特許7303802IP Force 特許公報全文掲載

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技術分野

（関連出願の相互引用） 本出願は、米国仮特許出願No.62/562,373（2017年9月23日出願）および米国仮特許出願No.62/562,374（2017年9月23日出願）（それらの内容は参照によってその全体が本明細書に含まれる）の利益並びに優先権を主張する。 （技術分野） 本技術は概して、A33タンパク質に特異的に結合する免疫グロブリン関連構成物（例えば抗体またはその抗原結合フラグメント）の調製およびその使用に関する。特に、本技術は、A33中和抗体の調製並びにA33関連癌の検出および治療におけるそれらの使用

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この特許公報に記載されている図面[図面の簡単な説明]から抜粋

【図1A-B】 （A）は、ヒト化A33二重特異性抗体（huA33-BsAb）の設計および構築を示す。（B）は、精製huA33-BsAbの4週間で37°Cにおける促進された安定性試験を示す。
【図1C-D】 （C）は、25°Cおよび37°CにおけるhuA33-BsAbの表面プラズモン共鳴（SPR）分析を示す。データは1：1結合モデルに適合させた。（D）は、種々の腫瘍細胞株および活性化T細胞のFACS染色を示す。平均蛍光強度（MFI）値は幾何平均であった。
【図2A-B】 （A）は、Colo205細胞および種々の抗体との24時間インキュベーション後のT細胞のCD25およびCD69マーカーの活性化を示す。（B）は、Colo205細胞および種々の抗体との96時間インキュベーション後のCFSE色素希釈を基準にした、分裂細胞の定量を示す。（C）は図2（B）の代表的画像を示す。（D）は、独立した実験におけるColo205細胞およびhuA33-BsAbとの96時間インキュベーション後のCD45RO染色を示す。（E）は、huA33-BsAbによるT細胞のin vivo活性化および分裂増殖（prolliferation）を示す。簡単に記せば、CFSEで標識した抹消血単核細胞（PBMC）をColo205細胞と混合し、混合物をDKOマウスの皮下に移植した。次の日にhuA33-BsAbを静脈内注射し、さらに4日後に腫瘍を単離してFACSで分析した。
【図3】 標的腫瘍の存在下でhuA33-BsAb活性化T細胞によって分泌されるサイトカインおよび細胞傷害性構成要素のプロフィールを示す。huA33-BsAbおよび標的細胞Colo205または陰性コントロール細胞SKMEL5の存在下におけるT細胞によるサイトカインおよび細胞溶解性分子生成のカイネティクスを4日間にわたって決定した。SKMEL5は大量のIL-6を分泌したので、抗体の非存在下でCol205細胞とともにインキュベートしたT細胞の上清をIL-6カイネティクス実験の陰性コントロールとして用いた。
【図4A-B】 （A）は、huA33-BsAbによって引き出される、種々の標的腫瘍細胞株およびコントロール細胞に対する細胞傷害性を示す。活性化T細胞を10：1のエフェクター対標的比（E：T）でエフェクター細胞として用いた。読みを得る前に細胞を16時間インキュベートした。（B）は、huA33-BsAbによって誘発されるColo205細胞に対する細胞傷害性を示す。区分けした新鮮なT細胞サブセットをエフェクター細胞として用いた（E：T＝5：1）。読みを得る前に細胞を48時間インキュベートした。CD4メモリーT細胞に対するEC50は25pMであった。
【図5A-B】 （A）は、酵母スクリーニングによるhuA33-BsAb（H2L2）の親和性成熟の要旨を示す。（B）は、親および親和性成熟huA33-BsAbのKDの要旨（上段）並びにSPR分析から得られた種々のhuA33-BsAbのon-off速度マップの要旨（下段）を示す。
【図5C】 （C）は、親および親和性成熟huA33-BsAbのT細胞依存細胞傷害（TDCC）アッセイの結果を示す。
【図6A-B】 （A）は、治療グループおよびコントロールグループにおける皮下LS174T腫瘍の増殖を示す。腫瘍サイズは体積によって評価した（腫瘍＋scPBMC対腫瘍＋scPBMC＋huA33-BsAbでp＝0.0133；腫瘍のみ対腫瘍＋scPBMC＋huA33-BsAbでp＝0.006）。（B）は、治療グループおよびコントロールグループにおける腹腔内LS174T腫瘍の増殖（上段）（腫瘍＋ATC対腫瘍＋ATC＋huA33-BsAbでp＝0.0125；腫瘍のみ対腫瘍＋ATC＋huA33-BsAbでp＝0.0026）、並びに治療グループおよびコントロールグループにおけるマウスの生存率（下段）を示す。
【図6C】 （C）は、種々のグループにおける腹部LS174T腫瘍の発光画像を示す。腫瘍のみのグループで21日後に腫瘍を獲得しなかったマウスが1匹存在し（＃4）、前記は分析から除外した。
【図7A-B】 （A）は、種々のグループにおける皮下Colo205腫瘍の増殖を示す発光画像を示す。（B）は、図7（A）のシグナルの定量（上段）および図7（A）の種々のグループのマウスの生存（下段）を示す。
【図7C-D】 （C）は、腹腔内SW1222腫瘍の発光画像を示す。21日後に腫瘍を獲得しなかった腫瘍のみグループの＃1マウスおよび腫瘍＋ATCグループの＃3マウスは、後の時点の画像から除外され、図7（D）の生存分析には含まれなかった。（D）は、腹腔内SW1222腫瘍を有するマウスの生存を示す。
【図8A-B】 （A）は、種々のグループにおける皮下SNU16腫瘍の増殖を示す。（B）は、図8（A）のマウス血液からヒト細胞の生着を示す。
【図9】 ヒト化A33の4つのバージョンのSPR分析を示す。全ての抗体がIgG1定常ドメインを含む。3A3-H1L1、3A3-H1L2、3A3-H2L1および3A3-H2L2は、ヒト化3A3の4バージョンであった。3A3-chA33はキメラ3A3であった。
【図10】 huA33-BsAbで染色した多様な細胞株のFACS分析の結果を示す。
【図11】 （A）は、Colo205細胞の存在下でhuA33-BsAbにより活性化されたT細胞上での24時間後（左）および96時間後（右）のPD-1アップレギュレーションを示す。図11（B）は、huA33-BsAbの存在下でSKMEL5と96時間インキュベートした後でT細胞の分裂が存在しないことを示す。図11（C）は、LS174T細胞の存在下でのhuA33-BsAbによるT細胞分裂の活性化を示す。図11（B）および11（C）では同じT細胞調製物を用いた。
【図12A-B】 （A）および（B）は、種々の抗体の存在下でColo205細胞とインキュベートされた48時間後のT細胞上のCD45ROおよびCD25マーカーの染色を示す。細胞は、LDH測定に上清を用いた後のTDCCアッセイから得られた。図12（A）：CD4(+)T細胞に基づくゲート開閉；図12（B）：CD8(+)T細胞に基づくゲート開閉。
【図13】 scFvをhuA33-BsAb形式へ迅速に改変する戦略を示す。発現ベクター（1）をHindIII/ApaIで直鎖化した。プロモーターフラグメント（3）をSpaI消化プロモーター含有ベクターから調製した。より高処理クローニングのためにベクターおよびプロモーターフラグメントの両方を大量に調製することができた。2つの5’プライマーを用いてVH（4）およびVL（2）を酵母から直接増幅してリーダー配列に付加し、前記をHindIII/SapI（VL）またはApaI/SapI（VH）で消化した。この4つのフラグメントを一工程反応で連結した。
【図14】 ネズミA33抗体のVHおよびVLドメインのアミノ酸配列およびそれらの対応する相同ヒト配列（配列番号:1－4）を示す。ネズミA33抗体のVHおよびVLドメインのCDR1、CDR2およびCDR3領域は下線付きの太字フォントで示される。
【図15】 huA33-H1（3A3-H1）（配列番号:5）およびhuA33-H2（3A3-H2）（配列番号:6）のヒト化重鎖のアミノ酸配列を示す。3A3-H1および3A3-H2のCDR1、CDR2およびCDR3は下線付きの太字フォントで示される。
【図16】 huA33-H1（3A3-H1）（配列番号:7）およびhuA33-H2（3A3-H2）（配列番号:8）のヒト化重鎖のcDNA配列を示す。
【図17】 huA33-L1（3A3-L1）（配列番号:9）およびhuA33-L2（3A3-L2）（配列番号:10）のヒト化軽鎖のアミノ酸配列を示す。3A3-L1および3A3-L2のCDR1、CDR2およびCDR3領域は下線付きの太字フォントで示される。
【図18】 huA33-L1（3A3-L1）（配列番号:11）およびhuA33-L2（3A3-L2）（配列番号:12）のヒト化軽鎖のcDNA配列を示す。
【図19】 Kingら（King et al., 1995（上掲書））の元のヒト化配列hA33と新規に再ヒト化したhuA33（3A3）配列とのアラインメントを示す。
【図20】 GPA33組換えタンパク質でSPR（Biacore T100）を用いてアッセイした、huA33のヒト化IgG変種の結合カイネティクスを示す。4バージョン全てが、キメラA33（chA33）の高い結合親和性を保持した。
【図21】 GPA33組換えタンパク質でSPR（Biacore T100）を用いてアッセイした、元のヒト化hA33（文献（Cheal et al, Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 43:925-937, 2016）に記載されたようにhA33-mC825二重特異性形式である）とhuA33（3A3-H2L2）の結合カイネティクスを示す。元のヒト化hA33は、huA33と比較してかなりの親和性を喪失した。
【図22】 GPA33組換えタンパク質でSPR（Biacore T100）を用いてアッセイした、元のヒト化hA33（文献（Cheal et al, Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 43:925-937, 2016）に記載されたようにhA33-mC825二重特異性形式である）とhuA33（3A3-H2L2）の結合カイネティクスを示す。元のヒト化hA33は、huA33と比較してかなりの親和性を喪失した。
【図23】 huA33重鎖および軽鎖配列（3A3-H1、3A3-H2、3A3-L1、3A3-L2）並びに元のhA33配列のヒト性分析を示す。4つの再ヒト化バージョンはいずれも元のchA33の高い結合親和性を保持していたので、H2L2バージョンをそのより高いヒト性T20スコアに基づいて更なる開発のために選択した。
【図24】 キメラchA33-IgG1の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を示す。前記は、それぞれ配列番号:13および配列番号:14に対応する。
【図25】 huA33-IgG1（H2L2）の重鎖のアミノ酸およびcDNA配列を示す。前記は、それぞれ配列番号:15および配列番号:16に対応する。
【図26】 huA33-IgG1（H2L2）の軽鎖のアミノ酸およびcDNA配列を示す。前記は、それぞれ配列番号:17および配列番号:18に対応する。
【図27】 T細胞嵌合huA33-BsAb二重特異性抗体の重鎖のアミノ酸およびcDNA配列を示す。前記は、それぞれ配列番号:19および配列番号:20に対応する。
【図28】 T細胞嵌合huA33-BsAb二重特異性抗体の軽鎖のアミノ酸およびcDNA配列を示す。前記は、それぞれ配列番号:21および配列番号:22に対応する。下線付き配列はGSリンカー配列に対応する。
【図29】 本明細書に開示するT細胞嵌合huA33-BsAb二重特異性抗体に対する潜在的改変の要旨を示す。
【図30】 huA33-BsAb形式の親和性成熟クローン31の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を示す。前記はそれぞれ配列番号:23および配列番号:24に対応する。下線付き配列はGSリンカー配列に対応する。
【図31】 huA33-BsAb形式の親和性成熟クローン32の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を示す。前記はそれぞれ配列番号:25および配列番号:26に対応する。下線付き配列はGSリンカー配列に対応する。
【図32】 huA33-BsAb形式の親和性成熟クローン48の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を示す。前記はそれぞれ配列番号:27および配列番号:28に対応する。下線付き配列はGSリンカー配列に対応する。
【図33】 huA33-BsAb形式の親和性成熟クローン49の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を示す。前記はそれぞれ配列番号:29および配列番号:30に対応する。下線付き配列はGSリンカー配列に対応する。
【図34】 huA33-BsAb形式の親和性成熟クローン53の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を示す。前記はそれぞれ配列番号:31および配列番号:32に対応する。下線付き配列はGSリンカー配列に対応する。
【図35】 huA33-BsAb形式の親和性成熟クローン56の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を示す。前記はそれぞれ配列番号:33および配列番号:34に対応する。下線付き配列はGSリンカー配列に対応する。
【図36】 huA33-BsAb形式の親和性成熟クローン57の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を示す。前記はそれぞれ配列番号:35および配列番号:36に対応する。下線付き配列はGSリンカー配列に対応する。
【図37】 二重特異性抗体huA33-huC825（H2L2）の重鎖のアミノ酸およびcDNA配列を示す。前記それぞれは配列番号:58および配列番号:59に対応する。
【図38】 二重特異性抗体huA33-huC825（H2L2）の軽鎖のアミノ酸およびcDNA配列を示す。前記それぞれは配列番号:60および配列番号:61に対応する。下線付き配列はGSリンカー配列に対応する。
【図39】 二重特異性抗体huA33-mC825（H2L2）の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を示す。前記それぞれは配列番号:62および配列番号:63に対応する。下線付き配列はGSリンカー配列に対応する。
【図40】 本明細書に開示する再ヒト化huA33-DOTA二重特異性抗体およびトレーサー量の177Lu-DOTA-ビオチンで処置した、皮下GPA33(+)SW1222ヒト結腸直腸腫瘍異種移植片を有するマウスにおけるGPA33陽性（GPA33(+)）ヒト結腸直腸腫瘍異種移植片への標的誘導に関するex vivo体内分布の結果を示す。

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