(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-07-12
(45)【発行日】2023-07-21
(54)【発明の名称】乳酸発酵食品の製造方法
(51)【国際特許分類】
A23C 9/123 20060101AFI20230713BHJP
A23C 9/133 20060101ALI20230713BHJP
【ＦＩ】
A23C9/123
A23C9/133
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2019182566
(22)【出願日】2019-10-03
(65)【公開番号】P2021058093
(43)【公開日】2021-04-15
【審査請求日】2022-06-28
【微生物の受託番号】NPMD NITE P-02906
【微生物の受託番号】NPMD NITE P-03005
(73)【特許権者】
【識別番号】505177667
【氏名又は名称】株式会社ミル総本社
(74)【代理人】
【識別番号】100088948
【弁理士】
【氏名又は名称】間宮 武雄
(72)【発明者】
【氏名】籔 修弥
(72)【発明者】
【氏名】岸永 幸雄
(72)【発明者】
【氏名】野村 亮太
【審査官】正 知晃
(56)【参考文献】
【文献】特開２０００－３０８４５７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平０４－００４８６２（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０３７０４３３９（ＣＮ，Ａ）
【文献】特開２０００－０１４３５６（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ２３Ｃ
Ａ２３Ｌ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
乳製品原料にグルタミン酸またはその塩類を添加し、その乳製品原料に、乳製品から分離されたストレプトコッカス・サーモフィラスＮＩＴＥ Ｐ－０２９０６菌株および／またはＮＩＴＥ Ｐ－０３００５菌株を接種して培養することを特徴とする乳酸発酵食品の製造方法。
【請求項2】
前記ＮＩＴＥ Ｐ－０２９０６菌株および／またはＮＩＴＥ Ｐ－０３００５菌株にラクトバチルス・ヘルベティカスを混合して培養する請求項１に記載の乳酸発酵食品の製造方法。
【請求項3】
乳製品原料にトマト果汁を添加する請求項１または請求項２に記載の乳酸発酵食品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
この発明は、乳酸菌を用いて乳酸発酵によりγ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を含有する食品を製造するための方法に関する。
【背景技術】
【0002】
γ－アミノ酪酸は、生体内においてグルタミン酸からの脱炭酸により生成され、抑制系の神経伝達物質としての働きを持つタンパク質非構成アミノ酸であるが、このγ－アミノ酪酸を経口摂取すると、血圧降下作用やストレス緩和作用などの生理的効果を示すことが知られている。γ－アミノ酪酸は、天然の食品中にも含まれており、その代表的なものがトマトであるが、γ－アミノ酪酸による生理的効果に注目し、近年、γ－アミノ酪酸を富化した機能性食品の開発が盛んに行われている。その中でも特に、グルタミン酸またはその塩類を多量に含有する乳製品原料を乳酸菌により乳酸発酵させ、グルタミン酸を脱炭酸させてγ－アミノ酪酸に変換させ、γ－アミノ酪酸を多く含む発酵食品を製造する方法が研究され開発されている。
【0003】
乳酸菌の種類は非常に多いが、グルタミン酸を脱炭酸させてγ－アミノ酪酸を生成する能力を持つ乳酸菌は、極く限られた種類のものしかない。また、γ－アミノ酪酸を生成する能力を持つ種類の乳酸菌であっても、栄養源となる培養基（培地）の構成により、γ－アミノ酪酸を少量しか生成しなかったり殆ど生産しなかったりすることがある。また、乳酸菌は、その分離源（由来）によって動物性乳酸菌と植物性乳酸菌とに分けられることがあるが、動物性または植物性の乳酸菌と被発酵原料（動物質または植物質）との組合せによってγ－アミノ酪酸生成能に差が出ることも考えられる。さらに、同じ菌種であっても、菌株によって大きな差があることも知られている。
【0004】
ここで、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptcoccus thermophilus）は、ラクトバチルス・ブルガリカスと共にヨーグルトの製造にスターターとして用いられる代表的な動物性乳酸菌であるが、γ－アミノ酪酸を生成する能力を持つことが知られている。例えば、乳製品をプロテアーゼ処理し、乳蛋白由来の各種ペプチドやアミノ酸を遊離させた後、グルタミン酸デカルボキシラーゼ産生能を有する乳酸菌としてストレプトコッカス・サーモフィラス等を接種して培養することにより、γ－アミノ酪酸含有発酵乳を製造する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。また、γ－アミノ酪酸を生産するストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスの組合せからなる乳酸発酵スターターを用いて豆乳の乳酸発酵を行い、豆乳に由来する独特の不快臭や不快味がなくγ－アミノ酪酸を含有する乳酸発酵豆乳を得る方法が提案されている（例えば、特許文献２参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特開２００１－１２０１７９号公報（第３－６頁）
【文献】特開２０１８－６４５２１号公報（第５－６頁、第１０－１２頁、第１３－１８頁）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
ストレプトコッカス・サーモフィラスは、動物性乳酸菌の１種であり、牛乳等の生乳、脱脂粉乳、全脂粉乳などの乳製品を原料として乳酸発酵食品を製造する場合にスターターとして用いると、乳糖（ラクトース）を栄養源として増殖し、代謝により乳酸などを生成するほか、グルタミン酸が存在すると脱炭酸によりγ－アミノ酪酸を生成する。このように、ストレプトコッカス・サーモフィラスはγ－アミノ酪酸産生能を有しているが、その能力は菌株によって大きな差があり、殆どγ－アミノ酪酸を生成しない菌株も存在する。
【0007】
この発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、高いγ－アミノ酪酸産生能を持つストレプトコッカス・サーモフィラスの菌株を見付け出し、その菌株を用いて、グルタミン酸の存在下で乳酸発酵によりγ－アミノ酪酸を多く含有する機能性乳酸発酵食品を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
この発明は、乳製品から種々の乳酸菌株を分離し、分離された乳酸菌株の中から、高いγ－アミノ酪酸産生能を持つストレプトコッカス・サーモフィラスの菌株を２つ見付け出し、その機能性を評価・確認した上で、その菌株を乳酸発酵食品の製造に用いることによって完成するに至った。
すなわち、請求項１に係る発明は、乳製品原料にグルタミン酸またはその塩類を添加し、その乳製品原料に、乳製品から分離されたストレプトコッカス・サーモフィラスＭ２０２０－１株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２９０６）（以下、単に「Ｍ２０２０－１株」という）および／またはＭ２０２０－２株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３００５）（以下、単に「Ｍ２０２０－２株」という）を接種して培養することにより乳酸発酵食品を製造することを特徴とする。
すなわち、請求項１に係る発明は、乳製品原料にグルタミン酸またはその塩類を添加し、その乳製品原料に、乳製品から分離されたストレプトコッカス・サーモフィラスＭ２０２０－１株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２９０６）（以下、単に「Ｍ２０２０－１株」という）および／またはＭ２０２０－２株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３００５）（以下、単に「Ｍ２０２０－２株」という）を接種して培養することにより乳酸発酵食品を製造することを特徴とする。
【0009】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の乳酸発酵食品の製造方法において、Ｍ２０２０－１株および／またはＭ２０２０－２株にラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactbacillus helveticus）を混合して培養することを特徴とする。
【0010】
請求項３に係る発明は、請求項１または請求項２に記載の乳酸発酵食品の製造方法において、乳製品原料にトマト果汁を添加することを特徴とする。
【発明の効果】
【0011】
請求項１に係る発明の方法により乳酸発酵食品を製造すると、γ－アミノ酪酸を多く含有する機能性乳酸発酵食品が得られる。
【0012】
請求項２に係る発明の製造方法では、より多くのγ－アミノ酪酸を含有する乳酸発酵食品が得られる。
【0013】
請求項３に係る発明の製造方法では、さらにより多くのγ－アミノ酪酸を含有する乳酸発酵食品が得られる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】この発明に係る製造方法において用いられるストレプトコッカス・サーモフィラスの菌株によるγ－アミノ酪酸産生能を確認するために行った試験結果を、従前の菌株によるγ－アミノ酪酸産生能と対比させて示すグラフである。
【図2】この発明に係る製造方法において用いられるストレプトコッカス・サーモフィラスの菌株によるγ－アミノ酪酸産生能を確認するために、図１に示したものとはグルタミン酸ナトリウムの濃度を変えて行った試験結果を、従前の菌株によるγ－アミノ酪酸産生能と対比させて示すグラフである。
【図3】この発明に係る製造方法において用いられるストレプトコッカス・サーモフィラスの菌株とラクトバチルス・ヘルベティカスとの混合培養によるγ－アミノ酪酸産生能を確認するために行った試験結果を、従前の菌株とラクトバチルス・ヘルベティカスとの混合培養によるγ－アミノ酪酸産生能と対比させて示すグラフである。
【図4】この発明に係る製造方法において用いられるストレプトコッカス・サーモフィラスの菌株とラクトバチルス・ヘルベティカスとの混合培養によるγ－アミノ酪酸産生能を確認するために、図３に示したものとはグルタミン酸ナトリウムの濃度を変えて行った試験結果を、従前の菌株とラクトバチルス・ヘルベティカスとの混合培養によるγ－アミノ酪酸産生能と対比させて示すグラフである。
【図5】この発明に係る製造方法において用いられるＭ２０２０－１株とラクトバチルス・ヘルベティカスとの混合培養によるγ－アミノ酪酸産生能を確認するために、ラクトバチルス・ヘルベティカスの菌株を変えて行った試験結果を示すグラフである。
【図6】この発明に係る製造方法において用いられるＭ２０２０－２株とラクトバチルス・ヘルベティカスとの混合培養によるγ－アミノ酪酸産生能を確認するために、ラクトバチルス・ヘルベティカスの菌株を変えて行った試験結果を示すグラフである。
【図7】この発明に係る製造方法によりそれぞれ得られた発酵乳におけるγ－アミノ酪酸および残存グルタミン酸ナトリウムの各濃度を示すグラフである。
【図8】同じく、この発明に係る製造方法によりそれぞれ得られた発酵乳におけるγ－アミノ酪酸および残存グルタミン酸ナトリウムの各濃度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、この発明の好適な実施形態について説明する。
この発明に係る方法では、各種乳製品から分離された種々の乳酸菌株の中から見付け出されたストレプトコッカス・サーモフィラスの特定の菌株、Ｍ２０２０－１株、Ｍ２０２０－２株を用い、その菌株を、グルタミン酸またはその塩類が添加された乳製品原料に接種して培養することにより、γ－アミノ酪酸を豊富に含有する機能性乳酸発酵食品を製造する。
この発明に係る方法では、各種乳製品から分離された種々の乳酸菌株の中から見付け出されたストレプトコッカス・サーモフィラスの特定の菌株、Ｍ２０２０－１株、Ｍ２０２０－２株を用い、その菌株を、グルタミン酸またはその塩類が添加された乳製品原料に接種して培養することにより、γ－アミノ酪酸を豊富に含有する機能性乳酸発酵食品を製造する。
【0016】
乳製品からの乳酸菌の分離・同定や特定菌株Ｍ２０２０－１株およびＭ２０２０－２株の選定は、以下のようにして行った。
１５種の乳製品（９種の市販のチーズおよび６種の市販のヨーグルト）のそれぞれについて、少量の乳製品を採取し、それを滅菌済みの１０％脱脂粉乳の水溶液１０ｍｌと混合し、３７℃の温度で２日間培養した。乳酸菌が増殖し固化したと認められる培養液を滅菌済みの１０％脱脂粉乳の水溶液１０ｍｌと混合し、３７℃の温度で２日間培養した。得られた培養液を、表１に示す組成のＧＹＰ培地（以下、「ＧＹＰ培地」は表１と同じ組成である）に少量添加し、３７℃の温度で１日間培養した後、炭酸カルシウムが０．５％の濃度となるように添加されたＧＹＰ寒天培地に培養物を接種し、希釈平板培養法により、乳酸菌と認められるコロニーを分離した。分離された各コロニーを形成する乳酸菌について、それぞれγ－アミノ酪酸産生能を確認するために、グルタミン酸ナトリウムが１％の濃度となるように添加されたＧＹＰ培地に乳酸菌を接種し、３７℃の温度で１週間培養した後、薄層クロマトグラフィーにより乳酸菌のγ－アミノ酪酸産生能を確認した。この結果、高いγ－アミノ酪酸産生能を有しているストレプトコッカス・サーモフィラスの２種の菌株、Ｍ２０２０－１株およびＭ２０２０－２株を分離した。
１５種の乳製品（９種の市販のチーズおよび６種の市販のヨーグルト）のそれぞれについて、少量の乳製品を採取し、それを滅菌済みの１０％脱脂粉乳の水溶液１０ｍｌと混合し、３７℃の温度で２日間培養した。乳酸菌が増殖し固化したと認められる培養液を滅菌済みの１０％脱脂粉乳の水溶液１０ｍｌと混合し、３７℃の温度で２日間培養した。得られた培養液を、表１に示す組成のＧＹＰ培地（以下、「ＧＹＰ培地」は表１と同じ組成である）に少量添加し、３７℃の温度で１日間培養した後、炭酸カルシウムが０．５％の濃度となるように添加されたＧＹＰ寒天培地に培養物を接種し、希釈平板培養法により、乳酸菌と認められるコロニーを分離した。分離された各コロニーを形成する乳酸菌について、それぞれγ－アミノ酪酸産生能を確認するために、グルタミン酸ナトリウムが１％の濃度となるように添加されたＧＹＰ培地に乳酸菌を接種し、３７℃の温度で１週間培養した後、薄層クロマトグラフィーにより乳酸菌のγ－アミノ酪酸産生能を確認した。この結果、高いγ－アミノ酪酸産生能を有しているストレプトコッカス・サーモフィラスの２種の菌株、Ｍ２０２０－１株およびＭ２０２０－２株を分離した。
【0017】
【表1】
【0018】
上記したような方法で分離されたＭ２０２０－１株およびＭ２０２０－２株が、従前のストレプトコッカス・サーモフィラスの菌株と比較して、γ－アミノ酪酸産生能において優位性を有しているかどうかを調べるために行った試験およびその結果について説明する。
［試験例１］
Ｍ２０２０－１株（図中および表中に「Ｍ２０２０－１」と表示）およびＭ２０２０－２株（図中および表中に「Ｍ２０２０－２」と表示）のほか、出願人が保有しているストレプトコッカス・サーモフィラスの２種の菌株（図中および表中にそれぞれ「ＴＨ３」、「ＴＨ４」と表示）、ならびに、一般社団法人日本乳業協会から購入したストレプトコッカス・サーモフィラスの５１０株（図中および表中に「ＴＨ５１０」と表示）、および、公益財団法人発酵研究所より分譲されたストレプトコッカス・サーモフィラスのＩＦＯ１３９５７株（図中および表中に「ＩＦＯ１３９５７」と表示）（なお、公益財団法人発酵研究所では現在、微生物の保存および分譲を行っておらず、その微生物株の保存事業は、独立行政法人製品評価技術基盤機構に引き継がれており、ストレプトコッカス・サーモフィラスのＩＦＯ１３９５７株は、同機構においてＮＢＲＣ１３９５７として保存されている。）を用い、グルタミン酸ナトリウムが１％の濃度で含有された滅菌済み（１２１℃の温度で１５分間加熱）のＧＹＰ培地にそれぞれの乳酸菌を接種し、３７℃の温度で１週間培養を行った。培養後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて培養液をアミノ酸分析し、グルタミン酸ナトリウム（図中に「ＧｌｕＮａ」と表示）の濃度およびγ－アミノ酪酸（図中に「ＧＡＢＡ」と表示）の濃度をそれぞれ測定し、グルタミン酸ナトリウムからγ－アミノ酪酸への変換効率を調べた。その試験結果を表２および図１のグラフに示す。表２中の数値は、培養液中のグルタミン酸ナトリウムおよびγ－アミノ酪酸の各濃度（ｇ／１００ｇ）を示す（表３－表７においても同じ）。
［試験例１］
Ｍ２０２０－１株（図中および表中に「Ｍ２０２０－１」と表示）およびＭ２０２０－２株（図中および表中に「Ｍ２０２０－２」と表示）のほか、出願人が保有しているストレプトコッカス・サーモフィラスの２種の菌株（図中および表中にそれぞれ「ＴＨ３」、「ＴＨ４」と表示）、ならびに、一般社団法人日本乳業協会から購入したストレプトコッカス・サーモフィラスの５１０株（図中および表中に「ＴＨ５１０」と表示）、および、公益財団法人発酵研究所より分譲されたストレプトコッカス・サーモフィラスのＩＦＯ１３９５７株（図中および表中に「ＩＦＯ１３９５７」と表示）（なお、公益財団法人発酵研究所では現在、微生物の保存および分譲を行っておらず、その微生物株の保存事業は、独立行政法人製品評価技術基盤機構に引き継がれており、ストレプトコッカス・サーモフィラスのＩＦＯ１３９５７株は、同機構においてＮＢＲＣ１３９５７として保存されている。）を用い、グルタミン酸ナトリウムが１％の濃度で含有された滅菌済み（１２１℃の温度で１５分間加熱）のＧＹＰ培地にそれぞれの乳酸菌を接種し、３７℃の温度で１週間培養を行った。培養後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて培養液をアミノ酸分析し、グルタミン酸ナトリウム（図中に「ＧｌｕＮａ」と表示）の濃度およびγ－アミノ酪酸（図中に「ＧＡＢＡ」と表示）の濃度をそれぞれ測定し、グルタミン酸ナトリウムからγ－アミノ酪酸への変換効率を調べた。その試験結果を表２および図１のグラフに示す。表２中の数値は、培養液中のグルタミン酸ナトリウムおよびγ－アミノ酪酸の各濃度（ｇ／１００ｇ）を示す（表３－表７においても同じ）。
【0019】
【表2】
【0020】
表２および図１に示した結果から分かるように、Ｍ２０２０－１株およびＭ２０２０－２株を用いて培養を行ったときは、ストレプトコッカス・サーモフィラスの他の菌株ＴＨ３株、ＴＨ４株、５１０株およびＩＦＯ１３９５７株を用いて培養を行った場合に比べて、グルタミン酸ナトリウムからγ－アミノ酪酸への変換効率の上昇が顕著であった。
【0021】
［試験例２］
ＧＹＰ培地に添加するグルタミン酸ナトリウムの含有濃度を２％に変えて、上記試験例１と同様の試験を行った。その試験結果を表３および図２のグラフに示す。
ＧＹＰ培地に添加するグルタミン酸ナトリウムの含有濃度を２％に変えて、上記試験例１と同様の試験を行った。その試験結果を表３および図２のグラフに示す。
【0022】
【表3】
【0023】
表３および図２に示した結果から分かるように、試験例１の結果と同様に、Ｍ２０２０－１株およびＭ２０２０－２株を用いて培養を行ったときは、ストレプトコッカス・サーモフィラスの他の菌株ＴＨ３株、ＴＨ４株、５１０株およびＩＦＯ１３９５７株を用いて培養を行った場合に比べて、グルタミン酸ナトリウムからγ－アミノ酪酸への変換効率の上昇が顕著であったが、γ－アミノ酪酸への変換効率は、グルタミン酸ナトリウムの含有濃度が１％である場合に比べて若干低くなった。ただし、グルタミン酸ナトリウムの含有濃度を２％にすることにより、当該濃度を１％にした場合に比べてγ－アミノ酪酸の収量は増加した。
【0024】
［試験例３］
ストレプトコッカス・サーモフィラスのＭ２０２０－１株およびＭ２０２０－２株ならびにＴＨ３株およびＴＨ４株のそれぞれと、出願人が保有しているラクトバチルス・ヘルベティカスのＨ株（図中および表中に「Ｈ」と表示）とを混合して培養したときのグルタミン酸ナトリウムからγ－アミノ酪酸への変換効率を調べた。試験条件は試験例１と同様とし、ＧＹＰ培地に添加するグルタミン酸ナトリウムの含有濃度を１％とした。その試験結果を表４および図３のグラフに示す。
ストレプトコッカス・サーモフィラスのＭ２０２０－１株およびＭ２０２０－２株ならびにＴＨ３株およびＴＨ４株のそれぞれと、出願人が保有しているラクトバチルス・ヘルベティカスのＨ株（図中および表中に「Ｈ」と表示）とを混合して培養したときのグルタミン酸ナトリウムからγ－アミノ酪酸への変換効率を調べた。試験条件は試験例１と同様とし、ＧＹＰ培地に添加するグルタミン酸ナトリウムの含有濃度を１％とした。その試験結果を表４および図３のグラフに示す。
【0025】
【表4】
【0026】
表４および図３に示した結果から分かるように、Ｍ２０２０－１株およびＭ２０２０－２株のいずれについても、ラクトバチルス・ヘルベティカスと混合培養することにより、単独培養した場合に比べて、グルタミン酸ナトリウムからγ－アミノ酪酸への変換効率が向上し、グルタミン酸ナトリウムのほぼ全量がγ－アミノ酪酸に変換された。
【0027】
［試験例４］
ＧＹＰ培地に添加するグルタミン酸ナトリウムの含有濃度を２％に変えて、上記試験例３と同様の試験を行った。その試験結果を表５および図４のグラフに示す。
ＧＹＰ培地に添加するグルタミン酸ナトリウムの含有濃度を２％に変えて、上記試験例３と同様の試験を行った。その試験結果を表５および図４のグラフに示す。
【0028】
【表5】
【0029】
表５および図４に示した結果から分かるように、試験例３の結果と同様に、Ｍ２０２０－１株およびＭ２０２０－２株のいずれについても、ラクトバチルス・ヘルベティカスと混合培養することにより、単独培養した場合に比べて、グルタミン酸ナトリウムからγ－アミノ酪酸への変換効率が向上したが、γ－アミノ酪酸への変換効率は、グルタミン酸ナトリウムの含有濃度が１％である場合に比べてほんの僅かであるが低下した。ただし、グルタミン酸ナトリウムの含有濃度を２％にすることにより、当該濃度を１％にした場合に比べてγ－アミノ酪酸の収量は増加した。
【0030】
［試験例５］
ストレプトコッカス・サーモフィラスのＭ２０２０－１株と混合培養するラクトバチルス・ヘルベティカスの菌株の違いによってγ－アミノ酪酸への変換効率が変化するかどうかを調べるために、Ｍ２０２０－１株と組み合わせるラクトバチルス・ヘルベティカスとして、出願人が保有しているＨ株、一般社団法人日本乳業協会から購入したＢ－１株（図中および表中にそれぞれ「ＨＢ－１」と表示）、独立行政法人製品評価技術基盤機構より分譲されたＮＢＲＣ１５０１９株（図中および表中にそれぞれ「Ｈ１５０１９」と表示）、および、同じく同機構より分譲されたＮＢＲＣ３８０９株（図中および表中にそれぞれ「Ｈ３８０９」と表示）を用い、混合培養を行った。試験条件は試験例１と同様とし、ＧＹＰ培地に添加するグルタミン酸ナトリウムの含有濃度を３％とした。その試験結果を表６および図５のグラフに示す。
ストレプトコッカス・サーモフィラスのＭ２０２０－１株と混合培養するラクトバチルス・ヘルベティカスの菌株の違いによってγ－アミノ酪酸への変換効率が変化するかどうかを調べるために、Ｍ２０２０－１株と組み合わせるラクトバチルス・ヘルベティカスとして、出願人が保有しているＨ株、一般社団法人日本乳業協会から購入したＢ－１株（図中および表中にそれぞれ「ＨＢ－１」と表示）、独立行政法人製品評価技術基盤機構より分譲されたＮＢＲＣ１５０１９株（図中および表中にそれぞれ「Ｈ１５０１９」と表示）、および、同じく同機構より分譲されたＮＢＲＣ３８０９株（図中および表中にそれぞれ「Ｈ３８０９」と表示）を用い、混合培養を行った。試験条件は試験例１と同様とし、ＧＹＰ培地に添加するグルタミン酸ナトリウムの含有濃度を３％とした。その試験結果を表６および図５のグラフに示す。
【0031】
【表6】
【0032】
表６および図５に示した結果から分かるように、Ｍ２０２０－１株については、ラクトバチルス・ヘルベティカスのＨ株およびＢ－１株のそれぞれと混合して培養したときに、グルタミン酸ナトリウムからγ－アミノ酪酸への変換効率が１００％となり、ＮＢＲＣ１５０１９株と混合培養したときに、グルタミン酸ナトリウムのほぼ全量がγ－アミノ酪酸に変換されたが、ＮＢＲＣ３８０９株と混合培養したときには、γ－アミノ酪酸への変換効率がそれほど高くならなかった。
【0033】
［試験例６］
ストレプトコッカス・サーモフィラスのＭ２０２０－２株と混合培養するラクトバチルス・ヘルベティカスの菌株の違いによってγ－アミノ酪酸への変換効率が変化するかどうかを調べるために、試験５と同様の試験を行った。試験条件は試験例１と同様とし、ＧＹＰ培地に添加するグルタミン酸ナトリウムの含有濃度を３％とした。その試験結果を表７および図６のグラフに示す。
ストレプトコッカス・サーモフィラスのＭ２０２０－２株と混合培養するラクトバチルス・ヘルベティカスの菌株の違いによってγ－アミノ酪酸への変換効率が変化するかどうかを調べるために、試験５と同様の試験を行った。試験条件は試験例１と同様とし、ＧＹＰ培地に添加するグルタミン酸ナトリウムの含有濃度を３％とした。その試験結果を表７および図６のグラフに示す。
【0034】
【表7】
【0035】
表７および図６に示した結果から分かるように、Ｍ２０２０－２株については、ラクトバチルス・ヘルベティカスのＨ株と混合培養したときに、グルタミン酸ナトリウムからγ－アミノ酪酸への変換効率が１００％となり、Ｂ－１株、ＮＢＲＣ１５０１９株およびＮＢＲＣ３８０９株のそれぞれと混合培養したときにも、高いγ－アミノ酪酸への変換効率を示した。
【0036】
以上の結果より、この発明に係る方法では、Ｍ２０２０－１株およびＭ２０２０－２株を乳酸発酵製品の製造に使用することとした。また、Ｍ２０２０－１株およびＭ２０２０－２株と他の乳酸菌とを混合培養するときに、他の乳酸菌としてラクトバチルス・ヘルベティカスを用いることとした。
【0037】
培養操作は、乳製品原料、例えば脱脂粉乳（スキムミルク）を水で溶解した溶液（培地）にグルタミン酸またはその塩類、例えばグルタミン酸ナトリウムを添加し、その乳製品原料にＭ２０２０－１株またはＭ２０２０－２株を接種して行われる。グルタミン酸またはその塩類の添加量は、それを多くするほどγ－アミノ酪酸の収量は増えるがγ－アミノ酪酸への変換効率が低下するので、乳製品原料中の濃度で、例えば１％～３％程度の添加量とする。乳製品原料への乳酸菌（Ｍ２０２０－１株またはＭ２０２０－２株）の接種量は、例えば３％～１０％程度とする。培養時の温度は、例えば３７℃とし、培養の時間は、例えば３日～７日間とする。また、乳製品原料に、γ－アミノ酪酸やその前駆物質であるグルタミン酸を比較的多く含んでいるトマト果汁を添加するようにしてもよい。
【0038】
Ｍ２０２０－１株とＭ２０２０－２株とは、それぞれを単独培養してもよいし、混合培養してもよい。また、Ｍ２０２０－１株、Ｍ２０２０－２株またはＭ２０２０－１株およびＭ２０２０－２株に他の乳酸菌、例えばラクトバチルス・ヘルベティカスなどを混合して培養してもよい。
【0039】
上記したようにして得られたγ－アミノ酪酸を含有する発酵乳は、二次加工されて、γ－アミノ酪酸を含有した各種の飲料や食物が製造される。例えば、発酵乳に果糖、ブドウ糖、液糖等の糖分、香料、水などを添加して味や香りを調整することにより、γ－アミノ酪酸を含有し乳酸菌を含んだ調整発酵乳や乳製品乳酸菌飲料（生菌）、乳酸菌飲料が得られ、また、その調整発酵乳等を８５℃程度の温度で加熱殺菌して容器詰めすることにより、γ－アミノ酪酸を含有した乳製品乳酸菌飲料（殺菌）が得られる。また、発酵乳を凍結乾燥または噴霧乾燥させることにより、γ－アミノ酪酸を含有した発酵乳粉末が得られ、その発酵乳粉末を飲料や食物に配合することにより、γ－アミノ酪酸を含有した清涼飲料水、青汁等の飲料、菓子類やインスタント食品などが得られ、発酵乳粉末を健康食品に添加してカプセルに充填したり圧縮成形したり造粒したりすることにより、γ－アミノ酪酸を含有したカプセル状・タブレット状・顆粒状等のサプリメントが得られる。
【実施例】
【0040】
次に、この発明の具体的な実施例について説明する。
［発酵乳の調製例１、２］
脱脂粉乳を水で溶解した溶液をオートクレーブ殺菌（１２１℃、１５分間）し、これにグルタミン酸ナトリウムを１％の濃度となるように添加して液体培地を調製し、その液体培地にストレプトコッカス・サーモフィラスのＭ２０２０－１株を５％の割合で接種し、３７℃の温度で７日間、静置培養することにより発酵乳を調製した（調製例１）。脱脂粉乳の水溶液に添加するグルタミン酸ナトリウムの含有濃度を２％に変えて、調製例１と同様の操作により発酵乳を調製した（調製例２）。
［発酵乳の調製例１、２］
脱脂粉乳を水で溶解した溶液をオートクレーブ殺菌（１２１℃、１５分間）し、これにグルタミン酸ナトリウムを１％の濃度となるように添加して液体培地を調製し、その液体培地にストレプトコッカス・サーモフィラスのＭ２０２０－１株を５％の割合で接種し、３７℃の温度で７日間、静置培養することにより発酵乳を調製した（調製例１）。脱脂粉乳の水溶液に添加するグルタミン酸ナトリウムの含有濃度を２％に変えて、調製例１と同様の操作により発酵乳を調製した（調製例２）。
【0041】
［発酵乳の調製例３、４］
脱脂粉乳を水で溶解した溶液をオートクレーブ殺菌（１２１℃、１５分間）し、これにグルタミン酸ナトリウムを１％の濃度となるように添加して液体培地を調製し、その液体培地にストレプトコッカス・サーモフィラスのＭ２０２０－２株を５％の割合で接種し、３７℃の温度で７日間、静置培養することにより発酵乳を調製した（調製例３）。脱脂粉乳の水溶液に添加するグルタミン酸ナトリウムの含有濃度を２％に変えて、調製例３と同様の操作により発酵乳を調製した（調製例４）。
脱脂粉乳を水で溶解した溶液をオートクレーブ殺菌（１２１℃、１５分間）し、これにグルタミン酸ナトリウムを１％の濃度となるように添加して液体培地を調製し、その液体培地にストレプトコッカス・サーモフィラスのＭ２０２０－２株を５％の割合で接種し、３７℃の温度で７日間、静置培養することにより発酵乳を調製した（調製例３）。脱脂粉乳の水溶液に添加するグルタミン酸ナトリウムの含有濃度を２％に変えて、調製例３と同様の操作により発酵乳を調製した（調製例４）。
【0042】
調製例１－４で得られた発酵乳における残存グルタミン酸ナトリウムの濃度およびγ－アミノ酪酸の濃度を表８および図７のグラフに示す。表８中の数値は、発酵乳中のグルタミン酸ナトリウムおよびγ－アミノ酪酸の各濃度（ｇ／１００ｇ）を示す。
【0043】
【表8】
【0044】
［発酵乳の調製例５、６］
脱脂粉乳を水で溶解した溶液をオートクレーブ殺菌（１２１℃、１５分間）し、これにグルタミン酸ナトリウムを１％の濃度となるように添加して液体培地を調製し、その液体培地に、ストレプトコッカス・サーモフィラスのＭ２０２０－１株およびＭ２０２０－２株を等量ずつ混合した乳酸菌を５％の割合で接種し、３７℃の温度で７日間、静置培養することにより発酵乳を調製した（調製例５）。脱脂粉乳の水溶液に添加するグルタミン酸ナトリウムの含有濃度を２％に変えて、調製例５と同様の操作により発酵乳を調製した（調製例６）。
脱脂粉乳を水で溶解した溶液をオートクレーブ殺菌（１２１℃、１５分間）し、これにグルタミン酸ナトリウムを１％の濃度となるように添加して液体培地を調製し、その液体培地に、ストレプトコッカス・サーモフィラスのＭ２０２０－１株およびＭ２０２０－２株を等量ずつ混合した乳酸菌を５％の割合で接種し、３７℃の温度で７日間、静置培養することにより発酵乳を調製した（調製例５）。脱脂粉乳の水溶液に添加するグルタミン酸ナトリウムの含有濃度を２％に変えて、調製例５と同様の操作により発酵乳を調製した（調製例６）。
【0045】
調製例５で得られた発酵乳における残存グルタミン酸ナトリウムの濃度は０．００４５ｇ／１００ｇであり、γ－アミノ酪酸の濃度は０．３７４８ｇ／１００ｇであった。また、調製例６で得られた発酵乳における残存グルタミン酸ナトリウムの濃度は０．００６８ｇ／１００ｇであり、γ－アミノ酪酸の濃度は０．８１６３ｇ／１００ｇであった。その結果を、「混合（１％）」および「混合（２％）」と表示して図８のグラフに示す。
【0046】
［発酵乳の調製例７、８］
脱脂粉乳を水で溶解した溶液をオートクレーブ殺菌（１２１℃、１５分間）し、これにグルタミン酸ナトリウムを１％の濃度となるように添加して液体培地を調製し、その液体培地に、ストレプトコッカス・サーモフィラスのＭ２０２０－１株およびＭ２０２０－２株ならびにラクトバチルス・ヘルベティカスを等量ずつ混合した乳酸菌を５％の割合で接種し、３７℃の温度で７日間、静置培養することにより発酵乳を調製した（調製例７）。脱脂粉乳の水溶液に添加するグルタミン酸ナトリウムの含有濃度を２％に変えて、調製例７と同様の操作により発酵乳を調製した（調製例８）。
脱脂粉乳を水で溶解した溶液をオートクレーブ殺菌（１２１℃、１５分間）し、これにグルタミン酸ナトリウムを１％の濃度となるように添加して液体培地を調製し、その液体培地に、ストレプトコッカス・サーモフィラスのＭ２０２０－１株およびＭ２０２０－２株ならびにラクトバチルス・ヘルベティカスを等量ずつ混合した乳酸菌を５％の割合で接種し、３７℃の温度で７日間、静置培養することにより発酵乳を調製した（調製例７）。脱脂粉乳の水溶液に添加するグルタミン酸ナトリウムの含有濃度を２％に変えて、調製例７と同様の操作により発酵乳を調製した（調製例８）。
【0047】
調製例７で得られた発酵乳における残存グルタミン酸ナトリウムの濃度は０．００５８ｇ／１００ｇであり、γ－アミノ酪酸の濃度は０．３９９８ｇ／１００ｇであった。また、調製例８で得られた発酵乳における残存グルタミン酸ナトリウムの濃度は０．００９７ｇ／１００ｇであり、γ－アミノ酪酸の濃度は０．８９７０ｇ／１００ｇであった。その結果を、「混合＋Ｈ（１％）」および「混合＋Ｈ（２％）」と表示して図８のグラフに示す。
【0048】
［発酵乳の調製例９、１０］
脱脂粉乳を水で溶解した溶液をオートクレーブ殺菌（１２１℃、１５分間）し、これにグルタミン酸ナトリウムを１％の濃度となるように添加し、さらにトマト果汁を２．５％の濃度となるように添加して液体培地を調製し、その液体培地に、ストレプトコッカス・サーモフィラスのＭ２０２０－１株およびＭ２０２０－２株を等量ずつ混合した乳酸菌を５％の割合で接種し、３７℃の温度で７日間、静置培養することにより発酵乳を調製した（調製例９）。脱脂粉乳の水溶液に添加するグルタミン酸ナトリウムの含有濃度を２％に変えて、調製例９と同様の操作により発酵乳を調製した（調製例１０）。
脱脂粉乳を水で溶解した溶液をオートクレーブ殺菌（１２１℃、１５分間）し、これにグルタミン酸ナトリウムを１％の濃度となるように添加し、さらにトマト果汁を２．５％の濃度となるように添加して液体培地を調製し、その液体培地に、ストレプトコッカス・サーモフィラスのＭ２０２０－１株およびＭ２０２０－２株を等量ずつ混合した乳酸菌を５％の割合で接種し、３７℃の温度で７日間、静置培養することにより発酵乳を調製した（調製例９）。脱脂粉乳の水溶液に添加するグルタミン酸ナトリウムの含有濃度を２％に変えて、調製例９と同様の操作により発酵乳を調製した（調製例１０）。
【0049】
調製例９で得られた発酵乳における残存グルタミン酸ナトリウムの濃度は０．００００ｇ／１００ｇであり、γ－アミノ酪酸の濃度は０．３７２１ｇ／１００ｇであった。また、調製例１０で得られた発酵乳における残存グルタミン酸ナトリウムの濃度は０．００４０ｇ／１００ｇであり、γ－アミノ酪酸の濃度は０．８４５７ｇ／１００ｇであった。その結果を、「混合 トマト（１％）」および「混合 トマト（２％）」と表示して図８のグラフに示す。
【0050】
［発酵乳粉末の調製例］
上記した発酵乳の調製例１で得られた発酵乳１００ｇを凍結乾燥させ、または、発酵乳１００ｇを噴霧乾燥させた。これらにより、発酵乳の粉末１０ｇが得られた。
上記した発酵乳の調製例１で得られた発酵乳１００ｇを凍結乾燥させ、または、発酵乳１００ｇを噴霧乾燥させた。これらにより、発酵乳の粉末１０ｇが得られた。
【0051】
［青汁の調製例］
上記した発酵乳粉末の調製例で得られた発酵乳粉末を使用し、ケール粉末２．９７ｇ（９９％）に対して発酵乳粉末０．００３ｇ（１％）との配合割合となるように、それぞれの粉末を秤量し、篩分けして粒度調整し、混合・攪拌・分散させて、得られた混合粉末をスティック状包装袋に充填して密封することにより青汁製品とした。
上記した発酵乳粉末の調製例で得られた発酵乳粉末を使用し、ケール粉末２．９７ｇ（９９％）に対して発酵乳粉末０．００３ｇ（１％）との配合割合となるように、それぞれの粉末を秤量し、篩分けして粒度調整し、混合・攪拌・分散させて、得られた混合粉末をスティック状包装袋に充填して密封することにより青汁製品とした。
【0052】
［インスタントみそ汁の調製例］
上記した発酵乳粉末の調製例で得られた発酵乳粉末を使用し、表９に示した配合割合となるように発酵乳粉末（表中に「ＧＡＢＡ発酵乳粉末」と表示）および各具材を秤量し、発酵乳粉末およびみそ粉末については篩分けして粒度調整し、混合・攪拌・分散させて、得られた混合物を包装袋に充填して密封することによりインスタントみそ汁製品とした。
上記した発酵乳粉末の調製例で得られた発酵乳粉末を使用し、表９に示した配合割合となるように発酵乳粉末（表中に「ＧＡＢＡ発酵乳粉末」と表示）および各具材を秤量し、発酵乳粉末およびみそ粉末については篩分けして粒度調整し、混合・攪拌・分散させて、得られた混合物を包装袋に充填して密封することによりインスタントみそ汁製品とした。
【0053】
【表9】
【0054】
［硬カプセル剤の調製例］
上記した発酵乳粉末の調製例で得られた発酵乳粉末を使用し、ゼラチンカプセル殻６３ｍｇ（２４％）に対して発酵乳粉末２００ｍｇ（７５％）、二酸化ケイ素４ｍｇ（１％）の配合割合となるように発酵乳粉末および二酸化ケイ素を秤量し、発酵乳粉末については篩分けして粒度調整し、発酵乳粉末と二酸化ケイ素とを混合・攪拌・分散させて、得られた混合物をゼラチンカプセル殻に充填して製剤化した。
上記した発酵乳粉末の調製例で得られた発酵乳粉末を使用し、ゼラチンカプセル殻６３ｍｇ（２４％）に対して発酵乳粉末２００ｍｇ（７５％）、二酸化ケイ素４ｍｇ（１％）の配合割合となるように発酵乳粉末および二酸化ケイ素を秤量し、発酵乳粉末については篩分けして粒度調整し、発酵乳粉末と二酸化ケイ素とを混合・攪拌・分散させて、得られた混合物をゼラチンカプセル殻に充填して製剤化した。
【0055】
［軟カプセル剤の調製例］
上記した発酵乳粉末の調製例で得られた発酵乳粉末を使用し、表１０に示した配合割合となるように発酵乳粉末および各材料を秤量し、発酵乳粉末については篩分けして粒度調整し、混合・攪拌・分散させて、得られた混合物を、溶解させたゼラチン被膜で被包成型した後、室温（２５℃）、湿度５０％以下の環境下で１０時間～２４時間乾燥させて製剤化した。
上記した発酵乳粉末の調製例で得られた発酵乳粉末を使用し、表１０に示した配合割合となるように発酵乳粉末および各材料を秤量し、発酵乳粉末については篩分けして粒度調整し、混合・攪拌・分散させて、得られた混合物を、溶解させたゼラチン被膜で被包成型した後、室温（２５℃）、湿度５０％以下の環境下で１０時間～２４時間乾燥させて製剤化した。
【0056】
【表10】
【0057】
［錠剤の調製例］
上記した発酵乳粉末の調製例で得られた発酵乳粉末を使用し、表１１に示した配合割合となるように発酵乳粉末および各材料を秤量し、発酵乳粉末については篩分けして粒度調整し、混合・攪拌・分散させて、得られた混合物を金型により圧縮成形して錠剤とした。
上記した発酵乳粉末の調製例で得られた発酵乳粉末を使用し、表１１に示した配合割合となるように発酵乳粉末および各材料を秤量し、発酵乳粉末については篩分けして粒度調整し、混合・攪拌・分散させて、得られた混合物を金型により圧縮成形して錠剤とした。
【0058】
【表11】
【0059】
［顆粒状サプリメントの調製例］
上記した発酵乳粉末の調製例で得られた発酵乳粉末を使用し、表１２に示した配合割合となるように発酵乳粉末および各材料を秤量し、発酵乳粉末については篩分けして粒度調整し、混合・攪拌・分散させて、得られた混合物を、水およびエタノールを用いて湿式造粒することにより、顆粒状サプリメントを製造した。
上記した発酵乳粉末の調製例で得られた発酵乳粉末を使用し、表１２に示した配合割合となるように発酵乳粉末および各材料を秤量し、発酵乳粉末については篩分けして粒度調整し、混合・攪拌・分散させて、得られた混合物を、水およびエタノールを用いて湿式造粒することにより、顆粒状サプリメントを製造した。
【0060】
【表12】
【産業上の利用可能性】
【0061】
この発明により、機能性を有する乳酸発酵食品を提供することができ、この発明は、食品分野や健康食品分野において大いに利用される可能性がある。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】