ホーム > 特許ランキング > Ｋｕｍｈｏ ＨＴ， Ｉｎｃ．
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-07-06
(45)【発行日】2023-07-14
(54)【発明の名称】ＩＣＡＭ－１に特異的に結合する抗体およびその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230707BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230707BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20230707BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230707BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230707BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230707BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230707BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230707BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230707BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230707BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20230707BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20230707BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20230707BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230707BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230707BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20230707BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230707BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20230707BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20230707BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20230707BHJP
A61P 5/14 20060101ALI20230707BHJP
A61P 17/14 20060101ALI20230707BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20230707BHJP
G01N 33/531 20060101ALI20230707BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230707BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
C07K16/46
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61P37/06
A61P11/06
A61P3/04
A61P3/10
A61P29/00
A61P29/00 101
A61P19/02
A61P17/00
A61P17/06
A61P1/04
A61P21/04
A61P5/14
A61P17/14
A61P37/08
G01N33/531 A
G01N33/53 D
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2021538358
(86)(22)【出願日】2019-12-31
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-15
(86)【国際出願番号】 KR2019018822
(87)【国際公開番号】W WO2020141869
(87)【国際公開日】2020-07-09
【審査請求日】2021-06-30
(31)【優先権主張番号】10-2018-0173725
(32)【優先日】2018-12-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】522387607
【氏名又は名称】クンホ、エイチティー、インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｋｕｍｈｏ ＨＴ， Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(74)【代理人】
【識別番号】100091487
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 行孝
(72)【発明者】
【氏名】ムン、ユリ
(72)【発明者】
【氏名】ジ、ギリョン
(72)【発明者】
【氏名】ユン、サンスン
(72)【発明者】
【氏名】キム、ジョンシク
【審査官】山内 達人
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００８／００７６４８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００７／０９１７１９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００４／０６０９１９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００９－５２４４３４（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ｃ０７Ｋ
Ｃ１２Ｐ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
Ｇ０１Ｎ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
次の相補性決定部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲｓ）を含む、抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片：配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、
配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、
配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および
配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３。
【請求項2】
フレームワークとして次を含む、請求項１に記載の抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片：配列番号９７または９８のアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク１；
配列番号９９または１００のアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク２；
配列番号１０１または１０２のアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク３；
配列番号８１のアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク４；
配列番号１０３または１０４のアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク１；
配列番号１０５のアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク２；
配列番号１０６のアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク３；および
配列番号１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク４。
【請求項3】
フレームワークとして次を含む、請求項１に記載の抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片：配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、および４８より選ばれたアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク１；
配列番号４９、５０、５１、５２、５３、５４、および５５より選ばれたアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク２；
配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、および８０より選ばれたアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク３；
配列番号８１のアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク４；
配列番号８２、８３、および８４より選ばれたアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク１；
配列番号８５、８６、８７、８８、および８９より選ばれたアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク２；
配列番号９０、９１、および９２より選ばれたアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク３；および
配列番号９３または９４のアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク４。
【請求項4】
配列番号７および１１～３４からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および配列番号８および３５～３８からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項１に記載の抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項5】
抗ＩＣＡＭ－１抗体は、動物抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項6】
前記抗原結合断片は、前記抗ＩＣＡＭ－１抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２である、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項7】
請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片を含む、免疫細胞媒介性疾患の予防または治療のための医薬組成物。
【請求項8】
前記免疫細胞媒介性疾患は、移植拒絶、移植片対宿主疾患、喘息、肥満、第２型糖尿病、免疫細胞媒介炎症、または自己免疫疾患である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記自己免疫疾患は、脳脊髄炎、リウマチ関節炎、全身紅斑性狼瘡、アトピー皮膚炎、多発性硬化症、１型糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、ベーチェット病、シェーグレン症候群、重症筋無力症、硬皮症、結節性多発動脈炎、菊池病、膠原病、橋本甲状腺炎、乾癬、白斑症、甲状腺機能亢進症、線維筋痛、円形脱毛、またはアレルギーである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項10】
請求項１の抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片をコードする、核酸分子。
【請求項11】
配列番号７および１１～３４より選ばれたアミノ酸配列；および配列番号８および３５～３８より選ばれたアミノ酸配列
をコードする、核酸分子。
【請求項12】
請求項１０または１１に記載の核酸分子を含む、組換えベクター。
【請求項13】
請求項１２に記載の組換えベクターを含む、組換え細胞。
【請求項14】
請求項１の抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子を含む組換えベクターを含む組換え細胞を培養する工程を含む、抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片の製造方法。
【請求項15】
請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片を含む、ＩＣＡＭ－１検出用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
ＩＣＡＭ－１に特異的に結合する抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片、およびその用途に関し、具体的には、抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片、および前記抗体または抗原結合断片を有効成分として含む樹状細胞の分化および／または機能調節用医薬組成物および免疫細胞媒介性疾患の予防および／または治療のための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ，ＤＣ）は多様な免疫反応を統合させる高度の特性化した抗原提示細胞であり、免疫の開始および免疫寛容に関連する抗原提示細胞の異種ファミリーを含む。現在まで、未成熟樹状細胞はＴ細胞を免疫性欠如（ａｎｅｒｇｙ）状態に誘導し、リポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＬＰＳ）のような活性刺激剤によって成熟樹状細胞に形質転換された樹状細胞は、Ｔ細胞一次応答を誘導する。また、独特のサイトカイン生産プロファイルを有する準成熟された樹状細胞は免疫寛容性機能を付与することができる。
【0003】
ＩＣＡＭ－１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ １）は、ドメイン１ないしドメイン５と命名され、Ｎ末端からＣ末端方向に番号が振られた５個の細胞外免疫グロブリンスーパーファミリードメイン、細胞膜透過領域、および細胞内領域で構成された、９０ｋＤａのタイプＩ細胞表面糖タンパク質である。
【0004】
ＩＣＡＭ－１はＴ細胞と抗原提示細胞間の相互作用のような白血球／白血球相互作用を媒介する。また、炎症過程の間組織への白血球流出を媒介する。インビトロ研究によって、ＩＣＡＭ－１／白血球機能関連抗原－１（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ－１，ＬＦＡ－１）の相互作用を妨げる抗体がＴ細胞の内皮細胞への付着を妨げ、これらの抗体によってＴ細胞活性化も混合リンパ球内で有意に減少し得ることが提示された（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９８８，８５：３０９５－３０９９）。ヒトＩＣＡＭ－１のドメインに結合する単一クローン抗体であるＲ６－５－Ｄ６（ｅｎｌｉｍｏｍａｂ）を使用した猿研究では、腎臓同種移植片生残率が増加し、移植片内へのＴ細胞浸透が対照群と比較して減少した（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９０，１４４：４６０４－４６１２）。また、エンリモマブ（ｅｎｌｉｍｏｍａｂ）はリウマチ性関節炎患者で疾患活性を抑制させる効果があることが立証された（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．１９９４，３７：９９２－９９９；Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１９９６，２３：１３３８－１３４４）。しかし、腎臓移植後のエンリモマブ誘導治療は急性拒絶反応の比率または移植片機能遅延の危険減少に大きな効果はない。また、エンリモマブはＴ細胞だけでなく好中球の血管内皮細胞への付着を遮断する機能をし、したがって好中球の移動を妨げるのは潜在的に感染に対する感受性を増加させると報告された（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９，１６２：２３５２－２３５７）。
【0005】
ＩＣＡＭ－１に特異的に結合して樹状細胞の分化および機能を調節してより効果的に免疫反応を調節できる物質の開発が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
一例はＩＣＡＭ－１を特異的に認識する抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0007】
前記抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号１（ＧＹＴＦＴＤＹＡ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号２（ＩＳＴＹＳＧＮＴ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ２）、および配列番号３（ＡＲＳＬＹＦＧＳＳＧＦＤＹ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ３）を含む重鎖相補性決定部位（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎｓ；ＣＤＲｓ）または前記重鎖相補性決定部位を含む重鎖可変領域；および
配列番号４（ＱＴＬＶＹＲＮＧＮＴＹ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号５（ＫＶＳ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ２）、および配列番号６（ＳＱＮＴＨＦＰＹＴ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む軽鎖相補性決定部位または前記軽鎖相補性決定部位を含む軽鎖可変領域を含むものであり得る。
配列番号１（ＧＹＴＦＴＤＹＡ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号２（ＩＳＴＹＳＧＮＴ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ２）、および配列番号３（ＡＲＳＬＹＦＧＳＳＧＦＤＹ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ３）を含む重鎖相補性決定部位（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎｓ；ＣＤＲｓ）または前記重鎖相補性決定部位を含む重鎖可変領域；および
配列番号４（ＱＴＬＶＹＲＮＧＮＴＹ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号５（ＫＶＳ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ２）、および配列番号６（ＳＱＮＴＨＦＰＹＴ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む軽鎖相補性決定部位または前記軽鎖相補性決定部位を含む軽鎖可変領域を含むものであり得る。
【0008】
一具体例で、前記重鎖可変領域は配列番号７および１１～３４からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号８および３５～３８からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含み得る。
【0009】
他の例は抗ＩＣＡＭ－１抗体の重鎖相補性決定部位、重鎖可変領域または重鎖をコードする核酸分子を提供する。
【0010】
他の例は抗ＩＣＡＭ－１抗体の軽鎖相補性決定部位、軽鎖可変領域または軽鎖をコードする核酸分子を提供する。
【0011】
他の例は前記抗ＩＣＡＭ－１抗体の重鎖相補性決定部位、重鎖可変領域または重鎖をコードする核酸分子および抗ＩＣＡＭ－１抗体の軽鎖相補性決定部位、軽鎖可変領域または軽鎖をコードする核酸分子を一つのベクターに共に含むかそれぞれ別のベクターに含む組換えベクターを提供する。
【0012】
他の例は前記組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。
【0013】
他の例は前記抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む疾病の予防および／または治療のための医薬組成物を提供する。前記疾病は免疫細胞媒介性疾患であり得る。他の例は前記ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を免疫細胞媒介性疾患の予防および／または治療を必要とする対象に投与する工程を含む、免疫細胞媒介性疾患の予防および／または治療方法を提供する。前記方法は、前記投与する工程以前に、免疫細胞媒介性疾患の予防および／または治療を必要とする対象を確認する工程をさらに含み得る。他の例は前記ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片の免疫細胞媒介性疾患の予防および／または治療、または免疫細胞媒介性疾患の予防および／または治療のための医薬組成物の製造に使用するための用途を提供する。前記医薬組成物、方法および用途において、免疫細胞媒介性疾患は移植拒絶、移植片対宿主疾患、喘息、自己免疫疾患などより選ばれたものであり得る。
【0014】
他の例は前記抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む樹状細胞の分化および／または機能を調節するための医薬組成物を提供する。他の例は抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を樹状細胞の分化および機能の調節を必要とする対象に投与する工程を含む樹状細胞の分化および／または機能を調節する方法を提供する。他の例は抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片の樹状細胞の分化および／または機能の調節または樹状細胞の分化および／または機能を調節するための医薬組成物の製造に使用するための用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0015】
本明細書ではＩＣＡＭ－１を特異的に認識する抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片およびこれらの用途が提供される。
【0016】
前記抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片はＩＣＡＭ－１のドメインのうちドメイン２を特異的に認識および／または結合することを特徴とする。前記抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片はＩＣＡＭ－１に対して抑制活性を有する拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）であり得る。しかし、前記抗体は抗原であるＩＣＡＭ－１のリガンドであるＬＦＡ－１との結合部位であるＩＣＡＭ－１のドメイン１ではなくドメイン２に結合することによって、ＩＣＡＭ－１／ＬＦＡ－１結合自体は阻害しない。これは前記抗体がＴ細胞のｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎを阻害しないことにより確認することができる。前記抗体は、寛容樹状細胞に分化を誘導して機能的に免疫抑制を誘導する点と樹状細胞とＴ細胞との共培養でＴ細胞の免疫活性を抑制する点でＴ細胞活性伝達のための免疫シナプスの空間的機能活性化および関連タンパク質間の結合および再編成に潜在的に影響を及ぼし得る。このような点で前記抗体はレセプター－リガンド結合を物理的に抑制するより機能的にＩＣＡＭ－１活性を抑制する拮抗剤であり得る。また、前記抗体は前記した活性によって結果的にリガンドを含むＴ細胞の免疫活性を抑制する結果を誘導するものであり得る。言い換えれば、本明細書で提供される抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片はＩＣＡＭ－１（例えば、ヒトＩＣＡＭ－１）のドメイン２に結合し、抗原特異的Ｔ－細胞耐性を誘導することによって、樹状細胞の分化および／または機能を抑制し、免疫細胞－媒介疾患に対する予防および／または治療効果を有するものであり得る。
【0017】
ＩＣＡＭ－１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ １）はＣＤ５４（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ５４）とも呼ばれ、内皮細胞または免疫系細胞上に発現する細胞表面糖タンパク質である。
【0018】
本明細書で提供される抗体の抗原として作用するＩＣＡＭ－１は哺乳類由来のものであり得、例えばヒトＩＣＡＭ－１（例えば、ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ ＮＰ＿０００１９２．２など）、サルＩＣＡＭ－１（例えば、ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ ＮＰ＿００１２６６５３２など）であり得る。一例で、前記抗体はヒトＩＣＡＭ－１とサルＩＣＡＭ－１に交差反応性を示すものであり得る。
【0019】
本明細書で「抗体」とは、免疫系内で抗原の刺激によって作られる物質または特定抗原に特異的に結合するタンパク質を総称するものであり、前記物質またはタンパク質に基づいて組換え的または合成的に生産されたタンパク質も含む概念として使用される。前記抗体は非自然的に生成されたもの、例えば、組換え的または合成的に生成されたものであり得る。前記抗体は動物抗体（例えば、マウス抗体など）、キメラ抗体（例えば、マウス－ヒトキメラ抗体）、ヒト化抗体、またはヒト抗体であり得る。前記抗体は単クローン抗体または多クローン抗体であり得る。
【0020】
また、本明細書で抗体は、特に言及しない限り、抗原結合能を保有する抗体のすべての断片を含むものと理解され得る。本明細書で「相補性決定部位（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ，ＣＤＲ）」とは、抗体の可変部位のうちの抗原との結合特異性を付与する部位を意味する。先立って説明した抗体の抗原結合断片は前記相補性決定部位を一つ以上含む抗体断片であり得る。
【0021】
一例はＩＣＡＭ－１を特異的に認識またはＩＣＡＭ－１に特異的に結合する抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0022】
前記抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号１（ＧＹＴＦＴＤＹＡ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号２（ＩＳＴＹＳＧＮＴ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ２）、および配列番号３（ＡＲＳＬＹＦＧＳＳＧＦＤＹ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ３）を含む重鎖相補性決定部位（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎｓ；ＣＤＲｓ）または前記重鎖相補性決定部位を含む重鎖可変領域；および
配列番号４（ＱＴＬＶＹＲＮＧＮＴＹ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号５（ＫＶＳ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ２）、および配列番号６（ＳＱＮＴＨＦＰＹＴ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む軽鎖相補性決定部位または前記軽鎖相補性決定部位を含む軽鎖可変領域を含むものあり得る。
配列番号１（ＧＹＴＦＴＤＹＡ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号２（ＩＳＴＹＳＧＮＴ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ２）、および配列番号３（ＡＲＳＬＹＦＧＳＳＧＦＤＹ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｈ３）を含む重鎖相補性決定部位（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎｓ；ＣＤＲｓ）または前記重鎖相補性決定部位を含む重鎖可変領域；および
配列番号４（ＱＴＬＶＹＲＮＧＮＴＹ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号５（ＫＶＳ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ２）、および配列番号６（ＳＱＮＴＨＦＰＹＴ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む軽鎖相補性決定部位または前記軽鎖相補性決定部位を含む軽鎖可変領域を含むものあり得る。
【0023】
前記重鎖可変領域で、
重鎖フレームワーク１（ＶＨ－ＦＲ１；ＣＤＲＨ１のＮ－末端隣接部位）は、配列番号９７（ＱＶＱＬＸ１ＱＳＧＡＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＰＧＸ５ＳＶＫＸ６ＳＣＫＸ７Ｓ；Ｘ１はＱまたはＶ、Ｘ２はＬまたはＶ、Ｘ３はＶまたはＫ、Ｘ４はＲまたはＫ、Ｘ５はＶまたはＡ、Ｘ６はＩまたはＶ、Ｘ７はＧまたはＡ）または配列番号９８（ＱＶＱＬＸ８ＱＳＧＡＥＶＸ９ＫＰＧＡＳＶＫＸ１０ＳＣＫＸ１１Ｓ；Ｘ８はＶまたはＱ、Ｘ９はＫまたはＶ、Ｘ１０はＩまたはＶ、Ｘ１１はＧまたはＡ）のアミノ酸配列、例えば、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、および４８より選ばれたアミノ酸配列を含むものであり得、
重鎖フレームワーク２（ＶＨ－ＦＲ２；ＣＤＲＨ１のＣ－末端とＣＤＲＨ２のＮ－末端の間の部位）は、配列番号９９（ＬＨＷＶＸ１２ＱＸ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７ＬＥＷＸ１８ＧＶ；Ｘ１２はＫまたはＲ、Ｘ１３はＳまたはＡ、Ｘ１４はＨまたはＰ、Ｘ１５はＡまたはＧ、Ｘ１６はＫまたはＱ、Ｘ１７はＳまたはＲ、Ｘ１８はＩまたはＭ）または配列番号１００（ＬＨＷＶＸ１９ＱＡＰＧＱＸ２０ＬＥＷＸ２１ＧＶ；Ｘ１９はＲまたはＫ、Ｘ２０はＲまたはＳ、Ｘ２１はＩまたはＭ）のアミノ酸配列、例えば、配列番号４９、５０、５１、５２、５３、５４、および５５より選ばれたアミノ酸配列を含むものであり得、
重鎖フレームワーク３（ＶＨ－ＦＲ３；ＣＤＲＨ２のＣ－末端とＣＤＲＨ３のＮ－末端の間の部位）は、配列番号１０１（Ｘ２２ＹＸ２３ＱＫＦＸ２４ＧＸ２５Ｘ２６ＴＸ２７ＴＸ２８ＤＸ２９ＳＸ３０Ｘ３１ＴＡＹＸ３２ＥＬＸ３３Ｘ３４ＬＸ３５ＳＥＤＸ３６ＡＸ３７Ｘ３８ＹＣ；Ｘ２２はＤまたはＫ、Ｘ２３はＮまたはＳ、Ｘ２４はＲまたはＱ、Ｘ２５はＫまたはＲ、Ｘ２６はＡまたはＶ、Ｘ２７はＭまたはＩ、Ｘ２８はＶまたはＲ、Ｘ２９はＫまたはＴ、Ｘ３０はＳまたはＡ、Ｘ３１はＴまたはＳ、Ｘ３２はＬまたはＭ、Ｘ３３はＡまたはＳ、Ｘ３４はＲまたはＳ、Ｘ３５はＴまたはＲ、Ｘ３６はＳまたはＴ、Ｘ３７はＩまたはＶ、Ｘ３８はＨまたはＹ）または配列番号１０２（Ｘ３９ＹＸ４０ＱＫＦＸ４１ＧＸ４２Ｘ４３ＴＸ４４ＴＸ４５ＲＸ４６ＳＡＸ４７ＴＡＹＸ４８ＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＸ４９Ｘ５０ＹＣ；Ｘ３９はＤまたはＫ、Ｘ４０はＮまたはＳ、Ｘ４１はＲまたはＱ、Ｘ４２はＲまたはＫ、Ｘ４３はＡまたはＶ、Ｘ４４はＩまたはＭ、Ｘ４５はＲまたはＶ、Ｘ４６はＴまたはＫ、Ｘ４７はＳまたはＴ、Ｘ４８はＭまたはＬ、Ｘ４９はＶまたはＩ、Ｘ５０はＹまたはＨ）のアミノ酸配列、例えば、配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、および８０より選ばれたアミノ酸配列を含むものであり得、および／または
重鎖フレームワーク４（ＶＨ－ＦＲ４；ＣＤＲＨ３のＣ－末端と隣接する部位）は、配列番号８１のアミノ酸配列を含むものであり得る。
重鎖フレームワーク１（ＶＨ－ＦＲ１；ＣＤＲＨ１のＮ－末端隣接部位）は、配列番号９７（ＱＶＱＬＸ１ＱＳＧＡＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＰＧＸ５ＳＶＫＸ６ＳＣＫＸ７Ｓ；Ｘ１はＱまたはＶ、Ｘ２はＬまたはＶ、Ｘ３はＶまたはＫ、Ｘ４はＲまたはＫ、Ｘ５はＶまたはＡ、Ｘ６はＩまたはＶ、Ｘ７はＧまたはＡ）または配列番号９８（ＱＶＱＬＸ８ＱＳＧＡＥＶＸ９ＫＰＧＡＳＶＫＸ１０ＳＣＫＸ１１Ｓ；Ｘ８はＶまたはＱ、Ｘ９はＫまたはＶ、Ｘ１０はＩまたはＶ、Ｘ１１はＧまたはＡ）のアミノ酸配列、例えば、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、および４８より選ばれたアミノ酸配列を含むものであり得、
重鎖フレームワーク２（ＶＨ－ＦＲ２；ＣＤＲＨ１のＣ－末端とＣＤＲＨ２のＮ－末端の間の部位）は、配列番号９９（ＬＨＷＶＸ１２ＱＸ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７ＬＥＷＸ１８ＧＶ；Ｘ１２はＫまたはＲ、Ｘ１３はＳまたはＡ、Ｘ１４はＨまたはＰ、Ｘ１５はＡまたはＧ、Ｘ１６はＫまたはＱ、Ｘ１７はＳまたはＲ、Ｘ１８はＩまたはＭ）または配列番号１００（ＬＨＷＶＸ１９ＱＡＰＧＱＸ２０ＬＥＷＸ２１ＧＶ；Ｘ１９はＲまたはＫ、Ｘ２０はＲまたはＳ、Ｘ２１はＩまたはＭ）のアミノ酸配列、例えば、配列番号４９、５０、５１、５２、５３、５４、および５５より選ばれたアミノ酸配列を含むものであり得、
重鎖フレームワーク３（ＶＨ－ＦＲ３；ＣＤＲＨ２のＣ－末端とＣＤＲＨ３のＮ－末端の間の部位）は、配列番号１０１（Ｘ２２ＹＸ２３ＱＫＦＸ２４ＧＸ２５Ｘ２６ＴＸ２７ＴＸ２８ＤＸ２９ＳＸ３０Ｘ３１ＴＡＹＸ３２ＥＬＸ３３Ｘ３４ＬＸ３５ＳＥＤＸ３６ＡＸ３７Ｘ３８ＹＣ；Ｘ２２はＤまたはＫ、Ｘ２３はＮまたはＳ、Ｘ２４はＲまたはＱ、Ｘ２５はＫまたはＲ、Ｘ２６はＡまたはＶ、Ｘ２７はＭまたはＩ、Ｘ２８はＶまたはＲ、Ｘ２９はＫまたはＴ、Ｘ３０はＳまたはＡ、Ｘ３１はＴまたはＳ、Ｘ３２はＬまたはＭ、Ｘ３３はＡまたはＳ、Ｘ３４はＲまたはＳ、Ｘ３５はＴまたはＲ、Ｘ３６はＳまたはＴ、Ｘ３７はＩまたはＶ、Ｘ３８はＨまたはＹ）または配列番号１０２（Ｘ３９ＹＸ４０ＱＫＦＸ４１ＧＸ４２Ｘ４３ＴＸ４４ＴＸ４５ＲＸ４６ＳＡＸ４７ＴＡＹＸ４８ＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＸ４９Ｘ５０ＹＣ；Ｘ３９はＤまたはＫ、Ｘ４０はＮまたはＳ、Ｘ４１はＲまたはＱ、Ｘ４２はＲまたはＫ、Ｘ４３はＡまたはＶ、Ｘ４４はＩまたはＭ、Ｘ４５はＲまたはＶ、Ｘ４６はＴまたはＫ、Ｘ４７はＳまたはＴ、Ｘ４８はＭまたはＬ、Ｘ４９はＶまたはＩ、Ｘ５０はＹまたはＨ）のアミノ酸配列、例えば、配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、および８０より選ばれたアミノ酸配列を含むものであり得、および／または
重鎖フレームワーク４（ＶＨ－ＦＲ４；ＣＤＲＨ３のＣ－末端と隣接する部位）は、配列番号８１のアミノ酸配列を含むものであり得る。
【0024】
前記軽鎖可変領域で、
軽鎖フレームワーク１（ＶＬ－ＦＲ１；ＣＤＲＬ１のＮ－末端隣接部位）は、配列番号１０３（ＤＶＶＬＴＱＸ５１ＰＬＳＸ５２ＰＶＸ５３ＬＧＸ５４Ｘ５５ＡＳＩＳＣＲＳＳ；Ｘ５１はＴまたはＳ、Ｘ５２はＬまたはＳ、Ｘ５３はＮまたはＴ、Ｘ５４はＤまたはＱ、Ｘ５５はＱまたはＰ）または配列番号１０４ ＤＶＶＬＴＱＸ５６ＰＬＳＸ５７ＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳ；Ｘ５６はＳまたはＴ、Ｘ５７はＬまたはＳ）のアミノ酸配列、例えば、配列番号８２、８３、および８４より選ばれたアミノ酸配列を含むものであり得、
軽鎖フレームワーク２（ＶＬ－ＦＲ２；ＣＤＲＬ１のＣ－末端とＣＤＲＬ２のＮ－末端の間の部位）は、配列番号１０５（ＬＨＷＹＸ５８ＱＸ５９Ｘ６０ＧＱＸ６１ＰＸ６２ＬＬＩＸ６３；Ｘ５８はＬまたはＱ、Ｘ５９はＫまたはＲ、Ｘ６０はＡまたはＰ、Ｘ６１はＳまたはＰ、Ｘ６２はＫまたはＲ、Ｘ６３はＹまたは存在しない）のアミノ酸配列、例えば、配列番号８５、８６、８７、８８、および８９より選ばれたアミノ酸配列を含むものであり得、
軽鎖フレームワーク３（ＶＬ－ＦＲ３；ＣＤＲＬ２のＣ－末端とＣＤＲＬ３のＮ－末端の間の部位）は、配列番号１０６（ＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＸ６４ＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＸ６５ＧＶＹＦＣ；Ｘ６４はＳまたはＡ、Ｘ６５はＬまたはＶ）のアミノ酸配列、例えば、配列番号９０、９１、および９２より選ばれたアミノ酸配列を含むものであり得、および／または
軽鎖フレームワーク４（ＶＬ－ＦＲ４；ＣＤＲＬ３のＣ－末端と隣接する部位）は、配列番号１０７（ＦＧＧＧＴＫＸ６６Ｘ６７Ｘ６８Ｘ６９Ｘ７０；Ｘ６６はＩまたはＬ、Ｘ６７はＫまたはＥ、Ｘ６８はＲまたはＩ、Ｘ６９はＱまたはＫ、Ｘ７０はＲまたは存在しない）のアミノ酸配列、例えば、配列番号９３または９４のアミノ酸配列を含むものであり得る。
軽鎖フレームワーク１（ＶＬ－ＦＲ１；ＣＤＲＬ１のＮ－末端隣接部位）は、配列番号１０３（ＤＶＶＬＴＱＸ５１ＰＬＳＸ５２ＰＶＸ５３ＬＧＸ５４Ｘ５５ＡＳＩＳＣＲＳＳ；Ｘ５１はＴまたはＳ、Ｘ５２はＬまたはＳ、Ｘ５３はＮまたはＴ、Ｘ５４はＤまたはＱ、Ｘ５５はＱまたはＰ）または配列番号１０４ ＤＶＶＬＴＱＸ５６ＰＬＳＸ５７ＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳ；Ｘ５６はＳまたはＴ、Ｘ５７はＬまたはＳ）のアミノ酸配列、例えば、配列番号８２、８３、および８４より選ばれたアミノ酸配列を含むものであり得、
軽鎖フレームワーク２（ＶＬ－ＦＲ２；ＣＤＲＬ１のＣ－末端とＣＤＲＬ２のＮ－末端の間の部位）は、配列番号１０５（ＬＨＷＹＸ５８ＱＸ５９Ｘ６０ＧＱＸ６１ＰＸ６２ＬＬＩＸ６３；Ｘ５８はＬまたはＱ、Ｘ５９はＫまたはＲ、Ｘ６０はＡまたはＰ、Ｘ６１はＳまたはＰ、Ｘ６２はＫまたはＲ、Ｘ６３はＹまたは存在しない）のアミノ酸配列、例えば、配列番号８５、８６、８７、８８、および８９より選ばれたアミノ酸配列を含むものであり得、
軽鎖フレームワーク３（ＶＬ－ＦＲ３；ＣＤＲＬ２のＣ－末端とＣＤＲＬ３のＮ－末端の間の部位）は、配列番号１０６（ＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＸ６４ＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＸ６５ＧＶＹＦＣ；Ｘ６４はＳまたはＡ、Ｘ６５はＬまたはＶ）のアミノ酸配列、例えば、配列番号９０、９１、および９２より選ばれたアミノ酸配列を含むものであり得、および／または
軽鎖フレームワーク４（ＶＬ－ＦＲ４；ＣＤＲＬ３のＣ－末端と隣接する部位）は、配列番号１０７（ＦＧＧＧＴＫＸ６６Ｘ６７Ｘ６８Ｘ６９Ｘ７０；Ｘ６６はＩまたはＬ、Ｘ６７はＫまたはＥ、Ｘ６８はＲまたはＩ、Ｘ６９はＱまたはＫ、Ｘ７０はＲまたは存在しない）のアミノ酸配列、例えば、配列番号９３または９４のアミノ酸配列を含むものであり得る。
【0025】
前記抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片において、
前記重鎖可変領域は配列番号９７または９８（例えば、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＦＲ１、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号９９または１００（例えば、配列番号４９、５０、５１、５２、５３、５４、または５５）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＦＲ２、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号１０１または１０２（例えば、配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＦＲ３、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、および配列番号８１のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＦＲ４を含み；
前記軽鎖可変領域は配列番号１０３または１０４（例えば、配列番号８２、８３、または８４）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＦＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号１０５（例えば、配列番号８５、８６、８７、８８、または８９）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＦＲ２、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、配列番号１０６（例えば、配列番号９０、９１、または９３）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＦＲ３、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３、および配列番号１０７（例えば、配列番号９３または９４）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＦＲ４を含むものであり得る。
前記重鎖可変領域は配列番号９７または９８（例えば、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＦＲ１、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号９９または１００（例えば、配列番号４９、５０、５１、５２、５３、５４、または５５）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＦＲ２、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号１０１または１０２（例えば、配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＦＲ３、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、および配列番号８１のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＦＲ４を含み；
前記軽鎖可変領域は配列番号１０３または１０４（例えば、配列番号８２、８３、または８４）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＦＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号１０５（例えば、配列番号８５、８６、８７、８８、または８９）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＦＲ２、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、配列番号１０６（例えば、配列番号９０、９１、または９３）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＦＲ３、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３、および配列番号１０７（例えば、配列番号９３または９４）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＦＲ４を含むものであり得る。
【0026】
一具体例で、前記重鎖可変領域は配列番号７および１１～３４からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号８および３５～３８からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含み得る。
【0027】
所望する抗原を被免疫動物に免疫させて生産する動物由来の抗体は一般的に治療目的でヒトに投与時免疫拒絶反応が起き得、このような免疫拒絶反応を抑制するためにキメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）が開発された。キメラ抗体は遺伝工学的方法を用いて抗－アイソタイプ（ａｎｔｉ－ｉｓｏｔｙｐｅ）反応の原因になる動物由来の抗体の不変領域をヒト抗体の不変領域に置き換えたものである。キメラ抗体は動物由来の抗体に比べて抗－アイソタイプ反応において相当部分改善されたが、依然として動物由来のアミノ酸が可変領域に存在しており潜在的な抗－イディオタイプ（ａｎｔｉ－ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ）反応に対する副作用を内包している。このような副作用を改善するために開発されたのがヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）である。これはキメラ抗体の可変領域中の抗原の結合に重要な役割をするＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｉｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）部位をヒト抗体骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に移植して製作される。
【0028】
ヒト化抗体を製作するためのＣＤＲ移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）技術において最も重要なのは動物由来の抗体のＣＤＲ部位を最もよく受け入れることができる最適化されたヒト抗体を選定することであり、そのために抗体データベースの活用、結晶構造（ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の分析、分子モデリング技術などを活用することができる。
【0029】
一具体例によれば、前記抗体は動物抗体（例えば、マウス抗体）、キメラ抗体（例えば、マウス－ヒトキメラ抗体）またはヒト化抗体であり得る。
【0030】
前記抗体または抗原結合断片において、配列番号１～３の重鎖ＣＤＲを除いた重鎖フレームワークおよび／または重鎖不変領域は免疫グロブリン（ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４など）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ）、例えば、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４など）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ）から由来した重鎖フレームワークおよび／または重鎖不変領域であり得、配列番号４～６の軽鎖ＣＤＲを除いた軽鎖フレームワークおよび／または軽鎖不変領域はカッパ（κ）またはラムダ（λ）タイプの軽鎖フレームワークおよび／または軽鎖不変領域であり得る。
【0031】
完全な抗体は２個の全長（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）軽鎖および２個の全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖と二硫化結合に連結されている。抗体の不変領域は重鎖不変領域と軽鎖不変領域に分けられ、重鎖不変領域はガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）およびイプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域はカッパ（κ）およびラムダ（λ）タイプを有する。
【0032】
用語の「重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するために十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨおよび３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３とヒンジ（ｈｉｎｇｅ）を含む全長重鎖およびその断片をすべて含む意味と解釈される。また、用語の「軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）」は抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬおよび不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖およびその断片をすべて含む意味と解釈される。
【0033】
用語の「ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）」は免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の高可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する。重鎖および軽鎖はそれぞれ３個のＣＤＲを含み得る（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）。前記ＣＤＲは抗体が抗原またはエピトープに結合するにあたって主要な接触残基を提供することができる。一方、本明細書において、用語の「特異的に結合」または「特異的に認識」は当業者に通常公知されている意味と同じものであって、抗原および抗体が特異的に相互作用して免疫学的反応をすることを意味する。
【0034】
用語の「抗原結合断片」は免疫グロブリン全体構造に対するその断片として、抗原が結合できる部分、例えば、ＣＤＲを含む抗体の一部を意味する。例えば、抗体の抗原結合断片はｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２であり得る。
【0035】
Ｆａｂは軽鎖および重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域および重鎖の最初の不変領域（ＣＨ１）を有する構造であり１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は重鎖ＣＨ１ドメインのＣ－末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有する点でＦａｂと差がある。Ｆ（ａｂ’）２抗体はＦａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは重鎖可変部位および軽鎖可変部位のみを有する最小の抗体フラグメントでＦｖ断片を生成する組換え技術は当業界に広く公知されている。二本鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は非共有結合により重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されており、単一鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ；ｓｃＦｖ）は一般的にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と単鎖の可変領域が共有結合により連結されるかまたはＣ－末端ですぐに連結されており、二重鎖Ｆｖのようにダイマーのような構造をなすことができる。前記抗原結合断片はタンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断するとＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断するとＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、遺伝子組換え技術により製作することができる。
【0036】
用語の「ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）」は抗体の重鎖に含まれている領域であって、ＣＨ１およびＣＨ２領域の間に存在し、抗体内抗原結合部位の柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）を提供する機能をする領域を意味する。
【0037】
前記抗ＩＣＡＭ－１抗体は単クローン抗体であり得る。単クローン抗体は当業界に広く知られた方法のとおりに製造することができる。例えば、ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ技法を用いて製造することができる。または抗ＩＣＡＭ－１抗体を用いて通常の方法によって動物（例えば、マウス）由来の単クローン抗体に製造することができる。
【0038】
一方、典型的なＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）フォーマットを用いてＩＣＡＭ－１との結合能に基づいて個別単クローン抗体をスクリーニングし得る。結合体に対して分子的相互作用を検定するための競争的ＥＬＩＳＡ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ）のような機能性分析または細胞－基盤分析（ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）のような機能性分析により阻害活性に対して検定し得る。その次に、強い阻害活性に基づいて選択された単クローン抗体メンバーに対してＩＣＡＭ－１に対するそれぞれの親和度（Ｋｄ ｖａｌｕｅｓ）を検定し得る。
【0039】
また他の例は前記抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む疾病の予防および／または治療のための医薬組成物を提供する。前記疾病は免疫細胞媒介性疾患であり得る。他の例は前記ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を免疫細胞媒介性疾患の予防および／または治療を必要とする対象に投与する工程を含む、免疫細胞媒介性疾患の予防および／または治療方法を提供する。前記方法は、前記投与する工程以前に、免疫細胞媒介性疾患の予防および／または治療を必要とする対象を確認する工程を追加で含み得る。他の例は前記ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片の免疫細胞媒介性疾患の予防および／または治療、または免疫細胞媒介性疾患の予防および／または治療のための医薬組成物の製造に使用するための用途を提供する。
【0040】
前記医薬組成物、方法および用途において、免疫細胞媒介性疾患は免疫細胞と関連するすべての疾病の中から選択され得る。前記免疫細胞はＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）、大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、単核球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）などからなる群より選ばれた一つ以上であり得る。一例で、前記免疫細胞媒介性疾患は移植拒絶（例えば、同種細胞移植、同種臓器移植、異種細胞移植、異種臓器移植の際に発生する拒絶反応）、移植片対宿主疾患（例えば、同種骨髓移植の際に発生する移植片対宿主疾患など）、喘息、肥満、第２型糖尿病、自己免疫疾患（例えば、脳脊髄炎（例えば、アレルギー性脳脊髄炎）、リウマチ関節炎、全身紅斑性狼瘡（ループス）、アトピー皮膚炎、多発性硬化症、１型糖尿病、慢性炎症性疾患（例えば、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎））、ベーチェット病、シェーグレン症候群、重症筋無力症、硬皮症、結節性多発動脈炎、菊池病、膠原病、橋本甲状腺炎、乾癬、白斑症、甲状腺機能亢進症、線維筋痛、円形脱毛、アレルギーなど）、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、大食細胞、単核球など）媒介炎症（例えば、大食細胞媒介炎症など）、前記免疫細胞媒介炎症によって誘発される炎症性疾病などより選ばれたものであり得る。
【0041】
他の例は前記抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む樹状細胞の分化および／または機能を調節するための医薬組成物を提供する。他の例は抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を樹状細胞の分化および機能の調節を必要とする対象に投与する工程を含む樹状細胞の分化および／または機能を調節する方法を提供する。他の例は抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片の樹状細胞の分化および／または機能の調節または樹状細胞の分化および／または機能を調節するための医薬組成物の製造に使用するための用途を提供する。
【0042】
前記医薬組成物は薬学的に許容可能な担体をさらに含み得る。前記薬学的に許容可能な担体は薬物の製剤化に通常用いられるものとして、ラクトース、デキストロース、スクロース、トレハロース、アルギニン、ヒスチジン、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどからなる群より選ばれた１種以上であり得るが、これに限定されるものではない。前記医薬組成物はまた、医薬組成物の製造に通常使用される希釈剤、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などからなる群より選ばれた１種以上をさらに含み得る。
【0043】
前記医薬組成物、または前記抗体またはその抗原結合断片の有効量は経口または非経口で投与し得る。非経口投与である場合は静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与、または病変部位局所投与などで投与し得る。経口投与時、タンパク質またはペプチドは消化されるため経口用組成物は活性薬剤をコートするか胃での分解から保護されるように剤形化することができる。また、前記組成物は活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与され得る。
【0044】
本明細書に記載された「薬学的有効量」は所望する薬理的効果を示すことができる有効成分（すなわち、抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片）の含有量または投与量を意味し、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与間隔、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によって多様に定まる。
【0045】
前記医薬組成物内の抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片の含有量または抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片の投与量は製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与間隔、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によって多様に処方し得る。例えば、前記抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片の１日投与量は、０．００１～１０００ｍｇ／ｋｇ、具体的には０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ、より具体的には０．１～５０ｍｇ／ｋｇ、さらに具体的には０．１～２０ｍｇ／ｋｇ範囲であり得るが、これに制限されるものではない。前記１日投与量は単位容量形態で一つの製剤に製剤化するか、適切に分量して製剤化するか、多用量容器内に入れ込んで製造することができる。
【0046】
前記医薬組成物は他の抗癌剤のような他の薬物と併用投与が可能であり、その投与量、投与方法および他の薬物の種類は患者の状態によって適宜処方することができる。
【0047】
前記医薬組成物はオイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液形態であるかエキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤などの形態に剤形化し得、剤形化のために分散剤または安定化剤をさらに含み得る。
【0048】
前記医薬組成物の投与対象患者はヒト、サルなどを含む霊長類などを含む哺乳類であり得る。
【0049】
一方、前記抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片はＩＣＡＭ－１に特異的に結合するので、これを用いてＩＣＡＭ－１を検出または確認することができる。したがって、本発明のまた他の例は前記抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片を含むＩＣＡＭ－１の検出用組成物を提供する。また、他の例は生物試料に前記抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片を処理する工程；および抗原－抗体反応の有無を確認する工程を含むＩＣＡＭ－１の検出方法を提供する。前記検出方法で、抗原－抗体反応が探知される場合、前記生物試料にＩＣＡＭ－１が存在すると決定（判断）することができる。したがって、前記検出方法は、前記抗原－抗体反応の有無を確認する工程の後に、抗原－抗体反応が探知される場合、前記生物試料にＩＣＡＭ－１が存在すると決定する工程をさらに含み得る。前記生物試料は哺乳類、例えばヒト（例えば、移植予定患者または移植を受けた患者、自己免疫疾患患者など）から得た（分離した）細胞、組織、体液、これらの培養物などからなる群より選ばれたものであり得る。
【0050】
前記抗原－抗体反応の有無を確認する工程は当業界に公知された多様な方法により行うことができる。例えば、通常の酵素反応、蛍光、発光および／または放射線検出により測定され得、具体的には、免疫クロマトグラフィー（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、酵素結合免疫吸着分析（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）、酵素免疫分析（ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）、蛍光免疫分析（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＦＩＡ）、発光免疫分析（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＬＩＡ）、ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、マイクロアレイなどからなる群より選ばれた方法によって測定されるが、これに制限されるものではない。
【0051】
他の例で、先立って説明した抗ＩＣＡＭ－１抗体の重鎖相補性決定部位、軽鎖相補性決定部位、またはこれらの組み合わせ；または重鎖可変領域、軽鎖可変領域、またはこれらの組み合わせを含むポリペプチド分子が提供される。前記ポリペプチド分子は抗体の前駆体として抗体製作に使用されることができるだけでなく、抗体と類似の構造を有するタンパク質骨格体（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄ；例えばペプチボディ）、二重特異抗体、または多重特異抗体の構成成分として含まれ得る。
【0052】
他の例は抗ＩＣＡＭ－１抗体の重鎖相補性決定部位、重鎖可変領域または重鎖をコードする核酸分子を提供する。
【0053】
他の例は抗ＩＣＡＭ－１抗体の軽鎖相補性決定部位、軽鎖可変領域または軽鎖をコードする核酸分子を提供する。
【0054】
他の例は前記抗ＩＣＡＭ－１抗体の重鎖相補性決定部位、重鎖可変領域または重鎖をコードする核酸分子および抗ＩＣＡＭ－１抗体の軽鎖相補性決定部位、軽鎖可変領域または軽鎖をコードする核酸分子を一つのベクターに共に含むかそれぞれ別のベクターに含む組換えベクターを提供する。
【0055】
用語の「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段を意味する。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクターおよびバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウィルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターを含む。前記組換えベクターとして使用できるベクターは当業界でしばしば使用されるプラスミド（例えば、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＱＫＸ１、ｐＱＫＸ２、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズおよびｐＵＣ１９など）、ファージ（例えば、λｇｔ４λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１およびＭ１３など）またはウイルス（例えば、ＳＶ４０など）を操作して製作することができる。
【0056】
前記組換えベクターで前記核酸分子はプロモータに作動的に連結され得る。用語の「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、ヌクレオチド発現調節配列（例えば、プロモータ配列）と他のヌクレオチド配列の間の機能的な結合を意味する。前記調節配列は「作動可能に連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」されることにより他のヌクレオチド配列の転写および／または解読を調節することができる。
【0057】
前記組換えベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築することができる。前記発現用ベクターは、当業界で植物、動物または微生物で外来のタンパク質を発現するのに使用される通常のものを使用することができる。前記組換えベクターは、当業界に公知化された多様な方法により構築することができる。
【0058】
前記組換えベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主として構築することができる。例えば、使用されるベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させる強力なプロモータ（例えば、ｐＬλプロモータ、ＣＭＶプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、Ｔ７プロモータなど）、解読の開始のためのリボゾーム結合部および転写／解読終結配列を含むことが一般的である。真核細胞を宿主とする場合には、ベクターに含まれる真核細胞で作動する複製起点は、ｆ１複製起点、ＳＶ４０複製起点、ｐＭＢ１複製起点、アデノ複製起点、ＡＡＶ複製起点およびＢＢＶ複製起点などを含むが、これに限定されるものではない。また、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモータ（例えば、メタロチオネインプロモータ）または哺乳動物ウィルスから由来したプロモータ（例えば、アデノウイルス後期プロモータ、ワクチニアウイルス７．５Ｋプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、サイトメガロウィルスプロモータおよびＨＳＶのｔｋプロモータ）が用いられ、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。
【0059】
他の例は前記組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。
【0060】
前記組換え細胞は前記組換えベクターを適切な宿主細胞に導入させることによって得られたものであり得る。前記宿主細胞は前記組換えベクターを安定してかつ連続的にクローニングまたは発現させる細胞として当業界に公知されたいかなる宿主細胞でも用いることができ、原核細胞としては、例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅ． ｃｏｌｉ ＲＲ１、Ｅ． ｃｏｌｉ ＬＥ３９２、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｘ １７７６、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｗ３１１０，バチルスサブティリス、バチルスチューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、そしてサルモネラチフィリウム、セラチアマルセッセンスおよび多様なシュードモナス種のような腸内菌と菌株などがあり、真核細胞に形質転換させる場合には宿主細胞として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞、例えば、Ｓｐ２／０、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ） Ｋ１、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＣＨＯ－Ｓ、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ－７、２９３、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３細胞株などが用いられるが、これに制限されるものではない。
【0061】
前記核酸分子またはそれを含む組換えベクターの宿主細胞内への運搬（導入）は、当業界に広く知られた運搬方法を用いることができる。前記運搬方法は、例えば、宿主細胞が原核細胞である場合、ＣａＣｌ２方法または電気穿孔方法などを用いることができ、宿主細胞が真核細胞である場合には、微細注入法、カルシウムホスフェート沈殿法、電気穿孔法、リポソーム－媒介形質感染法および遺伝子ボンバードメントなどを用いることができるが、これに限定されない。
【0062】
前記形質転換された宿主細胞を選別する方法は選択標識によって発現する表現型を用いて、当業界に広く知られた方法により容易に実施することができる。例えば、前記選択標識が特定抗生剤耐性遺伝子である場合には、前記抗生剤が含有された培地で形質転換体を培養することによって形質転換体を容易に選別することができる。
【0063】
他の例は前記核酸分子またはそれを含む組換えベクターを宿主細胞で発現させる工程を含む抗ＩＣＡＭ－１抗体の製造方法を提供する。前記製造方法は前記組換えベクターを含む組換え細胞を培養する工程を含み得、任意に培地から抗体を分離および／または精製する工程をさらに含み得る。
【発明の効果】
【0064】
本明細書で提供される抗ＩＣＡＭ－１抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＩＣＡＭ－１のドメイン２に結合し、抗原特異的Ｔ－細胞耐性を誘導する特性を有し、これによって、樹状細胞の分化および／または機能の調節および／または免疫細胞媒介性疾患に対する予防および／または治療に有用に使用されることができる。
【図面の簡単な説明】
【0065】
【図1】一実施例で製造したキメラ抗体ＳＩ９がＩＣＡＭ－１発現細胞株Ｄｕ１４５細胞に結合する現象をフローサイトメトリーで確認した結果である。
【図2a】一実施例で２８０ｎｍでＯＤ（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）を測定して精製された抗体を定量した結果を示すグラフである。
【図2b】一実施例で２８０ｎｍでＯＤ（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）を測定して精製された抗体を定量した結果を示すグラフである。
【図2c】一実施例で２８０ｎｍでＯＤ（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）を測定して精製された抗体を定量した結果を示すグラフである。
【図2d】一実施例で２８０ｎｍでＯＤ（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）を測定して精製された抗体を定量した結果を示すグラフである。
【図3a】一実施例により得られた抗ＩＣＡＭ－１抗体に対してｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ＨＰＬＣ（以下ＳＥ－ＨＰＬＣ）分析を実施してｐｅａｋ ｓｙｍｍｅｔｒｙ ｆａｃｔｏｒを測定した結果を示すグラフである。
【図3b】一実施例により得られた抗ＩＣＡＭ－１抗体に対してｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ＨＰＬＣ（以下ＳＥ－ＨＰＬＣ）分析を実施してｐｅａｋ ｓｙｍｍｅｔｒｙ ｆａｃｔｏｒを測定した結果を示すグラフである。
【図3c】一実施例により得られた抗ＩＣＡＭ－１抗体に対してｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ＨＰＬＣ（以下ＳＥ－ＨＰＬＣ）分析を実施してｐｅａｋ ｓｙｍｍｅｔｒｙ ｆａｃｔｏｒを測定した結果を示すグラフである。
【図3d】一実施例により得られた抗ＩＣＡＭ－１抗体に対してｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ＨＰＬＣ（以下ＳＥ－ＨＰＬＣ）分析を実施してｐｅａｋ ｓｙｍｍｅｔｒｙ ｆａｃｔｏｒを測定した結果を示すグラフである。
【図4a】一実施例により得られた抗ＩＣＡＭ－１抗体を６１℃で１時間の間放置してＡＮＳ試薬による蛍光変化を測定した結果を示すグラフである。
【図4b】一実施例により得られた抗ＩＣＡＭ－１抗体を６１℃で１時間の間放置してＡＮＳ試薬による蛍光変化を測定した結果を示すグラフである。
【図4c】一実施例により得られた抗ＩＣＡＭ－１抗体を６１℃で１時間の間放置してＡＮＳ試薬による蛍光変化を測定した結果を示すグラフである。
【図4d】一実施例により得られた抗ＩＣＡＭ－１抗体を６１℃で１時間の間放置してＡＮＳ試薬による蛍光変化を測定した結果を示すグラフである。
【図5】一実施例により得られた抗ＩＣＡＭ－１抗体を６７℃で１時間放置してＡＮＳ反応性を測定した結果を示すグラフである。
【図6】一実施例により得られた抗ＩＣＡＭ－１抗体のＩＣＡＭ－１抗原に対する結合力をＥＬＩＳＡ試験により比較したグラフである（ｙ軸：４５０ｎｍＯＤ値；ｘ軸：抗体濃度（ｎｇ／ｍｌ））。
【図7a】一実施例により得られた抗ＩＣＡＭ－１抗体のｍｅｌｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔを示すグラフである（７ａ：キメラ抗体、７ｂ：Ｈ１７Ｌ１、７ｃ：Ｈ１７Ｌ４）。
【図7b】一実施例により得られた抗ＩＣＡＭ－１抗体のｍｅｌｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔを示すグラフである（７ａ：キメラ抗体、７ｂ：Ｈ１７Ｌ１、７ｃ：Ｈ１７Ｌ４）。
【図7c】一実施例により得られた抗ＩＣＡＭ－１抗体のｍｅｌｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔを示すグラフである（７ａ：キメラ抗体、７ｂ：Ｈ１７Ｌ１、７ｃ：Ｈ１７Ｌ４）。
【図8】一実施例により得られた抗ＩＣＡＭ－１抗体の結合定数（Ｋｏｎ）と解離定数（Ｋｏｆｆ）を測定して親和度（ＫＤ）を示すグラフである。
【図9】多様な末梢血液条件で一実施例により得られたヒト化抗体投与による遺伝子発現プロファイルに対する変化を示すｈｅａｔ ｍａｐグラフである。
【図10】多様な末梢血液条件で一実施例により得られたヒト化抗体ＤＮＰ００７投与による遺伝子発現プロファイルに対する変化をＫＥＧＧ ｐａｔｈｗａｙについて分析して示すグラフである（－１０ｌｏｇ（ａｄｊｕｓｔｅｄ ｐ－ｖａｌｕｅ））。
【図11】多様な末梢血液条件で一実施例により得られたヒト化抗体ＤＮＰ００７投与による遺伝子発現プロファイルに対する変化をＧＯ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓについて分析して示すグラフである（－１０ｌｏｇ（ａｄｊｕｓｔｅｄ ｐ－ｖａｌｕｅ））。
【図12a】多様な末梢血液条件で一実施例により得られたヒト化抗体ＤＮＰ００７投与による遺伝子発現プロファイルに対する変化をサイトカイン遺伝子に対する増加、減少を分析して示すグラフである。
【図12b】多様な末梢血液条件で一実施例により得られたヒト化抗体ＤＮＰ００７投与による遺伝子発現プロファイルに対する変化をサイトカイン遺伝子に対する増加、減少を分析して示すグラフである。
【図13】多様な末梢血液条件で一実施例により得られたヒト化抗体ＤＮＰ００７投与によるサイトカインの変化をタンパク質レベルで変化した増加、減少を分析して示すグラフである。
【図14】樹状細胞と自身のＴ細胞共培養条件で一実施例により得られたヒト化抗体ＤＮＰ００７投与によるサイトカインの変化をタンパク質レベルで変化した増加、減少を分析して示すグラフである。
【図15】一実施例により得られたヒト化抗体ＤＮＰ００７処理された樹状細胞の成熟補助因子の発現程度を示すグラフである。
【図16】一実施例により得られたヒト化抗体ＤＮＰ００７処理された樹状細胞の炎症性サイトカイン分泌程度を示すグラフである。
【図17】一実施例により得られたヒト化抗体ＤＮＰ００７処理された樹状細胞の細胞自滅程度を示すグラフである。
【図18a】一実施例により得られたヒト化抗体ＤＮＰ００７処理された樹状細胞表面因子の発現程度を示すグラフとして、免疫寛容樹状細胞誘導の有無を示す。
【図18b】一実施例により得られたヒト化抗体ＤＮＰ００７処理された樹状細胞表面因子の発現程度を示すグラフとして、免疫寛容樹状細胞誘導の有無を示す。
【図19a】一実施例により得られたヒト化抗体ＤＮＰ００７処理された樹状細胞のＩＤＯ（Ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３－Ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）発現程度を示すグラフとして、Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｐａｔｈｗａｙ結果を示す。
【図19b】一実施例により得られたヒト化抗体ＤＮＰ００７処理された樹状細胞のＩＤＯ（Ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３－Ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）発現程度を示すグラフとして、Ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｐａｔｈｗａｙ結果を示す。
【図20】一実施例により得られたヒト化抗体ＤＮＰ００７処理された樹状細胞とともに培養されたＴ細胞の増殖程度および炎症性サイトカインであるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ｒ）の生成程度を示すグラフである。
【図21】一実施例により得られたヒト化抗体ＤＮＰ００７処理された樹状細胞とともに培養されたＴ細胞の炎症性サイトカインであるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ｒ）の生成程度およびＴ細胞増殖程度を多様な樹状細胞成熟経路（ＬＰＳ刺激、ＴＮＦ－ａ刺激、およびＣＤ４０Ｌ刺激）によって示すグラフである。
【図22a】一実施例により得られたヒト化抗体ＤＮＰ００７のリウマチ関節炎治療効果をリウマチ関節炎動物モデルで確認した結果として、抗体投与前後の関節炎点数を示す。
【図22b】一実施例により得られたヒト化抗体ＤＮＰ００７のリウマチ関節炎治療効果をリウマチ関節炎動物モデルで確認した結果として、抗体投与前後の関節炎点数を示す。
【図22c】一実施例により得られたヒト化抗体ＤＮＰ００７のリウマチ関節炎治療効果をリウマチ関節炎動物モデルで確認した結果として、抗－コラーゲン抗体水準（２２ｃ）をそれぞれ示す。
【図23a】一実施例により得られたヒト化抗体ＤＮＰ００７の移植片対宿主疾患抑制効果を移植片対宿主疾患動物モデルで確認した結果として、生存率を示す。
【図23b】一実施例により得られたヒト化抗体ＤＮＰ００７の移植片対宿主疾患抑制効果を移植片対宿主疾患動物モデルで確認した結果として、Ｔ細胞再構成程度を示す。
【発明を実施するための形態】
【0066】
以下では実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これは例示的なものに過ぎず、本発明の範囲を制限ためのものではない。
【実施例】
【0067】
＜実施例１＞マウス抗ＩＣＡＭ－１単クローン抗体の製作
ＩＣＡＭ－１に特異的な抗体を開発するために次のような実験を行った。
ＩＣＡＭ－１に特異的な抗体を開発するために次のような実験を行った。
【0068】
１－１：マウス免疫
組換えヒトＩＣＡＭ－１タンパク質（０．５ｍｇ／ｍｌ；ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＰ＿０００１９２．２）を同一体積のａｄｊｕｖａｎｔ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，＃ｖａｃ－ａｄｘ－１０）と混合して免疫物質を製造した。６週齢Ｂａｌｂ／ｃ雌マウス腹腔（ＩＰ；ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｃａｖｉｔｙ）に前記製造された免疫物質２００ｕＬを３週間隔で３回注入した。
組換えヒトＩＣＡＭ－１タンパク質（０．５ｍｇ／ｍｌ；ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＰ＿０００１９２．２）を同一体積のａｄｊｕｖａｎｔ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，＃ｖａｃ－ａｄｘ－１０）と混合して免疫物質を製造した。６週齢Ｂａｌｂ／ｃ雌マウス腹腔（ＩＰ；ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｃａｖｉｔｙ）に前記製造された免疫物質２００ｕＬを３週間隔で３回注入した。
【0069】
１－２：マウス抗ＩＣＡＭ－１単クローン抗体の製造
前記のように免疫化されたマウスの脾臓を切除して単一細胞浮遊液を収得してＲＰＭＩ（ＧＩＢＣＯ，＃２１８７５０３４）で２回洗浄した後、０．４％（ｗ／ｖ） ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ（ｓｉｇｍａ）を１：１（ｖ／ｖ）で混ぜた後トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ，＃Ｔ８１５４）染色法で細胞数を計数した。Ｘ６３ ｍｏｕｓｅ ｍｙｅｌｏｍａ細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８０）を洗浄して計数して細胞融合ｐａｒｔｎｅｒとして使用した。
前記のように免疫化されたマウスの脾臓を切除して単一細胞浮遊液を収得してＲＰＭＩ（ＧＩＢＣＯ，＃２１８７５０３４）で２回洗浄した後、０．４％（ｗ／ｖ） ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ（ｓｉｇｍａ）を１：１（ｖ／ｖ）で混ぜた後トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ，＃Ｔ８１５４）染色法で細胞数を計数した。Ｘ６３ ｍｏｕｓｅ ｍｙｅｌｏｍａ細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８０）を洗浄して計数して細胞融合ｐａｒｔｎｅｒとして使用した。
【0070】
前記骨髄（ｍｙｅｌｏｍａ）細胞と脾臓細胞は１：５の割合で混合して遠心分離後、上澄液を除去した。あらかじめ３７℃に予熱した５０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）１５００ １ｍｌを１分にわたって徐々に添加した。約１分程度停滞させてからＲＰＭＩ培地を徐々に追加して段階的に希釈した。遠心分離した後、１ｘＨＡＴ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ，ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ，ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）が含まれたＲＰＭＩ（２０％ ＦＢＳ，ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ－ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ－ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ；Ｇｉｂｃｏ）に浮游させ、９６－ウェルプレートに１５０ｕＬ／ウェルで分注した後３７℃、５％ＣＯ２培養器で培養した。前記融合後、一定期間ＨＡＴ ｆｅｅｄｉｎｇを行い、群落を形成したウェルが観察されるとＨＴ培地（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ，ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）１５０ｕＬを添加して３７℃、５％ＣＯ２培養器で４８時間培養した。
【0071】
ハイブリドーマ培養９６－ウェルプレートで培養液１００ｕＬを取ってＩＣＡＭ－１反応性の有無を確認した。ＩＣＡＭ－１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ，＃ＡＤＰ４－０５０）を１．０ｕｇ（ｍｉｃｒｏｇｒａｍ）／ｍｌ濃度でＰＢＳに希釈した後、１００ｕＬ／ウェルでＮｕｎｃ－ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ，＃４３９４５４）に分注して３７℃培養器に１時間保管してコートした。コート液を完全に除去した後、１Ｘ ｃａｓｅｉｎ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ，＃Ｂ６４２９）を２００ｕＬ／ウェルで分注して３７℃培養器に１時間保管してブロッキングした。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを完全に除去した後、ハイブリドーマ培養液を１００ｕＬ／ウェルで分注して３７℃培養器に１時間保管して抗原／抗体反応を誘導した。培養液を完全に除去した後、洗浄液（０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ２０ ｉｎ ＰＢＳ）で３回洗浄して２次抗体Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ，＃）をｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎに１：１０，０００（ｖ／ｖ）割合で希釈して１００ｕＬ／ウェルで分注して３７℃培養器に３０分保管して２次抗体反応を誘導した。３回洗浄してＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ，＃）を８０ｕＬ／ウェルで分注して発色を誘導した後、１．０Ｎ硫酸（Ｈ２ＳＯ４）を添加して反応を終結した。前記得られた抗－ＩＣＡＭ－１抗体が細胞表面に発現したＩＣＡＭ－１を認知することを確認するために、フローサイトメトリーを追加的に実施した。ＩＣＡＭ－１を発現する前立腺癌細胞株Ｄｕ１４５（ＡＴＣＣ，＃ＨＴＢ－８１）１Ｘ１０６ ｃｅｌｌに培養液１００ｕＬを添加して、常温で１５分間放置して抗体結合を誘導した。ＰＢＳを添加して洗浄して、２次抗体Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ，＃）を１：１００（ｖ／ｖ）割合でＰＢＳに希釈して、１００ｕｌ添加した後常温で１０分反応した。洗浄を実施して未反応２次抗体を除去した後、フローサイトメトリーで反応性を確認した。
【0072】
前記記述した試験方法のようにＩＣＡＭ－１抗原に結合する陽性抗体を一次的に選別し、Ｄｕ１４５細胞株に蛍光染色が可能な単クローン抗体を追加的に選別した。このように選別した単クローン抗体（ＳＩ９と命名）はＩＣＡＭ－１タンパク質抗原に高い反応性を示し、Ｄｕ１４５細胞株表面にも効果的に結合する特性を示した。
【0073】
＜実施例２＞キメラ抗－ＩＣＡＭ－１単クローン抗体の製作
２－１．抗－ＩＣＡＭ－１抗体遺伝子配列クローニング
実施例１で選別したマウス単クローン抗体ＳＩ９の遺伝子をＭｏｕｓｅ Ｉｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ．＃：６９８３１）を用いてクローニングした。実施例１で開発した単クローン抗体ＳＩ９生産ハイブリドーマを培養し、融合細胞株からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔを使用して抽出したＲＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、これをｐＧｅｍ－Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．＃：Ａ３６００）に挿入した後、シーケンシングによりＤＮＡ塩基配列を確認し、ＩＭＧＴ ｓｉｔｅ（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）を介してマウス抗体遺伝子を確認した。分析したＳＩ９抗体の重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列およびコーディング核酸配列を表１に整理した：
２－１．抗－ＩＣＡＭ－１抗体遺伝子配列クローニング
実施例１で選別したマウス単クローン抗体ＳＩ９の遺伝子をＭｏｕｓｅ Ｉｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ．＃：６９８３１）を用いてクローニングした。実施例１で開発した単クローン抗体ＳＩ９生産ハイブリドーマを培養し、融合細胞株からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔを使用して抽出したＲＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、これをｐＧｅｍ－Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．＃：Ａ３６００）に挿入した後、シーケンシングによりＤＮＡ塩基配列を確認し、ＩＭＧＴ ｓｉｔｅ（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）を介してマウス抗体遺伝子を確認した。分析したＳＩ９抗体の重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列およびコーディング核酸配列を表１に整理した：
【0074】
【表1】
【0075】
２－２．キメラ抗体の製造
前記製作された抗－ＩＣＡＭ－１マウス抗体ＳＩ９のアミノ酸配列に基づいて抗－ＩＣＡＭ－１キメラ抗体を製作した。
前記製作された抗－ＩＣＡＭ－１マウス抗体ＳＩ９のアミノ酸配列に基づいて抗－ＩＣＡＭ－１キメラ抗体を製作した。
【0076】
２－２－１．プラスミドの製作
抗－ＩＣＡＭ－１キメラ抗体の発現のために、重鎖発現用プラスミドと軽鎖発現用プラスミドをそれぞれ製作した。軽鎖発現用プラスミドはｐＯｐｔｉＶＥＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）ベクターを使用し、重鎖発現用プラスミドはｐｃＤＮＡ３．３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）ベクターを使用して製作した。
抗－ＩＣＡＭ－１キメラ抗体の発現のために、重鎖発現用プラスミドと軽鎖発現用プラスミドをそれぞれ製作した。軽鎖発現用プラスミドはｐＯｐｔｉＶＥＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）ベクターを使用し、重鎖発現用プラスミドはｐｃＤＮＡ３．３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）ベクターを使用して製作した。
【0077】
追加的なアミノ酸を挿入せず、抗体それぞれの可変領域コーディングｃＤＮＡと不変領域コーディングｃＤＮＡを連続的なアミノ酸配列として発現するようにするために、前記クローニングした可変領域のコーディング核酸配列（表１を参照）と知られているｈｕｍａｎ ＩｇＧ４不変領域（重鎖；ＧｅｎＢａｎｋ＿ＡＩＣ５９０４０．１）のコーディング核酸配列またはｋａｐｐａ不変領域（軽鎖；ＧｅｎＢａｎｋ＿ ＡＡＡ５８９８９．１）のコーディング核酸配列を連結した遺伝子それぞれを合成（Ｂｉｏｎｅｅｒ社）した。軽鎖不変領域のｍｉｄｄｌｅ ｈｉｎｇｅ部位の「ＣＰＳＣＰ」配列をＩｇＧ１ ｉｓｏｔｙｐｅのように「ＣＰＰＣＰ」に追加変形してａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇを防止できるようにした。このように合成した重鎖および軽鎖発現遺伝子は制限酵素Ｘｈｏ ＩとＳａｌ Ｉで切断した後、軽鎖発現遺伝子はｐＯｐｔｉＶｅｃベクターに、重鎖発現遺伝子はｐｃＤＮＡ３．３ベクターにそれぞれｌｉｇａｔｉｏｎし、完全な抗体発現用プラスミドを製作した（ｐｃＤＮＡ３．３－ａｎｔｉ－ＩＣＡＭ－１重鎖発現プラスミドおよびｐＯｐｔｉＶＥＣ－ａｎｔｉ－ＩＣＡＭ－１軽鎖発現プラスミド）。
【0078】
２－２－２．形質転換
前記製作されたｐｃＤＮＡ３．３－ａｎｔｉ－ＩＣＡＭ－１重鎖発現プラスミドとｐＯｐｔｉＶＥＣ－ａｎｔｉ－ＩＣＡＭ－１軽鎖発現プラスミドをＣＨＯ細胞由来であるＤＧ４４細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎさせて形質転換過程を行った。
前記製作されたｐｃＤＮＡ３．３－ａｎｔｉ－ＩＣＡＭ－１重鎖発現プラスミドとｐＯｐｔｉＶＥＣ－ａｎｔｉ－ＩＣＡＭ－１軽鎖発現プラスミドをＣＨＯ細胞由来であるＤＧ４４細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎさせて形質転換過程を行った。
【0079】
まずｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ３日前に浮游状態のＤＧ４４細胞を５％ＦＢＳが含まれたＭＥＭａ培地に培養して付着状態細胞に誘導した。形質転換はＶｉａＦｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．＃：Ｅ４９８１）を使用して６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで行った。形質転換一日前、１Ｘ１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で継代培養して付着状態に適応したＤＧ４４細胞を準備し、形質転換に使用されたＤＮＡの量はｐｃＤＮＡ３．３－ａｎｔｉ－ＩＣＡＭ－１重鎖発現プラスミドとｐＯｐｔｉＶＥＣ－ａｎｔｉ－ＩＣＡＭ－１軽鎖発現プラスミドそれぞれ１．０μｇ、および２．０μｇずつ１：２比率の組み合わせで使用した。形質転換は４８時間の間行った。フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて形質転換細胞群を分析してその結果を図１に示した。図１に示すように、マウスＳＩ９抗体の可変領域コーディング遺伝子をヒト抗体の不変領域コーディング遺伝子に挿入して得られたキメラ抗体のＩＣＡＭ－１発現細胞株結合現象を確認することができる。
【0080】
＜実施例３＞ヒト化抗－ＩＣＡＭ－１抗体の製作
３．１．Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎによる組換え抗体配列の選定
キメラＩＣＡＭ－１抗体（ＳＩ９）の重鎖、軽鎖それぞれのＣＤＲ部位のアミノ酸配列（ＣＤＲＨ１：ＧＹＴＦＴＤＹＡ（配列番号：１）、ＣＤＲＨ２：ＩＳＴＹＳＧＮＴ（配列番号：２）、ＣＤＲＨ３：ＡＲＳＬＹＦＧＳＳＧＦＤＹ（配列番号：３）、ＣＤＲＬ１：ＱＴＬＶＹＲＮＧＮＴＹ（配列番号：４）、ＣＤＲＬ２：ＫＶＳ（配列番号：５）、ＣＤＲＬ３：ＳＱＮＴＨＦＰＹＴ（配列番号：６））を維持しながらヒト抗体遺伝子をコーディングしているｇｅｒｍｌｉｎｅ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎを組換えたヒト化抗体配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法で選別した。
３．１．Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎによる組換え抗体配列の選定
キメラＩＣＡＭ－１抗体（ＳＩ９）の重鎖、軽鎖それぞれのＣＤＲ部位のアミノ酸配列（ＣＤＲＨ１：ＧＹＴＦＴＤＹＡ（配列番号：１）、ＣＤＲＨ２：ＩＳＴＹＳＧＮＴ（配列番号：２）、ＣＤＲＨ３：ＡＲＳＬＹＦＧＳＳＧＦＤＹ（配列番号：３）、ＣＤＲＬ１：ＱＴＬＶＹＲＮＧＮＴＹ（配列番号：４）、ＣＤＲＬ２：ＫＶＳ（配列番号：５）、ＣＤＲＬ３：ＳＱＮＴＨＦＰＹＴ（配列番号：６））を維持しながらヒト抗体遺伝子をコーディングしているｇｅｒｍｌｉｎｅ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎを組換えたヒト化抗体配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法で選別した。
【0081】
その結果、ヒト化ＤＮＰ００７抗体配列として、重鎖可変領域２４種、軽鎖可変領域４種をそれぞれ選別した。前記選別したヒト化抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域、ＣＤＲ、およびフレームワークのアミノ酸配列を下記表２、３、４および５に示した。下記表２および表３で太い下線を引いて表示した部分はＣＤＲのアミノ酸配列（順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）である。
【0082】
【表2】
【0083】
【表3】
【0084】
【表4】
【0085】
【表5】
【0086】
３．２．ヒト化組換え抗体の発現および分析
選別した抗体配列はそれぞれのヒトＩｇＧ４重鎖不変領域とｋａｐｐａ軽鎖不変領域と連結してヒトＩｇＧ４形態にＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）で発現させた。
選別した抗体配列はそれぞれのヒトＩｇＧ４重鎖不変領域とｋａｐｐａ軽鎖不変領域と連結してヒトＩｇＧ４形態にＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）で発現させた。
【0087】
【表6】
【0088】
Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ７日後に、ＫａｎＣａｐ Ａ ｒｅｓｉｎ（Ｋａｎｅｃａ社）を用いて培養液からヒト化組換え抗体を精製した。
【0089】
２８０ｎｍでのＯＤ（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）を測定して精製された抗体を定量してその結果を図２ａ～２ｄに示した。図２ａ～２ｄに示すように、組み合わせられる重鎖および軽鎖の種類とは関係なく、製造された多くの抗体が比較的高い生産性を示した。
【0090】
精製された抗体の純度分析のために、Ｓｅｐａｘ Ｚｅｎｉｘ－Ｃ ＳＥＣ－３００ ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ（Ｓｅｐａｘ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ＨＰＬＣ（以下ＳＥ－ＨＰＬＣ）分析を実施してｐｅａｋ ｓｙｍｍｅｔｒｙ ｆａｃｔｏｒを測定した。前記得られた結果を図３ａ～３ｄに示した。高純度抗体をＳＥ－ＨＰＬＣで分析すると一つのｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｐｅａｋで観察されるが、高分子／低分子などの異種体が含まれた場合、２個以上のｐｅａｋが観察されるかｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｐｅａｋ ｆａｃｔｏｒが低く観察される。図３ａ～３ｄに示すように、多くの場合、抗ＩＣＡＭ－１ヒト化抗体は相対的に高いｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｐｅａｋ ｆａｃｔｏｒを示した。
【0091】
３－３．物理化学的／生物学的特性によるヒト化抗体の選別
３－３－１．高安定性ヒト化抗体の選別
３－３－１－１．高安定性ヒト化抗体の１次選別
安定性が高い抗体を優先的に選別するために、高温の苛酷条件に抗体を放置して、物理的な性質変化を観察して、熱変性に抵抗性を示すヒト化抗体を選別した。
３－３－１．高安定性ヒト化抗体の選別
３－３－１－１．高安定性ヒト化抗体の１次選別
安定性が高い抗体を優先的に選別するために、高温の苛酷条件に抗体を放置して、物理的な性質変化を観察して、熱変性に抵抗性を示すヒト化抗体を選別した。
【0092】
熱変性測定は８－ａｎｉｌｉｎｏ－１－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（以下ＡＮＳ；Ｓｉｇｍａ社）を用いた結合実験によって確認した。ＡＮＳはタンパク質変性時露出する疎水性部位に結合して４７０ｎｍ波長の光を放出するのでタンパク質変性有無を確認できる化合物である。
【0093】
実施例２－１で準備したヒト化組換え抗体９６種をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）を用いて０．２ｍｇ／ｍｌ濃度で一定に希釈し、高温（６１℃）に適当時間（１時間）放置した。抗体試料２００ｕＬに０．２ｍｇ／ｍｌ ＡＮＳ溶液２０ｕＬを入れて混合して１５分反応した後、３６０ｎｍ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ、４６０ｎｍ ｅｍｉｓｓｉｏｎ条件で分析した。ＡＮＳ反応によって放出された４６０ｎｍ波長をｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ，ＳｙｎｅｒｇｙＨＴ）で測定して、Ｈ１Ｌ１抗体（１００％）を基準として相対評価して図４ａ～４ｄに示した。重鎖ＶＨ７およびＶＨ２２の場合、組み合わせられる軽鎖とは関係なくＡＮＳによる４７０ｎｍ蛍光放出が急激に増加することが示され、熱によって多少変性されることが確認されたが、その他抗体は比較的熱について安定性を示した。
【0094】
３－３－１－２．高安定性ヒト化抗体の２次選別
図２ａ－２ｄ、３ａ－３ｄ、および４ａ－４ｄで比較的高い抗体生産性、比較的高いｐｅａｋ ｓｙｍｍｅｔｒｙ ｆａｃｔｏｒおよび／または高温（６１℃）条件での比較的高い熱安全性を示す合計４７種のヒト化抗体を一次的に選定した（図５参照）。
図２ａ－２ｄ、３ａ－３ｄ、および４ａ－４ｄで比較的高い抗体生産性、比較的高いｐｅａｋ ｓｙｍｍｅｔｒｙ ｆａｃｔｏｒおよび／または高温（６１℃）条件での比較的高い熱安全性を示す合計４７種のヒト化抗体を一次的に選定した（図５参照）。
【0095】
より厳格な安定性評価のために、前記４７種のヒト化抗体を０．２ｍｇ／ｍｌ濃度で一定に希釈した後、６７℃高温で１時間放置してＡＮＳ反応性を測定し、Ｈ１Ｌ１抗体を基準として相対的な反応性を図５に示した。６１℃条件でのＡＮＳ反応性（４ａ～４ｄ）と比較し、６７℃でのＡＮＳ反応性が多少高まる傾向が示されたが、Ｈ１７Ｌ１、Ｈ４Ｌ３、Ｈ５Ｌ３、Ｈ１１Ｌ３、Ｈ１７Ｌ３、およびＨ１７Ｌ４の組み合わせの６種ヒト化抗体（表７を参照）は相対的に低いＡＮＳ反応性を示し、熱変性について高い抵抗性を有する抗体と評価された。
【0096】
【表7】
【0097】
３－３－２．抗原結合分析
安定性試験評価で表７のように先導抗体６種のヒト化抗体を選定し、Ｈ１１Ｌ３除いた抗体５種の結合力を親抗体（キメラ抗体；実施例１．３参照）と比較評価した。
安定性試験評価で表７のように先導抗体６種のヒト化抗体を選定し、Ｈ１１Ｌ３除いた抗体５種の結合力を親抗体（キメラ抗体；実施例１．３参照）と比較評価した。
【0098】
抗原ＩＣＡＭ－１（ＩＣＡＭ－１；Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ社）を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにウェル当たり１００ｎｇずつコートした後、ｂｌｏｃｋｉｎｇした。一次抗体量は８０ｎｇ／ｍｌから２倍ずつ系列希釈して、３７℃温度で１時間結合させ、二次抗体としてｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ｉｇ－ＨＲＰ接合体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を１：１００００で希釈して、３７℃温度で３０分間結合させた。各工程の間は３回ずつ水洗過程を経てＴＭＢ（３，３’，５，５’－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）反応した。１Ｎ Ｈ２ＳＯ４溶液でＴＭＢ溶液と同量（１００ｕｌ）処理して反応中止した後、４５０ｎｍでＯＤ値を測定した。
【0099】
前記のように得られた親抗体および５種のヒト化組換え抗体のＩＣＡＭ－１抗原に対する結合力を図６および表８に示した。
【0100】
【表8】
【0101】
評価したヒト化抗体５種すべては概してキメラ親抗体より高い反応性を示し、その中でＨ１７Ｌ４組み合わせの抗体が最も高い反応性を示した。
【0102】
３－３－３．Ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ分析
特に安定した物理的特性を示すヒト化抗体Ｈ１７Ｌ１とＨ１７Ｌ４のｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅを親抗体（キメラ抗体；実施例１．３参照）と比較して安定性を評価した。
特に安定した物理的特性を示すヒト化抗体Ｈ１７Ｌ１とＨ１７Ｌ４のｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅを親抗体（キメラ抗体；実施例１．３参照）と比較して安定性を評価した。
【0103】
抗体試料にＰｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ ｄｙｅ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，＃４４６６０３８）を添加して反応試料を製造し、２５℃から９５℃まで連続して温度をあげて抗体試料の変性を誘導した。抗体変性は反応液に５８０ｎｍ波長を照射してｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ ｄｙｅから放出する６２３ｎｍ波長を測定して確認し、ＶｉｉＡ（商標） ７ ｓｏｆｔｗａｒｅでｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅを分析した。前記得られた結果を下記の表９および図７ａ（キメラ親抗体）、７ｂ（Ｈ１７Ｌ１）および７ｃ（Ｈ１７Ｌ４）に示した：
【0104】
【表9】
【0105】
表９および図７ａ～７ｃに示すように、それぞれの抗体試料で２個のｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅが確認された。Ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ １はキメラ親抗体を含む３種の抗体すべてが６７℃程度で類似に測定されたが、ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ２はキメラ親抗体と比較して２種のヒト化抗体で１０℃以上さらに高く測定された。これはヒト化抗体２種がキメラ親抗体に比べて熱変性に強い抵抗性があることを意味する。
【0106】
３－３－４．Ａｆｆｉｎｉｔｙ測定
Ｈ１７Ｌ１およびＨ１７Ｌ４ヒト化抗体の抗原に対する親和度を親抗体と比較するためにＯｃｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用した。Ａｍｉｎｅ ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂｉｏ－ｓｅｎｓｏｒ ＡＲ２Ｇ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に抗体３種をそれぞれ付着して五つの濃度のＩＣＡＭ－１抗原溶液を添加して抗原／抗体反応が発生するように誘導した。前記抗原／抗体反応結果を用いて結合定数（Ｋｏｎ）と解離定数（Ｋｏｆｆ）を測定して親和度（ＫＤ）を計算してその結果を表１０および図８に示した：
Ｈ１７Ｌ１およびＨ１７Ｌ４ヒト化抗体の抗原に対する親和度を親抗体と比較するためにＯｃｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用した。Ａｍｉｎｅ ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂｉｏ－ｓｅｎｓｏｒ ＡＲ２Ｇ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に抗体３種をそれぞれ付着して五つの濃度のＩＣＡＭ－１抗原溶液を添加して抗原／抗体反応が発生するように誘導した。前記抗原／抗体反応結果を用いて結合定数（Ｋｏｎ）と解離定数（Ｋｏｆｆ）を測定して親和度（ＫＤ）を計算してその結果を表１０および図８に示した：
【0107】
【表10】
【0108】
表１０および図８に示すように、キメラ親抗体の親和度（ＫＤ）は１．０３Ｘ１０－８Ｍと測定され、Ｈ１７Ｌ１、Ｈ１７Ｌ４ヒト化抗体はそれぞれ３．４３Ｘ１０－９および３．６２ｘ１０－９Ｍと測定され、ヒト化抗体で改善された親和度を確認することができた。
【0109】
＜実施例４＞末梢血液での免疫調節効能試験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
４－１．末梢血液単核球分離およびＩＦＮｇ変化測定
本明細書で提供された抗体の免疫調節効能を確認するために、末梢血液単核球に前記実施例３で製造されたＤＮＰ００７抗体（Ｈ１７Ｌ４抗体）を処理して代表的な前炎症性（ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインＩＦＮ－ｇａｍｍａ分泌量を測定した。
４－１．末梢血液単核球分離およびＩＦＮｇ変化測定
本明細書で提供された抗体の免疫調節効能を確認するために、末梢血液単核球に前記実施例３で製造されたＤＮＰ００７抗体（Ｈ１７Ｌ４抗体）を処理して代表的な前炎症性（ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインＩＦＮ－ｇａｍｍａ分泌量を測定した。
【0110】
正常支援者から採血を実施して、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，＃１７１４４００２）で末梢血液単核球を分離した。１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地に分離した末梢血液単核球を懸濁して、ＧＭ－ＣＳＦ（Ｃｒｅａｇｅｎｅ）とＩＬ－４（Ｃｒｅａｇｅｎｅ）をそれぞれ１００ｎｇ／ｍｌ濃度で添加して、ｍｏｎｏｃｙｔｅから樹状細胞が分化できるようにした。ＤＮＰ００７抗体は１０．０ｕｇ／ｍｌ濃度で末梢血液単核球に共に添加した。
【0111】
樹状細胞前駆細胞であるｍｏｎｏｃｙｔｅに及ぼすＤＮＰ００７抗体効能を確認するために、分離した末梢血液単核球を培養皿で２時間培養して培養皿に付着を誘導した後、付着細胞と浮游細胞に分けてそれぞれＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４を１００ｎｇ／ｍｌ濃度でそれぞれ添加し、ＤＮＰ００７抗体（１０．０ｕｇ／ｍｌ）を共に添加した。
【0112】
培養６日目に末梢血液単核球、付着細胞および浮游細胞をそれぞれ洗浄してＬｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ＬＰＳ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，＃Ｌ２６３０）を５．０ｕｇ／ｍｌで添加して培養した。翌日培養液を取ってＨｕｍａｎ ＩＦＮ ｇａｍｍａ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃８８－７３１６－７７）で分泌されたＩＦＮ－ｇａｍｍａ濃度を測定した。
【0113】
末梢血液単核球、付着細胞および浮游細胞のすべての条件でＤＮＰ００７抗体を処理した試料群ではＩＮＦ－ｇａｍｍａ分泌量が顕著に減少した（表１１）。このような結果はＬＰＳによる免疫細胞活性化メカニズムをＤＮＰ００７抗体が抑制して現れる現象であると理解された。
【0114】
【表11】
【0115】
４－２．ＤＮＰ００７抗体の末梢血液単核球に対する影響分析－遺伝子発現プロファイル分析（ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによるＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ分析）
ＤＮＰ００７の免疫反応調節が単に樹状細胞によるものであるか、樹状細胞とＴ細胞をはじめとする免疫細胞の接触によるものであるかを調べるために、下記のようにヒト末梢血液単核細胞を分離後、５種類の末梢血液集団に分けて１００ｎｇ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦおよび１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－４を添加し、１０ｕｇ／ｍｌのＤＮＰ００７抗体添加有無の条件下で６日間培養して細胞を収得し、成熟した樹状細胞への誘導のために培養６日目に前記細胞を洗浄して５ｕｇ／ｍｌ ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で一日の間処理して、各集団別の細胞を収得して。ｔｏｔａｌ ＲＮＡを分離して遺伝子発現プロファイルを分析した。
ＤＮＰ００７の免疫反応調節が単に樹状細胞によるものであるか、樹状細胞とＴ細胞をはじめとする免疫細胞の接触によるものであるかを調べるために、下記のようにヒト末梢血液単核細胞を分離後、５種類の末梢血液集団に分けて１００ｎｇ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦおよび１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－４を添加し、１０ｕｇ／ｍｌのＤＮＰ００７抗体添加有無の条件下で６日間培養して細胞を収得し、成熟した樹状細胞への誘導のために培養６日目に前記細胞を洗浄して５ｕｇ／ｍｌ ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で一日の間処理して、各集団別の細胞を収得して。ｔｏｔａｌ ＲＮＡを分離して遺伝子発現プロファイルを分析した。
【0116】
（１）Ｗｈｏｌｅ ＰＢＭＣ：ヒト末梢血液単核細胞は健康な支援者の血液をＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で濃度こう配遠心分離を行って分離した。
（２）ＣＤ１４＋ｍｏｎｏｃｙｔｅ由来の樹状細胞：健康な支援者の血液をＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で濃度こう配遠心分離を行って分離したヒト末梢血液単核細胞からＣＤ１４＋単核球を磁気分離法（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ利用）を用いて分離した。
（３）ＣＤ１４ ｄｅｐｌｅｔｅ ＰＢＭＣ：（２）のＣＤ１４＋単核球を磁気分離法（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ利用）で分離して残った末梢血液集団を使用した。
（４）Ａｔｔａｃｈｅｄ ＰＢＭＣ：健康な支援者の血液をＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で濃度こう配遠心分離を行って、分離したヒト末梢血液単核細胞を１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ培地に２時間の間３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで細胞を付着させた後、上層液（浮游細胞を含む）を掬い取り、付着した細胞のみ分離した。
（５）（４）の実験で掬い取った上層の浮游細胞を使用した。
（２）ＣＤ１４＋ｍｏｎｏｃｙｔｅ由来の樹状細胞：健康な支援者の血液をＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で濃度こう配遠心分離を行って分離したヒト末梢血液単核細胞からＣＤ１４＋単核球を磁気分離法（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ利用）を用いて分離した。
（３）ＣＤ１４ ｄｅｐｌｅｔｅ ＰＢＭＣ：（２）のＣＤ１４＋単核球を磁気分離法（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ利用）で分離して残った末梢血液集団を使用した。
（４）Ａｔｔａｃｈｅｄ ＰＢＭＣ：健康な支援者の血液をＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で濃度こう配遠心分離を行って、分離したヒト末梢血液単核細胞を１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ培地に２時間の間３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで細胞を付着させた後、上層液（浮游細胞を含む）を掬い取り、付着した細胞のみ分離した。
（５）（４）の実験で掬い取った上層の浮游細胞を使用した。
【0117】
結果を図９に示した。図９に示すように、ＣＤ１４＋単核球から分化させた樹状細胞単独（Ａ）およびＣＤ１４＋単核球が含まれていない末梢血液集団（Ｂ）はＤＮＰ００７を処理していない対照群と類似の遺伝子発現プロファイルを示した。これに対し、ＣＤ１４＋由来の樹状細胞単独で存在する条件でない、他の様々な免疫細胞が共に存在する条件（Ｃ、Ｄ、Ｅ）では、ＤＮＰ００７の添加時、添加していない対照群とは顕著に異なる遺伝子発現プロファイル様相を示した。
【0118】
また、これら総遺伝子発現プロファイルでＤＮＰ００７を処理していない対照群に比べて、２倍以上上向および下向する遺伝子を類似の機能を有する遺伝子グループに分けたＫＥＧＧ ｐａｔｈｗａｙ ＆ ＧＯ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ分析した結果、ＤＮＰ００７によって変化する遺伝子発現プロファイルはほとんどの炎症反応をはじめとする免疫反応を調節するのに関与する遺伝子であった（図１０および図１１）。変化様相が明らかな遺伝子のうちのサイトカインに対する部分を図式化すると図１２ａおよび１２ｂのとおりである。末梢血液の中で付着した細胞を除いた上層の浮游細胞と全末梢血液細胞（ｗｈｏｌｅ ＰＢＭＣ）サンプルの遺伝子発現の分析結果、図１２ａおよび１２ｂのようにＩＬ６、ＩＬ１７、ＩＬ２３、ＩＬ３６など代表的な自己免疫疾患のターゲットになるサイトカインの遺伝子発現をＤＮＰ００７抗体処理によって抑制することが示された。
【0119】
これら結果により、本明細書で提案されたＩＣＡＭ－１抗体ＤＮＰ００７は単に樹状細胞にのみ限定して影響を及ぼすのではなく、樹状細胞と他の免疫細胞の接触法や細胞間交差反応に作用し、これにより多様な免疫反応遺伝子発現を調節して結果的に免疫抑制反応を招くことがわかる。
【0120】
４－３．ＤＮＰ００７抗体の末梢血液単核球に対する影響分析－サイトカインの分析
上記４－２実験セットの準備の際、遺伝子発現変化が実際のタンパク質発現変化と相関関係を示すかどうかを確認するために、４－２実験時に上層液を分離して実際のサイトカインを定量分析した。ＩＦＮｇａｍｍａ、ＩＬ１ ｂｅｔａ、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＩＬ－１７、ＩＬ－２７はＨｕｍａｎ Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｓｓａｙ（ＬＸＳＡＨ，Ｒ＆Ｄ）キットを用いて、ＴＧＦ－ｂｅｔａはＴＧＦ－ｂｅｔａ ｐｒｅｍｉｘｅｄ ａｓｓａｙキット（ＴＧＴＢＭＡＧ－６４Ｋ－０３；Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて分析した。
上記４－２実験セットの準備の際、遺伝子発現変化が実際のタンパク質発現変化と相関関係を示すかどうかを確認するために、４－２実験時に上層液を分離して実際のサイトカインを定量分析した。ＩＦＮｇａｍｍａ、ＩＬ１ ｂｅｔａ、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＩＬ－１７、ＩＬ－２７はＨｕｍａｎ Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｓｓａｙ（ＬＸＳＡＨ，Ｒ＆Ｄ）キットを用いて、ＴＧＦ－ｂｅｔａはＴＧＦ－ｂｅｔａ ｐｒｅｍｉｘｅｄ ａｓｓａｙキット（ＴＧＴＢＭＡＧ－６４Ｋ－０３；Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて分析した。
【0121】
図１３のように分析したサイトカインのすべてはＤＮＰ００７抗体投与によって４０～８０％水準の実際のタンパク質発現の減少を示した。これは実施例４－２の遺伝子発現プロファイル結果と一致する結果としてＤＮＰ００７抗体による免疫抑制反応を再確認したものといえる。
【0122】
また、正常な人の末梢血液に分離して樹状細胞に分化させた後、同一人のＴ細胞と共培養条件で、ＬＰＳ処理で免疫活性化を誘導したときも、ＤＮＰ００７抗体の投与したサンプルは図１４のように顕著な免疫サイトカインのタンパク質レベルでの発現抑制を確認した。
【0123】
実施例５．抗体の樹状細胞に対する効果試験
５－１．末梢血液単核球での準成熟樹状細胞（Ｓｅｍｉ－ｍａｔｕｒｅｄ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ）の誘導活性試験
本実施例では本明細書で提供された抗体が樹状細胞の分化および成熟に及ぼす効果を確認した。より具体的には、正常支援者から採血を実施して準備した末梢血液に、ＣＤ１４ ｍｉｃｒｏｂｅａｄ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０５０－２０１）を付着した後、セルハーベスター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ．Ｃａｔ．０００４０３）を用いてヒト末梢血液単核球を分離した。ここにＧＭ－ＣＳＦ（Ｃｒｅａｇｅｎｅ）とＩＬ－４（Ｃｒｅａｇｅｎｅ）をそれぞれ１００ｎｇ／ｍｌ濃度で処理した１０％ＦＢＳ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＲＰＭＩ培養液を入れ、５日間未成熟樹状細胞（ｉｍｍａｔｕｒｅ ＤＣ）に分化を誘導した。培養５日目にＬＰＳ Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，＃Ｌ２６３０）５ｕｇ／ｍｌを添加して、２４時間の間樹状細胞（ｍａｔｕｒｅ ＤＣ）を刺激して成熟樹状細胞に分化させた。本明細書で提供された抗体ＤＮＰ００７（Ｈ１７Ｌ４抗体）および対照抗体（ｈＩｇＧ）は、樹状細胞分化誘導過程０、３日目に５．０ｕｇ／ｍＬ濃度で添加した。分化６日目に樹状細胞の成熟表面因子であるＣＤ８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ １１－０８０９－４２）、ＣＤ８６（ＢＤ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ ５５５６５７）、ＣＤ４０（ＢＤ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ ５５５５８８）、ＣＤ５４（ＢＤ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ ３４７９７７）およびＨＬＡ－ＤＲ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ ３０７６１６）（以上、括弧内は該当因子に対する抗体である）の発現量をフローサイトメトリーを用いて確認および比較した。
５－１．末梢血液単核球での準成熟樹状細胞（Ｓｅｍｉ－ｍａｔｕｒｅｄ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ）の誘導活性試験
本実施例では本明細書で提供された抗体が樹状細胞の分化および成熟に及ぼす効果を確認した。より具体的には、正常支援者から採血を実施して準備した末梢血液に、ＣＤ１４ ｍｉｃｒｏｂｅａｄ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０５０－２０１）を付着した後、セルハーベスター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ．Ｃａｔ．０００４０３）を用いてヒト末梢血液単核球を分離した。ここにＧＭ－ＣＳＦ（Ｃｒｅａｇｅｎｅ）とＩＬ－４（Ｃｒｅａｇｅｎｅ）をそれぞれ１００ｎｇ／ｍｌ濃度で処理した１０％ＦＢＳ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＲＰＭＩ培養液を入れ、５日間未成熟樹状細胞（ｉｍｍａｔｕｒｅ ＤＣ）に分化を誘導した。培養５日目にＬＰＳ Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，＃Ｌ２６３０）５ｕｇ／ｍｌを添加して、２４時間の間樹状細胞（ｍａｔｕｒｅ ＤＣ）を刺激して成熟樹状細胞に分化させた。本明細書で提供された抗体ＤＮＰ００７（Ｈ１７Ｌ４抗体）および対照抗体（ｈＩｇＧ）は、樹状細胞分化誘導過程０、３日目に５．０ｕｇ／ｍＬ濃度で添加した。分化６日目に樹状細胞の成熟表面因子であるＣＤ８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ １１－０８０９－４２）、ＣＤ８６（ＢＤ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ ５５５６５７）、ＣＤ４０（ＢＤ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ ５５５５８８）、ＣＤ５４（ＢＤ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ ３４７９７７）およびＨＬＡ－ＤＲ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ ３０７６１６）（以上、括弧内は該当因子に対する抗体である）の発現量をフローサイトメトリーを用いて確認および比較した。
【0124】
前記得られた各因子の発現量（Ｍｅａｎ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，ＭＦＩ）をＬＰＳのみを処理した群に対する相対値に換算して図１５に示した。図１５で確認されるように、対照抗体（ｈＩｇＧ）を処理した樹状細胞の場合、ＬＰＳ刺激でＣＤ８０、ＣＤ５４、ＣＤ４０、およびＨＬＡ－ＤＲなどの補助因子の発現がいずれも増加したが、試験抗体ＤＮＰ００７とＬＰＳを共に処理した群ではこのような補助因子の発現が顕著に減少することを確認した。このような結果は前記本明細書で提供された抗体が抗原刺激による樹状細胞の成熟を制限し、免疫抑制環境を誘導することを示す。
【0125】
５－２．樹状細胞での炎症性サイトカイン分泌量試験
本明細書で提供された抗体が樹状細胞の分化および成熟段階に影響を与えるかどうかを確認するために、末梢血液から分離したヒト末梢血液単核球をＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４とともに５日間培養して樹状細胞に分化させ、ＬＰＳのような刺激因子を入れて２４時間培養して成熟を誘導させた後、樹状細胞の成熟度を測定するために培養液内の炎症性サイトカイン（Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の量を分析した。
本明細書で提供された抗体が樹状細胞の分化および成熟段階に影響を与えるかどうかを確認するために、末梢血液から分離したヒト末梢血液単核球をＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４とともに５日間培養して樹状細胞に分化させ、ＬＰＳのような刺激因子を入れて２４時間培養して成熟を誘導させた後、樹状細胞の成熟度を測定するために培養液内の炎症性サイトカイン（Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の量を分析した。
【0126】
より具体的には、ヒト末梢血液にＣＤ１４ ｍｉｃｒｏｂｅａｄ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０５０－２０１）を付着した後、セルハーベスター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ。Ｃａｔ。０００４０３）を用いてヒト末梢血液単核球を分離した。ここにＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４をそれぞれ１００ｎｇ／ｍｌ濃度で処理した１０％ＦＢＳ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＲＰＭＩ培養液を入れて、５日間未成熟樹状細胞（ｉｍｍａｔｕｒｅ ＤＣ）に分化を誘導した。培養５日目にＬＰＳ ５ｕｇ／ｍｌを添加して２４時間の間樹状細胞（ｍａｔｕｒｅ ＤＣ）を刺激して、成熟樹状細胞に分化を誘導した。本明細書で提供された抗体ＤＮＰ００７（Ｈ１７Ｌ４抗体）および対照抗体（ｈＩｇＧ）は、樹状細胞分化誘導過程０、３日目にそれぞれ０．１～１０．０ｕｇ／ｍＬ濃度で添加した。分化６日目に培養液内の炎症性サイトカイン（Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ；ＩＬ－６およびＴＮＦ－ａ）の量をＥＬＩＳＡ技法を用いて分析した。
【0127】
前記得られた結果を図１６に示した。図１６に示すように、対照抗体を処理した成熟した樹状細胞ではＬＰＳ刺激により代表的炎症性サイトカインであるＩＬ－６およびＴＮＦ－αの分泌量が大きく増加することに対し、試験抗体ＤＮＰ００７を処理した樹状細胞では炎症性サイトカインの分泌能が大きく減少した。樹状細胞の成熟は樹状細胞が抗原提示細胞として能力を取得する過程を意味し、成熟した樹状細胞は抗原特異的Ｔ細胞の活性を誘導する機能をする。本明細書で提供された抗体の処理によって、樹状細胞成熟度の重要な尺度である炎症性サイトカインＩＬ－６およびＴＮＦ－αの分泌が大きく抑制され、これにより本明細書で提供された抗体が樹状細胞の成熟を抑制する機能を有していることを確認した。
【0128】
５－３．樹状細胞の細胞自滅（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）試験
樹状細胞の分化段階で本明細書で提供された抗体が細胞死滅に影響を与えるかどうかを確認するために、前記抗体処理による６日間の分化および成熟させた樹状細胞の死滅程度を測定した。細胞死滅程度は７ＡＡＤ染色後フローサイトメトリーにより確認した。
樹状細胞の分化段階で本明細書で提供された抗体が細胞死滅に影響を与えるかどうかを確認するために、前記抗体処理による６日間の分化および成熟させた樹状細胞の死滅程度を測定した。細胞死滅程度は７ＡＡＤ染色後フローサイトメトリーにより確認した。
【0129】
より具体的には、ヒト末梢血液にＣＤ１４ ｍｉｃｒｏｂｅａｄ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０－０５０－２０１）を付着した後、セルハーベスター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ．Ｃａｔ．０００４０３）を用いてヒト末梢血液単核球を分離した。ＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４をそれぞれ１００ｎｇ／ｍｌ濃度で処理した１０％ＦＢＳ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＲＰＭＩ培養液を入れて５日間未成熟樹状細胞（ｉｍｍａｔｕｒｅ ＤＣ）に分化を誘導した。培養５日目にＬＰＳ ５ｕｇ／ｍｌを添加して２４時間の間樹状細胞（ｍａｔｕｒｅ ＤＣ）を刺激して、成熟樹状細胞を分化させた。本明細書で提供された抗体ＤＮＰ００７（Ｈ１７Ｌ４抗体）および対照抗体（ｈＩｇＧ）は樹状細胞分化誘導過程０、３日目に５．０ｕｇ／ｍＬ濃度で２回添加した。分化誘導後６日目なる日、成熟樹状細胞（ｍａｔｕｒｅ ＤＣ）を７ＡＡＤ（７－Ａｍｉｎｏ－Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ、ＢＤ、５１－６８９８１Ｅ ５ｕｌ／ｔｅｓｔ）を染色してフローサイトメトリーを用いて分析した。
【0130】
前記得られた結果を図１７に示した。図１７に示すように、分化および成熟を経た樹状細胞の細胞死滅程度を確認した結果、対照抗体処理群は２．３３％の細胞死滅を示すことに比べて、試験抗体ＤＮＰ００７を処理した樹状細胞の細胞死滅率は３６．３％で、対照群より高い細胞死滅効果を示した。
【0131】
前記試験抗体による樹状細胞の細胞死滅効果は細胞自滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）によるものと評価することができる。
【0132】
５－４．免疫寛容樹状細胞（Ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ ＤＣ）の誘導試験
本明細書で提供された抗体が免疫寛容樹状細胞を誘導するかどうかを確認するために、６日間の分化および成熟過程を経た準成熟樹状細胞で、フローサイトメトリーで免疫寛容樹状細胞の標識因子の発現を確認した。
本明細書で提供された抗体が免疫寛容樹状細胞を誘導するかどうかを確認するために、６日間の分化および成熟過程を経た準成熟樹状細胞で、フローサイトメトリーで免疫寛容樹状細胞の標識因子の発現を確認した。
【0133】
より具体的には、実施例５－２または５－３と同一にヒト末梢血液単核球から６日間の分化および成熟過程を経た準成熟樹状細胞に、本明細書で提供された抗体ＤＮＰ００７（Ｈ１７Ｌ４抗体）および対照抗体（ｈＩｇＧ）を樹状細胞分化誘導過程０、３日目に５．０ｕｇ／ｍＬ濃度で２回添加し、分化誘導後６日目なる日、フローサイトメトリーで免疫寛容樹状細胞標識因子の発現を確認した。
【0134】
細胞表面発現因子ＰＤＬ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ １７－５９８３－４２）、ＰＤＬ２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ １３０－０９８－５２８）、およびＡｄｅｎｏｓｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａ２ｂ（Ｎｏｖｕｓ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ ＮＢＰ２－４１３１２ＰＥ）（以上、括弧内は該当因子に対する抗体である）は、該当抗体を適正濃度で処理した後、冷蔵で２０分間反応して染色した。フローサイトメトリーバッファ（０．５％ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３ ｉｎ １ＸＰＢＳ）２ｍｌを添加して２２００ｒｐｍに３分遠心分離し、上層液を除去して洗浄して分析した。
【0135】
細胞液物質であるＩＤＯ（Ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３－Ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ １２－９４７７－４２）、ＴＧＦ－β（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ ＩＣ２４０Ｐ）、ＩＬ－１０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ １３０－１１２－７２９）（以上、括弧内は該当因子に対する抗体である）は、細胞内抗原染色方法キット製造会社のマニュアルに従い染色した。細胞ｐｅｌｌｅｔに１００ｕｌのＩＣ Ｆｉｘａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ ００－８２２２－４９）を入れて常温で光を遮断させた後、３０分間反応して細胞を固定した。１ｘ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ ００－８３３３－５６）を２ｍＬ添加して、６００ｇ ５分遠心分離して上層液を除去した。適切な濃度の各抗体を１ｘ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ １００ｕｌに添加して、残りの細胞ｐｅｌｌｅｔで処理し、常温で光を遮断させた後、３０分間反応させた。１ｘ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ２ｍＬを追加し、６００ｇ ５分条件で遠心分離し、洗浄し、フローサイトメトリーｂｕｆｆｅｒ ２ｍｌずつ添加し、遠心分離して、追加洗浄を実施した。１％パラホルムアルデヒドを添加して細胞を固定し、フローサイトメトリーを用いて各抗原の発現量を分析した。
【0136】
前記得られた結果を図１８ａおよび１８ｂに示した。図１８ａおよび１８ｂに示すように、試験抗体ＤＮＰ００７が処理された樹状細胞は免疫寛容の代表因子であるＩＤＯの発現が対照抗体処理された樹状細胞（対照群）に比べて相当な増加を示し、その他免疫抑制因子として知られているＰＤＬ１、ＰＤＬ２およびａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｒ Ａ２ｂの発現量も対照群に比べて増加した。このように、本明細書で提供された抗体を処理した樹状細胞の分析によりＩＤＯおよび免疫寛容に関連する一部因子の発現が増加することを確認した。特に樹状細胞に発現するＩＤＯは、Ｔ細胞の増殖を抑制して免疫寛容に重要な役割をすると知られている。したがって、本明細書で提供された抗体によるＩＤＯ発現増加は、免疫寛容が誘導される高い可能性を示唆する。
【0137】
５－５．樹状細胞でのＩＤＯ発現試験
本明細書で提供された抗体による樹状細胞成熟抑制が、知られている二つの成熟経路のうちどの経路によるものかを確認するために、ＬＰＳとＣＤ４０Ｌを用いて樹状細胞の成熟を誘導した。６日間の分化および成熟過程を経た準成熟樹状細胞で、フローサイトメトリーで免疫寛容樹状細胞標識因子であるＩＤＯの発現を確認した。
本明細書で提供された抗体による樹状細胞成熟抑制が、知られている二つの成熟経路のうちどの経路によるものかを確認するために、ＬＰＳとＣＤ４０Ｌを用いて樹状細胞の成熟を誘導した。６日間の分化および成熟過程を経た準成熟樹状細胞で、フローサイトメトリーで免疫寛容樹状細胞標識因子であるＩＤＯの発現を確認した。
【0138】
より具体的には、Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｐａｔｈｗａｙとして知られているＬＰＳによる刺激は、実施例５－２または５－３と同じ条件で行い、６日間の分化および成熟過程を経た準成熟樹状細胞を準備してテストした。
【0139】
Ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｐａｔｈｗａｙとして知られているＣＤ４０Ｌによる刺激試験では、ＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４をそれぞれ１００ｎｇ／ｍｌ濃度で処理した１０％ＦＢＳ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＲＰＭＩ培養液を入れて５日間分化した未成熟樹状細胞を使用した。培養してから５日目なる日、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４ １００ｎｇ／ｍｌの濃度で処理された１０％ＦＢＳ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＲＰＭＩにＣＤ４０Ｌ（Ｅｎｚｏ，ＡＬＸ－５２２－１１０） １ｕｇ／ｍｌを共に添加して、４８時間刺激を与えて成熟樹状細胞（ｍａｔｕｒｅ ＤＣ）を誘導した。本明細書で提供された抗体ＤＮＰ００７（Ｈ１７Ｌ４抗体）および対照抗体（ｈＩｇＧ）は樹状細胞分化誘導過程０、３日目に５．０ｕｇ／ｍＬ濃度で２回処理し、５日目にＣＤ４０Ｌを５．０ｕｇ／ｍＬの量で処理した。分化誘導７日になる日、成熟樹状細胞（Ｍａｔｕｒｅ ＤＣ）に上で言及した細胞内抗原染色方法（Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｎｔｉｇｅｎｓ）で染色した後、フローサイトメトリーを用いて分析した。
【0140】
前記得られた結果を図１９ａ（Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｐａｔｈｗａｙ）および１９ｂ（Ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｐａｔｈｗａｙ）に示した。図１９ａおよび１９ｂに示すように、試験抗体ＤＮＰ００７はＣＤ４０Ｌによる樹状細胞の成熟進行過程で細胞内ＩＤＯの発現減少を誘導することに対し、ＬＰＳによる樹状細胞の成熟は個体間ＩＤＯ発現が大きい差を示した。樹状細胞の成熟経路にはＬＰＳおよびＴＮＦ－ａ刺激によって誘導される古典的経路とＣＤ４０Ｌによって誘導される非古典的経路がある。前記結果は本明細書で提供された抗体が二つの樹状細胞成熟経路に影響を与え、特にＣＤ４０Ｌによる成熟を制限して免疫寛容樹状細胞に分化を誘導することを示す。
【0141】
５－６．水溶性物質によるＴ細胞免疫抑制試験
本明細書で提供された抗体の処理により成熟が抑制された樹状細胞がＴ細胞に影響を与える要因が細胞間の接合によるものであるか、あるいは細胞から分泌された媒介因子によるものであるかを確認するために、樹状細胞とＴ細胞を分離した条件で培養してＴ細胞の活性抑制能を確認した。
本明細書で提供された抗体の処理により成熟が抑制された樹状細胞がＴ細胞に影響を与える要因が細胞間の接合によるものであるか、あるいは細胞から分泌された媒介因子によるものであるかを確認するために、樹状細胞とＴ細胞を分離した条件で培養してＴ細胞の活性抑制能を確認した。
【0142】
より具体的には、ヒト末梢血液にＣＤ３ ｍｉｃｒｏｂｅａｄ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－０５０－２０１）を付着した後、セルハーベスターを用いて分離したヒトＴ細胞と前記実施例５－１ないし５－５と同じ条件で得た成熟樹状細胞（Ｍａｔｕｒｅ ＤＣ）を分離した条件で培養してＴ細胞の活性抑制能を確認した。培養液に通過できるように製作されたプレートの下のチャンバに、抗－ＣＤ３抗体（ＢＤ、５５７０５２）１ｕｇ／ｍｌと抗－ＣＤ２８抗体（ＢＤ、５５５７２５）１ｕｇ／ｍｌをコートして末梢血液から分離した自己Ｔ細胞を入れた。この際、自己Ｔ細胞は増殖を確認するための条件としてＣＦＳＥ Ｌａｂｅｌｉｎｇをした。上のチャンバには本明細書で提供された抗体ＤＮＰ００７（Ｈ１７Ｌ４抗体）を処理して分化させた樹状細胞を入れた。そして二つの細胞は各チャンバで培養液を共有したまま４日間培養した。樹状細胞と自己Ｔ細胞の個数は１：１０の割合で処理した。
【0143】
前記得られた結果を図２０に示した。図２０に示すように、二つの細胞の直接的な接触がない条件でもＴ細胞は、試験抗体処理樹状細胞によって増殖が抑制され、炎症性サイトカインであるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ｒ）の生成が減少した。前記結果は本明細書で提供される抗体処理樹状細胞がＴ細胞との物質交換によりＴ細胞の活性および増殖を抑制できることを示し、樹状細胞から分泌された物質はＴ細胞の活性を抑制する媒介因子として作用し、免疫寛容を誘導することを意味する。
【0144】
５－７．抗体処理された樹状細胞によるＴ細胞免疫抑制試験
本明細書で提供された抗体の処理で成熟が抑制された樹状細胞のＴ細胞活性抑制能を評価するために、樹状細胞とＴ細胞を共に培養した条件でＴ細胞の活性および増殖を確認した。先に樹状細胞の成熟は知られている二つの成熟経路への刺激因子であるＬＰＳ、ＴＮＦ－ａおよびＣＤ４０Ｌを用いて誘導し、Ｔ細胞の増殖と細胞内炎症性サイトカインの発現量を測定した。
本明細書で提供された抗体の処理で成熟が抑制された樹状細胞のＴ細胞活性抑制能を評価するために、樹状細胞とＴ細胞を共に培養した条件でＴ細胞の活性および増殖を確認した。先に樹状細胞の成熟は知られている二つの成熟経路への刺激因子であるＬＰＳ、ＴＮＦ－ａおよびＣＤ４０Ｌを用いて誘導し、Ｔ細胞の増殖と細胞内炎症性サイトカインの発現量を測定した。
【0145】
より具体的には、樹状細胞の成熟は知られている二つの成熟経路（Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｐａｔｈｗａｙ：ＬＰＳ，ＴＮＦ－ａｌｐｈａ／Ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｐａｔｈｗａｙ：ＣＤ４０Ｌ）を用いてそれぞれ誘導した。ＬＰＳとＣＤ４０Ｌによる刺激は実施例５－５と同様の方法で行われ、ＴＮＦ－ａｌｐｈａによる刺激は、未成熟樹状細胞に誘導された状態で５日目にＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４をそれぞれ１００ｎｇ／ｍｌ濃度で処理した１０％ ＦＢＳ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＲＰＭＩにＴＮＦ－ａ １３ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－１β１０ｎｇ／ｍｌ、ＰＧＥ２ ３５０ｎｇ／ｍｌを処理して４８時間刺激を与えて成熟樹状細胞（ｍａｔｕｒｅ ＤＣ）に分化させて行った。本明細書で提供された抗体ＤＮＰ００７（Ｈ１７Ｌ４抗体）および対照抗体（ｈＩｇＧ）は樹状細胞分化誘導過程中の０、３日目に５．０ｕｇ／ｍｌ濃度で２回処理した。
【0146】
Ｔ細胞の活性を誘導するために抗－ＣＤ３抗体１ｕｇ／ｍｌをコートしたプレートに上記のような方法で分化した成熟樹状細胞と自己Ｔ細胞を１：１０の割合で入れて、３日後にＴ細胞の増殖と細胞内炎症性サイトカインの発現量を測定した。この時、同様にＴ細胞の増殖を確認するためにＣＦＳＥ Ｌａｂｅｌｉｎｇを行った。
【0147】
前記結果を図２１に示した。図２１に示すように、対照抗体を処理した樹状細胞とともに培養したＴ細胞は活発な細胞増殖を示し、炎症性サイトカインに代表されるＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０を高く発現した。これと対照的に、試験抗体ＤＮＰ００７を処理して成熟が制限された樹状細胞とともに培養したＴ細胞は抗ＣＤ３抗体による刺激にもかかわらず、増殖が抑制され、炎症性サイトカイン分泌が顕著に減少した。
【0148】
このような結果は本明細書で提供される抗体が二つの樹状細胞の成熟経路（ＬＰＳおよびＴＮＦ－ａ刺激によって誘導される古典的経路とＣＤ４０Ｌによって誘導される非古典的経路）すべてに影響を与え、成熟が抑制された樹状細胞によって減作されたＴ細胞は増殖と炎症性サイトカインの発現を制限することを示す。すなわち、本明細書で提供される抗体によって誘導された準成熟樹状細胞はＴ細胞の活性および増殖を抑制する。
【0149】
実施例６．抗体の免疫関連疾患の治療効果（ｉｎ ｖｉｖｏ）
６－１．リウマチ関節炎の治療効果試験
本明細書で提供された抗体がリウマチ関節炎に効果があるかどうかを確認するために、ｍｉｌｄ ａｎｄ ｍｏｄｅｒａｔｅリウマチ関節炎モデルを次のように準備した：最初の日にＴｙｐｅ ＩＩ Ｂｏｖｉｎｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ（Ｃｈｏｄｒｅｘ ｉｎｃ，Ｃａｔ．＃：２００２１） ４ｍｇをＣＦＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．＃：Ｆ５８８１）とともに１：１体積の割合で０．５ｍｌ＋０．５ｍｌの量で準備して、０．１ｍｌずつ１０ヶ所に分けて霊長類動物（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ Ｍａｃａｑｕｅｓ（ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、性別：ｆｅｍａｌｅ、年齢：２．５～５ｙｅａｒｓ、体重：２～６ｋｇ、入手元：ＰｒｉｍＧｅｎ）などの表皮（Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）に注入した。２１日目の日と４５日目の日にも同様の方法で注入し、ただし二回目と三回目の注入はＣＦＡの代わりにＩＦＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．＃：Ｆ５５０６）に交替して注入した。対照群はＰＢＳを同じ方式で注入した。関節炎誘発の有無を測定するＲＡ ｓｃｏｒｅは動物の各関節の腫れや赤い色変化の程度を半定量的に点数化した（図２２ａ）。本明細書で提供された抗体ＤＮＰ００７（Ｈ１７Ｌ４抗体）は初めてｃｏｌｌａｇｅｎ処理後、７０日目から週２回、８ｍｇ／ｋｇで投与しながら評価基準によって６４関節の関節炎点数（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）を測定した。また、投与動物の血漿からＢｏｖｉｎｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ特異抗体を検査した。これはＣｈｏｎｄｒｅｘ社の）ＥＬＩＳＡキット（Ｃａｔ．＃：２０５２Ｔ）を用いてＢｏｖｉｎｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ特異抗体の変化を測定した。
６－１．リウマチ関節炎の治療効果試験
本明細書で提供された抗体がリウマチ関節炎に効果があるかどうかを確認するために、ｍｉｌｄ ａｎｄ ｍｏｄｅｒａｔｅリウマチ関節炎モデルを次のように準備した：最初の日にＴｙｐｅ ＩＩ Ｂｏｖｉｎｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ（Ｃｈｏｄｒｅｘ ｉｎｃ，Ｃａｔ．＃：２００２１） ４ｍｇをＣＦＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．＃：Ｆ５８８１）とともに１：１体積の割合で０．５ｍｌ＋０．５ｍｌの量で準備して、０．１ｍｌずつ１０ヶ所に分けて霊長類動物（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ Ｍａｃａｑｕｅｓ（ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、性別：ｆｅｍａｌｅ、年齢：２．５～５ｙｅａｒｓ、体重：２～６ｋｇ、入手元：ＰｒｉｍＧｅｎ）などの表皮（Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）に注入した。２１日目の日と４５日目の日にも同様の方法で注入し、ただし二回目と三回目の注入はＣＦＡの代わりにＩＦＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．＃：Ｆ５５０６）に交替して注入した。対照群はＰＢＳを同じ方式で注入した。関節炎誘発の有無を測定するＲＡ ｓｃｏｒｅは動物の各関節の腫れや赤い色変化の程度を半定量的に点数化した（図２２ａ）。本明細書で提供された抗体ＤＮＰ００７（Ｈ１７Ｌ４抗体）は初めてｃｏｌｌａｇｅｎ処理後、７０日目から週２回、８ｍｇ／ｋｇで投与しながら評価基準によって６４関節の関節炎点数（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）を測定した。また、投与動物の血漿からＢｏｖｉｎｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ特異抗体を検査した。これはＣｈｏｎｄｒｅｘ社の）ＥＬＩＳＡキット（Ｃａｔ．＃：２０５２Ｔ）を用いてＢｏｖｉｎｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ特異抗体の変化を測定した。
【0150】
前記得られた結果を図２２ｂおよび２２ｃに示した。その結果、試験抗体ＤＮＰ００７を投与したグループ（ｎ＝３）は、投与していないグループ（ｎ＝２）に比べてＡｒｔｈｒｉｔｉｃｓ ｓｃｏｒｅが減少し（図２２ｂ）、疾患の直接的な免疫学的因子であるａｎｔｉ－ｃｏｌｌａｇｅｎ抗体も顕著に減少した（図２２ｃ）。このような結果は本明細書に提供された抗体がリウマチ関節炎の治療に効果的であることを示す。
【0151】
６－２．移植片対宿主疾患の治療効果試験
移植片対宿主疾患（Ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ，ＧＶＨＤ）は、同種臓器（例えば、骨髄）移植時移植を受けた患者（授与者）から現れる副作用の一つであり、供与者のＴ細胞やＮＫ細胞が授与者の臓器を攻撃して現れる現象である。本明細書で提供された抗体が同種骨髓移植時移植片対宿主疾患の抑制に効果があるかどうかを確認するために、ＮＯＤ－ＳＣＩＤハツカネズミにヒトの末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）を入れてＴ細胞の再構成（Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）と生残率を対照群と比較した。
移植片対宿主疾患（Ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ，ＧＶＨＤ）は、同種臓器（例えば、骨髄）移植時移植を受けた患者（授与者）から現れる副作用の一つであり、供与者のＴ細胞やＮＫ細胞が授与者の臓器を攻撃して現れる現象である。本明細書で提供された抗体が同種骨髓移植時移植片対宿主疾患の抑制に効果があるかどうかを確認するために、ＮＯＤ－ＳＣＩＤハツカネズミにヒトの末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）を入れてＴ細胞の再構成（Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）と生残率を対照群と比較した。
【0152】
より具体的には、移植片対宿主疾患（Ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ，ＧＶＨＤ）モデルはＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）雌マウスを１．６Ｇｙで放射線照射した後、ヒトのＰＢＭＣを注入することによって確立した。ヒトのＰＢＭＣはＬｅｕｃｏｓｅｐ（商標） ｔｕｂｅ（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、２２７２９０）にＦｉｃｏｌｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７５４４２０２）を使用して遠心分離して中間白色層を分離して確保した。分離したヒトのＰＢＭＣはマウス一匹当たり１ｘ１０７ ｃｅｌｌｓ／２００μＬで腹腔投与した。
【0153】
本明細書で提供された抗体ＤＮＰ００７（Ｈ１７Ｌ４抗体）を１０ｍｇ／ｋｇ容量で週２回ずつ６週間、合計１２回投与して試験群を準備し、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ（Ｂｉｏ Ｘ ｃｅｌｌ，ＢＥ００９９）を１０ｍｇ／ｋｇ容量で週２回ずつ６週間、合計１２回投与して陽性対照群を準備した。Ｇ１（ｎ＝３）はＰＢＭＣも投与していない陰性対照群であり、Ｇ２（ｎ＝７）はｖｅｈｉｃｌｅとしてＧＶＨＤを誘発させてＰＢＳを投与した陰性対照群である。また、Ｇ３（ｎ＝７）はＣＴＬＡ－４－Ｉｇを投与した陽性対照群であり、Ｇ４（ｎ＝７）は試験抗体ＤＮＰ００７を投与した試験群である。ＧＶＨＤ誘発および治療効果の測定は五つの臨床的基準（体重減少、行動、活性度、脱毛、皮膚；ｗｅｉｇｈｔ ｌｏｓｓ，ｐｏｓｔｕｒｅ，ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｆｕｒ，ｓｋｉｎ）を点数化して記録した。
【0154】
前記得られた結果を図２３ａおよび２３ｂに示した。その結果、本明細書に提供された抗体が投与された試験群（Ｇ４）は陰性対照群であるＧ２より生残率が大きく向上し（図２３ａ）、ヒトＴ細胞の再構成が正常にうまく行われていることを確認した（図２３ｂ）。このような結果は、本明細書で提供された抗体が同種骨髓移植時に発生する移植片対宿主疾患を防止して正常な供与者Ｔ細胞の再構成を可能にする効果があることを示す。
【図1】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図3d】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図4d】
【図5】
【図6】
【図7a】
【図7b】
【図7c】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12a】
【図12b】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18a】
【図18b】
【図19a】
【図19b】
【図20】
【図21】
【図22a】
【図22b】
【図22c】
【図23a】
【図23b】
【配列表】