６６のうち他方であってもよい。たとえば、第１のＲＲＳがＬｏｘ７１である場合、第６のＲＲＳはＬｏｘ６６であってもよい。

【1014】

別の例において、第２のＲＲＳは、Ｌｏｘｍ２／７１およびＬｏｘｍ２／６６のうち一方であってもよい。ここで、第５のＲＲＳは、Ｌｏｘｍ２／７１およびＬｏｘｍ２／６６のうち他方であってもよい。たとえば、第２のＲＲＳがＬｏｘｍ２／７１である場合、第５のＲＲＳはＬｏｘｍ２／６６であってもよい。

【1015】

ここで、第１のＲＲＳは、第６のＲＲＳと対合されてもよい。

【1016】

ここで、第２のＲＲＳは、第５のＲＲＳと対合されてもよい。

【1017】

ここで、第１のＲＲＳと第６のＲＲＳとが対合される部位は、ＳＳＲによって認識されてもよい。

【1018】

ここで、第２のＲＲＳと第５のＲＲＳとが対合される部位は、ＳＳＲによって認識されてもよい。

【1019】

第１の標的染色体および第２の標的染色体の各々は、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。

【1020】

第１の融合細胞をＳＳＲで処理することは、タンパク質、またはそれをコードする核酸配列を含むベクターの形で、第１の融合細胞にＳＳＲを導入または送達することであってもよい。ここで、導入または送達の説明は、上述のとおりである。

【1021】

ＳＳＲは、染色体交換を誘導してもよい。

【1022】

一例において、ＳＳＲはＣｒｅリコンビナーゼであってもよい。

【1023】

上で説明される方法によって作製される人工組換え染色体を含む細胞は、少なくとも１つまたは複数の人工組換え染色体を含んでもよい。

【1024】

ここで、１つまたは複数の人工組換え染色体は、第３の部分、逆位の第１の断片、および第４の部分を含む第１の人工組換え染色体であってもよい。ここで、逆位の第１の断片は、第１の標的染色体に含まれる第１の断片の逆位によって得られてもよい。ここで、第１の人工組換え染色体は、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、第５のＲＲＳ、および／または第６のＲＲＳをさらに含んでもよい。代替的には、第１の人工組換え染色体は、第９のＲＲＳをさらに含んでもよい。第９のＲＲＳは、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、第５のＲＲＳ、および第６のＲＲＳのうち対合される２つのＲＲＳの組換えによって作製されるＲＲＳであってもよい。

【1025】

代替的には、ここで、１つまたは複数の人工組換え染色体は、第１の部分、逆位の第２の断片、および第２の部分を含む第２の人工組換え染色体であってもよい。ここで、逆位の第２の断片は、第２の標的染色体に含まれる第２の断片の逆位によって得られてもよい。ここで、第２の人工組換え染色体は、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、第５のＲＲＳ、および／または第６のＲＲＳをさらに含んでもよい。代替的には、第２の人工組換え染色体は第９のＲＲＳをさらに含んでもよい。第９のＲＲＳは、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、第５のＲＲＳ、および第６のＲＲＳのうち対合される２つのＲＲＳの組換えによって作製されるＲＲＳであってもよい。

【1026】

ここで、１つまたは複数の人工組換え染色体は、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。

【1027】

第１の人工組換え染色体を含む細胞において、逆位の第１の断片に含まれる遺伝子は、タンパク質として発現されない場合がある。代替的には、第１の人工組換え染色体を含む細胞は、第１の標的染色体を含む第１の融合細胞と比較して、第１の断片に含まれる遺伝子の発現パターンが異なっていてもよい。

【1028】

第２の人工組換え染色体を含む細胞において、逆位の第２の断片に含まれる遺伝子は、タンパク質として発現されない場合がある。代替的には、第２の人工組換え染色体含まれる細胞は、第２の標的染色体を含む第１の融合細胞と比較して、第２の断片に含まれる遺伝子の発現パターンが異なっていてもよい。

【1029】

上で説明される方法によって作製される人工組換え染色体を含む細胞は、特定の条件下で特定の遺伝子の発現において制御されてもよい。

【1030】

特定の条件は、人工組換え染色体を含む細胞をＳＳＲで処理することであってもよい。ここで、特定の遺伝子は、人工組換え染色体に含まれる遺伝子であってもよい。

【1031】

一例において、第１の人工組換え染色体を含む細胞において、特定の遺伝子は、第１の人工組換え染色体の、逆位の第１の断片に存在してもよい。ここで、特定の遺伝子は、逆位の形で存在してもよい。この場合、第１の人工組換え染色体を含む細胞は、ＳＳＲで処理されてもよい。第１の人工組換え染色体を含む、ＳＳＲで処理された細胞において、逆位の第１の断片は、再逆位されて（ｒｅｉｎｖｅｒｔｅｄ）もよい。再逆位（ｒｅｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）は、第１の断片に含まれる第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳの対合、およびそれを認識するＳＳＲによって生じさせてもよい。再逆位された第１の断片を含む第１の人工組換え染色体を含む細胞は、特定の遺伝子がタンパク質を発現することを可能にしてもよい。

【1032】

別の例において、第２の人工組換え染色体を含む細胞において、特定の遺伝子は、第２の人工組換え染色体の、逆位の第２の断片に存在してもよい。ここで、特定の遺伝子は、逆位の形で存在してもよい。この場合、第２の人工組換え染色体を含む細胞は、ＳＳＲで処理されてもよい。第２の人工組換え染色体を含む、ＳＳＲで処理された細胞において、逆位の第２の断片は、再逆位されてもよい。再逆位は、第２の断片に含まれる第７のＲＲＳおよび第８のＲＲＳの対合、およびそれを認識するＳＳＲによって生じさせてもよい。再逆位された第２の断片を含む第２の人工組換え染色体を含む細胞は、特定の遺伝子がタンパク質を発現することを可能にしてもよい。

【1033】

上で説明される方法によって作製される人工組換え染色体を含む細胞を含む動物は、特定の遺伝子の発現を調節してもよい。ここで、特定の条件は、動物へのＳＳＲの導入または送達であってもよい。

【1034】

上で説明される方法によって作製される人工組換え染色体を含む細胞を使用して作製される動物は、特定の遺伝子の発現を調節してもよい。ここで、特定の条件は、ＳＳＲの動物への導入または送達であってもよい。
［ｉｖ－２）ＡＳＣＥ－ＨＲ媒介染色体交換］

【1035】

本明細書で開示される例示的な実施形態によれば、ＡＳＣＥ－ＨＲ媒介染色体交換法を使用する人工組換え染色体を含む細胞、およびそれを作製する方法を提供することができる。

【1036】

人工組換え染色体を含む細胞は、上で説明される第１の融合細胞を使用して作製されてもよい。

【1037】

第１の融合細胞は、２つ以上の標的染色体を含んでもよい。

【1038】

２つ以上の標的染色体は、第１の標的染色体および第２の標的染色体を含んでもよい。

【1039】

ここで、第１の標的染色体は、１つまたは複数のＡＳＣＥを含んでもよい。

【1040】

ここで、第２の標的染色体は、１つまたは複数のＡＳＣＥを含んでもよい。

【1041】

ここで、第１の標的染色体に含まれる１つまたは複数のＡＳＣＥは、第２の標的染色体に含まれるＡＳＣＥと同じであっても、異なっていてもよい。

【1042】

ここで、第１の標的染色体に含まれる１つまたは複数のＡＳＣＥは、第２の標的染色体に含まれるＡＳＣＥと相補的結合を形成してもよい。

【1043】

ここで、第１の標的染色体に含まれる１つまたは複数のＡＳＣＥ、および第２の標的染色体に含まれる１つまたは複数のＡＳＣＥは、少なくとも８０％以上の相同性を有するヌクレオチドを含む核酸であってもよい。

【1044】

【1045】

１つの例示的な実施形態において、人工組換え染色体を含む細胞を作製する方法は、相同組換えを誘導する因子で第１の融合細胞を処理することを含んでもよい。

【1046】

第１の融合細胞の説明は、上述のとおりである。

【1047】

第１の融合細胞は、２つ以上の標的染色体を含んでもよい。

【1048】

２つ以上の標的染色体は、第１の標的染色体および第２の標的染色体であってもよい。

【1049】

ここで、第１の標的染色体は、１つまたは複数のＡＳＣＥ（第１のＡＳＣＥ）、第１の断片、および第１の部分を含んでもよい。

【1050】

ここで、第２の標的染色体は、１つまたは複数のＡＳＣＥ（第２のＡＳＣＥ）、第２の断片、および第２の部分を含んでもよい。

【1051】

ここで、第１のＡＳＣＥは、第２のＡＳＣＥと相補的結合を形成してもよい。

【1052】

ここで、第１のＡＳＣＥおよび第２のＡＳＣＥは、少なくとも８０％以上の相同性を有するヌクレオチドを含む核酸であってもよい。

【1053】

【1054】

相同組換えを誘導する因子は、第１の標的染色体および／または第２の標的染色体の二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導する因子であってもよい。

【1055】

相同組換えを誘導する因子は、第１の標的染色体および／または第２の標的染色体の一本鎖切断（ＳＳＢ）を誘導する因子であってもよい。

【1056】

ここで、相同組換えを誘導する因子は、染色体切断物質（染色体異常を誘導する物質）であってもよい。染色体切断物質は、電離放射線、ＵＶ、Ｘ線、γ線、反応性酸素種、または特定の化学物質であってもよい。特定の化学物質は、たとえば、ブレオマイシン、ヒドロキシウレア、カンプトテシン、４－ニトロキノリン１－酸化物（４－ＮＱＯ）、シスプラチン、またはＥＭＳまたはＭＭＳなどのメチル化剤であってもよいが、本発明はそれらに限定されない。

【1057】

ここで、相同組換えを誘導する因子は、操作されたヌクレアーゼであってもよい。たとえば、操作されたヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはクラスター化され規則的に間隔があいた短い回文構造の反復／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）であってもよい。

【1058】

ここで、操作されたヌクレアーゼは、タンパク質、またはそれをコードする核酸配列を含むベクターの形で、第１の融合細胞に導入または送達されてもよい。タンパク質の形での導入または送達は、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、一過性の細胞圧縮もしくは圧搾（たとえば、［Ｌｅｅ，ｅｔａｌ，（２０１２）ＮａｎｏＬｅｔｔ．，１２，６３２２－６３２７］において説明される）、脂質媒介トランスフェクション法、ナノ粒子、リポソーム、ペプチド媒介送達、またはそれらの組み合わせによって実施されてもよい。ベクターは、ウイルス性ベクターまたは組換えウイルス性ベクターであってもよい。ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、または単純ヘルペスウイルスであってもよいが、本発明はそれらに限定されない。ここで、ベクターの形での導入または送達は、公知のトランスフェクション法を用いて非標的供給源細胞に提供されてもよい。たとえば、トランスフェクション法は、ウイルス性トランスフェクション法、試薬トランスフェクション法、または物理的トランスフェクション法であってもよい。ウイルス性トランスフェクション法では、たとえば、レンチウイルスを使用してもよい。試薬トランスフェクション法では、たとえば、リン酸カルシウム、カチオン性脂質、ＤＥＡＥ－デキストラン、またはＰＥＩを使用してもよい。物理的トランスフェクション法では、たとえば、エレクトロポレーションを使用してもよい。さらに、トランスフェクション法では、リポソームを使用してもよいが、本発明はそれらに限定されない。

【1059】

ＤＳＢまたはＳＳＢを使用する相同組換えは、染色体交換を誘導してもよい。

【1060】

上で説明される方法によって作製される人工組換え染色体を含む細胞は、少なくとも１つまたは複数の人工組換え染色体を含んでもよい。

【1061】

ここで、１つまたは複数の人工組換え染色体は、第１の断片および第２の部分を含む第１の人工組換え染色体であってもよい。ここで、第１の人工組換え染色体は、第１のＡＳＣＥおよび／または第２のＡＳＣＥをさらに含んでもよい。代替的には、第１の人工組換え染色体は、第３のＡＳＣＥを含んでもよい。第３のＡＳＣＥは、第１のＡＳＣＥおよび第２のＡＳＣＥの組換えによって作製されるＡＳＣＥであってもよい。

【1062】

代替的には、ここで、１つまたは複数の人工組換え染色体は、第２の断片、および第１の部分を含む第２の人工組換え染色体であってもよい。ここで、第２の人工組換え染色体は、第１のＡＳＣＥおよび／または第２のＡＳＣＥをさらに含んでもよい。代替的には、第２の人工組換え染色体は第３のＡＳＣＥを含んでもよい。第３のＡＳＣＥは、第１のＡＳＣＥおよび第２のＡＳＣＥの組換えによって作製されるＡＳＣＥであってもよい。

【1063】

ここで、１つまたは複数の人工組換え染色体は、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。

【1064】

別の例示的な実施形態において、人工組換え染色体を含む細胞を作製する方法は、相同組換えを誘導する因子で第１の融合細胞を処理することを含んでもよい。

【1065】

第１の融合細胞の説明は、上述のとおりである。

【1066】

第１の融合細胞は、２つ以上の標的染色体を含んでもよい。

【1067】

２つ以上の標的染色体は、第１の標的染色体および第２の標的染色体を含んでもよい。

【1068】

ここで、第１の標的染色体は、２つ以上のＡＳＣＥ（第１のＡＳＣＥおよび第２のＡＳＣＥ）、第１の断片、第１の部分、および第２の部分を含んでもよい。一例において、第１の標的染色体は、［第１の部分］－［第１のＡＳＣＥ］－［第１の断片］－［第２のＡＳＣＥ］－［第２の部分］からなってもよい。

【1069】

ここで、第２の標的染色体は、２つ以上のＡＳＣＥ（第３のＡＳＣＥおよび第４のＡＳＣＥ）、第２の断片、第３の部分、および第４の部分を含んでもよい。一例において、第２の標的染色体は、［第３の部分］－［第３のＡＳＣＥ］－［第２の断片］－［第４のＡＳＣＥ］－［第４の部分］からなってもよい。

【1070】

ここで、第１のＡＳＣＥは、第３のＡＳＣＥまたは第４のＡＳＣＥと相補的結合を形成してもよい。この場合、第１のＡＳＣＥは、第３のＡＳＣＥまたは第４のＡＳＣＥと少なくとも８０％以上の相同性を有するヌクレオチドを含む核酸であってもよい。

【1071】

ここで、第２のＡＳＣＥは、第３のＡＳＣＥまたは第４のＡＳＣＥと相補的結合を形成してもよい。この場合、第２のＡＳＣＥは、第３のＡＳＣＥまたは第４のＡＳＣＥと少なくとも８０％以上の相同性を有するヌクレオチドを含む核酸を含んでよい。

【1072】

【1073】

相同組換えを誘導する因子は、第１の標的染色体および／または第２の標的染色体のＤＳＢを誘導する因子であってもよい。

【1074】

相同組換えを誘導する因子は、第１の標的染色体および／または第２の標的染色体のＳＳＢを誘導する因子であってもよい。

【1075】

【1076】

ここで、相同組換えを誘導する因子は、操作されたヌクレアーゼであってもよい。操作されたヌクレアーゼは、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓであってもよい。

【1077】

ここで、操作されたヌクレアーゼは、タンパク質、またはそれをコードする核酸配列を含むベクターの形で、第１の融合細胞に導入または送達されてもよい。誘導または送達の説明は、上述のとおりである。

【1078】

ＤＳＢまたはＳＳＢを使用する相同組換えは、染色体交換を誘導してもよい。

【1079】

上で説明される方法によって作製される人工組換え染色体を含む細胞は、少なくとも１つまたは複数の人工組換え染色体を含んでもよい。

【1080】

ここで、１つまたは複数の人工組換え染色体は、第３の部分、第１の断片、および第４の部分を含む第１の人工組換え染色体であってもよい。ここで、第１の人工組換え染色体は、第１のＡＳＣＥ、第２のＡＳＣＥ、第３のＡＳＣＥ、および／または第４のＡＳＣＥをさらに含んでもよい。代替的には、第１の人工組換え染色体は、第５のＡＳＣＥを含んでもよい。第５のＡＳＣＥは、第１のＡＳＣＥ、第２のＡＳＣＥ、第３のＡＳＣＥ、および第４のＡＳＣＥのうち相補的に結合された２つのＡＳＣＥの組換えによって作製されるＡＳＣＥであってもよい。

【1081】

代替的には、ここで、１つまたは複数の人工組換え染色体は、第１の部分、第２の断片、および第２の部分を含む第２の人工組換え染色体であってもよい。ここで、第２の人工組換え染色体は、第１のＡＳＣＥ、第２のＡＳＣＥ、第３のＡＳＣＥ、および／または第４のＡＳＣＥをさらに含んでもよい。代替的には、第２の人工組換え染色体は第５のＡＳＣＥを含んでもよい。第５のＡＳＣＥは、第１のＡＳＣＥ、第２のＡＳＣＥ、第３のＡＳＣＥ、および第４のＡＳＣＥのうち相補的に結合された２つのＡＳＣＥの組換えによって作製されるＡＳＣＥであってもよい。

【1082】

ここで、１つまたは複数の人工組換え染色体は、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。

【1083】

さらに別の例示的な実施形態において、人工組換え染色体を含む細胞を作製する方法は、相同組換えを誘導する因子で第１の融合細胞を処理することを含んでもよい。

【1084】

第１の融合細胞の説明は、上述のとおりである。

【1085】

第１の融合細胞は、２つ以上の標的染色体を含んでもよい。

【1086】

２つ以上の標的染色体は、第１の標的染色体および第２の標的染色体を含んでもよい。

【1087】

【1088】

ここで、第１の断片は、第３のＡＳＣＥおよび第４のＡＳＣＥをさらに含んでもよい。この場合、第３のＡＳＣＥは、第４のＡＳＣＥと相補的結合を形成してもよい。

【1089】

ここで、第２の標的染色体は、２つ以上のＡＳＣＥ（第５のＡＳＣＥおよび第６のＡＳＣＥ）、第２の断片、第３の部分、および第４の部分を含んでもよい。一例において、第２の標的染色体は、［第３の部分］－［第５のＡＳＣＥ］－［第２の断片］－［第６のＡＳＣＥ］－［第４の部分］からなってもよい。

【1090】

ここで、第２の断片は、第７のＡＳＣＥおよび第８のＡＳＣＥをさらに含んでもよい。この場合、第７のＡＳＣＥは、第８のＡＳＣＥと相補的結合を形成してもよい。

【1091】

第１のＡＳＣＥは、第６のＡＳＣＥと相補的結合を形成してもよい。この場合、第１のＡＳＣＥは、第６のＡＳＣＥと少なくとも８０％以上の相同性を有するヌクレオチドを有する核酸であってもよい。

【1092】

第２のＡＳＣＥは、第５のＡＳＣＥと相補的結合を形成してもよい。この場合、第２のＡＳＣＥは、第５のＡＳＣＥと少なくとも８０％以上の相同性を有するヌクレオチドを有する核酸であってもよい。

【1093】

第１の標的染色体および第２の標的染色体の各々は、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。

【1094】

相同組換えを誘導する因子は、第１の標的染色体および／または第２の標的染色体のＤＳＢを誘導する因子であってもよい。

【1095】

相同組換えを誘導する因子は、第１の標的染色体および／または第２の標的染色体のＳＳＢを誘導する因子であってもよい。

【1096】

【1097】

【1098】

【1099】

ＤＳＢまたはＳＳＢを使用する相同組換えは、染色体交換を誘導してもよい。

【1100】

上で説明される方法によって作製される人工組換え染色体を含む細胞は、少なくとも１つまたは複数の人工組換え染色体を含んでもよい。

【1101】

ここで、１つまたは複数の人工組換え染色体は、第３の部分、逆位の第１の断片、および第４の部分を含む第１の人工組換え染色体であってもよい。ここで、逆位の第１の断片は、第１の標的染色体に含まれる第１の断片の逆位によって得られてもよい。ここで、第１の人工組換え染色体は、第１のＡＳＣＥ、第２のＡＳＣＥ、第５のＡＳＣＥ、および／または第６のＡＳＣＥをさらに含んでもよい。代替的には、第１の人工組換え染色体は、第９のＡＳＣＥをさらに含んでもよい。第９のＡＳＣＥは、第１のＡＳＣＥ、第２のＡＳＣＥ、第５のＡＳＣＥ、および第６のＡＳＣＥのうち対合される２つのＡＳＣＥの組換えによって作製されるＡＳＣＥであってもよい。

【1102】

代替的には、ここで、１つまたは複数の人工組換え染色体は、第１の部分、逆位の第２の断片、および第２の部分を含む第２の人工組換え染色体であってもよい。ここで、逆位の第２の断片は、第２の標的染色体に含まれる第２の断片の逆位によって得られてもよい。ここで、第２の人工組換え染色体は、第１のＡＳＣＥ、第２のＡＳＣＥ、第５のＡＳＣＥ、および／または第６のＡＳＣＥをさらに含んでもよい。代替的には、第２の人工組換え染色体は第９のＡＳＣＥをさらに含んでもよい。第９のＡＳＣＥは、第１のＡＳＣＥ、第２のＡＳＣＥ、第５のＡＳＣＥ、および第６のＡＳＣＥのうち対合される２つのＡＳＣＥの組換えによって作製されるＡＳＣＥであってもよい。

【1103】

ここで、１つまたは複数の人工組換え染色体は、選択マーカー遺伝子および／またはトランスポゾンＩＴＲ配列をさらに含んでもよい。

【1104】

【1105】

第２の人工組換え染色体を含む細胞において、逆位の第２の断片に含まれる遺伝子は、タンパク質として発現されない場合がある。代替的には、第２の人工組換え染色体を含む細胞は、第２の標的染色体を含む第１の融合細胞と比較して、第２の断片に含まれる遺伝子の発現パターンが異なっていてもよい。

【1106】

上で説明される方法によって作製される人工組換え染色体を含む細胞は、特定の条件下で特定の遺伝子の発現において制御されてもよい。

【1107】

特定の条件は、人工組換え染色体を含む細胞を、相同組換えを誘導する因子で処理することであってもよい。ここで、特定の遺伝子は、人工組換え染色体に含まれる遺伝子であってもよい。

【1108】

一例において、第１の人工組換え染色体を含む細胞において、特定の遺伝子は、第１の人工組換え染色体の、逆位の第１の断片に存在してもよい。ここで、特定の遺伝子は、逆位の形で存在してもよい。この場合、第１の人工組換え染色体を含む細胞は、相同組換えを誘導する因子で処理されてもよい。相同組換えを誘導する因子で処理された第１の人工組換え染色体を含む細胞において、逆位の第１の断片は、再逆位されてもよい。再逆位は、第１の断片に含まれる第３のＡＳＣＥおよび第４のＡＳＣＥの相補的結合によって生じさせてもよい。再逆位された第１の断片を含む第１の人工組換え染色体を含む細胞において、特定の遺伝子は、タンパク質を産生するように発現されてもよい。

【1109】

別の例において、第２の人工組換え染色体を含む細胞において、特定の遺伝子は、第２の人工組換え染色体の、逆位の第２の断片に存在してもよい。ここで、特定の遺伝子は、逆位の形で存在してもよい。この場合、第２の人工組換え染色体を含む細胞は、相同組換えを誘導する因子で処理されてもよい。相同組換えを誘導する因子で処理された第２の人工組換え染色体を含む細胞において、逆位の第２の断片は、再逆位されてもよい。再逆位は、第２の断片に含まれる第７のＡＳＣＥおよび第８のＡＳＣＥの相補的結合によって生じさせてもよい。再逆位された第２の断片を含む第２の人工組換え染色体を含む細胞において、特定の遺伝子は、タンパク質を産生するように発現されてもよい。

【1110】

さらに、上で説明される方法によって作製される人工組換え染色体を含む細胞を含む動物は、特定の遺伝子の発現において制御されてもよい。ここで、特定の条件は、動物に相同組換えを誘導する因子を導入または送達することであってもよい。

【1111】

さらに、上で説明される方法によって作製される人工組換え染色体を含む細胞を使用して作製される動物は、特定の遺伝子の発現において制御されてもよい。ここで、特定の条件は、動物に相同組換えを誘導する因子を誘導または送達することであってもよい。

【1112】

本明細書で開示される人工組換え染色体を作製する方法は、人工種間染色体セグメント交換（ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓｅｇｍｅｎｔｅｘｃｈａｎｇｅ）（ＡｉＣＥ）技術と呼ばれてもよい。ＡｉＣＥは、人工組換え染色体を形成するために、第１の標的染色体の第１の断片を第２の標的染色体の第２の断片と交換することである。ＡｉＣＥは、人工組換え染色体を形成するために、第１の標的染色体の第１の断片を第２の標的染色体の第３の断片と交換し、第１の標的染色体の第２の断片を第３の標的染色体の第４の断片と交換することである。ここで、人工組換え染色体の作製は、断片の数に限定されない。たとえば、人工組換え染色体を形成するために、第１の標的染色体の第１の断片、第２の標的染色体の第２の断片、第３の標的染色体の第３の断片が使用されてもよい。たとえば、人工組換え染色体を形成するために、第１の標的染色体の第１の断片、第２の標的染色体の第２の断片、第３の標的染色体の第３の断片、第ｎの標的染色体の第ｎの断片が使用されてもよい。
ｉｖ－３）組換えのための構成要素の除去

【1113】

本明細書で開示される別の態様によれば、人工組換え染色体を含む細胞、およびそれを作製する方法は、組換えのための構成要素を除去することをさらに含んでもよい（図２０）。

【1114】

人工組換え染色体を含む細胞を作製する方法では、ＲＲＳ－ＳＳＲ媒介染色体交換法またはＡＳＣＥ－ＨＲ媒介染色体交換法を用いてもよい。

【1115】

ＲＲＳ－ＳＳＲ媒介染色体交換法およびＡＳＣＥ－ＨＲ媒介染色体交換法の説明は、上述のとおりである。

【1116】

人工組換え染色体を含む細胞を作製する方法は、組換えのための構成要素を除去することをさらに含んでもよい。

【1117】

ここで、組換えのための構成要素は、ＲＲＳまたはＡＳＣＥであってもよい。

【1118】

ここで、組換えのための構成要素は、人工組換え染色体に含まれてもよい。

【1119】

組換えのための構成要素を除去することでは、トランスポゾンシステムを用いてもよい。トランスポゾンシステムでは、当技術分野で公知の方法を用いてもよい。公知の方法としては、Ｆｒａｓｅｒ，ＭＪｅｔａｌ．（"ＡｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎｏｆＨｏｓｔＣｅｌｌＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｓｂｙＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ：ＲｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐＢｅｔｗｅｅｎＨｏｓｔＤＮＡＩｎｓｅｒｔｉｏｎｓａｎｄＦＰＭｕｔａｎｔｓｏｆＡｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａａｎｄＧａｌｌｅｒｉａｍｅｌｌｏｎｅｌｌａＮｕｃｌｅａｒＰｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓＶｉｒｕｓｅｓ，"１９８３，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ．４７（２）：２８７-３００．）；Ｓａｒｋａｒ，Ａ．ｅｔａｌ．（"ＭｏｌｅｃｕｌａｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｗｉｄｅｓｐｒｅａｄｐｉｇｇｙＢａｃｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｆａｍｉｌｙａｎｄｒｅｌａｔｅｄ"ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ"ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，"２００３，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＧｅｎｏｍｉｃｓ．２７０（２）：１７３-１８０）；Ｂｏｕａｌｌｅｇｕｅ，Ｍｅｔａｌ．（"ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｐｉｇｇｙＢａｃＳｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：ＦｒｏｍＳｅｌｆｉｓｈｎｅｓｓｔｏＤｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎ，"２０１７，ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎ．９（２）：３２３-３３９）；ＧｒａｂｕｎｄｚｉｊａＩｅｔａｌ．（"Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅｅｌｅｍｅｎｔｖｅｃｔｏｒｓｙｓｔｅｍｓｉｎｈｕｍａｎｃｅｌｌｓ，"２０１０，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８（６）：１２００-１２０９）；Ｃａｄｉｎａｎｏｓ，ＪａｎｄＢｒａｄｌｅｙ，Ａ（"ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆａｎｉｎｄｕｃｉｂｌｅａｎｄｏｐｔｉｍｉｚｅｄｐｉｇｇｙＢａｃｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓｙｓｔｅｍ，"２００７，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ．３５（１２）：ｅ８７）；ＩｚｓｖａｋＺａｎｄＩｖｉｃｓＺ（"Ｓｌｅｅｐｉｎｇｂｅａｕｔｙｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ：ｂｉｏｌｏｇｙａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｈｅｒａｐｙ，"２００４，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９（２）：１４７-１５６）；ＭａｔｅｓＬｅｔａｌ．（"ＭｏｌｅｃｕｌａｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆａｎｏｖｅｌｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｅＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅｅｎａｂｌｅｓｒｏｂｕｓｔｓｔａｂｌｅｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ，"２００９，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４１（６）：７５３-７６１）；およびＹｕｓａ，Ｋ．ｅｔａｌ．（"ＡｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｅｐｉｇｇｙＢａｃｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅｆｏｒｍａｍｍａｌｉａｎａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，"２０１１，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ．１０８（４）：１５３１－１５３６）が参照されてもよいが、本発明は、それらに限定されない。

【1120】

上で説明される方法（組換えのための要素を除去することを含む方法）によって作製される人工組換え染色体を含む細胞は、組換えのための構成要素を含まない、少なくとも１つまたは複数の人工組換え染色体を含んでもよい。

【1121】

ここで、人工組換え染色体を含む細胞は、ＲＲＳを含まない、少なくとも１つまたは複数の人工組換え染色体を含んでもよい。

【1122】

ここで、人工組換え染色体を含む細胞は、ＡＳＣＥを含まない、少なくとも１つまたは複数の人工組換え染色体を含んでもよい。

【1123】

以下に、説明の便宜を図って、組換えのための構成要素を含まない人工組換え染色体を最終の人工組換え染色体として説明する。

【1124】

１つの例示的な実施形態において、人工組換え染色体を含む細胞を作製する方法は、
ａ）第１の融合細胞をＳＳＲで処理すること、および
ｂ）ａ）において形成される細胞（第２の融合細胞）をトランスポザーゼ、またはそれをコードする核酸で処理すること、を含んでもよい。

【1125】

別の例示的な実施形態において、人工組換え染色体を含む細胞を作製する方法は、
ａ）第１の融合細胞を、相同組換えを誘導する因子で処理すること、および
ｂ）ａ）において形成される細胞（第２の融合細胞）をトランスポザーゼ、またはそれをコードする核酸で処理すること、を含んでもよい。

【1126】

ａ）第１の融合細胞をＳＳＲで処理すること、およびａ）ａ）において形成される第１の融合細胞を、相同組換えを誘導する因子で処理することの説明は、ｉｖ－１およびｉｖ－２において説明されるとおりである。

【1127】

ａ）において作製される細胞（第２の融合細胞）は、人工組換え染色体を含む細胞であってもよい。

【1128】

ここで、人工組換え染色体は、少なくとも１つまたは複数のＲＲＳまたはＡＳＣＥを含む人工組換え染色体であってもよい。

【1129】

ここで、人工組換え染色体は、少なくとも１つまたは複数のトランスポゾンＩＴＲ配列を含んでもよい。

【1130】

人工組換え染色体は、選択マーカー遺伝子をさらに含んでもよい。

【1131】

第２の融合細胞は、少なくとも１つまたは複数のＲＲＳまたはＡＳＣＥを含む、１つまたは複数の人工組換え染色体を含んでもよい。

【1132】

第２の融合細胞は、少なくとも１つまたは複数のトランスポゾンＩＴＲ配列を含む、１つまたは複数の人工組換え染色体を含んでもよい。

【1133】

トランスポザーゼは、ピギーバックトランスポザーゼ（ＰＢトランスポザーゼ）またはスリーピングビューティートランスポザーゼ（ＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙ）（ＳＢトランスポザーゼ）であってもよい。

【1134】

ここで、ＰＢトランスポザーゼのアミノ酸配列は、以下の表４に開示される。しかしながら、以下の表４に開示されるＰＢトランスポザーゼは、例であってもよいが、本発明はそれらに限定されない。

【表4】

【1135】

ピギーバックトランスポザーゼのアミノ酸配列

【1136】

トランスポザーゼ、またはそれをコードする核酸で処理することは、タンパク質、またはそれをコードする核酸配列を含むベクターの形で、導入または送達することであってもよい。ここで、導入または送達の説明は、上述のとおりである。

【1137】

上で説明される方法によって作製される人工組換え染色体を含む細胞は、少なくとも１つまたは複数の最終の人工組換え染色体を含んでもよい。

【1138】

ここで、１つまたは複数の最終の人工組換え染色体は、ＲＲＳを含まない人工組換え染色体であってもよい。

【1139】

ここで、１つまたは複数の最終の人工組換え染色体は、ＡＳＣＥを含まない人工組換え染色体であってもよい。

【1140】

以下に、説明の便宜を図って、１つまたは複数の最終の人工組換え染色体を含む細胞を、最終の組換え細胞として説明する。

【1141】

融合細胞を使用する人工組換え染色体を含む細胞を作製する方法の例として、人工組換え染色体を含む細胞は、第１の標的染色体含む標的細胞と第２の標的染色体を含むミクロセルとの細胞融合によって作製される融合細胞を、Ｃｒｅリコンビナーゼで処理することによって作製されてもよい。

【1142】

ここで、融合細胞は、第１の標的染色体および第２の標的染色体を含んでもよい。

【1143】

ここで、第１の標的染色体は、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳを含んでもよい。ここで、１つまたは複数の遺伝子（説明の便宜上、遺伝子Ａとして以下に説明される）は、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に含まれてもよい。

【1144】

ここで、第２の標的染色体は、第３のＲＲＳおよび第４のＲＲＳを含んでもよい。ここで、１つまたは複数の遺伝子（説明の便宜上、遺伝子Ｂとして以下に説明される）は、第３のＲＲＳと第４のＲＲＳとの間に含まれてもよい。

【1145】

ここで、第１の標的染色体に含まれる遺伝子Ａは、第２の標的染色体に含まれる遺伝子Ｂと同じである、または異なる遺伝子であってもよい。

【1146】

第１の標的染色体に存在する第１のＲＲＳは、第２の標的染色体に存在する第３のＲＲＳと対合されてもよく、第１の標的染色体に存在する第２のＲＲＳは、第２の標的染色体に存在する第４のＲＲＳと対合されてもよい。

【1147】

代替的には、第１の標的染色体に存在する第１のＲＲＳは、第２の標的染色体に存在する第４のＲＲＳと対合されてもよく、第１の標的染色体に存在する第２のＲＲＳは、第２の標的染色体に存在する第３のＲＲＳと対合されてもよい。

【1148】

対合はＣｒｅリコンビナーゼによって認識されてもよい。結果として、組換えが誘導されてもよい。

【1149】

対合およびＣｒｅリコンビナーゼを使用する組換えによって、人工組換え染色体が作製されてもよい。

【1150】

人工組換え染色体は、第１の標的染色体の遺伝子Ａを遺伝子Ｂと交換することによって作製されてもよい。

【1151】

代替的には、人工組換え染色体は、第２の標的染色体の遺伝子Ｂを遺伝子Ａと交換することによって作製されてもよい。

【1152】

人工組換え染色体を含む細胞は、トランスポザーゼでさらに処理されてもよい。

【1153】

ここで、トランスポザーゼ処理は、人工組換え染色体に存在するＲＲＳを除去することであってもよい。

【1154】

上述の例は、単に例であり、各構成要素（標的染色体、標的細胞、ミクロセル、融合細胞、人工組換え染色体、リコンビナーゼ、人工組換え染色体を有する細胞など）は、目的に従って様々な仕方で、修飾または改変されてもよい。
ｖ）選択方法

【1155】

本明細書で開示される態様によれば、１つまたは複数の人工組換え染色体を含む細胞を作製する方法は、特定の細胞を選択する方法をさらに含んでもよい。

【1156】

特定の細胞は、標的細胞、ミクロセル、第１の融合細胞、第２の融合細胞、および／または最終の組換え細胞であってもよい。

【1157】

標的染色体、標的細胞、ミクロセル、第１の融合細胞、第２の融合細胞、および最終の組換え細胞の説明は、上述のとおりである。

【1158】

選択方法は、上で説明されるｉ）～ｉｖ）にさらに加えられてもよい。

【1159】

選択方法は、逆位の遺伝子を使用して、特定の細胞を選択することであってもよい。

【1160】

ここで、逆位の遺伝子は、逆位の選択マーカー遺伝子であってもよい。逆位の選択マーカー遺伝子は、選択マーカー遺伝子の逆位によって得られてもよい。選択マーカー遺伝子の説明は、上述のとおりである。

【1161】

ここで、特定の細胞は、標的細胞、ミクロセル、第１の融合細胞、第２の融合細胞、および／または最終の組換え細胞であってもよい。

【1162】

例示的な実施形態によれば、特定の細胞は、再逆位された抗生物質耐性遺伝子によって選択されてもよい。

【1163】

抗生物質耐性遺伝子は、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、およびｐｕｒｏΔＴＫ遺伝子からの、いずれか１つまたは複数であってもよいが、本発明はそれらに限定されない。

【1164】

たとえば、ドナーＤＮＡが挿入された標的染色体を含む標的細胞が選択される場合、ドナーＤＮＡは、逆位の抗生物質耐性遺伝子、およびＦＲＴを含んでもよい。ドナーＤＮＡが挿入された標的染色体を含む標的細胞が、リコンビナーゼ、すなわちフリッパーゼ（ＦＬＰ）で処理される場合、逆位の抗生物質耐性遺伝子は再逆位されてもよい。結果として、再逆位された抗生物質耐性遺伝子は正常に発現され得、ドナーＤＮＡが挿入された標的染色体を含む標的細胞は、抗生物質処理によって、ＦＬＰで処理された細胞から選択されてもよい。

【1165】

別の例示的な実施形態によれば、特定の細胞は、再逆位された蛍光性タンパク質遺伝子によって選択されてもよい。

【1166】

蛍光性タンパク質遺伝子は、ＧＦＰ遺伝子、ＹＦＰ遺伝子、ＲＦＰ遺伝子、およびｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子からの、いずれか１つまたは複数であってもよいが、本発明はそれらに限定されない。

【1167】

たとえば、ドナーＤＮＡが挿入された標的染色体を含む標的細胞が選択される場合、ドナーＤＮＡは、逆位のＧＦＰ遺伝子、およびＦＲＴを含んでもよい。ドナーＤＮＡが挿入された標的染色体を含む標的細胞が、リコンビナーゼ、すなわちフリッパーゼ（ＦＬＰ）で処理される場合、逆位のＧＦＰ遺伝子は再逆位されてもよい。結果として、再逆位されたＧＦＰ遺伝子は正常に発現され得、ドナーＤＮＡが挿入された標的染色体を含む標的細胞は、蛍光性タンパク質の検出によって、ＦＬＰで処理された細胞から選択されてもよい。

【1168】

さらに別の例示的な実施形態によれば、特定の細胞は、逆位された蛍光性タンパク質をコードする遺伝子によって選択されてもよい。

【1169】

蛍光性タンパク質をコードする遺伝子は、ＧＦＰ遺伝子、ＹＦＰ遺伝子、ＲＦＰ遺伝子、およびｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子からの、いずれか１つまたは複数であってもよいが、本発明はそれらに限定されない。

【1170】

たとえば、ドナーＤＮＡが挿入された標的染色体を含む標的細胞が選択される場合、ドナーＤＮＡは、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子、およびＦＲＴを含んでもよい。ドナーＤＮＡが挿入された標的染色体を含む標的細胞が、リコンビナーゼ、すなわちフリッパーゼ（ＦＬＰ）で処理される場合、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子は逆位されてもよい。結果として、逆位されたｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子は正常に発現され得ず、ドナーＤＮＡが挿入された標的染色体を含む標的細胞は、蛍光性タンパク質の検出によって、ＦＬＰで処理された細胞から選択されてもよい。

【1171】

選択方法は、選択マーカーを使用して、特定の細胞を選択することであってもよい。

【1172】

ここで、選択マーカー遺伝子は、選択マーカー遺伝子であってもよい。選択マーカー遺伝子の説明は、上述のとおりである。

【1173】

ここで、特定の細胞は、標的細胞、ミクロセル、第１の融合細胞、第２の融合細胞、および／または最終の組換え細胞であってもよい。

【1174】

例示的な実施形態によれば、特定の細胞は、蛍光性タンパク質の検出によって選択されてもよい。

【1175】

蛍光性タンパク質の検出に関して、特定の細胞に含まれる、少なくとも１つまたは複数の染色体は、蛍光性タンパク質をコードする遺伝子を含んでもよい。

【1176】

ここで、少なくとも１つまたは複数の染色体は、標的染色体、人工組換え染色体、および／または最終の組換え染色体であってもよい。標的染色体、人工組換え染色体、および最終の組換え染色体の説明は、上述のとおりである。

【1177】

蛍光性タンパク質をコードする遺伝子は、ＧＦＰ遺伝子、ＹＦＰ遺伝子、ＲＦＰ遺伝子、またはｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子からの、いずれか１つまたは複数であってもよいが、本発明はそれらに限定されない。

【1178】

例示的な実施形態によれば、特定の細胞は、特定の細胞および非標的供給源細胞が混合された培地から、蛍光性タンパク質の検出によって選択されてもよい。

【1179】

たとえば、特定の細胞が標的細胞である場合、標的細胞は、ＧＦＰ遺伝子が挿入される標的染色体を含んでもよい。この場合、特定の細胞、すなわち標的細胞は、緑色蛍光の検出によって、非特定の供給源細胞から選択されてもよい。

【1180】

関心対象である１つの特定の細胞は、２つ以上の特定の細胞が混合された培地から、蛍光性タンパク質の検出によって選択されてもよい。

【1181】

ここで、２つ以上の細胞は、標的細胞、ミクロセル、第１の融合細胞、第２の融合細胞、および最終の組換え細胞から選択される２つ以上であってもよい。

【1182】

たとえば、２つ以上の特定の細胞が、第１の融合細胞および第２の融合細胞を含む場合、第２の融合細胞は、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子が挿入された人工組換え染色体を含んでもよい。この場合、関心対象である１つの特定の細胞、すなわち第２の融合細胞は、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の検出によって、第１の融合細胞から選択されてもよい。

【1183】

別の例示的な実施形態によれば、特定の細胞は、抗生物質耐性によって選択されてもよい。

【1184】

抗生物質耐性の検出に関して、特定の細胞に含まれる、少なくとも１つまたは複数の染色体は、抗生物質耐性遺伝子を含んでもよい。

【1185】

ここで、少なくとも１つまたは複数の染色体は、標的染色体、人工組換え染色体、および／または最終の組換え染色体を含んでもよい。標的染色体、人工組換え染色体、および最終の組換え染色体の説明は、上述のとおりである。

【1186】

抗生物質耐性遺伝子は、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、およびｐｕｒｏΔＴＫ遺伝子からの、いずれか１つまたは複数を含んでもよいが、本発明はそれらに限定されない。

【1187】

例示的な実施形態によれば、特定の細胞は、特定の細胞および非標的供給源細胞が混合された培地から、抗生物質耐性の検出によって選択されてもよい。

【1188】

たとえば、特定の細胞が標的細胞である場合、標的細胞は、ハイグロマイシン耐性遺伝子が挿入された特定の染色体を含んでもよい。ここで、特定の細胞、すなわち標的細胞は、ハイグロマイシンに対する抗生物質耐性の検出によって、非特定の供給源細胞から選択されてもよい。

【1189】

関心対象である１つの特定の細胞は、２つ以上の特定の細胞が混合された培地から、抗生物質耐性の検出によって選択されてもよい。

【1190】

ここで、２つ以上の特定の細胞は、標的細胞、ミクロセル、第１の融合細胞、第２の融合細胞、および最終の組換え細胞から選択される２つ以上であってもよい。

【1191】

たとえば、２つ以上の特定の細胞が、第１の融合細胞および第２の融合細胞を含む場合、第２の融合細胞は、ネオマイシン耐性遺伝子が挿入された人工組換え染色体を含んでもよい。ここで、関心対象である１つの特定の細胞、すなわち第２の融合細胞は、ネオマイシンに対する抗生物質耐性の検出によって、第１の融合細胞から選択されてもよい。

【1192】

さらに別の例示的な実施形態によれば、特定の細胞は、ｄｅａｄＣａｓ９リポーター（ｄＣａｓ９リポーター）によって選択されてもよい。リポーターは、マーカーを含んでもよい。リポーターは、たとえば、蛍光マーカーを含んでもよい。リポーターは、アプタマー、および／または薬剤をさらに含んでもよい。アプタマーおよび／または薬剤は、特定の物質に結合親和性を提供してもよい。

【1193】

アプタマーは、たとえば、ｄＣａｓ９に対する結合親和性を有してもよい。

【1194】

薬剤は、たとえば、ｄＣａｓ９に対する結合親和性を有してもよい。薬剤は、たとえば、抗ｄＣａｓ９抗体、または抗体バリアントであってもよい。抗体バリアントは、たとえば、抗原結合断片（Ｆａｂ）、Ｆ（ａｂ）'２、単一特異性Ｆａｂ２、二重特異性Ｆａｂ２、三重特異性Ｆａｂ２、一価Ｉｇ、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、二重特異性ダイアボディ、単鎖可変断片－結晶化可能断片（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）、ミニボディ、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）可変新規抗原受容体（Ｖ－ＮＡＲ）、重鎖免疫グロブリンＧ（ｈｃＩｇＧ）、および重鎖抗体の可変ドメイン（ＶｈＨ）のうちいずれか１つまたは複数を含んでもよいが、本発明は、それらに限定されない。

【1195】

ｄＣａｓ９リポーターの検出に関して、特定の細胞は、ｇＲＮＡ、またはそれをコードする核酸で処理されてもよい。

【1196】

ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ標的配列に結合してもよい。ｇＲＮＡ標的配列は、ｇＲＮＡに対するセンス配列を含んでもよい。ｇＲＮＡ標的配列は、ｇＲＮＡに対するアンチセンス配列を含んでもよい。ｇＲＮＡ標的配列は、非標的供給源染色体に存在しない場合があるが、標的染色体および人工組換え染色体に存在する配列から選択されてもよい。ｇＲＮＡ標的配列は、ドナーＤＮＡによって、非標的供給源染色体の標的配列に挿入されてもよい。非標的供給源染色体および標的配列は、上で説明された。

【1197】

ｇＲＮＡ標的配列および／またはｇＲＮＡの候補群は、ｉｎｓｉｌｉｃｏ設計によって抽出されてもよい。

【1198】

例示的な実施形態によれば、特定の細胞は、特定の細胞および非標的供給源細胞が混合された培地から、ｄＣａｓ９リポーター（ｄＣａｓ９リポーター）の検出によって選択されてもよい。

【1199】

たとえば、特定の細胞は、ｇＲＮＡ標的配列を含む、標的染色体または人工組換え染色体を含んでもよい。ここで、特定の細胞は、ｇＲＮＡ、ｄＣａｓ９、およびリポーターアプタマーでの処理、ならびにリポーターアプタマーに含まれるマーカーの検出によって、非標的供給源細胞から選択されてもよい。

【1200】

関心対象である１つの特定の細胞は、２つ以上の特定の細胞が混合した培地から、ｄＣａｓ９リポーターの検出によって選択されてもよい。

【1201】

たとえば、２つ以上の特定の細胞がミクロセルの群であり、関心対象の１つの特定の細胞が、標的染色体を含むミクロセルである場合、標的染色体は、ｇＲＮＡ標的配列を含んでもよい。ここで、標的染色体を含むミクロセルは、ｇＲＮＡ、ｄＣａｓ９、およびリポーターアプタマーでの処理、ならびにリポーターアプタマーに含まれるマーカーの検出によって、ミクロセルの群から選択されてもよい。

【1202】

別の例示的な実施形態によれば、特定の細胞は、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法によって選択され得る。ＦＩＳＨ法の例として、抗体－リポーターが使用されてもよい。染色体固有の凝縮構造、および／または染色体の特定の配列に対する抗体の結合親和性を使用して、抗体－リポーターを使用して標的配列を検出してもよい。抗体－リポーターを使用するＦＩＳＨ法では、公知の方法を使用してもよい。

【1203】

特定の細胞は、抗体標的配列を含む染色体を含んでもよい。

【1204】

ここで、抗体標的配列を含む染色体は、標的染色体、人工組換え染色体、および／または最終の組換え染色体を含んでもよい。標的染色体、人工組換え染色体、および最終の組換え染色体の説明は、上述のとおりである。

【1205】

ＦＩＳＨ法の検出に関して、特定の細胞は、抗体－リポーターで処理されてもよい。抗体－リポーターは、一次抗体およびリポーターが接続された構築物を意味してもよい。さらに、抗体－リポーターは、一次抗体の１つの領域に対して結合親和性を有する二次抗体、およびリポーターが接続された構築物を意味してもよい。この場合、抗体－リポーターでの処理は、一次抗体処理の後、時間的に連続して二次抗体－リポーター構築物を提供することを含んでもよい。

【1206】

抗体は、染色体上の抗体標的配列に結合してもよい。

【1207】

抗体標的配列および／または抗体の候補群は、ｉｎｓｉｌｉｃｏ設計によって抽出されてもよい。

【1208】

例示的な実施形態によれば、関心対象である１つの特定の細胞は、２つ以上の特定の細胞が混合された培地から、ＦＩＳＨ法検出によって選択されてもよい。

【1209】

【1210】

たとえば、２つ以上の特定の細胞が、第１の融合細胞および第２の融合細胞である場合、第２の融合細胞は、抗体標的配列を含む人工組換え染色体を含んでもよい。ここで、第２の融合細胞は、抗体－リポーターの処理、およびリポーターに含まれるマーカーの検出によって、第１の融合細胞から選択されてもよい。抗体は、抗体標的配列に結合してもよい。抗体標的配列は、人工組換え染色体の１つの領域である。

【1211】

本明細書における開示の一態様は、１つまたは複数の人工組換え染色体を含む細胞を使用して動物を作製する方法に関する。

【1212】

動物を作製する方法では、１つまたは複数の人工組換え染色体を含む細胞を使用してもよい。

【1213】

動物は、非ヒト動物であってもよい。

【1214】

ここで、非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、またはサルであってもよいが、本発明はそれらに限定されない。

【1215】

動物は、トランスジェニック（形質転換された）非ヒト動物であってもよい。

【1216】

ここで、形質転換は、１つまたは複数の人工組換え染色体によって生じさせてもよい。

【1217】

ここで、トランスジェニック（形質転換された）非ヒト動物は、野性型非ヒト動物と比較して、１つまたは複数の異なる表現型を有してもよい。１つまたは複数の異なる表現型は、１つまたは複数の人工組換え染色体によって生じさせてもよい。

【1218】

１つまたは複数の人工組換え染色体を含む細胞の説明は、上述のとおりである。

【1219】

１つまたは複数の人工組換え染色体を含む細胞は、第２の融合細胞または最終の人工組換え細胞であってもよい。

【1220】

第２の融合細胞および最終の組換え細胞の説明は、上述のとおりである。
体細胞核トランスファー（ＳＣＮＴ）

【1221】

本明細書で開示される例示的な実施形態によれば、第２の融合細胞または最終の組換え細胞から作製される子孫が提供される。

【1222】

本明細書で開示される別の例示的な実施形態によれば、第２の融合細胞または最終の組換え細胞から子孫を作製する方法が提供される。

【1223】

第２の融合細胞または最終の組換え細胞から作製される子孫は、ＳＣＮＴによって作製されてもよい。ＳＣＮＴを用いて、第２の融合細胞または最終の組換え細胞からドナー核を得、ドナー核を脱核された卵子に移植することによってクローニングされた卵子を作製し、クローニングされた卵子を代理母の子宮に移植することによって子孫を生成してもよく、ＳＣＮＴでは公知の方法を用いてもよい。公知の方法としては、ＣａｍｐｂｅｌｌＫＨｅｔａｌ．（"Ｓｈｅｅｐｃｌｏｎｅｄｂｙｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｆｅｒｆｒｏｍａｃｕｌｔｕｒｅｄｃｅｌｌｌｉｎｅ，"１９９６，Ｎａｔｕｒｅ．３８０（６５６９）：６４-６）；Ｇｕｐｔａ，Ｍ．Ｋｅｔａｌ．（"ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＣｈｉｃｋｅｎ，Ｍｉｃｅ，Ｃａｔｔｌｅ，ａｎｄＰｉｇＥｍｂｒｙｏｓｂｙＳｏｍａｔｉｃＣｅｌｌＮｕｃｌｅａｒＴｒａｎｓｆｅｒｉｎｔｏＰｉｇＯｏｃｙｔｅｓ，"２０１３，ＣｅｌｌｕｌａｒＲｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．１５（４）：３２２-３２８）；またはＬｉ，Ｊｅｔａｌ．（"Ｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｓｄｅｒｉｖｅｄｂｙｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｆｅｒｕｓｉｎｇａｎａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｅｎｕｃｌｅａｔｉｏｎａｐｐｒｏａｃｈ，"２００９，ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＳｔｅｍＣｅｌｌｓ．１１（１）：３９-５０）が参照されてもよいが、本発明はそれらに限定されない。
胚からの発生

【1224】

本明細書で開示される例示的な実施形態によれば、第２の融合細胞または最終の組換え細胞から作製される子孫が提供される。

【1225】

本明細書で開示される別の例示的な実施形態によれば、第２の融合細胞または最終の組換え細胞から子孫を作製する方法が提供される。

【1226】

第２の融合細胞または最終の組換え細胞からの子孫は、胚発生によって作製されてもよい。胚発生は、代理母の子宮に胚を移植することによって、胚から子孫を発生させることであり、公知の方法によって用いられてもよい。

【1227】

ここで、胚は、第２の融合細胞または最終の組換え細胞であってもよい。
胚盤胞注入

【1228】

本明細書で開示される例示的な実施形態によれば、第２の融合細胞または最終の組換え細胞から作製される子孫が提供される。

【1229】

本明細書で開示される別の例示的な実施形態によれば、第２の融合細胞または最終の組換え細胞から子孫を作製する方法が提供される。

【1230】

第２の融合細胞または最終の組換え細胞から作製される子孫は、胚盤胞注入によって作製されてもよい。胚盤胞注入を使用して、遺伝子を操作した胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を胞胚期に移植し、それによってキメラ胚盤胞を得、キメラ胚盤胞を代理母の子宮に移植することによって、子孫を発生させてもよく、公知の方法を使用してもよい。

【1231】

ここで、遺伝子を操作したＥＳ細胞は、第２の融合細胞または最終の組換え細胞であってもよい。
［実施例］

【1232】

以下に、実施例を参照しながらさらに詳細に本発明を説明する。

【1233】

実施例は、本発明をより十分に説明するために提供されるにすぎず、本発明の範囲は以下の実施例に限定されないことは当業者には明らかであろう。
実施例１．単一のＲＲＳを使用する人工組換え染色体、およびそれを使用するトランスジェニック動物の作製

【1234】

この実施例は、本明細書で開示される染色体を使用する形質転換導入法を証明するための特定の実験的な実施例であり、染色体間での組換えによって標的遺伝子が特定の部位に挿入された人工組換え染色体を有する細胞、およびそれを使用してトランスジェニックマウスを作製する方法に関する。以下の説明は、蛍光性タンパク質をコードする遺伝子が単一のＲＲＳを使用して免疫グロブリン重（ＩｇＨ）遺伝子座の可変領域の末端に挿入された細胞、およびそれを使用するトランスジェニックマウスの作製に関する、全般的な実施例を提供し、当該実施例は、人工組換え染色体を使用する実施例に過ぎないが、本発明はそれらに限定されない。関心対象の人工組換え染色体は、以下に説明する実施例を様々な仕方で修正すること、または以下に説明する実施例以外の様々な方法を加えることによって、作製されてもよい。
実施例１－１．標的細胞を作製するためのベクター構築

【1235】

マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）が標的ｍＥＳＣとして作製されるように第１のＤＮＡドナー（第１のベクター）を設計し、ヒト線維芽細胞が標的ヒト線維芽細胞として作製されるように第２のＤＮＡドナー（第２のベクター）を設計した。

【1236】

ＰＣＲ反応において使用したｔａｑは一般的なＰＣＲタグ（ＧｏＴａｑＧ２ｇｒｅｅｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国））であり、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（タカラバイオ株式会社、日本）を平滑末端作製のためのタグとして使用し、ＳｉｍｐｌｉＡｍｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）をサーマルサイクラーとして使用した。Ｔ－ｂｌｕｎｔベクター（Ｓｏｌｇｅｎｔ社、韓国）を、クローン作製およびＤＮＡシークエンシングにおいて使用されるＴベクターとして使用し、ＨＩＴコンピテント細胞（ＲＢＣＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、米国）をコンピテント細胞として使用した。ＤＮＡ組換えにおいて使用されるすべての制限酵素は、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社（ＮＥＢ）から購入し、ＤＮＡライゲーションにおいて使用されるリガーゼはＴ４ＤＮＡリガーゼ（タカラバイオ株式会社、日本）であった。

【1237】

マウスＥＳＣターゲティングにおいて使用される第１のＤＮＡドナー（第１のベクター）は、マウスＩｇＨ遺伝子座の可変領域（ＩｇＨＶ）の５'末端ターゲティングにおいて使用されるフランキング領域配列（Ｍ００２）、ネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）、ｌｏｘｐ、マウスＩｇＨＶの５'末端ターゲティングにおいて使用されるフランキング領域配列（Ｍ００１）、負の選択において使用されるＴＫ遺伝子、細菌の正の選択において使用されるアンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）、および複製開始点からなる。ＮｅｏＲの場合、ＥｃｏＲＩ部位を含むＳＶ４０プロモーター順方向遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）（表５、配列番号：１）、ならびにｌｏｘＰ配列およびＳａｌＩ部位を含むブリッジ、逆方向プライマー（表５、配列番号：２、３）を使用して、オーバーハングＰＣＲ法によって、ｐＣＭＶ６－ＡＣ－ＧＦＰベクターを鋳型として増幅した。ＳａｌＩおよびＸｈｏＩ部位を有するＧＳＰ（表５、配列番号：４および５）、ならびにＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位を有するＧＳＰ（表５、配列番号：６、７）を使用して、Ｍ００１およびＭ００２に対して、Ｊ１マウスゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ増幅を実施した。すべてのＰＣＲ産物を、Ｔ－ｂｌｕｎｔベクターへのライゲーション後、クローニングし、次いでそれらのＤＮＡ塩基配列を確認した。すべてのクローンから得られたプラスミドを、両端の制限部位に作用する制限酵素を使用して切断し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで処理したｐＯＳｄｕｐｄｅｌベクターにライゲーションした（図２１）。

【1238】

ヒト線維芽細胞ターゲティングにおいて使用される第２のＤＮＡドナー（第２のベクター）は、ヒトＩｇＨ遺伝子座の可変領域（ＩｇＨＶ）の５'末端ターゲティングにおいて使用されるフランキング領域配列（Ｈ００２）、ｔｕｒｂｏＧＦＰ－ＮｅｏＲ、ｌｏｘｐ、ヒトＩｇＨＶの５'末端ターゲティングにおいて使用されるフランキング領域配列（Ｈ００１）、負の選択において使用されるＴＫ遺伝子、細菌の正の選択において使用されるＡｍｐＲ、および複製開始点からなる。ｔｕｒｂｏＧＦＰ－ＮｅｏＲの場合、鋳型ベクター（ｐＣＭＶ６－ＡＣ－ＧＦＰ）のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を除去するために、ＣＭＶプロモーターおよびｔｕｒｂｏＧＦＰ－ＮｅｏＲのＰＣＲ産物を平滑末端ライゲーションに供した。ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する順方向ＧＳＰ（表５、配列番号：８）、および逆方向ＧＳＰとしてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（表５、配列番号：９）を使用するオーバーハングＰＣＲに、ＣＭＶプロモーターを供し、順方向ＧＳＰ（表５、配列番号：１０）、およびｌｏｘＰ配列およびＳａｌＩ部位を有する逆方向プライマーとしてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（表５、配列番号：２、３）を使用するオーバーハングＰＣＲに、ｔｕｒｂｏＧＦＰ－ＮｅｏＲを供した。ＳａｌＩおよびＸｈｏＩ部位を有するＧＳＰ（表５、配列番号：１１および１２）、ならびにＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するＧＳＰ（表５、配列番号：１３、１４）を使用して、Ｈ００１およびＨ００２に対して、ヒト線維芽細胞ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ増幅を実施した。すべてのＰＣＲ産物を、Ｔ－ｂｌｕｎｔベクターへのライゲーション後、クローニングし、次いでそれらのＤＮＡ塩基配列を確認した。すべてのクローンから得られたプラスミドを、両端の制限部位に作用する制限酵素を使用して切断し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで処理したｐＯＳｄｕｐｄｅｌベクターにライゲーションした（図２２）。
［表５］
ベクター構築において使用されるプライマー、およびそのＤＮＡ配列

【表5】

実施例１－２．単一のＲＲＳが挿入された染色体を含む細胞の作製
実施例１－２－１．ｌｏｘＰが挿入されたヒト染色体を含む標的ヒト細胞の作製

【1239】

本明細書において使用されるヒト皮膚線維芽細胞（ｈＤＦ）は、ＣｅｌｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｆｏｒＯｒｉｇｉｎ（ＣＥＦＯ）社（韓国、ソウル）から購入した。細胞増殖および維持のための基本培地として、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｃｏｒｎｉｎｇ社、米国、バージニア州、Ｍａｎｎａｓａｓ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、米国、バージニア州、Ｍａｎｎａｓａｓ）を補った、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｃｏｒｎｉｎｇ社、米国、バージニア州、Ｍａｎｎａｓａｓ）を使用し、５％ＣＯ_２、湿度９５％、および３７℃で維持されたインキュベーターにおいて細胞をインキュベートした。一過性トランスフェクションを、リポフェクタミン３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国、カリフォルニア州、Ｃａｒｌｓｂａｄ）を使用して実施した。１×１０^６個の細胞をＦＢＳおよび抗生物質を含まないＤＭＥＭに加えること、それに、ＮｏｔＩ酵素（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社、米国、マサチューセッツ州、Ｉｐｓｗｉｃｈ）で１回切った第２のＤＮＡドナー（第２のベクター）を１０μｇ加えること、それとリポフェクタミン３０００試薬を混合すること、ならびに室温にて５分間、細胞をインキュベートすることによって、トランスフェクションを実施した。５％ＣＯ_２、湿度９５％、および３７℃で維持されたインキュベーターにおいて２４～４８時間、細胞をインキュベートした（図２５）。

【1240】

第２のＤＮＡドナー（第２のベクター）がヒトＤＦに挿入されているか否かを確認するために、第２のＤＮＡドナー（第２のベクター）に存在する抗生物質耐性遺伝子を使用して細胞を選択した。ヒトＤＦに挿入された第２のＤＮＡドナー（第２のベクター）に存在するネオマイシン耐性遺伝子の発現によって細胞を選択した。本明細書において使用される抗生物質は、Ｇ４１８（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国、ニューヨーク州）であり、Ｇ４１８の細胞選択濃度を、細胞数計測キット－８（ｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ－８）（ＣＣＫ－８；株式会社同仁化学研究所、日本、熊本）を用いて測定した。第２のＤＮＡドナー（第２のベクター）でｈＤＦをトランスフェクションし、４８時間後に、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８で処理した。細胞選択プロセスを４～６週間実施し、形成されたｌｏｘＰが挿入されたクローンを、密にすることによってインキュベートした。選択されたｈＤＦを、蛍光顕微鏡（オリンパス株式会社、日本、東京）を使用して、ＧＦＰ発現によって確認した（図２５）。

【1241】

結果として、選択されたヒト皮膚線維芽細胞中の第２のＤＮＡドナー（第２のベクター）にタグ付けされたＧＦＰの発現が確認された。これに基づいて、第２のＤＮＡドナー（第２のベクター）がヒト皮膚線維芽細胞に挿入されたことを確認することができる。
実施例１－２－２．ｌｏｘＰが挿入されたマウス染色体を含む標的マウス細胞の作製

【1242】

本明細書において使用されるＪ１マウス胚性幹細胞（Ｊ１ｍＥＳＣ）は、Ｍａｃｒｏｇｅｎ社（韓国、ソウル）により寄贈された。Ｊ１ｍＥＳＣの培養では、０．１％ゼラチンコートディッシュを使用し、細胞増殖および維持のための基本培地として２ｉ培地を使用した。ＦＢＳを含まないＮ２Ｂ２７培地を、ＭＥＫ阻害剤ＰＤ０３２５９０１（１μＭ）およびＧＳＫ３阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１（３μｍ）（ともにＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社製、米国、ミズーリ州、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、および１，０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国、マサチューセッツ州、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）で補うことによって、培養培地を調製した。５％ＣＯ_２、湿度９５％、および３７℃で維持されたインキュベーターにおいて、細胞をインキュベートした。一過性トランスフェクションを、リポフェクタミン３０００を使用して実施した。１×１０^６個の細胞をＦＢＳおよび抗生物質を含まないＯｐｔｉ－ＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国、マサチューセッツ州、Ｗａｌｔｈａｍ）に加えること、それに、ＮｏｔＩで１回切った第１のＤＮＡドナー（第１のベクター）を１０μｇ加えること、それとリポフェクタミン３０００試薬を混合すること、ならびに室温にて５分間、細胞をインキュベートすることによって、トランスフェクションを実施した。５％ＣＯ_２、湿度９５％、および３７℃のインキュベーターにおいて２４～４８時間、細胞をインキュベートした（図２６）。

【1243】

第１のＤＮＡドナー（第１のベクター）がｍＥＳＣに挿入されたか否かを確認するために、第１のＤＮＡドナー（第１のベクター）に存在するネオマイシン耐性遺伝子の発現によって細胞を選択した。本明細書において使用される抗生物質は、Ｇ４１８（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国、ニューヨーク州、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ）であり、Ｇ４１８の細胞選択濃度を、細胞数計測キット－８（ＣＣＫ－８；株式会社同仁化学研究所、日本、熊本）を用いて測定した。第１のＤＮＡドナー（第１のベクター）でｍＥＳＣをトランスフェクションし、４８時間後に、１５０μｇ／ｍｌのＧ４１８で処理した。細胞選択プロセスを４～６週間実施し、形成されたｌｏｘＰが挿入されたクローンを、密にすることによって培養した。選択されたｍＥＳＣを、蛍光顕微鏡を使用して、ｍＣｈｅｒｒｙ発現によって確認した（図２６）。

【1244】

結果として、選択されたｍＥＳＣにおける第１のＤＮＡドナー（第１のベクター）にタグ付けされたｍＣｈｅｒｒｙの発現が確認された。これに基づいて、第１のＤＮＡドナー（第１のベクター）がｍＥＳＣに挿入されたことを確認することができる。
実施例１－３．標的ヒト細胞を使用するミクロセルの作製

【1245】

コルセミド（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国、ニューヨーク州、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ）を使用して、微小核形成を実施した。Ｇ４１８を使用して選択した１×１０^６個のヒト皮膚線維芽細胞を１００ｍｍディッシュに入れて１日後、培地を２０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭと交換し、線維芽細胞を０．１μｇ／ｍｌのコルセミドで処理し、５％ＣＯ_２、湿度９５％、および３７℃で維持されたインキュベーターにおいて４８時間、インキュベートした。微小核形成が誘導されたヒト細胞を、ｔｒｙＬＥ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国、ニューヨーク州、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ）を使用して剥離させ、血清を含まないＤＭＥＭで洗浄し、５分間、１０００ｒｐｍで遠心分離（ＬＡＢＯＧＥＮＥ株式会社、韓国）に供した。遠心分離に供した細胞を、予温した血清を含まないＤＭＥＭ：Ｐｅｒｃｏｌｌ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社、米国、ミズーリ州、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）（１：１（ｖ：ｖ））に懸濁させ、最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるようにサイトカラシンＢ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社、米国、ミズーリ州、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）で処理した。全細胞およびミクロセルを、３４～３７℃で１～１．５時間、１６０００ｇの遠心分離（ＬＡＢＯＧＥＮＥ社）によって単離した。単離された全細胞およびミクロセルを５０ｍｌチューブに移し、それに血清を含まないＤＭＥＭを加え、続いて１０分間、５００ｇで遠心分離した。上清を穏やかに除去し、チューブ表面に付着されたペレットに、血清を含まないＤＭＥＭを１０ｍｌ加え、８μｍフィルター（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国、イリノイ州、シカゴ）を使用して、サイズが８μｍ以下のミクロセルを単離した。単離されたミクロセルを含む上清を、１０分間、４００ｇで、再度遠心分離した。遠心分離されたミクロセルを、８μｍフィルターを使用する方法と同じ仕方で、５μｍフィルターを使用して単離した。最終的に単離されたミクロセルを、ＮｉｋｏｎｅｃｌｉｐｓｅＴＳ１００光学顕微鏡（ＮｉｋｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、米国、ニューヨーク州、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ）を使用して計数した。

【1246】

結果として、光学顕微鏡を使用して、ヒト皮膚線維芽細胞をコルセミドで処理し、次いで微小核が形成されたことを確認したが、これは、先の論文に開示される形態と同じである。さらに、形成された微小核の、サイトカラシンＢでの脱核、およびミクロセルのサイズによる単離のプロセスにおいて、ミクロセルがサイズによって単離されたことを、光学顕微鏡法によって確認した。したがって、標的ヒト細胞、すなわちヒト皮膚線維芽細胞から、ミクロセルが良好に作製され、単離されたことが実証された（図２７）。
実施例１－４．ミクロセル－標的マウス細胞の融合細胞の作製

【1247】

単離されたミクロセル（ヒトミクロセル）、およびレシピエント細胞として使用されるｍＥＳＣを調製した。ｍＥＳＣをＴｒｙＬＥで処理し、遠心分離した。遠心分離したｍＥＳＣを、１×ＤＰＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ社、韓国）で洗浄し、血球計数器を使用して細胞数を算出した。ヒトミクロセルとｍＥＳＣとの融合を、懸濁法によって、ＨＶＪ－Ｅタンパク質（コスモ・バイオ株式会社、日本、東京）を使用して実施した。ヒトミクロセルのｍＥＳＣに対する、算出された比は、１：４であった。調製されたヒトミクロセルおよびｍＥＳＣの各々を、５００μｌの低温の１×細胞融合用緩衝液で洗浄した。ヒトミクロセルおよびｍＥＳＣの緩衝溶液を、４℃で５分間、３００ｇで遠心分離した。２×１０^５個のｍＥＳＣ毎に２５μｌの１×細胞融合用緩衝液を加え、同じ体積の１×細胞融合用緩衝液をヒトミクロセルに加えた。ｍＥＳＣおよびヒトミクロセルを一緒に混合して、５～１０μｌのＨＶＪ－Ｅタンパク質を当該細胞に加え、次いで細胞を氷上で５分間、放置した。混合物を３７℃の水浴中に１５分間、放置した。ここで、混合物を５分毎にタッピングした。ヒトミクロセルとｍＥＳＣとの細胞融合後、混合物を、５分間、３００ｇで遠心分離して残りのＨＶＪ－Ｅタンパク質を除去した。融合した細胞を、ｍＥＳＣ培養培地を含むディッシュに加え、次いで、５％ＣＯ_２、湿度９５％、および３７℃で維持されたインキュベーターにおいて４８時間、インキュベートした。

【1248】

結果として、ヒトミクロセルとｍＥＳＣとの細胞融合後、混合物を培養培地に加え、顕微鏡を使用して観察し、ｍＥＳＣおよびヒトミクロセルが融合されたことが示された。ＨＶＪ－Ｅタンパク質を使用する方法は懸濁法である（ｍＥＳＣ増殖の形態がコロニーの形であるため、単一の細胞で実験を行うように実施される）ため、リアルタイムの融合プロセスは確認できないが、間接的に確認された（図２８）。
実施例１－５．融合細胞を使用する、人工組換え染色体を含む細胞の作製実施例１－５－１．融合細胞を使用する、人工組換え染色体を含む細胞の作製

【1249】

実施例１－４において形成される融合細胞において人工組換え染色体を作製するために、１×１０^６個の融合細胞を、１００μｌのＦＢＳおよび抗生物質を含まないＯｐｔｉ－ＭＥＭに加えた。ここで、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現させるために、１０μｇのｐＣＭＶ－Ｃｒｅベクター（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ有限責任会社、米国、カリフォルニア州、ＰａｌｏＡｌｔｏ）を加え、続いて１２５Ｖで５ｍｓ、二重パルスでトランスフェクションした。３００μｌの２ｉ培地を加え、細胞とよく混合した後、１００ｍｍディッシュに細胞を加え、５％ＣＯ_２、湿度９５％、および３７℃で維持されたインキュベーターにおいて４８時間、インキュベートして、染色体間の組換えを誘導した。

【1250】

４８時間後、融合細胞がｐＣＭＶ－Ｃｒｅベクターでトランスフェクションされていない群（－Ｃｒｅ）と、融合細胞がｐＣＭＶ－Ｃｒｅベクターでトランスフェクションされた群（＋Ｃｒｅ）との両方を、１５０μｇ／ｍｌのＧ４１８で処理した。１０～１４日間、細胞を選択し、培地交換において、同様に１５０μｇ／ｍｌのＧ４１８で２～３日毎に処理した。蛍光顕微鏡（オリンパス社）を使用して、選択された細胞の観察が確認された。

【1251】

結果として、融合細胞では、ｌｏｘＰ部位においてＣｒｅリコンビナーゼによる特異的な転座が生じることが確認された。換言すれば、ｈＤＦ染色体（第２のＤＮＡドナーによって挿入されたＧＦＰ遺伝子を含む染色体）を、ヒトミクロセルを使用してｍＥＳＣにトランスファーし、ｈＤＦ染色体（第２のＤＮＡドナーによって挿入されたＧＦＰ遺伝子を含む染色体）上に位置するｌｏｘＰと、ｍＥＳＣ染色体（第１のＤＮＡドナーによって挿入されたｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を含む染色体）上に位置するｌｏｘＰの対合、およびＣｒｅリコンビナーゼによって組み換えられた人工組換え染色体が作製された。作製された人工組換え染色体は、ｍＣｈｅｒｒｙ発現が生じたｍＥＳＣ染色体において生じるＧＦＰ発現のみによって同定した。したがって、ヒトミクロセルを介した染色体トランスファー、およびＣｒｅ－ｌｏｘＰを使用する染色体間の組換えが可能であることが確認された（図２９～３１）。

【1252】

実施例１－５－２．蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法を使用する人工組換え染色体の確認
［ＦＩＳＨプロセス］

【1253】

マウスＢＡＣプローブおよびヒトＢＡＣプローブを構築するために、ＲＰ２３－１９２Ｋ１６をマウス試料として使用し、ＣＴＤ－２５７２ｏ２をヒト試料として使用した。プラスミドマキシキット（ＰｌａｓｍｉｄＭａｘｉｋｉｔ）（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ）を使用してＢＡＣＤＮＡを調製し、ＴａｇＦＩＳＨＴａｇ（商標）ＤＮＡＭｕｌｔｉｃｏｌｏｒＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、米国）を使用してＢＡＣプローブを構築した。マウスＢＡＣプローブを、Ａｌｅｘａ４８８蛍光色素で標識し、ヒトＢＡＣプローブをＡｌｅｘａ５５５蛍光色素で標識した（図３４）。

【1254】

ＦＩＳＨ法において使用されるスライドを、細胞の分裂中期染色体の拡散のために、コルセミド（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国、ニューヨーク州、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ）および低張液（７５ＭｍＫＣｌ）で処理し、メタノール：酢酸（３：１）で塩基固定法（ｂａｓｉｃｆｉｘｉｎｇｍｅｔｈｏｄ）によって作製した。

【1255】

ＦＩＳＨＴａｇ（商標）ＤＮＡＭｕｌｔｉｃｏｌｏｒＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、米国）の基本指示に従って、ＦＩＳＨ実験を実施した。０．０５％ペプシン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社製、米国、ミズーリ州、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）／１０ｍＭＨＣｌ溶液において、３７℃で１０分間、スライドを透過処理した。室温にて１分間、一連のエタノール（７０％、８５％および１００％）でスライドを脱水し、風乾した。ハイブリダイゼーションのために、７０％ホルムアミド（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社）、および７２℃で２分間、ｐＨ７．０の２×ＳＳＣ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社）で、スライドを変性させ、－２０℃で２分間、一連のエタノール（７０％、８０％、および９５％）で脱水し、次いで風乾させた。ヒトＢＡＣプローブおよびマウスＢＡＣプローブの各々の最終濃度は、４ｎｇ／μｌであった。７２℃で５分間、各ＤＮＡプローブ２．５μｌ、６５％ホルムアミド、および２×ＳＳＣを変性させ、氷上で冷却し、その結果得られた溶液１０μｌで、各スライドを処理し、ガラスのカバースリップで覆い、次いでスライドの４辺をゴムセメントでシールした。一晩、３７℃で湿潤条件下に維持されたチャンバーにてハイブリダイゼーションを実施した。その後、スライドを２×ＳＳＣに浸漬してカバースリップを除去し、室温にて０．４×ＳＳＣで平衡化し、７３℃で２分間、０．４×ＳＳＣ中に置き、次いで、室温にてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を加えることによって洗浄した。ＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄｍｏｕｎｔｉｎｇｍｅｄｉｕｍおよびＤＡＰＩ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国、カリフォルニア州、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）を使用して核染色を実施した。

【1256】

Ａｉｒｙｓｃａｎを使用して、ＬＳＭ８００共焦点顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ社、ドイツ）下でスライドを観察した。４０×／１．２のプラン－アポクロマート（Ｐｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ）対物レンズ、および６３×／１．４ＮＡのプラン－アポクロマート油対物レンズを使用してスライドを観察し、ＺｅｉｓｓＺｅｎＢｌｕｅソフトウェアを使用して共焦点顕微鏡画像を解析した。
［ＦＩＳＨの結果］

【1257】

人工組換え染色体を含む細胞を選択した後、ヒト染色体１４番特異的ヒトＢＡＣプローブ（Ａｌｅｘａ５５５）、およびマウス染色体１５番特異的マウスＢＡＣプローブ（Ａｌｅｘａ４８８）を使用して、ＦＩＳＨ実験を実施した。細胞の染色体を、ＤＡＰＩ染色（４０×）によって、６３×油対物レンズを使用して確認した。ヒトＢＡＣプローブの蛍光（Ａｌｅｘａ５５５）およびマウスＢＡＣプローブの蛍光（Ａｌｅｘａ４８８）は、人工組換え染色体を有する融合細胞中の同じ部位で発せられ、４．１Ｍｂのマウス染色体１２番の末端がヒト染色体１４番の末端にトランスファーされたことを裏付けた（図３４および図３５）。
実施例１－６．人工組換え染色体を含む細胞を使用するトランスジェニック動物の作製

【1258】

人工組換え染色体を有する細胞を使用してトランスジェニック動物を作製するために、実施例１－５において得られる人工組換え染色体を有する細胞をＦＩＡＵで処理する。処理後に得られる細胞を、胚盤胞注入によって胞胚に移植し、それによってキメラ胚盤胞を作製する。作製されたキメラ胚盤胞を代理母の子宮に移植し、それによってマウスの子孫を作製する。作製されたマウスの子孫はキメラトランスジェニックマウスであり、ヘテロ接合体トランスジェニックマウス、またはホモ接合体トランスジェニックマウスを、キメラトランスジェニックマウスを繁殖させることによって作製する。

【1259】

作製されたトランスジェニックマウスは、マウスゲノム上のＩｇＨＶの５'末端にＧＦＰ遺伝子を有するマウスである。ここで、トランスジェニックマウスは、胚盤胞注入以外の様々な方法によって作製することができる。実施例２．２つのＲＲＳを使用する人工組換え染色体の作製、およびそれを使用するトランスジェニック動物の作製

【1260】

この実施例は、本明細書で開示される染色体を使用する形質転換導入法を証明するための実験的な実施例であり、染色体間での組換えによって関心対象の遺伝子が特定の位置で挿入される人工組換え染色体を含む細胞、およびそれを使用してトランスジェニックマウスを作製する方法に関する。以下の説明は、抗生物質耐性遺伝子が、２つのＲＲＳを使用してＩｇＨ遺伝子座の可変領域の末端に挿入される細胞、およびそれを使用するトランスジェニックマウスの作製に関する、全般的な実施例を提供し、当該実施例は、人工組換え染色体を使用する実施例に過ぎないが、本発明はそれらに限定されない。関心対象の人工組換え染色体は、以下に説明する実施例を様々な仕方で修正することによって、または以下に説明する実施例以外の様々な方法を加えることによって、作製されてもよい。
実施例２－１．標的細胞を作製するためのベクター構築

【1261】

【1262】

【1263】

マウスＥＳＣターゲティングにおいて使用される第１のＤＮＡドナー（第１のベクター）は、Ｍ００２、ＣＭＶプロモーター、Ｌｏｘｍ２／７１、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨｙｇｒｏＲ）、ｌｏｘ６６、Ｍ００１、負の選択において使用されるＴＫ遺伝子、細菌の正の選択において使用されるＡｍｐＲ、および複製開始点からなる。ＣＭＶプロモーターの場合、オーバーハングＰＣＲを、ＸｈｏＩ部位を有する順方向ＧＳＰ（表５、配列番号：１５）、およびＫｐｎＩ部位を有する逆方向ＧＳＰ（表５、配列番号：１６）を使用して、ｐＣＭＶ６－ＡＣ－ＧＦＰベクターを鋳型として実施した。ＨｙｇｒｏＲの場合、オーバーハングＰＣＲを、ＫｐｎＩ部位およびｌｏｘｍ２／７１を有する順方向ＧＳＰ（表５、配列番号：１７）、ならびにｌｏｘ６６およびＳａｌＩ部位を有する逆方向ＧＳＰ（表５、配列番号：１８）を使用して、ｐＳｅｃＴａｇ２－ｈｙｇｒｏＡベクターを鋳型として実施した。ＣＭＶプロモーターおよびＨｙｇｒｏＲのＰＣＲ産物をＴ－ｂｌｕｎｔベクターにライゲーションし、次いでクローニングし、続いてＤＮＡ塩基配列が確認された。２つのクローンから得られたプラスミドを、両端の制限部位に作用する制限酵素を使用して切断し、次いで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用してＸｈｏＩおよびＳａｌＩで処理した、実施例１－１の第１のベクターにライゲーションした（図２３）。

【1264】

ヒト線維芽細胞ターゲティングにおいて使用される第２のＤＮＡドナー（第２のベクター）は、Ｈ００２、ｌｏｘ７１、逆位ｐｕｒｏΔＴＫ、ｌｏｘｍ２／６６、ＮｅｏＲ、Ｈ００１、負の選択において使用されるＴＫ遺伝子、細菌の正の選択において使用されるＡｍｐＲ、および複製開始点からなる。逆位ｐｕｒｏΔＴＫの場合、オーバーハングＰＣＲを、ＸｈｏＩ部位およびｌｏｘ７１を有する順方向ＧＳＰ（表５、配列番号：１９）、ならびにｌｏｘｍ２／６６およびＨｉｎｄＩＩＩを有する逆方向ＧＳＰ（表５、配列番号：２０）を使用して、合成ＤＮＡを鋳型として実施した。ＮｅｏＲの場合、オーバーハングＰＣＲを、ＨｉｎｄＩＩＩを有する順方向ＧＳＰ（表５、配列番号：２１）、およびＳａｌＩを有する逆方向ＧＳＰ（表５、配列番号：２２）を使用して、ｐＣＭＶ６－ＡＣ－ＧＦＰベクターを鋳型として実施した。Ｌｏｘ７１－逆位ｐｕｒｏΔＴＫ－ｌｏｘｍ２／６６およびＮｅｏＲのＰＣＲ産物を、Ｔ－ｂｌｕｎｔベクターへのライゲーション後、クローニングし、それらのＤＮＡ塩基配列が確認された。２つのクローンから得られたプラスミドを、両端の制限部位に作用する制限酵素を使用して切断し、次いでＴ４ＤＮＡリガーゼを使用して、ＸｈｏＩおよびＳａｌＩで処理した、実施例１－１の第２のベクターにライゲーションした（図２４）。
実施例２－２．２つのＲＲＳが挿入された染色体を含む細胞の作製
実施例２－２－１．２つのｌｏｘＰが挿入されたヒト染色体を含む標的ヒト細胞の作製

【1265】

本明細書において使用される正常ヒト包皮線維芽細胞株（ＢＪ）は、ＡＴＣＣ（米国、バージニア州、Ｍａｎａｓｓａｓ）から購入した。細胞を増殖および維持するための基本培養培地として、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｃｏｒｎｉｎｇ社、米国、バージニア州、Ｍａｎｎａｓａｓ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、米国、バージニア州、Ｍａｎｎａｓａｓ）を含有する、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｃｏｒｎｉｎｇ社、米国、バージニア州、Ｍａｎｎａｓａｓ）を使用し、５％ＣＯ_２、湿度９５％、および３７℃で維持されたインキュベーターにおいて細胞をインキュベートした。一過性トランスフェクションを、Ｎｅｐａ２１（ネッパジーン株式会社、日本、千葉）エレクトロポレーターを使用して実施した。１×１０^６個の細胞を１００μｌのＦＢＳおよび抗生物質を含まないＯｐｔｉ－ＭＥＭに加えること、それに、ＮｏｔＩで１回切った第２のＤＮＡドナー（第２のベクター）を１０μｇ加えることによって、１５０Ｖで７．５ｍｓ、二重パルスでトランスフェクションを実施した。３００μｌの１０％ＦＢＳ含有培地を加え、細胞とよく混合した後、１００ｍｍディッシュに細胞を加え、５％ＣＯ_２、湿度９５％、および３７℃で維持されたインキュベーターにおいて２４～４８時間、インキュベートした。

【1266】

第２のＤＮＡドナー（第２のベクター）がヒト細胞株ＢＪに挿入されたか否かを確認するために、第２のＤＮＡドナー（第２のベクター）に存在する抗生物質耐性遺伝子を使用して細胞を選択した。第２のＤＮＡドナー（第２のベクター）に存在するネオマイシン耐性遺伝子の発現によって、ＢＪ細胞株から細胞を選択した。本明細書において使用される抗生物質は、Ｇ４１８（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国、ニューヨーク州）であり、Ｇ４１８の細胞選択濃度を、細胞数計測キット－８（ＣＣＫ－８；株式会社同仁化学研究所、日本、熊本）を用いて測定した。第２のＤＮＡドナー（第２のベクター）でＢＪ細胞をトランスフェクションし、４８時間後に、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８で処理した。細胞選択プロセスを４～６週間実施し、形成されたｌｏｘＰが挿入されたクローンを、密にすることによってインキュベートした。

【1267】

結果として、第２のＤＮＡドナー（第２のベクター）に挿入された抗生物質耐性遺伝子の発現を確認することによって、対照群において、選択期間中にすべての細胞が死滅したが、第２のＤＮＡドナー（第２のベクター）が挿入された群において、選択期間中にコロニーが同定されたことが示された。抗生物質を継続的に加えながらでも細胞の増殖および維持が継続したため、第２のＤＮＡドナー（第２のベクター）の発現が継続的に生じることを認めることができる。
実施例２－２－２．２つのｌｏｘＰが挿入されたマウス染色体を含む標的マウス細胞の作製

【1268】

本明細書において使用されるＪ１マウス胚性幹細胞（Ｊ１ｍＥＳＣ）は、Ｍａｃｒｏｇｅｎ社（韓国、ソウル）により寄贈された。Ｊ１ｍＥＳＣを０．１％ゼラチンコートディッシュに播き、細胞を増殖し、維持するための基本培養培地として２ｉ培地を使用し、ＭＥＫ阻害剤ＰＤ０３２５９０１（１μＭ）およびＧＳＫ３阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１（３μｍ）（ともにＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社製、米国、ミズーリ州、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、および１，０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国、マサチューセッツ州、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）を、ＦＢＳを含まないＮ２Ｂ２７培地に加えることによって調製した。５％ＣＯ_２、湿度９５％、および３７℃で維持されたインキュベーターにおいて、細胞をインキュベートした。一過性トランスフェクションを、Ｎｅｐａ２１（ネッパジーン株式会社、日本、千葉）エレクトロポレーターを使用して実施した。１×１０^６個の細胞を１００μｌのＦＢＳおよび抗生物質を含まないＯｐｔｉ－ＭＥＭに加えること、それに、ＮｏｔＩで１回切った第１のＤＮＡドナー（第１のベクター）を１０μｇ加えることによって、１２５Ｖで５ｍｓ、二重パルスでトランスフェクションを実施した。３００μｌの２ｉ培地を加え、細胞とよく混合した後、１００ｍｍディッシュに細胞を播種し、５％ＣＯ_２、湿度９５％、および３７℃で維持されたインキュベーターにおいて２４～４８時間、インキュベートした。

【1269】

第１のＤＮＡドナー（第１のベクター）がｍＥＳＣに挿入されたか否かを確認するために、第１のＤＮＡドナー（第１のベクター）に存在するハイグロマイシン耐性遺伝子の発現によって細胞を選択した。本明細書において使用される抗生物質は、ハイグロマイシンＢ（富士フイルム和光純薬株式会社、日本、大阪）であり、ハイグロマイシンの細胞選択濃度を、細胞数計測キット－８（ＣＣＫ－８；株式会社同仁化学研究所、日本、熊本）を用いて測定した。第１のＤＮＡドナー（第１のベクター）でｍＥＳＣをトランスフェクションし、４８時間後に、３２μｇ／ｍｌのハイグロマイシンで処理した。細胞選択プロセスを４～６週間実施し、形成されたｌｏｘＰが挿入されたクローンを、密にすることによって培養した。

【1270】

結果として、第１のＤＮＡドナー（第１のベクター）に挿入された抗生物質耐性遺伝子の発現を確認することによって、対照群において、選択期間中にすべての細胞が死滅したが、第１のＤＮＡドナー（第１のベクター）が挿入された群において、選択期間中にコロニーが同定されたことが示された。抗生物質を継続的に加えながらでも細胞の増殖および維持が継続したため、ターゲティングベクターの発現が継続的に生じたことを認めることができる。
実施例２－３．標的ヒト細胞を使用するミクロセルの作製

【1271】

コルセミド（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国、ニューヨーク州、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ）を使用して、微小核形成を実施した。Ｇ４１８を使用して選択した正常ヒト包皮線維芽細胞株（ＢＪ）の１×１０^６個の細胞を１００ｍｍディッシュに播種して１日後、培地を２０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭと交換し、細胞を０．１μｇ／ｍｌのコルセミドで処理し、５％ＣＯ_２、湿度９５％、および３７℃で維持されたインキュベーターにおいて４８時間、インキュベートした。微小核形成が誘導されたヒト細胞を、ｔｒｙＬＥ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国、ニューヨーク州、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ）を使用して剥離させ、血清を含まないＤＭＥＭで洗浄し、５分間、１０００ｒｐｍで遠心分離（ＬＡＢＯＧＥＮＥ株式会社、韓国）に供した。遠心分離に供した細胞を、予温した血清を含まないＤＭＥＭ：Ｐｅｒｃｏｌｌ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社、米国、ミズーリ州、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）（１：１（ｖ：ｖ））に懸濁させ、最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるようにサイトカラシンＢ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社、米国、ミズーリ州、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）で処理した。全細胞およびミクロセルを、３４～３７℃で１～１．５時間、１６０００ｇの遠心分離（ＬＡＢＯＧＥＮＥ社）によって単離した。単離された全細胞およびミクロセルを５０ｍｌチューブに移し、それに血清を含まないＤＭＥＭを加え、続いて１０分間、５００ｇで遠心分離した。上清を穏やかに除去し、チューブ表面に付着されたペレットに、血清を含まないＤＭＥＭを１０ｍｌ加え、８μｍフィルター（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国、イリノイ州、シカゴ）を使用して、サイズが８μｍ以下のミクロセルを単離した。単離されたミクロセルを含む上清を、１０分間、４００ｇで、再度遠心分離した。遠心分離されたミクロセルを、８μｍフィルターを使用する方法と同じ仕方で、５μｍフィルターを使用して単離した。最終的に単離されたミクロセルを、ＮｉｃｏｎｅｃｌｉｐｓｅＴＳ１００光学顕微鏡（ＮｉｃｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、米国、ニューヨーク州、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ）を使用して計数した。

【1272】

結果として、光学顕微鏡を使用して、正常ヒト包皮線維芽細胞株（ＢＪ）をコルセミドで処理し、次いで微小核が形成されたことを確認したが、これは、先の論文に開示される形態と同じである。さらに、形成された微小核の、サイトカラシンＢでの脱核、およびミクロセルのサイズによる単離のプロセスにおいて、サイズによってミクロセルが単離されたことを、光学顕微鏡法によって確認した。したがって、標的ヒト細胞、すなわち正常ヒト包皮線維芽細胞株（ＢＪ）から、ミクロセルが良好に作製され、単離されたことが実証された。
実施例２－４．ミクロセル－標的マウス細胞の融合細胞の作製

【1273】

単離されたミクロセル（ヒトミクロセル）、およびレシピエント細胞として使用されるｍＥＳＣを調製した。ｍＥＳＣをＴｒｙＬＥで処理し、遠心分離した。遠心分離したｍＥＳＣを、１×ＤＰＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ社、韓国）で洗浄し、血球計数器を使用して細胞数を算出した。ヒトミクロセルとｍＥＳＣとの融合を、懸濁法によって、ＨＶＪ－Ｅタンパク質（コスモ・バイオ株式会社、日本、東京）を使用して実施した。ヒトミクロセルのｍＥＳＣに対する、算出された比は、１：４であった。調製されたヒトミクロセルおよびｍＥＳＣの各々を、５００μｌの低温の１×細胞融合用緩衝液で洗浄した。ヒトミクロセルおよびｍＥＳＣの緩衝溶液で、４℃で５分間、３００ｇで遠心分離を実施した。２×１０^５個のｍＥＳＣ毎に２５μｌの１×細胞融合用緩衝液を加え、同じ体積の１×細胞融合用緩衝液をヒトミクロセルに加えた。ｍＥＳＣおよびヒトミクロセルを一緒に混合して、５～１０μｌのＨＶＪ－Ｅタンパク質をそれに加え、次いで細胞を氷上で５分間、放置した。混合物を３７℃の水浴中に１５分間、放置した。ここで、混合物を５分毎にタッピングした。ヒトミクロセルとｍＥＳＣとの細胞融合が完了した後、５分間、３００ｇで遠心分離することによって、残りのＨＶＪ－Ｅタンパク質を除去した。融合した細胞を、ｍＥＳＣ培養培地を含むディッシュに入れ、次いで、５％ＣＯ_２、湿度９５％、および３７℃で維持されたインキュベーターにおいて４８時間、インキュベートした。

【1274】

結果として、ヒトミクロセルとｍＥＳＣとの細胞融合後、混合物を培養培地に加え、顕微鏡を使用して観察し、ｍＥＳＣおよびヒトミクロセルが融合されたことが示された。ＨＶＪ－Ｅタンパク質を使用する方法は懸濁法（ｍＥＳＣ増殖の形態がコロニーの形であるため、単一の細胞で実験を行うように実施される）であるため、リアルタイムの融合プロセスは確認できないが、間接的に確認された。
実施例２－５．融合細胞を使用する、人工組換え染色体を含む細胞の作製

【1275】

実施例２－４において形成される融合細胞において人工組換え染色体を作製するために、１×１０^６個の融合細胞を、１００μｌのＦＢＳおよび抗生物質を含まないＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地に加えた。ここで、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現させるために、１０μｇのｐＣＭＶ－Ｃｒｅベクター（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ有限責任会社、米国、カリフォルニア州、ＰａｌｏＡｌｔｏ）を加え、続いて１２５Ｖで５ｍｓ、二重パルスでトランスフェクションした。３００μｌの２ｉ培地を加え、細胞とよく混合した後、１００ｍｍディッシュに細胞を加え、５％ＣＯ_２、湿度９５％、および３７℃で維持されたインキュベーターにおいて４８時間、インキュベートした。

【1276】

４８時間後、６ウェルプレートに５×１０^４個の融合細胞を播種し、０．６μｇ／ｍｌのピューロマイシンで処理した。ピューロマイシン濃度は、細胞数計測キット－８（ＣＣＫ－８；株式会社同仁化学研究所、日本、熊本）を用いて適切な濃度として決定した。細胞を１週間成長させ、２日または３日毎に、新鮮な培地およびピューロマイシンで処理した。細胞の固定と染色のためにクリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌｖｉｏｌｅｔ）（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社製、米国、ミズーリ州、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を使用し、サイズがおよそ７０μｍであるｍＥＳＣのコロニーを計数した。グラフパッドプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄＰＲＩＳＭ）（バージョン５．０１）を使用してグラフをプロットし、３つの群の間の統計的有意性をｏｎｅ－ｗａｙＡＮＯＶＡによって推定した。

【1277】

結果として、人工組換え染色体を含む細胞を選択するプロセスは、実施例２－１においても説明されたが、細胞は、融合細胞に対して処理されたＣｒｅリコンビナーゼによる、逆位されたピューロマイシン耐性遺伝子の正常な発現によって選択された。換言すれば、ヒト細胞株ＢＪの染色体（第２のＤＮＡドナーによって挿入された逆位ｐｕｒｏΔＴＫ遺伝子を含む染色体）を、ヒトミクロセルを介してｍＥＳＣにトランスファーし、ＢＪ染色体（第２のＤＮＡドナーによって挿入された逆位ｐｕｒｏΔＴＫ遺伝子遺伝子を含む染色体）上に位置する２つのｌｏｘＰ（第１のｌｏｘＰおよび第２のｌｏｘＰ）と、ｍＥＳＣ染色体（第１のＤＮＡドナーによって挿入されたハイグロマイシン耐性遺伝子を含む染色体）上に位置する２つのｌｏｘＰ（第３のｌｏｘＰおよび第４のｌｏｘＰ）との対合（第１のｌｏｘＰと第４のｌｏｘＰとの対合；および第２のｌｏｘＰと第３のｌｏｘＰとの対合）、およびＣｒｅリコンビナーゼによって組み換えられた人工組換え染色体が作製された。作製された人工組換え染色体は、再逆位されたｐｕｒｏΔＴＫ遺伝子を含み、ピューロマイシンで各群を処理することによって、細胞の生存を確認した。結果として、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現を受けた群においてｍＥＳＣ増殖が生じることが確認された。したがって、人工組換え染色体の作製によってｐｕｒｏΔＴＫ遺伝子が正常に発現したことを認めることができる（図３２および図３３）。
実施例２－６．人工組換え染色体を含む細胞を使用するトランスジェニック動物の作製

【1278】

人工組換え染色体を含む細胞を使用してトランスジェニック動物を作製するために、実施例２－５において得られる人工組換え染色体を含む細胞をＦＩＡＵで処理する。処理後に得られる細胞を、胚盤胞注入によって胞胚に移植し、それによってキメラ胚盤胞を構築する。構築されたキメラ胚盤胞を代理母の子宮に移植してマウスの子孫を作製する。作製されたマウスの子孫はキメラトランスジェニックマウスであり、ヘテロ接合体トランスジェニックマウス、またはホモ接合体トランスジェニックマウスを、キメラトランスジェニックマウスを繁殖させることによって作製する。

【1279】

作製されたトランスジェニックマウスは、マウスゲノム上にｐｕｒｏΔＴＫ遺伝子を有するマウスである。ここで、トランスジェニックマウスは、胚盤胞注入以外の様々な方法によって作製することができる。
実施例３．人工組換え染色体を使用するトランスジェニック動物の作製

【1280】

この実施例は、ヒト化マウスを作製する方法に関し、特にヒト化特異的遺伝子を有する染色体、すなわち人工組換え染色体を有するトランスジェニックマウスに関する。以下の説明は、ＩｇＨ遺伝子座の可変領域がヒト化されたトランスジェニックマウスを作製するための全般的な実施例に関し、当該実施例は、人工組換え染色体を使用する実施例に過ぎないが、本発明はそれらに限定されない。関心対象の人工組換え染色体は、以下に説明する実施例を様々な仕方で修正することによって、かつ以下に説明する実施例以外の様々な方法を加えることによって、作製されてもよい。
［実施例３－１．標的細胞を作製するためのベクター構築］

【1281】

マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）から標的ｍＥＳＣを作製するために、第１のＤＮＡドナー（第１のベクター）および第２のＤＮＡドナー（第２のベクター）を調製する。

【1282】

第１のベクターは、マウスＩｇＨ遺伝子座の可変領域（すべてのＶセグメント、Ｄセグメント、およびＪセグメント）の５'末端のターゲティングにおいて使用される第１の相同腕、ピギーバック末端反復（ＰＢ－ＴＲ）、プロモーター、ｌｏｘｍ２／６６（第１のＲＲＳ）、ブラストサイジン耐性遺伝子、プロモーター、ＦＲＴ、およびマウスＩｇＨ遺伝子座の可変領域の５'末端のターゲティングにおいて使用される第２の相同腕からなる。

【1283】

第２のベクターは、マウスＩｇＨ遺伝子座の可変領域（すべてのＶセグメント、Ｄセグメント、およびＪセグメント）の３'末端のターゲティングにおいて使用される第３の相同腕、逆位ハイグロマイシン耐性遺伝子、ＦＲＴ、ｌｏｘ７１（第２のＲＲＳ）、プロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）、ピギーバック末端反復（ＰＢ－ＴＲ）、およびマウスＩｇＨ遺伝子座の可変領域の３'末端のターゲティングにおいて使用される第４の相同腕からなる。

【1284】

標的ヒト線維芽細胞となるヒト線維芽細胞を作製するために、第３のＤＮＡドナー（第３のベクター）および第４のＤＮＡドナー（第４のベクター）を使用する。

【1285】

第３のベクターは、ヒトＩｇＨ遺伝子座の可変領域（すべてのＶセグメント、Ｄセグメント、およびＪセグメント）の５'末端のターゲティングにおいて使用される第５の相同腕、プロモーター、ブラストサイジン耐性遺伝子、ｌｏｘ６６（第３のＲＲＳ）、プロモーター、ＦＲＴ、およびヒトＩｇＨ遺伝子座の可変領域の５'末端のターゲティングにおいて使用される第６の相同腕からなる。

【1286】

第４のベクターは、ヒトＩｇＨ遺伝子座の可変領域（すべてのＶセグメント、Ｄセグメント、およびＪセグメント）の３'末端のターゲティングにおいて使用される第７の相同腕、ピギーバック末端反復（ＰＢ－ＴＲ）、逆位ハイグロマイシン耐性遺伝子、ＦＲＴ、逆位ｐｕｒｏΔＴＫ遺伝子、ｌｏｘｍ２／７１（第４のＲＲＳ）、プロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）、およびヒトＩｇＨ遺伝子座の可変領域の３'末端のターゲティングにおいて使用される第８の相同腕からなる。

【1287】

ここで、ＤＮＡドナーは目的に従って様々な形で設計されてもよく、選択プロセスのための様々な要素をさらに含むように設計は修正することができる。
実施例３－２．ＲＲＳが挿入された染色体を含む細胞の作製
実施例３－２－１．ＲＲＳが挿入されたヒト染色体を含む標的ヒト細胞の作製

【1288】

本明細書において使用されるヒト線維芽細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｃｏｒｎｉｎｇ社、米国、バージニア州、Ｍａｎｎａｓａｓ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、米国、バージニア州、Ｍａｎｎａｓａｓ）を含有する、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｃｏｒｎｉｎｇ社、米国、バージニア州、Ｍａｎｎａｓａｓ）を含有する培地、ならびに５％ＣＯ_２、湿度９５％、および３７℃で維持されたインキュベーターにおいて、増殖および維持のために培養した。一過性トランスフェクションを、リポフェクタミン３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国、カリフォルニア州、Ｃａｒｌｓｂａｄ）、またはＮｅｐａ２１（ＮＥＰＡＧＥＮＥ株式会社、日本、千葉）エレクトロポレーターを使用して実施する。１×１０^６個の細胞をＦＢＳおよび抗生物質を含まない培地に播種すること、それに１０μｇの第３のベクターを加えること、それとリポフェクタミン３０００試薬を混合すること、ならびに室温にて５分間、細胞をインキュベートすることによって、一過性トランスフェクションを実施する。代替的には、１０μｇの第３のベクターを加え、１５０Ｖで７．５ｍｓ、二重パルスでトランスフェクションを実施する。５％ＣＯ_２、湿度９５％、および３７℃で維持されたインキュベーターにおいて２４～４８時間、トランスフェクションした細胞をインキュベートする。

【1289】

第３のベクターが、ヒトＩｇＨ遺伝子座の可変領域の５'末端に挿入されているか否かを確認するために、トランスフェクションした細胞をブラストサイジンで処理することによって確認される細胞の生存にしたがって、第３のベクターの挿入を確認する。ブラストサイジン処理の後、生存細胞を得、第３のベクターのために使用されるのと同じ方法によって、第４のベクターでトランスフェクションする。５％ＣＯ_２、湿度９５％、および３７℃で維持されたインキュベーターにおいて２４～４８時間、トランスフェクションした細胞をインキュベートする。第４のベクターが、ヒトＩｇＨ遺伝子座の可変領域の３'末端に挿入されているか否かを確認するために、トランスフェクションした細胞をＧ４１８（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国、ニューヨーク州）で処理することによって、第４のベクターの挿入を確認する。Ｇ４１８処理の後、生存細胞を得る。

【1290】

第３のベクターおよび第４のベクターが、同じ染色体（ヒトＩｇＨ遺伝子座を有する染色体）に挿入されているか否かを確認するために、Ｇ４１８処理後に得られた細胞をリコンビナーゼ、フリッパーゼ（ＦＬＰ）で処理する。第３のベクターおよび第４のベクターが同じ染色体に挿入されている場合、当該２つのベクターに存在するＦＲＴおよび処理したＦＬＰによる組換えを誘導することによって、ヒトＩｇＨ遺伝子座の可変領域は逆位される。これを確認するために、ＦＲＴ－ＦＬＰ組換えが誘導された細胞をゼオシンで処理し、次いで、細胞の生存に従って、同じ染色体への第３のベクターおよび第４のベクターの挿入を確認する。ゼオシン処理の後、生存細胞を得る。得られた細胞は、ｌｏｘ６６（第３のＲＲＳ）およびｌｏｘｍ２／７１（第４のＲＲＳ）がそれぞれ、ヒトＩｇＨ遺伝子座の可変領域の両端に挿入されている染色体を含む細胞である。体細胞は一般に、２つのアレルを有するため、このような選択プロセスは通常、第３のベクターおよび第４のベクターのうち１つのみが２つのアレルに挿入される場合を排除するために実施する。

【1291】

ここで、ベクターがいくつかある場合、ベクターの導入は、順次に、ランダムに、または同時に、実施することができる。ベクターが導入された細胞を選択するプロセスは、ベクターに挿入される要素に従って、様々な仕方で修正することができる。
実施例３－２－２．ＲＲＳが挿入されたマウス染色体を含む標的マウス細胞の作製

【1292】

細胞増殖および維持のために、基本培地、すなわち、５％ＣＯ_２、湿度９５％、および３７℃で維持されたインキュベーターにおいて、ＦＢＳを含まないＮ２Ｂ２７培地をＭＥＫ阻害剤ＰＤ０３２５９０１（１μＭ）およびＧＳＫ３阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１（３μｍ）（ともにＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社製、米国、ミズーリ州、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、および１，０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国、マサチューセッツ州、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）で補うことによって調製される２ｉ培地において、本明細書において使用されるマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）を培養する。一過性トランスフェクションを、リポフェクタミン３０００、またはＮｅｐａ２１（ＮＥＰＡＧＥＮＥ株式会社、日本、千葉）エレクトロポレーターを使用して実施する。１×１０^６個の細胞をＦＢＳおよび抗生物質を含まない培地に播種すること、それに１０μｇの第１のベクターを加えること、それとリポフェクタミン３０００試薬を混合すること、ならびに室温にて５分間、細胞をインキュベートすることによって、一過性トランスフェクションを実施する。代替的には、１０μｇの第１のベクターを加え、１２５Ｖで５ｍｓ、二重パルスでトランスフェクションを実施する。５％ＣＯ_２、湿度９５％、および３７℃で維持されたインキュベーターにおいて２４～４８時間、トランスフェクションした細胞をインキュベートする。

【1293】

第１のベクターが、マウスＩｇＨ遺伝子座の可変領域の５'末端に挿入されているか否かを確認するために、トランスフェクションした細胞をブラストサイジンで処理した後の細胞の生存にしたがって、第１のベクターの挿入を確認する。ブラストサイジン処理の後、生存細胞を得、次いで第１のベクターと同じ方法によって、第２のベクターでトランスフェクションする。５％ＣＯ_２、湿度９５％、および３７℃で維持されたインキュベーターにおいて２４～４８時間、トランスフェクションした細胞をインキュベートする。第２のベクターが、マウスＩｇＨ遺伝子座の可変領域の３'末端に挿入されているか否かを確認するために、トランスフェクションした細胞をＧ４１８（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国、ニューヨーク州）で処理した後の細胞の生存にしたがって、第２のベクターの挿入を確認する。Ｇ４１８処理の後、生存細胞を得る。

【1294】

第１のベクターおよび第２のベクターが、同じ染色体（マウスＩｇＨ遺伝子座を有する染色体）に挿入されているか否かを確認するために、Ｇ４１８処理後に得られた細胞をリコンビナーゼ、すなわちフリッパーゼ（ＦＬＰ）で処理する。第１のベクターおよび第２のベクターが同じ染色体に挿入されている場合、マウスＩｇＨ遺伝子座の可変領域は、当該２つのベクターに存在するＦＲＴおよび処理したＦＬＰによる組換えを誘導することによって、逆位される。これを確認するために、ＦＲＴ－ＦＬＰ組換えが誘導された細胞をゼオシンで処理し、次いで、細胞の生存に従って、同じ染色体への第１のベクターおよび第２のベクターの挿入を確認する。ゼオシン処理の後、生存細胞を得る。得られた細胞は、ｌｏｘｍ２／６６（第１のＲＲＳ）およびｌｏｘ７１（第２のＲＲＳ）がそれぞれ、マウスＩｇＨ遺伝子座の可変領域の両端に挿入されている染色体を含む細胞である。体細胞は一般に、２つのアレルを有するため、このような選択プロセスは通常、第１のベクターおよび第２のベクターのうち１つのみが２つのアレルに挿入される場合を排除するために実施する。

【1295】

ここで、ベクターがいくつかある場合、ベクターの導入は、順次に、ランダムに、または同時に、実施してもよい。ベクターが導入された細胞を選択するプロセスは、ベクターに挿入される要素に従って、様々な仕方で修正することができる。
実施例３－３．標的ヒト細胞を使用するミクロセルの作製

【1296】

コルセミド（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国、ニューヨーク州、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ）を使用して、微小核形成を実施する。選択された標的ヒト細胞（ｌｏｘ６６（第３のＲＲＳ）およびｌｏｘｍ２／７１（第４のＲＲＳ）がそれぞれ、ヒトＩｇＨ遺伝子座の可変領域の両端に挿入されている染色体を含む細胞）を１×１０^６個に成長させて１日後、２０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭと培地を交換し、次いで細胞を０．１μｇ／ｍｌのコルセミドで処理し、５％ＣＯ_２、湿度９５％、および３７℃で維持されたインキュベーターにおいて４８時間、インキュベートする。微小核形成が誘導された標的ヒト細胞を、ｔｒｙＬＥ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国、ニューヨーク州、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ）を使用して剥離させ、血清を含まないＤＭＥＭで洗浄し、続いて５分間、１０００ｒｐｍで遠心分離（ＬＡＢＯＧＥＮＥ株式会社、韓国）する。遠心分離に供した細胞を、予温した血清を含まないＤＭＥＭ：Ｐｅｒｃｏｌｌ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社、米国、ミズーリ州、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）（１：１（ｖ：ｖ））に懸濁させ、最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるようにサイトカラシンＢ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社、米国、ミズーリ州、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）で処理する。全細胞およびミクロセルを、３４～３７℃で１～１．５時間、１６０００ｇの遠心分離（ＬＡＢＯＧＥＮＥ社）によって単離する。単離された全細胞およびミクロセルを５０ｍｌチューブに移し、それに血清を含まないＤＭＥＭを加え、続いて１０分間、５００ｇで遠心分離する。上清を穏やかに除去し、チューブ表面に付着されたペレットに、血清を含まないＤＭＥＭを１０ｍｌ加え、８μｍフィルター（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国、イリノイ州、シカゴ）を使用して、サイズが８μｍ以下のミクロセルを単離する。単離されたミクロセルを含む上清を、１０分間、４００ｇで、再度遠心分離する。遠心分離されたミクロセルを、８μｍフィルターを使用する方法と同じ仕方で、５μｍフィルターを使用して単離する。最終的に単離されたミクロセルを、ＮｉｋｏｎｅｃｌｉｐｓｅＴＳ１００光学顕微鏡（ＮｉｋｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、米国、ニューヨーク州、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ）を使用して計数する。したがって、標的ヒト細胞からミクロセルを得る。
実施例３－４．ミクロセル－標的マウス細胞の融合細胞の作製

【1297】

レシピエント細胞として使用される、単離されたヒトミクロセルおよび標的マウス細胞（ｌｏｘｍ２／６６（第１のＲＲＳ）およびｌｏｘ７１（第２のＲＲＳ）がそれぞれ、マウスＩｇＨ遺伝子座の可変領域の両端に挿入されている染色体を含む細胞）を調製する。標的マウス細胞をＴｒｙＬＥで処理し、続いて遠心分離する。遠心分離した標的マウス細胞を、１×ＤＰＢＳで洗浄し、血球計数器を使用して細胞数を算出する。ヒトミクロセルと標的マウス細胞との融合を、懸濁法によって、ＨＶＪ－Ｅタンパク質（コスモ・バイオ株式会社、日本、東京）を使用して実施する。ヒトミクロセルの標的マウス細胞に対する、算出された比は、１：４である。調製されたヒトミクロセルおよび標的マウス細胞の各々を、５００μｌの低温の１×細胞融合用緩衝液で洗浄する。ヒトミクロセルおよび標的マウス細胞の緩衝溶液で、４℃で５分間、３００ｇで遠心分離を実施する。２×１０^５個の標的マウス細胞毎に２５μｌの１×細胞融合用緩衝液を加え、同じ体積の１×細胞融合用緩衝液をヒトミクロセルに加える。標的マウス細胞およびヒトミクロセルを一緒に混合して、５～１０μｌのＨＶＪ－Ｅタンパク質をそれに加え、次いで細胞を氷上で５分間、放置する。混合物を３７℃の水浴中に１５分間、放置する。ここで、混合物を５分毎にタッピングする。ヒトミクロセルと標的マウス細胞との細胞融合が完了した後、５分間、３００ｇで遠心分離することによって、残りのＨＶＪ－Ｅタンパク質を除去する。融合した細胞を、標的マウス細胞培養培地を含むディッシュに入れ、次いで、５％ＣＯ_２、湿度９５％、および３７℃で維持されたインキュベーターにおいて４８時間、インキュベートする。作製された融合細胞は、標的ヒト染色体（ｌｏｘ６６（第３のＲＲＳ）およびｌｏｘｍ２／７１（第４のＲＲＳ）が挿入された、ヒトＩｇＨ遺伝子座の可変領域を含む染色体）、ならびに標的マウス染色体（ｌｏｘｍ２／６６（第１のＲＲＳ）およびｌｏｘ７１（第２のＲＲＳ）が挿入された、マウスＩｇＨ遺伝子座の可変領域を含む染色体）を含む細胞である。
実施例３－５．融合細胞を使用する、人工組換え染色体を含む細胞の作製

【1298】

ヒトミクロセルおよび標的マウス細胞を融合し、融合細胞を４８時間、安定化する。１００μｌのＦＢＳおよび抗生物質を含まないＯｐｔｉ－ＭＥＭを、１×１０^６個の融合細胞に加える。ここで、１０μｇのｐＣＭＶ－Ｃｒｅベクター（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ有限責任会社、米国、カリフォルニア州、ＰａｌｏＡｌｔｏ）を加えて１２５Ｖで５ｍｓ、二重パルスでトランスフェクションを実施する。３００μｌの２ｉ培地を加え、細胞とよく混合し、１００ｍｍディッシュに細胞を移し、５％ＣＯ_２、湿度９５％、および３７℃で維持されたインキュベーターにおいて４８時間、インキュベートする。

【1299】

人工組換え染色体がＣｒｅリコンビナーゼで処理された融合細胞において作製されているか否かを確認するために、Ｃｒｅリコンビナーゼで処理された融合細胞を抗生物質（ピューロマイシン、Ｇ４１８、およびハイグロマイシン）で処理する。Ｃｒｅリコンビナーゼで処理された融合細胞においては、標的ヒト染色体（ｌｏｘ６６（第３のＲＲＳ）およびｌｏｘｍ２／７１（第４のＲＲＳ）が挿入された、ヒトＩｇＨ遺伝子座の可変領域を含む染色体）と、標的マウス染色体（ｌｏｘｍ２／６６（第１のＲＲＳ）およびｌｏｘ７１（第２のＲＲＳ）が挿入された、マウスＩｇＨ遺伝子座の可変領域を含む染色体）との間の組換えをＣｒｅリコンビナーゼによって誘導する。標的マウス染色体における第１のＲＲＳは、標的ヒト染色体における第４のＲＲＳと対合され、標的マウス染色体における第２のＲＲＳは、標的ヒト染色体における第３のＲＲＳと対合される。ＲＲＳの対合は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識されて組換えを誘導する。

【1300】

結果として、標的マウス染色体のマウスＩｇＨ遺伝子座の可変領域がヒトＩｇＨ可変領域で置換された第１の人工組換え染色体、および標的ヒト染色体のヒトＩｇＨ遺伝子座の可変領域がマウスＩｇＨ可変領域で置換された第２の人工組換え染色体が、作製される。第１の人工組換え染色体において、ヒトＩｇＨ遺伝子座の可変領域を除く部分は、マウス遺伝子を有する（たとえば、マウスＩｇＨ遺伝子座の定常領域はマウス遺伝子である）。第２の人工組換え染色体において、マウスＩｇＨ遺伝子座の可変領域を除く部分は、ヒト遺伝子を有する（たとえば、ヒトＩｇＨ遺伝子座の定常領域はヒト遺伝子である）。

【1301】

抗生物質（ピューロマイシン、Ｇ４１８、およびハイグロマイシン）処理の後、生存細胞を得る。得られた細胞は、第１の人工組換え染色体および第２の人工組換え染色体を含む細胞であり、標的ヒト染色体および標的マウス染色体を含まない細胞である。

【1302】

作製された第１の人工組換え染色体は、第５のＲＲＳおよび第６のＲＲＳを含んでもよい。第５のＲＲＳおよび第６のＲＲＳは、第１のＲＲＳと第４のＲＲＳとの間の組換え、ならびに第２のＲＲＳおよび第３のＲＲＳとの間の組換えによって作製されるＲＲＳである。さらに、作製された第２の人工組換え染色体は、第７のＲＲＳおよび第８のＲＲＳを含んでもよい。第７のＲＲＳおよび第８のＲＲＳは、第１のＲＲＳと第４のＲＲＳとの間の組換え、ならびに第２のＲＲＳおよび第３のＲＲＳとの間の組換えによって作製されるＲＲＳである。

【1303】

第１の人工組換え染色体および第２の人工組換え染色体に含まれる、ＲＲＳ（第５のＲＲＳ、第６のＲＲＳ、第７のＲＲＳ、および第８のＲＲＳ）、ｐｕｒｏΔＴＫ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ならびにＦＲＴを、第１の人工組換え染色体および第２の人工組換え染色体を含む得られた細胞を、ピギーバックトランスポザーゼで処理することによって、除去する。ここで、ＲＲＳ（第５のＲＲＳ、第６のＲＲＳ、第７のＲＲＳ、および第８のＲＲＳ）、ｐｕｒｏΔＴＫ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）、ゼオシン耐性遺伝子、ならびにＦＲＴが除去される人工組換え染色体を含む細胞は、フィアルリジン（ＦＩＡＵ）で処理することによって選択する。

【1304】

人工組換え染色体は、ＲＲＳの位置、方向、および対合に従って、様々な仕方で組換えられてもよい。関心対象の人工組換え染色体を作製するために、上述のようにＤＮＡドナーの設計を修正することによって、人工組換え染色体を作製することができる。実施例３－６．人工組換え染色体を含む細胞を使用するトランスジェニック動物の作製

【1305】

人工組換え染色体を含む細胞を使用してトランスジェニック動物を作製するために、実施例３－５において得られる人工組換え染色体を含む細胞をＦＩＡＵで処理する。処理後に得られる細胞を、胚盤胞注入によって胞胚に移植して、それによってキメラ胚盤胞を作製する。作製されたキメラ胚盤胞を代理母の子宮に移植し、それによってマウスの子孫を生成する。作製されたマウスの子孫はキメラトランスジェニックマウスであり、ヘテロ接合体トランスジェニックマウス、またはホモ接合体トランスジェニックマウスを、キメラトランスジェニックマウスを繁殖させることによって作製する。

【1306】

作製されたトランスジェニックマウスにおいて、ゲノム上のＩｇＨ遺伝子座の可変領域はヒト化されていてもよく、トランスジェニックマウスを、ヒト化抗体および／または完全ヒト抗体の作製において使用してもよい。

【1307】

ここで、トランスジェニックマウスは、胚盤胞注入以外の様々な方法によって作製することができる。

【1308】

上述のとおり、限定された実施形態および図面を参照しながら実施形態を説明してきたが、様々な修正および交替が当業者には可能である。たとえば、説明される手法が上で説明される方法とは異なる順番で実施されても、または他の構成要素もしくは均等物で置き換えられるか、代用されても、適切な結果を得ることができる。したがって、他の実施形態、実施例、および特許請求の範囲の均等物は、以下に記載する特許請求の範囲の範囲内にある。
［配列表フリーテキスト］

【1309】

配列番号：１～２２はプライマー配列、配列番号：２３～３１はＲＲＳ配列、配列番号：３２および３３はリコンビナーゼのアミノ酸配列である。

【図1】