特許 7303407 腫瘍の診断および治療におけるＡｋｔ２の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-06-27

(45)【発行日】2023-07-05

(54)【発明の名称】腫瘍の診断および治療におけるＡｋｔ２の使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/711 20060101AFI20230628BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230628BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230628BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20230628BHJP

   C12Q 1/6883 20180101ALI20230628BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20230628BHJP

【ＦＩ】

A61K31/711 ZNA

A61P35/00

A61P35/02

C12N15/113 Z

C12Q1/6883 Z

G01N33/574 D

【請求項の数】 8

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2021181430

(22)【出願日】2021-11-05

(62)【分割の表示】P 2018546727の分割

【原出願日】2015-11-30

(65)【公開番号】P2022028749

(43)【公開日】2022-02-16

【審査請求日】2021-11-26

(73)【特許権者】

【識別番号】518189334

【氏名又は名称】シェ、ヤンホイ

【氏名又は名称原語表記】ＸＩＥ ＹＡＮＨＵＩ

(74)【代理人】

【識別番号】100091487

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 行孝

(74)【代理人】

【識別番号】100120617

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野 真理

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(72)【発明者】

【氏名】シェ、ヤンホイ

(72)【発明者】

【氏名】シェ、ミシュエ

【審査官】篭島 福太郎

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２００４／００４３０２３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】Leukemia and Lymphoma，2005年，Vol.46，p.1765-1773

【文献】Blood，2009年，Vol.113，p.2014-2021

【文献】Cell Death and Differentiation，2004年，Vol.11，p.S65-S72

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／７１１

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｐ ３５／０２

Ｃ１２Ｎ １５／１１３

Ｃ１２Ｑ １／６８８３

Ｇ０１Ｎ ３３／５７４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ａｋｔ２検出剤を含む、グルココルチコイド耐性腫瘍を検出するためのキットであって、前記Ａｋｔ２検出剤が、配列番号３または４で表されるヌクレオチド分子から選択される、前記キット。

【請求項2】

前記グルココルチコイドが、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、ベクロメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、酢酸コルチゾン、ブデソニド、二プロピオン酸ベクロメタゾン、シクレソニド、コルチゾン、メチルプレドニゾロン、酪酸クロベタゾール、フルオシノニド、二プロピオン酸ベクロメタゾン、フロ酸モメタゾン、ハルシノニド、プロピオン酸クロベタゾール、ハルシノニド、ハロメタゾンおよび二酢酸ジフロラゾンからなる群から選択される、請求項１に記載のキット。

【請求項3】

前記グルココルチコイドがデキサメタゾンである、請求項２に記載のキット。

【請求項4】

前記腫瘍がリンパ球由来腫瘍である、請求項１～３のいずれか一項に記載のキット。

【請求項5】

前記腫瘍が、リンパ球性白血病、リンパ腫および骨髄腫からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載のキット。

【請求項6】

前記腫瘍がＴ細胞由来腫瘍である、請求項１～３のいずれか一項に記載のキット。

【請求項7】

前記腫瘍が、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔリンパ球性白血病、Ｔ細胞リンパ腫および骨髄腫からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載のキット。

【請求項8】

前記腫瘍が、バーキットリンパ腫、急性Ｔリンパ球性白血病および骨髄腫からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物学と医学の分野に属し、腫瘍の診断および治療、特に、グルココルチコイド耐性腫瘍を診断するための、ＡｋｔキナーゼサブタイプであるＡｋｔ２の検出剤、ならびに、腫瘍、特に、リンパ球性白血病、骨髄腫およびリンパ腫を治療するための、Ａｋｔ２阻害剤とグルココルチコイドとの組合せに関する。

【背景技術】

【0002】

細胞内に広く存在するＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路は、細胞の成長、増殖および分化の調節に関与するシグナル伝達経路であり、ヒトの様々な腫瘍の発生率と発達に密接に関連する。ＡｋｔサブタイプとしてのＡｋｔ１およびＡｋｔ２は、両方とも、細胞の成長および増殖の調節と、血糖レベルの調節とにおいて役割を果たす。研究により、Ａｋｔ１は細胞におけるグルココルチコイド耐性の原因となる重要な標的であることが示されている。しかしながら、Ａｋｔ２と、リンパ球由来腫瘍の発生／発達、薬物耐性および予後との相関に関する報告はない。

【0003】

グルココルチコイド（ＧＣ）は、様々な血リンパ系腫瘍の第一選択化学療法として使用される、リンパ球のアポトーシスを誘導することができる臨床的に有効な薬物の１つである。グルココルチコイド耐性は、リンパ系腫瘍の臨床的処置における一般的な問題であり、処置の失敗の重要な原因である。現在、グルココルチコイド耐性についての研究においていくつかの進歩があったが、耐性の詳しい分子機構は依然として不明である。最近の研究では、グルココルチコイド耐性は、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）数の増加、ＧＲの構造的機能、分子シャペロンの発現および遺伝子突然変異と関連しておらず、ＧＲ突然変異は極めてまれであり；プレドニゾン耐性は、多剤耐性遺伝子（ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＧ２およびＭＶＰなど）と関連していないことが見出された。他の研究では、多くの標的遺伝子がグルココルチコイド耐性をもたらす可能性があることが見出され、グルココルチコイドの感受性および耐性は異なる細胞シグナル伝達経路によって媒介されると予備的に考えられている。それに従って、グルココルチコイド耐性腫瘍を治療するための新しい方法が必要である。

【発明の概要】

【0004】

一態様において、本発明は、腫瘍細胞におけるＡｋｔ２の発現を測定することを含んでなる、グルココルチコイド耐性腫瘍を診断するための方法であって、グルココルチコイド感受性腫瘍細胞に対して、測定された腫瘍細胞におけるＡｋｔ２発現の上昇がその腫瘍はグルココルチコイド耐性であることを示す方法を提供する。

【0005】

別の態様では、本発明は、グルココルチコイド耐性腫瘍を診断するための組成物またはキットの調製における、Ａｋｔ２の検出のための検出剤、例えば、Ａｋｔ２タンパク質に対する抗体、またはＡｋｔ２ ｍＲＮＡの検出のためのプローブもしくはプライマーなどの使用を提供する。

【0006】

別の態様では、本発明は、グルココルチコイド耐性腫瘍の診断における使用のための、Ａｋｔ２の検出のための検出剤、例えば、Ａｋｔ２タンパク質に対する抗体、またはＡｋｔ２ ｍＲＮＡの検出のためのプローブもしくはプライマーなどを提供する。

【0007】

別の態様では、本発明は、腫瘍を治療するため、例えば、グルココルチコイド療法に対する腫瘍の感受性を向上させるためまたはグルココルチコイド耐性腫瘍を治療するための方法であって、その腫瘍を有する患者に治療上有効な量のＡｋｔ２阻害剤およびグルココルチコイドを投与することを含んでなる方法を提供する。

【0008】

別の態様では、本発明は、腫瘍を治療するため、例えば、グルココルチコイド療法に対する腫瘍の感受性を向上もしくは増強するためまたはグルココルチコイド耐性腫瘍を治療するための医薬組成物であって、Ａｋｔ２阻害剤およびグルココルチコイドと、所望により、薬学的に許容可能な担体、賦形剤および／または希釈剤とを含んでなる医薬組成物を提供する。

【0009】

別の態様では、本発明は、腫瘍を治療するため、例えば、グルココルチコイド療法に対する腫瘍の感受性を向上させるためまたはグルココルチコイド耐性腫瘍を治療するためのの医薬組成物の調製におけるＡｋｔ２阻害剤の使用を提供する。ある実施形態では、前記医薬組成物は、グルココルチコイドと、所望により、薬学的に許容可能な担体、賦形剤および／または希釈剤とを含んでなる。

【0010】

別の態様では、本発明は、腫瘍の治療における使用のため、例えば、グルココルチコイド療法に対する腫瘍の感受性を向上させるためまたはグルココルチコイド耐性腫瘍を治療するためのＡｋｔ２阻害剤を提供する。

【0011】

本発明のある実施形態では、前記腫瘍は、リンパ球由来腫瘍、例えば、リンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫もしくはＴ細胞リンパ腫などのリンパ腫、または骨髄腫などである。本発明のある実施形態では、前記腫瘍は、Ｔリンパ球性白血病、Ｔ細胞リンパ腫および骨髄腫などのＴ細胞由来腫瘍である。本発明のある実施形態では、前記リンパ球性白血病は、急性リンパ球性白血病および慢性リンパ球性白血病からなる群から選択される。ある実施形態では、前記腫瘍は、急性Ｔリンパ球性白血病である。

【0012】

本発明のある実施形態では、前記グルココルチコイドは、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、ベクロメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、酢酸コルチゾン、ブデソニド、二プロピオン酸ベクロメタゾン、シクレソニド、コルチゾン、メチルプレドニゾロン、酪酸クロベタゾール、フルオシノニド、二プロピオン酸ベクロメタゾン、フロ酸モメタゾン、ハルシノニド、プロピオン酸クロベタゾール、ハルシノニド、ハロメタゾン、二酢酸ジフロラゾンおよびそれらの誘導体からなる群から選択される。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】デキサメタゾンとＡｋｔ／ＦｏｘＯ３ａ経路におけるタンパク質発現との相関。図１Ａ：ＣＣＲＦ－ＣＥＭフローサイトメトリー：異なる濃度のデキサメタゾンによって誘導されたＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞のアポトーシス。図１Ｂ：デキサメタゾンで処理した後のＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞におけるＡｋｔ／ＦｏｘＯ３ａ／Ｂｉｍシグナル伝達経路でのタンパク質発現のウエスタンブロット。ｐ－Ａｋｔ：リン酸化Ａｋｔ、ｐ－ＦｏｘＯ３ａ：リン酸化ＦｏｘＯ３ａ。図１Ｃ：異なる濃度のデキサメタゾンによって誘導されたＣＥＭ－ＤＲ細胞のアポトーシス。図１Ｄ：ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞およびＣＥＭ－ＤＲ細胞におけるＡｋｔ／ＦｏｘＯ３ａ／Ｂｉｍシグナル伝達経路のタンパク質発現。

【図2-1】グルココルチコイドと組み合せた細胞経路阻害剤のアポトーシスに対する効果。図２Ａ：Ａｋｔ阻害剤およびＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２で処理した各群のＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞のアポトーシス。図２Ｂ：Ａｋｔ阻害剤およびＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２で処理した各群のＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞におけるＡｋｔ／ＦｏｘＯ３ａ／Ｂｉｍシグナル伝達経路のタンパク質発現のウエスタンブロット。図２Ｃ：デキサメタゾンと組み合せた異なる濃度のＡｋｔ阻害剤で処理したＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞のアポトーシス。図２Ｄ：Ａｋｔ阻害剤で処理したＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞のアポトーシス。図２Ｅ：Ａｋｔ阻害剤およびＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２で処理した各群のＭｏｌｔ－４細胞のアポトーシス。図２Ｆ：Ａｋｔ阻害剤およびＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２で処理した各群のＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシス。

【図2-2】グルココルチコイドと組み合せた細胞経路阻害剤のアポトーシスに対する効果。図２Ｇ：２－ＤＧで処理した各群のＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞のアポトーシス。図２Ｈ：２－ＤＧで処理した各群のＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞におけるＡｋｔ／ＦｏｘＯ３ａ／Ｂｉｍシグナル伝達経路のタンパク質発現。図２Ｉ：Ｎｏｔｃｈ１経路阻害剤ｄａｐｔで処理した各群のＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞におけるＦｏｘＯ３ａタンパク質発現のウエスタンブロット。図２Ｊ：Ｎｏｔｃｈ１経路阻害剤ｄａｐｔで処理した各群のＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞のアポトーシス。

【図2-3】グルココルチコイドと組み合せた細胞経路阻害剤のアポトーシスに対する効果。図２Ｋ：ＳＧＫ阻害剤ＧＳＫで処理した腫瘍リンパ球のアポトーシス。図２Ｌ：他の細胞増殖経路阻害剤と比較した、Ａｋｔ阻害剤で処理したＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞のアポトーシス。図２Ｍ：Ａｋｔ阻害剤で処理したＳＰ２／０細胞のアポトーシス。図２Ｎ：Ａｋｔ阻害剤で処理したＲａｊｉ細胞のアポトーシス。

【図3】ヌードマウスにおけるグルココルチコイドに対するＡｋｔ阻害剤の感作。図３Ａ：各群のＣＣＲＦ－ＣＥＭ担癌マウスの腫瘍形成。図３Ｂ：各群のＣＣＲＦ－ＣＥＭ担癌マウスの皮下腫瘍サイズ。図３Ｃ：各群のＣＣＲＦ－ＣＥＭ担癌マウスの腫瘍ＨＥ染色。図３Ｄ：各群の担癌マウスの全生存期間の比較。図３Ｅ：各群の担癌マウスにおける脾臓細胞のアポトーシス。図３Ｆ：薬物投与後の各群の担癌マウスの肝臓トランスアミナーゼＡＬＴおよびＡＳＴのレベル。

【図4-1】グルココルチコイドと組み合せたＡｋｔ阻害剤の効果。図４Ａ：異なる濃度のＡｋｔ１、Ａｋｔ２またはＡｋｔ１／２阻害剤と組み合せた０．１μＭデキサメタゾンによって誘導されたＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞のアポトーシス。図４Ｂ：Ａｋｔサブタイプ阻害剤と組み合せた異なる濃度のデキサメタゾンで処理したＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞の生存率。図４Ｃ：Ａｋｔサブタイプ阻害剤で処理した各群のＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞のアポトーシス。図４Ｄ：Ａｋｔサブタイプ阻害剤で処理した各群のＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞のアポトーシス。

【図4-2】グルココルチコイドと組み合せたＡｋｔ阻害剤の効果。図４Ｅ：一定濃度比でデキサメタゾンと組み合せたＡｋｔサブタイプ阻害剤で処理した各群のＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞の生存率。図４Ｆ：Ａｋｔサブタイプ阻害剤で処理した各群のＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞のデキサメタゾンＩＣ５０値。図４Ｇ：Ａｋｔサブタイプ阻害剤と組み合せた異なる濃度のデキサメタゾンで処置したＣＥＭ－ＤＲ細胞の生存率。図４Ｈ：Ａｋｔサブタイプ阻害剤で処理した各群のＣＥＭ－ＤＲ細胞のアポトーシス。図４Ｉ：一定濃度比でデキサメタゾンと組み合せたＡｋｔサブタイプ阻害剤で処理した各群のＣＥＭ－ＤＲ細胞の生存率。

【図4-3】グルココルチコイドと組み合せたＡｋｔ阻害剤の効果。図４Ｊ：Ａｋｔサブタイプ阻害剤で処理した各群のＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシス。図４Ｋ：一定濃度比でデキサメタゾンと組み合せたＡｋｔサブタイプ阻害剤で処理した各群のＪｕｒｋａｔ細胞の生存率。図４Ｌ：Ａｋｔサブタイプ阻害剤で処理した各群のＤａｕｄｉ細胞のアポトーシス。図４Ｍ：一定濃度比でデキサメタゾンと組み合せたＡｋｔサブタイプ阻害剤で処理した各群のＤａｕｄｉ細胞のアポトーシス。図４Ｎ：Ａｋｔサブタイプ阻害剤で処理したＣＥＭ－ＤＲ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞のデキサメタゾンＩＣ５０値。

【図5-1】グルココルチコイドと組み合せたＡｋｔサブタイプ阻害剤の細胞生存率に対する効果。図５Ａ：各群のＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞における総Ａｋｔ１およびＡｋｔ２タンパク質ならびにリン酸化Ａｋｔ１およびＡｋｔ２タンパク質の発現。図５Ｂ：各群のＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞における総ＦｏｘＯ３ａタンパク質の発現。図５Ｃ：各群のＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞におけるリン酸化ＦｏｘＯ３ａタンパク質の発現。図５Ｄ：各群のＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞におけるＢｉｍタンパク質の発現。

【図5-2】グルココルチコイドと組み合せたＡｋｔサブタイプ阻害剤の細胞生存率に対する効果。図５Ｅ：様々なリンパ腫細胞および肝細胞におけるＡｋｔ１およびＡｋｔ２の発現レベル。図５Ｆ：ｓｉＲＮＡトランスフェクトＪｕｒｋａｔ細胞の蛍光図。図５Ｇ：各群のｓｉＲＮＡトランスフェクトＪｕｒｋａｔ細胞におけるＡｋｔ１およびＡｋｔ２タンパク質の発現。図５Ｈ：各群のｓｉＲＮＡトランスフェクトＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシス。図５Ｉ：初回治療を受けた患者または難治性再発性急性のリンパ球性白血病を有する患者のリンパ球におけるＡｋｔ１ ｍＲＮＡおよびＡｋｔ２ ｍＲＮＡの発現レベル。

【図5-3】グルココルチコイドと組み合せたＡｋｔサブタイプ阻害剤の細胞生存率に対する効果。図５Ｊ：初回治療を受けた患者または難治性急性のリンパ球性白血病を有する患者のリンパ球におけるＡｋｔ２ ｍＲＮＡのＲＯＣ分析。

【図6-1】デキサメタゾンと組み合せたＡｋｔ１阻害剤およびＡｋｔ２阻害剤の健康な肝細胞に対する効果。図６Ａ：デキサメタゾンと組み合せたＡｋｔ１阻害剤およびＡｋｔ２阻害剤の健康な肝細胞Ｌ－０２の細胞生存率に対する阻害。図６Ｂ：Ａｋｔ１阻害剤およびＡｋｔ２阻害剤で処理したＬ－０２細胞における総Ａｋｔサブタイプタンパク質ならびにリン酸化Ａｋｔサブタイプタンパク質の発現。図６Ｃ：Ａｋｔサブタイプ阻害剤で処理した２４時間後のＬ－０２細胞における総ＦｏｘＯ３ａタンパク質の発現。図６Ｄ：Ａｋｔサブタイプ阻害剤で処理した２４時間後のＬ－０２細胞におけるリン酸化ＦｏｘＯ３ａタンパク質の発現。

【図6-2】デキサメタゾンと組み合せたＡｋｔ１阻害剤およびＡｋｔ２阻害剤の健康な肝細胞に対する効果。図６Ｅ：Ａｋｔサブタイプ阻害剤で処理した２４時間後のＬ－０２細胞におけるＢｉｍタンパク質の発現。図６Ｆ：Ａｋｔサブタイプ阻害剤で処理した２４時間後の肝細胞Ｌ－０２の生存率の比較。図６Ｇ：各群のヌードマウスの末梢血アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）のレベル。図６Ｈ：各群のヌードマウスの末梢血アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）のレベル。図６Ｉ：各群のヌードマウスの末梢血総ビリルビン（ＴＢＩＬ）のレベル。

【図6-3】デキサメタゾンと組み合せたＡｋｔ１阻害剤およびＡｋｔ２阻害剤の健康な肝細胞に対する効果。図６Ｊ：各群のヌードマウスの末梢血白血球の計数。図６Ｋ：各群のヌードマウスの末梢血赤血球の計数。図６Ｌ：各群のヌードマウスの末梢血ヘモグロビンのレベル。図６Ｍ：各群のヌードマウスの末梢血血小板の計数。図６Ｎ：各群のヌードマウスの血糖のレベル。図６Ｏ：各群のヌードマウスの末梢血クレアチニンのレベル。

【図7-1】ヌードマウスにおけるデキサメタゾンと組み合せたＡｋｔ阻害剤の効果。図７Ａ：薬物投与後の各群のＣＣＲＦ－ＣＥＭ担癌マウスの皮下腫瘍サイズ。図７Ｂ：薬物投与後の各群のＣＣＲＦ－ＣＥＭ担癌マウスの皮下腫瘍サイズ。図７Ｃ：薬物投与後の各群のＣＣＲＦ－ＣＥＭ担癌マウスの脾臓サイズ。図７Ｄ：薬物投与後の各群のＣＣＲＦ－ＣＥＭ担癌マウス全生存期間。図７Ｅ：各群のヌードマウスの腫瘍ＨＥ染色：矢印は腫瘍内の壊死領域を指している。図７Ｆ：各群のヌードマウスの腫瘍Ｋｉ－６７染色。

【図7-2】ヌードマウスにおけるデキサメタゾンと組み合せたＡｋｔ阻害剤の効果。図７Ｇ：各群のヌードマウスの脾臓ＨＥ染色。図７Ｈ：各群のヌードマウスの脾臓ＣＤ３染色。図７Ｉ：各群のヌードマウスの脾臓ＴＤＴ染色。

【図8-1】ヌードマウスの器官の病理学的切片。図８Ａ：各群のヌードマウスの肝臓の病理学的切片（ＨＥ：１０^＊２０）。図８Ｂ：各群のヌードマウスの肝臓の病理学的切片（ＨＥ：１０^＊４０）。

【図8-2】ヌードマウスの器官の病理学的切片。図８Ｃ：各群のヌードマウスの心臓の病理学的切片（ＨＥ：１０^＊２０）。図８Ｄ：各群のヌードマウスの肺の病理学的切片（ＨＥ：１０^＊２０）。

【図8-3】ヌードマウスの器官の病理学的切片。図８Ｅ：各群のヌードマウスの腎臓の病理学的切片（ＨＥ：１０^＊２０）。

【発明を実施するための形態】

【0014】

発明の詳細な説明
特に断りのない限り、総ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に使用されている意味を有する。特に断りのない限り、総ての特許、特許出願、刊行物、ＧｅｎＢａｎｋ配列、ウェブサイト、および他の刊行物は、引用することにより本明細書の一部とされる。本明細書で使用される用語にいくつかの定義がある場合、本節の定義が優先される。ＵＲＬまたは別の識別子またはアドレスを記述するときは、いつでもインターネット上の情報に従って変更および更新することができ、関連情報はインターネットを検索することによって見つけられ得ることを理解されたい。本開示は、公に利用できるようにするための基礎として使用し得る。

【0015】

本発明者は、グルココルチコイド耐性腫瘍細胞におけるＡｋｔ２の発現が、グルココルチコイド感受性細胞と比較して増加していることを見出した。Ａｋｔ２阻害剤を用いてＡｋｔ２タンパク質を阻害することにより、グルココルチコイドに対するグルココルチコイド耐性腫瘍細胞の感受性が増大する。Ｔリンパ系腫瘍細胞では、Ａｋｔ２サブタイプ阻害剤は、グルココルチコイド誘導性リンパ球アポトーシスの感受性を著しく増大させる。薬剤耐性細胞株では、Ａｋｔ２サブタイプ阻害剤とグルココルチコイドとの組合せは、良好な相乗作用を示し、グルココルチコイド耐性を逆転させることができる。Ａｋｔ２サブタイプ阻害剤は、細胞内ｐ－ＦｏｘＯ３ａ／総ＦｏｘＯ３ａ比を著しくダウンレギュレートすることができ、アポトーシス誘導タンパク質Ｂｉｍの発現をアップレギュレートすることができ、細胞内ＦｏｘＯ３ａ／Ｂｉｍシグナル伝達経路を増強し、それによって、グルココルチコイドに対するリンパ球の感受性を増大させることにより、グルココルチコイド誘導性リンパ球アポトーシスを改善することができる。

【0016】

いかなる理論にも限定されるものではないが、本発明者は、Ａｋｔ２タンパク質の発現は、グルココルチコイドに対する細胞の感受性に関連し、細胞におけるＡｋｔ２タンパク質の過剰発現は、リンパ球におけるグルココルチコイド耐性の原因となる重要な機構であり得ると考えている。Ａｋｔ２は、リンパ系腫瘍のグルココルチコイド耐性を逆転させるためのより正確な治療標的として、またグルココルチコイド処置に対するリンパ系腫瘍の感受性を増強するための標的としても、またリンパ球がグルココルチコイド耐性であるかどうかを予測するための指標としても使用し得る。

【0017】

ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ試験により、Ａｋｔ２サブタイプ阻害剤は、最小限の毒性を有し、マウスの血液系、肝機能、腎機能および血糖レベルに影響を及ぼさないことが確認された。Ａｋｔ２サブタイプ阻害剤は、グルココルチコイド（デキサメタゾンなど）と相乗作用を示して、担癌マウスの腫瘍サイズおよび脾臓サイズを効果的に減少させ、腫瘍の液状化および壊死を引き起こし、全生存時間を増加させることができた；Ａｋｔ２サブタイプ阻害剤は、最良のグルココルチコイド感作効果と最小限の毒性副作用を有する医薬である。

【0018】

それに従って、一態様において、本発明は、腫瘍細胞におけるＡｋｔ２のレベルを測定することを含んでなる、グルココルチコイド耐性腫瘍を診断するための方法であって、グルココルチコイド感受性腫瘍細胞に対して、測定された腫瘍細胞におけるＡｋｔ２のレベルの上昇がその腫瘍はグルココルチコイド耐性であることを示す方法を提供する。

【0019】

本発明では、Ａｋｔ２レベルの増加とは、Ａｋｔ２タンパク質の発現の上昇および／またはＡｋｔ２タンパク質の活性の増加を指す。Ａｋｔ２発現レベルの測定は、当技術分野で公知の様々な発現測定方法、例えば、核酸レベルでのｍＲＮＡのレベルの測定またはタンパク質のレベルでのタンパク質のレベルの測定によって行うことができる。Ａｋｔ２タンパク質の活性の測定はまた、リン酸化活性などのＡｋｔ２活性を測定するための当技術分野で公知の様々な方法によって行うこともできる。

【0020】

本発明では、グルココルチコイド感受性腫瘍とは、腫瘍細胞に対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の値１０μＭ未満（＜１０μＭ）を示す、グルココルチコイド処置を含むレジメンを臨床的に適用することによって効果的に緩和され得る腫瘍を指す。例えば、腫瘍細胞に対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の値が１０μＭ未満（＜１０μＭ）であるならば、その腫瘍はデキサメタゾン感受性腫瘍である。

【0021】

本発明では、グルココルチコイド耐性腫瘍とは、腫瘍細胞に対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の値１０μＭ以上（≧１０μＭ）を示す、グルココルチコイドに対する耐性を示し、グルココルチコイドの治療効果が低下する腫瘍を指す。グルココルチコイド感受性腫瘍と比較して、グルココルチコイド耐性腫瘍は、同じ治療効果を達成するためにより多くのグルココルチコイドを必要とするか、またはグルココルチコイドで効果的に処置することさえできない。例えば、腫瘍細胞に対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の値が１０μＭ以上（≧１０μＭ）であるならば、その腫瘍はデキサメタゾン耐性腫瘍である。

【0022】

本発明では、前記グルココルチコイドは、腫瘍処置のために当業者によって使用され得る任意のグルココルチコイド薬物である。本発明のある実施形態では、前記グルココルチコイドは、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、ベクロメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、酢酸コルチゾン、ブデソニド、二プロピオン酸ベクロメタゾン、シクレソニド、コルチゾン、メチルプレドニゾロン、酪酸クロベタゾール、フルオシノニド、二プロピオン酸ベクロメタゾン、フロ酸モメタゾン、ハルシノニド、プロピオン酸クロベタゾール、ハルシノニド、ハロメタゾン、二酢酸ジフロラゾンおよびそれらの誘導体からなる群から選択される。本発明のある実施形態では、前記グルココルチコイドは、デキサメタゾンまたはその誘導体である。

【0023】

本明細書において使用される場合、「レベルの上昇または増加」は、以下のように決定され得る。例えば、グルココルチコイド感受性腫瘍細胞が対照群として使用され、対照群の細胞におけるＡｋｔ２タンパク質レベルの範囲が決定され、次いで、測定された腫瘍細胞におけるＡｋｔ２タンパク質の対応レベルが、対照群の細胞におけるＡｋｔ２タンパク質レベルの範囲より高いならば、測定された腫瘍細胞におけるＡｋｔ２タンパク質のレベルは「上昇したまたは増加した」と考えられる。

【0024】

本明細書において使用される場合、「レベルの上昇または増加」とは、基準値（例えば、グルココルチコイド感受性腫瘍細胞において観察された中央値または平均値）と比較して、測定された値が、例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％またはそれを超えて増加していることを指す。

【0025】

本発明では、Ａｋｔ２レベルは、Ａｋｔ２検出剤を用いることにより測定することができる。Ａｋｔ２検出剤とは、タンパク質および／または核酸レベルで、特に、ｍＲＮＡレベルでＡｋｔ２を検出することが可能な分子または化合物を指し、これは、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、低分子量化合物、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、ＲＮＡ干渉体（ＲＮＡｉ）、アンチセンスＲＮＡ、組換えタンパク質、抗体、またはそれらのコンジュゲートもしくは融合タンパク質であり得る。ＲＮＡｉ体については、Ｍｉｌｈａｖｅｔ Ｏ、Ｇａｒｙ ＤＳ、Ｍａｔｔｓｏｎ ＭＰ．（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ． ２００３ Ｄｅｃ；５５（４）：６２９－４８．総説）を参照、アンチセンスＲＮＡについては、Ｏｐａｌｉｎｓｋａ ＪＢ、Ｇｅｗｉｒｔｚ ＡＭ．（Ｓｃｉ ＳＴＫＥ．２００３ Ｏｃｔ ２８；２００３（２０６）：ｐｅ４７）を参照。例えば、グルココルチコイド耐性腫瘍を有すると疑われる患者におけるＡｋｔ２タンパク質のレベルを決定するために、本発明による方法は、Ａｋｔ２タンパク質結合リガンドを用いて、その患者からの腫瘍サンプルにおけるＡｋｔ２タンパク質のレベル（濃度または絶対量）を決定することができ、ここで、そのサンプル中のＡｋｔ２タンパク質のレベルの上昇は、その患者におけるグルココルチコイド耐性腫瘍の存在を示す。

【0026】

本明細書において使用される場合、前記リガンドは、受容体標的化薬剤、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、受容体特異的抗体、およびパターン認識受容体（ＰＲＲ）リガンドであり得る。ある実施形態では、前記リガンドは、抗体（またはその抗原結合フラグメント）である。サンプル中のＡｋｔ２タンパク質は、当業者に公知の任意の技術を用いて、特に、例えば、抗体またはフラグメントまたは抗体誘導体などの特異的リガンドを用いて、明らかにされ得るかまたは分析され得る。好ましくは、前記リガンドは、Ａｋｔ２タンパク質特異的抗体またはそのフラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ＣＤＲなど）またはその誘導体（一本鎖抗体、ＳｃＦｖなど）である。サンプル中の標的タンパク質の存在または量は、例えば、標識されたリガンドを用いて、第２の標識された検出リガンドを用いてなど、標的－リガンド複合体を検出することにより検出することができる。ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどを含む周知の免疫学技術を用いることができる。

【0027】

本明細書において使用される場合、用語「抗体」、「抗原結合フラグメント」または「免疫原性部分」は、当業者に一般的に知られている意味を有する。例えば、抗体の「抗原結合フラグメント」は、無傷抗体の組換えＤＮＡ技術または酵素消化または化学的切断によって作出され、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、および一本鎖抗体（ｓｖＦｃ）が含まれる。前記抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および標識され得る抗体、ならびにそれらのフラグメント、変異体または誘導体であり得る。前記抗体標識は、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、化学発光標識、またはビオチン基標識であり得る。

【0028】

抗体またはそのフラグメントの調製または使用はよく知られている。標的タンパク質に特異的な抗体は、従来の技術、特に、そのタンパク質（またはその免疫原性フラグメント）を含んでなる免疫原で非ヒト動物を免疫し、抗体（ポリクローナル）を回収するかまたは（モノクローナル抗体を産生する）細胞を作製することによって作出することができる。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、ＳｃＦｖフラグメントおよびヒト抗体またはヒト化抗体を調製するための技術は、例えば、下記に記載されている：Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ、１９８８；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３４１ （１９８９） ５４４；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２ （１９８８） ４２３；Ｈａｒｌｏｗ、Ｅ． ａｎｄ Ｌａｎｅ、Ｄ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、１９９９；ＷＯ９４／０２６０２、ＵＳ５，２２３，４０９、ＵＳ５，８７７，２９３、ＷＯ９３／０１２８８。

【0029】

前記タンパク質はまた、質量分析技術の当業者に公知の技術を用いて検出することもでき、そのような技術は、サンプル中の特定の特徴的な配列を検出するために、一般に、プロテオーム解析下に分類される。

【0030】

あるいは、本発明の方法は、Ａｋｔ２ ｍＲＮＡの量を検出するための任意の方法を用いて、腫瘍中のＡｋｔ２ ｍＲＮＡのレベルを決定することができ、ここで、腫瘍中におけるＡ ｋｔ２ ｍＲＮＡのレベルの上昇がその腫瘍はグルココルチコイド耐性腫瘍であることを示している。上記の検出方法には、サンプル中の核酸を検出することが可能な様々な技術、例えば、ノーザンブロット法、選択的ハイブリダイゼーション、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、定量的ＰＣＲまたはＰＣＲ関連核酸増幅による、核酸分子アレイ、ＤＮＡチップなどのような、オリゴヌクレオチドプローブでコーティングされた基質の使用などが含まれる。これらの方法は、サンプル中の核酸標的を選択的または特異的に検出することが可能な核酸プローブまたはプライマーの使用を含むことができる。例えば、ハイブリダイゼーションは、当業者に公知であり、標準的な条件を参照して行われ得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、例えば、ハイブリダイゼーションは、高い、中程度または低いストリンジェンシー条件下で行われ得る。あるいは、増幅は、当業者ならば、様々な公知の方法、例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ、転写介在増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ＮＡＳＢＡ、および対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、対立遺伝子特異的増幅、サザンブロット、一本鎖コンフォメーション分析（ＳＳＣＡ）、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）、ゲルシフト法、ヘテロ二重鎖分析などを用いて行うことができる。

【0031】

本発明のある実施形態では、前記Ａｋｔ２検出剤は、配列番号３または４に記載の配列などの、Ａｋｔ２ ｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡを検出するためのプライマーである。

【0032】

別の態様では、本発明は、グルココルチコイド耐性腫瘍を診断するための組成物またはキットの調製のための、本明細書に記載のＡｋｔ２検出剤の使用をさらに提供する。

【0033】

本明細書において使用される場合、用語「キット」とは、本明細書に記載のＡｋｔ２検出剤と、限定されるものではないが、Ａｋｔ２検出剤の、投与、診断およびその活性または特性の評価を含む目的のための別の品目との組合せを指す。このキットには、所望により、使用説明書(am instruction for use)が含まれる。

【0034】

別の態様では、本発明は、腫瘍、特に、Ａｋｔ２発現の上昇を特徴とするグルココルチコイド耐性腫瘍を有する患者を治療する方法であって、その患者に治療上有効な量のグルココルチコイドおよびＡｋｔ２阻害剤、例えば、Ａｋｔ２阻害剤およびグルココルチコイドを含んでなる医薬組成物を投与することを含んでなる方法を提供する。この投与は、限定されるものではないが、非経口経路、例えば、皮下、口腔または頬または鼻腔の粘膜を含む任意の好適な経路によって行うことができる。ある実施形態では、本発明の方法は、グルココルチコイド（例えば、グルココルチコイド）およびＡｋｔ２阻害剤（例えば、ＣＣＴ１２８９３０）を、任意の好適な用量比で、患者に投与することを含んでなり、例えば、それらのモル濃度比は、例えば、１：１０～５：１、１：１０～４：１、１：１０～３：１、１：１０～２：１、１：１０～１：１、１：１０～１：２、１：１０～１：３、１：１０～１：４または１：１０～１：５などの１：１０～１０：１であり得る。ある実施形態では、本発明の方法は、患者にグルココルチコイド（例えば、デキサメタゾン）およびＡｋｔ２阻害剤（例えば、ＣＣＴ１２８９３０）を、モル濃度比１：８で投与することを含んでなる。

【0035】

本明細書において使用される場合、腫瘍を有する対象を「治療すること」とは、その対象の腫瘍が部分的もしくは完全に排除されるか、または処置後にさらに進行することなく安定したままであることを指す。処置には、予防、治療および／または治癒が含まれる。「予防」とは、潜在的腫瘍の発生を防止しかつ／または腫瘍の悪化もしくは進行を防止することを指し、腫瘍発生につながる１以上の危険因子の減少または排除を含む；腫瘍が発生したことがないかどうかを判断することは不可能である場合が多いため、予防には、腫瘍の発症または腫瘍を有する危険性を低減することも含まれる。

【0036】

本明細書において使用される場合、用語「治療上有効な量」または「治療上有効な用量」とは、対象において治療効果をもたらすために少なくとも十分である投薬処方物中の薬剤、化合物または材料の量を指す。本発明のＡｋｔ２阻害剤については、当技術分野で公知の様々な技術を用いて、特定の治療上有効な用量を最初に推定することができる。例えば、細胞培養アッセイでは、薬剤を動物モデルで処方して、細胞培養で決定されたＩＣ５０を含んでなる循環濃度の範囲を得ることができる。ヒト対象に好適な用量範囲は、例えば、細胞培養実験および他の動物研究から得られたデータを用いて決定することができる。用量およびレジメンは、既知の用量およびレジメンに基づいて決定することができ、必要に応じて、Ａｋｔ２阻害剤の特性に基づいて推定され、かつ／または様々な因子に基づいて経験的に決定され得る。これらの因子には、対象の体重、全般的健康、年齢、使用される特定の化合物の活性、性別、食事、投与時間、排泄速度、薬物の組合せ、疾患の重篤度および経過、ならびに疾患に対する患者の感受性および医師の判断が含まれる。患者の状態が改善した後、維持量の化合物または組成物を投与し得、必要に応じて、投与の用量、投与形および頻度またはそれらの組合せを変更し得る。正確な用量およびレジメン(regiment)は、医師の判断と患者の具体的な状態に基づいているべきである。

【0037】

本発明では、Ａｋｔ２阻害剤とは、Ａｋｔ２の発現および／または活性を核酸レベルおよび／またはタンパク質レベルで阻害することが可能な分子を指す。当技術分野で利用可能なＡｋｔ２阻害剤を本発明に使用することができる。例えば、Ａｋｔ２阻害剤は、小分子化合物、例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物であり得る。

【化1】

【0038】

あるいは、Ａｋｔ２阻害剤は、ｍＲＮＡ干渉ＲＮＡ分子であり得るし、またはＡｋｔ２タンパク質のアンタゴニスト、例えば、リガンド、アプタマーもしくは抗体であり得る。ある実施形態では、前記Ａｋｔ２阻害剤は、Ａｋｔ２タンパク質に対する抗体である。別の実施形態では、前記Ａｋｔ２阻害剤は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、例えば、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。二本鎖ＲＮＡは、限定されるものではないが、ｍＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、およびｔＲＮＡを含む、任意のタイプのＲＮＡであり得る。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、特定のＲＮＡおよび／またはタンパク質の産生を特異的に阻害するために特に有用である。本発明に好適なｄｓＲＮＡ分子の設計および産生は、特に、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０００）、ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ９９／５３０５０、ＷＯ９９／４９０２９およびＷＯ０１／３４８１５を参照して、当業者の技術の範囲内である。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡと同一の約１９～２３個の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含んでなる。用語「ｓｈＲＮＡ」とは、約５０個未満のヌクレオチドが同じＲＮＡ分子上の相補配列と対になっているｓｉＲＮＡ分子を指し、この配列と相補配列は、少なくとも約４～１５個のヌクレオチドの不対合領域によって分離されている（２塩基相補領域によって作り出されたステム構造上に一本鎖ループを形成する）。十分に確立されたｓｉＲＮＡ設計基準がある（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．、２００１；Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ ｅｔ ａｌ．、２００４；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．、２００４を参照）。詳細については、Ａｍｂｉｏｎ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔおよびＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅなどの供給業者を参照。いったん設計されると、本発明の方法に使用されるｄｓＲＮＡは、当技術分野で公知の任意の方法により、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、組換えまたは合成手段によって作り出され得る。ＳｉＲＮＡは、リコンビナーゼ（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼなど）およびＤＮＡオリゴヌクレオチド鋳型を用いることによってｉｎ ｖｉｔｒｏで作り出され得るし、またはｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、培養細胞で調製され得る。好ましい実施形態では、前記核酸分子は合成的に作り出される。

【0039】

本発明のある実施形態では、前記Ａｋｔ２阻害剤は、Ａｋｔ２選択的または特異的な阻害剤である。本発明では、阻害剤に使用する場合、用語「選択的」および「特異的」は、互換的に使用することができ、その阻害剤が標的だけに阻害効果を有するか、または他の化合物もしくは分子よりも標的に対して、例えば、少なくとも約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、１００００倍高いなど、高い阻害効果を有することを意味する。例えば、式（ＩＩ）のＣＣＴ１２８９３０（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）は、無細胞アッセイにおいて６ｎＭのＩＣ５０値を有し、密接に関連するＰＫＡキナーゼよりもＡｋｔ２に対して２８倍の高い選択性を示す有効なＡＴＰ競合的選択的Ａｋｔ２阻害剤である。本発明のある実施形態では、前記Ａｋｔ２阻害剤は式（ＩＩ）の化合物である。

【化2】

【0040】

本発明の別の実施形態では、前記Ａｋｔ２阻害剤は、例えば、配列番号７または８に記載の、干渉ＲＮＡ分子である。

【0041】

前記Ａｋｔ２阻害剤は、限定されるものではないが、別の生物学的小分子化合物および手術を含む別の治療薬または方法の前、その合間に、またはその後に、別の治療薬または方法と組み合せて投与することができる。

【0042】

別の態様では、本発明は、腫瘍、特に、Ａｋｔ２発現の上昇を特徴とするグルココルチコイド耐性腫瘍を治療するための医薬組成物であって、本発明のＡｋｔ２阻害剤およびグルココルチコイドと、所望により、薬学的に許容可能な担体、賦形剤および／または希釈剤とを含んでなる医薬組成物を提供する。

【0043】

本発明のある実施形態では、前記Ａｋｔ２阻害剤および／またはグルココルチコイドは、医薬組成物で処方され得る。この医薬組成物は、任意の好適な投与経路、例えば、経口、鼻腔、非経口、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、口内、吸入、粘膜内、または局所投与のために処方され得る。例えば、本発明の医薬組成物は、カプセル剤、丸剤、錠剤、散剤、顆粒剤（例えば、ビーズ、粒子または結晶）、エアゾール剤、スプレー剤、フォーム剤、液剤、分散剤、チンキ剤、シロップ剤、エリキシル剤、懸濁剤、軟膏剤およびクリーム剤などの当技術分野の任意の医薬投与形であり得る。この医薬組成物は、固体、液体、ゲルまたは他の形態として処方され得る。この組成物が経口投与のために処方される場合、それは錠剤またはカプセル剤、例えば、腸溶コーティング錠剤または腸溶コーティングカプセル剤として処方され得る。

【0044】

ある実施形態では、前記Ａｋｔ２阻害剤およびグルココルチコイドは、任意の好適な比で、本発明の医薬組成物に処方され得、例えば、グルココルチコイドとＡｋｔ２阻害剤とのモル濃度比は、１０：１～１：１０、例えば、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、または１：５である。ある実施形態では、本発明の医薬組成物におけるグルココルチコイド（デキサメタゾンなど）とＡｋｔ２阻害剤（ＣＣＴ１２８９３０など）のモル比は１：０．８である。

【0045】

本発明の医薬組成物は、例えば、限定されるものではないが、ラクトース、スクロース、デンプン、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、結晶セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、生理食塩水および水を含む薬学的に許容可能な担体、賦形剤および／または希釈剤とともに、添加剤、例えば、増量剤、結合剤、湿潤剤、流動助剤、安定剤、保存剤、乳化剤および別の溶媒または可溶化剤または保存効果のための物質を含んでなり得る。

【0046】

別の態様では、本発明は、腫瘍、特に、Ａｋｔ２発現の上昇を特徴とするグルココルチコイド耐性腫瘍を治療するための医薬組成物の調製のための本発明によるＡｋｔ２阻害剤の使用を提供する。ある実施形態では、前記医薬組成物は、Ａｋｔ２阻害剤およびグルココルチコイドと、所望により、薬学的に許容可能な担体、賦形剤および／または希釈剤とを含んでなる。

【0047】

本発明のある実施形態では、前記腫瘍は、リンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫またはＴ細胞リンパ腫などのリンパ腫または骨髄腫などのリンパ球由来腫瘍である。本発明のある実施形態では、前記腫瘍は、Ｔリンパ球性白血病、Ｔ細胞リンパ腫および骨髄腫などのＴ細胞由来腫瘍である。本発明のある実施形態では、前記リンパ球性白血病は、急性リンパ球性白血病および慢性リンパ球性白血病からなる群から選択される。本発明のある実施形態では、前記リンパ球性白血病は、Ｂ細胞リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫からなる群から選択される。本発明のある実施形態では、前記腫瘍は、骨髄腫である。本発明のある実施形態では、前記腫瘍は、バーキットリンパ腫、急性Ｔリンパ球性白血病などのＴリンパ球性白血病および骨髄腫からなる群から選択される。

【0048】

本発明のある実施形態では、前記Ｂ細胞リンパ腫は、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（ＭＡＬＴ）、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫および濾胞性リンパ腫などのホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される。

【0049】

本発明のある実施形態では、前記Ｔ細胞リンパ腫は、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、非定型（ＰＴＣＬ－Ｕ）血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、皮下脂肪組織炎様Ｔ細胞リンパ腫（ＳＣＰＴＣＬ）、皮膚γδＴ細胞リンパ腫（ＣＧＤ－ＴＣＬ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＣＬ）、および腸症型腸管Ｔ細胞リンパ腫（ＥＩＴＣＬ）からなる群から選択される。

【0050】

本発明のある実施形態では、前記腫瘍は急性Ｔリンパ球性白血病である。

【0051】

本発明では、前記グルココルチコイドは、腫瘍処置のために当業者によって使用され得る任意のグルココルチコイド様薬物である。本発明のある実施形態では、前記グルココルチコイドは、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、ベクロメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、酢酸コルチゾン、ブデソニド、二プロピオン酸ベクロメタゾン、シクレソニド、コルチゾン、メチルプレドニゾロン、酪酸クロベタゾール、フルオシノニド、二プロピオン酸ベクロメタゾン、フロ酸モメタゾン、ハルシノニド、プロピオン酸クロベタゾール、ハルシノニド、ハロメタゾン、二酢酸ジフロラゾンおよびそれらの誘導体からなる群から選択される。本発明のある実施形態では、前記グルココルチコイドは、デキサメタゾンまたはその誘導体である。

【0052】

本明細書において使用される場合、範囲および量は、特定の値または範囲の「約」として表され得る。用語「約」には、正確な量も含まれ得る。それに従って、用語「約５％」とは、「約５％」および「５％」を指す。

【0053】

本明細書において使用される場合、用語「任意選択の」または「所望により」とは、以下の記載される事象または状況が起こっても起こらなくてもよいことを意味し、その記載はその事象または状況が起こる例およびその事象または状況が起こらない例を含むことを意味する。例えば、任意選択の薬学的に許容可能な担体とは、その薬学的に許容可能な担体を含むまたは含まない場合を指す。

【実施例】

【0054】

以下の実施例により本発明をさらに説明するが、任意の例またはその組合せは、本発明の範囲または実装形態を限定するものと解釈されるべきではない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義され、特許請求の範囲に規定された範囲は、本明細書および当技術分野における常識と組み合わせて、当業者により明確に理解され得る。本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、当業者は本発明の技術的解決策に対する修飾または変更を行うことができ、そのような修飾および変更も本発明の範囲内に含まれる。

【0055】

実施例１：デキサメタゾン活性と、Ａｋｔ／ＦｏｘＯ３ａ経路におけるタンパク質の発現レベルとの相関
ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞（ヒト由来の急性Ｔリンパ球性白血病細胞株、中国科学アカデミー上海生化学細胞生物学研究所（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）から購入）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社）を添加したＲＰＭＩ １６４０完全培地（Ｇｉｂｃｏ社）が入った細胞培養皿（ＣＯＲＮＩＮＧ社）に１×１０^５細胞／ｍｌの密度で接種し、対数増殖期に達するまで、５％ＣＯ_２、３７℃のインキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ社）内で培養した；次いで、細胞培養皿に、デキサメタゾン（ＤＥＸ、Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（上海）Ｃｏ．、Ｌｔｄ．）を終濃度０．１μＭまたは１μＭに添加し、５％ＣＯ_２および３７℃でさらに４８時間培養し、細胞を回収した。対照群にはいずれの試薬も添加しなかった。総ての実験を３反復で行った。

【0056】

アネキシンＶ－ＦＩＴＣ ＰＩ二重染色法（フローサイトメトリーキット（ＦＩＴＣ、ＰＩ二重染色）、Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（上海）Ｃｏ．、Ｌｔｄ．））によりアポトーシスを検出し、回収した細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１３５ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４および８ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．２）で１回洗浄した；４×結合バッファーを脱イオン水で１×結合バッファーに希釈し、次いで、細胞を１９５μｌの１×結合バッファーで２～５×１０^５／ｍｌの細胞密度に再懸濁した；５μｌのアネキシンＶ－ＦＩＴＣを、１９５μｌの細胞再懸濁液に添加し、混合し、室温で１０分間、暗所でインキュベートした；細胞を２００μｌの１×結合バッファーで１回洗浄し、次いで、１９０μｌの１×結合バッファー中に再懸濁した；１０μｌのヨウ化プロピジウム（２０μｇ／ｍｌ）を添加した。フローサイトメトリー装置（Ｂｅｃｋｍａｎ社）を検出に使用し、Ｓｕｍｍｉｔソフトウエアを使用してアポトーシスの速度を分析した。

【0057】

ウエスタンブロットによるタンパク質検出：本発明の実施例では、Ａｋｔ抗体（ウサギ由来）、リン酸化Ａｋｔ抗体（ウサギ由来）、ＦｏｘＯ３ａ抗体（ウサギ由来）、リン酸化ＦｏｘＯ３ａ抗体（ウサギ由来）およびＧＡＰＤＨ抗体（ウサギ由来）および二次抗体は総てＣＳＴ社から購入した。細胞を遠心管に回収し、１０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を、４℃で予冷したＰＢＳで２回洗浄した；細胞溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ－４０、０．１％ＳＤＳ、２μｇ／ｍｌアプロチニン、２μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭバナジウム酸ナトリウム）を添加し、細胞を氷上で４０分間溶解させ、細胞溶解物を２００００ｒｐｍで、４℃で１５分間遠心分離し、上清を回収した；ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）ゲル電気泳動用のタンパク質ローディングバッファー（１．２５ｍＬ １ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．５ｇ ＳＤＳ、２５ｍｇ ＢＰＢ、２．５ｍＬグリセロール、５ｍＬ脱イオン水）を添加し、続いて、５分間煮沸を行って、タンパク質を変性させた；変性したタンパク質を含有するローディングバッファーを、１２０Ｖでの電気泳動のために１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥに適用し、その後、１３０Ｖで１．５時間、ＰＶＤＦ膜（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（上海）Ｃｏ．、Ｌｔｄ．）に転写した；膜転写が完了した後、ＰＶＤＦ膜を直ちにウエスタン洗浄溶液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５））で１～２分間洗い流した；５％脱脂粉乳（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を加え、穏やかに撹拌した後、室温で６０分間ブロックした；５％脱脂粉乳で適当に希釈した一次抗体を添加し、穏やかに撹拌しながら室温で一晩インキュベートした；一次抗体を回収し、膜を洗浄溶液で３回、それぞれ５～１０分間洗浄した；ウエスタン洗浄溶液で適当に希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体を添加し、穏やかに撹拌しながら室温で１時間インキュベートした；二次抗体を回収し、膜をウエスタン洗浄溶液で３回、それぞれ５～１０分間洗浄した。適当な量の現像液（ＤＡＢ ４ｍｇ、３０％過酸化水素１５μＬ、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．５）５ｍＬ）をＰＶＤＦ膜上に滴下し、生物発光画像比色計およびゲルイメージングシステム（Ｔｈｅｒｍｏ社）を使用して画像を検出し、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウエアを使用してバンドの定量分析を行った。

【0058】

ＥｘｃｅｌおよびＳｔａｔａソフトウエアを使用してデータ処理を行い、ｔ検定を用いてデータ比較を行い、Ｐ＜０．０５は統計的に有意であるとみなした。

【0059】

結果：図１Ａに示されるように、デキサメタゾン感受性ＣＣＲＦ－ＣＥＭでは、アポトーシスは、デキサメタゾン濃度の増加に伴って徐々に増加した。図１Ｂに示されるように、ブランク群と比較して、０．１μＭデキサメタゾンで処理した細胞におけるリン酸化Ａｋｔの発現は、有意にダウンレギュレートされ、リン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）／総Ａｋｔは有意に減少し（ｐ＜０．０５）；それに従って、リン酸化ＦｏｘＯ３ａ（Ｓｅｒ ２５３）の発現は減少し、総ＦｏｘＯ３ａ発現は増加し、リン酸化ＦｏｘＯ３ａ（Ｓｅｒ ２５３）／総ＦｏｘＯ３ａタンパク質は有意にダウンレギュレートされ（ｐ＜０．０５）；上記の変化はデキサメタゾン濃度の増加に伴ってより明白であった。

【0060】

従って、Ａｋｔは、リンパ球におけるリン酸化による不活性化ＦｏｘＯ３ａの主要な調節キナーゼであり、ＦｏｘＯ３ａは、デキサメタゾン誘導性リンパ球アポトーシス中に不可欠な関与物である。

【0061】

実施例２：Ａｋｔ経路の異常な活性化は、リンパ系腫瘍細胞においてグルココルチコイド耐性が生じる機構である
ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞を、５％ＣＯ_２および３７℃のインキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ社）内で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社）および１μＭデキサメタゾン（ＤＥＸ、Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（上海）Ｃｏ．、Ｌｔｄ．）を含有するＲＰＭＩ １６４０完全培地（Ｇｉｂｃｏ社）で培養し、８５％～９０％集密度に達したときに、培地の１／２～２／３をピペッティングし新鮮培地を添加することにより継代培養し、２０代目の細胞を、１μＭ、２５μＭ、５０μＭおよび１００μＭの濃度のデキサメタゾンで４８時間処理した。フローサイトメトリーによって検出されたアポトーシスは有意に増加せず、グルココルチコイド耐性細胞株ＣＥＭ－ＤＲが得られたことが示唆された。次いで、実施例１に記載のとおり、対数増殖期に達するようにＣＥＭ－ＤＲ細胞を培養し、異なる濃度のデキサメタゾンを添加した後、アネキシンＶ－ＦＩＴＣ ＰＩ二重染色によってアポトーシスを検出し、ウエスタンブロットによってタンパク質を検出した。Ｂｉｍ抗体（ウサギ由来）はＣＳＴ社から購入した。

【0062】

結果：図１Ｃに示されるように、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭの濃度のデキサメタゾンで処理した細胞のアポトーシスは有意に増加しなかった；しかし、２００μＭの濃度のデキサメタゾンで処理した場合、アポトーシスは有意に増加した。図１Ｄに示されるように、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞と比較して、ＣＥＭ－ＤＲ細胞において総Ａｋｔ発現は異常に上昇し、リン酸化ＦｏｘＯ３ａ（Ｓｅｒ２５３）の発現は異常に増加し、アポトーシスタンパク質Ｂｉｍの発現はダウンレギュレートされた。ＣＥＭ：ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞。

【0063】

感受性細胞株ＣＣＲＦ－ＣＥＭと比較することにより、ＣＥＭ－ＤＲ細胞において総Ａｋｔの異常な増加が見出された。

【0064】

実施例３：Ａｋｔ阻害剤はグルココルチコイドに対する感受性を有意に増強することができる
本発明者らは、Ａｋｔ阻害剤Ａｋｔ ＩＶおよび他の細胞増殖経路阻害剤のグルココルチコイド誘導性腫瘍細胞アポトーシスに対する感作効果を比較した。他の細胞増殖経路阻害剤としては、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２、Ｎｏｔｃｈ１経路阻害剤ｄａｐｔ（異常なＮｏｔｃｈ経路は、ホルモン誘導性アポトーシスに対する胸腺細胞耐性につながる可能性がある）、解糖阻害剤２－ＤＧ（研究により２－ＤＧはグルココルチコイドに対する感受性を高めることができることが確認されている）およびＳＧＫｓ経路（グルココルチコイド誘導性キナーゼ）阻害剤ＧＳＫを含む。

【0065】

方法：細胞ＣＣＲＦ－ＣＥＭ（ヒト由来の急性Ｔリンパ球性白血病細胞株）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｍｏｌｔ４（ヒト由来の急性Ｔリンパ球性白血病細胞株）、Ｄａｕｄｉ、Ｒａｊｉ（ヒト由来のバーキットリンパ腫細胞株）、Ｌ１２１０（マウス由来のリンパ芽球性白血病細胞株）およびＳＰ２／０（マウス由来の骨髄腫細胞株）は総て中国科学アカデミー上海生化学細胞生物学研究所から購入した。

【0066】

細胞を、対数増殖期に達するまで、５％ＣＯ_２および３７℃のインキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ社）内で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社）を含有するＲＰＭＩ １６４０完全培地（Ｇｉｂｃｏ社）で培養し、次いで、培養培地に、異なる濃度の阻害剤および／またはデキサメタゾン／エタノール／ＤＭＳＯを添加し、続いて、さらなる培養を行い（デキサメタゾン／エタノール／ＤＭＳＯの添加では４８時間、阻害剤の添加では２４時間）、実施例１に記載のとおり、アネキシンＶ－ＦＩＴＣ ＰＩ二重染色によってアポトーシスを検出し、ウエスタンブロットによってタンパク質を検出した。

【0067】

結果：図２Ａに示されるように、デキサメタゾン単独と比較して、Ａｋｔ阻害剤Ａｋｔ ＩＶ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）およびＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の両方が、デキサメタゾンによって誘導されるＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞のアポトーシスを有意に増加させた（ｐ＜０．０１）。（Ａｋｔ阻害剤：１μＭ；デキサメタゾン：１μＭ；ＬＹ２９４００２：３０μＭ；エタノール：０．１％）。図２Ｂ（エタノール：０．１％）に示されるように、唯一のデキサメタゾンの群と比較して、Ａｋｔ阻害剤＋デキサメタゾン群およびＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２＋デキサメタゾン群では、リン酸化ＦｏｘＯ３ａ（Ｓｅｒ ２５３）の発現はＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞において有意にダウンレギュレートされ、アポトーシス誘導因子Ｂｉｍの発現はアップレギュレートされた。図２Ｃに示されるように、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞株では、各濃度のＡｋｔ阻害剤は、デキサメタゾンによって誘導されるアポトーシスを増加させることができ、アポトーシス速度はＡｋｔ阻害剤の濃度の増加に伴って高まった。図２Ｅおよび２Ｆ（ＤＭＳＯ：０．１％）に示されるように、唯一のデキサメタゾンの群と比較して、高度グルココルチコイド耐性のヒト由来急性Ｔリンパ球性白血病細胞株Ｍｏｌｔ４およびＪｕｒｋａｔでは、デキサメタゾンと組み合せたＡｋｔ阻害剤またはＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２は細胞のアポトーシス速度を有意に増加させ（ｐ＜０．０１）、Ａｋｔ阻害剤は、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２よりも、デキサメタゾンとのより良好な相乗作用を示した（ｐ＜０．０１）。

【0068】

図２Ｇに示されるように、デキサメタゾン単独と比較して、解糖阻害剤２－ＤＧ（Ｓｉｇｍａ社）はデキサメタゾンによって誘導されるＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞のアポトーシスを有意に増加させた（ｐ＜０．０１）。図２Ｈに示されるように、デキサメタゾン単独と比較して、２－ＤＧ＋デキサメタゾン群では、リン酸化ＦｏｘＯ３ａの発現は低下し、総ＦｏｘＯ３ａ発現は増加し、アポトーシス誘導因子Ｂｉｍの発現は有意にアップレギュレートされた（ｐ＜０．０１）。

【0069】

図２Ｊに示されるように、デキサメタゾン単独と比較して、Ｎｏｔｃｈ１経路阻害剤ｄａｐｔ（Ｓｉｇｍａ社）はデキサメタゾンによって誘導されるＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞のアポトーシスを有意に増加させた（ｐ＜０．０１）。図２Ｉに示されるように、デキサメタゾン単独と比較して、ｄａｐｔ＋デキサメタゾン群においてリン酸化ＦｏｘＯ３ａの発現は有意に低下した。

【0070】

図２Ｋ（エタノール：０．１％）に示されるように、ヒト由来の急性Ｔリンパ球性白血病細胞株ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、マウス由来のＴリンパ芽球性白血病細胞株Ｌ１２１０、ヒト由来のバーキットリンパ腫細胞株ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉでは、デキサメタゾン群とＧＳＫ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）＋デキサメタゾン群との間ではアポトーシス速度に有意差はなかった（ｐ＞０．０５）、ＳＧＫｓ経路阻害剤はデキサメタゾンと相乗作用して腫瘍リンパ球のアポトーシスを増加させることができなかったことが示唆された

【0071】

上記細胞増殖経路阻害剤のグルココルチコイドに対する感作効果を比較することにより、図２Ｌに示されるように、Ａｋｔ阻害剤は他の細胞増殖経路阻害剤よりも有意に優れ、デキサメタゾンと組み合せてアポトーシスを誘導する効果が最も高かった（ｐ＜０．０１）。図２Ｍおよび２Ｎ（ＤＭＳＯ：０．１％）に示されるように、ネズミ由来の骨髄腫細胞株ＳＰ２／０およびヒト由来のバーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉでは、デキサメタゾン単独と比較して、デキサメタゾンと組み合せたＡｋｔ阻害剤は、細胞アポトーシスを有意に増加させ（Ｐ＜０．０１）、それによって、グルココルチコイドに対する感受性を高めた。

【0072】

実施例４：ヌードマウスにおけるグルココルチコイドに対するＡｋｔ阻害剤の感作効果
ヌードマウスＢａｌｂ／ｃ（復旦大学薬学研究所（ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）動物研究センターから購入）を復旦大学薬学研究所動物実験センター特定病原体フリー（ＳＰＦ）動物飼育室で飼育した。対数増殖期のＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞を回収し、無血清ＲＰＭＩ １６４０培地中に約１×１０^８／ｍｌの細胞密度に再懸濁した。４週齢の免疫不全雌ヌードマウスを選択し、０．１ｍｌ／マウス（約１×１０^７細胞／マウス）での細胞懸濁液の腋窩皮下注射により処置した。４週間成長させ、腫瘍サイズが３００～５００ｍｍ^３に達したら、実験のためにマウスをランダムにグループ分けした。マウスに０．１ｍｇ／マウスのデキサメタゾンと１．２５μｇ／マウスのＡｋｔ阻害剤とを、１日１回、連続して７日間腹膜内注射した。担癌マウスの全生存時間、腫瘍サイズおよび脾臓細胞アポトーシスを測定し、腫瘍に対して病理学的ＨＥ染色を行った。

【0073】

結果：図３Ａおよび３Ｂに示されるように、単独デキサメタゾン群と比較して、Ａｋｔ阻害剤は、デキサメタゾンと相乗作用を示して、皮下腫瘍のサイズを減少させた（ｐ＜０．０１）。図３Ｄに示されるように、単独デキサメタゾン群と比較して、デキサメタゾンと組み合せたＡｋｔ阻害剤は、担癌マウスの全生存期間を有意に増加させた（ｐ＜０．０５）。また、フローサイトメトリーのためにマウス脾臓リンパ球を単離し、その結果を図３Ｅに示した。単独デキサメタゾン群と比較して、担癌マウスにおける脾臓リンパ球のアポトーシスは有意に増加した（ｐ＜０．０１）。

【0074】

担癌マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ実験により、Ａｋｔ阻害剤がグルココルチコイドに対して有意な感作効果を示すことが再び確認された

【0075】

実施例５：Ａｋｔ阻害剤は重篤な肝臓毒性を有する
肝臓に対してＡｋｔ阻害剤ＩＶの毒性が存在するかどうかをさらに調べるために、マウスにおける末梢血肝臓酵素ＡＬＴおよびＡＳＴのレベルを測定した。

【0076】

方法：実施例４に記載のとおりに調製した担癌マウスの末梢血肝臓酵素ＡＬＴおよびＡＳＴのレベルを、０．１ｍｇ／マウスのデキサメタゾンと、１．２５μｇ／マウスのＡｋｔ阻害剤とを、１日１回、連続して７日間腹腔内注射した後に測定した（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｓｃｈｏｏｌ Ｐｌａｎｎｉｎｇ Ｔｅａｃｈｉｎｇ Ｍａｔｅｒｉａｌ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ （第２版））。

【0077】

結果：図３Ｆに示されるように、生理食塩水群（ＮＣ）と比較して、Ａｋｔ阻害剤で処置したマウスにおける肝臓酵素ＡＬＴおよびＡＳＴのレベルは有意に増加した（ｐ＜０．０５、０．０１）。それに従って、Ａｋｔ阻害剤は明らかな肝臓毒性を示した。このことは、臨床的適用の見通しに影響を及ぼす可能性がある。

【0078】

実施例６：グルココルチコイドと組み合せたＡｋｔ阻害剤によって誘導されるリンパ系腫瘍細胞アポトーシスに対する相乗作用の比較
実施例３に記載のとおり、細胞を、対数増殖期に達するまで、５％ＣＯ_２および３７℃下の１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ １６４０完全培地で培養し、次いで、培養培地に、デキサメタゾンおよび異なる濃度のＡｋｔ阻害剤を添加し、続いて、さらなる培養を行い（デキサメタゾン／ＤＭＳＯの添加では４８時間、阻害剤の添加では２４時間）、実施例１に記載のとおり、アネキシンＶ－ＦＩＴＣ ＰＩ二重染色によってアポトーシスを検出し、ウエスタンブロットによってタンパク質を検出し、さらに、ＣＣＫ－８法によって細胞生存率を検出した。

【0079】

ＣＣＫ－８（細胞計数キット（ＣＣＫ－８）キット、Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．）による細胞生存率の検出：（１）細胞を９６ウェルプレートのウェルに１×１０^４細胞／ウェル以下の密度で播種し（５反復）、各ウェルに２００μｌ培養培地を補充し、実験条件に従ってそれぞれのウェルに異なる濃度の薬物を添加し、続いて、５％ＣＯ_２および３７℃下のインキュベーター内で４８時間培養を行った；（２）光学密度（ＯＤ）の読み取りに影響を与え得るウェル内の気泡の形成を避けながら、１０μｌのＣＣＫ－８溶液を各ウェルに添加した；（３）プレートを、５％ＣＯ_２および３７℃下、インキュベーター内で４時間インキュベートした；（４）４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った；（５）細胞生存率の曲線をプロットした：下式に従って細胞生存率を計算し、その後、異なる薬物濃度または処理時間をｘ軸、細胞生存をＹ軸と設定し、プロットを作成した；
細胞生存率（％）＝［（Ａｓ－Ａｂ）／（Ａｃ－Ａｂ）］×１００％，
Ａｓ：試験ウェル（細胞、ＣＣＫ－８、毒性物質を含有する培地）
Ａｃ：対照ウェル（毒性物質を含まない、細胞、ＣＣＫ－８を含有する培地）
Ａｂ：ブランクウェル（細胞および毒性物質、ＣＣＫ－８を含まない培地）。

【0080】

結果：研究のために、Ａｋｔ１阻害剤Ａ－６７４５６３（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社）（Ａｋｔ１下流標的のリン酸化活性化を阻害する）、Ａｋｔ２阻害剤ＣＣＴ１２８９３０（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社）（Ａｋｔ２下流標的のリン酸化活性化を阻害する）およびＡｋｔ１／２共阻害剤Ａｋｔｉ－１／２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）（Ａｋｔ１およびＡｋｔ２の両方の自己リン酸化を阻害する）を使用して、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞を、０．３μＭ、０．５μＭ、０．８μＭおよび１μＭのＡｋｔサブタイプ阻害剤と組み合せた０．１μＭのデキサメタゾンで処理し、図４Ａに示されるように、結果は、アポトーシスに対する効果は、０．８μＭのＡｋｔサブタイプ阻害剤と組み合せた０．１μＭのデキサメタゾンで最も強力であることを示した。図４Ｂに示されるように、異なる濃度のデキサメタゾン（０．８μＭの濃度のＡｋｔ１阻害剤、Ａｋｔ２阻害剤、およびＡｋｔ１／２阻害剤の総て）では、Ａｋｔサブタイプ阻害剤は、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞の生存率を有意に阻害することができた。図４Ｃおよび４Ｄ（ＤＭＳＯ濃度：０．１％）に示されるように、単独デキサメタゾン群と比較して、Ａｋｔ阻害剤と組み合せたデキサメタゾンは、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞のアポトーシスを有意に増加させた（ｐ＜０．０１）。図４Ｅおよび４Ｆに示されるように、Ａｋｔ１阻害剤、Ａｋｔ２阻害剤およびＡｋｔ１／２阻害剤を適用することによって、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞の５０％生存率（ＩＣ５０値）を阻害するデキサメタゾンの濃度は、元の０．３μＭから、それぞれ、０．１８μＭ、０．１３μＭおよび０．０３μＭまで低下した。

【0081】

培養した高度耐性細胞株ＣＥＭ－ＤＲでは、図４Ｇ（０．８μＭの濃度のＡｋｔ１阻害剤、Ａｋｔ２阻害剤およびＡｋｔ１／２阻害剤の総て）に示されるように、総てのＡｋｔサブタイプ阻害剤は、異なる濃度のデキサメタゾンでの細胞生存率を有意に阻害することができた。図４Ｈ（ＤＭＳＯ濃度：０．１％）に示されるように、単独デキサメタゾン群と比較して、Ａｋｔサブタイプ阻害剤と組み合せたデキサメタゾンは、ＣＥＭ－ＤＲ細胞のアポトーシスを有意に増加させた（ｐ＜０．０１）。図４Ｉおよび４Ｎに示されるように、Ａｋｔ１阻害剤、Ａｋｔ２阻害剤およびＡｋｔ１／２阻害剤を適用することによって、ＣＥＭ－ＤＲ細胞の５０％生存率（ＩＣ５０値）を阻害するデキサメタゾンの濃度は、元の１３８μＭから、それぞれ、５５μＭ、２５μＭおよび１１μＭまで低下した。

【0082】

耐性のヒト由来Ｔリンパ球性白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔでは、図４Ｊ（ＤＭＳＯ濃度：０．１％）に示されるように、単独デキサメタゾン群と比較して、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、およびＡｋｔ１／２と組み合せたデキサメタゾンは、細胞アポトーシスを有意に増加させることができた（ｐ＜０．０５、０．０１、０．０１）；ＤＥＸ＋Ａｋｔ１群のアポトーシスは、ＤＥＸ＋Ａｋｔ２群のものより有意に低かった（ｐ＜０．０１）。図４Ｋおよび４Ｎに示されるように、Ａｋｔ１阻害剤、Ａｋｔ２阻害剤およびＡｋｔ１／２阻害剤を適用することによって、Ｊｕｒｋａｔ細胞の５０％生存率（ＩＣ５０値）を阻害するデキサメタゾンの濃度は、元の２２４μＭから、それぞれ、２０８μＭ、７４μＭおよび６３μＭまで低下した。

【0083】

耐性のヒト由来バーキット細胞株Ｄａｕｄｉでは、図４Ｌ（ＤＭＳＯ濃度：０．１％）に示されるように、単独デキサメタゾン群と比較して、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、およびＡｋｔ１／２と組み合せたデキサメタゾンは、細胞アポトーシスを有意に増加させることができた（ｐ＜０．０５、０．０１、０．０１）；図４Ｍおよび４Ｎに示されるように、Ａｋｔ１阻害剤、Ａｋｔ２阻害剤およびＡｋｔ１／２阻害剤を適用することによって、Ｄａｕｄｉ細胞の５０％生存率（ＩＣ５０値）を阻害するデキサメタゾンの濃度は、元の２２５μＭから、それぞれ、１８３μＭ、２１３μＭおよび１１８μＭまで低下した。

【0084】

それに従って、単独デキサメタゾン群と比較して、デキサメタゾンと組み合せたＡｋｔサブタイプ阻害剤は、デキサメタゾンのＩＣ５０値を低下させた。具体的には、Ｔリンパ系腫瘍細胞株（ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞株、ＣＥＭ－ＤＲ細胞株、Ｊｕｒｋａｔ細胞株）では、単独デキサメタゾン群と比較して、Ａｋｔサブタイプ阻害剤は、デキサメタゾンのＩＣ５０値を有意に低下させ、グルココルチコイドと著しい相乗作用を示し、Ａｋｔ２阻害剤およびＡｋｔ１／２阻害剤は、Ａｋｔ１阻害剤よりもグルココルチコイドと良好な相乗作用を示した。

【0085】

実施例７：リンパ球生存率の阻害に対する、グルココルチコイドと組み合せたＡｋｔサブタイプ阻害剤の組合せ指数の比較
ＣＣＫ－８法（ＣＣＫ－８キット）により、様々なリンパ球系に対する２種類の薬物（デキサメタゾンおよび阻害剤）の単独および組合せでの阻害効果を観察し、次いで、各薬物の半阻害濃度(the half-inhibitory concentration)を、メジアン効果式(the median effect equation)を用いて計算し、組合せに使用した２種類の薬物の組合せ指数（ＣＩ）を、ＣｏｍｐｕＳｙｎソフトウエアを使用して計算した。

【0086】

（１）対数増殖期のリンパ球を採取し、５×１０^４／ｍＬの細胞懸濁液にし、ブランク対照群（５ウェル）、デキサメタゾン群（各濃度につき３ウェル、３反復）、単一阻害剤群（各濃度につき３ウェル、３反復）、デキサメタゾン＋阻害剤群（各組合せ濃度につき３ウェル、３反復）を調製し、１８０μＬの懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、５％ＣＯ_２および３７℃のインキュベーター内で２４時間インキュベートした。

【0087】

（２）２種類の薬物を５つの異なる濃度で９６ウェルプレートに添加し、細胞の薬物耐性に基づいて、デキサメタゾンを５つの濃度で調製し、Ａｋｔ１阻害剤Ａ－６７４５６３（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社）、Ａｋｔ２阻害剤ＣＣＴ１２８９３０（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社）およびＡｋｔ１／２阻害剤Ａｋｔｉ－１／２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）を５つの濃度で調製した。細胞の薬物耐性に基づいて、２種類の薬物の比を固定した。デキサメタゾン群を４８時間培養し、一方、阻害剤群を２４時間培養した。

【0088】

（３）１０μｌのＣＣＫ－８を、各ウェルに加え、２時間培養し、自動マイクロプレートリーダーを使用して光学密度（ＯＤ）を４５０ｎｍで測定し、細胞に対する薬物の増殖阻害率を計算した。

【0089】

（４）下式に従って増殖阻害率を計算した：細胞増殖阻害率＝（１－試験群の平均ＯＤ値／対照群の平均ＯＤ値）×１００％、Ｃｈｏｕ－Ｔａｌａｌａｙ組合せ指数法により２種類の薬物間の相互作用の効果を分析した。

【0090】

結果：Ａｋｔサブタイプ阻害剤と組み合せたデキサメタゾンのＣＩの値は、ＣｏｍｐｕＳｙｎソフトウエアを使用して計算した。ＣＩ＜１は、２種類の薬物が相乗作用を有することを示し、ＣＩ＝１は、２種類の薬物が相加作用を有することを示し、ＣＩ＞１は、２種類の薬物が拮抗作用を有することを示した。表１に示されるように、Ｔリンパ系腫瘍細胞（ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞、ＣＥＭ－ＤＲ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞）では、デキサメタゾンと組み合せたＡｋｔサブタイプ阻害剤は、高い相乗作用を示し、リンパ系腫瘍細胞の生存率を有意に阻害した。Ａｋｔ２阻害剤およびＡｋｔ１／２阻害剤は、Ａｋｔ１阻害剤よりも有意に優れていた；Ｂリンパ腫細胞では、デキサメタゾンと組み合せたＡｋｔ１／２阻害剤は、中程度の相乗作用を示し、デキサメタゾンと組み合せたＡｋｔ２阻害剤は、相加作用を示し、デキサメタゾンと組み合せたＡｋｔ１阻害剤は、低い程度の相乗作用を示した。

【0091】

【表1】

【0092】

実施例８：リンパ球のグルココルチコイド誘導性アポトーシスを増強するためのＡｋｔ２阻害剤の機構：細胞内ＦｏｘＯ３ａ／Ｂｉｍシグナル伝達経路のアップレギュレーション
方法：ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞を、対数増殖期に達するまで、５％ＣＯ_２および３７℃のインキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ社）内で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社）を含有するＲＰＭＩ １６４０完全培地（Ｇｉｂｃｏ社）で培養し、次いで、培養培地に、ＤＭＳＯ、デキサメタゾンおよび異なる阻害剤（ＤＭＳＯ：０．１％、デキサメタゾン：０．１μＭ、阻害剤：０．８μＭ）を添加し、さらに培養し（デキサメタゾンまたはＤＭＳＯの添加では４８時間、阻害剤の添加では２４時間）、実施例１に記載のとおり、ウエスタンブロットによってタンパク質を検出した。

【0093】

結果：図５Ａに示されるように、Ａｋｔ１阻害剤で処理したＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞では、ｐ－Ａｋｔ１が効果的に阻害され、ｐ－Ａｋｔ２の代償的増加を伴った。Ａｋｔ２阻害剤で前処理した後、ｐ－Ａｋｔ１およびｐ－Ａｋｔ２の発現は細胞において増加した。Ａｋｔ２阻害剤は、Ａｋｔ２のリン酸化を阻害しないが、Ａｋｔの下流標的のリン酸化活性化を阻害し、ｐ－Ａｋｔ１の代償的増加をもたらした。Ａｋｔ１／２阻害剤はＡｋｔ自体のリン酸化活性化を阻害し、ｐ－Ａｋｔ１およびｐ－Ａｋｔ２の発現をＤＭＳＯ群と比較して減少させた；しかしながら、ｐ－Ａｋｔ１およびｐ－Ａｋｔ２の発現はＤＭＳＯ群においてほとんどなかったため、Ａｋｔ１／２群およびＤＥＸ＋Ａｋｔ１／２群におけるｐ－Ａｋｔ１およびｐ－Ａｋｔ２タンパク質のバンドは現れなかった。

【0094】

図５Ｂに示されるように、ＤＭＳＯ群と比較して、ＤＥＸ＋Ａｋｔ１群、ＤＥＸ＋Ａｋｔ２群およびＤＥＸ＋Ａｋｔ１／２群の細胞における総ＦｏｘＯ３ａタンパク質のレベルは有意にアップレギュレートされ（Ｐ＜０．０５、０．０１、０．０５）；ＤＥＸ群と比較して、ＤＥＸ＋Ａｋｔ１群、ＤＥＸ＋Ａｋｔ２群およびＤＥＸ＋Ａｋｔ１／２群の細胞における総ＦｏｘＯ３ａタンパク質のレベルは有意にアップレギュレートされなかった（ｐ＞０．０５）。図５Ｃに示されるように、ＤＥＸ群と比較して、ＤＥＸ＋Ａｋｔ２群およびＤＥＸ＋Ａｋｔ１／２群の細胞における総ＦｏｘＯ３ａタンパク質のレベルは有意にダウンレギュレートされ（ｐ＜０．０１）；ＤＥＸ＋Ａｋｔ１群とＤＥＸ群との間では細胞内ｐ－ＦｏｘＯ３ａタンパク質の発現に有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。図５Ｄに示されるように、ＤＭＳＯ群と比較して、ＤＥＸ＋Ａｋｔ２群およびＤＥＸ＋Ａｋｔ１／２群の細胞におけるアポトーシス誘導タンパク質Ｂｉｍのレベルは有意にアップレギュレートされ（ｐ＜０．０１）、ＤＥＸ＋Ａｋｔ１群とＤＥＸ群との間では細胞内タンパク質Ｂｉｍの発現に有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。

【0095】

細胞内のＦｏｘＯ３ａ／Ｂｉｍシグナル伝達経路に影響を及ぼすことにより、Ａｋｔ２阻害剤およびＡｋｔ１／２阻害剤は、細胞におけるｐ－ＦｏｘＯ３ａ／総ＦｏｘＯ３ａの比率を有意にダウンレギュレートし、アポトーシス誘導タンパク質Ｂｉｍの発現をアップレギュレートし、グルココルチコイドによって誘導されるリンパ球のアポトーシスを増加させ、それによって、グルココルチコイドに対する感作で役割を果たした。また、ウエスタンブロットの結果により、Ａｋｔ１阻害剤は、細胞内のＦｏｘＯ３ａ／Ｂｉｍシグナル伝達経路に有意に影響を及ぼさないことが確認された。これは、Ａｋｔ１阻害剤がグルココルチコイドに対するリンパ球の比較的弱い感作効果を有した理由の説明となった。

【0096】

実施例９：リンパ球におけるＡｋｔ２発現とグルココルチコイド耐性との関係
リアルタイム定量的ＰＣＲアッセイ
１．ｍＲＮＡプライマーの配列設計および合成
Ａｋｔ１およびＡｋｔ２プライマー配列は以下のとおりである：
Ａｋｔ１ センス鎖プライマー：５’－ＧＣＴＧＧＡＣＧＡＴＡＧＣＴＴＧＧＡ－３’（配列番号１）
アンチセンスプライマー：５’－ＧＡＴＧＡＣＡＧＡＴＡＧＣＴＧＧＴＧ－３’（配列番号２）
Ａｋｔ２ センス鎖プライマー：５’－ＧＧＣＣＣＣＴＧＡＴＣＡＧＡＣＴＣＴＡ－３’（配列番号３）
アンチセンスプライマー：５’－ＴＣＣＴＣＡＧＴＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＴ－３’（配列番号４）

【0097】

２．ＲＮＡ抽出
ＲＮＡｒｏｓｅ試薬の指示に基づいて、細胞の全ＲＮＡを抽出した：
（１）５×１０^６細胞を１ｍｌ ＴＲｌＺＯＬ試薬に加え、続いて、室温で５分間放置した；
（２）２００μｌのクロロホルムを添加し（クロロホルムとＲＮＡｒｏｓｅ試薬との比は１：５であった）、その後、１５秒間撹拌し、続いて、１５－３０℃で２～３分間放置した；
（３）得られた混合物を１２０００ｒｐｍで、４℃で１５分間遠心分離した；
（４）４００μｌの上方の水相を新しいＲＮアーゼフリー遠心管に移し、４０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．５）および１ｍｌの無水エタノールを添加し、続いて、－２０℃で４時間以上沈殿させ、全ＲＮＡを得た；
（５）生成物を１２，０００ｒｐｍで、４℃で１０分間遠心分離し、上清を廃棄した；
（６）ペレットを１０００μｌ（１：１）の７５％エタノールで洗浄し、続いて、－２０℃で一晩または次の工程のために放置した；
（７）生成物を１２，０００ｒｐｍで、４℃で５分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを真空乾燥または風乾させた；
（８）ＲＮＡを３０μｌのＲＮアーゼフリー水に溶解し、撹拌し、数秒間軽く遠心分離し、５５℃～６０℃で１０分間インキュベートし、その後、使用のために－７０℃の冷凍庫に入れた。；
（９）ＵＶ分光光度計を用いた核酸定量分析のために上記溶液を少量採取し、ＯＤ２６０およびＯＤ２８０の値を測定して全ＲＮＡの濃度および純度を決定し、ＲＮＡ濃度を調整し、１％アガロースゲル電気泳動により抽出物の質を観察した。ＲＴ－ＰＣＲによってｍＲＮＡ発現を検出した。

【0098】

３．ｃＤＮＡへのｍＲＮＡの逆転写
全ＲＮＡ １μｇ
ｄＮＴＰ（０．５ｍｍｏｌ） １０ｍＭ
ＲＴプライマー（２ｐｍｏｌ） １０μＭ
６５℃５分
氷上で２分
５×Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｂｕｌｌ ５μｌ
ＤＤＴ（５ｍＭ） ０．１Ｍ
ＲＮａｓｅＯｕｔ（４Ｕ） ４０Ｕ／μｌ
スーパースクリプトＴＭＩＩＩ逆転写酵素 １００Ｕ
水（容量５０μｌまで添加）
穏やかに混合
５５℃６０分
７０℃１５分
ｃＤＮＡ反応産物を得た。

【0099】

４．定量的ＰＣＲアッセイのよるｍＲＮＡ存在量の検出
上記逆転写からのｃＤＮＡを１：１０に希釈し、鋳型として使用し、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＡＢＩ社）を使用してリアルタイムＰＣＲ反応を行った。反応系は以下の通りであった。

【0100】

２×ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ １μｌ
センスプライマー（１００μＭ） １μｌ
アンチセンスプライマー（１００μＭ） １μｌ
ｃＤＮＡ鋳型 ２μｌ
水を全容量２０μｌまで加え、リアルタイムＰＣＲ分析装置７５００ｆａｓｔ（ＡＢＩ社）を使用した。反応条件は以下のとおりであった：
１）９４℃５分
２）９４℃３０秒
３）５５℃３０秒
４）７２℃３０秒
５）プレート読み取り
６）～２）４５サイクル繰返し
７）７２℃２分
８）融解曲線：６０℃～９５℃、０．５℃あたり９０秒保持、プレート読み取り。

【0101】

次いで、１８ｓ ｒＲＮＡを正規化内部基準として使用し、結果を、２^{－△△ｃｔ}法を用いて分析した。

【0102】

Ａｋｔ１、Ａｋｔ２ ＲＮＡ小干渉法：細胞トランスフェクション
トランスフェクション試薬としてＩｎｔｅｒｆｅｒｉｎ（商標）を用いて、トランスフェクト細胞を選択し、蘇生後３～５継代の間継代培養した。トランスフェクション手順はトランスフェクション試薬の指示に従って行った。要するに、対数増殖期の細胞を２×１０^５／ウェルで播種し、トランスフェクション中に細胞を新鮮な完全培地（抗生物質を含まない）と交換し、ｓｉＲＮＡをＯｐｔｉ－ＭＥＭで希釈し、適当な量のＩＮＴＥＲＦＥＲｉｎ（商標）を添加し、混合し、室温で１０分間インキュベートした後、細胞に滴下し、適当な時間に細胞を回収した。細胞に緑色フルオレセイン標識ｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ－ｓｉＲＮＡ）（終濃度２０μＭのｓｉＲＮＡ、１．２５μｌ／ウェル）をトランスフェクトし、２４時間後に蛍光顕微鏡を用いてトランスフェクション効率を観察した。トランスフェクションの２４時間後にデキサメタゾン群を添加し、続いて、さらに２４時間培養を行った後、観察のために細胞を回収した；対照群には等量の無水エタノールを添加した。

【0103】

Ａｋｔ１ ｓｉＲＮＡ： ＧＧＣＣＣＡＡＣＡＣＣＵＵＣＡＵＣＡＵＴＴ（配列番号５）
ＡＵＧＡＵＧＡＡＧＧＵＧＵＵＧＧＧＣＣＴＴ（配列番号６）
Ａｋｔ２ ｓｉＲＮＡ： ＧＧＵＵＣＵＵＣＣＵＣＡＧＣＡＵＣＡＡＴＴ（配列番号７）
ＵＵＧＡＵＧＣＵＧＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴ（配列番号８）

【0104】

結果：図５Ｅに示されるように、グルココルチコイド感受性ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞におけるＡｋｔ２タンパク質の発現は非常に低く、Ａｋｔ２タンパク質のバンドは現れなかった；ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞由来の高度耐性細胞株ＣＥＭ－ＤＲでは、細胞におけるＡｋｔ２タンパク質の発現は、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞と比較して有意に増加し、Ａｋｔ２タンパク質のバンドは明らかに現れた；他の２つのグルココルチコイド耐性細胞株ＪｕｒｋａｔおよびＤａｕｄｉならびに正常肝細胞株Ｌ－０２におけるＡｋｔ２タンパク質の発現は、感受性細胞株ＣＣＲＦ－ＣＥＭのものよりも有意に高かった。

【0105】

図５Ｆおよび５Ｇに示されるように、小干渉ＲＮＡを使用して、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＡｋｔ１およびＡｋｔ２の発現それぞれを妨害した。図５Ｈに示されるように、デキサメタゾン群と比較して、デキサメタゾンによって誘導された、Ａｋｔ２発現の阻害を受けたＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスは、有意に増加し（ｐ＜０．０１）、Ａｋｔ１発現の阻害を受けたＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスは増加しなかった（ｐ＞０．０５）。ＮＣ：対照群、ｓｉＲＮＡを含まないエンプティプラスミドをトランスフェクトした。

【0106】

初回治療を受けた患者１０例および難治性再発性急性リンパ芽球性白血病を有する患者１１例（グルココルチコイドを含む化学療法レジメンを受け、平均７．２の治療コース後に難治性再発した）において、骨髄性リンパ球におけるＡｋｔ１ ｍＲＮＡおよびＡｋｔ２ ｍＲＮＡのレベルを測定した；図５Ｉに示されるように、初回治療群と比較して、難治性再発群におけるＡｋｔ２ ｍＲＮＡの発現は有意に上昇し（ｐ＜０．０１）、Ａｋｔ１ ｍＲＮＡの発現に有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。ＲＯＣ曲線分析によれば、図５Ｊに示されるように、Ａｋｔ２は、患者におけるグルココルチコイド耐性の程度を検出するためのマーカーとして使用され、ＲＯＣ曲線下面積は０．９８１８であり、最良判定閾値は１６．３９であり、診断感度は９０％であり、特異性は１００％であった。

【0107】

それに従って、本発明者らは、細胞におけるＡｋｔ２の過剰発現が、リンパ球におけるグルココルチコイド耐性を引き起こす重要な機構であり得ることを見出した：リン酸化を通じてＦｏｘＯ３ａを不活性化し、ｐ－ＦｏｘＯ３ａ／総ＦｏｘＯ３ａ比をアップレギュレートし、アポトーシス誘導因子Ｂｉｍの発現をダウンレギュレートすることによって、アップレギュレートされたＡｋｔ２は、細胞内ＦｏｘＯ３ａ／Ｂｉｍシグナル伝達経路を阻害し、グルココルチコイド耐性の発達につながった。

【0108】

実施例１０：肝細胞に対するＡｋｔ１阻害剤およびＡｋｔ２阻害剤の毒性効果の比較
Ｌ－０２ヒト由来の健康な肝細胞株は、中国科学アカデミー上海生化学細胞生物学研究所から購入した。ヌードマウスは、復旦大学薬学研究所動物研究センターから購入し、復旦大学薬学研究所動物実験センター特定病原体フリー（ＳＰＦ）動物飼育室で飼育した。

【0109】

実施例６および７に記載のとおりにＣＣＫ－８アッセイを行い、実施例１および２に記載のとおりにウエスタンブロットを行った。

【0110】

対数増殖期のＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞を回収し、無血清ＲＰＭＩ １６４０培地中に約１×１０^８／ｍｌの細胞密度で再懸濁した。４週齢の免疫不全雌ヌードマウスを選択し、０．１ｍｌ／マウス（約１×１０^７細胞／マウス）の量の細胞懸濁液の腋窩皮下注射により処置した。４週間成長させ、腫瘍サイズが３００～５００ｍｍ^３に達したら、実験のためにマウスをランダムにグループ分けした。マウスに０．１ｍｇ／マウスのデキサメタゾンと１．２５μｇ／マウスのＡｋｔ１阻害剤、Ａｋｔ２阻害剤またはＡｋｔ１／２阻害剤とを、１日１回、連続して７日間腹膜内注射した。８日目に、血液サンプルを眼窩から採取し、その後、末梢血検査のために上海動物試験センター（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ）に送った。

【0111】

結果：Ｌ０２肝細胞株の試験結果を図６Ａ～６Ｆに示した。ＤＭＳＯ：０．１％；ＤＥＸ：０．１μＭ；Ａｋｔ１阻害剤、Ａｋｔ２阻害剤およびＡｋｔ１／２阻害剤：０．８μＭ。

【0112】

図６Ａに示されるように、デキサメタゾンは肝細胞に損傷を与えなかった；Ａｋｔ１阻害剤は、肝細胞に最も重篤な損傷を示し、肝細胞活性は投与後４８時間以内に回復しなかった；Ａｋｔ１／２阻害剤は肝細胞にある程度の損傷を示し、肝細胞活性は１２時間投与後に５０．５％まで低下し、２４時間投与後に肝細胞活性は徐々に回復した；Ａｋｔ２阻害剤は肝細胞への損傷が最も少なく、肝細胞活性は６時間投与後に５６．１％に低下し、６時間投与後に肝細胞活性は徐々に回復し、２４時間投与後、この群の肝細胞活性はＡｋｔ１阻害剤群およびＡｋｔ１／２阻害剤群の両方よりも常に高かった。

【0113】

図６Ｂに示されるように、Ｌ－０２細胞をＡｋｔ１阻害剤またはＡｋｔ２阻害剤で前処理した後、細胞におけるｐ－Ａｋｔ１およびｐ－Ａｋｔ２の発現はそれに対応して増加した。図６Ｃに示されるように、ＤＭＳＯ群と比較して、ＤＥＸ＋Ａｋｔ１群、ＤＥＸ＋Ａｋｔ２群およびＤＥＸ＋Ａｋｔ１／２群の細胞における総ＦｏｘＯ３ａタンパク質のレベルは総て有意にアップレギュレートされた（ｐ＜０．０５、０．０１、０．０５）。図６Ｄに示されるように、ＤＭＳＯ群と比較して、ＤＥＸ＋Ａｋｔ１群、ＤＥＸ＋Ａｋｔ２群およびＤＥＸ＋Ａｋｔ１／２群の細胞における総ＦｏｘＯ３ａタンパク質の発現は有意にダウンレギュレートされた（ｐ＜０．０５、０．０５、０．０５）。図６Ｅに示されるように、ＤＭＳＯ群と比較して、ＤＥＸ＋Ａｋｔ２群およびＤＥＸ＋Ａｋｔ１／２群の細胞におけるアポトーシス誘導タンパク質Ｂｉｍの発現は有意にアップレギュレートされ（ｐ＜０．０５）、ＤＥＸ＋Ａｋｔ１群とＤＭＳＯ群との間では細胞内タンパク質Ｂｉｍの発現に有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。肝細胞株Ｌ－０２をＡｋｔサブタイプ阻害剤で２４時間処理した後、図６Ｆに示されるように、ＤＥＸ＋Ａｋｔ２群の細胞生存率は、ＤＥＸ＋Ａｋｔ１群およびＤＥＸ＋Ａｋｔ１／２群のものよりも有意に高かった（ｐ＜０．０１、０．０５）。上記の結果は、２４時間の投与後、肝細胞におけるＡｋｔ２シグナル伝達は阻害されたが、デキサメタゾンはＦｏｘＯ３ａによるＢｉｍの発現を誘導して、部分的アポトーシスを引き起こすことができ、一方、Ａｋｔ１阻害剤およびＡｋｔ１／２阻害剤は、肝細胞活性の阻害の点で、Ａｋｔ２阻害剤に比べてより強力であり、これは、Ａｋｔ１標的阻害による細胞の成長および増殖に関連するｍＴＯＲ経路の阻害によって引き起こされる可能性があり、肝細胞活性に対してより大きい効果がもたらされることを示唆した。Ａｋｔ２の主な標的であるＦｏｘＯ３ａ／Ｂｉｍ経路の阻害もまた、グルココルチコイド誘導性肝細胞アポトーシスを調節し、肝細胞活性にある程度の効果をもたらす可能性があるが、肝細胞活性に対するこのプロセスの効果は、Ａｋｔ１／ｍＴＯＲ経路の阻害から得られるものよりもわずかであり、ｐ－Ａｋｔ１の代償的増加は、Ａｋｔ１／ｍＴＯＲシグナル伝達経路を増強して、肝細胞活性の回復を可能にし得る。

【0114】

ヌードマウスにおけるＡｋｔサブタイプ阻害剤の毒性を調べた。図６Ｇに示されるように、ＮＣ群と比較して、Ａｋｔ１／２阻害剤で処置したマウスにおけるＡＬＴのレベルは有意に増加した（ｐ＜０．０１）。図６Ｈに示されるように、ＮＣ群と比較して、Ａｋｔ１阻害剤およびＡｋｔ１／２阻害剤で処置したマウスにおけるＡＳＴのレベルは有意に増加した（ｐ＜０．０５）。図６Ｉに示されるように、ＮＣ群と比較して、Ａｋｔ１阻害剤およびＡｋｔ１／２阻害剤で処置したマウスにおけるＴＢＩＬのレベルは有意に増加した（ｐ＜０．０１、０．０５）。図６Ｊおよび６Ｍ～６Ｏに示されるように、ＮＣ群と比較して、ＤＥＸ群、ＤＥＸ＋Ａｋｔ１群、ＤＥＸ＋Ａｋｔ２群およびＤＥＸ＋Ａｋｔ１／２群における末梢血白血球、血小板、クレアチニンおよび血糖レベルに有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。図６Ｋ～６Ｌに示されるように、ＮＣ群と比較して、ＤＥＸ群、ＤＥＸ＋Ａｋｔ１群、ＤＥＸ＋Ａｋｔ２群およびＤＥＸ＋Ａｋｔ１／２群における末梢血ＲＢＣおよびＨＧＢのレベルは有意に増加し、これは、グルココルチコイドの刺激による貯蔵プールから循環プールへの赤血球の移動によって起こり、末梢血赤血球数の増加がもたらされる可能性がある。ＮＣ：対照群、生理食塩水を注射した。

【0115】

また、心臓、肺、腎臓および肝臓を含む、各群の担癌マウスの重要な器官の病理学的標本を調製し、続いて、病理学的切片化およびＨＥ染色を行った。図８Ａおよび８Ｂに示されるように、各群の担癌マウスの肝細胞は変性または壊死のない正常形態に見え、線維組織の増殖は観察されず、肝細胞間マトリックスにおいて炎症細胞浸潤は観察されなかった。図８Ｃに示されるように、各群の担癌マウスの心筋細胞は正常形態に見え、心筋細胞間マトリックスにおいて炎症細胞浸潤は観察されなかった。図８Ｄに示されるように、各群の担癌マウスは、良好な肺胞充満および正常な肺胞細胞形態を呈し、肺胞腔に明白な出血または滲出はなかった。図８Ｅに示されるように、各群の担癌マウスは、正常な糸球体構造および管状構造を呈し、メサンギウム細胞増殖はなく、腎間質物質において炎症細胞浸潤は観察されなかった。上記の病理学的結果は、Ａｋｔ１およびＡｋｔ１／２サブタイプ阻害剤は、肝細胞にある程度の損傷をもたらし、マウスの末梢血肝臓酵素および総ビリルビンのレベルを増加させるが、阻害剤は７日の投与期間内に肝臓組織の形態学的変化を引き起こさなかったことを示唆した。

【0116】

実施例１１：担癌マウスにおけるＡｋｔサブタイプ阻害剤のグルココルチコイド感作効果のｉｎ ｖｉｖｏでのバリデーション
対数増殖期のＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞を回収し、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地中に約１×１０^８／ｍｌの細胞密度で再懸濁した。４週齢の免疫不全雌ヌードマウスを選択し、０．１ｍｌ／マウス（約１×１０^７細胞／マウス）の細胞懸濁液の腋窩皮下注射により処置し、４週間成長させ、腫瘍サイズ３００～５００ｍｍ^３に到達させたら、実験のためにマウスをランダムにグループ分けした。マウスに０．１ｍｇ／マウスのデキサメタゾンと１．２５μｇ／マウスのＡｋｔ１阻害剤、Ａｋｔ２阻害剤またはＡｋｔ１／２阻害剤とを、１日１回、連続して７日間腹膜内注射した。担癌マウスの全生存期間、腫瘍サイズおよび脾臓サイズを測定し、腫瘍の病理学的切片はＨＥ染色およびＫｉ－６７染色について得、脾臓の病理学的切片はＨＥ染色、ＣＤ３染色、およびＴｄＴ染色について得た。

【0117】

結果：図７Ａおよび７Ｂに示されるように、ＮＣ群（生理食塩水を注射した）と比較して、ＤＥＸ＋Ａｋｔ１群、ＤＥＸ＋Ａｋｔ２群およびＤＥＸ＋Ａｋｔ１／２群の腫瘍サイズは有意に減少した（ｐ＜０．０１、０．０１、０．０１）；ＤＥＸ群と比較して、ＤＥＸ＋Ａｋｔ２群およびＤＥＸ＋Ａｋｔ１／２群の腫瘍サイズは有意に減少し（ｐ＜０．０１、０．０５）、ＤＥＸ＋Ａｋｔ１群の腫瘍サイズは有意に減少しなかった（ｐ＞０．０５）。

【0118】

図７Ｃに示されるように、ＮＣ群と比較して、ＤＥＸ群、ＤＥＸ＋Ａｋｔ１群、ＤＥＸ＋Ａｋｔ２群およびＤＥＸ＋Ａｋｔ１／２群の脾臓サイズは有意に減少した（ｐ＜０．０１、０．０１、０．０１、０．０１）；ＤＥＸ群と比較して、ＤＥＸ＋Ａｋｔ２群の脾臓サイズは有意に減少し（ｐ＜０．０５）、ＤＥＸ＋Ａｋｔ１群およびＤＥＸ＋Ａｋｔ１／２群の脾臓サイズは有意に減少しなかった（ｐ＞０．０５、０．０５）。

【0119】

図７Ｄに示されるように、ＤＥＸ＋Ａｋｔ２群およびＤＥＸ＋Ａｋｔ１／２群における担癌マウスの全生存期間はＤＥＸ群のものよりも長かった（ｐ＜０．０５、０．０１）。

【0120】

それに従って、Ａｋｔサブタイプ阻害剤は、ｉｎ ｖｉｖｏでグルココルチコイドと相乗作用して、リンパ球のアポトーシスを効果的に促進することができ、グルココルチコイド感作に対するＡｋｔサブタイプ阻害剤の効果は有意であり、Ａｋｔ２阻害剤およびＡｋｔ１／２阻害剤の間では、Ａｋｔ１阻害剤より良好な感作効果を示した。

【0121】

結論：
１．感受性細胞株と比較して、細胞内Ａｋｔ２の発現は、グルココルチコイド耐性腫瘍リンパ球系において有意に増加した。リンパ球におけるＡｋｔ２の発現の差異は、グルココルチコイドに対する感受性の程度にある程度まで影響を及ぼしかつ反映し得、細胞におけるＡｋｔ２タンパク質の過剰発現は、リンパ球におけるグルココルチコイド耐性を生じる重要な機構であり得、Ａｋｔ２は、リンパ腫におけるグルココルチコイド耐性逆転のより正確な治療標的として使用し得る。Ａｋｔ２はまた、リンパ球がグルココルチコイド耐性であるか否かを診断するための指標としても使用し得る。

【0122】

２．Ｔリンパ系腫瘍細胞では、Ａｋｔ２サブタイプ阻害剤がグルココルチコイド誘導性リンパ球アポトーシスの感受性を有意に増加させた。薬剤耐性細胞株では、Ａｋｔ２サブタイプ阻害剤とグルココルチコイドとの組合せが、良好な相乗作用を示し、グルココルチコイド耐性を逆転させることができた。

【0123】

３．Ａｋｔ２サブタイプ阻害剤は、細胞内ｐ－ＦｏｘＯ３ａ／総ＦｏｘＯ３ａ比を有意にダウンレギュレートし、アポトーシス誘導タンパク質Ｂｉｍの発現をアップレギュレートし、細胞内ＦｏｘＯ３ａ／Ｂｉｍシグナル伝達経路を増強し、それによって、グルココルチコイドに対するリンパ球の感受性を高めることによって、グルココルチコイド誘導性リンパ球アポトーシスを改善することができた。

【0124】

４．ｉｎ ｖｉｖｏ試験およびｉｎ ｖｉｔｒｏ試験の両方により、Ａｋｔ２サブタイプ阻害剤が、最小限の毒性を有し、マウスの血液系、肝機能、腎機能および血糖レベルに影響を及ぼさないことが確認された。

【0125】

５．Ａｋｔ２サブタイプ阻害剤は、デキサメタゾンと相乗作用して、担癌マウスの腫瘍サイズおよび脾臓サイズを効果的に減少させ、腫瘍の液状化および壊死を引き起こし、全生存期間を増加させることができた；Ａｋｔ２サブタイプ阻害剤は、グルココルチコイドに対する最良の感作および最小限の毒性副作用を示す薬剤である。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7-1】

【図7-2】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【配列表】

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