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特許7312330３，４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリド、その製造方法及び使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-07-11
(45)【発行日】2023-07-20
(54)【発明の名称】３，４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリド、その製造方法及び使用
(51)【国際特許分類】
C07D 213/69 20060101AFI20230712BHJP
A61K 31/4425 20060101ALI20230712BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20230712BHJP
【ＦＩ】
C07D213/69 CSP
A61K31/4425
A61P25/16
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2022538312
(86)(22)【出願日】2020-06-23
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-20
(86)【国際出願番号】 CN2020097578
(87)【国際公開番号】W WO2021143048
(87)【国際公開日】2021-07-22
【審査請求日】2022-06-17
(31)【優先権主張番号】202010063101.9
(32)【優先日】2020-01-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】522245204
【氏名又は名称】杭州▲澤▼徳医▲薬▼科技有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】100128347
【弁理士】
【氏名又は名称】西内 盛二
(72)【発明者】
【氏名】▲兪▼ 永平
(72)【発明者】
【氏名】ハイダー ロバート チャールズ
(72)【発明者】
【氏名】袁 ▲シン▼
(72)【発明者】
【氏名】▲韓▼ 峰
(72)【発明者】
【氏名】▲陳▼ 文▲騰▼
(72)【発明者】
【氏名】章 国林
(72)【発明者】
【氏名】▲劉▼ 祖▲東▼
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼ 宇
【審査官】高橋 直子
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１１１１７０９３６（ＣＮ，Ａ）
【文献】欧州特許出願公開第１００６１０８（ＥＰ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００４／４１１５１（ＷＯ，Ａ２）
【文献】国際公開第２００９／１０３９５０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第１９９９／２３０７５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００３／２２８１７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】ACS Chem. Neurosci，2020年10月14日，2020,11，3646-3657
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｄ ２１３／６９
Ａ６１Ｋ ３１／４４２５
Ａ６１Ｐ ２５／１６
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
構造式が式（Ｉ）で示される３,４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリドであって、【化1】
（式（Ｉ）中、化合物ＡがＲ配置であり、化合物ＢがＳ配置である。）
前記式（Ｉ）で示される化合物は、その薬学的に許容される塩を含むことを特徴とする３,４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリド。
【請求項2】
請求項１に記載の３,４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリドの製造方法であって、メチルマルトール：フェニルアラニノールのモル比＝１：１～１：１．２、メチルマルトール：ホウ素含有試薬のモル比＝１：０．８～１：１．２となるように、三つ口フラスコにメチルマルトール、フェニルアラニノール、ホウ素含有試薬、水を順次加えて、反応が終了するまで所定の温度の条件下で２～１０時間撹拌するステップ（１）と、
ステップ（１）で得られた反応系のｐＨを０．０１ｍｏｌ／ｍＬ水酸化ナトリウム溶液で８．５に調整し、反応系に対してジクロロメタンで抽出を行い、有機相を合わせた後、それに６ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液を添加し、１時間還流し、次に－５～５℃、１２時間で結晶を析出し、吸引ろ過し、ジクロロメタンで洗浄して、白色固体の目的物を得るステップ（２）を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項3】
ステップ（１）において、前記ホウ素含有試薬は、ホウ酸、フェニルボロン酸及びホウ酸ナトリウムから選択されることを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
【請求項4】
ステップ（１）において、前記温度の範囲は、６０～１００℃であることを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
【請求項5】
ステップ（２）において、ジクロロメタンで洗浄する方法は、ろ過ケーキ１ｇを取り、１回３ｍｌの量でジクロロメタンを用いて２回洗浄することを含むことを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
【請求項6】
抗パーキンソン病薬の製造における請求項１に記載の３,４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、有機合成及び医薬化学の分野に属し、具体的には、３,４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリド、及びパーキンソン病治療薬の製造における使用に関する。
【背景技術】
【0002】
パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ）は振戦麻痺とも呼ばれ、よく見られる中枢神経系変性疾患であり、臨床では静止性振戦、筋強直、運動遅延や姿勢反射障害を主とする。ＰＤの正確な病因や発症機序はまだ完全に解明されておらず、主要な病理学的変化は中脳の黒質緻密部内のドーパミン（ｄｏｐａｍｉｎｅ、ＤＡ）分泌ニューロンの変性と死亡やレビー小体（Ｌｅｗｙ Ｂｏｄｙ））の産生である。そのうち、ＰＤドーパミン作動性ニューロンの変性と死亡プロセスに関与する可能性がある要因が多くあり、例えば遺伝的要因、環境的要因、年齢老化、酸化ストレス、ミトコンドリア機能障害などである。現在、中国では、６５歳以上の人のパーキンソン病の罹患率は約１．７％であり、患者の数は人口の高齢化に伴って増大している。ＰＤは発病率が高いだけでなく、生涯にわたる病気でもあり、病気の期間が進むにつれて、患者は徐々に生活や労働の能力を失い、認知障害や精神錯乱などの運動以外の合併症が発生し、生活品質に深刻な影響を与え、患者は長期に薬を服用する必要があり、家庭や社会に重い負担をもたらす。
【0003】
現在、ＰＤの薬物治療は、主に、ドーパミン代替薬物とドーパミン作動性に影響を与える薬物を使用し、Ｌ－ドパ（マドパー）は現在依然としてＰＤの症状を治療するのに最も有効な薬物であるが、長期治療は、例えば、ジスキネジア、運動障害や運動変動などの深刻な不良反応を引き起こし、また、より進行した患者の治療効果を低下させる可能性がある。もう１つのドーパミン作動性に影響を与える薬物がドーパミン受容体作動薬であり、これもＰＤ治療では重要な役割を果たし、これらは、内因性の神経伝達物質を模倣することにより、ドーパミン受容体に直接作用し、それらを活性化させ、ドーパミンに類似する作用を発揮させ、例えばロチゴチン、プラミペキソールやロピニロールなどの薬物が挙げられる。しかし、このようなドーパミン代替戦略は主に対症治療法であり、ＰＤ病状の進行を効果的に阻止又は緩和することができず、最終的に深刻な運動障害や認知症をもたらす。
【0004】
したがって、新規な構造を持つ抗ＰＤ薬を見つけることは重大な意義がある。
【発明の概要】
【0005】
本発明の目的は、構造式が式（Ｉ）で示される３,４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリドを提供することである。
（Ｉ）
前記式（Ｉ）で示される化合物は、その薬学的に許容される塩、ならびに前記式（Ｉ）で示される化合物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物、互変異性体又はそれらの任意の割合の混合物を含み、前記混合物がラセミ混合物を含む。
【化1】
前記式（Ｉ）で示される化合物は、その薬学的に許容される塩、ならびに前記式（Ｉ）で示される化合物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物、互変異性体又はそれらの任意の割合の混合物を含み、前記混合物がラセミ混合物を含む。
【0006】
本発明の別の目的は、３,４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリドの製造方法を提供することである。
前記製造方法は以下のステップを含む。
（１）メチルマルトール：フェニルアラニノール（モル比）＝１：１～１：１．２（好ましくは１：１．１）、メチルマルトール：ホウ素含有試薬（モル比）＝１：０．８～１：１．２（好ましくは１：１）となるように、三つ口フラスコにメチルマルトール、フェニルアラニノール、ホウ素含有試薬、水を順次加えて、所定の温度の条件で反応が終了するまで２～１０時間撹拌する。ここで、メチルマルトール１ｇあたり水５ｍｌを使用し、反応が終了するまで６０～１００℃の温度範囲の条件で２～１０時間撹拌する。前記ホウ素含有試薬は、ホウ酸、フェニルボロン酸、ホウ酸ナトリウムから選択される。
（２）ステップ（１）で得られた反応系のｐＨを０．０１ｍｏｌ／ｍＬ水酸化ナトリウム溶液で８．５に調整し、反応系に対してジクロロメタンで抽出を行い、有機相を合わせた後、それに６ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液を添加し、１時間還流し、次に－５～５℃、１２時間で結晶を析出し、吸引ろ過し、ジクロロメタンで洗浄して、白色固体の生成物を得る。前記洗浄方法は、ろ過ケーキ１ｇをジクロロメタンを用いて１回３ｍｌの量で２回洗浄することを含む。
前記製造方法は以下のステップを含む。
（１）メチルマルトール：フェニルアラニノール（モル比）＝１：１～１：１．２（好ましくは１：１．１）、メチルマルトール：ホウ素含有試薬（モル比）＝１：０．８～１：１．２（好ましくは１：１）となるように、三つ口フラスコにメチルマルトール、フェニルアラニノール、ホウ素含有試薬、水を順次加えて、所定の温度の条件で反応が終了するまで２～１０時間撹拌する。ここで、メチルマルトール１ｇあたり水５ｍｌを使用し、反応が終了するまで６０～１００℃の温度範囲の条件で２～１０時間撹拌する。前記ホウ素含有試薬は、ホウ酸、フェニルボロン酸、ホウ酸ナトリウムから選択される。
（２）ステップ（１）で得られた反応系のｐＨを０．０１ｍｏｌ／ｍＬ水酸化ナトリウム溶液で８．５に調整し、反応系に対してジクロロメタンで抽出を行い、有機相を合わせた後、それに６ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液を添加し、１時間還流し、次に－５～５℃、１２時間で結晶を析出し、吸引ろ過し、ジクロロメタンで洗浄して、白色固体の生成物を得る。前記洗浄方法は、ろ過ケーキ１ｇをジクロロメタンを用いて１回３ｍｌの量で２回洗浄することを含む。
【0007】
反応方程式は、以下のとおりである。
【化2】
【0008】
本発明のさらなる目的は、抗パーキンソン病薬の製造における前記３,４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリドの使用を提供することである。本発明は、動物試験により、このような化合物は優れた抗パーキンソン病活性を有することを証明した。
【0009】
従来技術に比べて、本発明の利点は以下のとおりである。（１）一段階の反応によって３,４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリドを直接合成する。（２）本発明により提供される３,４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリドは、動物試験を行った結果、このような化合物が優れた抗パーキンソン病活性を有することが動物試験によって確認された。この化合物は、新規な構造を持つ抗パーキンソン病薬の候補薬になる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、図面及び実施例を参照して本発明をさらに説明する。
【0012】
実施例１
（Ｒ）－３,４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリド（化合物Ａ）の製造
メチルマルトール（１６ｍｍｏｌ、２．０２ｇ）、Ｄ－フェニルアラニノール（１７．６ｍｍｏｌ、２．６６ｇ）、ホウ酸（１６ｍｍｏｌ、１．９５ｇ）、および水１０ｍｌを５０ｍｌ三つ口フラスコに順次に加えて、１００℃で２時間反応させた後、反応を終了した。反応液を水酸化ナトリウム溶液（０．０１ｍｏｌ／ｍＬ）でｐＨを８．５程度に調整し、ジクロロメタン（１０ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせた後に、その中に塩酸溶液（６ｍｏｌ／Ｌ）２０ｍｌを加えて、１時間撹拌還流し、さらに－５～５℃で撹拌しながら１２時間結晶化させ、ジクロロメタン（１０ｍＬ×２）で洗浄し、白色固体３．４２を得て、収率が７２％であった。
（Ｒ）－３,４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリド（化合物Ａ）の製造
メチルマルトール（１６ｍｍｏｌ、２．０２ｇ）、Ｄ－フェニルアラニノール（１７．６ｍｍｏｌ、２．６６ｇ）、ホウ酸（１６ｍｍｏｌ、１．９５ｇ）、および水１０ｍｌを５０ｍｌ三つ口フラスコに順次に加えて、１００℃で２時間反応させた後、反応を終了した。反応液を水酸化ナトリウム溶液（０．０１ｍｏｌ／ｍＬ）でｐＨを８．５程度に調整し、ジクロロメタン（１０ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせた後に、その中に塩酸溶液（６ｍｏｌ／Ｌ）２０ｍｌを加えて、１時間撹拌還流し、さらに－５～５℃で撹拌しながら１２時間結晶化させ、ジクロロメタン（１０ｍＬ×２）で洗浄し、白色固体３．４２を得て、収率が７２％であった。
【0013】
その構造式は以下のとおりである。
融点：１７７～１７９℃、１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ １０．３７ （ｓ， １Ｈ）， ８．５８ （ｄ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４３ （ｄ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２４ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．１９－７．１６ （ｍ， ３Ｈ）， ５．３６ （ｓ，１Ｈ）， ５．１０－５．０４ （ｍ， １Ｈ）， ３．９０－３．８２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．２７ （ｄｄ， Ｊ ＝ １４．０， ５．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．１２ （ｄｄ， Ｊ ＝ １４．０， １０．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．３０ （ｓ， ３Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２５ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ １５８．５， １４２．５， １４２．１， １３６．２， １３５．３， １２８．９， １２８．６， １２６．９， １１０．８， ６６．７， ６３．０， ３６．２， １２．６． ＨＲＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１５Ｈ１８ＮＯ３
＋［Ｍ＋Ｈ］＋： ２６０．１２８７， ｆｏｕｎｄ： ２６０．１２８９。
【化3】
【0014】
さまざまな条件での対照実験を以下に示す。
【0015】
比較例１－１において、反応温度を１００℃から６０℃に変更した以外、実施例１と同様に実施して、白色固体として（Ｒ）－３,４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリド２．４７ｇを得て、収率が５２％であった。
【0016】
比較例１－２において、Ｄ－フェニルアラニノールの使用量を（１６ｍｍｏｌ、２．４２ｇ）、すなわち、メチルマルトール：フェニルアラニノール（モル比）＝１：１に変更した以外、実施例１と同様に実施して、白色固体として（Ｒ）－３,４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリド２．６６ｇを得て、収率が５６％であった。
【0017】
比較例１－３において、Ｄ－フェニルアラニノールの使用量を（１９．２ｍｍｏｌ、２．９０ｇ）、すなわち、メチルマルトール：フェニルアラニノール（モル比）＝１：１．２に変更した以外、実施例１と同様に実施して、白色固体として（Ｒ）－３,４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリド３．５１ｇを得て、収率が７４％であった。
【0018】
比較例１－４において、ホウ酸の使用量を（１２．８ｍｍｏｌ、１．９４ｇ）、すなわち、メチルマルトール：ホウ酸（モル比）＝１：０．８に変更した以外、実施例１と同様に実施して、白色固体として（Ｒ）－３,４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリド３．０４ｇを得て、収率が６４％であった。
【0019】
比較例１－５において、ホウ酸の使用量を（１９．２ｍｍｏｌ、２．３４ｇ）、すなわち、メチルマルトール：ホウ酸（モル比）＝１：１．２に変更した以外、実施例１と同様に実施して、白色固体として（Ｒ）－３,４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリド３．５１ｇを得て、収率が７４％であった。
【0020】
比較例１－６において、ホウ酸をフェニルボロン酸に変更した以外、実施例１と同様に実施して、白色固体として（Ｒ）－３,４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリド２．８５ｇを得て、収率が６０％であった。
【0021】
比較例１－７において、ホウ酸をホウ酸ナトリウムに変更した以外、実施例１と同様に実施して、白色固体として（Ｒ）－３,４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリド２．４７ｇを得て、収率が５２％であった。
【0022】
実施例２
（Ｓ）－３,４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリド（化合物Ｂ）の製造
メチルマルトール（１６ｍｍｏｌ、２．０２ｇ）、Ｌ－フェニルアラニノール（１７．６ｍｍｏｌ、２．６６ｇ）、ホウ酸（１６ｍｍｏｌ、１．９５ｇ）、及び水１０ｍｌを５０ｍｌ三つ口フラスコに順次に加えて、１００℃で２時間反応させた後、反応を終了した。反応液を水酸化ナトリウム溶液（０．０１ｍｏｌ／ｍＬ）でｐＨを８．５程度に調整し、ジクロロメタン（１０ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせた後その中に塩酸溶液（６ｍｏｌ／Ｌ）２０ｍｌを加えて、１時間撹拌還流し、さらに－５～５℃で撹拌しながら１２時間結晶化し、ジクロロメタン（１０ｍＬ×２）で洗浄し、白色固体３．５１ｇを得て、収率が７４％であった。
（Ｓ）－３,４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリド（化合物Ｂ）の製造
メチルマルトール（１６ｍｍｏｌ、２．０２ｇ）、Ｌ－フェニルアラニノール（１７．６ｍｍｏｌ、２．６６ｇ）、ホウ酸（１６ｍｍｏｌ、１．９５ｇ）、及び水１０ｍｌを５０ｍｌ三つ口フラスコに順次に加えて、１００℃で２時間反応させた後、反応を終了した。反応液を水酸化ナトリウム溶液（０．０１ｍｏｌ／ｍＬ）でｐＨを８．５程度に調整し、ジクロロメタン（１０ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせた後その中に塩酸溶液（６ｍｏｌ／Ｌ）２０ｍｌを加えて、１時間撹拌還流し、さらに－５～５℃で撹拌しながら１２時間結晶化し、ジクロロメタン（１０ｍＬ×２）で洗浄し、白色固体３．５１ｇを得て、収率が７４％であった。
【0023】
その構造式は、以下のとおりである。
融点：１７７～１７９℃、１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ １０．３８ （ｓ， １Ｈ）， ８．５９ （ｄ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４４ （ｄ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２５ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．２０－７．１６ （ｍ， ３Ｈ）， ５．３７ （ｓ，１Ｈ）， ５．１１－５．０４ （ｍ， １Ｈ）， ３．９１－３．８２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．２８ （ｄｄ， Ｊ ＝ １４．０， ５．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．１３ （ｄｄ， Ｊ ＝ １４．０， １０．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．３０ （ｓ， ３Ｈ）． ＨＲＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１５Ｈ１８ＮＯ３
＋［Ｍ＋Ｈ］＋： ２６０．１２８７， ｆｏｕｎｄ： ２６０．１２８５。
【化4】
【0024】
実施例３
抗パーキンソン病における（Ｒ）－３,４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリド（化合物Ａ）の使用
抗パーキンソン病における（Ｒ）－３,４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリド（化合物Ａ）の使用
【0025】
マウスＭＰＴＰ慢性モデルに対する化合物Ａの行動学的影響
【0026】
１、マウスＭＰＴＰ慢性モデルの作成
ＭＰＴＰ（１－Ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌ－１,２,３,６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ、１－メチル－４－フェニル－１,２,３,６－テトラヒドロピリジン）慢性モデルを作成してＰＤをシミュレーションした。２５０ｍｇ／ｋｇでプロベネシドを腹腔内注射し、０．５時間後にＭＰＴＰを２５ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射した。３．５日おきに１回、５週間連続して注射した。ＭＰＴＰは血液脳関門を透過した後グリア細胞中のモノアミンオキシダーゼＢにより代謝物ＭＰＰ＋に転化された。ＭＰＰ＋はドーパミントランスポーターに対して高い親和性を有するので、ドーパミン作動性ニューロンに容易に入ることができ、ミトコンドリア複合体Ｉを抑制することで毒性作用を果たし、酸化ストレスをもたらすとともに細胞内カルシウム恒常性を破壊し、結果として、ドーパミン作動性ニューロンのアポトーシスや壊死を招き、最後に、ＰＤをシミュレーションする目的を達成させる。プロベネシドは、脳や腎臓内のＭＰＴＰの急速な除去や排泄を阻害することに用いられる。モデル作成においてプロベネシドの量もＴｒｉｓ－ＨＣｌの量も脳内のドーパミン含有量に明らかな影響を及ぼすことはない。
ＭＰＴＰ（１－Ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌ－１,２,３,６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ、１－メチル－４－フェニル－１,２,３,６－テトラヒドロピリジン）慢性モデルを作成してＰＤをシミュレーションした。２５０ｍｇ／ｋｇでプロベネシドを腹腔内注射し、０．５時間後にＭＰＴＰを２５ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射した。３．５日おきに１回、５週間連続して注射した。ＭＰＴＰは血液脳関門を透過した後グリア細胞中のモノアミンオキシダーゼＢにより代謝物ＭＰＰ＋に転化された。ＭＰＰ＋はドーパミントランスポーターに対して高い親和性を有するので、ドーパミン作動性ニューロンに容易に入ることができ、ミトコンドリア複合体Ｉを抑制することで毒性作用を果たし、酸化ストレスをもたらすとともに細胞内カルシウム恒常性を破壊し、結果として、ドーパミン作動性ニューロンのアポトーシスや壊死を招き、最後に、ＰＤをシミュレーションする目的を達成させる。プロベネシドは、脳や腎臓内のＭＰＴＰの急速な除去や排泄を阻害することに用いられる。モデル作成においてプロベネシドの量もＴｒｉｓ－ＨＣｌの量も脳内のドーパミン含有量に明らかな影響を及ぼすことはない。
【0027】
２、実験動物の群分け及び投与量
Ｃ５７／ＢＬマウス３６匹を６群に分け、群ごとにｎ≧６とし、具体的には、表１に示す。
モデルを作成した後、マウスに１ヶ月連続して胃内投与した。
Ｃ５７／ＢＬマウス３６匹を６群に分け、群ごとにｎ≧６とし、具体的には、表１に示す。
【表1】
【0028】
３．行動学的試験方法
投与が終了した後、実験動物について以下の行動学的試験を行った。
投与が終了した後、実験動物について以下の行動学的試験を行った。
【0029】
（１）ハンギング実験：
試験対象であるマウスの２つの前足を一本の水平金属ワイヤ（径５ｍｍ、地面からの距離３０ｃｍ）にハンギングして保持させ、マウスが金属ワイヤから落ちるまでの時間を記録し、６０秒を超えると６０秒としてカウントされる。実験の前にの１日２回訓練した。つかむ
試験対象であるマウスの２つの前足を一本の水平金属ワイヤ（径５ｍｍ、地面からの距離３０ｃｍ）にハンギングして保持させ、マウスが金属ワイヤから落ちるまでの時間を記録し、６０秒を超えると６０秒としてカウントされる。実験の前にの１日２回訓練した。つかむ
【0030】
マウスのハンギング能力のスコア基準
最初の１０秒以内に、マウスが２つの後足で金属ワイヤを掴む場合を３点、１つの後足で金属ワイヤを掴む場合を２点、２つの後足がいずれも金属ワイヤを掴めない場合を１点とし、最後に、スコアを算出してマウスが金属ワイヤから落ちるまでの時間を記録し、６０秒を超えると６０秒としてカウントされる。
最初の１０秒以内に、マウスが２つの後足で金属ワイヤを掴む場合を３点、１つの後足で金属ワイヤを掴む場合を２点、２つの後足がいずれも金属ワイヤを掴めない場合を１点とし、最後に、スコアを算出してマウスが金属ワイヤから落ちるまでの時間を記録し、６０秒を超えると６０秒としてカウントされる。
【0031】
（２）水迷路実験
Ｍｏｒｒｉｓ水迷路試験は認知や記憶能力の変化を検出するためのものである。円形プールは直径１２０ｃｍ、高さ７０ｃｍとし、プラットホームは高さ５０ｃｍ、直径１０ｃｍとし、プラットホームは水面よりも１ｃｍ低く、水温は（２２±２）℃とした。迷路の上にはディスプレイシステム付きのビデオカメラが設置され、コンピュータにより自動的に追跡し計時し、水泳軌跡を記録した。実験中に迷路外の参照物は変化しなかった。
場所学習逃避訓練（Ｐｌａｃｅ ｎａｖｉｇａｔｉｏｎ）：
マウスは、毎日４個の入水地点で訓練され、カメラ及びコンピュータによりその水泳経路のビデオを記録し、入水地点から水に入ってからプラットホームを見つけるまでの時間、即ち、プラットホームへの逃避潜時を記録した。マウスがプラットホームに登っった後１０秒滞在させ、９０秒以内にプラットホームを見つけて登ることができなかった場合、プラットホームを見つけるようにマウスを人為的に案内し、プラットホームに１０秒滞在させ、その逃避潜時を９０秒として記録した。毎回の水泳時間を９０秒に限定し、休憩間隔の時間を３０～５０分間とし、合計で４日間訓練した。逃避潜時は１日あたり４回の訓練の平均値として算出された。
プローブテスト（Ｓｐａｔｉａｌ ｐｒｏｂｅ）：
場所学習逃避訓練が終了した後、即ち５日目に、円形プラットホームを取り外し、マウスをいずれかの入水地点から水に入るようにし、その水泳軌跡及び時間を記録し、かつ９０秒以内の１回目に元のプラットホームの象限を越えて水泳する時間、及び回数を記録した。
Ｍｏｒｒｉｓ水迷路試験は認知や記憶能力の変化を検出するためのものである。円形プールは直径１２０ｃｍ、高さ７０ｃｍとし、プラットホームは高さ５０ｃｍ、直径１０ｃｍとし、プラットホームは水面よりも１ｃｍ低く、水温は（２２±２）℃とした。迷路の上にはディスプレイシステム付きのビデオカメラが設置され、コンピュータにより自動的に追跡し計時し、水泳軌跡を記録した。実験中に迷路外の参照物は変化しなかった。
場所学習逃避訓練（Ｐｌａｃｅ ｎａｖｉｇａｔｉｏｎ）：
マウスは、毎日４個の入水地点で訓練され、カメラ及びコンピュータによりその水泳経路のビデオを記録し、入水地点から水に入ってからプラットホームを見つけるまでの時間、即ち、プラットホームへの逃避潜時を記録した。マウスがプラットホームに登っった後１０秒滞在させ、９０秒以内にプラットホームを見つけて登ることができなかった場合、プラットホームを見つけるようにマウスを人為的に案内し、プラットホームに１０秒滞在させ、その逃避潜時を９０秒として記録した。毎回の水泳時間を９０秒に限定し、休憩間隔の時間を３０～５０分間とし、合計で４日間訓練した。逃避潜時は１日あたり４回の訓練の平均値として算出された。
プローブテスト（Ｓｐａｔｉａｌ ｐｒｏｂｅ）：
場所学習逃避訓練が終了した後、即ち５日目に、円形プラットホームを取り外し、マウスをいずれかの入水地点から水に入るようにし、その水泳軌跡及び時間を記録し、かつ９０秒以内の１回目に元のプラットホームの象限を越えて水泳する時間、及び回数を記録した。
【0032】
４．行動学的試験結果
【0033】
（１）ハンギング実験：
ＭＰＴＰ慢性モデル対照群は、Ｃ５７正常対照群と比較して、ハンギング時間が著しく低下した。
ＭＰＴＰ慢性モデル対照群は、Ｃ５７正常対照群と比較して、ハンギング時間が著しく低下した。
【0034】
ＭＰＴＰ慢性モデル＋マドパー群、ＭＰＴＰ慢性モデル＋化合物Ａ ２５ｍｇ／ｋｇ群、及びＭＰＴＰ慢性モデル＋化合物Ａ １００ｍｇ／ｋｇ群は、ＭＰＴＰ慢性モデル対照群と比較して、明らかな差がなく、ＭＰＴＰ慢性モデル＋プラミペキソール群は、ＭＰＴＰ慢性モデルと比較して、ハンギング時間が低下した。
【0035】
ＭＰＴＰ慢性モデル＋化合物Ａ ２５ｍｇ／ｋｇ群は、ＭＰＴＰ慢性モデル対照群に比べて、ハンギングスコアが増加した（図１）。その結果から、化合物Ａ ２５ｍｇ／ｋｇを投与すると、ＰＤ動物モデルの筋力を改善できる。この図には、Ｃ５７、ＭＰＴＰ＋化合物Ａ ２５ｍｇ／ｋｇ、ＭＰＴＰ＋化合物Ａ １００ｍｇ／ｋｇ群：ｎ＝７である；ＭＰＴＰ－Ｍ、ＭＰＴＰ＋マドパー、ＭＰＴＰ＋プラミペキソール群：ｎ＝６である。＊ｐ＜０．０５：Ｃ５７正常対照群に比べて統計学的差異がある。＃ｐ＜０．０５：ＭＰＴＰモデル対照群に比べて統計学的差異がある。
【0036】
（２）水迷路実験
化合物ＡのＭＰＴＰ慢性モデルＹ字迷路や水迷路実験に対する結果から、１００ｍｇ／ｋｇの用量での化合物Ａは、モデルの認知機能障害に対して改善作用を有する可能性があることを示した（図２）。この図には、Ｃ５７、ＭＰＴＰ＋化合物Ａ ２５ｍｇ／ｋｇ、ＭＰＴＰ＋化合物Ａ １００ｍｇ／ｋｇ群：ｎ＝７である；ＭＰＴＰ－Ｍ、ＭＰＴＰ＋マドパー、ＭＰＴＰ＋プラミペキソール群：ｎ＝６である。＊ｐ＜０．０５：Ｃ５７正常対照群に比べて統計学的差異がある。
化合物ＡのＭＰＴＰ慢性モデルＹ字迷路や水迷路実験に対する結果から、１００ｍｇ／ｋｇの用量での化合物Ａは、モデルの認知機能障害に対して改善作用を有する可能性があることを示した（図２）。この図には、Ｃ５７、ＭＰＴＰ＋化合物Ａ ２５ｍｇ／ｋｇ、ＭＰＴＰ＋化合物Ａ １００ｍｇ／ｋｇ群：ｎ＝７である；ＭＰＴＰ－Ｍ、ＭＰＴＰ＋マドパー、ＭＰＴＰ＋プラミペキソール群：ｎ＝６である。＊ｐ＜０．０５：Ｃ５７正常対照群に比べて統計学的差異がある。
【0037】
５．結論
化合物Ａは、ＭＰＴＰ慢性モデル動物の筋力や協調性を改善する傾向を示し、化合物Ａ １００ｍｇ／ｋｇは、ＭＰＴＰ慢性モデル動物の認知機能を部分的に改善することができ、このため、３,４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリドは、優れた抗パーキンソン病活性を有する。
化合物Ａは、ＭＰＴＰ慢性モデル動物の筋力や協調性を改善する傾向を示し、化合物Ａ １００ｍｇ／ｋｇは、ＭＰＴＰ慢性モデル動物の認知機能を部分的に改善することができ、このため、３,４－ジヒドロキシ－Ｎ－（１’－ベンジル－２’－ヒドロキシエチル）－２－メチルピリジニウムクロリドは、優れた抗パーキンソン病活性を有する。
【図1】
【図2】