(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-06-26
(45)【発行日】2023-07-04
(54)【発明の名称】癲癇の治療におけるカンナビノイドの使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/192 20060101AFI20230627BHJP
A61K 9/02 20060101ALI20230627BHJP
A61K 9/12 20060101ALI20230627BHJP
A61K 9/72 20060101ALI20230627BHJP
A61K 31/05 20060101ALI20230627BHJP
A61K 31/165 20060101ALI20230627BHJP
A61K 31/19 20060101ALI20230627BHJP
A61K 31/352 20060101ALI20230627BHJP
A61K 31/357 20060101ALI20230627BHJP
A61K 31/4015 20060101ALI20230627BHJP
A61K 31/415 20060101ALI20230627BHJP
A61K 31/423 20060101ALI20230627BHJP
A61K 31/515 20060101ALI20230627BHJP
A61K 31/5513 20060101ALI20230627BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230627BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20230627BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230627BHJP
【ＦＩ】
A61K31/192
A61K9/02
A61K9/12
A61K9/72
A61K31/05
A61K31/165
A61K31/19
A61K31/352
A61K31/357
A61K31/4015
A61K31/415
A61K31/423
A61K31/515
A61K31/5513
A61K45/00
A61P25/08
A61P43/00 121
【請求項の数】
14
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2021153168
(22)【出願日】2021-09-21
(62)【分割の表示】P 2018507504の分割
【原出願日】2016-07-29
(65)【公開番号】P2021191797
(43)【公開日】2021-12-16
【審査請求日】2021-10-08
(31)【優先権主張番号】1514079.1
(32)【優先日】2015-08-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】319016758
【氏名又は名称】ジーダブリュー・リサーチ・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】コリン・ストット
(72)【発明者】
【氏名】ニコラス・ジョーンズ
(72)【発明者】
【氏名】ロビン・ウィリアムズ
(72)【発明者】
【氏名】ベンジャミン・ウィアレイ
【審査官】松浦 安紀子
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２００５／０２６６１０８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１３－５２３７０８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５３２０９３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５０１２７１（ＪＰ，Ａ）
【文献】CBD-A: CANNABIDIOL ACID CANNABINOID PROFILE[ONLINE]，2015年07月02日，検索日：２０２２年８月３０日、ＵＲＬ：https://web.archive.org/web/20151020010230/https://www.whaxy.com/learn/can-the-CBD-A-cannabinoid-help-you
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／１９２
Ａ６１Ｋ ９／０２
Ａ６１Ｋ ９／１２
Ａ６１Ｋ ９／７２
Ａ６１Ｋ ３１／０５
Ａ６１Ｋ ３１／１６５
Ａ６１Ｋ ３１／１９
Ａ６１Ｋ ３１／３５２
Ａ６１Ｋ ３１／３５７
Ａ６１Ｋ ３１／４０１５
Ａ６１Ｋ ３１／４１５
Ａ６１Ｋ ３１／４２３
Ａ６１Ｋ ３１／５１５
Ａ６１Ｋ ３１／５５１３
Ａ６１Ｋ ４５／００
Ａ６１Ｐ ２５／０８
Ａ６１Ｐ ４３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
治療に有効な量のカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）を含む、癲癇の治療における使用のための組成物であって、前記ＣＢＤＡが全抽出物の９８％ｗ／ｗを超えて存在するような高度に精製された抽出物の形態であるか、前記ＣＢＤＡが合成的に生成される、組成物。
【請求項2】
前記癲癇が全般性癲癇である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記癲癇が全般性発作によって特徴付けられる、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
前記癲癇が強直間代性発作によって特徴付けられる、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項5】
前記治療に有効な量が少なくとも０．１ｍｇである、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
前記高度に精製された抽出物が１％ｗ／ｗ未満のテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）またはテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
前記ＣＢＤＡが１つまたは複数の他のカンナビノイドと同時に使用される、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
前記ＣＢＤＡがカンナビジオール（ＣＢＤ）と一緒に使用される、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
ＣＢＤＡ：ＣＢＤの比が９：１～１：９（ＣＢＤＡ：ＣＢＤ）の範囲である、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
前記ＣＢＤＡが１つまたは複数の他の抗癲癇薬（ＡＥＤ）と同時に使用される、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項11】
前記１つまたは複数の他のＡＥＤが、クロバザム、クロナゼパム、レベチラセタム、トピラメート、スチリペントール、フェノバルビタール、ラコサミド、バルプロ酸、およびゾニサミドから選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
前記ＣＢＤＡが４００ｍｇ未満の治療に有効な量の用量で使用される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項13】
前記ＣＢＤＡが１ｍｇ～１００ｍｇの１日量で使用される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
経口液剤、固体、半固体、ゲル、スプレー、エアロゾール剤、吸入剤、噴霧剤、浣腸または坐剤として送達するために処方される、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、癲癇の治療における治療に有効な量のカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）の使用に関する。一実施形態では、ＣＢＤＡは、全般性発作、好ましくは強直間代性発作の治療に使用される。
【0002】
好ましくは、使用されるＣＢＤＡは、ＣＢＤＡ含量が６０％を超える生薬原薬の形態であり、最も好ましくは、それは、ＣＢＤＡが全抽出物の９５％（ｗ／ｗ）を超え、９６％（ｗ／ｗ）および９７％（ｗ／ｗ）を超え、最も好ましくは９８％（ｗ／ｗ）までを超えて存在し、かつ抽出物の他の成分が特徴付けられるような高度に精製された大麻の抽出物である。具体的には、カンナビノイドであるテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）またはテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）が実質的に除去されている。あるいは、ＣＢＤＡは合成的に生成され得る。
【0003】
使用において、ＣＢＤＡは、１つまたは複数の他の抗癲癇薬（ＡＥＤ）と同時に使用され得る。あるいは、ＣＢＤＡは、１つまたは複数のＡＥＤと別個に、その後に、または同時に投与するように処方することができ、またはその組合せを単一剤形で提供することができる。ＣＢＤＡが別個に、その後に、または同時に投与するように処方される場合、それは、指示された方法でその１つまたは複数の成分を投与するためにキットとして、または使用説明書と一緒に提供することができる。それはまた、単独の薬物療法として、すなわち単剤療法として使用することもできる。
【背景技術】
【0004】
癲癇は、世界的に人口の約１％で起こっており（Ｔｈｕｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、そのうちの７０％は、利用可能な既存の抗癲癇薬（ＡＥＤ）により症状を十分に制御することができる。しかしながら、この患者群の３０％（Ｅａｄｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２）は、利用可能なＡＥＤを使用して発作からの解放を得ることができず、したがって難治性癲癇、すなわち「治療抵抗性癲癇」（ＴＲＥ）に罹患していると称される。
【0005】
難治性、すなわち治療抵抗性癲癇は、国際抗癲癇連盟（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｅａｇｕｅ Ａｇａｉｎｓｔ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ）（ＩＬＡＥ）により、「持続的な発作からの解放を達成するための２つの容認されたかつ適切に選択および使用されたＡＥＤ計画（単剤療法としてであろうと、または併用であろうと）の適正な試行の失敗」として２００９年に定義された（Ｋｗａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）。
【0006】
生涯の最初の数年間に癲癇を発症する個体は、治療が困難であることが多く、したがって多くの場合、治療抵抗性と呼ばれる。幼児期に頻繁に発作を経験する子供は、多くの場合、認知的遅れ、行動的遅れ、および運動遅延を引き起こす可能性のある神経障害が残る。
【0007】
幼児期の癲癇は、１００，０００人当たり約７００人の患者数である、子供および若年成人における比較的一般的な神経障害である。これは人口当たりの癲癇の成人数の２倍である。
【0008】
子供および若年成人が発作を示す場合、その原因を調べるために通常は検査が行われる。小児期の癲癇は、多くの異なる症候群および遺伝子の突然変異によって引き起こされる可能性があり、したがって、これらの子供の診断はある程度の時間を要する。
【0009】
癲癇の主な症状は、発作の繰返しである。患者が患っている癲癇のタイプまたは癲癇性症候群を判定するために、その患者が経験している発作型の検査が行われる。臨床的観察および脳波検査（ＥＥＧ）が行われ、発作型が下記に述べかつ図１に示すＩＬＡＥ分類に従って分類される。
【0010】
ＩＬＡＥによって提案された発作型の国際分類は１９８１年に採用され、改定提案が２０１０年にＩＬＡＥによって公表されたが、１９８１年分類は依然として破棄されていない。図１は、改定された用語法の２０１０年提案から改変され、「部分性」という用語法を「焦点性」に置き換える提案の変更を含む。加えて、用語「単純部分発作」は、用語「意識／反応が損なわれない焦点発作」によって置き換えられ、および用語「複雑部分発作」は、用語「意識／反応が損なわれる焦点発作」によって置き換えられた。
【0011】
図１から、発作が両側に分布したネットワーク内で生じ、急速にネットワーク全域に展開する全般発作は、６つのサブタイプ：強直間代発作（大発作）、欠神発作（小発作）、間代発作、強直発作、無緊張発作、およびミオクローヌス発作に分け得ることが分かる。
【0012】
発作が片側の大脳半球のみに限定されたネットワーク内で生じる焦点（部分）発作もサブカテゴリーに分けられる。この場合、発作は、前兆、運動、自律神経、および意識／反応を含む発作の１つまたは複数の特徴に従って特徴付けられる。発作が限局性発作として始まり、急速に進展して両側のネットワーク内に分布するようになる場合、この発作は両側性痙攣性発作として知られる。これは、二次性全般発作（焦点発作から進展し、もはや限局性に留まらない全般発作）に置き換えることが提案された用語法である。
【0013】
対象の意識／反応が変容する焦点発作は、機能障害を伴う焦点発作と呼ばれ、および対象の意識または反応が損なわれない焦点発作は、機能障害のない焦点発作と呼ばれる。
【0014】
焦点発作は、レノックス・ガストー症候群、結節性硬化症、ドラベ症候群、ＣＤＫＬ５、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）、発熱性感染症関連癲癇症候群（ＦＩＲＥＳ）、アイカルディ症候群、および脳異常を含む癲癇症候群において起こる場合がある。
【0015】
癲癇症候群はしばしば多くの異なる型の発作の症状を示すが、標準的なＡＥＤの多くは、所与の発作型／亜型を治療することを標的にしているか、またはそれに対してのみ有効であるため、患者が患っている発作の型を特定することが重要である。
【0016】
それらの作用の機序によって規定される一般的なＡＥＤを下記の表に示す。
【0017】
【表1】
【0018】
【表2】
【0019】
【表3】
【0020】
【表4】
【0021】
過去４０年にわたり、発作の治療のための非精神活性カンナビノイドであるカンナビジオール（ＣＢＤ）の使用について動物での複数の研究が存在している。例えば、Ｃｏｎｓｒｏｅら（１９８２）は、ＣＢＤが、痙攣誘発薬または電流を投与した後のマウスの発作を予防し得ることを特定した。
【0022】
癲癇の成人での研究はまた、ＣＢＤに関して過去４０年行われてきた。Ｃｕｎｈａらは、全般性癲癇を有する８人の成人患者へのＣＢＤの投与が、それら患者のうちの４人で発作の顕著な減少をもたらしたと報告した（Ｃｕｎｈａ ｅｔ ａｌ．，１９８０）。
【0023】
１９７８年の研究は、４人の成人の患者に２００ｍｇ／日の純粋なＣＢＤを与えた。それらの４人の患者のうちの２人が発作から解放されるようになったのに対し、残りでは発作頻度が変わらなかった（Ｍｅｃｈｏｕｌａｍ ａｎｄ Ｃａｒｌｉｎｉ，１９７８）。
【0024】
上記の研究とは対照的に、オープンラベル研究は、２００ｍｇ／日の純粋なＣＢＤが１２人の成人入院患者の発作の制御に効果がなかったと報告した（Ａｍｅｓ ａｎｄ Ｃｒｉｄｌａｎｄ，１９８６）。
【0025】
癲癇を有する患者でのＣＢＤの有効性を考察する年代順で最後の研究が、ＣＢＤが発作を制御できないことを示唆しているという事実に基づき、ＣＢＤが抗痙攣薬として役立つ可能性があるという期待はさほどない。
【0026】
過去４０年の研究において、癲癇の治療用に認可された３０種類を超える薬物が存在するが、それらのいずれもカンナビノイドではない。実際、場合によりこれらの化合物の予定された性質のために、かつ／または既知の向精神薬であるＴＨＣがプロ痙攣誘発薬とみなされてきたために、カンナビノイドに対する偏見が存在しているように思われる（Ｃｏｎｓｒｏｅ ｅｔ ａｌ．，１９７７）。
【0027】
最近公開された研究論文は、カンナビジオール濃度の高い大麻が癲癇の治療に有効である可能性があることを示唆した。Ｐｏｒｔｅｒ ａｎｄ Ｊａｃｏｂｓｏｎ（２０１３）は、あるＦａｃｅｂｏｏｋグループを介して行われた、治療抵抗性癲癇を有する子供に対するＣＢＤを多く含む大麻の使用について調査した両親調査を報告している。調査された１９組の親のうちの１６組は、その子供の癲癇が改善されたことを報告したことが分かった。この報告書で調査された子供は、すべて高濃度でＣＢＤを含有すると称される大麻抽出物を摂取していたが、これらの事例の多くについて、存在するＣＢＤの量、ならびにＴＨＣおよびテルペンなどの非カンナビノイド成分を含む他の成分の量は分からなかった。実際には、そのＣＢＤレベルは０．５～２８．６ｍｇ／ｋｇ／日の範囲（テストされたこれらの抽出物において）であったが、０．８ｍｇ／ｋｇ／日程度のＴＨＣレベルが報告された。
【0028】
ＴＲＥを有する子供に、痙攣誘発剤と呼ばれるＴＨＣを含む大麻抽出物（Ｃｏｎｓｒｏｅ ｅｔ ａｌ．，１９７７）を、０．８ｍｇ／ｋｇ／日の潜在的な精神活性用量で与えたことは望ましくない。
【0029】
ＴＨＣＡだけでなくＣＢＤＡを他のカンナビノイドおよび非カンナビノイド成分と共に含有することになる大麻の煎じ汁が癲癇に使用されてきたが、それら治療は単離されたまたは高度に精製されたＣＢＤＡに焦点を当てていない。むしろ最近の関心対象は、癲癇の治療におけるＣＢＤＡの脱炭酸形態、すなわちＣＢＤの使用にある。
【0030】
しかしながら、ＣＢＤＡは、国際公開第２００３／０６３８４７号パンフレットに示されているように悪心の治療に有効であることが分かっており、また国際公開第２００２／０６４１０９号パンフレットに示されているようにＴＮＦα阻害剤として免疫調節状態および抗炎症状態の治療用に提案されている。
【0031】
特許出願英国特許第２，４９５，１１８号明細書は、癲癇の治療用にＣＢＤＶおよびＣＢＤを含む組成物を使用することについて記述している。更に、特許出願国際公開第２０１１／１２１３５１号パンフレットは、癲癇の治療におけるＣＢＤＶの使用について記述している。これらの両方の文献は、少量の非脱炭酸ＣＢＤをＣＢＤＡとして含むＣＢＤＶの生薬原薬の使用について記述している。ＣＢＤＡはきわめて少量で存在し、したがって治療に有効な量では存在しない。
【0032】
特許出願米国特許出願公開第２０１５／１２６５９５号明細書は、ＣＢＤＡを含むカンナビノイドを含む経皮用組成物の使用について記述している。
【0033】
特許出願カナダ特許第２，８５９，９３４号明細書およびカナダ特許第２，７３７，４４７号明細書の両方が、化合物ＣＢＤＡを含む医療用の大麻化学変種について記述している。すべての大麻植物がカンナビノイドをそれらの酸の形態で産出し、それらは、次いで簡単に脱炭酸されて、従来から認知されている活性形態のＣＢＤを生成することが容易に理解される。
【0034】
ＣＢＤは、現在、抗癲癇薬として有望な候補であると思われているが、必要と考えられる用量が比較的大量であることおよびＣＢＤのバイオアベイラビリティが比較的劣ることを含む多くの潜在的限界が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0035】
【文献】国際公開第２００３／０６３８４７号
【文献】国際公開第２００２／０６４１０９号
【文献】英国特許第２，４９５，１１８号
【文献】国際公開第２０１１／１２１３５１号
【文献】米国特許出願公開第２０１５／１２６５９５号
【文献】カナダ特許第２，８５９，９３４号
【文献】カナダ特許第２，７３７，４４７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0036】
したがって、特定の発作亜型に対して活性および／または特異性を示すことができ、かつより低濃度で投与することができる他の化合物を見出すことが望ましい。これは、より少量の投与形態の利点を有し、また改良されたバイオアベイラビリティに伴ってより低用量を必要とし、かつ作用の発現がより速い。
【課題を解決するための手段】
【0037】
本発明の第一の態様によれば、癲癇の治療における使用のための治療に有効な量のカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）が提供される。
【0038】
一実施形態では、その癲癇は、全般性癲癇である。より好ましくは、その癲癇は、強直間代性発作によって特徴付けられる。
【0039】
治療に有効な量は、好ましくは少なくとも０．１ｍｇ、好ましくは少なくとも０．５ｍｇ、より好ましくは少なくとも１ｍｇ、より好ましくは更に少なくとも２０ｍｇ以上である。
【0040】
使用されるＣＢＤＡは、ＣＢＤＡ含量が６０％を超える生薬原薬の形態であり得、最も好ましくは、それは、ＣＢＤＡが全抽出物の９５％（ｗ／ｗ）を超え、９６％（ｗ／ｗ）および９７％（ｗ／ｗ）を超え、最も好ましくは９８％（ｗ／ｗ）までを超えて存在し、かつ抽出物の他の成分が特徴付けられるような高度に精製された大麻の抽出物である。具体的には、カンナビノイドであるテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）またはテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）が実質的に除去されている。好ましくは、この高度に精製された抽出物は、１％（ｗ／ｗ）未満のテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）またはテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）を含む。
【0041】
あるいは、ＣＢＤＡは、合成的に生成され得る。
【0042】
ＣＢＤＡはまた、１つまたは複数の他のカンナビノイドと同時に使用され得る。好ましくは、ＣＢＤＡは、ＣＢＤと共に使用される。
【0043】
ＣＢＤＡをＣＢＤと併用する場合、９：１～１：９（ＣＢＤＡ：ＣＢＤ）の比が好ましい。比の範囲には、８：２～２：８（ＣＢＤＡ：ＣＢＤ）、７：３～３：７（ＣＢＤＡ：ＣＢＤ）、６：４～４：６（ＣＢＤＡ：ＣＢＤ）、および１：１（ＣＢＤＡ：ＣＢＤ）ならびにこれらの間の任意の範囲が含まれる。
【0044】
本発明の更なる実施形態ではＣＢＤＡは、１つまたは複数の他の抗癲癇薬（ＡＥＤ）と同時に使用される。
【0045】
ＣＢＤＡは、１０００ｍｇ未満の１日量で使用され得る。好ましくは、ＣＢＤＡの１日量は、８００ｍｇ未満、好ましくは６００ｍｇ未満、より好ましくは４００ｍｇ未満である。
【0046】
１日量は、２００ｍｇ未満、１００ｍｇ未満、またわずか１０ｍｇまたは１ｍｇでもあり得る。
【0047】
カンナビノイドであるＣＢＤＡは、その中性形態であるＣＢＤよりもバイオアベイラブルであるため、同じ徴候の治療の場合にＣＢＤと比べてはるかに低い用量のＣＢＤＡを必要とするはずであると思われる。例えば、癲癇治療のためにヒトに２０ｍｇ／ｋｇの用量のＣＢＤを与えるのが有効であるのに対し、ＣＢＤＡの必要とされる用量は対数倍だけ減少させることができる。
【0048】
このようなより低い用量が治療において利点を有することは明らかである。
【0049】
更に、ＣＢＤＡのこのより大きいバイオアベイラビリティは、ＣＢＤＡがＣＢＤよりも迅速に作用し得ることを意味する。換言すれば、このカンナビノイドであるＣＢＤＡは、ＣＢＤよりも低いＴｍａｘを有することができる。この性質は、ＣＢＤＡをＣＢＤと組み合わせて含む有用な合剤をもたらすことができる。そのＣＢＤＡは、迅速な発現効果を与えるのに役立つことができ、一方、そのＣＢＤは持続効果を与えるのに役立つことができる。
【0050】
ＣＢＤＡ対ＣＢＤの比で示される量（ここで、ＣＢＤＡが支配的なカンナビノイドである）が想定され、それらには９５：５～５５：４５（ＣＢＤＡ：ＣＢＤ）の範囲が含まれる。
【0051】
あるいは、ＣＢＤＡおよびＣＢＤは、実質的に等しい量、すなわち５５：４５～４５：５５（ＣＢＤＡ：ＣＢＤ）で存在することもできる。しかし、更なる実施形態では、ＣＢＤが支配的なカンナビノイドであり得、その範囲は４５：５５～２０：８０（ＣＢＤＡ：ＣＢＤ）であり得る。
【0052】
更に、より高速で作用するＣＢＤＡが、急性発作または癲癇重積状態などの緊急の救急治療を必要とする癲癇の治療用の有用な候補である場合もある。好ましくは、そのＣＢＤＡは、非経口経路により、例えば静脈または筋肉中への注射によって投与される。
【0053】
本発明の第二の態様によれば、治療に有効な量のカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）を対象に投与することを含む、癲癇を治療する方法が提供される。
【0054】
好ましくは、その対象はヒトである。
【0055】
本発明の第三の態様によれば、治療に有効な量のカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）と、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む、癲癇の治療における使用のための組成物が提供される。
【0056】
この組成物は、経口液剤、固体、半固体、ゲル、注射剤、スプレー、エアゾール剤、吸入剤（ｉｎｈａｌｅｒ）、噴霧剤（ｖａｐｏｒｉｓｅｒ）、浣腸、または坐剤のうちの１つまたは複数として投与されることが想定される。このような薬剤は、経口、頬側、舌下、非経口、呼吸器、鼻、および遠位直腸の経路により投与することができる。
【0057】
定義
本発明を説明するために使用される用語の幾つかの定義を下記に詳述する。
本発明を説明するために使用される用語の幾つかの定義を下記に詳述する。
【0058】
本出願において述べるカンナビノイドを、それらの標準的な省略形と共に下記に列挙する。
【0059】
【表5】
【0060】
上記の表は網羅的ではなく、本出願において参照のために特定されるカンナビノイドを単に詳述するに過ぎない。これまでに６０種類を超える様々なカンナビノイドが同定されており、それらのカンナビノイドは、異なるグループ、すなわち植物性カンナビノイド、内在性カンナビノイド、および合成カンナビノイド（新規なカンナビノイド、または合成的に作られる植物性カンナビノイドもしくは内在性カンナビノイドであり得る）に分けることができる。
【0061】
特許出願番号国際公開第２００４／０２６８５７号パンフレットは、高度に精製されたＣＢＤＡの分析について記述している。このＣＢＤＡは、純度９８％超になるように精製され、０．１％未満のＣＢＤ、０．３％のＴＨＣＡ、および０．１％未満のＴＨＣを含むと記載されている。
【0062】
「植物性カンナビノイド」は、天然由来のカンナビノイドであり、大麻植物中に見出すことができる。植物性カンナビノイドは、植物から単離して高度に精製された抽出物を取り出すか、または合成的に複製することができる。
【0063】
「高度に精製されたカンナビノイド抽出物」は、大麻植物から抽出され、かつその高度に精製されたカンナビノイドが純度９８％（ｗ／ｗ）以上になるようにカンナビノイドと一緒に共抽出される他のカンナビノイドおよび非カンナビノイド成分が実質的に除去される程度まで精製されたカンナビノイドと定義される。
【0064】
「合成カンナビノイド」は、カンナビノイドの構造またはカンナビノイドに類似した構造を有し、かつ植物によるのではなく化学的手段を使用して製造される化合物である。
【0065】
本発明の実施形態は、添付図面を参照して以下に更に記述される。
【図面の簡単な説明】
【0066】
【図1】発作および癲癇を体系化するための用語の改訂についてのＩＬＡＥの提案（２０１０）を示す。
【図2A-D】ＰＴＺに誘発される全般性発作に与えるカンナビノイドの影響を示す。
【図3】キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）の細胞増殖に与えるＣＢＤＡの影響を示す。
【図4】キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）の細胞増殖に与えるＣＢＤの影響を示す。
【図5】キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）の増殖に与えるＣＢＤＡおよびＣＢＤの影響の二次プロットを示す。
【図6】実施例３のＣＢＤＡ抽出物のＨＰＬＣトレースを示す。
【発明を実施するための形態】
【0067】
図の凡例
図２：パネルＡ～Ｄは、発作強度（Ａ）、死亡率（Ｂ）、強直間代性発作を示す動物の割合（Ｃ）、および発作発症までの潜伏時間（Ｄ）に与えるＣＢＤＡ（１０～１００ｍｇ／ｋｇ）、ＣＢＤ（１００ｍｇ／ｋｇ）、およびＣＢＤ＋ＣＢＤＡ（９：１の比）の影響を例示する。パネルＡにおいて、発作強度の中央値は濃灰色の横線で表され、２５％値および７５％値はブラックボックスで表され、またホイスカーは最小値と最大値とを表す。パネルＤにおいて発症の潜伏時間は、ＩＱＲを伴う中央値として表される。統計的検定は、事後のマン・ホイットニーのＵ検定を伴うクラスカル・ワリス検定（パネルＡおよびＤ）、または事後のフィッシャーの正確確率検定を伴うχ二乗検定（パネルＢおよびＣ）のいずれかを使用して行った。Ｐ≦０．１（＃）；Ｐ≦０．０５（＊）；Ｐ≦０．０１（＊＊）；Ｐ≦０．００１（＊＊＊）；ｎ＝１５／グループ。
図２：パネルＡ～Ｄは、発作強度（Ａ）、死亡率（Ｂ）、強直間代性発作を示す動物の割合（Ｃ）、および発作発症までの潜伏時間（Ｄ）に与えるＣＢＤＡ（１０～１００ｍｇ／ｋｇ）、ＣＢＤ（１００ｍｇ／ｋｇ）、およびＣＢＤ＋ＣＢＤＡ（９：１の比）の影響を例示する。パネルＡにおいて、発作強度の中央値は濃灰色の横線で表され、２５％値および７５％値はブラックボックスで表され、またホイスカーは最小値と最大値とを表す。パネルＤにおいて発症の潜伏時間は、ＩＱＲを伴う中央値として表される。統計的検定は、事後のマン・ホイットニーのＵ検定を伴うクラスカル・ワリス検定（パネルＡおよびＤ）、または事後のフィッシャーの正確確率検定を伴うχ二乗検定（パネルＢおよびＣ）のいずれかを使用して行った。Ｐ≦０．１（＃）；Ｐ≦０．０５（＊）；Ｐ≦０．０１（＊＊）；Ｐ≦０．００１（＊＊＊）；ｎ＝１５／グループ。
【0068】
図３：増殖が、０．０２μＭ～２０μＭの範囲の濃度のＣＢＤＡの存在下で７日間にわたって測定された。１６８時間における細胞密度の二次プロットを使用して０．３０μＭのＩＣ５０を計算した。
【0069】
図４：増殖が、０．２５μＭ～２０μＭの範囲の濃度のＣＢＤ（ＧＷ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから得た）の存在下で７日間にわたって測定された。１４４時間における細胞密度の二次プロットを使用して１．６３μＭのＩＣ５０を計算した。
【0070】
図５：カンナビノイドは、ＣＢＤＡ＞ＣＢＤの効力順を有する。
【0071】
図６：ＨＰＬトレースにおいて示されたＣＢＤＡ生薬原薬は、６２．４％ｗ／ｗのＣＢＤＡ含量を含み、測定された他のカンナビノイドには、６．９％（ｗ／ｗ）のＣＢＤ、０．７％（ｗ／ｗ）のＴＨＣ、および０．５％（ｗ／ｗ）のカンナビクロメン（ＣＢＣ）が含まれた。
【実施例】
【0072】
実施例１：全般性発作の急性ペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）モデルでのＣＢＤＡのｉｎ ｖｉｖｏ評価
材料および方法
動物
成体雄ウィスター京都ラットが発作の急性ＰＴＺモデルにおいて使用された（＞Ｐ２４、７０～１１０ｇ）。これらの動物は、１ケージにつき５匹が湿度５０％で１２：１２時間の昼夜サイクル（０８００で点灯）の温熱調節室（２１℃）中に収容され、標準的な実験動物用飼料（ＰＣＤ Ｍｏｄ Ｃ、Ｓｐｅｃｉａｌ Ｄｉｅｔ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｗｉｌｔｈａｍ，ＵＫ）および水を自由摂取させた。すべての手順は、９時３０分～１８時３０分（ｗｈｉｔｅ ｌｉｇｈｔ ｈｏｕｒｓ）中に行われた。
材料および方法
動物
成体雄ウィスター京都ラットが発作の急性ＰＴＺモデルにおいて使用された（＞Ｐ２４、７０～１１０ｇ）。これらの動物は、１ケージにつき５匹が湿度５０％で１２：１２時間の昼夜サイクル（０８００で点灯）の温熱調節室（２１℃）中に収容され、標準的な実験動物用飼料（ＰＣＤ Ｍｏｄ Ｃ、Ｓｐｅｃｉａｌ Ｄｉｅｔ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｗｉｌｔｈａｍ，ＵＫ）および水を自由摂取させた。すべての手順は、９時３０分～１８時３０分（ｗｈｉｔｅ ｌｉｇｈｔ ｈｏｕｒｓ）中に行われた。
【0073】
医薬製剤
ＰＴＺ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）原液は、この実験手順の場合、０．９％ｗ／ｖ ＮａＣｌ中で作製された。ＣＢＤ（バッチ番号、ＣＢＤ－ＣＧ－１００１；ＧＷ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫ）およびＣＢＤＡ（バッチ番号、ＣＢＤＡ０４０９１２；ＧＷ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）原料は、エタノール、クレモフォール、および生理的食塩水の２：１：１７のビヒクル中で作製された。
ＰＴＺ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）原液は、この実験手順の場合、０．９％ｗ／ｖ ＮａＣｌ中で作製された。ＣＢＤ（バッチ番号、ＣＢＤ－ＣＧ－１００１；ＧＷ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫ）およびＣＢＤＡ（バッチ番号、ＣＢＤＡ０４０９１２；ＧＷ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）原料は、エタノール、クレモフォール、および生理的食塩水の２：１：１７のビヒクル中で作製された。
【0074】
ＣＢＤＡが、温度および／または製剤中の賦形剤のため、脱炭酸されてＣＢＤになったかどうかを調べるために製剤の分析が行われた。分析は、ＣＢＤＡが製剤化中にＣＢＤに転化しなかったことを明らかにした。したがって、ＣＢＤＡは製剤化中に変性せず、２：１：１７の比率をこの植物カンナビノイドの後の研究において使用することができる。
【0075】
全般性発作のＰＴＺ誘発モデル
ＰＴＺは、ＧＡＢＡＡ受容体のｔ－ブチル－ビシクル－ホスホロチオナート部位と結合することによりＧＡＢＡ阻害に拮抗する。更に、この化学的に誘発されるモデルは、欠神発作に対して効果を示すことができる。ＰＴＺ（９０ｍｇ／ｋｇ）が、成体雄ウィスターラット（ｎ＝１５／グループ）で発作を誘発させるために使用され、ラテン方格法を用いて実験用量をランダム化した。それらの動物を６Ｌパースペックス槽中に置き、それらの環境に１０分間慣れさせてから、ビヒクルに溶かしたカンナビノイド用量（表５参照）または陰性対照の役割を果たすビヒクルのみのボリュームを合わせた用量のうちの１つを受けさせた。テスト化合物またはビヒクルを投与して６０分後、動物にＰＴＺ（９０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を注射して発作を誘発し、動物の行動を３０分間記録した。
ＰＴＺは、ＧＡＢＡＡ受容体のｔ－ブチル－ビシクル－ホスホロチオナート部位と結合することによりＧＡＢＡ阻害に拮抗する。更に、この化学的に誘発されるモデルは、欠神発作に対して効果を示すことができる。ＰＴＺ（９０ｍｇ／ｋｇ）が、成体雄ウィスターラット（ｎ＝１５／グループ）で発作を誘発させるために使用され、ラテン方格法を用いて実験用量をランダム化した。それらの動物を６Ｌパースペックス槽中に置き、それらの環境に１０分間慣れさせてから、ビヒクルに溶かしたカンナビノイド用量（表５参照）または陰性対照の役割を果たすビヒクルのみのボリュームを合わせた用量のうちの１つを受けさせた。テスト化合物またはビヒクルを投与して６０分後、動物にＰＴＺ（９０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を注射して発作を誘発し、動物の行動を３０分間記録した。
【0076】
【表6】
【0077】
ＰＴＺに誘発された発作のビデオにより、全般性発作に適切な標準的な重症度評価尺度を用いてオフラインで評点を付けた（表６）。
【0078】
ヒト等価用量（ＨＥＤ）は、下記の式を使用して推定することができる。
【数1】
【0079】
ラットのＫｍは６であり、ヒトのＫｍは３７である。
【0080】
イヌ（実施例３）のＫｍは２０である。
【0081】
したがって、ラットにおける１０ｍｇ／ｋｇ用量は、約１．６ｍｇ／ｋｇのヒト用量に等しいことになる。ラットにおける５０ｍｇ／ｋｇ用量は、約８．１ｍｇ／ｋｇのヒト用量に等しいことになる。ラットにおける１００ｍｇ／ｋｇ用量は、約１６．２ｍｇ／ｋｇのヒト用量に等しいことになる。
【0082】
【表7】
【0083】
データ分析
特注の観測システムから得られる発作行動のビデオにより、Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｖｉｄｅｏ－Ｐｒｏソフトウェア（Ｎｏｌｄｕｓ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、ＰＴＺモデルに適切な発作尺度（表６）に従ってオフラインで評点を付けた。発作のＰＴＺモデルについて、観測者内および観測者間の行動得点の一致をＯｂｓｅｒｖｅｒ Ｖｉｄｅｏ－Ｐｒｏソフトウェアの信頼性解析機能、すなわち１秒の公差窓；コーエンのκ係数≧０．９５を使用して評価した。
特注の観測システムから得られる発作行動のビデオにより、Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｖｉｄｅｏ－Ｐｒｏソフトウェア（Ｎｏｌｄｕｓ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、ＰＴＺモデルに適切な発作尺度（表６）に従ってオフラインで評点を付けた。発作のＰＴＺモデルについて、観測者内および観測者間の行動得点の一致をＯｂｓｅｒｖｅｒ Ｖｉｄｅｏ－Ｐｒｏソフトウェアの信頼性解析機能、すなわち１秒の公差窓；コーエンのκ係数≧０．９５を使用して評価した。
【0084】
発作行動および発症の特異的マーカーを評価し、ビヒクル対照グループと薬物グループとの間で比較した。発作発症までの潜伏時間および強直間代性発作を発症した動物の割合を記録した（表６参照）。加えて、全般性発作の急性ＰＴＺモデルについて各グループの最大発作強度および死亡率を求めた。
【0085】
統計解析
発作発症までの潜伏時間および最大発作強度に与える薬物の影響を、事後のマン・ホイットニーのＵ検定を伴うクラスカル・ワリス検定を使用して評価した。強直間代性発作を発症した動物の割合および死亡率に与える薬物の影響を、事後のフィッシャーの正確確率検定を伴うχ二乗検定を使用して評価した。すべての場合、Ｐ≦０．０５を有意とみなした。
発作発症までの潜伏時間および最大発作強度に与える薬物の影響を、事後のマン・ホイットニーのＵ検定を伴うクラスカル・ワリス検定を使用して評価した。強直間代性発作を発症した動物の割合および死亡率に与える薬物の影響を、事後のフィッシャーの正確確率検定を伴うχ二乗検定を使用して評価した。すべての場合、Ｐ≦０．０５を有意とみなした。
【0086】
結果
この実施例の目的は、全般性発作のＰＴＺに誘発される急性モデルにおけるＣＢＤＡの抗痙攣薬としての可能性を比較のＣＢＤ用量と対比して検討することであった。加えて、ＣＢＤとＣＢＤＡとの間の相互作用の可能性を調べるために９：１の比率のＣＢＤとＣＢＤＡとが含められた。
この実施例の目的は、全般性発作のＰＴＺに誘発される急性モデルにおけるＣＢＤＡの抗痙攣薬としての可能性を比較のＣＢＤ用量と対比して検討することであった。加えて、ＣＢＤとＣＢＤＡとの間の相互作用の可能性を調べるために９：１の比率のＣＢＤとＣＢＤＡとが含められた。
【0087】
カンナビノイドによる治療は、全般性発作の急性ＰＴＺ誘発モデルにおける発作強度を有意に低減させた（図２のパネルＡ；Ｈ＝１４．３１、Ｐ≦０．０５）。ここで、１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＤＡ（Ｐ≦０．０５）およびＣＢＤ／ＣＢＤＡ比（Ｐ≦０．０５）は、ビヒクル対照と比べて有意な抗痙攣効果を示した。
【0088】
１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＤの投与後、死亡率は有意に低減（Ｐ≦０．０１）し、また１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＤＡ（Ｐ＝０．０６５６）およびＣＢＤ／ＣＢＤＡ比（Ｐ＝０．０６５６）についても有意な低減傾向が認められた（図２のパネルＢ；Ｘ２（６）＝３０．５１、Ｐ≦０．０００１）。
【0089】
カンナビノイドによる治療はまた、強直間代性発作の発生率を有意に低減させ（図２のパネルＣ；Ｘ２（６）＝１７．１７８、Ｐ≦０．０１）、１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＤＡの投与は、強直間代性発作の低減の傾向をもたらした（Ｐ≦０．１）。
【0090】
最後に、解析は、カンナビノイドの投与が、ＰＴＺ誘発モデルにおける発作発症までの潜伏時間に有意に影響を及ぼし、１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＤ（Ｐ≦０．０５）およびＣＢＤ／ＣＢＤＡ（比率９：１；Ｐ≦０．０５）が発症までの潜伏時間を有意に増大させることを明らかにした（図２のパネルＤ；Ｈ＝３７．３７、Ｐ≦０．０００１）。一方、ＣＢＤＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）は、発作発症までの潜伏時間を増大させる傾向を示した（Ｐ＝０．０９２９）。
【0091】
結論
以前の研究により予想されたように、ＣＢＤは、急性の全般性発作のこのモデルにおいて抗痙攣効果を発揮し、したがって植物カンナビノイドの抗痙攣効果を明らかにするこのモデルの変わることのない有効性を実証した。
以前の研究により予想されたように、ＣＢＤは、急性の全般性発作のこのモデルにおいて抗痙攣効果を発揮し、したがって植物カンナビノイドの抗痙攣効果を明らかにするこのモデルの変わることのない有効性を実証した。
【0092】
とりわけ、測定された４つのパラメータのうちの３つにおいてＣＢＤＡは有意な抗痙攣効果を生じ、また等価用量ではＣＢＤよりも統計的に効果的であった。
【0093】
例えば、図２のパネルＡは、発作強度に与えるＣＢＤＡおよびＣＢＤの効果について述べている。動物が１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＤＡで経験した最大発作強度に対する評点の中央値は３（表６、立ち直り反射が保存された完全に発症した両側性前肢クローヌス）であり、また１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＤに対する中央値は５（表６、立ち直り反射が失われた完全に発症した強直間代性発作）であった。これは、ＣＢＤＡが、ＣＢＤよりも動物が重篤な型の発作に罹るのを防ぐことができたことを示す。
【0094】
パネルＣは、加えて、１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＤＡが、１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＤと比較してより多くの動物において強直間代性発作の発症を防ぐことができたことを実証する。実際には、１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＤＡについてのこのデータは、このパラメータにおける唯一の統計的に有意なデータであった。これは、ＣＢＤＡが癲癇、特に強直間代性発作の発症の予防または治療においてＣＢＤよりも有効であることを示唆する。
【0095】
ＣＢＤＡとＣＢＤとの例示的な９：１の比での同時投与は、この組合せも抗痙攣薬として有効であることを実証した。植物はＣＢＤＡを自然に産生し、これを脱炭酸することができるため、それは部分的に脱炭酸した植物カンナビノイドまたはその抽出物を定められた比率で使用することを可能にする。そのような比率は多くの理由で有益であり得る。それらには様々な型の発作を標的にすることが含まれ、例えば、癲癇の動物モデルでのそれらの様々な作用に基づき、部分発作に対してはＣＢＤ、また全般性発作に対してはＣＢＤＡが有利であり得る。また、これらの２つの化合物の親油性またはバイオアベイラビリティの違いは、組合せを様々な放出プロフィールに関して開発することを可能にすることができ、例えばＣＢＤＡはＣＢＤよりも迅速に作用し、かつＣＢＤよりも生物学的に利用可能である可能性がある（実施例３参照）。
【0096】
この実施例は、単離または高度に精製されたカンナビノイドＣＢＤＡが抗痙攣効果を有することを初めて実証し、したがって、その有効性の極限を決定するために発作および癲癇の他のモデルでの更なる検討が正当化される。
【0097】
ＣＢＤおよびＣＢＤＡが同様の機序によって作用するかどうか、また同様の効能を有するかどうかを考察するために、本出願人は、キイロタマホコリカビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）の新しいモデルに関して検討を行った。
【0098】
実施例２：キイロタマホコリカビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）モデルを使用したカンナビノイドの分子標的の特定およびそれらの癲癇における使用
序文
キイロタマホコリカビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）は、生物医学モデル系としてアメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によってリストアップされているアメーバである（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ．ａｌ．，２００６）。それは、核、ゴルジ、ミトコンドリア、および小胞体を備えた真核生物に特有の細胞構造を有し、その半数体ゲノムは、各タンパク質の記述、各タンパク質を欠く変異体の表現型、および関連する公開された物質を含む特徴が完全に明らかにされ、また注釈が付けられている（Ｄｉｃｔｙｂａｓｅ．ｏｒｇ）。キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）は、単細胞として液体培養で増殖させることも、または飢餓時に多細胞子実体の形成を伴う多細胞発達に進行させることもできる。
序文
キイロタマホコリカビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）は、生物医学モデル系としてアメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によってリストアップされているアメーバである（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ．ａｌ．，２００６）。それは、核、ゴルジ、ミトコンドリア、および小胞体を備えた真核生物に特有の細胞構造を有し、その半数体ゲノムは、各タンパク質の記述、各タンパク質を欠く変異体の表現型、および関連する公開された物質を含む特徴が完全に明らかにされ、また注釈が付けられている（Ｄｉｃｔｙｂａｓｅ．ｏｒｇ）。キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）は、単細胞として液体培養で増殖させることも、または飢餓時に多細胞子実体の形成を伴う多細胞発達に進行させることもできる。
【0099】
キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）は、様々な薬物および化学薬品がそれらの効果を発揮する分子機序をより良く理解するために、より強力または安全な化合物を識別するために、またヒトタンパク質の細胞の役割の特徴を明らかにするために開発された。
【0100】
この一連の方法論は、分子薬理学および薬理遺伝学における様々な分野での価値のあるモデルとしてキイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）を使用することを可能にした。これらの研究分野では、確立されているまたは新しい医薬品の主要な標的が不明確なことが多く、またそれら化合物が特徴を明らかにされないままのオフターゲットの副作用を有することも多い。それらは、高コストな後期段階での薬物漸減を引き起こし、また場合により患者の薬剤服用順守に影響を与えることがある。
【0101】
癲癇の研究において、キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）は、バルプロ酸の分子効果を特定するために使用されており（Ｃｕｎｌｉｆｆｅ ｅｔ．ａｌ．２０１５；Ｃｈａｎｇ ｅｔ．ａｌ．２０１２）、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの哺乳動物モデルを翻訳してヒトの健康との関連性を実証してきた（Ｃｈａｎｇ ｅｔ．ａｌ．２０１２、２０１３、２０１４）。キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）が、癲癇治療用の臨床的に適切な治療用化合物を識別するために使用され得ることは明らかである。
【0102】
この実施例は、発作制御と関連して２つのカンナビノイド（ＣＢＤおよびＣＢＤＡ）の作用の分子機序を特定するためのキイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）の使用を実証する。
【0103】
材料および方法
増殖アッセイ
増殖アッセイに先立って野生型（Ａ×２）のキイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）細胞を振盪培養（ＨＬ５培地中）で２日間増殖させた。細胞（４９５μｌの培地中の９９００個）を２４ウェルプレートの各ウェルに加え、ＤＭＳＯに溶かした５μｌのカンナビノイド（またはＤＭＳＯ単独）を各ウェルに加えて各記載濃度（１％の最終ＤＭＳＯ濃度）を達成し、細胞を２２℃で維持した。細胞の数を７２時間目に、次いで２４時間ごとに数えた。各濃度について４回の繰返しが使用された。
増殖アッセイ
増殖アッセイに先立って野生型（Ａ×２）のキイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）細胞を振盪培養（ＨＬ５培地中）で２日間増殖させた。細胞（４９５μｌの培地中の９９００個）を２４ウェルプレートの各ウェルに加え、ＤＭＳＯに溶かした５μｌのカンナビノイド（またはＤＭＳＯ単独）を各ウェルに加えて各記載濃度（１％の最終ＤＭＳＯ濃度）を達成し、細胞を２２℃で維持した。細胞の数を７２時間目に、次いで２４時間ごとに数えた。各濃度について４回の繰返しが使用された。
【0104】
発達アッセイ
発達アッセイに先立って野生型（Ａ×２）のキイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）細胞を振盪培養（ＨＬ５培地中）で２日間増殖させた。細胞をリン酸塩緩衝液（ＫＫ２；２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．１）中で洗浄し、１×１０７個の細胞をニトロセルロースフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃｏｒｋ）上に広げた。４つに分割した吸収パッド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃｏｒｋ）を２ｍｌの培養皿中に置き、２０μＭのカンナビノイドを含有する０．５ｍｌのＫＫ２を含ませた。１ｍＭのバルプロ酸が陽性対照として使用され、一方、１％のＤＭＳＯを含有するＫＫ２が溶媒単独の対照として使用された。細胞を含有するニトロセルロースフィルターを４等分し、吸着パッド上に置き、湿度環境中で２２℃において２４時間維持した。解剖顕微鏡およびカメラを使用して子実体の形態を記録した。
発達アッセイに先立って野生型（Ａ×２）のキイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）細胞を振盪培養（ＨＬ５培地中）で２日間増殖させた。細胞をリン酸塩緩衝液（ＫＫ２；２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．１）中で洗浄し、１×１０７個の細胞をニトロセルロースフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃｏｒｋ）上に広げた。４つに分割した吸収パッド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃｏｒｋ）を２ｍｌの培養皿中に置き、２０μＭのカンナビノイドを含有する０．５ｍｌのＫＫ２を含ませた。１ｍＭのバルプロ酸が陽性対照として使用され、一方、１％のＤＭＳＯを含有するＫＫ２が溶媒単独の対照として使用された。細胞を含有するニトロセルロースフィルターを４等分し、吸着パッド上に置き、湿度環境中で２２℃において２４時間維持した。解剖顕微鏡およびカメラを使用して子実体の形態を記録した。
【0105】
生物情報学的分析
リストアップされたカンナビノイドの可能性のあるホモ・サピエンス（Ｈ．ｓａｐｉｅｎ）タンパク質標的のアミノ酸配列は、ユニプロット（Ｕｎｉｐｒｏｔ）（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏ．ｏｒｇ）から得た。キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）ゲノムの相同性の検索は、ｄｉｃｔｙｂａｓｅ．ｏｒｇで利用できるオンラインＢａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムを使用して行った。ＴＭＨＭＭサーバーＶ．２．０膜貫通領域予測ソフトウェアを使用してキイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）のオルソログタンパク質内の可能性のある膜貫通領域を求めた。タンパク質機能にとって必要な高度に保存された残基を含有するタンパク質の領域は、ＣｌｕｓｔａｌＷ２を使用する多重配列アライメントによって分析した。
リストアップされたカンナビノイドの可能性のあるホモ・サピエンス（Ｈ．ｓａｐｉｅｎ）タンパク質標的のアミノ酸配列は、ユニプロット（Ｕｎｉｐｒｏｔ）（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏ．ｏｒｇ）から得た。キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）ゲノムの相同性の検索は、ｄｉｃｔｙｂａｓｅ．ｏｒｇで利用できるオンラインＢａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムを使用して行った。ＴＭＨＭＭサーバーＶ．２．０膜貫通領域予測ソフトウェアを使用してキイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）のオルソログタンパク質内の可能性のある膜貫通領域を求めた。タンパク質機能にとって必要な高度に保存された残基を含有するタンパク質の領域は、ＣｌｕｓｔａｌＷ２を使用する多重配列アライメントによって分析した。
【0106】
細菌プレートのスクリーニング
ＳＭ寒天プレートが、ＣＢＤＡまたはＣＢＤをそれぞれ１２．３μＭおよび１６．７μＭの最終濃度まで加えて作製された。加熱殺菌（７５℃で３０分間）したラオウルテラ・プランティコーラ（Ｒ．ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）をプレート上に広げ、約５０個の野生型Ａ×２細胞を加え、放置して２２℃で増殖させた。プレートは定期的にコロニーが調べられた。
ＳＭ寒天プレートが、ＣＢＤＡまたはＣＢＤをそれぞれ１２．３μＭおよび１６．７μＭの最終濃度まで加えて作製された。加熱殺菌（７５℃で３０分間）したラオウルテラ・プランティコーラ（Ｒ．ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）をプレート上に広げ、約５０個の野生型Ａ×２細胞を加え、放置して２２℃で増殖させた。プレートは定期的にコロニーが調べられた。
【0107】
変異ＲＥＭＩライブラリーのスクリーニング
スクリーニングに先立ってＲＥＭＩライブラリー細胞を振盪培養（ＨＬ５培地中）で２日間増殖させた。細胞（２ｍｌの培地中に２５，０００個）を６ウェルプレートの各ウェルに加え、放置して２０分間付着させた。各ウェルからの培地を、４．８８μＭのＣＢＤＡまたは９．４７μＭのＣＢＤのいずれかを含有する培地と交換した。細胞は、３週間かけて３回スクリーニングされ、培地を２日ごとに交換して２２℃で維持された。可能性のある抵抗性変異株コロニーを単離し、細菌プレートに移した。同質遺伝子細胞系統を個々のコロニーから細菌プレート上に定着させた。
スクリーニングに先立ってＲＥＭＩライブラリー細胞を振盪培養（ＨＬ５培地中）で２日間増殖させた。細胞（２ｍｌの培地中に２５，０００個）を６ウェルプレートの各ウェルに加え、放置して２０分間付着させた。各ウェルからの培地を、４．８８μＭのＣＢＤＡまたは９．４７μＭのＣＢＤのいずれかを含有する培地と交換した。細胞は、３週間かけて３回スクリーニングされ、培地を２日ごとに交換して２２℃で維持された。可能性のある抵抗性変異株コロニーを単離し、細菌プレートに移した。同質遺伝子細胞系統を個々のコロニーから細菌プレート上に定着させた。
【0108】
個々の変異株の抵抗性の確認
ライブラリーのスクリーニングからの単離によるクローン細胞を液体培地（ＨＬ５培地）中で増殖させて集密１０ｃｍプレートを作った。細胞（４９５μｌの培地中に１０，０００個）を２４ウェルプレートの各ウェルに加え、ＤＭＳＯに溶かした５μｌのカンナビノイドを各ウェルに加えて、４．８８μＭのＣＢＤＡまたは９．４７μＭのＣＢＤ（１％の最終ＤＭＳＯ濃度）のいずれかを達成し、細胞を２２℃で維持した。細胞は、これらの２つのカンナビノイドに対するそれらの感受性を１週間にわたって監視された。
ライブラリーのスクリーニングからの単離によるクローン細胞を液体培地（ＨＬ５培地）中で増殖させて集密１０ｃｍプレートを作った。細胞（４９５μｌの培地中に１０，０００個）を２４ウェルプレートの各ウェルに加え、ＤＭＳＯに溶かした５μｌのカンナビノイドを各ウェルに加えて、４．８８μＭのＣＢＤＡまたは９．４７μＭのＣＢＤ（１％の最終ＤＭＳＯ濃度）のいずれかを達成し、細胞を２２℃で維持した。細胞は、これらの２つのカンナビノイドに対するそれらの感受性を１週間にわたって監視された。
【0109】
結果
増殖アッセイ
まず、キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）の増殖がカンナビノイド、すなわちカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）およびカンナビジオール（ＣＢＤ）に対して感受性であるかどうかを判定することが必要であった。これらの実験では、キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）は、１週間にわたる静止培養での増殖中にわたり一連の濃度範囲の各カンナビノイドにさらされた。２つのカンナビノイドのすべてが、用量依存的にキイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）細胞の増殖を阻害した（図３～５）。
増殖アッセイ
まず、キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）の増殖がカンナビノイド、すなわちカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）およびカンナビジオール（ＣＢＤ）に対して感受性であるかどうかを判定することが必要であった。これらの実験では、キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）は、１週間にわたる静止培養での増殖中にわたり一連の濃度範囲の各カンナビノイドにさらされた。２つのカンナビノイドのすべてが、用量依存的にキイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）細胞の増殖を阻害した（図３～５）。
【0110】
ＣＢＤＡの増殖阻害定数（ＩＣ５０）は０．３０μＭであり（図３）、０．０８μＭは細胞増殖を有意に阻害（Ｐ＜０．０５）し、また２０μＭは増殖をブロックした。
【0111】
ＣＢＤの増殖阻害定数（ＩＣ５０）は１．６３μＭであり（図４）、０．５μＭは細胞増殖を有意に阻害（Ｐ＜０．０５）し、また２０μＭは増殖をブロックした。
【0112】
２つのすべてのカンナビノイドのＩＣ５０値の比較は、ＣＢＤＡが最も強力であることを示唆し、ＣＢＤは８．７倍の効能の減少を示す。したがって、キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）細胞の増殖に及ぼすカンナビノイドの効力の順序は、ＣＢＤＡ＞ＣＢＤである（図５）。
【0113】
発達アッセイ
ＣＢＤＡおよびＣＢＤがキイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）の発達に与える効果を調べた。これは、細胞増殖をブロックする濃度（２０μＭ）のＣＢＤＡまたはＣＢＤの存在下において、栄養物が枯渇した環境中に細胞を置くことによって達成された。
ＣＢＤＡおよびＣＢＤがキイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）の発達に与える効果を調べた。これは、細胞増殖をブロックする濃度（２０μＭ）のＣＢＤＡまたはＣＢＤの存在下において、栄養物が枯渇した環境中に細胞を置くことによって達成された。
【0114】
カンナビノイド不在下の２４時間にわたるニトロセルロースフィルター上での細胞の発達は、茎によって底質より高い位置に保持された胞子頭部からなる子実体を生じさせた。この発達の形態は、広く使用されている抗癲癇薬のバルプロ酸（１ｍＭ）によってブロックされることが知られており、その場合、細胞は集合することができたが、発達を遂げて子実体を形成することができなかった。
【0115】
これに対してＣＢＤＡまたはＣＢＤ（２０μＭ）で処理されたキイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）細胞は、集合し発達して成熟した子実体を形成することができた。
【0116】
生物情報学的分析
次いで、キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）ゲノム内の可能性のあるオルソログを特定するためにホモ・サピエンス（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）におけるＣＢＤＡおよびＣＢＤの既知の標的が探し求められた。最新の文献によれば、ＣＢＤＡおよびＣＢＤの２１個の可能性のある哺乳動物の標的が公表されている。それぞれの可能性のある標的に対応するヒトのタンパク質配列を使用し、ＢＬＡＳＴ分析と組み合わせて、キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）ゲノムをオルソログの標的について検索した。このアプローチを使用して１０個の可能性のあるキイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）のオルソログが特定された。タンパク質の配列およびサイズの類似性、ならびに触媒部位およびモチーフの保存に基づき、３つのタンパク質が更なる検討のために特定された。
次いで、キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）ゲノム内の可能性のあるオルソログを特定するためにホモ・サピエンス（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）におけるＣＢＤＡおよびＣＢＤの既知の標的が探し求められた。最新の文献によれば、ＣＢＤＡおよびＣＢＤの２１個の可能性のある哺乳動物の標的が公表されている。それぞれの可能性のある標的に対応するヒトのタンパク質配列を使用し、ＢＬＡＳＴ分析と組み合わせて、キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）ゲノムをオルソログの標的について検索した。このアプローチを使用して１０個の可能性のあるキイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）のオルソログが特定された。タンパク質の配列およびサイズの類似性、ならびに触媒部位およびモチーフの保存に基づき、３つのタンパク質が更なる検討のために特定された。
【0117】
１：受動拡散型ヌクレオシド輸送体１（ＥＮＴ１）。このタンパク質は、ＣＢＤの可能性のある標的であり、アデノシン輸送で役割を果たす。キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）は、３つの可能性のあるＥＮＴ１オルソログを有し、３つのすべてがホモ・サピエンス（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）のタンパク質中に見いだされる推定上の複数回膜貫通構造を有する。この３つのキイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）のオルソログは、サイズが５２２、４８２、および４３０個のアミノ酸であり、４５６個のアミノ酸のホモ・サピエンス（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）のＥＮＴ１タンパク質に類似しており、最初の膜貫通領域内に位置する高度に保存されたモチーフを含有する。このモチーフは、多くの他の種由来のこのタンパク質内に見いだされる。
【0118】
２：モノアシルグリセリドリパーゼα（ＭＡＧＬａ）。このタンパク質は、エンドカンナビノイド系に関与している。キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）は、１つの可能性のあるＭＡＧＬａオルソログを有する。このオルソログは、３０３個のアミノ酸のホモ・サピエンス（Ｈ．ｓａｐｉｅｎ）のＭＡＧＬＡタンパク質に類似したサイズの４０９個のアミノ酸である。このキイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）とホモ・サピエンス（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）との両方のタンパク質は、多くの他の種に広く保存されている酵素機能において重要な保存された触媒セリン、アスパラギン酸、およびヒスチジン残基を有する。
【0119】
３：ジアシルグリセロールリパーゼα（ＤＡＧＬａ）。このタンパク質は、エンドカンナビノイド系に関与している。キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）は、３つの可能性のあるオルソログを有する。この３つのキイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）オルソログは、サイズが９３８、８５６、および８２６個のアミノ酸であり、１０４２個のアミノ酸のホモ・サピエンス（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）のＤＡＧＬａタンパク質よりもわずかに小さい。３つのキイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）オルソログのすべてが、触媒機能において重要な同じ保存されたセリンおよびアスパラギン酸の残基を有し、これらは多くの他の種に広く保存されている。
【0120】
細菌プレートのスクリーニング
ラオウルテラ・プランティコーラ（Ｒ．ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）細菌プレート上でのキイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）の増殖が、抵抗性ＲＥＭＩ変異ライブラリー細胞を単離することができる実行可能な方法であるかどうかを判定した。野生型Ａ×２細胞を加熱殺菌したラオウルテラ・プランティコーラ（Ｒ．ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）のＳＭ寒天プレート上で増殖させた。各ＳＭ寒天プレートは、それぞれ１２．３μＭおよび１６．７μＭの最終濃度のＣＢＤＡまたはＣＢＤを含有した。４日間のインキュベーション後、プレートを細胞生存（コロニー増殖）に関して評価した。対照（溶媒単独）と比較して、いずれのカンナビノイドについてもコロニー数の違いは見いだされなかった。
ラオウルテラ・プランティコーラ（Ｒ．ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）細菌プレート上でのキイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）の増殖が、抵抗性ＲＥＭＩ変異ライブラリー細胞を単離することができる実行可能な方法であるかどうかを判定した。野生型Ａ×２細胞を加熱殺菌したラオウルテラ・プランティコーラ（Ｒ．ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）のＳＭ寒天プレート上で増殖させた。各ＳＭ寒天プレートは、それぞれ１２．３μＭおよび１６．７μＭの最終濃度のＣＢＤＡまたはＣＢＤを含有した。４日間のインキュベーション後、プレートを細胞生存（コロニー増殖）に関して評価した。対照（溶媒単独）と比較して、いずれのカンナビノイドについてもコロニー数の違いは見いだされなかった。
【0121】
変異ＲＥＭＩライブラリーのスクリーニング
次いで、液体培養での増殖中にカンナビノイドに対して抵抗性を示したライブラリー内で変異株が同定された。このライブラリー細胞を４．８８μＭのＣＢＤＡまたは９．４７μＭのＣＢＤの存在下で３週間かけて増殖させた。２週間後、部分的抵抗性細胞のコロニーが、ライブラリーから得たプレート中に目で見えた。それら部分抵抗性細胞を細菌プレートに移し、継代して各変異株が同質遺伝子型であることを確かめた。
次いで、液体培養での増殖中にカンナビノイドに対して抵抗性を示したライブラリー内で変異株が同定された。このライブラリー細胞を４．８８μＭのＣＢＤＡまたは９．４７μＭのＣＢＤの存在下で３週間かけて増殖させた。２週間後、部分的抵抗性細胞のコロニーが、ライブラリーから得たプレート中に目で見えた。それら部分抵抗性細胞を細菌プレートに移し、継代して各変異株が同質遺伝子型であることを確かめた。
【0122】
個々の変異株の抵抗性の確認
各細胞系統の抵抗性を確かめた。すべての細胞系統をそれぞれ４．８８μＭおよび９．４７μＭの最終濃度のＣＢＤＡまたはＣＢＤのいずれかで処理し、１週間後に評価した。同質遺伝子細胞系統は、様々なカンナビノイドに対して抵抗性の若干の重なりを示した。変異細胞は、各カンナビノイドに対して全く抵抗を示さない、弱い抵抗を示すまたは部分的抵抗を示すものとして分類される３つの基本的表現型を有することが示された。変異細胞はまた、１つのカンナビノイドに対して抵抗性を有するか、複数のカンナビノイドに対して抵抗性を有するいずれかであることが分かった。
各細胞系統の抵抗性を確かめた。すべての細胞系統をそれぞれ４．８８μＭおよび９．４７μＭの最終濃度のＣＢＤＡまたはＣＢＤのいずれかで処理し、１週間後に評価した。同質遺伝子細胞系統は、様々なカンナビノイドに対して抵抗性の若干の重なりを示した。変異細胞は、各カンナビノイドに対して全く抵抗を示さない、弱い抵抗を示すまたは部分的抵抗を示すものとして分類される３つの基本的表現型を有することが示された。変異細胞はまた、１つのカンナビノイドに対して抵抗性を有するか、複数のカンナビノイドに対して抵抗性を有するいずれかであることが分かった。
【0123】
結論
癲癇の新規の治療療法としてのカンナビノイドの開発は、健康改善の真の可能性をもたらす研究の魅力的な新しい分野を提供する。これら化合物がどのように発作をブロックするのかと、潜在的な副作用との両方を理解するために、これらの化合物の作用機序および相対的効能の包括的な理解が治療法の開発にとって不可欠である。これらの機序を特定するための従来のアプローチは、非常に複雑でありかつ緩慢である。代替のアプローチとしてキイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）が、広く使用されている治療法であるバルプロ酸の機序を特定するために使用され、それは哺乳動物のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて証明された。
癲癇の新規の治療療法としてのカンナビノイドの開発は、健康改善の真の可能性をもたらす研究の魅力的な新しい分野を提供する。これら化合物がどのように発作をブロックするのかと、潜在的な副作用との両方を理解するために、これらの化合物の作用機序および相対的効能の包括的な理解が治療法の開発にとって不可欠である。これらの機序を特定するための従来のアプローチは、非常に複雑でありかつ緩慢である。代替のアプローチとしてキイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）が、広く使用されている治療法であるバルプロ酸の機序を特定するために使用され、それは哺乳動物のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて証明された。
【0124】
この今回の検討では、ＣＢＤＡおよびＣＢＤの２つのカンナビノイドがキイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）の増殖をブロックすることを実証した。増殖に影響を与える濃度は低いμＭ範囲であり、それは発作の動物モデルにおいて抗痙攣性であることが示されている濃度と等しい。これは、これらの２つのカンナビノイドのすべてにとっての標的がキイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）ゲノム中に存在することを示唆する。これはまた、キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）の標的が、哺乳動物モデルで示されたカンナビノイドに対して類似した感受性を有することを示唆する。
【0125】
次いで、この増殖阻害効果は、これらのカンナビノイドの標的を特定するために先入観のないスクリーニングとして採用することができる。挿入変異株のライブラリーを使用して変異株のプールを各カンナビノイドの存在下で２１日間かけて増殖させることができる。カンナビノイドの標的をコードする遺伝子中への挿入物のある変異株は、この増殖阻害に対して抵抗を示し、したがってスクリーニング中に感受性細胞に打ち勝つ可能性が高い。カンナビノイド抵抗性コロニー中の挿入により不活化された遺伝子の同定は、先入観のないアプローチにおいてこれらのカンナビノイドの分子標的（および機序）を特定することになる。キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）でのこのスクリーニングアプローチは、一連の化合物の標的および機序を特定するために使用されている。
【0126】
キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）はまた、子実体の形成が細胞の集合および分化を伴う発達モデルとして広く使用される。薬理学的研究は、薬物の機序を特定するのにこの発達過程を使用してきた。ここで検討されたカンナビノイドに関して、２つの化合物のすべてが、増殖をブロックすることが分かっている濃度でキイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）の発達に影響を与えなかった。これは、第一に、キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）増殖のブロックが、細胞が発達し得るうえで有害ではないこと、したがってカンナビノイドの標的が細胞の増殖または分裂（細胞質分裂）のブロックに関与している可能性があることを示唆している。これはまた、キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）の発達がこれらの化合物の更なる検討のために使用できないことを示唆している。キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）はまた、カンナビノイドの標的を特定する先入観のないアプローチと組み合わせて、既知の哺乳動物の標的を調べるための有用なモデルを提供する。
【0127】
合計２５の変異細胞系統が増殖阻害に対して抵抗性を示すことが分かった。様々なカンナビノイドに対する一連の抵抗性表現型は、関係している複数の遺伝子が存在することを示唆する。
【0128】
実施例３：イヌにおける毒物学的検討に基づくＣＢＤおよびＣＢＤＡのＰＫデータの比較
この検討の目的は、イヌに対する毎日の経口投与（チューブによる投与）後のＣＢＤ（実質的に純粋な化合物の形態 － 純度９５％を超える）およびＣＢＤＡ（生薬原薬の形態 － ＣＢＤＡが全抽出物の６０％ｗ／ｗを超え、かつ全カンナビノイド含量の８５％ｗ／ｗを超える）の毒性を判定することであった。
この検討の目的は、イヌに対する毎日の経口投与（チューブによる投与）後のＣＢＤ（実質的に純粋な化合物の形態 － 純度９５％を超える）およびＣＢＤＡ（生薬原薬の形態 － ＣＢＤＡが全抽出物の６０％ｗ／ｗを超え、かつ全カンナビノイド含量の８５％ｗ／ｗを超える）の毒性を判定することであった。
【0129】
この検討は、任意の関係のある医薬品規制調和国際会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈａｒｍｏｎｉｓａｔｉｏｎ）（ＩＣＨ）の指針と共に欧州指令（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ）２００１／８３／ＥＣおよびすべての後続の修正条項の周知の要求基準を満たすように設計された。
【0130】
動物に対してＣＢＤまたはＣＢＤＡのいずれかの１００ｍｇ／ｋｇを投薬した後、１日目に０．５、１、２、４、６、および２４時間の時点で毒物動態学用の血液試料（公称０．５ｍＬ）をすべての動物から採取した。
【0131】
試料は、頸動脈から採取してヘパリンリチウム中に入れた。試料を手で静かに混合し、次いで自動ミキサー上で連続して少なくとも２分間混合し、遠心分離までクライオラック中に置いた。遠心分離は、できるだけ速やかに約４℃で行った。得られた血漿を微光条件下で分離し、一意的にラベル付けした透明なガラスバイアルに移し、遮光ボックス中に置き、直ちに＜－５０℃で冷凍した。
【0132】
測定した毒物動態学的パラメータには、Ｃｍａｘ（ｎｇ／ｍＬ）、Ｔｍａｘ（ｈ）、およびＡＵＣ０－ｔ（ｈ＊ｎｇ／ｍＬ）が含まれ、結果は、ＣＢＤＡについて表７、ＣＢＤ（雄）について表８、ＣＢＤ（雌）について表９中に例示し、比較のＣｍａｘおよびＡＵＣ０－ｔは、雄について表１０、雌ついて表１１に示す。
【0133】
結果
【0134】
【表8】
【0135】
【表9】
【0136】
【表10】
【0137】
【表11】
【0138】
【表12】
【0139】
結論
ＣＢＤと同量のＣＢＤＡは、ＣＢＤよりもきわめて有意に高い（１桁分だけ）Ｃｍａｘ値およびＡＵＣ０－ｔ値をもたらし、これはＣＢＤＡがＣＢＤより迅速に作用し、かつＣＢＤよりもバイオアベイラブルであることを示唆していることが比較の表１０および１１から明らかであろう。これは、それが患者を治療することになる場合に重要な意義／利点を有する。
ＣＢＤと同量のＣＢＤＡは、ＣＢＤよりもきわめて有意に高い（１桁分だけ）Ｃｍａｘ値およびＡＵＣ０－ｔ値をもたらし、これはＣＢＤＡがＣＢＤより迅速に作用し、かつＣＢＤよりもバイオアベイラブルであることを示唆していることが比較の表１０および１１から明らかであろう。これは、それが患者を治療することになる場合に重要な意義／利点を有する。
【0140】
全体的な結論
要約すると実施例１、２、および３で提示されたデータは下記を実証する。
要約すると実施例１、２、および３で提示されたデータは下記を実証する。
【0141】
ＣＢＤＡは、癲癇の哺乳動物モデルにおいて抗痙攣効果を有し、かつ全般性発作、より具体的には強直間代性発作の治療に有効である。実際、この化合物は、テストされたパラメータの多くにおいてＣＢＤよりも有効であるように見える。
【0142】
ＣＢＤＡは、キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）の増殖に関してＣＢＤと比べて有意により強力であり、またＣＢＤＡは、ＣＢＤよりも迅速に作用しかつＣＢＤよりもバイオアベイラブルである。
【0143】
これらの発見は、ＣＢＤＡがＣＢＤに代わる抗痙攣薬を提供することを実証するため、これは非常に重要である。ＣＢＤＡがＣＢＤよりも強力かつバイオアベイラブルであるという発見は、この有効成分のより少量の１日用量を癲癇の治療に使用し得ることを意味する。この点に関して、実施例３のＰＫおよびＡＵＣ０－ｔのデータに基づいて４００ｍｇ未満の用量、また場合により１ｍｇ～１００ｍｇもの少ない用量を使用してヒト対象を治療することができることが実施例３から明白である。この点に関して、一般的な成人患者は体重６０ｋｇであり、したがって、そのような患者の１日用量は０．０１６ｍｇ／ｋｇ～１．６ｍｇ／ｋｇであり得る。
【0144】
参考文献
Ａｍｅｓ ＦＲ ａｎｄ Ｃｒｉｄｌａｎｄ Ｓ（１９８６）．“Ａｎｔｉｃｏｎｖｕｌｓａｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｎｎａｂｉｄｉｏｌ．”Ｓ Ａｆｒ Ｍｅｄ Ｊ ６９：１４．
Ｃｈａｎｇ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ ａｎｔｉｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ｄｒｕｇ ｖａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍｅｄｉｕｍ－ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ａｃｕｔｅｌｙ ｒｅｄｕｃｅ ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｉｎ Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ．”Ｄｉｓ．Ｍｏｄｅｌ．Ｍｅｃｈ．５．１（２０１２）：１１５－２４．
Ｃｈａｎｇ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．“Ｓｅｉｚｕｒｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｂｙ ｋｅｔｏｇｅｎｉｃ ｄｉｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ．”Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ６９（２０１３）：１０５－１４．
Ｃｈａｎｇ，Ｐ．，Ｍ．Ｃ．Ｗａｌｋｅｒ，ａｎｄ Ｒ．Ｓ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ．“Ｓｅｉｚｕｒｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ＰＩＰ３ ｌｅｖｅｌｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｓｅｉｚｕｒｅ－ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｓｃｕｅｄ ｂｙ ｖａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ．”Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．６２（２０１４）：２９６－３０６．
Ｃｏｎｓｒｏｅ Ｐ，Ｍａｒｔｉｎ Ｐ，Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ Ｄ．（１９７７）．“Ａｎｔｉｃｏｎｖｕｌｓａｎｔ ｄｒｕｇ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｏｆ ｄｅｌｔａ－９－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃａｎｎａｂｉｎｏｌ ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｅｉｚｕｒｅｓ ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ．”Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ Ｃｈｅｍ Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１６：１－１３
Ｃｏｎｓｒｏｅ Ｐ，Ｂｅｎｅｄｉｃｔｏ ＭＡ，Ｌｅｉｔｅ ＪＲ，Ｃａｒｌｉｎｉ ＥＡ，Ｍｅｃｈｏｕｌａｍ Ｒ．（１９８２）．“Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｎｎａｂｉｄｉｏｌ ｏｎ ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ ｓｅｉｚｕｒｅｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｃｏｎｖｕｌｓａｎｔ ｄｒｕｇｓ ｏｒ ｃｕｒｒｅｎｔ ｉｎ ｍｉｃｅ．”Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏ．８３：２９３－８
Ｃｕｎｈａ ＪＭ，Ｃａｒｌｉｎｉ ＥＡ，Ｐｅｒｅｉｒａ ＡＥ，Ｒａｍｏｓ ＯＬ，Ｐｉｍｅｎｔａｌ Ｃ，Ｇａｇｌｉａｒｄｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８０）．“Ｃｈｒｏｎｉｃ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｎａｂｉｄｉｏｌ ｔｏ ｈｅａｌｔｈｙ ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ ａｎｄ ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ｐａｔｉｅｎｔ．”Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．２１：１７５－８５
Ｃｕｎｌｉｆｆｅ，Ｂａｉｎｅｓ，Ｇｉａｃｈｅｌｌｏ，Ｌｉｎ，Ｍｏｒｇａｎ，Ｒｅｕｂｅｒ，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ“Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｕｐｄａｔｅ：Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｃａｕｓｅｓ ｏｆ ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ｓｅｉｚｕｒｅｓ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｎｅｗ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｎｏｎ－ｍａｍｍａｌｉａｎ ｍｏｄｅｌ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ”．Ｓｅｉｚｕｒｅ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ．２４Ｃ（２０１５）：４４－５１．
Ｅａｄｉｅ，ＭＪ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１２）．“Ｓｈｏｒｔｃｏｍｉｎｇｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｅｐｉｌｅｐｓｙ．”Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ １２（１２）：１４１９－２７．
Ｋｗａｎ Ｐ，Ａｒｚｉｍａｎｏｇｌｏｕ Ａ，Ｂｅｒｇ ＡＴ，Ｂｒｏｄｉｅ ＭＪ，Ｈａｕｓｅｒ ＷＡ，Ｍａｔｈｅｒｎ Ｇ，Ｍｏｓｈｅ ＳＬ，Ｐｅｒｕｃｃａ Ｅ，Ｗｉｅｂｅ Ｓ，Ｆｒｅｎｃｈ Ｊ．（２００９）“Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｅｐｉｌｅｐｓｙ：Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｐｒｏｐｏｓａｌ ｂｙ ｔｈｅ ａｄ ｈｏｃ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＩＬＡＥ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．”Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ．
Ｍｅｃｈｏｕｌａｍ Ｒ ａｎｄ Ｃａｒｌｉｎｉ ＥＡ（１９７８）．“Ｔｏｗａｒｄ ｄｒｕｇｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｃａｎｎａｂｉｓ．”Ｄｉｅ ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ ６５：１７４－９．
Ｐｏｒｔｅｒ ＢＥ，Ｊａｃｏｂｓｏｎ Ｃ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１３）．“Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａ ｐａｒｅｎｔ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｃａｎｎａｂｉｄｉｏｌ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｃａｎｎａｂｉｓ ｕｓｅ ｉｎ ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｅｐｉｌｅｐｓｙ”Ｅｐｉｌｅｐｓｙ Ｂｅｈａｖｉｏｕｒ．２９（３）５７４－７
Ｔｈｕｒｍａｎ，ＤＪ；Ｂｅｇｈｉ，Ｅ；Ｂｅｇｌｅｙ，ＣＥ；Ｂｅｒｇ，ＡＴ；Ｂｕｃｈｈａｌｔｅｒ，ＪＲ；Ｄｉｎｇ，Ｄ；Ｈｅｓｄｏｒｆｆｅｒ，ＤＣ；Ｈａｕｓｅｒ，ＷＡ；Ｋａｚｉｓ，Ｌ；Ｋｏｂａｕ，Ｒ；Ｋｒｏｎｅｒ，Ｂ；Ｌａｂｉｎｅｒ，Ｄ；Ｌｉｏｗ，Ｋ；Ｌｏｇｒｏｓｃｉｎｏ，Ｇ；Ｍｅｄｉｎａ，ＭＴ；Ｎｅｗｔｏｎ，ＣＲ；Ｐａｒｋｏ，Ｋ；Ｐａｓｃｈａｌ，Ａ；Ｐｒｅｕｘ，ＰＭ；Ｓａｎｄｅｒ，ＪＷ；Ｓｅｌａｓｓｉｅ，Ａ；Ｔｈｅｏｄｏｒｅ，Ｗ；Ｔｏｍｓｏｎ，Ｔ；Ｗｉｅｂｅ，Ｓ；ＩＬＡＥ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１１）．“Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｎｄ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｏｆ ｅｐｉｌｅｐｓｙ．”Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ．５２ Ｓｕｐｐｌ ７：２－２６
Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．“Ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｕｓｉｎｇ Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ．”Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１２．９（２００６）：４１５－２４．
Ａｍｅｓ ＦＲ ａｎｄ Ｃｒｉｄｌａｎｄ Ｓ（１９８６）．“Ａｎｔｉｃｏｎｖｕｌｓａｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｎｎａｂｉｄｉｏｌ．”Ｓ Ａｆｒ Ｍｅｄ Ｊ ６９：１４．
Ｃｈａｎｇ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ ａｎｔｉｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ｄｒｕｇ ｖａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍｅｄｉｕｍ－ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ａｃｕｔｅｌｙ ｒｅｄｕｃｅ ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｉｎ Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ．”Ｄｉｓ．Ｍｏｄｅｌ．Ｍｅｃｈ．５．１（２０１２）：１１５－２４．
Ｃｈａｎｇ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．“Ｓｅｉｚｕｒｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｂｙ ｋｅｔｏｇｅｎｉｃ ｄｉｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ．”Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ６９（２０１３）：１０５－１４．
Ｃｈａｎｇ，Ｐ．，Ｍ．Ｃ．Ｗａｌｋｅｒ，ａｎｄ Ｒ．Ｓ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ．“Ｓｅｉｚｕｒｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ＰＩＰ３ ｌｅｖｅｌｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｓｅｉｚｕｒｅ－ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｓｃｕｅｄ ｂｙ ｖａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ．”Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．６２（２０１４）：２９６－３０６．
Ｃｏｎｓｒｏｅ Ｐ，Ｍａｒｔｉｎ Ｐ，Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ Ｄ．（１９７７）．“Ａｎｔｉｃｏｎｖｕｌｓａｎｔ ｄｒｕｇ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｏｆ ｄｅｌｔａ－９－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃａｎｎａｂｉｎｏｌ ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｅｉｚｕｒｅｓ ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ．”Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ Ｃｈｅｍ Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１６：１－１３
Ｃｏｎｓｒｏｅ Ｐ，Ｂｅｎｅｄｉｃｔｏ ＭＡ，Ｌｅｉｔｅ ＪＲ，Ｃａｒｌｉｎｉ ＥＡ，Ｍｅｃｈｏｕｌａｍ Ｒ．（１９８２）．“Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｎｎａｂｉｄｉｏｌ ｏｎ ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ ｓｅｉｚｕｒｅｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｃｏｎｖｕｌｓａｎｔ ｄｒｕｇｓ ｏｒ ｃｕｒｒｅｎｔ ｉｎ ｍｉｃｅ．”Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏ．８３：２９３－８
Ｃｕｎｈａ ＪＭ，Ｃａｒｌｉｎｉ ＥＡ，Ｐｅｒｅｉｒａ ＡＥ，Ｒａｍｏｓ ＯＬ，Ｐｉｍｅｎｔａｌ Ｃ，Ｇａｇｌｉａｒｄｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８０）．“Ｃｈｒｏｎｉｃ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｎａｂｉｄｉｏｌ ｔｏ ｈｅａｌｔｈｙ ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ ａｎｄ ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ｐａｔｉｅｎｔ．”Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．２１：１７５－８５
Ｃｕｎｌｉｆｆｅ，Ｂａｉｎｅｓ，Ｇｉａｃｈｅｌｌｏ，Ｌｉｎ，Ｍｏｒｇａｎ，Ｒｅｕｂｅｒ，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ“Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｕｐｄａｔｅ：Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｃａｕｓｅｓ ｏｆ ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ｓｅｉｚｕｒｅｓ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｎｅｗ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｎｏｎ－ｍａｍｍａｌｉａｎ ｍｏｄｅｌ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ”．Ｓｅｉｚｕｒｅ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ．２４Ｃ（２０１５）：４４－５１．
Ｅａｄｉｅ，ＭＪ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１２）．“Ｓｈｏｒｔｃｏｍｉｎｇｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｅｐｉｌｅｐｓｙ．”Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ １２（１２）：１４１９－２７．
Ｋｗａｎ Ｐ，Ａｒｚｉｍａｎｏｇｌｏｕ Ａ，Ｂｅｒｇ ＡＴ，Ｂｒｏｄｉｅ ＭＪ，Ｈａｕｓｅｒ ＷＡ，Ｍａｔｈｅｒｎ Ｇ，Ｍｏｓｈｅ ＳＬ，Ｐｅｒｕｃｃａ Ｅ，Ｗｉｅｂｅ Ｓ，Ｆｒｅｎｃｈ Ｊ．（２００９）“Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｅｐｉｌｅｐｓｙ：Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｐｒｏｐｏｓａｌ ｂｙ ｔｈｅ ａｄ ｈｏｃ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＩＬＡＥ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．”Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ．
Ｍｅｃｈｏｕｌａｍ Ｒ ａｎｄ Ｃａｒｌｉｎｉ ＥＡ（１９７８）．“Ｔｏｗａｒｄ ｄｒｕｇｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｃａｎｎａｂｉｓ．”Ｄｉｅ ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ ６５：１７４－９．
Ｐｏｒｔｅｒ ＢＥ，Ｊａｃｏｂｓｏｎ Ｃ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１３）．“Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａ ｐａｒｅｎｔ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｃａｎｎａｂｉｄｉｏｌ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｃａｎｎａｂｉｓ ｕｓｅ ｉｎ ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｅｐｉｌｅｐｓｙ”Ｅｐｉｌｅｐｓｙ Ｂｅｈａｖｉｏｕｒ．２９（３）５７４－７
Ｔｈｕｒｍａｎ，ＤＪ；Ｂｅｇｈｉ，Ｅ；Ｂｅｇｌｅｙ，ＣＥ；Ｂｅｒｇ，ＡＴ；Ｂｕｃｈｈａｌｔｅｒ，ＪＲ；Ｄｉｎｇ，Ｄ；Ｈｅｓｄｏｒｆｆｅｒ，ＤＣ；Ｈａｕｓｅｒ，ＷＡ；Ｋａｚｉｓ，Ｌ；Ｋｏｂａｕ，Ｒ；Ｋｒｏｎｅｒ，Ｂ；Ｌａｂｉｎｅｒ，Ｄ；Ｌｉｏｗ，Ｋ；Ｌｏｇｒｏｓｃｉｎｏ，Ｇ；Ｍｅｄｉｎａ，ＭＴ；Ｎｅｗｔｏｎ，ＣＲ；Ｐａｒｋｏ，Ｋ；Ｐａｓｃｈａｌ，Ａ；Ｐｒｅｕｘ，ＰＭ；Ｓａｎｄｅｒ，ＪＷ；Ｓｅｌａｓｓｉｅ，Ａ；Ｔｈｅｏｄｏｒｅ，Ｗ；Ｔｏｍｓｏｎ，Ｔ；Ｗｉｅｂｅ，Ｓ；ＩＬＡＥ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１１）．“Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｎｄ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｏｆ ｅｐｉｌｅｐｓｙ．”Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ．５２ Ｓｕｐｐｌ ７：２－２６
Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．“Ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｕｓｉｎｇ Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ．”Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１２．９（２００６）：４１５－２４．
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】