特許 7305361 還元型グルタチオン含有乳酸菌培養物の製造法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-06-30

(45)【発行日】2023-07-10

(54)【発明の名称】還元型グルタチオン含有乳酸菌培養物の製造法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20230703BHJP

   C12P 21/02 20060101ALN20230703BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 A

C12P21/02 G

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2019015692

(22)【出願日】2019-01-31

(65)【公開番号】P2020120630

(43)【公開日】2020-08-13

【審査請求日】2021-07-15

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】000006884

【氏名又は名称】株式会社ヤクルト本社

(74)【代理人】

【識別番号】100101432

【弁理士】

【氏名又は名称】花村 太

(72)【発明者】

【氏名】山本 悠

(72)【発明者】

【氏名】楠原 史朗

(72)【発明者】

【氏名】三井田 聡司

(72)【発明者】

【氏名】牧野 譲

(72)【発明者】

【氏名】松井 彰久

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 雅彦

【審査官】田ノ上 拓自

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１３－１８８１７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００５－５１２５８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００６－１９７８３４（ＪＰ，Ａ）

【文献】Ann Ig, 2014年，Vol.26，p.205-212，doi:10.7416/ai.2014.1978

【文献】International Dairy Journal, 2015年，Vol.45，p.41-47，http://dx.doi.org/10.1016/j.idairyj.2015.01.015

【文献】食品群名/食品名： 乳類/＜牛乳及び乳製品＞/（粉乳類）/脱脂粉乳，食品詳細表示, 出典：日本食品標準成分表2020年版（八訂），https://fooddb.mext.go.jp/details/details.pl?ITEM_NO=13_13010_7&MODE=4&WEIGHT=100&TYPE=print, 検索日：2020年5月20日

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／２０

Ｃ１２Ｐ ２１／０２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

還元型グルタチオン産生細菌であるストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）をＬ－シスチンが添加された乳培地で培養し、増殖曲線が対数期から静止期に至る前に、前記培養された培養物に酸を添加してｐＨ４．１～４．５に調整するものであり、
前記乳培地が、２０％以上の無脂乳固形分（ＳＮＦ）を含むものであることを特徴とする還元型グルタチオン含有乳酸菌培養物の製造法。

【請求項2】

前記ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）とラクトバチルス属細菌とを、前記Ｌ－シスチンが添加された乳培地で混合培養することを特徴とする請求項１に記載の還元型グルタチオン含有乳酸菌培養物の製造法。

【請求項3】

前記培養物に添加する酸が有機酸であることを特徴とする請求項１又は２に記載の還元型グルタチオン含有乳酸菌培養物の製造法。

【請求項4】

前記乳培地は、前記Ｌ－シスチンが０．００２～０．００４％（ｗ／ｗ）の濃度で添加されていることを特徴とする請求項１～３の何れか１項に記載の還元型グルタチオン含有乳酸菌培養物の製造法。

【請求項5】

前記ラクトバチルス属細菌がラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)であることを特徴とする請求項２に記載の還元型グルタチオン含有乳酸菌培養物の製造法。

【請求項6】

培地中濃度が０．００２～０．００４％（ｗ／ｗ）となるようにＬ－シスチンを添加した無脂乳固形分（ＳＮＦ）２２．７％（ｗ／ｗ）含有乳培地に、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）とラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)とを接種し、１２～１８時間培養した後の保存前の培養物に、乳酸を添加してｐＨ４．３±０．１に調整することを特徴とする請求項５に記載の還元型グルタチオン含有乳酸菌培養物の製造法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、還元型グルタチオン高含有乳酸菌培養物に関するものである。

【背景技術】

【0002】

肝機能向上作用、免疫賦活作用等の他、抗酸化作用を有することが知られているグルタチオンは、グルタミン酸、システイン、グリシンからなるトリペプチドであり、酸化型及び還元型が存在する。酸化型は、２分子の還元型グルタチオンがジスルフィド結合によってつながった分子であり、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）はチオール基を有しており、フリーラジカルや過酸化物などの活性酸素種を還元して消去することができる。

【0003】

この還元型グルタチオンについては、所定量のシスチンを添加した乳培地で、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）を培養すると、還元型グルタチオンを高濃度で含有する培養物を得る製造方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。

【0004】

この提案では、無脂乳固形分(ＳＮＦ；Solids Not Fat)は１０～２０％であり、培養温度３０～３４℃、培養時間１２～２４時間の条件が記載され、シスチン0.002～0.004％を添加した培地では、還元型グルタチオン生産量が大きくなることが記載されており、更に具体的には、還元型グルタチオン量は、２１日間保存しても５～３２％程度しか減少しない（特許文献１、表１参照）ことが開示されている。

【0005】

また、ｐＨ３～４の発酵乳に、乳酸でｐＨ３～４に調整した副原料を添加する発酵乳の製造方法が提案されている（例えば、特許文献２参照）。これにより、微生物の産生する多糖類の濃度が高く、風味が良好な発酵乳食品を得ることができる効果を奏する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】特開２０１３－１８８１７７号公報

【文献】特開２０１４－０２７９４３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

さて、本出願人は、この特許文献１の技術に基づいて、新規な製品を種々検討していたところ、還元型グルタチオン産生細菌を高い無脂乳固形分（ＳＮＦ）を含む乳培地で培養したところ、乳酸菌培養物の保存中に、菌体内で蓄積された還元型グルタチオン（以下、「ＧＳＨ」とも記す）が菌体外に放出されて酸化型グルタチオン（以下、「ＧＳＳＧ」とも記す）に変化し、得られた乳酸菌培養物中のＧＳＨ量を維持することができないという新たな問題を確認するに至った。

【0008】

この現象は、還元型グルタチオン産生細菌単菌のみの培養だけでなく、還元型グルタチオン産生細菌と他の細菌との混合培養においても、高い無脂乳固形分（ＳＮＦ）を含む乳培地であれば、同様に菌体内で蓄積された還元型グルタチオン（ＧＳＨ）が菌体外に放出されて酸化型グルタチオンに変化することが確認された。

【0009】

本発明は、高い菌体内還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を維持することができる乳酸菌培養物及びその製造法を得ることを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明に係る還元型グルタチオン含有乳酸菌培養物の製造法は、ストレプトコッカス属還元型グルタチオン産生細菌であるストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）をＬ－シスチンが添加された乳培地で培養し、増殖曲線が対数期から静止期に至る前に、前記培養された培養物に酸を添加してｐＨ４．１～４．５に調整するものであり、
前記乳培地が、２０％以上の無脂乳固形分（ＳＮＦ）を含むものであることを特徴とするものである。

【0015】

本発明に係る還元型グルタチオン含有乳酸菌培養物の製造法は、前記ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）とラクトバチルス属細菌とを、前記Ｌ－シスチンが添加された乳培地で混合培養することを特徴とするものである。

【0016】

本発明に係る還元型グルタチオン含有乳酸菌培養物の製造法は、前記培養物に添加する酸が有機酸であることを特徴とするものである。
また、本発明に係る還元型グルタチオン含有乳酸菌培養物の製造法は、培地中濃度が０．００２～０．００４％（ｗ／ｗ）となるようにＬ－シスチンを添加した無脂乳固形分（ＳＮＦ）２２．７％（ｗ／ｗ）含有乳培地に、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）とラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)とを接種し、１２～１８時間培養した後の保存前の培養物に、乳酸を添加してｐＨ４．３±０．１に調整することを特徴とすることを特徴とするものである。

【発明の効果】

【0017】

本発明は、菌体内還元型グルタチオン（ＧＳＨ）量が高く、保存性も良い乳酸菌培養物を得ることができるという効果がある。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】ストレプトコッカス属細菌（ＳＴ－１）単菌発酵乳と、ラクトバチルス属細菌（ＬｃＳ）との混合培養発酵乳との菌体内ＧＳＨ量の変化を示す線図である。

【図2】菌体内外ＧＳＨ量及びＧＳＳＧ量の推移を示す説明図である。

【図3】乳酸添加の有無による菌体内外ＧＳＨ量及びＧＳＳＧ量の保存性の相違を示す説明図である。

【図4】乳酸添加による菌体内ＧＳＨ量とその保存性の相違を示す説明図である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明の還元型グルタチオン高含有乳酸菌培養物は、シスチン含有乳培地におけるストレプトコッカス属還元型グルタチオン産生細菌培養物の酸添加によるｐＨ調整物である。酸添加によって、菌体内で蓄積された還元型グルタチオン（ＧＳＨ）が菌体外に移行することを阻害するため、高い菌体内ＧＳＨ量を維持することができる。

【0020】

本発明のストレプトコッカス属還元型グルタチオン産生細菌としては、還元型グルタチオン産生能を有するストレプトコッカス属細菌であれば特に限定されるものではないが、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophlus)、ストレプトコッカス・アガラクティア(Streptococcus agalactiae)等のストレプトコッカス属細菌が挙げられ、これらは、１種単独で用いることもできるし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

【0021】

これらの中でも、特にストレプトコッカス・サーモフィルスが好ましい。ストレプトコッカス・サーモフィルスとしては、ストレプトコッカス・サーモフィルスYIT 2001、ストレプトコッカス・サーモフィルスATCC 19258等を用いることができるが、これらの中でも還元型グルタチオン含量が高くなるため、ストレプトコッカス・サーモフィルスYIT 2001(FERM BP-7538、寄託日：平成13年(2001年)1月31日)が好適に用いられる。

【0022】

ストレプトコッカス属還元型グルタチオン産生細菌は単独又は複数の同属の細菌で培養されてもよいが、製品化に際して他の属の乳酸菌と混合培養して還元型グルタチオン産生以外の好ましい性能を製品に持たせてもよい。例えば、ストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス属細菌、ラクトバチルス属微生物等が挙げられる。特に、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)YIT9029(FERM BP-1366、寄託日：昭和62年(1987年)5月18日）をストレプトコッカス属還元型グルタチオン産生細菌と共に混合培養することにより、良好なヨーグルト飲料を得ることができて好ましい。

【0023】

還元型グルタチオン産生乳酸菌を培養する際には、培養した発酵物の食品への適応性が高いという点で乳培地が好適に用いられる。この乳培地としては、牛乳、山羊乳、羊乳、豆乳などの動物及び植物由来の液状乳、または脱脂粉乳、全粉乳などの粉乳、濃縮乳から還元した乳などをそのまま或いは水で希釈したものを用いることができる。

【0024】

本発明の乳培地には、還元型グルタチオンを産生させるために、シスチンを添加する。本発明で用いられるシスチンには、Ｌ－シスチン、Ｄ－シスチン及びこれらの混合物が含まれるが、Ｌ－シスチンが好ましく用いられる。乳培地中のシスチンの添加量は、通常0.001～0.01％(w/w)、好ましくは0.001～0.006％(w/w)である。

【0025】

また、乳培地の無脂乳固形分（ＳＮＦ）は、高濃度（２０％(w/w) 以上、または２０％～２５％(w/w) ）に含まれると、乳酸菌培養物の保存中に、菌体内還元型グルタチオン（ＧＳＨ）が菌体外に放出されて酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）に変化し、有効量の菌体内ＧＳＨ量を維持することができないという新たな問題が発生した。尚、この状態で単に培養をやめて１０℃の冷蔵庫で保存しても、菌体外へのＧＳＨの放出をとめることができず、やはり菌体内ＧＳＨ量を維持することができなかった。

【0026】

また、還元型グルタチオン産生細菌と他の細菌との混合培養においても、高い無脂乳固形分（ＳＮＦ）を含む乳培地であれば、同様に菌体内で蓄積された還元型グルタチオン（ＧＳＨ）が菌体外に放出されて酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）に変化することが確認された。

【0027】

本発明の培養物に酸を添加してｐＨを調整したｐＨ調整物では、無脂乳固形分（ＳＮＦ）が２０％(w/w) 以上でも、乳酸菌培養物の保存中に、菌体内で蓄積された還元型グルタチオンが菌体外に放出され難く、菌体内で蓄積された還元型グルタチオン（ＧＳＨ）が菌体外に移行することを阻害するため、高い菌体内ＧＳＨを維持することができる。具体的には、菌体内ＧＳＨ量として、２０００ng/mL以上であり、好ましくは２５００ng/mL以上であり、より好ましくは３０００ng/mL以上である。また、菌体内ＧＳＨ、菌体内ＧＳＳＧ、菌体外ＧＳＨ、菌体外ＧＳＳＧの総量に対する菌体内ＧＳＨの割合は、３０％以上であり、好ましくは４０％以上であり、より好ましくは５５％以上である。さらに、菌体内ＧＳＨ、菌体内ＧＳＳＧ、菌体外ＧＳＨ、菌体外ＧＳＳＧの総量に対する菌体外ＧＳＨ量の割合は、４０％以下であり、好ましくは３０％以下であり、より好ましくは２０％以下である。

【0028】

尚、酸の添加によって培地のｐＨが急激に酸性側へ移行するが、好ましいｐＨ調整物としては、通常２４時間後に到達するであろうｐＨまで調整すればよい。具体的には、ｐＨ４．１～４．５に調整されるものであればよい。また、中和滴定法による乳酸酸度が１９．０±２．０となるように酸を添加すればよい。

【0029】

ｐＨ調整を行う酸については、ストレプトコッカス属還元型グルタチオン産生細菌の菌体内で蓄積された還元型グルタチオンが菌体外に放出されることを防ぐために、酸性とするために添加されるものであればよい。酸については、種々の酸を添加することが可能であるが、有機酸が食品の添加物として多く認められるため好ましく、乳酸が還元型グルタチオン産生細菌自体が産生する酸と同じものであるため、より好ましい。

【0030】

本発明のｐＨ調整については、ストレプトコッカス属還元型グルタチオン産生細菌が菌体内に充分に還元型グルタチオンが蓄積され、尚且つ、蓄積された還元型グルタチオンが菌体外へ移行する前に行われるのが最適である。多くの場合、還元型グルタチオン産生細菌の菌体内に還元型グルタチオンが充分に蓄積されるのは、ほぼピーク時、即ち、増殖曲線が対数期から静止期に至る前である。

【0031】

より詳しくは、ストレプトコッカス属還元型グルタチオン産生細菌をシスチン含有乳培地で１２～２０時間培養し、増殖曲線が対数期から静止期に至る前に、培養された培養物に酸を添加してｐＨを調整するものである。

【0032】

尚、酸を用いて急激にｐＨを下げたｐＨ調整物については、風味確認を不特定多数の人間が行った結果、培養１２時間で乳酸を添加して急激にｐＨを下げたものは、培養２４時間のものに比べて後味がよく、さっぱり感があり、乳酸添加による急激なｐＨ調整については、風味を悪化させるものではないことが判っている。

【0033】

本発明のｐＨ調整には、菌体内で蓄積された還元型グルタチオンが菌体外へ放出するのを阻害するが、この還元型グルタチオンの菌体外への放出は、冷蔵状態での保存で、酸の添加後７日間も阻害し続け菌体内への還元型グルタチオンの蓄積を充分に維持させることができる。

【0034】

本発明に示された還元型グルタチオン高含有乳酸菌培養物は、菌体内に還元型グルタチオンが蓄積されるため、培養物自体をヨーグルト食品、ヨーグルト飲料等として供したり、培養物自体や菌体を集菌して、これを乾燥することにより、食品やサプリメント剤等として供与してもよい。この場合、保存安定性は培養物自体の液体での保存と比べて遙かに高い利点もある。

【実施例】

【0035】

図１はストレプトコッカス属細菌（ＳＴ－１）単菌発酵乳と、ラクトバチルス属細菌（ＬｃＳ）との混合培養発酵乳との菌体内ＧＳＨ量の変化を示す線図である。図２は菌体内外ＧＳＨ量及びＧＳＳＧ量の推移を示す説明図である。図３は乳酸添加の有無による菌体内外ＧＳＨ量及びＧＳＳＧ量の保存性の相違を示す説明図である。図４は乳酸添加による菌体内ＧＳＨ量とその保存性の相違を示す説明図である。

【0036】

実施例１
先ず、ＳＮＦ濃度が高いと乳酸菌発酵物中の菌体内グルタチオン量がＳＮＦ濃度の低いものと比べて少なくなることを検証した。具体的には、本実施例１では、供試菌株として、ストレプトコッカス・サーモフィルスYIT2001(以下、「ＳＴ－１」とも記す)及びラクトバチルス・カゼイYIT9029(以下、「ＬｃＳ」とも記す)を用いた。ＳＴ－１のみ又は両菌の凍結保存菌液を10％(w/w)脱脂粉乳水溶液(ＳＴ－１は0.01％(v/v)、ＬｃＳは0.5％(v/v))に接種し、３７℃で２２時間前培養した。

【0037】

先ず、これら単菌と両菌との２種の前培養液２５mLを、L-シスチン濃度を変えて添加した乳培地(無脂乳固形分(ＳＮＦ)16％(w/w)及び22.7％(w/w)、L-シスチン0～0.006％)１０Ｌに接種し、34.5±0.5℃でｐＨが4.4未満に到達するまで撹拌培養を行って各々の乳酸菌発酵物を得た。乳酸菌発酵物中の菌体内の還元型グルタチオン含量を測定した。結果を次の表１に示す。表１からＳＮＦが２０％以上の場合、菌体内還元型グルタチオン量はＳＮＦが１６％の場合に比べ、低いことが判明した。

【0038】

尚、菌体内の還元型グルタチオンの測定法としては、次の通りに行った。先ず、検体１mLを10mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)９mLで希釈した。この溶液600μLを遠心分離(20,000ｇ、４℃、１０min)した後、上清を除去し菌体を回収した。これにφ0.1mmガラスビーズ(1,000mg)とホウ酸緩衝液(2mM EDTA、100mMホウ酸緩衝液、ｐＨ8.0) 800μLを加え、振とう(6.5/ms、60s)して菌体を破砕後、遠心分離(20,000ｇ、4℃、１０min)して上清を回収した。

【0039】

この上清200μLに1mM 4-(アミノスルホニル)-7-フルオロ-2,1,3-ベンゾオキサジアゾール(ABD-F)添加100mM ホウ酸緩衝液(ｐＨ8.0）300μLを添加し、６０℃で１５分間誘導体化反応を行った。１０分間氷冷後、 0.1N 塩酸を200μL添加し、孔径０．４５μｍのフィルターで遠心ろ過（10,000ｇ、４℃、２ｍｉｎ）したものを、ＨＰＬＣ／蛍光検出法で分析、定量した。

【0040】

【表1】

【0041】

次に、菌体内ＧＳＨ量の培養時間に対する変化を検証した結果を図１に示す。即ち、ＳＴ－１単菌及びＳＴ－１とＬｃＳとの混合菌を用いて、L-シスチンを0.002％添加した乳培地(無脂乳固形分(ＳＮＦ) 16％(w/w)及び22.7％(w/w))１０Ｌに接種し、撹拌培養を行い乳酸菌発酵物を経時的に摂取して、乳酸菌発酵物中の菌体内の還元型グルタチオン含量を測定した。図１に示す通り、菌体内ＧＳＨ量は、培養１２時間をピークにして徐々に低下していることが判った。

【0042】

実施例２
本実施例では、グルタチオンの経時変化を示す。具体的には、供試菌株として、実施例１と同様に、ＳＴ－１単菌及びＳＴ－１とＬｃＳとの混合菌を用いた。ＳＴ－１のみ又は両菌の凍結保存菌液を10％(w/w)脱脂粉乳水溶液に(ＳＴ－１は0.01％(v/v)、ＬｃＳは0.5％(v/v))接種し、３７℃で２４時間前培養した。

【0043】

得られた前培養液５mLを、3Lジャーファーメンター中の、L-シスチンを濃度0.002％(w/w)となるように添加した乳培地(無脂乳固形分(ＳＮＦ)22.7％(w/w)) 2LにＳＴ－１単菌又はＳＴ－１とＬｃＳとの混合菌を接種し、３４℃で２６時間撹拌培養して乳酸菌発酵物を得た。

【0044】

これら各乳酸菌発酵物は培養６時間目より２時間おきに回収し、菌体内外の還元型・酸化型グルタチオン量を測定した。結果を図２及び表２に示す。

【0045】

【表2】

【0046】

尚、菌体内の還元型及び酸化型グルタチオンの測定方法は、次の通りである。即ち、検体lmLを10mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)9mLで希釈した。この溶液600μLを遠心分離(20,000g、４℃、１０min)した後、上清を除去し菌体を回収した。これにφ0.lmmガラスビーズ(1,000mg)と2mM EDTA添加100mM ホウ酸緩衝液(ｐＨ8.0)800μLを加え、FastPrep-24(MP Biomedicals)で振とう(6.5/ms、60s)して菌体を破砕後、遠心分離(20,000g、４℃、１０min)して上清を回収した。

【0047】

上清200μLに精製水または還元剤(5mM TCEP、ナカライテスク)10μLを添加し、これに2mM EDTA添加100mMホウ酸緩衝液(ｐＨ8.0)290μLとlmM 4-(アミノスルホニル)-7-フルオロ-2,1,3-ベンゾオキサジアゾール(ABD-F)添加100mMホウ酸緩衝液(ｐＨ8.0)300μLを添加し、６０℃で１５分間誘導体化反応を行った。１０分間氷冷後、0.1N塩酸を200μL添加し、孔径0.45μmのフィルターで遠心ろ過(10,000g、４℃、２min)したものを、HPLC/蛍光検出法で分析、定量した。

【0048】

また、菌体外の還元型及び酸化型グルタチオンの測定方法は、次の通りである。即ち、検体1mLを10mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)9mLで希釈した溶液600μLを遠心分離(20,000g、４℃、１０min)した後、上清を回収した。上清200μLに精製水または還元剤(5mM TCEP、ナカライテスク)10μLを添加し、これに0.5mM 4-(アミノスルホニル)-7-フルオロ-2,1,3-ベンゾオキサジアゾール(ABD-F)添加400mMホウ酸緩衝液(ｐＨ8.0)590μLを添加し、６０℃で２０分間誘導体化反応を行った。１５分間氷冷後、0.4N塩酸200μLを添加したものをHPLC/蛍光検出法で分析、定量した。

【0049】

図２及び表２に示す通り、培養時間毎の菌体内ＧＳＨ量の推移については、１８時間までの菌体内ＧＳＨ量が多くなってはいるが、それ以降は、菌体内ＧＳＨの量が減少することが判った。

【0050】

実施例３
本実施例では、培養時間の短縮により菌体内ＧＳＨ高含有な菌液が得られること、及び乳酸の培養後添加によりそれを高く維持できることを示す。具体的には、供試菌株として、ＳＴ－１とＬｃＳとの混合菌を用いた。10％(w/w)脱脂粉乳水溶液に、ＳＴ－１を0.01％(v/v)及びＬｃＳを0.5％(v/v)接種し、３７℃で２４時間前培養した。

【0051】

得られた前培養液0.25mLを、300mLコルベン中へ、L-シスチンを濃度0.002％(w/w)となるように添加した乳培地(無脂乳固形分(ＳＮＦ)22.7％(w/w))100mLに接種し、３４℃で１２時間静置培養して乳酸菌発酵物を得た。培養終了後に乳酸をｐＨ4.3±0.1となるよう添加し、４℃で最大７日間保存した。保存前後の乳酸菌発酵物について、菌体内の還元型グルタチオン量を実施例１と同様の方法により測定し、保存後の残存率を算出した。

【0052】

【表3】

【0053】

乳酸菌発酵物中のＬｃＳの生菌数をセファロチン添加ＢＣＰ培地（最終濃度２μg/mL）培地で測定した。ＳＴ－１の生菌数は、ＳＴ－１・ＬｃＳの総生菌数からＬｃＳの生菌数を差し引いて算出した。結果を表３に示す。表３に示す通り、乳酸を添加したものが菌体内還元型グルタチオン量の残存率が乳酸を添加しなかったものよりも圧倒的に大きかった。

【0054】

実施例４
本実施例では、乳酸添加の有無によるグルタチオンの経時変化を示す。具体的には、実施例１と同様に、ＳＴ－１単菌及びＳＴ－１とＬｃＳとの混合菌を用いた。ＳＴ－１のみ又は両菌の凍結保存菌液を10％(w/w)脱脂粉乳水溶液に(ＳＴ－１は0.01％(v/v)、ＬｃＳは0.5％(v/v))接種し、３７℃で２４時間前培養した。

【0055】

得られた前培養液0.25mLを、300mLコルベン中へ、L-シスチンを濃度0.002％(w/w)となるように添加した乳培地(無脂乳固形分(ＳＮＦ)22.7％(w/w))100mLに接種し、３４℃で１２時間静置培養して乳酸菌発酵物を得た。得られた乳酸菌発酵物の１つをサンプリングして、１０℃で保存した。サンプリング時、保存２日、保存７日目の菌体内外の還元型・酸化型グルタチオン量を実施例２と同様に測定した。

【0056】

また、他の乳酸発酵物は、培養終了後に乳酸をｐＨ4.3±0.1となるよう添加した後に、サンプリングして、１つ目と同様に１０℃で保存した。サンプリング時、保存２日目、保存７日目の菌体内外の還元型・酸化型グルタチオン量を実施例２と同様に測定した。結果を図３に示す。

【0057】

図３に示す通り、乳酸を添加して急激にｐＨを低減させたものでは、保存２日目、保存７日目共に菌体内の還元型グルタチオン量が乳酸を添加していないものと比べて圧倒的に保存されていることが示された。また、１０℃保存７日目において、乳酸無添加の場合、菌体内ＧＳＨ、菌体内ＧＳＳＧ、菌体外ＧＳＨ、菌体外ＧＳＳＧの総量に対する菌体内ＧＳＨの割合は２０．２％であり、菌体外ＧＳＨの割合は４８．１％であった。一方、１０℃保存７日目において、乳酸添加の場合、菌体内ＧＳＨ、菌体内ＧＳＳＧ、菌体外ＧＳＨ、菌体外ＧＳＳＧの総量に対する菌体内ＧＳＨの割合は６０．６％であり、菌体外ＧＳＨの割合は１３．６％であり、両者に顕著な相違が見られた。

【0058】

実施例５
本実施例では、乳酸以外の酸にも菌体内ＧＳＨの維持効果があることを示す。具体的には、供試菌株として、ＳＴ－１を用いた。10％(w/w)脱脂粉乳水溶液にそれぞれ0.Ol％(v/v)接種し、３７℃で２４時間前培養した。この前培養液0.25mLを、300mLコルベン中の、L-シスチンを濃度0.004％(w/w)となるように添加した乳培地(無脂乳固形分(ＳＮＦ)22.7％(w/w))100mLに接種し、３４℃で１２時間静置培養して乳酸菌発酵物を得た。

【0059】

培養終了後に無機酸(塩酸、リン酸)もしくは有機酸(乳酸、クエン酸、コハク酸)を添加し、１０℃で最大７日間保存した。保存前後の乳酸菌発酵物について、菌体内の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）量を実施例１と同様の方法により測定し、保存後の残存率を算出した。結果を表４に示す。表４の結果から、無機酸よりも、有機酸の方が酸を添加することにより、菌体内還元型グルタチオンの残存率が高くなることが判明した。また、特に乳酸を添加した場合に効果が高いことが判明した。

【0060】

【表4】

【0061】

実施例６
本実施例では、培養を１８時間行った乳酸菌発酵物及びそれを用いて得た発酵乳製品が乳酸の後添加により菌体内ＧＳＨ高含有かつ高保存性となることを示す。具体的には、供試菌株として、ＳＴ－１及びＬｃＳを用いた。

【0062】

両菌の凍結保存菌液を10％(w/w)脱脂粉乳水溶液に(ＳＴ－１は0.01％(v/v)、ＬｃＳは0.5％(v/v))接種し、３７℃で２１時間前培養した。この前培養液25mLを、L-シスチンを添加した乳培地(無脂乳固形分(ＳＮＦ)22.7％(w/w)、L-シスチン0.004％)10Lに接種し、３４℃で１８時間撹拌培養を行った後、乳酸をｐＨ4.3±0.1となるよう添加し乳酸菌発酵物を得た。

【0063】

また、当該乳酸菌発酵物 530gを均質化後、シロップ(ファインリカー(FL)：製品あたり7.36％(w/w)、乳酸カルシウム：製品あたり0.055％(w/w)、クリーム：製品あたり1.5％(w/w))と混合し、1000gの発酵乳製品を得た。乳酸菌発酵物は５℃で７日間、発酵乳製品は１０℃で２１日間保存した。

【0064】

保存前後の乳酸菌発酵物と発酵乳製品について、菌体内の還元型グルタチオン量を実施例1と同様の方法により測定し、残存率を算出した。その結果、乳酸を添加することにより、シロップを混合した発酵乳飲料でも菌体内ＧＳＨ量が残存することが判明した。

【0065】

実施例７
本実施例は、ｐＨ調整の時期について検討した。具体的には、実施例４と同様に調整した。即ち、ＳＴ－１及びＬｃＳの凍結保存菌液を10％(w/w)脱脂粉乳水溶液に(ＳＴ－１は0.01％(v/v)、ＬｃＳは0.5％(v/v))接種し、３７℃で２１時間前培養した。

【0066】

前培養液２５mLを、L-シスチンを濃度0.004％(w/w)となるように添加した乳培地(無脂乳固形分(ＳＮＦ)22.7％(w/w)) １０Lに接種し、３４℃で１８時間撹拌培養して乳酸菌発酵物を得た。培養終了後に乳酸をｐＨ4.3±0.1、中和滴定法による乳酸酸度が19.0±2.0となるよう添加した後に、サンプリングして、１０℃で７日間保存し、菌体内の還元型・酸化型グルタチオン量を測定した（乳酸後添加）。

【0067】

比較例として、前培養液を添加する前のL-シスチンを濃度0.004％(w/w)となるように添加した乳培地(無脂乳固形分(ＳＮＦ)22.7％(w/w)) １０LのｐＨを乳酸を添加して６．０に調整した後、ＳＴ－１とＬｃＳとの混合菌液２５mLを接種し、３４℃で３２時間（中和滴定法による乳酸酸度が19.0±2.0になるまで）撹拌培養した乳酸菌発酵物（乳酸後添加）と、L-シスチンを濃度0.004％(w/w)となるように添加した乳培地(無脂乳固形分(ＳＮＦ)22.7％(w/w)) 10Lに、ＳＴ－１とＬｃＳとの混合菌液を接種し、３４℃で３２時間（中和滴定法による乳酸酸度が19.0±2.0になるまで）撹拌培養した乳酸菌発酵物（現行処方）を調製し、培養終了後にサンプリングして、１０℃で７日間保存し、菌体内の還元型・酸化型グルタチオン量を測定した。

【0068】

結果を図４に示す。図４に示す通り、乳酸の添加によるｐＨ調整は、１８時間培養後に行うことが還元型グルタチオンの産生量が多く、また、７日間の保存後も還元型グルタチオンの蓄積量が多いことが確認された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】