(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-07-05
(45)【発行日】2023-07-13
(54)【発明の名称】ジェノタイピングＰＣＲアッセイのための機械学習システム
(51)【国際特許分類】
G16B 25/00 20190101AFI20230706BHJP
G16B 40/10 20190101ALI20230706BHJP
G06N 20/00 20190101ALI20230706BHJP
G06N 20/10 20190101ALI20230706BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20230706BHJP
【ＦＩ】
G16B25/00
G16B40/10
G06N20/00 160
G06N20/10
C12Q1/686 Z
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2021511645
(86)(22)【出願日】2019-08-28
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-12-16
(86)【国際出願番号】 US2019048551
(87)【国際公開番号】W WO2020047081
(87)【国際公開日】2020-03-05
【審査請求日】2021-03-10
(31)【優先権主張番号】62/725,171
(32)【優先日】2018-08-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】502221282
【氏名又は名称】ライフ テクノロジーズ コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【氏名又は名称】松下 満
(74)【代理人】
【識別番号】100098475
【弁理士】
【氏名又は名称】倉澤 伊知郎
(74)【代理人】
【識別番号】100130937
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 泰史
(74)【代理人】
【識別番号】100144451
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 博子
(74)【代理人】
【識別番号】100123630
【弁理士】
【氏名又は名称】渡邊 誠
(72)【発明者】
【氏名】ワン タチン
(72)【発明者】
【氏名】ブルゾスカ ピウス
(72)【発明者】
【氏名】シェルトン エリオット
【審査官】藤澤 美穂
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１２－５２３６４５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１３／１３８７２７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／１１９４４３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２００８－２７８７８３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００８－５２６２４９（ＪＰ，Ａ）
【文献】ATHAMANOLAP, P. et al.，Trainable High Resolution Melt Curve Machine Learning Classifier for Large-Scale Reliable Genotyping of Sequence Variants，PLoS One，2014年10月02日，p.1-10，URL : https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0109094，DOI : 10.1371/journal.pone.0109094
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ１６Ｂ ５／００－９９／００
Ｇ０６Ｎ ２０／００
Ｇ０６Ｎ ２０／１０
Ｃ１２Ｑ １／６８６
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
品質管理システムであって、アッセイを含むｑＰＣＲシステムと、
前記アッセイに対する前記ｑＰＣＲシステムの動作から生じる生画像データの第１の信号を受信するように前記ｑＰＣＲシステムに結合された記憶システムと、
コンピューティングシステムであって、
前記第１の信号を受信し、
前記記憶システムから標識データセットである生画像データの第２の信号を受信し、
サポートベクターマシン（ＳＶＭ）を動作させて、前記第２の信号に基づいて前記第１の信号の遺伝子型の分類を生成して、前記分類に基づいて前記ｑＰＣＲシステムを調整する電子回路を含む、コンピューティングシステムと、を備え、
前記ＳＶＭは、放射基底関数カーネルを含み、
前記放射基底関数カーネルは、
【数1】
【請求項2】
前記ＳＶＭは、以下のソフトマージンパラメータ【数2】
【請求項3】
前記記憶システムおよびＳＶＭは、クラウドサーバシステムによって提供される、請求項１に記載の品質管理システム。
【請求項4】
前記ＳＶＭは、前記アッセイのモデルを生成するように構成されている、請求項１に記載の品質管理システム。
【請求項5】
前記モデルは、ＳＶＭ線形、多項式、および放射型分類器カーネルのうちの１つを含む、請求項４に記載の品質管理システム。
【請求項6】
品質管理方法であって、アッセイに対してｑＰＣＲシステムを動作させて、生画像データの第１の信号を生成することと、
標識データセットを含む生画像データの第２の信号を記憶システムから受信することと、
サポートベクターマシン（ＳＶＭ）を動作させて、前記第２の信号に基づいて前記第１の信号の遺伝子型の分類を生成すること、を含み、前記ＳＶＭは、
【数3】
【数4】
さらに、前記分類を適用して、前記ｑＰＣＲシステムを動作させるプロセスを調整すること、を含む、品質管理方法。
【請求項7】
前記記憶システムおよびＳＶＭは、クラウドサーバシステムによって提供される、請求項６に記載の品質管理方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
いくつかの従来のＰＣＲアッセイジェノタイピング方法論（例えば、Ｔａｑｍａｎ（登録商標））は、教師なし重心最小クラスタ分離シグマ（ＭＣＳＳ）アルゴリズムに基づく。ＭＣＳＳカットオフ（例えば５．０）が、品質管理（ＱＣ）の間にアッセイを不合格または合格としてタグ付けするために経験的に選択される。しかしながら、厳しいカットオフは、アッセイが微妙な差異で分類されないことを意味する。例えば、カットオフが５．０である場合、ＭＣＳＳ＝５．０は、ＱＣ合格分類となり、ＭＣＳＳ＝４．９は、ＱＣ不合格分類となる。これにより、許容可能であり得る多くの製品がＱＣ不合格となり、したがって、製造ロスが増加する。
【発明の概要】
【0002】
アッセイアレイのための新規の分類方法論が、サポートベクターマシン分類および学習に基づいて開示されており、細胞系と生物学的サンプルとをジェノタイピングするために実装され得る。新規の方法論は、遺伝子型を分類し、ｑＰＣＲ反応およびサンプルを遺伝子型分類を用いてタグ付けするためのモデルトレーニングを通じて、過去のジェノタイピング結果を考慮に入れることにより、以前のＱＣ法の問題のある曖昧さを改善する。
【図面の簡単な説明】
【0003】
任意の特定の要素または行為の考察を容易に識別するために、参照番号における最上位桁（複数可）は、その要素が最初に導入された、図の番号を指す。
【0004】
【図1】１つの実施形態によるプロセス１００を示す。
【図2】１つの実施形態によるｑＰＣＲシステム２００を示す。
【図3】１つの実施形態によるプレート調製３００を示す。
【図4】１つの実施形態によるジェノタイピングシステム４００を示す。
【図5】１つの実施形態による放射型アルゴリズム５００を示す。
【図6】１つの実施形態によるＳＶＭ ｑＰＣＲアッセイモデル６００を示す。
【図7】１つの実施形態によるクラウド学習および管理システム７００を示す。
【図8】本発明の実施形態を組み込み得るコンピューティングデバイス８００の例示的なブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【0005】
図１は、ＰＣＲ増幅に利用される１つの実施形態によるプロセス１００、具体的にはＰＣＲ増幅に利用される５’ヌクレアーゼアッセイを示す。プロセス１００は、すべてのサイクルで発生し、産物の指数関数的蓄積を妨害しない、本アッセイプロセスの４つの段を示す。４つの段は、重合段階１０２、鎖置換段階１０４、切断段階１０６、および完了段階１０８を含む。重合段階１０２の間、順方向プライマーおよび逆方向プライマーが、標的配列１１０の近くで、二本鎖ＤＮＡ１１４のあるセクションの複製を開始する。順方向プライマー（５’－＞３’）は、ホットスタートポリメラーゼ１２４（Ｔａｑポリメラーゼ）を含み、それは、ＤＮＡポリメラーゼが不活性である温度で機能し、不要な複製を回避する。プローブは、レポーター色素１１８、相補配列１２６、非蛍光クエンチャー１２０、およびマイナーグルーブバインダー１２２を含む。プローブは、相補配列１２６を介して、標的配列１１０にハイブリダイズする。非蛍光クエンチャー１２０およびマイナーグルーブバインダー１２２は、分子がプローブの３’末端に付着すると、機能する。プローブがそのままである場合、非蛍光クエンチャー１２０（ＮＦＱ）は、レポーター色素１１８が蛍光信号を発するのを防止する。非蛍光クエンチャー１２０が蛍光を発しないので、より低いバックグラウンド信号を生成し、その結果、定量化の精度が改善される。マイナーグルーブバインダー１２２（ＭＧＢ）は、プローブの融解温度（Ｔｍ）を、その長さを増加させることなく上昇させ、より短いプローブの設計を可能にする。重合段階１０２の間、ホットスタートポリメラーゼ１２４がプローブに向かって動き、レポーター色素１１８はプローブの５’側に付着している。
【0006】
鎖置換段階１０４では、ホットスタートポリメラーゼ１２４が、ハイブリダイズされたプローブと相互作用して、レポーター色素１１８を置換する。切断段階１０６では、ホットスタートポリメラーゼ１２４が、プローブからレポーター色素１１８を切断する。切断により、レポーター色素はクエンチャー色素から分離され、非蛍光クエンチャー１２０はもはやレポーター色素１１８をブロックせず、分離されたレポーター色素１１６はその蛍光を増加させる。蛍光の増加は、標的配列がプローブに相補的であり、ＰＣＲ中に増幅される場合にのみ発生する。装置は、二本鎖ＤＮＡ１１４上の標的配列の存在を示すレポーター色素からの蛍光を検出する。標的配列１１０へのプローブのハイブリダイゼーションのため、ホットスタートポリメラーゼ１２４は、相補的配列１２６で停止し、完了段階１０８を示す。
【0007】
図２は、反応プレート２０４、サンプル装填装置２０２、リアルタイムＰＣＲ装置２０８、サンプル混合物２０６、コンピュータシステム２２０、およびユーザインターフェース２２６を備えるｑＰＣＲシステム２００を示す。反応プレート２０４は、ｑＰＣＲ実験のための反応位置として機能する複数の貫通孔を各々が備える、複数のサブアレイを備える。貫通孔の各々は、アッセイ２１０でコーティングされ得る。いくつかの構成では、アッセイ２１０は、サンプルＤＮＡ中のヌクレオチド配列を特異的に標的とするプローブである。サンプルＤＮＡの増幅の間、プローブは、リアルタイムＰＣＲ装置２０８によって検出されるレポーター色素の放出によって、標的配列の存在を示す。反応プレート２０４は、サンプル装填装置２０２内で、標的ポリヌクレオチド配列２１２と組み合わされる。反応プレート２０４を標的ポリヌクレオチド配列２１２と組み合わせる前に、標的ポリヌクレオチド配列２１２は、反応ミックス２１６を含むサンプル混合物２０６において調製される。反応ミックス２１６は、少なくとも、ポリメラーゼ２１４およびプライマー２３０を含む。ポリメラーゼ２１４は、ＰＣＲ反応中に二本鎖ＤＮＡを増幅させる。サンプル装填装置２０２は、特定量のサンプル混合物２０６を、反応プレート２０４の意図された各貫通孔に装填する。サンプル装填装置２０２が、反応プレート２０４の準備を完了すると、反応プレート２０４は、リアルタイムＰＣＲ装置２０８内に装填される。リアルタイムＰＣＲ装置２０８は、ＤＮＡ複製のための特定の段階をトリガする異なる温度範囲を循環させるサーモサイクラーを動作させるためのコンピュータシステム２２０によって構成されている。反応プレート２０４は、ＤＮＡ鎖を変性させ、相補的塩基間の水素結合を切断し、２つの一本鎖ＤＮＡ分子を生成する高熱段階（９４～９８℃（２０１～２０８°Ｆ））を含む、いくつかの複製サイクルを経る。変性段階の後に、アニーリング段階が続き、そこでは、反応温度が、２０～４０秒間、５０～６５℃（１２２～１４９°Ｆ）に下げられる。アニーリング段階は、ＤＮＡ中の標的配列へのプライマーおよびプローブセットのアニーリングを可能にする。アニーリング段階の後に、延長／伸長段階が続き、そこでは、温度が、約７５～８０℃（１６７～１７６°Ｆ）である、Ｔａｑ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ポリメラーゼの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの最適活性温度に調整される。伸長／延長段階の間、ポリメラーゼは、プライマーの位置の隣から始まる相補鎖を合成し、新しい相補鎖を、それが標的配列上のプローブに当接するまで、合成し続ける。ポリメラーゼがプローブと相互作用すると、プローブは、リアルタイムＰＣＲ装置２０８の検出器２１８によって検出される蛍光マーカーを放出する。検出器２１８からの情報は、貫通孔のうちの１つに対応する第１の信号として、コンピュータシステム２２０によって記録される。検出された信号は、情報を記憶および処理して、サンプル混合物２０６中の標的配列のコピー数およびインスタンスを示すクラスタ分析プロット２２８を生成する、メモリ２２２およびプロセッサ２２４を備えるコンピュータシステム２２０に報告される。コンピュータシステム２２０は、ジェノタイピング結果をユーザインターフェース２２６に通信して、クラスタ分析プロット２２８を表示する。
【0008】
当業者には知らされているように、ＰＣＲ分析は、遺伝子標的を増幅するために、複数の熱サイクルを循環するための様々なプロトコルを有する熱サイクル装置で実施される。本教示の様々な実施形態において、増幅のために実施されるサイクル数は、約２０～４０サイクルであり得る。本教示の様々な実施形態に対して、増幅のために実施されるサイクル数は、４０サイクルよりも大きくてもよい。遺伝子標的の増幅のために、熱サイクル装置は、ＰＣＲ実験の第１の熱サイクルを、第１の熱サイクル数に関連し得る特定のサイクル時間で実施し得る。
【0009】
ジェノタイピング分析の様々な実施形態において、２つ以上のＤＮＡサンプルが、第１のプローブおよび第２のプローブを用いて探査される。プロセッサは、第１の時間に、データ収集のための様々なプロトコルのうちのいずれかに基づいてｑＰＣＲ装置から、２つ以上のＤＮＡサンプルの各々について、第１の時間における第１のプローブ強度および第２のプローブ強度を含む第１のデータセットを受信し得る。プロセッサは、第２の時間に、データ収集のための様々なプロトコルのうちのいずれかに基づいてｑＰＣＲ装置から、２つ以上のＤＮＡサンプルの各々について、第２の時間における第１のプローブ強度および第２のプローブ強度を含む第２のデータセットを受信し得る。
【0010】
本教示の様々な実施形態によれば、ユーザインターフェースは、第１の時間および第２の時間に受信したデータセットの分析のための視覚化ツールを、エンドユーザに提示し得る。前述したように、複数のサンプルを、バッチで、ジェノタイピング分析のために処理して、データ集約型のデータセットを生成してもよい。本教示によるシステムおよび方法の様々な実施形態は、そのようなデータ集約型データセットの評価および分析においてエンドユーザを支援し得る視覚化ツールの実施形態を提供する。本教示によるシステムおよび方法の様々な実施形態のために、エンドユーザからの入力に応答して、プロセッサは、第１のデータセットを使用して、第１のプローブ強度対第２のプローブ強度の第１のプロットを生成し得る。さらに、プロセッサは、エンドユーザからの入力に応答して、第２のデータセットを使用して、第２のプローブ強度の関数としての第１のプローブ強度の第２のプロットを生成し得る。本教示のシステムおよび方法の様々な実施形態によれば、プロセッサは、エンドユーザからの入力に応答して、第１のプロットおよび第２のプロットを表示し得る。様々な実施形態において、入力は、データを段階的に表示するためのユーザインターフェースを用いた対話型プロセスであり得る。そのような実施形態では、エンドユーザは、表示のために、任意のデータセットを任意の順序で選択し得る。
【0011】
様々な実施形態において、プロセッサは、ＰＣＲ実験の実行時間中にデータを受け取り受信し得る。例えば、プロセッサは、第１のデータセットの収集の後で、第２のデータセットの収集の前に、ｑＰＣＲ装置から第１のデータセットを受信し得る。さらに、このプロトコルは、実行時間全体にわたって拡張され得、したがって、例えば、プロセッサは、第２のデータセットの収集の後で、後続のデータセットの収集の前に、ｑＰＣＲ装置から第２のデータセットを受信し得る。
【0012】
いくつかの実施形態では、プロセッサは、熱サイクルが完了した後に、ｑＰＣＲ装置から第１のデータセットおよび第２のデータセットを受信し得る。例えば、プロセッサは、第１のデータセットおよび第２のデータセットを、それがコンピュータ可読媒体に記憶された後に受信し得る。
【0013】
いくつかの構成では、視覚化ツールは、ジェノタイピングデータセットの様々な態様を表示することにおいてエンドユーザを支援し、それによってジェノタイピングデータの分析を容易にし得る。様々な実施形態において、プロセッサは、第２のデータセットと第１のデータセットとの間の軌跡ラインを示すプロットを表示し得る。様々な実施形態において、プロセッサは、第１のデータセットに対して第１のプロット品質値で表示し、第２のデータセットに対して第２のプロット品質値で表示し得る。様々な実施形態によれば、ユーザインターフェースは、サンプル表上で行われ、ジェノタイピングデータのプロット上に動的に表示される、選択間の相互作用を提供する。様々な実施形態において、視覚化ツールのユーザインターフェースからエンドユーザによって行われる選択は、例えば、限定されないが、エンドユーザが、例えば、限定されないが、曖昧なエンドポイントデータを解決すること、手動呼び出しを行うこと、軌跡ラインを使用してクラスタの視覚化を支援して遺伝子型の割り当てを強化すること、アッセイ条件（すなわち、標識用プローブ、アッセイバッファなど）を最適化すること、および分析条件を最適化することを可能にするための、動的分析を提供し得る。
【0014】
様々な実施形態において、システムは、例えば、限定されないが、クラスタ分析プロット２２８に示されるグラフに従って表され得るデータセットを利用する。そのような表現は、生物学的サンプル中のゲノム遺伝子座の２つの対立遺伝子の一方に向けられた標識用プローブの各々に関連付けることができる、異なる波長で発光する２つの色素を利用した分析から生じ得る。そのような二重反応では、考えられる３つの遺伝子型の各々について、個別の信号セットが生成される。クラスタ分析プロットに示されているように、信号２対信号１のデカルト座標系では、そのようなグラフィック表現に示されている各データポイントは、所与の３つの個別の信号セットのうちの１つにおいて座標を有し得る。したがって、各データポイントについて、複数のサンプルの個別の信号セットを、データポイントとしてデータセット内に記憶し得る。そのようなデータセットは、様々なコンピュータ可読媒体に記憶され、後でより詳しく説明するように、分析中または分析後のいずれかに動的に分析され得る。
【0015】
ジェノタイピングデータを視覚化するための方法およびシステムの実施形態の特徴を実証するために使用される、１つのそのようなタイプのアッセイは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）試薬を利用することができ、例えば、限定されないが、後で説明するように、ＦＡＭおよびＶＩＣ色素標識を使用し得る。しかしながら、当業者は、標識用プローブ試薬を含む様々なアッセイを利用して、本教示の方法およびシステムの様々な実施形態に従って分析され得るデータを生成し得ることを認識するであろう。
【0016】
「標識用プローブ」という用語は、一般に、様々な実施形態によれば、典型的には定量分析またはｑＰＣＲ分析、ならびにエンドポイント分析のために、増幅反応に使用される分子を指す。そのような標識用プローブは、標的ポリヌクレオチドの増幅をモニタリングするために使用され得る。いくつかの実施形態において、増幅反応に存在するオリゴヌクレオチド標識用プローブは、時間の関数として生成されるアンプリコン（複数可）の量をモニタリングするのに好適である。そのようなオリゴヌクレオチド標識用プローブには、限定されないが、本明細書に記載の５’－エキソヌクレアーゼアッセイＴａｑＭａｎ（登録商標）標識用プローブ（米国特許第５，５３８，８４８号も参照）、様々なステムループ分子ビーコン（例えば、米国特許第６，１０３，４７６号および同第５，９２５，５１７号、ならびにＴｙａｇｉ ａｎｄ Ｋｒａｍｅｒ，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０３－３０８を参照）、ステムレスまたは線形ビーコン（例えば、ＷＯ９９／２１８８１を参照）、ＰＮＡ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ（商標）（例えば、米国特許第６，３５５，４２１号および同第６，５９３，０９１号を参照）、線形ＰＮＡビーコン（例えば、Ｋｕｂｉｓｔａ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＳＰＩＥ ４２６４：５３－５８を参照）、非ＦＲＥＴ標識用プローブ（例えば、米国特許第６，１５０，０９７号を参照）、Ｓｕｎｒｉｓｅ（登録商標）／Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（登録商標）標識用プローブ（米国特許第６，５４８，２５０号）、ステムループおよびデュプレックスＳｃｏｒｐｉｏｎ（商標）標識用プローブ（Ｓｏｌｉｎａｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９：Ｅ９６および米国特許第６，５８９，７４３号）、バルジループ標識用プローブ（米国特許第６，５９０，０９１号）、疑似ノット標識用プローブ（米国特許第６，５８９，２５０号）、サイクリコン（米国特許第６，３８３，７５２号）、ＭＧＢ Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）プローブ（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヘアピン標識用プローブ（米国特許第６，５９６，４９０号）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ライトアップ標識用プローブ、自己組織化ナノ粒子標識用プローブ、ならびに、例えば米国特許第６，４８５，９０１号、Ｍｈｌａｎｇａ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：４６３－４７１、Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１７：８０４－８０７、Ｉｓａｃｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ．１４：３２１－３２８、Ｓｖａｎｖｉｋ ｅｔ ａｌ．，２０００， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８１：２６－３５、Ｗｏｌｆｆｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７６６：７６９－７７１、Ｔｓｏｕｒｋａｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３０：４２０８－４２１５、Ｒｉｃｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：４０８８－４０９３、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｓｈａｎｇｈａｉ．３４：３２９－３３２、Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９６０６－９６１２、Ｂｒｏｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：２４９－５６、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１５：１１８－１２６、およびＹｕ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ １４：１１１５５－１１１６１に記載されている、フェロセン修飾標識用プローブが含まれる。標識用プローブは、ブラックホールクエンチャー（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、アイオワブラック（ＩＤＴ）、ＱＳＹクエンチャー（分子標識用プローブ）、ならびにＤａｂｓｙｌおよびＤａｂｃｅｌのスルホン酸塩／カルボン酸塩クエンチャー（Ｅｐｏｃｈ）を含むこともできる。標識用プローブは、２つの標識用プローブを含むことができ、例えば、蛍光体が一方のプローブ上にあり、クエンチャーが他方の上にあり、標的上での２つの標識用プローブのハイブリダイゼーションが信号を消光させるか、または標的上でのハイブリダイゼーションが、蛍光の変化を介して信号シグナチャを変化させる。標識用プローブはまた、カルボキシレート基の代わりにスルホン酸基を有するフルオレセイン色素のスルホン酸誘導体、フルオレセインのホスホルアミダイト形態、ＣＹ５のホスホルアミダイト形態（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を含み得る。
【0017】
本明細書で使用される場合、「核酸サンプル」という用語は、本教示による生物学的サンプル中に見出される核酸を指す。サンプルは、侵襲的または非侵襲的に収集され得ることが企図される。サンプルは、繊維、布地、巻きタバコ、チューインガム、接着材料、土壌、または無生物の上に、中に、内部に、それらに由来して存在するか、またはそれらと一緒に見出すことができる。本明細書で使用される場合の「サンプル」は、その最も広い意味で使用され、遺伝子標的または標的ポリヌクレオチドがそれから誘導され得る核酸を含有するサンプルを指す。サンプルは、細胞、細胞から単離された染色体（例えば、ある広がりの中期染色体）、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなどを含むことができる。サンプルは、植物、家畜、家庭用ペット、およびヒトのサンプルを含むがこれらに限定されない、核酸を含有する任意の生物を包含する動物または植物起源のものとすることができ、複数の供給源から誘導することができる。これらの供給源には、全血、毛髪、血液、尿、組織生検、リンパ液、骨、骨髄、歯、羊水、毛髪、皮膚、精液、肛門分泌物、膣分泌物、発汗、唾液、口腔内スワブ、様々な環境サンプル（例えば、農業、水、および土壌）、研究サンプル、精製サンプル、および溶解細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。標的ポリヌクレオチド配列を含有する核酸サンプルは、例えば、機械的力、超音波処理、制限エンドヌクレアーゼ切断などの手順の使用を含む、当技術分野で知られている様々なサンプル調製手順のいずれか、または当技術分野で知られている任意の方法を使用して、サンプルから単離できることが理解されよう。
【0018】
本明細書で使用される場合の「標的ポリヌクレオチド」、「遺伝子標的」などの用語は、本明細書で互換的に使用され、特定の関心対象核酸配列を指す。「標的」は、増幅が求められ、他の核酸分子の存在下で、またはより大きな核酸分子内に存在することができるポリヌクレオチド配列とすることができる。標的ポリヌクレオチドは、任意の供給源から得ることができ、任意の数の異なる組成コンポーネントを含むことができる。例えば、標的は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）とすることができる。標的は、メチル化、非メチル化、またはその両方とすることができる。さらに、特定の関心対象核酸配列のコンテクストで使用される「標的」は、追加的に、その代用物、例えば増幅産物、および天然配列を指すことが理解されよう。いくつかの実施形態では、特定の関心対象核酸配列は、例えば、限定されないが、法医学的サンプル中に見出すことができるような、劣化供給源から誘導される短鎖ＤＮＡ分子である。本教示の特定の関心対象核酸配列は、上記したように、いくつかの生物および供給源のうちのいずれかから誘導することができる。
【0019】
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、単離された核酸分子、ベクターＤＮＡ、および染色体ＤＮＡなど、当技術分野で理解されるような様々な形態のデオキシリボ核酸を指す。「核酸」は、任意の形態のＤＮＡまたはＲＮＡを指す。単離された核酸分子の例には、ベクターに含有される組換えＤＮＡ分子、異種宿主細胞中に維持される組換えＤＮＡ分子、部分的または実質的に精製された核酸分子、および合成ＤＮＡ分子が含まれるが、これらに限定されない。典型的には、「単離された」核酸は、核酸が誘導される生物のゲノムＤＮＡ中で、核酸に自然に隣接する配列（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置する配列）を含まない。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離された」核酸分子は、一般に、組換え技術によって生成される場合には、他の細胞材料もしくは培地を実質的に含まず、または化学合成される場合には、化学的前駆体もしくは他の化学物質を含まない。
【0020】
いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅産物は、例えばＰＣＴ特許出願第ＷＯ２００９／０５９０４９号に記載されているように、ＰＣＲ増幅プライマーにコンジュゲートされた蛍光色素によって検出され得る。ＰＣＲ増幅産物は、増幅産物の染色、例えば銀染色などを含むがこれらに限定されない他の技術によっても検出することができる。
【0021】
いくつかの実施形態では、検出は、装置、すなわち、コンピュータアルゴリズムを、必要ではないが、含むことができる、自動または半自動の検出手段を使用することを含む。いくつかの実施形態では、装置は、携帯型、可搬型であるか、または、例えば増幅産物の検出が行われる実験室、病院、もしくは他の環境にある、可動性もしくは可搬性の低いコンポーネント内に挿入することができる携帯型コンポーネントを含む。特定の実施形態では、検出ステップは、少なくとも１つの増幅ステップ、１つのシーケンシングステップ、１つの単離ステップ、１つの分離ステップ、例えば、限定されないが、少なくとも１つの蛍光スキャナおよび少なくとも１つのグラフ作成、記録、または読み取りコンポーネントを備えるキャピラリー電気泳動装置、吸光度モニタまたは蛍光スキャナおよびグラフレコーダに結合されたクロマトグラフィーカラム、記録および／または検出コンポーネントを備える質量分析計に結合されたクロマトグラフィーカラム、少なくとも１つのＵＶ／可視光スキャナおよび少なくとも１つのグラフ作成、記録、または読み取りコンポーネントを備える分光光度計装置、スキャナまたはＣＣＤカメラなどのデータ記録装置を有するマイクロアレイ、もしくは、少なくとも１つの蛍光スキャナおよび少なくとも１つのグラフ作成、記録、または読み取りコンポーネントを備えるシーケンシング装置、フルオロフォア標識可逆的ターミネーターヌクレオチドを含む、合成によるシーケンシング装置、ＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチドの取り込みに続くピロホスフェート（ＰＰｉ）放出の検出を含むピロシーケンシング法、ペアエンドシーケンシング、ポロニーシーケンシング、単一分子シーケンシング、ナノポアシーケンシング、およびハイブリダイゼーションによるかまたは参照により本明細書に組み込まれるＬｉｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．“Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔｅｎｔｓ ｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００８）１（１）６０－６７に説明されているような連結反応によるシーケンシングから選択される、検出コンポーネントを有するシーケンシング装置、と組み合わされるか、またはそれらの継続部である。
【0022】
特定の実施形態において、検出ステップは、増幅ステップ、例えば、限定されないが、Ｑ－ＰＣＲなどのリアルタイム分析と組み合わされる。検出ステップを実施するための例示的な手段には、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）遺伝子分析装置シリーズ、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＤＮＡ分析装置シリーズ、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）配列検出システム装置シリーズ、およびＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓリアルタイムＰＣＲ装置シリーズ（すべてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）、ならびに、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓマイクロアレイおよびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ１７００化学発光マイクロアレイ分析器などのマイクロアレイおよび関連ソフトウェア、とりわけＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ａｇｉｌｅｎｔ、およびＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能な、他の市販のマイクロアレイおよび分析システム（Ｇｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９２：２５１－６２，１９９９、Ｄｅ Ｂｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｎｅｒｖａ Ｂｉｏｔｅｃ １４：２４７－５２，２００２、およびＳｔｅａｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１４０－４５、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，２００３も参照）、またはビーズアレイプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カリフォルニア州サンディエゴ）が含まれる。例示的なソフトウェアには、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ（商標）ソフトウェア、ＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標）分析ソフトウェア、およびＧｅｎｏｔｙｐｅｒ（登録商標）ソフトウェア（すべてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）が含まれる。
【0023】
いくつかの実施形態において、増幅産物は、アンプリコンの少なくとも一部の質量対電荷比（ｍ／ｚ）に基づいて、検出および定量化することができる。例えば、いくつかの実施形態において、プライマーは、増幅産物に組み込まれ、質量分析計の検出に使用することができる質量タグ、電荷タグ、切断可能部分、または同位体を含むがこれらに限定されない、質量分析適合性レポーター基を含む（例えば、Ｈａｆｆ ａｎｄ Ｓｍｉｒｎｏｖ， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３７４９－５０，１９９７、およびＳａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：ｅ６３，２００３を参照）。増幅産物は、質量分析によって検出することができる。いくつかの実施形態において、プライマーは、検出のために増幅産物の一部の放出を容易にするために、制限酵素部位、切断可能部分などを含む。特定の実施形態において、多数の増幅産物が、液体クロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動によって分離され、ＥＳＩまたはＭＡＬＤＩに供され、そして質量分析によって検出される。質量分析の説明は、その他では、Ｔｈｅ Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｇａｒｙ Ｓｉｕｚｄａｋ， ＭＣＣ Ｐｒｅｓｓ， ２００３に見出すことができる。
【0024】
いくつかの実施形態において、検出することは、手動もしくは視覚的な読み取りもしくは評価、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、検出することは、自動化または半自動化されたデジタルまたはアナログの読み取りを含む。いくつかの実施形態において、検出することは、リアルタイム分析またはエンドポイント分析を含む。いくつかの実施形態において、検出することは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含むがこれに限定されない、マイクロ流体デバイスを含む。いくつかの実施形態において、検出することは、リアルタイム検出装置を含む。例示的なリアルタイム装置には、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７０００配列検出システム、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００配列検出システム、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００リアルタイムＰＣＲシステム、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００リアルタイムＰＣＲシステム、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲシステム（すべてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）システム（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）、Ｍｘ３０００Ｐ（商標）リアルタイムＰＣＲシステム、Ｍｘ３００５Ｐ（商標）リアルタイムＰＣＲシステム、およびＭｘ４０００（登録商標）マルチプレックス定量ＰＣＲシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）、ならびにスマートサイクラーシステム（Ｃｅｐｈｅｉｄ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって販売）が含まれる。リアルタイム装置の説明は、その他では、それぞれの製造業者のユーザズマニュアル、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｄｅｍｉｄｏｖ ａｎｄ Ｂｒｏｕｄｅ，ｅｄｓ．，Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００４、および米国特許第６，８１４，９３４号に見出すことができる。
【0025】
「増幅反応混合物」および／または「マスターミックス」という用語は、標的核酸を増幅するために使用される様々な（いくつかまたはすべての）試薬を含む水溶液を指し得る。かかる反応は、固体支持体または半固体支持体（例えば、アレイ）を使用して実施される場合もある。反応はまた、ユーザによって所望に応じて単独または多重型式で実施され得る。これらの反応は、典型的には、酵素、水性緩衝液、塩、増幅プライマー、標的核酸、およびヌクレオシド三リン酸を含む。いくつかの実施形態において、増幅反応ミックスおよび／またはマスターミックスは、例えば、緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ）、１種以上の塩（例えば、ＭｇＣ、ＫＣｌ）、グリセロール、ｄＮＴＰ（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＵ）、組換えＢＳＡ（仔ウシ血清アルブミン）、色素（例えば、ＲＯＸ受動参照色素）、１種以上の洗剤、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ゼラチン（例えば、魚もしくは仔ウシ源）、および／または消泡剤のうちの１つ以上を含み得る。状況に応じて、混合物は、完全または不完全増幅反応混合物のいずれかであり得る。いくつかの実施形態において、マスターミックスは、増幅反応での使用前に増幅プライマーを含まない。いくつかの他の実施形態において、マスターミックスは、増幅反応における使用の前に、標的核酸を含まない。いくつかの実施形態において、増幅マスターミックスは、増幅プライマーとの接触前に標的核酸試料と混合される。
【0026】
いくつかの実施形態において、増幅反応混合物は、増幅プライマーおよびマスターミックスを含む。いくつかの実施形態において、増幅反応混合物は、増幅プライマー、検出可能に標識されたプローブ、およびマスターミックスを含む。
【0027】
いくつかの実施形態において、増幅プライマーおよびマスターミックスの反応混合物、または増幅プライマー、プローブ、およびマスターミックスの反応混合物は、保管容器または反応容器内で乾燥する。いくつかの実施形態において、増幅プライマーおよびマスターミックスの反応混合物、または増幅プライマー、プローブ、およびマスターミックスの反応混合物は、保管容器または反応容器内で凍結乾燥される。いくつかの実施形態において、本開示は、一般に、単一の対照核酸分子からの複数の標的特異的配列の増幅に関する。例えば、いくつかの実施形態において、その単一の対照核酸分子は、ＲＮＡを含むことができ、他の実施形態において、その単一の対照核酸分子は、ＤＮＡを含むことができる。いくつかの実施形態において、標的特異的プライマーおよびプライマー対は、核酸分子、例えば対照核酸分子の、特定の領域を増幅することができる標的特異的配列である。いくつかの実施形態において、標的特異的プライマーは、ＲＮＡの逆転写をプライミングして、標的特異的ｃＤＮＡを生成することができる。いくつかの実施形態において、標的特異的プライマーは、標的ＤＮＡまたはｃＤＮＡを増幅することができる。いくつかの実施形態において、選択的増幅に必要なＤＮＡの量は、約１ｎｇ～１マイクログラムとすることができる。いくつかの実施形態において、１つ以上の標的配列の選択的増幅に必要なＤＮＡの量は、約１ｎｇ、約５ｎｇ、または約１０ｎｇとすることができる。いくつかの実施形態において、標的配列の選択的増幅に必要なＤＮＡの量は、約１０ｎｇ～約２００ｎｇである。
【0028】
本明細書で使用される場合、「反応容器」という用語は、一般に、本教示に従って反応が起こり得る任意の容器、チャンバ、デバイス、またはアセンブリを指す。いくつかの実施形態において、反応容器は、微小管、例えば、限定されないが、Ｍｉｃｒｏ Ａｍｐ（商標）光学管（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）などの０．２ｍＬもしくは０．５ｍＬ反応管、または微小遠心管、または分子生物学研究所で一般的に実用化されている種類の他の容器であり得る。いくつかの実施形態において、反応容器は、（４８、９６、または３８４ウェルマイクロタイタープレートなどの）マルチウェルプレートのウェル、スライドガラス上のスポット、ＴａｑＭａｎ（商標）アレイカード内のウェル、またはＴａｑＭａｎ（商標）低密度アレイを含むがこれに限定されない、マイクロ流体デバイスのチャネルもしくはチャンバ、またはＴａｑＭａｎ（商標）ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）リアルタイムＰＣＲプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の貫通孔を含み得る。例えば、限定ではないが、複数の反応容器が、同じ支持体上に存在することができる。ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）プレートは、例えば、反応プレート３０７２貫通孔である。かかるプレート内のかかる各貫通孔は、単一のＴａｑＭａｎ（商標）アッセイを含有し得る。いくつかの実施形態において、例えばＣａｌｉｐｅｒまたはＦｌｕｉｄｉｇｍから入手可能なラボオンチップ様デバイスが、反応容器を提供することができる。様々な反応容器が、市販されているか、または本教示に関連して使用するために設計できることが認識されるであろう。
【0029】
「ハイブリダイズする」および「アニールする」という基語の変形を含むがこれらに限定されない、「アニールすること」および「ハイブリダイズすること」という用語は、互換的に使用され、二本鎖、三本鎖、または他のより高次の構造の形成をもたらす、１つの核酸の、別の核酸とのヌクレオチド塩基対合相互作用を意味する。一次相互作用は、典型的には、ヌクレオチド塩基特異的であり、例えば、ワトソン・クリックおよびフーグスティーン型水素結合による、Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、およびＧ：Ｃである。特定の実施形態において、塩基積み重ねおよび疎水性相互作用も、二本鎖の安定性に寄与し得る。プライマーおよびプローブが相補的配列にアニールする条件は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５）およびＷｅｔｍｕｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：３４９（１９６８）に記載されている。
【0030】
概して、かかるアニーリングが行われるかは、とりわけ、標的隣接配列および／もしくはアンプリコン中のプライマーの相補的部分の相補的部分およびそれらの対応する結合部位、またはレポータープローブの対応する相補的部分およびその結合部位の長さ、ｐＨ、温度、一価および二価陽イオンの存在、ハイブリダイズしている領域内のＧヌクレオチドとＣヌクレオチドの割合、培地の粘度、ならびに変性剤の存在によって影響される。かかる可変要素は、ハイブリダイゼーションに必要な時間に影響を及ぼす。したがって、好ましいアニーリング条件は、特定の用途に依存するであろう。しかしながら、かかる条件は、過度の実験なしに、当業者が日常的に決定することができる。好ましくは、アニーリング条件は、プライマーおよび／またはプローブが、対応する標的隣接配列またはアンプリコン中の相補的配列と選択的にハイブリダイズするが、第２の反応温度で反応組成物中の異なる標的核酸または非標的配列に著しい程度にハイブリダイズしないことを可能にするように選択される。
【0031】
図３は、ｑＰＣＲ装置内に装填される前の反応プレート３０８のためのプレート調製３００を示す。反応プレート３０８は、複数のサブアレイを備え、各サブアレイ３１４は、複数のスルーアレイ貫通孔３０６を備える。各貫通孔は、アッセイ３１８の反応位置として機能し得る。いくつかの構成において、反応プレート３０８は、４８個のサブアレイを備え、各サブアレイは、３３ｎＬの反応容量を各々が保持できる６４個の貫通孔を備える。前述の構成において、反応プレート３０８は、３０７２個の貫通孔を備える。
【0032】
反応プレート３０８の構成に応じて、アレイ貫通孔３０６のいくつかは、それらの中に配置されたアッセイ３１８を含むであろう。各貫通孔は、アッセイ３１８が配置され得る親水性内部を備える。親水性貫通孔は、反応を封じ込める疎水性の表面にも囲まれている。
【0033】
設定量を各所望のアレイ貫通孔３０６に正確に装填するために、サンプル装填装置３０２が利用される。サンプル装填装置３０２は、設定量のサンプル混合物３１２を、反応プレート３０８の各所望の貫通孔にアリコートする。いくつかの構成において、チップブロック３１６が、サンプル装填装置３０２によって利用されて、プライマー３２４およびポリメラーゼ３２６の反応ミックス３２８を含むサンプル混合物３１２を反応プレート３０８の貫通孔内に分注する。
【0034】
サンプル装填装置３０２が動作されると、チップブロック３１６は、反応プレート３０８を横切って動き、設定量のサンプル混合物３１２が特定のアレイ貫通孔３０６に送達されることを可能にし得る。サンプル装填装置３０２がその実行を完了すると、反応プレート３０８は、装填済反応プレート３１０に変換され、ここで、複数のサブアレイ、例えばサブアレイ３２２は、標的ポリヌクレオチド配列３２０を含む装填済貫通孔３０４を備える。
【0035】
図４を参照すると、ジェノタイピングシステム４００は、ｑＰＣＲシステム４０２および学習システム４０４を備える。学習システム４０４は、サポートベクターマシン４０６、データ記憶システム４０８、人間分類器４１０、標識データセット４１２、および分類モデル４１４をさらに備える。
【0036】
ｑＰＣＲシステム４０２は、ｑＰＣＲシステム２００の一実施形態であり得る。ｑＰＣＲシステム４０２は、ＦＡＭ（登録商標）およびＶＩＣ（登録商標）蛍光色素の強度を含む信号を生成する。次いで、この強度のベクターは、学習システム４０４、サポートベクターマシン４０６およびデータ記憶システム４０８の両方へ送信される。ベクターは、重心最小クラスタ分離シグマ（ＭＣＳＳ）クラスタの数、アッセイアドレス、ＭＣＳＳ値などの値でさらに拡張され得る。
【0037】
サポートベクターマシン４０６は、ｑＰＣＲシステム４０２からデータベクターを受信する。サポートベクターマシン４０６は、最小値－最大値スケーリングまたはＺスコア正規化を利用することによって、入力生データベクターを正規化し得る。次いで、サポートベクターマシン４０６は、分類モデル４１４からモデルを選択し得る。モデルは、ＳＶＭ線形、多項式、および放射型分類器（ＲＢＦ）カーネルから選択され得る。ＲＢＦカーネルは、次のようであり得る：
ここで、ｘは、データベクターであり、γは、調整可能パラメータである。モデルはまた、ハードマージンまたはソフトマージンを有し得る。ソフトマージンは、次のようであり得る：
ここで、ｗおよびｂは、超平面のパラメータであり、ｘnは、データベクターであり、ｙnは、ｉ番目の標的であり、ζは、スラック変数であり、Ｃは、調整可能パラメータである。各モデルはまた、ハイパーパラメータのセットを有し得る。例えば、ＲＢＦカーネルを利用するモデルは、１０～１０００の値など、関連γ値を有し得る。追加的に、ソフトマージンを利用するモデルは、０．０１～３０の値など、関連Ｃ値を有し得る。パラメータは、動作効率と精度との間のバランスをとるように選択され得る。選択されたモデルは、例えば、０．３のＣ値および３００のγ値を有し得る。サポートベクターマシン４０６は、選択されたモデルを利用して、データベクターの遺伝子型予測を決定する。データセットは３つのクラスを含むので、１つ対残り（ＯｖＲ）戦略を利用して、新しいインスタンスの遺伝子型を割り当てる。この戦略は、クラス（ここでは、３つのクラス）ごとに１つの分類器を利用する。次いで、各分類器は、入力データベクターについて動作し、例えば、１つの分類器は「１１」状態用、１つは「１２」状態用、１つは「２２」状態用である。サポートベクターマシン４０６は、各分類器の出力に基づいて、「１１」状態、「１２」状態、および「２２」状態の間で選択し得る。次いで、決定された分類が出力される。
【数1】
【数2】
【0038】
データ記憶システム４０８は、ｑＰＣＲシステム４０２からのデータ出力を記憶する。データ記憶システム４０８は、モデルをトレーニングするために利用される履歴データを、モデルがトレーニングされた後にｑＰＣＲシステム４０２によって生成される追加データとともに、記憶し得る。新しいモデルが、データ記憶システム４０８に記憶された更新データセットから生成され得る。データ記憶システム４０８は、２つ以上のｑＰＣＲシステム４０２からのデータをさらに記憶し得る。
【0039】
人間分類器４１０は、データ記憶システム４０８に記憶されたデータに標識を適用して、標識データセット４１２を生成する。標識は、「１１」状態、「１２」状態、および「２２」状態を含む。次いで、標識データセット４１２を利用して、各分類モデル４１４をトレーニングする。
【0040】
分類モデル４１４は、ｑＰＣＲシステム４０２の動作に影響を及ぼし得る。分類モデル４１４は、他の分類モデル４１４とは異なる入力セットを利用し得る。次いで、選択された分類モデル４１４は、ｑＰＣＲシステム４０２からの出力データベクターを決定し得る。各分類モデル４１４は、多数派遺伝子型（ＭＧ）および遺伝子型一致（ＧＣ）を含み得る標識データセット４１２を受信することによってトレーニングされ得る。ＭＧは、一対のアッセイ－サンプル組み合わせが与えられたとして、最高頻度を有する遺伝子型である。生物学的に、ｑＰＣＲ反応の遺伝子型は一貫し得るので、ＭＧ＝ｍａｘ（Ｇ１１、Ｇ１２、Ｇ２２）であり、ここで、Ｇ１１、Ｇ１２、およびＧ２２は、ホモ接合体（Ｇ１１およびＧ２２）ならびにヘテロ接合体（Ｇ１２）の遺伝子型頻度である。ＧＣは、履歴データ内の多数派遺伝子型のインスタンス数をｑＰＣＲ反応（アッセイ－サンプル対）の総数で割ったパーセンテージであり、ＧＣ＝１００＊（ＭＧインスタンス／総インスタンス数）である。不合格のｑＰＣＲ反応は、約５０万のインスタンスからなる記憶データセット（別名、不良インスタンス）から抽出され、次いで、過去に不合格となったことのない別の５０万のインスタンス（良好インスタンス）がランダムに選択される。これは、トレーニングおよびテストに利用される入力データである。各分類モデル４１４は、３つの分類器を含み得る。各分類器は、標識データセット４１２を２つのカテゴリ、つまりクラスの一部か、またはクラスの一部ではないかに分割するための超平面（ｗおよびｂ値）を決定する。例えば、第１の分類器は、データベクターが「１１」であるか、または「１１」でないかを決定する。第２の分類器は、データベクターが「１２」であるか、または「１２」でないかを決定する。第３の分類器は、データベクターが「２２」であるか、または「２２」でないかを決定する。既存の（ベースライン）ジェノタイピングとＳＶＭベースのジェノタイピングとの間の精度が比較される。モデルの結果は、統計的有意性の観点から、同様、より良い、より悪いの３つのカテゴリのうちの１つになり得る。「最良」の予測モデルは、グリッド検索を利用した後、ＳＶＭのカーネルおよびパラメータの観点から決定される。一旦モデルが「最良」であると決定されると、その堅牢性が、４分割交差検証によって検証される。入力データセットは、４つのグループに分割される。次いで、モデルは、３つのグループで再トレーニングされ、４つのグループを用いてテストされる。これが、４回行われ、各グループは、１回はテストグループになる。トレーニング結果は、ＳＶＭベースのアルゴリズムが、同じデータセットに基づき、従来のモデルよりも少なくとも約２０％高い精度を予測することを示す。結果はまた、ＳＶＭ－ＲＢＦが、既存のものが遺伝子型予測を行うことができない、１クラスタまたは２クラスタのデータを救済できることも示す。加えて、ＳＶＭベースのアルゴリズムは、従来のアルゴリズムによってタグ付けされた、余計な低ＲＯＸのインスタンスのうちの５０％を超えるものを救済する。
【0041】
場合によっては、生データは、ｑＰＣＲシステムの動作からの生画像データを含む。生画像データは、ｑＰＣＲシステムの動作中にイメージセンサによって生成されたピクセル値のアレイを含む。
【0042】
図５を参照すると、放射型アルゴリズム５００は、テストおよびトレーニングデータを受信する（ブロック５０２）。次いで、テストおよびトレーニングデータが正規化される（ブロック５０４）。最小値－最大値スケーリングまたはＺスコア正規化を利用し得る。特定のカーネルが選択される（ブロック５０６）。カーネルは、線形、多項式、および放射型分類器（ＲＢＦ）カーネルを含み得る。次いで、カーネルのパラメータ範囲が決定される（ブロック５０８）。例えば、ＲＢＦカーネルの場合、γ値は、１０～１０００の範囲であり得る。次いで、放射型アルゴリズム５００は、ＳＶＭがハードマージンを有するか、またはソフトマージンを有するかを決定する（決定ブロック５１０）。マージンがソフトである場合、スラックペナルティ変数Ｃの範囲が決定される（ブロック５１２）。例えば、範囲は、０．０１～３０であり得る。一旦Ｃの範囲が決定されるか、またはマージンがハードである場合、グリッド検索が、トレーニングデータセットのパラメータの範囲（複数可）に対して実施される（ブロック５１４）。グリッド検索は、パラメータの範囲をパラメータの特定の組み合わせに変換し得る。例えば、前述の範囲のグリッド値は、Ｃ＝０．０１、γ＝１０、Ｃ＝３、γ＝１０ｏ、およびＣ＝３０、γ＝１０００であり得る。他の値を利用してもよい。次いで、テストデータを利用して、グリッド検索によって生成されたモデルをテストし、モデルパラメータを選択し得る（ブロック５１６）。モデルは、動作効率、精度、確度などに基づいて選択され得る。次いで、選択されたモデルは、４分割交差検証法を利用して検証される（ブロック５１８）。テストおよびトレーニングデータは、４つのグループに分割され得る。３つのグループを利用して、選択されたパラメータを利用するモデルを再トレーニングする。次いで、第４のグループを利用して、結果として得られたモデルをテストする。これが、４回実施され、各グループは、１回は「テスト」グループとなる。モデルは、異なるデータセットでトレーニングできる能力について評価される。
【0043】
図６を参照すると、ＳＶＭ ｑＰＣＲアッセイモデル６００は、入力データベクターを受信する（ブロック６０２）。入力データベクターは、ＦＡＭ（登録商標）およびＶＩＣ（登録商標）蛍光色素の強度、ならびにいくつかの実施形態において、重心最小クラスタ分離シグマ（ＭＣＳＳ）クラスタの数、アッセイアドレス、ＭＣＳＳ値などの値を含む他の情報を含む、ｑＰＣＲシステムからの出力であり得る。次いで、入力データベクターは、正規化される（ブロック６０４）。最小値－最大値スケーリングまたはＺスコアの正規化を利用してもよい。ＳＶＭ ｑＰＣＲアッセイモデル６００は、モデルをトレーニングするために利用される正規化方法を決定し、同じ方法を利用し得る。決定されたパラメータを有するカーネルが、入力データベクターに適用される（ブロック６０６）。これにより、正規化された入力が、トレーニング済モデルに適切な次元の空間に変換され得る。超平面が、変換された入力データベクターに適用されて、符号（すなわち、分類）が決定される（ブロック６０８）。３つ以上の分類が存在するので、複数の分類器（超平面）が利用され得る。分類ごとに１つの超平面が利用され得る。各超平面／分類器は、入力データベクターがその分類を有するか、またはその分類を有さないかをそれぞれ示す、符号「＋１」または「－１」を返す。ただ１つの「＋１」を有する入力データベクターには、その分類が与えられ得る。ブロック６０６およびブロック６０８には、以下を利用し得る。
ここで、φは、入力データベクターに対するカーネル変換であり、ｗおよびｂは、モデルのトレーニング中に決定されたモデルに対する超平面のパラメータである。ここでは、３つの分類が存在するので、３つの超平面が存在する。
【数3】
【0044】
図７は、１つの実施形態によるクラウド学習および制御システム７００を示す。クラウド学習および制御システム７００は、学習システム４０４、例えば本明細書に開示される実施形態のうちの１つ以上を備える、クラウド分析システム７１０を備える。いくつかのＰＣＲ実行または他の実験（例えば、ＰＣＲラボ装置７０４、ＰＣＲラボ装置７０６、およびＰＣＲラボ装置７０８）からの実験データは、インターネット７０２または他のネットワークを介して、クラウド分析システム７１０によってモニタリングされる。クラウド分析システム７１０は、実験データを処理し、学習された構成パラメータを、現在または将来の実験のために構成設定ＰＣＲ装置を調整するためのフィードバックとして提供する。
【0045】
図８は、本発明の実施形態を組み込み得るコンピューティングデバイス８００の例示的なブロック図である。図８は、本明細書に記載の技術的プロセスの態様を実行するための機械システムの単なる例示であり、特許請求の範囲を限定するものではない。当業者は、他の変形、修正、および代替を認識するであろう。１つの実施形態において、コンピューティングデバイス８００は、典型的には、モニタまたはグラフィカルユーザインターフェース８０２、データ処理システム８２０、通信ネットワークインターフェース８１２、入力デバイス（複数可）８０８、出力デバイス（複数可）８０６などを含む。
【0046】
図８に示されるように、データ処理システム８２０は、バスサブシステム８１８を介していくつかの周辺デバイスと通信する１つ以上のプロセッサ（複数可）８０４を含み得る。これらの周辺デバイスには、入力デバイス（複数可）８０８、出力デバイス（複数可）８０６、通信ネットワークインターフェース８１２、ならびに揮発性メモリ８１０および不揮発性メモリ８１４などの記憶サブシステムが含まれ得る。
【0047】
揮発性メモリ８１０および／または不揮発性メモリ８１４は、コンピュータ実行可能命令を記憶することができ、したがって、プロセッサ（複数可）８０４に適用されそれによって実行されると、本明細書に開示される分析および制御プロセスの実施形態を実装するロジック８２２を形成する。
【0048】
入力デバイス（複数可）８０８は、データ処理システム８２０に情報を入力するためのデバイスおよびメカニズムを含む。これらには、キーボード、キーパッド、モニタまたはグラフィカルユーザインターフェース８０２に組み込まれたタッチスクリーン、音声認識システムなどの音声入力デバイス、マイクロフォン、および他のタイプの入力デバイスが含まれ得る。様々な実施形態において、入力デバイス（複数可）８０８は、コンピュータマウス、トラックボール、トラックパッド、ジョイスティック、ワイヤレスリモート、描画タブレット、音声コマンドシステム、視線追跡システムなどとして具現化され得る。入力デバイス（複数可）８０８は、典型的には、ユーザが、モニタまたはグラフィカルユーザインターフェース８０２上に現れるオブジェクト、アイコン、制御領域、テキストなどを、ボタンのクリックなどのコマンドを介して、選択することを可能にする。
【0049】
出力デバイス（複数可）８０６は、データ処理システム８２０から情報を出力するためのデバイスおよびメカニズムを含む。これらには、当技術分野でよく理解されているように、モニタまたはグラフィカルユーザインターフェース８０２、スピーカ、プリンタ、赤外線ＬＥＤなどが含まれ得る。
【0050】
通信ネットワークインターフェース８１２は、通信ネットワーク（例えば、通信ネットワーク８１６）およびデータ処理システム８２０の外部のデバイスへのインターフェースを提供する。通信ネットワークインターフェース８１２は、他のシステムからデータを受信し、他のシステムにデータを送るためのインターフェースとして機能し得る。通信ネットワークインターフェース８１２の実施形態には、イーサネットインターフェース、モデム（電話、衛星、ケーブル、ＩＳＤＮ）、（非同期）デジタル加入者線（ＤＳＬ）、ＦｉｒｅＷｉｒｅ、ＵＳＢ、ＢｌｕｅｔｏｏｔｈまたはＷｉ－Ｆｉなどの無線通信インターフェース、近距離通信無線インターフェース、携帯電話インターフェースなどが含まれ得る。
【0051】
通信ネットワークインターフェース８１２は、アンテナ、ケーブルなどを介して通信ネットワーク８１６に結合され得る。いくつかの実施形態において、通信ネットワークインターフェース８１２は、データ処理システム８２０の回路基板上に物理的に統合され得るか、または場合によっては、「ソフトモデム」などのソフトウェアもしくはファームウェアなどで実装され得る。
【0052】
コンピューティングデバイス８００は、ＨＴＴＰ、ＴＣＰ／ＩＰ、ＲＴＰ／ＲＴＳＰ、ＩＰＸ、ＵＤＰなどのプロトコルを使用して、ネットワークを介した通信を可能にするロジックを含み得る。
【0053】
揮発性メモリ８１０および不揮発性メモリ８１４は、本明細書に記載のプロセスの様々な実施形態を実装するためのコンピュータ可読データおよび命令を記憶するように構成された有形媒体の例である。他のタイプの有形媒体には、リムーバブルメモリ（例えば、プラグイン式ＵＳＢメモリデバイス、モバイルデバイスＳＩＭカード）、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤなどの光記憶媒体、フラッシュメモリなどの半導体メモリ、非一時的な読み取り専用メモリ（ＲＯＭＳ）、バッテリバックアップされた揮発性メモリ、ネットワーク化された記憶デバイスなどが含まれる。揮発性メモリ８１０および不揮発性メモリ８１４は、開示されたプロセスと、本発明の範囲内にある、それらの他の実施形態との機能を提供する、基本的なプログラミングおよびデータ構成を記憶するように構成され得る。
【0054】
本発明の実施形態を実装するロジック８２２は、揮発性メモリ８１０および／または不揮発性メモリ８１４によって具現化され得る。当該ロジック８２２の命令は、揮発性メモリ８１０および／または不揮発性メモリ８１４から読み取られ、プロセッサ（複数可）８０４によって実行され得る。揮発性メモリ８１０および不揮発性メモリ８１４はまた、ロジック８２２によって使用されるデータを記憶するための保存場所を提供し得る。
【0055】
揮発性メモリ８１０および不揮発性メモリ８１４は、プログラム実行中に命令およびデータを記憶するための主ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）と、読み取り専用の非一時的命令が記憶されている読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）と、を含む、いくつかのメモリを含み得る。揮発性メモリ８１０および不揮発性メモリ８１４は、プログラムおよびデータファイルのための永続的（不揮発性）記憶装置を提供するファイル記憶サブシステムを含み得る。揮発性メモリ８１０および不揮発性メモリ８１４は、リムーバブルフラッシュメモリなどのリムーバブル記憶システムを含み得る。
【0056】
バスサブシステム８１８は、データ処理システム８２０の様々なコンポーネントおよびサブシステムが意図されたように互いに通信することを可能にするためのメカニズムを提供する。通信ネットワークインターフェース８１２は、単一バスとして概略的に示されているが、バスサブシステム８１８のいくつかの実施形態は、複数の別個のバスを利用し得る。
【0057】
コンピューティングデバイス８００が、スマートフォン、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、ラックマウント型コンピュータシステム、コンピュータサーバ、またはタブレットコンピュータデバイスなどのデバイスであり得ることは、当業者には容易に明らかであろう。当技術分野で一般に知られているように、コンピューティングデバイス８００は、複数のネットワーク化されたコンピューティングデバイスの集合として実装され得る。さらに、コンピューティングデバイス８００は、典型的には、そのタイプおよび性質が当技術分野で周知のオペレーティングシステムロジック（図示せず）を含むであろう。
【0058】
追加の用語および解釈
本明細書で使用される用語は、関連技術におけるそれらの通常の意味、または文脈におけるそれらの使用によって示される意味を与えられるべきであるが、明示的な定義が提供される場合、その意味が制御する。
本明細書で使用される用語は、関連技術におけるそれらの通常の意味、または文脈におけるそれらの使用によって示される意味を与えられるべきであるが、明示的な定義が提供される場合、その意味が制御する。
【0059】
「カーネル」は、高次元の暗黙的な特徴空間内で、その空間におけるデータの座標を計算することなく、むしろ特徴空間内のすべてのデータ対の射影間の内積を計算するだけで動作する、カーネル関数を指す。この動作は、多くの場合、座標の明示的な計算よりも計算コストが低くなる。ＳＶＭで使用する場合、このアプローチは、「カーネルトリック」と呼ばれる。
【0060】
「サポートベクターマシン」は、分類および回帰分析に使用されるデータを分析する関連学習アルゴリズムを有する教師あり学習モデルを指す。２つのカテゴリのうちの一方または他方に属すると各々がマークされたトレーニング例のセットが与えられると、ＳＶＭトレーニングアルゴリズムは、新しい例を一方または他方のカテゴリに割り当てるモデルを構築し、それを非確率的バイナリ線形分類器とする。ＳＶＭモデルは、個別のカテゴリの例が可能な限り広い明確なギャップによって分割されるようにマッピングされた、空間内の点としての例の表現である。次いで、新しい例が、同じ空間内にマッピングされ、それらがギャップのどちら側にあるかに基づいて、あるカテゴリに属すると予測される。線形分類を実施することに加えて、ＳＶＭは、いわゆるカーネルトリックを使用して非線形分類を効率的に実施し、入力を高次元の特徴空間内に暗黙的にマッピングすることができる。
【0061】
本明細書における「回路」は、少なくとも１つの個別の電気回路を有する電気回路、少なくとも１つの集積回路を有する電気回路、少なくとも１つの用途固有の集積回路を有する電気回路、コンピュータプログラムによって構成される汎用コンピューティングデバイス（例えば、本明細書に記載のプロセスもしくはデバイスを少なくとも部分的に実行するコンピュータプログラムによって構成される汎用コンピュータ、または本明細書に記載のプロセスもしくはデバイスを少なくとも部分的に実行するコンピュータプログラムによって構成されるマイクロプロセッサ）を形成する回路、メモリデバイスを形成する回路（例えば、ランダムアクセスメモリの形式）、または通信デバイス（例えば、モデム、通信スイッチ、または光電気機器）を形成する回路を指す。
【0062】
本明細書における「ファームウェア」は、読み取り専用メモリまたは媒体に記憶されたプロセッサ実行可能命令として具現化されたソフトウェアロジックを指す。
【0063】
本明細書における「ハードウェア」は、アナログまたはデジタル回路として具現化されたロジックを指す。
【0064】
本明細書における「ロジック」は、制御および／または手順信号、および／または設定および値（例えば、抵抗、インピーダンス、静電容量、インダクタンス、電流／電圧定格など）を備える、その材料および／または材料エネルギー構成経由の、デバイスの動作に影響を与えるように、適用され得る、機械メモリ回路、非一時的機械可読媒体、および／または回路を指す。磁気媒体、電子回路、電気および光メモリ（揮発性および不揮発性の両方）、ならびにファームウェアは、ロジックの例である。ロジックは、具体的には、純粋な信号またはソフトウェア自体を除外する（しかしながら、ソフトウェアを含み、それによって事柄の構成を形成するマシンメモリは除外しない）。
【0065】
本明細書における「ソフトウェア」は、マシンメモリ内のプロセッサ実行可能命令（例えば、揮発性または不揮発性メモリまたは媒体を読み取る／書き込む）として実装されるロジックを指す。
【0066】
本明細書において、「１つの実施形態」または「一実施形態」への言及は、そういう場合もあるが、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らない。文脈が明確に別様に要求しない限り、説明および特許請求の範囲全体を通して、「備える」、「備えている」などの語は、排他的または網羅的な意味ではなく、包括的な意味、つまり、「含むがこれに限定されない」という意味で解釈されるべきである。単数形または複数形を使用する語は、明示的に単一のものまたは複数のものに限定されない限り、それぞれ複数形または単数形も含む。追加的に、「本明細書に」、「上記に」、「以下に」という語および同様の意味の語は、本出願で使用される場合、本出願を全体として指し、本出願のいかなる特定の部分を指すものではない。請求項が２つ以上の項目の列挙を参照して「または」という語を使用する場合、その語は、明示的に一方または他方に限定されない限り、以下の解釈のすべてを網羅する：列挙内の項目のうちのいずれか、列挙内の項目のすべて、および列挙内の項目の任意の組み合わせ。本明細書で明示的に定義されていない任意の用語は、関連技術の当業者（複数可）によって一般的に理解されるような従来の意味を有する。
【0067】
本明細書に記載の様々な論理機能動作は、動作または機能を反映する名詞または名詞句を使用して参照されるロジックで実装され得る。例えば、関連付け動作は、「アソシエータ」または「コレレータ」によって実行され得る。同様に、スイッチングは、「スイッチ」によって、選択は「セレクタ」によって実行され得るなどとなり得る。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
