特許 7313614 骨髄増殖性腫瘍の診断

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-07-14

(45)【発行日】2023-07-25

(54)【発明の名称】骨髄増殖性腫瘍の診断

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6851 20180101AFI20230718BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20230718BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20230718BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20230718BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20230718BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6851 Z ZNA

G01N33/50 P

G01N33/53 D

G01N33/15 Z

C12N15/12

【請求項の数】 3

(21)【出願番号】P 2020514359

(86)(22)【出願日】2019-04-15

(86)【国際出願番号】 JP2019016071

(87)【国際公開番号】W WO2019203168

(87)【国際公開日】2019-10-24

【審査請求日】2022-03-31

(31)【優先権主張番号】P 2018078074

(32)【優先日】2018-04-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】502285457

【氏名又は名称】学校法人順天堂

(73)【特許権者】

【識別番号】899000068

【氏名又は名称】学校法人早稲田大学

(73)【特許権者】

【識別番号】503359821

【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】森下 総司

(72)【発明者】

【氏名】小松 則夫

(72)【発明者】

【氏名】常田 聡

(72)【発明者】

【氏名】山脇 紗耶

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 昌可

(72)【発明者】

【氏名】川路 英哉

【審査官】小田 浩代

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／１３４２３１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１６／０２６４６５５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】4 慢性骨髄性白血病/ 骨髄増殖性腫瘍，日本血液学会 造血器腫瘍診療ガイドライン[online]，2017年07月03日，URL: https://web.archive.org/web/20170703201315/http://www.jshem.or.jp/gui-hemali/1_4.html，[retrieved on 2.9.2023]

【文献】FENG, Y. X. et al.，Cancer-specific PERK signaling drives invasion and metastasis through CREB3L1，Nat. Commun.，2017年10月，Vol. 8:1079，pp. 1-10

【文献】KONDO, S. et al.，Physiological unfolded protein response regulated by OASIS family members, transmembrane bZIP transcription factors，IUBMB Life，2011年04月，Vol. 63，pp. 233-239

【文献】臼杵 憲祐，3．本態性血小板血症，日本内科学会雑誌，2007年07月，Vol. 96，pp. 1390-1397

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００

Ｇ０１Ｎ３３／００－３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

被験試料中の遺伝子CREB3L1の発現量を測定することを特徴とする、本態性血小板血症、真性赤血球増加症または真性多血症、及び骨髄線維症から選ばれる骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子測定方法であって、被験試料中の遺伝子CREB3L1の発現量が健常人の遺伝子CREB3L1の発現量に比べて多い場合に、前記骨髄増殖性腫瘍に罹患している指標とする測定法。

【請求項2】

遺伝子CREB3L1の発現量の測定が、ｍＲＮＡ又はタンパク質の測定である請求項１記載の測定法。

【請求項3】

被験試料中の遺伝子CREB3L1の発現量、または翻訳産物であるCREB3L1タンパク質を指標とする、本態性血小板血症、真性赤血球増加症または真性多血症、及び骨髄線維症から選ばれる骨髄増殖性腫瘍の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、骨髄増殖性腫瘍を正確に診断する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

骨髄増殖性腫瘍（ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ：ＭＰＮ）は、造血幹細胞レベルでの腫瘍化によって発症する疾患であり、骨髄系細胞（顆粒球、赤芽球、骨髄巨核球、肥満細胞）の著しい増殖を特徴とする。ＭＰＮには、慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＣＭＬ）、慢性好中球性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＣＮＬ）、真性赤血球増加症または真性多血症（ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ ｖｅｒａ：ＰＶ）、原発性骨髄線維症（ｐｒｉｍａｒｙ ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ：ＰＭＦ）、本態性血小板血症（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｈｅｍｉａ：ＥＴ）、慢性好酸球性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＣＥＬ）、好酸球増加症候群（ｈｙｐｅｒｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＨＥＳ）、肥満細胞症（ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、分類不能骨髄増殖性腫瘍（ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ，ｕｎｃｌａｓｓｉｆｉａｂｌｅ：ＭＰＮ，Ｕ）が含まれる。

【0003】

このうち、ＥＴ、ＰＶ、ＰＭＦに関するＷＨＯ２０１６診断基準は下記の通りである（非特許文献１）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【文献】Daniel AA, et al., The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood 127(20) pp.2391-2405 (2016)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

ＥＴでは、腫瘍原性の証明された遺伝子変異がおよそ８０％の症例で見出されるが、残り２０％の症例ではＪＡＫ２、ＣＡＬＲ、ＭＰＬ等の遺伝子変異が見出されず、診断を確定させるためには反応性（例えば正常な生体反応による一時的な血小板の増加）の可能性を除外しなければならない。ところが、腫瘍性か反応性かを鑑別することは難しい。
従って、本発明の課題は、骨髄増殖性腫瘍において腫瘍性か反応性かを確実に鑑別できる手段を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

そこで本発明者は、種々の血小板数の増加した患者の被験試料中の遺伝子発現を網羅的に検討したところ、腫瘍性と反応性とで発現量に大きな違いがあり、かつ健常人や反応性症例、骨髄増殖性腫瘍以外の疾患ではほとんど発現が見られなかったにもかかわらず、骨髄増殖性腫瘍では高い発現が認められた遺伝子CREB3L1を見出した。さらに、この遺伝子は血小板数と関係なく、骨髄増殖性腫瘍において高発現していた。すなわち、この被験試料中の遺伝子CREB3L1は、骨髄増殖性腫瘍の診断マーカーとして、また骨髄増殖性腫瘍の治療又は予防薬スクリーニングのマーカーとして有用であることを見出した。

【0007】

すなわち、本発明は、次の〔１〕～〔４〕を提供するものである。

【0008】

〔１〕被験試料中の遺伝子CREB3L1の発現量を測定することを特徴とする骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子測定方法。
〔２〕被験試料中の遺伝子CREB3L1の発現量が健常人の遺伝子CREB3L1の発現量に比べて多い場合に、骨髄増殖性腫瘍に関連すると判定する〔１〕記載の測定法。
〔３〕遺伝子CREB3L1の発現量の測定が、ｍＲＮＡ又はタンパク質の測定である〔１〕記載の測定法。
〔４〕被験試料中の遺伝子CREB3L1の発現量、または翻訳産物であるCREB3L1タンパク質を指標とする骨髄増殖性腫瘍の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、被験試料中の遺伝子CREB3L1発現量で骨髄増殖性腫瘍を診断できる。さらに、被験試料中の遺伝子CREB3L1発現量を指標とすれば、骨髄増殖性腫瘍の治療薬又は予防薬がスクリーニングできる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】遺伝子CREB3L1を含む、ＥＴと反応性症例の鑑別に有用な遺伝子を用いた、ＥＴと反応性症例の遺伝子発現プロファイルの相対的な位置関係を示す。プロットはＪＡＫ２－ＥＴ（黒四角）、ＭＰＬ－ＥＴ（黒三角）、ＣＬＡＲ－ＥＴ（菱形）、ＴＮ－ＥＴ（白丸）、反応性血小板増多症（グレー四角）を表す。

【図2】血小板中の遺伝子CREB3L1の発現量測定結果を示す。

【図3】末梢血由来のＲＮＡ中の遺伝子CREB3L1の発現量測定結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本発明は、被験試料中の遺伝子CREB3L1の発現量を測定することを特徴とする骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子測定方法である。

【0012】

検体とする試料は、骨髄増殖性腫瘍が疑われる被験者由来の試料であり、好ましくは骨髄増殖性腫瘍が疑われ、血小板数が増加している被被験者由来の試料である。血小板数の顕著な増加が認められる骨髄増殖性腫瘍としては、ＥＴ、ＰＶが挙げられる。ここで、ＥＴは血小板数のみが顕著に増加するが、赤血球数は増加しない。ＰＶは、赤血球数が顕著に増加し、血小板数が増加することもある。

【0013】

被験試料としては、血小板、巨核球等を含む生体試料であればよく、血小板、末梢血、バフィーコート、白血球、骨髄生検サンプル、骨髄穿刺サンプル、脾生検サンプル等が挙げられる。血小板としては、末梢血由来の血小板を用いることができる。例えば、末梢血から常法、例えば遠心分離法により分取した血小板濃縮分画（ＰＲＰ）を検体して用いることができる。例えば、血小板から抽出したｍＲＮＡを測定対象とすればよい。

【0014】

被験試料中の遺伝子CREB3L1の発現量の測定は、遺伝子の転写産物、すなわちｍＲＮＡの測定により行ってもよいし、遺伝子の翻訳産物、すなわちタンパク質の測定により行ってもよい。好ましくは、遺伝子の転写産物の測定により行なう。遺伝子の転写産物には、ｍＲＮＡから逆転写されて得られたｃＤＮＡも含まれる。

【0015】

遺伝子の転写産物の測定は、遺伝子CREB3L1の塩基配列の全部又は一部を含むヌクレオチドをプローブ又はプライマーとして用いて遺伝子発現の程度を測定すればよい。遺伝子発現の程度は、定量しようとする遺伝子又はその断片をターゲットとした定量ＰＣＲ法、マイクロアレイ（マイクロチップ）を用いた方法、ノーザンブロット法等で測定することが可能である。好ましくは定量ＰＣＲ法で遺伝子発現量を測定する。

【0016】

定量ＰＣＲ法としては、アガロースゲル電気泳動法、蛍光プローブ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＡＴＡＣ－ＰＣＲ法（Ｋａｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５，４６９４－４６９６，１９９７）、Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲ法（ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン法）（Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ ＴＤ，Ｍｅｔｈｏｄｓ２５，３８３－３８５，２００１）、Ｂｏｄｙ Ｍａｐ法（Ｇｅｎｅ，１７４，１５１－１５８（１９９６））、Ｓｅｒｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＳＡＧＥ）法（米国特許第５２７，１５４号、米国特許第５４４，８６１号、欧州特許公開第０７６１８２２号）、ＭＡＧＥ法（Ｍｉｃｒｏ－ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（特開２０００－２３２８８８号）等がある。リアルタイムＰＣＲとしては、例えばＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いた方法等が挙げられる。

【0017】

ＰＣＲ法は公知の手法で行うことができる。用いるプライマーの塩基長は、５～５０、好ましくは１０～３０、さらに好ましくは１５～２５である。通常、遺伝子CREB3L1の塩基配列に基づいてフォワードプライマー及びリバースプライマーが設計される。本発明の方法において遺伝子CREB3L1の塩基配列に基づいてプライマーの配列を設計することができる。

【0018】

これらの方法を用いて、上記遺伝子の全部又は一部から転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量を測定すればよい。

【0019】

ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）は、遺伝子CREB3L1の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを適当な基板上に固定化することにより作製することができる。

【0020】

固定基板としては、ガラス板、石英板、シリコンウェハーなどが挙げられる。基板の大きさとしては、例えば３．５ｍｍ×５．５ｍｍ、１８ｍｍ×１８ｍｍ、２２ｍｍ×７５ｍｍなどが挙げられるが、これは基板上のプローブのスポット数やそのスポットの大きさなどに応じて様々に設定することができる。ポリヌクレオチド又はその断片の固定化方法としては、ヌクレオチドの荷電を利用して、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミンなどのポリ陽イオンで表面処理した固相担体に静電結合させたり、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などの官能基を導入した固相表面に、アミノ基、アルデヒド基、ＳＨ基、ビオチンなどの官能基を導入したヌクレオチドを共有結合により結合させることもできる。固定化は、アレイ機を用いて行えばよい。遺伝子CREB3L1又はその断片を基板に固相化してＤＮＡマイクロアレイを作製し、該ＤＮＡマイクロアレイと蛍光物質で標識した被験試料由来のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを接触させ、ハイブリダイズさせ、ＤＮＡマイクロアレイ上の蛍光強度を測定することにより、ｍＲＮＡの種類と量を決定することができる。その結果、被験試料において発現が変動している遺伝子がわかり、遺伝子発現プロファイルを得ることができる。被験試料由来のｍＲＮＡを標識する蛍光物質は、限定されず、市販の蛍光物質を用いることができる。例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５等を用いればよい。ｍＲＮＡの標識は公知の方法で行うことができる。ＤＮＡマイクロアレイを用いた方法は、遺伝子CREB3L1のｍＲＮＡにハイブリダイズするヌクレオチドプローブの使用により測定することができる。測定に用いるプローブの塩基長は、１０～５０ｂｐ、好ましくは１５～２５ｂｐである。

【0021】

遺伝子CREB3L1の翻訳産物の測定は、翻訳されたタンパク質を検出・定量するか、又はタンパク質の活性を測定すればよい。タンパク質の検出・定量はＩＨＣ等の免疫染色法、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング法等の免疫測定法により行うことができる。

【0022】

後記実施例、特に図２に示すように、被験試料中の遺伝子CREB3L1の発現量は、ＥＴ（従来の遺伝子変異陽性及び陰性を含む）全例を含む骨髄増殖性腫瘍全例で顕著に増加しており、腫瘍性でない反応性症例（正常な生体反応による一時的な血小板の増加）、及び他の疾患では健常人とほぼ同等である。従って、被験試料中の遺伝子CREB3L1の発現量が健常人のそれよりも多い場合は、骨髄増殖性腫瘍であると診断できる。本発明においては、骨髄増殖性腫瘍の診断において、血小板数増加が反応性である症例を明確に鑑別し除外できる点において極めて重要である。

【0023】

本発明の骨髄増殖性腫瘍の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法は、被験試料中の遺伝子CREB3L1の発現量を指標とする。具体的には、例えば、骨髄増殖性腫瘍を有する動物の試料中の遺伝子CREB3L1の発現量の被験薬物投与による、変化を指標として骨髄増殖性腫瘍の治療薬又は予防薬をスクリーニングできる。被験薬物投与により、この動物の被験試料中の遺伝子CREB3L1の発現量が低下していれば、この被験薬物は骨髄増殖性腫瘍の治療又は予防に有効であると判定できる。
また、遺伝子CREB3L1の翻訳産物であるCREB3L1タンパク質を検出、もしくは定量することによる骨髄増殖性腫瘍の治療薬または予防薬のスクリーニングも可能である。

【実施例】

【0024】

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。

【0025】

試験例１（血小板由来ＲＮＡを使った網羅的遺伝子発現解析）
（方法）
ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ陽性のＥＴ（ＪＡＫ２－ＥＴ）、ＭＰＬＷ５１５Ｌ／Ｋ陽性のＥＴ（ＭＰＬ－ＥＴ）、ＣＡＬＲ変異陽性のＥＴ（ＣＡＬＲ－ＥＴ）、上記の遺伝子変異を有さないが、血小板数の増加をきたしている症例（ＴＮ）、反応性血小板増多症の患者由来末梢血から血小板ＲＮＡを取得し、その遺伝子発現データをＲＮＡ－ｓｅｑにより獲得した。ＥＴと反応性血小板増多症の遺伝子発現データをＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ（ＤＥ解析）により比較し、ＥＴまたは反応性血小板増多症で発現の高い遺伝子を抽出した。ＤＥ解析は、ＴＮ以外のデータを用いて解析した。ＤＥ解析で絞り込んだ遺伝子の発現量を用いて主成分分析（ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ：ＰＣＡ）をし、ＥＴと反応性血小板増多症を分けられるか確認した。

【0026】

（結果）
ＤＥ解析により、ＥＴと反応性血小板増多症とで発現量の異なる遺伝子を２４１種類選定し、それらのＡＵＣ値を算出した。ＡＵＣ値が０．９５より大きい値の遺伝子４８種類を候補遺伝子とした。候補遺伝子４８遺伝子の発現量を用い、収集したすべての検体を対象にＰＣＡを実施すると、図１のような結果を得た。これにより、ＥＴと反応性血小板増多症のクラスターが離れた位置にあることがわかり、候補遺伝子の発現量でＥＴと反応性血小板増多症を判別できると考えられた。一方、ＴＮは２症例を除きＥＴ側へプロットされた（図１）。
これら２症例は鉄欠乏性貧血であり、反応性血小板増多症であった。

【0027】

試験例２（CREB3L1のＰＣＲによる測定）
（方法）
（１）ＰＣＲの方法
下に示すプライマーを用いた定量的ＰＣＲ法により、血小板又は末梢血由来のＲＮＡ中のCREB3L1発現量を定量し、骨髄増殖性腫瘍、反応性血小板増多、骨髄増殖性腫瘍以外の疾患、健常者で発現量を比較した。

【0028】

（２）用いたプライマー
（ｉ）CREB3L1
GGA GAA TGC CAA CAG GAC（配列番号１）
ACC AGA ACA AAG CAC AAG G（配列番号２）
（ii）B2M（内部標準遺伝子）
CTA TCC AGC GTA CTC CAA AG（配列番号３）
ACA AGT CTG AAT GCT CCA CT（配列番号４）

【0029】

（結果）
骨髄増殖性腫瘍、反応性血小板増多、骨髄増殖性腫瘍以外の疾患及び健常者の血小板、由来のＲＮＡ中の遺伝子CREB3L1の相対発現量測定結果を図２に示す。遺伝子CREB3L1の発現量は、骨髄増殖性腫瘍に分類されるＥＴ、ＰＶ、ＰＭＦで際立って高く、反応性血小板増多症（Ｒｅ）、他疾患（ＣＭＬ）、健常人（ｈｅａｌｔｈｙ）では、ほぼ発現が見られなかった。また、末梢血由来のＲＮＡ中の遺伝子CREB3L1の発現量を骨髄増殖性腫瘍患者と健常人とで比較したところ、発現量に大きな差が見られたことから、血小板由来ＲＮＡ以外のサンプルも利用できることがわかった（図３）。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

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