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特許7308380遺伝子編集技術を用いたインビトロ部位特異的変異導入のための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-07-06
(45)【発行日】2023-07-14
(54)【発明の名称】遺伝子編集技術を用いたインビトロ部位特異的変異導入のための方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20230707BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N15/09 ZNA
【請求項の数】
22
(21)【出願番号】P 2019557536
(86)(22)【出願日】2018-01-09
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-02-06
(86)【国際出願番号】 US2018013009
(87)【国際公開番号】W WO2018132390
(87)【国際公開日】2018-07-19
【審査請求日】2020-12-22
(31)【優先権主張番号】62/444,629
(32)【優先日】2017-01-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/514,494
(32)【優先日】2017-06-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/533,170
(32)【優先日】2017-07-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】523199483
【氏名又は名称】クリスティアーナ ケア ジーン エディティング インスティテュート，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(73)【特許権者】
【識別番号】515195554
【氏名又は名称】エフ．オー．アール．イー バイオセラピューティクス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】クミエック，エリック，ブライアン
(72)【発明者】
【氏名】ヴィドネ，マイケル
(72)【発明者】
【氏名】ターシック，ガビ
(72)【発明者】
【氏名】サンズベリー，ブレット
【審査官】田中 晴絵
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２００３／０１９９０９１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】J Genet Genomics，2015年，42(8)，413-421
【文献】PLOS ONE，2017年01月04日，12(1)，e0169350
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的配列のインビトロ変異導入を実施するための方法であって、単離リボヌクレオチド粒子（ＲＮＰ）と第１のプラスミドとオリゴヌクレオチドと遺伝子を編集するための酵素活性を有する細胞抽出物とを含む混合物をインキュベートするステップであって、
前記ＲＮＰは、前記標的配列に対して相補的であるｃｒＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼを含み、
前記第１のプラスミドは、前記標的配列のヌクレオチド配列を含み、
前記オリゴヌクレオチドは、前記標的配列に対して相補的であるが少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドを含む、ヌクレオチド配列を含み、
従って変異した第２のプラスミドを生じさせる、
ステップと；
複数の細胞に前記第２のプラスミドを与えるステップと；
を含む方法。
【請求項2】
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｃｐｆ１、Ｃｐｆ２、ＣａｓＹ、およびＣａｓＸからなる群より選択される；または前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ｓｐＣａｓ９またはｓａＣａｓ９である；
請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＲＮＰは、ｔｒａｃｒＲＮＡをさらに含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡおよび前記ｃｒＲＮＡを単一のＲＮＡコンストラクトが含む、
請求項３に記載の方法。
【請求項5】
各オリゴヌクレオチドは、独立的に、２５～２００塩基長である；または各オリゴヌクレオチドは、独立的に、７２塩基長である、
請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記インビトロ変異導入は、一塩基ヌクレオチド改変、欠失および挿入からなる群より選択される、前記標的配列のヌクレオチド配列における少なくとも１つの変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
各オリゴヌクレオチドは、独立的に、化学修飾された末端連結をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記細胞抽出物は、全細胞抽出物、無細胞抽出物、核抽出物、および細胞質抽出物からなる群より選択される；または前記細胞抽出物は、真核細胞抽出物である；請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記真核細胞抽出物は、哺乳動物細胞抽出物であるか、またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来する、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記哺乳動物細胞抽出物は、ＨＥＫ、ＨＵＨ－７、ＤＬＤ１、およびＨＣＴ１１６からなる群より選択される少なくとも１種の細胞に由来する、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
（ａ）前記混合物が、（ｉ）複数のＲＮＰであって、各ＲＮＰが、前記複数のＲＮＰの他のＲＮＰのｃｒＲＮＡと比較して異なる標的配列に対して相補的であるｃｒＲＮＡを含む、複数のＲＮＰと、（ｉｉ）複数のオリゴヌクレオチドであって、各オリゴヌクレオチドが、前記複数のオリゴヌクレオチドの他のオリゴヌクレオチドと比較して異なる標的配列に対して相補的であるがその異なる標的配列と比較して少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドを含む、ヌクレオチド配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドと、を含み；（ｂ）複数の第２のプラスミドが生成され；
（ｃ）前記複数の第２のプラスミドが前記複数の細胞に与えられ；
（ｄ）インビトロ変異導入が前記異なる標的配列において生じる；または
前記第１のプラスミドが、前記異なる標的配列のヌクレオチド配列を１つ以上含む；または
複数のプラスミドをさらに含み、各プラスミドが、前記異なる標的配列のヌクレオチド配列を１つ以上含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項12】
第２の標的配列に対して相補的である第２のｃｒＲＮＡを含む第２のＲＮＰをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
単離リボヌクレオチド粒子（ＲＮＰ）とオリゴヌクレオチドとプラスミドと遺伝子を編集するための酵素活性を有する細胞抽出物とを含む、標的配列のためのインビトロ変異導入キットであって、前記ＲＮＰは、前記標的配列に対して相補的であるｃｒＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼを含み、
前記プラスミドは、前記標的配列のヌクレオチド配列を含み、
前記オリゴヌクレオチドは、前記標的配列に対して相補的であるが前記標的配列に関する少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドをその中に含む、ヌクレオチド配列を含む、
キット。
【請求項14】
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｃｐｆ１、Ｃｐｆ２、ＣａｓＹ、およびＣａｓＸからなる群より選択される；または
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ｓｐＣａｓ９またはｓａＣａｓ９である；
請求項１３に記載のキット。
【請求項15】
第２の標的配列に対して相補的な第２のｃｒＲＮＡを含む第２のＲＮＰをさらに含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項16】
前記ＲＮＰがｔｒａｃｒＲＮＡをさらに含む、
請求項１３に記載のキット。
【請求項17】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡおよび前記ｃｒＲＮＡを単一のＲＮＡコンストラクトが含む、
請求項１６に記載のキット。
【請求項18】
各オリゴヌクレオチドは、独立的に、２５～２００塩基長である；または各オリゴヌクレオチドは、独立的に、７２塩基長である；
請求項１３に記載のキット。
【請求項19】
各オリゴヌクレオチドは、独立的に、化学修飾された末端連結をさらに含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項20】
前記細胞抽出物は、全細胞抽出物、無細胞抽出物、核抽出物、および細胞質抽出物からなる群より選択される；または前記細胞抽出物は、真核細胞抽出物である；
請求項１３に記載のキット。
【請求項21】
前記真核細胞抽出物は、哺乳動物細胞抽出物であるか、またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来する、請求項２０に記載のキット。
【請求項22】
前記哺乳動物細胞抽出物は、ＨＥＫ、ＨＵＨ－７、ＤＬＤ１、およびＨＣＴ１１６からなる群より選択される少なくとも１種の細胞に由来する、請求項２１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／４４４，６２９号、２０１７年６月２日に出願された米国仮特許出願第６２／５１４，４９４号および２０１７年７月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／５３３，１７０号に対する合衆国法典第３５編第１１９条（ｅ）に基づく優先権を主張し、これらの仮特許出願は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１７年１月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／４４４，６２９号、２０１７年６月２日に出願された米国仮特許出願第６２／５１４，４９４号および２０１７年７月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／５３３，１７０号に対する合衆国法典第３５編第１１９条（ｅ）に基づく優先権を主張し、これらの仮特許出願は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
積み重なる証拠は、個々の患者のそれぞれにおける病理学的に同一の癌の増殖が、ドライバー変異（driving mutations）の種々のセットによって促進される、ということを示す。これらのドライバーを特定する必要性は、治療の調整および将来的な監視のスケジューリングの、認識された必要性から生じる。患者の診断における主な進歩は、癌を引き起こす変異を特定するための次世代シーケンシングの使用である。しかし、患者の変異の機能的特徴付けおよび異なる標的化治療薬に対するそれらの感受性が要求される。
【0003】
この問題に対処するための１つの可能な方法は、トランスフェクトされた細胞を利用したアッセイによってシグナル伝達経路の活性レベルを監視することである。機能的プラットフォームとして、この系は、変異のタイプに関係なく（すなわち、それが既知の変異であるか意義の不明なバリアント（Variant of Unknown Significance）（ＶＵＳ）であるかにかかわらず）、活性化された経路を明らかにする。このプロセスの中心的なステップは、その後にアッセイで試験される生細胞で直ちに発現させることができるプラスミド中に患者の変異を合成することである。現在、自動化されたロバストな様式で変異を生じさせるためのインビトロのツールは不足している。その代わりに、ＰＣＲに基づく部位特異的変異導入が用いられるが、この方法は、複数のＰＣＲ工程を必要とし、従って時間がかかる。
【0004】
ＰＣＲに基づく方法に付随する冗長な一連の手順の代替手段として、同時に多数の変異を正確かつ迅速に変異導入することを可能にする技術が必要とされている。最も進んでおり有望な遺伝子編集の方法の１つは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９である。この系は、それからガイドＲＮＡとＣａｓ９が発現されるプラスミドベースの系の使用または反応混合物に含める前にガイドＲＮＡが精製Ｃａｓ９タンパク質とカップリングされているリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の使用のいずれかによって構築される。
【0005】
シーケンシングを必要とすることなく変異を同時に生じさせることを可能にする迅速かつロバストなインビトロの技術が依然として要求されている。本発明は、この要求を満たす。
【発明の概要】
【0006】
本明細書で説明されるように、本発明は、インビトロ変異導入のための組成物と方法に関する。
【0007】
本発明の一態様は、標的配列のインビトロ変異導入を実施する方法を包含する。一実施形態において、方法は、単離リボヌクレオチド粒子（ＲＮＰ）と第１のプラスミドとオリゴヌクレオチドと無細胞抽出物とを含む混合物をインキュベートすることを含む。一実施形態において、ＲＮＰは、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９酵素を含む。一実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとアニーリングされる。一実施形態において、第１のプラスミドは、標的配列のヌクレオチド配列を含み、オリゴヌクレオチドは、標的配列に対して相補的であるが少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドを含む、ヌクレオチド配列を含み、従って第２のプラスミドを生じさせる。一実施形態において、複数の細胞に第２のプラスミドが与えられる。一実施形態において、当該複数の細胞から、インビトロ変異導入が標的配列において生じた少なくとも１つの細胞が選択される。
【0008】
本発明の別の態様は、複数の標的配列のインビトロ変異導入を実施する方法を包含する。一実施形態において、方法は、複数のリボヌクレオチド粒子（ＲＮＰ）と複数の第１のプラスミドと複数のオリゴヌクレオチドと無細胞抽出物とを含む混合物をインキュベートすることを含む。一実施形態において、複数のＲＮＰは、複数のｔｒａｃｒＲＮＡ、複数のｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９酵素を含み、ここで、複数のｔｒａｃｒＲＮＡは、複数のｃｒＲＮＡとアニーリングされる。一実施形態において、複数の第１のプラスミドは、複数の標的配列の複数のヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドは、複数の標的配列に対して相補的であるが標的配列ごとに少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドを含む、複数のヌクレオチド配列を含み、従って複数の第２のプラスミドを生じさせる。一実施形態において、複数の細胞に複数の第２のプラスミドが与えられる。一実施形態において、インビトロ変異導入が標的配列において生じた複数の細胞が選択される。
【0009】
別の態様では、本発明は、単離リボヌクレオチド粒子（ＲＮＰ）とオリゴヌクレオチドとプラスミドとバッファと無細胞抽出物とそれらの使用のための取扱説明資料とを含む、標的配列のためのインビトロ変異導入キットを包含する。一実施形態において、ＲＮＰは、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９を含む。一実施形態において、プラスミドは、標的配列のヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的配列に対して相補的であるが標的配列に関する少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドをその中に含む、ヌクレオチド配列を含む。
【0010】
本発明の別の態様は、単離リボヌクレオチド粒子（ＲＮＰ）とプラスミドとを含む第１の混合物をインキュベートすることを含む、標的配列のインビトロ変異導入を実施する方法を包含する。一実施形態において、ＲＮＰは、ｃｒＲＮＡおよびＣｐｆ１酵素を含み、ここで、ｃｒＲＮＡは、標的配列に対して相補的である。一実施形態において、ＲＮＰは、プラスミド中に二本鎖切断を生じさせる。一実施形態において、二本鎖切断を含む第１のプラスミドと、二本鎖オリゴヌクレオチドと、無細胞抽出物と、ＤＮＡリガーゼと、を含む第２の混合物がインキュベートされる。一実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチドは、Ｃｐｆ１切断部位に対して相補的な５’オーバーハングを含む。一実施形態において、再度環状化したプラスミドが生成される。一実施形態において、複数の細胞に、再度環状化したプラスミドが与えられる。一実施形態において、当該複数の細胞から、インビトロ変異導入が標的配列において生じた少なくとも１つの細胞が選択される。
【0011】
本発明のさらに別の態様は、単離ＲＮＰとプラスミドとを含む第１の混合物をインキュベートすることを含む、標的配列のインビトロ変異導入を実施する方法を包含する。一実施形態において、ＲＮＰは、ｃｒＲＮＡおよびＣｐｆ１酵素を含み、ここで、ｃｒＲＮＡは、標的配列に対して相補的である。一実施形態において、ＲＮＰは、プラスミド中に二本鎖切断を生じさせる。一実施形態において、二本鎖切断を含む第１のプラスミドと、一本鎖オリゴヌクレオチドと、無細胞抽出物と、ＤＮＡリガーゼと、を含む第２の混合物がインキュベートされる。一実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、Ｃｐｆ１切断部位に対して相補的な５’オーバーハングを含む。一実施形態において、再度環状化したプラスミドが生成される。一実施形態において、複数の細胞に、再度環状化したプラスミドが与えられる。一実施形態において、当該複数の細胞から、インビトロ変異導入が標的配列において生じた少なくとも１つの細胞が選択される。
【0012】
別の態様では、本発明は、単離ＲＮＰとプラスミドと一本鎖オリゴヌクレオチドと無細胞抽出物とＤＮＡリガーゼとを含む混合物をインキュベートすることを含む、標的配列のインビトロ変異導入を実施する方法を包含する。一実施形態において、ＲＮＰは、ｃｒＲＮＡおよびＣｐｆ１酵素を含み、ここで、ｃｒＲＮＡは、標的配列に対して相補的である。一実施形態において、ＲＮＰは、プラスミド中に二本鎖切断を生じさせる。一実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、Ｃｐｆ１切断部位に対して相補的な５’オーバーハングを含む。一実施形態において、再度環状化したプラスミドが生成される。一実施形態において、複数の細胞に、再度環状化したプラスミドが与えられる。一実施形態において、当該複数の細胞から、インビトロ変異導入が標的配列において生じた少なくとも１つの細胞が選択される。
【0013】
さらに別の態様では、本発明は、第１の単離ＲＮＰと第２の単離ＲＮＰとプラスミドとを含む第１の混合物をインキュベートすることを含む、標的配列のインビトロ変異導入を実施する方法を包含する。一実施形態において、第１のＲＮＰは、第１の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡと、第１のＣｐｆ１酵素と、を含む。一実施形態において、第２のＲＮＰは、第２の標的配列に対して相補的な第２のｃｒＲＮＡと、第２のＣｐｆ１酵素と、を含む。一実施形態において、第１のＲＮＰは、プラスミド中に第１の二本鎖切断を生じさせ、第２のＲＮＰは、プラスミド中に第２の二本鎖切断を生じさせる。一実施形態において、二本鎖切断を含む第１のプラスミドと、オリゴヌクレオチドと、無細胞抽出物と、ＤＮＡリガーゼと、を含む第２の混合物がインキュベートされる。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、Ｃｐｆ１切断部位に対して相補的な５’オーバーハングを含む。一実施形態において、再度環状化したプラスミドが生成される。一実施形態において、複数の細胞に、再度環状化したプラスミドが与えられる。一実施形態において、当該複数の細胞から、インビトロ変異導入が標的配列において生じた少なくとも１つの細胞が選択される。
【0014】
本発明の一態様は、単離リボヌクレオチド粒子（ＲＮＰ）と二本鎖オリゴヌクレオチドとプラスミドとバッファと無細胞抽出物とＤＮＡリガーゼとそれらの使用のための取扱説明資料とを含む、標的配列のためのインビトロ変異導入キットを包含する。一実施形態において、ＲＮＰは、ｃｒＲＮＡおよびＣｐｆ１酵素を含み、ここで、ｃｒＲＮＡは、標的配列に対して相補的である。一実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチドは、Ｃｐｆ１切断部位に対して相補的な５’オーバーハングを含む。
【0015】
本発明の別の態様は、単離リボヌクレオチド粒子（ＲＮＰ）と一本鎖オリゴヌクレオチドとプラスミドとバッファと無細胞抽出物とＤＮＡリガーゼとそれらの使用のための取扱説明資料とを含む、標的配列のためのインビトロ変異導入キットを包含する。一実施形態において、ＲＮＰは、ｃｒＲＮＡおよびＣｐｆ１酵素を含み、ここで、ｃｒＲＮＡは、標的配列に対して相補的である。一実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、Ｃｐｆ１切断部位に対して相補的な５’オーバーハングを含む。
【0016】
別の態様では、本発明は、単離リボヌクレオチド粒子（ＲＮＰ）と第１のプラスミドとオリゴヌクレオチドと無細胞抽出物とを含む混合物をインキュベートすることを含む、標的配列のインビトロ変異導入を実施する方法を包含する。一実施形態において、ＲＮＰは、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼを含む。一実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとアニーリングされる。一実施形態において、第１のプラスミドは、標的配列のヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的配列に対して相補的であるが少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドを含む、ヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、第２のプラスミドが生成される。一実施形態において、複数の細胞に第２のプラスミドが与えられる。一実施形態において、当該複数の細胞から、インビトロ変異導入が標的配列において生じた少なくとも１つの細胞が選択される。
【0017】
本発明の別の態様は、複数のリボヌクレオチド粒子（ＲＮＰ）と複数の第１のプラスミドと複数のオリゴヌクレオチドと無細胞抽出物とを含む混合物をインキュベートすることを含む、複数の標的配列のインビトロ変異導入を実施する方法を包含する。一実施形態において、複数のＲＮＰは、複数のｔｒａｃｒＲＮＡ、複数のｃｒＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼを含む。一実施形態において、複数のｔｒａｃｒＲＮＡは、複数のｃｒＲＮＡとアニーリングされる。一実施形態において、複数の第１のプラスミドは、複数の標的配列の複数のヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドは、複数の標的配列に対して相補的であるが標的配列ごとに少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドを含む、複数のヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、複数の第２のプラスミドが生成される。一実施形態において、複数の細胞に複数の第２のプラスミドが与えられる。一実施形態において、インビトロ変異導入が標的配列において生じた複数の細胞が選択される。
【0018】
本発明のさらに別の態様は、単離リボヌクレオチド粒子（ＲＮＰ）とプラスミドとを含む第１の混合物をインキュベートすることを含む、標的配列のインビトロ変異導入を実施する方法を包含する。一実施形態において、ＲＮＰは、ｃｒＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼを含み、ここで、ｃｒＲＮＡは、標的配列に対して相補的である。一実施形態において、ＲＮＰは、プラスミド中に二本鎖切断を生じさせる。一実施形態において、二本鎖切断を含む第１のプラスミドと、二本鎖オリゴヌクレオチドと、無細胞抽出物と、ＤＮＡリガーゼと、を含む第２の混合物がインキュベートされる。一実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＰ切断部位に対して相補的な５’オーバーハングを含む。一実施形態において、再度環状化したプラスミドが生成される。一実施形態において、複数の細胞に、再度環状化したプラスミドが与えられる。一実施形態において、当該複数の細胞から、インビトロ変異導入が標的配列において生じた少なくとも１つの細胞が選択される。
【0019】
本発明のさらに別の態様は、複数のリボヌクレオチド粒子（ＲＮＰ）と複数の第１のプラスミドと複数のオリゴヌクレオチドと無細胞抽出物とを含む混合物をインキュベートすることを含む、複数の標的配列のインビトロ変異導入を実施する方法を包含する。一実施形態において、複数のＲＮＰは、複数のｔｒａｃｒＲＮＡ、複数のｃｒＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼを含む。一実施形態において、複数のｔｒａｃｒＲＮＡは、複数のｃｒＲＮＡとアニーリングされる。一実施形態において、複数の第１のプラスミドは、複数の標的配列の複数のヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドは、複数の標的配列に対して相補的であるが標的配列ごとに少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドを含む、複数のヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、複数の第２のプラスミドが生成される。一実施形態において、複数の細胞に複数の第２のプラスミドが与えられる。一実施形態において、インビトロ変異導入が標的配列において生じた複数の細胞が選択される。
【0020】
本発明の別の態様は、単離リボヌクレオチド粒子（ＲＮＰ）とプラスミドとを含む第１の混合物をインキュベートすることを含む、標的配列のインビトロ変異導入を実施する方法を包含する。一実施形態において、ＲＮＰは、ｃｒＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼを含み、ここで、ｃｒＲＮＡは、標的配列に対して相補的である。一実施形態において、ＲＮＰは、プラスミド中に二本鎖切断を生じさせる。一実施形態において、二本鎖切断を含む第１のプラスミドと、二本鎖オリゴヌクレオチドと、無細胞抽出物と、ＤＮＡリガーゼと、を含む第２の混合物がインキュベートされる。一実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＰ切断部位に対して相補的な５’オーバーハングを含む。一実施形態において、再度環状化したプラスミドが生成される。一実施形態において、複数の細胞に、再度環状化したプラスミドが与えられる。一実施形態において、当該複数の細胞から、インビトロ変異導入が標的配列において生じた少なくとも１つの細胞が選択される。
【0021】
別の態様では、本発明は、単離ＲＮＰとプラスミドとを含む第１の混合物をインキュベートすることを含む、標的配列のインビトロ変異導入を実施する方法を包含する。一実施形態において、ＲＮＰは、ｃｒＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼを含み、ここで、ｃｒＲＮＡは、標的配列に対して相補的である。一実施形態において、ＲＮＰは、プラスミド中に二本鎖切断を生じさせる。一実施形態において、二本鎖切断を含む第１のプラスミドと、一本鎖オリゴヌクレオチドと、無細胞抽出物と、ＤＮＡリガーゼと、を含む第２の混合物がインキュベートされる。一実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＰ切断部位に対して相補的な５’オーバーハングを含む。一実施形態において、再度環状化したプラスミドが生成される。一実施形態において、複数の細胞に、再度環状化したプラスミドが与えられる。一実施形態において、当該複数の細胞から、インビトロ変異導入が標的配列において生じた少なくとも１つの細胞が選択される。
【0022】
さらに別の態様では、本発明は、単離ＲＮＰとプラスミドと一本鎖オリゴヌクレオチドと無細胞抽出物とＤＮＡリガーゼとを含む混合物をインキュベートすることを含む、標的配列のインビトロ変異導入を実施する方法を包含する。一実施形態において、ＲＮＰは、ｃｒＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼを含み、ここで、ｃｒＲＮＡは、標的配列に対して相補的である。一実施形態において、ＲＮＰは、プラスミド中に二本鎖切断を生じさせる。一実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＰ切断部位に対して相補的な５’オーバーハングを含む。一実施形態において、再度環状化したプラスミドが生成される。一実施形態において、複数の細胞に、再度環状化したプラスミドが与えられる。一実施形態において、当該複数の細胞から、インビトロ変異導入が標的配列において生じた少なくとも１つの細胞が選択される。
【0023】
さらに別の態様では、本発明は、第１の単離ＲＮＰと第２の単離ＲＮＰとプラスミドとを含む第１の混合物をインキュベートすることを含む、標的配列のインビトロ変異導入を実施する方法を包含する。一実施形態において、第１のＲＮＰは、第１の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡおよび第１のＣａｓエンドヌクレアーゼを含み、第２のＲＮＰは、第２の標的配列に対して相補的な第２のｃｒＲＮＡおよび第２のＣａｓエンドヌクレアーゼを含む。一実施形態において、第１のＲＮＰは、プラスミド中に第１の二本鎖切断を生じさせ、第２のＲＮＰは、プラスミド中に第２の二本鎖切断を生じさせる。一実施形態において、二本鎖切断を含む第１のプラスミドと、オリゴヌクレオチドと、無細胞抽出物と、ＤＮＡリガーゼと、を含む第２の混合物がインキュベートされる。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＰ切断部位に対して相補的な５’オーバーハングを含む。一実施形態において、再度環状化したプラスミドが生成される。一実施形態において、複数の細胞に、再度環状化したプラスミドが与えられる。一実施形態において、当該複数の細胞から、インビトロ変異導入が標的配列において生じた少なくとも１つの細胞が選択される。
【0024】
本発明の別の態様は、単離リボヌクレオチド粒子（ＲＮＰ）とオリゴヌクレオチドとプラスミドとバッファと無細胞抽出物とそれらの使用のための取扱説明資料とを含む、標的配列のためのインビトロ変異導入キットを包含する。一実施形態において、ＲＮＰは、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼを含む。一実施形態において、プラスミドは、標的配列のヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的配列に対して相補的であるが標的配列に関する少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドをその中に含む、ヌクレオチド配列を含む。
【0025】
本発明のさらに別の態様は、単離リボヌクレオチド粒子（ＲＮＰ）とオリゴヌクレオチドとプラスミドとバッファと無細胞抽出物とＤＮＡリガーゼとそれらの使用のための取扱説明資料とを含む、標的配列のためのインビトロ変異導入キットを包含する。一実施形態において、ＲＮＰは、ｃｒＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼを含み、ここで、ｃｒＲＮＡは、標的配列に対して相補的である。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＰ切断部位に対して相補的な５’オーバーハングを含む。
【0026】
上記の態様または本明細書に記載される本発明の任意の他の態様の様々な実施形態において、インビトロ変異導入は、一塩基ヌクレオチド改変（single base nucleotide modification）、欠失および挿入からなる群より選択される、標的配列のヌクレオチド配列における少なくとも１つの変異を含む。別の実施形態では、無細胞抽出物は、ＨＥＫ、ＨＵＨ－７、ＤＬＤ１、ＨＣＴ１１６およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからなる群より選択される少なくとも１種の細胞に由来する。
【0027】
一実施形態において、混合物は、約３７℃で約１２０分間インキュベートされる。別の実施形態では、各オリゴヌクレオチドは、独立的に、約２５～約２００塩基長である。さらに別の実施形態では、各オリゴヌクレオチドは、独立的に、約７２塩基長である。さらに別の実施形態では、各オリゴヌクレオチドは、独立的に、化学修飾された末端連結（chemically modified terminal linkage）をさらに含む。一実施形態において、化学修飾された末端連結は、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。
【0028】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＮｏｔＩ制限部位をさらに含む。一実施形態において、選択は、細胞をＮｏｔＩ酵素で消化することを含む。
【0029】
特定の実施形態では、本発明のキットまたは方法は、第２の標的配列に対して相補的な第２のｃｒＲＮＡを含む第２のＲＮＰをさらに含む。
【0030】
特定の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｆｏｋ１、Ｔ７、ｓｐＣａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃｐｆ２、ＣａｓＹ、ＣａｓＸおよびｓａＣａｓ９からなる群より選択される。
【0031】
本発明の説明を目的として、本発明の特定の実施形態が図面において示されている。しかし、本発明は、図面において示されている実施形態の正確な配置と手段に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図7-1】図７Ａ～図７Ｄは、本発明において実証される２つの例示的な遺伝学的読み出しについての標的ヌクレオチドを示す画像のセットである。図７Ａは、第１の読み出しの系を示す：プラスミドｐＫａｎ中のＧ残基をＴ残基に修正することによる、カナマイシン感受性のカナマイシン耐性への変換。図７Ｂは、容易な選択のための抗生物質耐性遺伝子を含まないが、形質転換後にプラスミドを受容した細胞のスクリーニングのために野生型形態のアンピシリン耐性遺伝子を有する、他のプラスミドを示す。この場合、標的は、その３番目の塩基がＧからＣに変換されると野生型のｅＧＦＰが生じる終止コドンを保持するｅＧＦＰ遺伝子である。図７Ｃは、ｅＧＦＰのインビトロ変異導入の系における標的塩基を示す配列の一群を図示する。Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＵとして列挙されている開始プラスミドクローンは、この場合はＧである標的塩基についての基準配列を表す。Ｃ（野生型配列）への変換は、予測された結果を生じ、最上段に図示されている。図７Ｄは、変異型カナマイシン標的のＤＮＡ配列およびカナマイシン感受性からカナマイシン耐性（ＧからＣ）への変換を図示する。典型的な反応混合物の組成が下に提示されている。
【図7-2】同上。
【図8B】同上。
【図10】図１０Ａ～図１０Ｃは、ＮｏｔＩ挿入の非限定的な提案されるメカニズムを図示する。図１０Ａは、ＮｏｔＩ制限酵素の切断部位を示す。図１０Ｂは、矢印で示される、ｌａｃＺ遺伝子上のＣｐｆ１－１２２８ ＲＮＰの互い違いの二本鎖切断部位を示す。二本鎖ＮｏｔＩ挿入セグメントは、Ｃｐｆ１切断によって生じるオーバーハングに対する相補的アームを利用して遺伝子配列内に組み込まれる。図１０Ｃは、ＮｏｔＩ挿入を遺伝子セグメント内に組み込むために本発明で用いられるインビトロ反応の概略工程を示す。
【図11】図１１Ａ～図１１Ｂは、ＮｏｔＩ部位の挿入を確認するためのＮｏｔＩ消化アッセイを図示する。インビトロ二本鎖ＮｏｔＩ挿入反応から単離されたプラスミドをＤＨ５α コンピテントＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。図１１Ａは、ＮｏｔＩ酵素消化に供された、プールされた細菌コロニーのＤＮＡからの結果を示す。図１１Ｂは、ＮｏｔＩ酵素消化に供された個々の細菌コロニーのＤＮＡからの結果を示す。
【図12】図１２は、ＮｏｔＩ部位の挿入を確認するためのＮｏｔＩ対照アッセイを図示する。インビトロＮｏｔＩ挿入反応にＣＦＥ（無細胞抽出物）およびリガーゼを添加しない場合、細菌コロニーのＤＮＡをＮｏｔＩ酵素消化に供した後に切断活性は見られず、これは、ＮｏｔＩの挿入が起こらなかったことを示す。さらなる反応は、一本鎖ＮｏｔＩオリゴヌクレオチドであるＮｏｔＩ－ＳまたはＮｏｔＩ－ＮＳのいずれかが二本鎖ＮｏｔＩ挿入断片の代わりにインビトロ反応に組み込まれた場合に、より低い頻度でＮｏｔＩの挿入が見られたということを示す。
【図13】図１３は、ＮｏｔＩ－Ｓ ｓｓＯＤＮを用いたＮｏｔＩ部位の挿入を確認するためのＮｏｔＩ消化アッセイを図示する。インビトロ一本鎖ＮｏｔＩオリゴヌクレオチドＮｏｔＩ－Ｓ挿入反応から単離されたプラスミドをＤＨ５α コンピテントＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。プールされた細菌コロニーのＤＮＡおよび個々の細菌コロニーのＤＮＡをＮｏｔＩ酵素消化に供した。ＮｏｔＩ消化の後に切断活性を示すＮｏｔＩ切断部位を含むＤＮＡが星印で示されている。
【図14】図１４は、ＮｏｔＩ－ＮＳ ｓｓＯＤＮを用いたＮｏｔＩ部位の挿入を確認するためのＮｏｔＩ消化アッセイを図示する。インビトロ一本鎖ＮｏｔＩオリゴヌクレオチドＮｏｔＩ－ＮＳ挿入反応から単離されたプラスミドをＤＨ５α コンピテントＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。プールされた細菌コロニーのＤＮＡおよび個々の細菌コロニーのＤＮＡをＮｏｔＩ酵素消化に供した。ＮｏｔＩ消化の後に切断活性を示すＮｏｔＩ切断部位を含むＤＮＡが星印で示されている。
【図23A】図２３Ａ～図２３Ｂは、本発明で用いられるインビトロでの遺伝子編集の実験プロトコルとツールを図示する一連の画像である。図２３Ａは、Ｃｐｆ１またはＣａｓ９のＲＮＰが複合体形成されてプラスミドＤＮＡと共に第１のインビトロ切断反応混合物に添加されることを示す。プラスミドＤＮＡを回収し、無細胞抽出物と共に第２のインビトロ再環状化反応混合物に添加する。反応が完了した後、反応からプラスミドＤＮＡを回収し、コンピテントＥ．ｃｏｌｉに形質転換する。次いで、形質転換細胞からＤＮＡを単離し、インビトロでなされた改変を特定するために配列決定する。図２３Ｂは、ｐＨＳＧ２９９のｌａｃＺ遺伝子領域の各所に存在する様々なＣｐｆ１ ＲＮＰ部位とＣａｓ９ ＲＮＰ部位を示す。１つのＣａｓ９結合部位と５つのＣｐｆ１結合部位が示されている。本明細書で説明されるインビトロ反応のために用いられるＣｐｆ１部位が、ボックス内に示されており、関連する切断部位が、互い違いの矢印で示されている。
【図23B】同上。
【図24A】図２４Ａ～図２４Ｃは、インビトロでのＲＮＰ切断と無細胞抽出物の活性を図示する一連のゲル画像である。図２４Ａは、野生型Ｃａｓ９、ニッカーゼＣａｓ９、およびそれぞれ異なるｃｒＲＮＡ配列を有する５つのＣｐｆ１のＲＮＰを用いてｐＨＳＧ２９９の切断が達成されたことを示す。ＤＮＡ切断産物の多様なコンフォメーションは、右側に示されているように、アガロースゲルを通るスーパーコイルＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡおよびニック入りＤＮＡの移動の度合いによって区別できる。図２４Ｂは、０．１～５０ｐｍｏｌの範囲の増加するＲＮＰ量でインビトロ反応の条件下において評価されたＣａｓ９とＣｐｆ１の相対的切断活性を示す。図２４Ｃは、増加する量の３種の哺乳動物細胞株源（ＨＣＴ １１６－１９（結腸）、ＨＥＬ ９２．１．７（赤芽球）およびＨＥＫ－２９３（腎臓））からの無細胞抽出物が、Ｃｐｆ１ ＲＮＰ、プラスミドＤＮＡおよび増加する量のそれぞれの無細胞抽出物を含むインビトロ切断反応に添加されたことを示す。各無細胞抽出物の量が増加すると、ＤＮＡフラグメントがＲＮＰ切断部位で生じたが、これは、露出したＤＮＡ末端が分解されたためであり、反応の活性が、ゲルのレーンを下方に流れるスメアなラインとして見えた。
【図24B】同上。
【図24C】同上。
【図25-1】図２５Ａ～図２５Ｃは、インビトロでのＣａｓ９とＣｐｆ１のＲＮＰの活性を図示する一連の画像である。図２５Ａは、Ｃａｓ９とＣｐｆ１のＲＮＰによるＤＮＡ破壊の頻度を、インビトロ反応から回収されたプラスミドＤＮＡで形質転換された細菌コロニーから分析された配列の総数に対する検出された破壊されたＤＮＡ配列の数のパーセンテージとして示す。Ｃｐｆ１部位とＣａｓ９部位がｌａｃＺ遺伝子領域に沿って示されており、関連する切断部位は、それぞれ、互い違いの矢印および一直線の矢印で示されている。ｌａｃＺ遺伝子領域の野生型配列が示されている。図２５Ｂは、切断部位の周囲にＤＮＡ破壊を伴わないＣａｓ９ ＲＮＰを含むインビトロ反応から評価された総数を代表する３つの配列を示す。図２５Ｃは、切断部位周辺で様々なＤＮＡ破壊を示すＣｐｆ１ ＲＮＰを含むインビトロ反応から評価された配列の総数を代表する５つの配列を示す。
【図25-2】同上。
【図26-1】図２６Ａ～図２６Ｄは、二本鎖ＮｏｔＩフラグメントの挿入の提案されるメカニズムおよび検証を図示する一連の画像である。図２６Ａは、ＮｏｔＩ制限切断部位の図である。図２６Ｂは、矢印で示されている、ｌａｃＺ遺伝子上のＣｐｆ１ ＲＮＰの互い違いの二本鎖切断部位を示す。二本鎖ＮｏｔＩフラグメントは、Ｃｐｆ１による切断によって生じたオーバーハングに対して相補的な２つのアームを利用して遺伝子配列内に挿入される。図２６Ｃは、ＮｏｔＩフラグメントをｌａｃＺ遺伝子領域内に挿入するインビトロ反応の概略工程を示す。図２６Ｄは、ｌａｃＺ遺伝子領域内へのＮｏｔＩ部位の組込みを確認するためにＮｏｔＩ酵素消化に供された、インビトロ二本鎖ＮｏｔＩフラグメント挿入反応から回収されたプラスミドで形質転換された選択された細菌コロニーから単離されたプラスミドＤＮＡを示す。改変された無細胞抽出物がインビトロ反応混合物の成分として存在しない場合にはＮｏｔＩフラグメントの挿入が起こらないということを確認するために、さらなる対照を実施した。
【図26-2】同上。
【図27-1】図２７Ａ～図２７Ｄは、二本鎖ＮｏｔＩフラグメント挿入配列を図示する一連のトレースである。野生型のｌａｃＺ遺伝子領域の配列、およびインビトロ二本鎖ＮｏｔＩフラグメント挿入反応から回収されたプラスミドＤＮＡで形質転換された選択された細菌コロニーが示されている。図２７Ａは、シーケンシング分析により、切断部位に完全なＮｏｔＩフラグメントの挿入を含む２つの配列が示されたことを示す。図２７Ｂは、切断部位の上流に１ｂｐの欠失を伴う２つのＮｏｔＩ部位フラグメント挿入断片を含む３つの配列を示す。図２７Ｃは、切断部位の上流に１ｂｐの欠失および切断部位の下流に７ｂｐの欠失を伴う３つのＮｏｔＩ部位フラグメント挿入断片を含む１つの配列を示す。図２７Ｄは、切断部位にＮｏｔＩ部位フラグメントの挿入を含まなかった１つの配列を示す。
【図27-2】同上。
【図28-1】図２８Ａ～図２８Ｄは、一本鎖ＮｏｔＩ分子の挿入の提案されるメカニズムおよび検証を図示する一連の画像である。図２８Ａは、ＮｏｔＩ制限切断部位の図である。図２８Ｂは、矢印で示されている、ｌａｃＺ遺伝子上のＣｐｆ１ ＲＮＰの互い違いの二本鎖切断部位を示す。一本鎖ＮｏｔＩ分子は、Ｃｐｆ１による切断によって生じたオーバーハングに対して相補的なアームを利用することによって、２本の鎖のうちの一方（センス鎖（Ｓ）または非センス（ＮＳ）鎖）に挿入される。図２８Ｃは、ｌａｃＺ遺伝子領域内へのＮｏｔＩ部位の組込みを確認するためにＮｏｔＩ酵素消化に供された、インビトロ一本鎖ＮｏｔＩ反応から回収されたプラスミドで形質転換された選択された細菌コロニーからのプールされたプラスミドＤＮＡおよび単離されたプラスミドＤＮＡを示す。図２８Ｄは、インビトロでの一本鎖のＮｏｔＩ－ＳおよびＮｏｔＩ－ＮＳの挿入反応の各々から回収されたプラスミドで形質転換された選択された細菌コロニーから単離されたプラスミドＤＮＡからの４つの代表的な配列を示す。
【図28-2】同上。
【図28-3】同上。
【図29A】図２９Ａ～図２９Ｄは、２つのＣｐｆ１酵素を用いた１８６ｂｐのフラグメントの挿入を図示する一連の画像である。図２９Ａは、異なる部位を切断する２つのＣｐｆ１ヌクレアーゼを用いて、親プラスミドからフラグメントを切り取り、それを、相補的なオーバーハングを有する２つの相補的なオリゴヌクレオチドのアニーリングによって作製された１８６塩基対のフラグメントと置き換えたことを示す。図２９Ｂ～図２９Ｃは、細菌における読み出しによりインビトロ反応について得られた配列を示す。図２９Ｄは、大部分は欠失であるが、挿入が成功した１つのクローンを含む、得られた結果のタイプを図示する。
【図29B】同上。
【図29C】同上。
【図29D】同上。
【図30】図３０は、挿入反応または置換反応および欠失事象を図示する。Ｃｐｆ１ ＲＮＰが互い違いの二本鎖ＤＮＡ切断を生じさせた後に二本鎖ＤＮＡフラグメントが切断部位に挿入されて元のＤＮＡセグメントを拡張させる、挿入が生じる。欠失事象は、Ｃｐｆ１ ＲＮＰが互い違いの二本鎖ＤＮＡ切断を生じさせ、ＤＮＡが再連結される前に露出末端が切除される場合に起こる。置換反応は、２つのＣｐｆ１ ＲＮＰが遺伝子セグメントに沿って別々の互い違いの二本鎖切断部位を生じさせた後に２つの切断部位の間のセグメント（＊で示されている）が除去され、二本鎖ＤＮＡフラグメントが挿入されて元のＤＮＡセグメントと置き換わる場合に起こる。
【図31】図３１は、インビトロでのＣｐｆ１ ＲＮＰの活性を図示する。Ｃｐｆ１ ＲＮＰによるＤＮＡ破壊の頻度を、インビトロ反応から回収されたプラスミドＤＮＡで形質転換された細菌コロニーから分析された配列の総数に対する検出された破壊されたＤＮＡ配列の数のパーセンテージとして示す。Ｃｐｆ１部位がｌａｃＺ遺伝子領域に沿って示されており、関連する切断部位は、野生型ｌａｃＺ遺伝子領域に沿って互い違いの赤い矢印で示されている。示されている５つの配列は、切断部位周辺で様々なＤＮＡ破壊を示すＣｐｆ１ ＲＮＰを含むインビトロ反応から評価された配列の総数を代表するものである。
【図32A】図３２Ａ～図３２Ｂは、インビトロ一本鎖ＮｏｔＩ－Ｓ反応から回収されたプラスミドで形質転換された選択された細菌コロニーから単離されたプラスミドＤＮＡからのさらなる配列を示す一連の画像である。
【図32B】同上。
【図33A】図３３Ａ～図３３Ｃは、ｌａｃＺ遺伝子における塩基置換を示す一連の画像である。図３３Ａは、８１塩基置換を示す。８１塩基対離れた２つのＣｐｆ１ ＲＮＰ結合部位が野生型ｌａｃＺ遺伝子配列に沿って示されており、生じる２つの互い違いの切断部位が、２つの互い違いの矢印で示されている。次いで、２つの切断部位の間のＤＮＡセグメントが除去され、二本鎖８１塩基置換フラグメントが切断部位で遺伝子内に組み込まれる。野生型ｌａｃＺ遺伝子配列が、完全な８１塩基置換の配列の上に示されている。ボックスは、挿入されたＮｏｔＩ制限酵素部位およびバーコード配列（ＴＴ）を示す。図３３Ｂは、１３６塩基置換を示す。１３６塩基対離れた２つのＣｐｆ１ ＲＮＰ結合部位が野生型ｌａｃＺ遺伝子配列に沿って示されており、生じる２つの互い違いの切断部位が、２つの互い違いの矢印で示されている。次いで、２つの切断部位の間のＤＮＡセグメントが除去され、二本鎖１３６塩基置換フラグメントが切断部位で遺伝子内に組み込まれる。野生型ｌａｃＺ遺伝子配列が、完全な１３６塩基置換の配列の上に示されている。ボックスは、挿入されたＮｏｔＩ制限酵素部位およびバーコード配列（ＡＡ／ＴＴ）を示す。図３３Ｃは、１８６塩基置換を示す。１７７塩基対離れた２つのＣｐｆ１ ＲＮＰ結合部位が野生型ｌａｃＺ遺伝子配列に沿って示されており、生じる２つの互い違いの切断部位が、２つの互い違いの矢印で示されている。次いで、２つの切断部位の間のＤＮＡセグメントが除去され、二本鎖１８６塩基置換フラグメントが切断部位で遺伝子内に組み込まれる。野生型ｌａｃＺ遺伝子配列が、完全な１８６塩基置換の配列の上に示されている。ボックスは、挿入されたＮｏｔＩ制限酵素部位およびバーコード配列（ＧＧＧ）を示す。
【図33B】同上。
【図33C】同上。
【図34】図３４は、ｌａｃＺ遺伝子における様々な長さのフラグメントの挿入のさらなる配列を示す。Ｃｐｆ１－１２２８ ＲＮＰ切断部位が野生型ｌａｃＺ遺伝子領域の配列に沿って図示されている。不完全な挿入をもたらす二本鎖の１７、３６、４５および８１塩基のＤＮＡフラグメントを含むインビトロ挿入反応からの配列が示されている。これらの配列は、単離されたプラスミドＤＮＡで形質転換された選択された細菌コロニーからのものであった。
【図35A】図３５Ａ～図３５Ｂは、ｌａｃＺ遺伝子における様々な長さのセグメント置換のさらなる配列を図示する。１７、４５、８１、１３６および１８６塩基のセグメント置換の反応について、２つのＣｐｆ１部位が野生型ｌａｃＺ遺伝子領域の配列に沿って示されている。これらの配列は、単離されたプラスミドＤＮＡで形質転換された細菌コロニーから選択されたが、二本鎖の１７、４５、８１、１３６および１８６塩基のＤＮＡフラグメントを含む不完全なインビトロ置換反応を実証した。
【図35B】同上。
【図36A】図３６Ａ～図３６Ｄは、ＫＲＡＳ遺伝子における部位特異的変異導入を図示する一連の画像である。図３６Ａは、カナマイシン耐性遺伝子および目的のＫＲＡＳ遺伝子を含むｐＫＲＡＳの代表的なプラスミドマップを示す。ＫＲＡＳ遺伝子の野生型配列と比較すると、Ｇ１２Ｄ変異とＧ１３Ｄ変異についての変異のバリエーションが分かる。図３６Ｂは、Ｇ１２Ｄ変異部位およびＧ１３Ｄ変異部位の両方に及ぶＫＲＡＳ遺伝子領域に沿って１１４塩基離れた２つのＣｐｆ１ ＲＮＰを示す。二本鎖１１４塩基置換フラグメントに組み込まれた単一変異および二重変異のバリエーションの描写が示されている。図３６Ｃは、野生型ＫＲＡＳ遺伝子領域の配列を示し、二本鎖１１４塩基ＤＮＡフラグメントの３つの変異のバリエーションを全て含む完全なインビトロ置換反応から単離されたプラスミドＤＮＡで形質転換された選択された細菌コロニーが示されており、組み込まれた特定の変異が赤いボックス内に示されている。図３６Ｄは、完璧に置換されたＧ１２Ｄ／Ｇ１３Ｄ変異フラグメントを含むプラスミド（灰色の実線）を野生型ＫＲＡＳプラスミド（黒い二本の実線）と位置合わせした図を通して、オフターゲット効果が生じなかったことの確認を示し、観察される唯一のミスマッチは、ボックス内に示されているＧ１２Ｄ変異とＧ１３Ｄ変異から生じる意図された２塩基対の変化であることが示された。
【図36B】同上。
【図36C】同上。
【図36D】同上。
【発明を実施するための形態】
【0033】
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語と科学用語は全て、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で説明されるものと類似または同等の任意の方法および材料が本発明の試験のための実施において使用されてよいが、例示的な材料および方法が本明細書で説明される。本発明の説明および特許請求において、以下の用語が使用されるであろう。
他に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語と科学用語は全て、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で説明されるものと類似または同等の任意の方法および材料が本発明の試験のための実施において使用されてよいが、例示的な材料および方法が本明細書で説明される。本発明の説明および特許請求において、以下の用語が使用されるであろう。
【0034】
本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態の説明を目的とするに過ぎず、限定的であることを意図するものではないということも理解されるべきである。
【0035】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書では、その冠詞の文法上の対象物の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「要素（an element）」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【0036】
本明細書で使用される「約」は、測定可能な値（量、持続時間等など）に対して適用される場合、指定される値から±２０％または±１０％（より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、一層より好ましくは±０．１％）の変動を包含することが意図されるが、これは、そのような変動が、開示される方法を実施するのに適切であるためである。
【0037】
本明細書で使用される場合、用語「量」は、混合物中の成分の存在量または数量を指す。
【0038】
本明細書で使用される場合、用語「ｂｐ」は塩基対を指す。
【0039】
用語「相補的」は、２本の核酸鎖の間の逆平行アライメントの度合いに対して適用される。完全な相補性は、各ヌクレオチドが、その逆のものの真向かいにあることを必要とする。相補性がないことは、各ヌクレオチドが、その逆のものの真向かいにないことを必要とする。相補性の度合いは、一緒になるかアニール／ハイブリダイズする配列の安定性を決定する。さらに、様々なＤＮＡ修復機能ならびに調節機能は、塩基対相補性に基づいている。
【0040】
用語「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」または「クリスパー（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）」または「ＣＲＩＳＰＲ」は、短い反復塩基配列とそれに続くウイルスまたはプラスミドへの以前の曝露に由来するスペーサーＤＮＡの短いセグメントとを含むＤＮＡ座位を指す。細菌と古細菌は、短鎖ＲＮＡを用いて外来核酸の分解を導くＣＲＩＳＰＲ／ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）システムと呼称される適応免疫防御を進化させている。細菌において、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断を介して、侵入してきた外来ＤＮＡに対する獲得免疫をもたらす。
【0041】
「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ」は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ酵素（CRISPR-associated endonuclease enzyme）を指す。Ｃａｓエンドヌクレアーゼの非限定的な例はＣａｓ９である。他の例示的なＣａｓエンドヌクレアーゼとしては、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｆｏｋ１、Ｔ７、ｓｐＣａｓ９、Ｃｐｆ２、ＣａｓＹ、ＣａｓＸおよび／またはｓａＣａｓ９が挙げられるが、これらに限定されない。
【0042】
「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９」システムまたは「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介型遺伝子編集」は、ゲノム編集／工学のために改変されているＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを指す。それは、典型的には、「ガイド」ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および非特異的ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）を含む。「ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）」は、本明細書では、「短鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）」と互換的に使用される。ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９結合に必要な「スキャフォールド」配列と、改変されるゲノム標的を規定するユーザー定義の約２０ヌクレオチドの「スペーサー」または「ターゲティング」配列と、で構成される短い合成ＲＮＡである。Ｃａｓ９のゲノム標的は、ｇＲＮＡ中に存在するターゲティング配列を変更することによって変更できる。
【0043】
「コードする」は、規定されたヌクレオチド配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）または規定されたアミノ酸配列のいずれかを有する生物学的プロセス中の他のポリマーおよび巨大分子の合成のための鋳型として働くポリヌクレオチド（遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなど）中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性、およびそれから生じる生物学的特性に対して適用される。従って、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写と翻訳が細胞または他の生物学的系においてタンパク質を生じさせる場合、タンパク質をコードする。コード鎖（そのヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡの配列と同一であり、通常は配列表に提示されている）と非コード鎖（遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される）は両方とも、タンパク質またはその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産物をコードすると称され得る。
【0044】
本明細書で使用される場合、「内因性」は、生物、細胞、組織または系の内部に由来する、またはそれらの内部で生産される、任意の物質に対して適用される。
【0045】
本明細書で使用される場合、用語「外因性」は、生物、細胞、組織または系の外部から導入される、またはそれらの外部で生産される、任意の物質に対して適用される。
【0046】
用語「発現」は、本明細書で使用される場合、そのプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳と定義される。
【0047】
「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に機能可能なように連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用エレメントを含む。発現のための他のエレメントが、宿主細胞によって、またはインビトロ発現系において、供給されてよい。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドが組み込まれたコスミド、プラスミド（例えば、裸のプラスミド、またはリポソーム中に含まれるプラスミド）およびウイルス（例えば、センダイウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）など、当技術分野で公知のものが全て包含される。
【0048】
「相同」は、本明細書で使用される場合、２つのポリマー分子の間の、例えば、２つの核酸分子（２つのＤＮＡ分子、２つのＲＮＡ分子、ＤＮＡとＲＮＡ分子、ＤＮＡとｓｇＲＮＡ分子など）の間の、または２つのポリペプチド分子の間の、サブユニット配列の同一性に対して適用される。２つの分子の両方のサブユニット位置が、同じモノマーサブユニットによって占められている場合（例えば、２つのＤＮＡ分子の各々の位置がアデニンによって占められている場合）には、それらは、その位置で相同である。２つの配列の間の相同性は、一致している位置または相同である位置の数の直接の関数である。例えば、２つの配列中の位置の半数（例えば、サブユニット１０個の長さのポリマー中の５つの位置）が相同であれば、その２つの配列は５０％相同であり、位置の９０％（例えば、１０個中９個）が一致しているか相同であれば、その２つの配列は９０％相同である。
【0049】
「同一性」は、本明細書で使用される場合、２つのポリマー分子の間の、特に２つのアミノ酸分子の間（２つのポリペプチド分子の間など）の、サブユニット配列の同一性に対して適用される。２つのアミノ酸配列が、同じ位置に同じ残基を有する場合（例えば、２つのポリペプチド分子の各々の位置がアルギニンによって占められている場合）には、それらは、その位置で同一である。同一性または２つのアミノ酸配列がアラインメントにおいて同じ位置に同じ残基を有する程度は、パーセンテージとして表されることが多い。２つのアミノ酸配列の間の同一性は、一致している位置または同一である位置の数の直接の関数である。例えば、２つの配列中の位置の半数（例えば、１０アミノ酸の長さのポリマー中の５つの位置）が同一であれば、その２つの配列は５０％同一であり、位置の９０％（例えば、１０個中９個）が一致しているか同一であれば、その２つのアミノ酸配列は９０％同一である。
【0050】
本明細書で使用される場合、「取扱説明資料」には、刊行物、記録、図表、または本発明の組成物および方法の有用性を伝えるために用いることができる任意の他の表現媒体が包含される。本発明のキットの取扱説明資料は、例えば、本発明の核酸、ペプチドおよび／または組成物を含む容器に添付されてよいか、当該核酸、ペプチドおよび／または組成物を含む容器と一緒に出荷されてよい。あるいは、取扱説明資料は、受領者が取扱説明資料と化合物を一体的に使用することを意図して容器とは別々に出荷されてよい。
【0051】
用語「改変された」は、本明細書で使用される場合、本発明の分子または細胞の変化した状態または構造を意図する。分子は、化学的、構造的および機能的なものを含む多くの方法で改変されてよい。細胞は、核酸の導入を介して改変されてよい。
【0052】
「変異」は、本明細書で使用される場合、（例えば、同じ対象から以前に採取されたＤＮＡサンプルであってよい）所与の基準配列からの変更をもたらすＤＮＡ配列の変化である。変異は、少なくとも１つのデオキシリボ核酸塩基（プリン（アデニンおよび／またはチミン）および／またはピリミジン（グアニンおよび／またはシトシン）など）の欠失および／または挿入および／または重複および／または置換を含み得る。変異は、生物（対象）の観察可能な特徴（表現型）に識別可能な変化を生じさせても生じさせなくてもよい。
【0053】
「核酸」は、デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドで構成されるかどうか、およびホスホジエステル結合または改変された結合（ホスホトリエステル結合、ホスホルアミデート結合、シロキサン結合、カーボネート結合、カルボキシメチルエステル結合、アセトアミデート結合、カルバメート結合、チオエーテル結合、架橋ホスホルアミデート結合、架橋メチレンホスホネート結合、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、ホスホロジチオエート結合、架橋ホスホロチオエート結合またはスルホン結合およびそのような結合の組み合わせなど）で構成されるかどうかにかかわらず、任意の核酸を意図する。核酸なる用語はまた、５つの生物学上存在する塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基で構成される核酸も具体的に含む。
【0054】
本発明に関して、一般的に存在する核酸塩基についての以下の略号が使用される。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシトシンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、「Ｕ」はウリジンを指す。
【0055】
他に特定されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮重のバージョンであり且つ同じアミノ酸配列をコードする、全てのヌクレオチド配列を包含する。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列なる表現はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が一部のバージョンではイントロン（複数可）を含み得るという範囲でイントロンを含んでもよい。
【0056】
用語「オリゴヌクレオチド」は、典型的には、一般的に約１００ヌクレオチド以下である短いポリヌクレオチドを指す。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）で表される場合、これはまた、「Ｕ」が「Ｔ」を置き換えるＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も包含する、ということが理解されるであろう。
【0057】
本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」「ポリペプチド」および「タンパク質」は、互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合で連結されたアミノ酸残基を含む化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含むはずであり、タンパク質の配列またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって互いに連結された２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が包含される。本明細書で使用される場合、当該用語は、短鎖（一般的に、当技術分野では、例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも呼称される）と長鎖（一般的に、当技術分野ではタンパク質と呼称される）の両方に対して適用され、それらには多くのタイプが存在する。「ポリペプチド」は、とりわけ、例えば、生物学的に活性のあるフラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質を包含する。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチドまたはそれらの組み合わせを包含する。
【0058】
用語「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成形態、および混合ポリマー、センス鎖とアンチセンス鎖の両方を包含し、非天然の、または誘導体化された、合成の、もしくは半合成の、ヌクレオチド塩基を含むように化学的または生化学的に改変されてよい。また、１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、置換、または他のポリヌクレオチド配列への融合、を含むがこれらに限定されない、野生型遺伝子または合成遺伝子の変更も本発明の範囲内に包含される。
【0059】
本明細書では、従来の表記法を用いてポリヌクレオチド配列を説明する。一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は５’方向と呼称される。
【0060】
「プライマー」は、配列特異的な様式で標的配列にハイブリダイズしてＰＣＲ中に伸長させることが可能であるオリゴヌクレオチド（通常は約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチド長のもの）である。
【0061】
用語「プロモーター」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の特定の転写を開始するのに必要である細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列と定義される。
【0062】
「サンプル」または「生体サンプル」は、本明細書で使用される場合、器官、組織、エキソソーム、血液、血漿、唾液、尿および他の体液を含むがこれらに限定されない、対象からの生物学的物質を意味する。サンプルは、対象から得られた任意の材料源であってよい。
【0063】
用語「対象」は、免疫応答が誘発され得る、生きている生物（例えば、哺乳動物）を包含することが意図される。「対象」または「患者」は、本明細書で使用される場合、ヒト、またはヒト以外の哺乳動物であってよい。ヒト以外の哺乳動物には、例えば、家畜およびペット（ヒツジ科、ウシ科、ブタ科、イヌ科、ネコ科およびネズミ科の哺乳動物など）が包含される。好ましくは、対象はヒトである。
【0064】
本明細書において互換的に使用される「標的遺伝子」、「標的配列（targeted sequence）」または「標的配列（target sequence）」は、変異導入のために特異的に標的とされる核酸配列を指す。標的とされる核酸配列は、ゲノムのコード（遺伝子）領域または非コード領域にあってよい。
【0065】
用語「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」は、本明細書で使用される場合、それによって外因性核酸が宿主細胞内に移行または導入されるプロセスに対して適用される。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換または形質導入された細胞である。当該細胞には、初代対象細胞およびその子孫が包含される。
【0066】
「ベクター」は、単離された核酸を含む構成物であって当該単離された核酸を細胞の内部に送達するために用いることができる構成物である。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性の化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含むがこれらに限定されない、数多くのベクターが当技術分野において公知である。従って、用語「ベクター」は、自律複製型のプラスミドまたはウイルスを包含する。当該用語はまた、細胞内への核酸の移行を促進する非プラスミド化合物と非ウイルス化合物（例えば、ポリリジン化合物、リポソーム等など）を包含すると解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0067】
範囲：本開示の全体にわたって、本発明の様々な態様は、範囲形式で提示され得る。範囲形式での説明は、単に便宜と簡潔さのためのものに過ぎず、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではない、ということが理解されるべきである。従って、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値だけでなく全ての可能な部分範囲も具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、１～６などの範囲の説明は、その範囲内の個々の数値（例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６）だけでなく、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６等などの部分範囲も具体的に開示していると見なされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【0068】
説明
本発明は、遺伝子編集技術を用いたインビトロ部位特異的変異導入を実施するための新規の方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、リボヌクレオチド粒子（ＲＮＰ）とオリゴヌクレオチドとバッファと無細胞抽出物とそれらの使用のための取扱説明資料とを含むインビトロ部位特異的変異導入キットを包含する。
本発明は、遺伝子編集技術を用いたインビトロ部位特異的変異導入を実施するための新規の方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、リボヌクレオチド粒子（ＲＮＰ）とオリゴヌクレオチドとバッファと無細胞抽出物とそれらの使用のための取扱説明資料とを含むインビトロ部位特異的変異導入キットを包含する。
【0069】
特定の実施形態では、本発明は、インビトロ変異導入を実施する方法を包含する。他の実施形態では、方法は、リボヌクレオチド粒子（ＲＮＰ）をアセンブルさせることを含む。さらに他の実施形態では、方法は、ＲＮＰと第１のプラスミドとオリゴヌクレオチドとバッファと無細胞抽出物とを含む混合物をインキュベートし、それにより第２のプラスミドを形成させることを含む。さらに他の実施形態では、方法は、第２のプラスミドを単離することを含む。さらに他の実施形態では、方法は、単離された第２のプラスミドを複数の細胞に与えることを含む。さらに他の実施形態では、方法は、当該複数の細胞から、標的遺伝子のインビトロ変異導入が生じた少なくとも１つの細胞を選択することを含む。特定の実施形態では、ＲＮＰは、ｔｒａｃｒＲＮＡをｃｒＲＮＡとアニーリングさせてからＣａｓ９と組み合わせることによってアセンブルされる。プラスミドは、遺伝子標的を含む。遺伝子標的は、細胞内の任意の遺伝子であってよい。一実施形態において、標的遺伝子はＥＧＦＰである。
【0070】
特定の実施形態では、本発明は、インビトロ変異導入を実施する方法を包含する。他の実施形態では、方法は、単離リボヌクレオチド粒子（ＲＮＰ）とプラスミドとを含む第１の混合物をインキュベートすることを含み、ここで、ＲＮＰは、ｃｒＲＮＡおよびＣｐｆ１酵素を含み、ｃｒＲＮＡは、標的遺伝子に対して相補的であり、ＲＮＰは、プラスミド中に二本鎖切断を生じさせる。さらに他の実施形態では、方法は、二本鎖切断を含む第１のプラスミドと、二本鎖オリゴヌクレオチドと、無細胞抽出物と、ＤＮＡリガーゼと、を含む第２の混合物をインキュベートすることを含み、ここで、二本鎖オリゴヌクレオチドは、Ｃｐｆ１切断部位に対して相補的な５’オーバーハングを含み、ＮｏｔＩ制限部位を含む再度環状化したプラスミドが生成される。さらに他の実施形態では、方法は、再度環状化したプラスミドを複数の細胞に与えることと、当該複数の細胞から、標的遺伝子においてインビトロ変異導入が生じた少なくとも１つの細胞を選択することと、を含む。
【0071】
特定の実施形態では、本発明は、標的配列のインビトロ変異導入を実施する方法を包含する。他の実施形態では、方法は、単離ＲＮＰとプラスミドとを含む第１の混合物をインキュベートすることを含み、ここで、ＲＮＰは、ｃｒＲＮＡおよびＣｐｆ１酵素を含み、ｃｒＲＮＡは、標的配列に対して相補的であり、ＲＮＰは、プラスミド中に二本鎖切断を生じさせる。さらに他の実施形態では、方法は、二本鎖切断を含む第１のプラスミドと、一本鎖オリゴヌクレオチドと、無細胞抽出物と、ＤＮＡリガーゼと、を含む第２の混合物をインキュベートすることを含み、ここで、一本鎖オリゴヌクレオチドは、Ｃｐｆ１切断部位に対して相補的な５’オーバーハングを含み、ＮｏｔＩ制限部位を含む再度環状化したプラスミドが生成される。さらに他の実施形態では、方法は、再度環状化したプラスミドを複数の細胞に与えることを含む。さらに他の実施形態では、方法は、当該複数の細胞から、標的配列においてインビトロ変異導入が生じた少なくとも１つの細胞を選択することを含む。
【0072】
特定の実施形態では、本発明は、標的遺伝子のインビトロ変異導入を実施する方法を包含する。他の実施形態では、方法は、第１の単離ＲＮＰと第２の単離ＲＮＰとプラスミドとを含む第１の混合物をインキュベートすることを含み、ここで、第１のＲＮＰは、第１の標的配列に対して相補的なｃｒＲＮＡと、第１のＣｐｆ１酵素と、を含み、第２のＲＮＰは、第２の標的配列に対して相補的な第２のｃｒＲＮＡを含み、第１のＲＮＰは、プラスミド中に第１の二本鎖切断を生じさせ、第２のＲＮＰは、プラスミド中に第２の二本鎖切断を生じさせる。さらに他の実施形態では、方法は、二本鎖切断を含む第１のプラスミドと、オリゴヌクレオチドと、無細胞抽出物と、ＤＮＡリガーゼと、を含む第２の混合物をインキュベートすることを含み、ここで、オリゴヌクレオチドは、Ｃｐｆ１切断部位に対して相補的な５’オーバーハングを含み、ＮｏｔＩ制限部位を含む再度環状化したプラスミドが生成される。さらに他の実施形態では、方法は、再度環状化したプラスミドを複数の細胞に与えることを含む。さらに他の実施形態では、方法は、当該複数の細胞から、標的配列においてインビトロ変異導入が生じた少なくとも１つの細胞を選択することを含む。
【0073】
特定の実施形態では、本発明は、単離ＲＮＰとプラスミドと一本鎖オリゴヌクレオチドと無細胞抽出物とＤＮＡリガーゼとを含む混合物をインキュベートすることを含む、標的配列のインビトロ変異導入を実施する方法を包含する。ＲＮＰは、ｃｒＲＮＡおよびＣｐｆ１酵素を含む。ｃｒＲＮＡは、標的配列に対して相補的であり、ＲＮＰは、プラスミド中に二本鎖切断を生じさせる。一本鎖オリゴヌクレオチドは、Ｃｐｆ１切断部位に対して相補的な５’オーバーハングを含む。再度環状化したプラスミドが生成され、複数の細胞に与えられる。当該複数の細胞から、標的配列においてインビトロ変異導入が生じた少なくとも１つの細胞が選択される。
【0074】
特定の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＮｏｔＩ制限部位を含む。
【0075】
細胞は、当業者に知られている任意の標準的な手段を用いて選択されてよい。一実施形態において、選択は、インビトロ変異導入が生じたことを確認するために細胞をＮｏｔＩ酵素で消化することを含む。無細胞抽出物は、ＨＥＫ、ＨＵＨ－７、ＤＬＤ１、ＨＣＴ１１６およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の細胞または細胞株に由来してよい。
【0076】
本明細書で実証されるのは、天然の系および細菌において見出されるものと類似する、ＲＮＰ粒子がｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒａｃＲＮＡを別々の実体として含む新しい系である。Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質と組み合わせることで、この系は、有効性と精度を高め、標的外部位への変異導入の懸念を低減する。一塩基点変異、一塩基の欠失または挿入、小さな挿入または欠失、および標的遺伝子のコード領域内の小さな重複に及ぶ、一連の変異合成能力が可能である。
【0077】
この新しいアッセイのための基本的工程が確立され、広範囲のＤＮＡ配列の変異について検証された。これは、主に、特定の標的遺伝子において点変異を生じさせることの有効性と効率を高めることに焦点を合わせた。さらに、アッセイの汎用性を拡大し、且つ遺伝子のコード領域内の複数の部位で同時に正確な変異導入を可能にする、より普遍的なＲＮＰ型粒子が使用される。
【0078】
標的遺伝子における様々な改変のためのオリゴヌクレオチドの構造と組成
一本鎖オリゴヌクレオチドは、よく研究されており、多数の化学修飾とバリエーションをそれらの組成に組み込むことができるため、遺伝子編集のために有用な合成ＤＮＡ分子である。これらの修飾のいくつかは、二本鎖ＤＮＡ標的に対するより高い結合親和性を可能にし、重要な反応中間体であるＤ－ループが遺伝学的交換を導くのに十分なほど安定であることを確実にする。標的遺伝子における所望の遺伝学的変化がより高い効率で生じるように、いくつかのクラスの化学修飾をこの研究において用いることができる。特定の実施形態では、一塩基ヌクレオチド改変、欠失または挿入は、無細胞抽出物におけるヌクレアーゼ消化を防ぐために化学修飾された末端連結を有する約７２塩基長のオリゴヌクレオチドによって実施される。この主力オリゴヌクレオチドは、それが、完全な相同域（perfect homologous register）で、および変更のために指定された標的遺伝子中のヌクレオチドにおいて生じる単一のミスマッチを除き標的遺伝子配列と相補的に、結合するように設計される。ミスマッチ塩基対は、それが、相補鎖のアラインメントの間にオリゴヌクレオチド中の中央の塩基で生じる場合に最も効率的に修正される。二重のヌクレオチド置換または小さな挿入もしくは欠失が望まれる標的遺伝子の改変の場合、ターゲティングオリゴヌクレオチドにおいて２つのタイプの化学修飾が利用される。両方とも、標的親和性を高めるように設計され、その結果、標的遺伝子の一部を欠失させることができるか、または小さな挿入を遺伝子配列内に配置できる。結合親和性、および一本鎖オリゴドナー（ｓｓＯＤＮ）がヘリックスに組み込まれる際の侵入するｓｓＯＤＮと二本鎖との間での安定なＤＮＡ対形成、を増加させる化学修飾は、単独で、または組み合わせて、ターゲティングオリゴヌクレオチド中に合成される。
一本鎖オリゴヌクレオチドは、よく研究されており、多数の化学修飾とバリエーションをそれらの組成に組み込むことができるため、遺伝子編集のために有用な合成ＤＮＡ分子である。これらの修飾のいくつかは、二本鎖ＤＮＡ標的に対するより高い結合親和性を可能にし、重要な反応中間体であるＤ－ループが遺伝学的交換を導くのに十分なほど安定であることを確実にする。標的遺伝子における所望の遺伝学的変化がより高い効率で生じるように、いくつかのクラスの化学修飾をこの研究において用いることができる。特定の実施形態では、一塩基ヌクレオチド改変、欠失または挿入は、無細胞抽出物におけるヌクレアーゼ消化を防ぐために化学修飾された末端連結を有する約７２塩基長のオリゴヌクレオチドによって実施される。この主力オリゴヌクレオチドは、それが、完全な相同域（perfect homologous register）で、および変更のために指定された標的遺伝子中のヌクレオチドにおいて生じる単一のミスマッチを除き標的遺伝子配列と相補的に、結合するように設計される。ミスマッチ塩基対は、それが、相補鎖のアラインメントの間にオリゴヌクレオチド中の中央の塩基で生じる場合に最も効率的に修正される。二重のヌクレオチド置換または小さな挿入もしくは欠失が望まれる標的遺伝子の改変の場合、ターゲティングオリゴヌクレオチドにおいて２つのタイプの化学修飾が利用される。両方とも、標的親和性を高めるように設計され、その結果、標的遺伝子の一部を欠失させることができるか、または小さな挿入を遺伝子配列内に配置できる。結合親和性、および一本鎖オリゴドナー（ｓｓＯＤＮ）がヘリックスに組み込まれる際の侵入するｓｓＯＤＮと二本鎖との間での安定なＤＮＡ対形成、を増加させる化学修飾は、単独で、または組み合わせて、ターゲティングオリゴヌクレオチド中に合成される。
【0079】
修飾の２’－Ｏ－（メチル、フルオロなど）の基は、ＲＮＡ標的およびＤＮＡ標的の両方との結合親和性を大幅に増加させ、また、無細胞条件および細胞へのマイクロインジェクション後の両方においてヌクレアーゼ消化に対する耐性を高めることも示されている。典型的には、一連の２’－Ｏ－メチル修飾（３～５個の範囲）が、主力ベクターの左および／または右のアーム（７２ｍｅｒ）に、ならびに標的部位を取り囲む分子の中央の基部内に、組み込まれる。ＤＮＡに対する結合親和性を向上させる別の２’修飾は、オリゴヌクレオチド中の指定された塩基へのフルオロ基の付加である。上と同じく、一連のフルオロ基修飾塩基が、３’と５’のアームに、ならびにターゲティングベクターの中央領域に、配置される。連結型核酸（Linked Nucleic Acid）（ＬＮＡ）は、結合親和性を増加させるための卓越した修飾となっている。ＬＮＡは、２’－Ｏを４’Ｃにつなぎ合わせてメチレンブリッジを作り出し、構造を３’－糖コンフォメーションに効果的にロックする、二環式核酸である。オリゴヌクレオチドの長さは、所望の最終産物が２０塩基の挿入である場合、約７２から約２００塩基まで伸ばすことができるため、オリゴヌクレオチドの側方部は、標的への結合の安定性を改善するために一連のこれらの修飾を有し得る。目的が２０塩基を欠失させることである場合も同様である。特定の実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、５２塩基長であり、結合力を改善する化学部分の側方部を有する。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２５～２００塩基長、およびそれらの間のありとあらゆる数、である。このようにして、一塩基置換を超える遺伝学的改変を、比較的高い効率で生じさせることができ、本明細書で概説される二重標的化アプローチを介して特定できる。
【0080】
オリゴヌクレオチドは、約１０ヌクレオチド～約２００ヌクレオチド、または約５０ヌクレオチド～約１２５ヌクレオチド、または約６０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、または約７０ヌクレオチド～約９０ヌクレオチドの長さになるように設計されてよい。オリゴヌクレオチドは、約４０、４５、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００ヌクレオチド、またはそれらの間の任意のヌクレオチド数、であってよい。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、６０ヌクレオチドを超える長さである。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、７０ヌクレオチドを超える長さである。さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約７２ヌクレオチドの長さである。さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約２５～約２００塩基長である。
【0081】
無細胞抽出物の供給源
発現ベクターまたはエピソーム標的に位置する遺伝子を編集するための酵素活性をもたらす細胞抽出物についてはいくつかの供給源が存在する。哺乳動物細胞のみから核抽出物を単離および精製する傾向があるかもしれないが、細胞質の活性を含む全細胞抽出物は、より高いレベルの遺伝子編集を可能にし、従って、本明細書で説明される実験において使用される。哺乳動物の無細胞抽出物は、ＨＥＫ、ＨＵＨ－７、ＤＬＤ１、ＨＣＴ１１６およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を含むがこれらに限定されない、任意のタイプの細胞から得ることができる。後者２つは結腸癌細胞に由来し、前者は肝臓に由来する。各細胞株は、遺伝子編集活性を触媒できる細胞抽出物のための豊富な供給源となっている。これらの細胞株は、１つ以上のミスマッチ修復タンパク質活性が欠損していることが知られており、これは、やや直感に反するものの、より高いレベルの遺伝子編集を実際に可能にする。ヌクレオチドの交換、挿入または欠失を可能にするために、侵入するオリゴヌクレオチドと標的遺伝子とによってミスマッチが生じると、野生型のミスマッチ修復経路の自然な傾向は、その対形成を認識して不安定化するはずである。広範な遺伝学的および生化学的な研究が実施され、標的部位でｓｓＯＤＮによって駆動されるヌクレオチド交換が、そのような変異細胞のバックグラウンドでは亢進されるということが示された（Ｄｅｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３１（６） ｅ２７）。発現ベクターの遺伝学的改変を可能にする酵母（主にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からの無細胞抽出物の調製と利用は、エピソーム標的を改変するための革新的なアプローチをもたらす。著しく遺伝学的に扱いやすいＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける遺伝学的バックグラウンドの多様性は、一塩基修復、小さなセグメントの欠失、小さなセグメントの挿入または遺伝子フラグメントの重複の実行においてより効率的な可能性がある酵素活性の豊富な供給源をもたらす。従って、最も有効かつ迅速な様式で成功を収めるために、目的に応じて適切な株を無細胞抽出物の供給源として利用できる。
発現ベクターまたはエピソーム標的に位置する遺伝子を編集するための酵素活性をもたらす細胞抽出物についてはいくつかの供給源が存在する。哺乳動物細胞のみから核抽出物を単離および精製する傾向があるかもしれないが、細胞質の活性を含む全細胞抽出物は、より高いレベルの遺伝子編集を可能にし、従って、本明細書で説明される実験において使用される。哺乳動物の無細胞抽出物は、ＨＥＫ、ＨＵＨ－７、ＤＬＤ１、ＨＣＴ１１６およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を含むがこれらに限定されない、任意のタイプの細胞から得ることができる。後者２つは結腸癌細胞に由来し、前者は肝臓に由来する。各細胞株は、遺伝子編集活性を触媒できる細胞抽出物のための豊富な供給源となっている。これらの細胞株は、１つ以上のミスマッチ修復タンパク質活性が欠損していることが知られており、これは、やや直感に反するものの、より高いレベルの遺伝子編集を実際に可能にする。ヌクレオチドの交換、挿入または欠失を可能にするために、侵入するオリゴヌクレオチドと標的遺伝子とによってミスマッチが生じると、野生型のミスマッチ修復経路の自然な傾向は、その対形成を認識して不安定化するはずである。広範な遺伝学的および生化学的な研究が実施され、標的部位でｓｓＯＤＮによって駆動されるヌクレオチド交換が、そのような変異細胞のバックグラウンドでは亢進されるということが示された（Ｄｅｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３１（６） ｅ２７）。発現ベクターの遺伝学的改変を可能にする酵母（主にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からの無細胞抽出物の調製と利用は、エピソーム標的を改変するための革新的なアプローチをもたらす。著しく遺伝学的に扱いやすいＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける遺伝学的バックグラウンドの多様性は、一塩基修復、小さなセグメントの欠失、小さなセグメントの挿入または遺伝子フラグメントの重複の実行においてより効率的な可能性がある酵素活性の豊富な供給源をもたらす。従って、最も有効かつ迅速な様式で成功を収めるために、目的に応じて適切な株を無細胞抽出物の供給源として利用できる。
【0082】
無細胞抽出物の補充
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの化学修飾は、広範囲の適切な遺伝学的改変を生じさせるための最も効率的なストラテジーをもたらす。しかし、特定の一連の遺伝子変化が問題となるのであれば、追加の遺伝学的ツールを補充した細胞抽出物を用いてよい。哺乳動物細胞株で高発現する多種多様なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９発現コンストラクトが利用可能である。これらのコンストラクトの非限定的な例としては、ヒトのコドンに最適化されたＳｐＣａｓ９とキメラガイドＲＮＡのための挿入部位とを含むプラスミドｐ４２２３０、およびｐＸ３３０バックボーンベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）を用いた他のコンストラクトが挙げられる。特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コンストラクトを哺乳動物細胞にトランスフェクトし、無細胞抽出物を調製する前に発現させることにより、遺伝子編集の酵素活性を高めることができる。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、無細胞抽出物の補充は、オリゴヌクレオチドを特定の部位に導いて標的遺伝子の編集の頻度を間接的に高めるのに役立つ可能性がある。特定の実施形態では、標的遺伝子のＤＮＡセグメントの単純な欠失または挿入が実験の目的であれば、最初にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の機能を補充した無細胞抽出物を利用して、その遺伝学的変化の発生を可能にすることが好ましい可能性がある。長い一本鎖ＤＮＡ分子を哺乳動物の遺伝子にインフレームで挿入して、その機能しない遺伝子にタグ付けする、革新的な一連の実験が実施されている（Ｍｉｕｒａ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ． ２０１５， Ａｕｇ ５；５：１２７９９）。そのようなアプローチも、無細胞抽出物を用いてインビトロで使用できる。
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの化学修飾は、広範囲の適切な遺伝学的改変を生じさせるための最も効率的なストラテジーをもたらす。しかし、特定の一連の遺伝子変化が問題となるのであれば、追加の遺伝学的ツールを補充した細胞抽出物を用いてよい。哺乳動物細胞株で高発現する多種多様なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９発現コンストラクトが利用可能である。これらのコンストラクトの非限定的な例としては、ヒトのコドンに最適化されたＳｐＣａｓ９とキメラガイドＲＮＡのための挿入部位とを含むプラスミドｐ４２２３０、およびｐＸ３３０バックボーンベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）を用いた他のコンストラクトが挙げられる。特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コンストラクトを哺乳動物細胞にトランスフェクトし、無細胞抽出物を調製する前に発現させることにより、遺伝子編集の酵素活性を高めることができる。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、無細胞抽出物の補充は、オリゴヌクレオチドを特定の部位に導いて標的遺伝子の編集の頻度を間接的に高めるのに役立つ可能性がある。特定の実施形態では、標的遺伝子のＤＮＡセグメントの単純な欠失または挿入が実験の目的であれば、最初にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の機能を補充した無細胞抽出物を利用して、その遺伝学的変化の発生を可能にすることが好ましい可能性がある。長い一本鎖ＤＮＡ分子を哺乳動物の遺伝子にインフレームで挿入して、その機能しない遺伝子にタグ付けする、革新的な一連の実験が実施されている（Ｍｉｕｒａ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ． ２０１５， Ａｕｇ ５；５：１２７９９）。そのようなアプローチも、無細胞抽出物を用いてインビトロで使用できる。
【0083】
キット
特定の態様では、本発明は、標的配列のためのインビトロ変異導入キットを提供する。一実施形態において、キットは、単離リボヌクレオチド粒子（ＲＮＰ）と、二本鎖オリゴヌクレオチドと、プラスミドと、バッファと、無細胞抽出物と、ＤＮＡリガーゼと、それらの使用のための取扱説明資料と、を含む。ＲＮＰは、ｃｒＲＮＡおよびＣｐｆ１酵素を含み、ここで、ｃｒＲＮＡは、標的配列に対して相補的であり、二本鎖オリゴヌクレオチドは、Ｃｐｆ１切断部位に対して相補的な５’オーバーハングを含む。特定の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＮｏｔＩ制限部位を含む。
特定の態様では、本発明は、標的配列のためのインビトロ変異導入キットを提供する。一実施形態において、キットは、単離リボヌクレオチド粒子（ＲＮＰ）と、二本鎖オリゴヌクレオチドと、プラスミドと、バッファと、無細胞抽出物と、ＤＮＡリガーゼと、それらの使用のための取扱説明資料と、を含む。ＲＮＰは、ｃｒＲＮＡおよびＣｐｆ１酵素を含み、ここで、ｃｒＲＮＡは、標的配列に対して相補的であり、二本鎖オリゴヌクレオチドは、Ｃｐｆ１切断部位に対して相補的な５’オーバーハングを含む。特定の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＮｏｔＩ制限部位を含む。
【0084】
別の実施形態では、インビトロ変異導入キットは、単離リボヌクレオチド粒子（ＲＮＰ）と、一本鎖オリゴヌクレオチドと、プラスミドと、バッファと、無細胞抽出物と、ＤＮＡリガーゼと、それらの使用のための取扱説明資料と、を含む。ＲＮＰは、ｃｒＲＮＡおよびＣｐｆ１酵素を含む。ｃｒＲＮＡは、標的遺伝子に対して相補的であり、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＮｏｔＩ制限部位と、Ｃｐｆ１切断部位に対して相補的な５’オーバーハングと、を含む。
【0085】
キットは、第２の標的配列に対して相補的な第２のｃｒＲＮＡを含む第２のＲＮＰをさらに含んでよい。
【0086】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、標的とされる遺伝学的変化を誘発するための容易かつ効率的な系である。Ｃａｓ９タンパク質による標的の認識は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）中の「シード」配列と、ｇＲＮＡ結合領域の上流にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む保存されたトリヌクレオチドと、を必要とする。そのため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、細胞株（２９３Ｔ細胞など）、初代細胞およびＣＡＲ Ｔ細胞における使用のためにｇＲＮＡを再設計することによって事実上任意のＤＮＡ配列を切断するように設計できる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、単一のＣａｓ９タンパク質を２種以上のｇＲＮＡと共発現させることによって複数のゲノム上の座位を同時に標的とすることができ、これにより、この系は、複数の遺伝子編集または複数の標的遺伝子の相乗的活性化に比類なく適したものとなっている。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、標的とされる遺伝学的変化を誘発するための容易かつ効率的な系である。Ｃａｓ９タンパク質による標的の認識は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）中の「シード」配列と、ｇＲＮＡ結合領域の上流にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む保存されたトリヌクレオチドと、を必要とする。そのため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、細胞株（２９３Ｔ細胞など）、初代細胞およびＣＡＲ Ｔ細胞における使用のためにｇＲＮＡを再設計することによって事実上任意のＤＮＡ配列を切断するように設計できる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、単一のＣａｓ９タンパク質を２種以上のｇＲＮＡと共発現させることによって複数のゲノム上の座位を同時に標的とすることができ、これにより、この系は、複数の遺伝子編集または複数の標的遺伝子の相乗的活性化に比類なく適したものとなっている。
【0087】
米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７では、遺伝子発現を阻害するために用いられるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの一例であるＣＲＩＳＰＲｉが説明されている。エラーを起こしやすい修復経路を惹起してフレームシフト変異をもたらすＤＮＡ二本鎖切断を誘発するためにＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを利用する、ＣＲＩＳＰＲｉは、永久的な遺伝子破壊を誘発する。触媒活性のないＣａｓ９（catalytically dead Cas9）は、エンドヌクレアーゼ活性を欠いている。ガイドＲＮＡと共発現させると、転写の伸長、ＲＮＡポリメラーゼの結合または転写因子の結合を特異的に妨げるＤＮＡ認識複合体が生じる。このＣＲＩＳＰＲｉシステムは、標的遺伝子の発現を効率的に抑制する。
【0088】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓでの遺伝子破壊は、標的遺伝子に対して特異的なガイド核酸配列とＣａｓエンドヌクレアーゼが細胞に導入され、これらが、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが標的遺伝子に二本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成すると、起こる。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、限定されるものではないがｐＡｄ５Ｆ３５－ＣＲＩＳＰＲベクターなど、発現ベクターを含む。別の実施形態では、Ｃａｓ発現ベクターは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの発現を誘導する。Ｔ７、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｆｏｋ１、当技術分野で知られている他のヌクレアーゼ、およびそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、他のエンドヌクレアーゼが用いられてもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓ９は、ｓｐＣａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃｐｆ２、ＣａｓＹ、ＣａｓＸ、および／またはｓａＣａｓ９をさらに包含する。
【0089】
特定の実施形態では、Ｃａｓ発現ベクターの誘導は、Ｃａｓ発現ベクター中の誘導性プロモーターを活性化する作用因子に細胞を曝露させることを含む。そのような実施形態では、Ｃａｓ発現ベクターは、抗生物質への曝露によって（テトラサイクリンまたはテトラサイクリンの誘導体（例えばドキシサイクリン）によって）誘導可能であるものなどの誘導性プロモーターを含む。しかし、他の誘導性プロモーターが用いられてもよいということが理解されるべきである。誘導因子は、誘導性プロモーターの誘導をもたらす選択条件（例えば、作用因子（例えば抗生物質）への曝露）であってよい。これは、Ｃａｓ発現ベクターの発現をもたらす。
【0090】
ガイド核酸配列は、遺伝子に対して特異的であり、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによって誘発される二本鎖切断のためにその遺伝子を標的とする。ガイド核酸配列の配列は、当該遺伝子の座位内にあってよい。特定の実施形態では、ガイド核酸配列は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチドまたはそれ以上の長さである。
【0091】
ガイド核酸配列は、免疫原性を低下させるか免疫抑制性の微小環境に対する感受性を低下させる遺伝子など、任意の遺伝子に対して特異的であってよい。ガイド核酸配列には、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、それらの組み合わせ（ＲＮＡ－ＤＮＡ組み合わせ配列）、または合成ヌクレオチドを含む配列が包含される。ガイド核酸配列は、単一分子または二重分子であってよい。特定の実施形態では、ガイド核酸配列は、単一のガイドＲＮＡを含む。
【0092】
ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関して、「標的配列」は、いくらかの相補性を有するようにガイド配列が設計される配列を指し、ここで、標的配列とガイド配列との間でのハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こしてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも要求されない。標的配列は、ＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドなど、任意のポリヌクレオチドを含んでよい。典型的には、ＣＲＩＳＰＲシステムに関する場合、（標的配列にハイブリダイズして１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体形成したガイド配列を含む）ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成は、標的配列中に、または標的配列の近くに（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０またはそれ以上の塩基対の範囲内に）、一方または両方の鎖の切断をもたらす。標的配列と同様に、これが機能するのに十分であれば、完全な相補性は要求されないと考えられる。特定の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、最も適切に位置合わせされた場合、ｔｒａｃｒの相手となる配列（tracr mate sequence）の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の配列相補性を有する。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上の要素の発現を駆動する１つ以上のベクターが宿主細胞に導入され、その結果、当該ＣＲＩＳＰＲシステムの要素の発現が、１つ以上の標的部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を導く。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒの相手となる配列に連結されたガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列は、それぞれ、別々のベクター上で別々の調節エレメントに機能可能なように連結されている可能性がある。あるいは、同じか異なる調節エレメントから発現される２つ以上の要素が１つのベクター中にまとめられ、この第１のベクターに含まれないＣＲＩＳＰＲシステムの任意の要素を１つ以上の追加のベクターが提供してもよい。１つのベクター中にまとめられているＣＲＩＳＰＲシステムの要素は、１つの要素が第２の要素に対して５’側に（第２の要素の「上流に」）、または第２の要素に対して３’側に（第２の要素の「下流に」）、位置するなど、任意の適切な方向で配置されてよい。１つの要素のコード配列は、第２の要素のコード配列と同じか反対側の鎖上に位置し、同じ方向または逆方向を向いていてよい。特定の実施形態では、単一のプロモーターが、ＣＲＩＳＰＲ酵素と、１つ以上のイントロン配列中に（例えば、それぞれ異なるイントロン中に、２つ以上が少なくとも１つのイントロン中に、または全てが１つのイントロン中に）埋め込まれたガイド配列、ｔｒａｃｒの相手となる配列（任意選択で、ガイド配列に機能可能なように連結されていてもよい）およびｔｒａｃｒ配列のうちの１つ以上と、をコードする転写物の発現を駆動する。
【0093】
特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素に加えて約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１個以上の、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１個以上よりも多い、ドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意の追加的なタンパク質配列を含んでよく、任意選択で、任意の２つのドメインの間にリンカー配列を含んでもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合され得るタンパク質ドメインの例としては、限定されるものではないが、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、および以下の活性のうちの１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられる：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性（transcription release factor activity）、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性および核酸結合活性。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得る、さらなるドメインは、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１００５９５０２で説明されている。特定の実施形態では、標的配列の位置を特定するために、タグ付けされたＣＲＩＳＰＲ酵素が使用される。
【0094】
従来のウイルスベースおよび非ウイルスベースの遺伝子導入法を用いて哺乳動物細胞または標的組織に核酸を導入できる。そのような方法を用いて、ＣＲＩＳＰＲシステムの成分をコードする核酸を培養中の細胞または宿主生物の細胞に与えることができる。非ウイルスベクター送達系には、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書で説明されるベクターの転写物）、裸の核酸、および送達ビヒクル（リポソームなど）と複合体形成した核酸が包含される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のための別の送達様式は、Ｃａｓ９－ガイドＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の形態のＲＮＡと精製Ｃａｓ９タンパク質の組み合わせを含む（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， ＥＬｉｆｅ ３：ｅ０４７６６）。ウイルスベクター送達系には、細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有する、ＤＮＡウイルスとＲＮＡウイルスが包含される（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， １９９２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８－８１３；およびＹｕ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３－２６）。
【0095】
特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来する。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ９タンパク質に由来する。Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたは他の種に由来してよい。
【0096】
一般に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、少なくとも１つのＲＮＡ認識および／またはＲＮＡ結合ドメインを含む。ＲＮＡ認識および／またはＲＮＡ結合ドメインは、ガイドＲＮＡと相互作用する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（すなわち、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、ＲＮＡｓｅドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、二量体化ドメインならびに他のドメインを含んでもよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、核酸結合の親和性および／または特異性を増加させるように、酵素活性を変化させるように、および／または当該タンパク質の別の特性を変化させるように、改変されてよい。特定の実施形態では、融合タンパク質のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質またはそのフラグメントに由来してよい。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、改変型Ｃａｓ９タンパク質に由来してよい。例えば、Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、当該タンパク質の１つ以上の特性（例えば、ヌクレアーゼ活性、親和性、安定性など）を変化させるように改変されてよい。あるいは、ＲＮＡ誘導型切断に関与しないＣａｓ９タンパク質のドメインは、改変型Ｃａｓ９タンパク質が野生型Ｃａｓ９タンパク質よりも小さくなるように当該タンパク質から排除されてよい。一般に、Ｃａｓ９タンパク質は、少なくとも２つのヌクレアーゼ（すなわち、ＤＮａｓｅ）ドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインは連携して一本鎖を切断し、ＤＮＡ中に二本鎖切断を作り出す（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３３７：８１６－８２１）。特定の実施形態では、Ｃａｓ９由来タンパク質は、機能するヌクレアーゼドメイン（ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインのいずれか）を１つだけ含むように改変されてよい。例えば、Ｃａｓ９由来タンパク質は、ヌクレアーゼドメインのうちの１つを除去する、または機能しなくなる（すなわち、ヌクレアーゼ活性が存在しない）ように変異させる、ように改変されてよい。ヌクレアーゼドメインのうちの１つが不活性である一部の実施形態では、Ｃａｓ９由来タンパク質は、二本鎖核酸にニックを導入することができるが（そのようなタンパク質は「ニッカーゼ」と呼称される）、二本鎖ＤＮＡを切断することはできない。上記の実施形態のいずれにおいても、ヌクレアーゼドメインのいずれかまたは全てが、部位特異的変異導入、ＰＣＲを介した変異導入、および全遺伝子合成、ならびに当技術分野で知られている他の方法など、周知の方法を用いて１つ以上の欠失変異、挿入変異および／または置換変異によって不活性化されてよい。
【0097】
１つの非限定的な実施形態において、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲシステムの発現を駆動する。当技術分野には、本発明において有用である好適なベクターが豊富にある。使用されるベクターは複製に適しており、任意選択で、真核細胞における組込みに適していてもよい。典型的なベクターは、転写と翻訳のターミネーター、開始配列、および所望の核酸配列の発現の調節に有用なプロモーターを含む。本発明のベクターはまた、核酸標準遺伝子送達プロトコル（nucleic acid standard gene delivery protocols）のために使用されてもよい。遺伝子送達のための方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号など、当技術分野において公知である。
【0098】
さらに、ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に与えられてもよい。ウイルスベクター技術は、当技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（第４版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２０１２）において、および他のウイルス学および分子生物学のマニュアルにおいて、説明されている。ベクターとして有用であるウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、シンドビスウイルス、ガンマレトロウイルスおよびレンチウイルスが包含されるが、これらに限定されない。一般に、好適なベクターは、少なくとも１種の生物で機能する複製開始点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つ以上の選択マーカーを含む（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８および米国特許第６，３２６，１９３号）。
【0099】
当業者であれば、本出願で説明される特定の手順、実施形態、特許請求の範囲および実施例に対する数多くの同等物を認識するか、通例の実験法だけを用いてそれらを確認できる。そのような同等物は、本発明の範囲内に属すると見なされ、本明細書に添付された特許請求の範囲に包含される。例えば、当技術分野で認識されている代替手段による、および通例の実験法だけを用いた、反応時間、反応のサイズ／体積、反応温度および実験試薬（溶媒、触媒、圧力、大気条件、および還元剤／酸化剤など）を含むがこれらに限定されない反応条件の改変は、本出願の範囲内に属する、ということが理解されるべきである。
【0100】
本明細書において値および範囲が提示されている場合は常に、これらの値および範囲に包含される全ての値および範囲が本発明の範囲内に包含されることが意図されている、ということが理解されるべきである。さらに、これらの範囲内に属する全ての値ならびに値の範囲の上限または下限も、本出願により企図される。
【0101】
以下の実施例は、本発明の態様をさらに説明する。しかし、それらは決して、本明細書に記載される本発明の教示または開示を限定するものではない。
【実施例】
【0102】
実験による実施例
本発明はさらに、以下の実験による実施例を参照することにより、詳細に説明される。これらの実施例は、単に説明を目的として提示されているに過ぎず、特に指定の無い限り、限定することを意図したものではない。従って、本発明は、決して以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになる、ありとあらゆるバリエーションを包含すると解釈されるべきである。
本発明はさらに、以下の実験による実施例を参照することにより、詳細に説明される。これらの実施例は、単に説明を目的として提示されているに過ぎず、特に指定の無い限り、限定することを意図したものではない。従って、本発明は、決して以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになる、ありとあらゆるバリエーションを包含すると解釈されるべきである。
【0103】
さらなる説明がなくとも、当業者は、前述の説明および以下の例示的な実施例を用いて、本発明の化合物を作製および利用できるし、特許請求される方法を実施できる、と考えられる。従って、以下の実施例は、本発明の例示的な実施形態を具体的に示すものであり、本開示の残りの部分を何らかの形で限定するものと解釈されるべきではない。
【0104】
これらの実験において利用される材料と方法を以下で説明する。
【0105】
無細胞抽出物の調製：
無細胞抽出物は、Ｃｏｌｅ－Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９． Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７（５）， １３２３－１３３０に概説されている手法に従って２億個のＨＣＴ１１６－１９細胞から調製した。得られた抽出物をすぐに等分し、－８０℃で保存した。ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）を培養し、８×１０６個の細胞を回収し、すぐに冷低張バッファ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、および２５０ｍＭ スクロース）で洗浄した。細胞を遠心分離し、洗浄し、スクロースを含まない冷低張バッファに再懸濁した後、氷上で１５分間インキュベートしてから、２５ストロークのＤｏｕｎｃｅホモジナイザーで溶解させた。濃い細胞ライセートの細胞質画分を氷上で６０分間インキュベートし、１２，０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。次いで、上清を等分し、すぐに－８０℃で凍結した。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて無細胞抽出物の濃度を決定した。
無細胞抽出物は、Ｃｏｌｅ－Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９． Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７（５）， １３２３－１３３０に概説されている手法に従って２億個のＨＣＴ１１６－１９細胞から調製した。得られた抽出物をすぐに等分し、－８０℃で保存した。ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）を培養し、８×１０６個の細胞を回収し、すぐに冷低張バッファ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、および２５０ｍＭ スクロース）で洗浄した。細胞を遠心分離し、洗浄し、スクロースを含まない冷低張バッファに再懸濁した後、氷上で１５分間インキュベートしてから、２５ストロークのＤｏｕｎｃｅホモジナイザーで溶解させた。濃い細胞ライセートの細胞質画分を氷上で６０分間インキュベートし、１２，０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。次いで、上清を等分し、すぐに－８０℃で凍結した。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて無細胞抽出物の濃度を決定した。
【0106】
ＲＮＰの構築：
Ｃａｓ９およびｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ成分を、１反応あたり１０ｐｍｏｌで８つの反応を行うことができるようにＲＮＰ複合体としてアセンブルさせた。
Ｃａｓ９およびｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ成分を、１反応あたり１０ｐｍｏｌで８つの反応を行うことができるようにＲＮＰ複合体としてアセンブルさせた。
【0107】
インビトロ反応：
特定の実施形態では、表１に示される成分で反応を準備し、３７℃で１２０分間インキュベートした。特定の実施形態では、インビトロＤＮＡ切断反応混合物は、２０μｌという最終体積で反応バッファ（１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中に混合された、２５０ｎｇのｐＨＳＧ２９９（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｃｏｍｐａｎｙ、滋賀、日本）またはｐＫＲＡＳ６１６３のプラスミドＤＮＡと１０ｐｍｏｌのＲＮＰを含んだ。各反応を３７℃で１５分間インキュベートした後、反応混合物からＤＮＡを単離し、シリカスピンカラムを用いて精製した。二次的なインビトロ再環状化反応は、３５μｌという最終体積となるように反応バッファ（２０ｍＭ ＴＲＩＳ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．４ｍＭ ＤＴＴ、および１．０ｍＭ ＡＴＰ）中に混合された、最初の切断反応から単離されたＤＮＡと、リガーゼを補充された１７５μｇの無細胞抽出物と、を含んだ。各反応を３７℃で１５分間インキュベートした。二本鎖の挿入フラグメントまたは置換フラグメントを含む反応の場合、１００ｐｍｏｌを最終反応混合物に添加した。次いで、最終反応混合物からのＤＮＡを、シリカスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ， ドイツ）を用いて精製した。
特定の実施形態では、表１に示される成分で反応を準備し、３７℃で１２０分間インキュベートした。特定の実施形態では、インビトロＤＮＡ切断反応混合物は、２０μｌという最終体積で反応バッファ（１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中に混合された、２５０ｎｇのｐＨＳＧ２９９（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｃｏｍｐａｎｙ、滋賀、日本）またはｐＫＲＡＳ６１６３のプラスミドＤＮＡと１０ｐｍｏｌのＲＮＰを含んだ。各反応を３７℃で１５分間インキュベートした後、反応混合物からＤＮＡを単離し、シリカスピンカラムを用いて精製した。二次的なインビトロ再環状化反応は、３５μｌという最終体積となるように反応バッファ（２０ｍＭ ＴＲＩＳ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．４ｍＭ ＤＴＴ、および１．０ｍＭ ＡＴＰ）中に混合された、最初の切断反応から単離されたＤＮＡと、リガーゼを補充された１７５μｇの無細胞抽出物と、を含んだ。各反応を３７℃で１５分間インキュベートした。二本鎖の挿入フラグメントまたは置換フラグメントを含む反応の場合、１００ｐｍｏｌを最終反応混合物に添加した。次いで、最終反応混合物からのＤＮＡを、シリカスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ， ドイツ）を用いて精製した。
【0108】
【表1】
【0109】
プラスミドＤＮＡの単離：
インキュベーションの後、各反応混合物をＰＢバッファにより１：５の比率で希釈した。ＱｉａｇｅｎのＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐプロトコルに従ってシリカメンブレンスピンカラムを用いてプラスミドＤＮＡを単離し、１０μＬの水で溶出した。ミニプレッププラスミドの収量は６２０ｎｇ～１．８μｇの範囲であったが、対照混合物では全成分混合物よりもプラスミドの回収量が高かった。
インキュベーションの後、各反応混合物をＰＢバッファにより１：５の比率で希釈した。ＱｉａｇｅｎのＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐプロトコルに従ってシリカメンブレンスピンカラムを用いてプラスミドＤＮＡを単離し、１０μＬの水で溶出した。ミニプレッププラスミドの収量は６２０ｎｇ～１．８μｇの範囲であったが、対照混合物では全成分混合物よりもプラスミドの回収量が高かった。
【0110】
単離されたプラスミドのコンピテント細胞への形質転換：
８つの反応混合物の各々から単離された、完全なプラスミドＤＮＡの濃度が様々な１０μＬを全て用いて、８つの形質転換を実施した。形質転換は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＯｎｅＳｈｏｔ ＴＯＰ１０ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉのプロトコルが概説するヒートショック手法のプロトコルに従って実施した。
８つの反応混合物の各々から単離された、完全なプラスミドＤＮＡの濃度が様々な１０μＬを全て用いて、８つの形質転換を実施した。形質転換は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＯｎｅＳｈｏｔ ＴＯＰ１０ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉのプロトコルが概説するヒートショック手法のプロトコルに従って実施した。
【0111】
形質転換細胞のプレーティングとカナマイシン選択：
形質転換細胞を１：５および１：１００の希釈の後にカナマイシンプレートにプレーティングし、一晩インキュベートしてカナマイシン耐性コロニーを増殖させた。インキュベーションの後、最後の３つの全成分反応を優先しながら１：１００希釈のプレートの８枚から３０コロニーを選択し、密封し、シーケンシングのために発送した。
形質転換細胞を１：５および１：１００の希釈の後にカナマイシンプレートにプレーティングし、一晩インキュベートしてカナマイシン耐性コロニーを増殖させた。インキュベーションの後、最後の３つの全成分反応を優先しながら１：１００希釈のプレートの８枚から３０コロニーを選択し、密封し、シーケンシングのために発送した。
【0112】
形質転換、選択、ＤＮＡの単離および分析：
インビトロ反応から回収したプラスミドＤＮＡをヒートショック法によってＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）またはＴＯＰ１０ Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＤＥ）のコンピテントＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。コンピテント細胞を氷上で３０分間インキュベートし、４２℃で２０秒間ヒートショックを与え、氷上に２分間置き、２２５ｒｐｍで１時間、３７℃にて１ｍｌのＳＯＣ培地中でインキュベートした。無希釈のコンピテント細胞を、カナマイシンを含む培地上にプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。単一のカナマイシン耐性コロニーを選択し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ， ドイツ）によってプラスミドＤＮＡを単離した。細菌コロニーから選択されたプラスミドＤＮＡに対する改変を、ＤＮＡシーケンシング（ＧｅｎｅＷｉｚ， Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ， ＮＪ）の後に評価した。関連するプラスミドの野生型配列に対してサンプルの配列をアラインメントするためにＳｎａｐＧｅｎｅソフトウェアを用いて、配列分析と破壊パターンを評価した。
インビトロ反応から回収したプラスミドＤＮＡをヒートショック法によってＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）またはＴＯＰ１０ Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＤＥ）のコンピテントＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。コンピテント細胞を氷上で３０分間インキュベートし、４２℃で２０秒間ヒートショックを与え、氷上に２分間置き、２２５ｒｐｍで１時間、３７℃にて１ｍｌのＳＯＣ培地中でインキュベートした。無希釈のコンピテント細胞を、カナマイシンを含む培地上にプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。単一のカナマイシン耐性コロニーを選択し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ， ドイツ）によってプラスミドＤＮＡを単離した。細菌コロニーから選択されたプラスミドＤＮＡに対する改変を、ＤＮＡシーケンシング（ＧｅｎｅＷｉｚ， Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ， ＮＪ）の後に評価した。関連するプラスミドの野生型配列に対してサンプルの配列をアラインメントするためにＳｎａｐＧｅｎｅソフトウェアを用いて、配列分析と破壊パターンを評価した。
【0113】
実験の結果を以下で説明する。
【0114】
実施例１：精製ＤＮＡテンプレートに対する、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体へとアセンブルされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のインビトロ活性
ＲＮＰのアセンブリのために、ｔｒａｃｒＲＮＡおよび（ｃｒ）ｉｓｐｒＲＮＡを別でアニーリングさせた後、精製Ｃａｓ９タンパク質を添加した（図１）。ＲＮＰのアセンブリの条件およびＣａｓ９は、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）， Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ， ＩＡ）によって提供された。
ＲＮＰのアセンブリのために、ｔｒａｃｒＲＮＡおよび（ｃｒ）ｉｓｐｒＲＮＡを別でアニーリングさせた後、精製Ｃａｓ９タンパク質を添加した（図１）。ＲＮＰのアセンブリの条件およびＣａｓ９は、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）， Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ， ＩＡ）によって提供された。
【0115】
精製ＲＮＰ複合体のＤＮＡ切断活性を図２に示す。反応は、ＲＮＰによる切断のために指定された標的配列を含むｅＧＦＰ遺伝子を含む超らせんＤＮＡプラスミド分子の使用に基づく。ＭＷマーカーのレーンに続いて、レーン１は、超らせん形態の精製プラスミドＤＮＡを示す。レーン２～５は、増加する量のＲＮＰ複合体を含む反応混合物の産物を示す。最も低いレベルにおいてさえ、二本鎖ＤＮＡ切断が観察された。過剰な５０ｐｍｏｌのレベルでは、おそらくは反応中にＣａｓ９タンパク質が大量にあるせいで、ＤＮＡ切断活性が実際にブロックされる。このタイトレーションにより、インビトロ変異導入キットにおいて用いられるＲＮＰがＤＮＡを効率的に切断していることが確認された。
【0116】
ＲＮＰによって導かれる切断の特異性を示すために実験を設計した（図３）。無処理のＨＣＴ１１６－１９細胞からゲノムＤＮＡを単離し、ＰＣＲを用いて、組み込まれた変異型ｅＧＦＰ遺伝子の配列を包囲する６０５ｂｐの増幅産物を生成させた。この増幅産物を、それぞれ２５ｐｍｏｌおよび５０ｐｍｏｌのＲＮＰ複合体と組み合わせ、３７℃で４０分間インキュベートした。完全な反応では、ＲＮＰ複合体のために設計された特定の切断部位から予測されるフラグメントと一致するサイズを有する２つの産物が生じた。対照として、ＲＮＰ複合体を、細胞株Ｋ５６２からの３４５塩基対の長さのＨＢＢ遺伝子から生成された増幅産物と共にインキュベートした。対照となる消化を、制限酵素ＤｄｅＩを用いて３４５塩基の増幅産物に対して実施した。この３４５塩基対のフラグメントは、ｅＧＦＰ標的を切断するように設計された（そして、本明細書中の他の場合には切断が成功した）ＲＮＰによる消化には耐性であった。制限酵素Ｄｄｅ１による消化は、ＰＣＲ産物が切断可能であることを保証するための陽性対照として役立った。ＲＮＰ複合体の個々の成分が省かれた場合の酵素活性を示す酵素反応を実施した（図４）。ＤＮＡ切断活性は、ＲＮＰの成分が全て存在する場合に最も有効であった（図４、レーン３）。ＲＮＰ切断の産物に対する哺乳動物の無細胞抽出物の活性を試験した。重要なことに、１０μｇの無細胞抽出物を含む反応では、プラスミドのいくらかの再環状化が観察された（図５、レーン３）。この特別な場合において、無細胞抽出物は、直鎖状となったプラスミドの部分的な再環状化を触媒した。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、おそらく、直鎖状となったプラスミドがヌクレオチド交換のためのテンプレートである。この実験は、超らせんＤＮＡが、ＲＮＰ粒子によって首尾よく切断され、無細胞抽出物によって環状形態に部分的に戻され得る、ということを実証した。重要なことに、ＲＮＰによって処理されたＤＮＡテンプレートは、機能する用量の無細胞抽出物中で安定であった。
【0117】
実施例２：インビトロ変異導入
本発明の遺伝学的読み出しの系の初期化と検証のストラテジーを図６に示す。ＲＮＰ粒子のアセンブリから始まり、その後に、一本鎖オリゴヌクレオチドと無細胞抽出物と遺伝子標的（この非限定的な実施例ではｅＧＦＰ遺伝子）を有する超らせんプラスミドＤＮＡテンプレートとが添加される、反応全体が示されている。反応は４０～６０分間行われ、その後に、標準的なＤＮＡミニプレップのプロトコルを用いて標的プラスミドを単離する。次いで、ヒートショックプロトコルによってプラスミド集団をエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に形質転換し、アンピシリンを含む寒天プレート上に細胞をプレーティングする。元のプラスミドには野生型アンピシリン耐性遺伝子が含まれており、従って、アンピシリン耐性を有する単一の形質転換細菌細胞から増殖する細菌コロニーを選択できる。アンピシリン耐性コロニーを採取し（通常は一度に５０個）、ＤＮＡシーケンシングのために処理する。ｅＧＦＰ遺伝子を含むＤＮＡ配列における対照の反応が、遺伝子の強調表示を伴ってプレートの下に示されている。本明細書で実証される実験では、ＴＡＧコドンが、ＴＡＣへの変換の標的とされた。
本発明の遺伝学的読み出しの系の初期化と検証のストラテジーを図６に示す。ＲＮＰ粒子のアセンブリから始まり、その後に、一本鎖オリゴヌクレオチドと無細胞抽出物と遺伝子標的（この非限定的な実施例ではｅＧＦＰ遺伝子）を有する超らせんプラスミドＤＮＡテンプレートとが添加される、反応全体が示されている。反応は４０～６０分間行われ、その後に、標準的なＤＮＡミニプレップのプロトコルを用いて標的プラスミドを単離する。次いで、ヒートショックプロトコルによってプラスミド集団をエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に形質転換し、アンピシリンを含む寒天プレート上に細胞をプレーティングする。元のプラスミドには野生型アンピシリン耐性遺伝子が含まれており、従って、アンピシリン耐性を有する単一の形質転換細菌細胞から増殖する細菌コロニーを選択できる。アンピシリン耐性コロニーを採取し（通常は一度に５０個）、ＤＮＡシーケンシングのために処理する。ｅＧＦＰ遺伝子を含むＤＮＡ配列における対照の反応が、遺伝子の強調表示を伴ってプレートの下に示されている。本明細書で実証される実験では、ＴＡＧコドンが、ＴＡＣへの変換の標的とされた。
【0118】
本研究では、２つの遺伝学的読み出しが用いられている。１つ目は、プラスミドｐＫａｎにおけるＧ残基のＴ残基への修正によるカナマイシン感受性のカナマイシン耐性への変換である（図７Ａ）。もう一方のプラスミドは、容易な選択のための抗生物質耐性遺伝子を含まないが、形質転換後にプラスミドを受容した細胞のスクリーニングのために野生型形態のアンピシリン耐性遺伝子を有する（図７Ｂ）。この場合、標的は、３番目の塩基ＧからＣへの変換により野生型ｅＧＦＰが生じる終止コドンを有するｅＧＦＰ遺伝子である。プラスミドは両方とも、抗生物質耐性の選択に関して、またはコロニースクリーニングおよび直接的な任意抽出のＤＮＡシーケンシング（direct, unselected DNA sequencing）を介して、この系の汎用性を実証するために使用される。
【0119】
無細胞抽出物は、試験された様々な組み合わせによって証明されるように、低いレベルで一塩基修復を触媒することが可能である（表２）。ＲＮＰまたはオリゴヌクレオチドを含め、遺伝子編集の成分を個々に添加しても、ｐＫａｎプラスミドの部位特異的な変異導入および変換を触媒しない。ＲＮＰ、一本鎖オリゴヌクレオチドおよび無細胞抽出物を同時に添加すると、ｐＫａｎ感受性プラスミドからｐＫａｎ耐性プラスミドへの変換の非常に大幅な増加を触媒した。４つの実験を３連で実施して、表３に提示されるデータを得た；コロニー数の平均範囲が提示されている。
【0120】
【表2】
【0121】
ｐｅＧＦＰ－からｐｅＧＦＰ＋への変換における一塩基の変更または変異導入は、ＲＮＰ、一本鎖オリゴヌクレオチドおよび無細胞抽出物を含む全ての反応成分を必要とした（表３）。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＰが存在しない場合、無細胞抽出物は、ｅＧＦＰ遺伝子内での変異導入事象を触媒しなかった（選択なし）。図８Ａ～図８Ｂの配列は、分析された１００個のコロニーのうち９個で点変異、欠失および挿入が生じたということを示す。１００個のアンピシリン耐性コロニーの中で、正確な修正を有するコロニーが３つ見出された。これは、選択を伴わない部位特異的変異導入である。これらの結果は、塩基置換、塩基欠失および塩基挿入は全て、同じ反応混合物内でこのインビトロ系によって触媒され得るという点で、このインビトロ系の注目すべき汎用性を実証した。従って、複数のタイプの特定の変異を、同じ遺伝子内で同じ標的部位に生じさせ、選択後に個々のプラスミド分子として分離および単離することができる。
【0122】
【表3】
【0123】
インビトロで改変され、クローンから単離されたプラスミドＤＮＡからの代表的なＤＮＡシーケンシングの結果を図８Ａ～図８Ｂに示す。これらのクローンは特定の順序で単離されなかったため、番号付けはランダムである。クローン１は、遺伝学的変化を有さない単離されたプラスミドを示す。標的塩基であるＴＡＧは、そのままであった。クローンの大部分は、標的部位に変化を有さなかった。クローン２は、標的部位を取り囲む完全な欠失を含んでいた。クローン５は、首尾よく変化した点変異（ＴＡＧからＴＡＣ）を含んでいた。クローン６は、同じＧからＣへの変化を含んでいたが、但し、標的部位の上流に２塩基の欠失も含んでいた。クローン１２もやはり、終止コドンＴＡＧの３番目の塩基という標的部位に完全に改変されたＣを含んでいた。これらの実験は、部位特異的変異導入反応を実証する。重要で興味深いのは、単離されたクローンの同じ集団内において、所望の点変異の変化を含め、様々な特異的に変異導入されたＤＮＡ配列が同じ反応で得られる可能性があるということである。これは、他のインビトロ変異導入アッセイでは不可能である。
【0124】
実施例３：反応条件の最適化および頻度と精度を改善するための代替方法の開発
Ｃａｓ９タンパク質は、インタクトなタンパク質の結合ドメイン内に埋め込まれた２つの核酸分解ドメインを含む。Ｃａｓ９に対して行われた遺伝子操作により、現在、野生型タンパク質の２つの変種が生み出されている；ｄｅａｄ Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と呼称されることが多い不活性型Ｃａｓ９、および２つのヌクレアーゼドメインのうちの一方が不活性に変更されている酵素であるニッカーゼ。この酵素は、二重らせんの２本の鎖のうちの一方を切断する能力を保持している。これらのＣａｓ９バリアントは両方とも、反応全体の頻度と汎用性を改善するためにインビトロ変異導入アッセイ内で系統的に試験することができる。その理論的根拠は、オリゴヌクレオチドによる変異導入の標的となる部位での単一の切断の導入またはＤＮＡヘリックスの巻き戻しが、反応全体の特異性と効率を改善できるということである。
Ｃａｓ９タンパク質は、インタクトなタンパク質の結合ドメイン内に埋め込まれた２つの核酸分解ドメインを含む。Ｃａｓ９に対して行われた遺伝子操作により、現在、野生型タンパク質の２つの変種が生み出されている；ｄｅａｄ Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と呼称されることが多い不活性型Ｃａｓ９、および２つのヌクレアーゼドメインのうちの一方が不活性に変更されている酵素であるニッカーゼ。この酵素は、二重らせんの２本の鎖のうちの一方を切断する能力を保持している。これらのＣａｓ９バリアントは両方とも、反応全体の頻度と汎用性を改善するためにインビトロ変異導入アッセイ内で系統的に試験することができる。その理論的根拠は、オリゴヌクレオチドによる変異導入の標的となる部位での単一の切断の導入またはＤＮＡヘリックスの巻き戻しが、反応全体の特異性と効率を改善できるということである。
【0125】
最適化プロセスは、超らせんＤＮＡに対するｄＣａｓ９およびニッカーゼの相互作用を調べることから始まった。図９に示されるように、ｄＣａｓ９は、超らせんＤＮＡに結合し、アガロースゲルを通る超らせんＤＮＡの移動を遅らせた。ニッカーゼの添加は、超らせんＤＮＡを開環状またはニックの入った形態のＤＮＡに変換した。ニッカーゼの用量が増えるにつれて、ゲル上に、いくつかの他の形態のＤＮＡが、特にゲルのローディングウェルのすぐ下に見える移動の遅い複合体として、出現した。ｄＣａｓ９反応の場合、超らせんＤＮＡのバンドシフトがレーン１に観察された。レーン２は、製造業者によって提案される通りのＢＳＡを含む反応混合物を示した。これらの条件下では、超らせん基質の前方に移動する移動の速い分子量、ならびにゲル中をいくらかより遅く移動する移動の遅い分子（この上部のバンドは、製造業者が提供する仕様書に載っている予測移動パターンと一致した）が観察された。これら２つのタイプの改変型Ｃａｓ９は、ＤＮＡとの明確な相互作用を示し、インビトロ変異導入アッセイにおいてＲＮＰ複合体へとアセンブルされた後に遺伝子編集活性について評価することができる。
【0126】
実施例４：無細胞抽出物系、ＲＮＰ、オリゴヌクレオチドおよびプラスミド発現ベクターを利用した標的遺伝子の改変
本発明は、標的遺伝子を改変するための新規の方法を提供し、無細胞抽出物系、ＲＮＰ、オリゴヌクレオチドおよびプラスミド発現ベクターを利用する。発現ベクターは、目的の遺伝子（標的遺伝子）を含み、特定の実施形態では、遺伝学的に変化したプラスミドの選択のための修正マーカーとして働く変異型カナマイシン遺伝子を含む。特定のオリゴヌクレオチドによって導かれる遺伝子の変化は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける遺伝学的読み出しを利用することによって測定される。この実施形態では、発現コンストラクト中に挿入されたカナマイシンに対する耐性を付与する変異型遺伝子が、特定のホスホロチオエート結合を有する７２塩基長の標準オリゴヌクレオチドによる修正に関して同時に標的となる。遺伝子編集は、哺乳動物細胞または酵母細胞から作製された無細胞抽出物において生じ、修復されたカナマイシン遺伝子の発現は、寒天プレート上のカナマイシン耐性細菌コロニーの出現によって測定される。カナマイシン耐性については、その目的は、遺伝子中の４０２１位のＧ／Ｃ塩基対（変異型）をＣ／Ｇ塩基対（機能型）に変換すると同時に標的遺伝子を遺伝学的に変化させることである。次いで、単離されたプラスミドは、機能するＲｅｃＡタンパク質を欠くＥ．ｃｏｌｉにエレクトロポレーションされる。この読み出しには、相同組換えとミスマッチ修復が欠損している細菌株が用いられるが、これは、これらの細菌が、それら自体では標的ヌクレオチド置換を触媒しないためである。このストラテジーは、バックグラウンドのレベルを最小化し、特定の標的遺伝子の変化を有するプラスミドのより効率的な特定を可能にする。Ｅ．ｃｏｌｉからのプラスミドの単離とＤＮＡシーケンシングは、そのプラスミド上で遺伝子編集活動が起こったことを示すカナマイシン耐性の最初の選択を介して遺伝学的変化を裏付ける。
本発明は、標的遺伝子を改変するための新規の方法を提供し、無細胞抽出物系、ＲＮＰ、オリゴヌクレオチドおよびプラスミド発現ベクターを利用する。発現ベクターは、目的の遺伝子（標的遺伝子）を含み、特定の実施形態では、遺伝学的に変化したプラスミドの選択のための修正マーカーとして働く変異型カナマイシン遺伝子を含む。特定のオリゴヌクレオチドによって導かれる遺伝子の変化は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける遺伝学的読み出しを利用することによって測定される。この実施形態では、発現コンストラクト中に挿入されたカナマイシンに対する耐性を付与する変異型遺伝子が、特定のホスホロチオエート結合を有する７２塩基長の標準オリゴヌクレオチドによる修正に関して同時に標的となる。遺伝子編集は、哺乳動物細胞または酵母細胞から作製された無細胞抽出物において生じ、修復されたカナマイシン遺伝子の発現は、寒天プレート上のカナマイシン耐性細菌コロニーの出現によって測定される。カナマイシン耐性については、その目的は、遺伝子中の４０２１位のＧ／Ｃ塩基対（変異型）をＣ／Ｇ塩基対（機能型）に変換すると同時に標的遺伝子を遺伝学的に変化させることである。次いで、単離されたプラスミドは、機能するＲｅｃＡタンパク質を欠くＥ．ｃｏｌｉにエレクトロポレーションされる。この読み出しには、相同組換えとミスマッチ修復が欠損している細菌株が用いられるが、これは、これらの細菌が、それら自体では標的ヌクレオチド置換を触媒しないためである。このストラテジーは、バックグラウンドのレベルを最小化し、特定の標的遺伝子の変化を有するプラスミドのより効率的な特定を可能にする。Ｅ．ｃｏｌｉからのプラスミドの単離とＤＮＡシーケンシングは、そのプラスミド上で遺伝子編集活動が起こったことを示すカナマイシン耐性の最初の選択を介して遺伝学的変化を裏付ける。
【0127】
実施例５：ヌクレオチドの挿入
本明細書で説明される同じ基本的反応ワークフローをヌクレオチドの挿入に利用した：ＲＮＰ粒子によって触媒されるＤＮＡ切断；ドナーＤＮＡ（この場合は、予めアニーリングされた二本鎖フラグメント）の添加；その後の、外因的に添加されるＤＮＡリガーゼを補充した、ＨＥＫ２９３細胞から作製される、哺乳動物の無細胞抽出物の添加。ここでの目的は、二本鎖切断を生じさせてプラスミド中に含まれるＤＮＡ配列の除去を実行するという先の例における意図とは反対に、ＲＮＰ切断の部位に１５塩基の二本鎖フラグメントを挿入することであった。この実証は、遺伝子編集インビトロ変異導入アッセイの適用範囲を、インビトロ反応に関して越えるべき重要な障壁である遺伝子またはＤＮＡの挿入の領域にまで広げる。
本明細書で説明される同じ基本的反応ワークフローをヌクレオチドの挿入に利用した：ＲＮＰ粒子によって触媒されるＤＮＡ切断；ドナーＤＮＡ（この場合は、予めアニーリングされた二本鎖フラグメント）の添加；その後の、外因的に添加されるＤＮＡリガーゼを補充した、ＨＥＫ２９３細胞から作製される、哺乳動物の無細胞抽出物の添加。ここでの目的は、二本鎖切断を生じさせてプラスミド中に含まれるＤＮＡ配列の除去を実行するという先の例における意図とは反対に、ＲＮＰ切断の部位に１５塩基の二本鎖フラグメントを挿入することであった。この実証は、遺伝子編集インビトロ変異導入アッセイの適用範囲を、インビトロ反応に関して越えるべき重要な障壁である遺伝子またはＤＮＡの挿入の領域にまで広げる。
【0128】
反応自体の詳細は以下の通りである（図１０Ａ～図１０Ｃ）：ＮｏｔＩ制限部位挿入断片のために二本鎖となるように２つの相補的な一本鎖オリゴヌクレオチド（５’－ＡＡＴＧＧＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣ－３’（配列番号１）および５’－ＣＣＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡ－３’（配列番号２））を設計したが、これらはそれぞれ、Ｃｐｆ１ ＲＮＰによる互い違いの切断部位に生じる２つのオーバーハングのうちの一方に対して相補的な５’オーバーハングを有する。スーパーコイルプラスミドＤＮＡとＣｐｆ１ ＲＮＰとを含むプラスミドＤＮＡ上で互い違いの二本鎖切断を生じさせるようにインビトロ反応を設定した。この反応は、３７℃で１５分間インキュベートされた。第１の反応から生じる直鎖状となったＤＮＡを、シリカメンブレンカラムを用いて単離および精製し、二本鎖ＮｏｔＩ制限部位挿入を挿入するための第２のインビトロ反応に添加した。この第２のインビトロ反応には、精製済みの直鎖状となったＤＮＡ、ＮｏｔＩ部位挿入断片、およびリガーゼを含む改変されたＨＥＫ ＣＦＥが含まれた。この反応は、３７℃で１５分間インキュベートされた。
【0129】
次いで、第２の反応から生じる再度環状化したＤＮＡを、シリカメンブレンカラムを用いて単離および精製し、ＤＨ５αコンピテントＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。カナマイシン抗生物質を含む寒天プレート上に細菌をプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。一晩たったプレートから単一のコロニーを採取し、振盪インキュベーターにおいてカナマイシン抗生物質を含むブロス中で３７℃にて１６時間培養した。一晩たった培養物からスーパーコイルＤＮＡを単離し、ＮｏｔＩ消化アッセイに含め、ＮｏｔＩ挿入断片を含む直鎖状となったＤＮＡをアガロースゲル上で可視化した。次いで、ＮｏｔＩ酵素による切断を示すＤＮＡをＰＣＲ増幅に供し、ＮｏｔＩ部位の挿入を確認するために配列決定した。
【0130】
制限酵素による切断、ＲＦＬＰ、およびＮｏｔＩ制限消化に供された精製プラスミドＤＮＡのＤＮＡ配列分析を実施した。結果は、環状プラスミドＤＮＡの線形化を示した。このプラスミド中にＮｏｔＩ制限部位は出現しないため、インビトロ遺伝子編集のプロセスを介してフラグメントが首尾よく挿入された場合にのみ、線形化が起こり得た（図１１Ａ～図１４）。ＤＮＡ配列分析により、ＲＮＰ粒子が意図して導く正確な部位における二本鎖フラグメントの挿入が確認された（図１５～図２２）。いくつかの異なるＤＮＡ配列が観察されたが、それらのうちのいくつかは、意図されるフラグメントの完全できれいな挿入を示す。
【0131】
実施例６：Ｃａｓ９またはＣｐｆ１のＲＮＰ粒子によって誘発されるＤＮＡ切断と改変
遺伝子編集のプロセスを研究するための完全に統合された無細胞系をここで構築した。図２３Ａは、プラスミドＤＮＡの部位特異的切断を導くＲＮＰ粒子へとアセンブルされたＣａｓ９またはＣｐｆ１を用いる反応の初期化と、それに続くＤＮＡリガーゼを補充した哺乳動物の無細胞抽出物の添加と、を図示する。反応を３７℃で１５分間インキュベートし、プラスミドＤＮＡを回収し、その後のコロニー選択とプラスミドＤＮＡの分析のためにＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。無細胞抽出物は、直鎖状となったプラスミドのプロセシングに必要な触媒活性（特にＤＮＡの切除、リン酸化およびライゲーションを含む）を提供する。外因的に加えられたドナーＤＮＡの存在下において、ＤＮＡのフラグメントを切断部位に正確に挿入できる。
遺伝子編集のプロセスを研究するための完全に統合された無細胞系をここで構築した。図２３Ａは、プラスミドＤＮＡの部位特異的切断を導くＲＮＰ粒子へとアセンブルされたＣａｓ９またはＣｐｆ１を用いる反応の初期化と、それに続くＤＮＡリガーゼを補充した哺乳動物の無細胞抽出物の添加と、を図示する。反応を３７℃で１５分間インキュベートし、プラスミドＤＮＡを回収し、その後のコロニー選択とプラスミドＤＮＡの分析のためにＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。無細胞抽出物は、直鎖状となったプラスミドのプロセシングに必要な触媒活性（特にＤＮＡの切除、リン酸化およびライゲーションを含む）を提供する。外因的に加えられたドナーＤＮＡの存在下において、ＤＮＡのフラグメントを切断部位に正確に挿入できる。
【0132】
図２３Ｂに示される適切なガイドＲＮＡ配列によって導かれるｌａｃＺ遺伝子領域に沿った様々なＣａｓ９部位とＣｐｆ１部位を標的とした。これらの実験で主に使用されるＣｐｆ１部位がボックスで囲まれており、関連する切断部位が、互い違いの矢印で示されている。この研究で使用されるＣａｓ９部位が、ｃｒＲＮＡの結合の位置を示すバーで示されている。ＤＮＡの欠失または挿入によるｌａｃＺ遺伝子の破壊により、Ｘ－ｇａｌを代謝できない機能しないβ－ガラクトースタンパク質の産生をもたらすことができるため、プラスミドｐＨＳＧ２９９に埋め込まれたｌａｃＺ遺伝子は、このアッセイのための魅力的なテンプレートを提供する。Ｘ－ｇａｌの存在下で培養される細菌に、破壊されたｌａｃＺ遺伝子を含むプラスミドが導入されると、よく確立された色の変化（青から白）が見られる。
【0133】
図２４Ａ～図２４Ｃは、アセンブルされたＲＮＰ粒子のインビトロ活性を示す。まず、図２４Ａは、インビトロでＲＮＰバリアントによってスーパーコイルｐＨＳＧ２９９の切断が誘発される単純な反応を示す。ｐＨＳＧ２９９に対するヌクレアーゼ活性は、異なるＣｐｆ１切断部位ならびに野生型Ｃａｓ９および関連するニッカーゼＣａｓ９の切断部位の各々において明らかである。第二に、Ｃａｓ９とＣｐｆ１の両方についての用量依存性が図２４Ｂに提示されており、ここで、Ｃｐｆ１は、より低いピコモルレベルでスーパーコイルＤＮＡの切断を示している。Ｃａｓ９ ＲＮＰによる切断活性は、５ｐｍｏｌのＲＮＰが存在するまでスーパーコイルＤＮＡの完全な線形化が観察されないＤＮＡ切断についての「閾値」限界を示した。２ｐｍｏｌの存在下において非常に僅かな直鎖状ＤＮＡのバンドが出現し始め、５ｐｍｏｌ以上での反応は全て、ほぼ全てのＤＮＡが完全に切断されることを示した。対照的に、Ｃｐｆ１ ＲＮＰによる切断活性は、むしろＤＮＡ切断の「勾配」増加を示した。０．５ｐｍｏｌ程度のＲＮＰの存在下において非常に僅かな直鎖状ＤＮＡのバンドが出現し始め、１ｐｍｏｌが存在するまで徐々に増加し、２ｐｍｏｌ以上での反応は全て、ほぼ全てのＤＮＡが完全に切断されることを示した。インビトロでＣａｓ９とＣｐｆ１の間に観察された切断パターンの違いは、この系内におけるＣｐｆ１の向上した触媒活性を反映している可能性がある。これらの結果は、ＤＮＡの構造改変のための遺伝学的ツールとして働く特定のガイドＲＮＡと組み合わせたＣａｓ９とＣｐｆ１の両方の有用性を実証した。
【0134】
哺乳動物の無細胞抽出物は以前に、ｓｓＯＤＮによって導かれる遺伝子編集のメカニズムと調節を調査するために利用された（Ｅｎｇｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ． ＢｉｏＥｓｓａｙｓ ３１， １５９－１６８（２００９））。その遺伝子編集経路の解明と再構築につながったデータの多くは、インビトロで実施された研究に由来するものであった（Ｃｏｌｅ－Ｓｔｒａｕｓｓ． ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７， １３２３－３０（１９９９））。同じ実験ワークフローが、無細胞のＣＲＩＳＰＲによって導かれる遺伝子編集システムの開発において利用された。図２４Ｃは、Ｃｐｆ１によって生じる直鎖状となったＤＮＡ（図２４Ｂを参照のこと）に対する抽出物の触媒活性を図示する。細胞源から調製された抽出物は、直鎖状となったプラスミドに対する様々な程度のＤＮＡ切除活性を示した。抽出物の各供給源は、増加する抽出物の濃度の関数として直鎖状となったプラスミドのサイズを減少させる好適なレベルのヌクレアーゼ活性をもたらした。ＨＥＫ－２９３細胞から調製された抽出物が示す活性は、これらの細胞が適切なレベルのＤＮＡ修復とＤＮＡ組換えの酵素活性を有すると考えられているため、特に興味深いものであった。
【0135】
実施例７：無細胞系における遺伝子編集成分によって導かれる特異的ＤＮＡ欠失
本明細書で説明されるように、ヒト細胞におけるゲノム修飾を取り巻く分子経路と調節回路を解明するために使用できるＣＲＩＳＰＲを利用した遺伝子編集システムが確立された。この目標に向けて、Ｃａｓ９ ＲＮＰ、ｐＨＳＧ２９９および哺乳動物の無細胞抽出物を伴うインビトロ反応においてｐＨＳＧ２９９に対するＤＮＡ切断活性を利用した。主な目的は、切断部位に特異的欠失を生じさせることと、その後の再環状化および細菌での遺伝学的読み出しであった。図２５Ａは、関連する遺伝学的ツールと共に遺伝学的標的の概要を示し、図２５Ｂは、その結果を図示する。協調的努力および１８個のクローンの分析にもかかわらず、Ｃａｓ９ ＲＮＰによって触媒される反応から生じる配列の欠失を有する改変されたプラスミド分子は特定されなかった。Ｃａｓ９ ＲＮＰ粒子のヌクレアーゼ活性を２つの別個のエキソヌクレアーゼ（Ｔ７およびＥｘｏ Ｉ）と組み合わせたいくつかの予備的実験を実施した。酵素のユニークな組み合わせを用いた１つの事例においてのみ、切除されたＤＮＡ配列が観察された。この反応は、ロバストなものではなかった。このネガティブな結果は、Ｃａｓ９による切断が、インビボとは異なりインビトロではＤＮＡ切除の影響を受けにくくなる可能性がある平滑末端の二本鎖ＤＮＡ切断を生じさせる、という事実に起因する可能性がある。
本明細書で説明されるように、ヒト細胞におけるゲノム修飾を取り巻く分子経路と調節回路を解明するために使用できるＣＲＩＳＰＲを利用した遺伝子編集システムが確立された。この目標に向けて、Ｃａｓ９ ＲＮＰ、ｐＨＳＧ２９９および哺乳動物の無細胞抽出物を伴うインビトロ反応においてｐＨＳＧ２９９に対するＤＮＡ切断活性を利用した。主な目的は、切断部位に特異的欠失を生じさせることと、その後の再環状化および細菌での遺伝学的読み出しであった。図２５Ａは、関連する遺伝学的ツールと共に遺伝学的標的の概要を示し、図２５Ｂは、その結果を図示する。協調的努力および１８個のクローンの分析にもかかわらず、Ｃａｓ９ ＲＮＰによって触媒される反応から生じる配列の欠失を有する改変されたプラスミド分子は特定されなかった。Ｃａｓ９ ＲＮＰ粒子のヌクレアーゼ活性を２つの別個のエキソヌクレアーゼ（Ｔ７およびＥｘｏ Ｉ）と組み合わせたいくつかの予備的実験を実施した。酵素のユニークな組み合わせを用いた１つの事例においてのみ、切除されたＤＮＡ配列が観察された。この反応は、ロバストなものではなかった。このネガティブな結果は、Ｃａｓ９による切断が、インビボとは異なりインビトロではＤＮＡ切除の影響を受けにくくなる可能性がある平滑末端の二本鎖ＤＮＡ切断を生じさせる、という事実に起因する可能性がある。
【0136】
次に、この反応を繰り返したが、Ｃａｓ９をヌクレアーゼＣｐｆ１に置き換えた。図２５Ｃは、ｐＨＳＧ２９９におけるｌａｃＺ遺伝子の遺伝子編集の成功を実証する。インビトロ反応から回収されたプラスミドで形質転換された複数の細菌クローンは、図２５Ａにおいて互い違いの矢印で示される標的部位を取り囲む配列の欠失を有することが見出された。ＤＮＡ配列が変化していないことが見出されたクローンを含むクローンの集団内で見出されたＤＮＡ欠失のタイプを実証するために代表的な配列のパネルを示す。分析された４１個の配列のうちの２２個が、Ｃｐｆ１ ＲＮＰによって生み出された切断部位を取り囲むＤＮＡの変化を示した。これらのデータは、Ｃｐｆ１がインビトロで遺伝子編集を触媒する実験システムの開発を実証した。細菌コロニー中の改変されたプラスミドは、様々な色合いの青を示した。ＤＮＡ欠失は、白色、淡い青色および濃い青色のコロニーで見出された。従って、青色のコロニーをスクリーニングプロセスから排除することはできず、これらのコロニーが変化したＤＮＡ配列を含むということを除外できなかった。
【0137】
実施例８：無細胞系におけるＲＮＰによって導かれる特異的なドナーＤＮＡの挿入
指定のＣｐｆ１切断部位で相同組換え修復（homology directed repair）（ＨＤＲ）を介してＤＮＡの挿入を実行することを試みることによって実験系を拡張した。そのために、アニーリングさせると、ｐＨＳＧ２９９には固有の部位が存在しない制限酵素ＮｏｔＩのための切断部位を含む二本鎖ＤＮＡフラグメントが生じる、２つの短い相補的ＤＮＡ分子を合成した。ＮｏｔＩ制限部位および実験系は、それぞれ図２６Ａおよび図２６Ｂに示されており、実験プロトコルは、図２６Ｃに概要が示されている。個別の遺伝子編集事象を調査するために、外因的に加えられたフラグメントの組み込まれたアームとネイティブのｌａｃＺ遺伝子の領域との間の相同領域を、ＮｏｔＩ部位に対して上流の位置に２塩基対の「バーコード」（ＴＴ：ＡＡ）を含めることによって識別した。中間ステップとして、および挿入されたフラグメントの存在をチェックするために、選択された細菌コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素ＮｏｔＩで消化した。図２６Ｄに示されるように、いくつかの精製プラスミドＤＮＡサンプルがＮｏｔＩによって消化され、予想通りに直鎖状となったプラスミドＤＮＡが生じた。フラグメントの挿入は、反応混合物中の無細胞抽出物の存在に依存していたが、これは、無細胞抽出物が存在しない場合にはＮｏｔＩによる切断が観察されなかったためである。
指定のＣｐｆ１切断部位で相同組換え修復（homology directed repair）（ＨＤＲ）を介してＤＮＡの挿入を実行することを試みることによって実験系を拡張した。そのために、アニーリングさせると、ｐＨＳＧ２９９には固有の部位が存在しない制限酵素ＮｏｔＩのための切断部位を含む二本鎖ＤＮＡフラグメントが生じる、２つの短い相補的ＤＮＡ分子を合成した。ＮｏｔＩ制限部位および実験系は、それぞれ図２６Ａおよび図２６Ｂに示されており、実験プロトコルは、図２６Ｃに概要が示されている。個別の遺伝子編集事象を調査するために、外因的に加えられたフラグメントの組み込まれたアームとネイティブのｌａｃＺ遺伝子の領域との間の相同領域を、ＮｏｔＩ部位に対して上流の位置に２塩基対の「バーコード」（ＴＴ：ＡＡ）を含めることによって識別した。中間ステップとして、および挿入されたフラグメントの存在をチェックするために、選択された細菌コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素ＮｏｔＩで消化した。図２６Ｄに示されるように、いくつかの精製プラスミドＤＮＡサンプルがＮｏｔＩによって消化され、予想通りに直鎖状となったプラスミドＤＮＡが生じた。フラグメントの挿入は、反応混合物中の無細胞抽出物の存在に依存していたが、これは、無細胞抽出物が存在しない場合にはＮｏｔＩによる切断が観察されなかったためである。
【0138】
ＮｏｔＩ制限を示すプラスミドＤＮＡサンプルをＰＣＲで増幅し、配列決定してＤＮＡの挿入を検証した。図２７Ａ～図２７Ｃは、ＮｏｔＩ陽性集団内で見出されたＤＮＡフラグメント挿入パターンのアレイを示しており、配列のパネルの上に野生型配列が提示されている。図２７Ａは、指定の切断部位に正確かつ完全な挿入を含むいくつかのクローンの配列を示す。二本鎖のＮｏｔＩ挿入フラグメントを含むインビトロ反応から回収されたＤＮＡで形質転換されたコロニーから単離されたプラスミドＤＮＡの約１５％が、完全な挿入を含むことが見出された。他の挿入パターンには、１塩基対の欠失を伴って２つのＮｏｔＩフラグメントの挿入が観察された挿入パターンが含まれた（図２７Ｂ）。３つの配列全てにおいて、挿入部位の上流の５’オーバーハング末端に位置する最後のヌクレオチドで１塩基の欠失が生じた。図２７Ｃは、３つのＮｏｔＩフラグメントの挿入が、挿入されたＮｏｔＩフラグメントを取り囲む複数の欠失（一番目の挿入フラグメントの上流の１塩基対の欠失、および三番目の挿入フラグメントの下流の７塩基対の欠失）を伴う、ＤＮＡ配列を示す。プラスミドＤＮＡの約８％は、図２７Ｄに見られるようにＤＮＡ配列の変化を有さなかった。
【0139】
実施例９：一本鎖ＤＮＡ分子によって促進される特異的ＤＮＡ挿入
アニーリングされた二本鎖ＤＮＡフラグメントの代わりに一本鎖ＤＮＡ分子がＨＤＲとフラグメントの挿入を導くことができる可能性を調査した。図２８Ａおよび図２８Ｂは、この実験で用いられる一本鎖分子および標的部位に対するそれらの方向／位置の図を提示する。これらの一本鎖分子は、本明細書で説明される先の実験において用いられた二本鎖フラグメント（図２６Ｂを参照のこと）を構成するものであった。各分子は、Ｃｐｆ１の互い違いの切断部位のオーバーハングに対して相補的な５塩基の領域を伴う１０塩基のオーバーハングを有する。図４Ｃに概要が示されている同じ実験プロトコルに従って、反応混合物から回収された精製ＤＮＡを細菌細胞に形質転換し、選択された細菌コロニーからプラスミドＤＮＡを単離した。単離されたＤＮＡサンプルに対してＮｏｔＩ制限消化を実施したが、その結果を図２８Ｃに提示する。センス鎖に組み込まれる一本鎖オリゴヌクレオチドＮｏｔＩ－Ｓを含む反応から単離されたＤＮＡプラスミドにまず注目すると、挿入を含むいくつかの産物はＮｏｔＩ酵素消化によって切断できるということが観察された。非センス鎖に組み込まれる一本鎖オリゴヌクレオチドＮｏｔＩ－ＮＳを含む反応からのサンプルも、ＮｏｔＩ制限部位を有する産物分子を生じさせた。まとめると、ＮｏｔＩとのインキュベーションによって首尾よく切断できるプラスミド分子の集団が観察されたが、これは、ＮｏｔＩ部位を含む一本鎖ＤＮＡ分子の少なくとも一部の挿入が成功したことを示す。
アニーリングされた二本鎖ＤＮＡフラグメントの代わりに一本鎖ＤＮＡ分子がＨＤＲとフラグメントの挿入を導くことができる可能性を調査した。図２８Ａおよび図２８Ｂは、この実験で用いられる一本鎖分子および標的部位に対するそれらの方向／位置の図を提示する。これらの一本鎖分子は、本明細書で説明される先の実験において用いられた二本鎖フラグメント（図２６Ｂを参照のこと）を構成するものであった。各分子は、Ｃｐｆ１の互い違いの切断部位のオーバーハングに対して相補的な５塩基の領域を伴う１０塩基のオーバーハングを有する。図４Ｃに概要が示されている同じ実験プロトコルに従って、反応混合物から回収された精製ＤＮＡを細菌細胞に形質転換し、選択された細菌コロニーからプラスミドＤＮＡを単離した。単離されたＤＮＡサンプルに対してＮｏｔＩ制限消化を実施したが、その結果を図２８Ｃに提示する。センス鎖に組み込まれる一本鎖オリゴヌクレオチドＮｏｔＩ－Ｓを含む反応から単離されたＤＮＡプラスミドにまず注目すると、挿入を含むいくつかの産物はＮｏｔＩ酵素消化によって切断できるということが観察された。非センス鎖に組み込まれる一本鎖オリゴヌクレオチドＮｏｔＩ－ＮＳを含む反応からのサンプルも、ＮｏｔＩ制限部位を有する産物分子を生じさせた。まとめると、ＮｏｔＩとのインキュベーションによって首尾よく切断できるプラスミド分子の集団が観察されたが、これは、ＮｏｔＩ部位を含む一本鎖ＤＮＡ分子の少なくとも一部の挿入が成功したことを示す。
【0140】
インビトロでの１本鎖ＤＮＡ分子挿入反応の両方から回収されたＮｏｔＩ陽性プラスミドサンプルについて目的の領域全体に対してＤＮＡシーケンシングを実施した。各々についての代表的なパネルが図２８Ｄに提示されている。シーケンシングデータは、ＲＦＬＰ分析を裏付け、クローンの両方のカテゴリー内の不均一な配列挿入断片集団を明らかにした。重要なことに、ＮｏｔＩ－Ｓによって駆動される反応から分析された配列の５０％において、意図される分子の完全な単一の挿入が観察された。ＮｏｔＩ－ＮＳが一本鎖ドナー分子として働く場合には、フラグメントの完全な挿入は検出されなかった。完全な挿入が検出されなかった事例の全てにおいて、各クローンには、様々な量のＤＮＡ改変が（多くの場合、欠失の形態で）含まれていた。このＨＤＲによって導かれる反応において示された鎖のバイアスは、おそらく、インビトロ遺伝子編集におけるフラグメント挿入のメカニズムへの洞察を提供するであろう。
【0141】
実施例１０：１８６ｂｐのフラグメントの挿入
この実験では、図２９Ａに示されるように、異なる部位で切断する２つのＣｐｆ１ヌクレアーゼを用いて、親プラスミドからフラグメントを切り出し、それを、相補的なオーバーハングを有する２つの相補的なオリゴヌクレオチドのアニーリングによって作製した１８６塩基対のフラグメントで置き換えた。図２９Ｂ～図２９Ｃに提示される配列は、このインビトロ反応について細菌における読み出しで得られた配列を示す。図２９Ｄは、大部分は欠失であるが、挿入が成功した１つのクローンを含む、得られた結果のタイプを図示する。重要なことに、本明細書で提示される先のデータでは１つのＣｐｆ１酵素が用いられたのに対し、この実験では、２つのＣｐｆ１酵素を用いて、プラスミドのフラグメントを欠落させ、同様のサイズのドナーＤＮＡフラグメントを首尾よく挿入するのに成功した。
この実験では、図２９Ａに示されるように、異なる部位で切断する２つのＣｐｆ１ヌクレアーゼを用いて、親プラスミドからフラグメントを切り出し、それを、相補的なオーバーハングを有する２つの相補的なオリゴヌクレオチドのアニーリングによって作製した１８６塩基対のフラグメントで置き換えた。図２９Ｂ～図２９Ｃに提示される配列は、このインビトロ反応について細菌における読み出しで得られた配列を示す。図２９Ｄは、大部分は欠失であるが、挿入が成功した１つのクローンを含む、得られた結果のタイプを図示する。重要なことに、本明細書で提示される先のデータでは１つのＣｐｆ１酵素が用いられたのに対し、この実験では、２つのＣｐｆ１酵素を用いて、プラスミドのフラグメントを欠落させ、同様のサイズのドナーＤＮＡフラグメントを首尾よく挿入するのに成功した。
【0142】
実施例１１：部位特異的ＤＮＡ挿入
Ｃｐｆ１ヌクレアーゼを含むＲＮＰ複合体の部位特異的ＤＮＡ切断活性を、ドナーＤＮＡフラグメントを用いてプラスミド中でのＤＮＡ切除、ＤＮＡ挿入および遺伝子セグメント置換を触媒できる哺乳動物の無細胞抽出物と組み合わせた（図２３Ａ）。ＣＲＩＳＰＲによって導かれる改変を含むプラスミドＤＮＡをインビトロ反応から回収し、コンピテントＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、次いで、カナマイシンを含む寒天上に当該Ｅ．ｃｏｌｉをプレーティングした。改変されたプラスミドＤＮＡを、最初に抗生物質耐性および表現型の変化（すなわち、色）によって、および／またはＤＮＡ配列分析によって直接、特定した。２つのターゲティングシステムを利用した；ｌａｃＺ遺伝子のインタクトな機能するコピーを含むプラスミドｐＨＳＧ２９９、および癌遺伝子ＫＲＡＳのインタクトな機能するコピーを含むプラスミドｐＫＲＡＳ６１６３。ｌａｃＺ遺伝子中で生じる挿入反応または置換反応は、遺伝子編集活性を示す、青から白への色の変化をもたらす。ｐＫＲＡＳ６１６３における挿入または置換は、成功した遺伝子編集活性を特定するのにＤＮＡ配列分析を必要とする。
Ｃｐｆ１ヌクレアーゼを含むＲＮＰ複合体の部位特異的ＤＮＡ切断活性を、ドナーＤＮＡフラグメントを用いてプラスミド中でのＤＮＡ切除、ＤＮＡ挿入および遺伝子セグメント置換を触媒できる哺乳動物の無細胞抽出物と組み合わせた（図２３Ａ）。ＣＲＩＳＰＲによって導かれる改変を含むプラスミドＤＮＡをインビトロ反応から回収し、コンピテントＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、次いで、カナマイシンを含む寒天上に当該Ｅ．ｃｏｌｉをプレーティングした。改変されたプラスミドＤＮＡを、最初に抗生物質耐性および表現型の変化（すなわち、色）によって、および／またはＤＮＡ配列分析によって直接、特定した。２つのターゲティングシステムを利用した；ｌａｃＺ遺伝子のインタクトな機能するコピーを含むプラスミドｐＨＳＧ２９９、および癌遺伝子ＫＲＡＳのインタクトな機能するコピーを含むプラスミドｐＫＲＡＳ６１６３。ｌａｃＺ遺伝子中で生じる挿入反応または置換反応は、遺伝子編集活性を示す、青から白への色の変化をもたらす。ｐＫＲＡＳ６１６３における挿入または置換は、成功した遺伝子編集活性を特定するのにＤＮＡ配列分析を必要とする。
【0143】
このインビトロ系は、単一のＣｐｆ１ ＲＮＰ切断部位におけるドナーＤＮＡフラグメントの挿入または別個の切断部位における２つのＣｐｆ１ ＲＮＰ複合体の作用によるドナーＤＮＡフラグメントでの遺伝子セグメントの置換を可能にする優れた汎用性を実証した。さらに、この系は、ＲＮＰ複合体の作用によって生じたＤＮＡ末端の切除による部位特異的欠失を含むプラスミド分子も生じさせた。従って、多様な遺伝子編集反応が同時に起こっていたが、これは、細胞に導入された場合に遺伝子編集ツールがどのように働くかを競争的に再現するものである。これら３つの経路が図３０で模式的に示されている；挿入には単一の切断が必要であり、置換には標的部位における２つの切断が必要であった。挿入反応と置換反応の両方において、Ｃｐｆ１ ＲＮＰの特徴的な切断パターンにより、各切断部位の５’末端にＤＮＡオーバーハングが生じた。次いで、アニーリングさせると、互い違いの末端に対する相同性を有する５塩基のオーバーハングが各５’末端において隣接する二本鎖の挿入フラグメントまたは置換フラグメントを有する、２つの相補的なオリゴヌクレオチドを設計することによって、ドナーＤＮＡフラグメントが作製された。ドナーＤＮＡフラグメントとＣｐｆ１切断部位との間での５塩基のオーバーハングの相同性は、挿入反応および置換反応の間のフラグメントの組込みを促進した。
【0144】
本明細書で説明されるように、ヒト細胞におけるゲノム修飾を取り巻く分子経路と調節回路を解明するために使用できるＣＲＩＳＰＲを利用した遺伝子編集システムが確立された。本明細書で説明されるように、Ｃｐｆ１を利用してスーパーコイルＤＮＡの切断を開始した後、無細胞抽出物を添加した。図３１は、ｐＨＳＧ２９９におけるｌａｃＺ遺伝子の遺伝子編集の成功を図示する。インビトロ反応から回収されたプラスミドで形質転換された複数の細菌クローンは、互い違いの矢印で示される標的部位を取り囲む配列の欠失を有することが見出された。分析された４１個の配列のうちの２２個が、Ｃｐｆ１ ＲＮＰによって生み出された切断部位を取り囲むＤＮＡ切除によるＤＮＡの変化を示した。これらのデータは、Ｃｐｆ１が触媒する部位特異的ＤＮＡ欠失をこのインビトロ系において実行できるということを実証した。
【0145】
このシステムが、一本鎖ＤＮＡフラグメントによって触媒される相同組換え修復が起こっている哺乳動物細胞において行われている反応を反映できる可能性を調査した。相同組換え修復のための好ましい基質の一本鎖ＤＮＡテンプレートおよびこれらのフラグメントの組み込みの成功が、不正確なアライメントを介してであろうが正確なアライメントを介してであろうが、再現性良く観察されている。制御可能な環境でこれらの反応を再現できる系を設計することにより、哺乳動物細胞における相同組換え修復の制御因子のいくつかの機能を特定および解明することができた。図２８Ａ～図２８Ｂは、実験のストラテジーおよびこの実験で用いられる一本鎖分子（標的挿入部位に対するそれらの方向を含む）の図を提示する。各分子は、Ｃｐｆ１の互い違いの切断部位のオーバーハングに対して相補的な５塩基の領域を伴う１０塩基のオーバーハングを有する。個別の遺伝子編集事象を調査するために、外因的に加えられたフラグメントの組み込まれたアームとネイティブのｌａｃＺ遺伝子の領域との間の相同領域を、ＮｏｔＩ部位に対して上流の位置に２塩基対の「バーコード」（ＴＴ：ＡＡ）を含めることによって識別した。中間ステップとして、および挿入されたフラグメントの存在をチェックするために、選択された細菌コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、ＮｏｔＩ制限酵素で消化した。図２３Ａに概要が示されている同じ実験プロトコルに従って、反応混合物から回収された精製ＤＮＡを細菌細胞に形質転換し、次いで、選択された細菌コロニーからプラスミドＤＮＡを単離した。単離されたＤＮＡサンプルに対してＮｏｔＩ制限消化を実施し（図２８Ｃ）、制限酵素によって切断されたクローンＤＮＡ単離物を、ＤＮＡ配列分析のために処理した。各々についての代表的なパネルが図２８Ｄに提示されている。図３２Ａ～図３２Ｂには、さらなるＤＮＡ配列データが示されている。シーケンシングデータは、ＲＦＬＰ分析を裏付け、クローンの両方のカテゴリー内の不均一な配列挿入断片集団を明らかにした。重要なことに、センス鎖に組み込まれる一本鎖オリゴヌクレオチドＮｏｔＩ－Ｓによって駆動される反応から分析された配列の５０％において、意図される分子の完全な単一の挿入が観察された。非センス鎖に組み込まれる一本鎖オリゴヌクレオチドＮｏｔＩ－ＮＳがドナー分子として働く場合には、フラグメントの完全な挿入は検出されなかった。完全な挿入が検出されなかった事例の全てにおいて、各クローンには、様々な量のＤＮＡ改変が（多くの場合、欠失の形態で）含まれていた。
【0146】
実施例１２：部位特異的遺伝子セグメント置換
ここでは、おそらく非相同末端結合反応を反映する部位特異的欠失およびおそらく相同組換え修復を反映する一本鎖ＤＮＡフラグメントの部位特異的挿入の両方がこのインビトロ系において可能であるということが実証された。遺伝子のセグメントの正確な置換を触媒的にサポートするこの系の能力が試験された。遺伝子編集の長期的な目的の１つは、機能しない遺伝子または機能に異常のあるエクソンの機能するコピーを首尾よく元に戻すことである。挿入の評価のために実施したのと同じ反応ストラテジーを実施したが（図２３Ａを参照のこと）、但し、この反応では、遺伝子のセグメントを取り除くために、２つのＣｐｆ１ ＲＮＰを用いて、ｌａｃＺ遺伝子に沿った異なる位置に２つの切断を生じさせた。８１、１３６および１７７塩基対の遺伝子セグメントを置換するように別個の反応を設計し、８１、１３６および１８６塩基のドナーＤＮＡフラグメントの個々の集団を別個の置換反応の各々にそれぞれ添加した。８１塩基のＤＮＡドナーフラグメントを含む反応に関しては、回収されたコロニーの２０％が、ｌａｃＺ遺伝子のコード領域を保つ完全な置換をインフレームで含んでいた（図３３Ａ）。１３６塩基置換反応の６６パーセントは、完全な置換を含むプラスミドをもたらし（図３３Ｂ）、１８６塩基置換反応の１０％は、完全な置換を有するプラスミドを含んでいた（図３３Ｃ）。確実に５’オーバーハングの相同性をネイティブの遺伝子セグメントと区別できるように、ドナーＤＮＡフラグメントの各々にバーコードＡＡ／ＴＴ／ＧＧＧを組み込んだ。１７、３６および４５塩基の長さのドナーＤＮＡフラグメントでも同じ実験を実施した。これらのドナーＤＮＡフラグメントはいずれも、正確な置換をもたらさなかったが（図３５Ａ）、但し、それらは、様々な長さと構成の、不正確な置換を生じさせた。これらの結果は、このインビトロ遺伝子編集システムが約８１～１８６塩基の範囲の長さのドナーＤＮＡフラグメントによる完全な遺伝子セグメント置換を触媒できるということを実証した。ドナーＤＮＡセグメントを含む反応から生じた単離プラスミドの集団においても部位特異的欠失が見出されたということに注目することも重要であり（図３５Ｂ）、これは、欠失/切除反応および置換反応の両方が同じインビトロ系において起こっていたという事実を裏付ける。
ここでは、おそらく非相同末端結合反応を反映する部位特異的欠失およびおそらく相同組換え修復を反映する一本鎖ＤＮＡフラグメントの部位特異的挿入の両方がこのインビトロ系において可能であるということが実証された。遺伝子のセグメントの正確な置換を触媒的にサポートするこの系の能力が試験された。遺伝子編集の長期的な目的の１つは、機能しない遺伝子または機能に異常のあるエクソンの機能するコピーを首尾よく元に戻すことである。挿入の評価のために実施したのと同じ反応ストラテジーを実施したが（図２３Ａを参照のこと）、但し、この反応では、遺伝子のセグメントを取り除くために、２つのＣｐｆ１ ＲＮＰを用いて、ｌａｃＺ遺伝子に沿った異なる位置に２つの切断を生じさせた。８１、１３６および１７７塩基対の遺伝子セグメントを置換するように別個の反応を設計し、８１、１３６および１８６塩基のドナーＤＮＡフラグメントの個々の集団を別個の置換反応の各々にそれぞれ添加した。８１塩基のＤＮＡドナーフラグメントを含む反応に関しては、回収されたコロニーの２０％が、ｌａｃＺ遺伝子のコード領域を保つ完全な置換をインフレームで含んでいた（図３３Ａ）。１３６塩基置換反応の６６パーセントは、完全な置換を含むプラスミドをもたらし（図３３Ｂ）、１８６塩基置換反応の１０％は、完全な置換を有するプラスミドを含んでいた（図３３Ｃ）。確実に５’オーバーハングの相同性をネイティブの遺伝子セグメントと区別できるように、ドナーＤＮＡフラグメントの各々にバーコードＡＡ／ＴＴ／ＧＧＧを組み込んだ。１７、３６および４５塩基の長さのドナーＤＮＡフラグメントでも同じ実験を実施した。これらのドナーＤＮＡフラグメントはいずれも、正確な置換をもたらさなかったが（図３５Ａ）、但し、それらは、様々な長さと構成の、不正確な置換を生じさせた。これらの結果は、このインビトロ遺伝子編集システムが約８１～１８６塩基の範囲の長さのドナーＤＮＡフラグメントによる完全な遺伝子セグメント置換を触媒できるということを実証した。ドナーＤＮＡセグメントを含む反応から生じた単離プラスミドの集団においても部位特異的欠失が見出されたということに注目することも重要であり（図３５Ｂ）、これは、欠失/切除反応および置換反応の両方が同じインビトロ系において起こっていたという事実を裏付ける。
【0147】
実施例１３：部位特異的変異導入
高精度でのｌａｃＺ遺伝子の一部のＤＮＡ置換の成功は、インビトロ遺伝子編集のユニークな用途の試験を促した。完全な遺伝子セグメント置換が注目すべき頻度で観察された（特に８１～１８６塩基の長さを有するドナーＤＮＡフラグメントを用いた場合）。ＫＲＡＳ遺伝子を標的として、コード領域内に見出される周知の発癌性変異を再設計することが決定された。最初の１３個のコドン内に２つの目立った変異が見られた。３５位では、ＧからＡへの塩基転換により、これらのコドンから生じるアミノ酸がグリシンからアスパラギン酸に変化する（図３６Ａ）。隣接するコドン１３では、２番目のＧからＡへの塩基転換が、やはり、グリシンをアスパラギン酸残基に変換する。これらの変異の各々は、単一の部位変化として、あるいは二重の部位変化として、ＫＲＡＳタンパク質の機能の再変更に重大な影響を与え得る。従って、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１３ＤおよびＧ１２ＤとＧ１３Ｄの変異の組み合わせを有する３種のドナーＤＮＡフラグメントで多重化することにより、単一の反応混合物において３種の変異の全てを生じさせた（図３６Ｂ）。最適化反応の結果は、成功した効率的な置換を８１～１８６塩基の範囲のフラグメントで達成できることを示したため、１１４塩基のドナーＤＮＡフラグメントを利用した（図３３Ａ～図３３Ｃ）。反応は、図２３Ａで説明されるように実施されたが、１点の変更を伴った：ドナーＤＮＡフラグメントとＲＮＰとの間のモル関係が維持され、その結果、この反応では、３種の異なるドナーフラグメントはそれぞれ、反応中に３３％しか存在しなかった。結果を図３６Ｃに提示する。ＫＲＡＳ遺伝子の部位特異的変異導入を単離し、１４個の細菌コロニーから独立的に単離されたプラスミドＤＮＡを分析することにより確認した。この集団内で、個々の変異および二重変異の両方が見出された。配列決定されたプラスミドの７８％が個々の変異または二重変異のいずれかを含むことが見出され、５０％は完全に置換されていた。これらの結果は、このインビトロ遺伝子編集反応を用いて、正確な遺伝子セグメント置換を多重化し、単一の反応混合物から部位特異的変異の集団を生じさせることができる、ということを明らかにした。さらに、この反応が本当に部位特異的であり、ＫＲＡＳ遺伝子のコード領域内に望ましくない標的外部位の変異を生じさせていないことを確認するために、ＫＲＡＳ遺伝子のコード領域を超えて上流および下流までプラスミドを配列決定した。シーケンシングストラテジーおよびＫＲＡＳのコード領域内の置換部位の位置のマップが図３６Ｄに示されている。図３６Ｃに示されるＧ１２Ｄ／Ｇ１３ＤドナーＤＮＡフラグメントを含むインビトロ反応から単離された再設計されたプラスミドＤＮＡ上の標的部位における意図された突然変異以外に、遺伝子に沿った他の位置ではＤＮＡ配列の変化は観察されなかった。これらの結果により、このインビトロ遺伝子編集システムは、検出可能な標的外部位の変異を生じさせることなく真核生物の遺伝子のコード領域内に複数の部位特異的変異を生じさせるために用いることができる、ということが示された。
高精度でのｌａｃＺ遺伝子の一部のＤＮＡ置換の成功は、インビトロ遺伝子編集のユニークな用途の試験を促した。完全な遺伝子セグメント置換が注目すべき頻度で観察された（特に８１～１８６塩基の長さを有するドナーＤＮＡフラグメントを用いた場合）。ＫＲＡＳ遺伝子を標的として、コード領域内に見出される周知の発癌性変異を再設計することが決定された。最初の１３個のコドン内に２つの目立った変異が見られた。３５位では、ＧからＡへの塩基転換により、これらのコドンから生じるアミノ酸がグリシンからアスパラギン酸に変化する（図３６Ａ）。隣接するコドン１３では、２番目のＧからＡへの塩基転換が、やはり、グリシンをアスパラギン酸残基に変換する。これらの変異の各々は、単一の部位変化として、あるいは二重の部位変化として、ＫＲＡＳタンパク質の機能の再変更に重大な影響を与え得る。従って、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１３ＤおよびＧ１２ＤとＧ１３Ｄの変異の組み合わせを有する３種のドナーＤＮＡフラグメントで多重化することにより、単一の反応混合物において３種の変異の全てを生じさせた（図３６Ｂ）。最適化反応の結果は、成功した効率的な置換を８１～１８６塩基の範囲のフラグメントで達成できることを示したため、１１４塩基のドナーＤＮＡフラグメントを利用した（図３３Ａ～図３３Ｃ）。反応は、図２３Ａで説明されるように実施されたが、１点の変更を伴った：ドナーＤＮＡフラグメントとＲＮＰとの間のモル関係が維持され、その結果、この反応では、３種の異なるドナーフラグメントはそれぞれ、反応中に３３％しか存在しなかった。結果を図３６Ｃに提示する。ＫＲＡＳ遺伝子の部位特異的変異導入を単離し、１４個の細菌コロニーから独立的に単離されたプラスミドＤＮＡを分析することにより確認した。この集団内で、個々の変異および二重変異の両方が見出された。配列決定されたプラスミドの７８％が個々の変異または二重変異のいずれかを含むことが見出され、５０％は完全に置換されていた。これらの結果は、このインビトロ遺伝子編集反応を用いて、正確な遺伝子セグメント置換を多重化し、単一の反応混合物から部位特異的変異の集団を生じさせることができる、ということを明らかにした。さらに、この反応が本当に部位特異的であり、ＫＲＡＳ遺伝子のコード領域内に望ましくない標的外部位の変異を生じさせていないことを確認するために、ＫＲＡＳ遺伝子のコード領域を超えて上流および下流までプラスミドを配列決定した。シーケンシングストラテジーおよびＫＲＡＳのコード領域内の置換部位の位置のマップが図３６Ｄに示されている。図３６Ｃに示されるＧ１２Ｄ／Ｇ１３ＤドナーＤＮＡフラグメントを含むインビトロ反応から単離された再設計されたプラスミドＤＮＡ上の標的部位における意図された突然変異以外に、遺伝子に沿った他の位置ではＤＮＡ配列の変化は観察されなかった。これらの結果により、このインビトロ遺伝子編集システムは、検出可能な標的外部位の変異を生じさせることなく真核生物の遺伝子のコード領域内に複数の部位特異的変異を生じさせるために用いることができる、ということが示された。
【0148】
他の実施形態
本明細書中の可変物の定義における要素の列挙の記載は、任意の単一の要素または列挙された要素の組み合わせ（またはサブコンビネーション）としての当該可変物の定義を包含する。本明細書中の実施形態の記載は、任意の単一の実施形態としての、または任意の他の実施形態もしくはその一部と組み合わせた、当該実施形態を包含する。
本明細書中の可変物の定義における要素の列挙の記載は、任意の単一の要素または列挙された要素の組み合わせ（またはサブコンビネーション）としての当該可変物の定義を包含する。本明細書中の実施形態の記載は、任意の単一の実施形態としての、または任意の他の実施形態もしくはその一部と組み合わせた、当該実施形態を包含する。
【0149】
本明細書で引用されるありとあらゆる特許、特許出願および刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態を参照して本発明を開示しているが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく本発明の他の実施形態および変形が他の当業者によって考案されてよいということは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような実施形態および同等の変形を全て包含すると解釈されることが意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23A】
【図23B】
【図24A】
【図24B】
【図24C】
【図25-1】
【図25-2】
【図26-1】
【図26-2】
【図27A】
【図27B】
【図27C】
【図27D】
【図28-1】
【図28-2】
【図28-3】
【図29A】
【図29B】
【図29C】
【図29D】
【図30】
【図31】
【図32A】
【図32B】
【図33A】
【図33B】
【図33C】
【図34】
【図35A】
【図35B】
【図36A】
【図36B】
【図36C】
【図36D】
【配列表】