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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-06-29
(45)【発行日】2023-07-07
(54)【発明の名称】細菌メタゲノム解析を通した脳腫瘍診断方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6886 20180101AFI20230630BHJP
C12Q 1/689 20180101ALI20230630BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20230630BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20230630BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230630BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20230630BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6886 Z
C12Q1/689 Z ZNA
C12Q1/686 Z
C12Q1/6869 Z
G01N33/53 M
C12N15/11 Z
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2022500794
(86)(22)【出願日】2020-06-30
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-13
(86)【国際出願番号】 KR2020008508
(87)【国際公開番号】W WO2021006523
(87)【国際公開日】2021-01-14
【審査請求日】2022-01-19
(31)【優先権主張番号】10-2019-0082317
(32)【優先日】2019-07-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2020-0057634
(32)【優先日】2020-05-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】516348577
【氏名又は名称】エムディー ヘルスケア インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＭＤ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ ＩＮＣ．
(73)【特許権者】
【識別番号】509329800
【氏名又は名称】ソウル大学校産学協力団
【氏名又は名称原語表記】ＳＥＯＵＬ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ Ｒ＆ＤＢ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】キム、ユン－クン
(72)【発明者】
【氏名】ペク、ソン ハ
(72)【発明者】
【氏名】ムン、ヒョ ウン
(72)【発明者】
【氏名】パク、ヒョン ウ
【審査官】千葉 直紀
(56)【参考文献】
【文献】Cell Mol Neurobiol., 2016, Vol. 36, No. 3, pp. 353-360
【文献】TRANSFUSION, 2016, Vol. 56, pp. 1138-1147
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
ＣＡＰＬＵＳ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）正常ヒトサンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出し、被検者サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する、段階；（ｂ）前記抽出した正常ヒトサンプル由来ＤＮＡおよび被検者サンプル由来ＤＮＡそれぞれに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを用いてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒト由来サンプルの細菌由来細胞外小胞の含有量と、被検者由来サンプルの細菌由来細胞外小胞の含有量を比較する段階
を含み、
前記正常ヒトサンプル及び前記被検者サンプルは、血液または血清であり、
前記正常ヒトサンプル及び前記被検者サンプルが血液である場合、前記段階（ｃ）において、正常ヒト由来サンプルと被検者由来サンプルのラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、およびステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含有量をそれぞれ比較する段階を含む；または
前記正常ヒトおよび被検者サンプルが血清である場合、前記段階（ｃ）において、正常ヒト由来サンプルと被検者由来サンプルのノエリア（Ｋｎｏｅｌｌｉａ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびツリシバクター（Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ）属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含有量をそれぞれ比較する段階を含むことを特徴とする、脳腫瘍診断のための情報提供方法。
【請求項2】
前記正常ヒトサンプルおよび前記被検者サンプルが血液である場合、
前記段階（ｃ）で、正常ヒト由来サンプルと被検者由来サンプルのラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、およびステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含有量をそれぞれ比較し；
正常ヒト由来サンプルと被検者由来サンプルの
放線菌門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびテネリクテス門（Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
放線菌綱（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびモリクテス綱（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
ツリシバクテラレス目（Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）およびキサントモナス目（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
イントラスポランギウム科（Ｉｎｔｒａｓｐｏｒａｎｇｉａｃｅａｅ）、ラクトバシラス科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、モギバクテリア科（Ｍｏｇｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ツリシバクター科（Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ノカルディア科（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、キサントモナス科（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、ウィクセラセエ（Ｗｅｅｋｓｅｌｌａｃｅａｅ）、およびベイヨネラ科（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）からなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または、
ツリシバクター（Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ）、テピディモナス（Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ）、およびクロアシバクテリウム（Ｃｌｏａｃｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含有量をそれぞれ比較して、脳腫瘍を判定することを特徴とする、請求項１に記載の脳腫瘍診断のための情報提供方法。
【請求項3】
前記正常ヒトおよび被検者サンプルが血清である場合、
前記段階（ｃ）で、正常ヒト由来サンプルと被検者由来サンプルのノエリア（Ｋｎｏｅｌｌｉａ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびツリシバクター（Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ）属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含有量をそれぞれ比較し；
正常ヒト由来サンプルと被検者由来サンプルの
フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、放線菌門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、およびプロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）からなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
クロストリジウム綱（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、バシラス綱（Ｂａｃｉｌｌ）、エリュシペロトリクス綱（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉａ）、ガンマプロテオバクテリア綱（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、放線菌綱（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アルファプロテオバクテリア綱（Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、およびネガティウィクテス綱（Ｎｅｇａｔｉｖｉｃｕｔｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
クロストリジウム目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）、ビフィドバクテリウム目（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、エリュシペロトリクス目（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ）、ラクトバシラス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）、ミクロコッカス目（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スフィンゴモナス目（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）、およびセレノモナス目（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ラクトバシラス科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、ペプトストレプトコッカス科（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、エリュシペロトリクス科（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、レンサ球菌科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、スフィンゴモナス科（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、およびポルフィロモナス科（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）からなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または
ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）ＵＣＧ－０１４、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）ＮＫ４Ａ１３６、ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）ＵＣＧ－０１３、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ルミニクロストリジウム（Ｒｕｍｉｎｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）６、ペプトクロストリジウム（Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ユウバクテリウム・コプロスタノリゲネス（［Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ］ ｃｏｐｒｏｓｔａｎｏｌｉｇｅｎｅｓ）、大腸菌－赤痢菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ－Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、ソラナム・メロンゲーナ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）、パラバクテロイデス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、ルミニクロストリジウム（Ｒｕｍｉｎｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクノスピラセエ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）（ｆ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）１、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、クロストリジアレスバディンＢＢ６０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ ｖａｄｉｎＢＢ６０）（ｆ）、ルミノコッカセエ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）（ｆ）、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）２、ペプトコッカセエ（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）（ｆ）、ジアフォロバクター（Ｄｉａｐｈｏｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）１、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびベイヨネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）からなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含有量をそれぞれ比較して、脳腫瘍を判定することを特徴とする、請求項１に記載の脳腫瘍診断のための情報提供方法。
【請求項4】
前記血液が、全血、血清、血漿、または血液単核球であることを特徴とする、請求項１に記載の脳腫瘍診断のための情報提供方法。
【請求項5】
下記の段階を含む、脳腫瘍発病を予測するための情報提供方法：（ａ）正常ヒトサンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出し、被検者サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出した正常ヒトサンプル由来ＤＮＡおよび被検者サンプル由来ＤＮＡそれぞれに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを用いてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒト由来サンプルの細菌由来細胞外小胞の含有量と被検者由来サンプルの細菌由来細胞外小胞の含有量を比較する段階を含み、
前記正常ヒトおよび被検者サンプルは、血液または血清であり、
前記正常ヒトおよび被検者サンプルが血液である場合、前記段階（ｃ）で、正常ヒト由来サンプルと被検者由来サンプルのラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、およびステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含有量をそれぞれ比較する段階を含む；または
前記正常ヒトおよび被検者サンプルが血清である場合、前記段階（ｃ）で、正常ヒト由来サンプルと被検者由来サンプルのノエリア（Ｋｎｏｅｌｌｉａ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびツリシバクター（Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ）属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含有量をそれぞれ比較する段階を含むことを特徴とする、脳腫瘍の発病を予測するための情報提供方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細菌メタゲノム解析を通して脳腫瘍を診断する方法に関し、より具体的には、正常ヒトおよび被検者由来サンプルを用いて細菌メタゲノム解析を行って特定細菌由来細胞外小胞の含有量の増減を分析することによって、脳腫瘍を診断する方法などに関する。
【0002】
本出願は、２０１９年０７月０８日に出願された韓国特許出願第１０－２０１９－００８２３１７号および２０２０年０５月１４日に出願された韓国特許出願第１０－２０２０－００５７６３４号に基づく優先権を主張し、当該出願の明細書および図面に開示されたすべての内容は本出願に援用される。
【背景技術】
【0003】
脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒ）は、脳および中枢神経系で発生する腫瘍であり、「脳癌（ｂｒａｉｎ ｃａｎｃｅｒ）」と混用して使用されることがあり、全体的に見るとき、全身で発生する腫瘍のうち４または５番目に多く発生し、特に小児では、全体悪性腫瘍のうち２番目に好発する腫瘍である。脳腫瘍の発生率は、人口１０万人当たり約１０人であり、原発性脳腫瘍のうちで最も多く発生する神経膠腫は、全体の約３５％を占め、悪性が多い。脳腫瘍の原因の一つとして今まで知られた突然変異誘発物質には、放射線、化学物質、ウイルスなどがあり、エイズのように免疫機能が低下する場合にも、脳腫瘍の発生頻度が増加することが知られている。最近、環境汚染などによって化学物質と癌発生間の関連性に対する関心が高まっているが、脳腫瘍の発生間には明確な因果関係が解明されていない。
【0004】
脳腫瘍が臨床症状を起こす機序としては、脳圧の上昇による症状、脳腫瘍が周囲の脳を圧迫することによって発生する症状、脳腫瘍が周囲脳神経を電気的に刺激することによって発生する症状（てんかん発作）、ホルモン異常による症状が含まれる。積極的な治療を受けない場合は、悪性、陽性脳腫瘍の両方とも致命的な結果を招くことになる。
【0005】
従来の脳腫瘍患者の予後を判別する方法としては、臨床治療の経過、放射線療法および化学療法の経過を総合し、脳腫瘍の悪性度と位置、年齢などを考慮して再発の可能性をはじめとする生存予後を決定することが一般的な方法であったが、これは、患者の類型ごとに多様な差異が存在し、臨床的治療に対する結果も変わるので、正確な予後予測方法といえない。したがって、脳腫瘍を診断し、予後を予測できる新しい診断および治療標的としてのバイオマーカー開発の必要性が台頭している。
【0006】
なお、微生物叢（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａあるいはｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）は、与えられた生息域に存在する細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）、古細菌（ａｒｃｈａｅａ）、真核生物（ｅｕｋａｒｙａ）を含む微生物群集（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）を言い、腸内微生物叢は、ヒトの生理現象に重要な役割をし、人体細胞と相互作用を通じてヒトの健康と病気に大きい影響を及ぼすことが知られている。人体に共生する細菌は、他の細胞への遺伝子、タンパク質などの情報を交換するために、ナノメートルサイズの小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）を分泌する。粘膜は、２００ナノメートル（ｎｍ）サイズ以上の粒子は通過できない物理的な防御膜を形成し、粘膜に共生する細菌である場合には粘膜を通過しないが、細菌由来小胞は、サイズがたいてい１００ナノメートルサイズ以下であるから、比較的自由に粘膜を通過して人体に吸収される。
【0007】
環境ゲノミクスとも呼ばれるメタゲノミクスは、環境で採取したサンプルから得られたメタゲノム資料に対する分析学と言える。最近、１６ｓリボソームＲＮＡ（１６ｓ ｒＲＮＡ）塩基配列を基盤とする方法によりヒトの微生物叢の細菌構成をリスト化することが可能になり、１６ｓリボソームＲＮＡの遺伝子である１６ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を次世代シーケンシング（ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＮＧＳ）プラットホームを用いて分析する。しかしながら、脳腫瘍の発病において、血液などの人体由来物から細菌由来小胞に存在するメタゲノム解析を通して脳腫瘍の原因因子を同定し、脳腫瘍を予測する方法については報告されたことがない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明者らは、脳腫瘍の原因因子および発病危険度をあらかじめ診断するために、正常ヒトおよび被検者由来サンプルである血液に存在する細菌由来細胞外小胞から遺伝子を抽出し、これに対してメタゲノム解析を行い、その結果、脳腫瘍の原因因子として作用できる細菌由来細胞外小胞を同定したところ、これに基づいて本発明を完成した。
【0009】
これより、本発明は、細菌由来細胞外小胞に対するメタゲノム解析を通して脳腫瘍を診断するための情報提供方法、脳腫瘍診断方法、および脳腫瘍発病危険度の予測方法などを提供することを目的とする。
【0010】
しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から当業者が明確に理解できる。
【課題を解決するための手段】
【0011】
上記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、下記の段階を含む、脳腫瘍診断のための情報提供方法を提供する：
（ａ）正常ヒトおよび被検者サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを用いてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒト由来サンプルと細菌由来細胞外小胞の含有量の増減を比較する段階。
（ａ）正常ヒトおよび被検者サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを用いてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒト由来サンプルと細菌由来細胞外小胞の含有量の増減を比較する段階。
【0012】
また、本発明は、下記の段階を含む、脳腫瘍診断方法を提供する：
（ａ）正常ヒトおよび被検者サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを用いてＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒト由来サンプルと細菌由来細胞外小胞の含有量の増減を比較する段階。
（ａ）正常ヒトおよび被検者サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを用いてＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒト由来サンプルと細菌由来細胞外小胞の含有量の増減を比較する段階。
【0013】
また、本発明は、下記の段階を含む、脳腫瘍の発病危険度の予測方法を提供する：
（ａ）正常ヒトおよび被検者サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを用いてＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒト由来サンプルと細菌由来細胞外小胞の含有量の増減を比較する段階。
（ａ）正常ヒトおよび被検者サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを用いてＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒト由来サンプルと細菌由来細胞外小胞の含有量の増減を比較する段階。
【0014】
また、本発明は、下記の段階を含む、脳腫瘍発病を予測するための情報提供方法を提供する：
（ａ）正常ヒトおよび被検者サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを用いてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒト由来サンプルと細菌由来細胞外小胞の含有量の増減を比較する段階。
（ａ）正常ヒトおよび被検者サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを用いてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒト由来サンプルと細菌由来細胞外小胞の含有量の増減を比較する段階。
【0015】
本発明の一具現例において、前記段階（ｃ）で、放線菌門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、藍色細菌門（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、サッカリバクテリア（Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ）、およびテネリクテス門（Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞の含有量の増減を比較できる。
【0016】
本発明の他の具現例において、前記段階（ｃ）で、クロストリジウム綱（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、バシラス綱（Ｂａｃｉｌｌｉ）、エリュシペロトリクス綱（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉａ）、ガンマプロテオバクテリア綱（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アルファプロテオバクテリア綱（Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ネガティウィクテス綱（Ｎｅｇａｔｉｖｉｃｕｔｅｓ）、サッカリバクテリア綱（Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ（ｐ））、クロロプラスト綱（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）、放線菌綱（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびモリクテス綱（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞の含有量の増減を比較できる。
【0017】
本発明のさらに他の具現例において、前記段階（ｃ）で、クロストリジウム目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）、ビフィドバクテリウム目（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、エリュシペロトリクス目（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ）、ラクトバシラス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）、ミクロコッカス目（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スフィンゴモナス目（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）、セレノモナス目（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）、クロロプラスト目（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ（ｃ））、サッカリバクテリア目（Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ（ｐ））、ツリシバクテラレス目（Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）およびキサントモナス目（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞の含有量の増減を比較できる。
【0018】
本発明のさらに他の具現例において、前記段階（ｃ）で、ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ペプトストレプトコッカス科（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、エリュシペロトリクス科（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、レンサ球菌科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ビフィドバクテリウム科（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、スフィンゴモナス科（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、ポルフィロモナス科（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、バクテロイデス科（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）、バクテロイダレスＳ２４－７（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ Ｓ２４－７）、クロロプラスト科（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ（ｃ））、プレボテラ科（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）、サッカリバクテリア科（Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ（ｐ））、イントラスポランギウム科（Ｉｎｔｒａｓｐｏｒａｎｇｉａｃｅａｅ）、ラクトバシラス科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、モギバクテリア科（Ｍｏｇｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ツリシバクター科（Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ノカルディア科（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、キサントモナス科（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、ウィクセラセエ（Ｗｅｅｋｓｅｌｌａｃｅａｅ）、およびベイヨネラ科（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）からなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞の含有量の増減を比較できる。
【0019】
本発明のさらに他の具現例において、前記段階（ｃ）で、ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）ＵＣＧ－０１４、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）ＮＫ４Ａ１３６、ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）ＵＣＧ－０１３、ルミニクロストリジウム（Ｒｕｍｉｎｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）６、ペプトクロストリジウム（Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ユウバクテリウム・コプロスタノリゲネス（［Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ］ ｃｏｐｒｏｓｔａｎｏｌｉｇｅｎｅｓ）、大腸菌－赤痢菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ－Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、エリシペラトクロストリジウム（Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、バクテロイダレス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ）Ｓ２４－７、クロロプラスト属（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ（ｃ））、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）９、カンジタダスサカリモナス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓａｃｃｈａｒｉｍｏｎａｓ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ツリシバクター（Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ）、テピディモナス（Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、およびクロアシバクテリウム（Ｃｌｏａｃｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含有量の増減を比較できる。
【0020】
本発明のさらに他の具現例において、前記段階（ｃ）で、放線菌門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、藍色細菌門（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、サッカリバクテリア（Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ）、およびテネリクテス門（Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
クロストリジウム綱（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、バシラス綱（Ｂａｃｉｌｌｉ）、エリュシペロトリクス綱（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉａ）、ガンマプロテオバクテリア綱（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アルファプロテオバクテリア綱（Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ネガティウィクテス綱（Ｎｅｇａｔｉｖｉｃｕｔｅｓ）、サッカリバクテリア綱（Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ（ｐ））、クロロプラスト綱（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）、放線菌綱（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびモリクテス綱（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
クロストリジウム目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）、ビフィドバクテリウム目（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、エリュシペロトリクス目（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ）、ラクトバシラス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）、ミクロコッカス目（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スフィンゴモナス目（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）、セレノモナス目（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）、クロロプラスト目（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ（ｃ））、サッカリバクテリア目（Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ（ｐ））、ツリシバクテラレス目（Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）およびキサントモナス目（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ペプトストレプトコッカス科（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、エリュシペロトリクス科（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、レンサ球菌科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ビフィドバクテリウム科（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、スフィンゴモナス科（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、ポルフィロモナス科（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、バクテロイデス科（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）、バクテロイダレスＳ２４－７（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ Ｓ２４－７）、クロロプラスト科（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ（ｃ））、プレボテラ科（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）、サッカリバクテリア科（Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ（ｐ））、イントラスポランギウム科（Ｉｎｔｒａｓｐｏｒａｎｇｉａｃｅａｅ）、ラクトバシラス科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、モギバクテリア科（Ｍｏｇｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ツリシバクター科（Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ノカルディア科（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、キサントモナス科（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、ウィクセラセエ（Ｗｅｅｋｓｅｌｌａｃｅａｅ）、およびベイヨネラ科（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）からなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または、
ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）ＵＣＧ－０１４、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）ＮＫ４Ａ１３６、ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）ＵＣＧ－０１３、ルミニクロストリジウム（Ｒｕｍｉｎｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）６、ペプトクロストリジウム（Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ユウバクテリウム・コプロスタノリゲネス（［Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ］ ｃｏｐｒｏｓｔａｎｏｌｉｇｅｎｅｓ）、大腸菌－赤痢菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ－Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、エリシペラトクロストリジウム（Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、バクテロイダレス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ）Ｓ２４－７、クロロプラスト属（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ（ｃ））、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）９、カンジタダスサカリモナス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓａｃｃｈａｒｉｍｏｎａｓ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ツリシバクター（Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ）、テピディモナス（Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、およびクロアシバクテリウム（Ｃｌｏａｃｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含有量の増減を比較できる。
クロストリジウム綱（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、バシラス綱（Ｂａｃｉｌｌｉ）、エリュシペロトリクス綱（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉａ）、ガンマプロテオバクテリア綱（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アルファプロテオバクテリア綱（Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ネガティウィクテス綱（Ｎｅｇａｔｉｖｉｃｕｔｅｓ）、サッカリバクテリア綱（Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ（ｐ））、クロロプラスト綱（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）、放線菌綱（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびモリクテス綱（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
クロストリジウム目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）、ビフィドバクテリウム目（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、エリュシペロトリクス目（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ）、ラクトバシラス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）、ミクロコッカス目（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スフィンゴモナス目（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）、セレノモナス目（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）、クロロプラスト目（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ（ｃ））、サッカリバクテリア目（Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ（ｐ））、ツリシバクテラレス目（Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）およびキサントモナス目（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ペプトストレプトコッカス科（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、エリュシペロトリクス科（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、レンサ球菌科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ビフィドバクテリウム科（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、スフィンゴモナス科（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、ポルフィロモナス科（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、バクテロイデス科（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）、バクテロイダレスＳ２４－７（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ Ｓ２４－７）、クロロプラスト科（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ（ｃ））、プレボテラ科（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）、サッカリバクテリア科（Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ（ｐ））、イントラスポランギウム科（Ｉｎｔｒａｓｐｏｒａｎｇｉａｃｅａｅ）、ラクトバシラス科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、モギバクテリア科（Ｍｏｇｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ツリシバクター科（Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ノカルディア科（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、キサントモナス科（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、ウィクセラセエ（Ｗｅｅｋｓｅｌｌａｃｅａｅ）、およびベイヨネラ科（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）からなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または、
ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）ＵＣＧ－０１４、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）ＮＫ４Ａ１３６、ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）ＵＣＧ－０１３、ルミニクロストリジウム（Ｒｕｍｉｎｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）６、ペプトクロストリジウム（Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ユウバクテリウム・コプロスタノリゲネス（［Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ］ ｃｏｐｒｏｓｔａｎｏｌｉｇｅｎｅｓ）、大腸菌－赤痢菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ－Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、エリシペラトクロストリジウム（Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、バクテロイダレス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ）Ｓ２４－７、クロロプラスト属（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ（ｃ））、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）９、カンジタダスサカリモナス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓａｃｃｈａｒｉｍｏｎａｓ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ツリシバクター（Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ）、テピディモナス（Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、およびクロアシバクテリウム（Ｃｌｏａｃｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含有量の増減を比較できる。
【0021】
本発明のさらに他の具現例において、前記段階（ｃ）で、正常ヒト由来サンプルと比較して、
テネリクテス門（Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ）の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
モリクテス綱（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
ツリシバクテラレス目（Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
ラクトバシラス科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、モギバクテリア科（Ｍｏｇｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ツリシバクター科（Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ノカルディア科（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、およびウィクセラセエ（Ｗｅｅｋｓｅｌｌａｃｅａｅ）からなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または、
ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ツリシバクター（Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ）、テピディモナス（Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、およびクロアシバクテリウム（Ｃｌｏａｃｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含有量が増加している場合、脳腫瘍と診断できる。
テネリクテス門（Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ）の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
モリクテス綱（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
ツリシバクテラレス目（Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
ラクトバシラス科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、モギバクテリア科（Ｍｏｇｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ツリシバクター科（Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ノカルディア科（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、およびウィクセラセエ（Ｗｅｅｋｓｅｌｌａｃｅａｅ）からなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または、
ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ツリシバクター（Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ）、テピディモナス（Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、およびクロアシバクテリウム（Ｃｌｏａｃｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含有量が増加している場合、脳腫瘍と診断できる。
【0022】
本発明のさらに他の具現例において、前記段階（ｃ）で、正常ヒト由来サンプルと比較して、
放線菌門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
放線菌綱（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
キサントモナス目（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
イントラスポランギウム科（Ｉｎｔｒａｓｐｏｒａｎｇｉａｃｅａｅ）、キサントモナス科（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、およびベイヨネラ科（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）からなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または、
ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）およびスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）からなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含有量が減少している場合、脳腫瘍と診断できる。
放線菌門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
放線菌綱（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
キサントモナス目（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
イントラスポランギウム科（Ｉｎｔｒａｓｐｏｒａｎｇｉａｃｅａｅ）、キサントモナス科（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、およびベイヨネラ科（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）からなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または、
ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）およびスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）からなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含有量が減少している場合、脳腫瘍と診断できる。
【0023】
本発明のさらに他の具現例において、前記段階（ｃ）で、正常ヒト由来サンプルと比較して、
フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）由来細胞外小胞、
クロストリジウム綱（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、バシラス綱（Ｂａｃｉｌｌｉ）、およびエリュシペロトリクス綱（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉａ）からなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
クロストリジウム目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）、ビフィドバクテリウム目（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、およびエリュシペロトリクス目（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ラクトバシラス科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、ペプトストレプトコッカス科（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、およびエリュシペロトリクス科（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）からなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または、
ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）ＵＣＧ－０１４、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）ＮＫ４Ａ１３６、ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）ＵＣＧ－０１３、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ルミニクロストリジウム（Ｒｕｍｉｎｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）６、ペプトクロストリジウム（Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）からなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含有量が増加している場合、脳腫瘍と診断できる。
フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）由来細胞外小胞、
クロストリジウム綱（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、バシラス綱（Ｂａｃｉｌｌｉ）、およびエリュシペロトリクス綱（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉａ）からなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
クロストリジウム目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）、ビフィドバクテリウム目（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、およびエリュシペロトリクス目（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ラクトバシラス科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、ペプトストレプトコッカス科（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、およびエリュシペロトリクス科（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）からなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または、
ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）ＵＣＧ－０１４、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）ＮＫ４Ａ１３６、ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）ＵＣＧ－０１３、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ルミニクロストリジウム（Ｒｕｍｉｎｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）６、ペプトクロストリジウム（Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）からなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含有量が増加している場合、脳腫瘍と診断できる。
【0024】
本発明のさらに他の具現例において、前記段階（ｃ）で、正常ヒト由来サンプルと比較して、
放線菌門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびプロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）からなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
ガンマプロテオバクテリア綱（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、放線菌綱（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アルファプロテオバクテリア綱（Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、およびネガティウィクテス綱（Ｎｅｇａｔｉｖｉｃｕｔｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
ラクトバシラス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）、ミクロコッカス目（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スフィンゴモナス目（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）、およびセレノモナス目（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、レンサ球菌科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ビフィドバクテリウム科（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、スフィンゴモナス科（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、およびポルフィロモナス科（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）からなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または、
ユウバクテリウム・コプロスタノリゲネス（［Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ］ ｃｏｐｒｏｓｔａｎｏｌｉｇｅｎｅｓ）、大腸菌－赤痢菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ－Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）からなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含有量が減少している場合、脳腫瘍と診断できる。
放線菌門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびプロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）からなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
ガンマプロテオバクテリア綱（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、放線菌綱（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アルファプロテオバクテリア綱（Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、およびネガティウィクテス綱（Ｎｅｇａｔｉｖｉｃｕｔｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
ラクトバシラス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）、ミクロコッカス目（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スフィンゴモナス目（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）、およびセレノモナス目（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、レンサ球菌科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ビフィドバクテリウム科（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、スフィンゴモナス科（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、およびポルフィロモナス科（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）からなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または、
ユウバクテリウム・コプロスタノリゲネス（［Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ］ ｃｏｐｒｏｓｔａｎｏｌｉｇｅｎｅｓ）、大腸菌－赤痢菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ－Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）からなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含有量が減少している場合、脳腫瘍と診断できる。
【0025】
本発明のさらに他の具現例において、前記段階（ｃ）で、正常ヒト由来サンプルと比較して、
放線菌門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、およびバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
エリュシペロトリクス綱（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉａ）細菌由来細胞外小胞、
エリュシペロトリクス目（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ）細菌由来細胞外小胞、
エリュシペロトリクス科（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）およびバクテロイデス科（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）からなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または、
バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）およびエリシペラトクロストリジウム（Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）からなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含有量が増加している場合、脳腫瘍と診断できる。
放線菌門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、およびバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
エリュシペロトリクス綱（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉａ）細菌由来細胞外小胞、
エリュシペロトリクス目（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ）細菌由来細胞外小胞、
エリュシペロトリクス科（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）およびバクテロイデス科（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）からなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または、
バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）およびエリシペラトクロストリジウム（Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）からなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含有量が増加している場合、脳腫瘍と診断できる。
【0026】
本発明のさらに他の具現例において、前記段階（ｃ）で、正常ヒト由来サンプルと比較して、
藍色細菌門（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびサッカリバクテリア（Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ）からなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
クロストリジウム綱（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、サッカリバクテリア綱（Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ（ｐ））、およびクロロプラスト綱（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）からなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
クロストリジウム目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）、クロロプラスト目（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ（ｃ））、およびサッカリバクテリア目（Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ（ｐ））からなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、バクテロイダレスＳ２４－７（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ Ｓ２４－７）、クロロプラスト科（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ（ｃ））、プレボテラ科（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）、およびサッカリバクテリア科（Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ（ｐ））からなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または、
バクテロイダレス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ）Ｓ２４－７、クロロプラスト属（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ（ｃ））、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）ＮＫ４Ａ１３６、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）９、およびカンジタダスサカリモナス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓａｃｃｈａｒｉｍｏｎａｓ）からなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含有量が減少している場合、脳腫瘍と診断できる。
藍色細菌門（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびサッカリバクテリア（Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ）からなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
クロストリジウム綱（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、サッカリバクテリア綱（Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ（ｐ））、およびクロロプラスト綱（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）からなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
クロストリジウム目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）、クロロプラスト目（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ（ｃ））、およびサッカリバクテリア目（Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ（ｐ））からなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、バクテロイダレスＳ２４－７（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ Ｓ２４－７）、クロロプラスト科（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ（ｃ））、プレボテラ科（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）、およびサッカリバクテリア科（Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ（ｐ））からなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または、
バクテロイダレス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ）Ｓ２４－７、クロロプラスト属（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ（ｃ））、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）ＮＫ４Ａ１３６、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）９、およびカンジタダスサカリモナス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓａｃｃｈａｒｉｍｏｎａｓ）からなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含有量が減少している場合、脳腫瘍と診断できる。
【0027】
本発明のさらに他の具現例において、前記正常ヒトおよび被検者サンプルは、血液または組織でありうる。
【0028】
本発明のさらに他の具現例において、前記血液は、全血、血清、血漿、または血液単核球でありうる。
【0029】
本発明のさらに他の具現例において、前記組織は、脳組織でありうる。
【発明の効果】
【0030】
環境に存在する細菌から分泌される細胞外小胞は、体内に吸収されて炎症の発生に直接的な影響を及ぼすことができ、脳腫瘍は、症状が現れる前に早期診断が難しいため、効率的な治療が難しいというのが実情である。これより、本発明による人体由来サンプルを用いた細菌由来細胞外小胞のメタゲノム解析を通して脳腫瘍発病の危険度をあらかじめ診断することによって、脳腫瘍の危険群を早期に診断および予測可能であり、また、適切な管理により発病時期を遅らせたり発病を予防することができる。これに加えて、発病後にも早期診断できるので、脳腫瘍の発病率を低減し、治療効果を高めることができるだけでなく、脳腫瘍と診断を受けた患者においてメタゲノム解析を通して原因因子の露出を避けることによって、病気の経過を良くしたり、再発を防ぐことができるという長所がある。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1】図１ａおよび図１ｂは、属（ｇｅｎｕｓ）レベルでＢｒａｙ－Ｃｕｒｔｉｓ類似度を基礎としてＰＣｏＡを使って健康な対照群グループ（ＨＣ）および脳腫瘍患者（ＢＴ）において血清ＥＶマイクロバイオームの（ａ）アルファ多様性（Ｃｈａｏ１、ＳｈａｎｎｏｎおよびＳｉｍｐｓｏｎ指数）および（ｂ）ベータ多様性を示す図である。
【図2】図２ａ～図２ｄは、門（ｐｈｙｌｕｍ）および属（ｇｅｎｕｓ）レベルで血清において健康な対照群グループ（ＨＣ）および脳腫瘍患者（ＢＴ）間のマイクロバイオームの豊富度の差異を示す図である。（ａ）は、血清微生物ＥＶの門レベルにおける豊富度ヒートマップ、（ｂ）は、血清微生物ＥＶの属レベルにおける豊富度ヒートマップを示す図であり、（ｃ）は、ｔ－検定による主な微生物ＥＶを門レベルで示し、（ｄ）は、属レベルで示す図である。
【図5】図５ａおよび図５ｂは、属レベルで血清ＥＶマイクロバイオームに基づく脳腫瘍診断モデルを示す図である。（ａ）は、Ｍ１（赤色）、Ｍ２（青色）、Ｍ３（緑色）、Ｍ４（黄色）に対するＲＯＣ曲線を示す図であり、（ｂ）は、Ｍ５に対するＲＯＣ曲線を示す図である。
【図6】図６ａ～図６ｅは、門および属レベルで脳組織における健康な対照群グループ（ＨＣ）と脳腫瘍患者（ＢＴ）間のマイクロバイオームの豊富度の差異を示す図であり、（ａ）および（ｂ）は、それぞれ門および属レベルで脳組織の核心微生物ＥＶ分類群のヒートマップ、（ｃ）および（ｄ）は、それぞれ門および属レベルでｔ－検定による主な微生物ＥＶ、（ｅ）は、ＬＥｆＳｅ解析を通して決定された有意に異なる微生物ＥＶバイオマーカーを属レベルで示す図である。
【図8】図８ａ～図８ｄは、（ａ）門、（ｂ）綱、（ｃ）目、（ｄ）科レベルで血清および組織の健康な対照群グループ（ＨＣ）と脳腫瘍患者（ＢＴ）間のＦｏｌｄ－ｃｈａｎｇｅを示す図である。赤色は、血清内臨床グループ間に有意に異なる微生物ＥＶの属を示す図であり、緑色は、脳組織内臨床グループ間に有意に異なる微生物ＥＶの属を示す図であり、青色は、血清および組織サンプル皆で有意差を有する微生物ＥＶの属を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0032】
［発明を実施するための最良の形態］
本発明は、細菌メタゲノム解析を通して脳腫瘍を診断する方法に関し、本発明者らは、正常ヒトおよび被検者由来サンプルを用いて細菌由来細胞外小胞から遺伝子を抽出し、これに対してメタゲノム解析を行い、脳腫瘍の原因因子として作用できる細菌由来細胞外小胞を同定した。
本発明は、細菌メタゲノム解析を通して脳腫瘍を診断する方法に関し、本発明者らは、正常ヒトおよび被検者由来サンプルを用いて細菌由来細胞外小胞から遺伝子を抽出し、これに対してメタゲノム解析を行い、脳腫瘍の原因因子として作用できる細菌由来細胞外小胞を同定した。
【0033】
これより、本発明は、（ａ）正常ヒトおよび被検者サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを用いてＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒト由来サンプルと細菌由来細胞外小胞の含有量の増減を比較する段階を含む脳腫瘍を診断するための情報提供方法を提供する。
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを用いてＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒト由来サンプルと細菌由来細胞外小胞の含有量の増減を比較する段階を含む脳腫瘍を診断するための情報提供方法を提供する。
【0034】
本発明において使用される用語「脳腫瘍診断」とは、患者に対して脳腫瘍が発病する可能性があるか、脳腫瘍が発病する可能性が相対的に高いか、または脳腫瘍がすでに発病したか否かを判別することを意味する。本発明の方法は、任意の特定患者に対する脳腫瘍の発病危険度が高い患者にとって特別かつ適切な管理を通じて発病時期を遅らせたり発病しないようにするのに使用できる。また、本発明の方法は、脳腫瘍を早期に診断して、最も適切な治療方式を選択することによって、治療を決定するために臨床的に使用できる。
【0035】
本発明において使用される用語「メタゲノム（ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ）」とは、「群集遺伝体」とも言い、土、動物の腸など孤立した地域内のすべてのウイルス、細菌、カビなどを含む遺伝体の総和を意味するものであって、主に培養にならない微生物を分析するために、シーケンサーを使用して一度に多くの微生物を同定することを説明する遺伝体の概念に使用される。特に、メタゲノムは、一種のゲノムまたは遺伝体をいうものではなく、一つの環境単位のすべての種の遺伝体であって、一種の混合遺伝体をいう。これは、オミックス的に生物学が発展する過程で一種を定義するとき、機能的に既存の一種だけでなく、多様な種が互いに相互作用して完全な種を作るという観点から出た用語である。技術的には高速シーケンシング法を用いて、種に関係なく、すべてのＤＮＡ、ＲＮＡを分析して、一つの環境内でのすべての種を同定し、相互作用、代謝作用を解明する技法の対象である。本発明では、好ましくは血清から分離した細菌由来細胞外小胞を用いてメタゲノム解析を実施した。
【0036】
本発明において、前記正常ヒトおよび被検者サンプルは、血液であってもよく、前記血液は、全血、血清、血漿、または血液単核球であってもよいが、これらに制限されるものではない。
【0037】
本発明において、前記正常ヒトおよび被検者サンプルは、組織であってもよく、前記組織は、脳組織であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0038】
本発明の実施例では、前記細菌由来細胞外小胞に対するメタゲノム解析を実施し、門（ｐｈｙｌｕｍ）、綱（ｃｌａｓｓ）、目（ｏｒｄｅｒ）、科（ｆａｍｉｌｙ）、および属（ｇｅｎｕｓ）レベルでそれぞれ分析して、実際に脳腫瘍発生の原因として作用できる細菌由来小胞を同定した（本発明の表８参照）。
【0039】
より具体的に、本発明の一実施例では、被検者由来血清サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを解析した結果、
門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、
綱（ｃｌａｓｓ）レベルで、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｂａｃｉｌｌｉ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｎｅｇａｔｉｖｉｃｕｔｅｓ、
目（ｏｒｄｅｒ）レベルで、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、
科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、
属（ｇｅｎｕｓ）レベルで、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ ＵＣＧ－０１４、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ＮＫ４Ａ１３６、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ ＵＣＧ－０１３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｒｕｍｉｎｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ６、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、［Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ］ ｃｏｐｒｏｓｔａｎｏｌｉｇｅｎｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ－Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ
の細菌由来細胞外小胞の含有量が脳腫瘍患者と正常ヒトとの間に有意差があった（実施例３参照）。
門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、
綱（ｃｌａｓｓ）レベルで、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｂａｃｉｌｌｉ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｎｅｇａｔｉｖｉｃｕｔｅｓ、
目（ｏｒｄｅｒ）レベルで、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、
科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、
属（ｇｅｎｕｓ）レベルで、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ ＵＣＧ－０１４、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ＮＫ４Ａ１３６、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ ＵＣＧ－０１３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｒｕｍｉｎｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ６、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、［Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ］ ｃｏｐｒｏｓｔａｎｏｌｉｇｅｎｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ－Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ
の細菌由来細胞外小胞の含有量が脳腫瘍患者と正常ヒトとの間に有意差があった（実施例３参照）。
【0040】
より具体的に、本発明の一実施例では、被検者由来脳組織サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを解析した結果、
門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ、
綱（ｃｌａｓｓ）レベルで、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ（ｐ）、Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ、
目（ｏｒｄｅｒ）レベルで、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ（ｃ）、Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ（ｐ）、
科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ Ｓ２４－７群、Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ（ｃ）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ（ｐ）、
属（ｇｅｎｕｓ）レベルで、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ Ｓ２４－７群、Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ（ｃ）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ＮＫ４Ａ１３６群、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ９、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓａｃｃｈａｒｉｍｏｎａｓ
の細菌由来細胞外小胞の含有量が脳腫瘍患者と正常ヒトとの間に有意差があった（実施例５参照）。
門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ、
綱（ｃｌａｓｓ）レベルで、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ（ｐ）、Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ、
目（ｏｒｄｅｒ）レベルで、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ（ｃ）、Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ（ｐ）、
科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ Ｓ２４－７群、Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ（ｃ）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ（ｐ）、
属（ｇｅｎｕｓ）レベルで、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ Ｓ２４－７群、Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ（ｃ）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ＮＫ４Ａ１３６群、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ９、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓａｃｃｈａｒｉｍｏｎａｓ
の細菌由来細胞外小胞の含有量が脳腫瘍患者と正常ヒトとの間に有意差があった（実施例５参照）。
【0041】
より具体的に、本発明の一実施例では、被検者由来血液サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで解析した結果、ＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａおよびＴｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞の含有量が脳腫瘍患者と正常ヒトとの間に有意差があった（実施例６参照）。
【0042】
より具体的に、本発明の一実施例では、血液サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを綱（ｃｌａｓｓ）レベルで解析した結果、ＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａおよびＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓ綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞の含有量が脳腫瘍患者と正常ヒトとの間に有意差があった（実施例６参照）。
【0043】
より具体的に、本発明の一実施例では、被検者由来血液サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを目（ｏｒｄｅｒ）レベルで解析した結果、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、およびＲＦ３９目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞の含有量が脳腫瘍患者と正常ヒトとの間に有意差があった（実施例６参照）。
【0044】
より具体的に、本発明の一実施例では、被検者由来血液サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで解析した結果、Ｉｎｔｒａｓｐｏｒａｎｇｉａｃｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｍｏｇｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｗｅｅｋｓｅｌｌａｃｅａｅ、およびＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞の含有量が脳腫瘍患者と正常ヒトとの間に有意差があった（実施例６参照）。
【0045】
より具体的に、本発明の一実施例では、被検者由来血液サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを属（ｇｅｎｕｓ）レベルで解析した結果、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ、Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、およびＣｌｏａｃｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含有量が脳腫瘍患者と正常ヒトとの間に有意差があった（実施例６参照）。
【0046】
前記実施例の結果を通じて、前記同定された細菌由来細胞外小胞の分布変数が脳腫瘍発生の予測に有用に用いられることを確認した。
【0047】
［発明を実施するための形態］
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例】
【0048】
［実験例１．被験者およびサンプル収集］
ソウル大学校病院と仁済大学校海雲台白病院から合計１８２人の脳腫瘍（ＢＴ，Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒ）患者と１２５人の健康な対照群（ＨＣ，Ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌ）被験者の血清サンプルをそれぞれ収集した。また、ソウル大学校病院から収集した５人のＢＴ患者と５人のＨＣ被験者から組織サンプルを評価した。各ＢＴ臨床対象は、治療のために病院を訪問するようにする症状を示した。健康管理対象は、一般的な健康診断を通じて選別された。本発明の実験例は、ソウル大学校病院の臨床試験審査委員会（ＩＲＢ番号Ｈ－１００９－０２５－３３１）と仁済大学校海雲台白病院（ＩＲＢ番号１２９７９９２－２０１５－０６４）により承認された。本発明のすべての方法は、承認された指針に従い行われ、すべての臨床対象から事前同意を得た。
ソウル大学校病院と仁済大学校海雲台白病院から合計１８２人の脳腫瘍（ＢＴ，Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒ）患者と１２５人の健康な対照群（ＨＣ，Ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌ）被験者の血清サンプルをそれぞれ収集した。また、ソウル大学校病院から収集した５人のＢＴ患者と５人のＨＣ被験者から組織サンプルを評価した。各ＢＴ臨床対象は、治療のために病院を訪問するようにする症状を示した。健康管理対象は、一般的な健康診断を通じて選別された。本発明の実験例は、ソウル大学校病院の臨床試験審査委員会（ＩＲＢ番号Ｈ－１００９－０２５－３３１）と仁済大学校海雲台白病院（ＩＲＢ番号１２９７９９２－２０１５－０６４）により承認された。本発明のすべての方法は、承認された指針に従い行われ、すべての臨床対象から事前同意を得た。
【0049】
収集されたすべてのヒト血清サンプルを血清分離用チューブ（ＳＳＴ）に移した後、４℃で１５分間３，０００ｒｐｍで遠心分離した。すべての脳組織サンプルは、液体窒素で凍結させ、分析のために－８０℃に保管した。
【0050】
［実験例２．ｉｎ ｖｉｖｏマウス研究モデル］
使用されたすべてのマウスは、６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスであった（Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ Ｉｎｃ、城南、韓国）。マウスは、ｉｎ ｖｉｖｏ研究過程の全般にわたって１２時間の昼夜周期で２２±２℃および５０±５％湿度の標準実験室の条件で収容し、維持した。
使用されたすべてのマウスは、６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスであった（Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ Ｉｎｃ、城南、韓国）。マウスは、ｉｎ ｖｉｖｏ研究過程の全般にわたって１２時間の昼夜周期で２２±２℃および５０±５％湿度の標準実験室の条件で収容し、維持した。
【0051】
［実験例３．ＥＶ ＤＮＡ抽出およびシーケンシング］
血清および組織サンプルからＥＶを抽出するために、１０ｍｌチューブに血液を入れ、遠心分離（３，５００ｘｇ、１０ｍｉｎ、４℃）を実施して浮遊物を沈めて上澄み液のみを回収した後、新しい１０ｍｌチューブに移した。０．２２μｍフィルターを使って前記回収した上澄み液から細菌および異物を除去した後、セントリプレップチューブ（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒｓ ５０ｋＤ）に移し、１５００ｘｇ、４℃で１５分間遠心分離して、５０ｋＤより小さい物質は捨て、１０ｍｌまで濃縮させた。再び０．２２μｍフィルターを使ってバクテリアおよび異物を除去した後、Ｔｙｐｅ ９０ｔｉローターで１５０，０００ｘｇ、４℃で３時間超高速遠心分離方法を使って上澄み液を捨て、固まったペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を生理食塩水（ＰＢＳ）で溶かして小胞を得た。
血清および組織サンプルからＥＶを抽出するために、１０ｍｌチューブに血液を入れ、遠心分離（３，５００ｘｇ、１０ｍｉｎ、４℃）を実施して浮遊物を沈めて上澄み液のみを回収した後、新しい１０ｍｌチューブに移した。０．２２μｍフィルターを使って前記回収した上澄み液から細菌および異物を除去した後、セントリプレップチューブ（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒｓ ５０ｋＤ）に移し、１５００ｘｇ、４℃で１５分間遠心分離して、５０ｋＤより小さい物質は捨て、１０ｍｌまで濃縮させた。再び０．２２μｍフィルターを使ってバクテリアおよび異物を除去した後、Ｔｙｐｅ ９０ｔｉローターで１５０，０００ｘｇ、４℃で３時間超高速遠心分離方法を使って上澄み液を捨て、固まったペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を生理食塩水（ＰＢＳ）で溶かして小胞を得た。
【0052】
前記方法により血液から分離した小胞１００μｌを１００℃でボイルして、内部のＤＮＡを脂質外に出るようにした後、氷に５分間冷ました。次に、残った浮遊物を除去するために、１０，０００ｘｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上澄み液のみを集めた後、Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＤＮＡ量を定量した。以後、前記抽出されたＤＮＡに細菌由来ＤＮＡが存在するかを確認するために、下記表１に示した１６ｓ ｒＤＮＡプライマーでＰＣＲを行うことによって、前記抽出された遺伝子に細菌由来遺伝子が存在することを確認した。
【0053】
【表1】
【0054】
［実験例４．微生物ＥＶ組成物のメタゲノム解析］
前記実験例３の方法で遺伝子を抽出した後、前記表１に示した１６Ｓ ｒＤＮＡプライマーを使ってＰＣＲを実施して遺伝子を増幅させ、シーケンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を行った。分類（Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）は、プロファイリングプログラムＭＤｘ－Ｐｒｏ ｖｅｒ．２（ＭＤ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｋｏｒｅａ）で行った。ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄリードをバーコードによってフィルタリングし、プライマー配列をＣｕｔａｄａｐｔ（バージョン１．１．６）を使ってトリミングした後、ＣＡＳＰＥＲと併合した。高品質シーケンシングリードを収得するために、３５０ｂｐ未満または５５０ｂｐ超過のリード、および２０未満のＰｈｒｅｄ品質スコアを有する配列を除外した。ＶＳＥＡＲＣＨ ｄｅ ｎｏｖｏクラスタリング方法を使って９７％類似度臨界値を基準として、ＯＴＵ（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ Ｕｎｉｔ）を属レベルに分類した。一つのサンプルにのみ１個の配列を含むＯＴＵは、追加分析から除外された。引き続いて、基本パラメーターの下でＳｉｌｖａ １３２ ｄａｔａｂａｓｅに対してＵＣＬＵＳＴおよびＱＩＩＭＥ １．９．１を使って分類レベル指定を種レベルで行った。データベースの分類学的情報が十分でないため、属レベルで群集を割り当てることができない場合、分類群が次に高いレベルに指定した。分類名の周囲の括弧は、主にゲノムデータベース内の全体ゲノム系統の発生に基づいて確認されなかった、提案された分類（ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）を示す。
前記実験例３の方法で遺伝子を抽出した後、前記表１に示した１６Ｓ ｒＤＮＡプライマーを使ってＰＣＲを実施して遺伝子を増幅させ、シーケンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を行った。分類（Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）は、プロファイリングプログラムＭＤｘ－Ｐｒｏ ｖｅｒ．２（ＭＤ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｋｏｒｅａ）で行った。ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄリードをバーコードによってフィルタリングし、プライマー配列をＣｕｔａｄａｐｔ（バージョン１．１．６）を使ってトリミングした後、ＣＡＳＰＥＲと併合した。高品質シーケンシングリードを収得するために、３５０ｂｐ未満または５５０ｂｐ超過のリード、および２０未満のＰｈｒｅｄ品質スコアを有する配列を除外した。ＶＳＥＡＲＣＨ ｄｅ ｎｏｖｏクラスタリング方法を使って９７％類似度臨界値を基準として、ＯＴＵ（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ Ｕｎｉｔ）を属レベルに分類した。一つのサンプルにのみ１個の配列を含むＯＴＵは、追加分析から除外された。引き続いて、基本パラメーターの下でＳｉｌｖａ １３２ ｄａｔａｂａｓｅに対してＵＣＬＵＳＴおよびＱＩＩＭＥ １．９．１を使って分類レベル指定を種レベルで行った。データベースの分類学的情報が十分でないため、属レベルで群集を割り当てることができない場合、分類群が次に高いレベルに指定した。分類名の周囲の括弧は、主にゲノムデータベース内の全体ゲノム系統の発生に基づいて確認されなかった、提案された分類（ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）を示す。
【0055】
［実験例５．予測診断モデルの確立］
脳腫瘍（ＢＴ，Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒ）予測診断モデルの開発のために、属レベルでＯＴＵの相対存在量をモデル変数と見なした。
脳腫瘍（ＢＴ，Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒ）予測診断モデルの開発のために、属レベルでＯＴＵの相対存在量をモデル変数と見なした。
【0056】
まず、ｐ値が０．０１未満であり、倍数変化が２倍より大きく、平均相対存在量が０．１％より大きい候補菌株を選定した。モデル変数として選定された菌株をＡＵＣ（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ）、感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）、特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）および正確度（ａｃｃｕｒａｃｙ）が最も高いモデルを決定するために比較した。
【0057】
第一の方法（Ｍ１）は、ＡＩＣ（Ａｋａｉｋｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）が変数の異なる予測診断モデルを比較するのに使用される段階的選択（ｓｔｅｐｗｉｓｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を使用した。第二の方法（Ｍ２）は、段階的選択方法論の他に共変量で年齢と性別を統合した。第三の選択方法（Ｍ３）は、菌株マーカーの発見のために線形判別分析（ＬＤＡ）およびＬＤＡ Ｅｆｆｅｃｔ Ｓｉｚｅ（ＬＥｆＳｅ）アルゴリズムを使用した。第四の方法（Ｍ４）は、ＬＥｆＳｅを使って選択した菌株マーカーを統合すること以外にも、共変量で年齢と性別を含む。また、第五の方法（Ｍ５）は、勾配ブースティングマシン（ＧＢＭ，Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｂｏｏｓｔｉｎｇ ｍａｃｈｉｎｅ）アンサンブル方法に基づくマシンランニングアルゴリズムにより計算された。
【0058】
ＧＢＭは、Ｐｙｔｈｏｎ（バージョン３．６．９）でｓｃｉｋｉｔ－ｌｅａｒｎのＧｒａｄｉｅｎｔ Ｂｏｏｓｔｉｎｇ Ｒｅｇｒｅｓｓｏｒ（バージョン０．２１．３）を使ってモデリングに統合した。変数の選択後、予測診断モデルは、モデル検証のために８０：２０の割合で設定されたトレーニングおよびテストセットとともにロジスティック回帰を使って計算された。
【0059】
［実験例６．統計分析］
ＢＴと対照群間の有意な年齢の差異は、それぞれ、スチューデントｔ－検定およびＷｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定を通じて決定された。コホートの性別に基づくグループ間の統計的差異を決定するために、カイ二乗検定（Ｃｈｉ－ｓｑｕａｒｅ ｔｅｓｔ）を行った。主座標分析（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ；ＰＣｏＡ）は、Ｂｒａｙ－Ｃｕｒｔｉｓの非類似度距離によるグループの個別分類レベル群集を決定するために行われた。ＨＣグループとＢＴグループ間のマイクロバイオーム組成の差異を分析するために、スチューデントｔ－検定を行った。ＬＥｆＳｅは、統計的および生物学的重要性を有するバイオマーカーの選択のために、臨床グループの間に有意であり、かつ差別化された豊富な属を決定するのに使用された。ＬＥｆＳｅアルゴリズムは、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定およびＬＤＡ（Ｌｉｎｅａｒ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を使ってカットオフＬＤＡスコア（ｌｏｇ１０）を２に設定した。ｐ値が０．０５未満（ｐ＜０．０５）であるとき、有意なものと見なし、すべての分析は、Ｒバージョン３．６．１を使って行った。
ＢＴと対照群間の有意な年齢の差異は、それぞれ、スチューデントｔ－検定およびＷｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定を通じて決定された。コホートの性別に基づくグループ間の統計的差異を決定するために、カイ二乗検定（Ｃｈｉ－ｓｑｕａｒｅ ｔｅｓｔ）を行った。主座標分析（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ；ＰＣｏＡ）は、Ｂｒａｙ－Ｃｕｒｔｉｓの非類似度距離によるグループの個別分類レベル群集を決定するために行われた。ＨＣグループとＢＴグループ間のマイクロバイオーム組成の差異を分析するために、スチューデントｔ－検定を行った。ＬＥｆＳｅは、統計的および生物学的重要性を有するバイオマーカーの選択のために、臨床グループの間に有意であり、かつ差別化された豊富な属を決定するのに使用された。ＬＥｆＳｅアルゴリズムは、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定およびＬＤＡ（Ｌｉｎｅａｒ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を使ってカットオフＬＤＡスコア（ｌｏｇ１０）を２に設定した。ｐ値が０．０５未満（ｐ＜０．０５）であるとき、有意なものと見なし、すべての分析は、Ｒバージョン３．６．１を使って行った。
【0060】
［実施例１．臨床的特性］
ＨＣ（Ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌ）およびＢＴ（Ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒ）対象体グループの臨床的特性の評価によって、２つのグループ間に有意差があるものと決定された（ｐ＜０．００１）。ＨＣ被験者は、４０歳から７８歳の間であり、平均年齢は、５９．７（ＳＤ １０．５）であり、ＢＴ被験者は、１６歳から８１歳の間であり、平均年齢が５１．５（ＳＤ １４．２）であった（表２）。
ＨＣ（Ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌ）およびＢＴ（Ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒ）対象体グループの臨床的特性の評価によって、２つのグループ間に有意差があるものと決定された（ｐ＜０．００１）。ＨＣ被験者は、４０歳から７８歳の間であり、平均年齢は、５９．７（ＳＤ １０．５）であり、ＢＴ被験者は、１６歳から８１歳の間であり、平均年齢が５１．５（ＳＤ １４．２）であった（表２）。
【0061】
【表2】
【0062】
［実施例２．多様性］
ＢＴ群では、種の豊富度のＣｈａｏ１指数と細菌群集多様性のシャノン指数が有意に高かったが、ＢＴ群と対照群間のシンプソン指数の差異は有意でなかった（図１ａ）。
ＢＴ群では、種の豊富度のＣｈａｏ１指数と細菌群集多様性のシャノン指数が有意に高かったが、ＢＴ群と対照群間のシンプソン指数の差異は有意でなかった（図１ａ）。
【0063】
ＰＣｏＡを行い、すべてのサンプルをＨＣとＢＴグループ間の類似度を評価するために、サンプル間において最も類似していない２つの主要座標（ＰＣｏ，ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）に沿ってプロットした。すべての分類群レベルで、２つの群間において有意な群集が観察された（ｐ＜０．００１）（図１ｂ）。
【0064】
［実施例３．血清内微生物ＥＶ豊富およびバイオマーカーの確認］
門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルでＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ豊富度は、患者群より対照群において顕著に低かった反面、ＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａとＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａはさらに高かった（図２ａおよび図２ｃ）。門レベルのバイオマーカーのＬＥｆＳｅ解析は、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、ＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａおよびＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓをｌｏｇ（ＬＤＡ ｓｃｏｒｅ）値が４より大きい唯一の門として導き出した（図３ａ）。
門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルでＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ豊富度は、患者群より対照群において顕著に低かった反面、ＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａとＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａはさらに高かった（図２ａおよび図２ｃ）。門レベルのバイオマーカーのＬＥｆＳｅ解析は、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、ＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａおよびＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓをｌｏｇ（ＬＤＡ ｓｃｏｒｅ）値が４より大きい唯一の門として導き出した（図３ａ）。
【0065】
綱（ｃｌａｓｓ）レベルでＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｂａｃｉｌｌｉ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、ＡｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａおよびＮｅｇａｔｉｖｉｃｕｔｅｓが大きく変化した。８個の綱レベルのバイオマーカーは、４．０のｌｏｇ（ＬＤＡスコア）を算出するＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａを用いて決定され、これらは、対照群において生物学的に有意に高い豊富度を示した（図４ａ）。
【0066】
目（ｏｒｄｅｒ）レベルでＣｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ、ＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓおよびＳｅｌｅｎｏｍｏｎａｄａｌｅｓは、対照群と患者グループの間において大きく変化した。目レベルでＬＥｆＳｅ評価結果、対照群と患者グループの間に１３個の分類群が有意に異なることが示され、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓがｌｏｇ（ＬＤＡスコア）値３．９であって、最も大きく違いが生じることが示された（図４ｂ）。
【0067】
科（ｆａｍｉｌｙ）レベルでＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、ＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅおよびＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅが大きく変化した。科レベルでＬＥｆＳｅ評価結果、合計２１個の分類群が有意に異なることが示され、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅがｌｏｇ（ＬＤＡスコア）値が４．０より大きく示された（図４ｃ）。
【0068】
最後に、属（ｇｅｎｕｓ）レベルでの解析結果、対照群とＢＴグループの間において多数の有意差を示す分類群が決定された（図２ｂ）。Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ ＵＣＧ－０１４、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ＮＫ４Ａ１３６、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ ＵＣＧ－０１３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｒｕｍｉｎｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ６およびＰｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍは、ＢＴグループにおいて対照群と比較して有意に高い反面、［Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ］ ｃｏｐｒｏｓｔａｎｏｌｉｇｅｎｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ－Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、およびＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓは、有意にさらに低いレベルで示された（図２ｄ）。
【0069】
属レベルの血清ＥＶマイクロバイオーム組成物のＬＥｆＳｅ解析は、合計３０個の属を算出し、特にＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ ＵＣＧ－０１４は、４．０を超過することが示された（図３ｂ）。合計４、９、１２、１８および２９ ｔａｘａは、すべてのグループにおいて０．５％より高い比率を示し、門、綱、目、科、属でｔ－検定を使って対照群と患者群の間に有意差を示した（ｐ＜０．０５）。
【0070】
［実施例４．血清微生物ＥＶメタゲノム基盤脳腫瘍（ＢＴ）診断モデルの開発］
対照群およびＢＴグループの血清微生物ＥＶメタゲノムプロファイルを使って、健康な対象体において脳腫瘍の危険を決定するための診断モデルを開発した。
対照群およびＢＴグループの血清微生物ＥＶメタゲノムプロファイルを使って、健康な対象体において脳腫瘍の危険を決定するための診断モデルを開発した。
【0071】
段階的選択およびロジスティック回帰分析に引き続いて、Ｍ１およびＭ２モデルは、１２個の重要な微生物ＥＶ属として、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、Ｋｎｏｅｌｌｉａ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｒｕｍｉｎｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを算出した。
【0072】
一方、Ｍ３およびＭ４に対するＬＥｆＳｅ解析により決定されたバイオマーカーを用いたロジスティック回帰分析は、２９個の異なる重要な微生物ＥＶ属として、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ ＵＣＧ－０１４、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ＮＫ４Ａ１３６、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ（ｆ）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ ＵＣＧ－０１３、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ １、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｕｍｉｎｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ６、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ ｖａｄｉｎＢＢ６０（ｆ）、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ（ｆ）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ２、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ（ｆ）、Ｄｉａｐｈｏｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ １、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｋｎｏｅｌｌｉａ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、およびＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａを算出した。
【0073】
Ｍ５の場合、分析された総微生物ＥＶメタゲノム情報の相対豊富度を特定バイオマーカーよりは分析のための特徴として入力された。
【0074】
テストセットを使用したモデル性能は、最適なＢＴ診断モデルを決定するために、各方法のＡＵＣ、感度、特異度および正確度をベースに評価した。その結果、ＢＴ診断モデルは、いずれも、０．９３より高いＡＵＣを示した（図５ａ）。
【0075】
ＧＢＭ方法に基づくモデルは、それぞれ、１．０００、０．９３６および０．９９３の値であって、最も高い感度、特異度およびＡＵＣを示した（図５ｂ）。
【0076】
［実施例５．脳組織微生物ＥＶメタゲノム基盤脳腫瘍（ＢＴ）診断モデルの開発］
門レベルでＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、ＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａおよびＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａは、すべてのグループにおいて最も豊富な門であり、患者および対照群において組織ＥＶ分類群の８０％以上を占めた。ＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａおよびＳａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａは、対照群が患者群より有意に高かった（図６ａ、図６ｃ）。
門レベルでＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、ＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａおよびＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａは、すべてのグループにおいて最も豊富な門であり、患者および対照群において組織ＥＶ分類群の８０％以上を占めた。ＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａおよびＳａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａは、対照群が患者群より有意に高かった（図６ａ、図６ｃ）。
【0077】
綱（ｃｌａｓｓ）レベルでＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉａは、対照群が患者群より有意に低かった。反面、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ（ｐ）およびＣｈｌｏｒｏｐｌａｓｔは、対照群が有意に高かった（図７ａ）。
【0078】
目（ｏｒｄｅｒ）レベルでＣｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ（ｃ）およびＳａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ（ｐ）は、対照群が顕著に豊富な反面、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓは、有意に低いことが分かった（図７ｂ）。
【0079】
科（ｆａｍｉｌｙ）レベルでＢａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ Ｓ２４－７群、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ、Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ（ｃ）、ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅおよびＳａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ（ｐ）が臨床グループ間に大きく変化し、ＬＥｆＳｅを通じて発見されたバイオマーカーには、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ Ｓ２４－７グループ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、ＢａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅおよびＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅが含まれた（図７ｃ）。
【0080】
属（ｇｅｎｕｓ）レベルでＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓとＥｒｙｓｉｐｅｌａｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍは、ＢＴ群に比べて対照群が有意に低い反面、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ Ｓ２４－７群、Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ（ｃ）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ＮＫ４Ａ１３６群、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ９、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓａｃｃｈａｒｉｍｏｎａｓは、有意に高かった（図６ｂ、図６ｄ）。属レベルでのＬＥｆＳｅ評価は、重要な脳腫瘍バイオマーカーとしてＢａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ Ｓ２４－７群、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ＮＫ４Ａ１３６、ＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓおよびＥｒｙｓｉｐｅｌａｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍを示した（図６ｅ）。
【0081】
また、対照群と患者間の血清および組織のマイクロバイオーム組成の変更を比較するために、同じ個体から得られた血清および組織の微生物ＥＶ組成物の倍数変化を分析した。
【0082】
門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで、患者のＳａｃｃａｒｉｂａｃｔｅｒｉａは、血清と組織の両方で有意に減少した（図８ａ）。
【0083】
綱（ｃｌａｓｓ）レベルで、患者のＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉａは、血清および組織サンプルの両方で有意に増加した（図８ｂ）。
【0084】
目（ｏｒｄｅｒ）レベルで、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉａｌｅｓは、患者血清と組織サンプルの両方で有意に増加した（図８ｃ）。
【0085】
科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで、患者の血清と組織においてＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉａｌｅｓが有意に高く、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅが有意に減少した（図８ｄ）。
【0086】
最後に、属レベルで患者の［Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ］ｒｅｃｔａｌｅ（Ｅ．ｒｅｃｔａｌｅ）およびＤｉａｌｉｓｔｅｒは、血清および組織サンプルの両方で有意に減少した。また、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ＮＫ４Ａ１３６は、脳腫瘍患者の組織において有意に低かったが、対照群の組織および血清サンプルと比較して患者の血清においてそれぞれ大きく増加することを確認した（図９）。
【0087】
［実施例６．血液サンプルを用いた脳腫瘍診断モデルの開発］
（実施例６－１．血液から抽出したＤＮＡのメタゲノム解析）
血液に存在する小胞を分離し、ＤＮＡを抽出するために、まず、１０ｍｌチューブに血液を入れ、遠心分離（３，５００ｘｇ、１０ｍｉｎ、４℃）を実施して、浮遊物を沈めて上澄み液のみを回収した後、新しい１０ｍｌチューブに移した。０．２２μｍフィルターを使って前記回収した上澄み液から細菌および異物を除去した後、セントリプレップチューブ（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒｓ ５０ｋＤ）に移し、１５００ｘｇ、４℃で１５分間遠心分離して、５０ｋＤより小さい物質は捨て、１０ｍｌまで濃縮させた。再び０．２２μｍフィルターを使ってバクテリアおよび異物を除去した後、Ｔｙｐｅ ９０ｔｉローターで１５０，０００ｘｇ、４℃で３時間超高速遠心分離方法を使って上澄み液を捨て、固まったペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を生理食塩水（ＰＢＳ）で溶かして小胞を収得した。
（実施例６－１．血液から抽出したＤＮＡのメタゲノム解析）
血液に存在する小胞を分離し、ＤＮＡを抽出するために、まず、１０ｍｌチューブに血液を入れ、遠心分離（３，５００ｘｇ、１０ｍｉｎ、４℃）を実施して、浮遊物を沈めて上澄み液のみを回収した後、新しい１０ｍｌチューブに移した。０．２２μｍフィルターを使って前記回収した上澄み液から細菌および異物を除去した後、セントリプレップチューブ（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒｓ ５０ｋＤ）に移し、１５００ｘｇ、４℃で１５分間遠心分離して、５０ｋＤより小さい物質は捨て、１０ｍｌまで濃縮させた。再び０．２２μｍフィルターを使ってバクテリアおよび異物を除去した後、Ｔｙｐｅ ９０ｔｉローターで１５０，０００ｘｇ、４℃で３時間超高速遠心分離方法を使って上澄み液を捨て、固まったペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を生理食塩水（ＰＢＳ）で溶かして小胞を収得した。
【0088】
前記方法により血液から分離した小胞１００μｌを１００℃で沸かして、内部のＤＮＡを脂質外に出るようにした後、氷に５分間冷ました。次に、残った浮遊物を除去するために、１０，０００ｘｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上澄み液のみを集めた後、Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＤＮＡ量を定量した。以後、前記抽出されたＤＮＡに細菌由来ＤＮＡが存在するかを確認するために、前記表１に示した１６ｓ ｒＤＮＡ ｐｒｉｍｅｒでＰＣＲを行うことによって、前記抽出された遺伝子に細菌由来遺伝子が存在することを確認した。結果をＳｔａｎｄａｒｄ Ｆｌｏｗｇｒａｍ Ｆｏｒｍａｔ（ＳＦＦ）ファイルで出力し、ＧＳ ＦＬＸ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ２．９）を用いてＳＦＦファイルをｓｅｑｕｅｎｃｅファイル（．ｆａｓｔａ）とｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅファイルに変換した後、リードの信用度評価を確認し、ｗｉｎｄｏｗ（２０ｂｐｓ）平均ｂａｓｅ ｃａｌｌ ａｃｃｕｒａｃｙが９９％未満（Ｐｈｒｅｄ ｓｃｏｒｅ＜２０）の部分を除去した。質が低い部分を除去した後、リードの長さが３００ｂｐｓ以上のものだけを利用し（Ｓｉｃｋｌｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １．３３）、結果分析のために、Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ Ｕｎｉｔ（ＯＴＵ）は、ＵＣＬＵＳＴとＵＳＥＡＲＣＨを用いてシーケンス類似度によってクラスタリングを行った。具体的に、属（ｇｅｎｕｓ）は９４％、科（ｆａｍｉｌｙ）は９０％、目（ｏｒｄｅｒ）は８５％、綱（ｃｌａｓｓ）は８０％、門（ｐｈｙｌｕｍ）は７５％シーケンス類似度を基準としてクラスタリングを行い、各ＯＴＵの門、綱、目、科、属レベルの分類を行い、ＢＬＡＳＴＮとＧｒｅｅｎＧｅｎｅｓの１６Ｓ ＤＮＡシーケンスデータベース（１０８，４５３シーケンス）を用いて９７％以上のシーケンス類似度を有するバクテリアを分析した（ＱＩＩＭＥ）。
【0089】
（実施例６－２．血液から分離した細菌由来小胞メタゲノム解析基盤脳腫瘍の診断モデル）
前記実施例６－１の方法で、脳腫瘍患者１７０人と年齢と性別をマッチングした正常ヒト２００人の血液から小胞を分離した後、メタゲノムシーケンシングを行った。診断モデルの開発は、まず、ｔ検定で２つの群間のｐ値が０．０５以下であり、グループ平均が０．１％以上である菌株を選定した後、ロジスティック回帰分析（ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）方法で診断的性能指標であるＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ）、感度、および特異度を算出した。
前記実施例６－１の方法で、脳腫瘍患者１７０人と年齢と性別をマッチングした正常ヒト２００人の血液から小胞を分離した後、メタゲノムシーケンシングを行った。診断モデルの開発は、まず、ｔ検定で２つの群間のｐ値が０．０５以下であり、グループ平均が０．１％以上である菌株を選定した後、ロジスティック回帰分析（ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）方法で診断的性能指標であるＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ）、感度、および特異度を算出した。
【0090】
血液内細菌由来小胞を門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで解析した結果、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＴｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ門細菌バイオマーカーにて診断モデルを開発したとき、脳腫瘍に対する診断的性能が有意に示された（表３および図１０参照）。
【0091】
【表3】
【0092】
血液内細菌由来小胞を綱（ｃｌａｓｓ）レベルで解析した結果、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓ綱細菌バイオマーカーにて診断モデルを開発したとき、脳腫瘍に対する診断的性能が有意に示された（表４および図１１参照）。
【0093】
【表4】
【0094】
血液内細菌由来小胞を目（ｏｒｄｅｒ）レベルで解析した結果、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、およびＲＦ３９目細菌バイオマーカーにて診断モデルを開発したとき、脳腫瘍に対する診断的性能が有意に示された（表５および図１２参照）。
【0095】
【表5】
【0096】
血液内細菌由来小胞を科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで解析した結果、Ｉｎｔｒａｓｐｏｒａｎｇｉａｃｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｍｏｇｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｗｅｅｋｓｅｌｌａｃｅａｅ、およびＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ科細菌バイオマーカーにて診断モデルを開発したとき、脳腫瘍に対する診断的性能が有意に示された（表６および図１３参照）。
【0097】
【表6】
【0098】
血液内細菌由来小胞を属（ｇｅｎｕｓ）レベルで解析した結果、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ、Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、およびＣｌｏａｃｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌バイオマーカーにて診断モデルを開発したとき、脳腫瘍に対する診断的性能が有意に示された（表７および図１４参照）。
【0099】
【表7】
【0100】
下記表８に血清、血液および脳組織サンプルにおける細菌由来小胞の分析結果を簡略に示した。
【0101】
【表8】
【0102】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。
【産業上の利用可能性】
【0103】
本発明による人体由来サンプルを用いた細菌由来細胞外小胞のメタゲノム解析を通して脳腫瘍発病の危険度をあらかじめ診断することによって、脳腫瘍の危険群を早期に診断および予測可能であり、また、適切な管理により発病時期を遅らせたり発病を予防することができる。これに加えて、発病後にも早期診断することができるので、脳腫瘍の発病率を低減し、治療効果を高めることができるだけでなく、脳腫瘍と診断を受けた患者においてメタゲノム解析を通して原因因子の露出を避けることによって、病気の経過を良くしたり、再発を防ぐことができるという長所があるので、産業上の利用可能性がある。
【図1a】
【図1b】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図3a】
【図3b】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図5a】
【図5b】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【図6d】
【図6e】
【図7a】
【図7b】
【図7c】
【図8a】
【図8b】
【図8c】
【図8d】
【図9】
【図 】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】