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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-06-28
(45)【発行日】2023-07-06
(54)【発明の名称】培養容器、及び細胞－担体複合体の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20230629BHJP
C12M 3/00 20060101ALI20230629BHJP
C12N 11/14 20060101ALI20230629BHJP
C12N 11/02 20060101ALI20230629BHJP
C12N 11/08 20200101ALI20230629BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 C
C12M3/00 A
C12N11/14
C12N11/02
C12N11/08
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2019047298
(22)【出願日】2019-03-14
(65)【公開番号】P2020145990
(43)【公開日】2020-09-17
【審査請求日】2021-12-29
(73)【特許権者】
【識別番号】504182255
【氏名又は名称】国立大学法人横浜国立大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000154
【氏名又は名称】弁理士法人はるか国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】福田 淳二
(72)【発明者】
【氏名】エン ライ
(72)【発明者】
【氏名】景山 達斗
【審査官】上村 直子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／２０４５６３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１２／１０８０６９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１０８３２４９９３（ＣＮ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１２／１１５０７９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／０７３６２５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／２３５３７５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第８８／００２３９８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２００２－１１２７６３（ＪＰ，Ａ）
【文献】Nature Communications，2012年，3:784，pp.1-12
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｍ １／００－３／１０
Ｃ１２Ｎ １１／００－１１／１８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞を培養するためのウェルを含む培養容器であって、前記培養容器に固定され、その少なくとも一部が前記細胞の培養中に前記ウェル内に配置されるファイバー状の担体を含み、
前記担体は、前記ウェルの内面に固定された一方の端部と、上方に延びる自由端である他方の端部とを有し、又は、前記培養容器の前記ウェル外の部分に固定されている、
培養容器。
【請求項2】
１つの前記ウェル内には、１つの前記担体が配置される、請求項１に記載の培養容器。
【請求項3】
前記担体は、前記ウェルの内面に固定された前記一方の端部を有し、
前記担体の一部は、前記ウェル外まで延びている、請求項１又は２に記載の培養容器。
【請求項4】
前記細胞の培養中に前記ウェルより上方に配置される支持部をさらに含み、前記担体は、前記支持部に固定される、
請求項１又は２に記載の培養容器。
【請求項5】
前記支持部は、着脱可能に設けられる、請求項４に記載の培養容器。
【請求項6】
請求項１乃至５のいずれかに記載の培養容器を用意すること、前記培養容器に固定された前記ファイバー状の担体の少なくとも一部が配置された前記ウェル内で細胞を培養すること、及び、
前記細胞の培養により、前記担体に接着した前記細胞を含む細胞－担体複合体を形成すること、
を含む、細胞－担体複合体の製造方法。
【請求項7】
前記担体を前記培養容器から分離することにより、前記細胞－担体複合体を回収することをさらに含む、請求項６に記載の細胞－担体複合体の製造方法。
【請求項8】
前記細胞の培養により、前記担体に接着した細胞集合体を含む前記細胞－担体複合体を形成する、請求項６又は７に記載の細胞－担体複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、培養容器、及び細胞－担体複合体の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
特許文献１には、規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、酸素を供給しながら混合培養することにより、毛包原基を形成させる工程を備えることを特徴とする再生毛包原基の集合体の製造方法が記載されている。
【0003】
特許文献２には、ガイドを有する移植用再生器官原基の製造方法であって、間葉系細胞から実質的に構成される第１の細胞集合体と、上皮系細胞から実質的に構成される第２の細胞集合体とを密着させて支持担体内部で培養することにより再生器官原基を調製する工程と、当該再生器官原基にガイドを挿入する工程とを含む製造方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】国際公開第２０１７／０７３６２５号
【文献】国際公開第２０１２／１０８０６９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、特許文献２に記載の方法においては、まず再生器官原基を調製し、その後、当該再生器官原基にガイドを挿入するため、操作には熟練を要していた。また、大量の再生器官原基を調製する場合、当該再生器官原基の各々にガイドを挿入する操作は煩雑にならざるを得なかった。
【0006】
本発明は、上記課題に鑑みて為されたものであり、細胞－担体複合体を簡便に製造することができる培養容器、及び細胞－担体複合体の製造方法を提供することをその目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る培養容器は、細胞を培養するためのウェルを含む培養容器であって、前記培養容器に固定され、その少なくとも一部が前記細胞の培養中に前記ウェル内に配置されるファイバー状の担体を含む。本発明によれば、細胞－担体複合体を簡便に製造することができる培養容器が提供される。
【0008】
前記培養容器において、１つの前記ウェル内には、１つの前記担体が配置されることとしてもよい。前記培養容器において、前記担体は、前記ウェルの内面に固定されていることとしてもよい。この場合、前記担体の一部は、前記ウェル外まで延びていることとしてもよい。
【0009】
また、前記培養容器において、前記担体は、前記培養容器の前記ウェル外の部分に固定されていることとしてもよい。この場合、前記細胞の培養中に前記ウェルより上方に配置される支持部をさらに含み、前記担体は、前記支持部に固定されることとしてもよい。また、これらの場合、前記支持部は、着脱可能に設けられることとしてもよい。
【0010】
上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る細胞－担体複合体の製造方法は、ウェルを含む培養容器を用意すること、前記培養容器に固定されたファイバー状の担体の少なくとも一部が配置された前記ウェル内で細胞を培養すること、及び、前記細胞の培養により、前記担体に接着した前記細胞を含む細胞－担体複合体を形成すること、を含む。本発明によれば、細胞－担体複合体を簡便に製造することができる細胞－担体複合体の製造方法が提供される。
【0011】
前記方法は、前記担体を前記培養容器から分離することにより、前記細胞－担体複合体を回収することをさらに含むこととしてもよい。前記方法においては、前記細胞の培養により、前記担体に接着した細胞集合体を含む前記細胞－担体複合体を形成することとしてもよい。前記方法においては、前記培養容器は、前記いずれかの培養容器であることとしてもよい。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、細胞－担体複合体を簡便に製造することができる培養容器、及び細胞－担体複合体の製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】本実施形態に係る培養容器の一例について、その外観を斜視で示す説明図である。
【図4A】本実施形態に係る培養容器に含まれるウェルの断面形状の他の例を示す説明図である。
【図4B】本実施形態に係る培養容器に含まれるウェルの断面形状のさらに他の例を示す説明図である。
【図4C】本実施形態に係る培養容器に含まれるウェルの断面形状のさらに他の例を示す説明図である。
【図4D】本実施形態に係る培養容器に含まれるウェルの断面形状のさらに他の例を示す説明図である。
【図4E】本実施形態に係る培養容器に含まれるウェルの断面形状のさらに他の例を示す説明図である。
【図5A】本実施形態に係る培養容器に含まれるファイバー状の担体の他の例を示す説明図である。
【図5B】本実施形態に係る培養容器に含まれるファイバー状の担体のさらに他の例を示す説明図である。
【図5C】本実施形態に係る培養容器に含まれるファイバー状の担体のさらに他の例を示す説明図である。
【図6A】本実施形態に係る培養容器に含まれるファイバー状の担体及び支持部の一例を示す説明図である。
【図6B】本実施形態に係る培養容器に含まれるファイバー状の担体及び支持部の他の例を示す説明図である。
【図6C】本実施形態に係る培養容器に含まれるファイバー状の担体及び支持部のさらに他の例を示す説明図である。
【図6D】本実施形態に係る培養容器に含まれるファイバー状の担体及び支持部のさらに他の例を示す説明図である。
【図6E】本実施形態に係る培養容器に含まれるファイバー状の担体及び支持部のさらに他の例を示す説明図である。
【図6F】本実施形態に係る培養容器に含まれるファイバー状の担体及び支持部のさらに他の例を示す説明図である。
【図7A】本実施形態に係る細胞－担体複合体の製造方法の一例に含まれる工程の一部を概略的に示す説明図である。
【図7B】本実施形態に係る細胞－担体複合体の製造方法の一例に含まれる工程の他の一部を概略的に示す説明図である。
【図7C】本実施形態に係る細胞－担体複合体の製造方法の一例に含まれる工程のさらに他の一部を概略的に示す説明図である。
【図7D】本実施形態に係る細胞－担体複合体の製造方法の一例に含まれる工程のさらに他の一部を概略的に示す説明図である。
【図7E】本実施形態に係る細胞－担体複合体の製造方法の一例に含まれる工程のさらに他の一部を概略的に示す説明図である。
【図7F】本実施形態に係る細胞－担体複合体の製造方法の一例に含まれる工程のさらに他の一部を概略的に示す説明図である。
【図7G】本実施形態に係る細胞－担体複合体の製造方法の一例に含まれる工程の一部の他の例を概略的に示す説明図である。
【図8A】本実施形態に係る細胞－担体複合体の製造方法の他の例に含まれる工程の一部を概略的に示す説明図である。
【図8B】本実施形態に係る細胞－担体複合体の製造方法の他の例に含まれる工程の他の一部を概略的に示す説明図である。
【図8C】本実施形態に係る細胞－担体複合体の製造方法の他の例に含まれる工程のさらに他の一部を概略的に示す説明図である。
【図8D】本実施形態に係る細胞－担体複合体の製造方法の他の例に含まれる工程のさらに他の一部を概略的に示す説明図である。
【図8E】本実施形態に係る細胞－担体複合体の製造方法の他の例に含まれる工程のさらに他の一部を概略的に示す説明図である。
【図8F】本実施形態に係る細胞－担体複合体の製造方法の他の例に含まれる工程のさらに他の一部を概略的に示す説明図である。
【図8G】本実施形態に係る細胞－担体複合体の製造方法の他の例に含まれる工程の一部の他の例を概略的に示す説明図である。
【図9A】本実施形態に係る細胞－担体複合体の製造方法のさらに他の例に含まれる工程の一部を概略的に示す説明図である。
【図9B】本実施形態に係る細胞－担体複合体の製造方法のさらに他の例に含まれる工程の他の一部を概略的に示す説明図である。
【図9C】本実施形態に係る細胞－担体複合体の製造方法のさらに他の例に含まれる工程のさらに他の一部を概略的に示す説明図である。
【図10】本実施形態に係る実施例において製造された細胞－担体複合体の位相差顕微鏡写真を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下に、本発明の一実施形態について説明する。なお、本発明は本実施形態に限られるものではない。なお、本明細書において、「上方」及び「下方」は、培養容器を用いて細胞の静置培養を行う場合における上方及び下方をそれぞれ指す。また、複数の図面において対応する要素には同一の符号を付して詳細な説明を省略することがある。
【0015】
まず、本実施形態に係る培養容器について説明する。図１には、本実施形態に係る培養容器１の一例について、その外観を斜視で示す。図２には、図１に示す培養容器１を平面視で示す。図３には、図２に示すIII－III線で切断した培養容器１の断面を示す。
【0016】
培養容器１は、細胞を培養するためのウェル２０と、当該培養容器１に固定され、その少なくとも一部が当該細胞の培養中に当該ウェル２０内に配置されるファイバー状の担体（以下、「ファイバー担体」という。）３０と、を含む。
【0017】
ウェル２０は、その内部で細胞を培養するために用いられる。ウェル２０には、細胞及び培養培地を保持するための空間２１が形成されている。ウェル２０の空間２１は、内面２２に囲まれる。ウェル２０の内面２２は、底面２２ａと、側面２２ｂとを含む。
【0018】
ここで、ウェル２０の底面２２ａは、内面２２のうち、平面視（図２参照）において視認される部分である。ウェル２０内に播種された細胞は、培養培地中で重力によって沈降し、底面２２ａ上に堆積する。ウェル２０は、底面２２ａの上方に開口２３を有する。例えば、ウェル２０内への細胞の播種は、開口２３を介して行われる。
【0019】
ウェル２０の内面２２（特に底面２２ａ）は、細胞非接着性であることが好ましい。ウェル２０の内面２２が細胞非接着性である場合、当該ウェル２０内における細胞の培養中、当該細胞は当該内面２２に接着せず、培養培地中に浮遊し、又は、ピペッティング等により培養培地を流動させることで当該内面２２から容易に脱離する。細胞非接着性の内面２２上で培養される細胞の形状は、ほぼ球形に維持される。
【0020】
これに対し、ウェル２０の内面２２が細胞接着性である場合、当該ウェル２０内における細胞の培養中、当該細胞は当該内面２２に接着し、ピペッティング等により培養培地を流動させても当該内面２２から容易には脱離しない。細胞接着性の内面２２上で培養された細胞は、当該内面２２に接着して伸展し、その形状は、培養培地中を浮遊している場合に比べて扁平になる。
【0021】
ウェル２０の底面２２ａ及び開口２３の形状は、本発明の効果が得られる範囲であれば特に限られず、円形、楕円形、多角形、又はその他の任意の形状であってよい。ウェル２０の底面２２ａの面積は、本発明の効果が得られる範囲であれば特に限られないが、例えば、１００μｍ２以上であってもよく、１０００μｍ２以上であることが好ましく、１００００μｍ２以上であることがより好ましく、１０００００μｍ２以上であることが特に好ましい。また、ウェル２０の底面２２ａの面積は、例えば、１０００ｍｍ２以下であってもよく、１００ｍｍ２以下であることが好ましく、５０ｍｍ２以下であることがより好ましく、２０ｍｍ２以下であることが特に好ましい。
【0022】
ウェル２０の底面２２ａの面積は、上述した下限値の一つと、上述した上限値の一つとを任意に組み合わせて特定されてもよい。具体的に、ウェル２０の底面２２ａの面積は、例えば、１００μｍ２以上、１０００ｍｍ２以下であってもよく、１０００μｍ２以上、１００ｍｍ２以下であることが好ましく、１００００μｍ２以上、５０ｍｍ２以下であることがより好ましく、１０００００μｍ２以上、２０ｍｍ２以下であることが特に好ましい。
【0023】
ウェル２０の深さ（底面２２ａの最下部とウェル２０の上端（例えば、開口２３が形成された基板１０の表面１１）との距離）は、本発明の効果が得られる範囲であれば特に限られないが、例えば、１００μｍ以上であることとしてもよく、１５０μｍ以上であることが好ましく、２００μｍ以上であることがより好ましく、３００μｍ以上であることが特に好ましい。また、ウェル２０の深さは、例えば、３０ｍｍ以下であることとしてもよく、２０ｍｍ以下であることが好ましく、１０ｍｍ以下であることがより好ましく、５ｍｍ以下であることが特に好ましい。
【0024】
ウェル２０の深さは、上述した下限値の一つと、上述した上限値の一つとを任意に組み合わせて特定されてもよい。具体的に、ウェル２０の深さは、例えば、１００μｍ以上、３０ｍｍ以下であることとしてもよく、１５０μｍ以上、２０ｍｍ以下であることが好ましく、２００μｍ以上、１０ｍｍ以下であることがより好ましく、３００μｍ以上、５ｍｍ以下であることが特に好ましい。
【0025】
培養容器１に含まれるウェル２０の数は特に限られないが、培養容器１は、複数のウェル２０を含むことが好ましい。さらに、培養容器１は、図１～図３に示すように、規則的に配置された複数のウェル２０を含むことが好ましい。具体的に、培養容器１は、例えば、等間隔で配置された複数のウェル２０を含む。また、培養容器１は、例えば、複数の列及び複数の行を構成する複数のウェル２０を含む。
【0026】
図１～図３に示す例において、培養容器１は、基板１０と、当該基板１０に形成されたウェル２０とを含む。具体的に、基板１０の表面１１には、ウェル２０の開口２３が形成されている。基板１０は、板状の部材であれば特に限られない。例えば、基板１０の形状（図２のように平面視で視認される形状）は特に限られず、矩形、円形、楕円形、その他の任意の形状であってよい。基板１０を構成する材料は特に限られず、樹脂等の有機高分子、ガラス等の無機材料、金属等、任意の材料が用いられるが、樹脂等の有機高分子が好ましく用いられる。
【0027】
ファイバー担体３０は、ファイバー状の形状を有し、その少なくとも一部に細胞が接着可能な担体である。ファイバー担体３０を構成する材料は、本発明の効果が得られる範囲であれば特に限られず、例えば、有機材料、無機材料、金属等、任意の材料が用いられる。ファイバー担体３０としては、例えば、人工繊維、又は天然繊維が好ましく用いられる。
【0028】
人工繊維としては、例えば、合成樹脂繊維等の人工有機繊維、半合成繊維、再生繊維、ガラス繊維等の人工無機繊維、ステンレス繊維等の金属繊維が用いられる。天然繊維としては、例えば、動物由来繊維、植物由来繊維、鉱物由来繊維が用いられる。動物由来繊維としては、例えば、ヒトの毛髪、又は非ヒト動物の毛（非ヒト哺乳類の毛、鳥類の毛、絹繊維等の昆虫由来繊維を含む。）が用いられる。植物由来繊維としては、例えば、綿繊維、又は麻繊維が用いられる。ファイバー担体３０としては、生分解性繊維を用いることとしてもよい。
【0029】
ファイバー担体３０は、可撓性を有することが好ましく、動物の毛（特に、ヒトの毛髪）に類似した可撓性を有することが特に好ましい。ファイバー担体３０の形状は、本発明による効果が得られる範囲であれば特に限られないが、例えば、動物の毛（特に、ヒトの毛髪）に類似した形状を有することが好ましい。ファイバー担体３０の断面形状は、本発明による効果が得られる範囲であれば特に限られず、円形、楕円形、矩形、その他の任意の形状であってよいが、円形又は楕円形であることが好ましい。
【0030】
各ファイバー担体３０は、単独で存在する１本のファイバー状の担体であることが好ましい。すなわち、ファイバー担体３０は、例えば、他のファイバーと編まれていない。また、ファイバー担体３０は、例えば、シート状の布（例えば、織布及び不織布）を構成するものではない。また、ファイバー担体３０は、中空体（例えば、中空糸）であってもよいし、中実体であってもよいが、中実体であることが好ましい。ファイバー担体３０は、少なくとも細胞が接触する部分に、細胞接着性の表面を有することが好ましい。
【0031】
ファイバー担体３０の断面積（ファイバー担体３０の長手方向に直交する断面の面積）は、本発明による効果が得られる範囲であれば特に限られないが、例えば、１００μｍ２以上であることとしてもよく、３００μｍ２以上であることが好ましく、５００μｍ２以上であることがより好ましく、１０００μｍ２以上であることが特に好ましい。また、ファイバー担体３０の断面積は、例えば、１ｍｍ２以下であることとしてもよく、１０００００μｍ２以下であることが好ましく、５００００μｍ２以下であることがより好ましく、３００００μｍ２以下であることが特に好ましい。
【0032】
ファイバー担体３０の断面積は、上述した下限値の一つと、上述した上限値の一つとを任意に組み合わせて特定されてもよい。具体的に、ファイバー担体３０の断面積は、例えば、１００μｍ２以上、１ｍｍ２以下であることとしてもよく、３００μｍ２以上、１０００００μｍ２以下であることが好ましく、５００μｍ２以上、５００００μｍ２以下であることがより好ましく、１０００μｍ２以上、３００００μｍ２以下であることが特に好ましい。
【0033】
ファイバー担体３０の長さは、本発明による効果が得られる範囲であれば特に限られないが、例えば、１００μｍ以上であることとしてもよく、２００μｍ以上であることが好ましく、３００μｍ以上であることがより好ましく、４００μｍ以上であることが特に好ましい。また、ファイバー担体３０の長さは、例えば、３０ｍｍ以下であることとしてもよく、２０ｍｍ以下であることが好ましく、１５ｍｍ以下であることがより好ましく、１０ｍｍ以下であることが特に好ましい。
【0034】
ファイバー担体３０の長さは、上述した下限値の一つと、上述した上限値の一つとを任意に組み合わせて特定されてもよい。具体的に、ファイバー担体３０の長さは、例えば、１００μｍ以上、３０ｍｍ以下であることとしてもよく、２００μｍ以上、２０ｍｍ以下であることが好ましく、３００μｍ以上、１５ｍｍ以下であることがより好ましく、４００μｍ以上、１０ｍｍ以下であることが特に好ましい。
【0035】
培養容器１において、１つのウェル２０に配置されるファイバー担体３０の数は、本発明の効果が得られる範囲であれば特に限られないが、１つのウェル２０内には、１つのファイバー担体３０が配置されることが好ましい。この場合、図１～図３に示すように、各ウェル２０には、ファイバー担体３０が１本ずつ配置される。
【0036】
ファイバー担体３０は、培養容器１に固定されている。すなわち、ファイバー状の部材であるファイバー担体３０の一部が、培養容器１に固定される。なお、ファイバー担体３０の一部が培養容器１に固定されているとは、当該ファイバー担体３０の一部と、当該培養容器１のうち当該ファイバー担体３０の一部が固定されている部分との相対的な位置関係が固定されていることを意味する。
【0037】
【0038】
ファイバー担体３０が固定される培養容器１の部分は、本発明による効果が得られる範囲であれば特に限られないが、例えば、ファイバー担体３０は、ウェル２０の内面２２に固定されることとしてもよい。すなわち、図１～図３に示す例において、ファイバー担体３０は、その一部（具体的には、一方の端部３１）が、ウェル２０の内面２２（具体的には、底面２２ａ）に固定されている。
【0039】
ファイバー担体３０は、自由端を有することとしてもよい。すなわち、図１～図３に示す例において、ファイバー担体３０は、培養容器１に固定された一方の端部３１（固定端）と、自由端である他方の端部３２とを有している。
【0040】
ファイバー担体３０がウェル２０の内面２２に固定されている場合、当該ファイバー担体３０の一部は、当該ウェル２０外まで延びていることとしてもよい。すなわち、図３に示す例において、ファイバー担体３０は、その一方の端部３１がウェル２０の内面２２に固定され、且つ、その他方の端部３２（自由端）が当該ウェル２０の開口２３から上方に延び出している。換言すれば、ファイバー担体３０の自由端である上記他方の端部３２は、ウェル２０が形成されている基板１０の表面１１から突出している。このようにファイバー担体３０の長さは、ウェル２０の深さより大きいこととしてもよい。
【0041】
ファイバー担体３０の少なくとも一部は、後述するとおり、細胞の培養中に、ウェル２０内に配置される。図１～図３に示す例では、上述のとおり、ファイバー担体３０の自由端（端部３２）がウェル２０外に配置される結果、当該ファイバー担体３０の一部がウェル２０内に配置されている。ファイバー担体３０のうち、ウェル２０の底面２２ａに固定されている一方の端部３１は、当該底面２２ａ近傍に配置されている。
【0042】
ウェル２０内にファイバー担体３０を配置する目的は、後述するように、当該ウェル２０内で培養される細胞を当該ファイバー担体３０に接着させることにある。この点、ファイバー担体３０の少なくとも一部を、ウェル２０の底面２２ａに接して配置することが好ましいが、後述するように、当該ファイバー担体３０が当該底面２２ａに接していない場合であっても、当該ファイバー担体３０の少なくとも一部を、細胞の培養中に当該細胞が存在する当該底面２２ａの近傍に配置することにより、当該細胞を当該ファイバー担体３０の少なくとも一部に接着させることができる。
【0043】
具体的に、例えば、細胞の培養中において、ウェル２０の底面２２ａの少なくとも一部から５００μｍ以下の範囲内に、ファイバー担体３０の少なくとも一部を配置する。この細胞の培養中におけるファイバー担体３０の少なくとも一部と、ウェル２０の底面２２ａの少なくとも一部との距離は、１００μｍ以下であることが好ましく、１０μｍ以下であることがより好ましく、１μｍ以下であることが特に好ましい。
【0044】
なお、培養容器１において、ファイバー担体３０は、細胞の培養中に、その少なくとも一部がウェル２０内に配置されればよい。すなわち、細胞培養の開始前、又は、細胞培養の終了後は、ファイバー担体３０はウェル２０内に配置されていなくてもよい。もちろん、培養容器１において、細胞の培養中かどうかに関わらず、ファイバー担体３０の少なくとも一部が、ウェル２０内に配置されることとしてもよい。
【0045】
図３に示す例において、培養容器１のウェル２０は、平坦な（水平な）形状の底面２２ａを有する、いわゆる平底のウェルであるが、ウェル２０の形状はこれに限られず、例えば、他の形状の内面２２を有してもよい。すなわち、ウェル２０は、例えば、図４Ａに示すように湾曲したＵ形状の底面２２ａを有する、いわゆるＵ底のウェルであってもよいし、図４Ｂに示すようにテーパ―形状の底面２２ａを有してもよいし、図４Ｃに示すようにＶ形状の底面２２ａ（内面２２）を有してもよい。また、ウェル２０の断面形状は、さらに他の形状であってもよい。
【0046】
培養容器１は、図４Ｄに示すように、ウェル２０を収容するキャビティ４０をさらに含むこととしてもよい。キャビティ４０には、培養培地を保持するための空間４１が形成されている。そして、キャビティ４０の底面を構成する表面１１にウェル２０が形成されている。キャビティ４０に培養培地を保持することにより、必然的に、ウェル２０にも培養培地が保持される。すなわち、ウェル２０は、その全体が培養培地中に浸漬される。
【0047】
図４Ｄに示す例において、ウェル２０及びキャビティ４０は、同一の基板１０に形成されているが、これに限られず、図４Ｅに示すように、ウェル２０が形成された基板１０と別体に成形された基板４５にキャビティ４０が形成されていることとしてもよい。すなわち、この場合、ウェル２０が形成された基板１０は、当該基板１０と別体に成形された基板４５に形成されたキャビティ４０内に載置される。
【0048】
図３に示す例において、ファイバー担体３０は、その一方の端部３１がウェル２０の底面２２ａ（具体的には、底面２２ａを構成する基板１０の一部）に挿入されることで固定されているが、当該ファイバー担体３０がウェル２０の内面２２に固定される態様は、これに限られない。
【0049】
すなわち、例えば、ファイバー担体３０は、図５Ａに示すように、その一部が、ウェル２０内に配置された、基板１０と異なる材料から構成される固定層２４に固定されてもよい。この場合、ファイバー担体３０の一部（図５Ａに示す例では、一方の端部３１）を、固定層２４に埋め込むことにより、当該ファイバー担体３０を培養容器１に固定する。ウェル２０内の固定層２４にファイバー担体３０が固定される場合、図５Ａに示すように、当該固定層２４の上面が、当該ウェル２０の底面２２ａとなる。
【0050】
具体的に、例えば、まずウェル２０内にゲルから構成される固定層２４を形成し、次いで、当該固定層２４に、ファイバー担体３０の一方の端部３１を刺し込むことにより、当該ファイバー担体３０を当該固定層２４に固定する。
【0051】
また、例えば、まずウェル２０内にゲル化前の原料液を入れてゲル化能を有する原料液層を形成し、次いで、ファイバー担体３０の一方の端部３１を当該原料液層に挿入し、その後、当該原料液層をゲル化して固定層２４を形成することにより、当該ファイバー担体３０を当該固定層２４に固定する。
【0052】
固定層２４を構成するゲルは、ファイバー担体３０の一部を固定できるものであれば特に限られないが、例えば、合成高分子ゲル、又は天然由来高分子ゲルが好ましく用いられる。また、固定層２４には、細胞非接着性のゲルが好ましく用いられる。細胞非接着性のゲルとしては、親水性高分子ゲルが好ましく用いられ、例えば、アガロースゲル、アルギン酸ゲル、及び合成高分子ゲル（例えば、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、ポリエチレンオキシド等を含むゲル）からなる群より選択される１以上の親水性高分子ゲルが好ましく用いられる。
【0053】
図３に示す例において、ファイバー担体３０は、基板１０と別体に成形された部材であるが、これに限られない。すなわち、ファイバー担体３０は、図５Ｂに示すように、基板１０と一体的に成形されてもよい。この場合、ファイバー担体３０は、ウェル２０（具体的に、図５Ｂに示す例では、底面２２ａ）と一体的に成形されているともいえる。したがって、ファイバー担体３０と基板１０とは同一の材料で構成される。一方、ファイバー担体３０が基板１０と別体に成形される場合、当該ファイバー担体３０を構成する材料は、当該基板１０を構成する材料と異なってもよいし、同一であってもよい。
【0054】
図３に示す例において、ファイバー担体３０は、その一部がウェル２０外まで延びているが、これに限られない。すなわち、ファイバー担体３０は、図５Ｃに示すように、その全体がウェル２０内に配置されてもよい。具体的に、図５Ｃに示す例において、ファイバー担体３０は、その一方の端部３１がウェル２０の内面２２（具体的には、底面２２ａ）に固定され、他方の端部３２は、自由端として当該ウェル２０の空間２１内に配置される。
【0055】
また、ファイバー担体３０は、培養容器１のウェル２０外の部分に固定されていることとしてもよい。この場合、ファイバー担体３０が固定される培養容器１の部分は、ウェル２０以外の部分であれば特に限られず、例えば、基板１０の一部（例えば、ウェル２０の開口２３が形成されている基板１０の表面１１）、又は基板１０以外の他の部材であってもよい。
【0056】
すなわち、培養容器１は、細胞の培養中にウェル２０より上方に配置される支持部をさらに含み、ファイバー担体３０は、当該支持部に固定されることとしてもよい。図６Ａには、この場合の一例を示す。
【0057】
図６Ａに示す例において、培養容器１は、ウェル２０より上方に配置される支持部５０を含んでいる。そして、ファイバー担体３０の一部が支持部５０に固定されている。また、ファイバー担体３０の他の一部は、ウェル２０内に配置されている。
【0058】
すなわち、ファイバー担体３０は、ウェル２０より上方に配置された支持部５０から吊り下げられている。そして、ファイバー担体３０の一部は、ウェル２０内まで下方に延びている。具体的に、支持部５０には、ファイバー担体３０の一方の端部３１が固定されている。また、ファイバー担体３０の他方の端部３２は、自由端として、ウェル２０内（具体的には、ウェル２０の底面２２ａ近傍）に配置されている。
【0059】
また、培養容器１は、細胞の培養中、当該培養容器１における支持部５０の位置を固定する位置決め部をさらに含むこととしてもよい。図６Ａには、この場合の一例を示す。図６Ａに示す例において、培養容器１は、支持部５０の位置を固定する位置決め部５１を含んでいる。
【0060】
位置決め部５１は、基板１０に固定されるとともに、支持部５０と連結されている。位置決め部５１によって、支持部５０の基板１０に対する相対的な位置が固定される。その結果、ファイバー担体３０の支持部５０に固定された部分（図６Ａに示す例では、ファイバー担体３０の一方の端部３１）の、ウェル２０又は基板１０に対する相対的な位置も固定される。
【0061】
なお、図６Ａに示す例では、位置決め部５１に形成された凸部５２が、基板１０の表面１１に形成された凹部１２に嵌め入れられることにより、当該位置決め部５１が当該基板１０に固定されているが、位置決め部５１を基板１０に固定する方法は、当該凹凸構造に限られず、フック等を含む係合構造や、接着剤を用いた接着構造等、任意の方法が用いられる。
【0062】
支持部５０は、図６Ａに示すように、ウェル２０の直上に配置されてもよいが、これに限られず、ウェル２０の直上以外の位置に配置されてもよい。図６Ｂには、この場合の一例を示す。図６Ｂに示す例において、支持部５０は、ウェル２０より上方であって、当該ウェル２０が形成されている基板１０の表面１１の上の位置（具体的には、隣接する一対のウェル２０の間の位置）に配置されている。
【0063】
支持部５０は、細胞の培養中、ウェル２０の開口２３を完全には塞がないことが好ましい。すなわち、細胞の培養中、培養容器１においては、ウェル２０の開口２３を介して、当該ウェル２０内に培養培地を入れ、又は当該ウェル２０内から培養培地を出すことが可能な程度に、当該開口２３が維持されていることが好ましい。
【0064】
具体的に、支持部５０は、培養容器１の平面視（図２参照）において、ウェル２０の開口２３の全体を覆わないことが好ましい。この点、図６Ａ及び図６Ｂに示すいずれの例においても、支持部５０は、培養容器１の平面視において、ウェル２０の開口２３の全体を覆うものではない。
【0065】
すなわち、図６Ａに示す例において、支持部５０は、培養容器１の平面視において、ウェル２０の開口２３の一部のみを覆っている。また、図６Ｂに示す例において、支持部５０は、培養容器１の平面視において、ウェル２０の開口２３を全く覆っていない。
【0066】
支持部５０を有する培養容器１において、ファイバー担体３０は、図６Ａ及び図６Ｂに示すように、ウェル２０内からウェル２０外まで延びていてもよいが、これに限られず、ファイバー担体３０は、その全体がウェル２０内に配置されてもよい。図６Ｃには、この場合の一例を示す。
【0067】
図６Ｃに示す例において、ファイバー担体２０の一方の端部３１は、ウェル２０の上端面、すなわち当該ウェル２０が形成されている基板１０の表面１１と同一平面上で支持部５０に固定され、当該ファイバー担体２０は当該支持部５０から吊り下げられている。
【0068】
このため、支持部５０に固定されている一方の端部３１を含め、ファイバー担体３０の全体がウェル２０内に配置されている。また、図６Ｃに示す例では、位置決め部５１は、隣接するウェル２０の間の位置に配置されている。
【0069】
なお、断面が図６Ｃのように示される支持部５０は、ウェル２０の開口２３の全体を塞ぐ蓋部であってもよいが、上述した他の態様と同様に、当該ウェル２０の開口２３を一部のみを塞ぐこととしてもよい。この点、支持部５０は、図６Ｄに示すように、培養容器１の平面視において、ウェル２０の開口２３の一部のみを塞ぐ構造を有してもよい。
【0070】
培養容器１が、ウェル２０を収容するキャビティ４０を含む場合、図６Ｅに示すように、支持部５０は、当該キャビティ４０より上方に配置されてもよい。図６Ｅに示す例において、位置決め部５１は、キャビティ４０が形成された表面４３に固定されている。また、培養容器１がキャビティ４０を含む場合において、位置決め部５１は、図６Ｆに示すように、ウェル２０が形成された表面１１に固定されてもよい。また、培養容器１がキャビティ４０を含む場合、支持部５０は、当該キャビティ４０内に配置されてもよい。
【0071】
【0072】
また、支持部５０は、着脱可能に設けられることとしてもよい。この場合、支持部５０は、例えば、図６Ａ～図６Ｆに示すように、培養容器１の基板１０とは別体に成形される。そして、支持部５０は、細胞の培養中は、位置決め部５１を介して基板１０に固定されることが好ましい。
【0073】
一方、細胞培養の開始前、又は細胞培養の終了後、支持部５０は、基板１０から脱離させることができる。なお、支持部５０が脱離可能に設けられる場合であっても、細胞培養の開始前、又は細胞培養の終了後に、当該支持部５０を基板１０に固定したままにしておいてもよい。また、細胞培養中に、支持部５０を一時的に脱着させてもよい。
【0074】
図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｅ及び図６Ｆに示す例では、位置決め部５１に形成された凸部５２が、基板１０の表面１１に形成された凹部１２に嵌め入れられることにより、当該位置決め部５１を介して支持部５０が着脱可能に設けられているが、支持部５０を着脱可能とする方法は、当該凹凸構造に限られず、フック等を含む係合構造や、剥がすことができる接着剤を用いた接着構造等、任意の方法が用いられる。
【0075】
【0076】
本方法は、ウェル２０を含む培養容器１を用意すること、当該培養容器１に固定されたファイバー担体３０の少なくとも一部が配置された当該ウェル２０内で細胞６０を培養すること、及び、当該細胞６０の培養により、当該ファイバー担体３０に接着した当該細胞６０を含む細胞－担体複合体１００を形成すること、を含む。
【0077】
本方法においては、まず、ウェル２０を含む培養容器１を用意する。培養容器１は、上述した培養容器であることが好ましい。すなわち、図７Ａに示すように、その少なくとも一部がウェル２０内に配置されたファイバー担体３０が固定された培養容器１を用意する。
【0078】
次いで、ファイバー担体３０の少なくとも一部が配置されたウェル２０内で細胞６０を培養する。すなわち、図７Ｂに示すように、培養容器１のウェル２０に細胞６０を播種することにより、当該細胞６０の培養を開始する。具体的には、培養培地８０に分散された細胞６０を含む細胞懸濁液をウェル２０に入れる。
【0079】
本方法において培養する細胞６０は、動物に由来する生きた細胞であれば特に限られない。動物は、ヒトであってもよいし、非ヒト動物（ヒト以外の動物）であってもよいが、ヒト細胞を用いることが好ましい。非ヒト動物は、特に限られないが、非ヒト脊椎動物（ヒト以外の脊椎動物）であることが好ましい。非ヒト脊椎動物は、特に限られないが、非ヒト哺乳類であることが好ましい。非ヒト哺乳類は、特に限られないが、例えば、霊長類（例えば、サル）、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ）、食肉類（例えば、イヌ、ネコ）、又は有蹄類（例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）であってもよい。
【0080】
細胞は、分化細胞であってもよいし、未分化細胞（幹細胞）であってもよい。幹細胞は、全能性幹細胞であってもよいし、多能性幹細胞であってもよいし、組織幹細胞であってもよい。具体的に、幹細胞は、例えば、人工多能性（ｉＰＳ）幹細胞であってもよいし、胚性幹（ＥＳ）細胞であってもよいし、胚性生殖（ＥＧ）細胞であってもよい。分化細胞は、分化した機能を有する細胞であれば特に限られないが、例えば、生体から採取された細胞（生体から採取された後に培養された細胞であってもよい。）であってもよいし、生体外において幹細胞から誘導された細胞であってもよい。
【0081】
細胞は、生体内の組織に由来する細胞であることとしてもよい。生体内の組織は、特に限られないが、例えば、毛包組織、皮膚組織、肝臓組織、心臓組織、腎臓組織、神経組織、骨組織、軟骨組織、骨髄組織、肺組織、腺組織、歯周組織又は血液であることとしてもよい。
【0082】
細胞は、接着性細胞であることが好ましい。接着性細胞は、生体内において、他の細胞及び／又は細胞外マトリクスに接着した状態で存在する細胞である。細胞としては、１種の細胞のみを用いてもよいし、２種以上の細胞を組み合わせて用いてもよい。２種以上の細胞を組み合わせる場合、これらの細胞を共培養することとなる。
【0083】
２種以上の細胞の組み合わせは、相互作用する異なる細胞の組み合わせであれば特に限られない。異なる細胞の組み合わせは、例えば、分化機能、増殖性、及び細胞表面マーカーからなる群より選択される１以上が異なる細胞の組み合わせである。
【0084】
２種以上の細胞の組み合わせは、生体内において相互作用する細胞の組み合わせであることが好ましい。この場合、細胞の組み合わせは、生体内の同一の組織において相互作用する細胞の組み合わせであってもよい。生体内の組織は、特に限られないが、例えば、毛包組織、腺組織、皮膚組織、肝臓組織、心臓組織、腎臓組織、神経組織、骨組織、軟骨組織、骨髄組織、肺組織、歯周組織又は血液であることとしてもよい。
【0085】
２種以上の細胞の組み合わせは、同一の動物に由来する細胞の組み合わせであってもよいし、異なる動物に由来する細胞の組み合わせであってもよい。すなわち、２種以上の細胞は、いずれもヒト細胞（ヒトに由来する細胞）であってもよいし、いずれも非ヒト動物細胞（ヒト以外の動物に由来する細胞）であってもよいし、一方がヒト細胞であり、他方が非ヒト動物細胞であってもよい。ただし、２種以上のヒト細胞を用いることが好ましい。
【0086】
２種以上の細胞の組み合わせは、例えば、上皮系細胞と間葉系細胞との組み合わせであることが好ましい。上皮系細胞と間葉系細胞との組み合わせは、特に限られないが、例えば、毛包組織又は腺組織（例えば、汗腺、皮脂腺、涙腺、及び唾液腺からなる群より選択される１以上）において相互作用する上皮系細胞と間葉系細胞との組み合わせであることが好ましい。
【0087】
上皮系細胞及び／又は間葉系細胞は、生体の毛包組織又は腺組織（例えば、汗腺、皮脂腺、涙腺、及び唾液腺からなる群より選択される１以上）から採取された細胞（当該毛包組織から採取された後に培養された細胞であってもよい。）であってもよいし、生体外において幹細胞から誘導された細胞であってもよい。
【0088】
具体的に、上皮系細胞は、毛包組織のバルジ領域の外毛根鞘最外層細胞、毛母基部に由来する上皮系細胞、又は幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、又はＥＧ細胞）から誘導された毛包上皮系細胞であることとしてもよい。また、上皮系細胞は、上皮幹細胞であってもよい。
【0089】
間葉系細胞は、毛乳頭細胞、真皮毛根鞘細胞、発生期の皮膚間葉系細胞、又は幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、又はＥＧ細胞）から誘導された毛包間葉系細胞であることとしてもよい。
【0090】
上皮系細胞は、発毛関連特性（例えば、発毛関連遺伝子の発現、及び／又は、間葉系細胞との共培養による毛包原基の形成）を有するものであってもよい。上皮系細胞は、毛包組織（例えば、毛包組織のバルジ領域の外毛根鞘最外層、及び又は、毛母基部）に由来する細胞であってもよく、皮膚組織に由来する細胞であってもよく、生体外で幹細胞（例えば、ｉＰＳ幹細胞、ＥＳ細胞、又はＥＧ細胞）から誘導された細胞であってもよい。上皮系細胞は、生体から採取された初代細胞であってもよく、予め培養された細胞（例えば、継代培養された細胞、及び／又は、株化された細胞）であってもよい。上皮系細胞は、例えば、サイトケラチンを発現する細胞として特定される。上皮系細胞は、上皮幹細胞であることが好ましい。上皮幹細胞は、例えば、サイトケラチン１５、及び／又は、ＣＤ３４を発現する細胞として特定される。
【0091】
間葉系細胞は、発毛関連特性（例えば、発毛関連遺伝子の発現、及び／又は、上皮系細胞との共培養による毛包原基の形成）を有するものであってもよい。間葉系細胞は、成体毛包組織（例えば、毛乳頭及び／又は毛球部毛根鞘）に由来する細胞であってもよく、皮膚組織（胎児、幼体、成体のいずれの皮膚組織であってもよい。）に由来する細胞であってもよく、生体外で幹細胞（例えば、人工多能性（ｉＰＳ）幹細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、又は胚性生殖（ＥＧ）細胞）から誘導された細胞であってもよい。間葉系細胞は、生体から採取された初代細胞であってもよく、予め培養された細胞（例えば、継代培養された細胞、及び／又は、株化された細胞）であってもよい。間葉系細胞は、例えば、Ｖｅｒｓｉｃａｎ及びＡＬＰ（アルカリフォスファターゼ）を発現する細胞として特定される。具体的に、間葉系細胞としては、毛乳頭細胞及び／又は毛球部毛根鞘細胞が好ましく用いられる。毛乳頭細胞及び毛球部毛根鞘細胞は、Ｖｅｒｓｉｃａｎ及びＡＬＰを発現する。
【0092】
培養培地８０は、その中で細胞６０の生存を維持するための成分を含む液体であれば特に限られず、例えば、培養する細胞６０の種類に応じて商業的に流通している公知の培養培地が用いられる。
【0093】
細胞６０の培養は、当該細胞６０の培養に適した温度で、当該細胞６０の培養に適した組成及び湿度の気相中、ウェル２０内において、培養培地中で当該細胞６０を保持することにより行う。また、本方法においては、ファイバー担体３０に接着した細胞６０を得るため、播種された細胞６０の少なくとも一部が当該ファイバー担体３０に接した状態で、培養を行う。
【0094】
ウェル２０への細胞６０の播種後、培養容器１を静置することで、細胞６０は、図７Ｃに示すように、ウェル２０内の培養培地８０中で、重力により、当該ウェル２０の底面２２ａ上に沈降する。
【0095】
この結果、一部の細胞６０は、ファイバー担体３０の周囲（具体的には、ウェル２０の底面２２ａに固定されたファイバー担体３０の一方の端部３１の周囲）に沈降し、当該ファイバー担体３０に接した状態で保持される。
【0096】
ウェル２０内で培養される細胞６０の密度は、本発明による効果が得られる範囲内であれば特に限られないが、例えば、図７Ｃに示すように、当該ウェル２０の底面２２ａ上に沈降した場合に、複数の細胞層が積み重なる程度の密度にて細胞６０を播種し、培養することが好ましい。
【0097】
播種された細胞６０の少なくとも一部がファイバー担体３０に接した状態で培養を継続することにより、図７Ｄに示すように、少なくとも一部の細胞６１が当該ファイバー担体３０に接着する。
【0098】
すなわち、細胞６０に接しているファイバー担体３０の一部の表面に予め細胞接着性を付与する処理（例えば、コラーゲンのコーティング処理）が施されている場合には、少なくとも一部の細胞６１は、当該細胞接着性の表面に接着する。
【0099】
また、細胞接着性を付与する処理を行わない場合であっても、接着性の細胞６１は、例えば、培養培地８０に含まれるタンパク質等の成分、及び／又は、当該細胞６１が培養培地８０中に分泌する細胞外マトリックス等の成分を介して、ファイバー担体３０の表面に接着する。
【0100】
このような細胞６０の培養により、図７Ｄに示すように、ファイバー担体３０と、当該ファイバー担体３０に接着した細胞６１とを含む細胞－担体複合体１００が形成される。
【0101】
また、一部の細胞６１がファイバー担体３０に接着した後も培養を継続することにより、図７Ｅに示すように、当該ファイバー担体３０に接着した細胞集合体７０を含む細胞－担体複合体１００を形成することができる。
【0102】
すなわち、一部の細胞６１がファイバー担体３０に接着し、他の細胞６０が当該一部の細胞６１と接した状態で培養を継続することにより、当該一部の細胞６１と他の細胞６０との結合、及び、当該他の細胞６０同士の結合の形成により、当該細胞６０が自発的に凝集する。
【0103】
その結果、ファイバー担体３０に接着した細胞６１を含み、当該ファイバー担体３０の一部を囲む細胞集合体７０が形成される。換言すれば、その内部にファイバー担体３０の一部が配置された細胞集合体７０が形成される。
【0104】
こうして、本方法においては、細胞－担体複合体１００を製造することができる。本方法によれば、ファイバー担体３０が固定された培養容器１を用いて細胞６０の培養を行うことにより、簡便に、細胞－担体複合体１００を製造することができる。
【0105】
【0106】
また、本方法は、細胞－担体複合体１００の形成後、ファイバー担体３０を培養容器１から分離することにより、当該細胞－担体複合体１００を回収することをさらに含むこととしてもよい。
【0107】
すなわち、ファイバー担体３０は、ファイバー状の部材であることから、培養容器１から容易に分離することができ、その結果、当該培養容器１から分離されたファイバー担体３０を含む細胞－担体複合体１００をウェル２０から回収することができる。この場合、回収された細胞－担体複合体１００は、培養容器１から分離されたファイバー片であるファイバー担体３０を含む。
【0108】
具体的に、例えば、図７Ａ～図７Ｅに示すように、ファイバー担体３０が、ウェル２０の底面２２ａに挿入されて固定されている場合には、図７Ｆに示すように、当該ファイバー担体３０を当該底面２２ａから引き抜くことにより、細胞－担体複合体１００を回収することができる。なお、図７Ｆに示す例では、細胞－担体複合体１００を回収した後のウェル２０の底面２２ａには、ファイバー担体３０の一方の端部３１が挿入されていた凹部１３が露出している。
【0109】
また、例えば、図５Ａに示すように、ファイバー担体３０がゲルで構成される固定層２４に固定されている場合、当該ファイバー担体３０を当該固定層２４から引き抜くことにより、細胞－担体複合体１００を回収することができる。
【0110】
また、例えば、図５Ｂに示すように、ファイバー担体３０が基板１０と一体的に成形されている場合、当該ファイバー担体３０のうち、ウェル２０の底面２２ａに固定されている部分（一方の端部３１）をメスやハサミ等の器具で切断することにより、細胞－担体複合体１００を回収することができる。
【0111】
培養容器１において、ファイバー担体３０がウェル２０の底面２２ａ等の内面２２に固定されている場合、当該ファイバー担体３０の一部が当該ウェル２０外まで延び出ていることは、当該ファイバー担体３０を当該培養容器１から分離するための操作が容易となるため好ましい。
【0112】
また、図７Ａ～図７Ｅに示すように、ファイバー担体３０の一部がウェル２０内の培養培地８０外まで延び出ていることは、図５Ｃに示すように、ファイバー担体３０の全体がウェル２０内に配置される場合も含めて、当該ファイバー担体３０を当該培養容器１から分離するための操作が容易となるため好ましい。
【0113】
図７Ｇには、培養容器１が、ウェル２０を収容するキャビティ４０を含む場合において、当該ウェル２０内に細胞６０が保持された様子を示す。この場合、キャビティ４０に培養培地８０を保持し、当該培養培地８０中に配置されたウェル２０内で細胞６０を培養する。図７Ｇに示す例において、その一部（具体的には、一方の端部３１）がウェル２０の内面２２（具体的には、底面２２ａ）に固定されたファイバー担体３０は、他の一部（具体的には、自由端である他方の端部３２）が培養培地の外まで延びている。
【0114】
【0115】
本方法においては、まず、図８Ａに示すように、一方の端部３１が支持部５０に固定されたファイバー担体３０の少なくとも一部がウェル２０内に配置された培養容器１を用意する。この培養容器１においては、支持部５０から吊り下げられたファイバー担体３０の自由端である端部３２が、ウェル２０の底面２２ａ近傍に配置されている。
【0116】
次いで、ファイバー担体３０の少なくとも一部が配置されたウェル２０内で細胞６０を培養する。すなわち、図８Ｂに示すように、培養容器１のウェル２０に、培養培地８０に分散された細胞６０を播種することにより、当該細胞６０の培養を開始する。
【0117】
その後、培養容器１を静置することで、細胞６０は、図８Ｃに示すように、ウェル２０内の培養培地中で、重力により、当該ウェル２０の底面２２ａ上に沈降する。この結果、一部の細胞６０は、ファイバー担体３０の周囲（具体的には、ウェル２０の底面２２ａ近傍に配置されたファイバー担体３０の他方の端部３２（自由端）の周囲）に沈降し、当該ファイバー担体３０に接した状態で保持される。
【0118】
そして、少なくとも一部の細胞６０がファイバー担体３０に接した状態で培養を継続することにより、図８Ｄに示すように、一部の細胞６１が当該ファイバー担体３０に接着する。すなわち、ファイバー担体３０が配置されたウェル２０内における細胞６０の培養により、当該ファイバー担体３０と、当該ファイバー担体３０に接着した細胞６１とを含む細胞－担体複合体１００が形成される。
【0119】
さらに、ファイバー担体３０の周囲で細胞６０の培養を継続することにより、図８Ｅに示すように、当該ファイバー担体３０に接着した細胞集合体７０を含む細胞－担体複合体１００が形成される。
【0120】
また、細胞－担体複合体１００の形成後、図８Ｆに示すように、ファイバー担体３０を培養容器１（具体的には、支持部５０）から分離することにより、当該細胞－担体複合体１００を回収することができる。具体的に、図８Ｆに示す例では、支持部５０に固定されていたファイバー担体３０の一方の端部３１付近をメスやハサミ等の器具で切断することにより、当該支持部５０から分離された当該ファイバー担体３０と、当該ファイバー担体３０の他方の端部３２の周囲に形成された細胞集合体７０を含む細胞－担体複合体１００を回収することができる。
【0121】
図８Ｇには、支持部５０を含む培養容器１が、ウェル２０を収容するキャビティ４０を含む場合において、当該ウェル２０内に細胞６０が保持された様子を示す。この場合、キャビティ４０に培養培地８０を保持し、当該培養培地８０中に配置されたウェル２０内で細胞６０を培養する。図８Ｇに示す例において、その一部（具体的には、一方の端部３１）が、キャビティ４０より上方に配置された支持部５０に固定されたファイバー担体３０は、他の一部（具体的には、自由端である他方の端部３２）が、ウェル２０内まで延びている。なお、支持部５０は、キャビティ４０内であって、当該キャビティ４０に保持された培養培地８０外に配置されてもよい。
【0122】
上述の図７Ａ～図７Ｆ、及び図８Ａ～図８Ｆに示す例では、予めファイバー担体３０の少なくとも一部が配置されたウェル２０に細胞６０を播種したが、これに限られず、当該ファイバー担体３０が配置されていないウェル２０に細胞６０を播種し、次いで、当該ウェル２０内に当該ファイバー担体３０を配置することとしてもよい。図９Ａ～図９Ｃには、この場合の本方法の一例に含まれる工程の一部を概略的に示す。
【0123】
本方法においては、図９Ａに示すように、ウェル２０内にファイバー担体３０が配置されていない培養容器１を用意する。次いで、ファイバー担体３０の少なくとも一部が配置されたウェル２０内で細胞６０を培養する。すなわち、まず、図９Ｂに示すように、ファイバー担体３０が配置されていないウェル２０に、培養培地８０に分散された細胞６０を播種する。
【0124】
次いで、図９Ｃに示すように、予め細胞６０が播種されたウェル２０内に、ファイバー担体３０の少なくとも一部を配置することにより、当該細胞６０の培養を開始する。すなわち、細胞６０の播種後、ファイバー担体３０が固定された支持体５０を培養容器１に設置することにより、当該ファイバー担体３０の一部（具体的には、ファイバー担体３０の自由端である端部３２）を、ウェル２０内の培養培地８０に浸漬して、底面２２ａ近傍に配置する。この支持体５０の設置は、当該支持体５０に連結された位置決め部５１を、基板１０に固定することにより行う。
【0125】
本方法により製造される細胞－担体複合体１００は、ファイバー担体３０を含むという特徴を利用して、様々な用途に適用される。すなわち、例えば、細胞－担体複合体１００が生体への移植用細胞を含む場合には、当該細胞－担体複合体１００は、移植片として利用される。細胞－担体複合体１００が移植される生体は、ヒトであってもよいし、非ヒト動物であってもよいが、ヒトであることが好ましい。
【0126】
具体的に、細胞－担体複合体１００が、毛包組織由来の細胞又は腺組織由来の細胞を含む場合、細胞－担体複合体１００は、毛包組織又は腺組織を再生させるため、生体に移植することができる。移植された細胞－担体複合体１００において、ファイバー担体３０は、例えば、当該細胞－担体複合体１００に含まれる細胞が増殖し、及び／又は遊走するためのガイドとしての役割を果たす。
【0127】
本方法により製造された細胞－担体複合体１００を生体に移植して当該細胞－担体複合体１００から毛を生やす場合、当該生体は特に限られず、ヒトであってもよいし、非ヒト動物であってもよい。細胞－担体複合体１００の生体への移植は、当該生体の皮膚への移植であることが好ましい。皮膚への移植は、例えば、皮下移植であってもよいし、皮内移植であってもよい。
【0128】
細胞－担体複合体１００の製造及びその生体への移植は、医学的用途であってもよいし、研究用途であってもよい。すなわち、例えば、脱毛を伴う疾患の治療又は予防のために、当該疾患を患っている又は患う可能性のあるヒト患者に移植する目的で細胞－担体複合体１００を製造し、当該細胞－担体複合体１００を当該ヒト患者に移植することとしてもよい。
【0129】
脱毛を伴う疾患は、特に限られないが、例えば、男性型脱毛症（Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ Ａｌｏｐｅｃｉａ：ＡＧＡ）、女子男性型脱毛症（Ｆｅｍａｌｅ Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ Ａｌｏｐｅｃｉａ：ＦＡＧＡ）、分娩後脱毛症、びまん性脱毛症、脂漏性脱毛症、粃糠性脱毛症、牽引性脱毛症、代謝異常性脱毛症、圧迫性脱毛症、円形脱毛症、神経性脱毛症、抜毛症、全身性脱毛症、及び症候性脱毛症からなる群より選択される１以上であることとしてもよい。
【0130】
また、例えば、脱毛を伴う疾患の治療又は予防に使用され得る物質の探索、及び／又は当該疾患の機構に関与する物質の探索のために、細胞－担体複合体１００を製造し、又は当該細胞－担体複合体１００を非ヒト動物に移植することとしてもよい。
【0131】
なお、細胞－担体複合体１００を生体に移植した後、当該細胞－担体複合体１００に含まれるファイバー担体３０は除去される。すなわち、例えば、移植された細胞－担体複合体１００から延び出るファイバー担体３０をピンセットで引き抜くことにより、当該ファイバー担体３０を除去することができる。また、ファイバー担体３０が生体分解性材料で構成されている場合には、移植後、当該ファイバー担体３０は、加水分解等によって分解され、除去される。
【0132】
次に、本実施形態に係る具体的な実施例について説明する。
【実施例】
【0133】
［上皮系細胞及び間葉系細胞の採取］
胎齢１８日のＣ５７ＢＬ／６マウス胎児より背部の皮膚組織を採取し、中尾らが報告した方法（Koh-ei Toyoshima et al. Nature Communication, 3, 784, 2012）を一部改変して、ディスパーゼ処理を４℃で１時間、３０ｒｐｍ震盪条件で行い、当該皮膚組織の上皮層と間葉層とを分離した。その後、上皮層に１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ処理を１時間２０分施し、さらにトリプシン処理を１０分施すことで、上皮系細胞を単離した。また、間葉層には１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ処理を１時間２０分施すことで間葉系細胞を単離した。
胎齢１８日のＣ５７ＢＬ／６マウス胎児より背部の皮膚組織を採取し、中尾らが報告した方法（Koh-ei Toyoshima et al. Nature Communication, 3, 784, 2012）を一部改変して、ディスパーゼ処理を４℃で１時間、３０ｒｐｍ震盪条件で行い、当該皮膚組織の上皮層と間葉層とを分離した。その後、上皮層に１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ処理を１時間２０分施し、さらにトリプシン処理を１０分施すことで、上皮系細胞を単離した。また、間葉層には１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ処理を１時間２０分施すことで間葉系細胞を単離した。
【0134】
［培養容器の製造］
規則的に配置された複数のウェルを含む培養容器を製造した。すなわち、まずＣＡＤソフト（Ｖ Ｃａｒｖｅ Ｐｒｏ ６．５）を用いて、作製するマルチウェルのパターンをコンピューターで設計した。次いで、切削機を用いて、設計したパターン通りにオレフィン系樹脂基板を切削することで、当該パターンを有する凹鋳型を作製した。この鋳型にエポキシ樹脂（クリスタルリジン、日新レジン株式会社製）を流し込み、１日硬化させ、その後、離型することで、上述の設計されたパターンを有する凸鋳型を形成した。形成した凸鋳型を２４ウェルプレートの底面に固定し、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を流し込んで固化し、その後、離型することで、ＰＤＭＳ基板に規則的なパターンで形成されたマルチウェル（各ウェルの直径は１ｍｍ、深さは１ｍｍ）を有するマルチウェル培養容器を作製した。
規則的に配置された複数のウェルを含む培養容器を製造した。すなわち、まずＣＡＤソフト（Ｖ Ｃａｒｖｅ Ｐｒｏ ６．５）を用いて、作製するマルチウェルのパターンをコンピューターで設計した。次いで、切削機を用いて、設計したパターン通りにオレフィン系樹脂基板を切削することで、当該パターンを有する凹鋳型を作製した。この鋳型にエポキシ樹脂（クリスタルリジン、日新レジン株式会社製）を流し込み、１日硬化させ、その後、離型することで、上述の設計されたパターンを有する凸鋳型を形成した。形成した凸鋳型を２４ウェルプレートの底面に固定し、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を流し込んで固化し、その後、離型することで、ＰＤＭＳ基板に規則的なパターンで形成されたマルチウェル（各ウェルの直径は１ｍｍ、深さは１ｍｍ）を有するマルチウェル培養容器を作製した。
【0135】
一方、ファイバー担体として、ステンレス繊維（外径１００μｍ、長さ１０ｍｍ）を用意した。このステンレス繊維の表面の細胞接着性を高めるため、当該ステンレス繊維にコラーゲンコーティングを施した。
【0136】
そして、コラーゲンが塗布されたステンレス繊維の一方の端部を、マルチウェル培養容器のウェルのＰＤＭＳ製底面に突き刺すことにより、当該ステンレス繊維を当該培養容器に固定した。なお、１つのウェルに１本のステンレス繊維を配置した。こうして、ファイバー担体としてのステンレス繊維が配置されたウェルを含む培養容器を得た。
【0137】
［細胞－担体複合体の製造］
上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞密度がそれぞれ４×１０３個／ウェルとなるように（すなわち、総細胞密度が８×１０３個／ウェルとなるように）、当該上皮系細胞と当該間葉系細胞とを混合して、上述のようにして製造した培養容器の各ウェルに播種した。
上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞密度がそれぞれ４×１０３個／ウェルとなるように（すなわち、総細胞密度が８×１０３個／ウェルとなるように）、当該上皮系細胞と当該間葉系細胞とを混合して、上述のようにして製造した培養容器の各ウェルに播種した。
【0138】
なお、培養培地としては、間葉系細胞培養培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）と、ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２とを体積比１：１で混合して調製された混合培地を用いた。その後、各ウェル内で３日間、細胞培養を行った。
【0139】
［結果］
３日間の細胞培養により、ファイバー担体の表面に接着した細胞集合体が形成された。３日間の細胞培養後に、ファイバー担体をウェルの底面から引き抜くことにより、当該ファイバー担体と、当該ファイバー担体に接着した細胞集合体とから構成される細胞－担体複合体を回収した。
３日間の細胞培養により、ファイバー担体の表面に接着した細胞集合体が形成された。３日間の細胞培養後に、ファイバー担体をウェルの底面から引き抜くことにより、当該ファイバー担体と、当該ファイバー担体に接着した細胞集合体とから構成される細胞－担体複合体を回収した。
【0140】
図１０には、回収された細胞－担体複合体の位相差顕微鏡写真を示す。図１０においてスケールバーは２００μｍを示す。図１０に示すように、ファイバー担体の一部に接着した細胞集合体を含む細胞－担体複合体が得られた。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
【図7G】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図8F】
【図8G】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10】
