特許 7311201 肝オルガノイド及びその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-07-10

(45)【発行日】2023-07-19

(54)【発明の名称】肝オルガノイド及びその製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20230711BHJP

   C12M 1/00 20060101ALN20230711BHJP

   C12M 3/00 20060101ALN20230711BHJP

【ＦＩ】

C12N5/071

C12M1/00 A

C12M3/00 A

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2022500823

(86)(22)【出願日】2020-07-23

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-15

(86)【国際出願番号】 KR2020009722

(87)【国際公開番号】W WO2021015572

(87)【国際公開日】2021-01-28

【審査請求日】2022-01-07

(31)【優先権主張番号】10-2019-0089027

(32)【優先日】2019-07-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】517336290

【氏名又は名称】ティーアンドアール バイオファブ カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｔ ＆ Ｒ ＢＩＯＦＡＢ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】５４２ｈｏ，２３７ Ｓａｎｇｉｄａｅｈａｋ－ｒｏ Ｓｉｈｅｕｎｇ－ｓｉ Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ １５０７３ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】100087491

【弁理士】

【氏名又は名称】久門 享

(74)【代理人】

【識別番号】100104271

【弁理士】

【氏名又は名称】久門 保子

(72)【発明者】

【氏名】ジン ソンワン

(72)【発明者】

【氏名】アン グンソン

(72)【発明者】

【氏名】カン ドング

【審査官】小金井 悟

(56)【参考文献】

【文献】韓国公開特許第１０－２０１７－０１１３４３７（ＫＲ，Ａ）

【文献】韓国公開特許第１０－２０１７－０１２４９７２（ＫＲ，Ａ）

【文献】韓国公開特許第１０－２０１５－０１２２２６０（ＫＲ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１４／１９７６２２（ＷＯ，Ａ２）

【文献】Genes ，2018年03月22日，Vol.9, No.4, 176，pp.1-15

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８

Ｃ１２Ｍ １／００－ ３／１０

Ｇｏｏｇｌｅ／Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

内部が複数の区画部（１１０）に分けられた管状の外腔部（１００）と、
前記区画部（１１０）に充填された細胞凝集体（２００）と、
前記外腔部（１００）の中心に備えられる内腔部（３００）と、を含み、
前記内腔部（３００）の中心には、内部が空いている管状の中空構造を持つ通孔（３１０）が形成され、
前記外腔部（１００）と前記内腔部（３００）は、血管内皮細胞を含むことで、前記外腔部（１００）の外面、複数の区画部（１１０）同士の間、及び前記通孔（３１０）の外周面に血管が形成されることを特徴とする、肝オルガノイド。

【請求項2】

前記外腔部（１００）と前記内腔部（３００）はハイドロゲルをさらに含み、
前記細胞凝集体（３００）は肝細胞及びハイドロゲルを含むことを特徴とする、請求項１に記載の肝オルガノイド。

【請求項3】

前記ハイドロゲルは、アルギン酸塩、フィブリンゲル、カルボキシルメチルセルロース、へパラン硫酸、ヒアルロン酸、コラーゲン、デキストラン、アガロース、ゼラチン、ラミニン、プルロニック、特定の組織で脱細胞化されたバイオインク、マトリゲル、水酸隣灰石、ヒアルロン酸及びポリエチレングリコールよりなる群から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とする、請求項２に記載の肝オルガノイド。

【請求項4】

肝小葉の断面パターンを有するように区画された空間を提供する区画部材（１）が備えられたバイオインク収容部（２）を準備する収容部準備ステップと、
前記バイオインク収容部（２）の各区画された空間に相異なるバイオインクを供給するバイオインク供給ステップと、
前記バイオインク収容部（２）に圧力を加えて、区画された空間に収容された相異なるバイオインクを単一ノズル（３）から吐出させる吐出ステップと、を含み、
前記区画部材（１）は、前記区画部材（１）の中心に形成される第３中空部（３０）と、前記第３中空部（３０）の外側に形成され、扇形の断面を有する複数の第２中空部（２０）と、前記第２中空部（２０）及び第３中空部（３０）を包む構造で形成される第１中空部（１０）と、を含み、
前記バイオインク供給ステップは、第１中空部（１０）に第１バイオインク（１１）が供給され、第２中空部（２０）に第２バイオインク（２１）が供給され、第３中空部（３０）に第３バイオインク（３１）が供給され、
前記第１バイオインク（１１）はハイドロゲルと血管細胞内皮を含み、
前記第２バイオインク（２１）は肝細胞及びハイドロゲルを含み、
前記第３バイオインク（３１）は、細胞が含まれていないハイドロゲルを含み、
前記第１乃至第３バイオインクに含まれるハイドロゲルは、アルギン酸塩、フィブリノーゲン、カルボキシルメチルセルロース、へパラン硫酸、ヒアルロン酸、コラーゲン及びデキストランよりなる群から選択される少なくとも１種を含み、
前記吐出段階以降に、前記第３中空部（３０）に供給された第３バイオインク（３１）を除く残りの領域の第１及び第２バイオインク（１１，２１）をゲル化させた後、細胞培養液として処理して第３バイオインク（３１）を除去して第３中空部（３０）に通孔を形成することを特徴とする、肝オルガノイドの製造方法。

【請求項5】

前記吐出ステップでバイオインク収容部（２）に加えられる圧力は０．１～５００ｋＰａであることを特徴とする、請求項４に記載の肝オルガノイドの製造方法。

【請求項6】

前記吐出ステップは、前記バイオインク供給ステップと同時に行われるか、或いはバイオインク供給ステップ以後に順次行われることを特徴とする、請求項４に記載の肝オルガノイドの製造方法。

【請求項7】

前記第１バイオインクはコラーゲンと血管内皮細胞を含み、
前記第２バイオインクはコラーゲンと肝細胞を含み、
前記第３バイオインクはアルギン酸塩を含むことを特徴とする、請求項４に記載の肝オルガノイドの製造方法。

【請求項8】

前記第１バイオインクは、コラーゲンとアルギン酸塩との混合物及び血管内皮細胞を含み、
前記第２バイオインクは、コラーゲンとアルギン酸塩との混合物及び肝細胞を含み、
前記第３バイオインクは、アルギン酸塩を含むことを特徴とする、請求項４に記載の肝オルガノイドの製造方法。

【請求項9】

前記第１バイオインクはアルギン酸塩と血管内皮細胞を含み、
前記第２バイオインクはアルギン酸塩と肝細胞を含み、
前記第３バイオインクはゼラチンを含むことを特徴とする、請求項４に記載の肝オルガノイドの製造方法。

【請求項10】

前記コラーゲンとアルギン酸塩との混合物は、ｐＨ７．０に中和された３ｗｔ％コラーゲンと３ｗｔ％アルギン酸塩が９：１の体積比率で混合されたことを特徴とする、請求項８に記載の肝オルガノイドの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、肝オルガノイドに係り、より詳細には、肝小葉（liver lobulｅ）形態の構造を長期間維持することができる肝オルガノイド及びその製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

新薬開発には、多くの時間及び努力、そしてかなりの費用がかかる。しかし、新薬開発に成功すれば高い付加価値を創出することができる。薬物が効果を発揮するためには、その物質が標的に薬効を与えるのに十分な濃度に達しなければならない。ところが、薬物が肝で代謝されると、活性を失ってしまう。

【0003】

薬物による肝毒性メカニズムは、肝代謝活性化との関係が深い。薬物由来肝毒性は、前臨床段階で新薬開発を中断させる原因となり、臨床段階では臨床実験を中断させる原因となる。また、薬物の市販後でも、薬物由来肝毒性が発見されると、その薬物は市場から撤退される。よって、毒性及び薬物代謝研究のための三次元肝モデルの開発は重要である。

【0004】

肝は、ヒトの臓器の中で最大の器官であり、胆汁だけでなく、人体に必要な数千種の物質と酵素を生産し、各種有毒物質を除毒する機能を果たす。

【0005】

肝の構造は非常に複雑であるが、通常、肝は、肝小葉が単位構造をなしている。このような肝小葉は、中央の中心静脈と、毛細血管を送り出す３つの小葉肝静脈で構成されている。小葉肝静脈から出てきた洞様毛細血管の周囲は肝細胞に囲まれており、肝細胞同士の間には毛細胆管が形成されている。洞様毛細血管と肝細胞との間には、ディッセ腔という狭い腔所があり、肝星状細胞が位置している。このような構造的複雑性により、ヒトの肝と類似な三次元肝モデルを製作することは非常に難しく、特に肝細胞は二次元培養の際に細胞の機能が急速に低下する。

【0006】

近年、オルガノイド（organoid）を用いて三次元肝モデルを開発するための研究が盛んに行われている。ミニ臓器と呼ばれるオルガノイド（organoid）は、特定の臓器や組織に起源した前駆細胞又は幹細胞を用いて作製された構造体であって、実際の人体臓器と類似な構造及び機能を持つ三次元構造体を意味する。

【0007】

最近のある研究では、ヒトの肝から抽出された成体幹細胞を用いて、ヒトの肝と類似な構造及び機能をする肝オルガノイドをｉｎ ｖｉｔｒｏで作製することに成功した。しかし、このような方法は、肝オルガノイドを作製するために必要な細胞をヒトの体内から抽出することは非常に難しく、ドナーごとに細胞の機能が異なるため、作製されたサンプルごとに差が生じるという欠点がある。さらに、細胞の自己組織化を介して培養するので、所望の形態で細胞を配列することができない。

【0008】

オルガノイド技術の他にも、微小流体力学装置、リソグラフィーを利用した三次元パターニングチップなど、特定の装置を用いた三次元培養技術も用いられているが、コスト消費が激しく、実験手順が非常に複雑である。スフェロイド技術は、バイオインクなしに細胞を凝集させて長期間培養が可能であるが、低酸素状態が凝集体中央部分で発生するので、２００～３００μｍ程度の大きさにのみ製作しなければならないという限界点がある。

【0009】

バイオプリンティング技術は、現在、オルガノイドと共に最も多く研究されている技術である。ヒトの肝構造を模写するために、様々な細胞が含有されたそれぞれのバイオインクを多重ヘッドを用いて所望の位置に吐出及び積層して数ミリメートルサイズの肝類似体を製作することができる。しかし、従来のバイオプリンティング技術は、プリンティング解像度の限界があり、大きな構造物を製作する場合には、積層により酸素低下が発生する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明は、肝小葉（liver lobulｅ）形態の構造からなるため低酸素状態を防止することができて長期培養が可能であり、且つ肝小葉形態の構造が長期間維持可能である肝オルガノイド及びその製造方法を提供するためのものであって、肝小葉形態の構造が長期間維持されることにより非臨床実験及び臨床実験の両方に使用可能な肝オルガノイド及びその製造方法を提供することができる。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明の一実施形態は、肝オルガノイドに関するものであり、内部が複数の区画部１１０に分けられた管状の外腔部１００と、前記区画部１１０に充填された細胞凝集体２００と、前記外腔部１００の中心に備えられる内腔部３００と、を含む。

【0012】

前記内腔部３００は、内部が空いている管状構造であることが好ましい。

【0013】

また、前記外腔部１００は、血管内皮細胞及びハイドロゲルを含むことができ、前記細胞凝集体２００は、肝細胞及びハイドロゲルを含むことができる。

【0014】

前記ハイドロゲルは、アルギン酸塩、フィブリンゲル、カルボキシルメチルセルロース、へパラン硫酸、ヒアルロン酸、コラーゲン、デキストラン、アガロース、ゼラチン、ラミニン、プルロニック、特定の組織で脱細胞化されたバイオインク、マトリゲル、水酸隣灰石、ヒアルロン酸及びポリエチレングリコールよりなる群から選択される少なくとも１種を含むか、或いはこれらの中の少なくとも２種或いは３種のハイドロゲルが混合された混合ハイドロゲルが使用できる。

【0015】

一方、本発明の他の実施形態としては、肝オルガノイドの製造方法が挙げられるが、肝小葉の断面パターンを有するように区画された空間を提供する区画部材１が備えられたバイオインク収容部２を準備する収容部準備ステップと、前記バイオインク収容部２の各区画された空間に相異なるバイオインクを供給するバイオインク供給ステップと、バイオインク収容部２に物理的な力を加えて、区画された空間に収容された相異なるバイオインクを単一ノズル３から吐出させる吐出ステップと、を含む。

【0016】

前記区画部材１は、前記区画部材１の中心に形成され、リング状の断面を有する第３中空部３０と、前記第３中空部３０の外側に形成され、扇形の断面を有する複数の第２中空部２０と、前記第２中空部２０及び第３中空部３０を包む構造で形成される第１中空部１０と、を含むことが好ましい。

【0017】

前記バイオインク供給ステップでは、第１中空部１０に第１バイオインク１１が供給され、第２中空部２０に第２バイオインク２１が供給され、第３中空部３０に第３バイオインク３１が供給されることが好ましく、前記第１バイオインク１１は血管細胞内皮及びハイドロゲルを含み、前記第２バイオインク２１は肝細胞及びハイドロゲルを含み、前記第３バイオインク３１はハイドロゲルを含むことがさらに好ましい。

【0018】

前記ハイドロゲルは、アルギン酸塩、フィブリンゲル、カルボキシルメチルセルロース、へパラン硫酸、ヒアルロン酸、コラーゲン、デキストラン、アガロース、ゼラチン、ラミニン、プルロニック、特定の組織で脱細胞化されたバイオインク、マトリゲル、水酸隣灰石、ヒアルロン酸及びポリエチレングリコールよりなる群から選択される少なくとも１種を含むことができる。

【0019】

前記吐出ステップでバイオインク収容部２に加えられる圧力は、０．１～５００ｋＰａであることがさらに好ましい。

【0020】

前記吐出ステップは、前記バイオインク供給ステップと同時に又は順次に行われることができる。

【発明の効果】

【0021】

本発明による肝オルガノイドは、血管内皮細胞（vascular endothelial cell）が外腔部と内腔部を包んでおり、外腔部と内腔部との間にも血管内皮細胞が連結されて構造的に安定し、長期間培養する場合でも構造的変化なしに形態を維持することができる。

【0022】

また、本発明の肝オルガノイドは、酸素を供給する内腔部を含むことにより、低酸素状態によるアポトーシスを防止することができるため、長期間培養が可能である。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】本発明の一実施例による肝オルガノイドの斜視図である。

【図2】本発明の他の実施例による肝オルガノイドの製造過程を示す模式図である。

【図3】本発明による肝オルガノイドを培養して観察した結果の顕微鏡写真である。

【図4】本発明による肝オルガノイドを培養して観察した結果の顕微鏡写真である。

【図5】本発明による肝オルガノイドを培養して観察した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0024】

以下、本発明の好適な実施例によって詳細に説明する前に、本明細書及び請求の範囲で使用された用語や単語は、通常的且つ辞書的な意味に限定されて解釈されてはならず、本発明の技術的思想に符合する意味と概念で解釈されるべきであることを明らかにする。

【0025】

本明細書全体において、ある部分がある構成要素を「含む」とするとき、これは、特に反対の記載がない限り、他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素をさらに含み得ることを意味する。

【0026】

以下では、本発明の肝オルガノイド及びその製造方法についてより詳細に説明する。

【0027】

図１は本発明の一実施例による肝オルガノイドの斜視図である。

【0028】

図１を参照すると、本発明の一実施例による肝オルガノイドは、内部が複数の区画部１１０に分けられた管状の外腔部１００と、前記区画部１１０に充填された細胞凝集体２００と、前記外腔部１００の中心に備えられ、内部が空いている管状の内腔部３００と、を含み、実際の肝小葉構造と類似な構造を持つ。
前記内腔部３００の中心には通孔３１０が形成されている。

【0029】

前記外腔部１００は、肝オルガノイドの全体的な構造を維持する役割を果たすものであり、図１に示すように、内部が複数の区画部１１０に分けられた管状の構造で形成されることができる。

【0030】

このような外腔部１００、前記複数の区画部１１０同士の間、及び内腔部３００の中心に形成された通孔３１０の外周面には、血管内皮細胞（vascular endothelial cell）及びハイドロゲル（hydrogel）が含まれる。

【0031】

このような血管内皮細胞（vascular endothelial cell）は、肝オルガノイドが流体と直接当接する面である外腔部１００の外面に位置して血管化されるだけでなく、細胞凝集体２００からの肝細胞の離脱を防止して本発明の肝オルガノイドの構造が長期間維持されるようにする。

【0032】

また、前記複数の区画部１１０同士の間、及び内腔部３００の中心に形成された通孔３１０の外周面も、血管内皮細胞が血管化される。

【0033】

前記ハイドロゲルは、アルギン酸塩、フィブリノーゲン、カルボキシルメチルセルロース、へパラン硫酸、ヒアルロン酸、コラーゲン、デキストラン、アガロース、ゼラチン、ラミニン、プルロニック、特定の組織で脱細胞化されたバイオインク、マトリゲル、水酸隣灰石、ヒアルロン酸及びポリエチレングリコールよりなる群から選択される少なくとも１種を含むことができる。このようなハイドロゲルは、水分含有量が高く、生体適合性及び機械的物性に優れるため、本発明の肝オルガノイドのように、細胞が含まれた構造のオルガノイドに適用することが非常に適する。

【0034】

前記外腔部１００の区画部１１０に充填される細胞凝集体２００は、肝細胞及びハイドロゲル（hydrogel）を含む。ハイドロゲルは、細胞が付着できない空隙を提供して肝細胞間の凝集を誘導する。

【0035】

また、前記細胞凝集体２００は、肝細胞及びハイドロゲルの他にも、サイトカインなどの細胞成長因子（growth factor）をさらに含むことができる。細胞成長因子（growth factor）は、細胞の成長及び分化に影響を与える物質であって、サイトカインを含むタンパク質、ポリペプチド又はこれらの複合体を意味する。このような細胞成長因子としては、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）を含む線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ＰＤＧＦＡＡ及びＰＤＧＦ－ＡＢを含む血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＢＭＰ－２及びＢＭＰ－７などを含む骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ－α）、ＴＧＦβ－１及びＴＧＦβ－３を含むトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ－β）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、ＩＬ－８などが挙げられる。

【0036】

前記内腔部３００は、本発明の肝オルガノイドを構成する外腔部１００の中心領域に位置し、内部が空いている管状の構造を持つ。このような内腔部３００は、中心に通孔３１０が形成されており、これにより肝オルガノイドに酸素を供給することができる。このような内腔部３００を介して、細胞凝集体２００に含まれた肝細胞に酸素を供給することにより、肝細胞が低酸素状態になって死滅することを防止することができる。これにより、本発明の肝オルガノイドは、長期間培養が可能であり、長期間培養しても構造が安定的に維持される。

【0037】

内腔部３００の中心領域に通孔３１０を形成させるために、内腔部３００の中心領域は、細胞が含まれていないハイドロゲルで形成されることが好ましいが、特に細胞が含まれず、吐出された以後に容易に除去可能なハイドロゲルで形成されることが好ましい。

【0038】

例えば、区画部材には、細胞が混ざっているコラーゲン（３７℃の温度でゲル化される）を入れ、内腔部の中心領域には、細胞が混ざっていないアルギン酸塩（カルシウムイオンによってゲル化される）を入れることができる。吐出されたオルガノイドを３７℃でゲル化させると、所望の形状にゲル化（固め）され、カルシウムイオンのないアルギン酸塩は水のように維持されるので、これを細胞培養液で洗浄すると、通孔に該当する内腔（ルーメン lumen）を形成することができる。すなわち、通孔或いは内腔形成のために、内腔部の中心領域のハイドロゲルのみをゲル化させないことにより、細胞培養液に拡散して無くなるように誘導することができる。

【0039】

図２は本発明の一実施例によって肝オルガノイドが製造される工程を概略的に示す模式図である。

【0040】

図２を参照すると、本発明の肝オルガノイドの製造方法は、試料吐出を用いた方式であって、肝小葉の断面パターンを有するように区画された空間を提供する区画部材１が備えられたバイオインク収容部２を準備する収容部準備ステップ（図２（ａ））と、前記バイオインク収容部２の各区画された空間に相異なるバイオインクを供給するバイオインク供給ステップ（図２（ｂ））と、バイオインク収容部２に圧力を加えて、区画された空間に収容された相異なるバイオインクを単一ノズル３から吐出させる吐出ステップ（図２（ｃ））と、を含むことができる。

【0041】

収容部準備ステップでの区画部材１は、上述した本発明の肝オルガノイドの断面パターンと対応する断面パターンを有するように形成されることが好ましい。具体的には、図２（ａ）に示すように、前記区画部材１の構造は、区画部材１の中心に形成され、リング状の断面を有する第３中空部３０と、前記第３中空部３０の外側に形成され、扇形の断面を有する複数の第２中空部２０と、前記第２中空部２０及び第３中空部３０を包む構造で形成される第１中空部１０と、を含む構造であり得る。

【0042】

このような第１中空部１０は、上述した肝オルガノイドの外腔部１００に対応し、第２中空部２０は、細胞凝集体２００に対応し、第３中空部３０は、内腔部３００の中心に位置する通孔３１０に対応する。

【0043】

このような区画部材１は、ＡＢＳ（Acrylonitrile butadiene styrene）、ＰＣＬ（polycaprolactone）、ＡＳＡ（Acrylonitrile-Styrene-Acrylate）、ＳＡＮ（Styrene-Acrylonitrile copolymer）、ＰＳ（Polystyrene）、ＰＰＳＦ／ＰＰＳＵ（Polyphenylsulfone）、ポリエーテルイミド（Polyetherimide）、ＰＬＡ（Polylactic acid）、ＰＤＬ（Poly-d-lysine）などの樹脂を用いてＦＤＭプリンティング方式で製造されるか、或いは非鉄又は非鉄合金などを用いた機械加工方式で製造されることができる。

【0044】

バイオインク供給ステップは、区画部材１によって区画されたバイオインク収容部２の各空間に相異なるバイオインクを供給するステップである。具体的には、図２（ｂ）に示すように、第１中空部１０には第１バイオインク１１が供給されることができ、第２中空部２０には第２バイオインク２１が供給されることができ、第３中空部３０には第３バイオインク３１が供給されることができる。

【0045】

第１バイオインク１１は、上述した外腔部１００と内腔部３００と区画部１１０との間に血管を形成するためのものであり、血管内皮細胞（vascular endothelial cell）及びハイドロゲル（hydrogel）を含むことが好ましい。

【0046】

第２バイオインク２１は、区画部１１０内に細胞集合体２００を形成するためのものであり、肝細胞及びハイドロゲルを含むことができる。

【0047】

肝細胞としては、例えば、胚由来肝幹細胞、逆分化肝幹細胞、成体肝幹細胞、一次肝細胞、不死化細胞株などが使用できる。

【0048】

また、第２バイオインク２１は、肝細胞及びハイドロゲルの他にも、細胞の成長及び分化に影響を与える物質である細胞成長因子をさらに含むことができる。このような細胞成長因子（growth factor）としては、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）を含む線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ＰＤＧＦＡＡ及びＰＤＧＦ－ＡＢを含む血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＢＭＰ－２及びＢＭＰ－７などを含む骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、形質転換成長因子α（ＴＧＦ－α）、ＴＧＦβ－１及びＴＧＦβ－３を含むトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ－β）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、ＩＬ－８などが挙げられる。

【0049】

また、第３バイオインク３１は、上述した内腔部３００の中央に位置する通孔（３１０）を形成するためのものであり、ハイドロゲルを含むことが好ましい。

【0050】

前記ハイドロゲルは、アルギン酸塩、フィブリンゲル、カルボキシルメチルセルロース、へパラン硫酸、ヒアルロン酸、コラーゲン、デキストラン、アガロース、ゼラチン、ラミニン、プルロニック、特定の組織で脱細胞化されたバイオインク、マトリゲル、水酸隣灰石、ヒアルロン酸及びポリエチレングリコールよりなる群から選択される少なくとも１種を含むことができる。

【0051】

第１中空部と第３中空部には、それぞれゲル化される条件が異なる他のハイドロゲルを収容させることができるが、例えば、第１中空部には、カルシウムによってゲル化されるアルギン酸塩を入れ、第３中空部には、約３０℃未満でゲル化され、３０℃以上では流体状態で存在するゼラチンを入れた後に、カルシウムイオンが含有された３７℃の細胞培養液に吐出させる場合、アルギン酸塩は直ちにゲル化され、ゼラチンはゲル化されない。

【0052】

したがって、ゼラチンは、流体状態で細胞培養液に拡散して溶けて無くなることにより、内腔部の中心に位置する通孔３１０を形成し、アルギン酸塩のみが維持されて本発明による特有の肝オルガノイドを製造することができる。

【0053】

前記吐出ステップは、図２（ｃ）に示すように、バイオインク収容部２に圧力を加えて、区画された空間に収容された相異なるバイオインクを単一ノズル３から吐出させるステップである。このとき、相異なるバイオインクのそれぞれには同じ圧力が加えられることが好ましい。

【0054】

前記収容部２に加えられる圧力は、約０．１～５００ｋＰａの範囲の圧力であることが好ましい。圧力があまり大きくて５００ｋＰａを超える場合には、ノズル３にかかる負荷が大きくなって損傷が発生する可能性がある。また、圧力が０．１ｋＰａ未満である場合には、バイオインクの粘性による抵抗のためノズル３からスムーズに排出されない。

【0055】

前記ノズル３の直径は約０．１～１００ｍｍであることが好ましい。ノズル３の直径が０．１ｍｍ未満である場合には、排出圧力が大きくなって細胞に損傷を引き起こすおそれがあり、ノズルの直径が１００ｍｍを超える場合には、精度に劣るうえ、材料の消費量があまり増加するという問題点がある。

【0056】

このような吐出ステップは、前記バイオインク供給ステップと同時に行われてもよく、順次に行われてもよい。

【0057】

前記吐出ステップで吐出されて形成された肝オルガノイドは、そのまま使用することができ、必要によっては、所定の厚さにカットして使用したり、特定パターンで連続積層して所望の形状に積層加工したりすることも可能である。

【0058】

例えば、繊維状に長く引いて使用するか或いはこれをカットして使用することができ、所望の形態で連続的に積層加工することができる。好ましくは、直径１ｍｍのノズルを介して吐出させるが、ヒトの肝小葉が約１ｍｍのサイズであり、長い繊維形状に吐出された構造物を再び１ｍｍにカットすると、肝小葉と非常に類似な構造体を得ることができるからである。また、これをカットせずに連続吐出及び積層加工して大きな塊状にする場合には、肝小葉が様々な構造に配列された肝葉（lobes of liver）を作ることも可能である。

【0059】

以下、本発明の実施例について説明する。しかし、本発明の範疇が以下の好適な実施例に限定されるものではなく、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、本発明の権利範囲内で本明細書に記載された内容の種々の変形形態を実施することができる。

【0060】

［実施例１］第１バイオインクの製造
ｐＨ６．０～８．０に中和されたコラーゲン水溶液に血管内皮細胞（vascular endothelial cell）を投入し、攪拌して第１バイオインクを製造した。

【0061】

［実施例２］第２バイオインクの製造
ｐＨ６～８に中和されたコラーゲン水溶液にヒト成体肝幹細胞を投入し、攪拌して第２バイオインクを製造した。

【0062】

［実施例３］第３バイオインクの製造
アルギン酸塩を蒸留水に投入し、常温で１２時間撹拌して第３バイオインクを製造した。

【0063】

［実施例］
本発明の肝オルガノイドを製造するために、図２（ａ）に示すように、第１中空部、第２中空部及び第３中空部を有する区画部材を、材料吐出方法でＰＬＡ（polyactic acid）を用いて製造した。

【0064】

このように製造された区画部材を３Ｄプリンタシリンジの収容部に挿入した後、第１中空部には上記で製造された第１バイオインクを供給し、第２中空部には第２バイオインクを供給し、第３中空部には第３バイオインクを供給した。その後、空圧を用いて約１０ｋＰａの圧力を加えてバイオインクを単一ノズル（直径：１ｍｍ）から吐出して肝オルガノイドを製造した。

【0065】

［比較例］
本発明の肝オルガノイドの効果を立証するために、２つの比較群（Mix（W/O lumen）ｖｓ Mix（W lumen））を設定して実験を進めた。まず、肝細胞（HepG2、以下同一）と血管内皮細胞（EA.hy926、以下同一）を約７：３の比率で混ぜてバイオインクと混合した後、区画部材のないシリンジにバイオインクを供給した。その後、空圧を用いて１０ｋＰａの圧力を加えてバイオインクを単一ノズル（直径：１ｍｍ）から吐出して肝オルガノイドを製造した（Mix W/O lumen）。次に、肝細胞と血管内皮細胞を約７：３の比率で混ぜてバイオインクと混合した後、肝オルガノイドと同様の方式で、２つの細胞が混合された肝オルガノイドを製造した（Mix W lumen）。

【0066】

その結果、内腔を作っていない混合モデルは、ゲルの中央内側で低酸素状態が発生して細胞が外郭のみで生き残って構造が激しく変形した。内腔を作った混合モデルは、内腔部に血管内皮細胞ではない肝細胞が一緒に成長するにつれて、内腔部分が血管化されて構造が維持されず、２つの細胞が任意に成長しながら内腔部が埋められ、結局、細胞の生存率が減少した。

【0067】

［実験例１］
実施例及び比較例の肝オルガノイドを１０日間培養した後、これを顕微鏡で観察して図３と図４に示した（図４のMIXは図３のMix（W lumen）と同じものであり、図４のPre-setは図３のPre-setと同じ試料である。）。

【0068】

図３のMix（W/O lumen）は、肝細胞と血管内皮細胞を同時にハイドロゲルに混ぜ、何のパターンもなく１ｍｍのノズルから吐出して観察した結果であり、Mix（W lumen）は、肝細胞と血管内皮細胞を同時にハイドロゲルに混ぜて肝オルガノイド製造方式と同様に吐出して観察した結果である。そして、Pre-setは、予め定められたパターンで肝オルガノイドを製造し、肝細胞と血管内皮細胞を異質的に区分されるようにした結果である。特にPre-setの場合には、血管内皮細胞が外腔部、内腔部、及びこれらの間に連結されることにより構造をよく維持していることが分かる。

【0069】

［実験例２］
長期間培養する場合でも、実施例の肝オルガノイドの構造が維持されることを確認するために、実施例と同様の方式で実験を行った。

【0070】

第１具現例として、血管部にコラーゲン、肝細胞部にコラーゲン、内腔部にアルギン酸塩をそれぞれ使用し、１ｍｍのノズルを介して１０ｋＰａの圧力で温度３７℃の細胞培養培地中で長い繊維状に吐出した後、インキュベータに移した。

【0071】

コラーゲンは、３７℃の温度で徐々にゲル化されるので、３７℃の培養液中で吐出する場合、ゲル化されながら液体中に繊維状に存在する。ゲル化が完了すると、内側の内部孔に位置するアルギン酸塩は拡散してメディアに溶ける。

【0072】

第２具現例として、血管部にコラーゲン及びアルギン酸塩、肝細胞部にコラーゲン及びアルギン酸塩、内腔部にアルギン酸塩をそれぞれ使用して実験を行った。

【0073】

この時、コラーゲンとアルギン酸塩との混合物の場合は、ｐＨ７．０に中和された３ｗｔ％コラーゲンと３ｗｔ％アルギン酸塩を９：１の体積比で混ぜた混合物を製造した。その後、混合物をそれぞれ細胞と混合して使用し、内腔部には３ｗｔ％アルギン酸塩のみを単独で使用した。

【0074】

前述した第１具現例と同様に、１ｍｍのノズルを介して１０ｋＰａの圧力で、カルシウムが含有された細胞培養培地中で長い繊維状に吐出した後、約５分間静置時間を置いた。アルギン酸塩の場合には、カルシウムイオンと出会うとすぐにゲル化されるが、約５分間静置する過程で、外側の外面にあるアルギン酸塩とコラーゲンとの混合物中のアルギン酸塩成分のみがゲル化され、内側にあるアルギン酸塩はゲル化されない。

【0075】

その後、カルシウムが含有された細胞培養培地をＰＢＳ（Phosphate-buffered saline）で洗浄し、カルシウムが含有されていない細胞培養培地を入れてインキュベータで培養した。このように順次コラーゲンがゲル化された後、内側の内腔部に位置するアルギン酸塩は細胞培養培地に拡散して溶けて無くなる。

【0076】

第３具現例として、血管部にアルギン酸塩、肝細胞部にアルギン酸塩、内腔部にゼラチンをそれぞれ使用した。前述した第１及び第２具現例と同様に、１ｍｍのノズルを介して１０ｋＰａの圧力で、カルシウムが含有された細胞培養培地内で長い繊維状に吐出した後、約５分間静置した。

【0077】

静置時間後、カルシウムイオンが含有された細胞培養培地をＰＢＳ（Phosphate-buffered saline）で洗浄した後、カルシウムイオンが含有されていない細胞培養培地を入れてインキュベータで培養した。３７℃でゼラチンは液状として存在するので、細胞培養培地に拡散して溶けて無くなる。

【0078】

このような具現例１乃至３のすべての試料は、２４ウェルプレートに１０％牛血清及び１％抗生剤が含有された細胞培養液であるＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle medium）と共に３７℃の細胞培養装置で培養された。培養液は、１日１回ずつ新たに交替された。アルギン酸塩のゲル化のために、ＰＢＳ又は細胞培養培地に塩化カルシウム（CaCl₂）を５０ｍＭの濃度で添加してカルシウムイオンを供給した。

【0079】

互いに異なる２種類の細胞を区分して観察するために、２つの細胞をそれぞれ免疫染色した。培養７日後、試料をＰＢＳで３回洗浄し、４％ホルムアルデヒドで５分間固定（fixation）させる。固定された試料をＰＢＳで再び３回洗浄した後、０．２５％Triton-X100を用いて１０分間透過化（permeabilization）させた。

【0080】

透過化された試料をＰＢＳで３回洗浄し、１％牛血清アルブミン（bovine serum albumin）で３０分間ブロッキング（blocking）し、ブロッキングされたサンプルにアルブミン（albumin）一次抗体で接地して３７℃のインキュベータで約１時間培養した。その後、それぞれの試料を３回洗浄し、アルブミンに接地される蛍光が内在している二次抗体を接地して３７℃のインキュベータで１時間培養する。

【0081】

このような過程を介して肝細胞がアルブミンで染色される。順次各試料を３回洗浄し、試料にＣＤ３１一次抗体で接地して３７℃のインキュベータで１時間培養した。その後、試料をそれぞれ３回洗浄し、アルブミンに接地される蛍光が内在している二次抗体を接地して３７℃のインキュベータで１時間培養した。これにより、血管内皮細胞がＣＤ３１で染色され、当該試料を共焦点顕微鏡で１０μｍの厚さにｚ軸方向にスキャニングして観察した。
同一の方式でＭＲＰ２も肝細胞に接地して共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した。

【0082】

アルブミンは、肝細胞が分泌するタンパク質であって肝細胞に特異的に染色され、ＭＲＰ２は、胆汁色素を肝細胞内から毛細胆管に排出するポンプタンパク質であって肝細胞に特異的に染色され、ＣＤ３１は、ＰＥＣＭＡ－１であって血管内皮細胞に特異的に発現及び染色される（図５参照）。

【0083】

特定のタンパク質（アルブミン、ＭＲＰ２、ＣＤ３１）の発現度を確認するためにウェスタンブロットを行った。まず、サンプル（Mix W lumen、Pre-set）の混合タンパク質を抽出して同じ濃度で正規化（normalization）した。混合タンパク質をアガロースゲルに電気泳動した後、タンパク質をナイロン膜に移した。ＴＢＳ（Tris-Buffered Saline）でタンパク質膜を洗浄し、１％ＢＳＡで１時間ブロッキングして一次抗体及び二次抗体で順次反応させた後、発光機器を用いてタンパク質発現度（バンド）を測定する。

【0084】

結論として、肝オルガノイド（Pre-set）のタンパク質発現及び維持が混合モデル（Mix W lumen）に比べて格段に高く、構造的維持も安定的であることを確認することができた（図４参照）。

【産業上の利用可能性】

【0085】

本発明による肝オルガノイドは、肝小葉（liver lobule）形態の構造からなるため低酸素状態を防止することができて長期間培養が可能であり、且つ肝小葉（liver lobule）形態の構造が長期間維持可能であるので、産業上利用可能性が存在する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】