特許 7313636 興奮性細胞および非興奮性細胞でＣａ２＋を画像化するための低親和性赤色蛍光指示薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-07-14

(45)【発行日】2023-07-25

(54)【発明の名称】興奮性細胞および非興奮性細胞でＣａ２＋を画像化するための低親和性赤色蛍光指示薬

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/02 20060101AFI20230718BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230718BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230718BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20230718BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20230718BHJP

   G01N 21/78 20060101ALI20230718BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20230718BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/02 ZNA

C12N15/12

C12N5/10

C07K14/47

G01N21/64 F

G01N21/78 C

C12N15/62 Z

【請求項の数】 25

(21)【出願番号】P 2020545529

(86)(22)【出願日】2019-03-01

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-06-24

(86)【国際出願番号】 CA2019050254

(87)【国際公開番号】W WO2019165563

(87)【国際公開日】2019-09-06

【審査請求日】2022-02-24

(31)【優先権主張番号】62/637,808

(32)【優先日】2018-03-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507388960

【氏名又は名称】ザ・ガバナーズ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・アルバータ

(73)【特許権者】

【識別番号】503250595

【氏名又は名称】ザ・チャンセラー・マスターズ・アンド・スカラーズ・オブ・ザ・ユニヴァーシティ・オブ・オックスフォード

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チャン、ユー － フェン

(72)【発明者】

【氏名】ウー、ジアフイ

(72)【発明者】

【氏名】ダニエルズ、マシュー ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】キャンベル、ロバート イー．

【審査官】中村 俊之

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／０４８８０８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／０３４２９８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／１９００８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１４－００１１６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／０８７５４２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Development of red fluorescent protein-based calcium ion and glutamate indicators by Jiahui Wu，A thesis submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy，2014年，p. 1- 182

【文献】Red fluorescent genetically encoded Ca２＋ indicators for use in mitochondria and endoplasmic reticulum，Biochem. J.，Vol. 464，2014年，p. 13-22

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １／００－ １９／００

Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８

Ｃ１２Ｎ １５／００－ １５／９０

Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００

Ｇ０１Ｎ ２１／６４

Ｇ０１Ｎ ２１／７８

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞内のＣａ^２＋レベルの変化を検出する方法であって、
該方法が、
ａ．蛍光性でありかつ２０μＭ超のＫｄで、Ｃａ^２＋に対する親和性を有する配列番号１２、１４、１６及び１８、並びに前記のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド、但し配列番号２を除く、からなる群から選択される１つまたは複数の低親和性Ｃａ^２＋指示薬を発現するように設計された細胞を含む試料を得るステップと；
ｂ．細胞を励起光に曝露するステップと；
ｃ．細胞を可視化または画像化することによって、ＥＲ、ＳＲおよび／またはミトコンドリアのＣａ^２＋レベルの変化を検出するステップと
を含む、上記方法。

【請求項2】

試料が、細胞培養物、幹細胞または哺乳動物血漿を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

試料が、安定な不死化細胞株の細胞培養物を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

細胞培養物がＨＬ１細胞株を含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

指示薬がレシオメトリックである、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

指示薬がインテンシオメトリックである、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

指示薬が別の蛍光指示薬と組み合わせて使用される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

単一波長を有する励起光が、指示薬と別の蛍光指示薬の両方を励起するのに使用され、前記指示薬と別の蛍光指示薬とが二つの異なる色を発光する単一波長二色画像化法を使用する、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

他の蛍光指示薬が細胞質のカルシウム指示薬である、請求項７または８に記載の方法。

【請求項10】

指示薬が、オルガネラ特異的標的化配列によりオルガネラに標的化される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

低親和性蛍光Ｃａ^２＋ポリペプチドであって、
該ポリペプチドが、蛍光性でありかつ２０μＭ超のＫｄで、Ｃａ^２＋に対する親和性を有する、配列番号１２、１４、１６及び１８、並びに前記のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドからなる群から選択され、但し配列番号２を除く、上記低親和性蛍光Ｃａ^２＋ポリペプチド。

【請求項12】

配列番号１２、１４、１６または１８のうちの１つのアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載のポリペプチド。

【請求項13】

オルガネラ特異的標的化配列をさらに含む、請求項１１または１２に記載のポリペプチド。

【請求項14】

配列番号１９の標的化配列を含む、請求項１３に記載のポリペプチド。

【請求項15】

Ｉ５４Ａ、Ｉ３３０Ｍ、およびＤ３２７Ｎ／Ｉ３３０Ｍ／Ｄ３６３Ｎからなる群から選択される配列番号４における突然変異を含む、請求項１１または１２に記載のポリペプチド。

【請求項16】

６０μＭ超のＣａ^２＋に対するＫｄを有する、請求項１１に記載のポリペプチド。

【請求項17】

請求項１１から１６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

【請求項18】

請求項１７に記載のポリヌクレオチドであって、
ａ．配列番号１１、１３、１５または１７；
ｂ．配列番号１１、１３、１５または１７のうちの１つと少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ２０μＭ超のＣａ^２＋に対するＫｄを有する蛍光Ｃａ^２＋指示薬をコードする核酸配列、但し配列番号１を除く；
ｃ．配列番号１２、１４、１６または１８のアミノ酸配列を含む蛍光Ｃａ^２＋指示薬をコードする核酸配列；および
ｄ．２０μＭ超のＣａ^２＋に対するＫｄを有し、かつ配列番号１２、１４、１６または１８のアミノ酸配列（但し配列番号２を除く）と少なくとも９０％の配列同一性を有する蛍光Ｃａ^２＋指示薬をコードする核酸配列、
からなる群から選択される核酸配列を含む、上記ポリヌクレオチド。

【請求項19】

オルガネラ特異的標的化配列をコードする配列をさらに含む、請求項１７または１８に記載のポリヌクレオチド。

【請求項20】

オルガネラ特異的標的化配列が配列番号１９をコードする、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項21】

Ｉ５４Ａ、Ｉ３３０Ｍ、およびＤ３２７Ｎ／Ｉ３３０Ｍ／Ｄ３６３Ｎからなる群から選択される配列番号４における突然変異を含む、請求項１７または１８に記載のポリヌクレオチド。

【請求項22】

請求項１７から２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項23】

請求項１７から２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列、または請求項２２に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項24】

心筋細胞である、請求項２３に記載の宿主細胞。

【請求項25】

別の蛍光カルシウム指示薬を同時発現する、請求項２３に記載の宿主細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明者：Ｙｕ－Ｆｅｎ ＣＨＡＮＧ；Ｊｉａｈｕｉ ＷＵ；Ｍａｔｔｈｅｗ Ｊ．ＤＡＮＩＥＬＳ；およびＲｏｂｅｒｔ Ｅ．ＣＡＭＰＢＥＬＬ
譲受人 アルバータ大学の理事
出願番号５５３２６．２７２ ＰＣＴ
本発明は、概して、小胞体、筋小胞体および／またはミトコンドリアに標的化され得る、低親和性蛍光Ｃａ^２＋指示薬に関する。

【背景技術】

【0002】

心臓細胞では、筋小胞体（ＳＲ）が、筋フィラメント収縮を誘発する電圧依存性Ｃａ^２＋侵入を可能にする、Ｃａ^２＋誘発性Ｃａ^２＋放出（ＣＩＣＲ）の増幅を担っている。収縮はＳＲの運動に関連しているため、運動アーチファクトを補正するには、（インテンシオメトリック（ｉｎｔｅｎｓｉｏｍｅｔｒｉｃ）と対照的に）レシオメトリック（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ）画像化アプローチが必要である。

【0003】

ミトコンドリア、小胞体（ＥＲ）、およびＳＲなどの細胞内コンパートメントは、低マイクロモル濃度から高ミリモル濃度までのカルシウムイオン（Ｃａ^２＋）濃度範囲を有する。Ｃａ^２＋濃度が高いコンパートメントでは、細胞質Ｃａ^２＋（典型的には０．１～１０μＭ範囲）の検出に最適化された蛍光指示薬が飽和し、Ｃａ^２＋濃度の生理学的に関連する変化に反応しなくなる。この課題に対処するために、遺伝子的にコードされた蛍光タンパク質（ＦＰ）を含む、低親和性Ｃａ^２＋指示薬の開発に相当な研究努力が払われてきた。合成色染料系指示薬とは対照的に、ＦＰ系指示薬は、対応するＤＮＡコード配列として細胞に送達され、特定の組織での発現のためのまたは特定の細胞内コンパートメントを標的とする追加の配列を含むことができる。

【0004】

低親和性指示薬の初期の例としては、Ｄ１ＥＲおよびＤ４ｃｐｖが挙げられ、これらは、シアンと黄色ＦＰとの間のＣａ^２＋依存性フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づいている。ＦＲＥＴ系指示薬は本質的にレシオメトリックであり、オルガネラまたは細胞の運動によるアーチファクトの画像化に左右されない定量的測定を提供する。単一ＦＰから設計された指示薬は、インテンシオメトリックになる傾向があり、多くの場合、より大きなシグナル変化を提供する。ＥＲを標的とする最初の単一ＦＰ系低親和性Ｃａ^２＋指示薬はＣａｔｃｈＥＲ（商標）であった。より最近では、いくつかの低親和性ＧＣａＭＰ型Ｃａ^２＋指示薬が発見され、これらはカルモジュリン（ＣａＭ）に融合した循環置換（ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ ｐｅｒｍｕｔａｔｅｄ）（ｃｐ）ＦＰとＣａ^２＋結合型のＣａＭに結合するペプチドで構成されている。これらには、ＣＥＰＩＡ（商標）、ＬＡＲ－ＧＥＣＯ（商標）およびＥＲ－ＧＣａＭＰ（商標）シリーズが含まれる。発光レシオメトリックである別の低親和性単一ＦＰ系Ｃａ^２＋指示薬はＧＥＭ－ＣＥＰＩＡ１ｅｒ（商標）であるが、これは、多くの場合、光毒性および自家蛍光の増加を伴う高エネルギー紫外光（４００ｎｍ以下）による励起を要する。

【0005】

多くの場合、光毒性および自家蛍光の減少を伴うので、より長い波長（すなわち、より赤方シフトしたまたは４００ｎｍ超）光で励起することができる指示薬を使用することが望ましくなり得る。

【0006】

この背景情報は、本出願人が可能性があると考えている既知の情報を本発明に関連付ける目的で提供されている。上記の情報のいずれかが本発明に対する先行技術を構成することを認めることは必ずしも意図されておらず、解釈されるべきでもない。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

一態様では、本発明は、細胞内のＣａ２＋レベルの変化を検出する方法であって、
（ａ）ＬＡＲ－ＧＥＣＯ１．５、ＬＡＲ－ＧＥＣＯ２、およびＬＡＲ－ＧＥＣＯ３、ＬＡＲ－ＧＥＣＯ４、ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ１、ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ２、ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ３、およびＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４、または前記のいずれか１つと実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群から選択される１つまたは複数の低親和性Ｃａ２＋指示薬を発現するように設計された細胞を含む試料を得るステップと；
（ｂ）細胞を励起光に曝露するステップと；
（ｃ）細胞を可視化または画像化することによって、ＥＲ、ＳＲおよび／またはミトコンドリアのＣａ２＋レベルの変化を検出するステップと
を含む方法を含み得る。

【0008】

別の態様では、本発明は、ＬＡＲ－ＧＥＣＯ１．５、ＬＡＲ－ＧＥＣＯ２、およびＬＡＲ－ＧＥＣＯ３、ＬＡＲ－ＧＥＣＯ４、ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ１、ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ２、ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ３、およびＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４、または前記のいずれか１つと実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群から選択される低親和性蛍光Ｃａ２＋ポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６または１８のうちの１つのアミノ酸配列を有し得る。

【0009】

いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、Ｉ５４Ａ、Ｉ３３０Ｍ、およびＤ３２７Ｎ／Ｉ３３０Ｍ／Ｄ３６３Ｎからなる群から選択される突然変異を含み得る。ポリペプチドは、２０μＭ、または好ましくは約６０μＭ超のＣａ^２＋に対するＫｄを有し得る。

【0010】

別の態様では、本発明は、本発明の低親和性蛍光Ｃａ２＋ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または実質的に類似のポリヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、以下からなる群から選択される核酸配列を含み得る：
（ａ）配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５または１７；
（ｂ）配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５または１７のうちの１つと少なくとも９０％の配列同一性を有し、２０μＭ超または場合により約６０μＭ超のＣａ^２＋に対するＫｄを有する蛍光Ｃａ^２＋指示薬をコードする核酸配列、但し配列番号１を除く；
（ｃ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６または１８のアミノ酸配列を含む蛍光Ｃａ２＋指示薬をコードする核酸配列；および
（ｄ）２０μＭ超または場合により約６０μＭ超の蛍光Ｃａ^２＋をコードし、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６または１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列、但し配列番号２を除く。

【0011】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、Ｉ５４Ａ、Ｉ３３０Ｍ、およびＤ３２７Ｎ／Ｉ３３０Ｍ／Ｄ３６３Ｎからなる群から選択されるアミノ酸突然変異をコードする突然変異を含む。

【0012】

他の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチド配列を含むベクターまたは宿主細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞が心筋細胞である。

【0013】

図面を参照して、本発明のいくつかの態様を、限定ではなく例として、図に詳細に示す。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】低親和性Ｃａ^２＋指示薬のエンジニアリングの概略的戦略を示す図である。

【0015】

【図2】ＬＡＲ－ＧＥＣＯ１、ＬＡＲ－ＧＥＣＯ１．５、ＬＡＲ－ＧＥＣＯ２、ＬＡＲ－ＧＥＣＯ３およびＬＡＲ－ＧＥＣＯ４のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。

【0016】

【図3】ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ１、ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ２、ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ３およびＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。

【0017】

【図4】Ｃａ^２＋に対する広範囲の親和性を有する、インテンシオメトリックおよびレシオメトリック赤色Ｃａ^２＋指示薬を示す図である。

【0018】

【図5】ＬＡＲ－ＧＥＣＯのインビトロ特性評価を示す。（図５Ａ）ＬＡＲ－ＧＥＣＯ１．５の励起スペクトルおよび発光スペクトルを示す図である。 （図５Ｄ）ＬＡＲ－ＧＥＣＯ２の励起スペクトルおよび発光スペクトルを示す図である。 （図５Ｇ）ＬＡＲ－ＧＥＣＯ３の励起スペクトルおよび発光スペクトルを示す図である。 （図５Ｊ）ＬＡＲ－ＧＥＣＯ４の励起スペクトルおよび発光スペクトルを示す図である。（図５Ｂ）Ｃａ^２＋不含状態（点線）とＣａ^２＋結合状態（実線）の両方における、ＬＡＲ－ＧＥＣＯ１．５の吸光度スペクトルおよび発光スペクトルを示す図である。 （図５Ｅ）Ｃａ^２＋不含状態（点線）とＣａ^２＋結合状態（実線）の両方における、ＬＡＲ－ＧＥＣＯ２の吸光度スペクトルおよび発光スペクトルを示す図である。 （図５Ｈ）Ｃａ^２＋不含状態（点線）とＣａ^２＋結合状態（実線）の両方における、ＬＡＲ－ＧＥＣＯ３の吸光度スペクトルおよび発光スペクトルを示す図である。 （図５Ｋ）Ｃａ^２＋不含状態（点線）とＣａ^２＋結合状態（実線）の両方における、ＬＡＲ－ＧＥＣＯ４の吸光度スペクトルおよび発光スペクトルを示す図である。（図５Ｃ）ｐＨの関数としてＬＡＲ－ＧＥＣＯ１．５の蛍光強度を示す図である。 （図５Ｆ）ｐＨの関数としてＬＡＲ－ＧＥＣＯ２の蛍光強度を示す図である。 （図５Ｉ）ｐＨの関数としてＬＡＲ－ＧＥＣＯ３の蛍光強度を示す図である。 （図５Ｌ）ｐＨの関数としてＬＡＲ－ＧＥＣＯ４の蛍光強度を示す図である。

【0019】

【図6】ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯのインビトロ特性評価を示す。（図６Ａ）ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ１の励起スペクトルおよび発光スペクトルを示す図である。 （図６Ｄ）ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ２の励起スペクトルおよび発光スペクトルを示す図である。 （図６Ｇ）ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ３の励起スペクトルおよび発光スペクトルを示す図である。 （図６Ｊ）ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４の励起スペクトルおよび発光スペクトルを示す図である。（図６Ｂ）Ｃａ^２＋不含状態（点線）とＣａ^２＋結合状態（実線）の両方における、ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ１の吸光度スペクトルおよび発光スペクトルを示す図である。 （図６Ｅ）Ｃａ^２＋不含状態（点線）とＣａ^２＋結合状態（実線）の両方における、ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ２の吸光度スペクトルおよび発光スペクトルを示す図である。 （図６Ｈ）Ｃａ^２＋不含状態（点線）とＣａ^２＋結合状態（実線）の両方における、ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ３の吸光度スペクトルおよび発光スペクトルを示す図である。 （図６Ｋ）Ｃａ^２＋不含状態（点線）とＣａ^２＋結合状態（実線）の両方における、ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４の吸光度スペクトルおよび発光スペクトルを示す図である。（図６Ｃ）ｐＨの関数としてＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ１の蛍光強度を示す図である。 （図６Ｆ）ｐＨの関数としてＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ２の蛍光強度を示す図である。 （図６Ｉ）ｐＨの関数としてＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ３の蛍光強度を示す図である。 （図６Ｌ）ｐＨの関数としてＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４の蛍光強度を示す図である。

【0020】

【図7】ＨｅＬａ細胞で発現されるＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４（ｎ＝７）が、ヒスタミン刺激後のＳＲ Ｃａ^２＋動態を検出することができることを示す図である。ΔＲ／Ｒ＝（Ｒｉｎｉｔ－Ｒ）／Ｒｉｎｉｔ＊１００％（式中、Ｒは４７０ｎｍでの励起の発光強度と５９５ｎｍでの励起の発光強度の比であり、Ｒｉｎｉｔは初期比である）。２０μΜヒスタミン適用を灰色バーで示す。

【0021】

【図8】不死化マウス心房ＨＬ１細胞株における低親和性Ｃａ^２＋指示薬の比較を示す。（図８Ａ）ＨＬ１細胞におけるＥＲ－ＬＡＲ－ＧＥＣＯ３およびＥＲ－ＬＡＲ－ＧＥＣＯ４の発現を示す図である。生細胞画像は左側で赤色に疑似カラー付けされ、共焦点顕微鏡で撮影されたＥＲ－ＬＡＲ－ＧＥＣＯ３およびＥＲ－ＬＡＲ－ＧＥＣＯ４の固定画像は右側でグレースケールで示される。（図８Ｂ）ＥＲ－ＬＡＲ－ＧＥＣＯ３による、カフェイン刺激に対する応答におけるＥＲ／ＳＲ Ｃａ^２＋の変化の観察を示す図である。 （図８Ｃ）ＥＲ－ＬＡＲ－ＧＥＣＯ４による、カフェイン刺激に対する応答におけるＥＲ／ＳＲ Ｃａ^２＋の変化の観察を示す図である。 （図８Ｄ）ＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４による、カフェイン刺激に対する応答におけるＥＲ／ＳＲ Ｃａ^２＋の変化の観察を示す図である。 （図８Ｅ）ＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４による、カフェイン刺激に対する応答におけるＥＲ／ＳＲ Ｃａ^２＋の変化の観察を示す図である。 （図８Ｆ）ＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４による、カフェイン刺激に対する応答におけるＥＲ／ＳＲ Ｃａ^２＋の変化の観察を示す図である。ＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４のレシオメトリック刺激は、４８８ｎｍ（図８Ｄ）および５９４ｎｍ（図８Ｅ）のレーザー照射で達成した。（図８Ｆ）ΔＲ／Ｒ_０トレースは（図８Ｄ）および（図８Ｅ）から計算した。（図８Ｇ）ＥＲ－ＬＡＲ－ＧＥＣＯ４（ｎ＝２１）、ＥＲ－ＬＡＲ－ＧＥＣＯ３（ｎ＝１４）、ＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ２（ｎ＝８）、ＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ１（ｎ＝７）、ＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４（ｎ＝１４）、ＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ３（ｎ＝８）、Ｒ－ＣＥＰＩＡｅｒ（ｎ＝１５）についての性能の比較を示す図である。インテンシオメトリック指示薬の場合、ΔＦ_ＳＲ＝（Ｆ_ｉｎｉｔ－Ｆ_ｃａｆ）／Ｆ_ｉｎｉｔ＊１００％（式中、Ｆは蛍光強度であり、Ｆ_ｉｎｉｔは初期強度であり、Ｆ_ｃａｆはカフェイン添加直後の強度である）。レシオメトリック指示薬の場合、ΔＲ_ＳＲ＝（Ｒ_ｉｎｉｔ－Ｒ_ｃａｆ）／Ｒ_ｉｎｉｔ＊１００％（式中、Ｒは４８８ｎｍでの励起の発光強度と５９４ｎｍでの励起の発光強度の比であり、Ｒ_ｉｎｉｔは初期比であり、Ｒ_ｃａｆはカフェイン添加直後の比である）。

【0022】

【図9】Ｇ－ＣＥＰＩＡｅｒベンチマークと比較した、ヒト胚性幹細胞由来心筋細胞（ｈＥＳ－ＣＭ）におけるＥＲ－ＬＡＲ－ＧＥＣＯおよびＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯの比較性能を示す図である。ｈＥＳ－ＣＭを、Ｇ－ＣＥＰＩＡｅｒと共に、ＥＲ－ＬＡＲ－ＧＥＣＯ、ＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯまたはＲ－ＣＥＰＩＡｅｒでコトランスフェクトした。単一細胞内の各レポーターペアからの代表的な発光シグナル（パネルの垂直ペア）を、Ｄｕａｌ Ｖｉｅｗシステムを通して同時に取得した。いくつかの細胞（すなわち、Ｒ－ＣＥＰＩＡ－Ｇ－ＣＥＰＩＡペア）は、収縮および弛緩と同時に起こる自発振動を受けた。挿入図は、０．８分から１分までのＧ－ＣＥＰＩＡｅｒおよびＲ－ＣＥＰＩＡｅｒを発現するｈＥＳ－ＣＭのタイムラプスを示す。カフェイン添加を灰色バーで示す。

【0023】

【図10】ｉＰＳＣ由来心筋細胞（ｉＰＳＣ－ＣＭ）におけるサイトゾルおよびＳＲ Ｃａ^２＋の観察を示す。細胞をＧ－ＧＥＣＯおよびＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ３でコトランスフェクトして、カフェイン刺激に対する自発活性および応答を可視化した（灰色バー）。Ｇ－ＧＥＣＯに４８８ｎｍのレーザーで照射した。ＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ３を４８８ｎｍおよび５９４ｎｍのレーザー照明によって励起した。２種類の応答が観察された。（図１０Ａ）１つの群の細胞では、カフェイン適用に対する大きな初期応答が観察されたが、自発的ＳＲ枯渇およびその後のＣａ^２＋振動のカップリングは明らかでなかったことを示す図である。 （図１０Ｂ）１つの群の細胞では、カフェイン適用に対する大きな初期応答が観察されたが、自発的ＳＲ枯渇およびその後のＣａ^２＋振動のカップリングは明らかでなかったことを示す図である。（図１０Ｃ）第２の群の細胞が、カフェイン適用の前（青色矢印）および後で、自発的ＳＲ排出と、ｉＰＳ－ＣＭで検出可能な細胞質Ｃａ^２＋の変化のカップリングを示すことを示す図である。個々の発光チャネルの強度を左側に示し、処理したレシオメトリックデータセットを右側に示す。

【0024】

【図11A】ＨＬ１細胞における、Ｇ－ＧＥＣＯ１およびＥＲ－ＬＡＲ－ＧＥＣＯ４による、カフェイン刺激に対する応答におけるサイトゾルＣａ^２＋およびＥＲ／ＳＲ Ｃａ^２＋の変化の観察を示す図である。

【図11B】ＨＬ １細胞における、Ｇ－ＧＥＣＯ１およびＥＲ－ＬＡＲ－ＧＥＣＯ３による、カフェイン刺激に対する応答におけるサイトゾルＣａ^２＋およびＥＲ／ＳＲ Ｃａ^２＋の変化の観察を示す図である。濃灰色トレースは、関連する左のｙ軸スケールバー（Ｆ／Ｆｏ（細胞））で、Ｇ－ＧＥＣＯ１細胞質発光の平均化応答を表す。濃黒色トレースは、右のｙ軸スケールバー（（Ｆ／Ｆｏ（ＳＲ））で、ＳＲ標的化赤色シフト指示薬の平均化応答を表す。個々の細胞応答を薄灰色トレースで示す。カフェイン適用を灰色バーで示す。

【0025】

【図12】ＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ３を使用したレシオメトリック測定による、ヒト胚性幹細胞由来心筋細胞（ｈＥＳ－ＣＭ）のＥＲ／ＳＲ貯蔵の特性評価を示す図である。ＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ３を４８８ｎｍおよび５９４ｎｍのレーザー照明によって励起した。カフェインはＳＲ貯蔵を枯渇させ、Ｃａ^２＋は、レシオメトリック（黒、ｉｉｉ）トレースでより明確に観察される小さなＣａ^２＋振動でゆっくり補充する。

【0026】

【図13】ｈＥＳ－ＣＭで細胞質Ｃａ^２＋（Ｇ－ＧＥＣＯ）およびＥＲ／ＳＲ Ｃａ^２＋（ＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４）を観察するための単一波長励起の実証を示している。（図１３Ａ）青色光によるＧ－ＧＥＣＯおよびＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４の励起を示す図である。ＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４の画像を共焦点顕微鏡によってさらに撮影したところ（右のグレースケール画像）、これらの細胞型で通常組織化されていない配置のＳＲを示した。（図１３Ｂ）カフェイン処理に対する応答におけるｈＥＳ－ＣＭのタイムラプスを示す図である。４８０ｎｍ ＬＥＤを使用して、Ｇ－ＧＥＣＯとＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４の両方を励起した。シグナルはデュアルビューシステムによって１０Ｈｚで同時に観測される。カフェイン適用を灰色バーで示す。

【0027】

【図14】電気ペーシング下でＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ３を使用したレシオメトリック測定によってｉＰＳＣ－ＣＭのＥＲ／ＳＲ Ｃａ^２＋動態を監視することができることを示している。（図１４Ａ）０．５Ｈｚおよび１．０Ｈｚでの電気ペーシングに応答してＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ３を発現するｉＰＳＣ－ＣＭのタイムラプスを示す図である。ＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ３を、レシオメトリック画像化を取得するために、４７０ｎｍ（ｉ）および５９５ｎｍ（ｉｉ）のＬＥＤ照明によって励起した。シグナルを２５Ｈｚで観測する。（図１４Ｂ）図１４Ａから計算したＦ／Ｆ０（式中、Ｆは蛍光強度であり、Ｆ０は静止強度である）を示す図である。Ｒは、黒線（ｉｉｉ）で示されるＦ／Ｆ０（ｅｘ４７０）／Ｆ／Ｆ０（ｅｘ５９５）の比である。細胞をＣ－Ｐａｃｅ ＥＰ（ＩＯＮ ＯＰＴＩＸ）によってペーシングし、電圧条件を１５Ｖで設定した。灰色ボックスは、細胞を電極で刺激したタイムスロットを示す。

【0028】

【図15】心筋細胞の同一性を確認するための筋節成分であるトロポニンＴおよびαアクチニンの免疫蛍光染色により、細長い外観ではなく典型的な基本の円形を示す、幹細胞由来心筋細胞の免疫蛍光特性評価を示す図である。これらの混合集団内では、細胞のごく一部が二核性であり、図１３Ａとは対照的に、細胞成熟の進化を潜在的に示す、明らかにより組織化されたＳＥＲＣＡ染色の一部の領域がある。スケールバー、１０ミクロン。ズームパネルは示される主画像から取った。

【0029】

【図16】ミトコンドリアのカルシウム動態をレシオメトリック観察するためのＨｅＬａ細胞におけるｍｔ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４の発現を示す。（図１６Ａ）ｍｔ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４の細胞内分布を示す図である。スケールバーは１０μｍを示す。（図１６Ｂ）２０μＭヒスタミンに応答して、ミトコンドリアの巨大なＣａ２＋流入が検出されたことを示す図である。ｍｔ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４を４７０ｎｍおよび５９５ｎｍのＬＥＤ照明によって励起した。ヒスタミン適用を灰色バーで示す。

【発明を実施するための形態】

【0030】

以下に示される詳細な説明および添付の図面は、本発明の種々の実施形態の説明として意図しており、発明者によって企図される唯一の実施形態を表すことを意図しているのではない。詳細な説明は、本発明の包括的な理解を提供する目的で特定の詳細を含むが、特許請求される発明は、このような特定の詳細によって限定され得ない。

【0031】

本発明の例は、有用なダイナミックレンジおよびＣａ^２＋親和性を有する新規な赤色シフト低親和性Ｃａ^２＋指示薬のツールボックス、ならびにこのような指示薬をコードするポリヌクレオチド配列を提供し得る。本明細書に記載されるＣａ^２＋指示薬は、オルガネラ特異的標的化配列を指示薬分子に融合することにより、オルガネラで選択的に発現および保持され得る。よって、これらの指示薬を、高濃度Ｃａ^２＋貯蔵、例えば培養心筋細胞のＳＲまたはミトコンドリアに標的化することができ、単独でまたは他の指示薬と組み合わせて画像化して、これまで典型的には間接的に試験されてきた疾患関連生物学の重要な側面の直接的可視化を可能にすることができる。

【0032】

いくつかの実施形態では、本発明は、ＬＡＲ－ＧＥＣＯ１（Ｋ_ｄ＝２４μＭ）［配列番号２］に由来するインテンシオメトリック赤色蛍光低親和性Ｃａ^２＋指示薬を含み得る。インテンシオメトリック赤色蛍光低親和性Ｃａ^２＋指示薬を設計するために、カルモジュリン（ＣａＭ）とニワトリ砂嚢ミオシン軽鎖キナーゼ（ＲＳ２０）からの短ペプチドとの間の相互作用を変化させ、Ｃａ^２＋に対するＣａＭの親和性を修正することによって、ＬＡＲ－ＧＥＣＯ１の解離定数を調整した。図１に関連して、本明細書に記載される赤色蛍光低親和性Ｃａ^２＋指示薬の合成でさまざまな戦略を追求した。

【0033】

第１の戦略は、元の非循環置換（ｎｃｐ）ＦＰ末端（すなわち、いわゆる「ｃａｍｇａｒｏｏ」トポロジー、指示薬のポーチにより小さなコンパニオンを搭載しているため）を元通りにしながら、ＲＳ２０のＮ末端をＣａＭのＣ末端に融合することによる、指示薬のトポロジーの修正を伴っていた。ＬＡＲ－ＧＥＣＯ１バリアントを表すためにここで使用される循環置換（ｃｐ）Ｒ－ＧＥＣＯ１（ＰＤＢ ＩＤ ４Ｉ２Ｙ）の構造を、図１Ａの左側に示す。赤色蛍光タンパク質ドメインは、カルモジュリン（橙色円柱）とＲＳ２０（灰色円柱）で構成されるＣａ^２＋結合ドメインに連結している。Ｃａ^２＋を紫色球として表す。図１Ａの右側には、非循環置換（ｎｃｐ）ＬＡＲ－ＧＥＣＯ１．５［配列番号４］の描写がある。青色線は、ｃｐリンカーまたはｎｃｐトポロジーのＣａＭ－ＲＳ２０リンカーを表す。

【0034】

代替戦略は、部位特異的突然変異誘発、例えば、ＣａＭ－ＲＳ２０界面のアラニンスキャンによるこの相互作用の弱体化、Ｃａ^２＋結合部位の外側の位置での突然変異の組み込み、またはＣａＭのＣａ^２＋結合部位への突然変異の組み込みを伴っていた。第２、第３および第４の戦略の例を図１Ｂに概略的に示す。左側に、戦略２～４の標的化残基を強調したＬＡＲ－ＧＥＣＯ１．５構造を示す。右側に、ＬＡＲ－ＧＥＣＯ１．５構造と同様に、標的化残基を強調したＲＳ２０とＣａＭの一次配列がある。

【0035】

図１に示される戦略１に基づいて、ＬＡＲ－ＧＥＣＯ１をｎｃｐトポロジーに変換して、ＣａＭとＲＳ２０がＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｖａｌ－Ａｓｐリンカーによって接続されており、ＦＰ末端が回復されているＬＡＲ－ＧＥＣＯ１．５を得た。理論に制限されるものではないが、この変更されたトポロジーには２つの可能な利点がある。１つ目は、ＲＳ２０とＣａＭとの間のリンカーを設計して、有効なＫ_ｄを潜在的に変更することができる可能性があることである。２つ目は、ＲＳ２０とＣａＭとの間の直接結合により、これらがＥＲまたはＳＲの内因性タンパク質との相互作用にあまり利用可能でなくなることである。

【0036】

ＬＡＲ－ＧＥＣＯ１．５はＬＡＲ－ＧＥＣＯ１と類似のＣａ^２＋親和性を有するが、７．４倍のＣａ^２＋に対する蛍光応答を維持しており、ｎｃｐトポロジーがこの機能に悪影響を及ぼさないことを示している。図４は、緩衝液（１０ｍＭ ＭＯＰＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．２）中の遊離Ｃａ^２＋濃度の関数としての正規化された蛍光強度を示している。ＬＡＲ－ＧＥＣＯ１．５のトレースは、ＬＡＲ－ＧＥＣＯ１と本質的に同じである。結果として、ｎｃｐトポロジーは、低親和性Ｃａ^２＋指示薬の設計およびエンジニアリングのために保持された。

【0037】

ＬＡＲ－ＧＥＣＯ１．５をテンプレートとして使用して、戦略２、３および４（ならびに／あるいはこれらの組み合わせ）を調査して、遺伝的バリアントを作成して、これらを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）コロニーの状況で発現させた。コロニーの蛍光画像化を使用して、明るい蛍光クローンを特定し、これらを選抜し、培養し、Ｃａ^２＋応答および親和性について試験した。この手順により、Ｃａ^２＋に対する親和性が低下した３つの例示的な指示薬が特定された。

【0038】

アラニンスキャン構築物の中で、Ｉｌｅ５４Ａｌａ突然変異を有する指示薬（ＬＡＲ－ＧＥＣＯ２［配列番号６］と呼ぶ）は、６０μＭのＣａ^２＋Ｋ_ｄを示し、Ｃａ^２＋に結合すると蛍光が５．７倍増加することが発見された。Ｉｌｅ３３０Ｍｅｔ突然変異に基づいて、１１０μＭのＫ_ｄを有し、Ｃａ^２＋に対する蛍光応答が７．５倍の指示薬（ＬＡＲ－ＧＥＣＯ３［配列番号８］と呼ぶ）が発見された。Ａｓｐ３２７Ａｓｎ、Ｉｌｅ３３０ＭｅｔおよびＡｓｐ３６３Ａｓｎの突然変異に基づいて、５４０μＭのＫ_ｄを有し、Ｃａ^２＋に対する蛍光応答が１３倍の指示薬（ＬＡＲ－ＧＥＣＯ４［配列番号１０］と呼ぶ）が発見された。

【0039】

ＬＡＲ－ＧＥＣＯ２、３および４の低い親和性は、特定された突然変異に関連しているため、本発明のいくつかの実施形態は、他のドメインが異なるが、同じまたは類似の機能を保持し、これらの突然変異の１つまたは複数を保持するバリアントポリペプチドを含み得る。

【0040】

ＥＲ標的化および保持配列への全ての指示薬の遺伝的融合ならびにＨｅＬａ細胞での発現は、ＥＲ局在化および明るい赤色蛍光の予想されるパターンを示した。図７は、ＨｅＬａ細胞で発現されるＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４が、ヒスタミン刺激後のＥＲ／ＳＲ Ｃａ^２＋動態を検出することができることを示している。

【表1】

【0041】

よって、表１に要約されるように、ＬＡＲ－ＧＥＣＯ２、－３および－４は、インテンシオメトリックで、親指示薬ＬＡＲ－ＧＥＣＯ１よりも親和性が低い赤色蛍光Ｃａ^２＋指示薬である。

【0042】

別の態様では、本発明は、レシオメトリック低親和性赤色ＧＥＣＯを含む。いくつかの実施形態では、これらの指示薬が、運動に対する感度を減少させ、定量的測定を改善し、二色画像化戦略で単一波長励起を可能にすることができるレシオメトリック特性を有する。よって、いくつかの実施形態では、本発明は、ここでＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯと記載される、１４６μＭ～１０２３μＭに及ぶＣａ^２＋に対する親和性を有する、少なくとも４つの新たなレシオメトリック低親和性赤色ＧＥＣＯを含む。

【0043】

これらの新規な新たな指示薬は、ｎｃｐトポロジーに設計された、以前に報告された励起レシオメトリック赤色Ｃａ^２＋指示薬であるＲＥＸ－ＧＥＣＯ１から誘導した。次いで、上記のＬＡＲ－ＧＥＣＯ３および－４を設計するために使用したのと同じ突然変異を導入して、新たな指示薬ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ１［配列番号１２］およびＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ２［配列番号１４］を作製した。図４、パネルＢは、緩衝液（１０ｍＭ ＭＯＰＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．２）中の遊離Ｃａ^２＋濃度の関数としての正規化された励起比を示している。励起比＝４８０ｎｍ／５８０ｎｍ励起蛍光強度比。Ｋ_ｄはＣａ^２＋の解離定数である。ＲＥＸ－ＧＥＣＯ１（Ｋ_ｄが２４０ｎＭ）と比較して、ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ１およびＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ２と呼ばれる新規な指示薬は、それぞれ１４６μＭおよび１０２３μＭという実質的に低いＣａ^２＋親和性をもたらす。

【0044】

他の実施形態では、ＲＥＸ－ＧＥＣＯ１のＣａＭ部分を、以前に報告されたインテンシオメトリック低親和性赤色Ｃａ^２＋指示薬であるＲ－ＣＥＰＩＡ１ｅｒのＣａＭ部分で置き換えた、さらなるＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ誘導体を作製した。ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ３［配列番号１６］と呼ばれる、結果として得られた新たな指示薬は、５６４μＭのＣａ^２＋Ｋ_ｄおよび２３倍のダイナミックレンジを示す。ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ３タンパク質をｎｃｐトポロジーに変換すると、５９３μＭという類似のＫ_ｄおよび１８倍のダイナミックレンジを有するＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４［配列番号１８］と呼ばれる別の新たな指示薬が得られた。

【0045】

ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯの特性評価を表２に要約する。

【表2】

【0046】

表３は、指示薬のカルシウム親和性の概要を提供する。これらの指示薬の特性評価を以下に記載する。

【表3】

【0047】

心筋細胞におけるＣａ^２＋動態の観察
心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）と呼ばれる心筋細胞（ｈｅａｒｔ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）では、収縮および弛緩にＣａ^２＋の周期的放出および再取り込みが必要であり、結果として、Ｃａ^２＋は収縮の重要な調節因子となる。典型的には、細胞質濃度は、拡張期範囲（約０．１μＭ遊離Ｃａ^２＋）から１桁高い収縮期範囲（約１μＭ遊離Ｃａ^２＋）まで変化する。細胞内Ｃａ^２＋緩衝は重要であるので、この変化をもたらすためには、約１００μＭの総Ｃａ^２＋が必要となる。必要なＣａ^２＋のほとんどはＳＲに由来し、ＳＲは細胞体積の一部のみを構成しているため、細胞質よりもはるかに高いＣａ^２＋濃度を含有している。結果として、低親和性Ｃａ^２＋指示薬の欠如により、ＳＲのＣａ^２＋動態の観察は困難である。このため、さまざまな化学的阻害剤の存在下または非存在下でのカフェイン誘発性ＳＲ排出に対する応答における細胞質Ｃａ^２＋の間接的測定が典型的に使用される。

【0048】

低親和性Ｃａ^２＋染料Ｆｌｕｏ－５Ｎ（Ｋ_ｄ＝９７μＭ）が、単離され、透過処理された成人の心室筋細胞におけるＳＲ Ｃａ^２＋の変化を可視化するために使用されているが、細胞質汚染なしでの特定のＳＲ負荷を達成するのが困難であり、インテンシオメトリック指示薬として、運動アーチファクトに影響されやすくなり得る。幹細胞由来心筋細胞は、心室筋細胞に見られる典型的な空間Ｔ管／ＳＲ構造を欠いており、したがって、誤った細胞質シグナルを位置情報に基づいて特定することができない。

【0049】

一実施形態では、本発明の指示薬は、これらの課題を軽減し、細胞培養物；および幹細胞由来心筋細胞で直接可視化することができる、ＳＲ Ｃａ^２＋の生理学的拍動間変化を提供することができる。

【0050】

細胞培養物で可視化されたＳＲ Ｃａ^２＋の生理学的変化

【0051】

多種多様なモデルが心血管研究で使用されている。本発明の一態様では、マウス心房心筋細胞に由来する、ＨＬ１細胞株として知られる安定な不死化細胞株の細胞培養物をモデルとして使用する。

【0052】

図８（パネルＡ、ＢおよびＣ）および図１１に関連して、ＨＬ１細胞株における細胞質Ｇ－ＧＥＣＯ１の同時発現を用いて、ＥＲ－ＬＡＲ－ＧＥＣＯ３およびＥＲ－ＬＡＲ－ＧＥＣＯ４を評価した。１０ｍＭのカフェイン添加に応答して、細胞質Ｃａ^２＋シグナルの上昇は、ＥＲ／ＳＲ Ｃａ^２＋シグナルの低下を伴い得る。

【0053】

図８、パネルＤ、ＥおよびＦに関連して、４８８ｎｍでの励起の発光強度を５９４ｎｍ励起での発光強度で割ることによって、ＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４のレシオメトリック画像化を達成した。

【0054】

図８、パネルＧに関連して、ＨＬ１細胞株におけるカフェイン刺激時の本発明のさまざまな指示薬のインテンシオメトリックまたはレシオメトリック応答（ΔＦ_ＳＲまたはΔＲ_ＳＲ）の比較は、ＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４およびＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ３が最大のシグナル変化を示す（それぞれ－７２．９＋／－１５．２％および－７６．０＋／－１６．１％変化）ことを示している。本発明はまた、ＳＲの心筋細胞における周期的な拡張期（約１０００～１５００μＭ）から収縮期（約３００～６００μＭ）のＣａ^２＋変化を検出するための、大きなダイナミックレンジおよび最適なＫ_ｄ値を有するＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４（ダイナミックレンジ１８倍、Ｋ_ｄ＝５９３μＭ）およびＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ３（ダイナミックレンジ２３倍、Ｋ_ｄ＝５６４μＭ）を実証するインビトロ特性評価を提供する。

【0055】

幹細胞で可視化されたＳＲ Ｃａ^２＋の生理学的変化
別の態様では、本明細書に記載される指示薬は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）またはヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する心筋細胞などにおける、ＳＲ Ｃａ^２＋レベルの変化の可視化を提供し得る。このような幹細胞は、遺伝性心疾患のモデル、またはインビトロでの薬物毒性および薬物スクリーニングのプラットフォームとなり得る。

【0056】

図９に関連して、緑色低親和性指示薬Ｇ－ＣＥＰＩＡｅｒ（ダイナミックレンジ４．７倍、Ｋ_ｄ＝６７２μＭを報告）を内部標準として使用して、細胞表現型の変動性および未成熟性の影響を最小限に抑えた。本明細書に記載される指示薬を、幹細胞由来心筋細胞で、緑色低親和性指示薬Ｇ－ＣＥＰＩＡｅｒと比較した。本発明は、カフェイン適用に応答して引き起こされるＳＲ Ｃａ^２＋枯渇に加えて、生理学的拍動間ＳＲ排出の可視化を可能にすることができる。

【0057】

強度トレースから、赤色指示薬の応答（ΔＦ_ＳＲ）を、Ｇ－ＣＥＰＩＡｅｒについてのペアΔＦ_ＳＲで割って、同じ細胞での比較Ｒ_{赤色／緑色}比を得ることができる（赤色チャネルからのΔＦ_ＳＲ／Ｇ－ＣＥＰＩＡｅｒからのΔＦ_ＳＲ）。ＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ３（Ｒ_{赤色／緑色}＝１．０３＋／－０．０８）これはＧ－ＣＥＰＩＡｅｒと同等に見える。ＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ３とＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４の両方（Ｒ_{赤色／緑色}＝０．７１＋／－０．０２）が、この系でＲ－ＣＥＰＩＡｅｒ（Ｒ_{赤色／緑色}＝０．６０＋／－０．０６）よりも性能が良いように見え、これはＨＬ１培養細胞株およびインビトロデータで得られた結果と一致している。例えばＧ－ＣＥＰＩＡｅｒトレースのみを使用した、細胞間の孤立した比較により、現在のインビトロ幹細胞由来心筋細胞モデルの弱点である可能性がある、個々の応答の有意な不均一性が明らかになり得る。

【0058】

レシオメトリックＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ３およびＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４指示薬は、インビトロ系で利点を提供する可能性があり、幹細胞モデルでさらに特徴付けることができる。

【0059】

いくつかのインテンシオメトリック指示薬と比較したレシオメトリックの利点は、細胞運動を自己補正することができることである。ＳＲの排出は、培養された心筋細胞の通常の振動収縮および弛緩よりも大きな運動を引き起こし得るので、これはカフェイン刺激法にとって特に問題である。このレシオメトリック画像化は、自発的拍動間Ｃａ^２＋放出および再取り込みの観察を提供する。図１２に関連して、カフェインを適用してＳＲのＣａ^２＋濃度を枯渇させた後、ＳＲへのＣａ^２＋の再取り込み中の振動を簡単に検出することができる。

【0060】

別の態様では、図１４に示されるように、電気ペーシング下でのｉＰＳＣ－ＣＭの拍動間Ｃａ^２＋濃度の変化もＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ３によって検出することができる。

【0061】

レシオメトリック指示薬は、図１２に示されるＳＲ排出および補充の情報のほとんどを捕捉するように思われる、図６に示される青緑色光スペクトルのＣａ^２＋依存性励起を有するので、本発明の実施形態は、図１３に示されるように、幹細胞由来心筋細胞におけるＧ－ＧＥＣＯ１およびＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４を使用した単一波長二色画像化を含み得る。これは、照明光源を切り替える必要性を避けるので、状況によっては望ましくなり得る、高フレームレート画像化または長時間の観察のための戦略となる。

【0062】

図９に関連して、たとえそれらが全て目に見えて収縮していたとしても、Ｇ－ＣＥＰＩＡを発現している全ての細胞で生理学的ＳＲ Ｃａ^２＋枯渇を検出することができるわけではないため、本発明は、図１０に示されるように、ｉＰＳＣ心筋細胞でのＧ－ＧＥＣＯおよびＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ３の同時発現を使用したサイトゾルＣａ^２＋観察によるＳＲ Ｃａ^２＋放出のレシオメトリック測定を可能にし得る。

【0063】

図１０パネルＢに関連して、いくつかの細胞は、初期カフェイン誘発ＳＲ Ｃａ^２＋枯渇と細胞質Ｃａ^２＋蓄積との間の初期カップリングを有するように見えるが、その後の振動は関連していないことが分かる。しかしながら、図１０パネルＣに関連して、同じ幹細胞分化からの他の細胞は、自発的サイトゾルＣａ^２＋過渡応答と隣接ＳＲのＣａ^２＋変動のカップリングを示し、カフェイン処理前のサイトゾルＣａ^２＋に寄与するＳＲ貯蔵からの生理学的Ｃａ^２＋放出を示している。カフェイン適用後、これらの細胞は、細胞質Ｃａ^２＋一過性回復の振幅とＳＲ Ｃａ^２＋含有量の段階的回復とその後の振動中の細胞質シグナルとＳＲシグナルの永続性のあるカップリングとの間の相関を示す。

【0064】

この細胞の自律的挙動は、細胞質Ｃａ^２＋トレースのみを使用しても特定できない可能性があり、インビトロ成熟の異なる段階を反映している可能性がある。これを支持して、幹細胞由来心筋細胞のごく一部がＳＥＲＣＡ（商標）などの成分に対して高次構造を発達させ、これが、図１３に示されるように、興奮と収縮のカップリングに関与していると考えられる。

【0065】

ミトコンドリアでのＣａ^２＋動態の観察
カルシウムシグナル伝達がミトコンドリア機能の調節に重要な役割を果たすことが知られている。ミトコンドリアカルシウム（Ｃａ^２＋）の過負荷は、ミトコンドリアの腫脹を誘発するアポトーシス促進方法の１つである。よって、異なる刺激に対する細胞状態または応答の予測におけるＣａ^２＋動態のリアルタイムの監視が興味深いだろう。しかしながら、ＥＲ／ＳＲと同様に、ミトコンドリアも高濃度のＣａ^２＋を含有しているので、ミトコンドリアでのカルシウムシグナル伝達の研究に使用するために最適化されたバリアントは比較的少数である。本発明の低親和性指示薬が、解決策を提供することができる。図１６は、ミトコンドリアのカルシウム動態をレシオメトリック観察するためのＨｅＬａ細胞におけるｍｔ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４の発現を示す。（図１６Ａ）ｍｔ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４の細胞内分布。スケールバーは１０μｍを示す。（Ｂ）２０μＭヒスタミンに応答して、ミトコンドリアの巨大なＣａ^２＋流入が検出された。ｍｔ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４を４７０ｎｍおよび５９５ｎｍのＬＥＤ照明によって励起した。ヒスタミン適用を灰色バーで示す。

【0066】

ポリペプチドおよびヌクレオチド配列
本発明の態様は、示されるアミノ酸配列、または実質的に類似のアミノ酸配列を有する、本明細書に記載される蛍光ポリペプチドを含む。実質的に類似のアミノ酸配列は、同じまたは類似の機能を有する、少なくともあるレベルの配列同一性を有する。多くのレベルの配列同一性がポリペプチドの同定に有用であり、このようなポリペプチドが同じまたは類似の機能または活性を有することは、当業者には十分理解されている。同一性％が９０％以上（すなわち、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）が有用となり得る。

【0067】

本発明の例では、ポリペプチドが、同様に蛍光性であり、２０μＭ超、より好ましくは約６０μＭ超のＫｄで、Ｃａ^２＋に対する低親和性を有する場合、同じまたは類似の機能を有する。しかしながら、前駆体蛍光ポリペプチドＬＡＲ－ＧＥＣＯ１およびＲＥＸ－ＧＥＣＯ１は、実質的に類似した配列を有するものとして含まれず、前駆体蛍光ポリペプチドをコードするいずれの核酸配列も含まれないことが理解されるだろう。

【0068】

本明細書で使用される場合、「核酸」はポリヌクレオチドを意味し、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを含む。核酸はまた、断片および修飾ヌクレオチドも含み得る。よって、「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」または「核酸断片」という用語は互換的に使用され、一本鎖または二本鎖であり、場合により合成、非天然または変化したヌクレオチド塩基を含有するＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ヌクレオチド（通常は５’－一リン酸型で見られる）は、以下のように１文字で表記される：「Ａ」はアデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡ）、「Ｃ」はシチジル酸またはデオキシシチジル酸、「Ｇ」はグアニル酸またはデオキシグアニル酸、「Ｕ」はウリジル酸、「Ｔ」はデオキシチミジル酸、「Ｒ」はプリン（ＡまたはＧ）、「Ｙ」はピリミジン（ＣまたはＴ）、「Ｋ」はＧまたはＴ、「Ｈ」はＡまたはＣまたはＴ、「Ｉ」はイノシン、「Ｎ」は任意のヌクレオチド。

【0069】

「相同性」、「相同な」、「実質的に類似の」および「実質的に対応する」という用語は、本明細書で互換的に使用される。これらは、１つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化が、核酸断片が遺伝子発現を媒介するまたは一定の表現型をもたらす能力に影響を及ぼさない核酸断片を指す。これらの用語はまた、最初の非修飾断片と比較して、得られる核酸断片の機能的特性を実質的に変化させない１つまたは複数のヌクレオチドの欠失または挿入などの核酸断片の修飾も指す。したがって、当業者が理解するように、本発明は特定の例示的な配列よりも多くを包含することが理解される。

【0070】

本発明はまた、本明細書に記載されるアミノ酸配列、または実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列、ならびに実質的に類似の核酸配列を含み得る。実質的に類似の核酸配列は、９０％以上の配列同一性（すなわち、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）を有し得る。

【0071】

核酸またはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較窓にわたる最大の対応のためにアラインメントされた場合に同じである、２つの配列中の核酸塩基またはアミノ酸残基を指す。よって、「配列同一性の割合」は、比較窓上で最適にアラインメントされた２つの配列を比較することによって決定される値を指し、比較窓内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントのための参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して、付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。この割合は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列中に生じる位置の数を決定して、一致した位置の数を得て、一致した位置の数を比較窓中の位置の総数で割り、この結果に１００を掛けて、配列同一性の割合を得ることによって計算される。これらの同一性は、本明細書に記載されるプログラムのいずれかの使用を含めて、当業者が決定することができる。

【0072】

配列アラインメントおよび同一性または類似性％の計算は、それだけに限らないが、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムを含む、相同配列を検出するために設計されたさまざまな比較方法を使用して決定することができる。本出願の文脈内では、配列分析ソフトウェアを分析に使用する場合、分析の結果が、特に指定されない限り、参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解される。本明細書で使用される場合、「デフォルト値」は、最初に初期化した際に元々ソフトウェアと共にロードされる値またはパラメータのセットを意味する。

【0073】

「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖメソッド」は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖとラベル付けされ（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１～１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ら（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９－１９１）、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムに見られるアラインメントメソッドに対応する。複数のアラインメントの場合、デフォルト値はＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌメソッドを使用したペアワイズアラインメントおよびタンパク質配列の同一性％の計算のデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸の場合、これらのパラメータはＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖプログラムを使用して配列をアラインメントした後、同じプログラムの「配列距離」表を表示することによって「同一性％」を取得することが可能である。

【0074】

「アラインメントのＢＬＡＳＴＮメソッド」は、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）が提供する、デフォルトパラメータを使用してヌクレオチド配列を比較するためのアルゴリズムである。

【0075】

さらに、当業者であれば、本発明に包含される実質的に類似の核酸配列が、本明細書に例示される配列、または本明細書に開示され、本明細書に開示される核酸配列のいずれかと機能的に同等であるヌクレオチド配列の任意の部分とハイブリダイズする能力（中程度にストリンジェントな条件下、例えば、０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃）によっても定義されることを認識する。ストリンジェンシー条件を調整して、遠縁の生物からの相同配列などの中程度に類似の断片から、近縁の生物からの機能的酵素を複製する遺伝子などの非常に高度に類似の断片までスクリーニングすることができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。

【0076】

「選択的にハイブリダイズする」という用語は、非標的核酸配列とのハイブリダイゼーションよりも検出可能により大きな程度（例えば、バックグラウンドに対して少なくとも２倍）および非標的核酸配列を実質的に排除する程度の、特定の核酸標的配列との核酸配列の、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での、ハイブリダイゼーションへの言及を含む。選択的ハイブリダイズ配列は、典型的には、互いに少なくとも約８０％の配列同一性、または８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性、最大１００％および１００％を含む配列同一性（すなわち、完全に相補的）を有する。

【0077】

「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、プローブがその標的配列に選択的にハイブリダイズする条件への言及を含む。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、状況によって異なる。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブと１００％相補的な標的配列を同定することができる（相同プロービング）。あるいは、より低い程度の類似性が検出されるように、ストリンジェンシー条件を調整して、配列内のいくつかのミスマッチを可能にすることができる（異種プロービング）。一般に、プローブは約１０００ヌクレオチド長未満であり、場合により５００ヌクレオチド長未満である。

【0078】

典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．５Ｍ Ｎａイオン未満、典型的にはｐＨ７．０～８．３で約０．０１～１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば、１０～５０ヌクレオチド）の場合、少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチド超）の場合、少なくとも約６０℃である条件となる。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加して達成することもできる。例示的な低ストリンジェンシー条件には、３７℃で３０～３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液によるハイブリダイゼーション、および５０～５５℃で１×～２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）での洗浄が含まれる。例示的な中程度のストリンジェンシー条件には、３７℃で４０～４５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーション、および５５～６０℃で０．５×～１×ＳＳＣでの洗浄が含まれる。例示的な高ストリンジェンシー条件には、３７℃で５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーション、および６０～６５℃で０．１×ＳＳＣでの洗浄が含まれる。

【0079】

特異性は典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、重要な因子は最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッドの場合、Ｔ_ｍはＭｅｉｎｋｏｔｈら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７～２８４（１９８４）の式から近似できる：Ｔ_ｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）－０．６１（％ｆｏｒｍ）－５００／Ｌ（式中、Ｍは一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの割合であり、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合であり、Ｌは塩基対中のハイブリッドの長さである）。Ｔ_ｍは、（定義されたイオン強度およびｐＨの下で）相補的標的配列の５０％が完全に一致したプローブにハイブリダイズする温度である。Ｔ_ｍは、１％のミスマッチごとに約１℃低下する；よって、Ｔ_ｍ、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を、所望の同一性の配列とハイブリダイズするように調整することができる。例えば。９０％超の同一性を有する配列が求められる場合、Ｔ_ｍを１０℃下げることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列とその相補物についての熱融点（Ｔ_ｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。しかしながら、厳格にストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔ_ｍ）よりも１、２、３または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる；中程度にストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔ_ｍ）よりも６、７、８、９または１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる；低ストリンジェンシー条件は、熱融点（Ｔ_ｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５または２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる。方程式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成、ならびに所望のＴ_ｍを使用して、当業者であれば、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーの変動が本質的に説明されることを理解するだろう。所望のミスマッチの程度が４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴ_ｍをもたらす場合、より高い温度を使用することができるようにＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、パートＩ、第２章「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ニューヨーク（１９９３）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２章、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク（１９９５）に見出される。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件は、少なくとも１０、３０、６０、９０、１２０または２４０分間適用することができる。

【0080】

例
本発明の実施形態を、以下の例を参照して説明する。これらの例は、例示のみのために提供される。

【0081】

例１Ａ：ＬＡＲ－ＧＥＣＯのエンジニアリング

【0082】

ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ Ｂ ｖｅｃｔｏｒ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＬＡＲ－ＧＥＣＯ１を、ＬＡＲ－ＧＥＣＯ１．５を組み立てるための最初のテンプレートとして使用した（戦略１－図１）。ＬＡＲ－ＧＥＣＯ１の開発は、許可される場合、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｕら Ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ Ｃａ２＋ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ａｎｄ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２０１４年１１月１５日；４６４（１）：１３～２２に記載されている。

【0083】

ＲＳ２０のＮ末端とＬＡＲ－ＧＥＣＯ１のＣａＭのＣ末端をアミノ酸配列（ＧＧＧＧＳＶＤ）によって接続した一方、元のｎｃｐ ＦＰ末端をオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって元通りにした。ＬＡＲ－ＧＥＣＯ２、３および４の開発につながった戦略２、３および４を調査するために、製造業者の指示に従ってＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、表４に列挙される点突然変異をＬＡＲ－ＧＥＣＯ１．５に導入した。特定の突然変異を含むオリゴヌクレオチドを、Ａｇｉｌｅｎｔのオンライン突然変異誘発プライマー設計プログラムを使用して設計した。

【表4】

【0084】

例１Ｂ：ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯのエンジニアリング
ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ１および２を設計するために、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ Ｂベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＲＥＸ－ＧＥＣＯ１を、最初に上記のようにオーバーラップ伸長ＰＣＲによってｎｃｐトポロジーに変換した。次いで、ＬＡＲ－ＧＥＣＯ３および４からの点突然変異を、前記のようにＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用してＲＥＸ－ＧＥＣＯ１のこのｎｃｐバージョンに導入して、それぞれＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ１および２を作製した。ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ３を構築するために、ＲＥＸ－ＧＥＣＯ１のＣａＭドメインを、オーバーラップ伸長ＰＣＲによってＲ－ＣＥＰＩＡ１ｅｒのＣａＭドメインに置き換えた。ｐＣＭＶ Ｒ－ＣＥＰＩＡ１ｅｒ（商標）は、Ｍａｓａｍｉｔｓｕ Ｉｉｎｏ（商標）（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号５８２１６）からの贈り物であった。ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４は、ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ３のトポロジーを上記のようにｎｃｐに変更することによって構築した。全てのＬＡＲ－ＧＥＣＯおよびＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ構成物の配列を、配列決定によって検証した。

【0085】

全てのＬＡＲ－ＧＥＣＯおよびＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯバリアントのＣａ^２＋親和性を試験するために、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ Ｂベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の各バリアントを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ１０Ｂ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に電気穿孔した。次いで、これらのバリアントを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、４００μｇ／ｍＬアンピシリン（Ｓｉｇｍａ）および０．０２％（ｗｔ／ｖｏｌ）Ｌ－アラビノース（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）を補充した１０ｃｍ ＬＢ－寒天ペトリ皿で、３７℃で一晩培養した。次いで、これらのペトリ皿を室温で２４時間置いた後、画像化した。画像化中、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーを照射するための５４２／２７ｎｍ（ＬＡＲ－ＧＥＣＯバリアントの場合）、または４３８／２４ｎｍと５４２／２７ｎｍの両方（ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯバリアントの場合）の励起フィルター、および６０９／５７ｎｍの発光フィルターを使用して、ペトリ皿ごとに画像を捉えた。次いで、各バリアントの赤色蛍光を発する単一の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーを選抜し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび０．０２％（ｗｔ／ｖｏｌ）Ｌ－アラビノースを含む４ｍＬ液体ＬＢで、３７℃で一晩培養した。次いで、製造業者の指示に従ってＢ－ＰＥＲ（商標）（Ｐｉｅｒｃｅ）によって液体ＬＢ培養物からタンパク質を抽出した。次いで、各バリアントの抽出したタンパク質溶液をＣａ^２＋滴定に供した。Ｃａ^２＋滴定では、抽出したタンパク質溶液を、さまざまな遊離Ｃａ^２＋濃度のＣａ^２＋緩衝液に添加した。Ｃａ^２＋／ＨＥＤＴＡ、およびＣａ^２＋／ＮＴＡ緩衝液を、Ｃａ^２＋飽和およびＣａ^２＋不含緩衝液（３０ｍＭ ＭＯＰＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭキレート試薬、ｐＨ７．２、１０ｍＭ Ｃａ^２＋有または無）を混合して０ｍＭ～１．３ｍＭの緩衝液Ｃａ^２＋濃度を達成することによって調製した。さまざまなＣａ^２＋濃度の各バリアントの蛍光スペクトルを、Ｓａｆｉｒｅ２（商標）蛍光マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用して記録した。次いで、これらの蛍光強度をＣａ^２＋濃度に対してプロットし、ヒルの式に当てはめて各バリアントのＣａ^２＋に対する解離定数を計算した。

【0086】

例２：インビトロ特性評価

【0087】

ＬＡＲ－ＧＥＣＯの詳細な特性評価のために、Ｗｕ Ｊ、Ｌｉｕ Ｌ、Ｍａｔｓｕｄａ Ｔ、Ｚｈａｏ Ｙ、Ｒｅｂａｎｅ Ａ、Ｄｒｏｂｉｚｈｅｖ ＭらＩｍｐｒｏｖｅｄ ｏｒａｎｇｅ ａｎｄ ｒｅｄ Ｃａ２＋ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ａｎｄ ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１３；４：９６３～９７２（Ｗｕら２０１３）に記載されるようにタンパク質を発現させ、精製した。１０ｍＭ ＥＧＴＡまたは１０ｍＭ ＣａＮＴＡ、３０ｍＭ ＭＯＰＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．２を含有する溶液でスペクトル測定を実施した。ＬＡＲ－ＧＥＣＯおよびＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯの蛍光量子収率を測定するために、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＬＳＳ－ｍＫａｔｅ２を標準として使用した。Ｃａ^２＋についての蛍光量子収率、消衰係数、ｐＫ_ａ、Ｋ_ｄの測定手順は、Ｗｕら２０１３に記載されている。Ｃａ^２＋滴定では、精製タンパク質をＣａ^２＋／ＨＥＤＴＡおよびＣａ^２＋／ＮＴＡ緩衝液に添加し、蛍光測定を上記のように実施した。

【0088】

図５に関連して、ＬＡＲ－ＧＥＣＯ１．５、ＬＡＲ－ＧＥＣＯ２、ＬＡＲ－ＧＥＣＯ３およびＬＡＲ－ＧＥＣＯ４のインビトロ特性評価は、４つ全てのｎｃｐ Ｃａ^２＋指示薬が、その前駆体であるＬＡＲ－ＧＥＣＯ１と実質的に同一のスペクトル特性を共有することを示している。さらに、これらの新たなＬＡＲ－ＧＥＣＯは、Ｃａ^２＋不含状態で類似のｐＨに対する単相性依存を示す。Ｃａ^２＋に結合すると、このｐＨへの依存が、単相性から二相性に切り替わり、これはＬＡＲ－ＧＥＣＯ１のｐＨ依存性と非常に類似である。

【0089】

図６に関連して、新たなＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯは、その前駆体であるＲＥＸ－ＧＥＣＯ１と非常に類似のスペクトル特性を共有している。さらに、これらのＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯは、ＲＥＸ－ＧＥＣＯ１と類似のｐＨ依存性プロファイルを示し、ｐＨ７～９の間に生じる比の最大のＣａ^２＋依存変化を有する。

【0090】

例３：哺乳動物細胞画像化用のプラスミド

【0091】

ＥＲ標的化配列（ＭＬＬＰＶＰＬＬＬＧＬＬＧＡＡＡＤ［配列番号１９］）およびＥＲ保持シグナル配列（ＫＤＥＬ）を含むプライマーを使用して、ＥＲ標的化ＧＥＣＯ遺伝子を作製した。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ（商標）およびＥｃｏＲＩ（商標）制限酵素（Ｔｈｅｒｍｏ）による消化に供した。消化されたＤＮＡ断片を、以前に同じ２つの酵素で消化された修飾ｐｃＤＮＡ３プラスミドと連結した。プラスミドをＧｅｎｅＪＥＴ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ）で精製し、次いで、配列決定して、挿入された遺伝子を確認した。

【0092】

例４：細胞培養条件およびトランスフェクション

【0093】

ＨＬ１細胞株を培養するために、３７℃で一晩、フラスコをゼラチン／フィブロネクチンでプレコーティングした。細胞を、補充Ｃｌａｙｃｏｍｂ Ｍｅｄｉｕｍ（商標）（１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ １２１０３Ｃ（Ｂａｔｃｈ ８Ａ０１７７））、１Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、０．１ｍＭノルエピネフリンおよび２ｍＭ Ｌ－グルタミンを含むＣｌａｙｃｏｍｂ Ｍｅｄｉｕｍ）で培養し、コンフルエントに達したら１：３に分割した。トランスフェクション試薬、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞を４８時間トランスフェクトした後、画像を取得した。

【0094】

ＯｘＦ２ヒト胚性幹細胞株を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｒ（商標）（ＫＳＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭグルタミン、１％非必須アミノ酸、１２５μＭメルカプトエタノール、０．６２５％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび４ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含有するＥＳ培地中マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上で培養した。分化の１週間前に、ＥＳコロニーを手動で切断し、ｍＴｅＳＲ１培地（商標）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）のＧｅｌｔｒｅｘ（商標）（Ｇｉｂｃｏ）コーティング６ウェルプレートに配置した。

【0095】

ヒトｉＰＳＣ由来心筋細胞（ヒトｉＰＳＣ心筋細胞－男性｜ａｘ２５０５（商標））をＡｘｏｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。細胞を６ウェルプレートのうちの２つのウェルに蒔き、ＡｘｏｌのＣａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｍｅｄｉｕｍ（商標）で８日間培養して、８０～９０％コンフルエントにした。次いで、細胞をフィブロネクチン／ゼラチン（０．５％／０．１％）でコーティングされたガラス底皿に再度蒔き、トランスフェクション試薬、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトランスフェクトした。タイロード緩衝液を最終観察に使用した。

【0096】

ＨｅＬａ細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中の自家製３５ｍｍガラス底皿で培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のトランスフェクション試薬を使用して、細胞をＣＭＶ－ｍｉｔｏ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４、ＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ３およびＥＲ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４でトランスフェクトした。

【0097】

例５：ヒト多能性幹細胞からの心筋細胞の分化

【0098】

このプロトコルは、Ｌｉａｎ Ｘ、Ｚｈａｎｇ Ｊ、Ａｚａｒｉｎ ＳＭ、Ｚｈｕ Ｋ、Ｈａｚｅｌｔｉｎｅ ＬＢ、Ｂａｏ Ｘら Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ｗｎｔ／β－ｃａｔｅｎｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｕｎｄｅｒ ｆｕｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３；８：１６２～１７５に報告される方法に基づく。ＥＳ細胞コロニーを、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して単一細胞に解離し、ｒｏｃｋ阻害剤、Ｙ２７６３２（１０μＭ）を添加したｍＴｅＳＲ１中Ｇｅｌｔｒｅｘでコーティングした６ウェルプレートに、１ウェル当たり０．５×１０^６個細胞で入れた。３日目に、８０～９０％コンフルエンスで、培地を１２μＭ ＧＳＫ－３阻害剤、ＣＨＩＲ ９９０２１Ｔｏｃｒｉｓ（商標）を含有するＲＰＭＩ／Ｂ２７（インスリンを含まないＢ２７補充－Ｇｉｂｃｏ）に交換した。２４時間後、培地を交換してＣＨＩＲを除去した。４８時間後、各ウェルからの培地の半分（１ｍｌ）を吸引し、最終濃度５μＭのｗｎｔ阻害剤、ＩＷＰ ２（商標）（Ｔｏｃｒｉｓ）を含有する新鮮なＲＰＭＩ／Ｂ２７で置き換えた。４８時間後、ＩＷＰを除去し、さらに４８時間後、培地を、インスリンを含むＲＰＭＩ＋Ｂ２７（商標）（Ｇｉｂｃｏ）に交換した。培養物をこの培地で維持し、この培地を週に２回交換した。次いで、細胞をフィブロネクチン／ゼラチン（０．５％／０．１％）でコーティングされたガラス底皿に再度蒔き、トランスフェクション試薬、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトランスフェクトした。

【0099】

例６：ｈＥＳ由来心筋細胞の特性評価のための免疫染色

【0100】

一次抗体は、マウスモノクローナル抗アクチニン（Ｓｉｇｍａ番号Ａ７８１１）、ウサギポリクローナル抗トロポニンＩ（ａｂｃａｍ、ａｂ４７００３）およびマウスモノクローナル抗ＳＥＲＣＡ２ ＡＴＰａｓｅ（商標）（ＡＢＲ番号ＭＡ３－９１０）とした。二次抗体は、Ｆａｂ断片抗マウス４８８および抗ウサギ５６８（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）とした。手順は以下の通りであった：４％パラホルムアルデヒド固定（室温で１０分間）、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ ｘ－１００（ＴＢＳＴ）で透過処理および洗浄、ＴＢＳＴ中２％ＢＳＡと０．００１％アジ化ナトリウムでブロッキング（室温で１時間）、１：２００の一次抗体（室温２時間）、ＴＢＳＴで３回洗浄（１洗浄当たり５分）、二次抗体１：１０００（室温で１時間）、ＴＢＳＴで３回洗浄（１洗浄当たり５分）、カバースリップを乾燥させ、Ｖｅｃｔｏｒｓｈｉｅｌｄ（商標）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にマウント。蛍光画像化は、４８８ｎｍおよび５４３ｎｍ励起で６３倍オイルレンズを使用してＬｅｉｃａ ＳＰ５共焦点顕微鏡で行った。

【0101】

例７：生細胞画像化条件

【0102】

非レシオメトリック画像化では、６０倍の対物レンズ（ＮＡ １．４２（商標）、Ｏｌｙｍｐｕｓ）および多波長ＬＥＤ光源（ＯｐｔｏＬＥＤ（商標）、ＣＡＲＩＮ）を備えた倒立顕微鏡（ＩＸ８１（商標）、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用した。青色（４７０ｎｍ）および緑色（５５０ｎｍ）励起を使用して、それぞれＧ－ＧＥＣＯまたはＧ－ＣＥＰＩＡおよびＬＡＲ－ＧＥＣＯを照明した。ＧＦＰフィルターセット（ＤＳ／ＦＦ０２－４８５／２０－２５、Ｔ４９５ｌｐｘｒダイクロイックミラー、およびＥＴ５２５／５０発光フィルター）を使用して、ＨＬ１細胞のＧ－ＧＥＣＯシグナルを観察した。ＲＦＰフィルターセット（ＤＳ／ＦＦ０１－５６０／２５－２５、Ｔ５６５ｌｐｘｒダイクロイックミラー、およびＥＴ６２０／６０発光フィルター）を使用して、ＨＬ１細胞のＬＡＲ－ＧＥＣＯ３およびＬＡＲ－ＧＥＣＯ４のシグナルを観察した。クワッドバンドバンドパスフィルター（ＤＳ／ＦＦ０１－３８７／４８５／５５９／６４９－２５、Ｓｅｍｒｏｃｋ）、ダイクロイッククワッドエッジビームスプリッター（ＤＳ／ＦＦ４１０／５０４／５８２／６６９－Ｄｉ０１－２５ｘ３６（商標）、Ｓｅｍｒｏｃｋ）およびクワッドバンドバンドパス発光フィルター（ＤＳ／ＦＦ０１－４４０／５２１／６０７／７００－２５（商標）、Ｓｅｍｒｏｃｋ）を含むクワッドバンドフィルターセットを使用して、ＥＳ－ＣＭでＧ－ＣＥＰＩＡとＬＡＲ－ＧＥＣＯまたはＧ－ＧＥＣＯとＬＡＲ－ＧＥＣＯを同時に観察した。蛍光シグナルは、ソフトウェア（ＣｅｌｌＲ（商標）、Ｏｌｙｍｐｕｓ）によって制御されるＥＭ－ＣＣＤカメラ（ＩｍａｇＥＭ（商標）、Ｈａｍａｍａｔｓｕ）への緑色（５２０／３０ｎｍ）および赤色（６３０／５０ｎｍ）チャネルを有するＤｕａｌ－Ｖｉｅｗシステム（ＤＣ２（商標）、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）を通して記録した。

【0103】

ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯによるＨＬ１細胞、ＥＳ－ＣＭおよびｉＰＳ－ＣＭのレシオメトリック画像化には、６３倍１．４０ ＮＡオイル対物レンズおよびマルチアルゴンイオンレーザーを備えた倒立共焦点顕微鏡ＺＥＩＳＳ ＬＳＭ７１０（商標）を使用した。ＨＬ１細胞では、ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯの赤色蛍光および遠赤色シグナルの画像を、４８８ｎｍ励起および５９４ｎｍ励起を使用して、それぞれ、５６０～７１０ｎｍおよび６３０～７２０ｎｍの波長範囲で検出した。ｉＰＳ－ＣＭでの同時のレシオメトリックＥＲと細胞質Ｃａ^２＋過渡応答では、緑色、赤色および遠赤色シグナルを、４８８ｎｍ励起および５９４ｎｍ励起を使用して、それぞれ、４９２～５４０ｎｍ、６３０～７２８ｎｍおよび６３０～７２８ｎｍの波長範囲で検出した。

【0104】

ＨｅＬａ細胞（図７および図１６）およびｉＰＳＣ－ＣＭ（図１４）でのレシオメトリック画像化では、６３倍対物レンズ（ＮＡ １．４、Ｚｅｉｓｓ）および多波長ＬＥＤ光源（ｐＥ－４０００、ＣｏｏｌＬＥＤ）を備えた倒立顕微鏡（Ｄ１、Ｚｅｉｓｓ）を使用した。青色（４７０ｎｍ）および橙色（５９５ｎｍ）励起を使用して、レシオメトリック励起のためにＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯを照明した。ＬＡＲＥＸの画像化には、ＲＦＰフィルターセット（Ｔ５９０ｌｐｘｒダイクロイックミラー、およびＥＴ ５９０ｌｐ発光フィルター）を使用した。蛍光シグナルは、ソフトウェア（ＨＣ Ｉｍａｇｅ）によって制御されるＣＭＯＳカメラ（ＯＲＣＡ－Ｆｌａｓｈ４．０ＬＴ、ＨＡＭＡＭＡＴＳＵ）を使用して記録した。

【0105】

例８：ＣＭＶ－ｍｉｔｏ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４ベクターの構築

【0106】

ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４を、以下の通りｐｃＤＮＡ３－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４（ＥＲ標的化および保持配列なし）からサブクローニングした：５’ＢａｍＨＩリンカー（ＭＴ－ＢａｍＨＩ－ＬＡＲＥＸ＿ＧＥＣＯ４－Ｆ）および３’ＨｉｎｄＩＩＩリンカー（ＭＴ－ＨｉｎｄＩＩＩ－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４－Ｒ）を有するＰＣＲプライマーを使用して、ｐｃＤＮＡ３－ＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４プラスミドから、ＥＲ標的化（ＭＬＬＰＶＰＬＬＬＧＬＬＧＡＡＡＤ［配列番号１９］）および保持配列（ＫＤＥＬ）を含まないＬＡＲＥＸ－ＧＥＣＯ４を増幅し、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＣＭＶ－ｍｉｔｏ－ＬＡＲ－ＧＥＣＯ１．２（Ａｄｄｇｅｎｅ 番号６１２４５）と連結してＬＡＲ－ＧＥＣＯ１．２断片を置き換えた。開始コドン（ＡＴＧ）を付加してＥＲ標的化配列を置き換え、終止コドン（ＴＡＡ）を保持配列の代わりに付加した。

【0107】

クローニングステップに使用されるオリゴヌクレオチドは、ＭＴ－ＢａｍＨＩ－ＬＡＲＥＸ＿ＧＥＣＯ４－Ｆ：５’－ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＴ－３’［配列番号２０］およびＭＴ－ＨｉｎｄＩＩＩ－ＬＡＲＥＸ＿ＧＥＣＯ４－Ｒ：５’－ＧＡＴＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣ－３’［配列番号２１］である。

【0108】

配列表
本出願に関連する配列表は、ｅ－ＰＣＴを介して電子形式で提出され、全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は５５３２６－２７２－Ｍａｒ１－２０１９．ｔｘｔである。テキストファイルのサイズは４８ＫＢであり、テキストファイルは２０１９年３月１日に作成された。

【0109】

解釈
本発明の説明を、例示および説明の目的で提示してきたが、網羅的であること、または開示される形態の発明に限定されることは意図していない。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、多くの修正および変形が当業者には明らかであるだろう。本発明の原理および実際の用途を最もよく説明し、当業者が、企図される特定の使用に適したさまざまな修正を加えたさまざまな実施形態について発明を理解できるようにするために、実施形態を選択し、説明した。以下の説明が本発明の具体的な実施形態または特定の使用に関するものである限り、それは例示のみを意図しており、特許請求される発明を限定するものではない。

【0110】

本明細書に添付される特許請求の範囲における全ての手段またはステップと機能要素の対応する構造、材料、作用および等価物は、具体的に特許請求される他の特許請求される要素と組み合わせて機能を実施するための任意の構造、材料または作用を含むことを意図している。

【0111】

本明細書における「一実施形態」、「ある実施形態」等への言及は、記載される実施形態が特定の態様、特徴、構造または特性を含み得るが、全ての実施形態がその態様、特徴、構造または特性を必ずしも含むわけではないことを示す。さらに、このような句は、必ずしもそうではないが、本明細書の他の部分で言及される同じ実施形態を指す場合がある。さらに、特定の態様、特徴、構造または特性がある実施形態に関連して記載されている場合、このような結びつきまたは組み合わせが明示的に記載されているかどうかにかかわらず、このような態様、特徴、構造または特性を他の実施形態に組み合わせる、影響を及ぼすまたは結びつけることは当業者の知識の範囲内である。換言すれば、２つの間に自明のもしくは本質的な矛盾がない限り、または明示的に除外されない限り、任意の要素または特徴を、異なる実施形態において任意の他の要素または特徴と組み合わせることができる。

【0112】

特許請求の範囲は、任意選択の要素を排除するように起草され得ることにさらに留意されたい。よって、この記載は、特許請求される要素の列挙に関しての「単独で」、「のみ」などの排他的用語の使用または「否定的」な限定の使用に対する先行する基礎として役立つことを意図している。「好ましくは」、「好ましい」、「好む」、「場合により」、「であり得る」および同様の用語は、言及される項目、条件またはステップが本発明の任意の（必須ではない）特徴であることを示すために使用される。

【0113】

単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。「および／または」という用語は、この用語が関連する項目のいずれか１つ、項目の任意の組み合わせ、または項目の全てを意味する。

【0114】

当業者によって理解されるように、特に記述された説明を提供することに関して、ありとあらゆる目的のために、本明細書に列挙される全ての範囲は、ありとあらゆる可能な部分範囲およびその部分範囲の組み合わせ、ならびにその範囲を構成する個々の値、特に整数値も包含する。列挙された範囲（例えば、重量パーセントまたは炭素基）には、その範囲内のそれぞれの具体的な値、整数、小数または同一性が含まれる。列挙された範囲は、同範囲を十分に記載し、これを少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１または１０分の１に分解できるようにするものとして容易に認識され得る。非限定的な例として、本明細書に論じられるいずれの範囲も、下３分の１、中３分の１および上３分の１等に容易に分解することができる。

【0115】

また、当業者によって理解されるように、「～まで（ｕｐ ｔｏ）」、「少なくとも（ａｔ ｌｅａｓｔ）」、「超（ｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎ）」、「未満（ｌｅｓｓ ｔｈａｎ）」、「超（ｍｏｒｅ ｔｈａｎ）」、「以上（ｏｒ ｍｏｒｅ）」などの、本明細書に記載される全ての範囲および全ての言語は、列挙された数を含み、このような用語は、後に上に論じられる部分範囲に分解することができる範囲を指す。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6-1】

【図6-2】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【配列表】

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