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特許7315729２－ペンチルフランを有効成分として含有する退行性脳疾患の治療用組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-07-18
(45)【発行日】2023-07-26
(54)【発明の名称】２－ペンチルフランを有効成分として含有する退行性脳疾患の治療用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/341 20060101AFI20230719BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20230719BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230719BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230719BHJP
【ＦＩ】
A61K31/341
A23L33/10
A61P25/28
A61P43/00 107
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2021577079
(86)(22)【出願日】2020-06-26
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-14
(86)【国際出願番号】 KR2020008347
(87)【国際公開番号】W WO2020263012
(87)【国際公開日】2020-12-30
【審査請求日】2021-12-24
(31)【優先権主張番号】10-2019-0077257
(32)【優先日】2019-06-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】516280679
【氏名又は名称】テグ・ギョンブク・インスティテュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ジェ・ヒュン・ク
(72)【発明者】
【氏名】ナ・ヘ・イ
(72)【発明者】
【氏名】ユン・ギュ・ジェ
【審査官】春日 淳一
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１６－５１５５８５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／１３０９３３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Food and Chemical Toxicology，2013年，Vol.59，p.586-594
【文献】Medical Mycology，2008年，Vol.46，p.209-215
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ，Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
２－ペンチルフラン（ｐｅｎｔｙｌｆｕｒａｎ）、その溶媒和物、立体異性体またはこれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含み、前記２－ペンチルフランは、小膠細胞を活性化させる、アルツハイマー病の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項2】
前記２－ペンチルフランは、下記化学式１で表される、請求項１に記載の薬学的組成物。【化1】
【請求項3】
前記組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項4】
前記活性化した小膠細胞は、食作用が促進され、これによってアルツハイマー病を誘発する物質を減少させる、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項5】
２－ペンチルフラン（ｐｅｎｔｙｌｆｕｒａｎ）、その溶媒和物、立体異性体またはこれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含み、前記２－ペンチルフランは、小膠細胞を活性化させる、アルツハイマー病の予防または改善用健康機能食品。
【請求項6】
前記２－ペンチルフランは、下記化学式１で表される、請求項５に記載のアルツハイマー病の予防または改善用健康機能食品。【化2】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
退行性脳疾患の治療用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
退行性脳疾患は、多様な原因によって脳神経に一時的または持続的な損傷が発生して、次第に精神または運動機能の全般的な障害が現れることを特徴とする。退行性脳疾患と報告された疾患は、約７０種以上があるが、そのうち代表的なものは、認知症、アルツハイマー、パーキンソン病、または前側頭葉退行病などがよく知られている。
【0003】
そのうち、認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ）は、誘発率の高い疾患の一つであり、記憶力、注意力、言語機能、視空間能力などに大脳皮質機能障害が発生して、認知症患者が日常、社会生活を営むのに大きな困難に直面することになる。
【0004】
認知症は、発病原因が正確に明らかにされていないが、老化過程でベータアミロイド（β－ａｍｙｌｏｉｄ；Ａβ）タンパク質が脳に蓄積されてくっつき合って発病するアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）、脳動脈硬化により発生する血管性認知症、アルコール性認知症などがその原因として提起されている。そのうち、アルツハイマー病による認知症が６０％以上と最も多いが、アルツハイマー病は、大脳皮質（ｃｏｒｔｅｘ）または海馬（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）に発生する脳萎縮、老人斑（ｓｅｎｉｌｅ ｐｌａｑｕｅ）、神経原線維のもつれ（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅｓ）および顆粒空胞変性（ｇｒａｎｕｌｏｖａｃｕｏｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、平野小体（Ｈｉｒａｎｏ ｂｏｄｙ）などの組織学的所見を特徴とする。Ａβは、老人斑の主な構成成分であって、Ａβの沈着は、アルツハイマー病が発生する重要な原因と推定されている。
【0005】
アルツハイマー病（ＡＤ）の症状は、ベータ－アミロイド（Ａβ）の沈着による細胞毒性だけでなく、コリン神経系のシナプス障害とも関連がある。コリン神経系の機能障害は、アルツハイマー患者の記憶と認知機能障害に寄与することが知られている。前脳のＭｅｙｎｅｒｔ基底核（ｂａｓａｌ ｎｕｃｌｅｕｓ ｏｆ Ｍｅｙｎｅｒｔ）コリン性ニューロンは、側頭葉、海馬、および扁桃体（ａｍｙｇｄａｌａ）とともに記憶および認知能力に関連するが、アルツハイマー患者の脳では、側頭葉で７８％、海馬で６０％、Ｍｅｙｎｅｒｔ基底核では６７％まで神経細胞が減少することが知られている。脳細胞が細胞毒性により損傷を受けることになると、情報の伝達、すなわち神経伝達物質の代謝に障害が発生することになり、これは、記憶認知障害を起こす原因となる。すでに多くの研究者らがアセチルコリン（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ；ＡＣｈ）とその合成に関係する酵素（ｃｈｏｌｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）がアルツハイマー病において選択的に減少することが観察されることを着実に報告してきた。さらに、アルツハイマー病患者の脳では、正常ヒトの脳機能に比べてニコチン性アセチルコリン受容体（ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）およびムスカリン性アセチルコリン受容体（ｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の減少だけでなく、コリンの再吸収とアセチルコリンの分泌機能が低下していることが知られている。
【0006】
現在までＦＤＡなどを通して公式的に認知症治療剤として許可された薬物の大部分は、アルツハイマーによる認知症を対象としているが、その薬物作用点がアセチルコリンエステラーゼ（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）に制限されている。しかしながら、この酵素を抑制することは、アセチルコリン低下現象を抑制して正常生活が可能に誘導する役割をするだけてあり、認知症を起こす根本的な原因を治療する方法ではない。その他に、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸 （Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ａｓｐａｒｔａｔｅ；ＮＭＤＡ）受容体拮抗剤を利用する薬物療法があるが、これも、アルツハイマー病患者においてＡＣｈの減少に基づくものであって、同様に根本的な治療方法ではない。すなわち、今までは認知症の発病原因を根本的に戻して正常状態に作る薬物はないのが現状である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
一態様は、２－ペンチルフラン（Ｐｅｎｔｙｌｆｕｒａｎ）またはその溶媒和物、立体異性体またはこれらの薬学的に許容可能な塩を含む、退行性脳疾患の予防または治療用組成物を提供することにある。
【0008】
他の態様は、２－ペンチルフラン（Ｐｅｎｔｙｌｆｕｒａｎ）またはその溶媒和物、立体異性体またはこれらの薬学的に許容可能な塩を含む退行性脳疾患の予防または改善用健康機能食品を提供することにある。
【0009】
本出願の他の目的およびメリットは、添付の請求範囲および図面とともに下記の詳細な説明によりさらに明確になるだろう。本明細書に記載されていない内容は、本出願の技術分野または類似の技術分野における熟練者なら十分に認識し類推できることであるから、その説明を省略する。
【課題を解決するための手段】
【0010】
一態様は、２－ペンチルフラン、その溶媒和物、立体異性体またはこれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する退行性脳疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。
【0011】
前記２－ペンチルフランは、下記化学式１で表されるものであってもよい。
【0012】
【化1】
【0013】
本明細書において用語「立体異性体（ｓｔｅｒｅｏｉｓｏｍｅｒ）」は、同じ化学式を有し、構成する原子間の結合順序も同一であるが、三次元構造が異なる分子を意味し、鏡像異性体（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ）と部分立体異性体（ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒ）とに分けられる。また、一具体例による前記ピリドン誘導体化合物の立体化学的異性体の形態は、化学式１の化合物が有しうるすべての可能な化合物を定義する。別途言及したり指摘しない場合、化合物の化学的名称は、すべての可能な立体化学的異性体形態の混合物を指し、前記混合物は、基本分子構造のすべての部分立体異性体および鏡像異性体を含む。特に、立体中心は、Ｒ－またはＳ－配位を有してもよく、２価シクリック（部分的に）飽和ラジカル上の置換基は、シス－またはトランス－配位を有してもよい。二重結合を含む化合物は、前記二重結合においてＥまたはＺ－立体化学を有してもよい。前記化学式１で表される化合物の立体化学的異性体の形態は、前記発明の範囲内に含まれるものと意図される。
【0014】
本明細書において用語「薬学的に許容可能な」は、過度な毒性、刺激、アレルギー反応またはその他問題点または合併症なしで利益／リスクの比が合理的なので、対象体（例：ヒト）の組織と接触して使用するのに適しており、健全な医学的判断の範疇以内の組成物を意味する。
【0015】
本明細書において使用された用語「薬学的に許容可能な塩」は、薬学的に許容可能な遊離酸（ｆｒｅｅ ａｃｉｄ）により形成された酸付加塩が有用である。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜硝酸または亜リン酸のような無機酸類と脂肪族モノおよびジカルボキシレート、フェニル－置換されたアルカノエート、ヒドロキシアルカノエートおよびアルカンジオエート、芳香族酸類、脂肪族および芳香族スルホン酸類のような無毒性有機酸から得る。このような薬学的に無毒な塩類としては、サルフェート、ピロサルフェート、バイサルフェート、サルファイト、バイサルファイト、ニトラート、ホスフェート、モノハイドロゲンホスフェート、ジハイドロゲンホスフェート、メタホスフェート、ピロホスフェートクロリド、ブロミド、ヨージド、フルオライド、アセテート、プロピオネート、デカノエート、カプリレート、アクリレート、ホルメート、イソブチレート、カプレート、ヘプタノエート、プロピオレート、オキサレート、マロネート、スクシネート、スベレート、セバケート、フマレート、マリエート、ブチン－１，４－ジオエート、ヘキサン－１，６－ジオエート、ベンゾアート、クロロベンゾアート、メチルベンゾアート、ジニトロベンゾアート、ヒドロキシベンゾアート、メトキシベンゾアート、フタレート、テレフタレート、ベンゼンスルホナート、トルエンスルホナート、クロロベンゼンスルホナート、キシレンスルホナート、フェニルアセテート、フェニルプロピオネート、フェニルブチレート、シトレート、ラクテート、β－ヒドロキシブチレート、グリコールレート、マレート、タルトレート、メタンスルホナート、プロパンスルホナート、ナフタレン－１－スルホナート、ナフタレン－２－スルホナートまたはマンデラートを含んでもよいが、これらに限定されない。
【0016】
前記酸付加塩は、通常の方法、例えば、前記化学式１または化学式２で表される化合物を過量の酸水溶液中に溶解させ、この塩を水混和性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンまたはアセトニトリルを使って沈殿させて製造することができる。また、この混合物から溶媒や過量の酸を蒸発させた後、乾燥させたり、または析出された塩を吸入ろ過させて製造することもできる。
【0017】
また、塩基を使って薬学的に許容可能な金属塩を製造することもできる。アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩は、例えば、化合物を過量のアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物溶液中に溶解し、非溶解化合物塩をろ過し、ろ液を蒸発、乾燥させて得ることができる。この際、金属塩としては、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩を製造することが薬学的に適合する。これに対応する銀塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩を適当な銀塩（例、硝酸銀）と反応させて得ることができる。
【0018】
本明細書において用語「退行性脳疾患」は、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）と他の類型の認知症（ｄｉｍｅｎｔｉａｓ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｅａｓｅ）と関連疾患（ＰＤ－ｒｅｌａｔｅｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、プリオン病、運動ニューロン疾患（Ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、ルー・ゲーリック病（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、ニーマン・ピック病（Ｎｉｅｍａｎｎ－Ｐｉｃｋ ｄｉｓｅａｓｅ）、脊髄性筋萎縮症（Ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、脊髄小脳失調症（ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ａｔａｘｉａ）および脳卒中からなる群から一つ以上を含むものであってもよい。退行性脳疾患の発病原因と成分との関係によって、前記薬学組成物の退行性脳疾患の予防および治療のための有効物質として使用できる。
【0019】
本明細書において使用された用語「予防」は、本発明による薬学組成物の投与により退行性脳疾患関連疾患を抑制させたり発病を遅延させるすべての行為を意味する。
【0020】
本明細書において使用された用語「治療」は、本発明による薬学組成物の投与により退行性脳疾患関連疾患に対する症状が好転したり有益に変更されるすべての行為を意味する。
【0021】
他の具体例において、２－Ｐｅｎｔｙｌｆｕｒａｎは、小膠細胞を活性化させたり、前記小膠細胞により食作用が増加するものであってもよい。より具体的に、増加した食作用により退行性脳疾患を誘発する物質（例えば、ベータアミロイド）の除去が増加する。一般的に、前記退行性脳疾患を誘発する物質は、ベータアミロイドでありうる。特定理論に制限されることなく、脳中でベータアミロイドに囲まれた小膠細胞は、免疫反応性が増加することができ、ベータアミロイドに対する食作用が増加することができ、したがって、このような食作用によりベータアミロイドを減少させて退行性脳疾患を治療および改善させることができることが報告されたことがある（Ｏｌｉｂｅｒａ Ｍ．Ｍｉｔｒａｓｉｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ Ａｍｙｌｏｉｄ ｂｙ Ｍｏｕｓｅ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｍｉｃｒｏｇｌｉａ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｖｏｌ．２７７，Ｎｏ．３３，１ｐ．）。したがって、一具体例による２－ペンチルフランは、小膠細胞の食作用を活性化させてベータアミロイドを減少させることによって、認知症を含む退行性脳疾患に有用に使用できる。
【0022】
本明細書において用語「小膠細胞（Ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）」は、中胚葉に由来する中枢神経系における神経膠細胞であって、中枢神経系で１次免疫機能を行う細胞をいう。小膠細胞は、組織を支持し、神経細胞に必要な物質を供給、組織内の物質運搬、破壊、および除去を担当し、活性化の有無によって異なる特性を有する。
【0023】
本明細書において用語「活性化した小膠細胞」とは、小膠細胞の活性化後の小膠細胞をいうものであり、小膠細胞の活性化とは、本来細長い枝と薄い細胞体の形状を維持している小膠細胞が外部から流入したり内部で発生する毒素を探知する場合、これらの毒素から神経細胞を保護するために、太くて短い枝と太い細胞体を有する活性化した形状に変化することである。前記活性化した小膠細胞は、正常状態の小膠細胞とは異なって、食作用を活発にし、細胞増殖をし、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１βおよびＩＬ－６などのようなサイトカイン、ケモカイン、ｉＮＯＳ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＣＯＸ－２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ－２）などの遺伝子を発現させて炎症媒介物質を生成する。小膠細胞の活性化は、損傷した細胞を除去し、外部から侵入するバクテリアやウイルスから神経細胞を保護する一面があり、同時に過活性化する場合、神経細胞を損傷させる一面もある。
【0024】
前記小膠細胞の活性化物質としては、バクテリアの内毒素であるリポポリサッカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ）、インターフェロン－γ、ベータアミロイド、ガングリオシドおよび２－Ｐｅｎｔｙｌｆｕｒａｎなどが含まれ得、一具体例において、２－Ｐｅｎｔｙｌｆｕｒａｎであってもよい。
【0025】
本明細書において用語「食作用（Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）」は、食菌作用、食細胞作用、飽食作用、ファゴサイトーシス、貪食作用とも命名でき、特定細胞が環境から固形粒子を取り入れて細胞内消化をする現象を意味する。前記特定細胞は、網状細胞、組織球、血管内上皮細胞、星状細胞、リンパ球、白血球および小膠細胞でありうる。本発明の一実施例において、好ましくは、小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）でありうる。前記固形粒子は、細菌、ウイルス、細胞デブリなどの異物でありうる。本発明の一実施例において、好ましくは、退行性脳疾患を誘発する物質でありうる。２－Ｐｅｎｔｙｌｆｕｒａｎにより活性化した小膠細胞は、食作用を活発にし、このような食作用により退行性脳疾患を誘発する物質を除去するものでありうる。
【0026】
前記薬学組成物は、有効成分以外に薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。この際、薬学的に許容可能な担体は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。また、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含んでもよい
【0027】
前記薬学組成物は、目的とする方法によって経口投与（経口剤）したり、非経口投与（例えば、注射剤として静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）することができ、例えば、皮下（すなわち、皮膚外用剤）または経口（すなわち、経口剤）投与することもできるが、これらに限定されない。
【0028】
前記各種剤形に添加される緩衝液としては、等張（ｉｓｏｔｏｎｉｃ）であり、ｐＨ４－９、ｐＨ５－９の無刺激のものを使用することが好ましい。投与量は、患者の状態および体重、病気の程度、薬物形態、投与経路および時間によって異なるが、当業者が適宜選択できる。
【0029】
前記薬学組成物は、薬学的に有効な量で投与することができる。用語「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスクの割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する感度、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素およびその他医学分野によく知られた要素によって決定できる。本発明の他の薬学組成物は、個別治療剤として投与したり、他の治療剤と併用して投与することができ、既存の治療剤とは順次にまたは同時に投与してもよく、単一または多重投与してもよい。前記要素を全部考慮して副作用なしで最小限の量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは、当業者か容易に決定できる。
【0030】
前記薬学組成物の有効量は、患者の年齢、性別、状態、体重、体内活性成分の吸収度、不活性率および排泄速度、病気の種類、併用薬物によって異なり、一般的には、１日に体重１ｋｇ当たり０．１～５００ｍｇの範囲内であっもよく、毎日または隔日で投与したり、１日に１～５回の範囲内に分けて投与してもよい。しかしながら、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などによって増減できるので、前記投与量がいかなる方法でもその範囲を限定するものではない。
【0031】
他の態様は、上記に記載された化合物のうち一つの化合物、その溶媒和物、立体異性体またはこれらの健康機能食品学的に許容可能な塩を含む、退行性脳疾患の予防または改善用健康機能食品を提供する。
【0032】
本明細書において使用された用語「改善」は、異常状態と関連したパラメーター、例えば症状の程度を少なくとも減少させるすべての行為を意味する。この際、前記健康機能性食品組成物は、退行性脳疾患の予防または改善のために、当該疾患の発病段階前または発病後、治療のための薬剤と同時にまたは個別的に使用できる。
【0033】
より具体的に、本明細書における改善は、２－ｐｅｎｔｙｌｆｕｒａｎを含む健康機能食品を摂取する場合、小膠細胞の活性化が高まり、これによって、食作用が増加することによって、退行性脳疾患を誘発する物質を減少させることを含んでもよい。
【0034】
前記食品組成物は、有効成分を食品にそのまま添加したり、他の食品または食品成分と共に使用でき、通常の方法により適切に使用できる。有効成分の混合量は、その使用目的（予防または改善用）によって好適に決定できる。一般的に、食品または飲料の製造時に、本発明の組成物は、原料に対して６０重量％以下、好ましくは、４０重量％以下の量で添加される。しかしながら、健康および衛生を目的としたり、または健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、前記量は、前記範囲以下でありうる。
【0035】
前記食品組成物は、指示された割合で必須成分として前記有効成分を含有すること以外に、追加される他の成分には、特別な制限がなく、通常の飲料と同様に、様々な香味剤または天然炭水化物などをさらなる成分として含有してもよい。上述した天然炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖など；ジサッカライド、例えばマルトース、スクロースなど；およびポリサッカライド、例えばデキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖、およびキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。上述したもの以外の香味剤として天然香味剤（ソーマチン、ステビア抽出物（例えばレバウディオサイドＡ、グリチルリチンなど））および合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を有利に使用できる。前記天然炭水化物の割合は、当業者の選択により適切に決定できる。
【0036】
上記の他にも、食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、ミネラル（電解質）、合成風味剤および天然風味剤などの風味剤、着色剤および増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有してもよい。このような成分は、独立して、または組み合わせて使用できる。このような添加剤の割合も、当業者が適宜選択できる。
【0037】
本出願で開示されたそれぞれの説明および実施形態は、それぞれの他の説明および実施形態にも適用可能である。すなわち、本出願で開示された多様な要素のすべての組み合わせが本出願の範疇に属する。また、下記記述された具体的な叙述により本出願の範疇が制限されるとみなすわけではない。
【発明の効果】
【0038】
一態様による２－Ｐｅｎｔｙｌｆｕｒａｎまたはその溶媒和物、立体異性体または薬学的に許容可能な塩は、退行性脳疾患を誘発する物質を除去する効果があるので、退行性脳疾患を予防または治療できるところ、既存の治療剤を代替できる有効物質として活用できる。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【図1】上方のｃｏｌｏｒ ｈｅａｔ ｍａｐは、それぞれマウスに肺炎球菌（１０４、１０５、および１０６ ｃｏｌｏｎｙ－ｆｏｒｍａｔｉｏｎ－ｕｎｉｔｓ，ＣＦＵ）を３つの異なる量で投与したｃｏｎｔｒｏｌ ｍｅｄｉａ（Ｃｔｒｌ）とｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ（Ｓｕｐ）を腹腔内（ＩＰ）注射した後のｒｅｓｉｄｅｎｃｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙを示すイメージである。総距離値は、同じ条件下で数量化された（ｎ＝５で１０／ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）。（Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；および＊＊＊、Ｐ＜１．０×１０－３）。
【図2】小膠細胞におけるｐｒｏ－（Ｔｎｆ、Ｉｌ６、Ｉｌ１ｂ）とａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ（Ｉｌ１０、Ｉｌ１３）のｍＲＮＡ発現量をＳｕｐ処置とＩＰ注射した大脳皮質で測定した図である。
【図3】星状細胞のｐｒｏ－（Ｔｎｆ、Ｉｌ６、Ｉｌ１ｂ）とａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ（Ｉｌ１０、Ｉｌ１３）のｍＲＮＡ発現量をＳｕｐ処置とＩＰ注射した大脳皮質で測定した図である。
【図4】４つの異なる肺炎球菌投与量（１、１０、１００、および１０００ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、ＭＯＩ；ｎ＝５／ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）で製造されたＳｕｐ処置した初代小膠細胞で測定されたサイトカインのタンパク質量を示すイメージである。（Ｔｎｆ、ＩＬ６、ＩＬ１ｂ）。（Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；および＊＊＊、Ｐ＜１．０×１０－３）
【図5】ＧＦＰの強度がＣｔｒｌ－およびＳｕｐ処置した状態の小膠細胞の形態を反映する代表蛍光イメージである。イメージは、ＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／＋マウスにＣｔｒｌまたはＳｕｐのＩＰ注射後に大脳皮質にある小膠細胞を示す。Ｓｃａｌｅ ｂａｒ：２０ｕｍ。ＧＦＰ強度は、次の２つの条件下で数量化された（ｎ＝３ ｔｏ ５ ｍｉｃｅ／ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）。
【図6】２５分間１分間隔で測定されたＣｔｒｌおよびＳｕｐ処置後に生成後に蓄積されたＯ２－の量を示すイメージである。Ｄａｔａは、Ｍｅａｎ±ＳＥＭで各時点で示す。
【図7】ＣｔｒｌまたはＳｕｐで移住した初代小膠細胞を示すイメージである。イメージは、Ｂｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ ａｓｓａｙを使って作成した。走化性指数は、移住した小膠細胞の（ｎ＝５／ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）の数量化された個数を示す。
【図8】ＣｔｒｌまたはＳｕｐ処理した後、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）ａｎａｌｙｓｉｓで測定したＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）－ｄｅｘｔｒａｎの初代小膠細胞の分布を示す。食細胞作用指数は、ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ（ＭＦＩｓ）（ｎ＝５／ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を表す。
【図9】走化性分析とＲＯＳ生成を示すイメージである。（Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；および＊＊＊、Ｐ＜１．０×１０－３）
【図10】走化性分析を示し、Ｃｔｒｌ、Ｓｕｐとｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ（ＦＴ）処理した後の食細胞作用を示すイメージである。（Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；および＊＊＊、Ｐ＜１．０×１０－３）
【図11】ｍＲＮＡ－ｓｅｑ ｄａｔａによれば、嗅覚受容体が初代小膠細胞で発現することを示すイメージである。
【図12】Ｓｕｐ処置で誘導された嗅覚受容体の相対発現量を示すイメージである。
【図13】Ｏｌｆｒ１１０とＯｌｆｒ１１１の相対的ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性（ｙ軸）が１１個のｆｕｒａｎ ａｎａｌｏｇｕｅの増加する濃度で測定されたことを示すイメージである。
【図14】候補代謝物に対してＯｌｆｒ１１０とＯｌｆｒ１１１を比較して相対的ルシフェラーゼ活性を示すイメージである。
【図15】Ｏｌｆｒ１１１の相対的ルシフェラーゼ活性を示すイメージである。
【図16】１１個のｆｕｒａｎ ａｎａｌｏｇｕｅに対するＯｌｆｒ１１０とＯｌｆｒ１１１の分子収容範囲を説明する環状マップを示すイメージである。中心に位置する類似体は、最も反応性の強い類似体を意味し、最も外側に位置する類似体は、最も反応性が弱いことを意味する。
【図17】２－ＰＦとＯｌｒｆ１１０との相互作用のための４つの決定的残基（Ｆ１０２、Ｆ１０４、Ｙ２５２、およびＹ２５９）を示す２－ＰＦ－Ｏｌｆｒ１１０高分子集合の構造モデルを示すイメージである。
【図18】増加する濃度（ｘ軸）の２－ＰＦで測定されたｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ Ｏｌｆｒ１１０と（凡例に表記された）９個のＯｌｆｒ１１０突然変異の相対的ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性（ｙ軸）を示すイメージである。
【図19】上方のイメージは、ＭＯＣＫ、Ｏｌｆｒ１１０、あるいは、Ｏｌｆｒ１１１ ｔｏ ２－ＰＦを発現している移住したＨａｎａ３Ａ細胞を示す。イメージは、Ｂｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ ａｓｓａｙを使って作成した。移住した小膠細胞の個数を示す走化性指数は、ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｏｌｖｅｎｔ（ＮＴ）と２－ＰＦ ａｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ １０、１００、１０００ｕｍ（ｎ＝５／ｃｏｎｄｔｉｏｎ）を処置した後に測定された。
【図20】合成２－ＰＦ、Ｓｕｐ、ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｅｄｉａ（Ｃｔｒｌ）に対するＬＣ－ＭＳ／ＭＳ ｄａｔａｓｅｔｓから得られた２－ＰＦの前駆イオンに（ｍ／ｚ＝１５３．０９１）対して抽出されたｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ（ＥＩＣｓ）を示すイメージである。
【図21】合成２－ＰＦ中の２－ＰＦ前駆イオンと２－ＰＦ前駆イオンのＳｕｐ．ＦｒａｇｍｅｎｔｅｄイオンのＭＳ／ＭＳ ｓｐｅｃｔｒａを示すイメージであり、ＨＭＤＢにより予測構想されたそれぞれに該当する構造とともに示される（Ｗｉｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
【図22】１０２と１０４ｕＭ ２－ＰＦを追加で入れた後、Ｓｕｐ中の２－ＰＦ前駆イオンに対するＥＩＣを示すイメージである。
【図23】細胞毒性のａｓｓａｙを示すイメージである。
【図24】活性酸素のａｓｓａｙを示すイメージである。
【図25】食作用のａｓｓａｙを示すイメージである。Ｓｕｐにｃｏｎｔｒｏｌ ｍｅｄｉａ（Ｃｔｒｌ）の処置とＡＴＰと（本文参照）増加する濃度の２－ＰＦ（０、１００、３００、および５００ｕＭ）を加えた後に測定された。
【図26】初代小膠細胞と星状細胞Ｏｌｆｒ１１０のウェスタンブロット分析と一緒に、ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとして使用された嗅覚上皮（ＯＥ）と嗅球（ＯＢ）を示すイメージである。Ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌとしては、β－ａｃｔｉｎが使用された。
【図27】大脳皮質における（上段パネル）Ｏｌｆｒ１１０（赤色）とＩｂａ－１（緑色）の発現を示すｃｏ－ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓを示すイメージである。小膠細胞マーカー；海馬における（中間パネル）Ｏｌｆｒ１１０とＧＦＡＰ（緑色）の発現、小膠細胞マーカー；大脳皮質における（下段パネル）Ｏｌｆｒ１１０とＮｅｕＮ（緑色）の発現、神経細胞マーカー。ＤＡＰＩは、青色で示される。Ｓｃａｌｅ ｂａｒ：５０ｕｍである。
【図28】ＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／＋大脳皮質中のＧＦＰ（＋）小膠細胞（緑色）Ｏｌｆｒ１１０（赤色）の発現を示すＩｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓを示すイメージである。左右パネルは、低解像度と高解像度イメージを示す。Ｓｃａｌｅ ｂａｒ：５０ｕｍ（左側）とＳｃａｌｅ ｂａｒ：２０ｕｍ（右側）。
【図29】Ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｅｄｉａ（Ｃｔｒｌ）とＳｕｐ（上段パネル）と一緒にＰＢＳ（Ｃｔｒｌ）と２－ＰＦ（下段パネル）の処置後に測定したＯｌｆｒ１１０の発現を示すＩｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓを示すイメージである。Ｏｌｆｒ１１０発現量は、赤色の強度によって数量化された。
【図30】３つの濃度でＰＢＳ溶媒と２－ＰＦのＩＰ注入後にマウスの居住頻度をそれぞれ示すヒートマップである。総移動距離は、同じ条件下で定量化して棒グラフに表示した。
【図31】２－ＰＦのＩＰ注射後に大脳皮質で測定された炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。
【図32】コントロールまたは２－ＰＦをＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／＋マウスに注入した後の小膠細胞のＧＦＰの強度を示す蛍光イメージである。大脳皮質の小膠細胞により生成された。
【図33】コントロールあるいは２－ＰＦ処理をした後にそれぞれ１、１６、２５、４０および９２分に大脳皮質の切片を測定して形成された低速の共焦点顕微鏡のイメージである。小膠細胞の体積は緑色で、食作用中の突出部分は矢印で表現された。
【図34】２－ＰＦ前処理後にｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡ＋Ｍｏｃｋ（ｓｉＣｔｒｌ）、ｓｉＲＮＡ ａｇａｉｎｓｔ Ｏｌｆｒ１１０＋Ｍｏｃｋ（ｓｉＯｌｆｒ１１０）、そしてｓｉＲＮＡ ａｇａｉｎｓｔ Ｏｌｆｒ１１０＋ｔｈｅ ｒｅｓｃｕｅ ｖｅｃｔｏｒ（Ｒｅｓｃｕｅ）で形質感染された初代小膠細胞の炎症性サイトカインのｍＲＮＡ表現程度を示すグラフである（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；および＊＊＊、Ｐ＜０．００１）。
【図35】培養上澄み液で測定した２－ＰＦ処理後のＴｎｆおよびＩｌ６のタンパク質レベルを示すグラフである。
【図36】２－ＰＦ処理後にｓｉＲＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎさせた場合の初代小膠細胞で生成された蓄積された酸素濃度の量を示すグラフである。１分間隔で２５分間の測定値が示されている。
【図37】ｓｉＲＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後にＦＡＣＳ分析により測定されたＦＩＴＣデキストリン強度を有する初代小膠細胞の分布を示すグラフである。図３６に記述された通りである。食菌指数は、定量化された平均蛍光強度を示す。
【図38】３つの異なる濃度である１０、１００、および１０００μＭ ２－ＰＦにおける初代小膠細胞を示すイメージである。
【図39】形質感染された小膠細胞を示す代表的な脳イメージである（黄色）。非小膠細胞は赤色で表示されており、形質感染されない小膠細胞は緑色で示されている。星印で表示された領域は、ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ注入後にＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／＋マウスの大脳皮質の部分である。
【図40】Ｏｌｆｒ１１０と１１１のｍＲＮＡ発現レベルを測定したグラフである。それぞれ、ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡ＋Ｍｏｃｋ＋ｓｉＧＬＯ（Ｃｔｒｌ）；Ｏｌｆｒ１１０ ｓｉＲＮＡ＋Ｍｏｃｋ＋ｓｉＧＬＯ（ｓｉＯｌｆｒ１１０）；あるいはＯｌｆｒ１１０ ｓｉＲＮＡ＋ｒｅｓｃｕｅ ｖｅｃｔｏｒ＋ｓｉＧＬＯ（Ｒｅｓｃｕｅ）注入後に測定されたのである。（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；および＊＊＊、Ｐ＜０．００１）
【図41】ＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／＋マウスの脳中で３タイプの細胞におけるＢｅａｄｓの分布を示すイメージである。Ｂｅａｄは白色点、小膠細胞は黄色点で表示している。３つの条件下で３匹の独立的なマウス内部の６個の位置で計数し、計数したＢｅａｄｓは棒グラフで表示された。（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；および＊＊＊、Ｐ＜０．００１）
【図42】対照群と実験群の小膠細胞間のＤＥＧｓ関係を示すイメージである。それぞれの数字はＤＥＧの数字を意味する。
【図43】ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ（赤色）とｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ（緑色）遺伝子のｌｏｇ２－ｆｏｌｄ－ｃｈａｎｇｅｓを示すヒートマップのイメージである。
【図44】２－ＰＦ処理された小膠細胞中のｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ遺伝子によりＧＯＢＰｓを豊富にすることを示すグラフである。
【図45】異なる濃度（０、１００、および５００μＭ）の条件下で処理された小膠細胞（ｎ＝５／ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）のｃＡＭＰ生成濃度を示すグラフである。それぞれはＳＱ２２５３６（ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）で処理された群であるか、またはそうでない群である。
【図46】同じ濃度の２－ＰＦで処理した後、初代小膠細胞で生産されるｃＡＭＰを示すグラフである。（ｎ＝５／条件）
【図47】小膠細胞の内部に増加したカルシウム濃度をｆｕｒａ－２ＡＭ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｍａｇｉｎｇで測定して示すイメージである。高い濃度は赤色で、低い濃度は緑色で示した。
【図48】２－ＰＦおよびＬＰＳ処理後、０、２、５、１０、２０および３０分にウェスタンブロット分析を使って１次微視神経細胞で測定されたリン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）、ｐ３８（ｐｐ３８）、ＪＮＫ（ｐＪＮＫ）およびＡｋｔ（ｐＡｋｔ）のウェスタンブロットの結果を示すイメージである。β－アクチンをローディングに使用した。
【図49】２－ＰＦ前処理後に初代小膠細胞から分泌されるＴｎｆとＩｌ６の濃度を示したのである。ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ（ＳＱ：ＳＱ２２５３６）で前処理した群と、そうでない群とに分けられる。
【図53】ＳＱ２２５３６またはｐｄ９８０５９と前培養させ、２－ＰＦを処理した後にウェスタンブロットにより初代小膠細胞で測定されるＥＲＫ、ｐｈｏｓｐｈｏｒ－ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）、ＣＲＥＢ、およびｐｈｏｓｐｈｏｒ－ＣＲＥＢ（ｐＣＲＥＢ）の量を示すグラフである。（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；および＊＊＊、Ｐ＜０．００１）
【図54】ｘ軸は、３００μＭの２－ＰＦで同時処理された２－ＥＦの濃度増加、ｙ軸は、Ｏｌｆｒ１１０の相対的ルシフェラーゼ活性を示すグラフである。（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；および＊＊＊、Ｐ＜１．０）
【図55】２－ＥＦ処理されたＳｕｐと処理されないＳｕｐでそれぞれ処理された初代小膠細胞で発生した活性酸素生成のグラフである（左側）。また、５００μＭの２－ＰＦで同時処理された２－ＥＦ Ｓｕｐとそうでない２－ＥＦが処理されたＳｕｐでそれぞれ処理された初代小膠細胞で発生した活性酸素生成のグラフである（右側）（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；および＊＊＊、Ｐ＜１．０）。ＡＮＯＶＡとともにＴｕｋｅｙ ｐｏｓｔ－ｈｏｃ修正法を利用した。
【発明を実施するための形態】
【0040】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【0041】
参考例：実験材料および実験準備
１．小膠細胞と星状細胞の培養
本実施例では、１次的に小膠細胞または星状細胞をＥ１８．５マウス胚芽の大脳皮質から抽出した後（Ｔａｍａｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、実施例１のように培養した。より具体的に、マウス胚芽の皮質を収集した後、冷たい上澄み液（＃１４１７０－１１２；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に貯蔵し、０．２５％トリプシン溶液（＃１５０９０－０４６；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３７℃で２０分間前処理した。その後、１０％ＦＢＳ（＃ＳＨ３０９１９．０３；Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（＃２５０３０－０８１；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．０４％ブドウ糖（＃Ｇ７０２１；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（＃１５１４０－１２２；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が添加された最小栄養培地で細胞をプレーティングした後に、４０μｍストレーナー（＃３５２３４０；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてろ過した。小膠細胞は、ｐｏｌｙ－Ｄ－ｌｙｓｉｎｅ（＃Ｐ７２８０；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）でメッキされたＴ７５フラスコに１．２×１０７ ｃｅｌｌの密度でプレーティングした。２時間後、前記混合物は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；＃ＳＨ３０２４３．０１；Ｈｙｃｌｏｎｅ）培地に移され、２週間３日を周期として培地を交替した。このような混合液から小膠細胞を分離するために、まず３７℃で１５０ｒｐｍで２時間振とうした後に、小膠細胞を含む混合液を上部から別途に抽出して移した後、室温で１３００ｒｐｍで５分間遠心分離して小膠細胞を分離することができた。分離した小膠細胞は、培養培地に移した。小膠細胞を移した後、残った混合液を１６０ｒｐｍで１日間振とう培養して小膠細胞を完全に除去した。次に、０．２５％トリプシンを処理して星状細胞を分離し、Ｔ７５フラスコで４日間さらに培養して収集した。収集した小膠細胞と星状細胞の純度は、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析およびマーカー遺伝子とタンパク質であるＩｂａ－１およびＧｆａｐを用いてｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙを用いて評価した。
１．小膠細胞と星状細胞の培養
本実施例では、１次的に小膠細胞または星状細胞をＥ１８．５マウス胚芽の大脳皮質から抽出した後（Ｔａｍａｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、実施例１のように培養した。より具体的に、マウス胚芽の皮質を収集した後、冷たい上澄み液（＃１４１７０－１１２；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に貯蔵し、０．２５％トリプシン溶液（＃１５０９０－０４６；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３７℃で２０分間前処理した。その後、１０％ＦＢＳ（＃ＳＨ３０９１９．０３；Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（＃２５０３０－０８１；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．０４％ブドウ糖（＃Ｇ７０２１；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（＃１５１４０－１２２；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が添加された最小栄養培地で細胞をプレーティングした後に、４０μｍストレーナー（＃３５２３４０；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてろ過した。小膠細胞は、ｐｏｌｙ－Ｄ－ｌｙｓｉｎｅ（＃Ｐ７２８０；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）でメッキされたＴ７５フラスコに１．２×１０７ ｃｅｌｌの密度でプレーティングした。２時間後、前記混合物は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；＃ＳＨ３０２４３．０１；Ｈｙｃｌｏｎｅ）培地に移され、２週間３日を周期として培地を交替した。このような混合液から小膠細胞を分離するために、まず３７℃で１５０ｒｐｍで２時間振とうした後に、小膠細胞を含む混合液を上部から別途に抽出して移した後、室温で１３００ｒｐｍで５分間遠心分離して小膠細胞を分離することができた。分離した小膠細胞は、培養培地に移した。小膠細胞を移した後、残った混合液を１６０ｒｐｍで１日間振とう培養して小膠細胞を完全に除去した。次に、０．２５％トリプシンを処理して星状細胞を分離し、Ｔ７５フラスコで４日間さらに培養して収集した。収集した小膠細胞と星状細胞の純度は、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析およびマーカー遺伝子とタンパク質であるＩｂａ－１およびＧｆａｐを用いてｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙを用いて評価した。
【0042】
２．肺炎球菌培養液から２－ｐｅｎｔｙｌｆｕｒａｎの選別
カプセル化した２つの血清型の菌株（Ｄ３９ Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ，Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１５）を３０ｇの滅菌されたＴｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ Ｂｒｏｔｈ（＃２４９２４０；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、０．５％の酵母抽出液（＃２８８６２０；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に培養した。次に、成長したバクテリアをＴｈｙ ｂｒｏｔｈに移し、３７℃で２４～４８時間の間培養して１０８ＣＦＵ／ｍｌの濃度になるようにした。培養液は、４，０００ｘｇで４℃を維持しつつ、１０分間遠心分離して培養上澄み液（Ｓｕｐ）を分離し、腹腔内注射（ＩＰ）に使用した。代謝物を含む分画物を分離するために、ｕｌｔｒａｃｅｌ ＹＭ－３膜を用いて追加でろ過した（３ｋＤａ ｐｏｒｅ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）。しかも、実験のために９８％純度の合成２－ＰＦ溶液を準備した後に、同量のメタノールを溶液に添加して混合溶液を作成した（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ社の溶液を購入）。１０２または１０４濃度の２－ｐｅｎｔｙｌｆｕｒａｎがＳｕｐに添加され、結果物は、０．１％のＴＦＡで処理された。
カプセル化した２つの血清型の菌株（Ｄ３９ Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ，Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１５）を３０ｇの滅菌されたＴｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ Ｂｒｏｔｈ（＃２４９２４０；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、０．５％の酵母抽出液（＃２８８６２０；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に培養した。次に、成長したバクテリアをＴｈｙ ｂｒｏｔｈに移し、３７℃で２４～４８時間の間培養して１０８ＣＦＵ／ｍｌの濃度になるようにした。培養液は、４，０００ｘｇで４℃を維持しつつ、１０分間遠心分離して培養上澄み液（Ｓｕｐ）を分離し、腹腔内注射（ＩＰ）に使用した。代謝物を含む分画物を分離するために、ｕｌｔｒａｃｅｌ ＹＭ－３膜を用いて追加でろ過した（３ｋＤａ ｐｏｒｅ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）。しかも、実験のために９８％純度の合成２－ＰＦ溶液を準備した後に、同量のメタノールを溶液に添加して混合溶液を作成した（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ社の溶液を購入）。１０２または１０４濃度の２－ｐｅｎｔｙｌｆｕｒａｎがＳｕｐに添加され、結果物は、０．１％のＴＦＡで処理された。
【0043】
３．動物モデルの準備
すべてのマウスは、標準温度調節、実験室条件、または着色されたトンネル、迷路、登山材料、ランニングホイールに自由に接近できる条件下で、ＤＧＩＳＴの動物管理倫理委員会の承認を受けたプロトコルに従って維持、および管理された。ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏの実験両方で８～１０週のＢＬ６Ｊまたは異型接合体ＣＸ３ＣＲ１＋／ＧＦＰマウスを利用した。前記マウスは、Ｃ５７／ＢＬ６ＪとＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／ＧＦＰを交差交配して生成した（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．２０００）。すべてのマウスは、室温で１２時間の周期で任意に無菌食品と水を提供された。
すべてのマウスは、標準温度調節、実験室条件、または着色されたトンネル、迷路、登山材料、ランニングホイールに自由に接近できる条件下で、ＤＧＩＳＴの動物管理倫理委員会の承認を受けたプロトコルに従って維持、および管理された。ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏの実験両方で８～１０週のＢＬ６Ｊまたは異型接合体ＣＸ３ＣＲ１＋／ＧＦＰマウスを利用した。前記マウスは、Ｃ５７／ＢＬ６ＪとＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／ＧＦＰを交差交配して生成した（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．２０００）。すべてのマウスは、室温で１２時間の周期で任意に無菌食品と水を提供された。
【0044】
４．ｑＲＴ－ＰＣＲの実行方法
ｍＲＮＡの測定のために、製造メーカーのプロトコルに従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてＭａｇＮａ ｌｙｓｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使って赤血球と小膠細胞、星状細胞、Ｈａｎａ３Ａ細胞または大脳皮質細胞からＲＮＡを分離した。以後、分離したｍＲＮＡを使って逆転写を通じてｃＤＮＡを生成した（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ １ｓｔ ｓｔｒおよびｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ－＃６１１０；Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃを利用）。この過程は、ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ－ＰＣＲ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒを利用）を通じてリアルタイムで定量的に測定した。測定値は、２－ΔΔＣｔ ｍｅｔｈｏｄを用いて計算した。
ｍＲＮＡの測定のために、製造メーカーのプロトコルに従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてＭａｇＮａ ｌｙｓｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使って赤血球と小膠細胞、星状細胞、Ｈａｎａ３Ａ細胞または大脳皮質細胞からＲＮＡを分離した。以後、分離したｍＲＮＡを使って逆転写を通じてｃＤＮＡを生成した（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ １ｓｔ ｓｔｒおよびｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ－＃６１１０；Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃを利用）。この過程は、ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ－ＰＣＲ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒを利用）を通じてリアルタイムで定量的に測定した。測定値は、２－ΔΔＣｔ ｍｅｔｈｏｄを用いて計算した。
【0045】
５．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ ａｓｓａｙの実行方法
小膠細胞から分泌されたＴｎｆ、Ｉｌ６、Ｉｌ１ｂサイトカインの発現レベルは、製造メーカープロトコルに従って測定された。より具体的には、２－ＰＦあるいは細胞上澄み液で処理した後２４時間後にＥＬＩＳＡにより測定された。ＥＬＩＳＡキットは、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した（＃ＤＹ４１０ ｆｏｒ Ｔｎｆ；＃ＤＹ４０６ ｆｏｒ Ｉｌ６；＃ＤＹ４０１ ｆｏｒ Ｉｌ１ｂ）。
小膠細胞から分泌されたＴｎｆ、Ｉｌ６、Ｉｌ１ｂサイトカインの発現レベルは、製造メーカープロトコルに従って測定された。より具体的には、２－ＰＦあるいは細胞上澄み液で処理した後２４時間後にＥＬＩＳＡにより測定された。ＥＬＩＳＡキットは、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した（＃ＤＹ４１０ ｆｏｒ Ｔｎｆ；＃ＤＹ４０６ ｆｏｒ Ｉｌ６；＃ＤＹ４０１ ｆｏｒ Ｉｌ１ｂ）。
【0046】
６．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ方法
小膠細胞活性化の形態学的変化を分析するために、９週齢のＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／＋マウスを使用した。２つのマウスに２－ＰＦが含まれたＩＰおよび含まれていないＩＰをそれぞれ注入した後、２時間後に低温切除術を用いて脳切片を抽出した。厚さ４０μｍの脳組織の切片を１μｍにさらに小さく均一化して準備した後に、４０倍拡大共焦点顕微鏡を用いて小膠細胞のＧＦＰシグナルを測定した。Ｚｅｉｓｓ ＺＥＮ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｚｅｉｓｓ）を使って小膠細胞のＧＦＰ－ｐｉｘｅｌ ｓｉｇｎａｌを分析した。
小膠細胞活性化の形態学的変化を分析するために、９週齢のＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／＋マウスを使用した。２つのマウスに２－ＰＦが含まれたＩＰおよび含まれていないＩＰをそれぞれ注入した後、２時間後に低温切除術を用いて脳切片を抽出した。厚さ４０μｍの脳組織の切片を１μｍにさらに小さく均一化して準備した後に、４０倍拡大共焦点顕微鏡を用いて小膠細胞のＧＦＰシグナルを測定した。Ｚｅｉｓｓ ＺＥＮ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｚｅｉｓｓ）を使って小膠細胞のＧＦＰ－ｐｉｘｅｌ ｓｉｇｎａｌを分析した。
【0047】
７．Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ（Ｏ２
－）濃度測定方法
スーパーオキシドの濃度は、ＶｅｒｓａＭａｘ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを使ってシトクロムｃが減少する程度を測定して計算した（Ｂａｂｉｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９７３）。小膠細胞は、９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で培養され、前記小膠細胞は、２－ペンチルフラン、シトクロムｃが存在する１０μＭ ＡＴＰ溶液、あるいはＳｕｐをｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ Ｂ（５μＭ；＃Ｃ６６７６２；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）と混ぜた溶液により活性化した。これによるＲＯＳの濃度は、１分間隔で２５分間５５０ｎｍで光吸収の変化を通じて測定された。
スーパーオキシドの濃度は、ＶｅｒｓａＭａｘ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを使ってシトクロムｃが減少する程度を測定して計算した（Ｂａｂｉｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９７３）。小膠細胞は、９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で培養され、前記小膠細胞は、２－ペンチルフラン、シトクロムｃが存在する１０μＭ ＡＴＰ溶液、あるいはＳｕｐをｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ Ｂ（５μＭ；＃Ｃ６６７６２；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）と混ぜた溶液により活性化した。これによるＲＯＳの濃度は、１分間隔で２５分間５５０ｎｍで光吸収の変化を通じて測定された。
【0048】
８．細胞走化性の測定方法
ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ Ｂｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒを用いて細胞走化性を測定した。より具体的には、ＰＢＳに２時間の間１０ｍｇ／ｍｌフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）によりポリカーボネートフィルター（８μｍ ｐｏｒｅ；＃１０１－８；Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ）をコーティングし、コーティングされたフィルターをＢｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒに設置した。また、プレートの底面を２－ペンチルフランを含有する無血清ＤＭＥＭまたは培養上澄み液で満たした。次に、小膠細胞またはＨａｎａ３Ａ細胞を嗅覚受容体構造に感染させた後、無血清ＤＭＥＭに懸濁させた。その後、３７℃で小膠細胞は４時間、Ｈａｎａ３Ａ細胞は８時間の間放置した。底面に沈んだ細胞は、４％ＰＦＡで固定させ、ヘマトキシリンで１０分間染色した。固定された細胞は、ｓｃｏｒｅｄ ｅｙｅｐｉｅｃｅを使って無作為に選択された５個の固定磁場（２００Ｘ）で光学顕微鏡で計数された。化学走化性指数は、無処理群を標準として細胞の移動数として定義された。
ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ Ｂｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒを用いて細胞走化性を測定した。より具体的には、ＰＢＳに２時間の間１０ｍｇ／ｍｌフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）によりポリカーボネートフィルター（８μｍ ｐｏｒｅ；＃１０１－８；Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ）をコーティングし、コーティングされたフィルターをＢｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒに設置した。また、プレートの底面を２－ペンチルフランを含有する無血清ＤＭＥＭまたは培養上澄み液で満たした。次に、小膠細胞またはＨａｎａ３Ａ細胞を嗅覚受容体構造に感染させた後、無血清ＤＭＥＭに懸濁させた。その後、３７℃で小膠細胞は４時間、Ｈａｎａ３Ａ細胞は８時間の間放置した。底面に沈んだ細胞は、４％ＰＦＡで固定させ、ヘマトキシリンで１０分間染色した。固定された細胞は、ｓｃｏｒｅｄ ｅｙｅｐｉｅｃｅを使って無作為に選択された５個の固定磁場（２００Ｘ）で光学顕微鏡で計数された。化学走化性指数は、無処理群を標準として細胞の移動数として定義された。
【0049】
９．食作用の測定方法
初代小膠細胞を２４－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（５×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に接種後、２４時間の間培養した。細胞を２－ＰＦまたはｓｕｐとともに３０分間予備培養し、３７℃で３０日間無血清ＤＭＥＭからＦＩＴＣ－ｄｅｘｔｒａｎ（１ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳの中の２０ｍｇ／ｍｌ；＃ＦＤ７０Ｓ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に移して４℃のＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳで０．２５％トリプシン（＃１５０９０－０４６；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により細胞を分離し、分離した細胞をＦＡＣＳ ＡｃｃｕｒｉＴＭ Ｃ６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、前記ソフトウェアを使って各条件における蛍光ヒストグラムを統合して計算した。食作用指数は、無処理群を標準としてＭＦＩとして定義された。
初代小膠細胞を２４－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（５×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に接種後、２４時間の間培養した。細胞を２－ＰＦまたはｓｕｐとともに３０分間予備培養し、３７℃で３０日間無血清ＤＭＥＭからＦＩＴＣ－ｄｅｘｔｒａｎ（１ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳの中の２０ｍｇ／ｍｌ；＃ＦＤ７０Ｓ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に移して４℃のＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳで０．２５％トリプシン（＃１５０９０－０４６；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により細胞を分離し、分離した細胞をＦＡＣＳ ＡｃｃｕｒｉＴＭ Ｃ６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、前記ソフトウェアを使って各条件における蛍光ヒストグラムを統合して計算した。食作用指数は、無処理群を標準としてＭＦＩとして定義された。
【0050】
１０．活性酸素濃度の測定方法
活性酸素の濃度は、２’，７’ －Ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＤＣＦ－ＤＡ，＃Ｄ６８８３；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使って既存の方法からささいな修正を経た方法を用いて測定した（Ｂａｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）。より具体的に、初代小膠細胞を２４時間の間２４－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（５．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）で１０μＭ ＤＣＦ－ＤＡで３７℃の温度で３０分間処理した。一つのプレートは、２－ＰＦで処理し、一つは、そうではなかった。それぞれのｗｅｌｌにある細胞は、ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＦＡＣＳ ＡｃｃｕｒｉＴＭ Ｃ６；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定された。ＭＦＩは、前記方法の同様に測定された。
活性酸素の濃度は、２’，７’ －Ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＤＣＦ－ＤＡ，＃Ｄ６８８３；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使って既存の方法からささいな修正を経た方法を用いて測定した（Ｂａｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）。より具体的に、初代小膠細胞を２４時間の間２４－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（５．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）で１０μＭ ＤＣＦ－ＤＡで３７℃の温度で３０分間処理した。一つのプレートは、２－ＰＦで処理し、一つは、そうではなかった。それぞれのｗｅｌｌにある細胞は、ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＦＡＣＳ ＡｃｃｕｒｉＴＭ Ｃ６；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定された。ＭＦＩは、前記方法の同様に測定された。
【0051】
１１．嗅覚受容体クローニングおよび細胞表面発現測定
マウスとヒトゲノムＤＮＡからの全体長さの嗅覚受容体遺伝子を適切なプライマーを使って増幅させた。これによって生成されたｃＤＮＡを制限酵素で分解した後、前記記述されたように、Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｌｕｃｙ、Ｆｌａｇ、およびＲｈｏ ｔａｇｓを含有するＰＭＥ１８Ｓ表現ベクターで制限酵素部位を有する嗅覚受容体構造を生成するために生成物を連結させた。すべての嗅覚受容体の構造は、配列分析により確認された（Ｓｈｅｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。次に、ＲＴＰ１Ｓを有するＨａｎａ３Ａ細胞で形質を感染させ、以前に記述されたように、細胞膜における位置と存在を確認した（Ｂｅｈｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００９；ＺｈｕａｎｇおよびＭａｔｓｕｎａｍｉ、２００８）。このような形質感染は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（＃１１６６８－０１９；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使って製造メーカーの指示により行われた。より具体的には、形質転換された細胞をポリＤリシン（１０μｇ／ｍｌ；＃Ｐ７２８０；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）でコーティングされたカバースリップ（＃０１０１０５０；Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ）上で成長させた。次に、暖かいＰＢＳ溶液で洗浄し、氷で３０分間冷却させて、エンドシトシスを遮断させた。その後、冷たいＰＢＳで洗浄した後、細胞を２分間氷で冷却されたメタノールとアセトンで固定させた（ｖ／ｖ＝１：１）（Ｍｅｔｈａｎｏｌ：＃１０６００９；ＭＥＲＣＫ，Ａｃｅｔｏｎｅ：＃１７９１２４；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）。その後、細胞を室温下に１時間の間正常ウマ血清（＃００８－０００－１２１；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共にインキュベーションした。マウス抗ロドプシン（ａｎｔｉ－Ｒｈｏ；１：１，０００；＃ＭＡＢＮ１５；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）あるいはウサギ抗Ｏｌｆｒ１１０（＃ａｂ１７７３２７；Ａｂｃａｍ）を４℃で一晩中インキュベーションさせた。その後、ＰＢＳで洗浄した後、Ｃｙ３－コンジュゲートロバ抗マウス抗体（１：１，０００；＃７１５－１６５－１５０；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、Ａｌｅｘａ４８８－コンジュゲートロバ抗マウス（１：１，０００；＃７１５－５４５－１５０；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、あるいはＣｙ３－コンジュゲートロバ抗ウサギ抗体（１：１，０００；＃７１１－１６５－１５２；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を室温で１時間の間処理した。細胞をＤＡＰＩ（＃Ｈ－１２００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ蛍光マウント媒質で装着した。異種嗅覚受容体の表現は、共焦点レーザースキャニング顕微鏡ＬＳＭ７００とＺＥＮソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）で分析した。
マウスとヒトゲノムＤＮＡからの全体長さの嗅覚受容体遺伝子を適切なプライマーを使って増幅させた。これによって生成されたｃＤＮＡを制限酵素で分解した後、前記記述されたように、Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｌｕｃｙ、Ｆｌａｇ、およびＲｈｏ ｔａｇｓを含有するＰＭＥ１８Ｓ表現ベクターで制限酵素部位を有する嗅覚受容体構造を生成するために生成物を連結させた。すべての嗅覚受容体の構造は、配列分析により確認された（Ｓｈｅｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。次に、ＲＴＰ１Ｓを有するＨａｎａ３Ａ細胞で形質を感染させ、以前に記述されたように、細胞膜における位置と存在を確認した（Ｂｅｈｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００９；ＺｈｕａｎｇおよびＭａｔｓｕｎａｍｉ、２００８）。このような形質感染は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（＃１１６６８－０１９；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使って製造メーカーの指示により行われた。より具体的には、形質転換された細胞をポリＤリシン（１０μｇ／ｍｌ；＃Ｐ７２８０；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）でコーティングされたカバースリップ（＃０１０１０５０；Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ）上で成長させた。次に、暖かいＰＢＳ溶液で洗浄し、氷で３０分間冷却させて、エンドシトシスを遮断させた。その後、冷たいＰＢＳで洗浄した後、細胞を２分間氷で冷却されたメタノールとアセトンで固定させた（ｖ／ｖ＝１：１）（Ｍｅｔｈａｎｏｌ：＃１０６００９；ＭＥＲＣＫ，Ａｃｅｔｏｎｅ：＃１７９１２４；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）。その後、細胞を室温下に１時間の間正常ウマ血清（＃００８－０００－１２１；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共にインキュベーションした。マウス抗ロドプシン（ａｎｔｉ－Ｒｈｏ；１：１，０００；＃ＭＡＢＮ１５；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）あるいはウサギ抗Ｏｌｆｒ１１０（＃ａｂ１７７３２７；Ａｂｃａｍ）を４℃で一晩中インキュベーションさせた。その後、ＰＢＳで洗浄した後、Ｃｙ３－コンジュゲートロバ抗マウス抗体（１：１，０００；＃７１５－１６５－１５０；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、Ａｌｅｘａ４８８－コンジュゲートロバ抗マウス（１：１，０００；＃７１５－５４５－１５０；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、あるいはＣｙ３－コンジュゲートロバ抗ウサギ抗体（１：１，０００；＃７１１－１６５－１５２；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を室温で１時間の間処理した。細胞をＤＡＰＩ（＃Ｈ－１２００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ蛍光マウント媒質で装着した。異種嗅覚受容体の表現は、共焦点レーザースキャニング顕微鏡ＬＳＭ７００とＺＥＮソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）で分析した。
【0052】
１２．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ測定方法
Ｄｕａｌ－Ｇｌｏルシフェラーゼ分析システム（＃Ｅ２９４０；Ｐｒｏｍｅｇａ）を嗅覚受容体リガンドスクリーニングに使用した。より具体的には、Ｈａｎａ３Ａ細胞を形質転換する１日前に白色ポリスチレン９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（＃３５３２９６；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に形質感染１日前に塗抹した。各プレートに対してｐＣＲＥＬｕｃ（１μｇ；＃２１９０７６；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＲＬ－ＳＶ４０（１μｇ；＃Ｅ２２３１；Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＲＴＰ１Ｓ（１μｇ）、およびＯＲ（６μｇ；あるいはＭｏｃｋ）ベクターを２４時間の間形質感染させた。製造メーカーのプロトコルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（＃１１６６８－０１９；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使って分析した。形質感染した細胞を多様な濃度の希釈されたｏｄｏｒａｎｔｓを用いてＣＤ２９３培地（＃１１９１３－０１９；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内で３７℃で４時間の間刺激させた。ルシフェラーゼの活性は、ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの活性で正常化した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて発光量を測定した。
Ｄｕａｌ－Ｇｌｏルシフェラーゼ分析システム（＃Ｅ２９４０；Ｐｒｏｍｅｇａ）を嗅覚受容体リガンドスクリーニングに使用した。より具体的には、Ｈａｎａ３Ａ細胞を形質転換する１日前に白色ポリスチレン９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（＃３５３２９６；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に形質感染１日前に塗抹した。各プレートに対してｐＣＲＥＬｕｃ（１μｇ；＃２１９０７６；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＲＬ－ＳＶ４０（１μｇ；＃Ｅ２２３１；Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＲＴＰ１Ｓ（１μｇ）、およびＯＲ（６μｇ；あるいはＭｏｃｋ）ベクターを２４時間の間形質感染させた。製造メーカーのプロトコルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（＃１１６６８－０１９；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使って分析した。形質感染した細胞を多様な濃度の希釈されたｏｄｏｒａｎｔｓを用いてＣＤ２９３培地（＃１１９１３－０１９；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内で３７℃で４時間の間刺激させた。ルシフェラーゼの活性は、ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの活性で正常化した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて発光量を測定した。
【0053】
１３．相同性モデリング方法
Ｏｌｆｒ１１０／１１１のマウスの嗅覚受容体相同性モデリングは、テンプレート検索、遺伝子シーケンスの整列、モデル確定、モデル量評価などを含む。また、これは、ウェブ基盤相同性モデリングツールであるＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬを通じて行われた。Ｏｌｆｒ１１０／１１１のアミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ ｄａｔａｂａｓｅを使ってＮＣＢＩ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴから初めて収得した。Ｏｌｆｒ１１０／１１１に対するテンプレート検索は、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＳＭＴＬ）のＢＬＡＳＴおよびＨＨｂｌｉｔｓを使用した。結果的に、１７９個と１８６個のテンプレートを発見することができた。Ｏｌｆｒ１１０／１１１の相同性モデルを構築するために、ヒトアデノシンＡ２Ａ受容体（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ：２．７Å，ＰＤＢ ＩＤ：３ＶＧ９）のＸ線結晶構造を鋳型構造として選択し、これは、配列同一性および類似性の両方に基づく。３ｄ相同性モデル構造は、Ｐｒｏｍｏｄを使って生成した。生成されたモデルの全体的な評価は、ＱＭＥＡＮ ｓｃｏｒｉｎｇ機能を利用した。Ｏｌｆｒ１１０／１１１の最終３Ｄモデル構造は、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬウェブサイトからダウンロードされた。
Ｏｌｆｒ１１０／１１１のマウスの嗅覚受容体相同性モデリングは、テンプレート検索、遺伝子シーケンスの整列、モデル確定、モデル量評価などを含む。また、これは、ウェブ基盤相同性モデリングツールであるＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬを通じて行われた。Ｏｌｆｒ１１０／１１１のアミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ ｄａｔａｂａｓｅを使ってＮＣＢＩ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴから初めて収得した。Ｏｌｆｒ１１０／１１１に対するテンプレート検索は、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＳＭＴＬ）のＢＬＡＳＴおよびＨＨｂｌｉｔｓを使用した。結果的に、１７９個と１８６個のテンプレートを発見することができた。Ｏｌｆｒ１１０／１１１の相同性モデルを構築するために、ヒトアデノシンＡ２Ａ受容体（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ：２．７Å，ＰＤＢ ＩＤ：３ＶＧ９）のＸ線結晶構造を鋳型構造として選択し、これは、配列同一性および類似性の両方に基づく。３ｄ相同性モデル構造は、Ｐｒｏｍｏｄを使って生成した。生成されたモデルの全体的な評価は、ＱＭＥＡＮ ｓｃｏｒｉｎｇ機能を利用した。Ｏｌｆｒ１１０／１１１の最終３Ｄモデル構造は、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬウェブサイトからダウンロードされた。
【0054】
１４．受容体－リガンド分子モデリング結合方法
リガンドの二次元的構造は、ＣｈｅｍＢｉｏＤｒａｗ（ｖｅｒ．１１．０．１）により生成され、これをＣｈｅｍ３Ｄ Ｐｒｏ（ｖｅｒ．１１．０．１）に伝送して３次元構造を生成した。リガンド準備および最適化に利用された過程は、ＳＹＢＹＬ－Ｘ ２．１．１（Ｔｒｉｐｏｓ Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）の「ｓａｎｉｔｉｚｅ」プロトコル（基本値）を使って行われた。Ｏｌｆｒ１１０／１１１（ｔｅｍｐｌａｔｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ＰＤＢ ＩＤ：３ＶＧ９）の相同性モデルは、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ相同性モデリングツールを用いて生成された。ＳＹＢＹＬ－Ｘ ２．１．１の構造準備ツールは、タンパク質の準備過程でも利用された。アミノ酸残基の欠損は修正され、ＴＲＩＰＯＳ ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄを用いてタンパク質に水素原子が追加で添加された。次に、ＰＯＷＥＬＬ方法（Ａｂａｇｙａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）で、初期最適化設定が基本設定から‘ｎｏｎｅ’変化させた後、タンパク質最小化過程を行った。ＥＨｇｋｓ終結勾配は、０．５ｋｃａｌ／（ｍｏｌ＊Å）に設定され、最大反復は、１０００回に設定された。次に、Ｓｕｒｆｌｅｘ－Ｄｏｃｋ ＧｅｏｍＸ ｍｏｄｕｌｅ（ＳＹＢＹＬ－Ｘ ２．１．１）を用いて前記方法で準備されたタンパク質とリガンドを使って全体ドッキングプロセスが行われた。ドッキングサイトは、Ｓｕｒｆｌｅｘ－Ｄｏｃｋ ｐｒｏｔｏｍｏｌにより誘導され、これは、理想的なリガンドの表現型であって、存在する結合部位とのすべての相互作用を示すことができることが特徴である。このプロトコルは、ＳＹＢＹＬ－Ｘ ２．１．１．のＭｕｌｔｉ ｃｈａｎｎｅｌ ｓｕｒｆａｃｅで最も大きく発現する受容体を共同で選択して捜し出して定義された。２つのプロトコルの発生因子であるＢｌｏａｔとＴｈｅｒｓｈｏｌｄは、それぞれ０．５（Å）および０に設定された。発生するｐｏｓｅｓの最大値は、２０であり、生成されたフォース間の最小ＲＭＳＤは、２０に設定された。ｐｏｓｅｓ間のＲＭＳＤの最小値は、０．０５に設定された。Ｓｕｒｆｌｅｘ－ｄｏｃｋ ＧｅｏｍＸの他のドッキング因子は、基本値に設定された。
リガンドの二次元的構造は、ＣｈｅｍＢｉｏＤｒａｗ（ｖｅｒ．１１．０．１）により生成され、これをＣｈｅｍ３Ｄ Ｐｒｏ（ｖｅｒ．１１．０．１）に伝送して３次元構造を生成した。リガンド準備および最適化に利用された過程は、ＳＹＢＹＬ－Ｘ ２．１．１（Ｔｒｉｐｏｓ Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）の「ｓａｎｉｔｉｚｅ」プロトコル（基本値）を使って行われた。Ｏｌｆｒ１１０／１１１（ｔｅｍｐｌａｔｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ＰＤＢ ＩＤ：３ＶＧ９）の相同性モデルは、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ相同性モデリングツールを用いて生成された。ＳＹＢＹＬ－Ｘ ２．１．１の構造準備ツールは、タンパク質の準備過程でも利用された。アミノ酸残基の欠損は修正され、ＴＲＩＰＯＳ ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄを用いてタンパク質に水素原子が追加で添加された。次に、ＰＯＷＥＬＬ方法（Ａｂａｇｙａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）で、初期最適化設定が基本設定から‘ｎｏｎｅ’変化させた後、タンパク質最小化過程を行った。ＥＨｇｋｓ終結勾配は、０．５ｋｃａｌ／（ｍｏｌ＊Å）に設定され、最大反復は、１０００回に設定された。次に、Ｓｕｒｆｌｅｘ－Ｄｏｃｋ ＧｅｏｍＸ ｍｏｄｕｌｅ（ＳＹＢＹＬ－Ｘ ２．１．１）を用いて前記方法で準備されたタンパク質とリガンドを使って全体ドッキングプロセスが行われた。ドッキングサイトは、Ｓｕｒｆｌｅｘ－Ｄｏｃｋ ｐｒｏｔｏｍｏｌにより誘導され、これは、理想的なリガンドの表現型であって、存在する結合部位とのすべての相互作用を示すことができることが特徴である。このプロトコルは、ＳＹＢＹＬ－Ｘ ２．１．１．のＭｕｌｔｉ ｃｈａｎｎｅｌ ｓｕｒｆａｃｅで最も大きく発現する受容体を共同で選択して捜し出して定義された。２つのプロトコルの発生因子であるＢｌｏａｔとＴｈｅｒｓｈｏｌｄは、それぞれ０．５（Å）および０に設定された。発生するｐｏｓｅｓの最大値は、２０であり、生成されたフォース間の最小ＲＭＳＤは、２０に設定された。ｐｏｓｅｓ間のＲＭＳＤの最小値は、０．０５に設定された。Ｓｕｒｆｌｅｘ－ｄｏｃｋ ＧｅｏｍＸの他のドッキング因子は、基本値に設定された。
【0055】
１５．構造特異的突然変異生成方法
Ｏｌｆｒ１１０構造の特異的突然変異ベクターは、ＰｆｕＵｌｔｒａ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（＃６００３８０；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使って生成した。すべての突然変異ベクター（Ｆ１０２Ｗ；Ｆ１０４Ｗ；Ｙ２５２Ｆ；Ｙ２５９Ｆ；Ｆ１０２Ｗ／Ｆ１０４Ｗ；Ｙ２５２Ｆ／Ｙ２５９Ｆ；Ｆ１０２Ｗ／Ｙ２５２Ｆ／Ｙ２５９Ｆ；Ｆ１０４Ｗ／Ｙ２５２Ｆ／Ｙ２５９Ｆ；Ｆ１０２Ｗ／Ｆ１０４Ｗ／Ｙ２５２Ｆ／Ｙ２５９Ｆ）の順序は、正方向および逆方向である（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）。
Ｏｌｆｒ１１０構造の特異的突然変異ベクターは、ＰｆｕＵｌｔｒａ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（＃６００３８０；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使って生成した。すべての突然変異ベクター（Ｆ１０２Ｗ；Ｆ１０４Ｗ；Ｙ２５２Ｆ；Ｙ２５９Ｆ；Ｆ１０２Ｗ／Ｆ１０４Ｗ；Ｙ２５２Ｆ／Ｙ２５９Ｆ；Ｆ１０２Ｗ／Ｙ２５２Ｆ／Ｙ２５９Ｆ；Ｆ１０４Ｗ／Ｙ２５２Ｆ／Ｙ２５９Ｆ；Ｆ１０２Ｗ／Ｆ１０４Ｗ／Ｙ２５２Ｆ／Ｙ２５９Ｆ）の順序は、正方向および逆方向である（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）。
【0056】
１６．サンプル準備
合成２－ＰＦ溶液（９８％以上の純度）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。同量のａｂｓｏｌｕｔｅ（９９．９％）メタノールを２ＰＦのｏｒｉｇｉｎａｌ溶液に添加した。２－ＰＦのｏｒｉｇｉｎａｌ溶液とメタノールを添加した溶液（２－ＰＦ＋ＣＨ３ＯＨ）を直接注入質量分光法（ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）で分析した。合成２－ＰＦのｌｉｑｕｉｄ－ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔａｎｄｅｍ－ｍａｓｓ－ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）分析のために、２－ＰＦ＋ＣＨ３ＯＨ溶液を使用した。ＳｕｐおよびＣｏｎｔｒｏｌ ｍｅｄｉａ（Ｃｔｒｌ）のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために、ＳｕｐまたはＣｔｒｌ（１ ｍｌ）を３ｋＤの加工サイズを有するｕｌｔｒａｃｅｌ ＹＭ－３膜を通じてフィルタリングしてタンパク質を除去した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）。５００μｌのｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈを同じ体積のメタノールと混合した。生成されたサンプルを１０分間超音波（ｓｏｎｉｃａｔｅｄ）処理し、４℃で２０分間１４，０００ｇで遠心分離させた（Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。上澄み液をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した（図３Ａ－Ｂ）。また、１０２と１０４ｕＭ濃度の２－ＰＦがＳｕｐに追加された。生成されたサンプルを０．１％ＴＦＡ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）で酸性化させた後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した。
合成２－ＰＦ溶液（９８％以上の純度）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。同量のａｂｓｏｌｕｔｅ（９９．９％）メタノールを２ＰＦのｏｒｉｇｉｎａｌ溶液に添加した。２－ＰＦのｏｒｉｇｉｎａｌ溶液とメタノールを添加した溶液（２－ＰＦ＋ＣＨ３ＯＨ）を直接注入質量分光法（ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）で分析した。合成２－ＰＦのｌｉｑｕｉｄ－ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔａｎｄｅｍ－ｍａｓｓ－ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）分析のために、２－ＰＦ＋ＣＨ３ＯＨ溶液を使用した。ＳｕｐおよびＣｏｎｔｒｏｌ ｍｅｄｉａ（Ｃｔｒｌ）のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために、ＳｕｐまたはＣｔｒｌ（１ ｍｌ）を３ｋＤの加工サイズを有するｕｌｔｒａｃｅｌ ＹＭ－３膜を通じてフィルタリングしてタンパク質を除去した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）。５００μｌのｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈを同じ体積のメタノールと混合した。生成されたサンプルを１０分間超音波（ｓｏｎｉｃａｔｅｄ）処理し、４℃で２０分間１４，０００ｇで遠心分離させた（Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。上澄み液をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した（図３Ａ－Ｂ）。また、１０２と１０４ｕＭ濃度の２－ＰＦがＳｕｐに追加された。生成されたサンプルを０．１％ＴＦＡ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）で酸性化させた後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した。
【0057】
１７．Ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ＨＥＳＩ ｓｏｕｒｃｅ
２－ＰＦおよび２－ＰＦ＋ＣＨ３ＯＨサンプルを５００μｌガス密閉注射器を使って加熱したエレクトロスプレーイオン源に２０μｌ／分の流速で注入した。また、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒの単一イオンモニタリング方法で８分間測定した。しかも、キャピラリー電圧は、３．５ｋＶ（ポジティブモード）に設定され、ソルベント除去キャピラリーの温度は、２５０℃に設定された。次に、全体ＭＳを７０，０００（ｍ／ｚ ２００）の分解能で５０～７５０ Ｔｈｏｍｓｏｎｓ（Ｔｈ）間の質量範囲でモニタリングした。最大イオン注入時間は、１００ｍｓであり、自動利得制御値は、１×１０６である。隔離窓は、１．０ｍ／ｚに設定された（Ｌｏｏβｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
２－ＰＦおよび２－ＰＦ＋ＣＨ３ＯＨサンプルを５００μｌガス密閉注射器を使って加熱したエレクトロスプレーイオン源に２０μｌ／分の流速で注入した。また、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒの単一イオンモニタリング方法で８分間測定した。しかも、キャピラリー電圧は、３．５ｋＶ（ポジティブモード）に設定され、ソルベント除去キャピラリーの温度は、２５０℃に設定された。次に、全体ＭＳを７０，０００（ｍ／ｚ ２００）の分解能で５０～７５０ Ｔｈｏｍｓｏｎｓ（Ｔｈ）間の質量範囲でモニタリングした。最大イオン注入時間は、１００ｍｓであり、自動利得制御値は、１×１０６である。隔離窓は、１．０ｍ／ｚに設定された（Ｌｏｏβｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
【0058】
１８．ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析法
ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅａｓｙ－Ｃｏｌｕｍｎ、７５μｍ×５０ｃｍ）とｔｒａｐ ｃｏｌｕｍｎ（７５μｍ×２ｃｍ）が装着されたＴｈｅｒｍｏ ＥＡＳＹ－ｎＬＣ １０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｄｅｎｓｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）をＬＣ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎに利用した。これより、パラメーターは次の通りである：ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ＝１０μｌ；ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｏｌｕｍｎｓ＝５０℃；ｆｌｏｗ ｒａｔｅ＝３００ ｎＬ／ｍｉｎ；およびｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ Ａ＝０．１％ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄおよびｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ Ｂ＝０．１％ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄおよび２％ｗａｔｅｒ ｉｎ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ．ＬＣ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎのために、次のような濃度勾配が５０分間利用された。：２％ ｔｏ ４０％ ｓｏｌｖｅｎｔ Ｂを３６ｍｉｎ、４０％～８０％ ｓｏｌｖｅｎｔ Ｂ ｏｖｅｒ ６分およびｆｒｏｍ ８０％～２％ｓｏｌｖｅｎｔ Ｂ ｏｖｅｒ ６分。ＬＣから溶出された試料は、ナノ電子噴霧装置が装着されたＱ－ＥｘａｃｔｉｖｅＴＭ ｈｙｂｒｉｄ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使って分析した。キャピラリー電圧は、３．５ｋＶ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅ）に設定され、キャピラリーの温度は、２５０℃に設定された。また、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅは、データ依存モードに設定され、７万解像度（ａｔ ｍ／ｚ ２００）で５０～７５０Ｔｈ質量範囲のスキャンを行った。実験結果、最も多く検出された上位１０個のイオンまで１．０ｍ／ｚで隔離された。また、前記イオンは、高いエネルギーとの衝突によって切片化されることを確認した。ＭＳスキャンは、１７，５００の解像度として検出された（Ｓａｉｇｕｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。最大イオン注入時間は、ｆｕｌｌ ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ ｓｃａｎｓの場合、それぞれ１００ｍｓおよび５０ｍｓであった。ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｇａｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔａｒｇｅｔ ｖａｌｕｅは、ｆｕｌｌ ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ ｓｃａｎｓそれぞれに対して１．０×１０６および１．０×１０５に設定された。
ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅａｓｙ－Ｃｏｌｕｍｎ、７５μｍ×５０ｃｍ）とｔｒａｐ ｃｏｌｕｍｎ（７５μｍ×２ｃｍ）が装着されたＴｈｅｒｍｏ ＥＡＳＹ－ｎＬＣ １０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｄｅｎｓｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）をＬＣ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎに利用した。これより、パラメーターは次の通りである：ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ＝１０μｌ；ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｏｌｕｍｎｓ＝５０℃；ｆｌｏｗ ｒａｔｅ＝３００ ｎＬ／ｍｉｎ；およびｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ Ａ＝０．１％ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄおよびｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ Ｂ＝０．１％ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄおよび２％ｗａｔｅｒ ｉｎ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ．ＬＣ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎのために、次のような濃度勾配が５０分間利用された。：２％ ｔｏ ４０％ ｓｏｌｖｅｎｔ Ｂを３６ｍｉｎ、４０％～８０％ ｓｏｌｖｅｎｔ Ｂ ｏｖｅｒ ６分およびｆｒｏｍ ８０％～２％ｓｏｌｖｅｎｔ Ｂ ｏｖｅｒ ６分。ＬＣから溶出された試料は、ナノ電子噴霧装置が装着されたＱ－ＥｘａｃｔｉｖｅＴＭ ｈｙｂｒｉｄ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使って分析した。キャピラリー電圧は、３．５ｋＶ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅ）に設定され、キャピラリーの温度は、２５０℃に設定された。また、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅは、データ依存モードに設定され、７万解像度（ａｔ ｍ／ｚ ２００）で５０～７５０Ｔｈ質量範囲のスキャンを行った。実験結果、最も多く検出された上位１０個のイオンまで１．０ｍ／ｚで隔離された。また、前記イオンは、高いエネルギーとの衝突によって切片化されることを確認した。ＭＳスキャンは、１７，５００の解像度として検出された（Ｓａｉｇｕｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。最大イオン注入時間は、ｆｕｌｌ ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ ｓｃａｎｓの場合、それぞれ１００ｍｓおよび５０ｍｓであった。ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｇａｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔａｒｇｅｔ ｖａｌｕｅは、ｆｕｌｌ ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ ｓｃａｎｓそれぞれに対して１．０×１０６および１．０×１０５に設定された。
【0059】
１９．Ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ（ＥＩＣ）およびＭＳ／ＭＳ ｓｐｅｃｔｒａ測定方法
ｆｕｌｌ ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ ｓｃａｎｓを含む全体ＭＳスキャンを用いて取得した未加工データから２－ＰＦの前駆体イオンが抽出された（ｍ／ｚ＝１５３．０９１ Ｄａ）。前記前駆体イオンは、２ｐｐｍの許容誤差内でクロマトグラフィーピークを１７および２２または１６および２２に設定して抽出されたのである。それぞれのスペクトルでｍ／ｚｆ－ｔｈｅ ｍａｓｓ ｏｆ ＣＨ３のピークと相当するものを連結し、結果的に断片化されたピークイオンとして候補構造が得られた（ＨＭＤＢ）（Ｗｉｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
ｆｕｌｌ ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ ｓｃａｎｓを含む全体ＭＳスキャンを用いて取得した未加工データから２－ＰＦの前駆体イオンが抽出された（ｍ／ｚ＝１５３．０９１ Ｄａ）。前記前駆体イオンは、２ｐｐｍの許容誤差内でクロマトグラフィーピークを１７および２２または１６および２２に設定して抽出されたのである。それぞれのスペクトルでｍ／ｚｆ－ｔｈｅ ｍａｓｓ ｏｆ ＣＨ３のピークと相当するものを連結し、結果的に断片化されたピークイオンとして候補構造が得られた（ＨＭＤＢ）（Ｗｉｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
【0060】
２０．ウェスタンブロット方法
ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（＃０４－６９３－１１６－００１；Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ＤＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）およびｌｙｓｅｄ ｕｓｉｎｇ ＭａｇＮＡ ｌｙｓｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）があるＴ－ＰＥＲ（登録商標）ｒｅａｇｅｎｔ（＃７８５１０；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細胞と組織を準備した後、ＭａｇＮＡレーザーを使って溶解させた（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。総タンパク質抽出物は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析法で定量化した。前記サンプルを７．５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥあるいは４－２０％ｇｒａｄｉｅｎｔ ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＩＮ ＴＧＸ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌｓ（＃４５６－１０６４；Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に溶解した後、ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（＃１０６００００２；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にブロッティングした。その後、膜を５％の脱脂粉乳とＴＢＳＴ、０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（＃Ｐ９４１６；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＴｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅで１時間の間ブロッキングした後、４℃で一晩中１次抗体と共にインキュベーションさせた。前記抗体は、次の通りである：Ｏｌｆｒ１１０（３６ｋＤａ；１：１，０００；＃ａｂ１７７３２７；Ａｂｃａｍ）、抗ロドプシン（３９ｋＤａ；１：１，０００；＃ＭＡＢＮ１５；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＣＲＥＢ（４３ｋＤａ；１：１，０００；＃９１９７；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＣＲＥＢ（４３ｋＤａ；１：１，０００；＃９１９８；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＥＲＫ（４４ｋＤａ；１：１，０００；＃ｓｃ０９４；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＥＲＫ（４２，４４ｋＤａ；１：１，０００；＃ｓｃ－７３８３；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ｐｈｏｓｐｈｏ－Ａｋｔ（６０ｋＤａ；１：５００；ｓｃ－２９３１２５；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＪＮＫ（４６，５４ｋＤａ；１：５００；ｓｃ－６２５４；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ｐｈｏｓｐｈｏｒ－ｐ３８（３８ｋＤａ；１：１，０００；ｓｃ－７９７３；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、あるいはｂｅｔａ－Ａｃｔｉｎ（４５ｋＤａ；１：１０，０００；＃４９６７；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。また、Ｉｓｏｔｙｐｅ－ｍａｔｃｈｅｄ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈペルオキシダーゼ－コンジュゲート２次抗体は、常温で２時間の間ＴＢＳＴ中の抗ウサギ（＃７１１－０３５－１５２；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を１：１００，０００として、抗マウス（＃７１５－０３５－１５０；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を１：４０，０００として使用された。免疫反応性タンパク質バンドは、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＴＭ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（＃３４０８０；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。
ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（＃０４－６９３－１１６－００１；Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ＤＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）およびｌｙｓｅｄ ｕｓｉｎｇ ＭａｇＮＡ ｌｙｓｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）があるＴ－ＰＥＲ（登録商標）ｒｅａｇｅｎｔ（＃７８５１０；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細胞と組織を準備した後、ＭａｇＮＡレーザーを使って溶解させた（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。総タンパク質抽出物は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析法で定量化した。前記サンプルを７．５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥあるいは４－２０％ｇｒａｄｉｅｎｔ ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＩＮ ＴＧＸ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌｓ（＃４５６－１０６４；Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に溶解した後、ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（＃１０６００００２；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にブロッティングした。その後、膜を５％の脱脂粉乳とＴＢＳＴ、０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（＃Ｐ９４１６；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＴｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅで１時間の間ブロッキングした後、４℃で一晩中１次抗体と共にインキュベーションさせた。前記抗体は、次の通りである：Ｏｌｆｒ１１０（３６ｋＤａ；１：１，０００；＃ａｂ１７７３２７；Ａｂｃａｍ）、抗ロドプシン（３９ｋＤａ；１：１，０００；＃ＭＡＢＮ１５；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＣＲＥＢ（４３ｋＤａ；１：１，０００；＃９１９７；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＣＲＥＢ（４３ｋＤａ；１：１，０００；＃９１９８；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＥＲＫ（４４ｋＤａ；１：１，０００；＃ｓｃ０９４；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＥＲＫ（４２，４４ｋＤａ；１：１，０００；＃ｓｃ－７３８３；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ｐｈｏｓｐｈｏ－Ａｋｔ（６０ｋＤａ；１：５００；ｓｃ－２９３１２５；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＪＮＫ（４６，５４ｋＤａ；１：５００；ｓｃ－６２５４；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ｐｈｏｓｐｈｏｒ－ｐ３８（３８ｋＤａ；１：１，０００；ｓｃ－７９７３；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、あるいはｂｅｔａ－Ａｃｔｉｎ（４５ｋＤａ；１：１０，０００；＃４９６７；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。また、Ｉｓｏｔｙｐｅ－ｍａｔｃｈｅｄ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈペルオキシダーゼ－コンジュゲート２次抗体は、常温で２時間の間ＴＢＳＴ中の抗ウサギ（＃７１１－０３５－１５２；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を１：１００，０００として、抗マウス（＃７１５－０３５－１５０；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を１：４０，０００として使用された。免疫反応性タンパク質バンドは、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＴＭ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（＃３４０８０；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。
【0061】
２１．免疫染色法
免疫蛍光染色のために４８時間の間標準条件でｐｏｌｙ－Ｄ－ｌｙｓｉｎｅ（１０μｇ／ｍｌ；＃Ｐ７２８０；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で２２ｍｍカバースリップ（＃０１０１０５０；Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ）をコーティングした後に、小膠細胞を培養させた。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％のパラホルムアルデヒド（＃６１４８；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で５分間固定させた。その後、４％の正常ウマ血清（＃００８－０００－１２１；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（＃Ｐ９４１６；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳで室温で１時間の間培養させた。次に、細胞を羅列した１次抗体とともに４℃で一晩中ブロッキングした。抗体は、次の通りである：Ｏｌｆｒ１１０（ｒａｂｂｉｔ－ａｎｔｉ－Ｏｌｆｒ１１０；１：１０，０００；＃ａｂ１７７３２７；Ａｂｃａｍ）、Ｉｂａ－１（ｇｏａｔ－ａｎｔｉ－Ｉｂａ－１；１：１，０００；＃ａｂ５０７６；Ａｂｃａｍ）、およびＧＦＡＰ（ｍｏｕｓｅ－ａｎｔｉ－ＧＦＡＰ；１：１，０００；＃５５６３３０；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。サンプルは、常温で１時間の間２次抗体とともに０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（＃Ｐ９４１６；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＰＢＳ溶液で培養された。２次抗体は、次の通りである：Ｃｙ３－コンジュゲートロバ抗ウサギ（１：１，０００；＃７１１－１６５－１５２；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、Ａｌｅｘａ４８８－コンジュゲートロバ抗ヤギ（１：１，０００；＃７０５－５４５－１４７；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、あるいはＡｌｅｘａ４８８－コンジュゲートロバ抗マウス（１：１，０００；＃７１５－５４５－１５０；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）。その後、細胞をＤＡＰＩ（＃Ｈ－１２００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ蛍光物質で装着させた後に、共焦点レーザースキャニング顕微鏡を用いて、ＬＳＭ７００とＺＥＮソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を用いて実験の結果物となるイメージを収得した。
免疫蛍光染色のために４８時間の間標準条件でｐｏｌｙ－Ｄ－ｌｙｓｉｎｅ（１０μｇ／ｍｌ；＃Ｐ７２８０；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で２２ｍｍカバースリップ（＃０１０１０５０；Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ）をコーティングした後に、小膠細胞を培養させた。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％のパラホルムアルデヒド（＃６１４８；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で５分間固定させた。その後、４％の正常ウマ血清（＃００８－０００－１２１；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（＃Ｐ９４１６；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳで室温で１時間の間培養させた。次に、細胞を羅列した１次抗体とともに４℃で一晩中ブロッキングした。抗体は、次の通りである：Ｏｌｆｒ１１０（ｒａｂｂｉｔ－ａｎｔｉ－Ｏｌｆｒ１１０；１：１０，０００；＃ａｂ１７７３２７；Ａｂｃａｍ）、Ｉｂａ－１（ｇｏａｔ－ａｎｔｉ－Ｉｂａ－１；１：１，０００；＃ａｂ５０７６；Ａｂｃａｍ）、およびＧＦＡＰ（ｍｏｕｓｅ－ａｎｔｉ－ＧＦＡＰ；１：１，０００；＃５５６３３０；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。サンプルは、常温で１時間の間２次抗体とともに０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（＃Ｐ９４１６；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＰＢＳ溶液で培養された。２次抗体は、次の通りである：Ｃｙ３－コンジュゲートロバ抗ウサギ（１：１，０００；＃７１１－１６５－１５２；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、Ａｌｅｘａ４８８－コンジュゲートロバ抗ヤギ（１：１，０００；＃７０５－５４５－１４７；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、あるいはＡｌｅｘａ４８８－コンジュゲートロバ抗マウス（１：１，０００；＃７１５－５４５－１５０；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）。その後、細胞をＤＡＰＩ（＃Ｈ－１２００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ蛍光物質で装着させた後に、共焦点レーザースキャニング顕微鏡を用いて、ＬＳＭ７００とＺＥＮソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を用いて実験の結果物となるイメージを収得した。
【0062】
２２．免疫組織化学法
マウスを４００ｍｇのｋｅｔａｍｉｎｅ／ｋｇ体重の用量を麻酔させ、硬膜外に灌流させた後、４％のＰＢＳ中のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ；＃６１４８；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で固定させた。マウスの脳は、４時間の間４℃の４％ＰＦＡに移した後、３０％のスクラーゼ溶液で１日間保管した。その後、Ｏ．Ｃ．Ｔ化合物（＃４５８３；Ｓｃｉｇｅｎ）を用いて洗浄した後に、ｃｒｙｏｔｏｍｅ（＃ＨＭ ５５０；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて厚さ４０μｍに切り出して標本を形成した。前記脳標本は、スライドに保管され、同時に０．３％ＰＢＳＴ（１Ｘ ＰＢＳ／０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）中の２％ロバ血清で３０分間浸漬させた後に、４℃のｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで一晩中１次抗体と共に培養された。１次抗体は、次の通りである：ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－Ｏｌｆｒ１１０；１：１０，０００；＃ａｂ１７７３２７；Ａｂｃａｍ，ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｉｂａ－１；１：１，０００；＃ａｂ５０７６；Ａｂｃａｍ，ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ＧＦＡＰ；１：１，０００；＃５５６３３０；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
マウスを４００ｍｇのｋｅｔａｍｉｎｅ／ｋｇ体重の用量を麻酔させ、硬膜外に灌流させた後、４％のＰＢＳ中のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ；＃６１４８；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で固定させた。マウスの脳は、４時間の間４℃の４％ＰＦＡに移した後、３０％のスクラーゼ溶液で１日間保管した。その後、Ｏ．Ｃ．Ｔ化合物（＃４５８３；Ｓｃｉｇｅｎ）を用いて洗浄した後に、ｃｒｙｏｔｏｍｅ（＃ＨＭ ５５０；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて厚さ４０μｍに切り出して標本を形成した。前記脳標本は、スライドに保管され、同時に０．３％ＰＢＳＴ（１Ｘ ＰＢＳ／０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）中の２％ロバ血清で３０分間浸漬させた後に、４℃のｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで一晩中１次抗体と共に培養された。１次抗体は、次の通りである：ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－Ｏｌｆｒ１１０；１：１０，０００；＃ａｂ１７７３２７；Ａｂｃａｍ，ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｉｂａ－１；１：１，０００；＃ａｂ５０７６；Ａｂｃａｍ，ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ＧＦＡＰ；１：１，０００；＃５５６３３０；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
【0063】
Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎおよびｒｅｓｃｕｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ後続段階で、スライドは、ＰＢＳＴ中の２次抗体と共に培養された。２次抗体は、次の通りである：Ｃｙ３－コンジュゲートロバ抗ウサギ；１：１，０００；＃７１１－１６５－１５２；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ａｌｅｘａ４８８－コンジュゲートロバ抗マウス；１：１，０００；＃７１５－５４５－１５０；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ａｌｅｘａ４８８－コンジュゲートロバａｎｔｉ－ｇｏａｔ（１：１，０００；＃７０５－５４５－１４７；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）。次に、染色されたスライドは、ＤＡＰＩ（＃Ｈ－１２００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ蛍光物質で処理した。実験の結果物として収得されるイメージは、共焦点レーザースキャニング顕微鏡ＬＳＭ７００（Ｚｅｉｓｓ）を使って２０倍拡大イメージを示した。
【0064】
２３．Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎおよびｒｅｓｃｕｅ実験方法
マウスの初代小膠細胞は、形質感染１日前に６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに位置させた。次に、初代小膠細胞を分化させるために、製造メーカーのプロトコルに従ってＯｐｔｉ－ＭＥＭ（＃１１０５８０２１；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（＃１３７７８１５０，Ｔｈｅｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。また、１００ｎＭのＯｌｆｒ１１０ ｓｉＲＮＡ（＃ＬＱ－０６４３５０－０１－０００２；４セットのＯＮ－ＴＡＲＧＥＴ＋マウスＯｌｆｒ１１０ ｓｉＲＮＡ；＃１：ＣＣＵＧＵＡＡＵＵＵＡＵＡＣＧＣＵＡＡ；＃２：ＣＧＵＵＡＡＧＧＵＡＣＵＣＡＵＵＵＡＵ；＃３：ＣＵＧＡＡＵＧＡＡＵＵＧＣＡＧＵＡＵＵ ＃４：ＧＡＵＵＧＡＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＧＵＡ，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）または１００ｎＭ非標的ｓｉＲＮＡ（ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＣＧＡＣＵＡＡ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて２４時間の間培養した。ｓｉＲＮＡ伝達効率は、ｓｉＧＬＯ Ｒｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｕｐｌｅｘ（＃Ｄ－００１６３０－０２－０５，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて確認した。以後、言及した部位指定突然変異誘発法を用いていくつかの沈黙ホモ突然変異（５’－ＣＵＣＡＡＣＧＡＧＣＵＧＣＡＡＵＡＣＣ－３’）を有するＯｌｆｒ１１０のｓｉＲＮＡ ＃３構造ベクターを生成した後、Ｏｌｆｒ１１０ノックダウンのために２４時間の間形質感染させた。構造ベクター実験で、前記構造ベクターは、製造メーカーのプロトコルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＬＴＸ（＃１５３３８１００；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、非標的またはｓｉＲＮＡ ＃３形質感染細胞で２４時間の間形質を感染させた。
マウスの初代小膠細胞は、形質感染１日前に６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに位置させた。次に、初代小膠細胞を分化させるために、製造メーカーのプロトコルに従ってＯｐｔｉ－ＭＥＭ（＃１１０５８０２１；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（＃１３７７８１５０，Ｔｈｅｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。また、１００ｎＭのＯｌｆｒ１１０ ｓｉＲＮＡ（＃ＬＱ－０６４３５０－０１－０００２；４セットのＯＮ－ＴＡＲＧＥＴ＋マウスＯｌｆｒ１１０ ｓｉＲＮＡ；＃１：ＣＣＵＧＵＡＡＵＵＵＡＵＡＣＧＣＵＡＡ；＃２：ＣＧＵＵＡＡＧＧＵＡＣＵＣＡＵＵＵＡＵ；＃３：ＣＵＧＡＡＵＧＡＡＵＵＧＣＡＧＵＡＵＵ ＃４：ＧＡＵＵＧＡＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＧＵＡ，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）または１００ｎＭ非標的ｓｉＲＮＡ（ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＣＧＡＣＵＡＡ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて２４時間の間培養した。ｓｉＲＮＡ伝達効率は、ｓｉＧＬＯ Ｒｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｕｐｌｅｘ（＃Ｄ－００１６３０－０２－０５，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて確認した。以後、言及した部位指定突然変異誘発法を用いていくつかの沈黙ホモ突然変異（５’－ＣＵＣＡＡＣＧＡＧＣＵＧＣＡＡＵＡＣＣ－３’）を有するＯｌｆｒ１１０のｓｉＲＮＡ ＃３構造ベクターを生成した後、Ｏｌｆｒ１１０ノックダウンのために２４時間の間形質感染させた。構造ベクター実験で、前記構造ベクターは、製造メーカーのプロトコルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＬＴＸ（＃１５３３８１００；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、非標的またはｓｉＲＮＡ ＃３形質感染細胞で２４時間の間形質を感染させた。
【0065】
２４．Ｅｘ ｖｉｖｏ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎおよびｒｅｓｃｕｅ実験法
９週齢のＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／＋雄マウスをケタミンで麻酔させた後に小さい穴（～１ｍＭ ｉｎ ｄｉａｍｅｔｅｒ）を頭蓋骨に穿設し、脳に接近可能なｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ注入を施行した（ｂｒｅｇｍａ－０．１１ｍｍ、１ｍｍ ｌｅｆｔ ｓｐｏｔ ｆｒｏｍ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｆｉｓｓｕｒｅ）。製造メーカーのプロトコルに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸを用いてＭｏｃｋ ｖｅｃｔｏｒ（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎの場合）あるいはｒｅｓｃｕｅ ｖｅｃｔｏｒ（ｒｅｃｏｖｅｒｙの場合）が存在する０．５μｌ ｏｆ ｓｉＲＮＡ（６６５ｎｇ）および０．５μｌ ｏｆ ｓｉＧＬＯ Ｒｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｕｐｌｅｘ（１３３ｎｇ，＃Ｄ－００１６３０－０２－０５，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を大脳皮質に注入した。０．５μｌ／ｍｉｎの速度でヘミルトン注射器を用いて注入が行われた。注射後４８時間後に、前述した方法（Ｔａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）とは若干修正して生体外イメージング分析方法を行った。ｓｉＲＮＡ構造の伝達は、ｓｉＧＬＯ ＲＥＤオリゴヌクレオチド二量体の赤色蛍光により確認できた。また、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いて注射部位で形質感染の効率性も確認できた。
９週齢のＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／＋雄マウスをケタミンで麻酔させた後に小さい穴（～１ｍＭ ｉｎ ｄｉａｍｅｔｅｒ）を頭蓋骨に穿設し、脳に接近可能なｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ注入を施行した（ｂｒｅｇｍａ－０．１１ｍｍ、１ｍｍ ｌｅｆｔ ｓｐｏｔ ｆｒｏｍ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｆｉｓｓｕｒｅ）。製造メーカーのプロトコルに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸを用いてＭｏｃｋ ｖｅｃｔｏｒ（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎの場合）あるいはｒｅｓｃｕｅ ｖｅｃｔｏｒ（ｒｅｃｏｖｅｒｙの場合）が存在する０．５μｌ ｏｆ ｓｉＲＮＡ（６６５ｎｇ）および０．５μｌ ｏｆ ｓｉＧＬＯ Ｒｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｕｐｌｅｘ（１３３ｎｇ，＃Ｄ－００１６３０－０２－０５，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を大脳皮質に注入した。０．５μｌ／ｍｉｎの速度でヘミルトン注射器を用いて注入が行われた。注射後４８時間後に、前述した方法（Ｔａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）とは若干修正して生体外イメージング分析方法を行った。ｓｉＲＮＡ構造の伝達は、ｓｉＧＬＯ ＲＥＤオリゴヌクレオチド二量体の赤色蛍光により確認できた。また、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いて注射部位で形質感染の効率性も確認できた。
【0066】
２５．ｍＲＮＡ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇおよびｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ
２時間の間ｖｅｈｉｃｌｅ（対照群）、Ｓｕｐ（ＭＯＩ １００）または２－ＰＦ（１００μＭ）を処理した後、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、７４１０４）を使って２×１０６個の初代小膠細胞からトータルＲＮＡを分離し、定量製造メーカーの標準プロトコルに従ってＱｕｂｉｔ ＲＮＡ ＨＳ分析キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｑ３２８５２）を使って分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒを使って各サンプルのＲＮＡ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）を測定し、すべてのサンプルのＲＩＮは、８．５以上であり、これは、ｍＲＮＡシーケンシングに適合する。製造メーカーの推奨プロトコルＳＭＡＲＴｅｒ－Ｓｅｑ ｖ４ Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ ｉｎｐｕｔ ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，６３４８８８）に従って全長ｃＤＮＡを生成した。ｃＤＮＡの一番目のストランド合成は、１０ｎｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡから１μｌの３’ＳＭＡＲＴ ＣＤＳ ｐｒｉｍｅｒ ＩＩ Ａを３分間７２℃で添加することによって始まった。ＳＭＡＲＴｅｒ－ｓｅｑ ｖ４ ｏｌｉｇｏおよびＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素を添加して２番目のストランドを合成し、反応物を４２℃で９０分間インキュベーションした後、７０℃で１０分間不活性化させた。二本鎖ｃＤＮＡをＰＣＲにより８サイクルの間増幅させ、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ｂｅａｄ（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ａ６３８８１）を使って精製した。ｍＲＮＡ－ｓｅｑ ｌｉｂｒａｒｙは、製造メーカーのＮｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ準備キット（ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＦＣ－１３１－１０２４）推奨プロトコルに従って生成された。ｃＤＮＡは、ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｄａｐｔｏｒで分割されると同時にタギング）し、Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡ Ｉｎｄｅｘ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＦＣ－１３１－１００１）のＩｎｄｅｘ Ｐｒｉｍｅｒｓを使ってＰＣＲで増幅させた。ＰＣＲ後、ＡＭＰｕｒｅ ｂｅａｄｓを使ってＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙを精製し、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使って品質を評価した。個別サンプルのＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙは、ＫＡＰＡ ｌｉｂｒａｒｙ定量キット（ＫＡＰＡ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＫＫ４８５４）を使って定量化した後、ｐｏｏｌｉｎｇした。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ２５００装備ですべてのライブラリーをシーケンシングして、二重インデックスされた１００ｂｐ ｐａｉｒｅｄ ｒｅａｄｓを生成し、各サンプルに対して平均５，８００万ｒｅａｄｓを生成した。ＦａｓｔＱＣ（Ｂａｂｒａｈａｍ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）を使ってｒａｗ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓの品質を確認し、ｃｕｔａｄａｐｔｅｒソフトウェアを使ってアダプタシーケンスを整理した。残っているｒｅａｄｓは、基本オプションと共にＴｏｐＨａｔ（Ｔｒａｐｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００９）を使ってマウスｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｏｍｅ（ＧＲＣｍ３８）に整列した。次に、整列したｒｅａｄｓをａｎｎｏｔａｔｉｏｎが完了した遺伝子に組み立て、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ（Ｔｒａｐｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０）を使ってｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ ＦＰＫＭを計算した。
２時間の間ｖｅｈｉｃｌｅ（対照群）、Ｓｕｐ（ＭＯＩ １００）または２－ＰＦ（１００μＭ）を処理した後、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、７４１０４）を使って２×１０６個の初代小膠細胞からトータルＲＮＡを分離し、定量製造メーカーの標準プロトコルに従ってＱｕｂｉｔ ＲＮＡ ＨＳ分析キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｑ３２８５２）を使って分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒを使って各サンプルのＲＮＡ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）を測定し、すべてのサンプルのＲＩＮは、８．５以上であり、これは、ｍＲＮＡシーケンシングに適合する。製造メーカーの推奨プロトコルＳＭＡＲＴｅｒ－Ｓｅｑ ｖ４ Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ ｉｎｐｕｔ ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，６３４８８８）に従って全長ｃＤＮＡを生成した。ｃＤＮＡの一番目のストランド合成は、１０ｎｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡから１μｌの３’ＳＭＡＲＴ ＣＤＳ ｐｒｉｍｅｒ ＩＩ Ａを３分間７２℃で添加することによって始まった。ＳＭＡＲＴｅｒ－ｓｅｑ ｖ４ ｏｌｉｇｏおよびＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素を添加して２番目のストランドを合成し、反応物を４２℃で９０分間インキュベーションした後、７０℃で１０分間不活性化させた。二本鎖ｃＤＮＡをＰＣＲにより８サイクルの間増幅させ、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ｂｅａｄ（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ａ６３８８１）を使って精製した。ｍＲＮＡ－ｓｅｑ ｌｉｂｒａｒｙは、製造メーカーのＮｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ準備キット（ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＦＣ－１３１－１０２４）推奨プロトコルに従って生成された。ｃＤＮＡは、ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｄａｐｔｏｒで分割されると同時にタギング）し、Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡ Ｉｎｄｅｘ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＦＣ－１３１－１００１）のＩｎｄｅｘ Ｐｒｉｍｅｒｓを使ってＰＣＲで増幅させた。ＰＣＲ後、ＡＭＰｕｒｅ ｂｅａｄｓを使ってＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙを精製し、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使って品質を評価した。個別サンプルのＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙは、ＫＡＰＡ ｌｉｂｒａｒｙ定量キット（ＫＡＰＡ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＫＫ４８５４）を使って定量化した後、ｐｏｏｌｉｎｇした。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ２５００装備ですべてのライブラリーをシーケンシングして、二重インデックスされた１００ｂｐ ｐａｉｒｅｄ ｒｅａｄｓを生成し、各サンプルに対して平均５，８００万ｒｅａｄｓを生成した。ＦａｓｔＱＣ（Ｂａｂｒａｈａｍ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）を使ってｒａｗ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓの品質を確認し、ｃｕｔａｄａｐｔｅｒソフトウェアを使ってアダプタシーケンスを整理した。残っているｒｅａｄｓは、基本オプションと共にＴｏｐＨａｔ（Ｔｒａｐｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００９）を使ってマウスｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｏｍｅ（ＧＲＣｍ３８）に整列した。次に、整列したｒｅａｄｓをａｎｎｏｔａｔｉｏｎが完了した遺伝子に組み立て、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ（Ｔｒａｐｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０）を使ってｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ ＦＰＫＭを計算した。
【0067】
２６．分化発現した遺伝子の選別
平均的に各標本から５，８００万件のデータが収集され、データの８９．９％がマウスの参照ゲノムに整列された。少なくとも一つのサンプルでＦＰＫＭ＞１の遺伝子は、以前に記述されたように発現することが明らかにされた（Ｇｒａｖｅｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。それぞれのサンプルのＦＰＫＭ値を集めた後に、ｌｏｇ２に変換されたＦＰＫＭ値に量子正規化（Ｂｏｌｓｔａｄ ｅｔ ａｌ．，２００３）を適用した。ＤＥＧを識別するために、このような正規値を以前に報告された統合統計テスト（Ｌｅｅなど、２０１０）を使って次のような比較を行った。前記比較は、Ｓｕｐ－ｔｒｅａｔｅｄ ｓａｍｐｌｅｓとＣｏｎｔｒｏｌを（Ｓｕｐ）、２－ＰＦ処理されたサンプルとＣｏｎｔｒｏｌ（２－ＰＦ）を比較することである。まず、各遺伝子に対してＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔを行って、Ｔ－ｖａｌｕｅを得た後に、無作為標本抽出実験を１，０００回行い、これを通じて得られたＴ値にガウスカーネル密度推定を適用した。Ｔ値に対する経験的ヌル分布を生成した。また、各遺伝子に対して、観察されたＴ値の補正Ｐ値は、両側検定法による経験的分布を使って計算された。ＤＥＧは、補正されたＰ値が０．０５未満であり、絶対ｌｏｇ２－ｍｅｄｉａｎ－ｒａｔｉｏ＞ｃｕｔｏｆｆ（Ｓｕｐ ｖｓ 対照群の場合、ｌｏｇ２倍数変化＝０．４１および０．５４、対照群の場合、２ ｖｓ ＰＦ）遺伝子であることが確認された。
平均的に各標本から５，８００万件のデータが収集され、データの８９．９％がマウスの参照ゲノムに整列された。少なくとも一つのサンプルでＦＰＫＭ＞１の遺伝子は、以前に記述されたように発現することが明らかにされた（Ｇｒａｖｅｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。それぞれのサンプルのＦＰＫＭ値を集めた後に、ｌｏｇ２に変換されたＦＰＫＭ値に量子正規化（Ｂｏｌｓｔａｄ ｅｔ ａｌ．，２００３）を適用した。ＤＥＧを識別するために、このような正規値を以前に報告された統合統計テスト（Ｌｅｅなど、２０１０）を使って次のような比較を行った。前記比較は、Ｓｕｐ－ｔｒｅａｔｅｄ ｓａｍｐｌｅｓとＣｏｎｔｒｏｌを（Ｓｕｐ）、２－ＰＦ処理されたサンプルとＣｏｎｔｒｏｌ（２－ＰＦ）を比較することである。まず、各遺伝子に対してＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔを行って、Ｔ－ｖａｌｕｅを得た後に、無作為標本抽出実験を１，０００回行い、これを通じて得られたＴ値にガウスカーネル密度推定を適用した。Ｔ値に対する経験的ヌル分布を生成した。また、各遺伝子に対して、観察されたＴ値の補正Ｐ値は、両側検定法による経験的分布を使って計算された。ＤＥＧは、補正されたＰ値が０．０５未満であり、絶対ｌｏｇ２－ｍｅｄｉａｎ－ｒａｔｉｏ＞ｃｕｔｏｆｆ（Ｓｕｐ ｖｓ 対照群の場合、ｌｏｇ２倍数変化＝０．４１および０．５４、対照群の場合、２ ｖｓ ＰＦ）遺伝子であることが確認された。
【0068】
カットオフは、上記で説明した無作為標本抽出実験で得られたｌｏｇ２倍数変化の分布で５番目および９５番目の百分位数値の平均として決定した。遺伝子オントロジー生物学的過程（ＧＯＢＰ）のエンリッチメント解析は、ＤＡＶＩＤソフトウェアを使って行われた（Ｈｕａｎｇ ｄａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。結果的に、濃縮されたＧＯＢＰは、ＤＡＶＩＤから計算されたＰ＜０．０５であり、カウントは、≧３であった。
【0069】
２７．ｃＡＭＰ ＥＬＩＳＡ ａｓｓａｙ
初代小膠細胞を４８ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（２×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に接種し、３０分間３０μＭ ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（＃Ｆ３９１７，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、または２－ＰＦ（１０，１００，５００μＭ）で処理した。抑制剤の効果を確認するために、１ｍＭ ｏｆ ＳＱ２２５３６（＃１７３１８－３１－９；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を３０分間前処理した。細胞を１０分間０．１Ｍ ｏｆ ＨＣｌ ｗｉｔｈ １％ｔｒｉｔｏｎ × １００ ｆｏｒ １０ｍｉｎ溶液で溶解させ、溶解液を６００Хｇの強度で２分間遠心分離させた。前記上澄み液は、直接ｃＡＭＰ ＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて製造メーカーのプロトコルに従ってｃＡＭＰ分析に使用した。光学密度は、４０５ｎｍでＶｅｒｓａＭａｘ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使って分析した。
初代小膠細胞を４８ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（２×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に接種し、３０分間３０μＭ ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（＃Ｆ３９１７，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、または２－ＰＦ（１０，１００，５００μＭ）で処理した。抑制剤の効果を確認するために、１ｍＭ ｏｆ ＳＱ２２５３６（＃１７３１８－３１－９；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を３０分間前処理した。細胞を１０分間０．１Ｍ ｏｆ ＨＣｌ ｗｉｔｈ １％ｔｒｉｔｏｎ × １００ ｆｏｒ １０ｍｉｎ溶液で溶解させ、溶解液を６００Хｇの強度で２分間遠心分離させた。前記上澄み液は、直接ｃＡＭＰ ＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて製造メーカーのプロトコルに従ってｃＡＭＰ分析に使用した。光学密度は、４０５ｎｍでＶｅｒｓａＭａｘ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使って分析した。
【0070】
２８．カルシウムイメージング
ｐｏｌｙ－Ｄ－ｌｙｓｉｎｅでコーティングされた１８ｍｍ口径顕微鏡ｃｏｖｅｒ ｇｌａｓｓｅｓ（＃０１１１５８０；Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ）に新しく分離した小膠細胞を位置させ、２４時間後に、前記小膠細胞は、ｓｕｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｃｈａｍｂｅｒで３０分間培養させる。前記チャンバーは、０．２２μｍでろ過したＲｉｎｇｅｒ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１１５ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＣａＣｌ２，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，４．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４）中に４μＭ ｏｆ Ｆｕｒａ－２／ＡＭ（Ｃａ２＋－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ；＃Ｆ１２２１；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が一緒にあるものである。前記カルシウム染色培養後に、チャンバーは、反転した顕微鏡に位置させ、３－ＰＦ処理前にＲｉｎｇｅｒ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎで２０分間洗浄した。この際、前記溶液のｆｌｏｗ ｒａｔｅは、１２ｍｌ／ｍｉｎである。次に、初代小膠細胞に３００μＭ ＡＴＰ（＃Ａ２３８３；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を５秒間処理させた。その後、５分間洗浄後、１００μＭ濃度の２－ペンチルフラン溶液で５秒間初代小膠細胞を処理した。この段階は、２つの濃度（３００および１０００μＭ）の２－ペンチルフラン溶液で進行された。最後に、３００μＭ ＡＴＰ溶液を５秒間処理する。放出された蛍光物質は、２秒ごとにＣＣＤカメラを用いて撮影された。Ｐｓｅｕｄｏ－ｃｏｌｏｒ ｉｍａｇｅｓは、ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｈａｎｇｅｓ（ΔＦ／Ｆ、Δ［Ｃａ２＋］ｉ）を用いて変換された。また、このイメージは、細胞内部のカルシウムイオンの変化を示す。撮影されたイメージの色強度は、最大１．５±０．１ＡＵ（ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｌｉｎｅａｒ ｕｎｉｔｓ）および最小０．４±０．１ＡＵに設定された。代表的は、カルシウムイオンピークは、１６０個の細胞を分析した後に選択された。
ｐｏｌｙ－Ｄ－ｌｙｓｉｎｅでコーティングされた１８ｍｍ口径顕微鏡ｃｏｖｅｒ ｇｌａｓｓｅｓ（＃０１１１５８０；Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ）に新しく分離した小膠細胞を位置させ、２４時間後に、前記小膠細胞は、ｓｕｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｃｈａｍｂｅｒで３０分間培養させる。前記チャンバーは、０．２２μｍでろ過したＲｉｎｇｅｒ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１１５ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＣａＣｌ２，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，４．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４）中に４μＭ ｏｆ Ｆｕｒａ－２／ＡＭ（Ｃａ２＋－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ；＃Ｆ１２２１；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が一緒にあるものである。前記カルシウム染色培養後に、チャンバーは、反転した顕微鏡に位置させ、３－ＰＦ処理前にＲｉｎｇｅｒ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎで２０分間洗浄した。この際、前記溶液のｆｌｏｗ ｒａｔｅは、１２ｍｌ／ｍｉｎである。次に、初代小膠細胞に３００μＭ ＡＴＰ（＃Ａ２３８３；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を５秒間処理させた。その後、５分間洗浄後、１００μＭ濃度の２－ペンチルフラン溶液で５秒間初代小膠細胞を処理した。この段階は、２つの濃度（３００および１０００μＭ）の２－ペンチルフラン溶液で進行された。最後に、３００μＭ ＡＴＰ溶液を５秒間処理する。放出された蛍光物質は、２秒ごとにＣＣＤカメラを用いて撮影された。Ｐｓｅｕｄｏ－ｃｏｌｏｒ ｉｍａｇｅｓは、ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｈａｎｇｅｓ（ΔＦ／Ｆ、Δ［Ｃａ２＋］ｉ）を用いて変換された。また、このイメージは、細胞内部のカルシウムイオンの変化を示す。撮影されたイメージの色強度は、最大１．５±０．１ＡＵ（ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｌｉｎｅａｒ ｕｎｉｔｓ）および最小０．４±０．１ＡＵに設定された。代表的は、カルシウムイオンピークは、１６０個の細胞を分析した後に選択された。
【0071】
２９．Ｃｈｅｍｉｃａｌｓおよびｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ
本実験で使用された化学物質は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。購入したすべての化合物は、次の通りである：Ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（＃６９５０９２）、ａｃｅｔｏｎｅ（＃Ｗ３３２６０７）、２－ａｍｉｎｏａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ（＃Ｗ３９０６０７）、ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｉｄｅ（＃４７１５７７）、ｅｔｈａｎｏｌ（＃Ｅ７０２３）、ｈｅｘａｎａｌ（＃１１５６０６）、ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｓｕｌｆｉｄｅ（＃７４２５４６）、ｉｎｄｏｌｅ（＃Ｗ２５９３０６）、ｉｓｏｐｅｎｔａｎｏｌ（＃３２００２１）、２－ｐｅｎｔｙｌｆｕｒａｎ（＃Ｗ３３１７０８）、ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（＃Ｗ３２４１０８）、ｆｕｒａｎ（＃１８５９２２）、２－ｍｅｔｈｙｌｆｕｒａｎ（＃Ｍ４６８４６）、２，３－ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｕｒａｎ（＃４２８４６９）、２－ｅｔｈｙｌｆｕｒａｎ（＃Ｗ３６７３０３）、２－ｐｒｏｐｙｌｆｕｒａｎ（＃Ｐ１４８８；東京化成工業株式会社ｔｒｙ，ＴＣＩ）、２－ｂｕｔｙｌｆｕｒａｎ（＃ＣＤＳ００１２０４）、２－ｔ－ｂｕｔｙｌｆｕｒａｎ（＃３８６２７８）、２－ｈｅｘｙｌｆｕｒａｎ（＃Ｈ２６６９８；Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）、およびＤＭＳＯに希釈された２－ｈｅｐｔｙｌｆｕｒａｎ（＃Ａ１０６０４；ＡｌｆａＡｅｓａｒ）（＃Ｄ２６５０；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）。ＤＭＳＯに希釈されたＡＴＰ（＃Ａ２３８３；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）。ＤＭＳＯに希釈されたａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ、ＰＫＡ、ＥＲＫ、Ｇ、およびＰＬＣ経路の抑制剤、次の濃度による抑制剤：ｐｄ９８０５９ ５０μＭ（＃ＰＨＺ１１６４；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、３００μＭ ＳＱ２２５３６（＃５６８５００；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、５μＭ Ｕ７３１２２（＃６６２０３５；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、１０μＭ Ｈ－８９（＃ｔｌｒｌ－ｈ８９；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、および１０μＭ Ｇａｌｌｅｉｎ（＃３７１７０９；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ．また、それぞれの抑制剤は、実験１時間前に前処理された。
本実験で使用された化学物質は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。購入したすべての化合物は、次の通りである：Ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（＃６９５０９２）、ａｃｅｔｏｎｅ（＃Ｗ３３２６０７）、２－ａｍｉｎｏａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ（＃Ｗ３９０６０７）、ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｉｄｅ（＃４７１５７７）、ｅｔｈａｎｏｌ（＃Ｅ７０２３）、ｈｅｘａｎａｌ（＃１１５６０６）、ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｓｕｌｆｉｄｅ（＃７４２５４６）、ｉｎｄｏｌｅ（＃Ｗ２５９３０６）、ｉｓｏｐｅｎｔａｎｏｌ（＃３２００２１）、２－ｐｅｎｔｙｌｆｕｒａｎ（＃Ｗ３３１７０８）、ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（＃Ｗ３２４１０８）、ｆｕｒａｎ（＃１８５９２２）、２－ｍｅｔｈｙｌｆｕｒａｎ（＃Ｍ４６８４６）、２，３－ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｕｒａｎ（＃４２８４６９）、２－ｅｔｈｙｌｆｕｒａｎ（＃Ｗ３６７３０３）、２－ｐｒｏｐｙｌｆｕｒａｎ（＃Ｐ１４８８；東京化成工業株式会社ｔｒｙ，ＴＣＩ）、２－ｂｕｔｙｌｆｕｒａｎ（＃ＣＤＳ００１２０４）、２－ｔ－ｂｕｔｙｌｆｕｒａｎ（＃３８６２７８）、２－ｈｅｘｙｌｆｕｒａｎ（＃Ｈ２６６９８；Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）、およびＤＭＳＯに希釈された２－ｈｅｐｔｙｌｆｕｒａｎ（＃Ａ１０６０４；ＡｌｆａＡｅｓａｒ）（＃Ｄ２６５０；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）。ＤＭＳＯに希釈されたＡＴＰ（＃Ａ２３８３；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）。ＤＭＳＯに希釈されたａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ、ＰＫＡ、ＥＲＫ、Ｇ、およびＰＬＣ経路の抑制剤、次の濃度による抑制剤：ｐｄ９８０５９ ５０μＭ（＃ＰＨＺ１１６４；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、３００μＭ ＳＱ２２５３６（＃５６８５００；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、５μＭ Ｕ７３１２２（＃６６２０３５；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、１０μＭ Ｈ－８９（＃ｔｌｒｌ－ｈ８９；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、および１０μＭ Ｇａｌｌｅｉｎ（＃３７１７０９；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ．また、それぞれの抑制剤は、実験１時間前に前処理された。
【0072】
３０．統計的分析法
本実験ですべてのデータは、平均±ＳＥＭで表示された。統計的有意性は、測定を繰り返したり、ｔｈｅ ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いてｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｖａｌｕｅｓをｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ方法で測定した。
本実験ですべてのデータは、平均±ＳＥＭで表示された。統計的有意性は、測定を繰り返したり、ｔｈｅ ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いてｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｖａｌｕｅｓをｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ方法で測定した。
【0073】
実施例１．Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる代謝物の小膠細胞の活性化有無の確認
病的行動は、過多サイトカインの分泌により誘発される症状の一つであることが知られている（Ｄａｎｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８）。本実験では、マウスの腹腔内にＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ培養液を注射後にマウスの移動性を測定して、病的行動の誘導可否と反応を確認した。マウスに現れる反応中の摂取の変化、体重の変化、体重や体温などの変化は、即刻反応に該当した。実験者らは、マウスの移動性変化量に集中した（Ｄａｎｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８）。腹腔内注射後にマウスの移動性が大幅に（Ｐ＜０．０１）減少することを確認し、このような変化は、注射量にも有意的な依存性があった（図１参照）。これとは対照的に、対照群を腹腔内に投入したマウスの場合、症状の訴えがないことを観察できた。このような症状の訴え、病的行動は、免疫系の過多サイトカイン分泌によるものであって（Ｋｏｎｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）、実際マウスのサイトカイン分泌の有無を確認するために、大脳皮質におけるサイトカインｍＲＮＡレベルを測定して比較した。この際、分析方法としては、ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ｑＰＴ－ＰＣＲ）を利用した。実験群において腹腔内注射は、大脳皮質における炎症性、そして非炎症性サイトカインの分泌を対照群と比較したとき、全部有意的に（Ｐ＜１．０×１０－３）増加したことを確認できた（図２参照）。感染後の小膠細胞と星状細胞は、それぞれ全部ｐｒｏとａｎｔｉサイトカインを分泌することが知られており（Ｎｏｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、本発明者らは、小膠細胞と星状細胞を腹腔内に注射した場合、２つのうちいずれかの場合において優先的にサイトカイン分泌が上昇するかを調査した。結果的に、５個のサイトカインのｍＲＮＡの分泌の有意的な（Ｐ＜１．０×１０－３）上昇が小膠細胞において確認された。Ｔｎｆ、Ｉｌ６、Ｉｌ１ｂ、Ｉｌ１０、Ｉｌ１３サイトカインがそれであり、これらは、全部小膠細胞の注入時に上昇したが、星状細胞の注入によってはそうでなかった（図３参照）。またＴｎｆ、Ｉｌ６、Ｉｌ１ｂの増加は、また、用量依存的であることを確認できた（図４参照）。
病的行動は、過多サイトカインの分泌により誘発される症状の一つであることが知られている（Ｄａｎｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８）。本実験では、マウスの腹腔内にＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ培養液を注射後にマウスの移動性を測定して、病的行動の誘導可否と反応を確認した。マウスに現れる反応中の摂取の変化、体重の変化、体重や体温などの変化は、即刻反応に該当した。実験者らは、マウスの移動性変化量に集中した（Ｄａｎｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８）。腹腔内注射後にマウスの移動性が大幅に（Ｐ＜０．０１）減少することを確認し、このような変化は、注射量にも有意的な依存性があった（図１参照）。これとは対照的に、対照群を腹腔内に投入したマウスの場合、症状の訴えがないことを観察できた。このような症状の訴え、病的行動は、免疫系の過多サイトカイン分泌によるものであって（Ｋｏｎｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）、実際マウスのサイトカイン分泌の有無を確認するために、大脳皮質におけるサイトカインｍＲＮＡレベルを測定して比較した。この際、分析方法としては、ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ｑＰＴ－ＰＣＲ）を利用した。実験群において腹腔内注射は、大脳皮質における炎症性、そして非炎症性サイトカインの分泌を対照群と比較したとき、全部有意的に（Ｐ＜１．０×１０－３）増加したことを確認できた（図２参照）。感染後の小膠細胞と星状細胞は、それぞれ全部ｐｒｏとａｎｔｉサイトカインを分泌することが知られており（Ｎｏｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、本発明者らは、小膠細胞と星状細胞を腹腔内に注射した場合、２つのうちいずれかの場合において優先的にサイトカイン分泌が上昇するかを調査した。結果的に、５個のサイトカインのｍＲＮＡの分泌の有意的な（Ｐ＜１．０×１０－３）上昇が小膠細胞において確認された。Ｔｎｆ、Ｉｌ６、Ｉｌ１ｂ、Ｉｌ１０、Ｉｌ１３サイトカインがそれであり、これらは、全部小膠細胞の注入時に上昇したが、星状細胞の注入によってはそうでなかった（図３参照）。またＴｎｆ、Ｉｌ６、Ｉｌ１ｂの増加は、また、用量依存的であることを確認できた（図４参照）。
【0074】
しかも、小膠細胞の活性化時に既存の分裂した形態からアメーバ形態に形態学的変化をもたらし、同時に段階の数とそれぞれの長さも増加させることが知られている（Ｋｒｅｕｔｚｂｅｒｇ、１９９６）。本発明者らは、上記のような形態学的変化を確認するために、対照群とｍｉｃｒｏｇｌｉａ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｇｇｅｄ ＧＦＰを用いてＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／＋ｍｉｃｅにおけるＧＦＰの強度を比較した。その結果、ＧＦＰの強度は、対照群と比較したとき、小膠細胞が腹腔内注射された群において有意的に（Ｐ＜１．０×１０－３）高いことを確認できた。これは、２－ＰＦの注入により小膠細胞の活性化が起こり、このような活性化によって小膠細胞の数と長さが増加することを意味する（図５参照）。しかも、時間が経過するほど小膠細胞が活性化し、形状が変化することを確認できる。これは、既存の分裂した形態からアメーバ形態への変化である。また、対照群に比べてＳｕｐを注入した実験群の小膠細胞のＧＦＰ強度が有意的に（Ｐ＜１．０×１０－３）高いことが分かった。したがって、２－ｐｅｎｔｙｌｆｕｒａｎ注入後に小膠細胞の活性化が起こり、形態学的変化も起こるという結論に至ることになる（図６～図８参照）。
【0075】
【0076】
実施例２．２－ｐｅｎｔｙｌｆｕｒａｎの小膠細胞Ｏｌｆｒ１１０との相互作用の有無の確認
本発明者は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから放出された代謝物が嗅覚受容体に結合して小膠細胞の活性化を誘導できるという仮設をたてた。１次的に嗅覚受容体候補を決定するために、初代小膠細胞のｍＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ分析を施行した。これによって発見された１３個の嗅覚受容体は、Ｏｌｆｒ１１１、Ｏｌｆｒ１１０、Ｏｌｆｒ４８２、Ｏｌｆｒ９９、Ｏｌｆｒ１３２、Ｏｌｆｒ１１５、Ｏｌｆｒ７７、Ｏｌｆｒ５４３、Ｏｌｆｒ４６１、Ｏｌｆｒ４５５、Ｏｌｆｒ１４２０、Ｏｌｆｒ１４１７、およびＯｌｆｒ５７であり、このうち、Ｏｌｆｒ１１１／１１０が最も多く発現することを確認できた（図１１参照）。また、遺伝子表現型データベース（ＧＳＥ５２５６４；（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）を用いて小膠細胞で発現する７種類の嗅覚受容体を追加で発見した（Ｏｌｆｒ１１０、Ｏｌｆｒ１１１、Ｏｌｆｒ９９、Ｏｌｆｒ１０２９、Ｏｌｆｒ４３３、Ｏｌｆｒ２２２、およびＯｌｆｒ９２０）。このような７個の嗅覚受容体は、Ｏｌｆｒ１１１／１１０を含み、他の細胞と比較すると、小膠細胞において特に発現するものである。このような過程を統合して合計１７個の候補受容体を算出した。
本発明者は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから放出された代謝物が嗅覚受容体に結合して小膠細胞の活性化を誘導できるという仮設をたてた。１次的に嗅覚受容体候補を決定するために、初代小膠細胞のｍＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ分析を施行した。これによって発見された１３個の嗅覚受容体は、Ｏｌｆｒ１１１、Ｏｌｆｒ１１０、Ｏｌｆｒ４８２、Ｏｌｆｒ９９、Ｏｌｆｒ１３２、Ｏｌｆｒ１１５、Ｏｌｆｒ７７、Ｏｌｆｒ５４３、Ｏｌｆｒ４６１、Ｏｌｆｒ４５５、Ｏｌｆｒ１４２０、Ｏｌｆｒ１４１７、およびＯｌｆｒ５７であり、このうち、Ｏｌｆｒ１１１／１１０が最も多く発現することを確認できた（図１１参照）。また、遺伝子表現型データベース（ＧＳＥ５２５６４；（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）を用いて小膠細胞で発現する７種類の嗅覚受容体を追加で発見した（Ｏｌｆｒ１１０、Ｏｌｆｒ１１１、Ｏｌｆｒ９９、Ｏｌｆｒ１０２９、Ｏｌｆｒ４３３、Ｏｌｆｒ２２２、およびＯｌｆｒ９２０）。このような７個の嗅覚受容体は、Ｏｌｆｒ１１１／１１０を含み、他の細胞と比較すると、小膠細胞において特に発現するものである。このような過程を統合して合計１７個の候補受容体を算出した。
【0077】
また、病原菌と関連したパターンを認知する多くの受容体は、効果的免疫反応のために病原菌感染により誘導されることがある（Ｗｏｒｎｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００６）。したがって、本発明者らは、まず、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いてＳｕｐ処理後に１７個の嗅覚受容体候補が初代小膠細胞から誘導されたか否かを調査した。結果的に、Ｓｕｐの処理がＯｌｆｒ１１０／１１１を最も多く増加させ、後にＯｌｆｒ９２０、Ｏｌｆｒ１４１７、Ｏｌｆｒ９９が続くことを確認できた（図１２参照）。次に、この５個の候補嗅覚受容体がＳｕｐの揮発性分子と反応するかを調査した。
【0078】
小膠細胞のｍＲＮＡ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓを通じて、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する１１個の揮発性代謝物を選別した（Ｏｌｆｒ１１１、Ｏｌｆｒ１１０、Ｏｌｆｒ４８２、Ｏｌｆｒ９９、Ｏｌｆｒ１３２、Ｏｌｆｒ１１５、Ｏｌｆｒ７７、Ｏｌｆｒ５４３、Ｏｌｆｒ４６１、Ｏｌｆｒ４５５、Ｏｌｆｒ１４２０、Ｏｌｆｒ１４１７、およびＯｌｆｒ５７）。このような１１個の代謝物を用いて候補嗅覚受容体を瞬間的に感染させた後、活性化することを確認した後に、Ｈａｎａ３Ａ細胞とともにルシフェラーゼ分析（ＺｈｕａｎｇおよびＭａｔｓｕｎａｍｉ、２００８）を使って反応性を確認した。１１個の代謝物のうち、特に２－ＰＦに強い反応性を示すことを確認できた。残りの３つの受容体は、エタノールにも高い反応性を示したが、ＭＯＣＫにも反応したことから見て、これは、非特異的反応と見える。したがって、このような結果は、Ｏｌｆｒ１１０／１１１が２－ｐｅｎｔｙｌｆｕｒａｎに対する選択的リガンドとして作用できることを意味する（図１３参照）。
【0079】
２－ＰＦ－ＯＲを追加評価するために、分子的に受容体を分析した。より具体的に、ルシフェラーゼ分析法を使って２－ＰＦをＯｌｆｒ１１０／１１１で処理した後に反応性を比較した。このようなアナログには、２－ＰＦ、２－ｂｕｔｙｌｆｕｒａｎ、２－ｔ－ｂｕｔｙｌｆｕｒａｎ、２－ｈｅｘｙｌｆｕｒａｎ、および２－ｐｒｏｐｙｌｆｕｒａｎの５個のフランが含まれていた。５個のフランは、Ｏｌｆｒ１１０／１１１に対して全部反応性を示した（図１４～図１６参照）。特に、これらのうち２－ＰＦが最も大きい反応性を示し、特にＯｌｆｒ１１０と最も強い反応性を示した（データ不図示）。Ｏｌｆｒ１１０の相同性モデリングとＯｌｆｒ１１０と２－ＰＦ間のドッキング分析方法を用いて２－ＰＦに結合するＯｌｆｒ１１０の重要残基を調査した。Ｏｌｆｒ１１０のアミノ酸を予測したドッキング分析は、２－ＰＦと膜貫通領域３のＦ１０２、Ｆ１０４と膜貫通領域６のＹ２５２とＹ２５９のような疎水性相互作用に重要である（図１７参照）。その中でも、ＭＯＲ２５６－３による嗅覚的認識にＦ１０４、Ｙ２５２が特に重要であることが分かった。ルシフェラーゼ分析により予測された４つの残基（Ｆ１０２、Ｆ１０４、Ｙ２５２およびＹ２５９）のうち一つ、あるいは多重の位置指定突然変異誘発方法を用いて分析を進めた。その結果、Ｆ１０４Ｗ突然変異の場合、ルシフェラーゼ活性を完全に喪失したが、これは、Ｆ１０４が２－ＰＦとＯｌｆｒ１１０間の相互作用で最も重要な役割を行っていることを示す（図１８参照）。２－ＰＦを処理してから、細胞走化性分析を通じてＯｌｆｒ１１０／１１１処理した細胞が濃度に比例して移動が増加することが分かった。このようなデータは、前記２－ＰＦとＯｌｆｒ１１０間の相互作用が細胞移動を増加させるなど、細胞機能を変化させることができることを示す（図１９参照）。
【0080】
実施例３．２－ｐｅｎｔｙｌｆｕｒａｎによる小膠細胞の活性化の確認
３．１．２－ＰＦによる小膠細胞の活性化有無の確認
次に、ｌｉｑｕｉｄ－ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔａｎｄｅｍｍａｓｓ－ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）分析を用いてＳｕｐに２－ＰＦが存在するかを確認した。ｌｉｑｕｉｄ－ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔａｎｄｅｍｍａｓｓ－ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を使って２－ＰＦに関するデータを得た後、質量電荷比を用いて２－ＰＦイオン前駆体を確認した（ｍ／ｚ＝１５３．０９１）。結果的に、前駆体イオンは、Ｓｕｐ中では確認されたが、対照群では確認されなかった（図２０参照）。また、合成２－ＰＦのＳｕｐにおいて同じＭＳスペクトルを有することを確認した（図２１参照）。Ｆ１０２で処理した場合と、Ｆ１０４で処理した場合、２－ＰＦ前駆体イオンの強度を比較した結果、Ｆ１０４を処理した場合、Ｆ１０２を処理した場合よりさらに強度が増加したこと（５６．０倍）を確認できた（図２２参照）。このような結果は、Ｓｕｐに２－ＰＦが具体的に存在することを意味する。また、Ｓｕｐにおいて２－ＰＦが小膠細胞の活性化を誘発するかを調査するために、２－ＰＦを１００、３００、５００μＭで処理し、１次的に小膠細胞を処理した。結果的に、小膠細胞の濃度勾配に比例して有意的に（Ｐ＜１．０×１０－３）細胞走化性（図２３参照）、活性酸素分泌（図２４参照）、食作用（図２５参照）が増加することを確認できた。
３．１．２－ＰＦによる小膠細胞の活性化有無の確認
次に、ｌｉｑｕｉｄ－ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔａｎｄｅｍｍａｓｓ－ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）分析を用いてＳｕｐに２－ＰＦが存在するかを確認した。ｌｉｑｕｉｄ－ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔａｎｄｅｍｍａｓｓ－ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を使って２－ＰＦに関するデータを得た後、質量電荷比を用いて２－ＰＦイオン前駆体を確認した（ｍ／ｚ＝１５３．０９１）。結果的に、前駆体イオンは、Ｓｕｐ中では確認されたが、対照群では確認されなかった（図２０参照）。また、合成２－ＰＦのＳｕｐにおいて同じＭＳスペクトルを有することを確認した（図２１参照）。Ｆ１０２で処理した場合と、Ｆ１０４で処理した場合、２－ＰＦ前駆体イオンの強度を比較した結果、Ｆ１０４を処理した場合、Ｆ１０２を処理した場合よりさらに強度が増加したこと（５６．０倍）を確認できた（図２２参照）。このような結果は、Ｓｕｐに２－ＰＦが具体的に存在することを意味する。また、Ｓｕｐにおいて２－ＰＦが小膠細胞の活性化を誘発するかを調査するために、２－ＰＦを１００、３００、５００μＭで処理し、１次的に小膠細胞を処理した。結果的に、小膠細胞の濃度勾配に比例して有意的に（Ｐ＜１．０×１０－３）細胞走化性（図２３参照）、活性酸素分泌（図２４参照）、食作用（図２５参照）が増加することを確認できた。
【0081】
次に、実験マウスの脳で２－ＰＦにより誘導された代謝物に対する実験を進めた。小膠細胞においてＯｌｆｒ１１０が発現することを調査し、抗体を利用するウェスタンブロットを用いてＯｌｆｒ１１０が小膠細胞において特異的に発現するが、嗅覚組織や星状細胞ではそうではないという点を確認した（図２６参照）。
【0082】
免疫染色法（ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）は、Ｏｌｆｒ１１０で強い発現を確認するが、ＧＦＡＰ陽性の星状細胞（ＧＦＡＰ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）や大脳皮質のＮｅｕＮ陽性ニューロン（ＮｅｕＮ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ）、ＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／＋ｍｉｃｅのＧＦＰ陽性の小膠細胞（ＧＦＰ（＋）ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ｏｆ ＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／＋ｍｉｃｅ）ではそうではなかった（図２８参照）。大脳皮質と海馬、視床下部、黒色質のような多様な大脳部分では、Ｉｂａ－１－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ中の特定のＯｌｆｒ１１０表現が観察される（データ不図示）。Ｓｕｐ処理がＯｌｆｒ１１０のｍＲＮＡ発現レベルを誘導し（図２１参照）、Ｏｌｆｒ１１０のタンパク質レベルを増加させたことを示した（図２９参照、ｔｏｐ ｉｍａｇｅ）。興味深くにも、２－ＰＦは、有意的に（Ｐ＜１．０×１０－３）Ｏｌｆｒ１１０のレベルを増加させた（図２９参照、ｂｏｔｔｏｍ ｉｍａｇｅ）。２－ＰＦの注入により誘発された病的行動は、濃度に比例してマウスの移動性が減少する様相を示した（図３０参照）。２－ＰＦの注入は、また、炎症性サイトカインの発現レベルを有意的に（Ｐ＜０．０５）増加させた（Ｔｎｆ、Ｉｌ６、Ｉｌ１ｂ、およびＩｌ１０）（Ｆｉｇｕｒｅ ３Ｌ）。また、２－ＰＦ ｔｒｅａｔｅｄ ＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／＋ｍｉｃｅのＧＦＰ発現強度も、非常に増加させた（図３２参照）。このような結果は、２－ＰＦにより誘導された小膠細胞の形態学的変化が小膠細胞の活性化につながることができることを意味する。また、２－ＰＦがＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／＋マウスの脳切片において２－ＰＦ培養後に小膠細胞の体外食作用を変化させることができるか否かを調査した。Ｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｉｍａｇｉｎｇを通じて小膠細胞の容量、突出程度、食細胞作用の活性程度が増加することが分かった（図３３参照；マクロファージが顕著に（Ｐ＜１．０×１０－３）増加するほど、食作用（図２２参照）も増加することを見ることができた。総合してみると、このようなデータは、２－ＰＦが脳で小膠細胞を活性化させるという結論に到達する。
【0083】
３．２．病的行動の増加実験
小膠細胞の活性化による病的行動の増加は、分泌されるサイトカインの増加に起因することが知られている。サイトカインの増加とともに病的行動の増加を確認するために本実験が進行された。病的行動の評価は、前記マウスにＳｕｐまたは２－ＰＦのＩＰの注入後に行われた。
小膠細胞の活性化による病的行動の増加は、分泌されるサイトカインの増加に起因することが知られている。サイトカインの増加とともに病的行動の増加を確認するために本実験が進行された。病的行動の評価は、前記マウスにＳｕｐまたは２－ＰＦのＩＰの注入後に行われた。
【0084】
ＩＰの注入後に、四面が開放された空間（４０×４０×４０ｃｍ、ｗｈｉｔｅ ｆｉｅｌｄ，ｂｌａｃｋ ｗａｌｌ）にマウスを位置させ、３０分間カメラを使ってマウスの位置を記録した後、移動距離を計算した。その後、ＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ ＸＴ（Ｎｏｌｄｕｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いてｐｓｅｕｄｏ－ｃｏｌｏｒ ｈｅａｔ ｍａｐで作成した。
【0085】
３．３．Ｅｘ ｖｉｖｏにおける食作用の増加実験
本実験では、小膠細胞の食作用を調べるために、９週齢の雄ＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／＋マウスの脳をｖｉｂｒａｔｏｍｅ（Ｌｅｉｃａ ＶＴ１２００）を用いて厚さ１５０μｍに切り出した後、氷冷された人工脳脊髄液（ａＣＳＦ：１２０ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３，１．２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４，５ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＣａＣｌ２，１ｍＭ ＭｇＳＯ４，３０５ｍＯｓｍ ｇｌｕｃｏｓｅ，ｐＨ７．４）に保管した。その後、スライスされた脳を細胞破片の除去のために培養させた。酸素処理されたａＣＳＦを３７℃で２時間の間ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｃｈａｍｂｅｒで前処理した。引き続いて、培養前に９．１０×１０７ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（３６０／４０７ｍｍ；＃１７４５８；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む５００μｌのａＣＳＦとともに培養し、オーダーメード型ナイロングリッドで覆った。共焦点顕微鏡を使って９２分間１分間隔でＴｉｍｅ ｌａｐｓｅ動画を撮影した。食細胞作用をする小膠細胞の数をイメージから計算した。
本実験では、小膠細胞の食作用を調べるために、９週齢の雄ＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／＋マウスの脳をｖｉｂｒａｔｏｍｅ（Ｌｅｉｃａ ＶＴ１２００）を用いて厚さ１５０μｍに切り出した後、氷冷された人工脳脊髄液（ａＣＳＦ：１２０ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３，１．２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４，５ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＣａＣｌ２，１ｍＭ ＭｇＳＯ４，３０５ｍＯｓｍ ｇｌｕｃｏｓｅ，ｐＨ７．４）に保管した。その後、スライスされた脳を細胞破片の除去のために培養させた。酸素処理されたａＣＳＦを３７℃で２時間の間ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｃｈａｍｂｅｒで前処理した。引き続いて、培養前に９．１０×１０７ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（３６０／４０７ｍｍ；＃１７４５８；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む５００μｌのａＣＳＦとともに培養し、オーダーメード型ナイロングリッドで覆った。共焦点顕微鏡を使って９２分間１分間隔でＴｉｍｅ ｌａｐｓｅ動画を撮影した。食細胞作用をする小膠細胞の数をイメージから計算した。
【0086】
実施例４．Ｏｌｆｒ１１０の２－ＰＦによる小膠細胞の活性化調節の可否
本発明者らは、２－ＰＦにより誘導される小膠細胞の活性化がＯｌｆｒ１１０により仲介されるかを実験した。実験で、Ｏｌｆｒ１１０に対する特定ｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡを回復させるＯｌｆｒ１１０の特異的突然変異ベクター構造を設計した。４つのｓｉＲＮＡ候補のうち３番がＨａｎａ３Ａ細胞においてＯｌｆｒ１１０のｍＲＮＡとタンパク質レベルを効果的に減少させることができた。形質感染後、初代小膠細胞においてｍＲＮＡとタンパク質の減少を観察できたが、構造ベクターは、ｓｉＲＮＡにより誘発されたｍＲＮＡとタンパク質の減少を回復させた。このｓｉＲＮＡと構造ベクターを用いて、Ｏｌｆｒ１１０が２－ＰＦ誘発性小膠細胞の活性化に及ぼす影響を確認できた。第一に、Ｏｌｆｒ１１０の無力化は、２－ＰＦにより誘導された初代小膠細胞の炎症性サイトカインｍＲＮＡレベルの増加を減少させ、反対に、構造ベクターは、このような無力化による効果を回復させた。また、ｍＲＮＡだけでなく、タンパク質レベルでも同様の効果を観察できた。２－ＰＦにより誘導されて増加した活性酸素は、ｓｉＲＮＡにより減少し、構造ベクターによりさらに回復された。しかしながら、Ｐ２Ｙ受容体により仲介される活性酸素の増加は、構造ベクターの存在により影響を受けなかった。Ｏｌｆｒ１１０ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎおよびｒｅｓｃｕｅ ｅｆｆｅｃｔｓ後、食作用と細胞走化性においても２－ＰＦによる同様の現象を観察できた。
本発明者らは、２－ＰＦにより誘導される小膠細胞の活性化がＯｌｆｒ１１０により仲介されるかを実験した。実験で、Ｏｌｆｒ１１０に対する特定ｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡを回復させるＯｌｆｒ１１０の特異的突然変異ベクター構造を設計した。４つのｓｉＲＮＡ候補のうち３番がＨａｎａ３Ａ細胞においてＯｌｆｒ１１０のｍＲＮＡとタンパク質レベルを効果的に減少させることができた。形質感染後、初代小膠細胞においてｍＲＮＡとタンパク質の減少を観察できたが、構造ベクターは、ｓｉＲＮＡにより誘発されたｍＲＮＡとタンパク質の減少を回復させた。このｓｉＲＮＡと構造ベクターを用いて、Ｏｌｆｒ１１０が２－ＰＦ誘発性小膠細胞の活性化に及ぼす影響を確認できた。第一に、Ｏｌｆｒ１１０の無力化は、２－ＰＦにより誘導された初代小膠細胞の炎症性サイトカインｍＲＮＡレベルの増加を減少させ、反対に、構造ベクターは、このような無力化による効果を回復させた。また、ｍＲＮＡだけでなく、タンパク質レベルでも同様の効果を観察できた。２－ＰＦにより誘導されて増加した活性酸素は、ｓｉＲＮＡにより減少し、構造ベクターによりさらに回復された。しかしながら、Ｐ２Ｙ受容体により仲介される活性酸素の増加は、構造ベクターの存在により影響を受けなかった。Ｏｌｆｒ１１０ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎおよびｒｅｓｃｕｅ ｅｆｆｅｃｔｓ後、食作用と細胞走化性においても２－ＰＦによる同様の現象を観察できた。
【0087】
次に、本発明者らは、Ｏｌｆｒ１１０ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎおよびｒｅｓｃｕｅ効果がマウスの脳で発生したかを調査した。より具体的に、ＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／＋マウスの大脳皮質にｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡ＋Ｍｏｃｋ＋ｓｉＧＬＯ（Ｃｔｒｌの場合）、Ｏｌｆｒ１１０ ｓｉＲＮＡ＋Ｍｏｃｋ＋ｓｉＧＬＯ（ｓｉＯｌｆｒ１１０）、およびＯｌｆｒ１１０ ｓｉＲＮＡ＋ｒｅｓｃｕｅ ｖｅｃｔｏｒ＋ｓｉＧＬＯ（Ｒｅｓｃｕｅの場合）のような組み合わせをｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ注入した（Ｔａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。注入後、マウスの脳スライスで感染した小膠細胞（黄色）と感染しない小膠細胞（緑色）および感染した非小膠細胞（赤色）を比較して観察した（図３９参照）。スライスされた脳の切片で蛍光部分をｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔした後に、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いてＯｌｆｒ１１０の発現レベルを測定した。結果的に、ｓｉＯｌｆｒ１１０の注射後に、当該嗅覚受容体の有意的な（Ｐ＜１．０×１０－３）減少を発見し、同時に陰性対照群であるＯｌｆｒ９２０の場合に、このような変化がないことを観察できた。実験者らは、ＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／＋マウスの大脳皮質においても同様のｋｎｏｃｋｄｏｗｎおよびｒｅｓｃｕｅ効果を観察できた。総合してみると、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｅｘ ｖｉｖｏの両方でＯｌｆｒ１１０は、２－ＰＦにより誘導された小膠細胞の活性化（サイトカイン分泌、活性酸素の分泌、細胞毒性、食作用）を調節できるという結論が出る。
【0088】
実施例５．２－ＰＦにより誘導されるＯｌｆｒ１１０依存的小膠細胞活性化のＧ
αｓ
－ｓ－ｃＡＭＰ－ＰＫＡＥＲＫおよびＧ
βγ
－ＰＬＣ－Ｃａ
２＋
ｐａｔｈｗａｙｓ経路による調節の可否
Ｏｌｆｒ１１０を通した小膠細胞の活性化を分子的観点で理解するために、本実験では、Ｓｕｐまたは２－ＰＦで処理した初代小膠細胞のｍＲＮＡ－シーケンス分析を行った。ｍＲＮＡシーケンシングデータを使ってそれぞれ１１２４、１４３８個の表現された遺伝子（ＤＥＧｓ）を確認できた（図４２参照）。このような（ＤＥＧｓ）の有意的部分は（Ｐ＜０．０１）は、２５３個の遺伝子部分であり、本実験で２５３個の遺伝子（２２．５および１７．６％ ｏｆ １１２４および１４３８ ＤＥＧｓ）が２つの実験群の間で共有されることを確認した。２５３個の共有ＤＥＧの中で１３５および７８個の遺伝子が２－ＰＦ処理された小膠細胞においてそれぞれ一定にｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄあるいはｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｄされる形状を示したが、残りの４０個の遺伝子は、そうではなかった（図４３参照）。次に、ｇｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ（ＧＯＢＰｓ）分析方法を用いて上と下に重なるこのような重なり遺伝子と関連した調査を行った。ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄされる遺伝子は、小膠細胞活性と関連があった。活性化の具体的な内容は、次の通りである（図４４参照）：サイトカイン分泌（サイトカイン生成および分泌）、細胞走化性（血液細胞移動および走化性）、活性酸素生成（活性酸素および活性酸素代謝過程に対する細胞反応）および食作用である。このようなデータは、Ｓｕｐと２－ＰＦ処理した実験群の両方が小膠細胞の活性化を調節する遺伝子をｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄすることによって活性化を誘導する反面、ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ遺伝子は転写を調節することを意味する（データ不図示）。結果的に、Ｏｌｆｒ１１０に対する２－ＰＦの結合が小膠細胞活性化に関与し、これによって、ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄを誘導するシグナル伝達経路が活性化されるという事実を確認できた。このようなシグナル伝達システムを理解するために、サイトカイン生成、走化性、活性酸素生成および食作用に関連したシグナル伝達システムの相互作用を説明するネットワークモデルを再構成する必要があった（データ不図示）。新しく確立されたモデルは、ｃＡＭＰ、ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ、ＰＬＣ、およびＣａ２＋のシグナル伝達経路が小膠細胞の活性化に関与する遺伝子をｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄすることを確認し、これは、以前の研究結果と一致した（ＶｅｒｄｅｒｉｏおよびＭａｔｔｅｏｌｉ、２００１）。
Ｏｌｆｒ１１０を通した小膠細胞の活性化を分子的観点で理解するために、本実験では、Ｓｕｐまたは２－ＰＦで処理した初代小膠細胞のｍＲＮＡ－シーケンス分析を行った。ｍＲＮＡシーケンシングデータを使ってそれぞれ１１２４、１４３８個の表現された遺伝子（ＤＥＧｓ）を確認できた（図４２参照）。このような（ＤＥＧｓ）の有意的部分は（Ｐ＜０．０１）は、２５３個の遺伝子部分であり、本実験で２５３個の遺伝子（２２．５および１７．６％ ｏｆ １１２４および１４３８ ＤＥＧｓ）が２つの実験群の間で共有されることを確認した。２５３個の共有ＤＥＧの中で１３５および７８個の遺伝子が２－ＰＦ処理された小膠細胞においてそれぞれ一定にｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄあるいはｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｄされる形状を示したが、残りの４０個の遺伝子は、そうではなかった（図４３参照）。次に、ｇｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ（ＧＯＢＰｓ）分析方法を用いて上と下に重なるこのような重なり遺伝子と関連した調査を行った。ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄされる遺伝子は、小膠細胞活性と関連があった。活性化の具体的な内容は、次の通りである（図４４参照）：サイトカイン分泌（サイトカイン生成および分泌）、細胞走化性（血液細胞移動および走化性）、活性酸素生成（活性酸素および活性酸素代謝過程に対する細胞反応）および食作用である。このようなデータは、Ｓｕｐと２－ＰＦ処理した実験群の両方が小膠細胞の活性化を調節する遺伝子をｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄすることによって活性化を誘導する反面、ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ遺伝子は転写を調節することを意味する（データ不図示）。結果的に、Ｏｌｆｒ１１０に対する２－ＰＦの結合が小膠細胞活性化に関与し、これによって、ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄを誘導するシグナル伝達経路が活性化されるという事実を確認できた。このようなシグナル伝達システムを理解するために、サイトカイン生成、走化性、活性酸素生成および食作用に関連したシグナル伝達システムの相互作用を説明するネットワークモデルを再構成する必要があった（データ不図示）。新しく確立されたモデルは、ｃＡＭＰ、ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ、ＰＬＣ、およびＣａ２＋のシグナル伝達経路が小膠細胞の活性化に関与する遺伝子をｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄすることを確認し、これは、以前の研究結果と一致した（ＶｅｒｄｅｒｉｏおよびＭａｔｔｅｏｌｉ、２００１）。
【0089】
次に、確立されたネットワークモデルを用いて２－ＰＦの効果に対して実験した。ｃＡＭＰシグナル伝達経路の場合、２－ＰＦ処理後、初代小膠細胞においてｃＡＭＰ濃度を測定した。結果的に、ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ抑制剤により処理されたｃＡＭＰの場合、２－ＰＦ処理により小膠細胞の活性化が増加したことが確認され、これは、濃度依存的であった（図４５参照）。Ｏｌｆｒ１１０のｓｉＲＮＡを利用すると、２－ＰＦにより誘導されるｃＡＭＰの生産を減少させることができ、構造ベクターを注入する場合、反対の効果を得ることができた（図４６参照）。カルシウムシグナル経路の場合、２－ＰＦ処理後にカルシウムイメージングを行った。結果的に、細胞内のカルシウムイオンの濃度が注入量につれて増加することを確認できた（図４７参照）。ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋシグナル伝達経路に対して、ＥＲＫ、ｐ３８、ＪＮＫ、およびＡｋｔのリン酸化レベルを測定し、処理後にリン酸化レベルが２分から増加し、２０分で中止されることを確認できた。次に、このようなシグナル伝達経路の抑制剤を用いて小膠細胞の活性化に対する相対的寄与度を調査した。ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ（ＳＱ２２５３６）、ＰＫＡ（Ｈ－８９）、ＥＲＫ（ｐｄ９８０５９）、あるいはＰＬＣ抑制剤（Ｕ７３１２２）で前処理した後に、２－ＰＦタンパク質を処理し、ＴｎｆおよびＩｌ６ ｃｙｔｏｋｉｎｅの濃度を測定した。結果的に、ＳＱ２２５３６あるいはＨ－８９によっては大きい減少を、ｐｄ９８０５９あるいはＵ７３１２２によっては相対的に小さい減少を示すことを確認できた（図４９参照）。特にＵ７３１２２は、ＲＯＳの生成を完全に（Ｐ＜１．０×１０－３）抑制した（図５０参照）。活性酸素生成がＧαｓｓ－ｃＡＭＰ－ＰＫＡＥＲＫおよびＧβγ－ＰＬＣ－Ｃａ２＋経路の抑制剤であるｇａｌｌｅｉｎにより同様に抑制されることを確認できた（Ｂｏｎａｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｕｋｈａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。すべての阻害剤は、食作用を顕著に減少（Ｐ＜０．０５）させ、ほぼ完全に（Ｐ＜１．０×１０－３）細胞走化性を減少させた。ＣＲＥＢおよびＥＲＫのリン酸化は、ＳＱ２２５３６およびｐｄ９８０５９により大きく減少した（図５３参照）。本研究は、Ｇαｓ－ｃＡＭＰ－ＰＫＡ－ＥＲＫ経路がサイトカインの生産、細胞毒性、および食作用を調節する反面、Ｇβγ－ＰＬＣ－Ｃａ２＋経路は、ＲＯＳ生成を調節することを示す。
【0090】
実施例６．２－ＰＦの競合的抑制剤の選別
以前の研究により嗅覚受容体の場合、活性剤と抑制剤が構造的に関連があるという報告があった。これを基に本発明者らは、２－ＰＦと誘導体のうちでＯｌｆｒ１１０とＯｌｆｒ１１１１と結合しない誘導体（２－メチルフラン、２，３－ジメチルフラン、２－エチルフラン、２－ヘキシルフラン、または２－ヘプチルフラン）を同時に処理して、２－ＰＦの活性を減少させる２－エチルフラン（２－ｅｔｈｙｌｆｕｒａｎ、２－ＥＦ）を選別した。Ｈａｎａ３Ａ細胞にＯｌｆｒ１１０をｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした後、２－ＰＦを３００μＭで固定し、２－ＥＦを１μＭ～１０ｍＭまでそれぞれ異なる濃度で２－ＰＦとともに処理して競合的活性を測定し、２－ＥＦの濃度が増加するほど２－ＰＦの活性が減少することを確認した（Ｋｄ＝１２０μＭ）。結果的に、Ｏｌｆｒ１１０のａｇｏｎｉｓｔである２－ＰＦが誘導させた活性酸素は、その競合的抑制剤（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）の２－ＥＦにより減少する（図５４参照）。競合的抑制剤として選別された２－ＥＦの小膠細胞活性を確認するために、初代小膠細胞に２－ＥＦの濃度を０、１００、３００、および５００μＭで前処理し、１００ ＭＯＩのＳｕｐを処理し、活性酸素の生成量を測定した。結果的に、１００のＭＯＩにより生成された活性酸素は、２－ＥＦの濃度が増加するほど、生成された活性酸素の量が少なくなることを観察できた（図５５の左側を参照）。次に、Ｓｕｐに５のＭＯＩを処理し、同時に２－ＰＦを５００μＭ処理後、２－エチルフランの濃度を０、１００、３００、および５００μＭで同時に処理した。その後、活性酸素の濃度を測定した。その結果、ＭＯＩ５により活性酸素が生成され、また、５００μＭの２－ＰＦにより活性酸素の生成がさらに増加した（図５５の右側を参照）。しかしながら、添加された２－ＥＦの濃度が高いほど、生成された活性酸素の濃度が低いことを確認できた。これは、活性酸素が経済的抑制剤である２－ＥＦにより抑制された結果を得たことを意味する。
以前の研究により嗅覚受容体の場合、活性剤と抑制剤が構造的に関連があるという報告があった。これを基に本発明者らは、２－ＰＦと誘導体のうちでＯｌｆｒ１１０とＯｌｆｒ１１１１と結合しない誘導体（２－メチルフラン、２，３－ジメチルフラン、２－エチルフラン、２－ヘキシルフラン、または２－ヘプチルフラン）を同時に処理して、２－ＰＦの活性を減少させる２－エチルフラン（２－ｅｔｈｙｌｆｕｒａｎ、２－ＥＦ）を選別した。Ｈａｎａ３Ａ細胞にＯｌｆｒ１１０をｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした後、２－ＰＦを３００μＭで固定し、２－ＥＦを１μＭ～１０ｍＭまでそれぞれ異なる濃度で２－ＰＦとともに処理して競合的活性を測定し、２－ＥＦの濃度が増加するほど２－ＰＦの活性が減少することを確認した（Ｋｄ＝１２０μＭ）。結果的に、Ｏｌｆｒ１１０のａｇｏｎｉｓｔである２－ＰＦが誘導させた活性酸素は、その競合的抑制剤（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）の２－ＥＦにより減少する（図５４参照）。競合的抑制剤として選別された２－ＥＦの小膠細胞活性を確認するために、初代小膠細胞に２－ＥＦの濃度を０、１００、３００、および５００μＭで前処理し、１００ ＭＯＩのＳｕｐを処理し、活性酸素の生成量を測定した。結果的に、１００のＭＯＩにより生成された活性酸素は、２－ＥＦの濃度が増加するほど、生成された活性酸素の量が少なくなることを観察できた（図５５の左側を参照）。次に、Ｓｕｐに５のＭＯＩを処理し、同時に２－ＰＦを５００μＭ処理後、２－エチルフランの濃度を０、１００、３００、および５００μＭで同時に処理した。その後、活性酸素の濃度を測定した。その結果、ＭＯＩ５により活性酸素が生成され、また、５００μＭの２－ＰＦにより活性酸素の生成がさらに増加した（図５５の右側を参照）。しかしながら、添加された２－ＥＦの濃度が高いほど、生成された活性酸素の濃度が低いことを確認できた。これは、活性酸素が経済的抑制剤である２－ＥＦにより抑制された結果を得たことを意味する。
【0091】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で容易に変形が可能であることを理解できる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。
【産業上の利用可能性】
【0092】
本発明によれば、２－Ｐｅｎｔｙｌｆｕｒａｎが小膠細胞を活性化させ、これによって、前記細胞による食作用が増加することを確認したところ、これから２－Ｐｅｎｔｙｌｆｕｒａｎまたはその溶媒和物、立体異性体または薬学的に許容可能な塩は、上記のような結果から退行性脳疾患を誘発する物質を除去する効果により退行性脳疾患を予防または治療できるところ、退行性脳疾患の治療剤開発分野において既存の治療剤を代替できる有効物質として有用に用いられる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51】
【図52】
【図53】
【図54】
【図55】
