特許 7315543 細胞を計数および／または特性化するための測定キュベット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-07-18

(45)【発行日】2023-07-26

(54)【発明の名称】細胞を計数および／または特性化するための測定キュベット

(51)【国際特許分類】

   G01N 21/05 20060101AFI20230719BHJP

   G01N 15/14 20060101ALI20230719BHJP

   G01N 15/12 20060101ALI20230719BHJP

   G01N 33/49 20060101ALI20230719BHJP

   G01N 27/02 20060101ALI20230719BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20230719BHJP

【ＦＩ】

G01N21/05

G01N15/14 C

G01N15/12 A

G01N33/49 H

G01N27/02 D

C12M1/34 A

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2020522792

(86)(22)【出願日】2018-06-28

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-09-03

(86)【国際出願番号】 FR2018051605

(87)【国際公開番号】W WO2019002787

(87)【国際公開日】2019-01-03

【審査請求日】2021-02-17

(31)【優先権主張番号】1755974

(32)【優先日】2017-06-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR

(73)【特許権者】

【識別番号】520005152

【氏名又は名称】ディアグドゥヴ

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】ベノワ・メルシェ

【審査官】横尾 雅一

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１１／０７７７６５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開昭６１－０１３１３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００３－５１５３３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１５／０１２９６８８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２００６－１７１０１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平１１－２８１５６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１４－２１５０４１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００５－２２１３２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許第０４６７３２８９（ＵＳ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ２１／００ － Ｇ０１Ｎ ２１／８３

Ｇ０１Ｎ １５／００ － Ｇ０１Ｎ １５／１４

Ｇ０１Ｎ ２７／０２

Ｃ１２Ｍ １／３４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞を列挙および／または特性化するための測定キュベット（１）であって、ベース（１１）と、前記ベース（１１）と共に光学測定チャンバ（１３）を形成するように前記ベース（１１）から延在する透明側方エンクロージャ（１２）と、を備え、前記透明側方エンクロージャ（１２）は球状外方表面（１２２）及び角柱状内方表面（１２１）を有し、前記ベース（１１）は、細胞が通過するための直径３０μｍ～１００μｍの貫通オリフィス（１１１）を有する、測定キュベット（１）において、
前記ベース（１１）および前記透明側方エンクロージャ（１２）は、インピーダンス測定および光学測定の両方に適した一個片キュベット（１）を形成し、
前記ベース（１１）は、錐台の側方表面（１１２１）と小径表面（１１２２）との組合せである上方表面（１１２）を有し、前記貫通オリフィス（１１１）は、前記上方表面（１１２）の前記小径表面（１１２２）に対応する部分にて前記ベース（１１）を横断することを特徴とする、測定キュベット（１）。

【請求項2】

前記ベース（１１）は、錐台の側方表面（１１３１）と小径表面（１１３２）との組合せである下方表面（１１３）を有し、前記貫通オリフィス（１１１）は、前記下方表面（１１３）の前記小径表面（１１３２）に対応する部分にて前記ベース（１１）を横断する、請求項１に記載の測定キュベット（１）。

【請求項3】

前記ベース（１１）は、前記小径表面（１１２２、１１３２）に対応する部分に４０μｍ～１００μｍの間の厚さを有する、請求項１または２に記載の測定キュベット（１）。

【請求項4】

前記光学測定チャンバ（１３）内に開口する取入れオリフィスを有する流体取入れ部（１６）をさらに備え、前記取入れオリフィスは、前記貫通オリフィス（１１１）よりも低い、請求項１から３のいずれか一項に記載の測定キュベット（１）。

【請求項5】

前記球状外方表面（１２２）の中心が、前記貫通オリフィス（１１１）の出口におよび前記貫通オリフィス（１１１）の近傍に位置する、請求項１から４のいずれか一項に記載の測定キュベット（１）。

【請求項6】

前記球状外方表面（１２２）の前記中心は、前記貫通オリフィス（１１１）の前記出口から２００μｍ～６００μｍの間に位置する、請求項５に記載の測定キュベット（１）。

【請求項7】

前記透明側方エンクロージャ（１２）の上方表面（１２４）上にシールハウジング（１５）をさらに備える、請求項１から６のいずれか一項に記載の測定キュベット（１）。

【請求項8】

前記ベース（１１）の下方にサブベース（１４）をさらに備え、前記サブベース（１４）は、前記ベース（１１）および前記透明側方エンクロージャ（１２）と共に前記一個片キュベット（１）を形成し、前記サブベース（１４）は、Ｖ字形状センタリング要素（１４１）を備える側方表面を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の測定キュベット（１）。

【請求項9】

請求項１から８のいずれか一項に記載の測定キュベット（１）と、キュベット支持部（２）とを備える、細胞を特性化するためのシステム（１０）。

【請求項10】

前記測定キュベット（１）は、請求項８に記載のものであり、前記キュベット支持部（２）は、交差部にて交差する２つの溝（２１、２２）を有し、横断プロファイルが、Ｖ字形であり、前記交差部は、前記測定キュベット（１）のための座部を形成する、請求項９に記載の細胞を特性化するためのシステム（１０）。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、フローサイトメトリの技術分野に、詳細には測定キュベットおよびかかる測定キュベット用の支持部などのフローサイトメトリ付属品に関する。

【背景技術】

【0002】

現行では、フローサイトメトリは、例えばサイズ、細胞内含有量、そのＤＮＡ含量等の、細胞の特徴および特性を判定することが可能である。また、フローサイトメトリは、ある細胞集団内におけるこれらの特徴の偏差および分布を調査して、最終的には例えば血液を構成する様々な細胞の分別など、細胞間における小集団の識別を結果としてもたらすことが可能である。

【0003】

さらに、フローサイトメトリは、迅速な方法である。典型的には、１分あたり数千個の細胞が特性化される。したがって、フローサイトメトリは、極めて少ない細胞小集団の列挙および特性化を可能にする。これらの小集団の極少性により、とりわけこれらの小集団に関してなされる統計的に許容され得る測定回数を実現することが不可能であるため、顕微鏡検査によるそれらの小集団の観察および特性化は一般的に可能ではない。

【0004】

さらに、近年における光学センサの改良および特に次第に低強度化される信号を検出するそれらの光学センサの能力により、細胞の体積を測定することと、一方ではインピーダンス測定によりおよび他方では光学測定により細胞含有量に関する情報を取得することとの両方が可能となる。

【0005】

フローサイトメトリは、本質的には細胞のサイズに対して大きな断面の液体流中に細胞を個別に通過させることからなる。この液体流は、ノズルで終端し、このノズルは、２つまたは複数の細胞が同時にまたは経時的に過度に近接して通過するのを防止するようにサイズ設定されたオリフィスを有する。流量が液体流とオリフィスとの間において一定である場合に、液体流直径が縮小するにつれて細胞速度は上昇し、細胞は、ノズルの直径を有する液体ジェット中に１秒当たり数千個程度の速度をノズルの出口にて達成する。

【0006】

細胞の体積測定は、ノズルオリフィスの各側におけるインピーダンスを測定することにより実施される。実際に、細胞の体積は、導電媒質中における細胞の通過により誘発されるインピーダンス変動と相関性があり（コールターシステム）、細胞は、電気的に絶縁性を有するものとして見なされる。体積は、細胞の形状に関係なく無条件に判定される。

【0007】

さらに、ノズルオリフィス中の細胞の通過により、細胞のある特定の流体力学的センタリングおよびさらに配向がもたらされる。したがって、ノズルから流出し細胞を含むジェットを励起源により発せられた光線中に正確に位置決めすることが可能となる。細胞がこの光線を横断する時に、細胞は、細胞の特性を判定するためにサイトメータによる利用に適したある特定数の光信号を散乱する。これらの光信号には、
－ 入射光線の一部分の反射により表わされる、液体と細胞との間のさらに細胞の異なる構成要素間の屈折率における相違に起因する、細胞上の光反射と、
－ 細胞に進入する光線の偏向により表される細胞上の光屈折と、
－ 本質的に数度～３６０°の立体角までに及ぶ立体角の下における細胞上の光偏向と
を含む。

【0008】

全てのこれらの信号は、集光システムにより集められ、次いで光学フィルタシステムによりそれらの波長（２０ｎｍ～５０ｎｍまたは３０ｎｍ～４０ｎｍの間の中～高波）に応じて分離され、最終的に様々な光学センサに到達する。これらの様々なセンサは、
－ 細胞の前方散乱を測定することと、
－ 細胞の側方散乱を測定することと、
－ 細胞の吸光度を測定することと、
－ 細胞の蛍光性を測定することと
に適し得る。

【0009】

前方散乱は、細胞膜の表面上に到達した入射光の一部分の、細胞膜の表面による散乱に起因する。この散乱光の部分は、入射光と同一の波長を有する。この散乱光の部分は、入射光の軸に沿って感知される。この散乱光の部分は、細胞のサイズおよび平均屈折率に関する情報を提供する。

【0010】

側方散乱は、細胞膜を通過した入射光の部分の全ての空間方向への細胞内小器官による散乱に起因する。側方散乱は、光電子増倍管またはアバランシェフォトダイオードにより感知され得る。屈折特性および反射特性を利用して、側方散乱は、細胞含量の微小な不均質性に関する情報を提供する。

【0011】

吸光度は、安定した励起源を必要とする。吸光度は、細胞の直径に対して、および細胞内小器官の吸収率に対して比例する。

【0012】

細胞が１つまたは複数の蛍光色素で標識化される場合には、これらの蛍光色素は、励起中に、励起源よりも大きな１つまたは複数の波長にて全ての空間方向において蛍光を発する。干渉フィルタが、様々な蛍光波長の分離（一般的には２０～５０ｎｍまたは３０～４０ｎｍの中～高波スペクトルへと）を可能にし、これらの蛍光波長のそれぞれが、光電子増倍管へと送られる。測定される蛍光の強度は、細胞に結合された蛍光色素分子の個数に依存する。例えば、細胞の細胞膜を受動的に横断しＤＮＡと特定的に結合する蛍光色素であるＤＲＡＣＱ５マーカを使用する場合には、有核細胞に関する情報を抽出することが可能である。ＤＲＡＣＱ５マーカは、６２２ｎｍ～６７６ｎｍの２つの吸収ピークと、２４０ｎｍ～３１４ｎｍの紫外領域内の２つの他の吸収ピークとを有する。ＤＲＡＣＱ５は、６６５ｎｍ～８００ｎｍの間の波長を有する赤色領域で蛍光を発する。一般的に使用されるフィルタは、９０°の入射ビームにて６５０ｎｍ未満の全てのスペクトル成分を反射し、６５０ｎｍ超のスペクトル成分を伝播するダイクロイックタイプフィルタである。光源の所与の定義を前提とした場合に、第１のフィルタは、５０ｎｍ程度の帯域幅を有する光源の波長にて自然にセンタリングされる。したがって、この設定では、各粒子ごとに３つの物理量を、すなわち粒子の体積を表す電気的測定値、細胞の屈折度に関係する消光測定値、および最終的に分析される細胞の核酸含有量に関係する蛍光測定値を測定することが可能となる。

【0013】

フローサイトメトリは、血液学的調査に対して有利に利用されて、様々なウイルス、病原菌、および寄生生物の診断および治療モニタリング、ならびに健康な細胞の機能調査を可能にする。フローサイトメトリにより、種々のタイプの血液細胞を計数および特性化することが可能となる。

【0014】

例えば、白血球に対して適用されるフローサイトメトリは、白血球の合計数を確認し、形態構造に応じて白血球を分別し、細胞体積のインピーダンス測定および吸光測定により３つの異なるタイプへと白血球を分類することを可能にする。

【0015】

第１のタイプは、大きな細胞（直径２０ｎｍ～４０μｍ）である単核細胞のタイプである。単核細胞の核の形状は、円形、楕円形、腎臓形、または全くの不規則形状である場合があり、最も多いケースは、腎臓形状である。単核細胞の核のクロマチンは、低濃度であり、凹凸が無く、規則的な構造を有する。血液中の単核細胞の滞留時間は、組織通過までの２日間であり、骨髄通過時間は、１～２日間である。単核細胞は、活性化されるとマクロファージになる。それらは、細菌、全細胞、および例えば埃などの様々ないわゆる汚染物質粒子に対して食作用を働かせ得る。

【0016】

第２のタイプは、免疫システムにおいて主要な役割を果たすリンパ球のタイプである。リンパ球は、異なるサイズの２つの群に、すなわち
－ 核の単一側において一般的に延在する非外延的なややまたは若干において好塩基性である細胞質を有する、円形形状または楕円形形状の、時としては腎臓形の核を有する小サイズリンパ球（直径７μｍ～９μｍ）、ならびに
－ 小サイズリンパ球の細胞質よりも外延的であり核を完全に囲む細胞質を有する、中心位置にまたは若干偏心位置に核を有する大サイズリンパ球（直径９μｍ～１５μｍ）
に分けられ得る。

【0017】

多核細胞としても知られる顆粒球のタイプであり、主要な機能が病原菌からの保護である第３のタイプは、３つの下位カテゴリーに分別され得る。

【0018】

最初に、好中球が、最も多い顆粒球である（約９６％）。好中球は、円形形状を有し、１２μｍ～１４μｍの直径を有する。好中球は、それらの核の多葉形状により特性化される（３～５個の小葉）。好中球は、組織通過までに２日間の血中滞留時間と、１０～１４日間の顆粒前駆体の骨髄通過時間とを有する。好中球の骨髄貯蔵分画が存在する。好中球は、細菌を死滅させることにおいて非常に有効であり、急性タイプの炎症中に優勢となる。好中球の本質的な役割は、細菌および酵母などの外来微生物から身体を防衛することである。好中球の排泄機能は、局所的炎症組織の反応を促進し、その組織の防御に寄与する。

【0019】

次に、好塩基球が、非常に少なく、白血球のわずかに約０．５％を構成する。好塩基球は、１０μｍ～１４μｍの直径を有する。好塩基球の二葉核は、比較的非常に多数であり細胞中にわたり分散された特定の顆粒によってマスクされる。好塩基球の血中滞留時間は、１２～１４時間であり、組織通過は知られていない。骨髄通過時間は、好中球の骨髄通過時間と同等となる。好塩基球の重要な機能は、好酸球を引き寄せることである。

【0020】

最後に、好酸球が、循環する白血球の約２％～５％を構成する（約３５０個／ｍｍ^３）。好酸球は、二葉核により、およびとりわけ球状の顆粒（直径０．５～１．５μｍ）の出現により特徴づけられる、直径１２μｍ～１４μｍの細胞である。好酸球は、アズール顆粒を含む。好酸球の多核細胞は、アレルギー性炎症および抗寄生虫防御において重要な細胞である。好酸球の分布は、とりわけ有機組織的であり、循環部分は、好酸球の合計数のわずかに１％を構成するにすぎない。好酸球の血中通過時間は、骨髄から退出後のおよび組織（特に小腸、肺、皮膚、および子宮）中での沈着までの３～８時間であり、その組織中において数十日の寿命を有することになる。

【0021】

さらなる例では、赤血球および血小板の合計数を判定することと、形態構造に応じてそれらを分別することと、細胞体積のインピーダンス測定および吸光測定によりそれらを分類することとが可能となる。

【0022】

フローサイトメトリの他の適用は、網状赤血球、赤芽球、未熟細胞および白血球前駆細胞、活性化リンパ球、または依然として架橋状態にある血小板などの種々のタイプの血液細胞の特性化および／または列挙により明白な診断上の重要点を示す。

【0023】

細胞の体積のインピーダンス測定は、ベースにオリフィスを有するキュベットを備えるデバイスを使用し、このオリフィスの約５０μｍの直径により、液体流中の細胞の個別の通過が可能となる。オリフィスの上流において、液体流は、特性化されることとなる細胞を含む試料ジェットと、この試料ジェットを囲むことにより試料ジェットのハイドロフォーカシングを可能にするシースジェット（一般的には生理食塩水）とから形成される。電圧計の端子は、電極に電気接続され、これらの電極の１つは、オリフィスおよび他方の下流電極の上流側に配設され、Ｏリングが、これらのレベルにおける耐密性を確保するために必要とされる。細胞の通過時に観察される電圧変動は、細胞の体積を表す。

【0024】

キュベットのベースは、非常に高コストである合成ルビーなどの宝石から作製された直径数ミリメートルおよび厚さ数ミクロンのディスクから一般的に製造される。貫通オリフィスは、このディスク中に機械加工され、次いでディスクは、ノズルの端部に手動的に圧着される。この圧着作業は、微小クラックが発生する場合がありしたがって正電極と負電極との間における抵抗の変更を生じさせしたがってインピーダンス測定を不正確なものにするため、リスクを伴わないものではない。

【0025】

光学測定に関して、この光学測定は、液体流中の細胞の個別の通過を可能にする８０μｍの直径を有するオリフィスを中心に有する平坦ベースから、およびこのベースに対して押し付けられた透明エンクロージャから形成されたキュベットを備えるさらなるデバイスを使用する。エンクロージャとベースの間はシールによりこれらの２つ部分の間の耐密性を確保する。ベースのすぐ近傍のエンクロージャの下方部分における二次シース入力により、４００μｍ長さにわたり試料流に同伴するように試料流をシースするためのシースジェットの、試料流が励起源により発せられた光線と交差する位置への到着が可能となる。第２のシールが、キュベットの上方部分における耐密性を確保するために必要とされる。

【0026】

体積測定および光学測定を同時に実施するために、光学測定デバイス用のベースとして体積測定デバイスのベースを使用して、これらの２つのデバイスを単一のデバイスに組み合わせることが可能である。しかし、構成が、４つのシールの使用を必要とする。さらに、様々な要素間に漏れが無いことを保証することができない。§§

【先行技術文献】

【特許文献】

【0027】

【文献】国際公開第２０１７／０２９２１０号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0028】

本発明の１つの目的は、先行技術の欠点の中の少なくとも１つを改善することである。

【課題を解決するための手段】

【0029】

これを目的として、本発明は、細胞、特に血液細胞を列挙および／または特性化するための測定キュベットであって、ベースと、ベースと共に光学測定チャンバを形成するようにベースから延在する透明側方エンクロージャとを備え、ベースが、細胞が通過するための直径３０～１００μｍの貫通オリフィスを有する、測定キュベットにおいて、ベースおよび透明側方エンクロージャが、インピーダンス測定および光学測定の両方に適した一個片キュベットを形成することを特徴とする、測定キュベットを提供する。

【0030】

この一個片測定キュベットにより、細胞体積測定および光学測定の両方のために以前は必要とされた４つのシールの中の３つが無い状態で済ますことが可能となる。実際に、この一個片の性質により、測定キュベットは、貫通オリフィスと光学測定チャンバとの間に、および正電極と様々な液体（シース液、Ｌｙｓｉｓ等）を排出する役割を果たすパーツとの間にシールをもはや必要としない。さらに、この測定キュベットは、数マイクロ秒の間隔での同一の細胞に対するインピーダンス体積測定および光学測定を可能にする。

【0031】

以下、さらなる任意のおよび非限定的な特徴を説明する。

【0032】

ベースは、錐台の側方表面と小径表面との組合せである上方表面を有してもよく、貫通オリフィスは、上方表面の小径表面に対応する部分にてベースを横断する。

【0033】

ベースは、錐台の側方表面と小径表面との組合せである下方表面を有してもよく、貫通オリフィスは、下方表面の小径表面に対応する部分にてベースを横断する。

【0034】

ベースは、小径表面に対応する部分に４０～１００μｍの間の厚さを有し得る。

【0035】

キュベットは、測定チャンバ内に開口する取入れオリフィスを有する流体取入れ部をさらに備えてもよく、取入れオリフィスは、貫通オリフィスよりも低い。

【0036】

エンクロージャは、球状外方表面を有してもよく、球状外方表面の中心が、貫通オリフィスの出口におよび貫通オリフィスの近傍に位置する。球状外方表面の中心は、貫通オリフィスの出口から２００～６００μｍの間に位置してもよい。

【0037】

キュベットは、エンクロージャの上方表面上にシールハウジングをさらに備えてもよい。

【0038】

キュベットは、ベースの下方にサブベースをさらに備え、サブベースは、ベースおよびエンクロージャと共に一個片キュベットを形成し、サブベースは、Ｖ字形状センタリング要素を備える側方表面を有する。

【0039】

また、本発明は、上述のような測定キュベットとキュベット支持部とを備える、細胞、特に血液細胞を特性化するためのシステムを提供する。キュベット支持部は、交差部にて交差する２つの溝を有してもよく、横断プロファイルが、Ｖ字形であり、交差部は、測定キュベットのための座部を形成する。

【0040】

さらなる目的、特徴、および利点が、添付の図面を参照として、例示としておよび非限定的なものとして与えられる以下の説明を読むことにより明らかになろう。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】本発明による測定キュベットの斜視図である。

【図2】図１の測定キュベットの面Ｐに沿った断面図である。

【図3】図２に示す貫通オリフィスの拡大図である。

【図4】図２における測定キュベットに至るプレフォームの面Ｐに沿った断面図である。

【図5】キュベット支持部上の図１の測定キュベットの斜視図である。

【図6】図５の測定キュベットおよびキュベット支持部と、光学測定に必要な様々な光学素子とを備える測定システムの斜視図である。

【図7】図６に示す面Ｐに沿った、測定システムの光学中心を通過する断面図である。

【図8】図１の測定キュベットを作製するための方法のステップを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0042】

本開示全体を通じて、空間的用語は、測定キュベットの通常の動作位置に関して決定される。

【0043】

測定キュベット。
以下、図１～図４を参照として、本発明による細胞を列挙および／または特性化するための測定キュベット１を説明する。

【0044】

測定キュベット１は、ベース１１と、ベース１１と共に光学測定チャンバ１３を形成するようにベース１１から延在する透明側方エンクロージャ１２とを備える。ベースは、細胞を通過させるための直径３０～１００μｍの貫通オリフィス１１１を有する。ベース１１およびエンクロージャ１２は、インピーダンス測定および光学測定の両方に適した一個片キュベットを形成する。

【0045】

有利には、貫通オリフィス１１１は、４０～８０μｍの、または５０～６０μｍの平均直径を有する。有利には、貫通オリフィス１１１は、円形ベースを有する円筒状である。この円形ベースの形状は、測定を妨害しないという利点を有する。実際に、市販のレーザを使用した微細機械加工により得られるオリフィスは、レーザにより発せられるビームのガウスエネルギープロファイルにより自然な円錐性を有する。しかし、テーパ状オリフィスは、細胞がテーパ状オリフィスを通過するときに細胞により形成されるパルスの形状を、特にパルス幅を変更することによって、時として著しく変更する。

【0046】

ベース１１は、上方表面１１２をさらに有してもよく、この上方表面１１２は、好ましくは直円錐としても知られる回転錐台である錐台の側方表面１１２１と小径表面１１２２との組合せである。対応する円錐頂角は、優先的には２０°～６０°の間である。小径部は、０．５～１．５ｍｍの間、好ましくは約１ｍｍであってもよい。次いで、貫通オリフィス１１１が、上方表面１１２の小径表面１１２２に対応するその部分にてベース１１を貫通して延在する。したがって、ベース１１の上方表面１１２は、光学測定チャンバ１３を貫通する。ベース１１の上方表面１１２を光学測定チャンバ１３内へと貫通することにより、測定は、貫通オリフィスの断面に対応する限定空間内で測定が実施されるキュベットとは異なり、開放空間内で実施されることが可能となる。開放空間内での測定の実施は、洗滌による測定ゾーンの洗浄を容易化する利点を有する。錐台のスロープにより、貫通オリフィス１１１の出口を励起源により発せられる光線の焦点に可能な限り近くに配置しつつ、光学開口に対して適合化することが可能となる（以下を参照）。

【0047】

追加的にはまたは代替的には、ベース１１は、下方表面１１３をさらに有してもよく、この下方表面１１３は、好ましくは回転錐台である錐台の側方表面１１３１と小径表面１１３２との組合せである。対応する円錐頂角は、優先的には２０°～６０°の間である。次いでこの場合に、貫通オリフィス１１１は、下方表面１１３の小径表面１１３２に対応する部分にてベース１１を貫通して延在する。したがって、ベース１１の下方表面１１３は、錐台の大径ベースに相当する入力から貫通オリフィス１１１に至るまで集束チャンバ１１４を画定する。かかる構成は、列挙および／または特性化されることとなる、ならびに小径表面１１３２に向かって側方に噴射されたシース流により貫通オリフィス１１１に向かって中心に送られることとなる細胞を含む試料流にシースすることを可能にし、したがって試料ジェットの正確な水力学的センタリングを確保する。この構成は、「ハイドロフォーカシング」として知られる。

【0048】

ベース１１が、上述のように上方表面１１２および下方表面１１３の両方を有する場合に、これらの表面は、下方表面１１３上の貫通オリフィス１１１の入口および上方表面１１２上の貫通オリフィス１１１の出口が共通の長手方向軸上に位置するように、互いに対して芯合わせされる。

【0049】

好ましくは、ベース１１は、貫通オリフィス１１１の近傍に、特に上方表面１１２および下方表面１１３の小径表面１１２２、１１３２に対応する部分にて、４０～１００μｍの間の厚さを有する。有利には、この厚さは、５０～８０μｍ、５５～７０μｍ、または約６０μｍである。

【0050】

エンクロージャ１２は、内方表面１２１を有し、この内方表面１２１の形状は、方形ベースの直円柱の側方表面の形状である。この側方表面のベースを形成する方形の側部は、好ましくは３～７ｍｍ、４～６ｍｍ、または４．５～５．５ｍｍの間で選択され、優先的には約５ｍｍである。円形、三角形等のベースに関する他の形状が選択されてもよい。好ましくは、ベースの形状は、規則的幾何学形状であってもよく、すなわち少なくとも１つの対称要素を、好ましくは対称中心または対称軸を有する。

【0051】

追加的にはまたは代替的には、エンクロージャ１２は、球状外方表面１２２を有し、対応する球体の中心は、貫通オリフィス１１１の出口におよび貫通オリフィス１１１の近傍に位置する。

【0052】

球状外方表面１２２および方形ベース直円柱内方表面１２１の組合せは、３つまたは４つの集束レンズ１２３を形成し、これらの集束レンズ１２３はそれぞれ、内方表面１２１の面に対応し、レンズの焦点は、球状外方表面１２２に対応する球体の中心である。したがって、測定キュベット１は、その構造にこれらのレンズを組み込み、このことは、測定キュベットと一方では励起源との間におよび他方ではセンサとの間に集束レンズを使用できるように有さなければならないこと、ならびに対応する調節を実施しなければならないことからユーザを解放することによって、測定システムの総コストを引き下げる助けとなる。さらに、かかる構造は、測定システムの球面収差を著しく軽減して、測定点における最大出力を保証する。さらに、０．５程度の開口数が、市販のデバイスとは異なりレンズを使用することなく実現され得る。

【0053】

さらに、貫通オリフィス１１１の出口におよび貫通オリフィス１１１の近傍にレンズ１２３の焦点を配置することにより、細胞が貫通オリフィス１１１から外にまさに出て試料流のセンタリングが最適であるときに、細胞に関する光学測定が可能となる。実際に、細胞が貫通オリフィスの出口からより離れるように移動するほどに、細胞の位置はより不確定になり、細胞が試料ジェットに対して芯ずれ状態になるリスクがより高くなる。

【0054】

したがって、球状外方表面１２２の中心は、具体的にはベース１１の上方表面１１２および下方表面１１３が回転錐台の側方表面および小径表面の組合せに相当する場合にベース１１の上方表面１１２および下方表面１１３の長手方向軸と平行である試料流の方向において、貫通オリフィス１１１の出口から、好ましくは２００～６００μｍ、３００～５００μｍ、または３５０～４５０μｍの間に、好ましくは約４００μｍに位置する。

【0055】

さらに、エンクロージャ１２は、その上方表面１２４上に、優先的にはＯリングであるシールを受けるためのシールハウジング１５を備え得る。

【0056】

測定キュベット１は、測定チャンバ１３内に開口する取入れオリフィスを有する流体取入れ部１６をさらに備えてもよい。この取入れオリフィスは、貫通オリフィス１１１よりも下方に配設される。この流体取入れ部は、貫通オリフィス１１１の出口における試料流の第２のシースを可能にする。さらに、流体取入れ部により、エリア中にわたるスイーピングによって再循環体積形成が防止されて、シースの有効性がより低くなる貫通オリフィス１１１の出口の下流およびその出口から距離をおいた位置において試料ジェットから流出する細胞が、ループ中に再循環し、したがって後の細胞に対してなされる光学測定を妨害するのを防止することが可能となる。さらに、錐台の側方表面１１２１および小径表面１１２２の組合せに対応する流体取入れ部１６とベース１１の上方表面１１２との間の組合せは、貫通オリフィス１１１の出口に向かって第２のシース流体を案内する利点を有する。

【0057】

測定キュベット１は、ベース１１の下方にサブベース１４をさらに備えてもよい。サブベース１４は、ベース１１およびエンクロージャ１２と共に一個片キュベットを形成する。サブベース１４は、集束チャンバ１１４に対して開口した穴１４３を有する。この穴の外方側部１４３１上に、ショルダ１４２がＯリングを受けるために設けられてもよい。

【0058】

外方側部１４３１上の穴１４３の直径は、ベース１１の下方表面１１３の錐台のベースを形成する円の直径よりも大きくてもよく、例えば４００～７００μｍ、４５０～６５０μｍ、５００～６００μｍの間、好ましくは５５０μｍであってもよい。この場合に、穴１４３の直径は、ベース１１の下方表面１１３の錐台のベースを形成する円の直径と同等になるまで漸減する。

【0059】

さらに、サブベース１４は、Ｖ字形状センタリング要素１４１を備える側方表面を有する。これらのＶ字形状センタリング要素１４１は、以降で説明されるキュベット支持部の溝に係合する。好ましくは、サブベースの側方表面は、２つのＶ字形状センタリング要素１４１を備え、それらの平均平面は、互いに好ましくは垂直に交差する。有利には、サブベースの側方表面は２対のＶ字形状センタリング要素１４１を備える。同一対の２つのＶ字形状センタリング要素の平均平面は、平行である一方で、他の対の２つのＶ字形状センタリング要素の平均平面は、互いに好ましくは垂直に交差する。有利には、１対のＶ字形状センタリング要素１４１の平均平面は、方形ベース直円柱内方表面１２１の２つの対向面と平行である。

【0060】

これらのＶ字形状センタリング要素１４１は、そのＶ字部の先端部が下方をすなわちエンクロージャからサブベースに向かって配向された方向を向いている突出要素である。好ましくは、Ｖ字部の先端部は削り取られる。Ｖ字部の先端部を削り取ることにより、測定キュベット１の製造中に先端部に時として存在し得るバリに起因する測定キュベット１の位置決め不良を防止することが可能となる。

【0061】

有利には、一個片キュベットは、好ましくは１．４～１．６の間の屈折率を有する。さらに、好ましくは低複屈折のおよび低加熱ひずみの、９０％超の動作波長の伝達率を有するように、プラスチックが優先的に選択される。

【0062】

さらに、一個片キュベットの材料は、有利には、低い吸水抵抗（例えば０．０１％未満）を有するように選択される。さらに、この材料は、好ましくは貫通オリフィスの両側の電極間に十分な電気絶縁を確保するために、３ＭＨｚ未満または１ＭＨｚ未満の周波数にて低誘電率（例えば最大３Ｆ／ｍ）を有する。

【0063】

一個片キュベットの材料は、有利にはプラスチックである。したがって、一個片キュベットは、成形により得られるため、先行技術の測定キュベットに比べて測定キュベットのコストを劇的に削減することが可能となる。一個片キュベットの材料は、本質的にはポリシクロオレフィン樹脂を含んでもよく、具体的には９５重量％超のまたは９９．５重量％超のこの樹脂を含んでもよい。かかる樹脂の一例は、Ｚｅｏｎ（登録商標）によるＺｅｏｎｅｘ Ｅ４８Ｒ（２０１５）である。かかる樹脂は、溶融形態において非常に流動性が高く、非常に低い空引きで非常に高圧にて射出されるのに適し、一個片キュベットの寸法および光学品質の表面粗度を正確に制御するのに適する。

【0064】

測定システム。以下、図５～図７を参照として、本発明による細胞を列挙および／または特性化するための測定システムを説明する。

【0065】

測定システム１０は、上述のような測定タンク１を備える。

【0066】

さらに、測定システム１０は、測定中に測定キュベット１を受け固定するためのキュベット支持部２を備える。キュベット支持部２は、有利には、測定キュベット１がＶ字形状センタリング要素１４１を有する場合に、交差部にて互いに好ましくは垂直に交差する２つの溝２１、２２を有してもよく、その横断プロファイルは、測定キュベット１のＶ字形状センタリング要素１４１の形状に対応するＶ字形である。交差部は、測定キュベット１のための座部を形成する。２つの溝２１、２２間の交差角度は、Ｖ字形状センタリング要素１４１の平均平面の交差角度に対応する。

【0067】

さらに、キュベット支持部２は、シースジェットおよび試料ジェットを受けるためのオリフィス２３を交差部に有する。このオリフィス２３は、測定キュベット１がキュベット支持部２上に配置される場合に、集束チャンバ１１４と流体連通状態になるのに適する。さらに、測定システム１０は、測定キュベット１とキュベット支持部２との間に配設されることとなるＯリング３を備え得る。

【0068】

測定システム１０は、インピーダンス測定のための正電極および負電極を備えるインピーダンス測定アセンブリをさらに備え得る。

【0069】

測定システム１０は、測定キュベット１に向かって光を放出するための励起源４を備える光学測定アセンブリをさらに備え得る。光学軸Ａが、励起源４により放出される光線４１の平均方向として励起源４から定義される。励起源４の配置は、測定キュベット１が定位置にある時に、光学軸Ａがエンクロージャ１２の球状外方表面１２２の中心Ｏを通過するように選択される。

【0070】

励起源４は、好ましくはインコヒーレント源である。したがって、光線４１の形状設定は、レーザを必要とする先行システムと比較して容易化され少なくともコストである。実際に、試料流は、数マイクロメートルの幅を有する。試料流の幅未満の直径のセルは、この幅に沿った任意の位置に位置し得る。低コヒーレンス励起源４の使用により、試料流の幅を含む、エンクロージャ１２の球状外方表面１２２の中心Ｏである測定点における均質的に照明されたゾーンの形成が可能となる。したがって、センサに到達する光信号は、試料流中の細胞の位置に関わらず同一となる。

【0071】

励起源４は、発光ダイオードおよび白熱電球から選択され得る。励起源は、６２０ｎｍ～６８０ｎｍ、６３５ｎｍ～６６５ｎｍの間の、有利には約６５０ｎｍの波長に中心を合わせられた発光スペクトルを有する。

【0072】

光学測定アセンブリは、光学軸Ａ上に入力成形光学素子５をさらに備え得る。これらの入力成形光学素子５は、励起源４と測定キュベット１との間に配設されることとなる。成形光学素子５により、励起源４に対して径方向に放出され第１の成形光学素子５に到達する光線４１を、光学軸Ａに対して平行な光線へと変換することが可能になる。このために、入力成形光学素子５は、集束レンズとして作用する第１の光学群５１を備える。エンクロージャ１２の球状外方表面１２２の中心Ｏにおける光線の焦点を改善するために、集束レンズとして作用する第２の光学群５２が、エンクロージャ１２の球状外方表面１２２の中心Ｏに向かう光線の第１の集束を実施するためにさらに設けられ得る。第２の光学群５２およびキュベット１の集束レンズ１２３の組合せにより、エンクロージャ１２の球状外方表面１２２の中心Ｏにおける最小限の球面収差と、この点Ｏにおける最大限の出力と、最大限の開口数とのいずれをも確保することが可能となる。測定キュベット１にレンズ１２３を組み込むことにより、コスト削減の助けとなり、このレンズ１２３が無い場合には、成形光学素子にレンズ１２３を組み込むことが必要である。第１の光学群５１、および該当する場合にはさらに第２の光学群５２は、好ましくは、キュベット支持部２の溝２１上への高さ位置決めおよび角度位置決めを容易化するための円形ベースを有するほぼ円筒形状のケーシング５３内に収容される。

【0073】

また、入力成形光学素子５は、測定キュベット１が定位置にある場合に、貫通オリフィス１１１の出口の近傍にレチクルの像を形成するのに適する。該当する場合には、レチクルの像は、エンクロージャ１２の球状外方表面１２２の中心Ｏを備える平面上に形成される。これを目的として、光学測定アセンブリは、励起源４と入力成形光学素子５との間に矩形レチクルをさらに備える。好ましくは、アスペクト係数（縦横比）が、３以下である。入力成形光学素子は、例えば長さ約１００μｍおよび幅約３０μｍの矩形レチクルを形成するのに適する。

【0074】

好ましくは、入力成形光学素子５は、集束光線４１が例えば３０°～５０°の間などの大きな立体角を形成するように適合化される。具体的には測定キュベット１のベースの上方表面１１２の錐台形状により可能となるこの大きな開口により、出力にて最大光を収集することが可能となる。

【0075】

光学測定アセンブリは、細胞の吸光度を測定するのに適したセンサと、測定キュベット１を通過し第１の受領光学素子６に到達する光線をセンサに向かって集束するための第１の出力受領光学素子６とを備える、吸光度測定モジュールを備えてもよい。好ましくは、このセンサおよび第１の受領光学素子６は、測定キュベット１に対して励起源４の対向側において光学軸Ａ上に配設され、第１の受領光学素子６は、測定キュベット１とセンサとの間に配設されることとなる。いくつかの場合では、センサおよび第１の受領光学素子６は、光学軸Ａの外部に配設されてもよく、その場合には、バッフルが、光学軸Ａ上におよび測定キュベット１と第１の受領光学素子６との間の光線４１の経路上に配設される。センサは、優先的にはフォトダイオードである。

【0076】

必須ではないが、好ましくは、第１の受領光学素子６は、システムの対称化によりコストを最小限に抑えるために入力成形光学素子５と同一の開口を有する。

【0077】

光学測定アセンブリは、細胞の側方散乱を測定するのに適したセンサと、キュベットにより散乱され第２の受領光学素子７に到達する光線４１をセンサに向かって集束させるための第２の出力受領光学素子７とを備える、散乱測定モジュールを備えてもよい。好ましくは、センサおよび第２の受領光学素子７は、光学軸Ａに対して垂直であり、キュベット支持部に対して平行であり、測定キュベット１が定位置にある場合にエンクロージャ１２の球状外方表面１２２の中心Ｏを通過する軸上に配設される。いくつかの場合では、センサおよび第２の受領光学素子７は、光学軸に対して垂直な軸の外部に配設されてもよく、その場合には、バッフルが、光学軸Ａに対して垂直な軸上に、および測定キュベット１と第２の受領光学素子７との間の光線４１の経路上に配設される。センサは、優先的にはアバランシェフォトダイオードである。

【0078】

光学測定アセンブリは、細胞の蛍光の測定に適したセンサと、キュベットにより散乱され第３の受領光学素子に到達する光線をセンサに向かって集束させるための第３の出力受領光学素子（図示せず）とを備える、蛍光測定モジュールを備えてもよい。好ましくは、センサおよび第３の受領光学素子は、光学軸に対して垂直であり、キュベット支持部に対して平行であり、測定キュベットが定位置にある場合にエンクロージャの球状外方表面の中心を通過する軸上に配設される。いくつかの場合では、センサおよび第３の受領光学素子は、光学軸に対して垂直な軸の外部に配設され、その場合には、バッフルが、光学軸に対して垂直な軸上に、およびキュベット支持部と第３の受領光学素子との間の光線の経路上に配設される。センサは、優先的にはアバランシェフォトダイオードである。

【0079】

光学測定アセンブリが側方散乱測定モジュールおよび蛍光測定モジュールの両方を備える場合には、その一方は、光学軸に対して垂直な軸上に位置し、他方はこの軸外に位置してもよい。この場合に、対応するバッフルは、ダイクロイックミラーである。

【0080】

代替的には、これらの２つのモジュールは、光学軸に対して垂直な軸の外部に位置してもよい。この場合には、キュベット支持部に最も近いバッフルが、ダイクロイックミラーである。最も遠いバッフルは、半反射性ミラーまたは真正ミラーのいずれかであってもよい。

【0081】

さらに代替的には、ダイクロイックミラーが、測定システム１０の同一の構成要素を使用しつつ１つまたは複数の蛍光の測定を可能にするために、側方散乱測定モジュールに追加されてもよい。ダイクロイックミラーは、キュベット支持部と第２の受領光学素子との間に配設される。さらに、ダイクロイック光学フィルタが、一般的には２０ｎｍ～５０ｎｍまたは３０ｎｍ～４０ｎｍの中～高帯域スペクトルにおいて種々の波長の光学蛍光信号を分離するために設けられてもよい。この場合には、ダイクロイック光学フィルタは、ダイクロイックミラーと蛍光センサとの間に配設される。

【0082】

本開示全体を通じて、「成形光学素子」および「受領光学素子」という用語は、光線の方向を変更するためのレンズまたはレンズのセットを示すものとして理解されるべきである。好ましくは、全ての成形光学素子および受領光学素子が、同一である。すなわち、これらの成形光学素子および受領光学素子はいずれも、第１の光学群および第２の光学群を備え、第２の光学群は、第１の光学群よりも測定キュベット１のより近くに配設されることとなる。

【0083】

好ましくは、受領光学素子６、７はそれぞれ、キュベット支持部２上への高さ位置決めおよび角度位置決めのために、成形光学素子５のように円形ベースを有する円筒形状のケーシングを有する。Ｖ字形状センタリング要素が、キュベット支持部２の対応する溝２１、２２に係合することが予期されてもよく、このＶ字形状センタリング要素は、測定キュベット１の位置決めのために使用されるものと同一のものであってもよい。

【0084】

有利には、測定キュベット１および／またはキュベット支持部２は、エンクロージャの方形ベース直円柱内方表面の面が光学軸に対して鉛直になるように適合化される。この場合に、成形光学素子は、光学軸上、または光学軸に対して垂直であり、測定キュベットが定位置にある場合にエンクロージャの球状外方表面の中心を通過する軸上のいずれかに配設される。

【0085】

測定キュベットを製造するための方法。以下、図２、図４、および図８を参照として、測定キュベットを製造するための方法を説明する。

【0086】

この方法は、プレフォームを成形することを含み、その形状は、ベースを例外としてほぼ測定キュベットの形状である（図４を参照）。特に、貫通オリフィスは、まだ形成されておらず、第１の貫通オリフィスの付近のベースのゾーンの厚さは、所望の厚さにまだ達していない。付近の厚さは、４００μｍ～６００μｍ、または４５０μｍ～５５０μｍ、または４７５μｍ～５２５μｍの間であり、好ましくは約５００μｍである。

【0087】

また、この方法は、４０μｍ～１００μｍ、５０μｍ～８０μｍ、５５μｍ～７０μｍの間の、または約６０μｍの厚さを残すために十分な深さにわたり将来的な貫通オリフィスの付近のベースのゾーンをアブレーションすることを含み、アブレーションは、極短パルスを利用して実施される。有利には、将来的な貫通オリフィスの付近のベースのゾーンのアブレーションは、レーザを使用して実施され、そのビームは、好ましくはベースの下方表面に送られる。好ましくは、アブレーションは、結果として０．６ｍｍ～１．４ｍｍの間の直径のアブレーション円をもたらす。このエリアの厚さ（貫通オリフィスの付近の厚さである）の制御は、定性的な抵抗測定を確保するために寸法的観点から重要となる。実際に、貫通オリフィスの厚さは、細胞が貫通オリフィスを通過する場合に前記細胞により生成されるパルスの幅と直接的にリンクする。厚さが過剰であり制御されない場合には、複数の細胞が同時に貫通オリフィスを通過するリスクが存在し、したがって直線性に関する測定アーチファクトが発生するリスクがある。

【0088】

次いで、この方法は、例えば特許文献１に記載される方法によるレーザマイクロマシニングで貫通オリフィスを形成することを含み、これによりインピーダンス測定のための完全な円筒状オリフィスを得ることが可能となる。

【0089】

この方法は、成形ステップとアブレーションステップとの間において位置決めツール上にプレフォームを位置決めすることを任意に含んでもよく、したがってこれにより貫通オリフィスアブレーションのアブレーションおよび形成の最中にプレフォームを固定することが可能となる。位置決めツールは、具体的にはキュベットの形状と相補的である凹部を上方表面に有する位置決め支持部を備えてもよい。

【符号の説明】

【0090】

１ 測定キュベット、測定タンク
２ キュベット支持部
３ Ｏリング
４ 励起源、低コヒーレンス励起源
５ 入力成形光学素子、第１の成形光学素子
６ 第１の出力受領光学素子、第１の受領光学素子、受領光学素子
７ 第２の受領光学素子
１０ 測定システム
１１ ベース
１２ 透明側方エンクロージャ
１３ 光学測定チャンバ
１４ サブベース
１５ シールハウジング
１６ 流体取入れ部
２１ 溝
２２ 溝
２３ オリフィス
４１ 光線、集束光線
５１ 第１の光学群
５２ 第２の光学群
５３ ケーシング
１１１ 貫通オリフィス
１１２ 上方表面
１１３ 下方表面
１１４ 集束チャンバ
１２１ 内方表面、方形ベース直円柱内方表面
１２２ 球状外方表面
１２３ 集束レンズ
１２４ 上方表面
１４１ Ｖ字形状センタリング要素
１４２ ショルダ
１４３ 穴
１１２１ 側方表面
１１２２ 小径表面
１１３１ 側方表面
１１３２ 小径表面
１４３１ 外方側部

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】