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7315564グリカン分析のためのブロックされた2-AAを使用するための方法およびキット
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-07-18
(45)【発行日】2023-07-26
(54)【発明の名称】グリカン分析のためのブロックされた2-AAを使用するための方法およびキット
(51)【国際特許分類】
   G01N 33/68 20060101AFI20230719BHJP
   C08B 37/00 20060101ALI20230719BHJP
   G01N 33/66 20060101ALI20230719BHJP
   G01N 33/58 20060101ALI20230719BHJP
【FI】
G01N33/68
C08B37/00 K
G01N33/66 Z
G01N33/58 Z
【請求項の数】 19
(21)【出願番号】P 2020541778
(86)(22)【出願日】2019-01-31
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-05-20
(86)【国際出願番号】 US2019016169
(87)【国際公開番号】W WO2019152724
(87)【国際公開日】2019-08-08
【審査請求日】2022-01-27
(31)【優先権主張番号】62/625,846
(32)【優先日】2018-02-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】399117121
【氏名又は名称】アジレント・テクノロジーズ・インク
【氏名又は名称原語表記】AGILENT TECHNOLOGIES, INC.
(74)【代理人】
【識別番号】100099623
【弁理士】
【氏名又は名称】奥山 尚一
(74)【代理人】
【氏名又は名称】松島 鉄男
(74)【代理人】
【識別番号】100125380
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 綾子
(74)【代理人】
【識別番号】100142996
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 聡二
(74)【代理人】
【識別番号】100166268
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 祐
(74)【代理人】
【識別番号】100170379
【弁理士】
【氏名又は名称】徳本 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100180231
【弁理士】
【氏名又は名称】水島 亜希子
(74)【代理人】
【氏名又は名称】有原 幸一
(72)【発明者】
【氏名】ブラセンコ,セルゲイ
(72)【発明者】
【氏名】アクソー,フランシス・ティー
(72)【発明者】
【氏名】ゲレーロ ナヴァロ,アンドレス
【審査官】大瀧 真理
(56)【参考文献】
【文献】特表平09-505281(JP,A)
【文献】米国特許第08629186(US,B1)
【文献】米国特許出願公開第2004/0248890(US,A1)
【文献】米国特許出願公開第2008/0207487(US,A1)
【文献】特表2017-524128(JP,A)
【文献】特表2013-506115(JP,A)
【文献】特表平08-510551(JP,A)
【文献】特開2012-162516(JP,A)
【文献】特表平07-507394(JP,A)
【文献】米国特許出願公開第2009/0088454(US,A1)
【文献】特表2013-525437(JP,A)
(58)【調査した分野】(Int.Cl.,DB名)
G01N 33/48 - 33/98
C08B 37/00
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
アントラニル酸(「2-AA」)でグリカンを標識するための方法であって、(a)tert-ブチルオキシカルボニル(「Boc」)基に結合した2-AA(「2-AA-Boc」)を得るステップと、
(b)前記2-AA-Bocから前記Boc基を除去するのに十分な時間および温度で前記2-AA-Bocを酸とともにインキュベーションすることによって前記Boc基を除去することにより、2-AAを得るステップと、
(c)前記2-AAおよび前記グリカンを含有する溶液を、前記2-AAが前記グリカンを標識するのを可能にする条件下でインキュベーションすることにより、前記グリカンを2-AAで標識するステップと
を含む、方法。
【請求項2】
前記酸が、トリフルオロ酢酸、ジフルオロ酢酸、または塩酸である、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記2-AA-Bocから前記Boc基を除去するのに十分な前記温度が、50~90℃である、請求項1に記載の方法。
【請求項4】
前記2-AA-Bocから前記Boc基を除去するのに十分な前記時間が、約1時間から一晩である、請求項1に記載の方法。
【請求項5】
前記2-AA-Bocとともにインキュベーションされる前記酸が、無溶媒である、請求項1に記載の方法。
【請求項6】
前記2-AA-Bocとともにインキュベーションされる前記酸が、非プロトン有機溶媒中にある、請求項1に記載の方法。
【請求項7】
前記非プロトン有機溶媒が、ジメチルスルホキシド(「DMSO」)、ジメチルホルムアミド(「DMF」)、またはN-メチルホルムアミドである、請求項6に記載の方法。
【請求項8】
前記酸が、1Mから6Mの濃度で存在する、請求項1に記載の方法。
【請求項9】
前記酸が、水溶液の形態であり、前記方法が、前記ステップ(b)と(c)の間に、(b’)前記2-AAを乾燥して、前記水溶液を除去するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項10】
ステップ(c)の前記インキュベーションが、約50~90℃において行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項11】
ステップ(c)の前記溶液が、還元剤をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項12】
前記還元剤が、シアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはピコリンボランである、請求項11に記載の方法。
【請求項13】
還元的アミノ化によってアントラニル酸(「2-AA」)でグリカンを標識するためのキットであって、(a)tert-ブチルオキシカルボニル(「Boc」)基に結合した2-AA(「2-AA-Boc」)を含有する容器と、(b)前記2-AA-Bocから前記Boc基を除去するのに適した酸を、前記2-AA-Bocから前記Boc基を除去するのに十分な濃度で含有する容器と、(c)還元剤とを含む、キット。
【請求項14】
前記酸が、トリフルオロ酢酸、ジフルオロ酢酸、または塩酸である、請求項13に記載のキット。
【請求項15】
前記ジフルオロ酢酸が、無溶媒であるか、または非プロトン有機溶媒中にある、請求項14に記載のキット。
【請求項16】
前記非プロトン有機溶媒が、ジメチルスルホキシド(「DMSO」)、ジメチルホルムアミド(「DMF」)、またはN-メチルホルムアミドである、請求項15に記載のキット。
【請求項17】
前記酸が、1Mから6Mの濃度で前記非プロトン有機溶媒中に存在する、請求項15に記載のキット。
【請求項18】
前記還元剤が、シアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはピコリンボランである、請求項13に記載のキット。
【請求項19】
さらに前記還元剤が、有機溶媒に溶解している、請求項18に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、2018年2月2日に出願された米国仮特許出願第62/625,846号に対する優先権、およびその利益を主張するものであり、その内容は、あらゆる目的のために引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【0002】
連邦政府資金の記載
適用なし。
【背景技術】
【0003】
生物学的サンプルのグリカンプロファイルを特定することが多くの状況において重要になってきている。例えば、一貫した生物学的特性を確保するために、抗体治療薬などの糖タンパク質のグリカンプロファイルを特定することが必要とされる。さらに、薬剤の収率または特性に悪影響を及ぼす可能性がある発酵条件の変化を防ぐために、そのような治療薬の製造過程においてグリコシル化プロファイルが監視される必要がある。
【0004】
標識グリカンの蛍光を観察すること、または標識グリカンをマススペクトロメトリーに供することなどによる分析によって標識に結合したグリカンを検出することを可能にするさまざまな標識が開発されてきた。糖タンパク質上に存在するN-グリカンは、酵素PNGase Fにより糖タンパク質からN-グリカンを放出し、共有する米国特許第8,124,792号および米国特許第8,445,292号に教示されるものなどの試薬により得られたグリコシルアミンを標識することによって分析されることが多い。グリカンを標識する別の手段は、それらを、蛍光色素2-アミノベンズアミド(「2-AB」)またはアントラニル酸(「2-AA」)による還元的アミノ化に供することである。例えば、Bigge et al., “Nonselective and Efficient Fluorescent Labeling of Glycans Using 2-Amino Benzamide and Anthranilic Acid,” Anal. Biochem. 230:229-238 (1995)を参照されたい。一般に、標識グリカンは、その後、例えば、高速液体クロマトグラフィー(「HPLC」)またはキャピラリー電気泳動によって分離された後、蛍光検出器などの分析手段に供される。
【0005】
2-ABは、還元的アミノ化によってグリカンを標識するために依然として広く使用されているが、この目的のための2-AAの使用は、規制物質法、合衆国法典第21編801条によって課される制約のため、少なくとも米国においてはやや難しくなってきた。以下を参照されたい。アントラニル酸、そのエステル、およびその塩は、規制物質の製造に使用される「リスト1化学物質」として合衆国法典第802条(34)項に列挙されている。リスト1化学物質は、記録管理、流通、および出荷に関してさまざまな要件が課される。2-AAは、2-ABよりもグリカンを標識する感度がわずかに高いと考えられる。グリカン分析に適しているが、アントラニル酸、そのエステル、およびその塩に関する麻薬取締局(「DEA」)規則に従った形態の2-AAを提供する都合がよい方法があれば望ましいと予想される。
【0006】
2-AA、そのエステル、およびその塩の流通および出荷を規制するDEA規則に従いながらも、還元的アミノ化およびグリカンの標識化に利用可能な2-AAを生成する方法およびキットに対するニーズが依然としてある。驚くべきことに、本発明は、これらおよびその他のニーズを満たすと考えられる。
【発明の概要】
【0007】
いくつかの実施形態において、本発明は、アントラニル酸(「2-AA」)でグリカンを標識するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、tert-ブチルオキシカルボニル(「Boc」)基に結合した2-AA(「2-AA-Boc」)を得るステップと、2-AA-BocからBoc基を除去するのに十分な時間および温度で2-AA-Bocを酸とともにインキュベーションすることによってBoc基を除去することにより、2-AAを得るステップと、2-AAおよびグリカンを含有する溶液を、2-AAがグリカンを標識するのを可能にする条件下でインキュベーションすることにより、グリカンを2-AAで標識するステップとを含む。いくつかの実施形態において、酸は、トリフルオロ酢酸、ジフルオロ酢酸、または塩酸である。いくつかの実施形態において、酸は、ジフルオロ酢酸(「DFA」)である。いくつかの実施形態において、2-AA-Bocから前記Boc基を除去するのに十分な温度は、50~90℃である。いくつかの実施形態において、2-AA-BocからBoc基を除去するのに十分な温度は、約70℃である。いくつかの実施形態において、2-AA-BocからBoc基を除去するのに十分な時間は、約1時間から一晩である。いくつかの実施形態において、前記2-AA-Bocとともにインキュベーションされる酸は、無溶媒である。いくつかの実施形態において、2-AA-Bocとともにインキュベーションされる酸は、非プロトン有機溶媒中にある。いくつかの実施形態において、非プロトン有機溶媒は、ジメチルスルホキシド(「DMSO」)、ジメチルホルムアミド(「DMF」)、またはN-メチルホルムアミドである。いくつかの実施形態において、非プロトン有機溶媒は、ジメチルスルホキシドである。いくつかの実施形態において、酸は、1Mから6Mの濃度で存在する。いくつかの実施形態において、酸は、DFAであり、約4Mの濃度で存在する。いくつかの実施形態において、酸は、水溶液の形態であり、本方法は、酸が2-AA-Bocとともにインキュベーションされた後に2-AAを乾燥して、2-AAがグリカンとともにインキュベーションされる前に水溶液を除去するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、グリカンとの2-AAのインキュベーションは、約50~90℃において行われる。いくつかの実施形態において、グリカンとの2-AAのインキュベーションは、約65℃において行われる。いくつかの実施形態において、2-AAおよびグリカンの溶液は、還元剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはピコリンボランである。
【0008】
実施形態の第2の群において、本発明は、還元的アミノ化によってアントラニル酸(「2-AA」)でグリカンを標識するためのキットを提供する。いくつかの実施形態において、本キットは、tert-ブチルオキシカルボニル(「Boc」)基に結合した2-AA(「2-AA-Boc」)を含有する容器と、2-AA-BocからBoc基を除去するのに適した酸を、2-AA-BocからBoc基を除去するのに十分な濃度で含有する容器とを含む。いくつかの実施形態において、Boc基を除去するのに適した酸は、無水条件下でBoc基を除去するのに適している。いくつかの実施形態において、酸は、トリフルオロ酢酸、ジフルオロ酢酸、または塩酸である。いくつかの実施形態において、酸は、ジフルオロ酢酸である。いくつかの実施形態において、ジフルオロ酢酸は、無溶媒である。いくつかの実施形態において、酸は、非プロトン有機溶媒中にある。いくつかの実施形態において、非プロトン有機溶媒は、ジメチルスルホキシド(「DMSO」)、ジメチルホルムアミド(「DMF」)、またはN-メチルホルムアミドである。いくつかの実施形態において、非プロトン有機溶媒は、DMSOである。いくつかの実施形態において、酸は、1Mから6Mの濃度で非プロトン有機溶媒中に存在する。いくつかの実施形態において、酸は、約4Mの濃度で非プロトン有機溶媒中に存在する。いくつかの実施形態において、2-AA-Bocの量は、5~10mgである。いくつかの実施形態において、本キットは、還元剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムである。いくつかの実施形態において、還元剤は、ピコリンボランである。いくつかの実施形態において、還元剤は、有機溶媒に溶解している。いくつかの実施形態において、溶媒は、DMSOである。
【発明を実施するための形態】
【0009】
還元的アミノ化は、分析のためにグリカンを標識する一般的な方法である。2つのフルオロフォア、アントラニル酸(2-アミノ安息香酸、または「2-AA」)および2-アミノベンズアミド、すなわち「2-AB」は、グリカンに結合するときの安定性および感度のため、還元的アミノ化によってグリカンを標識するために広く使用されてきた。Sigma-Aldrichウェブサイトによると、2-AAは、2-ABよりもグリカンを標識する感度がわずかに高い。不運にも、背景において述べたとおり、麻薬取締局(「DEA」)は、規制物質メタカロンの合成に使用することもできるため、アントラニル酸、そのエステル、およびその塩の使用に対して制約および記録管理要件を課した。これらの制約は、米国においてグリカン標識および分析における合法の使用のために2-AAを使用することをより困難にした。
【0010】
驚くべきことに、本発明は、アントラニル酸またはアントラニル酸のエステルもしくは塩ではない2-AAの誘導体の輸送および使用を可能にするが、そのような標識化のための標準的なワークフローのわずかな改変だけでグリカンを標識するための誘導体の導入および使用を可能にする、分析のためにグリカンを標識するキットおよび方法を提供する。
【0011】
本発明のキットおよび方法は、tert-ブチルオキシカルボニル(「Boc」)基で保護されたアミンを有する2-AAを利用する。有機合成においてアミン基を保護するためにBoc基を使用することは、ペプチド合成の手順において周知である。一般に、Boc保護基が付加され、所望の合成ステップが実施され、Boc基を有する化合物を酸とともにインキュベーションすることによって保護基が除去される。酸により、インキュベーションは、周囲温度であってもよいが、50~90℃の温度が好ましい。(参照の都合上、Boc基が2-AA分子のアミン部分に共有結合した2-AAは、本明細書において「2-AA-Boc」、「ブロックされた2-AA」または「保護された2-AA」と言及される場合もある。2-AA-BocからのBoc基の除去は、2-AAを「脱保護すること」または2-AAを「脱ブロックすること」と言及される場合もある)。
【0012】
ペプチド合成と関連したアミンの保護および脱保護の使用は周知であるが、2-AAのブロックおよび脱ブロックは、分析を実施するための工程の数および時間を減らしたい技術者の通常の要望とは対照的に標識化ワークフローに工程および時間を追加するため、全般的に、または特にグリカン標識化における2-AAの使用に関して、グリカンの標識化および分析に使用されてこなかった。したがって、2-AA上のアミンをブロックすること、または2-AAのBoc保護型を使用することは直観に反している。しかし、ここで、2-AAのBocとの結合は、2-AAまたは2-AAのエステルもしくは塩ではない化合物を作り出すため、List 1 Chemicalではないと考えられる。さらに、脱保護ステップは、2-AAが酸との混合物中に存在するという結果になる。酸の2-AAとの組み合わせは、還元的アミノ化によってグリカンを標識するのに有用である。
【0013】
Boc保護基の付加および除去
t-Boc保護基の付加および除去は、数十年も行われてきた。例えば、Lundt et al., “Removal of t-butyl and t-butoxycarbonyl protecting groups with trifluoroacetic acid,” Chem. Biol. & Drug Design, 12(5):258-268 (1978);Atherton et al., J. Chem. Soc., Chem. Commun., 13:537-539 (1978);Hemmasi and Bayer, Int J Pept Protein Res. 9(l):63-70 (1977);Schnolzer et al., “In situ neutralization in Boc-chemistry solid phase peptide synthesis. Rapid, high yield assembly of difficult sequences,” Int J Pept Protein Res. 1992 Sep-Oct, 40(3-4): 180-93;およびHan et al., “Fast, efficient and selective deprotection of tert-butoxycarbonyl (Boc) group using HCl/dioxane (4 m),” J. Peptide Res., 58, 338-341 (2001)を参照されたい。Boc保護基の付加および除去は、例えば、Green and Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley-Interscience, NY (1999), pp. 518-525および736-739に全般的に教示される。
【0014】
Boc保護2-AAは、例えば、それを「2-(Boc-アミノ)安息香酸」と列記しているSigma Aldrich Corp.(セントルイス、ミズーリ州)、およびBachem(Bachem Americas, Inc.、トーランス、カリフォルニア州、カタログ番号A-3240)から商業的に入手可能である。あるいは、Boc基は、公知の技術によって2-AAなどの化合物に付加することができる。例えば、ウィキペディアには、Boc保護基は、「炭酸水素ナトリウムなどの塩基の存在下においてジ-tert-ブチルジカーボネートを使用して水性条件下で付加することができる。アミンの保護はまた、塩基として4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)を使用してアセトニトリル溶液中で達成することができる」と示されている。その記事には、「無溶媒もしくはジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸、またはメタノール中のHCl」などの強酸を使用することによってBoc基を除去できることがさらに報告されている。これは、保護された生成物の3Mの塩酸および酢酸エチルによる周囲温度での30分間の脱保護、塩酸水溶液およびトルエンを伴う保護された化合物の65℃における加熱、ならびに保護された化合物のジクロロメタンおよびトリフルオロ酢酸(「TFA」)の50/50混合物中への溶解の教示としてさまざまな研究報告をまとめている。
【0015】
上で挙げたSchnolzerの参考文献は、100%TFAを使用したアミノ酸からのBoc保護基の急速な除去について教示している。上述のとおり、脱保護プロトコルは、一般に3Mの塩酸またはトリフルオロ酢酸などの強酸の使用を必要とする。
【0016】
当該技術分野において知られているいくつかの脱保護スキームは、水溶液の酸を使用してBoc基を除去する。本発明の方法およびキットに水溶液を使用することができる(水溶液の酸は、本明細書において「酸性水溶液」と呼ばれる場合もある)。続くグリカンの還元的アミノ化は無水条件下で実施されなければならないため、これらの方法には、2-AAが脱保護された後に水を除去するための「乾燥」ステップが使用される。好適な実施形態において、酸は、無溶媒であるか、または2-AAの脱ブロック後、目的とするグリカンの標識化に先立って除去される必要がないよう、還元的アミノ化と適合したジメチルスルホキシド(「DMSO」)、ジメチルホルムアミド(「DMF」)、もしくはN-メチルホルムアミドなどの非プロトン有機溶媒中にあるかのいずれかである。テトラヒドロフランを使用することもできるが、それは、より揮発性のため、あまり好ましくない。一部の好適な実施形態において、有機溶媒は、DMSOである。選択された酸および有機溶媒の混合物は、本明細書において「酸溶液」と呼ばれる場合もある。
【0017】
無溶媒または有機溶媒中のいずれかの酸の使用は、2-AAの非ブロック化と、それに続く脱ブロックされたばかりの2-AAを使用したグリカンの還元的アミノ化との間の「乾燥」ステップの必要性を排除するため、好ましい。述べたとおり、酸は、無溶媒で使用することができる。有機溶媒が使用される場合、酸は、好ましくは1Mから6Mの濃度で使用され、約3~5Mがより好ましく、約4Mがさらにより好ましく、「約」は、ここでは±0.25Mを意味する。
【0018】
好適な実施形態において、2-AA-Bocは、ブロックされた2-AAからBoc基を除去するのに十分な時間および温度でそれを酸、酸性水溶液、または酸溶液とともにインキュベーションすることによって脱保護される。2-AA-Bocが酸性水溶液中で脱保護される場合、その後、「乾燥」ステップが使用されて、脱保護された2-AAをすぐにグリカンの標識化ができる無水条件に残す。
【0019】
いくつかの実施形態において、2-AAの非ブロック化および2-AAによるグリカンの標識化は、同じ容器で実施される(いわゆる、「ワンポット」手順)。これは、それぞれの移動が分析されるグリカンの一部を減少させる可能性がある、反応物の別の容器への複数回の移動を回避する。例えば、2-AA-Bocは、バイアル中で酸、酸性水溶液、または酸溶液と混合された後、バイアルを1時間から一晩の所望の時間、加熱ブロックに入れてもよい。バイアルは、一般に50~90℃に加熱される。一部の好適な実施形態において、バイアルは、約70℃に加熱される。温度に関する「約」は±5℃を意味する。
【0020】
酸性水溶液を使用して2-AA-Bocが脱保護された場合、その後、それは、一般に乾燥された後、標識される対象のグリカンの添加に先立って有機溶媒が添加される。2-AA-Bocが、Boc基を除去するのに十分な時間および温度で無水条件下で酸とともにインキュベーションすること(無溶媒の酸または非プロトン有機溶媒中の酸のいずれかとともにインキュベーションすることなど)によって脱保護された好適な実施形態において、グリカンサンプルは、無水溶液に直接添加され、還元的アミノ化によって脱ブロックされたばかりの2-AAで標識することができる。例えば、2-AA-Bocは、下記スキーム1に示されるとおり、それをTFAなどの酸とともにDMSO中、70℃の温度で一晩インキュベーションすることによって非ブロック化されてもよい。
【0021】
【化1】
【0022】
当業者は認識していると予想されるように、保護されたアミノ酸からBoc基を除去するために、特定の酸を使用するためのインキュベーション時間および温度の他の組み合わせが、当該技術分野において知られており、2-AA-BocからBoc基を除去する目的に容易に適合させることができる。ジフルオロ酢酸(DFA)は、ペプチド合成に使用されるBoc基を非ブロック化する際に一般的に使用されるTFA程強い酸ではないため、DFAが使用される場合、2-AAを非ブロック化するためのインキュベーション時間、もしくは温度、またはその両方は、DFAの弱い強度を反映するよう、酸としてTFAを使用したプロトコルに使用されるものを超えて適度に増加させられなければならない。任意の特定の時間および温度が、2-AA-Bocの完全な非ブロック化をもたらすかどうかを判定するために、任意の特定の溶媒中の任意の特定の濃度の任意の特定の酸を用いて容易に試験することができる。2-AAおよび2-AA-Bocはともに蛍光であるため、得られた生成物は、例えば、HPLCを実施し、溶出された生成物の蛍光を調べ、2-AAおよび2-AA-Bocの相対量を求めることによって、脱保護の完全性に関して容易に試験することができる。
【0023】
還元的アミノ化によるグリカンの標識化の過程に還元剤が存在するのが好ましい。そのような標識化における還元剤の使用は、当該技術分野において周知であるため、ここでは簡単に記載するに留める。グリカンの還元的アミノ化への使用に適した還元剤としては、シアノ水素化ホウ素ナトリウムおよびピコリンボランが挙げられる。還元剤は、一般にDMSOまたはテトラヒドロフラン(THF)などの有機溶媒中にあるが、一部のワークフローでは、還元剤が固形物であるうちに還元剤に酸または酸溶液が添加されて、その後、還元剤を酸または酸溶液に溶解させてもよい。還元剤は、1:1、1:2、1:3、または1:4の還元剤を含有する溶液対2-AAおよび酸または酸溶液を含有する溶液の比で一般に添加される。還元剤の濃度は、一般に最終混合物中で0.5から2Mである。
【0024】
脱ブロックされた2-AAは、目的とするグリカンの還元的アミノ化のための通常のワークフローに使用することができる。2-AAは、一般に0.1Mから2Mの濃度、より好ましくは、0.3Mから1Mの濃度、さらにより好ましくは、約0.3Mから約0.6Mの濃度、最も好ましくは、約0.4Mの濃度でグリカンの標識化に使用され、「約」は、ここでは±0.05Mを意味する。
【0025】
キット
本発明は、2-AA-Bocと、2-AA-Bocを脱ブロックするための試薬とを含むキットを提供する。例えば、本キットは、選択された回数のグリカン分析に適した量の2-AA-Bocを含有する1つ以上の容器を提供してもよい。
【0026】
例えば、グリカンは、96ウェルプレートなどのマルチウェルプレートを使用して2-AAによって標識されてもよい。都合よく、容器中の2-AA-Bocの量は、脱ブロックされたときに、得られた2-AAの量が96ウェルプレートのウェル中のグリカンサンプルを標識するのに十分であるよう選択されてもよい。グリカンを標識する際に使用される2-AAの量は非常に少なく、約40mgの2-AAは、一般に96ウェルプレートのすべてのウェル中のグリカンを標識するのに十分である。本キットは、2-AA-Bocの脱ブロックに使用するために選択された酸、酸性水溶液、または酸溶媒溶液を含む1つ以上の容器をさらに含む。都合よく、2-AA-Bocを含む容器、酸、酸性水溶液、もしくは酸溶媒溶液を含む容器、または両方の容器は、2-AA-Bocおよび酸または酸を含む溶液が一緒に混合されたら、得られた混合物を含む容器が、加熱ブロックに入れられ、Boc基を除去するために選択された温度でインキュベーションされて、脱ブロックされた2-AAが得られるような大きさにされる。
【0027】
標識化のための脱ブロックされた2-AAの容器は、一般に5~30mgのおよそ0.4Mの2-AAの溶液を含有する。同じ量および濃度の2-AA-Bocを含有する容器は、脱ブロックされると、同等量の標識化のための2-AAをもたらすことになる。
【0028】
好適な実施形態において、本キットは、容器中で2-AA-Bocおよび酸が既に混合された状態で出荷または流通されない。それは、流通および出荷中に酸とともにいくらかの脱ブロックされた2-AAを含む混合物をもたらすことになるためである。2-AA-Bocおよび酸は、グリカンサンプルの標識化および分析が実施される場所でのみ一緒に混合され、一般にグリカンサンプルの還元的アミノ化を実施する直前に行われることが見込まれる。
【0029】
本キットは、2-AAによる還元的アミノ化に有用な還元剤をさらに含んでもよい。例えば、本キットは、還元剤としてシアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはピコリンボランを含んでもよい。還元剤は、一般に酸または酸溶液の2-AA-Bocとのインキュベーションに先立って、酸または酸を含む溶液に添加されることになる。
【0030】
本キットは、好ましくは、提供される酸または酸溶液を使用して2-AA-Bocを脱ブロックするための時間および温度条件を含む、脱ブロックされた2-AAをもたらすために含まれる試薬の使用に関する説明書をさらに含む。
【0031】
2-AAによって標識されたグリカンの分析
2-AA-Bocの脱保護が起こると、得られた脱ブロックされた2-AAは、Abo et al., “Determination of monosaccharides derivatized with 2-aminobenzoic Acid by capillary electrophoresis,” Methods Mol Biol. 2013; 984:45-50、Rustighi et al., “Analysis of N-acetylaminosugars by CE: a comparative derivatization study,” Electrophoresis. 2009 Aug; 30(15):2632-9、またはJiang et al., Anal Chim Acta. 2017 Apr 15; 962:32-40に記載されているものなどの標準的な技術によって目的とするグリカンを標識するために使用することができる。都合よく、分析されるグリカン(単数または複数)は、脱ブロックされたばかりの2-AAを含有する受入容器に添加されてもよく、上で挙げた参考文献に記載されているものなどのグリカンを標識するための標準的で周知のプロトコルに従った還元的アミノ化に供される。反対に、脱ブロックされたばかりの2-AAは、標識されるグリカンを含有する別の容器にピペットで分注されるか、注がれるか、または別の方法で移されてもよく、グリカンの還元的アミノ化はその別の容器において実施することができる。場合により、あらゆる過剰な標識を除去するために浄化ステップが実施されてもよい。2-AAによる還元的アミノ化によって標識されたグリカンの浄化のための一般的な方法としては、親水性相互作用液体クロマトグラフィー、すなわち「HILIC」、または黒鉛化炭素の使用が挙げられる。標識グリカンは、その後、上で挙げた参考文献中のものなどの標準的な方法によって分析することができる。例えば、標識グリカンは、受入容器からピペットで分注されるか、または溶出され、高速液体クロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動による分離に供され、分離された標識グリカンの蛍光を観察することによって標識グリカンの存在が検出されてもよい。
【実施例
【0032】
[実施例1]
この実施例は、2-AA-Bocを脱保護し、得られた非ブロック化2-AAをグリカン標識化プロトコルに使用する例となるワークフローを記載する。
【0033】
5mgの2-AA-Boc粉末をバイアルに入れ、そこに、0.15mLの4M TEAのDMSO溶液を添加する。2-AA-Bocが溶液に溶解したら、バイアルを加熱ブロックのウェルに入れ、70℃で一晩インキュベーションして、2-AA-BocからBoc基を除去し、脱ブロックされた2-AAを得る。バイアルを加熱ブロックから取り除き、冷ました後、還元剤をグリカン標識化のための調製物に添加する。新しく脱ブロックされた2-AAを含有する5μLの溶液をバイアルにピペットで分注し、5μLの2Mシアノ水素化ホウ素ナトリウムのDMSO溶液を添加する。その後、酵素消化によって目的とする糖タンパク質から遊離した乾燥グリカンをバイアルに添加し、新しく脱ブロックされた2-AAおよび還元剤を含有する溶液に再溶解させる。バイアルを必要に応じてかき混ぜ、またはボルテックスして、すべての乾燥グリカンが溶液と接触し、再溶解したことを確認する。その後、溶液に溶解したばかりのグリカンを含有するバイアルを加熱ブロックのウェルに入れ、65℃で3時間インキュベーションして、それにより、グリカンの還元的アミノ化および標識化を引き起こす。
【0034】
本明細書に記載される例および実施形態は、説明の目的のために過ぎず、それを鑑みさまざまな改変または変更が当業者に示されることになるが、それらは本出願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲に含まれることが理解される。本明細書中で引用されたすべての刊行物、特許および特許出願は、あらゆる目的のために引用することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする。
出願時の特許請求の範囲は以下の通り。
[請求項1]
アントラニル酸(「2-AA」)でグリカンを標識するための方法であって、(a)tert-ブチルオキシカルボニル(「Boc」)基に結合した2-AA(「2-AA-Boc」)を得るステップと、
(b)前記2-AA-Bocから前記Boc基を除去するのに十分な時間および温度で前記2-AA-Bocを酸とともにインキュベーションすることによって前記Boc基を除去することにより、2-AAを得るステップと、
(c)前記2-AAおよび前記グリカンを含有する溶液を、前記2-AAが前記グリカンを標識するのを可能にする条件下でインキュベーションすることにより、前記グリカンを2-AAで標識するステップと
を含む、方法。
[請求項2]
前記酸が、トリフルオロ酢酸、ジフルオロ酢酸、または塩酸である、請求項1に記載の方法。
[請求項3]
前記酸が、ジフルオロ酢酸(「DFA」)である、請求項2に記載の方法。
[請求項4]
前記2-AA-Bocから前記Boc基を除去するのに十分な前記温度が、50~90℃である、請求項1に記載の方法。
[請求項5]
前記2-AA-Bocから前記Boc基を除去するのに十分な前記温度が、約70℃である、請求項4に記載の方法。
[請求項6]
前記2-AA-Bocから前記Boc基を除去するのに十分な前記時間が、約1時間から一晩である、請求項1に記載の方法。
[請求項7]
前記2-AA-Bocとともにインキュベーションされる前記酸が、無溶媒である、請求項1に記載の方法。
[請求項8]
前記2-AA-Bocとともにインキュベーションされる前記酸が、非プロトン有機溶媒中にある、請求項1に記載の方法。
[請求項9]
前記非プロトン有機溶媒が、ジメチルスルホキシド(「DMSO」)、ジメチルホルムアミド(「DMF」)、またはN-メチルホルムアミドである、請求項8に記載の方法。
[請求項10]
前記非プロトン有機溶媒が、ジメチルスルホキシドである、請求項9に記載の方法。
[請求項11]
前記酸が、1Mから6Mの濃度で存在する、請求項1に記載の方法。
[請求項12]
前記酸が、DFAであり、約4Mの濃度で存在する、請求項11に記載の方法。
[請求項13]
前記酸が、水溶液の形態であり、前記方法が、前記ステップ(b)と(c)の間に、(b’)前記2-AAを乾燥して、前記水溶液を除去するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
[請求項14]
ステップ(c)の前記インキュベーションが、約50~90℃において行われる、請求項1に記載の方法。
[請求項15]
ステップ(c)の前記インキュベーションが、約65℃において行われる、請求項1に記載の方法。
[請求項16]
ステップ(c)の前記溶液が、還元剤をさらに含む、請求項1に記載の方法。
[請求項17]
前記還元剤が、シアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはピコリンボランである、請求項15に記載の方法。
[請求項18]
還元的アミノ化によってアントラニル酸(「2-AA」)でグリカンを標識するためのキットであって、(a)tert-ブチルオキシカルボニル(「Boc」)基に結合した2-AA(「2-AA-Boc」)を含有する容器と、(b)前記2-AA-Bocから前記Boc基を除去するのに適した酸を、前記2-AA-Bocから前記Boc基を除去するのに十分な濃度で含有する容器とを含む、キット。
[請求項19]
前記Boc基を除去するのに適した前記酸が、無水条件下で前記Boc基を除去するのに適している、請求項18に記載のキット。
[請求項20]
前記酸が、トリフルオロ酢酸、ジフルオロ酢酸、または塩酸である、請求項19に記載のキット。
[請求項21]
前記酸が、ジフルオロ酢酸である、請求項20に記載のキット。
[請求項22]
前記ジフルオロ酢酸が、無溶媒である、請求項21に記載のキット。
[請求項23]
前記酸が、非プロトン有機溶媒中にある、請求項18に記載のキット。
[請求項24]
前記非プロトン有機溶媒が、ジメチルスルホキシド(「DMSO」)、ジメチルホルムアミド(「DMF」)、またはN-メチルホルムアミドである、請求項23に記載のキット。
[請求項25]
前記非プロトン有機溶媒が、DMSOである、請求項23に記載のキット。
[請求項26]
前記酸が、1Mから6Mの濃度で前記非プロトン有機溶媒中に存在する、請求項23に記載のキット。
[請求項27]
前記酸が、約4Mの濃度で前記非プロトン有機溶媒中に存在する、請求項23に記載のキット。
[請求項28]
前記2-AA-Bocの量が、5~10mgである、請求項18に記載のキット。
[請求項29]
還元剤をさらに含む、請求項18に記載のキット。
[請求項30]
前記還元剤が、シアノ水素化ホウ素ナトリウムである、請求項29に記載のキット。
[請求項31]
前記還元剤が、ピコリンボランである、請求項29に記載のキット。
[請求項32]
さらに前記還元剤が、有機溶媒に溶解している、請求項29に記載のキット。
[請求項33]
さらに前記溶媒が、DMSOである、請求項32に記載のキット。