【図1】 トレハロースを給餌したＪＮＣＬマウスにおける疾患病状の改善を示す図である。（ａ）トレハロースはＣｌｎ３Δｅｘ７－８マウスの生存期間を有意に延長した。処置（Ｔｒｅ）Ｃｌｎ３Δｅｘ７－８マウス：ｎ＝１３。未処置（ＵＴ）Ｃｌｎ３４ｅｘ７－８マウス：ｎ＝１２。（ｂ）トレハロース処置を行った、および行わなかった１２ヶ月齢のＷＴマウスおよびＣｌｎ３Δｅｘ７－８マウスの脳重量。すべてのマウス群、ｎ＝４または５。（ｃ）トレハロース処置を行った、および行わなかった１２ヶ月齢のＷＴおよびＣｌｎ３Δｅｘ７－８マウスの脳の異方性比率。左パネル：４つの群の脳の代表的な冠状画像；脳梁は黄色い矢印で示されている。右パネル：脳梁容積の定量化。すべてのマウス群、ｎ＝３または４。スケールバー、２μｍ。処置群および対照群のマウスにおける脳梁の３次元再構成は、補足動画１～４で報告される。（ｄ）ホットプレートテストでは、Ｃｌｎ３Δｅｘ７－８マウスは、野生型（ＷＴ）同腹仔と比較して５０℃の加熱された金属表面に置かれ多場合の反応が遅くなり、痛覚感受性が低下することを示している。トレハロース（Ｔｒｅ）処置により、Ｃｌｎ３Δｅｘ７－８マウスにおいてこの表現型は救済された。すべてのマウス群、ｎ＝１４～１９。データは平均値±平均値の標準誤差を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図2】 処置マウスおよび未処置マウスにおける体重の評価を示す図である。１２ヶ月齢のＷＴマウスおよびＣｌｎ３Δｅｘ７－８マウスの体重のヒストグラムは、トレハロース（Ｔｒｅ）処置にかかわらず、遺伝子型間に差がないことを明らかにしている。ｎｓ、非有意。すべてのマウス群、ｎ＝８～１１。データは平均値±ＳＥＭを表す。

【図3】 処置および未処置マウスにおける聴覚機能の評価を示す図である。（ａ）生後１０ヶ月の聴性脳幹反応（ＡＢＲ）は、ＷＴ同腹仔と比較してＣｌｎ３Δｅｘ７－８マウスにおいてＡＢＲ閾値の上昇を示し、これは聴力損失を示す。（ｂ）トレハロース処置は両方の遺伝子型においてＡＢＲ閾値を低下させ、これは聴覚の改善を示している。すべてのマウス群、ｎ＝４～６。データは平均値±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５。

【図4】 蓄積負荷の評価を示す図である。（ａ、ｂ）トレハロース処置（Ｔｒｅ）マウスおよび未処置マウスの、７ヶ月齢での一次体性感覚皮質（Ｓ１ＢＦ；ａ）、および相互接続視床中継核（ＶＰＭ／ＶＰＬ；ｂ）における蓄積物質の共焦点画像および定量化。閾値画像分析により、Ｃｌｎ３Δｅｘ７－８マウスの皮質および視床においてより高レベルの自己蛍光蓄積物質が明らかになり、これがトレハロース処置により減少した。スケールバー、５０μｍすべてのマウス群、ｎ＝３または４。（ｃ、ｄ）１２ヶ月齢のトレハロース処置マウスおよび対照マウスの、一次体性感覚皮質（Ｓ１ＢＦ；ｃ）、および相互接続視床中継核（ＶＰＭ／ＶＰＬ；ｄ）における蓄積物質の量の共焦点画像および定量化。閾値画像分析により、Ｃｌｎ３Δｅｘ７－８マウスの皮質および視床においてより高レベルの自己蛍光蓄積物質が明らかになり、これがトレハロース処置により部分的に減少した。すべてのマウス群、ｎ＝３または４。スケールバー、５０μｍ（ａ～ｄ）。データは平均値±平均値の標準誤差を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（ｅ、ｆ）未処理（ＵＴ）Ｃｌｎ３Δｅｘ７－８マウス脳のＴＥＭ分析は、プルキンエ細胞（ｅ）および皮質ニューロン（ｆ）の両方において、高電子密度の細胞質物質（黄色の矢じり）の顕著な蓄積を示す。ＦＰＰ計数の頻度分布は、トレハロース（Ｔｒｅ）処置マウスにおけるＦＰＰの有意な減少を明らかにした。マウスの群当たりの細胞数ｎ＝１８。頻度分析にはコルモゴロフ－スミルノフ検定を適用した。スケールバー、２μｍ。

【図5】 処置および未処置のＣｌｎ３Δｅｘ７－８マウスにおける１２ヶ月齢でのリソソーム蓄積負荷の透過型電子顕微鏡観察を示す図である。電子顕微鏡写真は、未処置のＪＮＣＬマウスのリソソームにおけるフィンガープリントプロファイル（ＦＰＰ）の存在を示し、これは処置マウスでは劇的に減少している。顕微鏡写真は、未処置（ＵＴ）および処置（Ｔｒｅ）マウスのコホートからのプルキンエ細胞の代表例である。矢印はＦＰＰを示す。スケールバーは０．２μｍである。

【図6】 神経炎症の評価の図である。（ａ、ｂ）一次体性感覚皮質（Ｓ１ＢＦ；ａ）および相互接続視床中継核（ＶＰＭ／ＶＰＬ；ｂ）におけるＧＦＡＰの免疫組織化学的染色を用いた、７ヶ月齢でのトレハロース処置（Ｔｒｅ）および未処置（ＵＴ）のＷＴおよびＣｌｎ３Δｅｘ７－８マウスにおける星状細胞増加症の分析および定量化。（ｃ、ｄ）Ｓ１ＢＦ（ｃ）およびＶＰＭ／ＶＰＬ（ｄ）脳領域におけるＣＤ６８の免疫組織化学的染色を用いたミクログリア活性化の分析および定量化。ミクログリア活性化は、Ｃｌｎ３Δｅｘ７－８マウスのＳ１ＢＦおよびＶＰＭ／ＶＰＬ領域の両方で明らかであり、これはＳ１ＢＦ領域におけるトレハロース処置によって有意に救済される。すべてのマウス群、ｎ＝４または５。（ｅ、ｆ）Ｓ１ＢＦ（ｅ）およびＶＰＭ／ＶＰＬ（ｆ）におけるＧＦＡＰの免疫組織化学的染色を用いた、１２ヶ月齢でのトレハロース処置（Ｔｒｅ）マウスおよび対照（ＵＴ）マウスにおける星状細胞増加症の分析および定量化。トレハロース処置は、Ｃｌｎ３Δｅｘ７－８マウスにおけるＧＦＡＰ免疫反応性を、Ｓ１ＢＦ領域で４３％およびＶＰＭ／ＶＰＬ領域で６７％減少させた。（ｇ、ｈ）Ｓ１ＢＦ（ｇ）およびＶＰＭ／ＶＰＬ（ｈ）脳領域における、ＣＤ６８に対する免疫組織化学的染色を用いたミクログリア活性化の分析および定量化。ミクログリア活性化は、Ｃｌｎ３Δｅｘ７－８マウスのＳ１ＢＦおよびＶＰＭ／ＶＰＬ領域の両方において明らかであり、これはトレハロース処置によりＶＰＭ／ＶＰＬ領域において４８％減少される。すべてのマウス群、ｎ＝３または４。スケールバー、５０ｍｍ。データは平均値±平均値の標準誤差を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図7】 トレハロース処理におけるＴＦＥＢのｍＴＯＲＣ１非依存性核内移行を示す図である。（ａ）トレハロース処理におけるＴＦＥＢの時間依存性核内移行（緑色のシグナル）を示すＨｅＬａ／ＴＦＥＢ細胞の共焦点顕微鏡分析。（ｂ）２４時間のトレハロース処理（Ｔｒｅ）後または未処理細胞（ＵＴ）中のＴＦＥＢ細胞内局在化（Ｃ、細胞質；Ｎ、核）の定量化。ａ、ｂのスケールバーは４０μｍである。（ｃ）免疫ブロット分析により、ｍＴＯＲＣ１の下流の基質の発現レベルが示される。野生型（ＷＴ）およびＴＳＣ２ヌルＭＥＦ細胞をトレハロース（Ｔｒｅ；１００ｍＭ）で２４時間処理するか、または未処理のままにした。対照として、細胞をＴｏｒｉｎ１（３００ｎＭ）またはラパマイシン（３００ｎＭ）で２時間処理し、その後溶解物を抽出した。ホスホ－および総Ｓ６Ｋ１（Ｐ－Ｓ６Ｋ１およびＴ－Ｓ６Ｋ１）、ホスホ－および総Ｓ６（Ｐ－Ｓ６およびＴ－Ｓ６）、ならびにホスホ－および総４Ｅ－ＢＰ１（Ｐ－４Ｅ－ＢＰ１およびＴ－４Ｅ－ＢＰ１）が、ｍＴＯＲＣ１活性の読み出しとして検出された。（ｄ）ＷＴ細胞および（ｅ）ＴＳＣ２ヌルＭＥＦ細胞をＴＦＥＢ－３×ＦＬＡＧで一過性にトランスフェクトし、トレハロース投与後のＴＦＥＢの核内移行について試験した。（ｆ）ＴＦＥＢ－３×ＦＬＡＧおよびｍＴＯＲまたは（ｇ）ＴＦＥＢ－３×ＦＬＡＧおよび構成的に活性なｍＴＯＲ（ＣＡ－ｍＴＯＲ、Ｃ２４１９Ｋ）構築物を同時トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を、トレハロース処理（１００ｍＭで２４時間）または未処理のままにし、その後、それぞれＦＬＡＧおよびｍＴＯＲ抗体を用いてＴＦＥＢ（赤）およびｍＴＯＲ（緑）を免疫蛍光標識した。スケールバー、１０μｍ（ｄ～ｇ）。データは平均値±平均値の標準誤差を表す。

【図8】 トレハロースがｍＴＯＲＣ１活性を変化させないことを示す図である。ＨｅＬａ細胞を、トレハロースで２４時間または４８時間、またはｍＴＯＲＣ１阻害の対照としてラパマイシン（６００ｎＭ、１６時間）またはＴｏｒｉｎ１（３００ｎＭ、２時間）で処理した。ｍＴＯＲＣ１基質の免疫ブロット分析は、トレハロース処理においてそれらのリン酸化状態が変化しないことを示している。ＧＡＰＤＨを負荷対照として使用した。

【図9】 トレハロースはＳ２１１でＴＦＥＢのリン酸化を修正しない。ＴＦＥＢ－Ｆｌａｇを、ＴＦＥＢ－ＦｌａｇをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞から免疫沈降させ、２４時間トレハロースで処理するか、または未処理のままにした。免疫ブロット分析は、ホスホ（Ｓｅｒ）－１４－３－３結合モチーフに対する抗体および対照抗体を用いて行った。

【図10】 ＴＦＥＢの細胞内局在はｍＴＯＲＣ２には依存しないことを示す図である。（ａ）ＨｅＬａ細胞に、指示されている場合にはＲｉｃｔｏｒに対するｓｉＲＮＡを７２時間トランスフェクトした。細胞を、指示されている場合、分析前に２４時間トレハロースで処理した。棒グラフは、３回の繰り返しの平均値を表す。データは平均値±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１（ｂ）ＨｅＬａ／ＴＦＥＢ－Ｆｌａｇ細胞を（ａ）のように処理し、免疫蛍光共焦点分析のために標識した。スケールバーは２０μｍである。

【図11】 トレハロースによるＣＬＥＡＲネットワークの活性化を示す図である。（ａ、ｂ）トレハロース処理におけるリソソーム遺伝子の上方制御を示す、対照（ＣＴＲＬ；ａ）およびＪＮＣＬ線維芽細胞（ｂ）の発現分析。遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨに対して正規化した。（ｃ）トレハロース投与により上方制御された遺伝子を表すＣｙｔｏｓｃａｐｅ生成ネットワーク。ドット（遺伝子を表す）は青い線によって接続されており、色強度は共調節の程度に比例している。ネットワークはＴＦＥＢリソソーム標的を含むより緊密な発現関係を有する遺伝子のコア（ネットワークの中心）を有するが、よりゆるやかに相関している他の遺伝子がネットワークの周辺に見出される。（ｄ、ｅ）リソソーム遺伝子を用いた、ＣＴＲＬ（ｄ）およびＪＮＣＬ線維芽細胞（ｅ）へのトレハロース投与後のトランスクリプトーム変化のＧＳＥＡ。上のパネルは、ランク付けされた遺伝子発現データについてのＧＳＥＡによって生成された濃縮プロットを示す（左、赤：上方制御；右、青：下方制御）。垂直の青いバーは、ランク付けされたリスト内の各選択された遺伝子セットにおける遺伝子の位置を示す。下のパネルは、ランク付けされたリスト内のリソソーム遺伝子の累積分布を示す。分析した遺伝子の５０％を含むランキング位置が示されている。分析は、トレハロース投与後に上方制御された遺伝子の中のリソソーム遺伝子の濃縮を示す。（ｆ、ｇ）ＣＴＲＬ（ｆ）およびＪＮＣＬ線維芽細胞（ｇ）へのトレハロース投与後の、リソソーム遺伝子およびリソソーム代謝において公知の役割を有するＴＦＥＢ標的を含むトランスクリプトームの変化のＧＳＥＡを報告している。ＴＦＥＢリソソーム標的は、一般的なリソソーム遺伝子よりも高いＥＳスコアを有し、トレハロースが、対照およびＪＮＣＬ線維芽細胞の両方においてリソソーム機能に関与するＴＦＥＢ標的を優先的に上方制御したことを示している。データは平均値±平均値の標準誤差を表す。

【図12】 インビボでのＴＦＥＢ核内移行とＣＬＥＡＲネットワーク活性化を示す図である。（ａ、ｂ）Ｅ１７．５でのＷＴ（ａ）およびＣｌｎ３Δｅｘ７－８胚（ｂ）からの培養皮質ニューロンの発現分析は、トレハロース投与におけるリソソーム遺伝子の転写活性化を示す。（ｃ、ｄ）ＷＴ（ｃ）およびＣｌｎ３Δｅｘ７－８（ｄ）マウスからの脳切片の共焦点顕微鏡観察は、処置マウスのプルキンエにおけるＴＦＥＢの優勢な核分布を示す。棒グラフのＣとＮは、それぞれ細胞質ゾルおよび核の分布を示している。スケールバー、２０μｍ。（ｅ、ｆ）未処置マウスと比較した、トレハロース投与におけるＷＴ（ｅ）およびＣｌｎ３Δｅｘ７－８（ｆ）マウスからの脳ホモジネートの発現分析は、リソソーム遺伝子の転写活性化を示している。遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子Ｓ１６に対して正規化した。赤い破線は未処置マウスにおける相対的遺伝子発現を示す。データは平均値±平均値の標準誤差を表す。

【図13】 ＷＴおよびＣｌｎ３Δｅｘ７－８マウス由来の処理された星状細胞におけるリソソームの増強を示す図である。野生型（ＷＴ）およびＪＮＣＬ（Ｃｌｎ３Δｅｘ７－８）マウスから単離した培養星状細胞におけるリソソームマーカー、Ｌａｍｐ１の免疫ブロット分析。

【図14】 ＡｋｔがＴＦＥＢをＳｅｒ４６７でリン酸化することを示す図である。（ａ）トレハロースおよびキナーゼ阻害剤の添加時のＴＦＥＢの核内移行を示すＨｅＬａ／ＴＦＥＢ細胞の共焦点顕微鏡分析（ＡｋｔについてはＭＫ２２０６；ＰＩ３ＫについてはＬＹ２９４００２；ｍＴＯＲについてはｔｏｒｉｎ１およびラパマイシン）。破線ボックス（上段）は、高出力インサート（下段）の位置を示している。（ｂ）同じキナーゼ阻害剤と共にインキュベートしたＨｅＬａ／ＴＦＥＢ細胞の細胞内分画。（ｃ）以下の種からのＴＦＥＢアミノ酸配列のマルチアラインメント：Ａｃ、グリーンアノール（Ａｎｏｌｉｓ ｃａｒｏｌｅｎｓｉｓ）；Ｂｔ、ウシ（ボース・タウルス（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ））；Ｄｒ、ゼブラフィッシュ（ダニオ・レニオ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ））；Ｆｃ、イエネコ（フェリス・カトゥース（Ｆｅｌｉｘ ｃａｔｕｓ））；Ｇｇ、セキショクヤケイ（ガルス・ガルス（ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）；Ｈｓ、ホモサピエンス；Ｌａ、アフリカゾウ（ロクソドンタ・アフリカーナ（Ｌｏｘｏｄｏｎｔａ ａｆｒｉｃａｎａ））；Ｍｍ、ハツカネズミ（ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））；Ｒｎ、ドブネズミ（ラトス・ノルベギクス（Ｒａｔｔｕｓ Ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））；Ｓｈ、タスマニアデビル（Ｓａｒｃｏｐｈｉｌｕｓ ｈａｒｒｉｓｉｉ）；Ｓｐ、アメリカムラサキウニ（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ）；ＸＩ、アフリカツメガエル（キセノプス・レヴィス（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ））。Ａｋｔリン酸化部位のコンセンサスロゴ（ｗｅｂｌｏｇｏ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ／ｌｏｇｏ．ｃｇｉで作成）はＴＦＥＢ配列と整列している。位置４６７はヒトタンパク質配列を指す。（ｄ）ＴＦＥＢおよびＴＦＥＢ（Ｓ４６７Ａ）の細胞内局在化。（ｅ）ＴＦＥＢまたはＴＦＥＢ（Ｓ４６７Ａ）をトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞におけるリソソームおよびオートファジー遺伝子の発現分析。遺伝子発現を、ハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨに対して正規化した。破線は、空のベクターをトランスフェクトした細胞における相対的遺伝子発現を示す。（ｆ）ＨｅＬａ細胞における１４－３－３タンパク質とＴＦＥＢ－ＦｌａｇまたはＴＦＥＢ（Ｓ４６７Ａ）との共局在化アッセイ。（ｇ）ＴＦＥＢまたはＴＦＥＢ（Ｓ４６７Ａ）と１４－３－３タンパク質との免疫共沈降アッセイ。（ｈ）Ａｋｔインビトロキナーゼアッセイ。組換え活性ＡＫＴ１および精製ＴＦＥＢ－ＦｌａｇまたはＴＦＥＢ（Ｓ４６７Ａ）－Ｆｌａｇを［３２Ｐ］ＡＴＰの存在下でインキュベートしたところ、ＡｋｔがＴＦＥＢをリン酸化すること、およびこの反応がＳ４６７を必要とすることが明らかになった。（ｉ）３つの異なるＡＫＴｓｉＲＮＡによって媒介されるＡＫＴサイレンシングは、ウエスタンブロット分析によって示されるように、ＴＦＥＢ核内移行およびリソソーム拡大をもたらした。（ｊ）ＨｅＬａ細胞の経時分析は、ＬＡＭＰ１、ｐ６２およびＬＣ３マーカーによって示されるように、トレハロース誘導性ＡＫＴ不活性化およびオートファジーフラックスの増加を示す。（ｋ）ＴＦＥＢ－ＦＬＡＧと、ＡＫＴ－ＧＦＰまたはＡＫＴ（ＤＤ）－ＧＦＰのいずれかとを共トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を、２４時間トレハロースで処理し、その後ＴＦＥＢ（赤色）およびＡＫＴ－ＧＦＰ（緑色）で免疫蛍光標識した。ＤＡＰＩは細胞の核を示す。（１）トレハロース処置マウスからのＷＴおよびＣｌｎ３Δｅｘ７－８の脳ホモジネートにおいてＡＫＴの活性化の減少が観察された。スケールバー、１０μｍ（ａ、ｅ、ｆ、ｋ）。データは平均値±平均値の標準誤差を表す。＊Ｐ＜０．０５。

【図15】 血清刺激がＡｋｔ活性を調節することによりＴＦＥＢの細胞内局在を調節することを示す図である。（ａ）ＷＴ細胞およびＴｓｃ２－／－細胞を血清飢餓状態にし（１６時間）、指示されている場合は飢餓の最後の２時間にＭＫ２２０６で処理し、指示されている場合は最後の３０分間透析血清で刺激した。示したように細胞溶解物を抗体でプローブした。（ｂ）ＷＴ細胞およびＴｓｃ２－／－細胞にＴＦＥＢ－Ｆｌａｇを一過性にトランスフェクトし、（ａ）と同様に処理し、免疫蛍光共焦点顕微鏡によって分析した。スケールバーは６０μｍである。

【図16】 トレハロースがＧＳＫ３β非依存的にＴＦＥＢのＡｋｔ調節を制御することを示す図である。（ａ）ＨｅＬａ細胞を２４時間トレハロースで処理するか、または未処理のままにした。免疫ブロット分析を用いて、ＧＳＫ３３のレベルおよびそのリン酸化状態を評価した。ＧＡＰＤＨを負荷対照として使用した。（ｂ）ＨｅＬａ細胞に、ＴＦＥＢ－３×Ｆｌａｇおよび構成的に活性なＧＳＫ３β（ＣＡ－ＧＳＫ３β）を同時トランスフェクトし、トレハロースまたはＭＫ２２０６で２４時間処理し、Ｆｌａｇ（赤色）およびＧＳＫ３β（緑色）についての免疫蛍光標識により調べた。スケールバーは２０＆ｍである。（ｃ）ＨｅＬａ細胞に、ＴＦＥＢ－３×Ｆｌａｇおよび構成的に活性なＡｋｔ（Ａｋｔ－ＤＤ）を同時トランスフェクトし、ＧＳＫ３β阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１で２４時間処理し、Ｆｌａｇ（赤）およびＡｋｔ（緑）についての免疫蛍光標識により調べた。スケールバーは２０μｍである。

【図17】 トレハロースがＥＲＫを阻害しないことを示す図である。ＴＦＥＢ－ＦｌａｇまたはＴＦＥＢ－Ｓ４６７Ａ－Ｆｌａｇプラスミドを一過性にトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞からの全タンパク質抽出物のウエスタンブロット分析は、ＴＦＥＢ－Ｓ４６７Ａのより低い分子量へのシフトを示す。

【図18】 Ｓ４６７Ａ ＴＦＥＢ型の分子量のシフトを示す図である。ＴＦＥＢ－ＦｌａｇまたはＴＦＥＢ－Ｓ４６７Ａ－Ｆｌａｇプラスミドを一過性にトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞からの全タンパク質抽出物のウエスタンブロット分析は、ＴＦＥＢ－Ｓ４６７Ａのより低い分子量へのシフトを示す。

【図19】 ＴＦＥＢ－Ｓ１４２ＡおよびＴＦＥＢ－Ｓ２１１Ａの共焦点顕微鏡分析を示す図である。ＨｅＬａ細胞に指示された構築物を一過性にトランスフェクトし、免疫蛍光共焦点顕微鏡分析により分析した。スケールバーは１０μｍである。

【図20】 ＷＴおよびＴｓｃ２－／－マウス胚性線維芽細胞におけるＴＦＥＢ（Ｓ４６７Ａ）核局在化を示す図である。Ｔｓｃ２－／－マウス胚性線維芽細胞。ＷＴおよびＴｓｃ２－／－ＭＥＦにＴＦＥＢ（Ｓ４６７Ａ）を一過性にトランスフェクトし、共焦点顕微鏡によって分析した。スケールバーは１０μｍである。

【図21】 ＡｋｔがＴＦＥＢの安定性を調節することを示す図であるバイシストロン性ＴＦＥＢ－Ｆｌａｇ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰまたはＴＦＥＢ（Ｓ４６７Ａ）－Ｆｌａｇ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰと、Ａｋｔ（ＤＤ）－ＧＦＰベクターを同時トランスフェクトした細胞、またはＡｋｔ（ＤＤ）－ＧＦＰベクターをトランスフェクトしない細胞由来の溶解物の免疫ブロットは、変異型ＴＦＥＢタンパク質が野生型ＴＦＥＢよりも安定であることを示す。

【図22】 ＡｋｔがＴＦＥＢと相互作用することを示す図である。（ａ）ＴＦＥＢとＡｋｔとの相互作用を示す免疫共沈降アッセイ。（ｂ）ＡｌａによるＴＦＥＢ Ｓｅｒ４６７の置換は、Ａｋｔとの結合に影響を及ぼさない。

【図23】 ＡＫＴの薬理学的阻害は、ＴＦＥ３およびＭＩＴＦの核内移行を誘導する。ＨｅＬａ細胞にＴＦＥ３－３×Ｆｌａｇ（ａ）およびＭＩＴＦ－３×Ｆｌａｇ（ｂ）を一過性にトランスフェクトし、共焦点顕微鏡により分析した。スケールバーは１０μｍである。

【図24】 Ａｋｔ阻害が、ＴＦＥＢ核内移行およびＣＬＥＡＲネットワークの活性化を促進することを示す図である。（ａ）トレハロースまたはＭＫ２２０６で処理した細胞における点の数の増加を示すＬＣ３染色。（ｂ）ＬＣ３脂質化のイムノブロット分析。（ｃ）トレハロースまたはＭＫ２２０６で処理した試料中の自食性小胞（黄色の矢印）の数の増加を示すＨｅＬａ細胞の顕微鏡写真。（ｄ）ＭＫ２２０６で処理したＨｅＬａ細胞におけるリソソームおよびオートファジー遺伝子の発現分析。遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨに対して正規化した。破線は未処理細胞における相対的遺伝子発現を示す。（ｅ～ｇ）Ｃｌｎ３Δｅｘ７－８マウスへのＭＫ２２０６の腹腔内注射により、Ａｋｔの不活性化（ｅ）、ＴＦＥＢの核内移行（ｆ）、およびリソソーム遺伝子とオートファジー遺伝子の上方制御（ｇ）が示される。スケールバー、１０μｍ（ａ）、５０ｎｍ（ｃ）、２０μｍ（ｆ）。

【図25】 Ａｋｔの薬理学的阻害が、リソソーム内セロイド脂肪色素を有する患者からの初代細胞における細胞クリアランスを調節することを示す図である。（ａ～ｄ）欠陥のあるＣＬＮ３（ｃ．４６１－６７７ｄｅｌ；ａ）、ＰＰＴ１（ｃ．６６５Ｔ＞Ｃ、ｐ．Ｌ２２２Ｐ；ｂ）、ＴＰＰ１（ｃ．３８０Ｇ＞Ａ、ｐ．Ｒ１２７Ｑ；ｇ．３５５６、ＩＶＳ５－１Ｇ＞Ｃ；ｃ）またはＭＦＳＤ８（ｃ．１０３Ｃ＞Ｔ、ｐ．Ｒ３５Ｘ；ｄ）を有する初代線維芽細胞の共焦点顕微鏡分析は、ＭＫ２２０６およびトレハロースがセロイド脂肪色素沈着物（緑色）のクリアランスを誘導することを示す。欠陥タンパク質が示されている。各パネルについて６０を超える細胞が分析された。スケールバー、３０μｍ。（ｅ）ＴＦＥＢのＡｋｔ依存性トレハロース活性化の概略図。データは平均値±平均値の標準誤差を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図26】 リソソーム内セロイド脂肪色素の蓄積に対するトレハロースおよびＡｋｔの効果を示す図である。欠陥のあるＣＬＮ３を有する初代線維芽細胞の共焦点顕微鏡分析（ｃ．４６１－６７７ｄｅｌ）。（ａ）細胞をトレハロースで７日間または４日間処理し、続いてトレハロースを除去し、さらに３日間増殖させた。（ｂ）細胞を４日間７日間ＭＫ２２０６で処理し、続いてＭＫ２２０６を除去し、さらに３日間増殖させた。データは平均値±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。スケールバーは３０μｍである。

【図27】 図７、８、９、１０、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２１、２２および２４に示すウエスタンブロットの全スキャンを示す図である。

【図28】 トレハロースおよびレンツトレハロースＡ、Ｂ、およびＣの化学構造を示す図である。

【図29】 トレハロースおよびその類似体であるラクトトレハロース（ｂ）；ガラクトトレハロース（ｃ）；６－アジドトレハロース（ｄ）の化学構造を示す図である。

【図30】 バッテン病マウスの神経細胞死に対するトレハロース、ミグルスタット、およびトレハロースとミグルスタットの併用の効果を示す図である。野生型マウス、未処置バッテン病マウス、ならびにトレハロース、低濃度のミグルスタット、高濃度のミグルスタット、およびミグルスタットとトレハロースとの併用で処置したバッテン病マウスにおけるＣＡＳ－３陽性細胞の密度のヒストグラム（細胞数／面積）。

【図31】 バッテン病マウスのアストログリア増殖症に対するトレハロース、ミグルスタット、およびトレハロースとミグルスタットとの併用の効果を示す図である。（Ａ）野生型マウス、未処置のバッテン病マウス、ならびにトレハロース、低濃度のミグルスタット、高濃度のミグルスタット、およびミグルスタットとトレハロースとの併用で処置したバッテン病マウス由来の神経組織におけるＧＦＡＰ染色を示す顕微鏡画像。（Ｂ）野生型マウス、未処置バッテン病マウス、ならびにトレハロース、低濃度のミグルスタット、高濃度のミグルスタット、およびミグルスタットとトレハロースとの併用で処置したバッテン病マウスにおけるＧＦＡＰ陽性細胞の密度（細胞数／面積）のヒストグラム。

【図32】 バッテン病マウスのマクロファージ浸潤に対するトレハロース、ミグルスタット、およびトレハロースとミグルスタットとの併用の効果を示す図である。（Ａ）野生型マウス、未処置のバッテン病マウス、ならびにトレハロース、低濃度のミグルスタット、高濃度のミグルスタット、およびミグルスタットとトレハロースとの併用で処置したバッテン病マウス由来の神経組織におけるＣＤ６８染色を示す顕微鏡画像。（Ｂ）野生型マウス、未処置バッテン病マウス、ならびにトレハロース、低濃度のミグルスタット、高濃度のミグルスタット、およびミグルスタットとトレハロースとの併用で処置したバッテン病マウスにおけるＣＡＳ－３陽性細胞の密度（細胞数／面積）のヒストグラム。