特許 7303743 細胞を樹状細胞または抗原提示細胞にリプログラムするための組成物、その方法および使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-06-27

(45)【発行日】2023-07-05

(54)【発明の名称】細胞を樹状細胞または抗原提示細胞にリプログラムするための組成物、その方法および使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20230628BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20230628BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20230628BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20230628BHJP

   C12N 15/863 20060101ALI20230628BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20230628BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20230628BHJP

   C12N 15/19 20060101ALI20230628BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20230628BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230628BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20230628BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230628BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230628BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230628BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20230628BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20230628BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12 ZNA

C12N15/85 Z

C12N15/86 Z

C12N15/861 Z

C12N15/863 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/867 Z

C12N15/19

C12N15/113 120Z

C12N5/10

A61K31/711

A61K48/00

A61P35/00

A61P35/02

A61P25/28

A61P37/02

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2019524083

(86)(22)【出願日】2018-04-05

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-05-07

(86)【国際出願番号】 IB2018052378

(87)【国際公開番号】W WO2018185709

(87)【国際公開日】2018-10-11

【審査請求日】2021-04-01

(31)【優先権主張番号】110012

(32)【優先日】2017-04-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】PT

(31)【優先権主張番号】17171166.6

(32)【優先日】2017-05-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】110263

(32)【優先日】2017-08-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】PT

(31)【優先権主張番号】110267

(32)【優先日】2017-08-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】PT

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】520008382

【氏名又は名称】アスガード セラピューティクス エービー

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(72)【発明者】

【氏名】リベイロ レモス ペレイラ，カルロス フィリペ

(72)【発明者】

【氏名】フェレイラ ピレシュ，クリスチアーナ

(72)【発明者】

【氏名】フィウザ ロサ，ファビオ アレクサンドレ

【審査官】小田 浩代

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１６／１２０６５１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Schonheit J. et al.，PU.1 level-directed chromatin structure remodeling at the Irf8 gene drives dendritic cell commitment，Cell Rep.，2013年，Vol. 3(5)，pp. 1617-1628

【文献】Laiosa CV. et al.，Reprogramming of committed T cell progenitors to macrophages and dendritic cells by C/EBP alpha and PU.1 transcription factors，Immunity，2006年，Vol. 25(5)，pp. 731-744

【文献】Schraml BU. et al.，Genetic tracing via DNGR-1 expression history defines dendritic cells as a hematopoietic lineage，Cell，2013年，Vol. 154(4)，pp. 843-858

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ１／００－１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８、およびＰＵ．１である、３種の転写因子をコードする３つのポリヌクレオチド配列の組み合わせを含む、１つまたは複数の構築物またはベクター。

【請求項2】

前記３種の転写因子は、
ａ）配列番号１または配列番号２（ＢＡＴＦ３）、
ｂ）配列番号５または配列番号６（ＩＲＦ８）、および
ｃ）配列番号７または配列番号８（ＰＵ．１）
からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列によりコードされる、
請求項１に記載の１つまたは複数の構築物またはベクター。

【請求項3】

前記３種の転写因子の組み合わせが、５’から３’に向かって以下の順：
ＰＵ．１、ＩＲＦ８、ＢＡＴＦ３；または
ＩＲＦ８、ＰＵ．１、ＢＡＴＦ３
である、請求項１または２に記載の１つまたは複数の構築物またはベクター。

【請求項4】

前記１つまたは複数のベクターが、ウイルスベクターである、請求項１～３のいずれか１項に記載の１つまたは複数のベクター。

【請求項5】

前記１つまたは複数のベクターが、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される、請求項４に記載の１つまたは複数のベクター。

【請求項6】

医療において使用するための、ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８およびＰＵ．１である３種の転写因子をコードする３つのポリヌクレオチド配列の組み合わせを含む構築物またはベクターを含む組成物。

【請求項7】

癌、神経変性疾患、加齢疾患、および感染性疾患からなる群から選択される疾患の治療において使用するための、ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８およびＰＵ．１である３種の転写因子をコードする３つのポリヌクレオチド配列の組み合わせを含む１つまたは複数の構築物またはベクターを含む組成物。

【請求項8】

前記癌は、悪性腫瘍、早期癌、基底細胞癌、子宮頸部異形成、軟組織肉腫、生殖細胞腫瘍、網膜芽細胞腫、ホジキンリンパ腫、血液癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、膣癌、乳癌、上咽頭癌、気管癌、喉頭癌、気管支癌、細気管支癌、肺癌、食道癌、胃癌、胆管癌、腸癌、結腸癌、大腸癌、直腸癌、膀胱癌、尿管癌、腎臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、脾臓癌、脳癌、リンパ系癌、骨癌、膵臓癌、白血病、皮膚癌、および骨髄腫からなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

薬物スクリーニングにおける使用のための、ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８およびＰＵ．１である３種の転写因子をコードする３つのポリヌクレオチド配列の組み合わせを含む１つまたは複数の構築物またはベクターを含む組成物。

【請求項10】

免疫療法における使用のための、ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８およびＰＵ．１である３種の転写因子をコードする３つのポリヌクレオチド配列の組み合わせを含む１つまたは複数の構築物またはベクターを含む組成物。

【請求項11】

樹状細胞に細胞をリプログラミングまたは誘導するための方法であって、
ａ）細胞に、ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ８およびＰＵ．１である３種の転写因子をコードする３つのポリヌクレオチド配列を含む１つまたは複数のベクターを形質導入するステップと、
ｂ）前記形質導入された細胞を、樹状細胞の生育を支援する細胞培地中で培養するステップと
を含む、方法。

【請求項12】

前記３種の転写因子の組み合わせが、５’から３’に向かって以下の順：
ＰＵ．１、ＩＲＦ８、ＢＡＴＦ３、または
ＩＲＦ８、ＰＵ．１、ＢＡＴＦ３
である、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記形質導入するステップが、免疫刺激性サイトカインをコードする核酸配列および／またはＩＬ－１０を標的とするｓｉＲＮＡをコードする核酸配列を含む少なくとも１種のベクターをさらに含む、請求項１１または１２に記載の方法。

【請求項14】

前記細胞が、分化細胞、内胚葉由来細胞、中胚葉由来細胞、外胚葉由来細胞、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、腸幹細胞を含む複能性幹細胞、線維芽細胞、臍帯血幹細胞、並びに癌細胞および細胞株からなる群から選択されるか、または前記細胞はヒトもしくはマウス線維芽細胞、またはホ乳動物臍帯血幹細胞である、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

技術分野
本開示は、単離された転写因子を導入および発現することにより、分化細胞、複能性または多能性幹細胞から、抗原提示能を有する樹状細胞または抗原提示細胞を作製する方法の開発に関する。より詳細には本開示は、転写因子の組み合わせの驚くべき使用による直接的な細胞リプログラミングにより、分化細胞、複能性または多能性幹細胞を樹状細胞または抗原提示細胞の状態にリダイレクトするための方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

背景
細胞リプログラミングは、１つの細胞状態のエピジェネティックかつ転写性のネットワークを異なる細胞型のネットワークに再接続することに依存する。転写因子（ＴＦ）形質導入実験により、成体体細胞または分化細胞の可塑化が強調され、任意の望ましい細胞型を生成する新規な技術が提供された。ＴＦの強制的発現により、体細胞または分化細胞を、胚性幹細胞と著しく類似した誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）にリプログラミングすることが可能である（１、２）。あるいは体細胞は、別の特別な細胞型に変換することも可能である（３）。ＴＦを用いて標的細胞の同一性を特定することで、直接的な系譜変換が、マウスおよびヒト線維芽細胞を神経細胞、心筋細胞および肝細胞などの複数の細胞型にリプログラミングするのに有効であることが立証された（４）。系譜変換は、造血系でも実証されており、ＴＦの強制的発現はＢ細胞および線維芽細胞におけるマクロファージの運命を誘導し（５）、クローン原性造血前駆体へのマウス線維芽細胞の直接的リプログラミングはＧａｔａ２、Ｇｆｉ１ｂ、ｃＦｏｓおよびＥｔｖ６で実現される（６）。これらの４種のＴＦは、内皮様の中間体を通して進む動的多段階血液生成工程を誘導し、インビトロで発達的な造血を再現する（７）。

【0003】

リプログラミングされた細胞は、再生医療にとって非常に有望な治療ツールであり、ｉＰＳＣの分化により得られた細胞は、既に臨床試験でテストされている。しかし造血系の再生の場合、ｉＰＳＣから成熟血液細胞を生成するアプローチが、依然として欠けている。それゆえ、血液製剤として使用され得る患者特有の最終的な造血細胞を生成するために、代替的な方策が求められている。ＴＦに媒介される直接的細胞リプログラミングの機会を条件に、樹状細胞（ＤＣ）などの免疫系の抗原提示細胞（ＡＰＣ）の生成を見通すことができる。

【0004】

ＤＣは、必要となる可溶性および膜結合性の共刺激分子の全てと共に、表面上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と複合化したペプチド抗原を表示することにより、Ｔ細胞応答を活性化することが可能なプロフェッショナルＡＰＣである。ＤＣは、一次免疫応答を誘導して、予めプライミングされたＴリンパ球のエフェクター機能を強化して、自然免疫と適応免疫とのコミュニケーションを組織化する。ＤＣは、ほとんどの組織に見出されるが、そこでそれらは、抗原環境を連続的に試し、複数の型の受容体を使用して侵入した病原体についてモニタリングする。安定した状態、および病原体検出速度の上昇時に、非リンパ組織中のセンチネルＤＣ（ｓｅｎｔｉｎｅｌ ＤＣ）が、リンパ器官に遊走し、そこでそれらが回収および処理した抗原をＴ細胞に提示する。Ｔ細胞により獲得された表現型は、ＤＣがその抗原を提示する状況に依存する。抗原が、病原体に由来する場合、または抗原そのものが損傷されている場合、ＤＣは、危険なシグナルを受け取って活性化し、その後、Ｔ細胞は、刺激されて、防御免疫を提供するのに必要なエフェクターになる。

【0005】

適応免疫を誘導するＤＣの能力が、細菌、ウイルスおよび寄生虫病原体、ならびに癌免疫療法のためのＤＣワクチン方策についての研究を拡大した。事実、固形および血液腫瘍をはじめとする複数の腫瘍型にＤＣ介在性免疫療法を使用した臨床試験が、続行中である（８）。しかし、その臨床転帰は、おそらくインビトロでＤＣを生成することにおける可変的な効率に関連して一定せず、自家性の単球は、低効率なＤＣの原因となり、造血前駆体は、非常に少数で単離される。加えてこれらの前駆細胞は一般に、癌を担持する患者では損傷されていて、機能不全のＤＣを生成する（８、９）。癌回避の機構も、ＤＣを基にした免疫療法に一定した治療的利点が欠如することの背景にあるかもしれない。腫瘍進行の間に、癌細胞は、複数の免疫工程を開拓して、免疫サーベランスを回避する。これらの適応性が、癌の抗原多様性と一緒になって、免疫系による腫瘍抗原認識を防止し、結果的に腫瘍細胞の免疫原性および現行の免疫療法の低減を担っている。

【0006】

直接的リプログラミングによるＡＰＣの生成は、ＤＣの詳細および細胞同一性をよりよく理解する新たな機会を切り開き、自家性の遺伝子操作細胞を利用した免疫応答のより効率的な制御に寄与する。

【0007】

本開示が取り組んだ技術的問題を例示するために、これらの事実を開示している。

【発明の概要】

【0008】

本発明の主題は、驚くべきことに、分化細胞、複能性または多能性幹細胞をインビトロ、エクスビボまたはインビボで樹状細胞にリプログラミングまたは誘導する複数の単離された転写因子を同定する。

【0009】

驚くべきことに、本開示に記載されたリプログラミングにより生成された誘導樹状細胞は、脾臓ＤＣ（天然のＤＣ）よりも生来成熟しており、抗原提示のための外因性活性化刺激にあまり依存しない。

【0010】

ＤＣは、自然免疫系および適応免疫系の境界で機能する、体全体に存在するプロフェッショナルＡＰＣである。ＤＣは、抗原を捕捉して処理し、Ｔ細胞に提示して、そのＴ細胞に異なる型の免疫応答または寛容を標的とさせる能力を通して、外部環境と適応免疫系の間の重大なつながりを提供することができる。最初にＤＣは、抗原を捕捉し、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩを通してそれらを処理しなければならない。それらの活性化の後、ＤＣは、適応免疫の重要な特色である複数のＢ細胞およびＴ細胞応答をプライミングする局所流入リンパ節に向かって遊走することができる。早期の防御有効性が、主としてＢリンパ球により産生された抗原特異性抗体の誘導により付与される。特異的抗原に対する長期防御には、続く抗原暴露後に急速かつ効率的応答を提供し得る特異的抗体の持続および免疫記憶の生成が必要となる。プロフェッショナルＡＰＣとしてのＤＣは、抗原を交差提示する能力を有し、つまり、ＭＨＣクラスＩＩで外来抗原を、そしてＭＨＣクラスＩで内因性抗原を提示する古典的能力に加えて、ＭＨＣクラスＩでも外来抗原を提示することができ、それが細胞傷害性Ｔリンパ球応答（ＣＴＬ）の生成のための重大なステップとなる。

【0011】

ＤＣが存在する個体発生プロセスおよび／または微細環境が、ＤＣによる表面受容体の異なる組み合わせの発現をもたらす場合がある。例えば表現型基準のみで、マウスＤＣを異なる部分集団に分類することができる。これらのうち、リンパ組織中の従来型ＤＣは、伝統的にｃＤＣ１およびｃＤＣ２の部分集団に細分される。異なるＤＣサブセットが、特定の病原体の特異的認識に関与し、かつ／または異なる免疫応答、例えば、Ｔｈ１もしくはＴｈ２（免疫）または制御性Ｔ細胞（寛容）を調節し得ることが主張されてきた。しかし、ＤＣの表現型および機能的挙動は、外部活性化刺激によっても著しく条件づけられ、著しい可塑性を表す。ｃＤＣ１およびｃＤＣ２サブセットは、インビボでＴｈ１およびＴｈ２を差次的にプライミングする。癌の免疫療法は、ＤＣを用いてＴｈ１または細胞傷害性Ｔリンパ球応答をプライミングし、腫瘍クリアランスを促進することに依存する。

【0012】

現在のところ、ＤＣを基にした免疫療法は、自家性ＤＣ前駆体、つまり低効率のＤＣの産生に関連する単球または非常に少数で単離される造血前駆体に依存する。加えて、これらの前駆細胞は一般に、癌を担持する患者では損傷されていて、機能不全のＤＣを生成する。対照的に、線維芽細胞などの非造血細胞型は通常、影響を受けない。ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）もまた、他の競合する利点を示し、即ち、小さな皮膚パンチバイオプシーから容易に得られ、インビトロでは数回の継代で容易に増大し（４週間後に１５００～２０００万細胞）、凍結保存して要求に応じて使用することができる。自然免疫系と適応免疫系の境界で機能するＡＰＣとしてのＤＣの基本的役割を想定すれば、機能的ＤＣを作製して抗原特異性免疫応答をプライミングする代替的方策を見出す臨床的必要性が、依然として存在する。

【0013】

本開示の一態様は、
インビトロ、エクスビボまたはインビボでの樹状細胞または抗原提示細胞への、幹細胞もしくは分化細胞、またはそれらの混合物からなるリストから選択される細胞のリプログラミングまたは誘導因子として、
ＢＡＴＦ３（配列番号１または配列番号２）、ＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）、ＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）、ＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）、
からなるリストの配列と９０％同一の配列によりコードされた少なくとも２種の単離された転写因子の組み合わせを含む組成物に関する。

【0014】

幾つかの実施形態において、配列表に提供された配列によりコードされた参照ポリペプチドと同一または類似の活性を有するポリペプチド変異体またはファミリーメンバーを、本明細書に記載された組成物、方法およびキットにおいて用いることができる。一般に、本明細書に記載された組成物、方法およびキットにおける使用のためのＤＣ誘導因子をコードする特定のポリペプチドの変異体は、本明細書に記載されていて当業者に公知の配列アライメントプログラムおよびパラメータによる計測で、特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％以上の配列同一性を有する。

【0015】

比較のための配列アライメントの方法は、当該技術分野で周知であり、そのような方法としては、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡが挙げられる。ＧＡＰでは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８：４４３－４５３）のアルゴリズムを利用して、マッチの数を最大にしてギャップの数を最小にする２つの配列のグローバル（配列全体にわたる）アライメントを見出す。ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３－１０）では、２つの配列の間の配列同一性％を算出して、類似性の統計解析を実施する。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国立生物工学情報センター）（ＮＣＢＩ）を通して公的に入手することができる。類似性および同一性の全体的パーセンテージは、ＭａｔＧＡＴソフトウエアパッケージにおいて入手される方法の１つを利用して決定されてもよい（Ｃａｍｐａｎｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００３ Ｊｕｌ１０；４：２９．ＭａｔＧＡＴ：タンパク質またはＤＮＡ配列を用いて類似性／同一性マトリクスを作成するアプリケーション）。当業者に明白な通り、わずかなマニュアル編集を実施して、保存されたモチーフの間のアライメントを最適化してもよい。本発明の主題においてパーセンテージとして示される配列同一性は、デフォルトパラメータを含むＢＬＡＳＴを用いてアミノ酸配列全体で決定されている。

【0016】

より良好な結果のための一実施形態において、単離された転写因子の組み合わせは、
ＢＡＴＦ３（配列番号１または配列番号２）およびＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）；またはＢＡＴＦ３（配列番号１、配列番号２）およびＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）；またはＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）およびＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）；またはＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）およびＢＡＴＦ３（配列番号１、配列番号２）；またはＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）およびＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）；またはＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）およびＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）；またはＢＡＴＦ３（配列番号１、配列番号２）、ＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）およびＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）；またはＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）、ＢＡＴＦ３（配列番号１、配列番号２）およびＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）；またはＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）、ＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）およびＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）；またはＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）、ＢＡＴＦ３（配列番号１、配列番号２）、ＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）およびＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）
であってもよい。

【0017】

一実施形態において、本開示の単離された転写因子は、獣医学またはヒト医療において、特に免疫療法において、または神経変性疾患もしくは癌もしくは感染性疾患において、用いられてもよい。

【0018】

より良好な結果のための一実施形態において、該細胞は、多能性幹細胞、複能性幹細胞、分化細胞、腫瘍細胞、癌細胞、およびそれらの混合物からなるリストから選択されてもよい。特定のホ乳動物細胞において、より特別にはマウスまたはヒト細胞において。

【0019】

より良好な結果のための一実施形態において、本開示の単離された転写因子は、樹状細胞への、多能性幹細胞、複能性幹細胞または分化細胞、およびそれらの混合物からなるリストから選択される細胞のリプログラミングまたは誘導因子として使用されてもよい。

【0020】

より良好な結果のための一実施形態において、本開示の単離された転写因子は、抗原提示細胞への、腫瘍細胞、癌細胞、およびそれらの混合物からなるリストから選択される細胞のリプログラミングまたは誘導因子として使用されてもよい。

【0021】

本開示の別の態様は、
インビトロ、エクスビボまたはインビボでの樹状細胞または抗原提示細胞への、幹細胞もしくは分化細胞、またはそれらの混合物からなるリストから選択される細胞のリプログラミングまたは誘導因子として、
ＢＡＴＦ３（配列番号１または配列番号２）、ＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）、ＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）、ＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）、およびそれらの混合物からなるリストの配列と少なくとも９０％同一、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または同一である少なくとも２種の配列の組み合わせの使用である。

【0022】

好ましくは、該組み合わせは、ＢＡＴＦ３（配列番号１または配列番号２）、ＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）、ＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）、ＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）、およびそれらの混合物からなるリストから選択されてもよい。より好ましくは、該単離された転写は、以下の組み合わせを含むことができる：ＢＡＴＦ３（配列番号１または配列番号２）およびＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）；またはＢＡＴＦ３（配列番号１、配列番号２）およびＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）；またはＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）およびＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）；またはＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）およびＢＡＴＦ３（配列番号１、配列番号２）；またはＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）およびＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）；またはＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）およびＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）；またはＢＡＴＦ３（配列番号１、配列番号２）、ＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）およびＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）；またはＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）、ＢＡＴＦ３（配列番号１、配列番号２）およびＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）；またはＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）、ＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）およびＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）；またはＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）、ＢＡＴＦ３（配列番号１、配列番号２）、ＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）およびＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）。

【0023】

本開示の別の態様は、本発明の主題に記載される少なくとも１種の単離された転写因子をコードする構築物またはベクターに関する。

【0024】

より良好な結果のための一実施形態において、該構築物またはベクターは、５’から３’に向かって以下の配列順：ＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）、ＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）、ＢＡＴＦ３（配列番号１、配列番号２）；またはＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）、ＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）、ＢＡＴＦ３（配列番号１、配列番号２）、の３種の単離された転写因子の組み合わせであってもよい。

【0025】

一実施形態において、該ベクターは、ウイルスベクター、特にレトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、またはアデノ随伴ウイルスベクターである。

【0026】

より良好な結果のための一実施形態において、該形質導入ステップは、ＩＬ－１２をコードする核酸配列；ＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸配列；ＩＬ－７をコードする核酸配列；ＩＬ－１０ＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡをコードする核酸配列、およびそれらの混合物からなるリストから選択される少なくとも１種のベクターをさらに含む。

【0027】

より良好な結果のための一実施形態において、ステップの該形質導入は、免疫刺激性サイトカインをコードする核酸を含む少なくとも１種のベクターをさらに含む。

【0028】

本開示の別の態様は、
幹細胞または分化細胞、およびそれらの混合物からなるリストから選択される細胞に、ＢＡＴＦ３（配列番号１または配列番号２）、ＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）、ＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）、ＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）、およびそれらの混合物からなるリストの配列と少なくとも９０％同一である、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または同一である配列をコードする少なくとも２つの核酸配列を含む１つまたは複数のベクターを形質導入するステップと、
該形質導入された体細胞を、樹状細胞または抗原提示細胞の生育を支援する細胞培地中で培養するステップと、
を含む樹状細胞または抗原提示細胞に幹細胞または分化細胞をリプログラミングまたは誘導するための方法に関する。

【0029】

好ましくはより良好な結果のために、単離された転写因子の組み合わせは、以下のコードされた組み合わせから選択される：ＢＡＴＦ３（配列番号１または配列番号２）およびＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）；またはＢＡＴＦ３（配列番号１、配列番号２）およびＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）；またはＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）およびＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）；またはＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）およびＢＡＴＦ３（配列番号１、配列番号２）；またはＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）およびＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）；またはＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）およびＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）；またはＢＡＴＦ３（配列番号１、配列番号２）、ＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）およびＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）；またはＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）、ＢＡＴＦ３（配列番号１、配列番号２）およびＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）；またはＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）、ＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）およびＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）；またはＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）、ＢＡＴＦ３（配列番号１、配列番号２）、ＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）およびＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）。

【0030】

より良好な結果のための一実施形態において、該構築物またはベクターは、５’から３’に向かって以下の配列順：ＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）、ＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）、ＢＡＴＦ３（配列番号１、配列番号２）；またはＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）、ＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）、ＢＡＴＦ３（配列番号１、配列番号２）、の少なくとも３種の単離された転写因子の組み合わせであってもよい。

【0031】

より良好な結果のための一実施形態において、細胞が、単離された転写因子の複数を形質導入されて、少なくとも２日間、好ましくは少なくとも５日間、より好ましくは少なくとも８日間、より好ましくは９日間培養されてもよい。

【0032】

より良好な結果のための一実施形態において、該形質導入ステップは、ＩＬ－１２をコードする核酸配列；ＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸配列；ＩＬ－７をコードする核酸配列；ＩＬ－１０ＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡをコードする核酸配列、およびそれらの混合物からなるリストから選択される少なくとも１種のベクターをさらに含んでいてもよい。

【0033】

より良好な結果のための一実施形態において、該細胞は、多能性幹細胞、または複能性幹細胞、分化細胞、およびそれらの混合物からなる群から選択されてもよい。特に、内胚葉由来細胞、中胚葉由来細胞、または外胚葉由来細胞、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、腸幹細胞などの複能性幹細胞、多能性幹細胞、腫瘍または癌細胞および細胞株からなる群から選択されてもよい。

【0034】

より良好な結果のための一実施形態において、該細胞は、非ヒト細胞、好ましくはマウスまたはヒト細胞であってもよく、より好ましくは細胞は、ヒトもしくはマウス線維芽細胞、またはホ乳動物臍帯血幹細胞である。

【0035】

本開示の別の態様は、本開示に記載された方法により得られる誘導樹状細胞または抗原提示細胞に関する。

【0036】

本開示の別の態様は、本開示に記載された方法により得られる誘導抗原提示細胞に関する。特に誘導抗原提示細胞は、癌抗原、自己抗原、アレルゲン、病原性および／または感染性生物体からの抗原を提示することが可能である。

【0037】

本開示の別の態様は、治療有効量の、本開示に記載された少なくとも１種の単離された転写因子、または本開示に記載された誘導樹状細胞、または本開示に記載された誘導抗原提示細胞、またはそれらの混合物と、医薬的に許容できる賦形剤と、を含む組成物に関する。

【0038】

好ましい実施形態において、該組成物は、獣医学またはヒト医療、特に免疫療法、または神経変性疾患、または癌もしくは感染性疾患における使用であってもよい。

【0039】

好ましい実施形態において、該組成物は、抗ウイルス薬、鎮痛薬、抗炎症薬、化学療法薬、放射線療法薬、抗生物質、利尿剤またはそれらの混合物をさらに含んでいてもよい。

【0040】

好ましい実施形態において、該組成物は、充填剤、結合剤、崩壊剤もしくは滑沢剤、またはそれらの混合物をさらに含んでいてもよい。

【0041】

好ましい実施形態において、該組成物は、皮内および経皮治療における使用であってもよい。

【0042】

好ましい実施形態において、該組成物は、注射製剤、特にインサイチュでの注射としての使用であってもよい。

【0043】

好ましい実施形態において、該組成物は、獣医学またはヒト医療、特に免疫療法、または神経変性疾患の処置もしくは治療、または癌の処置もしくは治療、または感染性疾患の処置もしくは治療における使用であってもよい。

【0044】

好ましい実施形態において、該組成物は、中枢および末梢神経系障害の処置、治療または診断における使用であってもよい。

【0045】

好ましい実施形態において、該組成物は、新生物、特に癌、即ち固形または血液腫瘍の処置、治療、診断における使用であってもよい。

【0046】

好ましい実施形態において、該組成物は、良性腫瘍、悪性腫瘍、早期癌、基底細胞癌、子宮頸部異形成、軟組織肉腫、生殖細胞腫瘍、網膜芽細胞腫、加齢黄斑変性、ホジキンリンパ腫、血液癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、膣癌、乳癌、上咽頭癌、気管癌、喉頭癌、気管支癌、細気管支癌、肺癌、中空臓器癌、食道癌、胃癌、胆管癌、腸癌、結腸癌、大腸癌、直腸癌、膀胱癌、尿管癌、腎臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、脾臓癌、脳癌、リンパ系癌、骨癌、膵臓癌、白血病、皮膚癌、または骨髄腫の処置、診断または治療における使用であってもよい。

【0047】

好ましい実施形態において、該組成物は、真菌、ウイルス、クラミジア、細菌、ナノバクテリア、または寄生虫感染性疾患の処置、治療または診断における使用であってもよい。

【0048】

好ましい実施形態において、該組成物は、ＨＩＶ、ＳＡＲＳコロナウイルス、アジア風邪ウイルス、単純ヘルペス、帯状疱疹、肝炎、またはウイルス性肝炎の感染の治療または診断における使用であってもよい。

【0049】

好ましい実施形態において、該組成物は、アミロイド疾患、特にアミロイドＡ（ＡＡ）アミロイドーシス、アルツハイマー病、軽鎖（ＡＬ）アミロイドーシス、２型糖尿病、甲状腺の髄質癌、パーキンソン病、多発ニューロパシー、または海綿状脳症（クロイツフェルト・ヤコブ病）の処置、治療または診断における使用であってもよい。

【0050】

本開示の別の態様は、本開示に記載された少なくとも１種の単離された転写因子、または本開示に記載された誘導樹状細胞、または本開示に記載された誘導抗原提示細胞、またはそれらの混合物を含む組成物を含む癌のためのワクチンに関する。

【0051】

以下の成分：本開示に記載された少なくとも１種の単離された転写因子、または本開示に記載された誘導樹状細胞、または本開示に記載された誘導抗原提示細胞、本開示に記載された組成物、または本開示に記載されたベクター、または本開示に記載された構築物、またはそれらの混合物を含む組成物、のうちの少なくとも１つを含むキット。

【0052】

本開示の一態様は、樹状細胞誘導ための、または細胞を抗原提示樹状細胞（ＤＣ）にリプログラミングするための、組成物、方法およびキットに関する。幾つかの実施形態において、該組成物は、少なくとも１種のＤＣ誘導因子を含む。そのような組成物、方法およびキットは、本明細書に記載された通りインビトロ、エクスビボ、またはインビボで樹状細胞を誘導するために用いることができ、これらの誘導樹状細胞（ｉＤＣ）は、免疫療法に用いることができる。

【0053】

樹状細胞誘導ための、または細胞を本開示の樹状細胞にリプログラミングするための、組成物、方法およびキットは、樹状細胞状態への分化細胞の直接的リプログラミングを可能にする転写因子の新規組み合わせの利用に一部基づく。そのような組成物、核酸構築物、方法およびキットは、本明細書に記載された通りインビトロ、エクスビボ、またはインビボで樹状細胞を誘導するために用いることができ、これらの誘導樹状細胞は、免疫療法に用いることができる。

【0054】

一実施形態において、本開示は、免疫系の調節に関し、特に標的抗原への免疫応答をプライミングするためにリプログラミングされた樹状細胞の使用に関する。

【0055】

一実施形態において、得られた樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩ抗原標的に対してＴ細胞を活性化させる抗原提示細胞である。癌、ウイルス、細菌および寄生虫感染は全て、リプログラミングされた樹状細胞により改善される。リプログラミングされた樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩ経路を介して細胞外抗原を交差提示することができるため、それらは、細胞傷害性Ｔリンパ球応答の生成に特に適する。

【0056】

一実施形態において、線維芽細胞における強制的発現により、ＢＡＴＦ３（配列番号１または配列番号２）、ＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）、ＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）、ＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）、およびそれらの混合物からなるリストから選択される単離された転写因子（または外来転写因子）は、Ｃｌｅｃ９ａ ＤＣ特異性レポーター、ＤＣ形態、および従来型ＤＣ１型（ｃＤＣ１）転写プログラムの活性化を誘導する。誘導樹状細胞（ｉＤＣ）は、細胞表面のｃＤＣ１マーカーである主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）－ＩおよびＩＩ、ならびに共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０を発現する。ｉＤＣは、粒子を貪食し、ＬＰＳまたはｐｏｌｙ Ｉ：Ｃでのチャレンジの際に、炎症性サイトカインを分泌することができる。ｉＤＣはＣＤ４＋Ｔ細胞に抗原を提示し、ＣＤ８＋Ｔ細胞に抗原を交差提示する。

【0057】

一実施形態において、線維芽細胞における強制的発現により、ＢＡＴＦ３（配列番号１または配列番号２）、ＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）、ＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）からなるリストから選択される単離された転写因子（または外来転写因子）は、典型的なＤＣマーカーであるＣＬＥＣ９ＡおよびＨＬＡ－ＤＲの発現、ならびにＤＣ形態を誘導する。誘導樹状細胞（ｉＤＣ）は、粒子および可溶性タンパク質を貪食することができる。この開示は、癌および細胞感染のための強力な新規処置、ならびに種々の診断アッセイおよび細胞スクリーニングアッセイを提供する。

【0058】

一実施形態において、癌細胞株における強制的発現により、ＢＡＴＦ３（配列番号１または配列番号２）、ＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）、ＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）からなるリストから選択される単離された転写因子（または外来転写因子）は、細胞表面でのＣｌＥＣ９ＡおよびＭＨＣ－ＩＩの発現を誘導する。

【0059】

一実施形態において、ＣＬＥＣ９Ａは、樹状細胞のサブセットｃＤＣ１で優先的に発現される。これは、細胞の外部から得られる抗原を処理すること、およびＭＨＣクラスＩ分子を介して該抗原をＴ細胞に提示することができるため、重要な細胞型である。これは、ＭＨＣクラスＩＩ分子を介して細胞外由来抗原を提示するほとんどの抗原提示細胞と対照的である。その結果、抗原提示のこのメカニズムは、「交差提示」と称されることがある。それゆえこれらの細胞は、細胞内病原体、例えばウイルスおよび癌に対する免疫応答の本質的部分であるＣＴＬの応答の生成および刺激において重要な役割を担う。

【0060】

一実施形態において、ｉＤＣを介して刺激された免疫応答は、ＣＴＬまたはヘルパーＴ細胞であり得るＴ細胞の増殖を含む。抗原提示細胞（そして特にｉＤＣ）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の両方の増殖を誘導することができ、任意の所与の免疫応答において両方の型のＴ細胞の増殖を刺激することができる。

【0061】

一実施形態において、ｉＤＣは、少なくともＴｈ１、Ｔｈ２、およびＴｈ１７型免疫応答に関係し得る。したがって本発明の方法は、任意の抗原に対する様々な型の免疫応答の刺激に適用されてもよい。しかしこれらの細胞は、ＣＴＬ応答の生成において特に重要であると考えられ、そのため刺激される免疫応答は、好ましくはＣＴＬ応答である。該方法は、典型的にはＣＤ８を発現するＴ細胞であり、ＭＨＣクラスＩ分子に関連して同族抗原を示す細胞に対する細胞傷害活性が可能である、ＣＴＬの生成および／または増殖を決定することを含んでいてもよい。

【0062】

それゆえ、ｉＤＣは、癌、またはウイルス感染などの細胞内寄生虫もしくは病原体による感染などのＣＴＬ応答を誘導することが望ましい任意の病状の予防および／または処理のために用いられてもよい。

【0063】

それにもかかわらず、修飾されている場合のｉＤＣは、ＣＴＬに加えて、またはその代わりに、ヘルパーＴ細胞の増殖をもたらすことができる。したがって該方法は、追加または代わりとして、ヘルパーＴ細胞の生成および／または増殖を計測することを含んでいてもよい。該ヘルパーＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞であってもよく、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７またはＴｒｅｇ型であってもよい。

【0064】

特定の状況下では、ｉＤＣは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）増殖を刺激することができると考えられる。Ｔｒｅｇ細胞は、Ｆｏｘｐ３（フォークヘッドボックスｐ３）転写因子の発現を特徴とする。ほとんどのＴｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ２５＋であり、ヘルパーＴ細胞のサブセットと見なすことができるが、小数集団は、ＣＤ８＋かもしれない。したがって本開示の方法により刺激される免疫応答は、抗原に応答してＴｒｅｇ細胞の増殖を誘導することを含んでいてもよい。Ｔｒｅｇ細胞が抗原に対する免疫系の他の細胞の応答を他の方法で、例えばそれらの活性を阻害または抑制することによりモジュレートすることが可能であることを条件として、全体としての免疫系に及ぼす効果は、抗原に対する応答をモジュレート（例えば、抑制または阻害）することであり得る。したがって本発明のこの態様の方法は、それと同時に、抗原に対する免疫応答をモジュレートする方法と呼ぶことができる。これは、（例えば）自己免疫疾患の処置において特に有用であり得る。

【0065】

ｉＤＣは、抗原特異性応答を促進するであろう。該抗原は、免疫応答、特にＣＴＬ応答を上昇させながらＴｈ１７応答またはＴｒｅｇ応答も上昇させることが望ましい任意のタンパク質またはその断片であってもよい。これらは、癌細胞、および細胞内病原体または寄生虫を含有する細胞など、ＣＴＬ応答を刺激することが望ましい細胞に関連する抗原、該細胞に発現、提示または分泌される抗原を挙げることができる。例えば該抗原は、細胞内病原体もしくは寄生虫（ウイルスタンパク質など）により発現されるタンパク質からの、または癌もしくは腫瘍細胞により発現されるタンパク質からの、エピトープペプチドであっても、またはそれを含んでいてもよい。したがって該抗原は、腫瘍特異性抗原であってもよい。用語「腫瘍特異性」抗原は、固形腫瘍からの抗原に制限されると解釈すべきでなく、任意の癌性細胞、形質転換細胞または悪性細胞により特異的に発現される抗原を包含すると解釈すべきである。

【0066】

それゆえ本発明は、プライミングされた抗原提示細胞またはその集団を提供する。「プライミングされた」は、細胞が抗原と接触しており、ＭＨＣ分子、好ましくはＭＨＣ Ｉ分子に関連して抗原またはそのエピトープを提示し、Ｔ細胞を活性化または刺激してそれに応答してエフェクター細胞を増殖および分化させることができる、という意味である。

【0067】

用語「抗原」は、当該技術分野で十分に理解されており、免疫原性物質および抗原エピトープを包含する。任意の抗原の使用が、本発明における使用に想定されること、したがって非限定的に自己抗原（正常であるか、疾患関連かにかかわらず）、感染性抗原（例えば、微生物抗原、ウイルス抗原など）、または一部の他の外来抗原（例えば、食品成分、花粉など）を包含することは、察知されるであろう。抗原提示細胞への抗原の負荷は、標準的方法、例えばパルシング、形質導入、トランスフェクション、および／または電気細胞融合を利用して遂行することができる。抗原が核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、タンパク質、タンパク質溶解物、全細胞溶解物、または他のタンパク質、即ちヒートショックタンパク質に連結された抗原タンパク質であり得ることが、想定される。該抗原は、ＨＩＶ、インフルエンザ、単純ヘルペス、ヒトパピローマウイルス、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＥＢＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）などをはじめとするウイルスなどの病原性微生物に由来し得る、またはそれから単離され得る。該抗原は、クラミジア、マイコバクテリア、レジオネラ、髄膜炎菌、ストレプトコッカスＡ群、サルモネラ、リステリア、インフルエンザ菌などの病原菌に由来しても、またはそれから単離されてもよい。さらに、該抗原は、アスペルギルス、侵襲性カンジダ、ノカルジア、ヒストプラスモシス、クリプトスポリジアなどをはじめとする病原性酵母に由来しても、またはそれから単離されてもよい。該抗原は、非限定的にニューモシスチス・カリニ、トリパノソーマ、リーシュマニア、プラスモジウム、およびトキソプラズマ・ゴンディをはじめとする病原性原生動物および病原性寄生虫に由来しても、またはそれから単離されてもよい。特定の実施形態において、該抗原は、新生物発生前または過形成状態に関連する抗原を包含する。抗原は、癌に関連しても、または癌に因果関係があってもよい。そのような抗原は、腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または組織特異性抗原、そのエピトープ、およびそのエピトープアゴニストである。そのような抗原としては、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびそのエピトープ、例えばＣＡＰ－１、ＣＡＰ－１－６Ｄ、ＭＡＲＴ－１、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ、ＧＰ－１００、ＭＵＣ－１、ＭＵＣ－２、点突然変異性ｒａｓ発癌遺伝子、正常および点突然変異性ｐ５３発癌遺伝子、ＰＳＭＡ、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１（ｇｐ７５）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＲＰ－２、ＴＡＧ７２、ＫＳＡ、ＣＡ－１２５、ＰＳＡ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ／ｃ－ｅｒｂ／Ｂ２、ＢＲＣ－Ｉ、ＢＲＣ－ＩＩ、ｂｃｒ－ａｂｌ、ｐａｘ３－ｆｋｈｒ、ｅｗｓ－ｆｌｉ－１、ＴＡＡおよび組織特異性抗原の修飾物、ＴＡＡのスプライスバリアント、エピトープアゴニストなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0068】

本明細書で用いられる用語「薬剤」は、非限定的に、小分子、核酸、ポリペプチド、ペプチド、薬物、イオンなどの任意の化合物または物質を意味する。「薬剤」は、非限定的に合成および天然由来タンパク質性および非タンパク質性の物体をはじめとする任意の化学的物体または部分であり得る。幾つかの実施形態において、薬剤は、核酸、核酸類似体、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマー、核酸のオリゴマー、アミノ酸、または炭水化物、例えば非限定的にタンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡｚｙｍｅ、糖タンパク質、ｓｉＲＮＡ、リポタンパク質、アプタマー、ならびにそれらの修飾物および組み合わせである。幾つかの実施形態において、該核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、例えば核酸類似体は、ＰＮＡ、ｐｃＰＮＡおよびＬＮＡであり得る。核酸は、一本鎖または二本鎖であってもよく、該当するタンパク質コードする核酸、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡなどを含む群から選択され得る。そのような核酸配列としては、例えば転写レプレッサー、アンチセンス分子、リボザイム、小分子阻害性核酸配列、例えば非限定的にＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡｉ（ｍＲＮＡｉ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどとして働くタンパク質をコードする核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質および／またはそのペプチド剤もしくは断片は、該当する任意のタンパク質、非限定的に突然変異タンパク質；治療性タンパク質；通常は細胞内に存在しない、またはより低レベルで発現されるトランケート化タンパク質であり得る。該当するタンパク質は、突然変異タンパク質、遺伝子操作されたタンパク質、ペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、キメラタンパク質、抗体、ヒト化タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、修飾タンパク質およびその断片を含む群から選択され得る。

【0069】

本明細書で用いられる用語「転写因子」または「ＴＦ」は、ＤＮＡ結合ドメインを用いてＤＮＡの特異的部分に結合して、ＤＮＡからＲＮＡへの遺伝子情報の転写を制御する径の一部となるタンパク質を指す。

【0070】

本明細書で用いられる用語「ＤＣ誘導因子」は、その用語が本明細書で定義される通り、発現がＤＣ状態への細胞、例えば体細胞のリプログラミングに寄与する、タンパク質、ＲＮＡまたは小分子などの発達能力を改変する因子を指す。ＤＣ誘導因子は、例えばインビトロでｉＤＣを作製する方法においてこれらの因子の１つまたは複数に置き換えることができる任意の遺伝子、タンパク質、ＲＮＡまたは小分子をはじめとする、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、ＢＡＴＦ３およびＴＣＦ４など、細胞をＤＣ状態にリプログラミングし得る転写因子であり得る。幾つかの実施形態において、ＤＣ誘導因子の外来発現は、１種または複数のＤＣ誘導因子の内部発現を誘導するため、該１種または複数のＤＣ誘導因子の外来発現は、ｉＤＣ状態の細胞の安定した維持にもはや必要でない。

【0071】

本明細書で用いられる用語「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、表面で主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と複合化された抗原を提示する細胞を指し、この工程は、抗原提示として公知である。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いてこれらの複合体を認識することができる。これらの細胞は、抗原を処理して、それらをＴ細胞に提示する。

【0072】

本明細書で用いられる用語「体細胞」は、生物体の身体を形成する任意の生体細胞、即ち多細胞生物体における、配偶子、生殖細胞、生殖母細胞、または未分化幹細胞以外の任意の細胞を指す。

【0073】

内因性ＤＣ誘導因子の発現は、クロマチン修飾剤を使用して、または使用せずに、細胞内のホ乳動物遺伝子発現をモジュレートすることが可能なＤＮＡ標的化システムの使用により誘導され得る。幾つかの実施形態において、該ＤＮＡ標的化システムは、任意の修飾タンパク質、細胞と接触された単離ポリヌクレオチドまたはベクター、ならびにＰＵ．１、ＩＲＦ８、ＢＡＴＦ３およびＴＣＦ４からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子のプロモーター領域を標的化する少なくとも１種のガイドＲＮＡを含み得るＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）９に基づくシステム（ＷＯ２０１４１９７７４８ Ａ２に記載）を含んでいてもよい。該ＤＮＡ標的化システムは、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４を含んでいてもよい。幾つかの実施形態において、該ＤＮＡ標的化システムは、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、ＢＡＴＦ３およびＴＣＦ４からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の異なる標的領域に結合する２種以上の転写活性化因子様エフェクター転写因子（ＵＳ２０１４０３０９１７７ Ａ１に記載）を含んでいてもよい。

【0074】

一実施形態において、ｉＤＣは、とりわけ黒色腫、前立腺癌、膠芽腫、急性骨髄性白血病などの癌の患者において特異的な免疫応答を誘導する免疫療法として用いることができる。

【0075】

一実施形態において、ｉＤＣは、ウイルス、細菌および寄生虫病原体により誘起される感染を処置するのに用いることもできる。

【0076】

一実施形態において、ｉＤＣは、ワクチン免疫原性検査のためのインビトロツールとして用いることもできる。

【0077】

本開示において用いられる多能性幹細胞は、ヒトの胚の破壊を必然的に含む方法を繰り返す必要がなく、即ち誘導多能性幹細胞を使用して得られる。誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣとしても公知）は、細胞内リプログラミングにより成体細胞から直接生成され得る多能性幹細胞の型である。

【0078】

この方法により得ることができる誘導樹状細胞（ｉＤＣ）は、細胞表面のＭＨＣ－ＩおよびＩＩ、ならびに共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０を発現する。

【0079】

幾つかの実施形態において、該組成物は、免疫療法を対象において少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５．７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％改善するのに効果的な量で、本発明の主題で開示される単離された転写因子の開示を含んでいてもよい。

【0080】

幾つかの実施形態において、該組成物は、免疫療法を対象において少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５．７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％改善するのに有効な量で、本発明の主題における誘導樹状細胞の開示を含んでいてもよい。

【0081】

本開示のＤＣ誘導因子は、インビトロ、エクスビボまたはインビボでリプログラミングを誘導するように送達され得る。

【0082】

本開示の分化細胞は、必要な対象から単離することができ、ＤＣ誘導因子は、ｉＤＣへのリプログラミングを誘導するように導入することができる。生成されたｉＤＣは、輸液で患者に戻すことができる。

【0083】

あるいはＤＣ誘導因子は、例えば癌抗原を提示する能力を有するｉＤＣへの癌細胞のインビボでのリプログラミングを誘導するために送達することができる。

【0084】

好ましい投与経路としては、経口、非経口、筋肉内、静脈内、インサイチュでの注射、鼻内、舌下、髄腔内、および吸入が挙げられるが、これらに限定されない。

【0085】

幾つかの実施形態において、用量または投与剤形は、対象に、１日１回、１日２回、または１日３回投与される。他の実施形態において、該用量は、対象に、週１回、月１回、２ヶ月に１回、年４回、年３回、年２回、または年１回投与される。

【0086】

本発明の実施形態は、免疫障害についての小分子スクリーニングを実行するのに有用な細胞の研究使用のためのキットおよび該細胞の生成のための方法をはじめとし、複数の適用例を提供する。加えて本発明は、自家樹状細胞を生成して必要とする患者へ戻すための商業的および医療的に有用な方法を提供する。

【0087】

例えば、本明細書に記載された方法を用いて樹状細胞を生成し、さらに癌として定義することもできる過剰増殖疾患をはじめとする疾患を処置することができる。さらなる実施形態において、該癌は、黒色腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺癌、肝細胞癌、白血病、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、膠芽腫、歯肉癌、舌癌、神経芽細胞腫、頭部癌、頸部癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、大腸癌、食道癌、非ホジキンリンパ腫、子宮癌、肝臓癌、甲状腺癌、腎臓癌、皮膚癌、骨癌、精巣癌、卵巣癌、中皮腫、子宮頸癌、胃腸癌、リンパ腫、脳癌、結腸癌、肉腫または膀胱癌である。該癌は、腫瘍細胞で構成された腫瘍を含む場合もある。例えば腫瘍細胞は、黒色腫細胞、膀胱癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、前立腺癌細胞、肝臓癌細胞、膵臓癌細胞、胃癌細胞、精巣癌細胞、脳癌細胞、卵巣癌細胞、リンパ癌細胞腫、皮膚癌細胞、脳癌細胞、骨癌細胞、または軟組織癌細胞を挙げることができるが、これらに限定されない。他の実施形態において、該過剰増殖疾患は、関節リウマチ、炎症性腸疾患、骨関節炎、平滑筋腫、腺腫、脂肪腫、血管腫、線維腫、血管閉塞、再狭窄、アテローム性硬化症、新生物発生前の病変（腺腫性過形成および前立腺上皮内新生物など）、インサイチュの癌、口内毛様白板症、または乾癬である。

【0088】

したがって一実施形態において、本明細書で提供されるのは、ＢＡＴＦ３（配列番号１、配列番号２）、ＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）、ＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）、ＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）、またはそれらの混合物から選択される少なくとも２種、３種、４種以上のＤＣ誘導因子をコードする１種または複数の発現ベクターを含む樹状細胞（ＤＣ）誘導組成物である。特定の実施形態において、その添加は、その効率を少なくとも８％上昇させる。

【0089】

本明細書に記載されたこれらの態様およびそのような全ての態様の幾つかの実施形態において、該１種または複数の発現ベクターは、レトロウイルスベクターである。

【0090】

本明細書に記載されたこれらの態様およびそのような全ての態様の幾つかの実施形態において、該１種または複数の発現ベクターは、レンチウイルスベクターである。幾つかの実施形態において、該レンチウイルスベクターは、誘導性レンチウイルスベクターである。

【0091】

同じく、幾つかの態様において本明細書で提供されるのは、ＢＡＴＦ３（配列番号１、配列番号２）、ＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）、ＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）、ＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）、またはそれらの混合物から選択される少なくとも２種、３種、４種のＤＣ誘導因子をコードする修飾ｍＲＮＡ配列を含み、上記修飾ｍＲＮＡ配列それぞれの各サイトカインが修飾シトシンであり、上記修飾ｍＮＲＡ配列それぞれの各ウラシルが修飾ウラシルである、樹状細胞（ＤＣ）誘導組成物、またはそれらの組み合わせである。

【0092】

幾つかの態様において、本明細書で提供されるのは、ＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）、ＢＡＴＦ３（配列番号１または配列番号２）、ＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）、ＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）、またはそれらの混合物から選択される少なくとも２種の配列を含み、上記修飾ｍＲＮＡ配列それぞれの各サイトカインが修飾シトシンであり、上記修飾ｍＮＲＡ配列それぞれの各ウラシルが修飾ウラシルである、樹状細胞（ＤＣ）誘導組成物、またはそれらの組み合わせである。

【0093】

本明細書に記載されたこれらの態様およびそのような全ての態様の幾つかの実施形態において、該修飾シトシンは、５－メチルシトシンであり、該修飾ウラシルは、シュードウラシルである。

【0094】

同じく幾つかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、体細胞から誘導樹状細胞（ｉＤＣ）を調製するための方法であって、
該体細胞を、ＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）をコードする核酸配列、ＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）をコードする核酸配列、ＢＡＴＦ３（配列番号１、配列番号２）をコードする核酸配列を含む１種または複数のベクターで形質導入し、各上記核酸配列が、プロモーターに動作可能に連結されていること；および
該形質導入された体細胞を、樹状細胞の生育を支援する細胞培地で培養し、それによりｉＤＣを調製すること、
を含む、方法である。

【0095】

本明細書に記載されたこれらの態様およびそのような全ての態様の幾つかの実施形態において、該形質導入ステップは、ＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）をコードする核酸配列；ＩＬ１２をコードする核酸配列；ＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸配列；ＩＬ－７をコードする核酸配列；ＩＬ－１０ＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡをコードする核酸配列のうちの１つまたは複数を含む１種または複数のベクターをさらに含む。

【0096】

本明細書に記載されたこれらの態様およびそのような全ての態様の幾つかの実施形態において、該形質導入ステップは、免疫刺激性サイトカインをコードする核酸を含む１種または複数のベクターをさらに含む。好ましくは該サイトカインは、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ－β）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、Ｆｌｔ－３リガンドまたはｋｉｔリガンドのうちの１つである。これらのサイトカインのアミノ酸配列は、当該技術分野で周知である。ヘテロダイマー免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１２）の場合、誘導樹状細胞（ｉＤＣ）は、サイトカイン分子の両方のサブユニットを発現するように遺伝子修飾されることになる。

【0097】

さらなるベクターは、これらのサイトカインの変異体をコードする核酸を含んでいてもよい。例えば前形態および成熟形態の両方を有するそれらのサイトカインの場合（例えば、シグナルペプチドの開裂前および後、または活性断片を得る限定されたタンパク質分解の前および後）、本発明のＡＰＣは、前形態または成熟形態のいずれかを発現させるように遺伝子修飾されてもよい。サイトカインの活性断片と異種配列（例えば、異種シグナルペプチド）との融合タンパク質など他の変異体を用いてもよい。種の変異体を、ヒト対象における活性を維持する程度に用いてもよい。したがって例えば、ヒトサイトカインのネズミ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、非ヒト霊長類、または他のホ乳動物変異体が、それらのヒト相同体と実質的に類似の活性を維持するならば、これらの種の変異体を発現するように、ヒトＡＰＣを遺伝子修飾してもよい。

【0098】

最大ＣＴＬ刺激および増殖、ならびに／または他のＴ細胞型の刺激および増殖を実現するために、さらなる免疫刺激剤を投与することが望ましい場合もある。これらとしては、樹状細胞を活性化すること、およびＴ細胞活性化を促進する能力を刺激することが可能な薬剤を挙げることができる。そのような薬剤は、アジュバントと称することができる。該アジュバントは、ＣＤ４０のアゴニスト（可溶性ＣＤ４０リガンド、またはＣＤ４０に特異的なアゴニスト抗体など）、ＣＤ２８、ＣＤ２７もしくはＯＸ４０のアゴニスト（例えば、それらの分子の１種に特異的なアゴニスト抗体）、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト（例えば、ＣＴＬＡ－４に特異的なブロッキング抗体）、および／またはＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、および／または樹状細胞活性化を誘導することが可能な任意の他の薬剤を含んでいてもよい。ＴＬＲアゴニストは、Ｔｏｌｌ様受容体を活性化する物質である。好ましくは該ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７またはＴＬＲ９の活性化因子である。適切なＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ４に結合するＭＰＬ（モノホスホリルリピドＡ）である。用いられ得る他のＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ２に結合するＬＴＡ（リポタイコ酸）；ＴＬＲ３に結合するｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ（ポリイノシン酸－ポリシチジル酸）；ＴＬＲ５に結合するフラジェリン；ＴＬＲ７に結合するイミキモドもしくはｐｏｌｙＵ ＲＮＡ（１－（２－メチルプロピル）－１Ｈ－イミダゾ（４，５－ｃ）キノリン－４－アミン）、ならびにＴＬＲ９に結合するＣｐＧ（ＤＮＡ ＣｐＧモチーフ）；またはＴＬＲに結合してそれを活性化する任意の他の成分である。より詳細については、Ｒｅｉｓ ｅ Ｓｏｕｓａ， Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ． Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６：２７， ２００４を参照されたい。ＴＬＲを介して働き得ないアジュバントとしては、５’三リン酸ＲＮＡ、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、およびカードラン（β－１，３－グルカン）などのβ－グルカンが挙げられる。

【0099】

本明細書に記載されたこれらの態様およびそのような全ての態様の幾つかの実施形態において、該培養ステップは、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ－β）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、Ｆｌｔ－３リガンドまたはｋｉｔリガンドからなる群から選択される少なくとも１種の免疫刺激性組換えサイトカインを補充された、樹状細胞または抗原提示細胞の生育を支援する細胞培地の使用をさらに含む。ヘテロダイマー免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１２）の場合、誘導樹状細胞（ｉＤＣ）は、サイトカイン分子の両方の細部ユニットと共に培養されることになる。他の炎症促進性サイトカインを、アジュバントとして用いてもよい。

【0100】

本明細書に記載されたこれらの態様およびそのような全ての態様の幾つかの実施形態において、該体細胞は、線維芽細胞である。

【0101】

本明細書に記載されたこれらの態様およびそのような全ての態様の幾つかの実施形態において、該体細胞は、造血系譜の細胞である。

【0102】

本明細書に記載されたこれらの態様およびそのような全ての態様の幾つかの実施形態において、該造血系譜の細胞は、前骨髄細胞、好中球、好酸球、好塩基球、網状赤血球、赤血球、肥満細胞、破骨細胞、巨核球、血小板を生成する巨核球、血小板、単球、マクロファージ、リンパ球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、自然リンパ球、複能性造血幹細胞および始原細胞、寡能性造血前駆細胞、系譜限定の造血前駆体から選択される。

【0103】

本明細書に記載されたこれらの態様およびそのような全ての態様の幾つかの実施形態において、該造血系譜細胞は、複能性始原細胞（ＭＰＰ）、共通骨髄始原細胞（ＣＭＰ）、顆粒球－単球始原細胞（ＧＭＰ）、共通リンパ始原細胞（ＣＬＰ）、およびｐｒｅ巨核球－赤血球始原細胞から選択される。

【0104】

本明細書に記載されたこれらの態様およびそのような全ての態様の幾つかの実施形態において、該造血系譜細胞は、巨核球－赤血球始原細胞（ＭＥＰ）、ＰｒｏＢ細胞、ＰｒｅＢ細胞、ＰｒｅＰｒｏＢ細胞、ＰｒｏＴ細胞、二重陰性Ｔ細胞、ｐｒｏ－ＮＫ細胞、ｐｒｅ－樹状細胞（ｐｒｅ－ＤＣ）、ｐｒｅ顆粒球／マクロファージ細胞、顆粒球／マクロファージ始原（ＧＭＰ）細胞、およびｐｒｏ肥満細胞（ＰｒｏＭＣ）から選択される。

【0105】

同じく幾つかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載された１種または複数の発現ベクター成分を含むＤＣ誘導組成物のいずれかを含む、誘導樹状細胞（ｉＤＣ）を作製するためのキットである。

【0106】

幾つかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載された修飾ｍＲＮＡ配列成分を含むＤＣ誘導組成物のいずれかを含む、誘導樹状細胞（ｉＤＣ）を作製するためのキットである。

【0107】

本明細書に記載されたこれらの態様およびそのような全ての態様の幾つかの実施形態において、該１種または複数の発現ベクターは、レンチウイルスベクターである。幾つかの実施形態において、該レンチウイルスベクターは、誘導性レンチウイルスベクターである。幾つかの実施形態において、該レンチウイルスベクターは、ポリシストロニック誘導性レンチウイルスベクターである。幾つかの実施形態において、該ポリシストロニック誘導性レンチウイルスベクターは、３つ以上の核酸配列を発現する。幾つかの実施形態において、該ポリシストロニック誘導性レンチウイルスベクターの核酸配列のそれぞれは、２Ａペプチド配列により分離されている。

【0108】

ポリシストロニックウイルス発現システムの使用は、ｉＤＣへの体細胞のインビボリプログラミング効率を上昇させ得る。したがって本明細書に記載された態様の幾つかの実施形態において、ポリシストロニックレンチウイルスベクターが、用いられる。そのような実施形態において、本明細書に記載されたＤＣ誘導因子の２種以上をコードする配列が、ポリシストロニック転写産物として単一プロモーターから発現される。２Ａペプチド方策を利用して、ポリシストロニックベクターを作製することができる（例えば、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２００５ Ｍａｙ；５（５）：６２７－３８参照）。ポリシストロニック発現ベクターシステムはまた、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを利用して、多重遺伝子、またはポリシストロニックなメッセージを作出することができる。ＩＲＥＳエレメントは、５’－メチル化キャップ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回して、内部部位で翻訳を開始することができる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ， １９８８）。ＩＲＥＳエレメントは、異種オープンリーディングフレームに連結することができる。それぞれがＩＲＥＳによって分離された複数のオープンリーディングフレームを一緒に転写し、それによりポリシストロニックなメッセージを作出することができる。ＩＲＥＳエレメントのおかげで、各オープンリーディングフレームは、効率的翻訳のためにリボソームに接近可能である。複数の遺伝子を、単一プロモーター／エンハンサーを用いて効率的に発現させて、単一メッセージを転写することができる。例えば米国特許第４，９８０，２８５号；同第５，９２５，５６５号；同第５，６３１，１５０号；同第５，７０７，８２８号；同第５，７５９，８２８号；同第５，８８８，７８３号；同第５，９１９，６７０号；および同第５，９３５，８１９号；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい。

【0109】

以下の図は、本明細書を例示するための好ましい実施形態を提供しており、本発明の範囲を限定するものと理解してはならない。

【図面の簡単な説明】

【0110】

【図1】造血系分化の略図。造血系の分化は通常、漸次的により制限された始原体を通して、造血幹細胞（ＨＳＣ）から樹状細胞（ＤＣ）（破線のボックスで強調されている）などの分化した血液エフェクター細胞に進行するが、本明細書に記載された結果は、ＤＣで濃縮された転写因子を利用して、分化した体細胞を他の系譜から抗原提示能力を有する樹状細胞の運命にリプログラミングすることを目指している。複能性始原細胞（ＭＰＰ）、共通骨髄始原細胞（ＣＭＰ）、共通リンパ始原細胞（ＣＬＰ）、顆粒球－単球始原細胞（ＧＭＰ）、ｐｒｅ巨核球－赤血球（ｐｒｅ－ＭＥＧ／Ｅ）始原細胞、巨核球－赤血球始原細胞（ＭＥＰ）、コロニー形成単位－赤血球（ＣＦＵ－Ｅ）、巨核球始原体ＭｋＰ、ｐｒｏ肥満細胞（ＰｒｏＭＣ）、単球ＤＣ始原体（ＭＤＰ）、共通樹状細胞前駆体（ＣＤＰ）、ｐｒｅ樹状細胞（ｐｒｅ－ＤＣ）、二重陰性Ｔ系譜前駆体（ＤＮ１、ＤＮ２）。

【図2】直接的細胞リプログラミングによる抗原提示細胞の生成。マウスおよびヒト線維芽細胞からの樹状細胞（ｉＤＣ）の誘導のための、本発明の主題におけるＴＦ組の開示の影響の観察。誘導ＤＣは、細胞抽出物または定義された抗原（プライミングされたｉＤＣ）を負荷した後に個人に合わせた免疫療法を生成するために適用することができる。ＤＣは、マクロファージ（Ｍφ）、Ｔ、ＢおよびＮＫ細胞への抗原提示に特化される。誘導ＤＣは、癌、ウイルス、寄生虫または細菌感染に対する抗原特異性芽根期応答を刺激する。

【図3】抗原特異性免疫応答を刺激する癌細胞のインサイチュまたはエクスビボ直接的リプログラミング。ＴＦ組（ＰＩＢ）のカクテルをインビボ、またはインサイチュ、またはエクスビボ、またはインビトロで癌細胞に直接導入した場合の、ＤＣの運命および抗原提示能力の誘導についてのＴＦ組（ＰＩＢ）の影響。この方策により腫瘍細胞は、特異的抗原（腫瘍ＡＰＣ）をＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞へ提示して、腫瘍に対する標的化免疫応答を惹起することができる。

【図4】ＤＣの直接的リプログラミングのための１８のＴＦ候補。（Ａ）複数のマウス組織にまたがる１８の候補因子の遺伝子発現を示したヒートマップ（ＧｅｎｅＡｔｌａｓ ＭＯＥ４３０）。１８の因子の大部分は、ＤＣ内で特異的に濃縮されるが（黒いボックス）、他の組織では濃縮されない（右）。（Ｂ）骨髄培養物から得られたマクロファージ（Ｍφ）と比較した場合の、マウスＤＣにおける１８の因子の遺伝子発現増加を示したヒートマップ（左パネル、ＧＳＥ６２３６１）。共通樹状細胞前駆体（ＣＤＰ）、ｐｒｅ従来型ＤＣ（Ｐｒｅ－ｃＤＣ１およびＰｒｅ－ＣＤ２）および従来型ＤＣ（ｃＤＣ１およびｃＤＣ２）における１８のＴＦの遺伝子発現を示したヒートマップ（右パネル、ＧＳＥ６６５６５）。遺伝子発現データを、Ｃｌｕｓｔｅｒ３．０で解析して、Ｔｒｅｅｖｉｅｗにより表示した。赤色は、平均を超える発現増加を示し、青色は、発現減少を示す。（Ｃ）遺伝子オントロジーによる生物学的工程（左）およびマウス機能喪失型突然変異体表現型（右）エンリッチメント解析を、Ｅｎｒｉｃｈｒ（ｈｔｔｐ：／／ａｍｐ．ｐｈａｒｍ．ｍｓｓｍ．ｅｄｕ／Ｅｎｒｉｃｈｒ／）を用いて候補の１８のＴＦについて実施した。リストは、最も濃縮された項目（上位１９種）を示し、左の列は、各ｐ値を示す。最も濃縮された生物学的工程は、白血球分化（ｐ＝２．５１Ｅ－１２）、白血球活性化（ｐ＝１．０２Ｅ－１１）、ＤＣ分化（ｐ＝９．５８Ｅ－１２）、およびＤＣ活性化（ｐ＝６．３１Ｅ－１１）であり、突然変異体表現型には、異常な適応免疫（ｐ＝１．１９Ｅ－０４）および異常な抗原提示（ｐ＝１．２５Ｅ－０３）がある。

【図5】Ｃｌｅｃ９ａの発現は、従来型ＤＣ系譜に特異的に限定される。（Ａ）Ｃｌｅｃ９ａ－Ｃｒｅ Ｘ Ｒ２６－ｓｔｏｐ－Ｔｏｍａｔｏ二重トランスジェニックマウスは、従来型ＤＣとそれにコミットされた前駆体（ＣＤＰ、共通樹状細胞前駆体）の同定を可能にするが、他の白血球ではｔｄＴｏｍａｔｏの発現が限定されるため、可能でない。（Ｂ）ＤＣ、およびＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ｗｗｗ．ｉｍｍｇｅｎ．ｏｒｇ）で入手できるデータから得られた複数の造血細胞系譜におけるＣｌｅｃ９ａの発現プロファイル。（Ｃ）シングルセルレベルでの単球ＤＣ始原体（ＭＤＰ）およびＤＣにコミットされた前駆体（ＣＤＰおよびｐｒｅ－ＤＣ）におけるＣｌｅｃ９ａ遺伝子の遺伝子発現（ＧＳＥ６０７８３）。

【図6】Ｃｌｅｃ９ａは、成熟ｃＤＣ１において高度に発現される。（Ａ）ＤＣ前駆体（ＣＤＰ、ｐｒｅ－ＤＣ１およびｐｒｅ－ＣＤ２）および成熟細胞（ｃＤＣ１およびｃＤＣ２）におけるＣｌｅｃ９ａの遺伝子発現（ＧＳＥ６０７８２）。（Ｂ）二重トランスジェニックＣ９ａ－ｔｄＴ動物から単離された脾臓ｃＤＣ１（ＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋細胞）におけるＣｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏの確証。Ｃｌｅｃ９ａを発現しないＣＤ８＋Ｔ細胞が、対照として含まれた。

【図7】候補ＴＦをスクリーニングするためのＣｌｅｃ９ａレポーターＭＥＦの単離および精製。（Ａ）二重トランスジェニック（Ｃｌｅｃ９ａ－Ｃｒｅ Ｘ Ｒ２６－ｓｔｏｐ－Ｔｏｍａｔｏ）の妊娠した雌を用いて、胎生Ｅ１３．５日目のＭＥＦを単離した。頭部、胎児肝臓および内部臓器を摘出した後、ＭＥＦをコンフルエンスになるまで培養した。ＭＥＦを、造血能力を有する細胞を表し得る残留するＣＤ４５＋およびｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞を除去するために選別した。（Ｂ）残留するＣＤ４５＋およびｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞を除去するゲーティング方策。集団のおよそ９７％である二重陰性ＭＥＦを選別した。（Ｃ）選別された集団の純度確証。

【図8】Ｃｌｅｃ９ａレポーターＭＥＦを活性化する候補ＴＦの能力をスクリーニングするための実験計画。精製されたＭＥＦに、ＤＣ特異性ＴＦをコードする誘導性レンチウイルスベクターの異なるプールを形質導入した。ＭＥＦをＤｏｘの存在下で培養してＴＦの発現を誘導し、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現のために１～１５日目にモニタリングした。Ｃｌｅｃ９ａプロモーターの活性は、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現を誘導して、終止コドンの切除、および結果としてのｔｄＴｏｍａｔｏの発現を媒介する。

【図9】候補ＤＣ誘導ＴＦの組み合わせはＣｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターの活性化を誘導する。（Ａ）ＭＥＦに、Ｍ２ｒｔＴＡ（対照として）、１８のＴＦ全て、および３～４ＴＦのプールを形質導入して、Ｄｏｘ添加後５日目に蛍光顕微鏡測定およびフローサイトメトリーにより分析した。（Ｂ）８日目のＭ２ｒｔＴＡ、１８のＴＦ全て、またはより小規模なプールを形質導入した後のｔｄＴ＋細胞の定量。平均±ＳＤ、ｎ＝２。（Ｃ）８日目の４ＴＦのプールから個々のＴＦを除去した後、またはそれらの個々の発現のｔｄＴ＋細胞の定量。平均±ＳＤ、ｎ＝２。

【図10】極微量の転写因子ネットワークが、マウス線維芽細胞においてＣｌｅｃ９ａレポーターを活性化し、ＤＣ形態を誘導する。（Ａ）ＭＥＦにＭ２ｒｔＴＡ（対照として）またはＰＵ．１、ＩＲＦ８およびＢＡＴＦ３（ＰＩＢ－３ＴＦの混合物）を形質導入して、Ｄｏｘ添加後５日目に蛍光顕微鏡測定およびフローサイトメトリーにより分析した。（Ｂ）フローサイトメトリーにより分析されたＣｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーター活性化の速度論。（Ｃ）Ｄｏｘ添加後５日目のＰＩＢのプールから個々のＴＦを除去した後、またはそれらの個々の発現のｔｄＴ＋細胞の定量。（Ｄ）ＰＩＢ形質導入細胞（ｔｄＴｏｍａｔｏ＋または全集団においてゲーティング）およびＭ２ｒｔＴＡ形質導入細胞においてサイズ（ＦＳＣ）および複雑さ（ＳＳＣ）を示したフローサイトメトリーヒストグラム。（Ｅ）Ｄｏｘ添加後５日目のｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の形態。（Ｆ）Ｄｏｘ添加後８日目のＦ－アクチンについての免疫蛍光性。

【図11】０～７日目にタイムラプス顕微鏡測定により分析されたＣｌｅｃ９ａレポーター活性化の速度論。スケールバーは、２００μｍを表す。

【図12】極微量の転写因子ネットワークが、総造血系マーカーＣＤ４５の発現を誘導する。ＰＩＢ形質導入ＭＥＦにおけるＣＤ４５およびｔｄＴｏｍａｔｏの発現についての８日目のフローサイトメトリー分析。

【図13】ＴＣＦ４はＣｌｅｃ９ａレポーター活性化の効率を上昇させる。（Ａ）ＭＥＦに、ＰＵ．１、ＩＲＦ８およびＢＡＴＦ３、ＰＩＢ（黒色のバー）または１８の候補のうち個々のＴＦを組み合わせたＰＩＢ（灰色のバー）を形質導入した。ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞を８日目に定量した。Ｍ２ｒｔＴＡ形質導入が、対照として含まれた。平均±ＳＤ、ｎ＝２～６。（Ｂ）ＭＥＦに、ＰＩＢ（黒色のバー）または個々の造血系ＴＦを組み合わせたＰＩＢ（灰色のバー）を形質導入した。８日目に、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞を定量した。平均±ＳＤ、ｎ＝２～６。

【図14】Ｃｌｅｃ９ａレポーター活性化を誘導するための最適な培養条件。（Ａ）ＰＩＢ（ＰＵ．１、ＩＲＦ８およびＢＡＴＦ３）を形質導入されて、Ｄｏｘ添加後１０日目に異なる条件で培養されたＭＥＦにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の定量。（Ｂ）ＰＩＢ（黒色のバー）を形質導入されて、Ｄｏｘ添加後１０日目にＯＰ９およびＯＰ９－ＤＬ１細胞と共培養されたＭＥＦにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の絶対数。ＯＰ９およびＯＰ９－ＤＬ１培養物が、対照として含まれた。

【図15】シングルセルレベルでのＰＵ．１、ＩＲＦ８、ＢＡＴＦ３およびＴＣＦ４の発現プロファイル。単一の単球－樹状細胞前駆体（ＭＤＰ）および限定されたＤＣ前駆細胞（ＣＤＰおよびｐｒｅ－ＤＣ）におけるＰＵ．１、ＩＲＦ８、ＢＡＴＦ３およびＴＣＦ４の遺伝子発現（ＧＳＥ６０７８３）。遺伝子発現レベルを、百万マッピングリードでのエキソンモデルのキロベースあたりのリード（ＲＰＫＭ）値で示す。

【図16】マウス細胞／組織におけるＰＵ．１、ＩＲＦ８、ＢＡＴＦ３因子発現の分析。（Ａ）９６の組織および細胞型にまたがるＰｕ．１＋Ｉｒ８＋Ｂａｔｆ３を組み合わせた遺伝子発現レベル。異なるマウス組織および細胞型からの遺伝子発現データを、ＧｅｎｅＡｔｌａｓ ＭＯＥ４３０データベースから得た。「ＧＰＳｆｏｒＧｅｎｅｓ」プログラムを記載して、ＴＦの組み合わせが最も濃縮された組織を分類するために用いた（最良適合＝１）。（Ｂ）ＤＣ前駆体（ＣＤＰ、ｐｒｅ－ＤＣ１およびｐｒｅ－ＤＣ２）および成熟細胞（ｃＤＣ１およびｃＤＣ２）におけるＰｕ．１、Ｉｒｆ８およびＢａｔｆ３の遺伝子発現（ＧＳＥ６０７８２）。遺伝子発現レベルを、相対的遺伝子発現で示す。（Ｃ）他のＤＣサブセットと比較した場合のｃＤＣ１サブセットに属するＣＤ１０３＋ＤＣ（赤色で強調）、ならびにＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ｗｗｗ．ｉｍｍｇｅｎ．ｏｒｇ）で入手できる複数の造血系細胞系譜におけるＣｌｅｃ９ａ、ＰＵ．１、ＩＲＦ８およびＢＡＴＦ３の発現増加を示すヒートマップ。遺伝子発現データを、Ｃｌｕｓｔｅｒ３．０で解析して、Ｔｒｅｅｖｉｅｗにより表示した。赤色は、平均を超える発現増加を示し、青色は、発現減少を示す。

【図17】誘導ＤＣは、細胞表面でｃＤＣ１マーカーを発現する。（Ａ）Ｄｏｘ添加後８日目のＰＩＢ形質導入ＭＥＦの表面表現型のフローサイトメトリー分析。ｔｄＴ＋およびｔｄＴ－集団におけるＣＤ１０３、ＣＤ８ａ、ＣＤ４、Ｃ１１ＢおよびＢ２２０発現の定量。（Ｂ）代表的なフローサイトメトリープロット。

【図18】誘導ＤＣは、細胞表面で抗原提示機構を発現する。（Ａ）Ｄｏｘ添加後７日目のＭ２ｒｔＴＡ（対照として）およびＰＩＢ（ＰＵ．１、ＩＲＦ８およびＢＡＴＦ３）形質導入ＭＥＦにおけるＭＨＣ－ＩＩ発現のフローサイトメトリー分析。ｔｄＴ＋およびｔｄＴ－集団を示す。（Ｂ）Ｍ２ｒｔＴＡおよびＰＩＢ形質導入細胞におけるＭＨＣ－ＩＩ表面発現の速度論。ＭＥＦを、Ｄｏｘ添加後１～１５日目にフローサイトメトリーにより分析した。（Ｃ）Ｄｏｘ添加後５日目の、ＰＩＢのプールから個々のＴＦを除去した後のバルク培養における高および低レベルでＭＨＣ－ＩＩを発現した細胞のパーセンテージの定量。（Ｄ）４ＴＦを形質導入した後、または個々を除去した際のｔｄＴｏｍａｔｏ＋集団内の５日目ＭＨＣ－ＩＩ＋細胞の定量。

【図19】誘導ＤＣは細胞表面でＭＨＣ－Ｉを発現する。Ｄｏｘ添加後７日目のＭ２ｒｔＴＡおよびＰＩＢ形質導入ＭＥＦにおけるＭＨＣ－Ｉ発現のフローサイトメトリー分析。

【図20】誘導ＤＣは細胞表面で共刺激分子を発現する。Ｄｏｘ添加後５日目のＰＩＢ（ＰＵ．１、ＩＲＦ８およびＢＡＴＦ３）形質導入ＭＥＦにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ＋集団の細胞表面での共刺激分子（ＣＤ８０およびＣＤ８６）のフローサイトメトリー分析。ＭＨＣ－ＩＩ＋およびＭＨＣ－ＩＩ－集団を示す。

【図21】誘導ＤＣは、ＬＰＳ刺激の際にＣＤ４０発現を上方制御する。（Ａ）８日目のＰＩＢ形質導入ＭＥＦにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ－およびｔｄＴｏｍａｔｏ＋集団におけるＣＤ４０発現のフローサイトメトリー分析。（Ｂ）ヒストグラムは、１３日目の一夜ＬＰＳ刺激を行った、または行っていないＣＤ４０の発現を示す。

【図22】ＰＩＢ因子は、線維芽細胞における全体的な樹状細胞遺伝子発現プログラムを誘導する。（Ａ）Ｃｌｅｃ９ａレポーターＭＥＦに、Ｐｕ．１（Ｐ）、Ｉｒｆ８（Ｉ）およびＢａｔｆ３（Ｂ）を形質導入して、ｉＤＣを生成した。形質導入細胞を、ＦＡＣＳにより選別し、３日目（ｄ３、２０のＣｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞）、７日目（ｄ７、４０のＣｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞）および９日目（ｄ９、３６のＣｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋細胞）にＦｌｕｄｉｇｍ Ｃ１システムを利用したフルトランスクリプトシングルセルＲＮＡ－ｓｅｑを利用して採取した。Ｃ５７Ｂｌ／６動物から単離された０日目の非形質導入ＭＥＦ（３０細胞）および脾臓ＤＣ（ｓＤＣ、６６のＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ８ａ＋細胞）を、対照として用いた。（Ｂ）１６３のシングルセルのクラスタリングを示したゲノムワイドトランスクリプトームのｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔＳＮＥ）分析。各ドットは、個々の細胞を表す。各試料群の細胞数を、括弧内に示す。（Ｃ）ＳＣ３クラスタリングアルゴリズムにより得られたコンセンサスマトリックスの完全連結法階層的クラスタリング。（Ｄ）５つの異なる生体試料群（列、ＭＥＦ、ｄ３、ｄ７、ｄ９およびｓＤＣ）での６５２５の最も可変性のある遺伝子の発現を示したヒートマップ。４つの遺伝子クラスタリング：Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｉ（３０１４の遺伝子）、ＩＩ（５３０の遺伝子）、ＩＩＩ（３４７の遺伝子）およびＩＶ（２６３４の遺伝子）を示す。カラースキームは、－２（青色）～２（赤色）のＺスコア分布に基づく。各クラスターの遺伝子の例を示す（右パネル）。（Ｅ）線維芽細胞遺伝子の発現レベルを、センサスカウント（ｃｅｎｓｕｓ ｃｏｕｎｔ）の中央値±９５％信頼区間として示す。（Ｆ）バイオリンプロット（高さ：遺伝子発現、幅：遺伝子を発現する細胞の存在率）として表された、クラスターＩＩ（Ｅｅａ１、Ａｌｄｈ１ａ２、Ｉｆｉｔ３）、クラスターＩＩＩ（Ｈ２－ＰＢ、Ｃｔｓｃ、Ｃｄ７４）およびクラスターＩＶ（Ｃｌｅｃ９ａ、Ｃｄ４５、Ｃｄ１１ｃ、Ｔｌｒ３、Ｃｃｒ２、Ｎｌｒｃ５）における遺伝子発現レベル。センサスカウントの対数値を示し、水平線は中央値に対応する。

【図23】ＰＩＢ因子は、内因性Ｐｕ．１、Ｉｒｆ８およびＢａｔｆ３を含むＤＣ転写制御因子の発現を誘導する。（Ａ）ＤＣ転写制御因子：Ｚｂｔｂ４６、Ｂｃｌ１１ａ、Ｓｔａｔ２、Ｉｒｆ７、Ｓｔａｔ６およびＳｔａｔ１の発現レベルを示したバイオリンプロット。（Ｂ）Ｐｕ．１、Ｉｒｆ８およびＢａｔｆ３遺伝子の発現レベルを、±１．５×四分位間範囲まで拡大した箱ひげ図として表された対数カウントとして示す。合計（左パネル）および内因性転写産物（右パネル）レベルを表示している。

【図24】ｉＤＣリプログラミングの間の段階的移行についてのパスウェイエンリッチメント。（Ａ）段階的ｉＤＣリプログラミングのための遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）を、ＮｅｔＰａｔｈの注釈を付けたシグナル伝達経路からの注釈付き遺伝子セットを利用して実施した。３日目は、ＭＥＦに対比して３日目に上方制御された経路を参照し、７日目は、３日目に対比して７日目に上方制御された経路を参照し、９日目は、７日目に対比して９日目に上方制御された経路を参照する。データベースは、正規化エンリッチメントスコア（ＮＥＳ）に従って整列させ、偽発見率（ＦＤＲ）のｑ値を示している。下のパネルは、ＩＬ－４（３日目）およびオンコスタチンＭ（９日目）遺伝子セットについてのエンリッチメントプロットを示す。

【図25】ｉＤＣリプログラミングの間の段階的移行についての転写ネットワーク。（Ａ）各段階的移行のためのｉＤＣリプログラミングの間の転写因子共分散ネットワーク。図示されるのは、５より多くのエッジを有する転写制御因子であり、各エッジは、連結する転写制御因子の間にある０．３５より大きな相関関係を表す。転写因子ＰＵ．１、ＩＲＦ８およびＢＡＴＦ３を、赤色で強調している。（Ｂ）骨髄からＤＣ前駆体（ＣＤＰおよびｐｒｅ－ＤＣ１）および成熟細胞（ｃＤＣ１）においてパネルＡに示された転写制御因子の発現を示したヒートマップ（ＧＳＥ６０７８２）。遺伝子発現データを、Ｃｌｕｓｔｅｒ３．０で解析して、Ｔｒｅｅｖｉｅｗにより表示した。赤色は、平均を超える発現増加を示し、青色は、発現減少を示す。（Ｃ）Ｄｏｘの添加後３、５、７、１０および２５日目のＰＩＢ形質導入ＭＥＦを、造血系コロニー形成についてアッセイした（平均±ＳＤ、ｎ＝２）。選別されたｓＤＣ１および未選別の脾臓細胞および骨髄細胞が、対照として含まれた。

【図26】ＰＩＢ因子は、ｃＤＣ１発現プログラムに向かう転写リプログラミングを誘導する。ｃＤＣ１およびｃＤＣ２遺伝子発現シグネチャーを、Ｓｃｈｌｉｔｚｅｒら（１１）からのデータベースを解析することにより作成した（ＧＳＥ６０７８３）。リプログラミングの間のｃＤＣ１およびｃＤＣ２遺伝子シグネチャーの累積発現レベル中央値。

【図27】シングルセルリプログラミングトラジェクトリーの再構成。（Ａ）シングルセルのゲノムワイドなトランスクリプトームを、ＴＳＣＡＮソフトウエア（擬似時間）で整列させた。非形質導入ＭＥＦ、３日目（ｄ３）、７日目（ｄ７）の誘導ＤＣ（ｉＤＣ）Ｃｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋、９日目（ｄ９）のＣｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋、および脾臓ＤＣ（ｓＤＣ、ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ８ａ＋）の系列を示す。各ドットは、個々の細胞を表す。（Ｂ）予測されたトラジェクトリーに従う二次元独立性コンポーネント空間での細胞発現プロファイル。黒色の実線は、Ｍｏｎｏｃｌｅ２により構築された擬似時系列を示す。各ドットは、生体試料群（左パネル）または細胞状態（右パネル）に従って着色された個々の細胞を表す。各細胞状態に割り付けられた各試料群からの細胞数を、カッコ内に表す。

【図28】シングルセルリプログラミングトラジェクトリーの再構成は、ｉＤＣの異なる成熟状態を強調する。（Ａ）ＢＥＡＭにより同定された分岐依存性遺伝子（ｂｒａｎｃｈ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｅｎｅｓ）の５つの速度（ｋｉｎｅｔｉｃ）クラスター。（Ｂ）細胞状態２と細胞状態３の間の遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）を、免疫シグネチャーコレクション（４，８７２の遺伝子セット、ＦＤＲ＜０．０２または遺伝子セットあたり最大２００遺伝子）に存在する遺伝子セットを用いて実施した。遺伝子セットを正規化エンリッチメントスコア（ＮＥＳ）に従って整列させて、偽発見率（ＦＤＲ）ｑ値を示している。黒色線は、ＤＣ遺伝子セットを表す。右パネルは、成熟した刺激性ＤＣ、ＩＦＮγ刺激されたＤＣおよびＩＦＮα刺激されたＤＣ遺伝子セットのエンリッチメントプロットを示す（全てが状態３で濃縮されている）。

【図29】ＰＩＢ因子は、ＤＣ成熟に関連する遺伝子の高レベルの発現を誘導する。（Ａ）２つのＭＳｉｇＤＢ遺伝子セットのエンリッチメントを示した９日目のｉＤＣおよびｓＤＣ１のＧＳＥＡ（左）。バイオリンプロット（右）は、９日目に濃縮されている遺伝子の発現分布を示す。

【図30】ＰＩＢ因子は、ＤＣ成熟に関連する遺伝子の高レベルの発現を誘導する。（Ａ）Ｍｏｎｏｃｌｅ２（擬似時間）で整列された状態１、２および３からのシングルセルにおけるＣｉｉｔａ、Ｈ２－Ａａ、Ｈ２－Ａｂ１およびＨ２－Ｅｂ１遺伝子の発現レベル。各ドットは、個々の細胞の相対的発現値を表す。線は、状態２（実線）および状態３（破線）についての枝の速度曲線を表す。（Ｂ）Ｃｉｉｔａ、Ａｃｐ５、Ｔｎｆｒｓｆ１ａ、Ｔａｐｂｐ、Ｉｎｐｐ５ｄ、Ｔｒａｆ６およびＩｔｇａ４遺伝子の発現レベルを示したバイオリンプロット。センサスカウントの対数値を示し、水平線は中央値に対応する。

【図31】誘導ＤＣはＴＬＲ刺激により炎症性サイトカインを分泌する。（Ａ）一夜のＴＬＲ４（ＬＰＳ）またはＴＬＲ３（Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ）刺激を利用して、または利用せずにＰＩＢ（ＰＵ．１、ＩＲＦ８およびＢＡＴＦ３）またはＰＩＢＴ（ＰＵ．１、ＩＲＦ８、ＢＡＴＦ３およびＴＣＦ４）を形質導入されたＭＥＦによるサイトカインの分泌。ＰＩＢまたはＰＩＢＴ因子を形質導入されたＭＥＦの上清を、Ｄｏｘ添加後１０日目に回収して、ＢＤ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ Ｍｏｕｓｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてサイトカイン濃度について分析した。未処置、または一夜の１００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ処置もしくは２５μｇ／ｍＬ Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ処置の細胞についてのサイトカインレベルを示し、黒色または灰色のバーは、それぞれＰＩＢまたはＰＩＢＴ形質導入ＭＥＦを表す。

【図32】誘導ＤＣは小粒子を貪食することができる。ＰＩＢ（ＰＵ．１、ＩＲＦ８およびＢＡＴＦ３）を形質導入されたＭＥＦを、ＦＩＴＣ標識ラテックスビーズ（１μｍ）と共に一夜インキュベートし、Ｄｏｘの添加後７日目に蛍光顕微鏡測定により分析した。

【図33】誘導ＤＣはタンパク質および死亡細胞を貪食することができる。（Ａ）ＰＩＢ形質導入ＭＥＦをＦＡＣＳ選別して、１１日目にｔｄＴｏｍａｔｏ－およびｔｄＴｏｍａｔｏ＋（ｉＤＣ）集団をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識オボアルブミン（ＯＶＡ－Ａｌｅｘａ６４７）と共に３７℃でインキュベートして、フローサイトメトリーにより分析した。対照を氷（４℃）上に保持した。（Ｂ）１１日目の選別されたｔｄＴｏｍａｔｏ－およびｔｄＴｏｍａｔｏ＋（ｉＤＣ）集団を、ＣｅｌｌＶｕｅ Ｃｌａｒｅｔ Ｆａｒ Ｒｅｄ膜染色剤で標識された死亡細胞と共に一夜インキュベートして、フローサイトメトリーにより分析した。（Ｃ、Ｄ）１１日目のｉＤＣを、ＤＡＰＩを標識された死亡細胞と共に一夜インキュベートして、蛍光により、または（Ｄ）タイムラプス顕微鏡測定により分析した。

【図34】誘導ＤＣはＴＬＲシグナル伝達およびエンドサイトーシス経路に関与する遺伝子を発現する。（Ａ）ＴＬＲシグナル伝達および（Ｂ）抗原取込み、を調節する遺伝子のバイオリンプロット。

【図35】誘導ＤＣは、抗原を捕捉して、それをＣＤ４＋Ｔ細胞に提示する。（Ａ）抗原提示アッセイの略図。Ｄｏｘ添加後８日目のｉＤＣを、ＯＴ－ＩＩ Ｒａｇ２ＫＯマウスから単離されてオボアルブミン（ＯＶＡ）またはＰＶＡペプチド３２３－３３９の存在下にＣＦＳＥで標識されたＯＴ－ＩＩ ＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養した。７日後に、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化をＣＦＳＥ希釈、およびＴ細胞活性化マーカーＣＤ４４の発現により評価した。（Ｂ）ＯＶＡの存在下でＰＩＢまたはＰＩＢ＋ＴＣＦ４を形質導入されて、ＬＰＳで刺激された、または刺激されていないＭＥＦと共培養されたＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロット。脾臓ＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋ＤＣと共培養されたＣＤ４＋Ｔ細胞が、対照として含まれた。灰色の線は、非接触ＣＤ４＋Ｔ細胞に対応する。（Ｃ）ＬＰＳおよびＯＶＡまたはＯＶＡペプチドの存在下でＰＩＢを形質導入されたＭＥＦと共培養されたＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ４４発現を示すフローサイトメトリープロット。

【図36】誘導ＤＣは抗原を捕捉してＣＤ４＋Ｔ細胞に提示する。ＬＰＳおよびＯＶＡまたはＯＶＡペプチドの存在下でＰＩＢを形質導入されたＭＥＦと共培養されたＣＦＳＥｌｏｗ ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージの定量。脾臓ＤＣが、対照として含まれた。

【図37】誘導ＤＣはエンドサイトーシスカーゴを細胞質に効率的に輸送して、交差提示遺伝子を発現する。（Ａ）１６日目のｉＤＣに、β－ラクタマーゼのＦＲＥＴ感受性サイトゾル基質を負荷して、β－ラクタマーゼと共にインキュベートした。サイトゾルへのβ－ラクタマーゼ輸送の速度を、フローサイトメトリーによりＣＣＦ４切断として測定した。（Ｂ）遺伝子調節交差提示のためのバイオリンプロット。

【図38】誘導ＤＣは外部抗原を捕捉してＣＤ８＋Ｔ細胞に交差提示する。（Ａ）１６日目のｉＤＣを、Ｂ３Ｚ Ｔ細胞ハイブリドーマと共に１６時間コインキュベートし、ＬＰＳまたはＰｏｌｙ Ｉ：Ｃ（ＰＩＣ）刺激の非存在下（左パネル）または存在下（右パネル）で、可溶性ＯＶＡタンパク質の濃度を上昇させた。Ｔ細胞活性化を、Ｂ３Ｚ（ＩＬ－２プロモーターにより誘発）におけるβ－ガラクトシダーゼ発現の上方制御として測定し、比色基質：ＣＰＲＧを用いて定量した。（Ｂ）交差提示アッセイの略図（左パネル）。Ｄｏｘ添加後８日目のｉＤＣを、ＯＴ－Ｉ Ｒａｇ２ＫＯマウスから単離されたＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養して、オボアルブミン（ＯＶＡ）またはＯＶＡ ２５７－２６４ペプチドの存在下にＣＦＳＥで標識した。４日後に、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を、ＣＦＳＥ希釈およびＴ細胞活性化マーカーＣＤ４４の発現により評価した。ＯＶＡの存在下でＰＩＢまたはＰＩＢ＋ＴＣＦ４を形質導入されたＭＥＦと共培養されたＣＦＳＥ標識ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ４４発現を示したフローサイトメトリープロット。脾臓ＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋ＤＣと共培養されたＣＤ８＋Ｔ細胞が、対照（中央パネル）および各定量（右パネル）として含まれた。

【図39】ＰＵ．１、ＩＲＦ８およびＢＡＴＦ３は、ヒト線維芽細胞におけるＤＣ様形態を誘導する。（Ａ）ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）に、ＰＩＢ（ＰＵ．１、ＩＲＦ８、ＢＡＴＦ３）を形質導入して、Ｄｏｘの存在下で培養した。（Ｂ）Ｄｏｘ添加後３日目にＰＩＢを形質導入されたＭＤＦの明視野像。白色矢尻は、典型的なＤＣ様形態の細胞を表示している。Ｍ２ｒｔＴＡ形質導入ＨＤＦを対照として示す。（Ｃ）ＤＣ様形態であるＰＩＢ形質導入ＨＤＦの高倍率の明視野像。

【図40】ＰＵ．１、ＩＲＦ８およびＢＡＴＦ３はヒト線維芽細胞におけるＨＬＡ－ＤＲおよびＣＬＥＣ９Ａの発現を誘導する。Ｄｏｘ添加後９日目のＰＩＢ形質導入ヒト線維芽細胞におけるＨＬＡ－ＤＲおよびＣＬＥＣ９Ａ発現のフローサイトメトリー分析。

【図41】ＰＵ．１、ＩＲＦ８およびＢＡＴＦ３はヒト線維芽細胞においてビーズおよびタンパク質を捕捉する能力を誘導する。（Ａ）ＰＩＢを形質導入されたＨＤＦを、ＦＩＴＣ標識ラテックスビーズ（１μｍ）と共に一夜インキュベートして、Ｄｏｘ添加後７日目に蛍光顕微鏡測定により分析した。ＣｅｌｌＶｕｅ Ｃｌａｒｅｔ Ｆａｒ ＲｅｄおよびＤＡＰＩを用いて、それぞれ細胞膜および核を染色した。（Ｂ）Ｄｏｘ添加後７日目にオボアルブミン－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７と共に３７℃で２０分間インキュベートした後のＰＩＢ形質導入ＨＤＦのフローサイトメトリー分析。対照は、氷（４℃）上に保持した。

【図42】ＰＩＢ因子は、肺癌細胞におけるＣｌｅｃ９ａおよびＭＨＣ－ＩＩ発現を誘導する。Ｄｏｘ添加後８日目のＰＩＢ形質導入３ＬＬ細胞におけるＣｌｅｃ９ａおよびＭＨＣ－ＩＩ発現のフローサイトメトリー分析。Ｍ２ｒｔＴＡ形質導入細胞が、対照として含まれる。

【図43】ＰＩＢ因子は黒色腫細胞におけるＣｌｅｃ９ａおよびＭＨＣ－ＩＩ発現を誘導する。Ｄｏｘ添加後８日目のＰＩＢ形質導入Ｂ１６細胞におけるＣｌｅｃ９ａおよびＭＨＣ－ＩＩ発現のフローサイトメトリー分析。Ｍ２ｒｔＴＡ形質導入細胞が、対照として含まれる。

【図44】ポリシストロニックベクターにおけるＰＩＢ因子の送達はリプログラミング効率を上昇させる。（Ａ）２Ａ様配列により分離されたＰｕ．１、Ｉｒｆ８およびＢａｔｆ３（ＰＩＢ）またはＩｒｆ８、Ｐｕ．１およびＢａｔｆ３（ＩＰＢ）のいずれかをコードしたポリシストロニック領域の略図。（Ｂ）Ｄｏｘ添加後７日目の個々のベクター（右上パネル）またはポリシストロニックベクター（ＰＩＢおよびＩＰＢ）においてＰｕ．１、Ｉｒｆ８およびＢａｔｆ３を形質導入されたＭＥＦにおけるＣｌｅｃ９ａレポーター活性化のフローサイトメトリー分析。Ｍ２ｒｔＴＡ形質導入細胞が、対照として含まれる。（Ｃ）７日目の個々のベクターまたはポリシストロニックベクターにおけるＰＩＢ因子での形質導入後のｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の定量。

【発明を実施するための形態】

【0111】

詳細な記載
本開示は、樹状細胞または抗原提示細胞への分化または未分化細胞の誘導またはリプログラミングを可能にする転写因子の新規な使用および組み合わせの本明細書に記載された驚くべき効果に一部基づく、樹状細胞状態または抗原提示細胞状態への細胞誘導または細胞リプログラミングのための組成物、核酸構築物、方法およびそれらのキットに関する。そのような組成物、核酸構築物、方法およびキットは、樹状細胞をインビトロ、エクスビボ、またはインビボで誘導するために用いることができ、これらの誘導樹状細胞または抗原提示細胞は、免疫療法の適用に用いることができる。

【0112】

天然のＤＣは、全ての組織内で播種される骨髄由来細胞である。ＤＣは、環境をサンプリングして、集めた情報を適応免疫系の細胞（Ｔ細胞およびＢ細胞）に移送するように保たれている。抗原貪食により、ＤＣは、ペプチド－主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子複合体の形態である処理された抗原を、リンパ組織内のナイーブ（即ち、抗原未経験の）Ｔ細胞に提示することにより免疫応答を開始する。活性化の後、ＤＣは、典型的には共刺激分子およびＭＨＣ分子を過剰発現し、加えて多くのＴおよびＢリンパ球応答を開始および／または増強することを担う様々なサイトカイン、即ちＩ型インターフェロン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－アルファ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１２およびＩＬ－６を分泌する。したがってＤＣは一般に、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ分子（ＭＨＣ－ＩＩ）、ＣＤ８０／８６およびＣＤ４０などの共刺激分子、ならびにインテグリンＣＤ１１ｃの高度の発現と、炎症性サイトカインを分泌し、非リンパからリンパ器官へ遊走してナイーブＴ細胞を刺激する優れた能力により同定される。マウスおよびヒトにおいて、ＤＣの異なるサブセットは、表現型、個体発生プロセスおよび機能により可変的に定義され得る。それらには、マウスリンパ器官で見出される従来型ＤＣサブセット１（ｃＤＣ１、ＣＤ８α＋ＤＣサブセットとしても公知）および非リンパ組織内の関連のＣＤ１０３＋ＤＣサブセットがある。類似の表現型を担持する細胞が、近年になり、ヒト、ヒト化マウスおよびヒツジにおいて記載されており、ｃＤＣ１ファミリーの異種間保存が示された。この広範囲のファミリーは、異なる機能的特性を有し、最も注目すべきは死亡細胞または瀕死の細胞からの材料を捕捉する際、およびＭＨＣクラスＩでの交差提示のために外来抗原を処理する際の顕著な効率を有する。これらの２つの特色により、ｃＤＣ１ ＤＣは細胞関連抗原を交差提示し、感染性物質または腫瘍に対するＣＴＬ応答を惹起することができる。ｃＤＣ１＋ＤＣは、ＣＤ８＋Ｔ細胞をプライミングすることに加えて、組織特異性細胞関連抗原への交差寛容の確立に関連づけられた。細胞関連抗原に対してＣＤ８＋Ｔ細胞をクロスプライミングする、または交差寛容化するｃＤＣ１ ＤＣの能力により、それらが死亡細胞に遭遇する状況を解読し得ることが示唆される。ＣＬＥＣ９Ａとしても知られるＤＮＧＲ－１は、マウスにおける死亡細胞関連抗原へのＣＴＬのクロスプライミングに好適な壊死細胞の受容体である。ＤＮＧＲ－１は、マウスｃＤＣ１ ＤＣ、ＣＤ１０３＋ＤＣにより、およびそれらのヒト同等物により高レベルで選択的に発現され、細胞死の後に暴露された細胞内リガンドの認識を担う。近年になり、Ｃｌｅｃ９ａの発現が、リンパ組織内の従来型ＤＣ系譜およびその始原体にコミットされたＤＣ前駆体の同定を可能にすることが示された（１０）。

【0113】

本明細書に記載された通り分化された細胞を誘導ＤＣにリプログラミングすることが可能なＤＣ誘導因子の同定に成功すれば、ＤＣ生物学的性質の基本的理解を複数の方法で進めることができる。この業績により、ＤＣの極わずかな転写ネットワークに徹底した洞察が与えられるであろう。加えて、ＤＣ誘導因子の同定により、ＤＣ状態がどのようにして確立されるか、そして重要な調節機構がどのようにして配置されるかを理解するための前例にない好機が提供される。

【0114】

転写因子は、発達の間に全ての細胞型の運命決定における重大な役割を担う。転写因子介在性リプログラミングを利用した直接的リプログラミング方策の成功により、そのような因子を利用して特定の運命への多能性ＥＳ／ｉＰＳ細胞または複能性幹細胞の分化を指揮することが、等しく妥当であることが示される。したがって、本明細書で同定されたＤＣ誘導因子を利用すれば、ＤＣで濃縮された転写因子の発現により決定的なＤＣ運命へのＥＳ／ｉＰＳ細胞の分化の方向づけが実現され得る。加えて、本明細書で同定されたＤＣ誘導因子を利用すれば、ＤＣで濃縮された転写因子の発現により決定的なＤＣ運命への複能性造血幹細胞および始原細胞の分化の方向づけが実現され得る（図１に示された造血系譜樹に沿った分化の強制）。

【0115】

典型的にはＤＣ誘導因子をコードする核酸、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの構築物が、ウイルスベクターを用いて、またはウイルスベクターを用いずに、１回または反復でのトランスフェクションを介して細胞に導入され、遺伝子産物の発現および／またはＲＮＡ分子の翻訳が、本明細書に記載された通り、ＤＣと形態学的、生化学的および機能的に類似した細胞をもたらす。十分な抗原でプライミングされた後のこれらの誘導ＤＣ（ｉＤＣ）は、抗原を捕捉、処理して、免疫系のエフェクター細胞（マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）に提示して、癌、ウイルスおよび寄生虫／細菌感染に対する抗原特異性免疫応答を誘発する能力を有する（図２）。

【0116】

本開示の一態様は、癌細胞自身の抗原を免役細胞に強制的に提示させるための癌細胞におけるＴＦの使用またはＴＦの組み合わせの使用（インサイチュまたはエクスビボ）である（図３）。この方法は、癌の回避メカニズムを迂回して腫瘍免疫原性を増強するため、抗癌性免疫療法の臨床転帰を向上させる実行可能な方策となる。

【0117】

一実施形態において、１８の候補ＴＦを、ＤＣ内で特異的に濃縮した遺伝子発現により選択し（図４Ａ）、低効率のＡＰＣ（図４Ｂ、左パネル）（２０）であり、かつＤＣ個体発生プロセス中（図４Ｂ、右パネル）にある、マクロファージと比較して、ＤＣ内で濃縮した。１８のＴＦについての遺伝子オントロジー（ＧＯ）エンリッチメント解析で、白血球およびＤＣの分化（それぞれｐ＝２．５１Ｅ－１２およびｐ＝９．５８Ｅ－１２）ならびに活性化（ｐ＝１．０２Ｅ－１１およびｐ＝６．３１Ｅ－１１）における基本的役割が強調され、マウス突然変異体表現型のエンリッチメント解析では、それらの遺伝子における遺伝的撹乱が大部分の造血系表現型、特に異常な適応免疫（ｐ＝１．１９Ｅ－０４）および異常な抗原提示（ｐ＝１．２５Ｅ－０３）を誘発することが確証された（図４Ｃ）。１８の候補ＴＦは、リプログラミングが立証されたドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性レンチウイルスベクターにおいて個別にクローニングされた（６）。

【0118】

一実施形態において、細胞リプログラミングにより新規な樹状細胞誘導ＴＦとＤＣ誘導ＴＦの組み合わせの効果をスクリーニングするために、ＤＣ特異性レポーター（Ｃｌｅｃ９ａ－Ｃｒｅ Ｘ Ｒ２６－ｓｔｏｐ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）を宿すマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）で開始し、示されたＤＣ誘導ＴＦへのレポーターの活性化を利用した。Ｃｌｅｃ９ａ－ｔｏｍａｔｏレポーターマウスにおいて、該ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光タンパク質はもっぱら、ＣＤＰ、ｐｒｅ－ＤＣ、およびｃＤＣにおいて発現される（１０）。培養されたマクロファージ、他の免疫系譜または単球由来ＤＣは、Ｃｌｅｃ９ａを、つまりｔｄＴｏｍａｔｏタンパク質を発現しない（図５Ａ）。免疫系では、Ｃｌｅｃ９ａ遺伝子発現は、ＣＤＰおよびそれらの始原体（ｐｒｅ－ＤＣおよびｃＤＣ）に選択的に限定される（図５Ｂ）。ｃＤＣおよび前駆体の遺伝子発現解析の結果から、Ｃｌｅｃ９ａ発現がＣＤＰおよびｐｒｅ－ＤＣにおけるｃＤＣ系譜へのコミットメント後に獲得され、単球ＤＣ始原体（ＭＤＰ）におけるコミットメント前には獲得されていないことが、強調される（図５Ｃ）（１１）。Ｃｌｅｃ９ａは、ＣＤＰ、ｐｒｅ－ＤＣおよびｃＤＣサブセットの両方で発現され、高レベルのｃＤＣ１サブセットに達する（図６Ａ）（２１）。Ｃｌｅｃ９ａレポーターマウスから単離された脾臓細胞を分析して、ｃＤＣ１細胞（ＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ａ＋におけるゲーティング）の９８．８％がｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光タンパク質を発現することが確証された（図６Ｂ）。

【0119】

二重トランスジェニックＣｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターＭＥＦを、Ｅ１３．５胚から単離して、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により造血系譜に既にコミットされ得る任意の混入したｔｄＴｏｍａｔｏ＋またはＣＤ４５＋細胞を排除した（図７Ａおよび７Ｂ）。スクリーニングおよびその後の実験に用いられたＭＥＦは、純度９９．８％のｔｄＴｏｍａｔｏ－ＣＤ４５－であった（図７Ｃ）。

【0120】

一実施形態において、ＰＵ．１、ＩＲＦ８およびＢＡＴＦ３は、Ｃｌｅｃ９ａ活性化に充分であり、樹状細胞の形態を課す。

【0121】

一実施形態において、Ｃｌｅｃ９ａレポーターＭＥＦに、候補ＴＦの組み合わせを形質導入して、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現について評価した（図８）。１８の候補ＴＦまたは４ＴＦのプールの１つを形質導入した後に、本発明者らは、Ｄｏｘ添加後５日目のｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の出現を観察した（図９Ａ、図９Ｂ）。Ｐｕ．１、Ｉｒｆ４、Ｉｒｆ８およびＢａｔｆ３で構成されたプールが、１８のＴＦよりも多くのｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞を生成し（それぞれ、２．３６％対０．５９％）、誘導されたレポーター活性化に必要となる因子の最小限の組み合わせがこのプールに含有されることが示唆された。ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞は、対照Ｍ２ｒｔＴＡベクターでの形質導入後に検出されなかった。その後、本発明者らは、因子それぞれを個別に除去した（図９Ｃ）。Ｐｕ．１、Ｉｒｆ８およびＢａｔｆ３（ＰＩＢ）の除去により、レポーター活性化が減少したが、Ｉｒｆ４の除去は、影響を有さなかった。これらの結果から、ＰＩＢがＤＣリプログラミングに必須であることが示唆される。

【0122】

一実施形態において、ＰＵ．１、ＩＲＦ８またはＢＡＴＦ３（ＰＩＢ）の組み合わせが、ＭＥＦにおいて発現されると、Ｃｌｅｃ９ａレポーターが、高い効率（およそ３．９６％）で活性化される（図１０Ａ）。一実施形態において、その後、レポーター活性化の速度を評価した（図１０Ｂ）。ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞は、１日目～２日目の間に検出され始め、５日目～７日目の間にピークとなる（図１０Ｂ）。一実施形態において、ＰＵ．１、ＩＲＦ８またはＢＡＴＦ３の除去は、レポーター活性化を完全に排除したが、それらの個別の発現は、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞を生成するのに十分でなかった（図１０Ｃ）。これらのデータから、この実施形態において、ＰＩＢがＣｌｅｃ９ａ活性化および誘導樹状細胞（ｉＤＣ）生成のための最小限のＴＦの組み合わせを構成することが示唆される。重要なこととして、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞は、サイズおよび複雑さの上昇を示し（図１０Ｄ）、ＤＣに特徴的な星状形態および樹状突起の確立の観察と一致する（図１０Ｅ、図１０Ｆ）。レポーター活性化がタイムラプス顕微鏡測定により３０時間前後に生じることが確証され、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞が形態変化を示し、遊走能力および樹状突起が６日以内に徐々に確立されることが観察された（図１１）。総造血系マーカーＣＤ４５は、ＰＩＢ形質導入ＭＥＦのおよそ２０％で発現され、ｔｄＴ＋細胞のおよそ６．６％がこの集団に含まれる（図１２）。

【0123】

一実施形態において、さらなる因子を発現することのＰＩＢへの影響を評価した。１８のＴＦの候補プール（図１３Ａ）および他の造血系ＴＦ（図１３Ｂ）からのＴＦそれぞれの個別の影響を評定した。テストされた３１のＴＦから、ＳＴＡＴ３、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ２、ＮＦＩＬ３、ＢＣＬ６、Ｌ－ＭＹＣ、ＲＵＮＸ１およびＫＬＦ４が、生成されたｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の数に負に影響することが観察された。ＴＣＦ４およびＧｆｉ１ｂの添加から、レポーター活性化において、それぞれ２．２倍および１．９倍の増加が示された。

【0124】

ｉＤＣ生成のための培養条件を最適化する試みにおいて、サイトカインの顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＬ４およびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３ｌ）がＤＣ運命決定の際に重要な役割を担うため（１２）、誘導の間のそれらの添加をテストした（図１４Ａ）。同じく、リポ多糖（ＬＰＳ）の添加、異なる培地組成（ＲＰＭＩ、２－メルカプトエタノール（２－ＭＥ）および４ｍＭ Ｌ－グルタミン（２×Ｇｌｕｔ））ならびに間質細胞ＯＰ－９およびＯＰ９－ＤＬ１との共培養をテストした（図１４Ｂ）（１３）。これらの培養の改良は、誘導されたｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の数を増加させなかった。

【0125】

一実施形態において、ＰＩＢおよびＴＣＦ４のインビボ発現パターンを解析した。ＰＵ．１、ＩＲＦ８、ＢＡＴＦ３およびＴＣＦ４転写産物は、単一ＤＣ前駆細胞において発現される（図１５）。Ｐｕ．１は、ＭＤＰ、ＣＤＰおよびｐｒｅＤＣで等しく発現されるが、ＩＲＦ８の発現は、ＣＤＰで顕著に増加し、ｐｒｅＤＣにおいて維持される。ＢＡＴＦ３およびＴＣＦ４は、ｐｒｅＤＣにおいては後期段階のみで上方制御される。さらに、ＰＵ．１＋ＩＲＦ８＋ＢＡＴＦ３の組み合わせでの発現は、９６種の細胞および組織のうちでＣＤ８ａ＋ＤＣ細胞が最も濃縮される（図１６Ａ）。重要なこととしてＰｕ．１レベルは、両方のｐｒｅＤＣ段階ではより高く、Ｉｒｆ８およびＢａｔｆ３は、ｐｒｅ－ｃＤＣ１およびｃＤＣ１サブセットにおいて特異的に濃縮される（図１６Ｂ）。他のＤＣサブセットおよび複数の造血細胞系譜に比較してＣｌｅｃ９ａ、Ｐｕ．１、Ｉｒｆ８およびＢａｔｆ３は、ｃＤＣ１サブセットに属するＣＤ１０３＋ＤＣの発現増加を示す（図１６Ｃ）。

【0126】

一実施形態において、Ｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターの活性化が従来型ｃＤＣとｐＤＣサブセットとを識別するのに用いられる典型的な表面マーカーなどのＤＣマーカーの発現に反映されるか否かを評価した（図１７Ａ、図１７Ｂ）。興味深いこととして、ｃＤＣ１およびＣＤ１０３は、ｔｄＴｏｍａｔｏ－細胞では検出不能レベルであったのと対照的に、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞では２５±１３．６５％発現されており、非リンパ遊走性ｃＤＣ１プログラムの運命決定が示唆される。さらに、本発明者らは、ｃＤＣ２およびｐＤＣマーカーの残留する発現のみを検出することができた（それぞれＣＤ４＋細胞が０．４１±０．５８％、ＣＤ１１ｂ＋細胞が２．５６±０．１８％、Ｂ２２０＋細胞が０．７７±１．０９％）。

【0127】

一実施形態において、Ｃｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターの活性化が細胞表面の抗原提示機構の重要成分の発現に反映されるか否かを評価した。注目すべきこととして、７日目のｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の７１．４％がＡＰＣ機能性の確立にとっての重要な分子であるＭＨＣ－ＩＩを表面で発現することが観察された（図１８Ａ）。ＭＨＣ－ＩＩの発現は、１日目～２日目の間に徐々に獲得され始め、７日目～１１日目の間にピークとなる（図１８Ｂ）。ＭＨＣ－ＩＩ活性化の速度は、Ｃｌｅｃ９ａレポーターの活性化と類似している（図１０Ｂ）。７日目にはｔｄＴｏｍａｔｏ－同等物は、ＭＨＣ－ＩＩ＋細胞をより低いパーセンテージ（１４．２％）で含有した（図１８Ａ）。その後、ＭＨＣ－ＩＩの発現がＰＩＢ因子により直接制御されるか否かに取り組んだ。因子のそれぞれを個別に排除することにより、ＩＲＦ８またはＢＡＴＦ３発現ではなくＰＵ．１発現が、ＭＨＣ－ＩＩ活性化に重要であることが観察され（図１８Ｃ）、プロモーターＩ（ＣＩＩＴＡｐＩ）を通してクラスＩＩトランスアクティベータ（ＣＩＩＴＡ）を調節する上での記載されたＰｕ．１の役割と一致した（１４、１５）。ＣＩＩＴＡは、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の発現の主要制御因子として知られ、ＣＩＩＴＡプロモーターの差次的な使用を通してＭＨＣ－ＩＩ発現の細胞型特異性、サイトカイン誘導性、および発達由来のモジュレーションを決定する（１６）。従来型ＤＣにおいて、ＣＩＩＴＡｐＩは、ＭＨＣ－ＩＩ遺伝子の調節に関連づけられている。

【0128】

一実施形態において、ＣＩＩＴＡとの相互作用を通してＭＨＣ－ＩＩの発現を誘導する際の記載されたＩＲＦ４関与により（１７）、ＩＲＦ４がｔｄＴｏｍａｔｏ＋集団内のＭＨＣ－ＩＩ＋細胞の生成においてＰｕ．１を補填し得るか否かを評価した。それゆえ、４ＴＦ（ＩＲＦ４を含む）により、またはそれらの個別の排除により生成されたｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞におけるＭＨＣ－ＩＩの発現を評定した（図１８Ｄ）。プールにおけるＩＲＦ４の組み入れは、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞上でのＭＨＣ－ＩＩ発現を増加させず、ＩＲＦ４は、Ｐｕ．１の損失の代用になり得なかった。したがってＩＲＦ４およびＰＵ．１は、ＤＣではなくＢ細胞におけるＣＩＩＴＡプロモーターＩＩＩを通してＭＨＣ－ＩＩ発現を相乗的に促進することが見出された（１７）。ｉＤＣへのリプログラミングの間に、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞におけるＭＨＣ－ＩＩ発現に厳密に必要とされるＰＵ．１との相乗効果が観察されなかった。

【0129】

一実施形態において、ＡＰＣ機能性の確立にとって重要な分子であるＭＨＣクラスＩ分子の発現を評価した。７日目のｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の５６．７％が、表面でＭＨＣ－Ｉを発現した（図１９）。７日目には、ｔｄＴ－区画は、より低いパーセンテージ（１１．２％）のＭＨＣ－Ｉ＋細胞を含有した（図１９）。

【0130】

一実施形態において、効率的な抗原提示に必要とされる共刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現を評価した（図２０）。ＣＤ８０およびＣＤ８６は、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＭＨＣ－ＩＩ－細胞のわずか１２．９％と対照的に、３５．２％のｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋細胞で発現された。ｉＤＣの細胞表面でのＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現のこの特徴づけから、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋細胞のコホートが抗原提示において拮抗的であることが示唆される。さらなる共刺激分子のＣＤ４０は、ｔｄＴｏｍａｔｏ－細胞のわずか２．８％に比較して、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞では１６．１％発現された（図２１Ａ）。残りのｃＤＣ、特にｃＤＣ１サブセットは、微生物刺激に応答して共刺激分子の発現を上方制御し、より効果的なＡＰＣになることが記載されている（２５）。したがってｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞は、Ｔｏｌｌ様受容体ＴＬＲ４刺激（ＬＰＳ）の後に細胞表面でのＣＤ４０の発現を上方制御する（４倍増加）（図２１Ｂ）。

【0131】

一実施形態において、ｉＤＣリプログラミングの間の転写変動の程度を定義するために、ＰＩＢの形質導入の後に全長シングルセルトランスクリプトームを測定した（図２２Ａ）。１９２個の細胞を最初、非形質導入ＭＥＦから情報採取し、３日目のＣｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞、７日目のＣｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞、９日目のＣｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋細胞、および新たに単離されたＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ８ａ＋脾臓ＤＣ（ｓＤＣ）を選別した。これらから、１６３の個別の細胞が、品質管理フィルターを通過し、分析に用いられた。個々の遺伝子座での読み取りのアライメントの後、センサスアルゴリズムを用いて、実験スパイクイン対照を要さずに差次的発現解析の正確度を改善して、相対的なＲＮＡｓｅｑ発現レベル（転写産物／ミリオン、ＴＰＭ）を相対的転写産物数（センサスカウント）に変換した。最初に、ｔ分布型確率的線形埋め込み（ｔＳＮＥ）アルゴリズムを用いて、ゲノムワイドトランスクリプトームのクラスター解析を実施し（図２２Ｂ）、細胞の２つの主なクラスターを観察した。３日目のＩＤＣおよび７日目細胞の大部分を、ＭＥＦに接近してマッピングし、残りの７日目および全ての９日目ｉＤＣを、ｓＤＣと共にクラスタリングする。それは、シングルセルコンセンサスクラスタリング（ＳＣ３）を用いた教師なしクラスタリングで実施され、９日目および一部の７日目ｉＤＣの群でｓＤＣの全体的類似性が確証された（図２２Ｃ）。さらに、全体的なトランスクリプトームリプログラミングのタイミングは、７日目～１５日目の間のＣｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋細胞のピーク生成と十分に相関する（図１８Ｂ）。ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞は、３日目という早期に時間依存性の転写変動を示し、９日目までのｉＤＣは、真に良質なＤＣと著しく類似する。この解析から、ＰＩＢ因子がＤＣ運命に向かう全体的転写リプログラミングを誘導することが示唆される。データベースにまたがる６５２５というほとんどの可変性遺伝子を抽出して、クラスタリングの後に４群に組織化することができた（図２２Ｄ）。クラスターＩは、ＭＥＦ内で高度に発現される遺伝子を含み、それはＤＣリプログラミングの間に発現停止される。これらには、Ｃｏｌ５ａ２、Ｇｒｅｍ１、Ｌｏｘ、Ａｃｔａ２およびＴｈｙ１などの典型的な線維芽細胞マーカーが挙げられる（図２２Ｅ）。クラスターＩＩには、３日目および７日目に濃縮された転写産物が含まれ、リプログラミングの初期段階での活性化が示唆される。このクラスターは、細胞内輸送および代謝に関連するＥｅａ１およびＡｌｄｈ１ａ２、ならびにＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）シグナル伝達物質（Ｉｆｉｔ３）などの遺伝子を含む（図２２Ｆ）。対照的にクラスターＩＩＩは、９日目に濃縮される遺伝子を包含する（図２２Ｄ）。興味深いこととして、ＭＨＣ－ＩＩ関連遺伝子（Ｈ２－Ｐｂなど）およびＤＣにおける交差提示を調節する遺伝子（カテプシンＣｔｓｃおよびＣｄ７４など）は、このクラスター内で濃縮される（図２２Ｆ）。最後にクラスターＩＶは、総造血マーカーＣｄ４５および共通ＤＣマーカーＣｄ１１ｃ（図２２Ｆ）などのｓＤＣ１およびリプログラミングされたｉＤＣ（図２２Ｄ）内で濃縮された遺伝子を含む（図２２Ｄ）。重要なこととして、Ｃｌｅｃ９ａ遺伝子およびＴｌｒ３などのｃＤＣ１に限定される遺伝子もまた上方制御され、ＭＨＣクラスＩ依存性免疫応答の重要な制御因子（Ｎｌｒｃ５）が、ｃＤＣ１の重要な特色である抗原交差提示に必要となる（２３）。実際に本発明者らは、リプログラミング過程で、ｃＤＣ２シグネチャー遺伝子に比較してｃＤＣ１シグネチャー遺伝子のロバストな増加を検出した（図２６）（１１）。総括すると、これらのデータから、完全なＤＣリプログラミングにｃＤＣ１サブセットが好適であることが示唆される。したがってＧＯ解析では、抗原処理および提示に関連するカテゴリー（ｐ値＝３．３４Ｅ－０８、１．８０Ｅ－０６、３．５３Ｅ－０６、４．０３Ｅ－０６）が、生物学的工程および経路で最も濃縮されていることが示された（表１）。最も高い細胞成分ＧＯカテゴリーには、リソゾーム（ｐ値＝１．３１Ｅ－０７）および分解型液胞（ｐ値＝１．４４Ｅ－０７）があり、ＤＣの抗原処理と遊走を協調させる際のリソゾームシグナル伝達の記載された役割と合致した（２４）。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のターゲット予測では、ｍｉＲ－１５５（ｐ値＝１．４１Ｅ－１１）およびｍｉＲ－１２４（ｐ値＝１．００Ｅ－１０）ターゲットの最高のエンリッチメントを示し（表２）、それぞれＤＣの機能および運命決定に関連づけられた（２５、２６）。

【表1】

【表2】

【0132】

この解析から、本発明者らの候補ＴＦリストに本来含まれるＺｂｔｂ４６およびＢｃｌ１１ａをはじめとするＤＣ転写制御因子の活性化も明らかとなった（図２３Ａ）。インターフェロン制御因子ＩＦＮおよびシグナル伝達物質および転写活性化因子（ＳＴＡＴ）タンパク質ファミリーの複数のメンバーも、同定された。例えば、それぞれＴＬＲ誘導ＤＣ活性化およびＩ型ＩＦＮ応答の重要な媒介物質であるＳｔａｔ２およびＩｒｆ７は、３日目および７日目に高レベルで検出される。Ｓｔａｔ６もまた、３日目および７日目に高度の発現中央値を示すが、Ｓｔａｔ１の発現は、９日目に脾臓ＤＣよりも１２８倍高いレベルまで増加する。ＤＣの成熟が、ＳＴＡＴ６からＳＴＡＴ１への活用の変化を伴うことが報告されており、Ｐｕ．１、Ｉｒｆ８およびＢａｔｆ３の過剰発現がＤＣ成熟を誘導し得ることが示唆される。３つのＴＦのレンチウイルス介在性発現と一致して、３日目、７日目および９日目にｓＤＣに比較して、Ｐｕ．１、Ｉｒｆ８およびＢａｔｆ３の高レベルの発現が観察された（図２３Ｂ、上パネル）。本発明者らのレンチウイスルベクターは、ＵＴＲを含まないコード配列をコードするため、３’－および５’－ＵＴＲでの読み取りを利用して内因性転写産物の発現レベルを定量した。重要なこととして、３日目に始まる内因性Ｐｕ．１、Ｉｒｆ８およびＢａｔｆ３の発現が、観察された（図２３Ｂ、下パネル）。リプログラミングの９日目に、内因性発現レベルは、脾臓ＤＣと同等である。

【0133】

転写リプログラミングの動力学的性質をさらに特徴づけるために、遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）を、ＮｅｔＰａｔｈ遺伝子セットを用いて実施して、０日目、３日目、７日目、および９日目の間の移行を比較した（図２４、上パネル）。複数の免疫関連遺伝子セットが、ＭＥＦに比較して３日目に高度に濃縮されることが観察された。興味深いこととして、ＤＣのインビトロ分化に用いられるＩＬ－４は、最上位にランクされた（ＮＥＳ：１．９７、ＦＤＲ ｑ値：０．０２）（図２４、左下パネル）。幾つかの遺伝子セットは、７日目も濃縮されているが、より小さなＮＥＳ値となり、より微妙な移行がこの相の間に起こる可能性が示唆される。対照的に、過去にＤＣ成熟に関連づけられたインターロイキン経路およびオンコスタチンＭをはじめとする複数の遺伝子セットは、７日目に比較して９日目に高度に濃縮された（図２４、右下パネル）。

【0134】

一実施形態において、ｉＤＣリプログラミングの間の段階的移行のための転写ネットワークを評価した（図２５Ａ）。３日目までのＭＥＦの移行が、ＰＩＢリプログラミング因子に高度に連結された高密なＴＦネットワークの発現に関連し、３日目～７日目の移行がより滑らかで低密なＴＦネットワークを特徴とし、ＰＩＢ因子を含まず、７日目～９日目の移行が高密なＴＦネットワークを特徴とし、２つのＴＦクラスターに分割することができ、一方はｃＤＣマーカーＺｂｔｂ４６を含んでより高密であり、一方はＰＩＢ因子を含みより少ないＴＦで構成されることを特徴とすることが観察された。これは、より微妙な移行が３日目～７日目の間に起こり得るという見解を裏づけており、９日目ｉＤＣが安定した細胞運命を獲得した可能性が示唆される。重要なこととして、これらの転写制御因子の全てが、活性化された日と無関係に、成熟ＤＣで濃縮され、ＤＣ始原体では濃縮されず、リプログラミングプロセスが中間的な始原体状態を通過しないことが示唆される（図２５Ｂ）。さらに、ｉＤＣリプログラミングプロセスにおける中間的始原細胞が存在しないことが、選別されたｓＤＣ１と、対照としての未選別の脾臓細胞および骨髄細胞を含むＤｏｘ添加後３、５、７、１０および２５日目のＰＩＢ形質導入ＭＥＦでの造血系コロニー形成アッセイを実施することにより、さらに検証された（図２５Ｃ）。ｉＤＣまたはｓＤＣ１培養物にはコロニーは観察されなかったが、予測では、培養された未選別の脾臓細胞および骨髄細胞は、コロニーの起源となった。これにより、リプログラミングプロセスが直接的であり、中間的な始原細胞を通して移行しないという見解が支持される。

【0135】

一実施形態において、細胞トランスクリプトームの緩徐な移行に基づき擬似時系列を確立することにより、ＤＣリプログラミング経路の再構築を開始した（図２７Ａ）。シングルセルＲＮＡ－ｓｅｑ解析（ＴＳＣＡＮ）ソフトウエアにおける擬似時間再構築を利用して、その系列が時間的リプログラミング事象と一致し、ＭＥＦはその後３日目ｉＤＣに、次に大部分が７日目ｉＤＣに続くことが観察された。興味深いこととして、４つの個別の７日目および幾つかの９日目ｉＤＣは、擬似系列におけるｓＤＣと一致する位置にあり、トランスクリプトームリプログラミングが完了したことが示唆される。しかし残りの９日目ｉＤＣは、脾臓ＤＣよりも初期タイムポイントからさらに離れると思われる。これらの結果のロバストネスを確証するために、分化経路を描写するための別のアルゴリズムであるＭｏｎｏｃｌｅ２を用いて擬似時系列を実施した。この再構築で、擬似時系列の３つの枝に沿った生物学的試料群を設置した（図２７Ｂ、左パネル）。ＭＥＦ、３日目ｉＤＣおよび２６の７日目ｉＤＣを、最初の枝に沿って配置させて、細胞状態１を考慮し（図２７Ｂ、右パネル）、その後、分岐点に至って、状態２および状態３に分割する。状態２は、８２％のｓＤＣおよび３つの７日目および１３の９日目ｉＤＣを含む。しかし、９日目ｉＤＣの５５％および１１のｓＤＣは、状態３に配置され、ＴＳＣＡＮの結果と一致する。これらの２つの状態の間の転写差異を理解するために、ＧＯエンリッチメント解析を、差次的発現遺伝子を用いて実施し（表３）、状態３における最上の生物学的プロセスおよび経路が、ＤＣ活性化および成熟の公知の炎症性介在物質であるＩ型およびＩＩ型（ＩＦＮ－ｙ）ＩＦＮシグナル伝達を含むことが示された（３８、３９）。状態３で濃縮された遺伝子の遺伝的撹乱により、異常なＡＰＣおよび異常な免疫系などの対応する免疫表現型が強調された。それと一致して、ＢＥＡＭ解析から、分岐依存性遺伝子の２つの速度論的クラスターが、抗原提示および他の免疫関連プロセスで機能的に濃縮された状態３（スラスター２および４）において上方制御されることが明らかとなった（図２８Ａおよび表４）。

【表3】

【表4】

【0136】

一実施形態において、ＧＳＥＡで、成熟した刺激性ＤＣ、ＩＦＮγおよびＩＦＮαで刺激されたＤＣ遺伝子セットなどの免疫シグネチャーのための４７０５対１６７の遺伝子セットが、状態２に比較して状態３で上方制御されたことも示された（図２８Ｂ）。状態３は、９日目ｉＤＣの大部分を含むため、ｓＤＣ１（ナイーブ）を９日目ｉＤＣと比較すると、類似の成熟特性が観察されることを確証しようとした。ＧＳＥＡで、抗原処理および提示、ならびにＤＣ成熟遺伝子セットが、９日目ｉＤｃで濃縮されることが示された（図２９Ａ）。興味深いこととして、未熟なＤＣに関連する状態６は、ｓＤＣ１において上方制御されたが、成熟を増加させると記載された状態１は、９日目ｉＤＣで上方制御された（図２３Ａ）。

【0137】

一実施形態において、ｉＤＣが、ＤＣの成熟に関連すると報告されたＭＨＣ－ＩＩ分子を高レベルで発現することが過去に観察されたことを前提として（図１８）、観察された擬似時間トラジェクトリーが異なる成熟状態の指標であるか否かを検討しようと努めた。分岐速度曲線（Ｂｒａｎｃｈ ｋｉｎｅｔｉｃ ｃｕｒｖｅｓ）が、ＭＨＣ－ＩＩ遺伝子発現の公知の主要制御因子であるＣｉｉｔａ、および状態２に比較して状態３に向かう複数のＭＨＣ－ＩＩ遺伝子（Ｈ２－Ａａ、Ｈ２－Ａｂ１およびＨ２－Ｅｂ１）の連続した上方制御を反映することが観察された（図３０Ａ）。これと一致して、Ｃｉｉｔａ、ならびにマウス（Ｔｎｆｒｓ１ａ、Ｔａｐｂｐ、Ｉｎｐｐ５ｄおよびＴｒａｆ６）およびヒト（Ａｃｐ５およびＩｔａｇ４）ＤＣ成熟に関連する遺伝子の発現が、９日目ｉＤＣで濃縮された（図３０Ｂ）。これらのデータから、ｉＤＣがｓＤＣよりも本質的に成熟しており、抗原提示の外来活性化刺激にあまり依存しない可能性が示唆される。

【0138】

一実施形態において、本開示の実施形態全ての幾つかの態様における誘導樹状細胞は、天然由来の内因性樹状細胞と機能的特徴が類似するものの、遺伝子発現が異なる（表５）。

【表5】

【0139】

一実施形態において、成熟ＤＣは、膜関連の共刺激分子に加えて、Ｔ細胞応答の発生に重要となる炎症促進機能を備えたサイトカインを発現する。これらの応答は、少なくとも１１の異なるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の惹起により開始することができ、異なる保存的微生物またはウイルス構造の特異的認識を可能にする。ＴＬＲ３（ポリイノシン酸－ポリシチジル酸（ｐｏｌｙ－Ｉ：Ｃ）を用いる）またはＴＬＲ４（リポ多糖（ＬＰＳ））刺激でチャレンジすると、ｉＤＣがサイトカインを培地に分泌するか否かを求めた（図３１）。ｉＤＣのＬＰＳまたはｐｏｌｙ Ｉ：Ｃチャレンジの際に、ＩＬ－６の分泌増加が観察された（それぞれ、１４倍または１０倍）。腫瘍壊死因子ＴＮＦ（７倍）およびインターフェロンＩＦＮ－γ（２倍）の分泌増加も、それぞれＬＰＳ刺激またはｐｏｌｙ Ｉ：Ｃの後に観察された。ＰＩＢ＋ＴＣＦ４（ＰＩＢＴ）を形質導入された細胞は、刺激に対して等しく応答し、ＩＬ－６、ＴＮＦおよびＩＦＮ－γの分泌増加を示す。重要なこととして、ｉＤＣの刺激の際、抗炎症性サイトカインＩＬ－１０の分泌増加は観察されなかった。これらの結果から、ｉＤＣが炎症促進性プロファイルに向かう成熟を実行したことが示唆される。

【0140】

一実施形態において、抗原特異性免疫応答を開始するｉＤＣの能力を評価した。最初に、ｉＤＣがＦＩＴＣ標識ラテックスビーズ１μｍとのインキュベーションにより粒子を貪食し得るか否かを評価した。インキュベーション後、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞は、細胞質中に数多くの蛍光ビーズを含有しており（図３２）、ｉＤＣがファゴサイトーシスへの拮抗性を確立したことが示唆される。

【0141】

その後、本発明者らは、可溶性タンパク質を捕捉するｉＤＣの能力を評価した。注目すべきこととして、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の１３．８％は、３７℃で２０分間インキュベートした後に可溶性タンパク質を活発に取り込むことができたが、対照的に４℃でインキュベートした場合にはわずか５．６％であり（図３３Ａ）、ｉＤＣがファゴサイトーシス／エンドサイトーシスへの拮抗性を確立したことがさらに示唆される。対照的に、ｔｄＴｏｍａｔｏ－細胞では、わずか４．６％が類似の能力を示した。次に本発明者らは、ｉＤＣがインビトロで死亡細胞材料を内在化し得るか否かを評価した（図３３Ｂ～Ｄ）。この特有の能力は、ＭＨＣ－Ｉ上で細胞関連抗原を交差提示するｃＤＣ１ ＤＣサブタイプに関連することが示されている（２７）。標識された死亡細胞との一夜インキュベーションの後、精製されたｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の６５．７％が、死亡細胞材料を取り込んだが、対照的にｔｄＴｏｍａｔｏ－細胞ではわずか１０．５％であった（図３３Ｂ）。死亡細胞の取り込みを、ライブ画像によりさらに分析し、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞が死亡細胞を細胞質中に貪欲に蓄積することが観察された（図３３Ｃ）。ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞は、活発に運動し、死亡細胞に遭遇すると、細胞の突起を伸ばして、それを取込み貪食する（図３３Ｄ）。

【0142】

さらに本発明者らは、ｉＤＣがＴＬＲをコードする遺伝子（Ｔｌｒ３およびＴｌｒ４）、ならびにＭｙＤ８８依存性（ＴＲＡＭ（Ｔｉｃａｍ２によりコードされる）およびＴｒａｆ６）および非依存性（ＩＫＫε）経路をはじめとするＴＬＲシグナル伝達の他のメディエータを発現することを確証した（図３４Ａ）。同じく本発明者らは、ｉＤＣが受容体介在性エンドサイトーシス（Ｆｃｇｒ２Ｂ、Ｔｆｒ２およびＭｒｃ１）および死亡細胞のマクロピノサイトーシス（Ａｘｌ、Ｌｒｐ１およびＳｃａｒｆ１）の重要なメディエータを発現することを確証しており、ｉＤＣが抗原を感知して取り込む能力を獲得したことが示唆される（図３４Ｂ）。

【0143】

一実施形態において、ＣＤ４ Ｔ細胞の抗原特異性増殖を促進するためのｉＤＣの機能的能力を評価した（図３５Ａ）。このために、ＭＨＣクラスＩＩに限定されたオボアルブミン特異性Ｔ細胞（ＯＴ－ＩＩ細胞）を、ＯＴ－ＩＩ Ｒａｇ２ ＫＯマウスのリンパ節および脾臓から単離して用いた（１８）。このモデルにおいて、Ｔ細胞は、ＤＣのＭＨＣ－ＩＩの環境下で示されると、処理された抗原ペプチド（ＯＶＡ３２３－３３９）に応答する。それゆえ、ＯＴ－ＩＩ ＣＤ４ Ｔ細胞を、オボアルブミンタンパク質（ＯＶＡ）または前処理された抗原性ペプチド（ＯＶＡ３２３－３３９）を与えた場合のｉＤＣと共培養した。機能性ＤＣは、ＭＨＣ－ＩＩの環境下ではタンパク質を捕捉して処理し、処理された抗原性ペプチドを提示することができる。誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を、共培養の７日後のＣＦＳＥ希釈およびＴ細胞活性化マーカーＣＤ４４の活性化により測定した。注目すべきこととして、ＯＶＡタンパク質の存在下でＰＩＢ生成ｉＤＣと共培養された場合に、５６％のＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＣＦＳＦを希釈した（図３５Ｂ）。ＰＩＢ＋ＴＣＦ４を形質導入されたＭＥＦと共培養された場合に、３８．２％のＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＣＦＳＥ量を希釈しており、リプログラミングプール中のＴＣＦ４の含有が、ｉＤＣの刺激能を上昇させないことが示唆される。脾臓ＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋ＤＣを対照として用い、２４．１％の増殖性Ｔ細胞を生成した。重要なこととして、ＤＣ「成熟」を誘導するために一般に用いられるＬＰＳ刺激の添加が、ＰＩＢ（１．５倍）またはＰＩＢ＋ＴＣＦ４（２倍）を形質導入されたＭＥＦ、および脾臓ＤＣ（３倍）の抗原特異性の刺激能上昇させた（図３５Ｂおよび図３６）。予測通り、共培養されなかったＴ細胞は、ＬＰＳ刺激の有無にかかわらず増殖しなかった。ｉＤＣの刺激能をさらに評定するために、それらがＣＤ４４などのＴ細胞活性化マーカーの発現を誘導し得るか否かを評価した。ＰＩＢ生成ｉＤＣおよび脾臓ＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋ＤＣの両方と共培養された場合には、前処理された抗原を与えられると、ＯＴ－ＩＩ ＣＤ４ Ｔ細胞がＣＦＳＥを希釈し、ＣＤ４４の発現を上方制御した（図３５Ｃ）。重要なこととして、ＯＶＡタンパク質を与えられると、ｉＤＣは、脾臓ＤＣに比較して、ＯＴ－ＩＩ Ｔ細胞中でＣＤ４４発現を誘導するための同等の能力を示す（５２．２％対６３．８％）。このデータにより、ＯＶＡタンパク質を取り込んで処理した後、処理されたオボアルブミンペプチドを細胞表面のＭＨＣ－ＩＩ複合体中で提示する、ｉＤＣの機能的能力が裏づけられる。総括すると、これらの結果から、ｉＤＣの機能的能力が強調され、直接リプログラミングされた線維芽細胞を用いて抗原を提示すること、および抗原特異性適応免疫応答を誘導することの実行可能性が裏づけられる。

【0144】

一実施形態において、ｉＤＣが抗原をサイトゾルに輸送する能力を獲得して、交差提示能力に必須である重要な遺伝子を発現するか否かを評価した。サイトゾル経路を介した交差提示は、細胞内区画からサイトゾルまでの抗原輸送を必要とする。したがって抗原輸送を実施するｉＤＣの能力を、細胞蛍光分析に基づくアッセイを利用して評価した（図３７Ａ）。注目すべきこととして、ｂ－ラクタマーゼとの９０分間インキュベーション後には、およそ８０％のＣＣＦ４負荷ｉＤＣが、切断されたＣＣＦ４を発現した。したがってｉＤＣは、ｂ－ラクタマーゼを取り込んで、それを細胞質に効率的に輸送し、切断されたＣＣＦ４の生成を導くことができた。同じく、ｉＤＣが、Ｃｙｂｂ、Ａｔｇ７、Ｔａｐ１およびＴａｐ２などの交差提示経路に関与する遺伝子を発現することも、確証された（図３７Ｂ）。

【0145】

一実施形態において、ｉＤＣが抗原をＣＤ８＋Ｔ細胞に交差提示し得るか否かを評価した。このために、ＭＨＣ－Ｉ分子でのＯＶＡの交差提示を、ＩＬ－２プロモーターの制御下でβ－ガラクトシダーゼを発現するＢ３Ｚ Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞とｉＤＣを共発現することにより評価した（図３８Ａ、左パネル）。ｉＤＣが抗原特異性Ｔ細胞活性化を濃度依存的に誘導し得ることが観察された。さらに、ｐｏｌｙ Ｉ：ＣでのＴＬＲ３刺激の後にＢ３Ｚ Ｔ細胞の活性化が増加し、ＬＰＳでの刺激では増加しないことが観察された（図３８Ａ、右パネル）。ｐｏｌｙ Ｉ：ＣによるｃＤＣ１の成熟が、ＭＨＣ－Ｉ交差提示プロセスを増進することが、記載されている（２８）。さらに、ＯＴ－Ｉ Ｒａｇ２ ＫＯマウスのリンパ節および脾臓から単離された、ＭＨＣクラスＩに限定されたオボアルブミン特異性Ｔ細胞（ＯＴ－Ｉ細胞）を用いて、交差提示も評価した（１９）。このモデルにおいて、Ｔ細胞は、ＤＣのＭＨＣ－Ｉの環境下で示されると、処理された抗原ペプチド（ＯＶＡ２５７－２６４）に応答する。それゆえ、ＯＴ－Ｉ ＣＤ８ Ｔ細胞を、オボアルブミンタンパク質（ＯＶＡ）およびｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ刺激の存在下でｉＤＣと共培養した（図３８Ｂ）。機能性ＤＣは、ＭＨＣ－Ｉの環境下では外来性タンパク質を捕捉して処理し、処理された抗原性ペプチドの交差提示を実施し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を誘導することができる。誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を、共培養の４日後のＣＦＳＥ希釈およびＴ細胞活性化マーカーＣＤ４４の活性化により測定した。注目すべきこととして、ＯＶＡタンパク質の存在下では、ｉＤＣと共培養された場合に、１１．３±１．１３％のＣＤ８＋Ｔ細胞が、それぞれＣＦＳＦを希釈し、ＣＤ４４発現を上方制御した（図３８Ｂ）。脾臓ＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋ＤＣを対照として用い、１８．０５±０．７８％の増殖性のＣＤ４４＋Ｔ細胞を生成した。

【0146】

一実施形態において、ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にＰＩＢを形質導入した（図３９Ａ）。重要なこととして、ＰＩＢ ＴＦがＨＤＦに導入されると、形態学的変化が観察された。形質導入の３日後に、ＨＤＦが特徴的な双極性の細長い形状を喪失し、星形のＤＣ様形態を獲得することが観察された（図３９Ｂおよび３９Ｃ）。さらに、典型的なＤＣ表面マーカーの発現を評価した。ＰＩＢを形質導入されたヒト包皮線維芽細胞ＢＪは、ＨＬＡ－ＤＲ分子と、公知の特異的ヒトＤＣマーカーであるＣＬＥＣ９Ａと、を発現しており（図４０）、ＤＣ誘導因子とＰＩＢの組み合わせがマウスとヒトの間で保存され、ヒトｉＤＣを生成するのに十分であることが示唆される。

【0147】

一実施形態において、ヒトｉＤＣがＦＩＴＣ標識ラテックスビーズ１μｍとのインキュベーションにより粒子を貪食し得るか否かを評価した。インキュベーション後に、ＰＩＢ形質導入ＨＤＦは、細胞質中に数多くの蛍光ビーズを含有しており（図４１Ａ）、ｉＤＣがファゴサイトーシスへの拮抗性を確立したことが示唆される。加えてタンパク質を取り込む能力を、ｉＤＣをＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識オボアルブミンとインキュベートすることにより評価した（図４１Ｂ）。３７℃でのインキュベーションの後、１．２％のＰＩＢ形質導入ＨＤＦが、標識タンパク質を含有しており、ｉＤＣがタンパク質を活発に貪食し得ることが示唆される。

【0148】

一実施形態において、癌細胞がＰＵ．１、ＩＲＦ８およびＢＡＴＦ３での形質導入後にＤＣ表現型特性を獲得するか否かを評価した。注目すべきこととして、Ｄｏｘ添加後８日目に細胞表面で、２．１３％のＰＩＢ形質導入肺癌細胞（３ＬＬ細胞株）が、ＭＨＣ－Ｉ分子を発現し、２．３３％が、ＭＨＣ－ＩＩおよびＣＬＥＣ９Ａを共発現した（図４２）。同様に、２６％のＰＩＢ形質導入Ｂ１６黒色腫癌細胞が、ＣＬＥＣ９Ａを発現し、１．０４％の細胞が、それをＭＨＣ－ＩＩ分子と共発現した（図４３）。これらの結果から、ＰＩＢ因子を用いて癌細胞においてＤＣ表現型を誘導し得ることが示唆される。

【0149】

一実施形態において、各配列が２Ａペプチド配列で分離されている３つの核酸配列を発現したポリシストロニック誘導性レンチウイルスベクターに、ＰＵ．１、ＩＲＦ８およびＢＡＴＦ３のコード領域をクローニングした（図４４Ａ）。３つのＴＦが、異なる順序：ＰＵ．１、ＩＲＦ８およびＢＡＴＦ３（ＰＩＢ）またはＩＲＦ８、ＰＵ．１およびＢＡＴＦ３（ＩＰＢ）で含まれた。印象的なこととして、Ｃｌｅｃ９ａレポーター活性化が、ポリシストロニックベクターを形質導入されたＭＥＦの１０．８％および６．６％（それぞれＰＩＢおよびＩＰＢ）で観察された。対照的に、わずか１．９％のｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞が、個々の因子をコードしたレンチウイルスベクターを形質導入されたＭＥＦで観察された（図４４Ｂおよび４４Ｃ）。予測通り、ポリシストロニックベクターにおけるＰＩＢ因子の送達が、リプログラミング効率を最大６倍増加させた。

【0150】

一実施形態において、各候補ＴＦのコード領域を、ＴＦの発現がテトラサイクリンオペレーターおよび最小ＣＭＶプロモーターの制御下にある誘導性レンチウイルスｐＦＵＷ－Ｔｅｔ０ベクターに個別にクローニングした（６）。構成的に活性なヒトユビキチンＣプロモーター（ＦＵＷ－Ｍ２ｒｔＴＡ）の制御下でリバーステトラサイクリントランスアクチベータＭ２ｒｔＴＡを含有する過去に記載されたレンチウイルスベクターを、組み合わせて用いた。ヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞に、ＴＦをコードするプラスミドと、パッケージング構築物と、ＶＳＶ－Ｇエンベロープタンパク質と、の混合物をトランスフェクトした。ウイルス上清を３６、４８および６０時間後に回収し、濾過して（０．４５μｍ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）、その状態で使用するか、またはＡｍｉｃｏｎ超遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で４０倍に濃縮した。

【0151】

幾つかの実施形態において、配列表に提供された配列によりコードされた参照ポリペプチドと同一または類似の活性を有するポリペプチド変異体またはファミリーメンバーを、本明細書に記載された組成物、方法およびキットで用いることができる。一般に、本明細書に記載された組成物、方法およびキットにおける使用のためのＤＣ誘導因子をコードする特定のポリペプチドの変異体は、本明細書に記載されていて当業者に公知の配列アライメントプログラムおよびパラメータによる計測で、特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％以上の配列同一性を有する。

【0152】

ホモサピエンス塩基性ロイシンジッパー型ＡＴＦ様転写因子（ＢＡＴＦ３）、ｍＲＮＡ（配列番号１）および同じアミノ酸をコードするコドン最適化された、または異なるコドンは自然に、本明細書に示された核酸に関連して含まれることが企図される。

【0153】

ホモサピエンスＳｐｉ－１癌原遺伝子（ＰＵ．１）、ｍＲＮＡ（配列番号７）および同じアミノ酸をコードするコドン最適化された、または異なるコドンは自然に、本明細書に示された核酸に関連して含まれることが企図される。

【0154】

ホモサピエンスインターフェロン制御因子８（ＩＲＦ８）、ｍＲＮＡ（配列番号５）および同じアミノ酸をコードするコドン最適化された、または異なるコドンは自然に、本明細書に示された核酸に関連して含まれることが企図される。

【0155】

ホモサピエンス転写因子４（ＴＣＦ４）、ｍＲＮＡ（配列番号１３）および同じアミノ酸をコードするコドン最適化された、または異なるコドンは自然に、本明細書に示された核酸に関連して含まれることが企図される。

【0156】

本明細書で提供された組成物、方法およびキットの幾つかの実施形態において、線維芽細胞、または造血系譜細胞、複能性幹細胞、誘導多能性幹細胞、癌または腫瘍細胞など、出発体細胞からｉＤＣを生成するのに使用または選択されるＤＣ誘導因子の数は、少なくとも３である。幾つかの実施形態において、使用または選択されるＤＣ誘導因子の数は、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも３３、少なくとも３５、少なくとも４０以上である。

【0157】

同じく該組成物、方法およびキットの様々な態様において、本明細書でも提供されるのは、ｉＤＣを作製する際の使用のための、１種または複数のＤＣ誘導因子をコードする単離されたアミノ酸配列、および単離されたＤＮＡまたはＲＮＡ核酸配列である。

【0158】

本明細書に記載された組成物、方法およびキットの幾つかの実施形態において、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、ＢＡＴＦ３およびＴＣＦ４などのＤＣ誘導因子（複数可）をコードする核酸配列または構築物が、標準の分子生物学的技術を利用して、細胞のトランスフェクションに適した発現ベクターに挿入される、または動作可能に連結される。本明細書で用いられる「ベクター」は、本明細書に記載された核酸構築物または交換カセットなど、有用な生物学的または生化学的特性を挿入されたヌクレオチド配列に提供するｄｓＤＮＡ分子などの核酸分子を指す。例としては、プラスミド、ファージ、自律複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、およびインビトロもしくは宿主細胞において複製することができる、もしくは複製される、または宿主細胞内の所望の位置に所望の核酸セグメントを運搬することができる、他の配列が挙げられる。ベクターは、１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｉ、ＩＩまたはＩＩｓ型のいずれに関わらず）を有することができ、その配列は、ベクターの本質的な生物学的機能を損失させずに計測可能な方式で切断することができ、その核酸断片は、複製およびクローニングを起こすために、スプライシングまたは挿入することができる。ベクターは、２つの核酸分子の間で核酸配列の交換を可能にする１つまたは複数の組換え部位を含むこともできる。ベクターは、例えばＰＣＲ、転写および／または翻訳開始および／または調節部位、組換えシグナル、レプリコン、さらなる選択マーカーなどのための、プライマー部位をさらに提供することができる。ベクターは、ベクターを形質転換された細胞の同定における使用に適した１種または複数の選択マーカーをさらに含むことができる。

【0159】

本明細書に記載された組成物、方法およびキットの幾つかの実施形態において、該発現ベクターは、ウイルスベクターである。幾つかのウイルス介在性発現方法は、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを用い、そのような発現方法は、遺伝子送達において用いられており、当該技術分野で周知である。

【0160】

本明細書に記載された組成物、方法およびキットの幾つかの実施形態において、該ウイルスベクターは、レトロウイルスである。レトロウイルスは、遺伝子送達のための簡便なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子を、当該技術分野で公知の技術を利用して、ベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。該組換えウイルスはその後、単離され、インビボまたはエクスビボのいずれかで対象の標的細胞に送達することができる。複数のレトロウイスル系が、記載されている。例えば米国特許第５，２１９，７４０号；Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｍａｎ（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０－９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ． Ｄ．（１９９０）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５－１４；Ｓｃａｒｐａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８０：８４９－５２； Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：８０３３－３７；Ｂｏｒｉｓ－Ｌａｗｒｉｅ ａｎｄ Ｔｅｍｉｎ（１９９３）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０２－０９を参照されたい。本明細書に記載された組成物、方法およびキットの幾つかの実施形態において、該レトロウイスルは、複製欠損である。ウイルス構造タンパク質がパッケージング細胞株にトランスに供給されることを条件に、レトロウイスルベクター系は、５’および３’ＬＴＲならびにパッケージングシグナルを含有する最小ベクターによりベクターをパッケージングさせて標的細胞に感染および組み込みを行わせるのに十分である、という事実を活用している。遺伝子移入のためのレトロウイルスベクターの基本的利点としては、ほとんどの細胞株における効率的感染および遺伝子発現、標的細胞の染色体ＤＮＡへの精密なシングルコピーベクター組み込み、ならびにレトロウイルスゲノムの操作の容易さが挙げられる。

【0161】

本明細書に記載された組成物、方法およびキットの幾つかの実施形態において、該ウイルスベクターは、アデノウイルスに基づく発現ベクターである。アデノウイルスは、宿主ゲノムに組み込むレトロウイルスとは異なり、染色体外に存在し続け、つまり挿入された突然変異原性に関連するリスクが最小限に抑えられる（Ｈａｊ－Ａｈｍａｄ ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５７：２６７－７４；Ｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７：５９１１－２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７１７－２９；Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：９３３－４０；Ｂａｒｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５１－５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ． Ｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６－２９；ならびにＲｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４６１－７６）。アデノウイルスベクターは、広範囲の細胞に感染し、広い宿主範囲を有し、高効率の感染性を示し、異種遺伝子の発現を高レベルで指揮し、インビボでそれらの遺伝子の長期発現を実現する。該ウイルスは、無細胞ビリオンとして完全に感染性であるため、産生細胞株の注射が必要でない。安全性に関して、アデノウイルスは、重度のヒト病態に関連せず、ウイルス由来の組換えベクターを、ウイルスゲノムの早期領域１（「Ｅ１」）における欠失により複製欠損にさせることができる。アデノウイルスはまた、相対的に容易に、多量に生成することができる。本明細書に記載された組成物、方法およびキットにおける使用のためのアデノウイルスベクターは、非限定的に、血清型２、５、１２、４０、および４１などの４０を超える血清型のアデノウイルス株のいずれかなど、様々なアデノウイルス血清型のいずれかに由来し得る。本明細書で用いられるアデノウイルスベクターは、好ましくは複製欠損であり、適切なプロモーターに動作可能に連結された該当するＤＣ誘導因子を含有する。

【0162】

本明細書に記載された組成物、方法およびキットの幾つかの実施形態において、ＰＵ．１、ＩＲＦ８、ＢＡＴＦ３およびＴＣＦ４などのＤＣ誘導因子（複数可）をコードする核酸配列は、１種または複数の誘導性レンチウイルスベクターを用いて導入または送達される。１種または複数の誘導性レンチウイルスベクターを用いて送達されたＤＣ誘導因子の発現の制御は、幾つかの実施形態において、動作可能に連結された誘導性プロモーターの制御下で、発現ベクターにおいて少なくとも１種のＤＣ誘導因子を有する細胞を、調節剤（例えば、ドキシサイクリン）または他の誘導剤と接触することにより、実現することができる。誘導性レンチウイルスベクターの幾つかの型を用いる場合、そのような細胞を誘導剤と接触させると、ＤＣ誘導因子の発現が誘導され、調節剤を取り出すと、発現が阻害される。誘導性レンチウイルスベクターの他の型を用いる場合、調節剤の存在が発現を阻害し、調節剤の除去が発現を可能にする。本明細書で用いられる用語「発現の誘導」は、例えば誘導剤の存在下での、または細胞における遺伝子の内因性発現を起こす１種もしくは複数の薬剤または因子の存在下での、誘導性ウイルスベクターによりコードされたＤＣ誘導因子などの遺伝子の発現を指す。

【0163】

本明細書に記載された態様の幾つかの実施形態において、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性レンチウイルス系が用いられる。レンチウイルスは、レトロウイルスと異なり、静止細胞を形質導入して、より多様な造血細胞型を形質導入させ易くする。例えばｐＦＵＷ－ｔｅｔＯレンチウイルス系は、初代造血前駆細胞を高い効率で形質導入することが示されている。

【0164】

本明細書で用いられる方法の幾つかの実施形態において、ＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）、ＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）、ＢＡＴＦ３（配列番号１、配列番号 ２）および／またはＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）などのＤＣ誘導因子（複数可）をコードする核酸配列が、非組み込みベクター（例えば、アデノウイルス）を用いて導入または送達される。レトロウイルスベクターなどの組み込みベクターは、宿主細胞ゲノムに取り込まれ、正常な遺伝子機能を潜在的に破壊することができるが、非組み込みベクターは、染色体外転写により遺伝子産物の発現を制御する。非組み込みベクターは、宿主ゲノムの一部にならないため、非組み込みベクターは、細胞集団中で核酸を一過性に発現する傾向がある。これは、一部として、非組み込みベクターが複製欠損にされることが多い、という事実によるものである。したがって、非組み込みベクターは、非限定的に、（１）宿主ゲノムの破壊がないこと、および（２）一過性発現、および（３）残余のウイルス組み込み生成物がないことなど、レトロウイルスベクターを超える複数の利点を有する。本明細書に記載された方法での使用のための非組み込みベクターの幾つかの非限定的実施例としては、アデノウイルス、バキュロウイルス、アルファウイルス、ピコルナウイルス、およびワクチンウイルスが挙げられる。本明細書に記載された方法の幾つかの実施形態において、該非組み込みベクターは、アデノウイルスである。非組み込みベクターの他の利点としては、高い力価でそれらを生成する能力、インビボでの安定性、および宿主細胞の効率的感染が挙げられる。

【0165】

本明細書に記載された組成物、方法、およびキットにおいてｉＤＣを生成する際の使用のための核酸構築物およびベクターは、幾つかの実施形態において、細胞の正および負の選択のための選択マーカーをコードする１つまたは複数の配列をさらに含み得る。そのような選択マーカーの配列は、典型的には核酸構築物の導入の非存在下では通常、細胞内で見出されない抗生物質への耐性または感受性の特性を提供することができる。選択マーカーは、抗生物質などの選択剤と共に用いて、挿入された核酸構築物を発現する細胞に合わせて培養時に選択することができる。正の選択マーカーをコードする配列は、典型的には抗生物質耐性を提供し、即ち、正の選択マーカーの配列が、細胞のゲノム中に存在する場合、該細胞は、抗生物質または薬剤に感受性がある。負の選択マーカーをコードする配列は、典型的には抗生物質または薬剤への感受性を提供し、即ち、負の選択マーカーが、細胞のゲノム中に存在する場合、該細胞は、抗生物質または薬剤に感受性がある。

【0166】

本明細書に記載された組成物、方法、およびそれらのキットにおいてｉＤＣを作製する際の使用のための核酸構築物およびベクターは、幾つかの実施形態において、該構築物の調節、発現、安定性のための他の核酸エレメント、または他のベクター遺伝子エレメント、例えば当業者に公知のプロモーター、エンハンサー、ＴＡＴＡ－ボックス、リボソーム結合部位、ＩＲＥＳをさらに含むことができる。

【0167】

本明細書に記載された組成物、方法、およびキットの幾つかの実施形態において、ＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）、ＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）、ＢＡＴＦ３（配列番号１、配列番号２）および／またはＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）などのＤＣ誘導因子（複数可）は、内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２０１２－００４６３４６－Ａ１号に記載される通り、合成された修飾ＲＮＡとして提供される、または合成された修飾ＲＮＡとして細胞内に導入もしくは送達される。合成された修飾ＲＮＡを用いて本明細書に記載された方法に従ってｉＤＣに細胞をリプログラミングするそれらの実施形態において、該方法は、例えば少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも１６回、少なくとも１７回、少なくとも１８回、少なくとも１９回、少なくとも２０回、少なくとも２５回、少なくとも３０回以上のトランスフェクションなど、細胞の反復接触を含み得る、またはＤＣ誘導因子をコードする合成された修飾ＲＮＡの反復トランスフェクションを含み得る。

【0168】

１種または複数の修飾ヌクレオチドに加えて、本明細書に記載された組成物、方法、およびキットにおける使用のための修飾ｍＲＮＡは、当業者に公知で米国特許出願公開第２０１２－００４６３４６－Ａ１号および同第２０１２０２５１６１８Ａ１号、ならびにＰＣＴ公告ＷＯ２０１２／０１９１６８号に記載された任意のさらなる修飾を含むことができる。そのような他の成分としては、例えば５’キャップ（例えば、一方のグアニンがＮ７メチル基および３’－Ｏ－メチル基を含む、５’－５’－三リン酸グアニン－グアニン結合を含むアンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップ；グアニンがＮ７メチル化を含み、最後の５’－ヌクレオチドがキャップ１を生成する２’－Ｏ－メチルを含むような、ｍＲＮＡの最も５’側のヌクレオチドとグアニンヌクレオチドとの間でカノニカル５’－５’－三リン酸結合を作製し得る、組換えワクチンウイルスキャッピング酵素および組換え２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ酵素を用いて作製されたキャップ）；ポリ（Ａ）テール（例えば、３０ヌクレオチド長より大きな、３５ヌクレオチド長より大きな、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも４５ヌクレオチド、少なくとも５５ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチド、少なくとも７０ヌクレオチド、少なくとも８０ヌクレオチド、少なくとも９０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、少なくとも１０００ヌクレオチドまたはより大きなポリ－Ａ－テール）；コザック配列；３’－非翻訳領域（３’ＵＴＲ）；５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）；核酸から切除され得る１つもしくは複数のイントロンヌクレオチド配列、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0169】

本明細書に記載された組成物、方法、およびキットにおける使用のための修飾ｍＲＮＡは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含むことができる。ＩＲＥＳは、唯一のリボソーム結合部位として作用することができ、またはｍＲＮＡの複数のリボソーム結合部位の１つとして働き得る。１つより多くの機能的リボソーム結合部位を含むｍＲＮＡは、該リボソーム（「マルチシストロニックｍＲＮＡ」）により独立して翻訳される、本明細書に記載されたＤＣ誘導因子などの複数のペプチドまたはポリペプチドをコードすることができる。核酸にＩＲＥＳが設けられている場合、さらに場合により提供されるのが、第二の翻訳可能な領域である。本発明により用いられ得るＩＲＥＳ配列の例としては、ピコルナウイルス（例えば、ＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、手足口病ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、ネズミ白血球ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＷ）、またはコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0170】

本明細書に記載された組成物、方法、およびキットの幾つかの実施形態において、該合成された修飾ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む。本明細書に記載された組成物、方法、およびキットの幾つかの実施形態において、該合成された修飾ＲＮＡ分子は、少なくとも２つの修飾ヌクレオシドを含む。

【0171】

本明細書に記載された組成物、方法、およびキットの幾つかの実施形態において、該修飾ヌクレオシドは、５－メチルシトシン（５ｍＣ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ４Ｕ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２’フルオロウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）、２’デオキシウリジン（２’ｄＵ）、４－チオウリジン（ｓ４Ｕ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２’－Ｏ－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’－Ｏ－トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、２’－Ｏ－メチルシチジン（Ｃｍ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２’－Ｏ－メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、およびイノシン（Ｉ）からなる群から選択される。幾つかの実施形態において、該修飾ヌクレオシドは、５－メチルシトシン（５ｍＣ）、シュードウラシル、またはそれらの組み合わせである。

【0172】

修飾ｍＲＮＡは、分子の長さ全体に沿って均一に修飾される必要はない。異なるヌクレオチド修飾および／またはバックボーン構造が、核酸内の様々な位置に存在し得る。当業者は、核酸の機能が実質的に低減しないように、該ヌクレオチド類似体または他の修飾（複数可）が核酸の任意の位置に配置され得ることを、察知するであろう。修飾は、５’または３’末端修飾でもあり得る。該核酸は、最小１％および最大１００％の修飾ヌクレオチド、または任意の介在するパーセント値、例えば少なくとも５０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％の修飾ヌクレオチド、または少なくとも９０％の修飾ヌクレオチドを含み得る。

【0173】

幾つかの実施形態において、分子中の所与のヌクレオシドの各出現が修飾されていること（例えば、各シトシンが修飾シトシン、例えば５－メチルシトシンであり、各ウラシルが修飾ウラシル、例えばシュードウラシルである、など）が、好ましいが、絶対に必要ではない。例えば、該修飾ｍＲＮＡは、ウラシルまたはシトシンなどの修飾ピリミジンを含むことができる、幾つかの実施形態において、核酸中のウラシルの少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％が、修飾ウラシルで置き換えられている。同じヌクレオシドの異なる出現が、所与の合成された修飾ＲＮＡ分子内で異なる方法で修飾され得ることもまた、企図される。該修飾ウラシルは、単一の特有構造を有する化合物で置き換えることができ、または異なる構造（例えば２、３、４以上の特有構造）を有する複数の化合物で置き換えることができる。幾つかの実施形態において、核酸中のシトシンの少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％が、修飾シトシンで置き換えられていてもよい。該修飾シトシンは、単一の特有構造を有する化合物で置き換えることができ、または異なる構造（例えば２、３、４以上の特有構造）を有する複数の化合物で置き換えることができる（例えば、５ｍＣとして修飾された幾つかのシトシン、２’－Ｏ－メチルシトシンまたは他のシトシン類似体として修飾された他のもの）。ＲＮＡ分子が合成されている場合に、所望の修飾ヌクレオシドのみが、ＤＣ誘導因子をコードする得られたＲＮＡ分子に取り込まれるように、そのような多重修飾合成ＲＮＡ分子は、所望の修飾ヌクレオシド全てを含むリボヌクレオシドブレンドまたは混合物を用いることにより生成することができる。

【0174】

特定の実施形態において、例えばタンパク質生成の精密なタイミングが望ましい場合には、細胞に導入される修飾核酸を細胞内で分解することが望ましい。したがって、本明細書に記載された組成物、方法、およびキットの幾つかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、細胞内での指揮された手法で作用され得る分解ドメインを含む修飾核酸である。

【0175】

ｉＤＣが、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはアミノ酸配列の形態でのＤＣ誘導因子の送達により生成され得ることは理解されるであろうが、本明細書に記載された組成物、方法、およびキットの幾つかの実施形態において、例えば１種または複数のＤＣ誘導因子の発現を誘導する小分子または小分子カクテルなどの薬剤での細胞の処置によってなど、他の方法を用いて、ｉＤＣ誘導が誘導され得る。

【0176】

本明細書に記載された組成物、方法、およびキットを用いて細胞に導入される、または細胞集団に誘導されるＤＣ誘導因子の発現の検出が、例えばウェスタンブロット分析、免疫細胞化学的測定、および蛍光外在性検出をはじめとする当業者に公知の複数の技術のいずれかにより実現され得る。

【0177】

ＤＣ誘導因子の所与の組み合わせがｉＤＣを生成したか否かを識別するために、１種または複数のＤＣ活性またはパラメータ、例えば幾つかの実施形態において、表面抗原の差次的発現を測定することができる。本明細書に記載された組成物、方法、およびキットを用いた誘導ＤＣの生成が、好ましくは例えばＣＬＥＣ９Ａ、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０３などの内因性ＤＣの特徴である細胞表面表現型を出現させる。

【0178】

ＤＣは、最も確実には機能的挙動により他の免疫細胞から識別される。抗原特異性Ｔ細胞応答を誘導する樹状細胞の能力など、ＤＣ表現型または樹状細胞活性の機能的態様は、当該技術分野で公知であり本明細書に記載される、例えば図面に、即ち図１～４４に記載される日常的方法を用いて、当業者により容易に決定され得る。本明細書に記載された態様の幾つかの実施形態において、リプログラミング因子を同定する機能的アッセイを用いることができる。例えば幾つかの実施形態において、抗原提示および抗原交差提示アッセイを用いて、その組成物、方法およびそれらのキットを用いて生成されたｉＤＣのＴ細胞応答の抗原特異性誘導（抗原提示の可能性）を確証することができる。サイトカイン分泌を用いて、本明細書に記載された組成物、方法、およびキットを用いて生成されたｉＤＣの免疫調整特性を確証することができる。本明細書に記載された組成物、方法、およびキットを用いて生成されたｉＤＣの粒子、タンパク質および死亡細胞を貪食する能力は、それぞれ標識されたビーズ、オボアルブミンまたは死亡細胞の存在下で形質導入された細胞を培養して、フローサイトメトリー分析を行うことにより、評価することができる。

【0179】

本明細書で用いられる「細胞パラメータ」、「ＤＣパラメータ」または「抗原提示活性」は、内因性または自然ＤＣの測定可能成分または量、特に正確に測定され得る成分を指す。細胞パラメータは、細胞の表現型、機能または挙動に関する任意の測定可能パラメータであり得る。そのような細胞パラメータとしては、細胞表面決定基、受容体、立体配座または翻訳後修飾を含むタンパク質、脂質、炭水化物、有機または無機分子、核酸、例えばｍＲＮＡ、ＤＮＡ、全体的な遺伝子発現パターンなどの、生存性、細胞成長、マーカーの１種もしくは複数、または組み合わせの発現における変動を含むが、これらに限定されない、ＤＣまたはＤＣ集団の特徴およびマーカーにおける変動が挙げられる。そのような細胞パラメータは、当業者に公知の種々のアッセイのいずれかを用いて測定することができる。例えば、生存性および細胞成長は、トリパンブルー色素排除、ＣＦＳＥ希釈、および３Ｈ－チミジン取り込みなどのアッセイにより測定することができる。タンパク質またはポリペプチドマーカーの発現は、例えばフローサイトメトリーアッセイ、ウェスタンブロット技術、または顕微鏡測定法を利用して測定することができる。遺伝子発現プロファイルは、例えばＲＮＡ配列決定法および定量的または半定量的リアルタイムＰＣＲアッセイを利用して、アッセイすることができる。細胞パラメータはまた、機能的パラメータまたは機能的活性を指すこともできる。ほとんどの細胞パラメータは、定量的読み出し情報を提供するであろうが、幾つかの例において、半定量的または定量的結果が許容され得る。読み出し情報としては、単一の計測値を挙げることができ、または平均値、中央値もしくは分散などを挙げることができる。特徴的には、一定範囲のパラメータ読み出し値が、複数の同じアッセイからの各パラメータについて得ることができる。可変性が予測され、テストパラメータのセットのそれぞれについての値範囲は、標準的統計方法を、単一の値を提供するのに用いられる一般的な統計方法と共に用いて得られるであろう。

【0180】

本明細書に記載された組成物、方法、およびキットの幾つかの実施形態において、さらなる因子および薬剤を用いて、ｉＤＣリプログラミングを増進することができる。例えばエピジェネティックな経路を修飾する因子および薬剤を用いて、ｉＤＣへのリプログラミングを促進することができる。

【0181】

本質的には、任意の初代体細胞型を、本明細書に記載された組成物、方法およびキットに従って、ｉＤＣを生成するため、または体細胞をｉＤＣにリプログラミングするために用いることができる。そのような初代体細胞型はまた、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性幹細胞；他の複能性幹細胞；寡能性幹細胞；および（５）単能性幹細胞をはじめとする他の幹細胞型を包含する。本明細書に記載された方法の様々な態様および実施形態において有用な初代体細胞の幾つかの非限定的例としては、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、脂肪細胞、心臓細胞、骨格筋細胞、造血または免疫細胞、幹細胞、脾臓細胞、胚細胞、循環血細胞、胃腸細胞、腎臓細胞、骨髄細胞、および膵臓細胞、ならびにそれらの細胞を誘導する幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。該細胞は、非限定的に、脾臓、骨髄、血液、脳、肝臓、肺、消化管、胃、腸、脂肪、筋肉、子宮、皮膚、脾臓、内分泌系、臓器、骨などをはじめとする任意の体細胞組織から単離された初代細胞であり得る。用語「体細胞」は、体細胞が不死化されていないことを前提に、幾つかの実施形態において、培養で生育された初代細胞をさらに包含する。該細胞が、インビトロ条件下で維持される場合、従来の組織培養条件および方法を用いることができ、それは当業者に公知であり、様々な初代体細胞のための単離および培養方法は、当業者の能力に充分含まれる。

【0182】

本明細書に記載されたこれらの態様およびそのような全ての態様の幾つかの実施形態において、該体細胞は、線維芽細胞である。

【0183】

本明細書に記載されたこれらの態様およびそのような全ての態様の幾つかの実施形態において、該体細胞は、造血系譜の細胞であり得る。

【0184】

本明細書に記載されたこれらの態様およびそのような全ての態様の幾つかの実施形態において、該体細胞は、癌細胞または腫瘍細胞であり得る。

【0185】

本明細書に記載された組成物、方法およびキットの幾つかの実施形態において、ｉＤＣにリプログラミングまたは作製される体細胞は、造血系起源の細胞である。本明細書で用いられる用語「造血系由来細胞」、「造血系由来分化細胞」、「造血系譜の細胞」および「造血起源の細胞」は、複能性造血幹細胞（ＨＳＣ）から誘導または分化された細胞を指す。したがって本明細書に記載された組成物、方法およびキットでの使用のための造血系譜の細胞としては、複能性、寡分化性、および系譜限定の造血前駆細胞、顆粒球（例えば、前骨髄球、赤血球）、赤血球（例えば、網状赤血球、赤血球）、血小板（例えば、巨核球、巨核球を産生する血小板、血小板）、単球（例えば、単球、マクロファージ）、樹状細胞、およびリンパ球（例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を担うＴリンパ球、免疫グロブリンを発現して抗体を産生するＢリンパ球またはＢ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、および自然リンパ球）が挙げられる。本明細書で用いられる用語「造血前駆細胞」は、非限定的に、顆粒球、単球、赤血球、巨核球、ならびにリンパ球Ｂ細胞およびＴ細胞をはじめとする造血系の２種以上の細胞型に分化することが可能な複能性、寡分化性、および系譜限定の造血細胞を指す。造血前駆細胞は、複能性始原細胞（ＭＰＰ）、共通骨髄始原細胞（ＣＭＰ）、共通リンパ始原細胞（ＣＬＰ）、顆粒球－単球始原細胞（ＧＭＰ）、およびｐｒｅ巨核球－赤血球始原細胞を包含する。系譜限定の造血前駆細胞としては、巨核球－赤血球始原細胞（ＭＥＰ）、ＰｒｏＢ細胞、ＰｒｅＢ細胞、ＰｒｅＰｒｏＢ細胞、ＰｒｏＴ細胞、二重陰性Ｔ細胞、ｐｒｏＮＫ細胞、ｐｒｅ顆粒球／マクロファージ細胞、顆粒球／マクロファージ始原（ＧＭＰ）細胞、およびＰｒｏ肥満細胞（ＰｒｏＭＣ）が挙げられる。造血系譜の分化チャートを、図１に提供する。

【0186】

本明細書に記載された組成物、方法およびキットにおける使用のための造血起源の細胞は、胎児組織、臍帯血、骨髄、末梢血、動員された末梢血、脾臓、肝臓、胸腺、リンパなど、これらの細胞を含むことで知られる任意の供給源から得ることができる。これらの供給源から得られた細胞は、当業者に許容できる任意の方法を利用してエクスビボで増大されて、本明細書に記載されたｉＤＣを作製するための組成物、方法、およびキットで使用することができる。例えば、当業者に許容できる任意の手順を利用して、細胞を選別して画分し、処理して、特異的細胞型を除去し、または他の方法で操作して、本明細書に記載された方法における使用のための細胞の集団を得ることができる。単核リンパ球を、例えば米国特許第４，６９０，９１５号に記載された連続フロー細胞分離装置を用いて反復白血球フェレーシスにより、回収されてもよい、あるいは血球計数器を用いたフローサイトメトリー、抗体もしくはタンパク質コーティングビーズを用いた磁気分離、特異的タンパク質もしくはタンパク質型の発現もしくは発現欠如により細胞を基質に保持するアフィニティークロマトグラフィーもしくは固体担体アフィニティー分離、または該当する細胞型により特異的に発現される１種もしくは複数の表面抗原に対する１種もしくは複数の抗体を利用したバッチ精製などのＣＬＰ方法のアフィニティー精製ステップを利用して単離されてもよい。造血起源の細胞は、末梢血から得ることもできる。末梢血からの細胞の採取の前に、対象を、例えば顆粒球－コロニー刺激因子などのサイトカインで処理して、骨髄から血液区画への細胞遊走を促進し、かつ／または該当する集団の活性化および／もしくは増殖を促進することができる。例えば表面タンパク質を同定するのに適した任意の方法を用いて、異種集団から造血起源の細胞を単離することができる。幾つかの実施形態において、リンパ球などの造血起源の細胞のクローン集団を得ることができる。幾つかの実施形態において、造血起源の細胞は、クローン集団ではない。

【0187】

さらに、本明細書に記載された組成物、方法およびキットの様々な態様および実施形態に関係して、体細胞は、非限定的例としてネズミ、ウシ、サル、ブタ、ウマ、ヒツジ、またはヒト細胞をはじめとする任意のホ乳動物種から得ることができる。幾つかの実施形態において、該体細胞は、ヒト細胞である。幾つかの実施形態において、該細胞は、非ヒトホ乳動物などの非ヒト生物体のものである。

【0188】

本明細書に記載されたｉＤＣを作製するための方法は、当業者に利用可能で周知である任意の培地において、造血起源の細胞などの体細胞を培養すること、または増大させることを含む。そのような培地として、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ Ｆ１２ Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）、Ｆ－１２Ｋ Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）、ＲＰＭＩ－１６４０ Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）、ならびにＤＣの培養および増大用の無血清培地が挙げられるが、これらに限定されない。多くの培地はまた、ナトリウムを含む、または含まない低糖配合物として入手できる。本明細書に記載された方法で用いられる培地は、幾つかの実施形態において、１種または複数の免疫刺激性サイトカインを補充することができる。一般に用いられる成長因子としては、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－４、Ｆｌｔ－３リガンドおよびｋｉｔリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、好ましい実施形態において、該免疫刺激性サイトカインは、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ－β）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、Ｆｌｔ－３リガンドおよびｋｉｔリガンドからなる群から選択される。

【0189】

培養される細胞は、例えば懸濁させて、または細胞外マトリックス成分などの固体担体に付着されて、または例えばフィーダー細胞などに播種して、維持することができる。本明細書に記載された方法で用いられる細胞は、固体担体、幾つかの実施形態ではＩ型およびＩＩ型コラーゲン、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチン、「スーパーフィブロネクチン」およびフィブロネクチン様ポリマー、ゼラチン、ポリ－Ｄおよびポリ－Ｌ－リシン、トロンボスポンンジン、およびビトロネクチンなどへの付着を促進するさらなる因子を必要とし得る。幾つかの実施形態において、該細胞は、懸濁培養における成長に適する。懸濁コンピーテント宿主細胞は、概ね単分散であるか、または実質的な凝集を含まない緩い凝集体の中で成長する。懸濁コンピーテント宿主細胞としては、適合または操作を行わずに懸濁培養に適する細胞（例えば、リンパ細胞などの造血起源の細胞）、および付着依存性細胞（例えば、上皮細胞、線維芽細胞）の修飾または適合により懸濁コンピーテントにされた細胞が挙げられる。

【0190】

本明細書に記載されたこれらの態様およびそのような全ての態様の幾つかの実施形態において、該単離された誘導樹状細胞（ｉＤＣ）は、必要とする対象への投与のために、医薬的に許容できる担体をさらに含む。

【0191】

同じく幾つかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されたＤＣ誘導組成物およびｉＤＣを調製する方法を利用して、または本明細書に記載されたＤＣ誘導因子、ＤＣ誘導組成物もしくはｉＤＣを調製する方法の組み合わせのいずれかを利用して生成された、単離された誘導樹状細胞（ｉＤＣ）およびその細胞クローンを利用して、抗原特異性免疫応答を誘導し、癌細胞または感染物質を排除する処置を必要とする対象を処置する方法である。そのような処置方法において、線維芽細胞または造血系譜の細胞などの体細胞を最初、対象から単離し、単離された細胞に、それぞれ発現ベクターまたは合成ｍＲＮＡを含むＤＣ誘導組成物を、本明細書に記載された通り形質導入またはトランスフェクトすることができる。本明細書に記載されたＤＣ誘導因子、ＤＣ誘導組成物、またはｉＤＣを調製する方法の組み合わせのいずれかを利用して生成された単離された誘導樹状細胞（ｉＤＣ）をその後、対象へのｉＤＣの全身注射を介するなど、対象に投与することができる。

【0192】

同じく幾つかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されたＤＣ誘導組成物、およびＤＣ誘導因子の組み合わせのいずれかを利用して、抗原特異性免疫応答を誘導して、癌細胞または乾癬物質を排除する処置を必要とする対象を処置する方法である。そのような処置方法において、該細胞に、発現ベクターを含むＤＣ誘導組成物を、本明細書に記載された通り形質導入する。癌細胞を最初、対象から単離し、発現ベクターを含むＤＣ誘導組成物を該細胞に形質導入し、その後、全身注射を介するなど、対象に投与することができる。該修飾された癌細胞は、抗原提示能力を獲得し、それらの腫瘍抗原をＴ細胞に提示して、Ｔ細胞自体への細胞傷害性応答を排除する。

【0193】

本明細書に記載された組成物、方法およびキットを用いて生成されたリプログラムされたｉＤＣは、本明細書に記載された処置方法の幾つかの実施形態において、直接使用するか、または免疫療法を必要とする対象に投与することができる。したがって、本明細書に記載された方法の様々な実施形態は、細胞療法を必要とする個体または対象への、本明細書に記載された組成物、方法、およびキットのいずれかを利用して生成されたｉＤＣまたはｉＤＣ集団の有効量の投与を含む。投与される細胞または細胞集団は、自家性集団であり得る、または１種もしくは複数の異種供給源に由来し得る。さらにそのようなｉＤＣは、リンパ節に遊走させてエフェクターＴ細胞を活性化させる手法で、投与することができる。

【0194】

細胞を対象に投与するための種々の手段が、当業者に公知である。そのような方法としては、全身注射、例えば静脈注射、または対象の標的部位への細胞植え込みを挙げることができる。細胞は、対象への注射または植え込みによる導入を容易にする送達デバイスに挿入されてもよい。そのような送達デバイスとしては、レシピエント対象の身体に細胞および流体を注射するためのチューブ、例えばカテーテルを挙げることができる。１つの好ましい実施形態において、該チューブはさらに、例えば細胞を所望の位置で対象に導入し得る、針を有する。該細胞は、種々の異なる形態で送達されるように調製することができる。例えば該細胞は、溶液もしくはゲルに懸濁することができ、またはそのような送達デバイスに含まれると、支持マトリックス中に埋入することができる。細胞が生存性を維持するような医薬的に許容できる担体または希釈剤と、細胞を混合することができる。

【0195】

したがって、本明細書に記載された方法により生成された細胞を用いて、非限定的に乳癌、前立腺癌、リンパ腫、皮膚癌、膵臓癌、結腸癌、黒色腫、悪性黒色腫、卵巣癌、脳癌、原発性脳癌腫、頭頸部癌、膠腫、膠芽腫、肝臓癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、頭部または頸部癌腫、乳房癌腫、卵巣癌腫、肺癌腫、小細胞肺癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌腫、精巣癌腫、膀胱癌腫、膵臓癌腫、胃癌腫、結腸癌腫、前立腺癌腫、尿生殖器癌腫、甲状腺癌腫、食道癌腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、副腎癌腫、腎細胞癌腫、子宮内膜癌腫、副腎皮質癌腫、悪性膵臓インスリノーマ、悪性カルチノイド癌腫、絨毛癌腫、菌状息肉腫、悪性高カルシウム血症、子宮頸部過形成、白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性顆粒球性白血病、毛様細胞白血病、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、真性多血症、本態性血小板増加症、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、軟組織肉腫、骨肉腫、原発性マクログロブリン血症、および網膜芽細胞腫などをはじめとする複数の癌および腫瘍を処置または緩和するように細胞を調製することができる。

【0196】

上述のことに加えて、本発明の方法を用いて、特定の癌に罹患し易くなることが知られる病原体による感染を予防または排除することができる。本明細書で提供された癌ワクチン中での使用のための特別な関心がある病原体としては、Ｂ型肝炎ウイルス（肝細胞癌腫）、Ｃ型肝炎ウイルス（肝癌（ｈｅｐｔｏｍａｓ））、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）（バーキットリンパ腫、鼻咽頭癌、免疫抑制された個体におけるＰＴＬＤ）、ＨＴＬＶＬ（成人Ｔ細胞白血病）、発癌性ヒトパピローマウイルス１６、１８、３３、４５型（成人子宮頸癌）、およびヘリコバクター・ピロリ菌（Ｂ細胞胃リンパ腫）が挙げられる。他の医療的に関係がありホ乳動物、より詳細にはヒトにおいて抗原として働き得る微生物は、文献、例えばＣ． Ｇ． Ａ Ｔｈｏｍａｓ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ Ｔｉｎｄａｌｌ，（１９８３）に詳細に記載されている。

【0197】

上述のことに加えて、本発明の方法は、ウイルス感染に用いることができる。模範的なウイルス病原体としては、ホ乳動物、より詳細にはヒトに感染する感染性ウイルスが挙げられるが、これに限定されない。感染性ウイルスの例としては、レトロウイスル科（例えば、ＨＩＶ－Ｉ（ＨＴＬＶ－ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ－ＩＩＩ／ＬＡＶまたはＨＩＶ－ＩＩＩとも称される）およびＨＩＶ－ＬＰなどの他の単離物などのヒト免疫不全ウイルス）；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カリシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、胃腸炎を誘発する株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；フラビウイルス科（ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ＳＡＲＳコロナウイルスなどのコロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えばエボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（例えば、ハンタンウイルス、ブニヤウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、およびロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型および２型、水痘－帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；ポックスウイルス科（Ｐ．ｏｘｙｉｒｉｄａｅ）（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびイリドウイルス科（例えばアフリカブタ熱ウイルス）；ならびに未分類のウイルス（例えば、海綿状脳症の病原体、デルタ肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損型サテライト（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ）であると考えられる）、非Ａ非Ｂ型肝炎の病原体（クラス１＝内因的に伝染するもの；クラス２＝非経口的に伝染するもの（即ち、Ｃ型肝炎）；ノーウォークウイルスおよび関連ウイルス、ならびにアストロウイルス）などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0198】

上述のことに加えて、本発明の方法を用いて、脊髄動物のグラム陰性およびグラム陽性菌を標的にすることができる。そのようなグラム陽性菌としては、パスツレラ属の菌種、ブドウ球菌の菌種、および連鎖状球菌属の菌種が挙げられるが、これらに限定されない。グラム陰性菌としては、大腸菌、シュードモナス属の菌種、およびサルモネラ属の菌種が挙げられるが、これらに限定されない。感染性細菌の特異的例としては、ヘリコバクター・ピロリ、ボレリア・ブルグドルフェリ、レジオネラ・ニューモフィリア、マイコバクテリウム属の菌種（例えば、Ｍ．ツベルクローシス、Ｍ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーレ、Ｍ．カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ）、Ｍ．ゴルドネ）、黄色ブドウ球菌、ナイセリア・ゴノレー、ナイセリア・メニンギティディス、リステリア・モノサイトゲネス、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｂ群連鎖球菌）、連鎖球菌（緑色）、ストレプトコッカス・フェカリス、ストレプトコッカス・ボビス、連鎖球菌（嫌気性の菌種）、ストレプトコッカス・ニューモニエ、病原性カンピロバクター菌、腸球菌の菌種、インフルエンザ菌、炭疽菌、ジフテリア菌、コリネバクテリウム属の菌種、豚丹毒菌、ウェルシュ菌、破傷風菌、エンテロバクター・エアロゲネス、クレブシエラ・ニューモニエ、パスツレラ・ムルトシダ、バクテロイデス属の菌種、フソバクテリウム・ナクレタム、ストレプトバシラス・モニフォルミス、トレポネーマ・パリジウム、トレポネーマ・ペルテヌエ、レプトスピラ、チケッチアおよびアクチノマイセス・イスラエリが挙げられるが、これらに限定されない。

【0199】

上述のことに加えて、本発明の方法を用いて、非限定的にホ乳動物、より詳細にはヒトに感染する感染性真菌および寄生虫をはじめとする病原体を標的とすることができる。感染性真菌の例としては、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、コクシディオイデス・イミティス、ブラストマイセス・デルマティティディス、クラミジア・トラコマティス、およびカンジダ・アルビカンスが挙げられるが、これらに限定されない。

【0200】

上述のことに加えて、本発明の方法を用いて、細胞内寄生虫および偏性細胞内寄生虫などの寄生虫を標的とすることができる。寄生虫の例としては、熱帯熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、二日熱マラリア原虫、ネズミバベシア、多型バベシア、トリパノソーマ・クルージ、トキソプラズマ・ゴンディ、トリヒネラ・スピラリス、森林型熱帯リーシュマニア、リーシュマニア・ドノバニ、リーシュマニア・ブラジリエンシス、リーシュマニア・トロピカ、トリパノソーマ・ガンビエンス、トリパノソーマ・ローデシエンス、ウケレリア・バンクロフティ、ブルギア・マライ、ブルギア・チモリ、アスカリス・ランブリコイデス、オンコセルカ・ボルブルスおよびマンソン住血吸虫が挙げられるが、これらに限定されない。

【0201】

修飾された誘導樹状細胞を、１種または複数の標的抗原への将来または既存の免疫応答の抑制を含む寛容原性応答を誘導するために用い得る場合。したがってＤＣを誘導するのは、例えば移植片拒絶、移植片対宿主病、アレルギー、寄生虫疾患、炎症性疾患および自己免疫疾患をはじめとする望ましくない免疫応答を処置または予防するのに有用である。本発明に従って処置または予防され得る移植片拒絶の例としては、骨髄の移植、および心臓、肝臓、膵臓、腎臓、肺、目、皮膚などの臓器の移植に関連する拒絶が挙げられる。アレルギーの例としては、季節性呼吸器アレルギー；枯草熱などの空中アレルゲンへのアレルギー；血清ＩｇＥおよび好酸球増加を低減することにより処置可能なアレルギー；喘息；湿疹；動物アレルギー；食物アレルギー；ラテックスアレルギー；皮膚炎；またはアレルギー減感作により処置可能なアレルギーが挙げられる。本発明により処置または予防され得る自己免疫疾患としては、例えば乾癬、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、スティッフマン症候群、甲状腺炎、シデナム舞踏病、関節リウマチ、糖尿病、および多発性硬化症が挙げられる。炎症性疾患の例としては、クローン病、慢性炎症性眼疾患、慢性炎症性肺疾患および慢性炎症性肝疾患、自己免疫性溶血性貧血、特発性白血球減少症、潰瘍性大腸炎、皮膚筋炎、強皮症、混合性結合組織病、過敏性腸症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群（抗リン脂質症候群）、原発性粘液浮腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、シェーグレン症候群、関節リウマチ、交感性眼炎、橋本病／甲状腺機能低下、セリアック病／疱疹状皮膚炎、脱髄性疾患、原発性胆汁性肝硬変、混合性結合組織病、慢性活動性肝炎、グレーブス病／甲状腺機能亢進症、強皮症、慢性特発性血小板減少性紫斑症、糖尿病性腎症および敗血症性ショックが挙げられる。

【0202】

医薬的に許容できる担体および希釈剤としては、生理食塩水、水性緩衝溶液、溶媒および／または分散媒が挙げられる。そのような担体および希釈剤の使用は、当該技術分野で周知である。該溶液は、好ましくは滅菌性であり、流体である。好ましくは、細胞導入の前に、該溶液は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの使用により、製造および貯蔵の条件下で安定しており、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から防護される

【0203】

細胞投与様式が例えば静脈注射、吸入による肺送達、局所、または鼻内投与により、相対的に非侵襲性であることが好ましい。しかし、該細胞投与経路は、処置さえる組織に依存することになり、植え込みを包含し得る。細胞送達のための方法は、当業者に公知であり、本明細書に記載された方法および組成物での利用については、医薬品の当業者によって推定され得る。

【0204】

同じく幾つかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載された１種または複数の発現ベクター成分を含むＤＣ誘導組成物のいずれかを含む、誘導樹状細胞（ｉＤＣ）を作製するためのキットである。

【0205】

同じく幾つかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載された誘導樹状細胞を作製する方法のための成分としての、本明細書に記載されたＤＣ誘導因子の１種または複数を含むキットである。

【0206】

したがって、幾つかの態様において、本明細書で提供されるのは、以下の成分：（ａ）ＢＡＴＦ３（配列番号１、配列番号２）、ＳＰＩＢ（配列番号３、配列番号４）、ＩＲＦ８（配列番号５、配列番号６）、ＰＵ．１（配列番号７、配列番号８）、ＳＴＡＴ３（配列番号１１、配列番号１２）、ＴＣＦ４（配列番号１３、配列番号１４）、ＩＫＺＦ１（配列番号１５、配列番号１６）、ＩＤ２（配列番号１７、配列番号１８）、ＢＣＬ１１Ａ（ＳＥＱ． ＩＤ．１９、配列番号２０）、ＲＥＬＢ（配列番号２１、配列番号２２）、ＺＢＴＢ４６（配列番号２３、配列番号２４）、ＲＵＮＸ３（配列番号２５、ＳＥＱ： ＩＤ． ２６）、ＧＦＩ１（配列番号２７、配列番号２８）、ＩＲＦ２（配列番号２９、配列番号３０）、ＮＦＩＬ３（配列番号３１、配列番号３２）、ＢＣＬ６（配列番号３３、配列番号３４）、Ｌ－ＭＹＣ（配列番号３５、ＳＥＱ． ＩＤ．３６）、ＮＲ４Ａ３（配列番号３７、配列番号３８）から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８種以上のＤＣ誘導因子をコードする１種または複数の発現ベクターと、（ｂ）それらのための包装および使用説明書導入と、を含む誘導樹状細胞を調製するためのキットである。

【0207】

幾つかの実施形態において、本明細書に記載されたキットはさらに、該合成ｍＲＮＡまたはＤＣ誘導因子をコードする１種もしくは複数の発現ベクターを、混和物として、または分離したアリコットとして提供することができる。

【0208】

幾つかの実施形態において、該キットは、リプログラミングの効率を増進するための薬剤をさらに含むことができる。幾つかの実施形態において、該キットは、樹状細胞状態に誘導された細胞を同定するために細胞型特異性マーカーを検出する１種または複数の抗体またはプライマー試薬をさらに含むことができる。

【0209】

幾つかの実施形態において、該キットは、緩衝剤をさらに含むことができる。幾つかのそのような実施形態において、該緩衝液は、ｐＨ７．０のＲＮａｓｅ不含のＴＥ緩衝液である。幾つかの実施形態において、該キットは、細胞培養培地を含むコンテナをさらに含む。

【0210】

本明細書に記載されたキットの全てが、緩衝剤、細胞培地、形質導入もしくはトランスフェクション媒体、および／または媒体サプリメントをさらに含むことができる。好ましい実施形態において、該緩衝剤、細胞培地、トランスフェクション媒体、および／または媒体サプリメントは、ＤＮＡａｓｅおよびＲＮＡａｓｅ不含である。幾つかの実施形態において、該キット中で提供される合成された修飾ＲＮＡは、エンドユーザーが適切な量の緩衝剤または媒体を添加して、該成分を所望の濃度、例えば１００ｎｇ／μｌにするように、凍結乾燥粉末など、特定量または質量、例えば２０μｇの非溶液形態であり得る。

【0211】

本明細書に記載されたキットの全てが、非植え込み可能な送達デバイス、例えば針、シリンジ、ペンデバイス、または植え込み可能な送達デバイス、例えばポンプ、半永久型ステント（例えば、静脈内、腹腔内、大槽内または関節内）、またはリザーバーなど、本明細書に記載されたキット成分を利用して作製される細胞の単回投与または反復もしくは頻回輸液を容易にするデバイスをさらに含むことごとができる。幾つかのそのような実施形態において、該送達デバイスとしては、ｉＤＣを含む医薬組成物の単一用量を分配する機器を挙げることができる。幾つかの実施形態において、該デバイスは、該組成物を連続で、例えば拡散により放出する。幾つかの実施形態において、該デバイスとしては、対象内のパラメータをモニタリングするセンサーを挙げることができる。例えば該デバイスはポンプ、例えば、任意選択的に関連の電子装置を含むことができる。

【0212】

一実施形態において、誘導樹状細胞は、例えば、体細胞、多能性細胞、始原細胞もしくは幹細胞の本明細書に開示された因子の少なくとも１種の遺伝子発現を修飾することにより、または本明細書に開示された少なくとも１種のタンパク質を生成する少なくとも１種のタンパク質もしくはＲＮＡにこれらの細胞型の任意の１種を暴露することにより、人の手によって作製される。該細胞はさらに、それらを、本明細書に開示された因子の少なくとも１種を刺激する小分子に暴露することにより作製することができる。幾つかの態様において、少なくとも２、３、４、５、６、７、または８種の因子を用いて、誘導樹状細胞を作製する。

【0213】

一実施形態において、開示の実施形態全ての幾つかの態様における該誘導樹状細胞は、天然由来の内因性樹状細胞と、機能的特徴が類似しているが遺伝子発現が顕著に異なる。

【0214】

一実施形態において、本明細書に記載された誘導樹状細胞は、翻訳後修飾シグネチャーおよびそれらの遺伝子発現シグネチャーの両方が、天然由来の樹状細胞と異なる。

【0215】

一実施形態において、本明細書に記載された誘導樹状細胞は、インビトロで接着培養物として成長し、培養で１ヶ月以上生き残る能力が、天然由来の樹状細胞と異なる。

【0216】

一実施形態において、誘導樹状細胞はまた、天然由来の樹状細胞と異なる遺伝子発現シグネチャーを含むと定義される。天然由来の樹状細胞の遺伝子発現パターンを該誘導樹状細胞のものと比較することにより、差異を実験的に示すことができる。それゆえ、本発明の幾つかの実施形態全ての幾つかの態様において、該誘導樹状細胞は、特異的遺伝子の約１～５％、２～５％、３～５％、最大５０％、最大４０％、最大３０％、最大２５％、最大２０％、最大１５％、または最大１０％の発現シグネチャーと異なる、約１～５％、５～１０％、５～１５％または５～２０％の発現シグネチャーを含む。例えば、ｉＤＣにおけるＰＵ．１、ＩＲＦ８、ＢＡＴＦ３およびＴＣＦ４などのＤＣ誘導因子（複数可）の発現レベルは、ＤＣ誘導因子が過剰発現されているため、天然由来ＤＣよりも高い。

【0217】

一実施形態において、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を単離して、以下の方法で精製される：Ｃｌｅｃ９ａＣｒｅ／Ｃｒｅ動物（１０）をＲｏｓａ２６－ｓｔｏｐｆｌｏｘ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）と交配させて、二重ホモ接合Ｃｌｅｃ９ａ^{Ｃｒｅ／Ｃｒｅ} Ｒｏｓａ^{ｔｄＴｏｍａｔｏ／ｔｄＴｏｍａｔｏ}（Ｃ９Ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）マウスを作製した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス、Ｒａｇ２構成ノックアウト（ＫＯ）／ＯＴ－ＩＩランダムトランスジェニック（Ｒａｇ２ＫＯ／ＯＴ－ＩＩ）マウスおよびＲａｇ２ＫＯ／ＯＴ－Ｉランダムトランスジェニックマウスを、それぞれＣｈａｒｌｅｓ ＲｉｖｅｒおよびＴａｃｏｎｉｃから得た（１７～１９）。動物は全て、温度制御下で（２３±２℃）で飼育され、一定の１２時間明暗周期に供され、飼料および水に自由に接近できた。

【0218】

一実施形態において、ＭＥＦの初代培養物を、Ｃ９Ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏまたはＣ５７ＢＬ／６マウスのＥ１３．５胚から単離した（６、１０）。頭部、胎児肝臓および全ての内部臓器を摘出して、残留する組織を、機器で分離した。切断された組織を、０．１２％トリプシン／０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液（３ｍＬ／胚）および３７℃で１５分間のインキュベーションを用いて酵素消化した。同じ溶液を胚あたり追加で３ｍＬ添加して、さらに１５分間インキュベートした。単一細胞懸濁液を得て、生育培地中で０．１％ゼラチンコーティング付き１０ｃｍ組織培養皿に播種した。細胞を、コンフルエンスになるまで２～３日間成育させて、Ｔｒｙｐｌｅ Ｅｘｐｒｅｓｓで解離させ、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で凍結させた。ＭＥＦを、レンチウイルス形質導入のために播種する前に、造血能を有する細胞を表し得る残りのＣＤ４５＋およびｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞を除去するために選別した。スクリーニングおよび後の実験で用いられるＭＥＦは、ｔｄＴｏｍａｔｏ－ ＣＤ４５－であり、純度９９．８％で、４継代まで増大させた。

【0219】

一実施形態において、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＭＥＦおよびヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）を、生育培地［１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび抗生物質（１０μｇ／ｍｌペニシリンおよびストレプトマイシン）を補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）］に保持し、ＯＰ－９およびＯＰ－９－ＤＬ１細胞株を、２０％ＦＢＳ、１ｍＭ Ｌ－グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシン（１０μｇ／ｍｌ）含有の最小必須培地（ＭＥＭ）アルファで培養した。ＯＰ－９およびＯＰ－９－ＤＬ１は、日常的に８０％コンフルエントで継代した。細胞は全て、３７℃および５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２で維持した。他に断りがなければ、組織培養試薬は全て、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製であった。

【0220】

一実施形態において、ウイルス形質導入およびリプログラミング実験は、以下の方法で実施した：Ｃ９Ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ ＭＥＦを、０．１％ゼラチンコーティング付き６ウェルプレートに４０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を、８μｇ／ｍＬポリブレンを補充された生育培地中に１：１比のＦＵＷ－ＴｅｔＯ－ＴＦおよびＦＵＷ－Ｍ２ｒｔＴＡレンチウイルス粒子と共に一夜インキュベートした。ＴＦの組み合わせをテストする場合、等しいＭＯＩの各ウイルス粒子を適用した。細胞を連続数日間内に２回形質導入し、一夜インキュベートした後、培地を新鮮な生育培地に交換した。二回目の形質導入の後、生育培地にドキシサイクリン（１μｇ／ｍＬ）を補充した（０日目）。培地は、培養期間中に２～３日ごとに取り換えた。出現したｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞を、形質導入後の１～１５日後に分析した。断りがあれば、異なる培養条件、即ちＲＰＭＩ－１６４０、リポ多糖（ＬＰＳ、１００ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）、２－メルカプトエタノール（１×１０４μＭ；２－ＭＥ）、Ｌ－グルタミン（２μｍｏｌ／ｍｌ）、ＧＭ－ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＩＬ－４（２０ｎｇ／ｍｌ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＦｌｔ３ｌ（１００ｎｇ／ｍｌ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を適用した。

【0221】

一実施形態において、蛍光顕微鏡測定および免疫蛍光法を、以下の方法で評価した：ＭＥＦおよび形質導入ＨＤＦ中のＣ９Ａに促されたｔｄＴｏｍａｔｏを、倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＶｅｒｔ ２００Ｍ）下の６ウェルプレート上で直接視覚化し、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎおよびＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウエアで画像処理した。ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール、１μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）およびファロイジン（５０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を用いて、それぞれ核およびＦ－アクチンを染色した。タイムラプス顕微鏡測定の場合、Ｄｏｘ添加後の６日と４時間の間に１時間ごとに、ＩＮＣＥＬＬ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて蛍光写真を得た。動画を、ＩｍａｇｅＪソフトウエア（ＮＩＨ）で作成した。

【0222】

一実施形態において、フローサイトメトリー分析を、以下の方法で実施した：形質導入されたＣ９Ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ ＭＥＦまたは形質導入されたヒト線維芽細胞を、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓで解離して、ＰＢＳ ５％ＦＢＳ ２００μＬで再懸濁させて、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での分析の前に４℃に保持した。試料の回収を、３－ｂｌｕｅ－１－ｒｅｄ構成（ＦＬ１内の５３３／３０フィルター；ＦＬ２内の５８５／４０フィルター、ＦＬ３内の６７０ ＬＰフィルターおよびＦＬ４内の６７５／２５フィルター）で実施した。ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光は、ＦＬ２チャネルで分析した。ＣＤ４５またはＭＨＣ－ＩＩ細胞表面マーカー発現の分析については、解離された細胞を、ラット血清（１／１００、ＧｅｎｅＴｅｘ）の存在下、ＰＢＳ ５％ＦＢＳで希釈されたＡＰＣ－Ｃｙ７ラット抗マウスＣＤ４５抗体またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ラット抗マウスＩ－Ａ／Ｉ－Ｅと共に、４℃で３０分間インキュベートして、非特異的結合を遮断した。細胞をＰＢＳ５％ＦＢＳで洗浄し、ＰＢＳ５％ＦＢＳで再懸濁させて、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーターで分析した。ＣＤ４５ ＡＰＣ－Ｃｙ７およびＩ－Ａ／Ｉ－Ｅ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７の蛍光を、ＦＬ４チャンネルで分析した。ＭＨＣＩＩ、ＣＤ８０およびＣＤ８６細胞表面発現の複合分析のために、解離された細胞をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ラット抗マウスＩ－Ａ／Ｉ－Ｅ、ＢＶ６５０ラット抗マウスＣＤ８０およびＰＥ－ＣＹ７ラット抗マウスＣＤ８６で染色して、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。形質導入されたＨＤＦの分析のために、解離された細胞をＡＰＣマウス抗ヒトＣＬＥＣ９ＡおよびＦＩＴＣマウス抗ヒトＨＬＡ－ＤＲで染色した。ＡＰＣとの共培養７日後のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖および活性化を評定するために、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識Ｔ細胞を、ＰＥラット抗マウスＣＤ４４と共にインキュベートして、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６で分析した。フローサイトメトリーのデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（ＦＬＯＷＪＯ、ＬＬＣ、バージョン７．６）を用いて解析した。

【0223】

一実施形態において、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を、以下の方法で実施した：Ｃ９Ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ ＭＥＦを精製するために、細胞を、ＰＢＳ ５％ＦＢＳで希釈されたＡＰＣ－Ｃｙ７抗ＣＤ４５抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。次に、ＭＥＦをＰＢＳ５％ＦＢＳで洗浄し、ＰＢＳ５％ＦＢＳで再懸濁させて、ｔｄＴｏｍａｔｏ－ＣＤ４５－ＭＥＦをＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩで精製した。記載されたｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩを用いて精製して、ドキシサイクリンの非存在下または存在下で培養する場合。脾臓ＤＣの単離の場合、脾臓細胞をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ラット抗マウスＩ－Ａ／Ｉ－Ｅ、ＦＩＴＣラット抗マウスＣＤ１１ｃおよびＡＰＣ－Ｃｙ７ラット抗マウスＣＤ８ａと共にインキュベートした。ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ８ａ＋脾臓ＤＣを、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で精製した。ＦＡＣＳデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアで処理した。

【0224】

一実施形態において、ＧＰＳｆｏｒＧｅｎｅｓソフトウエアを用いて、ＤＣ系譜についての Ｐｕ．１、Ｉｒｆ８およびＢａｔｆ３の組み合わせの特異度を計算した。遺伝子発現データを、ＢｉｏＧＰＳデータベース（ＧｅｎｅＡｔｌａｓ ＭＯＥ４３０）からダウンロードして、対数領域に変換し、発現値を異なる試料にまたがり各遺伝子について０～１範囲にするように正規化した。得られたデータをその後、Ｐｕ．１＋Ｉｒｆ８＋Ｂａｔｆ３の最高平均発現となる試料を検索した。

【0225】

一実施形態において、シングルセルｍＲＮＡｓｅｑ分析を、以下の方法で実施した：シングルエンドリードを、ｋ＝２１のＳａｌｍｏｎ ｖ０．８．１を用いて、ｍｍ１０マウスゲノム（Ｅｎｓｅｍｂｌ注釈、リリース８９）にマッピングした。得られたＴＰＭを、ｔｘｉｍｐｏｒｔライブラリーを用いてＲにインポートし、Ｍｏｎｏｃｌｅライブラリーで実行されたセンサスアルゴリズムを用いて、ｍＲＮＡカウントに変換した。Ｓｃａｔｔｅｒライブラリーを用いて、品質管理閾値をパスしない細胞および遺伝子を廃棄した。以下のＱＣ基準を用いた：１）細胞あたりのライブラリーサイズ；２）各単一細胞で検出された遺伝子数；３）ミトコンドリア遺伝子におけるカウントのパーセンテージ。最初にプロファイリングされた１９２の細胞のうち、１６３の個々の細胞が品質管理フィルターをパスし、解析に用いられた。Ｃｕｓｔｏｍ Ｒスクリプトを用いて、ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔＳＮＥ）（ＭｏｎｏｃｌｅおよびＳｃａｔｔｅｒパッケージ）、主成分分析（ＰＣＡ）（ＭｏｎｏｃｌｅおよびＳｃａｔｔｅｒパッケージ）、階層クラスタリング（ＳＣ３パッケージ）、分散分析を実施し、ヒートマップ、箱ひげ図、散布図、バイオリンプロット、デンドログラム、棒グラフ、およびヒストグラムを構築した。概して、ｇｇｐｌｏｔ２、ｇｐｌｏｔｓ、ｇｒａｐｈｉｃｓおよびｐｈｅａｔｍａｐパッケージを用いて、データグラフを作成した。

【0226】

一実施形態において、異なる発現分析を、Ｍｏｎｏｃｌｅパッケージを用いて実施し、０．０５未満のＢＨ補正ｐ値を有する遺伝子を選択した。得られた遺伝子を次に、分散によりフィルタリングした（全ての条件で１以上の分散を有する遺伝子を選択した）。最後に、得られた６，５２５の遺伝子を、階層クラスタリングに基づいて４つの異なるクラスターに群分けした。

【0227】

一実施形態において、遺伝子の内因性発現を、デフォルト設定を含むＳＴＡＲ ｖ２．５．３ａを利用して計測した。ウィンドウを、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に対応する遺伝子開始－１０ｋｂおよび遺伝子終了＋１０ｋｂに基づいて定義し、それを用いて、ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｖ２．２７．０のｍｕｌｔｉｃｏｖを利用してＵＴＲ内の読み取り数を計算した。

【0228】

一実施形態において、ｉＤＣのＤＣ系譜を、ＳｃｈｌｉｔｚｅｒによるｃＤＣ１およびｃＤＣ２遺伝シグネチャーを用いることにより決定した（１１）。遺伝子の大部分は、ＭＥＦにおいて、および本発明者らの全条件で高度に発現された。これらの遺伝子を、廃棄した。さらに、ｓＤＣ細胞を、ｃＤＣ１マーカーのＣＤ１１ｃ、ＭＨＣ－ＩＩおよびＣＤ８αについて精製されたため、ｓＤＣにおいて発現されるが同時にｃＤＣ２シグネチャーリストに見いだされる遺伝子を、廃棄した。その後、ｃＤＣ１／ｃＤＣ２遺伝子リストを用いて、階層クラスタリングを実施した。次に、ＭＥＦ細胞における遺伝子発現中央値が３日目、７日目および９日目に比較して有意に低かったクラスターのみを、選択した。その他に、ｃＤＣ２遺伝子リストについて、先に記載された手順に加えて、ｓＤＣ細胞内での遺伝子発現中央値が３日目、７日目および９日目に比較して有意に高かった遺伝子クラスターも、廃棄した。次に、各選択された遺伝子にまたがる遺伝子発現中央値を、各特定条件から計算した。最後に、Ｓｃｈｌｉｔｚｅｒとその共同研究者により定義されたプリソートされたｃＤＣ１およびｃＤＣ２遺伝子シグネチャー全てにわたる遺伝子発現中央値を、計算した。

【0229】

一実施形態において、最小全域木での独立成分分析を利用して擬似時系列パスに沿って細胞を連結させるアルゴリズムのＭｏｎｏｃｌｅパッケージを、ＭＥＦからｉＤＣ細胞リプログラミングまでの擬似時間経過で細胞を整列させるのに用いた。Ｍｏｎｏｃｌｅ解析は、９日目がｃＤＣ１様細胞になることを立証する代替的アプローチであるため、細胞発達を定義する遺伝子としてのＳｃｈｌｉｔｚｅｒ，２０１５（１１）によるｃＤＣ１およびｃＤＣ２遺伝子に基づいて実施した。得られたトラジェクトリーを、Ｍｏｎｏｃｌｅ関数を利用して視覚化した。単一細胞トラジェクトリーが、枝を含んでいたため、枝の間で差次的に発現された遺伝子を見出すために、Ｍｏｎｏｃｌｅパッケージで実行される特別な統計学的検定：分岐発現解析モデリング（ｂｒａｎｃｈｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｍｏｄｅｌｉｎｇ）（ＢＥＡＭ）を用いた。Ｍｏｎｏｃｌｅ分岐アルゴリズムの代替的アプローチとして、クラスターを連結する最小全域木を構成することにより、クラスタリングと擬時間解析とを組み合わせたＴＳＣＡＮを用いた。Ｍｏｎｏｃｌｅと対照的にＴＳＣＡＮは、全ての遺伝子を利用して、細胞を整列させることができる。

【0230】

一実施形態において、遺伝子オントロジー（生物学的プロセス、細胞成分およびＫＥＧＧ経路）を、Ｅｎｒｉｃｈｒ（ｈｔｔｐ：／／ａｍｐ．ｐｈａｒｍ．ｍｓｓｍ．ｅｄｕ／Ｅｎｒｉｃｈｒ／）およびＤａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ， Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＤＡＶＩＤ）クラスター化関数解析（ｄａｖｉｄ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／）を用いて実施した。

【0231】

一実施形態において、マイクロＲＮＡ標的相互作用解析を、ｍｉＲＴａｒＢａｓｅ ２０１７， Ｅｎｒｉｃｈｒ ｗｅｂｓｉｔｅ （ｈｔｔｐ：／／ａｍｐ．ｐｈａｒｍ．ｍｓｓｍ．ｅｄｕ／Ｅｎｒｉｃｈｒ／）を用いて実施した。

【0232】

一実施形態において、マウス表現型解析を、Ｎｅｔｗｏｒｋ２ｃａｎｖａｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａａｙａｎｌａｂ．ｎｅｔ／Ｎ２Ｃ／＃．ＷｍＲｖＯｊＬｃ８ｙｋ）を用いて実施した。

【0233】

一実施形態において、全ての可能な条件と状態の間の遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＳｉｇＤＢ）およびＮｅｔＰａｔｈからのＣ７：免疫シグネチャーに対して実施した。

【0234】

一実施形態において、ＴＦネットワーク解析を、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数を用いたペアワイズ相関行列により算出した。ＴＦを、マウスにおけるＤＢＤ：転写因子予測データベース （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ．ｏｒｇ／）に基づいて選択した。その目的は、ｍｅｆから９日目までの条件の切り替えを研究することであるため、ｍｅｆから３日目に；３日目から７日目に；７日目から９日目に切り替えることに対応する３種のリストを作成して、条件対ごとにｌｏｇＦＣ＝０．５を有するそれらのＴＦのみを組み入れた。次に、３つの条件対ごとのｌｏｇＦＣに基づいて定義されたＴＦから、少なくとも５つの他のＴＦと０．３５より大きなＰｅａｒｓｏｎ相関係数を有するＴＦを選択した。それらの結果が偶然に得られる可能性がある、という事実を考慮して、ＴＦが偶然にこの閾値をパスする確率を決定するために、順列を利用した。１００の順列を実施して、それらの全てで、この閾値をパスするＴＦが０となった。３つの条件対について選択されたＴＦのためにＰｅａｒｓｏｎペアワイズ相関行列を採用して、ｇｒａｐｈ．ａｄｊａｃｅｎｃｙ（） ｏｆ ｉｇｒａｐｈ Ｒパッケージの関数を用いた。

【0235】

一実施形態において、メチルセルロースクローン原性アッセイを、以下の方法で実施した：Ｄｏｘ添加後３、５、７、１０および２５日目のＰＩＢ形質導入ＭＥＦを、１％メチルセルロース培地（Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ Ｍ３４３４、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でアッセイした。選別されたｓＤＣ１（ＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ａ＋）、ならびに未選別の脾臓細胞および骨髄細胞を、対照として用いた。造血系コロニーをスコアリングして、３７℃の５％ＣＯ_２中での培養の７～１０日後にカウントした。

【0236】

一実施形態において、ビーズ取り込みアッセイを、以下の方法で評価した：形質導入Ｃ９Ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ ＭＥＦおよび形質導入ＨＤＦ培養物を、生育培地中で１：１０００比の２．５％黄緑色蛍光カップリング固体ラテックスビーズ（カルボキシラート修飾ポリスチレン、Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。１６時間後に、細胞をＰＢＳ ５％ＦＢＳで２回洗浄し、倒立顕微鏡下で分析した。ＤＡＰＩ（１μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を、核染色に用いた。

【0237】

一実施形態において、標識オボアルブミンの取り込みを、以下の方法で評価した：形質導入されたＭＥＦおよびヒト線維芽細胞培養物を、Ａｌｅｘａ６４７標識オボアルブミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に３７℃または４℃で２０分間インキュベートした。ＰＢＳ ５％ＦＢＳでの洗浄後に、細胞をＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６で分析した。

【0238】

一実施形態において、死亡細胞の取り込みを、以下の方法で評価した：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を紫外（ＵＶ）線に暴露して、細胞死を誘導し、ＣｅｌｌＶｕｅ（登録商標）Ｃｌａｒｅｔ Ｆａｒ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｋｅｒ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）で、製造業者の使用説明書に従って標識した。形質導入ＭＥＦを、近赤外線標識された死亡細胞と共に一夜インキュベートして、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６で分析した。

【0239】

一実施形態において、炎症性サイトカインアッセイを、以下の方法で実施した：サイトカインのインターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ７０）、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のレベルを、Ｄｏｘ補充の１０日後にｉＤＣ培養物の上清で評定した。９日目に、１００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳまたは２５μｇ／ｍＬポリイノシン酸－ポリシチジル酸（ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を、一夜刺激の間に添加した。６ウェルプレートのウェルの培養上清５０μＬを採取して、ＣＢＡ Ｍｏｕｓｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、製造業者の使用説明書に従って分析した。ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６でデータ取得を実施して、データをＦＣＡＰアレイソフトエア、バージョン３．０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用して解析した。ＣＢＡの検出限界は、ＩＬ－６、２０．９１ ｐｇ／ｍｌ；ＩＬ－１０、１０．５５ ｐｇ／ｍｌ；ＩＦＮ－γ、１８．２ ｐｇ／ｍｌ；ＴＮＦ、１８．１３ ｐｇ／ｍｌ；ＩＬ－１２ｐ７０、２０．０５ ｐｇ／ｍｌであった。

【0240】

一実施形態において、脾臓ＤＣ単離物を、以下の方法で評価した：新たに単離された脾臓を、２枚の滅菌スライドのフロストの端部を用いてホモジナイズした。細胞を、２％ＦＢＳを補充されたＰＢＳ中に採取して、７０μｍセルストレイナー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で濾過した。赤血球細胞を、ＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により室温で８分間溶解した。ＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋ＤＣを、ＦＡＣＳ（ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により精製して、直ちに抗原提示アッセイに用いた。

【0241】

一実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞単離および抗原提示アッセイを、以下の方法で評価した：Ｒａｇ２ＫＯ／ＯＴ－ＩＩマウスの脾臓由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｍｏｕｓｅ ＣＤ４ Ｃｅｌｌｓ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、製造業者の使用説明書に従って濃縮した。濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＦＳＥ ５μＭにより室温で１０分間標識し、洗浄してカウントした後、ＡＰＣと共に培養した。Ｄｏｘ添加後８日目のｉＤＣ培養物または脾臓ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋ＤＣ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳの存在下または非存在下でＯＶＡタンパク質（１０μｇ／ｍＬ）またはＯＶＡ３２３－３３９ペプチド（１０μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートして、非接触ＣＦＳＥ標識ＯＴ－ＩＩ ＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養した。ｉＤＣ培養物（２００００細胞）または２００００個の脾臓ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋ＤＣを、９６ウェル丸底組織培養プレートにおいて、２００００個のＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋Ｔ細胞と共にインキュベートした。Ｔ細胞増殖（ＣＦＳＥ染色の希釈）および活性化（ＣＤ４４発現）を、共培養の７日後のフローサイトメトリーにより評定した。

【0242】

一実施形態において、ＣＤ８＋Ｔ細胞単離および抗原交差提示を、以下の方法で評価した：Ｒａｇ２ＫＯ／ＯＴ－Ｉマウスの脾臓由来のＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｍｏｕｓｅ ＣＤ８ Ｃｅｌｌｓ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、製造業者の使用説明書に従って濃縮した。濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＦＳＥ ５μＭにより室温で１０分間標識し、洗浄してカウントした後、ＡＰＣと共に培養した。Ｄｏｘ添加後８日目のｉＤＣ培養物または脾臓ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋ＤＣ細胞を、２５ｎｇ／ｍＬ Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃの存在下でＯＶＡタンパク質（１０μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートして、非接触ＣＦＳＥ標識ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した。ｉＤＣ培養物（２００００細胞）または２００００個の脾臓ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ－ＩＩ＋ＤＣを、９６ウェル丸底組織培養プレートにおいて、２００００個のＣＦＳＥ標識ＣＤ８＋Ｔ細胞と共にインキュベートした。Ｔ細胞増殖（ＣＦＳＥ染色の希釈）および活性化（ＣＤ４４発現）を、共培養の４日後のフローサイトメトリーにより評定した。

【0243】

一実施形態において、ハイブリドーマ交差提示アッセイを、以下の方法で実施した：Ｄｏｘ添加後１６日目のＰＩＢ形質導入Ｃｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ ＭＥＦを、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓで解離させて、生育培地で再懸濁させ、異なる濃度のＯＶＡタンパク質と共に４時間インキュベートした。大規模に洗浄した後、ＰＩＢ形質導入ＭＥＦ（１００，０００細胞）を、９６ウェル丸底組織培養プレート内で１００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳまたは２５μｇ／ｍＬ ＰＩＣの存在下または非存在下で１００，０００個のＢ３Ｚ細胞と共培養した。１８時間後に、細胞を０．１２５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０（代替品）、９ｍＭ ＭｇＣｌ２、および比色性ＣＰＲＧ β－ガラクトシダーゼ基質を含有する緩衝液で溶解した。β－ガラクトシダーゼ活性を、５９０ｎｍでの光学密度としてマイクロプレートリーダーで測定した。

【0244】

一実施形態において、Ｃｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞によるサイトゾルへの抗原輸送の効率を、細胞蛍光法に基づくアッセイにより分析した。手短に述べるとＤｏｘ添加後１６日目のＰＩＢ形質導入ＭＥＦを、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓで解離させて、ローディング緩衝液で再懸濁させ、１μＭ ＣＣＦ４－ＡＭにより室温で３０分間ロードした。その後、細胞を洗浄して、２ｍｇ／ｍＬ β－ラクタマーゼと共に３７℃で３０、６０および９０分間インキュベートした。反応を停止させるために、細胞を氷冷ＰＢＳに移し入れた。ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩでのフローサイトメトリー分析の直前に、細胞をＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。高い青色：緑色（Ｖ４５０／Ｖ５００）蛍光比率で生存するＣｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞のパーセンテージを、細胞質への抗原輸送の効率の尺度として用いた。

【0245】

一実施形態において、群間の比較を、一元配置ＡＮＯＶＡと、その後のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウエアでのＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ多重比較検定により実施した。関連していれば、Ｐ値を示す（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。

【表6】

【0246】

当業者は、日常的実験法だけを利用することで、本明細書に記載された本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識するであろう、または確認することができよう。本発明の範囲は、上記記載に限定されることを意図するのではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に示される通りである。

【0247】

要素または特色の単一形態が、特許請求の範囲の詳細で用いられる場合、具体的に排除されていなければ、複数形態も含まれ、そしてその逆もあてはまる。例えば用語「１つの細胞」または「その細胞」もまた、複数形態の「細胞」または「その細胞」を含み、そしてその逆もあてはまる。特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの物品は、反することが示されない限り、または他の方法で文脈から明らかでない限り、１以上を意味する場合がある。反することが示されない限り、または他の方法で文脈から明らかでない限り、群の１つまたは複数のメンバーの間に「または」を含む特許請求の範囲または明細書は、群のメンバーの１つ、１つより多く、または全てが、所与の生成物もしくは工程の中に存在するか、所与の生成物もしくは工程で用いられるか、または他の方法で所与の生成物もしくは工程に関係するか、を満たしていると判断される。本発明は、群の厳密に１つのメンバーが、所与の生成物もしくは工程の中に存在する、所与の生成物もしくは工程で用いられる、または他の方法で所与の生成物もしくは工程に関係する、実施形態を包含する。本発明はまた、群のメンバーの１つより多く、または全てが所与の生成物もしくは工程の中に存在する、所与の生成物もしくは工程で用いられる、または他の方法で所与の生成物もしくは工程に関係する、実施形態を包含する。

【0248】

さらに、本発明が、請求項の１つもしくは複数または明細書の関連部分の中の１つまたは複数の限定、要素、原因、記述用語、その他が、別の請求項に導入されるような全ての変更、組み合わせ、および並べ替えを包含することが、理解されなければならない。例えば別の請求項に従属する任意の請求項を、同じ基本の請求項に従属する任意の他の請求項の中に見いだされる１つまたは複数の限定を含むように改良することができる。さらに、請求項で組成物が挙げられている場合、ほかに示されない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者に明白でない限り、本明細書に開示された目的のいずれかのために該組成物を使用する方法が含まれること、および本明細書に開示された作製方法または当該技術分野で公知の他の方法のいずれかに従って該組成物を作製する方法が含まれることが、理解されなければならない。

【0249】

範囲が与えられている場合、エンドポイントが含まれる。さらに、ほかに示されない限り、または他に文脈および／もしくは当業者の理解から明白にならない限り、範囲として表された値が、他に文脈に明確に示されない限り、本発明の異なる実施形態で述べられた範囲内の任意の具体的値を、該範囲の下限の単位の十分の一まで推定し得ることが、理解されなければならない。他に示されない限り、または他の方法で文脈および／もしくは当業者の理解から明白でない限り、範囲としてあらわされた値が、所与の範囲内の任意の部分的範囲を推定することができ、該部分的範囲のエンドポイントが該範囲の下限の単位の十分の一と同程度の正確さで表されることも、理解されなければならない。

【0250】

加えて、本発明の任意の特定の実施形態が、請求項の任意の１つまたは複数から明白に除外され得ることが、理解されなければならない。範囲が与えられている場合、該範囲内の任意の値が、請求項の任意の１つまたは複数から明白に除外される場合がある。本発明の組成物および／または方法の任意の実施形態、要素、特色、適用、または態様は、任意の１つまたは複数の請求項から除外される可能性がある。明瞭にする目的で、１つまたは複数の要素、特色、目的または態様が除外される実施形態の全てを、本明細書に明白に示してはいない。

【0251】

上記の実施形態は、組み合わせ可能である。

【0252】

以下の特許請求の範囲は、本開示の特定の実施形態をさらに提示している。

【0253】

本文書に挙げられた全ての参考資料は、そのあらゆる参考資料が個別に参照により組み入れられるかのごとく、全体として参照により本明細書に組み入られる。

【0254】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

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【図16】

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【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

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【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【配列表】

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