特許 7313684 抗ＧＰ７３抗体及びイムノコンジュゲート

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-07-14

(45)【発行日】2023-07-25

(54)【発明の名称】抗ＧＰ７３抗体及びイムノコンジュゲート

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20230718BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20230718BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230718BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230718BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230718BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230718BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20230718BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230718BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230718BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230718BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20230718BHJP

   A61K 31/537 20060101ALI20230718BHJP

   A61K 31/704 20060101ALI20230718BHJP

   A61K 31/5517 20060101ALI20230718BHJP

   A61K 31/706 20060101ALI20230718BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230718BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20230718BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20230718BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20230718BHJP

   G01N 33/536 20060101ALI20230718BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20230718BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

C12N15/13

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61P35/00

A61P35/02

A61K45/00

A61K47/68

A61K31/537

A61K31/704

A61K31/5517

A61K31/706

A61K39/395 D

A61K39/395 N

G01N33/53 N

G01N33/574 A

G01N33/48 P

G01N33/536 C

G01N33/536 D

G01N33/53 Y

C12N5/0783

【請求項の数】 49

(21)【出願番号】P 2019547778

(86)(22)【出願日】2017-11-21

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-04-23

(86)【国際出願番号】 EP2017079870

(87)【国際公開番号】W WO2018091724

(87)【国際公開日】2018-05-24

【審査請求日】2020-09-03

(31)【優先権主張番号】16199882.8

(32)【優先日】2016-11-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】519177426

【氏名又は名称】キュレアブ ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】ステナー－リーヴェン， フランク

(72)【発明者】

【氏名】マークリー， ノルベルト

(72)【発明者】

【氏名】リーヴェン， ハイケ

【審査官】藤澤 雅樹

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１０５６９９６５３（ＣＮ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５１６０４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５３１７５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１６／０３７９８５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１６－５３３７２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５１５１３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０５７３４０５９（ＣＮ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】Collin Bachert, et al，Traffic，2007年07月29日，8.10，1415-1423，https://doi.org/10.1111/j.1600-0854.2007.00621.x

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＧＰ７３又はその抗原部分に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）ＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＭＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３０）；
ｂ）ＳＳＲＳＶＥＬＱＴＲＩＶＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３１）；及び／又は
ｃ）ＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＶＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３２）
のアミノ酸配列内のエピトープに結合し、且つ細胞内に内部移行される、抗体又はその抗原結合断片。

【請求項2】

エピトープがアミノ酸配列ＲＩＭＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３３）内にある、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項3】

抗体又はその抗原結合断片が二重特異性抗体である、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項4】

モノクローナル抗体、キメラ抗体、組換え抗体、組換え抗体の抗原結合断片、ヒト化抗体、又はファージの表面に提示されるか若しくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の表面に提示される抗体である、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項5】

ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体である、請求項４に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項6】

配列番号４に記載のＣＤＲ１、配列番号５に記載のＣＤＲ２、及び配列番号６に記載のＣＤＲ３を含む可変重（ＶＨ）鎖と、配列番号７に記載のＣＤＲ１、配列番号８に記載のＣＤＲ２、及び配列番号９に記載のＣＤＲ３を含む可変軽（ＶＬ）鎖とを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項7】

配列番号２若しくは配列番号３５のアミノ酸配列、又は配列番号２若しくは配列番号３５に対して９０％の配列同一性を有する配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列、及び
配列番号３若しくは配列番号３６のアミノ酸配列、又は配列番号３若しくは配列番号３６に対して９０％の配列同一性を有する配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含む、請求項６に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項8】

配列番号１２に記載のＣＤＲ１、配列番号１３に記載のＣＤＲ２、及び配列番号１４に記載のＣＤＲ３を含む可変重（ＶＨ）鎖と、配列番号１５に記載のＣＤＲ１、配列番号１６に記載のＣＤＲ２、及び配列番号１７に記載のＣＤＲ３を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列とを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項9】

配列番号１０若しくは配列番号３７のアミノ酸配列、又は配列番号１０若しくは配列番号３７に対して９０％の配列同一性を有する配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列、及び
配列番号１１若しくは配列番号３８のアミノ酸配列、又は配列番号１１若しくは配列番号３８に対して９０％の配列同一性を有する配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含む、請求項８に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項10】

抗原結合断片がＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片又はＦｖ断片である、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項11】

ＧＰ７３又はその抗原部分に特異的に結合する抗体の可変重（ＶＨ）鎖配列及び可変軽（ＶＬ）鎖配列をコードするポリヌクレオチドであって、抗体が、
ａ）ＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＭＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３０）；
ｂ）ＳＳＲＳＶＥＬＱＴＲＩＶＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３１）；及び／又は
ｃ）ＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＶＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３２）
のアミノ酸配列内のエピトープに結合し、且つ細胞内に内部移行される、ポリヌクレオチド。

【請求項12】

請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。

【請求項13】

請求項１２に記載の宿主細胞を培養することを含む、ＧＰ７３又はその抗原部分に特異的に結合する抗体を製造するための方法であって、抗体が、
ａ）ＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＭＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３０）；
ｂ）ＳＳＲＳＶＥＬＱＴＲＩＶＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３１）；及び／又は
ｃ）ＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＶＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３２）
のアミノ酸配列内のエピトープに結合し、且つ細胞内に内部移行されるものである、方法。

【請求項14】

ＧＰ７３又はその抗原部分に特異的に結合する抗体を製造するための方法であって、抗体が、
ａ）ＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＭＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３０）；
ｂ）ＳＳＲＳＶＥＬＱＴＲＩＶＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３１）；及び／又は
ｃ）ＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＶＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３２）
のアミノ酸配列内のエピトープに結合し、且つ細胞内に内部移行されるものであり、
ａ）ＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＭＥＬＥＧＲＶＲＲ （配列番号３０）；
ｂ）ＳＳＲＳＶＥＬＱＴＲＩＶＥＬＥＧＲＶＲＲ （配列番号３１）；及び
ｃ）ＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＶＥＬＥＧＲＶＲＲ （配列番号３２）
から選択されるポリペプチドを非ヒト対象に投与することを含む、方法。

【請求項15】

請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体と、細胞傷害性剤又は細胞傷害性剤のプロドラッグとを含む、イムノコンジュゲート。

【請求項16】

式Ａｂ（－Ｌ－Ｄ）ｐ
（式中：
ａ）Ａｂは、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体であり；
ｂ）Ｌは、リンカーであり；
ｃ）Ｄは、細胞傷害性剤であり；且つ
ｄ）ｐは、１－８の範囲である）
を有する請求項１５に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項17】

細胞傷害性剤が、メイタンシノイド、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン及びネモルビシン誘導体から選択される、請求項１５又は１６に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項18】

Ｄが式Ａ：

[式中、
波線はリンカーへの共有結合部位を示し；
点線は、二重結合の任意選択の存在を示し（二重結合は、例えばＣ１とＣ２、又はＣ２とＣ３の間に存在し得る）；
Ｒ^２及びＲ^１２は、－Ｈ、－ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ_２、－ＣＮ、－Ｒ、－ＯＲ、＝ＣＨ－Ｒ^Ｄ、＝Ｃ（Ｒ^Ｄ）_２、－Ｏ－ＳＯ_２－Ｒ、－ＣＯ_２Ｒ、－ＣＯＲ、及び－ハロゲンから各々独立に選択され；
ここでＲ^Ｄは、－Ｈ、－ＣＯ_２Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｒ、ＣＨＯ、ＣＯ_２Ｈ、－Ｒ、－ＯＨ、－ＯＲ、－ＳＨ、－ＳＲ、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ、－ＮＲＲ´、－ＮＯ_２、Ｍｅ_３Ｓｎ－、及び－ハロゲンから独立に選択され；
Ｒ^６、Ｒ^９、Ｒ^１６及びＲ^１９は、－Ｈ、－Ｒ、－ＯＨ、－ＯＲ、－ＳＨ、－ＳＲ、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ、－ＮＲＲ’、－ＮＯ_２、Ｍｅ_３Ｓｎ－、及び－ハロゲンから独立に選択され；
Ｒ^７及びＲ^１７は、－Ｈ、－Ｒ、－ＯＨ、－ＯＲ、－ＳＨ、－ＳＲ、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ、－ＮＲＲ’、－ＮＯ_２、Ｍｅ_３Ｓｎ－、及び－ハロゲンから独立に選択され；
Ｑは、－Ｏ－、－Ｓ－、及び－Ｎ（Ｈ）－から独立に選択され；
Ｒ^１１は－Ｈか－Ｒのいずれかであるか、又はＱが－Ｏ－である場合、Ｒ^１１は－ＳＯ_３Ｍであってもよく、ここでＭはアルカリ金属又はアルカリ土類金属カチオンであり；
Ｒ及びＲ’は、置換されていてもよいＣ_１－１２アルキル、Ｃ_３－８ヘテロシクリル、Ｃ_３－２０複素環及びＣ_５－２０アリール基から各々独立に選択され、且つ、Ｒ及びＲ’は、同じ窒素原子に結合する場合は、それらが結合する窒素原子と共に、置換されてもよい４、５、６又は７員の複素環式環を形成することができ；
Ｒ″は、１個以上の炭素原子が、Ｏ、ＮＨ及びＳから選択されるヘテロ原子、並びに／又は置換されていてもよい芳香族環によって置き換えられてもよいＣ_３－１２アルキレン基であり；
ここで芳香族環は、５又は６個の炭素原子と、Ｎ又はＮＨから選択される１つ又は２つのヘテロ原子とを含み；
Ｘ及びＸ’は、Ｏ、Ｓ及びＮ（Ｈ）から独立に選択される]
のピロロベンゾジアゼピン、並びにその塩（例：薬学的に許容される塩）及び溶媒和物（例：薬学的に許容される溶媒和物）である、請求項１７に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項19】

Ｄが構造：

（式中、ｎは、０又は１である）
を有する、請求項１８に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項20】

Ｄがネモルビシン誘導体である、請求項１６に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項21】

Ｄが、

；及び

から選択される構造を有する、請求項２０に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項22】

リンカーが、プロテアーゼによって切断可能であり、酸に不安定であり、且つ／又はヒドラゾンを含む、請求項１６から２１のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項23】

から選択される式を有する、請求項１６に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項24】

ｐが２－５の範囲である、請求項１６から２３のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項25】

請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と、機能性剤とを含むイムノコンジュゲートであって、機能性剤がエンドソームのエスケープドメイン（ＥＥＤ）ペプチドである、イムノコンジュゲート。

【請求項26】

式Ａｂ（－ＥＥＤＬ－ＥＥＤペプチド）を有する請求項２５に記載のイムノコンジュゲートであって、式中、Ａｂが請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片であり、ＥＥＤＬがＥＥＤリンカーである、イムノコンジュゲート。

【請求項27】

請求項２６に記載のイムノコンジュゲートであって、ＥＥＤペプチドが、配列番号４２のアミノ酸配列を含むデングウイルスＥＥＤペプチドであり、ＥＥＤリンカーが、配列番号４３のアミノ酸配列を含む、イムノコンジュゲート。

【請求項28】

請求項１５から２７のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。

【請求項29】

更なる治療剤を含む、請求項２８に記載の薬学的組成物。

【請求項30】

請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。

【請求項31】

更なる治療剤を含む、請求項３０に記載の薬学的組成物。

【請求項32】

ＧＰ７３陽性がんを有する対象を治療するための医薬であって、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項１５から２７のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート又は請求項２８から３１のいずれか一項に記載の薬学的組成物の有効量を含む、医薬。

【請求項33】

ＧＰ７３陽性がんが肝がんである、請求項３２に記載の医薬。

【請求項34】

追加的治療剤を更に含む、請求項３２又は３３に記載の医薬。

【請求項35】

前記医薬の投与が、静脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、腫瘍内、膀胱内、子宮内、関節内、鼻腔内、皮下、局所、浣腸として、又は胃洗浄としてである、請求項３２から３４のいずれか一項に記載の医薬。

【請求項36】

ＧＰ７３陽性細胞の増殖を阻害するための医薬であって、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片又は請求項１５から２７のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲートを含み、前記医薬が、前記細胞の表面上のＧＰ７３への前記抗体又はその抗原結合断片又は前記イムノコンジュゲートの結合を許容する条件下で投与され、それにより前記細胞の増殖を阻害する、医薬。

【請求項37】

前記細胞が肝がん細胞である、請求項３６に記載の医薬。

【請求項38】

生物学的試料中のヒトＧＰ７３を検出するためのキットであって、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含み、前記抗体又はその抗原結合断片が、天然に存在するヒトＧＰ７３への抗体又はその抗原結合断片の結合を許容する条件下で、生物学的試料と接触させられ、生物学的試料中に抗体又はその抗原結合断片と天然に存在するヒトＧＰ７３との複合体が形成されているかどうかが検出される、キット。

【請求項39】

検出することが、免疫組織化学、免疫蛍光イメージング、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及び蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、ウェスタンブロット、免疫沈降法又は放射線画像撮影法を含む、請求項３８に記載のキット。

【請求項40】

疾患を有するとして対象を同定するためのキットであって、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含み、対象からの試料における、前記抗体又はその抗原結合断片のＧＰ７３ポリペプチド又はその抗原部分との特異的結合レベルが決定され、コントロール試料と比較した特異的結合レベルの増加を検出することが、疾患を有するとして対象を同定し、疾患ががんである、キット。

【請求項41】

がんが、肝がん、卵巣がん、子宮内膜がん腫、悪性黒色腫、前立腺がん、胃がん、結腸直腸がん、肺がん及び白血病から選択される、請求項４０に記載のキット。

【請求項42】

配列番号１で示されるヒトＧＰ７３のアミノ酸配列におけるアミノ酸３６－５５内のエピトープに結合することができるキメラ抗原受容体ＣＡＲ Ｔ細胞。

【請求項43】

更なる治療剤が、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害するＥＧＦＲ抗体又は小分子であり、薬学的組成物が、がんの治療における使用のためのものである、請求項２９又は３１に記載の薬学的組成物。

【請求項44】

ＧＰ７３の異常発現に関連する疾患の治療における使用のための医薬であって、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項１５から２７のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート、又は請求項２８から３１のいずれか一項に記載の薬学的組成物を含み、疾患ががんである、医薬。

【請求項45】

請求項４４に記載の使用のための医薬であって、疾患ががんである、医薬。

【請求項46】

請求項４５に記載の使用のための医薬であって、がんが肝がん、卵巣がん、子宮内膜がん腫、黒色腫、前立腺がん、結腸直腸がん腫及び／又は乳がんである、医薬。

【請求項47】

血漿中の循環可溶性ＧＰ７３（ｓＧＰ７３）のレベルを低下させる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項１５から２７のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート、又は請求項２８から３１のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項48】

請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項１５から２７のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート、又は請求項２８から３１のいずれか一項に記載の薬学的組成物による治療に対する対象の応答をモニターするためのキットであって、対象の治療の前の１つ以上の時点で、及び対象の治療の後の１つ以上の時点で血漿中の循環ｓＧＰ７３のレベルが測定され、治療ががんの治療である、キット。

【請求項49】

対象の血漿における治療の前の時点と比較した治療後の時点での循環ｓＧＰ７３レベルの低下を検出することが、治療に応答性であるとして対象を同定する、請求項４８に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＧＰ７３又はその抗原部分に特異的に結合する抗原結合分子、好ましくは抗体又はその抗原結合断片に関し、ここで、抗原結合分子は、通常タンパク質分解切断の後に細胞内に内部移行されるＧＰ７３の細胞外部分内のエピトープに結合する。本発明は更に、抗原結合分子、特に抗ＧＰ７３抗体又はその抗原結合断片を含むイムノコンジュゲートに関する。本発明の抗原結合分子及びイムノコンジュゲートは、治療用コンジュゲートとして単独で、又は診断用コンジュゲートとして他のネイキッド抗体若しくは治療剤若しくは他のイムノコンジュゲートと組み合わせて投与され得る。本発明はまた、抗ＧＰ７３抗体をコードするヌクレオチド配列、並びに該ヌクレオチド配列を含むイムノコンジュゲート、ベクター及び宿主細胞、並びに抗ＧＰ７３抗体を作製する方法に関する。本発明の抗原結合分子、抗体及び組成物は、ＧＰ７３の発現が変化する、特にＧＰ７３が過剰発現する疾患、例えばがんの診断及び治療用途に有用である。

【背景技術】

【0002】

ゴルジタンパク質７３（ＧＰ７３）（別名ゴルジ膜タンパク質１（ＧＯＬＭ１））又はゴルジ関連リンタンパク質(Golgi-associated-Phosphoprotein)２（ＧＯＬＰＨ２）は、ＩＩ型１回膜貫通タンパク質である。その本来の機能は不明である。ＧＰ７３のゲノム配列は、１１のエクソンと２つのスプライシングバリアントを予測している。転写バリアント１（ＮＭ＿０１６５４８．３）は、長さが３１００ｎｔであり、エクソン２から１１を含むが、転写バリアント２（ＮＭ＿１７７９３７．２）は、長さが３０９２ｎｔであり、エクソン１及び３から１１を含む。スプライシングバリアントも転写バリアントも、同じオープンリーディングフレームをコードする。これらのバリアントの生物学的意義は現在明らかではない。Ｋｉｍら，Ｇｏｌｇｉ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ ２ ｉｎ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｃｅｌｌ＆Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２ ２：３１を参照されたい。定常状態条件下で、ＧＰ７３は、シス－及びメディアルゴルジ装置の必須膜タンパク質である。しかしながら、ＧＰ７３は、シスゴルジからエンドソーム及び細胞表面に循環することができる。Ｐｕｒｉ Ｓら，Ｃｙｃｌｉｎｇ ｏｆ ｅａｒｌｙ Ｇｏｌｇｉ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｖｉａ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ ｕｐｏｎ ｌｕｍｅｎａｌ ｐＨ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ Ｔｒａｆｆｉｃ ２００２，３：６４１－６５３を参照されたい。ＧＰ７３のエンドソーム輸送がプロタンパク質転換酵素フーリン媒介切断を可能にし、その細胞外空間への放出をもたらし、ＨＣＣの血清バイオマーカーとしてのその存在についての分子的説明を提供するというエビデンスがある。Ｂａｃｈｅｒｔ Ｃら，Ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｃｉｓ Ｇｏｌｇｉ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧＰ７３ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｔｒａｆｆｉｃ ２００７，８：１４１５－１４２３；Ｍａｒｒｅｒｏ ＪＡら，ＧＰ７３，ａ ｒｅｓｉｄｅｎｔ Ｇｏｌｇｉ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｅｒｕｍ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ ２００５，４３：１００７－１０１２；Ｍａｏ Ｙら，Ｇｏｌｇｉ ｐｒｏｔｅｉｎ ７３（ＧＯＬＰＨ２） ｉｓ ａ ｖａｌｕａｂｌｅ ｓｅｒｕｍ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｇｕｔ ２０１０，５９：１６８７－１６９３）；Ｌｉ Ｘら，Ｓｅｒｕｍ ｇｏｌｇｉ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ ２ ｌｅｖｅｌ：ａ ｂｅｔｔｅｒ ｍａｒｋｅｒ ｔｈａｎ ａｌｐｈａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ ｅａｒｌｙ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００９，５０：１６８２又はＺｈｕら，Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ，ａｎｄ ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｔｈｅｒａｐｙＢｉｏｍａｒｋ Ｒｅｓ ２０１３，１：１０を参照されたい。ＧＰ７３は、肝細胞、胆管細胞、食道、腎臓、前立腺がん及び他の様々ながん腫を含むいくつかの悪性腫瘍において高度に発現することが示されているが、隣接する非腫瘍組織においてはそうではない。ＧＰ７３陽性ＨＣＣ患者は、ＧＰ７３陰性ＨＣＣ患者よりも高い腫瘍グレードを有する。胆管がん腫（ＢＤＣ）において、ＧＰ７３発現は良好な全生存と相関するが、ＨＣＣにおいて、ＧＰ７３過剰発現は、転移のリスクの増加、より高い再発の確率、及びより低い生存性と関連することが見出されている。Ｒｉｅｎｅｒら，Ｇｏｌｇｉ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ ２（ＧＯＬＰＨ２）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｖａｌｕｅ ａｓ ａ ｓｅｒｕｍ ｍａｒｋｅｒ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００９，４９：１６０２－１６０９及びＹｅら，２０１６，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３０，４４４－４５８ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １２，２０１６を参照されたい。ＧＰ７３を標的とするための抗体は、国際公開第２０１４／１４４３５５号、中華人民共和国特許第１０５６９９６５３号及び中華人民共和国特許第１０５７３４０５９号に記載されている。がん患者におけるＧＰ７３を阻害して細胞媒介性免疫を増強するための抗体の使用は、国際公開第２０１２／１１２７９８号に記載されている。ＧＰ７３は、肺がんの診断のためのバイオマーカーとして（国際公開第２０１１／０９３６７５号）、又は全身性炎症状態、例えば敗血症の検査として（国際公開第２０１３／０８３７８１号）提案されている。近年、ＧＰ７３（ＧＯＬＭ１）は、この腫瘍細胞の増殖及び転移の促進によってＥＧＦＲ／ＲＴＫと相互作用することが記載されている。Ｙｅら，２０１６，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３０，４４４－４５８ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １２，２０１６を参照されたい。

【0003】

したがって、がん及び感染症など、ＧＰ７３の発現の変化を伴う状態及び疾患の診断及び治療のためのＧＰ７３を標的とする薬剤へのニーズが存在する。上記の技術的問題は、特許請求の範囲に規定されている実施態様によって解決される。

【発明の概要】

【0004】

本発明は、以下に関する。
１． ＧＰ７３又はその抗原部分に特異的に結合する抗原結合分子であって、
ａ） ＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＭＥＬＥＧＲＶＲＲ 配列番号３０
ｂ） ＳＳＲＳＶＥＬＱＴＲＩＶＥＬＥＧＲＶＲＲ 配列番号３１、及び／又は
ｃ） ＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＶＥＬＥＧＲＶＲＲ 配列番号３２
のアミノ酸配列内のエピトープに結合する、抗原結合分子。
２． エピトープがアミノ酸配列ＲＩＭＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３３）、好ましくはＥＧＲＶＲＲ（配列番号３４）内にある、実施態様１に記載の抗原結合分子。
３． 抗原結合分子が抗体、その抗原結合断片、二重特異性抗体、設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰＩＮ）、アプタマー又は別の抗体模倣物である、実施態様１又は２に記載の抗原結合分子。
４． 抗体がモノクローナル抗体、キメラ抗体、組換え組換え抗体、組換え抗体の抗原結合断片、ヒト化抗体、又はファージの表面に提示されるか若しくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の表面に提示される抗体である、実施態様３に記載の抗原結合分子。
５． 抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体である、実施態様４に記載の抗原結合分子。
６． 抗体が、配列番号６に記載のＣＤＲ３を含む可変重（ＶＨ）鎖と、配列番号９に記載のＣＤＲ３を含む可変軽（ＶＬ）鎖とを含む、実施態様３、４又は５に記載の抗原結合分子。
７． 抗体が：
ａ） 配列番号４に記載のＣＤＲ１、配列番号５に記載のＣＤＲ２、及び配列番号６に記載のＣＤＲ３を含む可変重（ＶＨ）鎖と、配列番号７に記載のＣＤＲ１、配列番号８に記載のＣＤＲ２、及び配列番号９に記載のＣＤＲ３を含む可変軽（ＶＬ）鎖とを含むか、又は
ｂ） （ａ）の抗体と同じエピトープに結合する抗体である、
実施態様３から６のいずれか１つに記載の抗原結合分子。
８． 抗体が：
ａ） 配列番号２若しくは配列番号３５のアミノ酸配列、又は配列番号２若しくは配列番号３５に対して９０％、好ましくは９５％の配列同一性を有する配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列、及び
配列番号３若しくは配列番号３６のアミノ酸配列、又は配列番号３若しくは配列番号３６に対して９０％、好ましくは９５％の配列同一性を有する配列を含む可変軽（ＶＬ））鎖配列を含むか、又は
ｂ） （ａ）の抗体と同じエピトープに結合する抗体である、
実施態様３から７のいずれか１つに記載の抗原結合分子。
９． 抗体が、配列番号１４に記載のＣＤＲ３を含む可変重（ＶＨ）鎖と、配列番号１７に記載のＣＤＲ３を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列とを含む、実施態様３、４又は５の抗原結合分子。
１０． 抗体が：
ａ） 配列番号１２に記載のＣＤＲ１、配列番号１３に記載のＣＤＲ２、及び配列番号１４に記載のＣＤＲ３を含む可変重（ＶＨ）鎖と、配列番号１５に記載のＣＤＲ１、配列番号１６に記載のＣＤＲ２、及び配列番号１７に記載のＣＤＲ３を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列とを含むか、又は
ｂ） （ａ）の抗体と同じエピトープに結合する抗体である、
実施態様３、４、５又は９の抗原結合分子。
１１． 抗体が：
ａ） 配列番号１０若しくは配列番号３７のアミノ酸配列、又は配列番号１０若しくは配列番号３７に対して９０％、好ましくは９５％の配列同一性を有する配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列、及び
配列番号１１若しくは配列番号３８のアミノ酸配列、又は配列番号１１若しくは配列番号３８に対して９０％、好ましくは９５％の配列同一性を有する配列を含む可変軽（ＶＬ））鎖配列を含むか、又は
ｂ） （ａ）の抗体と同じエピトープに結合する抗体である、
実施態様３、４、５、９又は１０に記載の抗原結合分子。
１２． 抗原結合断片がＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片又はＦｖ断片である、実施態様３に記載の抗原結合分子。
１３． 抗原結合分子が細胞内に内部移行される、実施態様１から１２のいずれか１つに記載の抗原結合分子。
１４． ＧＰ７３又はその抗原部分に特異的に結合する抗体の可変重（ＶＨ）鎖配列及び／又は可変軽（ＶＬ）鎖配列の少なくとも一方をコードするポリヌクレオチドであって、抗体が、
ａ） ＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＭＥＬＥＧＲＶＲＲ 配列番号３０
ｂ） ＳＳＲＳＶＥＬＱＴＲＩＶＥＬＥＧＲＶＲＲ 配列番号３１；及び／又は
ｃ） ＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＶＥＬＥＧＲＶＲＲ 配列番号３２
のアミノ酸配列内のエピトープに結合する、ポリヌクレオチド。
１５． 実施態様１４に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
１６． 実施態様１５に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体を製造するための方法。
１７． ポリペプチド又はその抗原部分に特異的に結合する抗体を製造するための方法であって、
ａ） ＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＭＥＬＥＧＲＶＲＲ 配列番号３０
ｂ） ＳＳＲＳＶＥＬＱＴＲＩＶＥＬＥＧＲＶＲＲ 配列番号３１；及び
ｃ） ＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＶＥＬＥＧＲＶＲＲ 配列番号３２
から選択されるポリペプチドを対象に投与することを含む、方法。
１８． 実施態様１から１７のいずれか１つに記載の抗体と、細胞傷害性剤又は細胞傷害性剤のプロドラッグとを含むイムノコンジュゲート。
１９． 式Ａｂ（－Ｌ－Ｄ）ｐ（式中：

ａ） Ａｂは、実施態様１から１８のいずれか１つに記載の抗体であり；
ｂ） Ｌは、リンカーであり；
ｃ） Ｄは、細胞傷害性剤であり；且つ
ｄ） ｐは１－８の範囲である）
を有する実施態様１８に記載のイムノコンジュゲート。
２０． 細胞傷害性剤が、メイタンシノイド、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン及びネモルビシン誘導体から選択される、実施態様１８又は１９に記載のイムノコンジュゲート。
２１． Ｄが、式Ａ：

のピロロベンゾジアゼピン、並びにその塩（例：薬学的に許容される塩）及び溶媒和物（例：薬学的に許容される溶媒和物）であり、式中、
波線は、リンカーへの共有結合部位を示し；
点線は、二重結合の任意選択の存在を示し（二重結合は、例えばＣ１とＣ２、又はＣ２とＣ３の間に存在し得る）；

Ｒ^２及びＲ^１２は、－Ｈ、－ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ_２、－ＣＮ、－Ｒ、－ＯＲ、＝ＣＨ－Ｒ^Ｄ、＝Ｃ（Ｒ^Ｄ）_２、－Ｏ－ＳＯ_２－Ｒ、－ＣＯ_２Ｒ、－ＣＯＲ、及び－ハロゲンから各々独立に選択され；
ここでＲ^Ｄは、－Ｈ、－ＣＯ_２Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｒ、ＣＨＯ、ＣＯ_２Ｈ、－Ｒ、－ＯＨ、－ＯＲ、－ＳＨ、－ＳＲ、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ、－ＮＲＲ´、－ＮＯ_２、Ｍｅ_３Ｓｎ－、及び－ハロゲンから独立に選択され；
Ｒ^６、Ｒ^９、Ｒ^１６及びＲ^１９は、－Ｈ、－Ｒ、－ＯＨ、－ＯＲ、－ＳＨ、－ＳＲ、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ、－ＮＲＲ’、－ＮＯ_２、Ｍｅ_３Ｓｎ－、及び－ハロゲンから独立に選択され；
Ｒ^７及びＲ^１７は、－Ｈ、－Ｒ、－ＯＨ、－ＯＲ、－ＳＨ、－ＳＲ、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ、－ＮＲＲ’、－ＮＯ_２、Ｍｅ_３Ｓｎ－、及び－ハロゲンから独立に選択され；
Ｑは、－Ｏ－、－Ｓ－、及び－Ｎ（Ｈ）－から独立に選択され；
Ｒ^１１は－Ｈか－Ｒのいずれかであるか、又はＱが－Ｏ－である場合、Ｒ^１１は－ＳＯ_３Ｍであってもよく、ここでＭはアルカリ金属又はアルカリ土類金属カチオンであり；
Ｒ及びＲ’は、置換されていてもよいＣ_１－１２アルキル、Ｃ_３－８ヘテロシクリル、Ｃ_３－２０複素環及びＣ_５－２０アリール基から各々独立に選択され、且つ、Ｒ及びＲ’は、同じ窒素原子に結合する場合は、それらが結合する窒素原子と共に、置換されてもよい４、５、６又は７員の複素環式環を形成することができ；
Ｒ″は、１個以上の炭素原子が、Ｏ、ＮＨ及びＳから選択されるヘテロ原子、並びに／又は置換されていてもよい芳香族環によって置き換えられてもよいＣ_３－１２アルキレン基であり；
ここで芳香族環は、５又は６個の炭素原子と、Ｎ又はＮＨから選択される１つ又は２つのヘテロ原子とを含み；
Ｘ及びＸ’は、Ｏ、Ｓ及びＮ（Ｈ）から独立に選択される、
実施態様１９のイムノコンジュゲート。
２２． Ｄが構造：
（式中、ｎは０又は１である）

を有する、実施態様２１に記載のイムノコンジュゲート。
２３． Ｄがネモルビシン誘導体である、実施態様１９に記載のイムノコンジュゲート。
２４． Ｄが、

から選択される構造を有する、実施態様２３に記載のイムノコンジュゲート。
２５． リンカーが、プロテアーゼによって切断可能であり、酸に不安定であり、且つ／又はヒドラゾンを含む、実施態様１９から２４のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。
２６．

から選択される式を有する、実施態様１９に記載のイムノコンジュゲート。
２７． ｐが２－５の範囲である、実施態様１９から２６のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート。
２８． 実施態様１から１７のいずれか１つに記載の抗体と、機能性剤とを含むイムノコンジュゲートであって、機能性剤が、好ましくはエンドソームのエスケープドメイン（ＥＥＤ）ペプチドであるイムノコンジュゲート。
２９． 式Ａｂ（－ＥＥＤＬ－ＥＥＤペプチド）を有する実施態様２８に記載のイムノコンジュゲートであって、式中、Ａｂが実施態様１から１７のいずれか１つに記載の抗体であり、ＥＥＤＬがＥＥＤリンカーであるイムノコンジュゲート。
３０． 実施態様２８又は２９に記載のイムノコンジュゲートであって、ＥＥＤペプチドが、配列番号４２のアミノ酸配列を含むデングウイルスＥＥＤペプチドであり、ＥＥＤリンカーが、配列番号４３のアミノ酸配列を含む、イムノコンジュゲート。
３１． 実施態様１８から３０のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
３２． 更なる治療剤を含む、実施態様３１に記載の薬学的組成物。
３３． 実施態様１から１３のいずれか１つに記載の抗原結合分子と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
３４． 更なる治療剤を含む、実施態様３３に記載の薬学的組成物。
３５． ＧＰ７３陽性がんを有する対象を治療する方法であって、実施態様１から１３のいずれか１つに記載の抗原結合分子、実施態様１８から３０のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート又は実施態様３１から３４のいずれか１つに記載の薬学組成物の有効量を対象に投与することを含む、方法。
３６． ＧＰ７３陽性がんが肝がんである、実施態様３５に記載の方法。
３７． 追加的治療剤を個体に投与することを更に含む、実施態様３５又は３６に記載の方法。
３８． 投与が、静脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、腫瘍内、膀胱内、子宮内、関節内、鼻腔内、皮下、局所、浣腸として、又は胃洗浄としてである、実施態様３５から３７のいずれか１つに記載の方法。
３９． ＧＰ７３陽性細胞の増殖を阻害する方法であって、該細胞表面のＧＰ７３への抗原結合分子又はイムノコンジュゲートの結合を許容する条件下で、実施態様１から１３のいずれか１つに記載の抗原結合分子又は実施態様１８から３０のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲートに該細胞を曝露し、それにより該細胞の増殖を阻害することを含む、方法。
４０． 細胞が肝がん細胞である、実施態様３９に記載の方法。
４１． 生物学的試料中のヒトＧＰ７３を検出する方法であって、天然に存在するヒトＧＰ７３への抗原結合分子の結合を許容する条件下で、実施態様１から１３のいずれか１つに記載の抗原結合分子と生物学的試料とを接触させること、及び生物学的試料中に抗原結合分子と天然に存在するヒトＧＰ７３との複合体が形成されているかどうかを検出することを含む、方法。
４２． 実施態様４１に記載の方法であって、検出することが、免疫組織化学、免疫蛍光イメージング、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及び蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、ウェスタンブロット、免疫沈降法、又は放射線画像撮影法(radiographic imaging)を含む、方法。
４３． 疾患を有するとして対象を同定するための方法であって、対象からの試料における、実施態様１から１３のいずれか１つに記載の抗原結合分子のＧＰ７３ポリペプチド又はその抗原部分との特異的結合レベルを決定することを含み、コントロール試料と比較した特異的結合レベルの変化を検出することが、疾患を有するとして対象を同定する、方法。
４４． 疾患ががんである、実施態様４３に記載の方法。
４５． がんが、肝がん、卵巣がん、子宮内膜がん腫、悪性黒色腫、前立腺がん、胃がん、結腸直腸がん腫、肺がん、白血病、及び乳がんの群から選択される、実施態様４３に記載の方法。
４６． ヒトＧＰ７３のアミノ酸３６－５５内のエピトープに結合することができるＲＮＡアプタマー。
４７． ヒトＧＰ７３のアミノ酸３６－５５内のエピトープに結合することができるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞。
４８． フーリン切断コンセンサス配列ＥＧＲＶＲＲに結合し、ＧＰ７３タンパク質のタンパク質分解切断を阻害する抗原結合分子。
４９． がんの治療における使用のための、実施態様１から１３のいずれか１つに記載の抗原結合分子と、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害するＥＧＦＲ抗体又は小分子とを含む組成物。
５０． ＧＰ７３とＥＧＦＲとを標的とし、感受性がん細胞におけるＥＧＦＲシグナル伝達を遮断する二重特異性抗体。
５１． ＧＰ７３に結合するが可溶性ＧＰ７３（ｓＧＰ７３）には結合せず、したがって循環ｓＧＰ７３によって阻害又は中和されない抗体。
５２． ＧＰ７３の異常発現に関する疾患の治療における使用のための、実施態様１から１３のいずれか１つに記載の抗原結合分子、実施態様１８から３０のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート、又は実施態様３１から３４のいずれか１つに記載の薬学的組成物。
５３． 疾患ががんであり、好ましくはがんは肝がん、卵巣がん、子宮内膜がん腫、黒色腫、前立腺がん、結腸直腸がん腫、肺がん、白血病、及び乳がんである、実施態様５２に記載の使用のための抗原結合分子、イムノコンジュゲート又は薬学的組成物。
５４． 血漿中の循環可溶性ＧＰ７３（ｓＧＰ７３）のレベルを低下させる、実施態様１から１３のいずれか１つに記載の抗原結合分子、実施態様１８から３０のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート、又は実施態様３１から３４のいずれか１つに記載の薬学的組成物。
５５． 実施態様１から１３のいずれか１つに記載の抗原結合分子、実施態様１８から３０のいずれか１つに記載のイムノコンジュゲート、又は実施態様３１から３４のいずれか１つに記載の薬学的組成物による、治療に対する対象の応答をモニターするための方法であって、対象の治療の前の１つ以上の時点で、及び対象の治療の後の１つ以上の時点で血漿中の循環ｓＧＰ７３のレベルを測定することを含む、方法。
５６． 対象の血漿における治療の前の時点と比較した治療後の時点での循環ｓＧＰ７３レベルの低下を検出することが、治療に応答性であるとして対象を同定する、実施態様５５に記載の方法。

【0005】

したがって本発明は、ＧＰ７３又はその抗原部分に特異的に結合する抗原結合分子に関し、ここで、抗原結合分子は、アミノ酸配列ＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＭＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３０）；ＳＳＲＳＶＥＬＱＴＲＩＶＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３１）；及び／又はＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＶＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３２）内のエピトープに結合する。したがって本発明は、抗原結合分子、特にＧＰ７３の細胞外部分内の特定のエピトープに結合する抗体を提供する。

【0006】

本発明はすなわち、限定されないが、例えばネモルビシン及びその誘導体（例えばＰＮＵ－１５９６８２）又はアウリスタチン（例えばＭＭＡＦ）にコンジュゲートした、ＧＰ７３又はその処理断片に特異的に結合する抗体及び抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）（抗体又はその抗原結合断片を含む）が、ＧＰ７３発現がん細胞の死滅及び／又は増殖阻害、並びにＧＰ７３発現がんの治療に使用することができるという驚くべき発見に、少なくとも部分的に基づく。理論に縛られることなく、本発明の抗原結合分子は、切断されるのではなく細胞内に内部移行されるＧＰ７３の細胞外部分の領域に結合すると考えられる。ＧＰ７３は、短い細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、及び長い細胞外部分に構造化されている。この細胞外部分は、アミノ酸Ｒ５５の推定タンパク質分解切断ドメインで終結する、膜貫通ドメインに隣接する短い領域（ｒＧＰ７３という）と、ＧＰ７３のＣ末端部分（ｓＧＰ７３という）とを含む。本発明の結合分子は、ｒＧＰ７３を標的とする。細胞膜に隣接し、且つ、この２０アミノ酸含有領域内のプロテアーゼ相互作用のすぐ近くにもかかわらず、ｒＧＰ７３へのピーク結合活性を示す２つの抗体が同定された。

【0007】

したがって本発明は、ＧＰ７３の細胞外部分の前記領域、すなわちｒＧＰ７３に特異的に結合する抗原結合分子に関する。特定の実施態様において、本発明は抗原結合分子に関し、ここで、結合エピトープの少なくとも一部が、ＧＰ７３のＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＭＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３０）；ＳＳＲＳＶＥＬＱＴＲＩＶＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３１）；及び／又はＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＶＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３２）内のアミノ酸配列ＥＧＲＶＲＲ内にある。やはり理論に縛られることなく、アミノ酸配列ＥＧＲＶＲＲ（配列番号３３）は推定フーリン認識モチーフであると考えられる。したがって、本明細書で提供される抗原結合分子、特に抗体の潜在的な作用様式は、図１２及び図２３に示すように、フーリン切断と競合している。本明細書に記載の抗体、例えばＧ２－２、Ｇ２－２ｏｐｔｉ、Ｇ２－１、及びＧ２－１ｏｐｔｉの結合は、フーリンプロテアーゼによる膜結合ＧＰ７３のプロセシングの低下をもたらす。予想される結果は、図２３に示すように、環境中及び血流中の、タンパク質のＣ末端部分を含む可溶性ＧＰ７３の減少である。それぞれの抗体結合及びフーリン部位の遮断によるこのフーリンプロテアーゼプロセスの妨害は、図１３及び図２４に示される増殖阻害の原因である可能性が高い。本発明の抗原結合分子、例えば本明細書に記載の抗体Ｇ２－２、Ｇ２－２ｏｐｔｉ、Ｇ２－１、及びＧ２－１ｏｐｔｉによる新規の寄与は、ＧＰ７３タンパク質の主要部分のプロセシング及び分泌後に細胞表面に残る脱落タンパク質の細胞外部分での結合である。循環ｓＧＰ７３に結合し、且つこの結合複合体によって中和されるであろう従来知られている抗体とは対照的に、本発明の抗原結合分子、特に本明細書に開示の抗体は、ｓＧＰ７３に影響されずに起源細胞に到達し、そこでＧＰ７３の残りとフーリン切断部位の近位にあるＧＰ７３の全長タンパク質とに結合する。この効果を図１１に示す。ｓＧＰ７３含有条件培地は、Ｇ２－４というフーリン切断部位結合抗体の遠位の場合、ＧＰ７３陽性ＨＵＨ７細胞の細胞表面への抗体結合を減少させる。フーリン切断部位結合抗体Ｇ２－２の近位は、上清中の可溶性ＧＰ７３の存在に影響されない。

【0008】

最近、ｓＧＰ７３に結合する抗体が国際公開第２０１４／１４４３５５号に記載された。国際公開第２０１４／１４４３５５号は特に、ＧＰ７３のアミノ酸３０７－３３９、２７６－２８７、３４４－３６３、又は６３－９６内のフーリン切断部位の遠位に結合する抗体を記載している。中華人民共和国特許第１０５６９９６５３号も同様に、Ｇｐ７３のアミノ酸５６－６７、すなわちｓＧＰ７３内で結合する抗体を開示している。

【0009】

中華人民共和国特許第１０５７３４０５９号は、開示された抗体が結合するエピトープを規定することなく、ＧＰ７３に結合する抗体を記載している。添付の実施例に示されるように、中華人民共和国特許第１０５７３４０５９号の抗体の結合特異性を決定するために、中華人民共和国特許第１０５７３４０５９号の抗体を生成し、エピトープを包含するペプチド又は無関係のコントロールペプチドの結合についてだけではなく、エピトープ領域ＧＰ７３ ＡＡ ３６－５５の有無にかかわらずＧＰ７３の結合について試験した。図２１及び図２２に示されるように、中華人民共和国特許第１０５７３４０５９号のエピトープは、本発明のエピトープと重複しない。

【0010】

したがって本発明の抗体は、ｒＧＰ７３に結合し、内部移行されることよって起源細胞に到達することができるため、当該技術分野において知られているものよりも有利である。本発明の抗体のこの独特の性質は、腫瘍細胞の特異的標的化を可能にする。

【0011】

上記に従って、ＧＰ７３に結合する本発明の抗原結合分子、特に抗体は、以下の特徴のうちの１つ以上を有する。

ａ） ヒトＧＰ７３のアミノ酸３６－５５（配列番号１）内のエピトープに結合する；

ｂ） ヒトＧＰ７３のアミノ酸Ｅ５０からＲ５５で推定フーリン切断認識モチーフに及ぶエピトープに結合する；

ｃ） 組換えヒトＧＰ７３に結合する；

ｄ） がん細胞の表面の内因性ＧＰ７３に結合する；

ｅ） 肝細胞がん腫細胞の表面の内因性ＧＰ７３に結合する；

ｆ） ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｕＨ７、ＪＨＨ－４、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５）、ＨＬＥ、ＨｕＣＣＴ１から選択される細胞株の細胞表面の内因性ＧＰ７３に結合する；

ｇ） Ｈｅｐ－５５．１Ｃ、Ｈｅｐａ１－６（ＣＲＬ－１８３０）、ＢｐＲｃ１（ＣＲＬ－２２１７）、Ｂ７ＩＦｉ１（ＣＲＬ－２７１１）、４Ｔ１（乳がん）から選択される細胞株の細胞表面の内因性マウスＧＰ７３に結合する；

ｈ） ＰＣ３及びＤＵ１４５（前立腺がん）、ＭＤＡ－４６８（乳がん）、ＳＫ－ＢＲ－３（乳がん）、ＣａＣｏ２、ＳＷ ４８０及びＨＣＴ １１３（結腸直腸がん腫）、Ｈ１９７５（肺がん））から選択される細胞株の細胞表面の内因性ヒトＧＰ７３に結合する；

ｉ） ヒト腫瘍組織細胞表面の内因性ヒトＧＰ７３に結合する；

ｊ） 悪性黒色腫、子宮内膜がん腫、卵巣がん腫、胃がんから選択されるヒト腫瘍組織細胞表面の内因性ヒトＧＰ７３に結合する；

ｋ） 白血球、特に、限定されないが、顆粒球、リンパ球、マクロファージ及び樹状細胞の表面の内因性ＧＰ７３に結合する；
ｌ） 細胞株ＴＨＰ－１由来の、骨髄性白血病細胞を含む骨髄細胞表面の内因性のＧＰ７３に結合する；及び／又は

ｍ） ＧＰ７３発現細胞（ａ－ｌに記載）の表面の切断されていないＧＰ７３に結合する。

【0012】

本発明の範囲内で、ヒトＧＰ７３は、配列番号１のアミノ酸配列（完全長ＧＰ７３バリアント１）を有するか、又はヒトＧＰ７３は、配列番号１のアミノ酸１１－４０１（完全長ＧＰ７３バリアント２）を含む。配列番号１は配列番号３０を含み、一方、配列番号３１と配列番号３２はそれぞれ、マウス型、イヌ型のＧＰ７３に由来する。

【0013】

いくつかの実施態様では、本発明の抗原結合分子は、抗体若しくはその抗原結合部分、二重特異性抗体若しくはその抗原結合部分、設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰＩＮ）、アプタマー又は他の抗体模倣物、例えばアフィボディ分子、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、クニッツドメインペプチド、モノボディである。

【0014】

本発明の抗体は特に、モノクローナル抗体、キメラ抗体、組換え抗体、組換え抗体の抗原結合断片、ヒト化抗体、又はファージの表面に提示されているか若しくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の表面に提示されている抗体であり得る。本発明の抗体は更に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体であってもよい。上記に従って、本発明の抗体は、ヒトＧＰ７３のアミノ酸３６－５５内のエピトープに結合する。いくつかの実施態様において、抗体は、マウスＧＰ７３及び／又はイヌＧＰ７３に結合する。したがって、一実施態様では、本発明は、配列番号６に記載のＣＤＲ３を含む可変重（ＶＨ）鎖と、配列番号９に記載のＣＤＲ３を含む可変軽（ＶＬ）鎖とを含む抗体に関する。本発明の抗体は、配列番号４に記載のＣＤＲ１、配列番号５に記載のＣＤＲ２、配列番号６に記載のＣＤＲ３を含むＶＨ鎖と、配列番号７に記載のＣＤＲ１、配列番号８に記載のＣＤＲ２、配列番号９に記載のＣＤＲ３を含むＶＬ鎖とを含み得る。いくつかの実施態様において、本発明の抗体は、配列番号２、好ましくは配列番号３５のアミノ酸配列又は配列番号２若しくは配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、特に９５％の配列同一性を有する配列を含むＶＨ鎖配列と、（ｂ）配列番号３、好ましくは配列番号３６のアミノ酸配列又は配列番号３若しくは配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、特に９５％の配列同一性を有する配列を含むＶＬ配列とを含む。更なる実施態様では、本発明は、配列番号１４に記載のＣＤＲ３を含む可変重（ＶＨ）鎖及び配列番号１７に記載のＣＤＲ３を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含む抗体に関する。可変軽鎖のＣＤＲ３もまた、配列番号４４に記載されている通りである。特定の実施態様において、抗体は、配列番号１２に記載のＣＤＲ１、配列番号１３に記載のＣＤＲ２及び配列番号１４に記載のＣＤＲ３を含む可変重（ＶＨ）鎖、並びに配列番号１５に記載のＣＤＲ１、配列番号１６に記載のＣＤＲ２及び配列番号１７に記載のＣＤＲ３を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含み得る。やはり、ＶＬ鎖配列のＣＤＲ３もまた、配列番号４４に記載の通りである。なお更なる一実施態様において、抗体は、配列番号１０、好ましくは配列番号３７のアミノ酸配列又は配列番号１０若しくは配列番号３７と９０％、特に９５％の配列同一性を有する配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列と、配列番号１１、好ましくは配列番号３８のアミノ酸配列又は配列番号１１若しくは配列番号３８と９０％、特に９５％の配列同一性を有する配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列とを含む。

【0015】

本明細書に記載の実施態様において、抗体は、モノクローナル抗体であり得る。本明細書に記載の実施態様において、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体であり得る。本明細書に記載の実施態様において、抗体は、ＧＰ７３に結合する抗体断片であり得る。本明細書に記載の実施態様において、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ、ｌｇＧ３、ｌｇＧ４、ｌｇＭ、ｌｇＡ１、ｌｇＡ２、ｌｇＡｓｅｃ、ｌｇＤ、ｌｇＥであり得る。本明細書で用いられる場合、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例：ｌｇＭ又はｌｇＧ１）を指す。これらの抗体は、完全長であってもよく、或いはｌｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３、ｌｇＧ４、ｌｇＭ、ｌｇＡ１、ｌｇＡ２、ｌｇＡｓｅｃ、ｌｇＤ又はｌｇＥの抗体定常及び／又は可変ドメインなどの抗原結合断片のみを含んでもよく、或いはＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片及びＦｖ断片から構成されてもよい。

【0016】

ある実施態様において、抗体は、配列番号２８、好ましくは配列番号３９（これは、哺乳動物細胞における発現を最適化するための、配列番号２８の改変型である）のアミノ酸配列又は配列番号２８若しくは配列番号３９と９０％、特に９５％の配列同一性を有する配列を含む重鎖定常領域配列を含む。

【0017】

本発明は更に、本発明の抗原結合分子、特に抗体をコードするポリヌクレオチドに関する。特定の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、ＧＰ７３又はその抗原部分に特異的に結合する抗体の可変重（ＶＨ）鎖配列及び／又は可変軽（ＶＬ）鎖配列の少なくとも一方をコードし、ここで抗体は、アミノ酸配列ＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＭＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３０）；ＳＳＲＳＶＥＬＱＴＲＩＶＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３１）；及び／又はＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＶＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３２）内のエピトープに結合する。

【0018】

本発明は更に、本発明．のポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。本発明は更に、本発明の宿主細胞を培養することを含む、抗体の製造方法に関し、ここで宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドを含む。特定の実施態様において、抗体の製造方法は、本発明の抗体を効率的に産生させるのに適した条件下で本発明の宿主細胞を培養することを含む。

【0019】

本発明は更に、ポリペプチド又はその抗原部分に特異的に結合する抗体を製造するための方法に関し、ＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＭＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３０）；ＳＳＲＳＶＥＬＱＴＲＩＶＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３１）；及びＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＶＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３２）から選択されるポリペプチドを対象に投与することを含む。

【0020】

本発明はまた、本発明の抗原結合分子、特に抗体と、ＥＥＤペプチドと、細胞傷害剤又は細胞傷害剤のプロドラッグとを含むイムノコンジュゲートに関する。

【0021】

いくつかの実施態様では、抗原結合分子とＥＥＤペプチドとを含むイムノコンジュゲートは、式Ａｂ（－ＥＥＤＬ－ＥＥＤペプチド）（式中、Ａｂは本発明の抗体であり、ＥＥＤＬはリンカーである）を有する。好ましい実施態様において、ＥＥＤペプチドは、配列番号４２のアミノ酸配列を含むデングウイルスＥＥＤである。ある実施態様では、抗原結合分子は、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＥＥＤリンカーを介してＥＥＤペプチドに結合している。

【0022】

いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、式：
Ａｂ（-Ｌ-Ｄ）_ｐ
（式中、
Ａｂは、本発明の抗体であり；
Ｌは、リンカーであり；
Ｄは、細胞傷害性剤であり；
ｐは、１‐８の整数、好ましくは１‐６の整数、より好ましくは２‐５の整数である）
を有する。

【0023】

細胞傷害性剤は好ましくは、メイタンシノイド、カリケアマイシン、ドラスタチン誘導体（これはアウリスタチン（例えばＭＭＡＦ（本明細書ではモノメチルアウリスタチンＦともいう）でもよい）、及びネモルビシン誘導体から選択される。

【0024】

本発明のＧＰ７３抗体薬物コンジュゲート（本明細書では「ＧＰ７３ ＡＤＣ」又は「ＡＤＣ」ともいう）は、ＧＰ７３に対するヒトモノクローナル抗体、特に、バリン－シトルリンリンカーを介して毒素にコンジュゲートした本発明の抗体を含む。

【0025】

Ｄは、式Ａ：

のピロロベンゾジアゼピン、並びにその塩（例：薬学的に許容される塩）及び溶媒和物（例：薬学的に許容される溶媒和物）であり得、上式中、
波線は、リンカーへの共有結合部位を示し；
点線は、二重結合の任意選択の存在を示し（二重結合は、例えばＣ１とＣ２、又はＣ２とＣ３の間に存在し得る）；
Ｒ^２及びＲ^１２は、－Ｈ、－ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ_２、－ＣＮ、－Ｒ、－ＯＲ、＝ＣＨ－Ｒ^Ｄ、＝Ｃ（Ｒ^Ｄ）_２、－Ｏ－ＳＯ_２－Ｒ、－ＣＯ_２Ｒ、－ＣＯＲ、－Ｏ－ＳＯ_２－Ｈ、－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯＨ及び－ハロゲンから各々独立に選択され；
ここでＲ^Ｄは、－Ｈ、－ＣＯ_２Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｒ、ＣＨＯ、ＣＯ_２Ｈ、－Ｒ、－ＯＨ、－ＯＲ、－ＳＨ、－ＳＲ、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ、－ＮＲＲ‘、－ＮＯ_２、Ｍｅ_３Ｓｎ－、及び－ハロゲンから独立に選択され；
Ｒ^６、Ｒ^９、Ｒ^１６及びＲ^１９は、－Ｈ、－Ｒ、－ＯＨ、－ＯＲ、－ＳＨ、－ＳＲ、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ、－ＮＲＲ’、－ＮＯ_２、Ｍｅ_３Ｓｎ－、及び－ハロゲンから独立に選択され；
Ｒ^７及びＲ^１７は、－Ｈ、－Ｒ、－ＯＨ、－ＯＲ、－ＳＨ、－ＳＲ、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ、－ＮＲＲ’、－ＮＯ_２、Ｍｅ_３Ｓｎ－、及び－ハロゲンから独立に選択され；
Ｑは、－Ｏ－、－Ｓ－、及び－Ｎ（Ｈ）－から独立に選択され；
Ｒ^１１は－Ｈか－Ｒのいずれかであるか、又はＱが－Ｏ－である場合、Ｒ^１１は－ＳＯ_３Ｍであってもよく、ここでＭはアルカリ金属又はアルカリ土類金属カチオンであり；
Ｒ及びＲ’は、置換されていてもよいＣ_１－１２アルキル、Ｃ_３－８ヘテロシクリル、Ｃ_３－２０複素環及びＣ_５－２０アリール基から各々独立に選択され、且つ、Ｒ及びＲ’は、同じ窒素原子に結合する場合は、それらが結合する窒素原子と共に、置換されてもよい４、５、６又は７員の複素環式環を形成することができ；
Ｒ″は、１個以上の炭素原子が、Ｏ、ＮＨ及びＳ、並びに／又は置換されていてもよい芳香族環から選択されるヘテロ原子によって置き換えられてもよいＣ_３－１２アルキレン基であり；
ここで芳香族環は、５又は６個の炭素原子と、Ｎ又はＮＨから選択される１つ又は２つのヘテロ原子とを含み；
Ｘ及びＸ’は、Ｏ、Ｓ及びＮ（Ｈ）から独立に選択される。

【0026】

より好ましくは、Ｄは構造：

（式中、ｎは０又は１である）
を有する。

【0027】

Ｄは、ネモルビシン誘導体でもあってもよい。この場合、Ｄは好ましくは、

から選択される構造を有する。

【0028】

本発明のイムノコンジュゲートはリンカーを含んでもよく、ここでリンカーはプロテアーゼによって切断可能である。或いは、リンカーは、酸に不安定であり得、且つ／又はヒドラゾンを含み得る。

【0029】

本明細書に記載の抗体を含むイムノコンジュゲートが提供され、ここで該イムノコンジュゲートは、

（式中、ｐは、１－８、好ましくは２－５の範囲であり、
Ａｂは、上で定義した通りである）
から選択される式を有する。

【0030】

本発明は更に、本発明のイムノコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物に関する。いくつかの実施態様では、薬学的製剤は追加的治療剤を含む。

【0031】

更なる実施態様では、本発明の抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物が提供される。特定の実施態様では、薬学的製剤は更なる治療剤を含む。

【0032】

別の態様では、本発明の抗原結合分子、好ましくは抗体、又は本発明のイムノコンジュゲート、又は本発明の薬学的組成物の有効量を対象に投与することを含む、ＧＰ７３陽性がんを有する対象を治療するための方法が提供される。特定の実施態様では、かかる方法において使用されるイムノコンジュゲートは、モノメチル（Monomethy）アウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）又はネモルビシン又はネモルビシン代謝物（ＰＮＵ）又はピロロベンゾジアゼピン（ＰＤＢ）又は他の毒素とコンジュゲートした、本発明の抗体を含む。特定の実施態様では、ＧＰ７３陽性がんは、肝がんである。この方法は、例えばセツキシマブ、トラスツズマブのような潜在的に相乗的な抗体、又はソラフェニブ、スニチニブ、レゴラフィニブのような小分子であるがこれらに限定されない追加的治療剤を個体に投与することを更に含み得る。更に、それぞれのＧＰ７３陽性腫瘍に有効な従来の化学療法とこれらの抗体との組み合わせは、有利であり得る。最後に、抗体は、介入の過程、例えば外科的切除又は経カテーテル動脈化学塞栓術（ＴＡＣＥ）のような腫瘍塞栓術の過程で加えられる。

【0033】

更に、本発明の抗原結合分子、好ましくは抗体、又は本発明のイムノコンジュゲート、又は本発明の薬学的組成物が、ＧＰ７３陽性がんの治療における使用のために提供される。

【0034】

いくつかの実施態様では、ＧＰ７３陽性細胞の増殖を阻害する方法が提供される。かかる方法は、細胞表面のＧＰ７３への本発明の抗原結合分子又は本発明のイムノコンジュゲートの結合を許容する条件下で、有効量の抗原結合分子又はイムノコンジュゲートを個体に投与し、それにより細胞の増殖を阻害することを含み得る。いくつかの実施態様では、増殖の阻害は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）及びウェスタンブロットから選択される方法によって検出され得る。いくつかの実施態様では、ＧＰ７３陽性細胞は、肝がん細胞である。

【0035】

いくつかの実施態様では、生物学的試料中のヒトＧＰ７３を検出する方法が提供される。該方法は、天然に存在するヒトＧＰ７３への抗原結合分子の結合を許容する条件下で、本発明の抗原結合分子と生物学的試料とを接触させること、及び生物学的試料中に抗原結合分子と天然に存在するヒトＧＰ７３との複合体が形成されているかどうかを検出することを含む。いくつかの実施態様では、検出は、免疫組織化学、イメージング、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及び蛍光標識細胞分取から選択される方法を伴い得る。いくつかの実施態様では、生物学的試料は、肝がん細胞、子宮内膜がん腫細胞、卵巣がん腫細胞又は黒色腫細胞を含む試料であり得る。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】正常組織及び罹患組織及び腫瘍組織におけるＧＰ７３の発現を示す。ＧＰ７３の発現は、Ｓｉｇｍａ及びＳａｎｔａ Ｃｒｕｚからのポリクローナルウサギ及びポリクローナルヤギ抗体によって決定された。

【図2】異種間のエピトープ異なる種におけるＧＰ７３抗原の相同性が示されている。

【図3A】ＧＰ７３タンパク質の模式図ＧＰ７３の細胞内部分は、ｉＧＰ７３と表される。ＧＰ７３の膜貫通部分は、ｔＧＰ７３と表される。ｒＧＰ７３は、タンパク質分解切断後に細胞膜に結合した細胞外空間に存在し、後に細胞内に内部移行されるＧＰ７３の残りを表す。これは、本発明の抗原結合分子の、特に抗体の特異的エピトープは、ＧＰ７３の切断された可溶性部分である。アミノ酸Ｎ１０９、Ｎ１４４、Ｃ１５９、Ｃ１７０、Ｏ２１８、Ｏ２３５及びＮ３９８の推定二次修飾部位がマークされている。

【図3B】ゴルジ装置から細胞膜へエキソサイトーシスにより輸送されるＧＰ７３の模式図。例えば炎症などの特定の条件下では、ＧＰ７３は、残基５５でのタンパク質分解切断によるプロセシングを受けて、可溶性ＧＰ７３（ｓＧＰ７３）及び、細胞外空間に存在する、切断後に細胞膜に結合したＧＰ７３の残り（ｒＧＰ７３という）になる。

【図3C】抗体Ｇ２－２とＧ２－１の結合部位を示す、ＧＰ７３の模式図。いずれかの抗体の結合により、残基５５のタンパク質分解切断部位は遮断される。

【図3D】治療標的としてのＧＰ７３の模式図Ａ：切断されていないＧＰ７３；Ｂ：切断されたＧＰ７３；Ｃ：タンパク質分解切断後、ｒＧＰ７３は、エンドサイトーシスによって細胞内に回収される。ネオ抗原ｒＧＰ７３は、特異的抗体、例えばＧ２－２によって結合される；Ｄ：ｒＧＰ７３及び抗体又はＡＤＣは、エンドサイトーシスによって細胞内に共輸送される。ＡＤＣの細胞内移動の後、毒素（星印）は、細胞損傷及び死をもたらす。

【図4】Ａ：ヒトタンパク質アトラスに公開された免疫蛍光画像を示す。Ｓｉｇｍａからのポリクローナルウサギ由来抗体（ＨＰＡ０１０６３８）は、ｍＧ２－２よりも更にＣ末端側でＧＰ７３に結合する。これらの抗体の典型的なゴルジ染色が示されている（左向き矢印）。Ｂ：Ａｌｅｘａｎｄｅｒ細胞上でＣ末端抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚからのｓｃ－４８０１０）（左向き矢印）及びｍＧ２－２（下向き矢印）を用いた二重染色。ゴルジ装置で染色の重複（先端が触れている２本の矢印）があるが、ｍＧ２－２の排他的な外膜染色（下向きの矢印）がある。

【図5】抗ｒＧＯＬＰＨ抗体Ｇ２－２及びコントロールによる組織の免疫組織化学的染色。実施例３に記載のように、Ａ：正常肝；Ｂ：肝炎肝；Ｃ及びＤ：肝細胞がん腫（ＨＣＣ）のパラフィン包埋組織をマウスＧ２－２（ｍＧ２－２）（Ａ，Ｂ，Ｃ）又は抗ＧＰ７３抗体ＭＯ６Ａ（Ｓｉｇｍａ）を用いて染色した後、抗マウス抗体を用いて二次染色し、顕微鏡下で４０倍の倍率で検査した。

【図6】細胞株ＲＡＭＯＳ（Ｂ細胞起源）、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓起源）及びＧＰ７３－ｍｙｃを発現するＨＥＫ２９３（ＨＥＫ ２９３ ＧＰ７３－ｍｙｃ）を、Ｇ２－２、Ｇ２－１、Ｇ２－４、抗Ｍｙｃ抗体又は抗ＣＤ１９抗体（後者はｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）で染色した。実施例４の通り、細胞の表面染色の検出は実線で示され、二次抗体コントロールの検出のみが破線で示されている。

【図7】ヒト肝細胞がん細胞腫株ＨｕＨ７及びＪＨＨ４上の異なる抗体（ｍＧ２－２、Ｇ２－１、Ｇ２－４及びポリクローナルヤギ抗体ＳＣ－４８０１０）を用いて試験した、ＧＰ７３表面発現。それぞれの細胞株の陽性度は、実施例４に記載の通り、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表される。

【図8】競合ＥＬＩＳＡアッセイ結合抗体としてホースラディシュ・ペルオキシダーゼ標識Ｇ２－１（Ｇ２－１－ＨＲＰ）又はＧ２－２（Ｇ２－２－ＨＲＰ）及び競合抗体としてＧ２－１又はＧ２－２を用いて、ペプチドＥＬＩＳＡを実施した。競合的阻害は、Ｇ２－１とＧ２－２－ＨＲＰ及びＧ２－２とＧ２－１－ＨＲＰ（黒三角）について示されている。実施例５に記載の通り、ＧＰ７３のペプチドＡＡ ３６－５５への結合は、ポジティブコントロールとして機能し（黒丸）、ネガティブコントロールは、無関係のペプチドへの結合であった（黒菱形）。

【図9】Ｇ２－１及びＧ２－２の、ｐＨ依存性ペプチド結合ＧＰ７３のペプチドＡＡ ３６－５５への結合のｐＨ依存性について試験するために、ペプチドＥＬＩＳＡを実施した。実施例５に記載されているように、抗体Ｇ２－１とＧ２－２の双方についての安定な結合は、７．４‐５．４のｐＨ範囲で実証されている。

【図10】フローサイトメトリーによるＧ２－２及びＧ２－１の内部移行実験マウス肝がん細胞株及びヒト前立腺がん細胞株ＤＵ１４５へのＧ２－２の内部移行が、フローサイトメトリーによって試験される。１５分後、実施例６に記載されているように、Ｇ２－２及びＧ２－１の細胞表面検出は３０％未満に低下し、これは３７℃での急速な内部移行を示す。

【図11】Ｇ２－２及びコントロールの細胞環境に応じた内部移行各抗体に結合したｐＨ感受性色素ｐＨｒｏｄｏ Ｇｒｅｅｎを用いて、ＦＡＣＳにより抗体内部移行を測定した。この色素は、ｐＨ５．４未満でのみ、すなわち抗体のエンドソームへの内 部移行及び移動後にのみ、蛍光を呈する。可溶性ＧＰ７３を含む条件培地でのプレインキュベーションは、ｓＧＰ７３のＣ末端部分に結合する抗体であるＧ２－４の内部 移行を減少させる。ｒＧＰ７３に結合するＧ２－２の内部移行は、実施例６に記載されているように、変化しない。

【図12】ＧＰ７３へのＧ２－２又はＧ２－１の結合に応じたフーリン切断の定量化０ユニットから３ユニットのフーリンの範囲を用いたＧＰ７３切断の測定値を示す。Ｇ２－２又はＧ２－１とのプレインキュベーションは、実施例７に記載のように、フーリン切断（３Ｕ及び１．５Ｕ）に有意な減少をもたらす。

【図13A】異なる抗体で処理した後のＨｕＨ７細胞（ヒト肝細胞がん腫）の増殖。Ｇ２－２、Ｇ２－２＋セツキシマブ；ｍＧ２－２、ｍＧ２－２＋セツキシマブ；セツキシマブ又はコントロール抗体で、それぞれ０．１２５ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌまで濃度を漸増させながらＨｕＨ７細胞を処理した。７２時間後に増殖細胞を測定した。細胞増殖は抗体濃度に応じて減少した。この効果は、実施例８に記載の通り、Ｆｃ部分、すなわちＧ２－２中のヒトＩｇＧ１又はｍＧ２－２中のマウスＩｇＧ２ａとは無関係であった。

【図13B】異なる抗体で処理した後のＨｕＨ７細胞（ヒト肝細胞がん）、４Ｔ１細胞（マウス乳がん）及びＣａＣｏ２細胞（ヒト結腸直腸がん）の増殖。この３種の細胞株をＧ２－１；Ｇ２－１＋セツキシマブ；セツキシマブ；ベバシズマブ；又はベバシズマブ＋セツキシマブ（合計２ｍｇ／ｍｌ）で処理した。７２時間後に増殖細胞を測定した。実施例８に記載されているように、ＨｕＨ７細胞においてＧ２－１とセツキシマブの相加効果がある。

【図14】Ｇ２－２に結合した、マラミド（Malamide）交換リンカーに結合したＭＭＡＦから成る抗体薬物コンジュゲートをＨｕＨ７細胞に添加した。右の曲線（三角）は、ＩＣ５０ ２７７ｎＭの薬物成分により決定されたＭＭＡＦの毒性を示す。中央の曲線（四角）は、抗体成分により決定された６．３４ｎＭのＩＣ５０を有するＧ２－２－Ｍａｌ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦを示す。左の曲線（丸）は、実施例９及び１０に記載の通り、薬物成分により決定された０．１２４ｎＭのＩＣ５０を有するＧ２－２－Ｍａｌ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦを示す。

【図15】ＨｕＨ７異種移植マウスモデルの腫瘍増殖モデル。皮下ヒト肝細胞がん（ＨｕＨ７）を有するＢｕｌｂ／ｃネイキッドマウスを、０日目に２ｍｇ／ｋｇのＧ２－２－ＰＮＵ（ＡＤＣ）と７日目に１ｍｇ／ｋｇのＧ２－２－ＰＮＵで、０日目と７日目に２ｍｇ／ｇのＧ２－２（ネイキッドｍＡＢ）で、２回、すなわち１日目と７日目にＧ２－２（ネイキッドｍＡＢ）及びＰＮＵ（ａｄ ｍｉｘ）又はＰＢＳ（ビヒクル）で処理した。ＡＤＣ群とビヒクル群との間の腫瘍増殖の差は、実施例１１に記載の通り、２１日目で統計的に有意になる（一方向ＡＮＯＶＡ ｐ＝０．５；ＳＰＳＳ １８．０）。

【図16】ＨＵＨ７異種移植マウスモデルのカプランマイヤー生存曲線。ＡＤＣ群とビヒクル群との間の生存性の差は、統計的に有意である（ログランク／ブレスロー／タローン・ウェアｐ＝０．０２；ＳＰＳＳ １８．０）。

【図17】免疫組織化学：実施例３に記載の通り、卵巣がんを抗ＧＰ７３抗体ＭＯ６（Ｓｉｇｍａ）及びｍＧ２－２で染色し、続いて抗マウス抗体で二次染色し、顕微鏡下で倍率１００ｘで検査した。

【図18】免疫組織化学： 実施例３に記載の通り、子宮内膜がんをＭＯ６及びｍＧ２－２で染色し、続いて抗マウス抗体で二次染色し、顕微鏡下で倍率１００ｘで検査した。

【図19】免疫組織化学：実施例３に記載の通り、黒色腫をＭＯ６及びｍＧ２－２で染色し、続いて抗マウス抗体で二次染色し、顕微鏡下で倍率４０ｘで検査した。

【図20】実施例１３に記載の、結合アッセイに使用されている組換えタンパク質及びペプチドを示す模式図。Ｃ末端に１０×Ｈｉｓタグを有する完全長ＧＰ７３（ＡＡ １－４０１）は、ＡＡ ５５でのタンパク質分解切断後にｓＧＰ７３－Ｈｉｓとして分泌される。したがってｓＧＰ７３－Ｈｉｓは、Ｃ末端に１０×Ｈｉｓタグを有するＡＡ ５６－４０１を包含する。対照的に、細胞内部分（ｉＧＰ７３ ＡＡ １－１２）及び膜貫通ドメイン（ｔＧＰ７３ ＡＡ １３－３５）を欠く変異バリアント（Ｒ５２Ａ）であるＧＰ７３ ＡＶＲＲは、分泌されるが切断されないため、ＡＡ ３６－４０１及びＣ末端の１０×Ｈｉｓタグを包含する。

【図21A-C】ｓＧＰ７３－ＨＩＳとＧＰ７３－ＨｉｓＡＶＲＲで比較した、（Ａ）：アイソタイプコントロール抗体、（Ｂ）：中華人民共和国特許第１０５７３４０５９号に記載のモノクローナルマウス抗体である８Ａ１０（ＩｇＧ２ａ）、及び（Ｃ）：Ｇ２－２ｏｐｔｉ（ＩｇＧ２ａ）の結合曲線。（Ｃ）のみが、実施例１３に記載の、クレームされているエピトープＡＡ ３６－５５を含むＧＰ７３を包含する。

【図22A-C】実施例１３に記載の、クレームされているエピトープであるペプチドｒＧＰ７３（ＧＰ７３ ＡＡ ３６－５５）と無関係のコントロールペプチドで比較した、（Ａ）：アイソタイプコントロール抗体、（Ｂ）：中華人民共和国特許第１０５７３４０５９号に記載のモノクローナルマウス抗体である８Ａ１０（ＩｇＧ２ａ）、及び（Ｃ）：Ｇ２－２ｏｐｔｉ（ＩｇＧ２ａ）の結合曲線。

【図23】２９３ＨＥＫ ＧＰ７３－Ｈｉｓ完全長細胞をベバシズマブ又はＧ２－２ｏｐｔｉ（ＩｇＧ１）で処理した後の細胞培養上清中のｓＧＰ７３の測定値。フーリン切断は、上清中にｓＧＰ７３が出現するための必須条件である。漸増濃度のＧ２－２ｏｐｔｉ（ＩｇＧ１）は、フーリン切断を遮断し、ＧＰ７３濃度を低下させる。

【図24】異なるヒトがん由来の細胞株を１ｍｇ／ｍｌの抗体Ｇ２－２ｏｐｔｉ（ＩｇＧ１）又はＧ２－２ｏｐｔｉ－ＥＥＤ（ＩｇＧ１）又はセツキシマブ又はベバシズマブで９６時間処理した。未処理コントロールの増殖と比較した相対的増殖（％）が示されている。試験したがんの実体は、実施例１５に記載の通り、結腸直腸がん（ＨＣＴ１１６；Ｋ－Ｒａｓ変異Ｇ１２Ｖを含むＳＷ４０；ＣａＣｏ２）、卵巣がん（ＳＫＯＶ３）、肝がん（ＨＵＨ７、Ｈｅｐａ１－６）、前立腺がん（ＤＵ１４５、ＰＣ３）、及び肺がん（ＥＧＦＲ変異Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒを含むＨ１９７５）である。

【発明を実施するための形態】

【0037】

「抗原結合分子」は、本明細書で用いられる場合、抗原に特異的に又は選択的に結合することができる任意の分子である。結合分子は、抗体若しくはその断片を含み得るか又はそれらであり得る。抗ＧＰ７３結合分子は、上で更に詳述したように、特異的認識部位、エピトープでＧｐ７３抗原に結合する分子、例えば抗ＧＰ７３抗体又はその断片である。すなわち、本発明の抗原結合分子は、配列番号３０、３１及び／又は３２のいずれか１つのアミノ酸配列内のエピトープに結合する。他の抗ＧＰ７３結合分子はまた、多価分子、多重特異性分子（例えばダイアボディ）、融合分子、アプチマー、アビマー、又は他の天然に存在する若しくは組換えにより作製された分子を含み得る。本発明において有用な例示的抗原結合分子は、抗体様分子を含む。抗体様分子は、標的分子に結合することによって機能を発揮することができる分子であり（例えばCurrent Opinion in Biotechnology 2006, 17:653-658; Current Opinion in Biotechnology 2007, 18:1-10; Current Opinion in Structural Biology 1997, 7:463-469; Protein Science 2006, 15:14-27参照）、例えばＤＡＲＰｉｎ（国際公開第２００２／０２０５６５号）、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（国際公開第１９９５／００１９３７号）、Ａｖｉｍｅｒ（国際公開第２００４／０４４０１１号；国際公開第２００５／０４０２２９号）、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（国際公開第２００２／０３２９２５号）、及びフィノマー（国際公開第２０１３／１３５５８８号）を含む。

【0038】

本明細書で用いられる「抗ＧＰ７３抗体」及び「ＧＰ７３に結合する抗体」又は単に「抗体」という用語は、ＧＰ７３を標的とする際に診断薬及び／又は治療剤として有用であるように十分な親和性でＧＰ７３に結合可能な抗体を指す。一実施態様において、抗ＧＰ７３抗体の、無関係な非ＧＰ７３タンパク質への結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で測定して、抗体のＧＰ７３への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、ＧＰ７３に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦５ｎｍ、≦４ｎＭ、≦３ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０^－８Ｍ以下、例えば１０^－８Ｍ‐１０^－１３Ｍ、例えば１０^－９Ｍ‐１０^－１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。特定の実施態様では、抗ＧＰ７３抗体は、異なる種由来のＧＰ７３間で保存されている、ＧＰ７３のエピトープに結合する。上で更に詳述したように、本発明の抗体は、ＧＰ７３細胞外部分内の特定のピトープに結合する。特に、本発明の抗体は、配列番号３０、３１及び／又は３２のアミノ酸配列内のエピトープに結合する。用語「抗体」は通例、本明細書では最も広い意味で用いられ、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び抗体断片（所望の抗原結合活性を示す限り）を含むがこれらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。本発明内の抗体はまた、キメラ抗体、組換え抗体、組換え抗体の抗原結合断片、ヒト化抗体、又はファージの表面に提示されているか若しくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の表面に提示されている抗体であり得る。

【0039】

抗体の「抗原結合断片」は、インタクトな抗体の一部分を含み、且つ、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。

【0040】

タンパク質の特定の領域内の「エピトープに結合する抗体」は、タンパク質に結合するのにその領域内に１以上のアミノ酸の存在を必要とする抗体である。

【0041】

特定の実施態様では、タンパク質の限定された領域内の「エピトープに結合する抗体」は、変異解析によって同定され、ここで、タンパク質のアミノ酸は変異しており、得られた改変タンパク質（例えばエピトープを含む改変タンパク質）への抗体の結合は、未改変タンパク質への結合の少なくとも２０％であると決定される。いくつかの実施態様では、タンパク質の限定された領域内の「エピトープに結合する抗体」は、変異解析によって同定され、ここで、タンパク質のアミノ酸は変異しており、得られた改変タンパク質（例えばエピトープを含む改変タンパク質）への抗体の結合は、未改変タンパク質への結合の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％であると決定される。ある実施態様では、抗体の結合は、ＦＡＣＳ、ＷＢによって、又はＥＬＩＳＡなどの適切な結合アッセイによって決定される。

【0042】

本発明の文脈で提供される抗体又はその抗原結合断片は、上で定義した「抗ＧＰ７３抗体又はその抗原結合断片」である限り、特に限定されない。したがって該抗体は、配列番号３０、３１及び／又は３２のアミノ酸配列内のエピトープに特異的に結合する／それらを特異的に認識する／それらと相互作用する任意の抗体であり得る。したがって本発明はまた、本明細書で提供される任意の特定の抗体と同じエピトープに結合する抗体も提供する。

【0043】

本発明の文脈で使用される「に結合する」という用語は、互いに少なくとも２つの「抗原相互作用部位」の結合（相互作用）を意味する。「抗原相互作用部位」という用語は、本発明によれば、ＧＰ７３の特定の抗原又は抗原の特定の群との特異的相互作用の能力を示す、ポリペプチドのモチーフ、すなわち本発明の抗体の一部又は抗原結合断片を意味する。前記結合／相互作用はまた、「特異的認識」を意味するとも理解される。「特異的に認識する」という用語は、本発明によれば、抗体が、本明細書に記載のＧＰ７３の少なくとも２のアミノ酸と特異的に相互作用及び／又は結合、特に配列番号３０、３１及び／又は３２．のアミノ酸配列内の少なくとも２のアミノ酸と相互作用／結合することができることを意味する。

【0044】

本発明に従って用いられる「特異的相互作用」という用語は、本発明の抗体又はその抗原結合断片が類似の構造のポリ）ペプチドと交差反応しないか又は本質的に交差反応しないことを意味する。したがって、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３０、３１及び／又は３２．のアミノ酸配列内の特定のアミノ酸によって形成されたＧＰ７３の構造と特異的に結合／相互作用する。かかる分子の特定の具体例は、本明細書で提供されている。

【0045】

調査対象である抗原結合分子、特に抗体又はその抗原結合断片のパネルの交差反応性は、例えば、一般的な条件下で前記抗体又はその抗原結合断片のパネルの、目的の（ポリ）ペプチドへの結合及び多かれ少なかれ（構造的及び／又は機能的に）密接に関連した複数の（ポリ）ペプチドへの結合を評価することによって試験することができる（例えばHarlow 及びLane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)及びUsing Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1999)参照）。本明細書に記載されているＧＰ７３の特定の構造、例えば本明細書に記載されているＧＰ７３の特定のエピトープ又は（ポリ）ペプチド／タンパク質に結合するが、同じＧＰ７３の他のいかなるエピトープ又は（ポリ）ペプチドにも結合しないか又は本質的に結合しないコンストラクト（すなわち抗体、その抗原結合断片など）だけが目的のエピトープ又は（ポリ）ペプチド／タンパク質に特異的であると考えられ、本明細書で提供されている方法に従って更なる研究のために選択される。これらの方法は特に、構造的及び／又は機能的に密接に関連した分子についての結合研究、遮断及び競合研究を含み得る。これらの結合研究はまた、ＦＡＣＳ解析、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、例えばＢＩＡｃｏｒｅOを用いる）、超遠心分析法、等温滴定熱量測定、蛍光偏光測定法、蛍光分光法又は放射標識リガンド結合アッセイによるものを含む。

【0046】

したがって特異性は、当該技術分野で既知の方法及び本明細書に記載の方法によって実験で決定することができる。かかる方法は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ－、ＲＩＡ－、ＥＣＬ－、ＩＲＭＡ試験及びペプチドスキャンを含むがこれらに限定されない。

【0047】

本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、少量で存在し得る自然に生じる可能性のある変異変異体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。モノクローナル抗体は、それらがハイブリドーマ培養によって合成され、本質的に他の免疫グロブリンによって汚染されていないという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団の中のものであるという抗体の特徴を指しており、抗体を何か特定の方法で作製しなければならないことを意味するものではない。前述の通り、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６（１９７５），４９５に記載のハイブリドーマ法によって作製することができる。

【0048】

本明細書で使用される「ポリクローナル抗体」という用語は、１以上の他の非同一抗体の間で又はそれらの存在下で産生された抗体を指す。一般に、ポリクローナル抗体は、非同一抗体を産生したいくつかの他のＢリンパ球の存在下で、Ｂリンパ球から産生される。通常、ポリクローナル抗体は、免疫動物から直接得られる。

【0049】

本明細書で使用される「完全ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を指す。完全ヒト抗体は、マウスにおいて、マウス細胞において又はマウス細胞に由来するハイブリドーマにおいて産生される場合、マウスの炭水化物鎖を含み得る。同様に「マウス抗体」又は「マウスの抗体」は、マウス／マウスの免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を指す。完全ヒト抗体は、マウスにおいて、ラット細胞において又はラット細胞に由来するハイブリドーマにおいて産生される場合、ラットの炭水化物鎖を含み得る。同様に、「ラット抗体」という用語は、ラット免疫グロブリン配列のみを含む抗体を指す。完全ヒト抗体は例えば、広く使用されているスクリーニング技術であって、完全ヒト抗体の産生及びスクリーニングを可能にするファージディスプレイによっても産生され得る。ファージ抗体も本発明に関して使用することができる。ファージディスプレイ法は、例えば米国特許第５４０３４８４号、同第５９６９１０８号、及び同第５８８５７９３号に記載されている。完全ヒト抗体の開発を可能にする別の技術は、マウスハイブリドーマ技術の改変を伴う。マウスは、自身のマウス遺伝子と引き換えにヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むようにトランスジェニックされる（例えば米国特許第５８７７３９７号参照）。

【0050】

用語「キメラ抗体」とは、（ヒト又は非ヒト（例えばマウス、ウマ、ウサギ、イヌ、ウシ、ニワトリ）種の）他の抗体由来の抗体領域（例：定常領域）と融合又はキメラ化した、本発明の可変領域を含む抗体を指す。

【0051】

抗体という用語はまた、組換えヒト抗体、異種抗体、及びヘテロハイブリッド抗体を指す。「組換え（ヒト）抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物（例：マウス）から単離された抗体など、組換え手段によって調製、発現、作製若しくは単離されるすべてのヒト配列抗体、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現される抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作製若しくは単離される抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域（存在する場合）を有する。しかしながら、かかる抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックな動物を使用する場合にはｉｎ ｖｉｖｏ体細胞突然変異誘発）に供することができ、したがって組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨ及びＶＬ配列に由来し、関連しているが、ｉｎ ｖｉｖｏではヒト抗体生殖細胞系レパートリー内に天然に存在しない可能性がある配列である。

【0052】

「異種抗体」は、このような抗体を産生するトランスジェニック非ヒト有機体に関連して説明される。この用語は、トランスジェニック非ヒト動物から成っておらず、且つ一般にトランスジェニック非ヒト動物以外の種に由来する有機体でみられるアミノ酸配列又はコード核酸配列に対応する、アミノ酸配列又はコード核酸配列を有する抗体を指す。

【0053】

「ヘテロハイブリッド抗体」という用語は、異なる有機体起源の軽及び重鎖を有する抗体を指す。例えば、マウス軽鎖と会合したヒト重鎖を有する抗体は、ヘテロハイブリッド抗体である。ヘテロハイブリッド抗体の例には、キメラ及びヒト化抗体が含まれる。

【0054】

抗体という用語は、ヒト化抗体にも関する。非ヒト（例えばマウス又はウサギ）抗体の「ヒト化」形態とは、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（例えば抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は他の抗原結合サブ配列）である。ヒト化抗体は多くの場合、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギなどの非ヒト種のＣＤＲ由来の残基（ドナー抗体）により置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入されたＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。これらの改変は、抗体性能を更に改善し、最適化するために行われる。ヒト化抗体は一般に、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここでＣＤＲ領域のすべて又は実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべて又は実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、少なくとも免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の一部を含み得る。更なる詳細は、ＪｏｎｅｓＮａｔｕｒｅ ３２１（１９８６），５２２－５２５；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ Ｎａｔｕｒｅ ３３２（１９９８），３２３－３２７、及びＰｒｅｓｔａ Ｃｕｒｒ Ｏｐ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ２（１９９２），５９３－５９６を参照されたし。

【0055】

抗体のヒト化のための一般的な方法は、ＣＤＲ移植を伴い、そこでは非ヒト「ドナー」抗体からの機能的抗原結合部位がヒト「アクセプター」抗体に移植される。ＣＤＲ移植法は、当該技術分野で既知であり、例えば米国特許第５２２５５３９号、同第５６９３７６１号、及び同第６４０７２１３号に記載されている。別の関連する方法は、遺伝子再構成及び遺伝子変換を受けることができる１つ以上のヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含有するように遺伝子操作されているトランスジェニック動物からのヒト化抗体の産生である（例えば米国特許第７１２９０８４号参照）。

【0056】

したがって本発明の文脈において、「抗体」という用語は、完全免疫グロブリン分子及びかかる免疫グロブリン分子の一部（すなわち「その抗原結合断片」）を指す。上述のように、この用語は更に、修飾及び／又は改変抗体分子も指す。この用語はまた、組換え的又は合成的に生成／合成された抗体も指す。この用語はまた、インタクトな抗体とその抗体断片、例えば分離された軽及び重鎖、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２も指す。抗体という用語はまた、完全ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植抗体、及び一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）又は抗体融合タンパク質などの抗体コンストラクトを含むが、これらに限定されない。

【0057】

「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、本発明の文脈では、抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインを有し、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドはＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインの間に、ｓｃＦＶが抗原結合に望ましい構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを更に含む。単鎖抗体の産生のための技術は、例えばＰｌｕｃｋｔｈｕｎのＴｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），２６９－３１５に記載されている。

【0058】

本明細書で使用される「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖、並びに１つの重鎖のＣ_Ｈ１及び可変領域から成る。Ｆａｂ分子の重鎖は、他の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することはできない。

【0059】

「Ｆｃ」領域は、抗体のＣ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３ドメインを含む２つの重鎖断片を含む。２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合によって、及びＣ_Ｈ３ドメインの疎水性相互作用によって結合される。

【0060】

「Ｆａｂ’断片」は、鎖間ジスルフィド結合が２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖間に形成され、Ｆ（ａｂ’）_２分子が形成され得るように、１つの軽鎖と、Ｖ_Ｈドメイン及びＣ_Ｈ１ドメインを含む１つの重鎖の一部と、Ｃ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｈ２ドメインとの間の領域とを含む。

【0061】

「Ｆ（ａｂ’）_２断片」は、鎖間ジスルフィド結合が２つの重鎖間に形成されるように、２つの軽鎖及び、Ｃ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｈ２ドメインの間の定常領域の一部を含む２つの重鎖を含む。したがってＦ（ａｂ’）_２断片は、２つの重鎖間のジスルフィド結合によって結合される２つのＦａｂ’断片で構成されている。

【0062】

「Ｆｖ領域」は、重鎖と軽鎖双方の可変領域を含むが、定常領域を欠く。

【0063】

本発明に従って使用される抗体、抗体コンストラクト、抗体断片、抗体誘導体（すべてＩｇ由来）又はそれらの対応する免疫グロブリン鎖は、当該技術分野で既知の従来の技術を使用して、例えばアミノ酸欠失、挿入、置換、付加、及び／若しくは組換え、並びに／又は当該技術分野で既知の他の任意の改変を単独で又は組み合わせて用いることによって、更に改変することができる。免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の基礎となるＤＮＡ配列にこのような改変を導入するための方法は、当業者によく知られている。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ（１９８９），ｌｏｃ．ｃｉｔを参照のこと。「Ｉｇ由来ドメイン」という用語は特に、少なくとも１つのＣＤＲを含む（ポリ）ペプチドコンストラクトに関する。列挙されたＩｇ由来ドメインの断片又は誘導体は、上記の抗体分子の一部であり、且つ／又は化学的／生化学的又は分子生物学的方法によって改変されている（ポリ）ペプチドを指す。対応する方法は、当該技術分野で知られており、特に実験室マニュアルに記載されている（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd edition (1989) and 3rd edition (2001); Gerhardt et al., Methods for General and Molecular Bacteriology ASM Press (1994); Lefkovits, Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press (1997); Golemis, Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002)参照）。

【0064】

本明細書で使用される「ＣＤＲ」という用語は、「相補的決定領域」を指し、これは当該技術分野においてよく知られている。ＣＤＲは、前記分子の特異性を決定し、特定のリガンドと接触する免疫グロブリンの一部である。ＣＤＲは、分子の最も可変的な部分であり、前記分子の多様性に寄与する。各Ｖドメインには、３つのＣＤＲ領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３がある。ＣＤＲ－Ｈは、可変重鎖のＣＤＲ領域を表し、ＣＤＲ－Ｌは、可変軽鎖のＣＤＲ領域を指す。ＶＨは可変重鎖を意味し、ＶＬは可変軽鎖を意味する。Ｉｇ由来領域のＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔ 「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，第５版．ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１－３２４２アメリカ合衆国保健福祉省（１９９１）；Ｃｈｏｔｈｉａ Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７），９０１－９１７又はＣｈｏｔｈｉａ Ｎａｔｕｒｅ ３４２（１９８９），８７７－８８３に記載されているように決定することができる。

【0065】

したがって本発明に関して、上記の抗体分子は、完全抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ又はＩｇＥなどの免疫グロブリン）、Ｆ（ａｂ）－、Ｆａｂ’－ＳＨ－、Ｆｖ－、Ｆａｂ’－、Ｆ（ａｂ’）２断片、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、完全ヒト抗体、二価抗体コンストラクト、抗体融合タンパク質、合成抗体、二価単鎖抗体、三価単鎖抗体、及び多価単鎖抗体から成る群より選択される。

【0066】

「ヒト化手法」は、当該技術分野において良く知られており、特に抗体分子、例えばＩｇ由来分子についての記述がある。「ヒト化」という用語は、非ヒト抗体由来の配列の一部を含む非ヒト（例えばマウス）抗体又はその断片（例えば抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）、ｓｃＦｖ、又は他の抗原結合部分配列）のヒト化形態を指す。ヒト化抗体には、ヒト免疫ブロブリンの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の結合性、特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギなどの非ヒト種のＣＤＲ由来の残基により置き換えられているヒト免疫グロブリンが含まれる。ヒト化抗体は一般に、少なくとも１つ、通例２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここでＣＤＲ領域のすべて又は実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべて又は実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。最適には、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含むであろう。特にＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１（１９８６），５２２－５２５，Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２（１９９２），５９３－５９６を参照のこと。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該技術分野でよく知られている。ヒト化抗体は一般に、その抗体の元の結合活性を依然として保持している非ヒトである供給源からそれに導入された１つ以上のアミノ酸を有する。抗体／抗体分子のヒト化のための方法は、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１（１９８６），５２２－５２５；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２（１９８８），３２３－３２７；及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９（１９８８），１５３４－１５３６に更に詳述されている。ヒト化抗体の具体例、例えばＥｐＣＡＭに対する抗体は、当該技術分野で既知であり、例えばＬｏＢｕｇｌｉｏ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ａｂｓｔｒａｃｔ（１９９７），１５６２、及びＫｈｏｒ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ａｂｓｔｒａｃｔ（１９９７），８４７を参照のこと。

【0067】

したがって本発明に関して、ヒト化されており、薬学的組成物において首尾よく使用することができる抗体分子又はその抗原結合断片が提供される。

【0068】

本発明の抗体又は抗原結合断片の特異性は、上記の抗体又は抗原結合断片のアミノ酸配列の性質によってだけでなく、抗体が結合できるエピトープによっても示され得る。したがって本発明は、一実施態様において、本発明の抗体、好ましくは抗体Ｇ２－２ｏｐｔｉと同じエピトープを認識する抗ＧＰ７３抗体又はその抗原結合断片に関する。実施例の節で示すように、エピトープは、配列番号３０、３１及び／又は３１、すなわち配列番号１によって示されるＧＰ７３の、ＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＭＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３０）、ＳＳＲＳＶＥＬＱＴＲＩＶＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３１）及び／又はＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＶＥＬＥＧＲＶＲＲ（配列番号３２）のアミノ酸配列内に位置するリニアエピトープである。好ましい実施態様では、本発明の抗体によって結合されるエピトープは、配列番号３０のアミノ酸配列ＲＩＭＥＬＥＧＲＶＲＲ内、より好ましくはアミノ酸配列ＥＧＲＶＲＲ内にある。

【0069】

当業者には、エピトープはＧＰ７３タンパク質に含まれてもよいがその分解生成物に含まれてもよく、又は化学合成ペプチドであってもよいことが理解され得る。アミノ酸位置は、タンパク質の配列中の、対応するアミノ酸配列の位置を明らかにするために示されているにすぎない。本発明は、エピトープを含む全てのペプチドを包含する。ペプチドは、長さ１００超のアミノ酸から成るポリペプチドの一部であっても、又は００未満、好ましくは５０未満、より好ましくは２５未満のアミノ酸、更に一層好ましくはｌ１６未満のアミノ酸から成る小さいペプチドであってもよい。かかるペプチドのアミノ酸は、天然アミノ酸又は非天然アミノ酸（例：ベータアミノ酸、ガンマアミノ酸、Ｄ－アミノ酸）又はそれらの組み合わせであってもよい。更に、本発明は、エピトープのそれぞれのレトロインベルソペプチドを包含し得る。該ペプチドは、結合していなくても結合していてもよい。それは、例えば小分子（例：薬物又はフルオロフォア）に、高分子量ポリマー（例： ポリエチレングリコール （ＰＥＧ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）等）に、又はタンパク質、脂肪酸、糖部分に結合していても、或いは膜に挿入されてもよい。

【0070】

当該の抗体と本発明の抗体が同じエピトープを認識するかどうかを試験するために、以下の競合試験を実施することができる。３ｍｏｉ（感染多重度）で感染させたベロ細胞を２０時間後に、競合物として様々な濃度の当該の抗体と共に１時間インキュベートする。第２のインキュベーション工程において、本発明の抗体を１００ｎＭの一定濃度で塗布し、その結合を、本発明の抗体の定常ドメインに対する蛍光標識抗体を用いてフローサイトメトリーで検出する。当該の抗体の濃度に反比例する結合は、双方の抗体が同じエピトープを認識することを示している。とはいえ、使用され得る多くの他のアッセイが当該技術分野で知られている。

【0071】

本発明はまた、ＧＰ７３の天然のポリペプチド及び組換えポリペプチドに対する特異的抗体の製造にも関する。この製造は、例えばマウスなどの動物の免疫化に基づく。しかし、抗体／抗血清の製造のための他の動物もまた、本発明の範囲に想定されている。例えば、モノクローナル及びポリクローナル抗体は、ウサギ、マウス、ヤギ、ロバ等によって産生され得る。対応して選択されたＧＰ７３のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、適切なベクターにサブクローニングすることができ、ここで組換えポリペプチドは、発現が可能な有機体内、例えば細菌中で発現される。したがって、発現された組換えタンパク質をマウスに腹腔内注射することができ、結果として生じる特異的抗体は例えば、心臓内血管穿刺によって提供されるマウス血清から得ることができる。本発明はまた、添付の実施例に例示されているように、ＤＮＡワクチン戦略を用いることによる天然ポリペプチド及び組換えポリペプチドに対する特異的抗体の製造も想定している。ＤＮＡワクチン戦略は、当該技術分野でよく知られており、遺伝子銃又はジェット注射及び筋肉内若しくは皮内注射によるリポソーム媒介送達を包含する。従って、ＧＰ７３のポリペプチド又はタンパク質又はエピトープに対する抗体、特に本明細書で提供されている抗体のエピトープは、ＧＰ７３の所望のポリペプチド又はタンパク質若しくはエピトープ、特に本発明の抗体のエピトープ（配列番号３０、３１及び／又は３２のアミノ酸配列内にある）を発現するベクターを筋肉内に直接注射することによって動物を直接免疫することにより、得ることができる。得られた特異的抗体の量は、ＥＬＩＳＡを用いて定量化することができ、これもまた本明細書中以下に記載される。抗体を製造するための更なる方法は、当該技術分野でよく知られている。例えばＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８８を参照のこと。

【0072】

したがって、指定のアッセイ条件下では、ＧＰ７３の特定の抗体及び対応するエピトープは互いに結合し、試料中に存在する他の成分には有意な量では結合しない。このような条件下での標的分析物への特異的結合は、特定の標的分析物に対する特異性について選択される結合部分を必要とし得る。特定の抗原と特異的に反応性である抗体を選択するために、様々なイムノアッセイフォーマットを使用することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡ イムノアッセイは、分析物と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択するために日常的に使用されている。特異的免疫反応性を決定するために使用され得るイムノアッセイフォーマット及び条件の記述については、Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｄｅａｎ（２０００），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ及び／又はＨｏｗａｒｄ ａｎｄ Ｂｅｔｈｅｌｌ（２０００）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｃｒｃ．Ｐｒ．Ｉｎｃ．を参照のこと。特異的又は選択的反応は、典型的にはノイズに対するバックグラウンドシグナルの少なくとも２倍であり、より典型的にはバックグラウンドよりも１０－１００倍大きい。当業者は、新規ポリペプチドに対する特異的結合分子を提供及び生成する立場にある。特異的結合アッセイについては、それは望ましくない交差反応性を回避するために容易に使用することができ、例えばポリクローナル抗体は既知の方法により容易に精製及び選択することができる（Shepherd and Dean, loc. cit.参照）。

【0073】

抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１及びＩｇＡ２等のサブクラス（アイソタイプ）に更に分けられる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。

【0074】

本明細書で用いられる「細胞傷害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害若しくは防止し、且つ／又は細胞死若しくは破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害性剤は、限定されるものではないが、放射性同位体（例えばＡｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２、及びＬｕの放射性同位体）：化学療法剤又は薬物（例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；増殖阻害剤；酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素；抗生物質；小分子毒素等の毒素、又は細菌、真菌、植物若しくは動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又はバリアントを含む）、並びに以下に開示される種々の抗腫瘍剤又は抗がん剤を含む。

【0075】

「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例には：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；及びＢ細胞活性化が含まれる。

【0076】

薬剤、例えば薬学的製剤の「有効量」とは、必要な投与量及び期間で、所望の治療的又は予防的結果を達成するのに有効な量を指す。

【0077】

本明細書で使用される「エンドソームエスケープドメイン」（ＥＥＤ）という用語は、細胞内のエンドソーム循環プロセス（endosomal cycling process）を破壊し、細胞質内のエンドソーム含有量を放出し、それによって細胞機能を阻害若しくは防止し、且つ／又は細胞死若しくは破壊を引き起こすペプチドを指す。ＥＥＤには、デングウイルス及び他のウイルス由来のＥＥＤ及びそのバリアント、細菌由来のＥＥＤ、並びに２つの芳香族インドール環又は１つのインドール環及び２つの芳香族フェニル基を含むペプチドが含まれるが、これらに限定されない（国際公開第２０１６／０１５６２１号；国際公開第２０１６／０３７９８５号；Kiesgen et al., Protein Eng Des Sel. 27(10):331-7 (2014)及びLohn et al., Sci Rep. 6:32301 (2016))。

【0078】

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞とその子孫を指す。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、それには初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。本明細書には、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が含まれる。

【0079】

「イムノコンジュゲート」とは、細胞傷害性剤を含むがそれに限定されない、１以上の異種分子にコンジュゲートした抗体である。

【0080】

「個体」又は「対象」とは、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されるものではないが、家畜動物（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えばヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）を含む。特定の実施態様では、個体又は対象はヒトである。

【0081】

「単離された」核酸とは、その自然環境の成分から分離されている核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、核酸分子は、染色体外に、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。

【0082】

「抗ＧＰ７３抗体をコードする単離された核酸」は、抗体重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする１以上の核酸分子を指し、これには、単一のベクター又は別々のベクター中のそのような核酸分子、及び宿主細胞内の１つ以上の位置に存在するそのような核酸分子が含まれる。

【0083】

本明細書で使用される「ＧＰ７３」という用語は、任意の天然ＧＰ７３を指す。この用語は、特に断らない限り、霊長類（例えばヒト及びカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来のＧＰ７３を指す。この用語は、天然に存在するＧＰ７３のバリアント、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも含む。例示的なヒトＧＰ７３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に示される。非限定的な例示的マウスＧＰ７３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２９に示される。

【0084】

用語「ＧＰ７３陽性がん」は、表面にＧＰ７３を発現する細胞を含むがんを指す。いくつかの実施態様では、細胞表面のＧＰ７３の発現は例えば、免疫組織化学、ＦＡＣＳなどの方法でＧＰ７３に対する抗体を使用して決定される。或いは、ＧＰ７３ ｍＲＮＡ発現は、細胞表面のＧＰ７３の発現と相関すると考えられ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びＲＴ－ＰＣＲ（定量的ＲＴ－ＰＣＲを含む）から選択される方法により決定することができる。

【0085】

用語「がん」及び「がん性」は典型的には、無秩序な細胞成長／増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか又は説明している。がんの例としては、がん種、肝がん、肝細胞がん、胃がん、肺がん、食道がん、乳がん、前立腺がん、リンパ腫（例：ホジキン及び非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれるが、これらに限定されない。

【0086】

用語「ＧＰ７３陽性細胞」は、表面に完全長又は部分的なＧＰ７３を発現する細胞を指す。

【0087】

参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを得るように配列をアラインさせ、必要に応じてギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの一般的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列をアラインさせるための適切なパラメーターを決定することができる。

【0088】

用語「薬学的製剤」又は「薬学的組成物」は、その中に含有されている活性成分の生物学的活性が有効になることを可能にするような形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である追加の成分を含まない調製物を指す。

【0089】

「薬学的に許容される担体」とは、有効成分以外の薬学的製剤中の成分であって、対象に対して非毒性である成分を指す。薬学的に許容される担体には、限定されないが、バッファー、添加剤、安定剤又は保存剤が含まれる。

【0090】

本明細書で用いられる場合、「治療（treatment）」（及び「治療する（treat）」又は「治療すること（treating）」など、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のため、又は臨床病理の過程において実施され得る。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移の予防、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。

【0091】

本明細書で使用される用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター及び導入された宿主細胞のゲノムに取り込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それが作動可能に連結された核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」という。

【0092】

［一価の基］
本明細書で使用される場合、用語「アルキル」とは、直鎖状、分岐状又は環状であり得る一価の飽和炭化水素基を指す。用語「アルキル」は好ましくは、直鎖状でも分岐状でもよく、環状ではない一価の飽和炭化水素基を指す。したがって「アルキル」基は、いかなる炭素－炭素二重結合又はいかなる炭素－炭素三重結合も含まない。「Ｃ_１－５アルキル」は、１－５個の炭素原子を有するアルキル基を意味する。好ましい例示的なアルキル基は、メチル、エチル、プロピル（例：ｎ－プロピル又はイソプロピル）又はブチル（例：ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル又はｔｅｒｔ－ブチル）である。

【0093】

特記しない限り、「アルキル」は、直鎖状、分岐状又は環状でもよく、１－１８個の炭素原子、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８個の炭素原子を含む一価の飽和炭化水素基、すなわち「Ｃ_１－Ｃ_１８アルキル」である。
その例は、メチル（Ｍｅ、－ＣＨ_３）、エチル（Ｅｔ、－ＣＨ_２ＣＨ_３）、１－プロピル（ｎ－Ｐｒ、ｎ－プロピル、－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、２－プロピル（ｉ－Ｐｒ、ｉ－プロピル、－ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、１－ブチル（ｎ－Ｂｕ、ｎ－ブチル、－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、２－メチル－１－プロピル（ｉ－Ｂｕ、ｉ－ブチル、－ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、２－ブチル（ｓ－Ｂｕ、ｓ－ブチル、－ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３）、２－メチル－２－プロピル（ｔ－Ｂｕ、ｔ－ブチル、－Ｃ（ＣＨ_３）_３）、１－ペンチル（ｎ－ペンチル、－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、２－ペンチル（－ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、３－ペンチル（－ＣＨ（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２）、２－メチル－２－ブチル（－Ｃ（ＣＨ_３）_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、３－メチル－２－ブチル（－ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、３－メチル－１－ブチル（－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、２－メチル－１－ブチル（－ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３）、１－ヘキシル（－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、２－ヘキシル（ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、３－ヘキシル（－ＣＨ（ＣＨ_２ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３））、２－メチル－２－ペンチル（Ｃ（ＣＨ_３）_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、３－メチル－２－ペンチル（－ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３）、４－メチル－２－ペンチル（ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、３－メチル－３－ペンチル（－Ｃ（ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２）、２－メチル－３－ペンチル（ＣＨ（ＣＨ_２ＣＨ_３）ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、２，３－ジメチル－２－ブチル（－Ｃ（ＣＨ_３）_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、及び３，３－ジメチル－２－ブチル（ＣＨ（ＣＨ_３）Ｃ（ＣＨ_３）_３である。

【0094】

「アルキル」の好ましい例は、直鎖状、分岐状又は環状でもよく、１－１２個の炭素原子、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２個の炭素原子を含む一価の飽和炭化水素基である「Ｃ_１－Ｃ_１２アルキル」である。

【0095】

「アルキル」の更に好ましい例は、直鎖状、分岐状又は環状でもよく、１－８個の炭素原子、すなわち１、２、３、４、５、６、７又は８個の炭素原子を含む一価の飽和炭化水素基を指す「Ｃ_１－Ｃ_８アルキル」である。
代表的な「Ｃ_１－Ｃ_８アルキル」基には、－メチル、－エチル、－ｎ－プロピル、－ｎ－ブチル、－ｎ－ペンチル、－ｎ－ヘキシル、－ｎ－ヘプチル、及び－ｎ－オクチルが含まれるがこれらに限定されない。
分岐状「Ｃ_１－Ｃ_８アルキル」には、－イソプロピル、－ｓｅｃ－ブチル、－イソブチル、－ｔｅｒｔ－ブチル、－イソペンチル、２－メチルブチルが含まれるがこれらに限定されない。

【0096】

「アルキル」の更に一層好ましい例は、直鎖状、分岐状又は環状でもよく、１－５個の炭素原子、すなわち１、２、３、４、５又は６個の炭素原子を含む一価の飽和炭化水素基を指す「Ｃ_１－Ｃ_６アルキル」である。
代表的な「Ｃ_１－Ｃ_６アルキル」基には、－メチル、－エチル、－ｎ－プロピル、－ｎ－ブチル、－ｎ－ペンチル、及び－ｎ－ヘキシル（-and n-hexyl）が含まれるがこれらに限定されない。
分岐状「Ｃ_１－Ｃ_６アルキル」には、－イソプロピル、－ｓｅｃ－ブチル、－イソブチル、－ｔｅｒｔ－ブチル、－イソペンチル、及び２－メチルブチルが含まれるがこれらに限定されない。

【0097】

本明細書で用いられる用語「Ｃ_１－Ｃ_４アルキル」は、直鎖状、分岐状又は環状でもよく、１－４個の炭素原子、すなわち１、２、３又は４個の炭素原子を含む一価の飽和炭化水素基を指す。
代表的な「Ｃ_１－Ｃ_４アルキル」基には、－メチル、－エチル、－ｎ－プロピル、－ｎ－ブチルが含まれるがこれらに限定されない。分岐状「Ｃ_１－Ｃ_４アルキル」には、－イソプロピル、－ｓｅｃ－ブチル、－イソブチル、－ｔｅｒｔ－ブチルが含まれるがこれらに限定されない。

【0098】

本明細書で使用される場合、用語「アルケニル」は、直鎖状、分岐状又は環状でもよく、１つ以上の（例えば１つ又は２つの）炭素－炭素二重結合を含むが炭素－炭素三重結合は全く含まない一価の飽和炭化水素基を指す。

【0099】

特記しない限り、「アルケニル」は、２－１８個の炭素原子、すなわち２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８個の炭素原子を含むＣ_２－Ｃ_１８の一価の飽和炭化水素基であって、直鎖状、分岐状又は環状でもよく、且つ、１つ以上の（例えば１つ又は２つの）炭素－炭素二重結合を含むが炭素－炭素三重結合は全く含まない。

【0100】

「アルケニル」の好ましい例は、２－８個の炭素原子、すなわち２、３、４、５、６、７又は８個の炭素原子を有するアルケニル基を意味する「Ｃ_２－Ｃ_８アルケニル」である。好ましい例示的なアルケニル基は、エテニル、プロペニル（例：プロパ－１－エン－１－イル、プロパ－１－エン－２－イル又はプロパ－２－エン－１－イル）、ブテニル、ブタジエニル（例：ブタ－１，３－ジエン－１－イル又はブタ－１，３－ジエン－２－イル）、ペンテニル又はペンタジエニル（例えばイソプレニル）である。更なる例には、エチレン又はビニル（－ＣＨ＝ＣＨ_２）、アリル（－ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２）、－１－ブテニル、－２－ブテニル、－イソブチレニル、－１－ペンテニル、－２－ペンテニル、－３－メチル－１－ブテニル、－２－メチル－２－ブテニル、シクロペンテニル（－Ｃ_５Ｈ_７）、１－ヘキセニル、２－ヘキセニル、３－ヘキセニル、５－ヘキセニル（－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２）、及び－２，３－ジメチル－２－ブテニルが含まれるがこれらに限定されない。

【0101】

Ｃ_２－Ｃ_６アルケニルの例には、－ビニル、－アリル、－１－ブテニル、－２－ブテニル、－イソブチレニル、－１－ペンテニル、－２－ペンテニル、－３－メチル－１－ブテニル、－２－メチル－２－ブテニル、－２，３－ジメチル－２－ブテニル、１－ヘキセニル、２－ヘキセニル、及び３－ヘキセニルが含まれるがこれらに限定されない。

【0102】

「アルケニル」の更に好ましい例は、２－４個の炭素原子を有するアルケニル基を意味する、「Ｃ_２－Ｃ_４アルケニル」である。故に、例としては、－ビニル、－アリル、－１－ブテニル、－２－ブテニル、及び－イソブチレニルである。

【0103】

本明細書で使用される場合、用語「アルキニル」は、直鎖状、分岐状又は環状でもよく、１つ以上の（例えば１つ又は２つの）炭素－炭素三重結合と、場合により１つ以上の炭素－炭素二重結合を含む、一価の飽和炭化水素基を指す。
他に定義されない限り、用語「アルキニル」は、２－８個の炭素原子を有するアルキニル基を意味する、「Ｃ_２－８アルキニル」を指す。好ましい例示的なアルキニル基は、アセチレニル、プロピニル、１－ブチニル、２－ブチニル、１－ペンチニル、２－ペンチニル、シクロペンテニル、３－メチル－１－ブチニル、５－ヘキセニル、ビニル、エチレンである。
好ましいアルキニル基は、２－６個の炭素原子を有するアルキニル基を意味する「Ｃ_２－６アルキニル」及び２－４個の炭素原子を有するアルキニル基を意味する「Ｃ_２－４アルキニル」である。

【0104】

用語「アルコキシ」は、「－Ｏ－アルキル」によって表される基を指し、ここで「アルキル」は、アルキルの好ましい例を含めて、上で定義した通りである。
例示的アルコキシ基には、限定されないが、メトキシ（－ＯＣＨ_３）及びエトキシ（－ＯＣＨ_２ＣＨ_３）が含まれる。

【0105】

「アルコキシ」の好ましい例は、１－５個の炭素原子を有するアルコキシ基であり、「－Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_５アルキル」と記すことができる「Ｃ_１－Ｃ_５アルコキシ」である。

【0106】

本明細書で使用される場合、用語「カルボシクリル（carbocyclyl）」は、単環式環、並びに架橋環、スピロ環及び／又は縮合環系（これは、例えば２つ又は３つの環から構成され得る）を含む環基を指し、ここで１つ以上の炭素環原子が酸化されていてもよく（すなわちオキソ基を形成する）、更にここで前記環基は、飽和、部分不飽和（すなわち不飽和だが芳香族ではない）又は芳香族であり得る。「カルボシクリル」基の好ましい例は、１個の水素原子が引き抜かれている下記の「カルボシクリル」の定義に対応する。
用語「炭素環（carbocycle）」は好ましくは、３－７個の炭素原子を有する飽和若しくは不飽和単環又は７－１２個の炭素原子を有する二環を指す。単環式炭素環は好ましくは、３－６個の環原子、より好ましくは５又は６個の環原子を有し、以下に定義されているようなフェニルを含む。二環式炭素環は典型的には、例えばビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］若しくは［６，６］系として配置されている７－１２個の環原子を有するか、又はビシクロ［５，６］若しくは［６，６］系として配置されている９若しくは１０個の環原子を有する。単環式炭素環の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、１－シクロペント－１－エニル、１－シクロペント－２－エニル、１－シクロペント－３－エニル、シクロヘキシル、１－シクロヘキサ－１－エニル、１－シクロヘキサ－２－エニル、１－シクロヘキサ－３－エニル、シクロヘプチル、及びシクロオクチルが含まれる。

【0107】

「Ｃ_３－Ｃ_８炭素環」は、３、４、５、６、７又は８員の飽和又は不飽和非芳香族環状炭素である。代表的なＣ_３－Ｃ_８炭素環には、限定されないが、－シクロプロピル、－シクロブチル、－シクロペンチル、－シクロペンタジエニル、－シクロヘキシル、－シクロヘキセニル、－１，３－シクロヘキサジエニル、－１，４－シクロヘキサジエニル、－シクロヘプチル、－１，３－シクロヘプタジエニル、－１，３，５－シクロヘプタトリエニル、－シクロオクチル、及び－シクロオクタジエニルが含まれる。

【0108】

「Ｃ_３－Ｃ_８カルボシクロ」は、炭素環基の水素原子のうちの１つが結合で置換されている、上で定義したＣ_３－Ｃ_８炭素環基を指す。

【0109】

本明細書で使用される場合、用語「アリール」は、単環式芳香環、並びに少なくとも１つの芳香環を含有する架橋環及び／又は縮合環系（例えば２又は３個の縮合環から成る環系）を含む芳香族炭化水素環基を指し、ここで、これらの縮合環の少なくとも１つは芳香族であるか、又は２つもしくは３つの環から成る架橋環系であり、これらの架橋環の少なくとも１つは芳香族である。「アリール」は、例えばフェニル、ナフチル、ジアリニル（dialinyl）（すなわち１，２－ジヒドロナフチル、テトラリニル（すなわち１，２，３，４－テトラヒドロナフチル）、アントラセニル又はフェナントレニルを指す。
他に定義されない限り、用語「アリール」は、炭素環式芳香族環に５－２０個の炭素原子を有するアリール基である「Ｃ_５－Ｃ_２０アリール」を指す。
アリール基のより好ましい例は、炭素環式芳香族環に５－１４個の炭素原子を有するアリール基である、「Ｃ_５－Ｃ_１４アリール」である。

【0110】

本明細書で使用される場合、用語「ヘテロシクリル」は、環、並びに架橋環、スピロ環及び／又は縮合環系（例えば２つ又は３つの環から構成され得る）を含む環基を指し、ここで前記環基は、Ｏ、Ｓ、Ｐ及びＮから独立に選択される１つ以上（例えば１、２、３又は４個）の環ヘテロ原子を含み、残りの環原子は炭素原子であり、１つ以上のＰ環原子（存在する場合）及び／若しくはＳ環原子（存在する場合）、並びに／又は１つ以上のＮ環原子（存在する場合）は酸化されていてもよく、ここで１つ以上の炭素環原子も酸化されていてもよく（すなわちオキソ基を形成する）、更にここで前記環基は、飽和、部分不飽和（すなわち不飽和だが芳香族ではない）又は芳香族であり得る。他に定義されない限り、「ヘテロシクリル」は好ましくは、ヘテロアリールを指す。

【0111】

「ヘテロシクリル」の好ましい例は、Ｏ、Ｓ及びＮから成る群からのヘテロ原子により環炭素原子のうちの１－４個が独立に置換されている芳香族又は非芳香族Ｃ_３－Ｃ_８炭素環である、「Ｃ_３－Ｃ_８ヘテロシクリル」を指す。Ｃ_３－Ｃ_８複素環の代表的な例には、限定されないが、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェン、インドリル、ベンゾピラゾリル、クマリニル、イソキノリニル、ピロリル、チオフェニル、フラニル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、キノリニル、ピリミジニル、ピリジニル、ピリドニル（ｐｙｒｉｄｏｎｙｌ）、ピラジニル、ピリダジニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル及びテトラゾリルが含まれる。
例示的な複素環は、例えばＰａｑｕｅｔｔｅ，Ｌｅｏ Ａ．，「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｍ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（W.A. Benjamin, New York, 1968）、特に１、３、４、６、７及び９章；「Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ」（John Wiley & Sons, New York,１９５０年から現在）、特に１３、１４、１６、１９及び２８巻；並びにＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９６０）８２：５５６６に記載がある。

【0112】

複素環の例には、限定ではなく例として、ピリジル、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジル（ピペリジル）、チアゾリル、テトラヒドロチオフェニル、硫黄酸化テトラヒドロチオフェニル、ピリミジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル、ベンゾフラニル、チアナフタレニル（thianaphthalenyl）、インドリル、インドレニル（indolenyl）、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ピペリジニル、４－ピペリドニル（4-piperidonyl）、ピロリジニル、２－ピロリドニル（2-pyrrolidonyl）、ピロリニル、テトラヒドロフラニル、ビステトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ビス－テトラヒドロピラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オクタヒドロイソキノリニル、アゾシニル、トリアジニル、６Ｈ－１，２，５－チアジアジニル、２Ｈ，６Ｈ－１，５，２－ジチアジニル、チエニル、チアントレニル、ピラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、キサンテニル、フェノキサチニル（phenoxathinyl）、２Ｈ－ピロリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、３Ｈ－インドリル、１Ｈ－インダゾリル、プリニル、４Ｈ－キノリジニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、４ａＨ－カルバゾリル、カルバゾリル、β－カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ピリミジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フラザニル、フェノキサジニル、イソクロマニル、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペラジニル、インドリニル、イソインドリニル、キヌクリジニル、モルホリニル、オキサゾリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、オキシインドリル、ベンゾオキサゾリニル、及びイサチノイル（isatinoyl）が含まれる。

【0113】

限定ではなく例として、炭素結合複素環は、ピリジンの２、３、４、５又は６位、ピリダジンの３、４、５又は６位、ピリミジンの２、４、５又は６位、ピラジンの２、３、５又は６位、フラン、テトラヒドロフラン、チオフラン、チオフェン、ピロール又はテトラヒドロピロールの２、３、４又は５位、オキサゾール、イミダゾール又はチアゾールの２、４又は５位、イソオキサゾール、ピラゾール又はイソチアゾールの３、４又は５位、アジリジンの２又は３位、アゼチジンの位置２、３又は４位、キノリンの２、３、４、５、６、７又は８位、或いはイソキノリンの１、３、４、５、６、７又は８位で結合される。更に典型的には、炭素結合複素環には、２－ピリジル、３－ピリジル、４－ピリジル、５－ピリジル、６－ピリジル、３－ピリダジニル、４－ピリダジニル、５－ピリダジニル、６－ピリダジニル、２－ピリミジニル、４－ピリミジニル、５－ピリミジニル、６－ピリミジニル、２－ピラジニル、３－ピラジニル、５－ピラジニル、６－ピラジニル、２－チアゾリル、４－チアゾリル又は５－チアゾリルが含まれる。

【0114】

限定ではなく例として、窒素結合複素環は、アジリジン、アゼチジン、ピロール、ピロリジン、２－ピロリン、３－ピロリン、イミダゾール、イミダゾリジン、２－イミダゾリン、３－イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、２－ピラゾリン、３－ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドール、インドリン、１Ｈ－インダゾールの１位、イソインドール又はイソインドリンの２位、モルホリンの４位、及びカルバゾール又はβ－カルボリンの９位で結合される。更に典型的には、窒素結合複素環には、１－アジリジル、１－アゼテジル（1-azetedyl）、１－ピロリル、１－イミダゾリル、１－ピラゾリル、及び１－ピペリジニルが含まれる。

【0115】

本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアリール」とは、単環式芳香族環、並びに少なくとも１つの芳香族環を含有する架橋環及び／又は縮合環系（例えば、縮合環の少なくとも１つは芳香族である、２つ又は３つの縮合環から成る環系；又は架橋環の少なくとも１つは芳香族である、２つ又は３つの環から成る架橋環系）を含む芳香環基を指し、ここで前記芳香環基は、Ｏ、Ｓ、Ｐ及びＮ，から独立に選択される１つ以上（例えば１、２、３又は４個）の環ヘテロ原子を含み、残りの環原子は炭素原子であり、ここで１つ以上のＳ環原子（存在する場合）及び／又は１つ以上のＰ環原子（存在する場合）及び／又は１つ以上のＮ環原子（存在する場合）は酸化されていてもよく、更にここで１つ以上の炭素環原子も酸化されていてもよい（すなわちオキソ基を形成する）。「ヘテロアリール」は例えば、チエニル（すなわちチオフェニル）、ベンゾ［ｂ］チエニル、ナフト［２，３－ｂ］チエニル、チアントレニル（ｔｈｉａｎｔｈｒｅｎｙｌ）、フリル（すなわちフラニル）、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、キサンテニル、フェノキサチイニル、ピロリル（例：２Ｈ－ピロリル）、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル（すなわちピリジニル；例：２－ピリジル、３－ピリジル又は４－ピリジル）、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、インドリル（例：３Ｈ－インドリル）、インダゾリル、プリニル、イソキノリル、キノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、シンノリニル、プテリジニル、カルバゾリル、ベータカルボニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ペリミジニル（perimidinyl）、フェナントロリニル（例：［１，１０］フェナントロリニル、［１，７］フェナントロリニル又は［４，７］フェナントロリニル）、フェナジニル、チアゾリル、イソチアゾリル、フェノチアジニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、フラザニル（furazanyl）、フェノキサジニル（phenoxazinyl）、ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジニル（例：ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル）、１，２－ベンゾイソオキサゾール－３－イル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンズイミダゾリル、１Ｈ－テトラゾリル、２Ｈ－テトラゾリル、クマリニル又はクロモニル（chromonyl）を指す。

【0116】

他に定義されない限り「ヘテロアリール」は、好ましくは、Ｏ、Ｓ、Ｐ及びＮから独立に選択される１つ以上（例えば１、２、３又は４個）の環ヘテロ原子を含む５－１４員（より好ましくは５－１０員）単環式環又は縮合環系を指し、ここで１つ以上のＳ環原子及び／又は１つ以上のＰ環原子（存在する場合）及び／又は１つ以上のＮ環原子（存在する場合）は酸化されていてもよく、ここで１つ以上の炭素環原子も酸化されていてもよく；「ヘテロアリール」は、更に一層好ましくは、Ｏ、Ｓ、Ｐ及びＮから独立に選択される１つ以上（例えば１、２、又は３個）の環ヘテロ原子を含む５又は６員単環式環を指し、ここで１つ以上のＳ環原子及び／又は１つ以上のＰ環原子（存在する場合）及び／又１つ以上のＮ環原子（存在する場合）は酸化されていてもよく、ここで１つ以上の炭素環原子も酸化されていてもよい。

【0117】

好ましいヘテロアリール基は、３－２０個の炭素原子と、Ｎ、Ｏ、Ｐ及びＳから選択される１－３個のヘテロ原子とを含む。他の好ましいヘテロアリール基は、３－７個の環員（ring member）（２－６個の炭素原子と、Ｎ、Ｏ、Ｐ及びＳから選択される１－３個のヘテロ原子）を有する単環、又は７－１０個の環員（４－９個の炭素原子と、Ｎ、Ｏ、Ｐ及びＳから選択される１－３個のヘテロ原子）を有する二環、例えば：ビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］又は［６，６］系である。

【0118】

用語「アリールアルキル」は、「－（アルキレン）－（アリール）」、「－（アルケニレン）－（アリール）」及び「－（アルキニレン）－（アリール）」（「アルキレン」、「アルケニレン」及び「アルキニレン」は以下に定義される通りであり、「アリール」は上で定義されている）で表される基を指す。アルキレンは、好ましくはＣ_１－Ｃ_６アルキレンであり、且つ、好ましくは非環式である。アリール基は、好ましくはＣ_５－Ｃ_１４アリール基である。言い換えれば、用語「アリールアルキル」は、炭素原子、典型的には末端又はｓｐ^３炭素原子に結合した水素原子の１つがアリールラジカルで置換されている非環式アルキルラジカルを指す。典型的なアリールアルキル基には、限定されないが、ベンジル、２－フェニルエタン－１－イル、２－フェニルエテン－１－イル、ナフチルメチル、２－ナフチルエタン－１－イル、２－ナフチルエテン－１－イル、ナフトベンジル、２－ナフトフェニルエタン－１－イル等が含まれる。アリールアルキル基は６－２０個の炭素原子を含み、例えば、アリールアルキル基の、アルキル、アルケニル又はアルキニル基を含むアルキル部分は１－６個の炭素原子であり、アリール部分は５－１４個の炭素原子である。

【0119】

用語「ヘテロアリールアルキル」は、「－（アルキレン）－（ヘテロアリール）」、「－（アルケニレン）－（ヘテロアリール）」及び「－（アルキニレン）－（ヘテロアリール）」（「アルキレン」、「アルケニレン」及び「アルキニレン」は以下に定義される通りであり、「アリール」は上で定義されている）で表される基を指す。言い換えれば、「ヘテロアリールアルキル」は、炭素原子、典型的には末端又はｓｐ^３炭素原子に結合した水素原子の１つがヘテロアリールラジカルで置換されている非環式アルキルラジカルを指す。典型的なヘテロアリールアルキル基には、限定されないが、２－ベンズイミダゾリルメチル、２－フリルエチルなどが含まれる。ヘテロアリールアルキル基は６－２０個の炭素原子を含み、例えば、ヘテロアリールアルキル基の、アルカニル、アルケニル又はアルキニル基を含むアルキル部分は１－６個の炭素原子であり、ヘテロアリール部分は５－１４個の炭素原子、並びにＮ、Ｏ、Ｐ及びＳから選択される１－３個のヘテロ原子である。ヘテロアリールアルキル基のヘテロアリール部分は、３－７個の環員を有する単環（２－６個の炭素原子）又は７－１０個の環員を有する二環（４－９個の炭素原子と、Ｎ、Ｏ、Ｐ，及びＳから選択される１－３個のヘテロ原子）、例えば：ビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］又は［６，６］系であり得る。

【0120】

［二価の基］
本明細書で使用される場合、用語「アルキレン」とは、「アルキル」という用語に対応する二価の基を指し、ここで水素の１つが除去されており、典型的には結合によって置き換えられている。特に明記しない限り、「アルキレン」という用語は好ましくは、親アルカンの同じか又は２つの異なる炭素原子から２つの水素原子を除去することにより得られる２つの一価のラジカル中心を有する、１－１８個の炭素原子から成る飽和分岐若しくは直鎖又は環状炭化水素ラジカルを指す。典型的なアルキレンラジカルには、限定されないが、メチレン（－ＣＨ_２－）１，２－エチレン（－ＣＨ_２ＣＨ_２－）、１，３－プロピレン（－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２－）、及び１，４－ブチレン（－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２－）等が含まれる。
「アルキレン」の好ましい例は、式－（ＣＨ_２）_１－１０－の直鎖状飽和炭化水素基である、「Ｃ_１－Ｃ_１０アルキレン」である。Ｃ_１－Ｃ_１０アルキレンの例には、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン（ocytylene）、ノニレン及びデカレンが含まれる。

【0121】

本明細書で使用される場合、用語「アルケニレン」とは、「アルケニル」という用語に対応する二価の基を指し、ここで水素の１つが除去されており、典型的には結合によって置き換えられている。特に明記しない限り、「アルキレン」という用語は、親アルケンの同じか又は２つの異なる炭素原子から２つの水素原子を除去することにより得られる２つの一価のラジカル中心を有する、２－１８個の炭素原子から成る不飽和分岐若しくは直鎖又は環状炭化水素ラジカルを指す。好ましいアルケニレンは、２－１２個の炭素原子、２－８個の炭素原子又は２－４個の炭素原子を含む。典型的なアルケニレンラジカルには、限定されないが、１，２－エチレン（－ＣＨ＝ＣＨ－）が含まれる。

【0122】

本明細書で使用される場合、用語「アルキニレン」とは、「アルキニル」という用語に対応する二価の基を指し、ここで水素の１つが除去されており、典型的には結合によって置き換えられている。特に明記しない限り、「アルキニレン」という用語は、親アルキンの同じか又は２つの異なる炭素原子から２つの水素原子を除去することにより得られる２つの一価のラジカル中心を有する、２－１８個の炭素原子から成る不飽和分岐若しくは直鎖又は環状炭化水素ラジカルを指す。好ましいアルキニレンは、２－１２個の炭素原子、２－８個の炭素原子又は２－４個の炭素原子を含む。典型的なアルキニレンラジカルには、限定されないが、アセチレン（－Ｃ≡Ｃ－）、プロパルギル（－ＣＨ_２Ｃ≡Ｃ－）、及び４－ペンチニル（－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｃ≡Ｃ－）が含まれる。

【0123】

本明細書で使用される場合、用語「アリーレン」とは、「アリール」という用語に対応する二価の基を指し、ここで水素の１つが除去されており、典型的には結合によって置き換えられている。原子価は、芳香族炭化水素環基内の任意の位置にあってよい。一例としてフェニレン基において、原子価は、以下の構造に示されるように、オルト、メタ又はパラ位にある。

【0124】

［置換基］
本明細書において、様々な基が「置換されていてもよい」か又は「置換されている」とされる。一般に、これらの基は、１つ以上の置換基、例えば１、２、３又は４つの置換基を有し得る。置換基の最大数は、置換される部分の利用可能な結合部位の数によって制限されることが理解されよう。他に定義されない限り、本明細書で言及される「置換されていてもよい」基とは、好ましくは２つ以下の置換基を有し、特に１つの置換基のみを有し得る。更に、他に定義されない限り、任意選択の置換基が存在しないこと、すなわち対応する基が無置換であることが好ましい。

【0125】

アルキル、アリール、アリールアルキレン、アリールアルキル、アルキレン、アルケニレン及びアルキニレンの置換基には、限定されないが、－Ｘ、－Ｒ、－ＯＨ，－ＯＲ、－ＳＲ、－ＳＨ、－ＮＲ_２、－ＮＲ_３、＝ＮＲ、－ＣＸ_３、－ＣＮ、－ＯＣＮ、－ＳＣＮ、－Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、－ＮＣＳ、－ＮＯ、－ＮＯ_２、＝Ｎ_２、－Ｎ_３、ＮＣ（＝Ｏ）Ｒ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ_２、－ＳＯ_３ ^－、－ＳＯ_３Ｈ、－Ｓ（＝Ｏ）_２Ｒ、－ＯＳ（＝Ｏ）_２ＯＲ、－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＲ、－Ｓ（＝Ｏ）Ｒ、－ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ）_２、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）_２、－Ｐ（ＯＨ）_３、－ＰＯ_３Ｈ_２、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｘ、－Ｃ（＝Ｓ）Ｒ、－ＣＯ_２Ｒ、－ＣＯ_２－、－Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ、－Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ_２、－Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ_２、－Ｃ（＝ＮＲ）ＮＲ_２が含まれ；
ここで、各Ｘは独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択されるハロゲンであり；且つ、
各Ｒは独立に、－Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_１８アルキル、Ｃ_６－Ｃ_２０アリール、Ｃ_３－Ｃ_１４ヘテロシクリル、保護基又はプロドラッグ部分である。

【0126】

アルキル、アリール、アリールアルキレン、アリールアルキル、アルキレン、アルケニレン及びアルキニレンの好ましい置換基には、－Ｃ_１－Ｃ_８アルキル、－Ｏ－（Ｃ_１－Ｃ_８ アルキル）、－アリール、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）_２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、－ＳＯ_３Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＨ、－ハロゲン、－Ｎ_３、－ＮＨ_２、－ＮＨ（Ｒ’）、－Ｎ（Ｒ’）_２及び－ＣＮが含まれ；ここで各Ｒ’は独立に、Ｈ、－Ｃ_１－Ｃ_８アルキル及びアリールから選択される。

【0127】

他に定義されない限り、置換基には、限定されないが、Ｃ_１－Ｃ_８アルキル、－Ｏ－（Ｃ_１－Ｃ_８アルキル）、－アリール、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）_２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、－ＳＯ_３Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＨ、－ハロゲン、－Ｎ_３、－ＮＨ_２、－ＮＨ（Ｒ’）、－Ｎ（Ｒ’）_２及び－ＣＮが含まれ；ここで各Ｒ’は独立に、Ｈ、－Ｃ_１－Ｃ_８アルキル及びアリールから選択される。

【0128】

アルキル基の置換基はアルキル基を含まないことが好ましい。

【0129】

置換されていると記載されているフェニル基は好ましくは、上で定義した１－４つの置換基を含有する。置換されていると記載されているＣ_３－Ｃ_８ヘテロシクリル基は好ましくは、上で定義した１－７つの置換基を含有する。置換されていると記載されているＣ_３－Ｃ_８ヘテロシクロ基は好ましくは、１－６つの上で定義された置換基を含有する。置換されていると記載されているＣ_３－Ｃ_２０複素環基は好ましくは、１－７つの上で定義された置換基を含有する。置換されていると記載されているＣ_３－Ｃ_８炭素環基は好ましくは、上で定義した１－７つの置換基を含有する。

【0130】

本明細書で使用される場合、用語「ハロゲン」は、フルオロ（－Ｆ）、クロロ（－Ｃｌ）、ブロモ（－Ｂｒ）又はヨード（－Ｉ）を指す。

【0131】

本明細書で使用される場合、「任意選択の（optional）」、「（場合によって）～してもよい／任意選択的に（optionally）」及び「～でもよい／～し得る（may）」という用語は、示された特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）が存在し得るが存在しなくてもよいことを意味する。「任意選択の」、「（場合によって）～してもよい／任意選択的に」及び「～でもよい／～し得る」という用語が使用するときは必ず、本発明は、両方の可能性、すなわち対応する特徴が存在すること、又は対応する特徴が存在しないことの両方の可能性に特に関する。例えば「ＸはＹで置換されていてもよい」（又は「ＸはＹで置換され得る」）という表現は、ＸはＹで置換されているか又は無置換であることを意味する。同様に、組成物の成分が「任意選択」であると示されている場合、本発明は、両方の可能性、すなわち対応する成分が存在する（組成物に含まれている）こと、又は対応する成分が組成物に存在しないことの両方の可能性に特に関する。

【0132】

用語「リンカー」は、抗体を共有結合的に薬物部分に結合させる原子の鎖又は共有結合を含む化学部分を指す。リンカーの例には、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレル若しくは－（ＣＲ_２）_ｎＯ（ＣＲ_２）_ｎ－などの二価のラジカル、又はアルキルオキシ（例えばポリエチレンオキシ、ＰＥＧ、ポリメチレンオキシ）及びアルキルアミノ（例えばポリエチレンアミノ、Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ^ＴＭ）の繰り返し単位；並びにスクシネート、スクシンアミド、ジグリコレート、マロネート及びカプロアミドを含む二価酸エステル及びアミドが含まれる。様々な実施態様では、リンカーは、１以上のアミノ酸残基、例えばバリン、フェニルアラニン、リジン及びホモリジンを含むことができる。

【0133】

用語「キラル」は、その鏡像パートナーに重ね合わせることができないという特性を有する分子を指し、一方、用語「アキラル」は、その鏡像パートナーに重ね合わせることができる分子を指す。

【0134】

用語「立体異性体」は、同一の化学構造を有するが、原子又は基の空間配置の点で異なる化合物を指す。

【0135】

「ジアステレオマー」とは、２つ以上のキラル中心を持つ立体異性体であって、その分子が互いに鏡像関係にない立体異性体を指す。ジアステレオマーは、異なる物理的性質、例えば融点、沸点、スペクトル特性及び反応性を有する。ジアステレオマーの混合物は、例えば電気泳動法及びクロマトグラフィーなどの高分解能分析手順の下で分離することができる。

【0136】

「エナンチオマー」とは、互いに重ね合わせることができない鏡像である、化合物の２つの立体異性体を指す。

【0137】

本明細書で使用される立体化学的定義及び慣例は、Ｓ．Ｐ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｎｎｓ（１９８４）ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；及びＥｌｉｅｌ，Ｅ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｎ，Ｓ．，Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（１９９４）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに概ね従う。多くの有機化合物は、光学的に活性な形態で存在する、すなわち、それらは平面偏光面を回転させる能力を有する。光学活性化合物を記載する際、接頭語Ｄ及びＬ、又はＲ及びＳを使用して、そのキラル中心の周りでの分子の絶対配置を表す。接頭語ｄ及びｌ又は（＋）及び（－）は、化合物による平面偏光の回転の符号を示すために用いられ、（－）又はlは化合物が左旋性であることを示す。接頭語（＋）又はｄを有する化合物は、右旋性である。所与の化学構造の場合、これらの立体異性体は、互いの鏡像であること以外は同一である。特定の立体異性体は、エナンチオマーとも称され、このような異性体の混合物は、しばしばエナンチオマー混合物と呼ばれる。エナンチオマーの５０：５０混合物は、ラセミ混合物又はラセミ体と称され、化学反応又はプロセスにおいて立体選択又は立体特異性がなかった場合に生じ得る。用語「ラセミ混合物」及び「ラセミ体」は、２つのエナンチオマー種の等モル混合物を指し、光学活性を欠く。

【0138】

「脱離基」は、他の官能基によって置換され得る官能基を指す。ある種の脱離基は、当該技術分野で周知であり、その例には、限定されないが、ハロゲン化物（例えば塩化物、臭化物、ヨウ化物）、メタンスルホニル（メシル）、ｐ－トルエンスルホニル（トシル）、トリフルオロメチルスルホニル（トリフラート）、及びトリフルオロメチルスルホネートが含まれる。

【0139】

用語「保護基」は、化合物の他の官能基に反応しながら特定の官能基をブロック又は保護するために一般に用いられる置換基を指す。例えば、「アミノ保護基」は、化合物のアミノ官能基をブロック又は保護する、アミノ基に結合する置換基である。適切なアミノ保護基には、限定されないが、アセチル、トリフルオロアセチル、ｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）及び９－フルオレニルメチレンオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）が含まれる。保護基及びそれらの使用の概要については、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１又はそれ以降の版を参照されたい。

【0140】

本発明の範囲は、プロトン化を受けやすい孤立電子対を有する原子、例えばアミノ基の、無機若しくは有機酸によるプロトン化によって、又は生理学的に許容されるカチオンを有する酸基（例えばカルボン酸基）の塩として形成され得る、本明細書に開示の化合物の全ての薬学的に許容される塩形態を包含する。例示的な塩基付加塩は、例えば、ナトリウム若しくはカリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム若しくはマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；亜鉛塩；アンモニウム塩；トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、プロカイン塩、メグルミン塩、エチレンジアミン塩又はコリン塩等の脂肪族アミン塩；Ｎ，Ｎ－ジベンジルエチレンジアミン塩、ベンザチン塩、べネタミン（ｂｅｎｅｔｈａｍｉｎｅ）塩等のアラルキルアミン塩；ピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩又はイソキノリン塩等の複素環芳香族アミン塩；テトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアンモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩又はテトラブチルアンモニウム塩等の第四級アンモニウム塩；及びアルギニン塩、リジン塩又はヒスチジン塩等の塩基性アミノ酸塩を包含する。例示的な酸付加塩は、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩（例：硫酸塩又は硫酸水素塩）、硝酸塩、リン酸塩（例：リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩）、炭酸塩、炭酸水素塩、過塩素酸塩、ホウ酸塩又はチオシアン酸塩等の鉱酸塩；酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、ペンタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヘプタン酸塩、オクタン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、デカン酸塩、ウンデカン酸塩、オレイン酸塩、ステアリン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、アジピン酸塩、グルコン酸塩、グリコール酸塩、ニコチン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、アスコルビン酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩）、樟脳酸塩、グルコヘプタン酸塩又はピバル酸塩等の有機酸塩；メタンスルホン酸塩（メシル酸塩）、エタンスルホン酸塩（エシル酸塩）、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩（イセチオン酸塩）、ベンゼンスルホン酸塩（ベシル酸塩）、ｐ－トルエンスルホン酸塩（トシル酸塩）、２－ナフタレンスルホン酸塩（ナプシル酸塩）、３－フェニルスルホン酸塩又はカンファースルホン酸塩等のスルホン酸塩；グリセロリン酸塩；アスパラギン酸塩又はグルタミン酸塩などの酸性アミノ酸塩を包含する。本明細書に開示の化合物の薬学的に許容される好ましい塩には、塩酸塩、臭化水素酸塩、メシル酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、及びリン酸塩が含まれる。本明細書に開示の化合物の薬学的に許容される特に好ましい塩は、塩酸塩である。したがって、本明細書に開示の化合物は、塩酸塩、臭化水素酸塩、メシル酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、酢酸塩又はクエン酸塩の形態であることが好ましく；且つ、式（Ｉ）の化合物が塩酸塩であることが特に好ましい。

【0141】

更に本発明の範囲は、例えば水との溶媒和物（例えば水和物）又は有機溶媒（例えばメタノール、エタノール又はアセトニトリル）との溶媒和物、すなわちそれぞれ、メタノレート（methanolate）、エタノレート（ethanolate）又はアセトニトリレート（acetonitrilate）としてのものも含めた、本明細書に開示のいかなる溶媒和形態或いはいかなる多形形態の化合物をも包含する。本明細書に開示の化合物のかかる溶媒和物には、本明細書に開示の化合物の薬学的に許容される塩の溶媒和物も含まれることを理解されたい。

【0142】

本書で言及されている全ての刊行物、特許出願、特許及び特許文書は、あたかも個々に参照により援用されているかのように、本明細書においてその全体が参照により援用される。そのように参照により援用されているそれらの文書と本書との間に矛盾する用法がある場合、援用されている参考文献における用法は、本書のそれに対する捕捉とみなされるものとし、両立しない矛盾については、本書での用法に従う。

【0143】

一態様では、本発明は部分的には、ＧＰ７３に結合する抗体と、このような抗体を含むイムノコンジュゲートに基づく。本発明の抗体及びイムノコンジュゲートは、例えばＧＰ７３陽性がんの診断又は治療のために有用である。

【0144】

本明細書では、ＧＰ７３に結合する単離された抗体が提供される。２つの例示的な天然に存在するヒトＧＰ７３アイソフォームは配列番号１に示され、プロセシングされた、例えばプロテアーゼにより切断された、対応するＧＰ７３形態（アミノ酸５６－４０１）は、図３に示される。

【0145】

いくつかの実施態様では、本発明の抗ＧＰ７３抗体は、以下の特性のうちの少なくとも１つ以上を、任意の組み合わせで有する：
ａ） 組換えヒトＧＰ７３に結合する；
ｂ） がん細胞の表面の内因性ＧＰ７３に結合する；
ｃ） がん細胞表面のヒトＧＰ７３のアミノ酸３６－５５内のエピトープ（ネオエピトープ）に結合する；
ｄ） 肝細胞がん細胞表面の内因性ＧＰ７３に結合する；
ｅ） ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｕＨ７、ＪＨＨ－７、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５）、ＨＬＥ、ＨｕＣＣＴ１から選択される細胞株の細胞表面の内因性ＧＰ７３に結合する；
ｆ） ＳＫＢＲ３（乳がん）、ＳＫＯＶ３（卵巣がん）、ＰＣ３及びＤＵ１４５（前立腺がん）、ＨＣＴ１１６、ＣａＣｏ２、ＳＷ４８０（結腸直腸がん）、Ｈ１９７５（肺がん）から選択される細胞株の細胞表面の内因性ＧＰ７３に結合する；
ｇ） Ｈｅｐ５５－１Ｃ、Ｈｅｐａ１－６、Ｈｅｐ３３．１ｃから選択される細胞株の細胞表面の内因性ＧＰ７３に結合する；
ｈ） ＭＤＡ及び４Ｔ１（乳がん）等から選択される細胞株の細胞表面の内因性ＧＰ７３に結合する；
ｉ） ＣＲＬ２２１２から選択される細胞株の細胞表面の内因性ＧＰ７３に結合する；
ｊ） ＧＰ７３発現細胞（ａ－ｉに記載）表面の切断されていないＧＰ７３に結合する；
ｋ） ヒトＧＰ７３のアミノ酸３６－５５内のエピトープに結合する；
ｌ） ヒトＧＰ７３の推定フーリン切断認識モチーフＥ５０－Ｒ５５にわたるエピトープに結合する

【0146】

いくつかの実施態様では、抗体の特性は、例えば後述の実施例に記載されるように決定される。いくつかの実施態様では、抗体の特性は、２９３ＨＥＫ細胞内で産生された組換えＧＰ７３タンパク質によって決定される。非限定的な例として、いくつかの実施態様では、完全長ＧＰ７３又はＧＰ７３非切断型突然変異体（Ｒ５２Ａ）が細胞内（例えば２９３ＨＥＫ細胞）で発現され、野生型ＧＰ７３若しくはＧＰ７３非切断型突然変異体又はＮ末端切断型ＧＰ７３（ＡＡ５６－４０１）に結合する抗体がＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳによって検出される。

【0147】

本明細書で提供される特定の実施態様は、部分的に、ヒトＧＰ７３タンパク質のアミノ酸３５－５５内のエピトープに結合する抗体Ｇ２－２及び／又はＧ２－２ｏｐｔｉの開発に基づく。いくつかの実施態様では、本明細書で提供される抗体は、ヒトＧＰ７３のアミノ酸３５－５５内のエピトープに結合する。いくつかのそのような実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体Ｇ２－２の１つ以上のＣＤＲ配列を含む。

【0148】

したがって、いくつかの実施態様では、本発明は、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号７のアミノ酸配列を含ＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５又は６のＣＤＲを含む抗ＧＰ７３抗体を提供する。

【0149】

一態様では、本発明は、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つ全てのＶＨ ＣＤＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。一実施態様において、抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む。更なる実施態様において、抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、及び配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２を含む。更なる実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。

【0150】

別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つ全てのＶＬ ＣＤＲ配列を含むｌ抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含む。

【0151】

別の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つ全てのＶＨ ＣＤＲ配列を含むＶＨドメイン；並びに
（ｂ） （ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つ全てのＶＬ ＣＤＲ配列を含むＶＬドメイン
を含む。

【0152】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体を提供する。

【0153】

別の態様では、抗ＧＰ７３抗体は、配列番号２又は配列番号３５のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施態様において、配列番号２又は配列番号３５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＧＰ７３抗体は、ＧＰ７３への結合能を保持する。ある実施態様では、配列番号２又は配列番号３５において、合計１から１０のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。ある実施態様では、配列番号２又は配列番号３５において、合計１から５のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。ある実施態様では、置換、挿入又は欠失は、ＣＤＲの外側の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。好ましい実施態様では、哺乳動物細胞における発現を最適化するために、配列番号２の合計３つのアミノ酸が置換されている（配列番号３５）。任意選択的に、抗ＧＰ７３抗体は、配列番号２又は配列番号３５のＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾も含む。特定の実施態様において、ＶＨは、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；及び（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む。

【0154】

別の態様において、配列番号３又は配列番号３６のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗ＧＰ７３抗体が提供される。ある実施態様において、配列番号３又は配列番号３６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＧＰ７３抗体は、ＧＰ７３への結合能を保持する。ある実施態様では、配列番号３又は配列番号３６において、合計１から１０のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。ある実施態様では、配列番号３又は配列番号３６において、合計１から５のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。特定の実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわちＦＲ内で）生じる。好ましい実施態様では、哺乳動物細胞における発現を最適化するために、配列番号３の合計８つのアミノ酸が置換されている（配列番号３６）。任意選択的に、抗ＧＰ７３抗体は、配列番号３又は配列番号３６のＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾も含む。特定の実施態様において、ＶＬは、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む。

【0155】

別の態様では、上記実施態様のいずれかにおけるＶＨ、及び上記実施態様のいずれかにおけるＶＬを含む抗ＧＰ７３抗体が提供される。好ましい実施態様では、抗体は、配列番号３５のＶＨ配列及び配列番号３６のＶＬ配列を含み、これらの配列の翻訳後修飾も含む。別の好ましい実施態様では、抗ＧＰ７３抗体は、配列番号３５のＶＨ配列及び配列番号３６のＶＬ配列を含む抗体のヒト化形態を含む。一実施態様では、該抗体は、配列番号２のＶＨ配列及び配列番号３のＶＬ配列を含み、これらの配列の翻訳後修飾も含む。別の実施態様では、抗ＧＰ７３抗体は、配列番号２のＶＨ配列及び配列番号３のＶＬ配列を含む抗体のヒト化形態を含む。

【0156】

本明細書では、更なる態様において、本明細書で提供される抗ＧＰ７３抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。好ましい実施態様では、配列番号３７のＶＨ配列及び配列番号３８のＶＬ配列を含む抗ＧＰ７３抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。ある実施態様において、配列番号１０のＶＨ配列及び配列番号１１のＶＬ配列を含む抗ＧＰ７３抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。

【0157】

本発明の更なる態様では、上記実施態様による抗ＧＰ７３抗体は、ヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施態様において、抗ＧＰ７３抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）_２断片である。別の実施態様では、抗体は、実質的に完全長抗体であり、例えば、本明細書に記載のＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ａ抗体又は他の抗体クラス若しくはアイソタイプである。

【0158】

更なる態様では、上記実施態様による抗ＧＰ７３抗体は、配列番号２８、好ましくは配列番号３９（これは哺乳動物細胞における発現を最適化するための、配列番号２８の改変型である）のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域配列を含む。別の態様では、抗ＧＰ７３抗体は、配列番号２８又は配列番号３９のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖定常領域配列を含む。

【0159】

更なる態様では、上記実施態様による抗ＧＰ７３抗体は、後述の特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせて含む。

【0160】

本明細書で提供される特定の実施態様は、部分的に、ヒトＧＰ７３タンパク質のアミノ酸３６－５５内のエピトープに結合する抗体Ｇ２－２の開発に基づく。いくつかの実施態様では、本明細書で提供される抗体は、ヒトＧＰ７３のアミノ酸３４７－３６６内のエピトープに結合する。いくつかのそのような実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体Ｇ２－１の１つ以上のＣＤＲ配列を含む。

【0161】

いくつかの実施態様では、本発明は、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号１５のアミノ酸配列を含ＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１７又は配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５又は６のＣＤＲを含む抗ＧＰ７３抗体を提供する。

【0162】

一態様では、本発明は、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つ全てのＶＨ ＣＤＲ配列を含むｌ抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。別の実施態様において、抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、配列番号１７又は配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む。更なる実施態様において、抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１７又は配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、及び配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２を含む。更なる実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。

【0163】

別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；（ｃ）配列番号１７又は配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つ全てのＶＬ ＣＤＲ配列を含むｌ抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、
（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び
（ｃ）配列番号１７又は配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含む。

【0164】

別の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つ全てのＶＨ ＣＤＲ配列を含むＶＨドメイン；並びに
（ｂ） （ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７又は配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つ全てのＶＬ ＣＤＲ配列を含むＶＬドメイン
を含む。

【0165】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１７又は配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む抗体を提供する。

【0166】

別の態様では、抗ＧＰ７３抗体は、配列番号１０又は配列番号３７のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施態様において、配列番号１０又は配列番号３７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＧＰ７３抗体は、ＧＰ７３への結合能を保持する。ある実施態様では、配列番号１０又は配列番号３７において、合計１から１０のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。ある実施態様では、配列番号１０又は配列番号３７において、合計１から５のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。ある実施態様では、置換、挿入又は欠失は、ＣＤＲの外側の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。好ましい実施態様では、哺乳動物細胞における発現を最適化するために、配列番号１０の合計６つのアミノ酸が置換されている（配列番号３７）。任意選択的に、抗ＧＰ７３抗体は、配列番号１０又は配列番号３７のＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾も含む。特定の実施態様において、ＶＨは、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む。

【0167】

別の態様において、配列番号１１又は配列番号３８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗ＧＰ７３抗体が提供される。ある実施態様において、配列番号１１又は配列番号３８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＧＰ７３抗体は、ＧＰ７３への結合能を保持する。ある実施態様では、配列番号１１又は配列番号３８において、合計１から１０のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。ある実施態様では、配列番号１１又は配列番号３８において、合計１から５のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。特定の実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわちＦＲ内で）生じる。好ましい実施態様では、哺乳動物細胞における発現を最適化するために、配列番号１１の合計１０つのアミノ酸が置換されている（配列番号３８）。任意選択的に、抗ＧＰ７３抗体は、配列番号１１又は配列番号３８のＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾も含む。特定の実施態様において、ＶＬは、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１７又は配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む。

【0168】

別の態様では、上記実施態様のいずれかにおけるＶＨ、及び上記実施態様のいずれかにおけるＶＬを含む抗ＧＰ７３抗体が提供される。好ましい実施態様では、抗体は、配列番号３７のＶＨ配列及び配列番号３８のＶＬ配列を含み、これらの配列の翻訳後修飾も含む。別の実施態様では、抗ＧＰ７３抗体は、配列番号３７のＶＨ配列及び配列番号３８のＶＬ配列を含む抗体のヒト化形態を含む。一実施態様では、該抗体は、配列番号１０のＶＨ配列及び配列番号１１のＶＬ配列を含み、これらの配列の翻訳後修飾も含む。別の実施態様では、抗ＧＰ７３抗体は、配列番号１０のＶＨ配列及び配列番号１１のＶＬ配列を含む抗体のヒト化形態を含む。

【0169】

本明細書では、更なる態様において、本明細書に提供される抗ＧＰ７３抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。好ましい実施態様では、配列番号３５のＶＨ配列及び配列番号３６のＶＬ配列を含む抗ＧＰ７３抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。ある実施態様において、配列番号２のＶＨ配列及び配列番号３のＶＬ配列を含む抗ＧＰ７３抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。

【0170】

本発明の更なる態様では、上記実施態様による抗ＧＰ７３抗体は、ヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施態様において、抗ＧＰ７３抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）_２断片である。別の実施態様では、抗体は、実質的に完全長抗体であり、例えば、本明細書に記載のＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ａ抗体又は他の抗体クラス若しくはアイソタイプである。

【0171】

更なる態様では、上記実施態様による抗ＧＰ７３抗体は、配列番号２８、好ましくは配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域配列を含む。別の態様では、抗ＧＰ７３抗体は、配列番号２８又は配列番号３９のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖定常領域配列を含む。

【0172】

更なる態様では、上記実施態様による抗ＧＰ７３抗体は、後述の特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせて含む。

【0173】

ある実施態様では、本明細書で提供される抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦５０ｎｍ、≦１０ｎＭ、≦５ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ、場合によって１０^－１３Ｍ（例えば１０^－８Ｍ以下、例えば１０^－８Ｍから１０^－１３Ｍ、例えば１０^－９Ｍから１０^－１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。

【0174】

一実施態様では、－１０反応単位（ＲＵ）に固定化された抗原ＣＭ５チップを用いた２５℃のＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－３０００（ニュージャージー州ピスカタウェイのＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用してＫｄを測定する。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、供給業者の指示書に従ってＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（－０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、未反応基をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。反応速度論的な測定のために、抗体の２倍の段階希釈（０．５８ｎＭから２００ｎＭ）を、２５℃、約２５μｌ／分の流速で、０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０^ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入する。会合センサーグラムと解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによる単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００評価ソフトウェア）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ）／ｋｏｎ比として計算する。例えば、Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９））を参照のこと。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる会合速度が１０６Ｍ^－１ｓ^－１を上回る場合、会合速度は、分光計、例えばストップフロー装置付き分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ－Ａｍｉｎｃｏ^ＴＭ 分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される漸増濃度の抗原の存在下で、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭの抗抗原抗体の２５℃での蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）の増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて測定することができる。

【0175】

表１－１：１結合についてのＢｉａｃｏｒｅデータフィット

ＧＰ７３ペプチド：ＳＳＲＳＶＤＬＱＴＲＩＭＥＬＥＧＲＶＲＲ
解析ソフトウェア：Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ 評価ソフトウェア（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）

【0176】

ある実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれる。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成により調製することができる。このような改変は、例えば抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失及び／又は残基への挿入及び／又は残基の置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせが、最終構築物に到達するまでなされ得る。

【0177】

ある実施態様では、１以上のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。置換突然変異誘発の対象部位には、ＣＤＲ及びＦＲが含まれる。保存的置換は、表２の「好ましい置換」という見出しの下に示されている。より実質的な変更は、表２で「例示的置換」という見出しの下に示し、アミノ酸側鎖のクラスに関して更に後述する。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、生成物を所望の活性、例えば保持／改善された抗原結合、低下した免疫原性又は改善されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣについてスクリーニングすることができる。

【0178】

表２

【0179】

アミノ酸は共通の側鎖特性に従って部ループ分けすることができる。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１クラスのメンバーを別のクラスのものと交換することを必要とする。

【0180】

置換バリアントの１つの種類は、親抗体（例えばヒト化又はヒト抗体）の１以上の超可変領域残基の置換を伴う。一般的には、更なる研究のために選択される、結果として得られたバリアントは、親抗体と比較して、特定の生物学的特性（例えば増加した親和性、低下した免疫原性）の改変（例えば改善）を有し、且つ／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持する。例示的な置換バリアントは、親和性成熟抗体であり、例えば本明細書に記載のファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成することができる。簡潔に言えば、１以上のＨＶＲ残基が突然変異し、バリアント抗体がファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングされる。

【0181】

変更例えば置換）は、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＣＤＲ内で行われ得る。このような変更は、ＣＤＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で突然変異を経るコドンによりコードされた残基（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）内で行うことができ、得られたバリアントＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリーから構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えばＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍらＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)）に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施態様において、多様性が、様々な方法（例えばエラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング又はオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）のいずれかにより、成熟のために選択された可変遺伝子に導入される。次いで、二次ライブラリーが作製される。次いで、該ライブラリーは、所望の親和性を持つ任意の抗体バリアントを同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入する別の方法は、複数のＣＤＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されるＣＤＲ指向の手法を含む。抗原結合に関与するＣＤＲ残基は、例えばアラニンスキャニングアラニンスキャニング突然変異誘発又はモデリングを用いて、特異的に同定することができる。特にＣＤＲ Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ３が、多くの場合標的とされる。

【0182】

特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、かかる変更が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、１以上のＣＤＲ内で生じ得る。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的変更（例えば本明細書において提供される保存的置換）をＣＤＲ内で行うことができる。このような変更は、ＣＤＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であってもよい。上記のバリアントＶＨ配列及びＶＬ配列に関するある実施態様において、各ＣＤＲは変化しないか又はわずか１つ、２つ若しくは３つのアミノ酸置換を含む。

【0183】

突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５により記載されているように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグループ（例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕ等の荷電残基）が同定され、抗原と抗体の相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えばアラニン又はポリアラニン）により置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。代わりに又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造を用いて抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。バリアントをスクリーニングして、それらが所望の特性を含むかどうかを決定することができる。

【0184】

アミノ酸配列挿入物は、 １残基から、１００以上の残基を有するポリペプチドの長さに及ぶアミノ－及び／又はカルボキシル末端融合体、 並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例は、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体を含む。抗体分子の他の挿入バリアントは、抗体のＮ末端又はＣ末端と酵素との融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、又は抗体の血清半減期を延ばすポリペプチドとの融合を含む。

【0185】

特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を上昇又は低下させるように改変される。グリコシル化部位の抗体への付加又は欠失は、１以上のグリコシル化部位が作製又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することにより、簡便に達成することができる。

【0186】

抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに結合する炭水化物を改変することができる。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、通常Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合により結合した分岐状の二分岐オリゴ糖を典型的に含む。例えばＷｒｉｇｈｔらＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えばマンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「幹」におけるＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含み得る。いくつかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を有する抗体バリアントを作製するためになされ得る。

【0187】

一実施態様において、抗体バリアントは、Ｆｃ領域に（直接的に又は間接的に）結合するフコースを欠く炭水化物構造を有して提供される。そのような抗体のフコースの量は、例えば１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％又は２０％から４０％であり得る。フコースの量は、例えば国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に結合している全ての糖構造体の合計（例えば複合、ハイブリッド及び高マンノース構造体）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域のおよそ２９７位に位置する（Ｆｅ領域残基のＥＵ番号付け）アスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７は、抗体のわずかな配列変異に起因して、２９７位のおよそ±３アミノ酸上流又は下流に、すなわち２９４位から３００位に位置する場合もある。このようなフコシル化バリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Presta, L.）；同第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照。「脱フコシル化」又は「フコース欠損」抗体バリアントに関連する出版物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、同第２００２／０１６４３２８号、同第２００４／００９３６２１号、同第２００４／０１３２１４０号、同第２００４／０１１０７０４号、同第２００４／０１１０２８２号、同第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、同第２００３／０８４５７０号、同２００５／０３５５８６号、同第２００５／０３５７７８号、同第２００５／０５３７４２号、同第２００２／０３１１４０号、ＯｋａｚａｋｉらＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９－１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ－ＯｈｎｕｋｉらＢｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が含まれる。脱フコシル化抗体を産生できる細胞株の例は、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripkaら, Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)、Presta, Lの米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、及びＡｄａｍｓらの国際公開第２００４／０５６３１２号（特に実施例１１））及びノックアウト細胞株、例えばアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えばYamane-Ohnukiら, Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)、Kanda, Y.ら, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)、及び国際公開第２００３／０８５ｌ０７号を参照）を含む。

【0188】

抗体バリアントは、二分（bisected）オリゴ糖、例えば抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されているオリゴ糖を更に備えている。そのような抗体バリアントは、低下したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。そのような抗体バリアントの例は、例えば国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔｔら）；米国特許第６６０２６８４号（Ｕｍａｎａら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも１のガラクトース残基を持つ抗体バリアントも提供される。そのような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。このような抗体バリアントは、例えば国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌら）；同第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；及び同第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。

【0189】

特定の実施態様において、１以上のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入し、それによりＦｃ領域バリアントを生成することができる。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。

【0190】

特定の実施態様において、本発明は、抗体のｉｎ ｖｉｖｏの半減期は重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣ）は不要又は有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないがいくつかのエフェクター機能を有する抗体バリアントを意図している。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ細胞傷害性アッセイを実施して、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣの活性の低下／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体がＦｃＲ結合を欠く（したがっておそらくＡＤＣＣ活性を欠く）がＦｃＲｎ結合能力を保持することを確かめることができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞はＦｃＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃＲＩ、ＦｃＲＩＩ、及びＦｃＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－４９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。目的分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例は、米国特許第５５００３６２号（例えばＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７０５９－７０６３（１９８６）を参照）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９－１５０２（１９８５）、５，８２１，３３７（Bruggemann, M. et al.,J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照）に記載されている。

【0191】

或いは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ^ＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（カリフォルニア州マウンテンビューのＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（ウィスコンシン州マディソンのＰｒｏｍｅｇａ）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。

【0192】

代わりに又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えばＣｌｙｎｅｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏで評価することができる。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施して、抗体がＣ１ｑに結合できないこと、したがってＣＤＣ活性を欠くことを確認することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施することができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)、Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)、及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照）。ＦｃＲｎ結合、及びｉｎ ｖｉｖｏのクリアランス／半減期の測定もまた、当該分野で知られている方法を用いて行うことができる（例えばPetkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照）。

【0193】

エフェクター機能が低下した抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの１つ以上の置換を伴うものを含む（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含め、アミノ酸位２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうちの２以上における置換を有するＦｃ突然変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。

【0194】

ＦｃＲへの結合が改善又は減少した特定の抗体バリアントが記載されている。（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照）。

【0195】

特定の実施態様では、抗体バリアントは、ＡＤＣＣを改善する１以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位，及び／又は３３４位（残基のＥＵ番号付け）における置換を有するＦｃ領域を含む。

【0196】

いくつかの実施態様では、例えば米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びＩｄｕｓｏｇｉｅらのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載されているように、改変された（すなわち改善されたか減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域における変更がなされる。

【0197】

増加した半減期を持ち、胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Guyerら、J. Immunol.117:587 (1976)及びKimら、J. Immunol. 24:249 (1994)）が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１以上の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃバリアントは、Ｆｃ領域残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４のうちの１つ以上における置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するものを含む（米国特許第７３７１８２６号）。

【0198】

Ｆｃ領域のバリアントのその他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）、米国特許第５６４８２６０号、同第５６２４８２１号、及び国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
ある実施態様において、抗体の１以上の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作抗体、例えば「チオＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施態様において、置換される残基は、抗体の接近可能な部位に存在する。これらの残基をシステインで置換することによって反応性チオール基が抗体の接近可能部位に配置され、そしてこの反応性チオール基を用いて、本明細書中に更に記載されるように、抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー－薬剤部分にコンジュゲートさせ、免疫コンジュゲートを作製することができる。ある実施態様において、次の残基のいずれか１つ又はそれ以上がシステインと置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作抗体は、例えば米国特許第７５２１５４１号に記載のように作製することができる。

【0199】

ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当該技術分野で知られていて容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むように更に改変されてもよい。抗体の誘導体化に適した部分は、限定されるものではないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（propropylene）グリコールホモポリマー、プロリプロピレン（prolypropylene）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにこれらの混合物を含む（ただし、これらに限定されない）。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量であってよく、分岐状でも非分岐状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、２つ以上のポリマーが結合している場合、それらは同じ分子でも異なる分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、その抗体誘導体が規定の条件下での治療に使用されるかどうかを含めた（但しこれらに限定されない）考慮事項に基づいて決定され得る。

【0200】

別の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱されてもよい、非タンパク質部分と抗体とのコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)）。放射線は、任意の波長であってよく、通常の細胞に害を与えないが抗体－非タンパク質部分の近位細胞が死滅する温度に非タンパク質部分を加熱する波長を含むがこれに限定されない。

【0201】

抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載されているように、組換え方法及び組成物を用いて製造される。一実施態様では、本明細書に記載される抗ＧＰ７３抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。更なる実施態様では、そのような核酸を含む１以上のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。更なる実施態様では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一実施態様において、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及びＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第ニのベクターを含む（例えば、これらで形質転換されている）。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はリンパ系細胞（例えばＹ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、上述のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、任意選択的に宿主細胞（又は宿主細胞培地）から抗体を回収することとを含む、抗ＧＰ７３抗体を作製する方法が提供される。

【0202】

抗ＧＰ７３抗体の組換え生産のために、例えば上述のような、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために１以上のベクターに挿入される。そのような核酸は、容易に単離可能であり、従来の手順を用いて（例えば抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。

【0203】

抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適した宿主細胞は、本明細書に記載の原核生物細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌内で製造され得る。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば米国特許第５６４８２３７号、同第５７８９１９９号及び同第５８４０５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体断片の発現について記載している、Charlton, Methods in Molecular Biology, 第248 巻(B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), 245-254頁も参照のこと）。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離し、更に精製することができる。

【0204】

原核生物に加えて、グリコシル化経路が「ヒト化」されていて、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす真菌株及び酵母株を含めた糸状菌又は酵母などの真核微生物も、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主である。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９－１４１４（２００４）及びＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９－１４１４（２００４）を参照。

【0205】

グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例は、植物細胞及び昆虫細胞を含む。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にヨトウガ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて使用することができる。

【0206】

植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、同第６０４０４９８号、同第６４２０５４８号、同第７１２５９７８号、及び同第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ^ＴＭ技術を記載）を参照のこと。

【0207】

脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株のその他の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶｌ株（ＣＯＳ－７）；ヒト胚腎臓株（例えばGraham et al.,J.Gen Virol.36:59(1977)に記載されている２９３又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えばＭａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記載されているＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ ｌ）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頚がん細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗｌ３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）；例えばＭａｔｈｅｒら，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載されているＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）；並びにＹＯ、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体生産に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えばＹａｚａｋｉ及びＷｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖａｌ．２４８（B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), 255-268頁(2003)を参照。

【0208】

本明細書で提供される抗ＧＰ７３抗体は、当該技術分野で既知の様々なアッセイによって、同定され、物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、又は特徴づけられる。

【0209】

一態様では、本発明の抗体は、その抗原結合活性について、例えばＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣｏｒｅ（登録商標）、ＦＡＣＳ、免疫蛍光法又は免疫組織化学等の既知の方法により試験される。

【0210】

別の態様では、ＧＰ７３への結合について本明細書に記載の抗体のいずれかと競合する抗体を同定するために、競合アッセイが使用される。特定の実施態様では、このような競合抗体は、本明細書に記載の抗体によって結合されるのと同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第６６巻（Humana Press, Totowa, NJ）に掲載のＭｏｒｒｉｓ（１９９６）「Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」に示されている。

【0211】

例示的競合アッセイでは、固定化ＧＰ７３は、ＧＰ７３に結合する第１の標識抗体（例えば、本明細書に記載の抗体のいずれか）と、ＧＰ７３への結合について第１の抗体と競合する能力を試験される第２の非標識抗体とを含む溶液中でインキュベートされる。コントロールとして、固定化ＧＰ７３が、第１の標識抗体を含むが第２の非標識抗体は含まない溶液中でインキュベートされる。第１の抗体のＧＰ７３への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化されたＧＰ７３に結合した標識の量が測定される。固定化ＧＰ７３に結合した標識の量がコントロール試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第２の抗体が第１の抗体とＧＰ７３への結合に関して競合していることを示している。Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照。

【0212】

本発明はまた、エンドソームエスケープドメイン（ＥＥＤ）ペプチド又は１つ以上の細胞傷害性剤、例えば化学療法剤若しくは化学療法薬、増殖抑制剤、毒素（例えばタンパク毒素、細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素活性毒素又はその断片）又は放射性同位体（すなわち放射性コンジュゲート）等、にコンジュゲートする、本明細書の抗ＧＰ７３抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。

【0213】

イムノコンジュゲートは、腫瘍への薬物部分の標的化送達を可能にし、いくつかの実施態様では、非コンジュゲート薬の全身投与が正常細胞に対して許容できないレベルの毒性をもたらし得る、腫瘍中の細胞内蓄積を可能にする（Polakis P. (2005) Current Opinion in Pharmacology 5:382-387）。

【0214】

抗体－ＥＥＤコンジュゲート化合物の例示的な実施態様は、腫瘍細胞を標的とする抗体（Ａｂ）、ＥＥＤペプチド、及びＡｂをＥＥＤペプチドに結合させるＥＥＤリンカー（ＥＥＤＬ）を含む。ＥＥＤは、配列番号４３に示されるような適切なリンカーペプチドによって、タグとして抗体に直接結合され得る。例示的な抗体－ＥＥＤコンジュゲート化合物は、式Ａｂ（－ＥＥＤＬ－ＥＥＤペプチド）を有する。ＥＥＤペプチドには、限定されないが、デングウイルス及びその他のウイルス由来のＥＥＤペプチド、並びにそれらのバリアント、２つの芳香族インドール環又は１つのインドール環及び２つの芳香族フェニル基を含む細菌由来のＥＥＤ並びにペプチドが含まれる（国際公開第２０１６／０１５６２１号；国際公開第２０１６／０３７９８５号；Kiesgen et al., Protein Eng Des Sel. 27(10):331-7 (2014) 及びLohn et al., Sci Rep. 6:32301 (2016)）。

【0215】

抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、強力な細胞傷害性薬物を抗原発現腫瘍細胞に対して標的化する（Teicher, B.A. (2009) Current Cancer Drug Targets 9:982-1004）ことによって抗体と細胞傷害性薬物双方の特性を組み合わせ、それにより有効性を最大にし、且つ、オフターゲット毒性を最小にすることで治療指数を高める標的化学療法分子である（Carter, and Senter P.D. (2008) The Cancer Jour. 14(3):154-169; Chari, R.V. (2008) Ace. Chem. Res. 41:98-107)。

【0216】

本発明のＡＤＣ化合物は、抗がん活性を有するものを含む。いくつかの実施態様では、ＡＤＣ化合物は、薬物部分にコンジュゲートした、すなわち共有結合した抗体を含む。いくつかの実施態様では、抗体は、リンカーを介して薬物部分に共有結合している。本発明の抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、有効用量の薬物を腫瘍組織に選択的に送達し、それにより、治療指数（「治療濃度域」）を増大させながらより高い選択性、すなわちより低い有効用量を達成することができる。

【0217】

抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬物部分（Ｄ）は、細胞傷害又は細胞増殖抑制効果を有する任意の化合物、部分又は基を含む。薬物部分は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はインターカレーション、並びにＲＮＡポリメラーゼ、タンパク質合成及び／又はトポイソメラーゼの阻害を含むがこれらに限定されないメカニズムによって、その細胞傷害又は細胞増殖抑制効果を与え得る。例示的な薬物部分には、限定されないが、メイタンシノイド、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ネモルビシン及びその誘導体、ＰＮＵ－１５９６８２、アントラサイクリン、ズオカルマイシン、ビンカアルカロイド、タキサン、トリコテセン、ＣＣ１０６５、カンプトテシン、エリナフィド（elinafide）、並びに細胞傷害活性を有するこれらの立体異性体、同配体、アナログ及び誘導体が含まれる。このようなイムノコンジュゲートの非限定的な例を以下で更に詳細に論ずる。

【0218】

抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物の例示的な実施態様は、腫瘍細胞を標的とする抗体（Ａｂ）、薬物部分（Ｄ）、及びＡｂをＤに結合させるリンカー部分（Ｌ）を含む。いくつかの実施態様では、抗体は、リジン及び／又はシステインなどの１以上のアミノ酸残基を介してリンカー部分（Ｌ）に結合している。

【0219】

１．１ １．例示的な抗体－薬物コンジュゲート
１．２
抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物の例示的な実施態様は、腫瘍細胞を標的とする抗体（Ａｂ）、薬物部分（Ｄ）、及びＡｂをＤに結合させるリンカー部分（Ｌ）を含む。抗体は、リジン及び／又はシステインなどの１以上のアミノ酸残基を介してリンカー部分（Ｌ）に結合していてもよい。
例示的なＡＤＣは、式Ｉ：
Ａｂ（－Ｌ－Ｄ）_ｐ Ｉ
（式中、ｐは１～約２０である）
を有する。

【0220】

抗体にコンジュゲートすることのできる薬物部分の数は、遊離システイン残基の数によって制限され得る。遊離システイン残基は、本明細書に記載される方法によって、抗体のアミノ酸配列に導入することができる。式Ｉの例示的なＡＤＣは、限定されないが、１、２、３又は４の操作されたシステインアミノ酸を有する抗体を含む（Lyon, R. et al (2012) Methods in Enzym. 502:123-138）。いくつかの実施態様では、工学的操作を用いなくとも、１以上の遊離システイン残基が既に抗体中に存在し、その場合、既存の遊離システイン残基を使用して、抗体を薬物にコンジュゲートさせることができる。いくつかの実施態様では、抗体は、１以上の遊離システイン残基を生成するために、抗体のコンジュゲーションに先立ち還元条件に曝される。

【0221】

ａ．例示的リンカー
「リンカー」（Ｌ）は、１以上の薬物部分（Ｄ）を抗体（Ａｂ）に結合させて式１の抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成するのに使用できる、二官能性又は多官能性部分である。いくつかの実施態様では、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、薬物及び抗体に共有結合するための反応性官能基を有するリンカーを用いて調製することができる。例えば、いくつかの実施態様では、抗体（Ａｂ）のシステインチオールは、リンカーの反応性官能基又は薬物－リンカー中間体との結合を形成し、ＡＤＣをつくる。

【0222】

一態様では、リンカーは、抗体上に存在する遊離システインと反応して共有結合を形成することができる官能基を有する。このような反応官能基の非限定的な例には、マレイミド、ハロアセトアミド、α－ハロアセチル、活性化エステル、例えばスクシンイミドエステル、４－ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、無水物、酸クロリド、スルホニルクロリド、イソシアネート、及びイソチオシアネートが含まれる。例えば、Ｋｌｕｓｓｍａｎら（２００４），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １５（４）：７６５－７７３の７６６頁に開示されているコンジュゲーション方法、及び本明細書に開示の実施例を参照されたい。

【0223】

リンカーは、抗体上に存在する求電子基と反応できる官能基を有する。例示的な求電子基には、限定されないが、アルデヒド基及びケトンカルボニル基が含まれる。いくつかの実施態様では、リンカーの反応性官能基のヘテロ原子は、抗体上の求電子基と反応し、抗体単位への共有結合を形成することができる。このような反応性官能基の非限定的な例には、限定されないが、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジンが含まれる。

【0224】

リンカーは、１以上のリンカー成分を含み得る。例示的なリンカー成分には、６－マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢ」）、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（「ＳＰＰ」）、及び４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１カルボキシレート（「ＭＣＣ」）が含まれる。様々なリンカー成分が当該技術分野で既知であり、そのうちのいくつかについて後述する。

【0225】

リンカーは、薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。非限定的で例示的な切断可能なリンカーには、酸不安定性リンカー（例えばヒドラゾンを含む）、プロテアーゼ感受性（例えばペプチダーゼ感受性）リンカー、光解離性リンカー又はジスルフィド含有リンカーが含まれる（Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)；米国特許第５２０８０２０号）。

【0226】

リンカー成分は、別のリンカー成分又は薬物部分に抗体を結合させる「ストレッチャー単位」を含み得る。非限定的で例示的なストレッチャー単位を以下に示す（波線は、抗体、薬物又は追加的リンカー成分への共有結合の部位を示す）：

【0227】

リンカー成分は、直接的に又はストレッチャー単位及び／若しくはアミノ酸単位を介して薬物部分に抗体を結合させる「スペーサー」単位を含み得る。スペーサー単位は、「自壊性」でも「非自壊性」でもよい。「非自壊性」のスペーサー単位は、スペーサー単位の一部又は全部がＡＤＣの切断時に薬物部分に結合したままであるものである。非自壊性スペーサー単位の例には、限定されないが、グリシンスペーサー単位及びグリシン－グリシンスペーサー単位が含まれる。腫瘍細胞関連プロテアーゼによるグリシン－グリシンスペーサー単位を含むＡＤＣの酵素切断は、ＡＤＣの残りの部分からのグリシン－グリシン－薬物部分の放出をもたらし得る。いくつかのこのような事例では、グリシン－グリシン－薬物部分を腫瘍細胞中で加水分解工程に付し、それにより薬物部分からグリシン－グリシンスペーサー単位を切断する。

【0228】

「自壊性」スペーサー単位は、薬物部分の放出を可能にする。リンカーのスペーサー単位は、ｐ－アミノベンジル単位を含み得る。更に、ｐ－アミノベンジルアルコールをアミド結合を介してアミノ酸単位に結合させることができ、カルバメート、メチルカルバメート又は炭酸塩がベンジルアルコールと薬物の間に作られる（Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103）。スペーサー単位は、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（paminobenzyloxycarbonyl）（ＰＡＢ）であってもよい。自壊性リンカーを含むＡＤＣは、以下の構造を有し得る。

式中、Ｑは、－Ｃ_１－Ｃ_８アルキル、－Ｏ－（Ｃ_１－Ｃ_８アルキル）、－ハロゲン、－ニトロ又は－シアノであり；
ｍは、０から４の整数であり；
ｐは、１－約２０の範囲である。好ましくは、ｐは、１－１０、１－７、１－５又は１－４の範囲である。
Ａは任意選択のアシル基であり、ａは０－８の範囲であり；Ｗは任意選択の第２の自壊性基であり、ｗは０－１である。

【0229】

自壊性スペーサーの他の例には、限定されないが、ＰＡＢ基と電子化学的に類似している芳香族化合物、例えば２－アミノイミダゾール－５－メタノール誘導体（米国特許第７３７５０７８号；Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237)及びオルト－又はパラ－アミノベンジルアセタールが含まれる。置換及び無置換４－アミノ酪酸アミド（Rodrigues et al (1995) Chemistry Biology 2:223）、適切に置換されたビシクロ［２．２．１］及びビシクロ［２．２．２］環系（Storm et al (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815）、並びに２－アミノフェニルプロピオン酸アミド（Amsberry, et al (1990) J. Org. Chem. 55:5867）等の、アミド結合加水分解時に環化を受けるスペーサーを使用することができる。グリシン残基のα炭素への薬物の結合は、ＡＤＣにおいて有用であり得る自壊性スペーサーの別の例である（Kingsbury et al (1984) J. Med. Chem. 27:1447）。

【0230】

リンカーＬは、分岐した多官能性リンカー部分を介して抗体に２つ以上の薬物部分を共有結合させるための樹状型リンカーであってもよい（Sun et al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768）。樹状リンカーは、抗体に対する薬物のモル比、すなわち負荷を増加させることができ、これはＡＤＣの効力に関連する。したがって、抗体が１つの反応性システインチオール基をのみを有する場合、樹状リンカーを介して多数の薬物部分を結合することができる。

【0231】

いくつかの実施態様では、リンカーは、溶解度及び／又は反応性を調節する基で置換される。非限定的な例として、スルホネート（－ＳＯ_３ ^－）又はアンモニウムなどの荷電置換基は、リンカー試薬の水溶解度を高め、ＡＤＣを調製するために用いられる合成経路に応じて、リンカー試薬と抗体及び／又は薬物部分とのカップリング反応を容易にすることができ、又はＡｂ－Ｌ（抗体－リンカー中間体）とＤとの、又はＤ－Ｌ（薬物－リンカー中間体）とＡｂとのカップリング反応を容易にすることができる。いくつかの実施態様では、リンカーの一部を抗体に結合させ、且つ、リンカーの一部を薬物に結合させ、その後Ａｂ－（リンカー部分）^ａを薬物－（リンカー部分）^ｂに結合させて式１のＡＤＣを形成する。いくつかの実施態様では、抗体は、式１のＡＤＣにおいて２以上の薬物が抗体に結合されるように、２以上の（リンカー部分）^ａ置換基を含む。

【0232】

本発明の化合物は、限定するものではないが、ビス－マレイミド－トリオキシエチレングリコール（ＢＭＰＥＯ）、Ｎ－（β－マレイミドプロピルオキシ）－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）、Ｎ－（ε－マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、Ｎ－［γ－マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、１，６－ヘキサン－ビスビニルスルホン（ＨＢＶＳ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシ－（６－アミドカプロン酸）（ＬＣ－ＳＭＣＣ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、スクシンイミジル３－（ブロムアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）、スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチラート（ＳＭＰＢ）、スクシンイミジル６－［（ベータ－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート］（ＳＭＰＨ）、イミノチオラン（ＩＴ）、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、及びスルホ－ＳＭＰＢ（スルホスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドフェニル）ブチラート））及びスクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート（ＳＶＳＢ）、並びに以下のビスマレイミド試薬：ジチオビスマレイミドエタン（ＤＴＭＥ）、１，４－ビスマレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，４－ビスマレイミジル－２，３－ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ビスマレイミドエタン（ＢＭＯＥ）、ＢＭ（ＰＥＧ）_２（以下に示す）及びＢＭ（ＰＥＧ）_３（以下に示す）；イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス‐アジド化合物（例えばビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えばビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン－２，６－ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）を含む、リンカー試薬を用いて調製されたＡＤＣを特に含む。

【0233】

ビス－マレイミド試薬は、抗体中のシステインのチオール基がチオール含有薬物部分、リンカー又はリンカー－薬物中間体に結合することを許容し得る。チオール基と反応性の他の官能基には、限定されないが、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネート及びイソチオシアネートが含まれる。

【0234】

特定の有用なリンカー試薬は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（イリノイ州ロックフォード），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．（コロラド州ボルダー）等の様々な商業的供給源から入手することができ、又は、例えばＤｕｂｏｗｃｈｉｋら（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３８：５２５７－６０；Ｗａｌｋｅｒ，Ｍ．Ａ．（１９９５）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：５３５２－５３５５；Ｆｒｉｓｃｈら（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．７：１８０－１８６；米国特許第６２１４３４５号；国際公開第０２／０８８１７２号；米国特許出願公開第２００３／１３０１８９号；同第２００３／０９６７４３号；国際公開第０３／０２６５７７号；同第０３／０４３５８３号；及び同第０４／０３２８２８号等、当該技術分野で記載されている手順に従って合成することができる。

【0235】

炭素－１４－標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である。例えば、国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと。

【0236】

ｂ．例示的薬物部分
（１）メイタンシン及びメイタンシノイド

イムノコンジュゲートは、１以上のメイタンシノイド分子にコンジュゲートした抗体を含んでもよい。メイタンシノイドはメイタンシンの誘導体であり、Ｃ１のメチル基は好ましくは、チオエタニル基又はＣＨ_２Ｃ（ＣＨ_３）_２ＳＨで置換されている。メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することにより作用する有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは、東アフリカの灌木メイテナスセラタ（Maytenus serrata）から最初に単離された（米国特許第３８９６１１１号）。続いて、特定の微生物もメイタンシノイド（例えばメイタンシノール及びＣ－３メイタンシノールエステル）を生成することが発見された（米国特許第４１５１０４２号）。合成メイタンシノイドは、例えば、米国特許第４１３７２３０号；同第４２４８８７０号；同第４２５６７４６号；同第４２６０６０８号；同第４２６５８１４号；同第４２９４７５７号；同第４３０７０１６号；同第４３０８２６８号；同第４３０８２６９号；同第４３０９４２８号；同第４３１３９４６号；同第４３１５９２９号；同第４３１７８２１号；同第４３２２３４８号；同第４３３１５９８号；同第４３６１６５０号；同第４３６４８６６号；同第４４２４２１９号；同第４４５０２５４号；同第４３６２６６３号；及び同第４３７１５３３号に開示されている。

【0237】

メイタンシノイド薬物部分は抗体－薬物コンジュゲートの魅力的な薬物部分である。なぜなら、この薬物部分は、（ｉ）発酵生成物の発酵又は化学修飾又は誘導体化により調製するために比較的到達可能であり、（ｉｉ）非ジスルフィドリンカーを介した抗体へのコンジュゲーションに適した官能基による誘導化を行い易く、（ｉｉｉ）血漿中で安定であり、且つ、（ｉｖ）様々な腫瘍細胞株に対して有効であるからである。

【0238】

メイタンシノイド薬物部分としての使用に適した特定のメイタンシノイドは、当該技術分野で周知であり、既知の方法に従って天然供給源から単離することができるか、又は工学的操作を用いて製造することができる（例えばYu et al (2002) PNAS 99:7968-7973参照）。メイタンシノノイドは、既知の方法に従って合成的に調製することもできる（米国特許出願公開第２０１１／１５８９９１号）。

【0239】

例示的メイタンシノイド薬物部分には、限定されないが、修飾された芳香族環を有するもの、例えばＣ－１９－デクロロ（米国特許第４２５６７４６号）（例えばアンサマイトシンＰ２の水素化アルミニウムリチウム還元により調製）；Ｃ－２０－ヒドロキシ（又はＣ－２０－デメチル）＋／－Ｃ－１９－デクロロ（米国特許第４３６１６５０号及び同第４３０７０１６号）（例えばストレプトミセス属（Streptomyces）若しくはアクチノミセス属（Actinomyces）を用いる脱メチル化又はＬＡＨ（水素化アルミニウムリチウム；米国特許第４２９４７５７号参照）を用いる脱塩素化により調製）及びＣ－２０－デメトキシ、Ｃ－２０－アシルオキシ（－ＯＣＯＲ）、＋／－デクロロ（米国特許第４２９４７５７号）（例えば塩化アシルを用いるアシル化により調製）、並びに芳香族環のその他の位置に修飾を有するものが含まれる。

【0240】

また、例示的なメイタンシノイド薬物部分には、修飾を有するもの、例えばＣ－９－ＳＨ（米国特許第４４２４２１９号）（例えばメイタンシノールとＨ_２Ｓ又はＰ_２Ｓ_５との反応により調製）；Ｃ－１４－アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ_２ ＯＲ）（米国特許第４３３１５９８号）；Ｃ－１４－ヒドロキシメチル又はアシルオキシメチル（ＣＨ_２ＯＨ又はＣＨ_２ＯＡｃ）（米国特許第４４５０２５４号）（例えばノカルジア属（Nocardia）から調製）；Ｃ－１５－ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４３６４８６６号）（例えばストレプトミセス属（Streptomyces）によるメイタンシノールの変換により調製）；Ｃ－１５－メトキシ（米国特許第４３１３９４６号及び同第４３１５９２９号）（例えばトレウィア ヌディフローラ（Trewia nudiflora）から単離）；Ｃ－１８－Ｎ－デメチル（米国特許第４３６２６６３号及び同第４３２２３４８号）（例えばストレプトマイセス属によるメイタンシノールの脱メチル化により調製）；及び４，５－デオキシ（米国特許第４３７１５３３号）（例えばメイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元により調製）が含まれる。

【0241】

メイタンシノイド化合物上の多数の位置が、結合位置として有用である。例えばエステル結合は、従来のカップリング技術を使用してヒドロキシル基との反応により形成され得る。いくつかの実施態様では、この反応は、ヒドロキシル基を有するＣ－３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ－１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ－１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ－２０位で生じ得る。いくつかの実施態様では、結合は、メイタンシノール又はメイタンシノールアナログのＣ－３位で形成される。

【0242】

メイタンシノイド薬物部分は、構造：

（式中、波線はメイタンシノイド薬物部分の硫黄原子の、ＡＤＣのリンカーへの共有結合を示す。各Ｒは独立に、Ｈ又はＣ_１－Ｃ_６アルキルである。
アミド基を硫黄原子に結合させる「アルキレン」鎖、すなわち（ＣＲ_２）_ｍは上に定義した通りであり、例えばメチレン、エチレン、プロピレンであってもよく、すなわちｍは１、２又は３である）
を有するものを含む。（ＵＳ６３３４１０；米国特許第５２０８０２０号；Chari et al. (1992) Cancer Res. 52:127-131; Liu et al (1996) Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:8618-8623）；これらは全体が参照により援用される。

【0243】

メイタンシノイド薬物部分の全ての立体異性体、すなわち不斉炭素におけるＲ及びＳ立体配置（configuration）の任意の組み合わせが本発明のＡＤＣのために考慮される（米国特許第７２７６４９７号；同第６９１３７４８号；同第６４４１１６３号；米国再発行特許第３９１５１号；米国特許第５２０８０２０号；Widdison et al (2006) J. Med. Chem. 49:4392-4408,これらは全体が参照により援用される）。

【0244】

いくつかの実施態様では、メイタンシノイドの薬物部分は以下の立体化学を有する

【0245】

メイタンシノイドの薬物部分の例示的実施態様には、限定されないが、以下の構造：

（式中、波線は薬物の硫黄原子の、抗体－薬物コンジュゲートのリンカー（Ｌ）への共有結合を示す）
を有するＤＭ１、ＤＭ３及びＤＭ４が含まれる。

【0246】

その他の例示的なメイタンシノイド抗体－薬物コンジュゲートは、以下の構造及び略語を有する。

（式中、Ａｂは抗体であり、ｐは１－約２０、好ましくはｐは１－１０、ｐは１－７、ｐは１－５、ｐは１－４、又はｐは１－２である）ＳＭＣＣは、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレートであり、ＤＭ１は上に定義した通りである。

（式中、Ａｂは抗体であり、ｐは１－約２０、好ましくはｐは１－１０、ｐは１－７、ｐは１－５、ｐは１－４、又はｐは１－２である）ＳＰＰは、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエートであり、ＤＭ１は上に定義した通りである。

【0247】

ＤＭ１がＢＭＰＥＯ（ビス－マレイミド－トリオキシエチレングリコール）リンカーを介して抗体のチオール基に結合している例示的な抗体－薬物コンジュゲートは、以下の構造を有する。

（式中、Ａｂは抗体であり；ｎは０、１又は２であり；ｐは１～約２０、好ましくはｐは１－１０、ｐは１－７、ｐは１－５、ｐは１－４、又はｐは１－４である）

【0248】

メイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲート、その作製方法及び治療用途は、例えば米国特許第５２０８０２０号、同第５４１６０６４号、米国特許出願公開第２００５／０２７６８１２号；及び欧州特許第０４２５２３５号に開示されており、これらの開示内容は、参照により本明細書に明示的に援用される。更にはＬｉｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８６１８－８６２３（１９９６）；及びＣｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７－１３１（１９９２）を参照のこと。

【0249】

抗体－メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子いずれの生物活性も大きく低下させることなく、抗体をメイタンシノイド分子に化学的に結合させることにより調製することができる。例えば、米国特許第５２０８０２０号参照（開示内容は参照により本明細書に明示的に援用される）。抗体分子１つに平均３－４個のメイタンシノイド分子がコンジュゲートしているＡＤＣは、抗体の機能又は溶解度に悪影響を与えることなく、標的細胞の細胞傷害性の増大に効果を示している。場合によっては、１分子の毒素／抗体でさえ、ネイキッド抗体の使用よりも細胞傷害性を増大させると予想される。

【0250】

抗体－メイタンシノイドコンジュゲートを作製するための例示的な結合基には、例えば、本明細書に記載されるもの、並びに米国特許第５２０８０２０号；欧州特許第０４２５２３５号；Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７－１３１（１９９２）；米国特許出願公開第２００５／０２７６８１２号及び同第２００５／０１６９９３号に開示されるものが含まれ、これら文献の開示内容は参照により本明細書に明示的に援用される。

【0251】

１．１．１．１ （２）カリケアマイシン
イムノコンジュゲートは、１以上のカリケアマイシン分子にコンジュゲートした抗体を含んでもよい。抗生物質のカリケアマイシンファミリー及びそのアナログは、ピコモル以下の濃度において二本鎖ＤＮＡ破壊を生じさせることができる（Hinman et al., (1993) Cancer Research 53:3336-3342; Lode et al., (1998) Cancer Research 58:2925-2928）。カリケアマイシンは細胞内作用部位を有するが、場合によっては原形質膜を容易に横切らない。したがって、抗体媒介性内部移行によるこれらの薬剤の細胞取り込みは、場合によっては薬剤の細胞傷害性効果を大きく増大させる。カリケアマイシンの薬物部分との抗体－薬物コンジュゲートを調製する非限定的で例示的な方法は、例えば米国特許第５７１２３７４号；同第５７１４５８６号；同第５７３９１１６号；及び同第５７６７２８５号に記載されている。

【0252】

（４）ピロロベンゾジアゼピン
ＡＤＣは、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）を含んでもよい。ＰＤＢダイマーは、特定のＤＮＡ配列を認識し、これに結合する。天然物のアントラマイシンであるＰＢＤが最初に報告されたのは、１９６５年である（Leimgruber, et al., (1965) J. Am. Chem. Soc., 87:5793-5795; Leimgruber, et al., (1965) J. Am. Chem. Soc., 87:5791-5793）。それ以来、複数のＰＢＤ（天然に存在するものとアナログの両方）が報告されている（Thurston, et al., (1994) Chem. Rev. 1994, 433-465；三環式ＰＢＤ足場のダイマー（米国特許第６８８４７９９号；同第７０４９３１１号；同第７０６７５１１号；同第７２６５１０５号；同第７５１１０３２号；同第７５２８１２６号；同第７５５７０９９号）を含む）いかなる特定の理論にも束縛されることを意図するものではないが、ダイマー構造は、Ｂ型ＤＮＡの副溝とのイソヘリシティー（isohelicity）に適した三次元形状を付与し、結合部位に嵌合をもたらすと考えられる（Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, New York, pp. 3-11 (1975); Hurley and Needham VanDevanter, (1986) Ace. Chem. Res., 19:230-237）。Ｃ２アリール置換基を有する二量体ＰＢＤ化合物は、細胞傷害性剤として有用であることが示されている（Hartley et al (2010) Cancer Res. 70(17):6849-6858; Antonow (2010) J. Med. Chem. 53(7):2927-2941; Howard et al (2009) Bioorganic and Med. Chem. Letters 19(22):6463-6466）。

【0253】

ＰＢＤ化合物は、ｉｎ ｖｉｖｏで除去可能な窒素保護基によってＮ１０位でそれらを保護することにより、プロドラッグとして使用することができる（国際公開第００／１２５０７号；同第２００５／０２３８１４号）。

【0254】

ＰＢＤダイマーは抗体にコンジュゲートされており、その結果得られたＡＤＣは抗がん特性を有することが示されている（米国特許出願公開第２０１０／０２０３００７号）。ＰＢＤダイマー上の非限定的で例示的な結合部位には、５員ピロロ環、ＰＢＤ単位間のテザー、及びＮ１０－Ｃ１１イミン基が含まれる（国際公開第２００９／０１６５１６号；米国特許出願公開第２００９／３０４７１０号；同第２０１０／０４７２５７号；同第２００９／０３６４３１号；同第２０１１／０２５６１５７号；国際公開第２０１１／１３０５９８号）。

【0255】

ＡＤＣの非限定的で例示的なＰＢＤダイマー成分は、式Ａ：

のもの、並びにその塩（例：薬学的に許容される塩）及び溶媒和物（例：薬学的に許容される溶媒和物）であり、上式中：
波線はリンカーへの共有結合部位を示し；
点線は、二重結合の任意選択の存在を示し（二重結合は、例えばＣ１とＣ２、又はＣ２とＣ３の間に存在し得る）；
Ｒ^２及びＲ^１２は、－Ｈ、－ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ_２、－ＣＮ、－Ｒ、－ＯＲ、＝ＣＨ－Ｒ^Ｄ、＝Ｃ（Ｒ^Ｄ）_２、－Ｏ－ＳＯ_２－Ｒ、－ＣＯ_２Ｒ、－ＣＯＲ、及び－ハロゲンから各々独立に選択され；
ここでＲ^Ｄは、－Ｈ、－ＣＯ_２Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｒ、ＣＨＯ、ＣＯ_２Ｈ、－Ｒ、－ＯＨ、－ＯＲ、－ＳＨ、－ＳＲ、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ、－ＮＲＲ´、－ＮＯ_２、Ｍｅ_３Ｓｎ－、及び－ハロゲンから独立に選択され；
Ｒ^６、Ｒ^９、Ｒ^１６及びＲ^１９は、－Ｈ、－Ｒ、－ＯＨ、－ＯＲ、－ＳＨ、－ＳＲ、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ、－ＮＲＲ’、－ＮＯ_２、Ｍｅ_３Ｓｎ－、及び－ハロゲンから独立に選択され；
Ｒ^７及びＲ^１７は、－Ｈ、－Ｒ、－ＯＨ、－ＯＲ、－ＳＨ、－ＳＲ、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ、－ＮＲＲ’、－ＮＯ_２、Ｍｅ_３Ｓｎ－、及び－ハロゲンから独立に選択され；
Ｑは、－Ｏ－、－Ｓ－、及び－Ｎ（Ｈ）－から独立に選択され；
Ｒ^１１は－Ｈか－Ｒのいずれかであるか、又はＱが－Ｏ－である場合、Ｒ^１１は－ＳＯ_３Ｍであってもよく、ここでＭはアルカリ金属又はアルカリ土類金属カチオンであり；
Ｒ及びＲ’は、置換されていてもよいＣ_１－１２アルキル、Ｃ_３－８ヘテロシクリル、Ｃ_３－２０複素環及びＣ_５－２０アリール基から各々独立に選択され、且つ、Ｒ及びＲ’は、同じ窒素原子に結合する場合は、それらが結合する窒素原子と共に、置換されてもよい４、５、６又は７員の複素環式環を形成することができ；
Ｒ″は、１個以上の炭素原子が、Ｏ、ＮＨ及びＳＯ、並びに／又は置換されていてもよい芳香族環から選択されるヘテロ原子によって置き換えられてもよいＣ_３－１２アルキレン基であり；
ここで芳香族環は、５又は６個の炭素原子と、Ｎ又はＮＨから選択される１つ又は２つのヘテロ原子とを含み；
Ｘ及びＸ’は、Ｏ、Ｓ及びＮ（Ｈ）から独立に選択される。

【0256】

好ましくは、Ｒ及びＲ’は各々独立に、置換されていてもよいＣ_１－１２アルキル、Ｃ_３－２０ヘテロシクリル及びＣ_５－２０アリール基から選択され、Ｒ及びＲ’は、同じ窒素原子に結合する場合は、それらが結合する窒素原子と共に、置換されていてもよい４，５，６又は７員の複素環式環を形成することができる。

【0257】

好ましくは、Ｒ^９及びＲ^１９は、－Ｈである。
好ましくは、Ｒ^６及びＲ^１６は、－Ｈである。
好ましくは、Ｒ^７及びＲ^１７は共に－ＯＲ^７Ａであり、Ｒ^７Ａは、置換されてもよいＣ_１－４アルキルである。
より好ましくは、Ｒ^７ＡはＭｅである。或いは、Ｒ^７ＡはＣＨ_２Ｐｈであり、Ｐｈはフェニル基である。
好ましくは、ＸはＯである。
好ましくは、Ｒ^１１はＨである。
好ましくは、各モノマー単位中のＣ２とＣ３の間に二重結合が存在する。

【0258】

好ましくは、Ｒ^２及びＲ^１２は、Ｈ及びＲから独立に選択される。より好ましくは、Ｒ^２及びＲ^１２は独立に、Ｒである。更に一層好ましくは、Ｒ^２及びＲ^１２は独立に、置換されていてもよいＣ_５－２０アリール又はＣ_５－１０アリール又はＣ_５－７アリールである。なお一層好ましくは、Ｒ^２及びＲ^１２は独立に、置換されてもよいフェニル、チエニル、ナフチル（ｎａｐｔｈｙｌ）、ピリジル、キノリニル，又はイソキノリニルである。或いは、Ｒ^２及びＲ^１２は、＝Ｏ、＝ＣＨ_２、＝ＣＨ－Ｒ^Ｄ及び＝Ｃ（Ｒ^Ｄ）_２から独立に選択される。好ましくは、Ｒ^２及びＲ^１２は、各々＝ＣＨ_２であるか、又はＲ^２及びＲ^１２は、各々Ｈである。或いは、Ｒ^２及びＲ^１２は、各々＝Ｏであるか、又はＲ^２及びＲ^１２は、各々＝ＣＦ_２である。Ｒ^２及び／又はＲ^１２はまた、独立に＝Ｃ（Ｒ^Ｄ）_２でもあり得る。好ましくは、Ｒ^２及び／又はＲ^１２は、独立に＝ＣＨ－Ｒ^Ｄである。

【0259】

Ｒ^２及び／又はＲ^１２が＝ＣＨ－Ｒ^Ｄである場合、各基は独立に、以下に示す立体配置のいずれかを有する。

【0260】

好ましくは、＝ＣＨ－Ｒ^Ｄは、立体配置（Ｉ）にある。

【0261】

Ｒ″は好ましくは、Ｃ_３アルキレン基又はＣ_５アルキレン基である。

【0262】

ＡＤＣの例示的なＰＢＤダイマー成分は、式Ａ（Ｉ）の構造を有する。

上式中、ｎは、０又は１である。

【0263】

ＡＤＣの別の例示的なＰＢＤダイマー成分は、式Ａ（ＩＩ）の構造を有する。

上式中、ｎは、０又は１である。

【0264】

ＡＤＣの別の例示的なＰＢＤダイマー成分は、式Ａ（ＩＩＩ）の構造を有する。

上式中、Ｒ^Ｅ及びＲ^Ｅ”は、Ｈ又はＲ^Ｄから各々独立に選択され、
ここでＲ^Ｄは上記のように定義され；且つ
上式中、ｎは０又は１である。

【0265】

好ましくは、ｎは、０又は１である。Ｒ^Ｅ及び／又はＲ^Ｅ”は、好ましくはＨである。更に好ましくは、Ｒ^Ｅ及びＲ^Ｅ”はＨである。或いは、Ｒ^Ｅ及び／又はＲ^Ｅ”はＲ^Ｄでもよく、ここでＲ^Ｄは、置換されてもよいＣ_１－１２アルキルである。好ましくは、Ｒ^Ｅ及び／又はＲ^Ｅ”はＲ^Ｄであり、ここでＲ^Ｄはメチルである。

【0266】

ＡＤＣの例示的なＰＢＤダイマー成分は、式Ａ（ＩＶ）の構造を有する。

上式中、Ａｒ^１及びＡｒ^２は各々独立に、置換されていてもよいＣ_５－２０アリールであり；
Ａｒ^１とＡｒ^２は、同じでも異なっていてもよく；
ｎは、０又は１である。

【0267】

ＡＤＣの別の例示的なＰＢＤダイマー成分は、式Ａ（Ｖ）の構造を有する。

上式中、Ａｒ^１及びＡｒ^２は各々独立に、置換されていてもよいＣ_５－２０アリールであり；
Ａｒ^１とＡｒ^２は、同じでも異なっていてもよく；
ｎは、０又は１である。

【0268】

好ましくは、Ａｒ^１及びＡｒ^２は、各々独立に、置換されてもよいフェニル、フラニル、チオフェニル及びピリジルから選択される。更に好ましくは、Ａｒ^１及びＡｒ^２は、各々独立に、置換されてもよいフェニルである。或いは、Ａｒ^１及びＡｒ^２は、各々独立に、置換されてもよいチエン－２－イル又はチエン－３－イルである。或いは、Ａｒ^１及びＡｒ^２は、各々独立に、置換されてもよいキノリニル又はイソキノリニルである。キノリニル又はイソキノリニル基は、任意の利用可能な環位置を介してＰＢＤのコアに結合していてよい。キノリニルは例えば、キノリン－２－イル、キノリン－３－イル、キノリン－４－イル、キノリン－５－イル、キノリン－６－イル、キノリン－７－イル及びキノリン－８－イルである。いくつかの実施態様では、キノリニルは、キノリン－３－イル及びキノリン－６－イルから選択される。イソキノリニルは、イソキノリン－１－イル、イソキノリン－３－イル、イソキノリン－４－イル、イソキノリン－５－イル、イソキノリン－６－イル、イソキノリン－７－イル及びイソキノリン－８－イルとすることができる。好ましくは、イソキノリニルは、イソキノリン－３－イル及びイソキノリン－６－イルから選択される。

【0269】

更なる非限定的で例示的な、ＡＤＣのＰＢＤダイマー成分は、式Ｂ：

のもの、並びにその塩及び溶媒和物であり、上式中：
波線はリンカーへの共有結合部位を示し；
ＯＨに接続する波線は、Ｓ又はＲ立体配置を示し；
Ｒ^ｖ１及びＲ^ｖ２は独立に、Ｈ、メチル、エチル及びフェニル（このフェニルは、特に４位において、フルオロで置換されてもよい）、及びＣ_５－６ヘテロシクリルから選択され、ここでＲ^ｖ１とＲ^ｖ２は同じでも異なってもよく；ｎは、０又は１である。
好ましくはＲ^ｖ１及びＲ^ｖ２は独立に、Ｈ、フェニル及び４－フルオロフェニルから選択される。

【0270】

リンカーは、Ｂ環のＮ１０のイミン、Ｃ環のＣ－２エンド／エクソ位、又はＡ環に結合するテザー単位を含む、ＰＢＤダイマー薬物部分の様々な部位の１つに結合することができる（以下の構造式Ｃ（Ｉ）及びＣ（ＩＩ）を参照）。

【0271】

非限定的で例示的な、ＡＤＣのＰＢＤダイマー成分は、式Ｃ（Ｉ）及びＣ（ＩＩ）のものを含む。

ここで、式Ｃ（Ｉ）及びＣ（ＩＩ）は、それらのＮ１０－Ｃ１１のイミン型で示されている。例示的なＰＢＤ薬物部分はまた、以下の表：

に示されるように、カルビノールアミン型及び保護されたカルビノールアミン型も含み、
上式中、
ＸがＣＨ_２の場合、ｎは１－５であり；
ＸがＮ又はＯの場合、ｎは１であり；
Ｚ及びＺ’は、ＯＲ及びＮＲ_２から独立に選択され、ここでＲは、１－５個の炭素原子を含有する一級、二級又は三級アルキル鎖であり；
Ｒ_１、Ｒ’_１、Ｒ_２及びＲ’_２は各々独立に、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_８アルキル、Ｃ_２－Ｃ_８アルケニル、Ｃ_２－Ｃ_８アルキニル、Ｃ_５－２０アリール（置換アリールも含む）、Ｃ_５－２０ヘテロアリール基、－ＮＨ_２、－ＮＨＭｅ、－ＯＨ及び－ＳＨから選択され、この場合、アルキル、アルケニル及びアルキニル鎖は最大５個の炭素原子を好ましくは含み；
Ｒ_３及びＲ’_３は、Ｈ、ＯＲ、ＮＨＲ及びＮＲ_２から独立に選択され、ここでＲは、１－５個の炭素原子を含有する一級、二級又は三級アルキル鎖であり；
Ｒ_４及びＲ’_４は、Ｈ、Ｍｅ，及びＯＭｅから独立に選択され；
Ｒ_５は、Ｃ_１－Ｃ_８アルキル、Ｃ_２－Ｃ_８アルケニル、Ｃ_２－Ｃ_８アルキニル、Ｃ_５－２０アリール（ハロ、ニトロ、シアノ、アルコキシ、アルキル及びヘテロシクリルで置換されたアリールも含む）及びＣ_５－２０ヘテロアリール基から選択され、いくつかの実施態様ではここで、アルキル、アルケニル及びアルキニル鎖が最大５個の炭素原子を含み；
Ｒ_１１は、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_８アルキル又は保護基（例えばアセチル、トリフルオロアセチル、ｔ－ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）、９－フルオレニルメチレンオキシカルボニル（fluorenylmethylenoxycarbonyl）（Ｆｍｏｃ）、又はバリン－シトルリン－ＰＡＢ）などの自壊単位（self-immolating unit）を含む部分であり；
Ｒ_１２は、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_８アルキル又は保護基であり；
ここでＲ_１、Ｒ’_１、Ｒ_２、Ｒ’_２、Ｒ_５若しくはＲ_１２のうちの１つにおける水素又はＡ環の間の－ＯＣＨ_２ＣＨ_２（Ｘ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ－スペーサーにおける水素は、ＡＤＣのリンカーに連結する結合に置換される。

【0272】

例示的な、ＡＤＣのＰＤＢダイマー部分には、限定されないが、以下が含まれる（波線は、リンカーへの共有結合部位を示す）。

【0273】

更なる非限定的で例示的な、ＰＢＤダイマーを含有するＡＤＣは、モノメチルジスルフィドＮ１０結合ＰＢＤ（monomethyl disulfide N10-linked PBD）（以下に示す）

を抗体にコンジュゲートさせ、以下のモノメチルジスルフィドＮ－１０結合ＰＢＤ抗体－薬物コンジュゲート：を製造することにより、作製され得る。

【0274】

ＰＢＤダイマー－マレイミド－アセタールのリンカーは、酸不安定性である。

【0275】

ＰＢＤダイマー及びＰＢＤダイマーを含むＡＤＣは、当該技術分野で既知の方法に従って調製され得る。例えば、国際公開第２００９／０１６５１６号；米国特許出願公開第２００９／３０４７１０号；同第２０１０／０４７２５７号；同第２００９／０３６４３１号；同第２０１１／０２５６１５７号；国際公開第２０１１／１３０５９８号を参照されたい。

【0276】

ｃ，アントラサイクリン
いくつかの実施態様では、ＡＤＣはアントラサイクリンを含む。アントラサイクリンは、細胞傷害活性を呈する抗生物質化合物である。いかなる特定の理論にも束縛されることを意図するものではないが、研究により、アントラサイクリンが複数の異なるメカニズムにより細胞を死滅させるように作用するかもしれないことが示されており、このようなメカニズムには以下が含まれる。
１）薬物分子の、細胞のＤＮＡへのインターカレーション、それによるＤＮＡ依存性核酸合成の阻害
２）細胞の巨大分子と反応して細胞に損傷を与えるフリーラジカル薬物による産生；及び／又は
３）薬物分子と細胞膜との相互作用（例：C. Peterson et al., 「Transport And Storage Of Anthracycline In Experimental Systems And Human Leukemia」 in Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy; N.R. Bachur, “Free Radical Damage” id. at pp.97-102参照）。

【0277】

アントラサイクリンは、その細胞傷害能力により、白血病、乳がん、肺がん、卵巣腺がん及び肉腫等、複数のがんの治療に使用されてきた （例えばP.H- Wiernik, in Anthracycline: Current Status And New Developments p 11参照）。

【0278】

非限定的で例示的なアントラサイクリンには、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ダウノマイシン、ネモルビシン及びこれらの誘導体が含まれる。ダウノルビシン及びドキソルビシンのイムノコンジュゲート及びプロドラッグが調製され、研究されている（Kratz et al (2006) Current Med. Chem. 13:477-523; Jeffrey et al (2006) Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362; Torgov et al (2005) Bioconj. Chem. 16:717-721; Nagy et al (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:829-834; Dubowchik et al (2002) Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532; King et al (2002) J. Med. Chem. 45:4336-4343; EP 0 328 147; US 6,630,579）。抗体－薬物コンジュゲートのＢＲ９６－ドキソルビシンは、腫瘍関連抗原ルイスＹと特異的に反応するものであり、第Ｉ及びＩＩ相試験において評価されている（Saleh et al (2000) J. Clin. Oncology 18:2282-2292; Ajani et al (2000) Cancer Jour. 6:78-81; Tolcher et al (1999) J. Clin. Oncology 17:478-484）。

【0279】

ＰＮＵ－１５９６８２は、ネモルビシンの強力な代謝産物（又は誘導体）である（Quintieri, et al. (2005) Clinical Cancer Research 11(4):1608-1617）。ネモルビシンは、ドキソルビシンのグリコシドアミノ上に２－メトキシモルホリノ基を有する、ドキソルビシンの半合成アナログであり、臨床評価段階にあるもので（Grandi et al (1990) Cancer Treat. Rev. 17:133; Ripamonti et al (1992) Brit. J. Cancer 65:703）あり、この臨床評価には、肝細胞がんの第ＩＩ／ＩＩＩ相試験が含まれている（Sun et al (2003) Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 22, Abs 1448; Quintieri (2003) Proceedings of the American Association of Cancer Research, 44: I^st Ed, Abs 4649; Pacciarini et al (2006) Jour. Clin. Oncology 24: 14116）。

【0280】

ネモルビシン又はネモルビシン誘導体を含む、非限定的で例示的なＡＤＣは、式Ｉｂ：

に示され、
上式中、Ｒ_１は、水素原子、ヒドロキシ又はメトキシ基であり；
Ｒ_２は、Ｃ_１－Ｃ_５アルコキシ基、
又は薬学的に許容されるその塩であり；
Ｒ_１及びＲ_２は共に、メトキシ（－ＯＭｅ）である。

【0281】

Ｌ_１及びＺは共に、本明細書に記載のリンカー（Ｌ）である。
Ｔは、本明細書に記載の抗体（Ａｂ）であり；
ｍは、１－約２０であり、好ましくはｍは、１－１０、１－７、１－５又は１－４である。

【0282】

ネモルビシン又はネモルビシン誘導体を含む更なる非限定的で例示的なＡＤＣは、式Ｉｂ：

に示され、
上式中、Ｒ_１は、水素原子、ヒドロキシ又はメトキシ基であり；
Ｒ_２は、Ｃ_１－Ｃ_５アルコキシ基、又は
薬学的に許容されるその塩であり；
Ｌ_２及びＺは共に、本明細書に記載のリンカー（Ｌ）であり；
Ｔは、本明細書に記載の抗体（Ａｂ）であり；
ｍは、１－約２０であり、好ましくはｍは、１－１０、１－７、１－５又は１－４である。
Ｒ_１及びＲ_２は共に、メトキシ（－ＯＭｅ）である。

【0283】

ネモルビシン含有ＡＤＣのネモルビシン成分は、ＰＮＵ－１５９６８２である。このような場合には、ＡＤＣの薬物部分は、以下の構造：

のうちの１つを有し、式中、波線はリンカー（Ｌ）への結合を示す。

【0284】

ＰＮＵ－１５９６８２を含めたアントラサイクリンは、複数の結合部位と本明細書に記載のリンカーを含めた様々なリンカー（米国特許出願公開第２０１１／００７６２８７号；国際公開第２００９／０９９７４１号；米国特許出願公開第２０１０／００３４８３７号；国際公開第２０１０／００９１２４号）を介して抗体にコンジュゲートすることができる。

【0285】

ネモルビシンを含む例示的なＡＤＣ及びリンカーには、限定されないが：

ＰＮＵ－１５９６８２－マレイミドアセタールＡｂ
及び

ＰＮＵ－１５９６８２－マレイミド－Ａｂ
が含まれる。

【0286】

ＰＮＵ－１５９６８２マレイミドアセタール－Ａｂのリンカーは、酸不安定性である。

【0287】

（６）その他の薬物部分
薬物部分はまた、ゲルダナマイシン（Mandler et al (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791）；及び酵素活性毒素及びその断片を含み、これには、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ－サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリ（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サポンソウ（sapaonaria oficinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトギリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセン（tricothecene）が含まれる。例えば、国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。

【0288】

薬物部分は、核酸分解活性を有する化合物（例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ）も含む。

【0289】

イムノコンジュゲートは、放射性原子を含み得る。放射性コンジュゲート抗体の製造のために、種々の放射性同位体が利用される。
例としては、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２、及びＬｕの放射性同位体がある。いくつかの実施態様において、イムノコンジュゲートは、検出用に使用される場合、シンチグラフ検査のための放射性原子、例えばＴｃ^９９若しくはＩ^１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法、ＭＲＩとしても知られている）のためのスピン標識、例えばジルコニウム８９、ヨウ素１２３、ヨウ素１３１、インジウム１１１、フッ素１９、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでもよい。ジルコニウム８９は、例えばＰＥＴ画像法のために、様々な金属キレート剤と複合化し、抗体にコンジュゲートすることができる（国際公開第２０１１／０５６９８３号）。

【0290】

放射能標識又は他の標識は、既知の方法でイムノコンジュゲートに取り込むことができる。例えばペプチドは、例えば１つ以上の水素の代わりに１つ以上のフッ素１９原子を含む適切なアミノ酸前駆体を用いて、生合成又は化学合成することができる。例えばＴｃ^９９、Ｉ^１２３、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８及びＩｎ^１１１等の標識を、抗体中のシステイン残基を介して結合させることができる。イットリウム９０を、抗体のリジン残基を介して結合させることができる。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80 49-57）を用いて、ヨウ素１２３を取り込むことができる。「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９）には、いくつかの他の方法が記載されている。

【0291】

イムノコンジュゲートは、プロドラッグ活性化酵素にコンジュゲートした抗体を含み得る。プロドラッグ活性化酵素は例えば、プロドラッグ（例：ペプチジル化学療法剤、国際公開第８１／０１１４５号参照）を、抗がん薬などの活性薬物に変換することができる。このようなイムノコンジュゲートは、いくつかの実施態様では、抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ療法（「ＡＤＥＰＴ」）において有用である。抗体にコンジュゲートすることが可能な酵素には、限定されないが、以下が含まれる：ホスフェート含有プロドラッグを遊離薬物に変換させるのに有用なアルカリホスファターゼ；スルフェート含有プロドラッグを遊離薬物に変換させるのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性の５－フルオロシトシンを抗がん薬の５－フルオロウラシルに変換させるのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換させるのに有用なプロテアーゼ、例えば、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、及びカテプシン（例えばカテプシンＢ及びＬ）；Ｄ－アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換させるのに有用なＤ－アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化されたプロドラッグを遊離薬物に変換させるのに有用な炭水化物切断酵素、例えばβ－ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼ；β－ラクタムで誘導体化されている薬物を遊離薬物に変換させるのに有用なβ－ラクタマーゼ；並びにアミン窒素においてフェノキシアセチル基又はフェニルアセチル基によって誘導体化されている薬剤を遊離薬物に変換させるのに有用なペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれ、ペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼ。いくつかの実施態様では、当該技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術によって、酵素を抗体に共有結合させることができる。例えばＮｅｕｂｅｒｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４－６０８（１９８４）を参照のこと。

【0292】

特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは、プロドラッグ活性化酵素にコンジュゲートした抗体を含み得る。いくつかのこのような実施態様では、プロドラッグ活性化酵素は、プロドラッグ（例えばペプチジル化学療法剤、国際公開第８１／０１１４５号参照））を抗がん薬などの活性薬物に変換する。このようなイムノコンジュゲートは、いくつかの実施態様では、抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ療法（「ＡＤＥＰＴ」）において有用である。抗体にコンジュゲートし得る酵素には、限定されないが、以下が含まれる：ホスフェート含有プロドラッグを遊離薬物に変換させるのに有用なアルカリホスファターゼ；スルフェート含有プロドラッグを遊離薬物に変換させるのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性の５－フルオロシトシンを抗がん薬の５－フルオロウラシルに変換させるのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換させるのに有用なプロテアーゼ、例えば、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、及びカテプシン（例えばカテプシンＢ及びＬ）；Ｄ－アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換させるのに有用なＤ－アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化されたプロドラッグを遊離薬物に変換させるのに有用な炭水化物切断酵素、例えばβ－ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼ；β－ラクタムによって誘導体化された薬物を遊離薬物に変換させるのに有用なβ－ラクタマーゼ；並びにアミン窒素においてフェノキシアセチル基又はフェニルアセチル基によって誘導体化された薬剤を遊離薬物に変換させるのに有用なペニシリンアミダーゼ、例えば、それぞれペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼ。いくつかの実施態様では、当該技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術によって、酵素を抗体に共有結合させることができる。例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４－６０８（１９８４）を参照のこと。

【0293】

薬物負荷は、式Ｉの分子における１抗体当たりの薬物部分の平均数であるｐにより表される。薬物負荷は、１抗体当たり１－２０の範囲の薬物部分（Ｄ）である。式ＩのＡＤＣは、１－２０の範囲の薬物部分とコンジュゲートした抗体の集合を含む。コンジュゲーション反応からのＡＤＣの調製における１抗体当たりの薬物部分の平均数は、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ及びＨＰＬＣ等の一般的な手段により特徴づけることができる。また、ｐを単位としてＡＤＣの定量的分布が決定され得る。場合によっては、均質ＡＤＣ（ｐが一定値である）の、他の薬物負荷を有するＡＤＣからの分離、精製及び特徴づけは、逆相ＨＰＬＣ又は電気泳動などの手段により達成され得る。

【0294】

いくつかの抗体－薬物コンジュゲートについては、ｐは抗体上の結合部位の数によって制限され得る。例えば、上記特定の例示的実施態様にあるように、結合がシステインチオールである場合、抗体は、１つのみ若しくは複数のシステインチオール基を有してもよく、又は１つのみ若しくは複数の十分に反応性のチオール基であって、それを介してリンカーが結合し得る反応性チオール基を有してもよい。特定の実施態様では、より高い薬物負荷、例えばｐ＞５は、特定の抗体－薬物コンジュゲートの凝集、不溶化、毒性、又は細胞透過性の喪失を引き起こすことがある。特定の実施態様では、ＡＤＣの平均薬物負荷は、１－約８、約２－約６、又は約３－約５の範囲である。実際、特定のＡＤＣについて、１抗体当たりの薬物部分の最適な比は８未満であってもよく、約２－約５であってもよいことが示されている（米国特許第７４９８２９８号）。

【0295】

特定の実施態様では、理論的最大値を下回る薬物部分が、コンジュゲーション反応中に抗体にコンジュゲートする。後述するように、抗体は例えば、薬物－リンカー中間体又はリンカー試薬と反応しないリジン残基を含有してもよい。通常、抗体は、薬物部分に結合し得る、反応性の遊離システインチオール基を多くは含まず、実際、抗体中の大部分のシステインチオール残基はジスルフィド架橋として存在する。特定の実施態様では、抗体は、部分的又は完全還元条件下で、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤により還元されて、反応性システインチオール基を生成し得る。特定の実施態様では、抗体は、リジン又はシステインといった反応性求核基を明らかにするために、変性条件にさらされる。

【0296】

ＡＤＣの負荷（薬物／抗体比）は、異なる方法、例えば（ｉ）抗体に対して過剰モルの薬物－リンカー中間体又はリンカー試薬を制限すること、（ｉｉ）コンジュゲーション反応時間又は温度を制限すること、及び（ｉｉｉ）システインチオール修飾のための部分的又は限定的還元条件によって制御することができる。

【0297】

複数の求核基が薬物－リンカー中間体又はリンカー試薬と反応する場合、結果として得られる生成物は、抗体に結合した１つ以上の薬物部分の分布を有するＡＤＣ化合物の混合物であることを理解されたい。１抗体当たりの薬物の平均数は、この混合物から、抗体に特異的であって、且つ、薬物に特異的である二重ＥＬＩＳＡ抗体アッセイによって計算することができる。個々のＡＤＣ分子は混合物において質量分析で同定し、ＨＰＬＣ、例えば疎水性相互作用クロマトグラフィーによって分離することができる（例えばMcDonagh et al (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7):299-307; Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Hamblett, K.J., et al. 「Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate」, Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004; Alley, S.C., et al. 「Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates」, Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004参照）。特定の実施態様では、単一の負荷値を有する均質ＡＤＣは、電気泳動又はクロマトグラフィーによってコンジュゲート混合物から単離され得る。

【0298】

式ＩのＡＤＣは、（１）共有結合を介し、抗体の求核基を二価性リンカー試薬と反応させてＡｂ－Ｌを形成し、続いて薬物部分Ｄと反応させる；（２）共有結合を介し、薬物部分の求核基を二価性リンカー試薬と反応させてＤ－Ｌを形成し、続いて抗体の求核基と反応させることを含む、当業者に既知の有機化学反応、条件、及び試薬を用いる複数の経路により調製することができる。

【0299】

抗体上の求核基は、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、及び（ｉｖ）抗体がグリコシル化される糖のヒドロキシル基又はアミノ基を含むがこれらに限定されない。アミン、チオール及びヒドロキシル基は求核性であり、（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート及び酸ハロゲン化物などの活性エステル、（ｉｉ）アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えばハロアセトアミド；並びに（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基を含む、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子基と反応して共有結合を形成することができる。特定の抗体は、還元可能な鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、完全に又は部分的に還元されるように、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）又はトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤を用いる処理によって、リンカー試薬とのコンジュゲーションに対して反応性にさせることができる。したがって、各システイン架橋は、理論的には２の反応性チオール求核試薬を形成する。リジン残基の改変、例えば、リジン残基と２－イミノチオラン（Ｔｒａｕｔの試薬）との反応によって、追加的な求核基を抗体内に導入することができ、その結果、アミンがチオールに変換される。また、反応性チオール基も、１、２、３、４又はそれ以上のシステイン残基を導入することによって（例えば１以上の非天然システインアミノ酸残基を含むバリアント抗体を調製することによって）、抗体内に導入することができる。

【0300】

本発明の抗体－薬物コンジュゲートは、アルデヒド又はケトンカルボニル基などの抗体上の求電子基と、リンカー試薬又は薬物上の求核基との間の反応によっても生成され得る。リンカー試薬上の有用な求核基には、限定されないが、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート及びアリールヒドラジドが含まれる。一実施態様では、抗体は、リンカー試薬又は薬物上の求核置換基と反応することができる求電子部分を導入するために改変される。別の実施態様では、グリコシル化された抗体の糖は、例えば過ヨウ素酸酸化剤で酸化させ、リンカー試薬又は薬物部分のアミン基と反応し得るアルデヒド又はケトン基を形成させることができる。得られたイミンシッフ塩基群は、安定な結合を形成するか、又は、例えば水素化ホウ素試薬により還元され、安定なアミン結合を形成することもある。一実施態様では、グリコシル化抗体の炭水化物部分とガラクトースオキシダーゼ又はメタ過ヨウ素酸ナトリウムとの反応により、薬物上の適切な基と反応することができる抗体中にカルボニル（アルデヒド及びケトン）基が生じる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）。別の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含有する抗体は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応して、第１のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成することができる（Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146；米国特許第５３６２８５２号）。このようなアルデヒドは、薬物部分又はリンカー求核試薬と反応させることができる。

【0301】

薬物部分上の例示的求核基は、（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート及び酸ハロゲン化物等の活性エステル；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基を含む、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子基と反応して共有結合を形成することができる、アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート及びアリールヒドラジド基を含むがこれらに限定されない。

【0302】

ＡＤＣを調製するために使用される非限定的且つ例示的な架橋試薬は、本明細書の「例示的リンカー」の項に記載されている。このような架橋試薬を使用して、タンパク質性部分と化学的部分とを含む２つの部分を結合させ方法は、当該技術分野で既知である。いくつかの実施態様では、抗体と細胞傷害性剤とを含む融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製することができる。組換えＤＮＡ分子は、抗体をコードする領域と、互いに隣接しているか又はコンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により分離されているコンジュゲートの細胞傷害性部分とを含み得る。

【0303】

また別の実施態様では、腫瘍の事前標的化に利用するための「受容体」（例えばストレプトアビジン）に抗体をコンジュゲートすることができ、この場合抗体－受容体コンジュゲートが患者に投与され、続いて清澄剤を使用して循環から未結合コンジュゲートを取り除き、その後細胞傷害性剤（例：薬物又は放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートしている「リガンド」（例：アビジン）の投与が行われる。

【0304】

特定の実施態様では、本明細書において提供される抗ＧＰ７３抗体のいずれもが、生物学的試料中のＧＰ７３の存在を検出するために有用である。本明細書で使用する「検出（する）」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。「生物学的試料」には、例えば、細胞又は組織（例えば、リンパ球、リンパ芽球、単球、骨髄性単球、及びこれらの混合物といった、がん性又はがん性の可能性があるリンパ組織を含む生検材料）が含まれる。

【0305】

一実施態様では、診断又は検出の方法における使用のための抗ＧＰ７３抗体が提供される。更なる態様では、生物学的試料中のＧＰ７３の存在を検出する方法が提供される。特定の実施態様では、該方法は、抗ＧＰ７３抗体のＧＰ７３への結合を許容する条件下で、生物学的試料を本明細書に記載の抗ＧＰ７３抗体と接触させることと、生物学的試料中に抗ＧＰ７３抗体とＧＰ７３との複合体が形成されているかどうかを検出することとを含む。そのような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法又はｉｎ ｖｉｖｏ法であり得る。一実施態様では、抗ＧＰ７３抗体は、抗ＧＰ７３抗体を用いる療法に適した対象を選択するために使用され、例えばＧＰ７３は患者の選択のためのバイオマーカーである。更なる実施態様では、生物学的試料は細胞又は組織である。

【0306】

更なる実施態様では、例えばがんの診断、予後判定若しくは進行度診断、適切な治療過程の決定、又は治療法に対するがんの応答のモニタリングのために、抗ＧＰ７３抗体をｉｎ ｖｉｖｏで（例えば生体イメージングにより）使用して、対象におけるＧＰ７３陽性がんを検出する。当該技術分野で既知のｉｎ ｖｉｖｏでの検出のための１つの方法は、免疫陽電子放出断層撮影（免疫ＰＥＴ）であり、これは例えば、ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎら，Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ １２：１３７９－１３８９（２００７）及びＶｅｒｅｌら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４：１２７１－１２８１（２００３）に記載されている。このような実施態様では、方法は、対象におけるＣＤ３３陽性がんの検出のために提供され、この方法は、標識抗ＧＰ７３抗体を、ＧＰ７３陽性がんを有する又は有すると疑われる対象に投与すること、及び対象において標識抗ＣＤ３３抗体を検出することを含み、標識抗ＧＰ７３抗体の検出は、対象におけるＧＰ７３陽性がんを示す。このような実施態様のいくつかにおいて、標識抗ＧＰ７３抗体は、^６８Ｇａ、^１８Ｆ、^６４Ｃｕ、^８６Ｙ、^７６Ｂｒ、^８９Ｚｒ及び^１２４Ｉ等の陽電子放射体にコンジュゲートした抗ＧＰ７３抗体を含む。

【0307】

更なる実施態様では、診断又は検出の方法は、基質に固定化されている第１の抗ＧＰ７３抗体を生物学的試料と接触させて、ＧＰ７３の存在について試験すること、この基質を第２の抗ＧＰ７３抗体に曝露すること、及び第２の抗ＧＰ７３が生物学的試料中の第１の抗ＧＰ７３抗体とＧＰ７３との複合体に結合したかどうかを検出することを含む。基質は、任意の支持媒体、例えばガラス、金属、セラミック、ポリマービーズ、スライド、チップ、及びその他の基質とすることができる。特定の実施態様では、生物学的試料は、細胞又は組織を含む。特定の実施態様では、第１の又は第２の抗ＧＰ７３抗体は、本明細書に記載される抗体のいずれかである。

【0308】

上記実施態様のいずれかによって診断又は検出得る例示的な障害には、限定されないが、ＧＰ７３陽性肝がん、ＧＰ７３陽性肝細胞がん、ＧＰ７３陽性胃がん、ＧＰ７３陽性食道がん、ＧＰ７３陽性膵臓がん、ＧＰ７３陽性肺がん、ＧＰ７３陽性結腸がん、ＧＰ７３陽性乳がん、ＧＰ７３陽性前立腺がん、ＧＰ７３陽性白血病及びＧＰ７３陽性リンパ腫等のＧＰ７３陽性がんが含まれる。いくつかの実施態様では、ＧＰＣ陽性がんは、肝がんである。いくつかの実施態様では、ＧＰＣ陽性がんは、肝細胞がんである。いくつかの実施態様では、ＧＰ７３陽性がんは、「０」より大きい抗ＧＰ７３免疫組織化学（ＩＨＣ）又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）スコアを与えられるがんであり、この「０」のスコアは、＞９０％の腫瘍細胞における非常に弱い染色又は無染色に該当する。別の実施態様では、ＧＰ７３陽性がんは、１＋、２＋又は３＋のレベルでＧＰ７３を発現する。いくつかの実施態様において、ＧＰ７３陽性がんは、ＧＰ７３ ｍＲＮＡを検出する逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）アッセイに従って、ＧＰ７３を発現するｉがんである。いくつかの実施態様では、ＲＴ－ＰＣＲは定量的ＲＴ－ＰＣＲである。

【0309】

特定の実施態様では、標識された抗ＧＰ７３抗体が提供される。標識は、限定されるものではないが、直接検出される標識又は部分（例えば蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識及び放射性標識等）及び、例えば酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される部分（例えば酵素又はリガンド）が含まれる。
例示的な標識は、限定されるものではないが、放射性同位体^３２Ｐ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ及び^１３１Ｉ；フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体；ダンシル；ウンベリフェロン；ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）；ルシフェリン；２，３－ジヒドロフタラジンジオン；ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）；アルカリホスファターゼ；β－ガラクトシダーゼ；グルコアミラーゼ；リゾチーム；糖質酸化酵素、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ；過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化する酵素（例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ又はミクロペルオキシダーゼ）に結合している複素環式オキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ；ビオチン／アビジン；スピン標識；バクテリオファージ標識；安定なフリーラジカル等を含む。別の実施態様では、標識は陽電子放射体である。陽電子放射体には、限定されないが、^６８Ｇａ、^１８Ｆ、^６４Ｃｕ、^８６Ｙ、^７６Ｂｒ、^８９Ｚｒ及び^１２４Ｉが含まれる。特定の一実施態様では、陽電子放射体は^８９Ｚｒである。

【0310】

本明細書に記載の抗ＧＰ７３抗体又はイムノコンジュゲートの薬学的製剤は、所望の純度を有する当該抗体又はイムノコンジュゲートを、１つ以上の任意選択の薬学的に許容される担体と混合することによって（Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態に調製される。通常、薬学的に許容される担体は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、限定されるものではないが、以下を含む：リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えばオクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及びその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ－タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤。本明細書における薬学的に許容される例示的担体は、介在性（insterstitial）薬物分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１以上の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。

【0311】

例示的な凍結乾燥抗体製剤又はイムノコンジュゲート製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体製剤又は水性イムノコンジュゲート製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものを含み、後者の製剤はヒスチジン－酢酸バッファーを含む。

【0312】

本明細書中の製剤はまた、治療される特定の適応症に必要な、複数の活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含有してもよい。

【0313】

活性成分は、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルション中で、例えばコアセルベーション法又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン－マイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルに封入することができる。これらの技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編．（１９８０）に開示されている。

【0314】

徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の適切な例は、抗体又はイムノコンジュゲートを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、このマトリックスは、成形品の形態、例えばフィルム又はマイクロカプセルである。ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために使用される製剤は、一般に無菌である。無菌状態は、例えば無菌濾過膜に通す濾過により、容易に達成することができる。

【0315】

本明細書で提供される抗原結合分子、抗ＧＰ７３抗体又はイムノコンジュゲートのいずれもが、方法、例えば治療方法において使用され得る。

【0316】

一態様では、本明細書に提供される抗ＧＰ７３抗体又はイムノコンジュゲートは、ＧＰ７３陽性細胞の増殖を阻害する方法において使用され、この方法は、細胞の表面のＧＰ７３への抗ＧＰ７３抗体又はイムノコンジュゲートの結合を許容する条件下で、細胞を抗ＧＰ７３抗体又はイムノコンジュゲートに曝露し、それにより細胞の増殖を阻害することを含む。特定の実施態様では、方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ法である。更なる実施態様では、細胞は、顆粒球又は骨髄芽球である。

【0317】

ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞増殖の阻害は、Ｐｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州マディソン）より市販されているＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ^ＴＭ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙを用いてアッセイすることができる。そのアッセイは、代謝的に活性な細胞の指標である存在するＡＴＰの定量化に基づいて、培養物中の生細胞の数を決定する。Ｃｒｏｕｃｈら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６０：８１－８８，米国特許第６６０２６７７号参照。このアッセイは９６ウェル又は３８４ウェルフォーマットで実施され、自動ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に適したものにされる。Ｃｒｅｅら（１９９５）ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ６：３９８－４０４参照。

【0318】

アッセイ手順は、単一の試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬）を培養細胞に直接添加することを伴う。これにより細胞溶解が起こり、ルシフェラーゼ反応により生じる発光シグナルが生成される。発光シグナルは存在するＡＴＰの量に比例し、これは培養物中に存在する生細胞の数に正比例する。データは、ルミノメーター又はＣＣＤカメラ撮像装置により記録することができる。発光出力は、相対発光量（ＲＬＵ）として表わされる。

【0319】

別の態様では、医薬としての使用のための抗ＧＰ７３抗体又はイムノコンジュゲートが提供される。更なる態様では、治療方法における使用のための抗ＧＰ７３抗体又はイムノコンジュゲートが提供される。特定の実施態様では、ＧＰ７３陽性がんの治療における使用のための抗ＧＰ７３抗体又はイムノコンジュゲートが提供される。特定の実施態様では、本発明は、ＧＰ７３陽性がんを有する個体の治療方法における使用のための抗ＧＰ７３抗体又はイムノコンジュゲートを提供し、この方法は、有効量の抗ＧＰ７３抗体又はイムノコンジュゲートを個体に投与することを含む。そのような一実施態様において、該方法は、少なくとも１種の追加の治療剤、例えば下記に記載のものの有効量を該個体に投与することを更に含む。

【0320】

更なる態様において、本発明は、医薬の製造又は調製における抗ＧＰ７３抗体又はイムノコンジュゲートの使用を提供する。一実施態様では、医薬は、ＧＰ７３陽性がんの治療のためのものである。更なる実施態様では、医薬は、ＧＰ７３陽性がんを治療する方法における使用のためのものであり、この方法は、ＧＰ７３陽性がんを有する個体に有効量の該医薬を投与することを含む。そのような一実施態様において、該方法は、少なくとも１種の追加の治療剤（例えば下記に記載のもの）の有効量を該個体に投与することを更に含む。

【0321】

更なる態様では、本発明は、ＧＰ７３陽性がんを治療するための方法を提供する。一実施態様では、方法は、このようなＧＰ７３陽性がんを有する個体に対し、有効量の抗ＧＰ７３抗体又はイムノコンジュゲートを投与することを含む。このような一実施態様では、該方法は、後述するような少なくとも１種の追加の治療剤の有効量を該個体に投与することを更に含む。

【0322】

上記実施態様によるＧＰ７３陽性がんは、例えばＧＰ７３陽性肝がん、ＧＰ７３陽性肝細胞がん、ＧＰ７３陽性膵臓がん、ＧＰ７３陽性肺がん、ＧＰ７３陽性結腸がん、ＧＰ７３陽性乳がん、ＧＰ７３陽性前立腺がん、ＧＰ７３陽性白血病又はＧＰ７３陽性リンパ腫である。いくつかの実施態様では、ＧＰ７３陽性がんは、「０」より大きい抗ＧＰ７３免疫組織化学（ＩＨＣ）又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）スコアを与えられるがんであり、この「０」のスコアは、＞９０％の腫瘍細胞における非常に弱い染色又は無染色に該当する。別の実施態様では、ＧＰ７３陽性がんは、１＋、２＋又は３＋のレベルでＧＰ７３を発現する。

【0323】

上記実施態様に記載の「個体」は、ヒトであってよい。

【0324】

更なる態様では、本発明は、例えば、上記治療方法おける使用のための、本明細書で提供される抗ＧＰ７３抗体又はイムノコンジュゲートを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様では、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗ＧＰ７３抗体又はイムノコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む。別の実施態様では、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗ＧＰ７３抗体又はイムノコンジュゲートと、例えば後述のような少なくとも１種の追加の治療剤とを含む。

【0325】

本発明の抗体又はイムノコンジュゲートは、治療において、単独で、又は他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体又はイムノコンジュゲートは少なくとも１種の追加的な治療剤と同時投与され得る。

【0326】

上記のかかる併用療法は、併用投与（２種以上の治療剤が同一又は別々の製剤に含まれている）と、本発明の抗体又はイムノコンジュゲートの投与が追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与前、投与と同時及び／又は投与後に起き得る分離投与とを包含する。本発明の抗体又はイムノコンジュゲートは、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。

【0327】

本発明の抗体又はイムノコンジュゲート（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内及び鼻腔内、また、局所治療のために望ましい場合は、病巣内、子宮内又は膀胱内投与を含む任意の適切な手段により投与され得る。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存し、任意の適切な経路、例えば静脈内又は皮下注射などの注射によるものであってよい。限定されないが、様々な時点にわたる、単回又は複数回投与、ボーラス投与及びパルス注入を含めた様々な投薬計画が本明細書において考慮される。

【0328】

本発明の抗体又はイムノコンジュゲートは、医療実施基準（good medical practice）に合致するように製剤化、調薬及び投与される。これに関連して考慮すべき因子は、治療中の特定の障害、治療中の特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与計画、及び医療従事者に既知の他の因子を含む。本発明の抗体又はイムノコンジュゲートは、必ずしも必須ではないが任意選択的に、当該障害を予防ｊ又は治療するのに目下使用されている１種以上の薬剤と共に製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体又はイムノコンジュゲートの量、障害又は治療の種類、及び上で論じた因子以外の因子によって決まる。これらは一般的には、本明細書に記載されているのと同じ投薬量及び投与経路で、又は本明細書に記載されている用量の約１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投薬量及び任意の経路で使用される。

【0329】

疾患の予防又は治療のための、本発明の抗体又はイムノコンジュゲートの適切な用量は（単独で、又は１種以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用されるとき）、治療される疾患の種類、抗体又はイムノコンジュゲートの種類、疾患の重症度及び経過、抗体又はイムノコンジュゲートが予防目的で又は治療目的で投与されるのか、治療歴、患者の病歴及び抗体又はイムノコンジュゲートに対する応答、並びに主治医の判断に依拠するであろう。抗体又はイムノコンジュゲートは、単回で、又は一連の治療にわたって適切に患者に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば１回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ－１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ－１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体又はイムノコンジュゲートが患者への投与のための初期候補用量となり得る。一つの典型的な１日用量は、上記因子に応じて約１μｇ／ｋｇ－１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲だろう。数日以上にわたる反復投与に関しては、治療は状態に応じて通常、症状の望まれる抑制が起こるまで持続されるであろう。抗体又はイムノコンジュゲートの１つの例示的な用量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ－約１０ｍｇ／ｋｇであろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの１つ以上の用量（又はこれらの任意の組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は、断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が抗体の約２から約２０、例えば約６用量を受けるように）投与してよい。初期の高負荷用量の後、１以上の低用量を投与してよい。しかしながら、他の用量レジメンも有用であり得る。本療法の進捗は、一般的な手法及びアッセイにより容易にモニターされる。

【0330】

上記製剤又は治療方法のいずれもが、本発明のイムノコンジュゲートと抗ＧＰ７３抗体の両方を使用して実施できると理解される。

【0331】

本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と、容器に貼られているか又は容器に付随するラベル又は添付文書とを含む。好適な容器は、例えばビン、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグ等を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、障害の治療、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又は別の組成物と併用される組成物を保持し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１種の活性剤は、本発明の抗体又はイムノコンジュゲートである。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された状態の治療のために使用されることを示している。
更に製造品は、（ａ）本発明の抗体又はイムノコンジュゲートを含む組成物を中に収容する第１の容器；及び（ｂ）更なる細胞傷害性剤又はその他の治療剤含む組成物を中に収容する第２の容器を備えていてもよい。本発明のこの実施態様における製造品は、特定の状態を治療するために組成物が使用され得ることを示す添付文書を更に備えていてもよい。代わりに又は更に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液又はデキストロース溶液を含む第２（又は第３）の容器を更に備えていてもよい。それは、他のバッファー、希釈液、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及び使用者の観点から望まれる他の物質を更に含んでもよい。

【実施例】

【0332】

以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。

【0333】

実施例１：モノクローナル抗体の生成
ＧＰ７３細胞外ドメイン抗体検出及び特徴づけ
以下の手順を用いて、２つのヒトｓｃＦＶライブラリー（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ）を、短い残りのヒトＧＰ７３細胞外ドメインを包含するペプチド（ｒＧＰ７３、配列番号１ ＡＡ ３６－５５）でスクリーニングすることによって、ヒトＧＰ７３に対するモノクローナル抗体を生成した。４回のパンニングを実施し、４１種のバインダーをＥＬＩＳＡで試験し、６種を検証し、配列決定した。２種の完全ｓｃＦｖクローンを同定し、（ｉ）Ｇ２－２及びＧ２－１のヒトＩｇＧ１重鎖及びヒトＩｇｋ軽鎖定常領域と共に、並びに（ｉｉ）ｍＧ２－２のマウスＩｇＧ２ａ重鎖及びヒトＩｇｋ軽鎖定常領域と共にクローニングした。抗体Ｇ２－２の重鎖及び軽鎖可変領域配列は、それぞれ配列番号２及び３に示される。抗体Ｇ２－１の重鎖及び軽鎖可変領域配列は、それぞれ配列番号１０及び１１に示される。ヒト重鎖定常領域（ＩｇＧ１）は、配列番号２６に示され、ヒトカッパ軽鎖配列は、配列番号２７に示される。マウス重鎖定常領域（ＩｇＧ２ａ）は、配列番号２８に示される。

【0334】

Ｂ．ＧＰ７３可溶性断片抗体検出及び特徴づけ
以下の手順を用いて、ヒトＧＰ７３のＡＡ ３４７－３６６を含むペプチド（配列番号１）で２頭のＢａｌｂ／ｃマウスを免疫することによって、ヒトＧＰ７３に対するモノクローナル抗体を生成した。融合後、６つのハイブリドーマが、ペプチド３４７－３６６に結合する抗体を発現した。３つの抗体を配列決定し、抗体製造のために培養し続けた。

【0335】

陽性のクローンを増やし、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳにより、ヒトＧＰ７３、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、ＨｅｐＧ２細胞及びＨｕＨ ７細胞への結合について再度スクリーニングした。１つの抗体、Ｇ２－４を選択し、精製した。抗体Ｇ２－４の重鎖及び軽鎖可変領域配列は、それぞれ配列番号１８及び１９に示される。

【0336】

更に大規模な抗体製造のために、ＣＨＯ及び２９３ＨＥＫ細胞中で抗体を生成した。ＶＬ及びＶＨをコードするベクターを、ＣＨＯ細胞中にトランスフェクトし、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによりＩｇＧを細胞培養培地から精製した。

【0337】

実施例２：免疫蛍光分析
Ａｌｅｘａｎｄｅｒ細胞を４つのチャンバースライド上で増殖させ、４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．２％サポニンで処理し、１０％ウシ血清アルブミンでブロックした。細胞をヤギ抗ＧＰ７３（サンタクルスｓｃ－４８０１０）及びｍＧ２－２と共に１時間インキュベートし、洗浄した。結合抗体を抗ヤギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ａｂｃａｍ ａｂ１５０１２９）及び抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（ａｂｃａｍ ａｂ１５０１１５）で染色した。核をＤＡＰＩで処理した。

【0338】

実施例３：各種腫瘍の免疫組織化学分析
正常肝、肝炎肝、肝細胞がん（ＨＣＣ）、子宮内膜がん、卵巣がん、黒色腫、小細胞肺がん及び胃がんのパラフィン包埋組織をマウスＧ２－２（ｍＧ２－２）又はマウス抗ＧＯＬＰＨ（ＭＯ６Ａ Ｓｉｇｍａ）で染色し、続いて抗マウスＩｇＧで二次染色した。核をヘマトキシリン（青）で染色し、細胞質をヘマラム－エオシンで染色した。

【0339】

実施例４：抗ＧＯＬＰＨ抗体Ｇ２－２、Ｇ２－１及びコントロールを用いた各種細胞株のフローサイトメトリー
異なるヒト及びマウス細胞株、例えばＨｕＨ７、ＪＨＨ４、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３－ＧＰ７３－ｍｙｃ及びＲａｍｏｓを、それらの細胞表面でのＧＰ７３の発現並びに、Ｇ２－２、Ｇ２－１及びＧ２－４の結合についてフローサイトメトリー分析により試験した。細胞を培養し、ペレットにし、ＰＦＡ４％で固定し、ｍＧ２－２、ｍＧ２－１、Ｇ２－４、抗ｍｙｃ又は抗ＣＤ１９ＩｇＧ（ＢＤ ＨＩＢ１９）と共にインキュベートし、洗浄し、二次蛍光抗マウス抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）で染色した。

【0340】

実施例５： 競合及びｐＨ依存性ペプチドＥＬＩＳＡ
一晩ビオチン化ペプチドでコーティングした９６ウェルプレート中でＥＬＩＳＡを実施し、２％ゼラチンでブロックした。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ標識化抗体Ｇ２－１（Ｇ２－１－ＨＲＰ）又はＧ２－２（Ｇ２－２－ＨＲＰ）を塗布し、１，５時間インキュベートした。競合試験のために、非標識Ｇ２－１又はＧ２－２を高濃度で添加した。ｐＨ依存的結合のために、リン酸バッファーｐＨ４．４、５．４、６．４又は７．４中で抗体を用いた。十分に洗浄した後、発色基質（ＴＭＢ Ａｍｅｒｓｈａｍ）を加えてペルオキシダーゼを検出した。反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。

【0341】

実施例６：Ｇ２－２の内部移行
細胞株ＤＵ１４５（前立腺がん）及びＨｅｐ５５．１Ｃ（肝細胞がん）を、抗体Ｇ２－２及びＧ２－１を内部移行する能力について試験した。細胞を、１０μｇ／ｍｌのＧ２－２又はＧ２－１と共にＰＢＳ中４℃で１時間インキュベートした。未結合Ｇ２－２を洗い流し、細胞を、１０％ＦＣＳを含む組織培養培地に移し、その後３７℃に温めて内部移行させるか、４℃で維持した。１５、３０、６０又は１２０分後に、細胞を０．１％アジ化ナトリウム（sodium acide）を含む氷冷バッファーに移すことにより、内部移行プロセスを停止させた。細胞を、ＡＰＣコンジュゲートヤギ抗ヒトＦａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ）で染色し、ＦＡＣＳで分析した。細胞表面Ｇ２－２の残存レベルを平均蛍光強度（ＭＦＩ）に基づいて計算した。１５分後、Ｇ２－２及びＧ２－１の細胞表面検出は、ＨｕＨ７では３０％に、ＤＵ１４５では１０％未満に減少した。

【0342】

Ｃ末端ＧＰ７３結合抗体、例えばＧ２－４が結合を阻害される条件下でＧ２－２及びＧ２－１がＧＰ７３に結合し、内部移行されることを実証するために、抗体をＧｒｅｅｎ ＳＴＰ Ｅｓｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で標識した。この色素は、中性ｐＨでは非蛍光性であるが、例えばエンドソーム中のように、ｐＨがより酸性になるにつれて蛍光が増す。標識化抗体をサイズ排除（４０Ｋ ＭＷＣＯ）により精製した。バックグラウンド蛍光のコントロールとして、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＳＴＰ Ｅｓｔｅｒ（Ｉｓｏ．）で標識されていない非結合アイソタイプ抗体を使用した。１０μｇ／ｍｌの各抗体を新鮮な培地又は条件培地のいずれかで、４℃で一晩プレインキュベートした。条件培地として、７２時間培養したＨＥＫ ２９３又はＨＥＫ ２９３ ＧＰ７３－ｍｙｃ細胞のいずれかからの上清を供給し、それをそれぞれ１Ｌの新鮮培地に対して透析した（１０ｋ ＭＷＣＯ）。透析後の分泌された可溶性ＧＰ７３の存在を確認するために、抗ｍｙｃ抗体を用いてウェスタンブロットにより上清を分析した。３００μｌ／ウェルの各プレインキュベートした抗体を、２４ウェルプレート中で３７℃、５％ＣＯ２で２４時間増殖している０．６ｘ１０６ＨｕＨ７細胞に与えた。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳで分析した。

【0343】

実施例７：Ｇ２－２又はＧ２－１結合に依存する、ＧＰ７３のフーリン切断分析
フーリン切断の試験は、抗体Ｇ２－１及びＧ２－２がフーリン切断部位５６Ｒで、又はそのＮ末端でＧＰ７３に結合するのに対して、Ｃ末端ＨＩＳタグを有する組換えＧＰ７３（ＧＰ７３－ＨＩＳ）はＧＰ７３のＣ末端で抗ＨＩＳ抗体によって検出されるという事実を利用する。プレート結合抗ヒトＩｇＧは、ＧＰ７３－ＨＩＳに結合するＧ２－１又はＧ２－２を捕捉することができる。Ｇ２－１又はＧ２－２が既にＧＰ７３－ＨＩＳに結合している設定でフーリン切断が起こると、ＧＰ７３のＮ末端部分のみがＧ２抗体に存在することになる。対照的に、フーリン切断がＧ２抗体によって妨げられている場合、ＧＰ７３－ＨＩＳは、抗ＨＩＳ抗体によって検出することができる。

【0344】

フーリン切断を、１．５ｍｌチューブ中で行った。Ｇ２抗体がフーリン切断を妨げることができるどうかを試験するために、組換えＧＯＬＰＨ－ＨＩＳタンパク質（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＧ２－２又はＧ２－１を１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び１ｍＭ ＣａＣｌ２バッファー（ｐＨ７．５）中で２時間インキュベートし、抗体をＧＰ７３に結合させた。３０℃、２時間の切断のために、各反応物に３Ｕ、１．５Ｕ、０．７５Ｕ、０．３７５Ｕ又は０Ｕのフーリン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を補充した。本アッセイ設定における最大フーリン切断を試験するために、組換えＧＯＬＰＨ－ＨＩＳタンパク質（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及び３Ｕ、１．５Ｕ、０．７５Ｕ、０．３７５Ｕ又は０Ｕのいずれかのフーリンを１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び１ｍＭ ＣａＣｌ２バッファー（ｐＨ７．５）中で２時間インキュベートし、フーリン切断を可能にした。３０℃で結合させるために、各反応物にＧ２－２又はＧ２－１のいずれかを２時間補充した。
各反応物から２ｘ１００μｌを、抗ヒトＩｇＧで一晩コートした９６ウェルプレートのウェルに移し、１％セラチンでブロックした。室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、抗ＨＩＳ－ｈｒｐ抗体と共に１時間インキュベートし、再度洗浄し、発色基質（ＴＭＢ Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共にインキュベートしてペルオキシダーゼを検出し、停止して４５０ｎｍで読み取った。結果は、Ｇ２－１及びＧ２－２の結合に起因するフーリン切断の減少を実証している。

【0345】

実施例８：抗ＧＰ７３抗体と、種々の細胞株の細胞生存性に対するその効果
細胞株ＨｕＨ７（ヒト肝細胞がん）、４Ｔ１マウス乳がん）及びＣａＣｏ２（ヒト結腸直腸がん）由来の細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、標準条件下、３７℃５％ＣＯ_２で培養した。Ｇ２－２、Ｇ２－２＋セツキシマブ；ｍＧ２－２、ｍＧ２－２＋セツキシマブ；セツキシマブ又はコントロール抗体で、それぞれ０．１２５ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌまで濃度を漸増させながらＨｕＨ７細胞を９６ウェルプレートに移した。各試験は、三重で実施した。７２時間後、各ウェルにＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）を補充し、３７℃で２０分間インキュベートした。蛍光を６１５ｎｍで読み取り、細胞生存性定量化した。ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ試薬は、代謝的に活性な細胞によって減少する。細胞生存性は抗体濃度に応じて減少した。この効果はＦｃ部分、すなわちＧ２－２におけるヒトＩｇＧ１又はｍＧ２－２におけるマウスＩｇＧ２ａとは無関係であった。

【0346】

異なる細胞株に対するＧ２－１の効果を試験するために、ＨｕＨ７、４Ｔ１及びＣａＣｏ２細胞を９６ウェルプレートに移した。各ウェルを、Ｇ２－１ ２ｍｇ／ｍｌ、Ｇ２－１ １ｍｇ／ｍｌ＋セツキシマブ １ｍｇ／ｍｌ、セツキシマブ ２ｍｇ／ｍｌ、ベバシズマブ ２ｍｇ／ｍｌ又はベバシズマブ １ｍｇ／ｍｌ＋セツキシマブ １ｍｇ／ｍｌのいずれかで処理した。各試験は、３重で実施した。７２時間後、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ試薬を使用し、６１５ｎｍで蛍光を測定して、細胞生存性を定量化した。また、Ｇ２－１とセツキシマブの相加効果がＨｕＨ７細胞に見られた。

【0347】

実施例９：抗ＧＰ７３抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
抗ＧＰ７３抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、部分的に還元されたＧ２－２（ヒトＩｇＧ１／カッパ）及びｍＧ２－２（マウスＩｇＧ２／カッパ）を薬物－リンカー部分マレイミドアセタールＰＮＵ－１５９６８２又はメイタンシノイド（ＭＭＡＦ）にコンジュゲートすることによって製造した。前述のように、例えばＪｕｎｕｔｕｌａら（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：９２５－９３２及び米国特許出願公開第２０１１／０３０１３３４号では、抗体を薬物－リンカー部分と組み合わせることにより、抗体の遊離システイン残基への薬物－リンカー部分のコンジュゲーションが可能になっている。数時間後、ＡＤＣを精製した。各ＡＤＣの薬物負荷（１抗体当たりの薬物部分の平均数）を決定したところ、ＰＮＵコンジュゲートは２であり、ＭＭＡＦコンジュゲートも２であった。

【0348】

実施例１０：ＨｕＨ７細胞におけるＧ２－２－ＡＤＣの有効性
Ｇ２－２にマラメイド（malameide）交換リンカーによって結合されたＭＭＡＦから成る抗体薬物コンジュゲートを、様々な濃度でＨＵＨ７細胞の細胞培地に添加した。１時間後に培地を交換した。９８時間後、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）を使用して細胞生存率を分析した。黒い曲線は、抗体成分によって決定した、６．３４ｎＭのＩＣ５０を有するＧ２－２－Ｍａｌ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦを示す。赤い曲線は、抗体成分によって決まる、０．１２４ｎＭのＩＣ５０を有するＧ２－２－Ｍａｌ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦを示す。青い曲線は、薬物成分によって決定まる、ＩＣ５０ ２７７ｎＭのＭＭＡＦの毒性を示す。ＭＭＡＦの毒性は、図１０に示されるように、Ｇ２－２抗体への結合のためにファクター２２３４によって増強された。

【0349】

実施例１１：細胞株異種移植モデルにおけるＧ２－２－ＡＤＣの有効性
ヒトＨｕＨ７異種移植モデルを用いて、抗ＧＰ７３ ＡＤＣの有効性を調べた。メスＢａｌｂ／ｃヌードマウス（中国、北京のＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の各々の側腹部に１０百万個のＨｕＨ７細胞を皮下接種した。異種移植片腫瘍が平均腫瘍体積１８３ｍｍ^３に達したとき（０日目）、動物をそれぞれ１２頭のマウス群にランダム化し、０日目に２ｍｇ／ｋｇ ＡＤＣ及び７日目に１ｍｇ／ｋｇ ＡＤＣの静脈内注射又はコントロール物質を与えた。試験期間を通して一日おきに、マウスの腫瘍及び体重を測定した。体重の減少が開始時体重の２０％を超えたとき、マウスを速やかに安楽死させた。腫瘍が２０００ｍｍ^３に達したとき、全ての動物を安楽死させた。異種移植マウスから単離されたＨｕＨ７細胞及びＨｕＨ７腫瘍の表面でのＧＰ７３の発現は、ＦＡＣＳ及びＩＨＣによって確認された。

【0350】

図１５に示すように、かなりの腫瘍増殖がＧ２－２－ＰＮＵで得られた。累積生存性の差異は、図１２に示すように、ビヒクル群とＡＤＣ群との間で統計的に有意であった。データは、ＳＰＳＳを用いて分析された。

【0351】

前述の発明は明確な理解のために例示及び実施例によってある程度詳細に説明されているが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示内容は、その全体が出典明示により本明細書に援用される。

【0352】

実施例１２：最適化された抗ＧＰ７３抗体
抗体Ｇ２－２及びＧ２－１は、一般に利用可能なデータベース（例：ＩＭＧＴ／ｍＡｂ－ＤＢ）に見出される抗体とのコンピューター比較に由来する定方向突然変異誘発によって、哺乳動物細胞における発現について最適化された。それぞれの調整は、マウス重鎖の可変領域及び定常領域のフレームワークに影響を与えた。それによって、ＣＤＲは元のままであった。これらの最適化された配列は、Ｇ２－２ｏｐｔｉ（ＩｇＧ１）及びＧ２－１ｏｐｔｉ（ＩｇＧ１）と命名された。いくつかの実験のために、Ｇ２－２ｏｐｔｉ（ＩｇＧ１）を、マウスＣＨ２及びＣＨ２を有するキメラヒト／マウス型であるＧ２－２ｏｐｔｉ（ＩｇＧ２ａ）に変換した。機能アッセイにおいて、これらのコンストラクトは、それぞれＧ２－２又はＧ２－１と同じ科祖霊協の性能を示した。

【0353】

実施例１３：中華人民共和国特許第１０５７３４０５９号の抗体８Ａ１０、並びにＧＰ７３タンパク質及びペプチドに対するＧ２－２の差次的結合
中華人民共和国特許第１０５７３４０５９号の抗体８Ａ１０を、ＧＰ７３に対するＧ２－２と比較してＧＰ７３に対する８Ａ１０の差次的結合を試験するために作製した。具体的には、８Ａ１０が本発明の抗体と同じエピトープを認識するかどうかを試験するために実験を行った。

【0354】

中華人民共和国特許第１０５７３４０５９号の抗体８Ａ１０の公開されたヌクレオチド配列は、カッパ軽鎖の定常領域に点突然変異（Ｙ１９３Ｃ）を含んでいた。十分な発現のために、この配列をＹ１９３への逆突然変異によって、標準的マウスカッパ配列に合わせた。８Ａ１０の、その他の点では変更されていないヌクレオチド配列は、米国ニュージャージー州のＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成された。マウスＩｇＧ２ａの適切な配列を補った重鎖及びＮ末端において、分泌シグナルを添加した。ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションのために、各鎖を哺乳動物発現ベクターにクローニングした。抗体を固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により細胞上清から抽出し、ウェスタンブロット法及びＥＬＩＳＡにより完全性について試験した。

【0355】

Ｃ末端に１０ｘＨＩＳタグをタグ付けされた完全長ＧＰ７３ ＡＡ １－４０１を含むｃＤＮＡ、又はＲ５２Ａ突然変異を有するＡＡ ３６‐４０１を含むＧＰ７３ΔＮバリアントのいずれかを２９３ＨＥＫ細胞にトランスフェクトし、１０ｘＨＩＳタグをＣ末端にタグ付けされた切断不能なバリアントＧＰ７３－Ｈｉｓ ＡＶＲＲ）を得た。双方のコンストラクトにおいて、分泌シグナルがインフレームでＮ末端に付加された。完全長ＧＰ７３発現細胞の上清は、ＧＰ７３ ＡＡ ５６－４０１（ｓＧＰ７３；配列番号４０）を包含するｓＧＰ７３－１０ｘＨｉｓを含み、これは、フーリン又は別のプロテアーゼによりＡＡ ５５でタンパク質分解的に切断されている。ＧＰ７３ΔＮバリアントの上清は、図２０に示すように、ＧＰ７３ ＡＡ ３６－４０１（ＧＰ７３ ＡＶＲＲ；配列番号４１）を包含するＧＰ７３－１０ｘＨｉｓ ＡＶＲＲを含む。２つのコンストラクトのうち後者のみが、ｒＧＰ７３エピトープを含む。両タンパク質は、ＩＭＡＣによって単離された。

【0356】

ｓＧＰ７３又はＧＰ７３ ＡＶＲＲで一晩コーティングした９６ウェルプレート内でＥＬＩＳＡを実施し、２％ゼラチンでブロックした。抗体８Ａ１０、Ｇ２－２ｏｐｔｉ（ＩｇＧ２ａ）又はアイソタイプコントロール抗体を塗布し、１，５時間インキュベートし、洗い流した。二次ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体を１時間添加し、徹底的に洗浄した後、発色基質（ＴＭＢ Ａｍｅｒｓｈａｍ）を塗布してペルオキシダーゼを検出した。反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取って図２１に示した。結果は、８Ａ１０がｓＧＰ７３にのみ結合し、ＧＰ７３ ＡＶＲＲには結合しないのに対して、Ｇ２－２ｏｐｔｉ（ＩｇＧ２ａ）はＧＰ７３ ＡＶＲＲに結合するがｓＧＰ７３には結合しないことを実証し、認識されたエピトープが重複しないことを示唆する。

【0357】

ビオチン化ペプチドｇｐ７３ ＡＡ ３６－５５又は無関係なペプチドで一晩コーティングした９６ウェルプレート内でＥＬＩＳＡを実施し、２％ゼラチンでブロックした。抗体８Ａ１０、Ｇ２－２ｏｐｔｉ（ＩｇＧ２ａ）又はアイソタイプコントロール抗体（ＩｇＧ２ａ）を塗布し、１，５時間インキュベートし、その後洗い流した。二次ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体を１時間添加し、徹底的に洗浄した後、発色基質（ＴＭＢ Ａｍｅｒｓｈａｍ）を塗布してペルオキシダーゼを検出した。反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取って図２２に示した。結果は、８Ａ１０がｒＧＰ７３に結合しないことを実証し、８Ａ１０とＧ２－２ｏｐｔｉ（ＩｇＧ２ａ）の認識されたエピトープが重複しないことを裏付けている。

【0358】

実施例１４：ＨＥＫ２９３－ＧＰ７３－Ｈｉｓ細胞におけるフーリン切断実験
ＨＥＫ２９３ ＧＰ７３－Ｈｉｓ完全長細胞を、９６ウェルプレートに１ウェル当たり１５００細胞を播種し、一晩培養した。翌日、培地を交換し、細胞をベバシズマブ３１．３μｇ／ｍｌ、ベバシズマブ６２，５μｇ／ｍｌ、Ｇ２－２ｏｐｔｉ（ＩｇＧ１）３１．３μｇ／ｍｌ又はＧ２－２ｏｐｔｉ（ＩｇＧ１）６２．５μｇ／ｍｌで処理した。フーリン切断阻害を調べるために、細胞増殖に影響を及ぼさない範囲でそれぞれの抗体濃度を選択した。９６時間後、アップコンバージョン蛍光体技術（Up-converting Phosphor Technology）（ＵＣＰ）を利用して、ｓＧＰ７３の測定のために上清を回収し、残りの細胞層を実施例８に記載のＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ試薬（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いる増殖アッセイにおいて使用した。ここで、Ｇ２－２ｏｐｔｉ（ＩｇＧ１）は、ＨＥＫ２９３ ＧＰ７３－Ｈｉｓ完全長細胞による上清へのｓＧＰ７３分泌を減少させるのに対して、アイソタイプコントロールであるベバシズマブは、上清中のｓＧＰ７３レベルに影響を及ぼさない。

【0359】

ｓＧＰ７３の検出のために、抗ＧＰ７３ ＵＣＰ標識抗体を含有するＨｏｔｇｅｎ希釈バッファー中で各上清を１：１に希釈した。その０．１ｍｌを、マウス抗ＧＰ７３抗体コート済みニトロセルロースメンブレン（Ｃ線）を含むＨｏｔｇｅｎ ＧＰ７３試験カセットにロードし、１５分間クロマトグラフィープロセスのためにインキュベートし、それによってヤギ抗マウス標識抗体でコーティングしたメンブレン部分（Ｔ線）に到達した。試験カセットをＨｏｔｇｅｎ Ｕｐ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＵＣＰ） Ａｎａｌｙｓｅｒに挿入することによって測定されたＣ線とＴ線での発光の差からＧＰ７３濃度を推定した。

【0360】

実施例１５：異なる細胞株の細胞生存率に対する抗体Ｇ２－２ｏｐｔｉ（ＩｇＧ１）とＧ２－２ｏｐｔｉ－ＥＥＤ（ＩｇＧ１）の効果
最適化された抗体Ｇ２－２ｏｐｔｉ（ＩｇＧ１）及びその抗体バリアント、Ｇ２－２ｏｐｔｉ－ＥＥＤ（ＩｇＧ１）（後者はエンドソームエスケープ配列（ＥＥＤ）を有する）の有効性について、ヒト及びマウスのがん細胞株で試験した。ヒトがん細胞ＨＣＴ １１６ ｐ５３ｗｔ、ＨＣＴ １１６ ｐ５３－／－、ＳＷ ４８０ Ｋ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｖ変異、Ｃａｃｏ２（全て結腸直腸がん細胞株）、ＳＫＯＶ３（卵巣がん）、ＨＵＨ７（ヒト肝細胞がん腫細胞株）、Ｈｅｐａ１－６（マウス肝細胞がん腫細胞株）、ＤＵ１４５、ＰＣ３（ヒト前立腺がん細胞株）及びＨ１９７５（ＥＧＦＲ変異Ｔ７９０Ｍ及びＬ８５８Ｒを有する肺がん細胞株）を９６ウェルプレートに１ウェル当たり１５００細胞で播種し、一晩ＤＭＥＭ中で培養した。翌日培地を交換し、細胞を１ｍｇ／ｍｌのＧ２－２ｏｐｔｉ（ＩｇＧ１）又はＧ２－２ｏｐｔｉ－ＥＥＤ（ＩｇＧ１）又はセツキシマブ又はベバシズマブ又はＰＢＳで処理した。９６時間後、実施例８に記載の通りにＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ試薬（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて、細胞生存率を定量化した。ＰＢＳ処理細胞の結果は、１００％生存率レベルとなった（図２３参照）。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図23】

【図24】

【配列表】

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