特許 7303369 腫瘍溶解性ウイルス、その使用、およびがんを治療する医薬品

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-06-26

(45)【発行日】2023-07-04

(54)【発明の名称】腫瘍溶解性ウイルス、その使用、およびがんを治療する医薬品

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/86 20060101AFI20230627BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230627BHJP

   C12N 15/57 20060101ALI20230627BHJP

   C12N 15/869 20060101ALI20230627BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230627BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230627BHJP

   A61K 35/763 20150101ALI20230627BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230627BHJP

   C12N 9/50 20060101ALN20230627BHJP

【ＦＩ】

C12N15/86 Z

C12N7/01 ZNA

C12N15/57

C12N15/869 Z

C12N15/63 Z

A61K35/76

A61K35/763

A61P35/00

C12N9/50

【請求項の数】 18

(21)【出願番号】P 2022502452

(86)(22)【出願日】2020-06-05

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-26

(86)【国際出願番号】 CN2020094751

(87)【国際公開番号】W WO2021008269

(87)【国際公開日】2021-01-21

【審査請求日】2022-02-24

(31)【優先権主張番号】201910642804.4

(32)【優先日】2019-07-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

【微生物の受託番号】CCTCC  CCTCC NO: V201920

【微生物の受託番号】CCTCC  CCTCC NO: C201974

(73)【特許権者】

【識別番号】521523947

【氏名又は名称】伍沢堂

(74)【代理人】

【識別番号】240000327

【弁護士】

【氏名又は名称】弁護士法人クレオ国際法律特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】伍沢堂

【審査官】西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】特表平１１－５０６９３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１３／００６５９５２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】Fukuhara, H. et al.，"Oncolytic virus therapy: A new era of cancer treatment at dawn"，Cancer Sci.，2016年，Vol. 107，pp. 1373-1379

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ゲノムに第１の制御エレメントが挿入され、前記第１の制御エレメントに、がん細胞特異的プロモーター配列および前記がん細胞特異的プロモーターによって駆動されて標的がん細胞において特異的プロテアーゼを発現させる第１の核酸配列が含まれ、
ゲノムに第２の制御エレメントがさらに挿入され、前記第２の制御エレメントに、細胞外トラクションシグナルペプチドをコードするための第２の核酸配列および特異的切断部位をコードするための第３の核酸配列が含まれ、前記特異的切断部位が、特異的プロテアーゼによって認識され、切断され、
前記第２の制御エレメントが、腫瘍溶解性ウイルスの必須遺伝子の５’末端に位置しており、
前記第２の制御エレメントは、前記腫瘍溶解性ウイルスの必須遺伝子のオープンリーディングフレームの開始コドンと第２のトリプレットコドンの間に位置しており、
前記第１の制御エレメントの挿入位置は、前記腫瘍溶解性ウイルスの２つの遺伝子の間に位置する、
腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項2】

前記特異的プロテアーゼは、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、トロンビン、Ｘａ因子プロテアーゼ、タバコエッチウイルスプロテアーゼまたは組換えＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼであり、
好ましくは、前記特異的プロテアーゼがヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼである場合、前記特異的切断部位のアミノ酸配列がＬＥＶＬＦＱＧＰであり、
前記特異的プロテアーゼがトロンビンである場合、前記特異的切断部位のアミノ酸配列がＬＶＰＲＧＳであり、
前記特異的プロテアーゼがＸａ因子プロテアーゼである場合、前記特異的切断部位のアミノ酸配列がＩＥ／ＤＧＲであり、
前記特異的プロテアーゼがタバコエッチウイルスプロテアーゼである場合、前記特異的切断部位の配列がＥＮＬＹＦＱＧであり、
前記特異的プロテアーゼが組換えＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼである場合、前記特異的切断部位の配列がＬＥＶＬＦＱＧＰである、
請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項3】

前記細胞外トラクションシグナルペプチドは、インターフェロンα２、インターロイキン２、ヒト血清アルブミン、ヒト免疫グロブリン重鎖、または海洋カイアシ類動物由来のルシフェラーゼ細胞外分泌シグナルペプチドである、
請求項１または２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項4】

前記第１の制御エレメントは、エンハンサー配列をさらに含み、前記エンハンサー配列が前記がん細胞特異的プロモーター配列と前記特異的プロテアーゼコード配列の間に位置し、前記エンハンサー配列が前記特異的プロテアーゼの発現を増強するためのものであり、
好ましくは、前記エンハンサー配列が、ＣＭＶエンハンサー配列またはＳＶ４０エンハンサー配列である、
請求項１～３のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項5】

前記標的がん細胞は、肺がん細胞、肝臓がん細胞、乳がん細胞、胃がん細胞、前立腺がん細胞、脳腫瘍細胞、ヒト結腸がん細胞、子宮頸がん細胞、腎臓がん細胞、卵巣がん細胞、頭頸部がん細胞、黒色腫細胞、膵臓がん細胞または食道がん細胞である、
請求項１～４のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項6】

前記がん細胞特異的プロモーターは、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーター、ヒト上皮成長因子受容体－２プロモーター、Ｅ２Ｆ１プロモーター、オステオカルシンプロモーター、癌胎児性抗原プロモーター、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターおよびセルロプラスミンプロモーターから選択されるいずれか１種である、
請求項１～５のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項7】

前記腫瘍溶解性ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ウシポックスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、麻疹ウイルス、耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルスおよびインフルエンザウイルスから選択されるいずれか１種であり、
好ましくは、前記腫瘍溶解性ウイルスが単純ヘルペスウイルスである場合、必須遺伝子は、エンベロープ糖タンパク質Ｌ、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、キャプシドタンパク質、スパイラルエンザイムプロ酵素サブユニット、ＤＮＡ複製開始結合ヘリカーゼ、ミリスチン酸誘導体タンパク質、デオキシリボヌクレアーゼ、外被セリン／トレオニンプロテインキナーゼ、ＤＮＡパッケージング末端酵素サブユニット１、コートタンパク質ＵＬ１６、ＤＮＡパッケージングタンパク質ＵＬ１７、キャプシドの３本鎖サブユニット２、主要なキャプシドタンパク質、エンベロープタンパク質ＵＬ２０、核タンパク質ＵＬ２４、ＤＮＡパッケージングタンパク質ＵＬ２５、キャプシド成熟プロテアーゼ、キャプシドタンパク質、エンベロープ糖タンパク質Ｂ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ触媒サブユニット、核外輸送層タンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質ＵＬ３２、ＤＮＡパッケージングタンパク質ＵＬ３３、核外輸送膜タンパク質、大キャプシドタンパク質、キャプシドの３本鎖サブユニット１、リボヌクレオチド還元酵素サブユニット１、リボヌクレオチド還元酵素サブユニット２、エンベロープ宿主閉鎖タンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ加工性サブユニット、膜タンパク質ＵＬ４５、コートタンパク質ＶＰ１３／１４、トランス活性化タンパク質ＶＰ１６、コートタンパク質ＶＰ２２、エンベロープ糖タンパク質Ｎ、コートタンパク質ＵＬ５１、ヘリカーゼ－プライマーゼプライマーゼサブユニット、エンベロープ糖タンパク質Ｋ、ＩＣＰ２７、核タンパク質ＵＬ５５、核タンパク質ＵＬ５６、転写調節因子ＩＣＰ４、調節タンパク質ＩＣＰ２２、エンベロープ糖タンパク質Ｄおよび膜タンパク質ＵＳ８Ａから選択される１種または複数種であり、
好ましくは、前記腫瘍溶解性ウイルスがアデノウイルスである場合、必須遺伝子は、初期タンパク質１Ａ、初期タンパク質１Ｂ １９Ｋ、初期タンパク質１Ｂ ５５Ｋ、カプセル化されたタンパク質Ｉｖａ２、ＤＮＡポリメラーゼ、末端タンパク質前駆体ｐＴＰ、カプセル化されたタンパク質５２Ｋ、キャプシドタンパク質前駆体ｐＩＩＩａ、ペントンマトリックス、コアタンパク質ｐＶＩＩ、コアタンパク質前駆体ｐＸ、コアタンパク質前駆体ｐＶＩ、ヘキソン、プロテアーゼ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、ヘキサマーアセンブリタンパク質１００Ｋ、タンパク質３３Ｋ、カプセル化されたタンパク質２２Ｋ、キャプシドタンパク質前駆体、タンパク質Ｕ、フィブリン、調節タンパク質Ｅ４オープンリーディングフレーム６／７、調節タンパク質Ｅ４ ３４Ｋ、調節タンパク質Ｅ４オープンリーディングフレーム４、調節タンパク質Ｅ４オープンリーディングフレーム３、調節タンパク質Ｅ４オープンリーディングフレーム２および調節タンパク質Ｅ４オープンリーディングフレーム１から選択される１種または複数種であり、
好ましくは、前記腫瘍溶解性ウイルスがウシポックスウイルスである場合、必須遺伝子は、ヌクレオチド還元酵素小サブユニット、セリン／トレオニンキナーゼ、ＤＮＡ結合ウイルスコアタンパク質、ポリメラーゼ大サブユニット、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット、ＤＮＡポリメラーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、仮想的ＤＮＡ結合ウイルス核タンパク質、ＤＮＡ結合リンタンパク質、ウイルスコアシステインプロテアーゼ、ＲＮＡヘリカーゼＮＰＨ－ＩＩ、仮想的メタロプロテアーゼ、転写伸長因子、グルタチオン様タンパク質、ＲＮＡポリメラーゼ、仮想的ウイルス核タンパク質、後期転写因子ＶＬＴＦ－１、ＤＮＡ結合ウイルス核タンパク質、ウイルスキャプシドタンパク質、ポリメラーゼ小サブユニット、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットｒｐｏ２２、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットｒｐｏ１４７、セリン／トレオニンプロテインホスファターゼ、ＩＭＶヘパリン結合性表面タンパク質、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、後期転写因子ＶＬＴＦ－４、ＤＮＡトポイソメラーゼ１型、ｍＲＮＡキャッピング酵素大サブユニット、ウイルスコアタンパク質１０７、ウイルスコアタンパク質１０８、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ、トリホスファターゼ、初期遺伝子転写因子ＶＥＴＦの７０ ｋＤａ小サブユニット、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットｒｐｏ１８、ヌクレオシド三リン酸加水分解酵素－Ｉ、ｍＲＮＡキャッピング酵素小サブユニット、リファンピシンターゲット、後期転写因子ＶＬＴＦ－２、後期転写因子ＶＬＴＦ－３、ジスルフィド結合形成経路、コアタンパク質４ｂ前駆体ｐ４ｂ、コアタンパク質３９ｋＤａ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットｒｐｏ１９、初期遺伝子転写因子ＶＥＴＦの８２ｋＤａ大サブユニット、転写因子ＶＩＴＦ－３の３２ｋＤａ小サブユニット、ＩＭＶ膜タンパク質１２８、コアタンパク質４ａ前駆体Ｐ４ａ、ＩＭＶ膜タンパク質１３１、ホスホネート化ＩＭＶ膜タンパク質、ＩＭＶ膜タンパク質Ａ１７Ｌ、ＤＮＡヘリカーゼ、ウイルスＤＮＡポリメラーゼプロセシング因子、ＩＭＶ膜タンパク質Ａ２１Ｌ、パルミトイル化タンパク質、中間遺伝子転写因子ＶＩＴＦ－３の４５ｋＤａ大サブユニット、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットｒｐｏ１３２、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼｒｐｏ３５、ＩＭＶタンパク質Ａ３０Ｌ、仮想的ＡＴＰアーゼ、セリン／トレオニンキナーゼ、ＥＥＶ成熟タンパク質、パルミトイル化ＥＥＶ膜糖タンパク質、ＩＭＶ表面タンパク質Ａ２７Ｌ、ＥＥＶ膜リン酸糖タンパク質、ＩＥＶおよびＥＥＶ膜糖タンパク質、ＥＥＶ膜糖タンパク質、ジスルフィド結合形成経路タンパク質、仮想的ウイルス核タンパク質、ＩＭＶ膜タンパク質Ｉ２Ｌ、ポックスウイルスミリストイルタンパク質、ＩＭＶ膜タンパク質Ｌ１Ｒ、後期１６ｋＤａ仮想的膜タンパク質、仮想的ウイルス膜タンパク質Ｈ２Ｒ、ＩＭＶ膜タンパク質Ａ２１Ｌ、ケモカイン結合タンパク質、表皮成長因子様タンパク質およびＩＬ－１８結合タンパク質から選択される１種または複数種であり、
好ましくは、前記腫瘍溶解性ウイルスがコクサッキーウイルスである場合、必須遺伝子は、タンパク質Ｖｐｇ、コアタンパク質２Ａ、タンパク質２Ｂ、ＲＮＡヘリカーゼ２Ｃ、タンパク質３Ａ、プロテアーゼ３Ｃ、逆転写酵素３Ｄ、コートタンパク質Ｖｐ４およびタンパク質Ｖｐ１から選択される１種または複数種であり、
好ましくは、前記腫瘍溶解性ウイルスが麻疹ウイルスである場合、必須遺伝子は、核タンパク質Ｎ、リンタンパク質Ｐ、マトリックスタンパク質Ｍ、膜貫通糖タンパク質Ｆ、膜貫通糖タンパク質ＨおよびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＬから選択される１種または複数種であり、
好ましくは、前記腫瘍溶解性ウイルスが耳下腺炎ウイルスである場合、必須遺伝子は、核タンパク質Ｎ、リンタンパク質Ｐ、融合タンパク質Ｆ、ＲＮＡポリメラーゼＬから選択される１種または複数種であり、
好ましくは、前記腫瘍溶解性ウイルスが水疱性口内炎ウイルスである場合、必須遺伝子は、糖タンパク質Ｇ、核タンパク質Ｎ、リン酸タンパク質ＰおよびＲＮＡポリメラーゼＬから選択される１種または複数種であり、
好ましくは、前記腫瘍溶解性ウイルスがポリオウイルスである場合、必須遺伝子は、キャプシドタンパク質ＶＰ１、キャプシドタンパク質ＶＰ２、キャプシドタンパク質ＶＰ３、システインプロテアーゼ２Ａ、タンパク質２Ｂ、タンパク質２Ｃ、タンパク質３Ａ、タンパク質３Ｂ、プロテアーゼ３Ｃ、タンパク質３ＤおよびＲＮＡガイドＲＮＡポリメラーゼから選択される１種または複数種であり、
好ましくは、前記腫瘍溶解性ウイルスがインフルエンザウイルスである場合、必須遺伝子は、血球凝集素、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、膜タンパク質Ｍ１、膜タンパク質Ｍ２、ポリメラーゼＰＡ、ポリメラーゼＰＢ１－Ｆ２およびポリメラーゼＰＢ２から選択される１種または複数種である、
請求項１～６のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項8】

前記腫瘍溶解性ウイルスの１つまたは複数の必須遺伝子の５’末端に前記第２の制御エレメントが挿入される、
請求項１～７のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項9】

前記腫瘍溶解性ウイルスが単純ヘルペスウイルス１型であり、必須遺伝子がＩＣＰ２７であり、前記がん細胞特異的プロモーターがテロメラーゼ逆転写酵素プロモーターであり、前記特異的プロテアーゼがヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼであり、前記細胞外トラクションシグナルペプチドがインターフェロンα２シグナルペプチドであり、前記特異的切断部位のアミノ酸配列がＬＥＶＬＦＱＧＰであり、前記第２の制御エレメントが前記必須遺伝子のオープンリーディングフレームの開始コドンＡＴＧと第２のトリプレットコドンの間に位置し、前記第１の制御エレメントが前記必須遺伝子の下流に位置している、
請求項１～７のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項10】

前記テロメラーゼ逆転写酵素プロモーターのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示されており、
前記ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５に示されており、
前記ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼのオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６に示されており、
前記インターフェロンα２シグナルペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７に示されており、前記第２の核酸配列のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示されており、
前記第３の核酸配列のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９に示されている、
請求項９に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項11】

前記２つの遺伝子は、２つの必須遺伝子であるか、または２つの非必須遺伝子であるか、またはそのうちの１つが必須遺伝子であり、もう１つが非必須遺伝子である、
請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項12】

腫瘍溶解性ウイルスの標的部位に挿入される挿入配列を有し、
前記挿入配列が、前記第１の制御エレメントおよび前記第２の制御エレメントを含み、前記第１の制御エレメントの標的部位が前記腫瘍溶解性ウイルスの２つの遺伝子の間に位置し、前記第２の制御エレメントが前記腫瘍溶解性ウイルスの必須遺伝子の５’末端に位置している、
請求項１～１１のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルスを調製するための核酸分子。

【請求項13】

前記挿入配列の５’末端に前記の標的部位の上流配列に相同である５’末端相同性アーム配列を有し、前記挿入配列の３’末端に前記の標的部位の下流配列に相同である３’末端相同性アーム配列を有する、
請求項１２に記載の核酸分子。

【請求項14】

請求項１２または１３に記載の核酸分子を含むベクター。

【請求項15】

請求項１４に記載のベクターを親ウイルスおよび相補的宿主細胞と共培養し、培養物から前記腫瘍溶解性ウイルスを収集することを含み、
前記親ウイルスのゲノム配列が、野生型ウイルスのゲノム配列に対して、前記必須遺伝子が欠失するものであり、
前記相補的宿主細胞に前記必須遺伝子を発現させる発現配列が含まれる、
請求項１～１１のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルスを調製する方法。

【請求項16】

がんを治療する医薬品の調製における、請求項１～１１のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルスの使用。

【請求項17】

請求項１～１１のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス、および薬学に許容されるアジュバントを含む、
がんを治療する医薬品。

【請求項18】

遺伝子治療薬またはワクチンがさらに含まれる、
請求項１７に記載の医薬品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願への相互参照）
本開示は、２０１９年０７月１６日に中国特許庁に提出された出願番号２０１９１０６４２８０４４の「腫瘍溶解性ウイルス、その使用、およびがんを治療する医薬品」という名称の中国特許出願の優先権を主張するものであり、その内容のすべては本明細書に参照として取り込まれる。

【0002】

本開示は、がん治療の技術分野に関し、具体的には、腫瘍溶解性ウイルス、その使用、およびがんを治療する医薬品に関する。

【背景技術】

【0003】

がんは、すでにもっとも人々の健康を脅かす疾患となっている。中国は、がん、特に肺がん、胃がん、肝臓がん、直腸がんの発生率の高い国である。統計によると、２０１６年だけでも、様々な種類の新規がん患者が全国で４８０万人増加し、２３０万人の患者が様々な種類のがんで亡くなった。技術の進歩に伴い、様々な新しい治療法、特に生物学的薬物治療が続々と臨床に使用されている。しかし、医薬品の安全性、有効性、患者の生活の質のニーズはまだ満たされていない。そのため、新薬や新治療法の開発が求められている。

【0004】

１９９１年、Ｍａｒｔｕｚａらが「Ｓｃｉｅｎｃｅ」ジャーナルに発表した記事によれば、トランスジェニック単純ヘルペスウイルスが悪性神経膠腫の治療に一定の効果があることが証明されていた。それ以来、がんを治療するための腫瘍溶解性ウイルスの開発がますます注目を集めている。腫瘍溶解性ウイルスによる、がんに対する治療法の原理は、自然界に存在するいくつかの病原性の低いウイルスに対して遺伝子組み換えを行い、腫瘍細胞内で選択的に複製させて腫瘍を破壊することである。また、免疫応答を誘発し、免疫細胞を引き付けて、残存のがん細胞を殺し続けるか、免疫応答により転移したがん細胞を殺すことができる。ここ数十年で、腫瘍溶解性ウイルスの関係研究は大きく進歩した。

【0005】

人々は、前後してニューカッスル病ウイルス（ｎｅｗ ｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ、ＮＤＶ）、単純ヘルペスウイルス１型（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ－１、ＨＳＶ－１）、レオウイルス（ｒｅｏｖｉｒｕｓ）、腫瘍溶解性アデノウイルス（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）を使用して腫瘍溶解性ウイルスを開発しており、そして動物実験ではそれが安全で有効であることが示されている。しかし、臨床成績は予想をはるかに下回っていた。良くなかった臨床成績は、現在の腫瘍溶解性ウイルスの設計案に関わっている。従来の腫瘍溶解性ウイルスは、主に１つまたは複数のウイルス非必須遺伝子を削除するか、１つまたは複数の必須遺伝子をがん特異的プロモーターの駆動で発現させることによって、がん細胞における腫瘍溶解性ウイルスの選択的増殖の目的を達成するものである。非必須遺伝子の削除またはがん特異的プロモーターの駆動での必須遺伝子の発現は、いずれもｉｎ ｖｉｖｏでのウイルスの増殖に影響を与える。要するに、現在の腫瘍溶解性ウイルスの良くない臨床成績は既存の設計案による結果である。腫瘍溶解性ウイルスの有効性と広いスペクトル効果を高めるために、ウイルスのゲノムの完全性を維持するとともにウイルス遺伝子の時間に伴う発現の高度な調和性に影響を与えることのないようにすることが腫瘍溶解性ウイルスの設計に重要である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本開示の一態様は、野生型ウイルスを遺伝子操作してなした組換え腫瘍溶解性ウイルスであり、がん細胞において強力な複製能力で複製して宿主がん細胞を殺すことができ、非がん細胞に対して確実な安全性を有する腫瘍溶解性ウイルスを提供する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本開示の別の態様において、上記の腫瘍溶解性ウイルスを調製するための核酸分子を提供する。

【0008】

本開示のさらに別の態様において、上記の核酸分子を含むベクターを提供する。

【0009】

本開示のさらに別の態様において、上記の腫瘍溶解性ウイルスを調製するための方法を提供する。

【0010】

本開示のさらに別の態様において、がん治療における、上記の腫瘍溶解性ウイルスの使用を提供する。

【0011】

本開示のさらに別の態様において、がんを治療する医薬品を提供する。

【0012】

第１の局面において、本開示は、腫瘍溶解性ウイルスを提供し、前記腫瘍溶解性ウイルスのゲノムに第１の制御エレメントが挿入され、第１の制御エレメントに、がん細胞特異的プロモーター配列およびがん細胞特異的プロモーターによって駆動されて標的がん細胞において特異的プロテアーゼを発現させる第１の核酸配列が含まれ、
腫瘍溶解性ウイルスのゲノムに第２の制御エレメントがさらに挿入され、第２の制御エレメントに、細胞外トラクションシグナルペプチドをコードするための第２の核酸配列および特異的切断部位をコードするための第３の核酸配列が含まれ、特異的切断部位が、特異的プロテアーゼによって認識され、切断され、
第２の制御エレメントが、腫瘍溶解性ウイルスの必須遺伝子の５’末端に位置している。

【0013】

本開示による腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞特異的プロモーターによって制御され、正常細胞のような非がん細胞に感染すると、その下流の特異的プロテアーゼが発現しないため、細胞外トラクションシグナルペプチドが、下流の必須遺伝子配列により発現されるウイルス複製に不可欠なタンパク質を細胞外へ引き出し、その結果、腫瘍溶解性ウイルスが必要なエレメントを欠き、非がん細胞において複製することができなくなる。一方、それががん細胞に感染すると、該腫瘍溶解性ウイルスのがん細胞特異的プロモーターが特異的プロテアーゼの発現を駆動し、特異的プロテアーゼが細胞外トラクションシグナルペプチドと上記の必須遺伝子によって発現されるタンパク質の間の特異的切断部位を切断し、ウイルス複製に必要なタンパク質ががん細胞に残され、腫瘍溶解性ウイルスが正常に複製でき、その複製によってがん細胞を死滅させることができる。

【0014】

本開示による組換え腫瘍溶解性ウイルスは、その元のゲノムにおける遺伝子（必須遺伝子も非必須遺伝子も）がいずれも削除されなく、強力な複製能力で複製でき、その複製でがん細胞を殺すことができる。

【0015】

本開示の一態様による腫瘍溶解性ウイルスのゲノムの模式的構成図は図１のＡを参照できる。

【0016】

なお、第１の制御エレメントの挿入位置は、腫瘍溶解性ウイルスの２つの遺伝子の間（２つの必須遺伝子の間、２つの非必須遺伝子の間、または１つの必須遺伝子と１つの非必須遺伝子の間でありうる）に位置しており、遺伝子の正常な機能に影響を与えることがない。

【0017】

本開示の１つまたは複数の実施形態において、特異的プロテアーゼは、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ（ＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼ）、トロンビン、Ｘａ因子プロテアーゼ、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶプロテアーゼ）または組換えＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼである。

【0018】

本開示の特異的プロテアーゼは、上記のプロテアーゼに限定されず、他のいくつかの実施形態において、当業者が必要に応じて適切なプロテアーゼを選択して本開示に適用することができ、これらも本開示の保護範囲に属する。

【0019】

同様に、当業者は、必要に応じて特異的プロテアーゼによって認識、切断されることができる適切な特異的切断部位を選択して本開示に適用することができる。

【0020】

例えば、特異的プロテアーゼがヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼである場合、特異的切断部位のアミノ酸配列がＬＥＶＬＦＱＧＰであり、
特異的プロテアーゼがトロンビンである場合、特異的切断部位のアミノ酸配列がＬＶＰＲＧＳであり、
特異的プロテアーゼがＸａ因子プロテアーゼである場合、特異的切断部位のアミノ酸配列がＩＥ／ＤＧＲ（ＩＥＤＧＲ ｏｒ ＩＤＧＲ）であり、
特異的プロテアーゼがタバコエッチウイルスプロテアーゼである場合、特異的切断部位の配列がＥＮＬＹＦＱＧであり、
特異的プロテアーゼが組換えＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼである場合、特異的切断部位の配列がＬＥＶＬＦＱＧＰである。

【0021】

本開示の１つまたは複数の実施形態において、細胞外トラクションシグナルペプチドは、インターフェロンα２、インターロイキン２、ヒト血清アルブミン、ヒト免疫グロブリン重鎖、または海洋カイアシ類動物由来のルシフェラーゼ細胞外分泌シグナルペプチドである。

【0022】

本開示の細胞外トラクションシグナルペプチドは、上記のようなタイプに限定されなく、他のいくつかの実施形態において、当業者が必要に応じて適切な細胞外トラクションシグナルペプチドを選択して本開示の技術案に適用してもよく、それと融合するタンパク質を細胞外へ引き抜くことができればよく、これらも本開示の保護範囲に属する。

【0023】

本開示の１つまたは複数の実施形態において、第２の制御エレメントは、腫瘍溶解性ウイルスの必須遺伝子のオープンリーディングフレームの開始コドン（ＡＴＧ）と第２のトリプレットコドンの間に位置している。

【0024】

細胞外トラクションシグナルペプチドおよび必須遺伝子が発現すると、細胞外トラクションシグナルペプチドは、特異的切断部位配列を介して必須タンパク質と融合（上記の必須遺伝子により発現される）し、特異的切断部位配列が切断されていない場合、必須タンパク質が細胞外へ引き出され、腫瘍溶解性ウイルスが正常に複製できなくなる。

【0025】

本開示の１つまたは複数の実施形態において、第１の制御エレメントは、エンハンサー配列をさらに含み、エンハンサー配列ががん細胞特異的プロモーター配列と特異的プロテアーゼコード配列の間に位置し、エンハンサー配列が特異的プロテアーゼの発現を増強するためのものである。

【0026】

本開示では、エンハンサー配列の具体的なタイプが限定されなく、下流の遺伝子配列の発現を増強できるエンハンサーであれば本開示に使用できる。１つまたは複数の実施形態において、エンハンサー配列は、ＣＭＶエンハンサー配列またはＳＶ４０エンハンサー配列である。本開示の他の実施形態において、当業者が必要に応じて適切なエンハンサー配列を選択でき、がん細胞、特にがん細胞特異的プロモーターの転写活性が低いがん細胞における特異的プロテアーゼの発現を増強することに用いられるエンハンサーであれば、すべて本開示の保護範囲に属する。

【0027】

エンハンサーを導入することで、特異的プロテアーゼの発現量を増やすことができる。腫瘍溶解性ウイルスががん細胞に感染すると、特異的プロテアーゼが大量に発現し、高効率で特異的切断部位を切断でき、より多くの発現された必須タンパク質（上記の必須遺伝子により発現される）を細胞内に残させ、腫瘍溶解性ウイルスの複製能力を増強させることができ、がん細胞に対する死滅能力の向上に寄与できる。

【0028】

本開示の１つまたは複数の実施形態において、標的がん細胞は、肺がん細胞、肝臓がん細胞、乳がん細胞、胃がん細胞、前立腺がん細胞、脳腫瘍細胞、ヒト結腸がん細胞、子宮頸がん細胞、腎臓がん細胞、卵巣がん細胞、頭頸部がん細胞、黒色腫細胞、膵臓がん細胞または食道がん細胞である。

【0029】

なお、標的がん細胞の種類は、当業者が実際の状況に応じて選択することができる。同様に、がん細胞特異的プロモーターは、選択される標的がん細胞で特異的に発現するもの、または様々ながん細胞で特異的に発現を駆動するもの（ただし、非がん細胞では発現を駆動しない）であり得る。

【0030】

本開示の１つまたは複数の実施形態において、がん細胞特異的プロモーター配列が、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーター（ｈＴＥＲＴ）、ヒト上皮成長因子受容体－２プロモーター（ＨＥＲ－２）、Ｅ２Ｆ１プロモーター、オステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）プロモーター、癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）プロモーター、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターおよびセルロプラスミンプロモーターのうちの任意の１種である。

【0031】

本開示のがん細胞特異的プロモーター配列は、上記の種類に限定されず、他のいくつかの実施形態において、当業者が必要に応じて、がん細胞において下流遺伝子の発現を特異的に駆動できる適切なプロモーターを選択できる。どのがん細胞特異的プロモーターが選択されても、すべて本開示の保護範囲に属する。

【0032】

本開示の１つまたは複数の実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、単純ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス１型）、アデノウイルス、ウシポックスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、麻疹ウイルス、耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルスおよびインフルエンザウイルスから選択されるいずれか１種である。

【0033】

なお、本開示の腫瘍溶解性ウイルスの種類は上記の種類に限定されなく、他の実施形態において、当業者は、実際の状況に応じて適切な腫瘍溶解性ウイルスを選択することができ、がん細胞に感染させてがん細胞を抑制しまたは殺す能力を有すれば、本開示の腫瘍溶解性ウイルスとして使用することができる。どの腫瘍溶解性ウイルスが選択されても、すべて本開示の保護範囲に属する。

【0034】

また、異なる腫瘍溶解性ウイルスは異なる必須遺伝子を有し、当業者は、実際の状況に応じて適切な腫瘍溶解性ウイルスおよび必須遺伝子を選択することができる。

【0035】

例えば、腫瘍溶解性ウイルスが単純ヘルペスウイルスである場合、必須遺伝子は、エンベロープ糖タンパク質Ｌ、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、キャプシドタンパク質、スパイラルエンザイムプロ酵素サブユニット、ＤＮＡ複製開始結合ヘリカーゼ、ミリスチン酸誘導体タンパク質、デオキシリボヌクレアーゼ、外被セリン／トレオニンプロテインキナーゼ、ＤＮＡパッケージング末端酵素サブユニット１、コートタンパク質ＵＬ１６、ＤＮＡパッケージングタンパク質ＵＬ１７、キャプシドの３本鎖サブユニット２、主要なキャプシドタンパク質、エンベロープタンパク質ＵＬ２０、核タンパク質ＵＬ２４、ＤＮＡパッケージングタンパク質ＵＬ２５、キャプシド成熟プロテアーゼ、キャプシドタンパク質、エンベロープ糖タンパク質Ｂ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ触媒サブユニット、核外輸送層タンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質ＵＬ３２、ＤＮＡパッケージングタンパク質ＵＬ３３、核外輸送膜タンパク質、大キャプシドタンパク質、キャプシドの３本鎖サブユニット１、リボヌクレオチド還元酵素サブユニット１、リボヌクレオチド還元酵素サブユニット２、エンベロープ宿主閉鎖タンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ加工性サブユニット、膜タンパク質ＵＬ４５、コートタンパク質ＶＰ１３／１４、トランス活性化タンパク質ＶＰ１６、コートタンパク質ＶＰ２２、エンベロープ糖タンパク質Ｎ、コートタンパク質ＵＬ５１、ヘリカーゼ－プライマーゼプライマーゼサブユニット、エンベロープ糖タンパク質Ｋ、ＩＣＰ２７、核タンパク質ＵＬ５５、核タンパク質ＵＬ５６、転写調節因子ＩＣＰ４、調節タンパク質ＩＣＰ２２、エンベロープ糖タンパク質Ｄおよび膜タンパク質ＵＳ８Ａから選択される１種または複数種であり、
或いは、腫瘍溶解性ウイルスがアデノウイルスである場合、必須遺伝子は、初期タンパク質１Ａ、初期タンパク質１Ｂ １９Ｋ、初期タンパク質１Ｂ ５５Ｋ、カプセル化されたタンパク質Ｉｖａ２、ＤＮＡポリメラーゼ、末端タンパク質前駆体ｐＴＰ、カプセル化されたタンパク質５２Ｋ、キャプシドタンパク質前駆体ｐＩＩＩａ、ペントンマトリックス、コアタンパク質ｐＶＩＩ、コアタンパク質前駆体ｐＸ、コアタンパク質前駆体ｐＶＩ、ヘキソン、プロテアーゼ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、ヘキサマーアセンブリタンパク質１００Ｋ、タンパク質３３Ｋ、カプセル化されたタンパク質２２Ｋ、キャプシドタンパク質前駆体、タンパク質Ｕ、フィブリン、調節タンパク質Ｅ４オープンリーディングフレーム６／７、調節タンパク質Ｅ４ ３４Ｋ、調節タンパク質Ｅ４オープンリーディングフレーム４、調節タンパク質Ｅ４オープンリーディングフレーム３、調節タンパク質Ｅ４オープンリーディングフレーム２および調節タンパク質Ｅ４オープンリーディングフレーム１から選択される１種または複数種であり、
或いは、腫瘍溶解性ウイルスがウシポックスウイルスである場合、必須遺伝子は、ヌクレオチド還元酵素小サブユニット、セリン／トレオニンキナーゼ、ＤＮＡ結合ウイルスコアタンパク質、ポリメラーゼ大サブユニット、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット、ＤＮＡポリメラーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、仮想的ＤＮＡ結合ウイルス核タンパク質、ＤＮＡ結合リンタンパク質、ウイルスコアシステインプロテアーゼ、ＲＮＡヘリカーゼＮＰＨ－ＩＩ、仮想的メタロプロテアーゼ、転写伸長因子、グルタチオン様タンパク質、ＲＮＡポリメラーゼ、仮想的ウイルス核タンパク質、後期転写因子ＶＬＴＦ－１、ＤＮＡ結合ウイルス核タンパク質、ウイルスキャプシドタンパク質、ポリメラーゼ小サブユニット、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットｒｐｏ２２、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットｒｐｏ１４７、セリン／トレオニンプロテインホスファターゼ、ＩＭＶヘパリン結合性表面タンパク質、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、後期転写因子ＶＬＴＦ－４、ＤＮＡトポイソメラーゼ１型、ｍＲＮＡキャッピング酵素大サブユニット、ウイルスコアタンパク質１０７、ウイルスコアタンパク質１０８、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ、トリホスファターゼ、初期遺伝子転写因子ＶＥＴＦの７０ ｋＤａ小サブユニット、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットｒｐｏ１８、ヌクレオシド三リン酸加水分解酵素－Ｉ、ｍＲＮＡキャッピング酵素小サブユニット、リファンピシンターゲット、後期転写因子ＶＬＴＦ－２、後期転写因子ＶＬＴＦ－３、ジスルフィド結合形成経路、コアタンパク質４ｂ前駆体ｐ４ｂ、コアタンパク質３９ｋＤａ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットｒｐｏ１９、初期遺伝子転写因子ＶＥＴＦの８２ｋＤａ大サブユニット、転写因子ＶＩＴＦ－３の３２ｋＤａ小サブユニット、ＩＭＶ膜タンパク質１２８、コアタンパク質４ａ前駆体Ｐ４ａ、ＩＭＶ膜タンパク質１３１、ホスホネート化ＩＭＶ膜タンパク質、ＩＭＶ膜タンパク質Ａ１７Ｌ、ＤＮＡヘリカーゼ、ウイルスＤＮＡポリメラーゼプロセシング因子、ＩＭＶ膜タンパク質Ａ２１Ｌ、パルミトイル化タンパク質、中間遺伝子転写因子ＶＩＴＦ－３の４５ｋＤａ大サブユニット、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットｒｐｏ１３２、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼｒｐｏ３５、ＩＭＶタンパク質Ａ３０Ｌ、仮想的ＡＴＰアーゼ、セリン／トレオニンキナーゼ、ＥＥＶ成熟タンパク質、パルミトイル化ＥＥＶ膜糖タンパク質、ＩＭＶ表面タンパク質Ａ２７Ｌ、ＥＥＶ膜リン酸糖タンパク質、ＩＥＶおよびＥＥＶ膜糖タンパク質、ＥＥＶ膜糖タンパク質、ジスルフィド結合形成経路タンパク質、仮想的ウイルス核タンパク質、ＩＭＶ膜タンパク質Ｉ２Ｌ、ポックスウイルスミリストイルタンパク質、ＩＭＶ膜タンパク質Ｌ１Ｒ、後期１６ｋＤａ仮想的膜タンパク質、仮想的ウイルス膜タンパク質Ｈ２Ｒ、ＩＭＶ膜タンパク質Ａ２１Ｌ、ケモカイン結合タンパク質、表皮成長因子様タンパク質およびＩＬ－１８結合タンパク質から選択される１種または複数種であり、
或いは、腫瘍溶解性ウイルスがコクサッキーウイルスである場合、必須遺伝子は、タンパク質Ｖｐｇ、コアタンパク質２Ａ、タンパク質２Ｂ、ＲＮＡヘリカーゼ２Ｃ、タンパク質３Ａ、プロテアーゼ３Ｃ、逆転写酵素３Ｄ、コートタンパク質Ｖｐ４およびタンパク質Ｖｐ１から選択される１種または複数種であり、
或いは、腫瘍溶解性ウイルスが麻疹ウイルスである場合、必須遺伝子は、核タンパク質Ｎ、リンタンパク質Ｐ、マトリックスタンパク質Ｍ、膜貫通糖タンパク質Ｆ、膜貫通糖タンパク質ＨおよびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＬから選択される１種または複数種であり、
或いは、腫瘍溶解性ウイルスが耳下腺炎ウイルスである場合、必須遺伝子は、核タンパク質Ｎ、リンタンパク質Ｐ、融合タンパク質Ｆ、ＲＮＡポリメラーゼＬから選択される１種または複数種であり、
或いは、腫瘍溶解性ウイルスが水疱性口内炎ウイルスである場合、必須遺伝子は、糖タンパク質Ｇ、核タンパク質Ｎ、リン酸タンパク質ＰおよびＲＮＡポリメラーゼＬから選択される１種または複数種であり、
或いは、腫瘍溶解性ウイルスがポリオウイルスである場合、必須遺伝子は、キャプシドタンパク質ＶＰ１、キャプシドタンパク質ＶＰ２、キャプシドタンパク質ＶＰ３、システインプロテアーゼ２Ａ、タンパク質２Ｂ、タンパク質２Ｃ、タンパク質３Ａ、タンパク質３Ｂ、プロテアーゼ３Ｃ、タンパク質３ＤおよびＲＮＡガイドＲＮＡポリメラーゼから選択される１種または複数種であり、
或いは、腫瘍溶解性ウイルスがインフルエンザウイルスである場合、必須遺伝子は、血球凝集素、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、膜タンパク質Ｍ１、膜タンパク質Ｍ２、ポリメラーゼＰＡ、ポリメラーゼＰＢ１－Ｆ２およびポリメラーゼＰＢ２から選択される１種または複数種である。

【0036】

本開示の１つまたは複数の実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスの１つまたは複数の必須遺伝子のオープンリーディングフレームの開始コドンＡＴＧと第２のトリプレットコドンの間に第２の制御エレメントが挿入される。

【0037】

つまり、本開示のいくつかの実施形態において、必須遺伝子の数は１つまたは複数であり得る。必須遺伝子が複数ある場合、これらの必須遺伝子の種類が異なってもよく、各種の必須遺伝子のオープンリーディングフレームＡＴＧと第２のトリプレットコドンの間に第２の制御エレメントが挿入され、そして、第２の制御エレメントのコピー数も増加される。この場合、該腫瘍溶解性ウイルスが非がん細胞に感染させると、複製に必要な腫瘍溶解性ウイルスの複数の必須遺伝子によって発現されるタンパク質が細胞外へ引き出され、腫瘍溶解性ウイルスの複製能力が大幅に弱まり、したがって、非がん細胞に対する安全性が向上した。

【0038】

本開示の１つまたは複数の実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスが単純ヘルペスウイルス１型であり、必須遺伝子がＩＣＰ２７であり、がん細胞特異的プロモーターがテロメラーゼ逆転写酵素プロモーターであり、特異的プロテアーゼがヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼであり、細胞外トラクションシグナルペプチドがインターフェロンα２シグナルペプチドであり、特異的切断部位のアミノ酸配列がＬＥＶＬＦＱＧＰであり、第２の制御エレメントが必須遺伝子のオープンリーディングフレームの開始コドンＡＴＧと第２のトリプレットコドンの間に位置し、第１の制御エレメントが必須遺伝子の下流に位置している。

【0039】

本開示の１つまたは複数の実施形態において、
テロメラーゼ逆転写酵素プロモーターのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示されており、
ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５に示されており、
ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼのオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６に示されており、
インターフェロンα２シグナルペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７に示されており、第２の核酸配列のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示されており、
第３の核酸配列のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９に示されている。

【0040】

別の態様において、本開示は、上記のいずれか１種の腫瘍溶解性ウイルスを調製するための核酸分子を提供し、その核酸分子は、腫瘍溶解性ウイルスの標的部位に挿入される挿入配列を有する。挿入配列が、第１の制御エレメントおよび第２の制御エレメントを含み、第１の制御エレメントの標的部位が組換え腫瘍溶解性ウイルスの２つの遺伝子の間に位置し、第２の制御エレメントが腫瘍溶解性ウイルスの必須遺伝子の開始コドンと第２のトリプレットコドンの間に位置している。

【0041】

本開示の１つまたは複数の実施形態において、挿入配列の５’末端に標的部位の上流配列に相同である５’末端相同性アーム配列を有し、挿入配列の３’末端に標的部位の下流配列に相同である３’末端相同性アーム配列を有する。

【0042】

該核酸分子は、相同組換えによって挿入配列を野生型腫瘍溶解性ウイルスゲノムに挿入して、本開示の腫瘍溶解性ウイルスを得ることができる。

【0043】

別の態様において、本開示は、上記の核酸分子を含むベクターを提供する。

【0044】

別の態様において、本開示は、上記のいずれか１種の腫瘍溶解性ウイルスを調製する方法を提供し、この方法は、上記のベクターを親ウイルスおよび相補的宿主細胞と共培養し、培養物から組換え腫瘍溶解性ウイルスを収集することを含み、
ここで、親ウイルスのゲノム配列が、野生型ウイルスのゲノム配列に対して、必須遺伝子が欠失するものであり、
相補的宿主細胞に必須遺伝子を発現させる発現配列が含まれる。

【0045】

別の態様において、本開示は、がんを治療する医薬品の調製における、上記のいずれか１種の腫瘍溶解性ウイルスの使用を提供する。

【0046】

別の態様において、本開示は、上記のいずれか１種の腫瘍溶解性ウイルス、および薬学に許容されるアジュバントを含む、がんを治療する医薬品を提供する。

【0047】

当業者は、必要に応じて適切な薬学的に許容されるアジュバントを選択することができ、本開示で限定しない。

【0048】

本開示の１つまたは複数の実施形態において、医薬品には、遺伝子治療薬またはワクチンがさらに含まれる。

【0049】

別の態様において、本開示は、被験者の疾患を治療する方法を提供し、該方法は、
本開示による医薬品を被験者または患者に投与することを含み、
ここで、疾患は、肺がん、胃がん、肝臓がん、直腸がん、乳がん、前立腺がん、脳腫瘍、結腸がん、子宮頸がん、腎臓がん、卵巣がん、頭頸部がん、黒色腫、膵臓がん、または食道がんである。

【図面の簡単な説明】

【0050】

本開示の実施例の技術案をより明瞭に説明するために、以下は、実施例に必要な図面を簡単に説明する。図面は、本開示のいくつかの実施例を示すものにすぎず、範囲を限定するものではないことを理解されたい。当業者にとって、発明能力を利用しなくても、これらの図面をもとに他の関係図面を得ることもできる。

【図1】本開示による組換え腫瘍溶解性ウイルスのゲノム配列に挿入された制御エレメントの構造およびコントロール関係の模式図である。Ａ：本開示による腫瘍溶解性ウイルスの一実施態様であり、第１の制御エレメントが必須遺伝子３’末端の非コード領域の前に位置し、第２の制御エレメントが必須遺伝子オープンリーディングフレーム開始コドンと第２のトリプレットコドンの間に位置している。Ｂ：Ａのより具体的な一実施態様であり、ウイルスがＨＳＶ－１であり、がん細胞特異的プロモーターがｈＴＥＲＴプロモーターであり、エンハンサーがＣＭＶエンハンサーであり、特異的プロテアーゼがＨＲＶ－３Ｃプロテアーゼであり、必須遺伝子がＩＣＰ２７であり、細胞外シグナルトラクションペプチドがインターフェロンα２シグナルペプチドである。特異的切断部位は、ＨＲＶ－３Ｃプロテアーゼによって特異的に切断される。それによって構築された腫瘍溶解性ウイルスは、ｏＨＳＶ－ＢＪＳと名付けられた。

【図2】プラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ＥＧＦＰの模式的構成図である。

【図3】アフリカミドリザルの腎臓細胞（Ｖｅｒｏ、正常細胞）では、ＩＣＰ２７ ｍＲＮＡが組換えウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＳから正常に発現され、ＩＣＰ２７タンパク質が細胞内での蓄積が非常に少なかった。Ｖｅｒｏ細胞に３ ＭＯＩ（ウイルス数／細胞）ＨＳＶ－１野生型ウイルスＫＯＳまたは腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＳを感染させ、１日後、細胞を収集し、ＲＮＡを単離してタンパク質を抽出し、逆転写と半定量ＰＣＲの結合によりＩＣＰ２７ ｍＲＮＡを検出し（図のＡ）、ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）でＨＳＶ ＩＣＰ２７によってコードされるタンパク質を検出した（図のＢ）。

【図4】ＨＲＶ－３Ｃ ｍＲＮＡは、４種のがん細胞で容易に検出可能なレベルまで発現し、ＩＣＰ２７タンパク質が組換えウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＳおよび野生型ウイルスＫＯＳにおいてほとんど無差別に発現された。図のＡ：ＨＲＶ－３Ｃ ｍＲＮＡの発現の検出結果、図のＢ：ＩＣＰ２７タンパク質発現の検出結果。

【図5】野生型ウイルスＫＯＳおよび腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＳのがん細胞における増殖動態である。０．１ ＭＯＩのＫＯＳまたはｏＨＳＶ－ＢＪＳで様々ながん細胞に感染させ、異なる日数が経った後に、細胞と培地を回収し、３回の凍結融解サイクルで細胞内に残されたウイルスを培地に放出した。ウイルスを相補的細胞Ｃ_{ＩＣＰ２７}に感染させ、プラーク法でウイルス力価（プラーク形成単位／ミリリットル、ＰＦＵ／ｍｌ）を測定した。図において、Ａ：子宮頸がんＨｅｌａ細胞、Ｂ：子宮頸部扁平上皮がんｓｉＨａ細胞、Ｃ：乳がんＳＫ－ＢＲ３細胞、Ｄ：乳がんＭＥ－１８０細胞。

【図6】組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＳは、動物において肺がん、胃がん、肝臓がんおよび直腸がんの増殖を顕著に抑制した。ヒト腫瘍マウス動物モデルを構築した。モデル構築後、腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍内に３日に１回、合計３回注射した。ネガティブコントロールとしてＰＢＳ（腫瘍溶解性ウイルスを含まず）を注入した。腫瘍溶解性ウイルス注射後、腫瘍サイズを週に２回測定した。ネガティブコントロール動物を安楽死させるときに、実験を終了させた。腫瘍の大きさに基づいて腫瘍の成長曲線を作成した（図において、Ａ：肺がん、Ｂ：胃がん、Ｃ：直腸がん、Ｄ：直腸がん）、試験終了時の試験群の腫瘍の大きさとネガティブコントロールを比較、分析して、相対的阻害率を計算した（図のＥ）。

【発明を実施するための形態】

【0051】

本開示の実施例の目的、技術案および利点をより明瞭にするために、以下、本開示の実施例における技術案を明瞭かつ完全に説明する。実施例に具体的な条件が示されていない場合、従来の条件またはメーカーが推奨する条件に従って実施するものとする。使用される試薬または機器は、製造元が明示されていない場合、すべて市販で購入できる一般的な製品である。

【0052】

明細書で使用される場合、「塩基配列」および「ヌクレオチド配列」という用語は交換して使用することができ、一般に、ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基の配列を指す。

【0053】

「プライマー」という用語は、ポリヌクレオチドテンプレートと二重鎖を形成した後、核酸合成の開始点として機能し、その３’末端からテンプレートに沿って伸長し、それによって拡張された二重鎖を形成することができる、天然または合成オリゴヌクレオチドを指す。伸長プロセスで追加されるヌクレオチド配列は、テンプレートポリヌクレオチドの配列によって決定され、プライマーはＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーは通常、プライマー伸長産物の合成での使用と互換性のある長さを持ち、その特定の長さは、温度、プライマー由来、実験方法などの多くの要因の影響を受ける。

【0054】

「プロモーター」という用語は、一般に、ＲＮＡポリメラーゼによって特異的に認識され、ＲＮＡポリメラーゼを活性化することができる構造遺伝子の５’末端の上流に位置するＤＮＡ配列を指す。

【0055】

「エンハンサー」という用語は、それに連鎖する遺伝子の転写の頻度を増加させるＤＮＡ配列を指す。エンハンサーはプロモーターによって転写を増強させる。効果的なエンハンサーは、遺伝子の５’末端または遺伝子の３’末端に位置してもよく、一部が遺伝子のイントロンに位置してもよい。エンハンサーの効果は顕著であり、一般的に遺伝子転写の頻度を１０～２００倍増やすことができ、数千倍になることもある。

【0056】

用語の「被験者」、「個体」および「患者」は、本明細書で交換して使用することができ、脊椎動物を指し、好ましくは哺乳動物を指し、最も好ましくはヒトを指す。哺乳動物は、げっ歯類、類人猿、ヒト、家畜、スポーツ動物、ペットなどを含むが、これらに限定されない。

【0057】

本開示の特徴および性能について実施例を用いてより詳細に説明する。

【0058】

実施例１
本実施例による腫瘍溶解性ウイルスは、野生型の単純ヘルペスウイルス１型ＫＯＳを形質転換することにより得られ、該組換え腫瘍溶解性ウイルスのゲノムは、以下の構成を有する（図１のＢを参照）。

【0059】

（１）該組換え腫瘍溶解性ウイルスの必須遺伝子ＩＣＰ２７の３’末端の非コード領域の前に第１の制御エレメントを有する。第１の制御エレメントには、がん細胞特異的プロモーターであるｈＴＥＲＴ、エンハンサーであるＣＭＶエンハンサー、特異的プロテアーゼであるヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ（ＨＲＶ－３Ｃプロテアーゼ）をコードする核酸配列、およびＢＧＨ Ｐｏｌｙ（Ａ）が含まれる。

【0060】

ここで、ｈＴＥＲＴの塩基配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示されている。

【0061】

ＣＭＶエンハンサーの塩基配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０に示されている。

【0062】

ＨＲＶ－３Ｃプロテアーゼをコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６に示されている。

【0063】

ＨＲＶ－３Ｃプロテアーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５に示されている。

【0064】

（２）該組換え腫瘍溶解性ウイルスは、必須遺伝子ＩＣＰ２７のオープンリーディングフレームの開始コドン（ＡＴＧ）と第２のトリプレットコドンの間に第２の制御エレメントを有し、該第２の制御エレメントには、細胞外トラクションシグナルペプチドであるインターフェロンα２シグナルペプチドをコードする第２の核酸配列および特異的切断部位配列をコードする第３の核酸配列が含まれる。

【0065】

ここで、インターフェロンα２シグナルペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７に示されている。

【0066】

インターフェロンα２シグナルペプチドをコードする第２の核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示されている。

【0067】

特異的切断部位配列のアミノ酸列は、
ＬＥＶＬＦＱＧＰであり、
特異的切断部位配列のコード配列である第３の核酸配列は、
ＴＴＡＧＡＡＧＴＴＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＧＴＣＣＴである。

【0068】

ＩＣＰ２７が発現すると、インターフェロンα２細胞外トラクションシグナルペプチドは、特異的切断部位配列を介してＩＣＰ２７タンパク質のＮ末端に結合する。該腫瘍溶解性ウイルスが正常細胞に感染すると、ＨＲＶ－３Ｃプロテアーゼは発現せず、特異的切断部位は切断されず、インターフェロンα２細胞外トラクションシグナルがＩＣＰ２７タンパク質の分泌に細胞外に誘導し、腫瘍溶解性ウイルスの複製が阻害されまたは失敗し、正常細胞に安全であり、損傷を引き起こすことがなかった。該腫瘍溶解性ウイルスががん細胞に感染すると、ＨＲＶ－３ＣプロテアーゼがｈＴＥＲＴの駆動下で特異的に発現し、特異的切断部位が、発現されたＨＲＶ－３Ｃプロテアーゼによって認識されて切断され、ＩＣＰ２７タンパク質が通常がん細胞に正常に局在化することができ、該腫瘍溶解性ウイルスが正常に複製し、それによって標的のがん細胞を死滅させることができる。

【0069】

また、本実施例による上記の組換え腫瘍溶解性ウイルスの調製方法は以下のとおりである。

【0070】

（１）ＩＣＰ２７を発現させるＶｅｒｏ細胞株の樹立
（ａ）野生型ヘルペスウイルス１型ＫＯＳのＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＩＣＰ２７遺伝子のコード領域をＰＣＲで増幅し、増幅した断片を、ネオマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ＥＧＦＰ（図２を参照）のＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａサイトの間に挿入してＥＧＦＰを置き換えた。該組換えプラスミドはＩＣＰ２７発現プラスミドと名付けられ、ＩＣＰ２７遺伝子はＣＭＶプロモーターの駆動下で発現された。

【0071】

（ｂ）Ｖｅｒｏ細胞を異なる濃度のＧ４１８で処理し、３日ごとにＧ４１８を含む培地を交換し、１０日後の細胞死を観察した。細胞死に必要な最小限のＧ４１８濃度を決定し、これを、細胞株を樹立する際のＧ４１８濃度として使用した。

【0072】

（ｃ）３．５×１０^５個のＶｅｒｏ細胞を６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに播種し、抗生物質を含まない培地で一晩インキュベートし、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００で、ステップ（ａ）で得られたＩＣＰ２７発現プラスミド４μｇを各ウェルに形質導入した。２４時間後、１：２０、１：４０及び１：６０の比率で希釈し、プレートに移し、Ｇ４１８を含む培地で培養し、３日ごとにＧ４１８を含む培地を交換した。培地を６～７回交換した後、クローンを収集し、２４ウェルプレートから段階的に増幅した。その後、タンパク質を単離し、ウエスタンブロット法（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）でＩＣＰ２７の発現を検出した。ＩＣＰ２７を高度に発現するクローン由来の細胞を選択し、ＩＣＰ２７を発現するＶｅｒｏ細胞を取得し、それを相補的細胞Ｃ_{ＩＣＰ２７}と名付けた。

【0073】

該相補的細胞Ｃ_{ＩＣＰ２７}は、２０１９年４月２４日付で中国武漢市武昌珞珈山武漢大学にある中国典型培養物寄託センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託がなされ、ＣＣＴＣＣ ＮＯ．Ｃ２０１９７４の受託番号が付与された。

【0074】

（２）ＥＧＦＰでＩＣＰ２７を置き換えた組換えウイルスの構築
親ウイルスは野生型ヘルペスウイルス１型ＫＯＳを基礎材料として構築され、ＥＧＦＰでＩＣＰ２７遺伝子を置き換えて得られた組換えウイルスを移行型ヘルペスウイルスとし、親ウイルスと名付けた。具体的な方法は以下のとおりである。

【0075】

（ａ）第１の核酸断片を人工合成し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示されるように、その上流から下流（５’－３’）へ、順にＩＣＰ２７ ５’末端配列、ＣＭＶプロモーター、Ｋｏｚａｋ配列、ＥＧＦＰコーディングフレーム、ＢＧＨ Ｐｏｌｙ（Ａ）及びＩＣＰ２７ ３’末端配列が含まれる。

【0076】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １において：
１－６番目：無関係な配列、末端の長さを長くすると酵素的切断が容易になり、
７－１２番目：Ｘｈｏ１サイト、Ｃ／ＴＣＧＡＧ、
１３－５７５番目：ＩＣＰ２７ ５’末端配列、
５７６－１１６３番目：ＣＭＶプロモーター、
１１６４－１１７４番目：スペーサー配列、
１１７５－１１８０番目：Ｋｏｚａｋ配列、タンパク質の発現を増強させ、
１１８１－１９００番目：ＥＧＦＰコーディングフレーム、
１９０１－２１４４番目：ＢＧＨ Ｐｏｌｙ（Ａ）、
２１４５－２６６７番目：ＩＣＰ２７ ３’末端配列、
２６６８－２６７３番目：ＨｉｎｄＩＩＩサイトＡ／ＡＧＣＴＴ、
２６７４－２６７９番目：無関係な配列、末端の長さを長くすると酵素的切断が容易になる。

【0077】

（ｂ）ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで第１の核酸断片を酵素的切断し、ｐｃＤＮＡ３．１－ＥＧＦＰプラスミドのＸｈｏ１およびＨｉｎｄＩＩＩサイトに結合した。得られた組換えプラスミドをＥＧＦＰ発現プラスミドと名付けた。

【0078】

（ｃ）３．５×１０^５個／ウェルの量で、上記の相補的細胞Ｃ_{ＩＣＰ２７}を６ウェル細胞培養プレートに播種し、抗生物質を含まない培地で一晩培養した。

【0079】

（ｄ）それぞれ０．１、０．５、１、３ＭＯＩ（ウイルス／細胞）野生型ウイルスＫＯＳを相補的細胞Ｃ_{ＩＣＰ２７}に感染させ、１時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００で上記のＥＧＦＰ発現プラスミド（４μｇ ＤＮＡ／ウェル）を細胞に形質導入した。４時間後、完全培地で形質導入溶液を置き換えた。すべての細胞が感染した後、細胞と培地を収集し、３回凍結融解し、遠心処理によって上清液を回収し、上清液を希釈し、上記の相補的細胞Ｃ_{ＩＣＰ２７}に感染させた。

【0080】

（ｅ）プラーク単離法によってウイルスを単離した。４～５日後、蛍光顕微鏡下で緑色のウイルスプラークを選択した。そして、得られたウイルスプラークを、純粋なウイルスプラークを得るまで２または３回スクリーニングした。ウイルスを増殖して拡大して、ＥＧＦＰでＩＣＰ２７を置き換えた組換えウイルスを得、親ウイルスＨＳＶ－ＥＧＦＰと名付けた。

【0081】

（３）第１の発現制御エレメントおよび第２の制御エレメントを含む組換えプラスミドの構築
（ａ）マルチクローニングサイトにＸｈｏＩサイトのみを含むようにＴＡクローニングプラスミドに対して遺伝子操作しておき、ＴＡ－ＸｈｏＩプラスミドと名付けた。

【0082】

（ｂ）第２の核酸断片を人工合成し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示されるように、その上流から下流（５’－３’）へ、天然ＩＣＰ２７プロモーターを含むＩＣＰ２７ ５’末端の非コード領域配列、インターフェロンα２細胞外トラクションシグナルペプチドをコードする第２の核酸配列、ＨＲＶ－３Ｃプロテアーゼによって切断される特異的切断部位配列をコードする第３の核酸配列、ＩＣＰ２７オープンリーディングフレーム配列、ＳＶ４０ Ｐｏｌｙ（Ａ）、ＩＣＰ２７ ３’末端の非コード領域配列が順に含まれる。ここで、ＳＶ４０ Ｐｏｌｙ（Ａ）とＩＣＰ２７ ３’末端の非コード領域配列の間に、第１の制御エレメントを挿入、構築するための１つのＨｉｎｄＩＩＩサイトがある。

【0083】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２において：
１－６番目：Ｘｈｏ １サイト、
７－６７７番目：天然ＩＣＰ２７プロモーターを含むＩＣＰ２７ ５’末端の非コード領域配列、
６７８－７４６番目：インターフェロンα２シグナルペプチドをコードする第２の核酸配列、
７４７－７７０番目：ＨＲＶ－３Ｃプロテアーゼによって切断される特異的切断部位配列をコードする第３の核酸配列、
７７１－２３０６番目：ＩＣＰ２７オープンリーディングフレーム配列（開始コドンＡＴＧなし）、
２３０７－２７５３番目：ＳＶ４０ Ｐｏｌｙ（Ａ）、
２７５４－２７５９番目：ＨｉｎｄＩＩＩサイト、
２７６０－３２７９番目：ＩＣＰ２７ ３’末端の非コード領域配列、
３２８０－３２８５番目：Ｘｈｏ １サイト。

【0084】

Ｘｈｏ １で第２の核酸断片を酵素的切断した後、ＴＡ－ＸｈｏＩプラスミドに挿入し、組換えプラスミドを得ておき、ＴＡ－ＸｈｏＩ－Ｓ－ＩＣＰ２７プラスミドと名付けた。

【0085】

（ｃ）第３の核酸断片を人工合成し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示されるように、その上流から下流（５’－３’）へ、順にｈＴＥＲＴプロモーター、ＣＭＶエンハンサー、Ｋｏｚａｋ配列、ＨＲＶ－３Ｃプロテアーゼをコードする核酸配列およびＳＶ４０ Ｐｏｌｙ（Ａ）が含まれる。

【0086】

第３の核酸断片の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示されるように、含まれる各エレメントが以下のとおりである。

【0087】

１－６番目：ＨｉｎｄＩＩＩサイト、
７－４３２番目：ｈＴＥＲＴプロモーター、
４３３－５２７番目：ＣＭＶエンハンサー、
５２８－５３９番目：Ｋｏｚａｋ配列、
５４０－１０８８番目：ＨＲＶ－３Ｃプロテアーゼをコードする核酸配列、
１０８９－１５４４番目：ＳＶ４０ Ｐｏｌｙ（Ａ）、
１５４５－１５５０番目：ＨｉｎｄＩＩＩサイト。

【0088】

ＨｉｎｄＩＩＩで第３の核酸断片を酵素的切断した後、同じく酵素的切断されたＴＡ－ＸｈｏＩ－Ｓ－ＩＣＰ２７プラスミドに挿入し、組換えプラスミドを得ておき、ＴＡ－ＸｈｏＩ－Ｓ－ＩＣＰ２７－３Ｃプラスミドと名付けた。

【0089】

（４）組換え腫瘍溶解性ヘルペスウイルスの構築
（ａ）３．５×１０^５個／ウェルの量で、上記の相補的細胞Ｃ_{ＩＣＰ２７}を６ウェル細胞培養プレートに播種し、抗生物質を含まない培地で一晩培養した。

【0090】

（ｂ）それぞれ０．１、０．５、１、３ＭＯＩ（ウイルス／細胞）親ウイルスＨＳＶ－ＥＧＦＰを相補的細胞Ｃ_{ＩＣＰ２７}に感染させ、１時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００で上記のＴＡ－ＸｈｏＩ－Ｓ－ＩＣＰ２７－３Ｃプラスミド（４ μｇ ＤＮＡ／ウェル）を細胞に形質導入した。４時間後、完全培地で形質導入溶液を置き換えた。すべての細胞が感染した後、細胞と培地を収集し、３回凍結融解し、遠心処理によって上清液を回収し、上清液を希釈し、上記の相補的細胞Ｃ_{ＩＣＰ２７}に感染させた。プラーク単離法によってウイルスを単離した。４～５日後、蛍光顕微鏡下で緑色のウイルスプラークを選択した。そして、得られたウイルスプラークを、純粋なウイルスプラークを得るまで２または３回スクリーニングした。ウイルスを増殖して拡大して、感染細胞のＤＮＡを単離し、特異的プライマーを使用して、ＰＣＲ増幅によってフラグメントを調べ、配列特定を行い、本実施例の組換え腫瘍溶解性ウイルスを得、ｏＨＳＶ－ＢＪＳと名付けた。

【0091】

該組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＳは、２０１９年４月２４日付で中国武漢市武昌珞珈山武漢大学にある中国典型培養物寄託センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託がなされ、ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｖ２０１９２０の受託番号が付与されている。

【0092】

実験例１
正常細胞Ｖｅｒｏにおける実施例１による組換え腫瘍溶解性ヘルペスウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＳのＩＣＰ２７の発現の検出
方法：それぞれ野生型ＫＯＳおよび組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＳでＶｅｒｏ（３ ＭＯＩ）に感染させ、１日後、細胞を収集し、ＲＮＡを単離してタンパク質を抽出し、逆転写と半定量ＰＣＲの結合によりＩＣＰ２７ ｍＲＮＡの発現レベルを検出し、ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）でＩＣＰ２７によってコードされたタンパク質の発現レベルを検出した。ｍＲＮＡおよびタンパク質の検出は、いずれもβ－アクチン（β－ａｃｔｉｎ）をローディングコントロールとして用いた。

【0093】

結果：図３のＡに示すように、ＩＣＰ２７ ｍＲＮＡレベルは、ｏＨＳＶ－ＢＪＳおよびＫＯＳに感染したＶｅｒｏ細胞で有意差が見られなかった。しかし、ｏＨＳＶ－ＢＪＳに感染したＶｅｒｏ細胞においてＩＣＰ２７タンパク質の量は、ＫＯＳに感染したＶｅｒｏ細胞（図３のＢを参照）より有意に少なかった。これは、上記実施例１で得られた組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＳｈが、正常細胞におけるＩＣＰ２７の発現後、インターフェロンα２細胞外トラクションシグナルペプチドによって細胞外に分泌されたことを示している。

【0094】

実験例２
がん細胞におけるＨＲＶ－３ＣプロテアーゼおよびＩＣＰ２７の発現の検出
方法：３ ＭＯＩ組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＳまたはＫＯＳを４種の異なるがん細胞に感染させ、２４時間後、全ＲＮＡおよびタンパク質を単離した。半定量ＰＣＲによりＨＲＶ－３Ｃ ｍＲＮＡの発現を分析し、ウエスタンブロット法によりＩＣＰ２７タンパク質の量を検出した。ｍＲＮＡおよびタンパク質の検出は、いずれもβ－アクチンをローディングコントロールとして用いた。

【0095】

結果により、ＨＲＶ－３Ｃ ｍＲＮＡがｏＨＳＶ－ＢＪＳに感染した４種の異なるがん細胞で検出可能なレベルまで発現され（図４のＡを参照）、ＩＣＰ２７タンパク質が組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＳに感染した４種のがん細胞で検出可能なレベルまで蓄積され、且つ腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＳに感染した各種類のがん細胞におけるＩＣＰ２７タンパク質の量は、ＫＯＳに感染した細胞に対して有意差がなかった（図４のＢを参照）ことが示されている。結果から、ＨＲＶ－３Ｃは、がん細胞で特異的に発現し、特異的切断部位（ＬＥＶＬＦＱＧＰ）を切断して、ＩＣＰ２７タンパク質が細胞内に残されてウイルスの増殖をサポートできるようにしたことがわかった。

【0096】

実験例３
組換え腫瘍溶解性ヘルペスウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＳの増殖動態
方法：それぞれ０．１ ＭＯＩのＫＯＳおよびｏＨＳＶ－ＢＪＳを異なるがん細胞に感染させ、異なる日経った後に、細胞と培地を回収し、３回の凍結融解サイクルで細胞内に残されたウイルスを培地に放出した。ウイルスを相補的細胞Ｃ_{ＩＣＰ２７}に感染し、プラーク法でウイルス力価（プラーク形成単位／ミリリットル、ＰＦＵ／ｍｌ）を測定した。

【0097】

結果により、ｏＨＳＶ－ＢＪＳが異なるがん細胞に感染したときの増殖に大きく異なるがが、ｏＨＳＶ－ＢＪＳとＫＯＳの増殖動態は同じ種類のがん細胞で有意差はなく（図５のＡ～Ｄを参照）、これは、がん細胞におけるｏＨＳＶ－ＢＪＳの増殖能力または複製能力が、野生型ＫＯＳと一致または同等であることを示しており、ｏＨＳＶ－ＢＪＳの複製能力が弱まっていなかったことを示している。

【0098】

実験例４
組換え腫瘍溶解性ヘルペスウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＳのがん細胞に対する死滅能力
方法：０．２５または０．５ ＭＯＩのＫＯＳまたはｏＨＳＶ－ＢＪＳを異なるがん細胞に感染させ、異なる日経った後、細胞の生存率を測定した。結果を表１～４に示す。

【0099】

表１～４のデータからわかるように、０．２５または０．５ ＭＯＩ ｏＨＳＶ－ＢＪＳは異なるがん細胞に対して死滅能力が異なるが、同じがん細胞に対して、ｏＨＳＶ－ＢＪＳの細胞に対する死滅効率はＫＯＳとほぼ同じであった（表１～４）。組換え腫瘍溶解性ヘルペスウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＳは、一定の広いスペクトル効果を持ち、ＫＯＳに近い殺傷効率で標的がん細胞を死滅させることができることが示されている。

【0100】

【表1】

【0101】

【表2】

【0102】

【表3】

【0103】

【表4】

【0104】

実験例５
組換え腫瘍溶解性ヘルペスウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＳの、正常細胞の生存率に対する影響
方法：腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＳ（２ ＭＯＩ）および野生ウイルスＫＯＳ（０．５ ＭＯＩ）でＶｅｒｏ細胞または初代ヒト角膜上皮細胞に感染させた。ｏＨＳＶ－ＢＪＳで感染した細胞と未処理の細胞の活性を３日後に測定し、野生ウイルスＫＯＳで感染した細胞の活性を２日後に測定した。ＫＯＳで感染した細胞は、２日後、Ｖｅｒｏ細胞または初代ヒト角膜上皮細胞がすべて死亡したが、腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＳで感染した細胞は、生存率が無処理の場合とほぼ同じであった（表５）。結果から、腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＳが正常細胞に対して安全であることがわかった。

【0105】

【表5】

【0106】

実験例６
ｉｎ ｖｉｖｏでの組換え腫瘍溶解性ヘルペスウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＳの腫瘍抑制効果の検出
方法：体重１４～１６グラムの４～８週齢の雄マウスを利用して腫瘍モデルを構築した。ヒト肺がん、胃がん、肝臓がんのマウスの癌モデルは、それぞれｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されたヒト非小細胞肺がんＡ５４９細胞、胃がんＮＣＩ－Ｎ８７細胞、肝臓がんＳＫ－ＨＥＰ－１細胞をＢＡＬｂ／ｃ（肺がんおよび胃がん）またはＮＰＧマウス（肝臓がん）に皮下接種し、腫瘍が所定のサイズまで成長したとき、腫瘍を取り出して小さく切り、相応のマウスに移植して４０～１２０ｍｍ^３まで成長させた後、腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍内に注射した。３日に１回、合計３回、毎回１．２×１０^７感染ユニット（４０μｌのＰＢＳに懸濁）を複数の箇所に注射するように腫瘍内に注射した。ネガティブコントロールとしてＰＢＳ（腫瘍溶解性ウイルスを含まず）を注入した。各実験群あたり８匹の動物であった。腫瘍溶解性ウイルス注射後、腫瘍サイズを週に２回測定した（１回目の注射時の腫瘍の相対的なサイズは１と定義されている）、合計１７～３２日間測定した（ネガティブコントロール動物を安楽死させる必要がある時間によって決める）。腫瘍の大きさに基づいて腫瘍の成長曲線を作成した、試験終了時の試験群の腫瘍の大きさとネガティブコントロールを比較、分析して、相対的阻害率を計算した。

【0107】

相対的阻害率（％）＝（陰性対照群の腫瘍体積－実験群の腫瘍体積）／陰性対照群の腫瘍体積×１００％。

【0108】

結果により、ｏＨＳＶ－ＢＪＳは、肺がん、胃がん、肝臓がんおよび直腸がんの増殖を異なる程度で遅らせることができる（図６のＡ～Ｄ）。ｏＨＳＶ－ＢＪＳの肺がん、胃がん、肝臓がんおよび直腸がんに対する阻害率は、それぞれ４５％、３７％、２６％および４９％であった（図６のＥ）。結果から、ｏＨＳＶ－ＢＪＳは、広範囲で様々ながんの増殖を阻害でき、広いスペクトル効果をもつことが示されている。

【0109】

上記の説明は、本開示の代表的な実施例にすぎず、本開示を限定することを意図するものではない。当業者にとって、本開示は、様々な変化および変更を有してもよい。本開示の精神および原則の範囲内で行われた変更、均等置換、改善などは、いずれも本開示の保護範囲に含まれるものとする。

【産業上の利用可能性】

【0110】

本開示による腫瘍溶解性ウイルスは、産業上、大量生産することができ、該腫瘍溶解性ウイルスが元のゲノム上の遺伝子（必須遺伝子も非必須遺伝子も）を削除せず、強力な複製能力で複製し、がん細胞を殺すことができる。がんの治療に使用され、非がん細胞に対して安全である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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