特許 7316222 長時間作用型インターロイキン－１５受容体作動薬並びに関連する免疫治療組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-07-19

(45)【発行日】2023-07-27

(54)【発明の名称】長時間作用型インターロイキン－１５受容体作動薬並びに関連する免疫治療組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/60 20170101AFI20230720BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20230720BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230720BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20230720BHJP

   C07K 14/54 20060101ALN20230720BHJP

【ＦＩ】

A61K47/60

A61K38/20 ZNA

A61P35/00

A61P37/04

C07K14/54

【請求項の数】 22

(21)【出願番号】P 2019563255

(86)(22)【出願日】2018-05-15

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-07-02

(86)【国際出願番号】 US2018032817

(87)【国際公開番号】W WO2018213341

(87)【国際公開日】2018-11-22

【審査請求日】2021-05-14

(31)【優先権主張番号】62/582,186

(32)【優先日】2017-11-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/536,966

(32)【優先日】2017-07-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/506,494

(32)【優先日】2017-05-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/648,240

(32)【優先日】2018-03-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】597148884

【氏名又は名称】ネクター セラピューティクス

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】カーク， ピーター ベネディクト

(72)【発明者】

【氏名】ジャン， ピン

(72)【発明者】

【氏名】ブリュワー， ペイウェン クオ

【審査官】菊池 美香

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１５／１５３７５３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Pharmaceutical Research, 2012, Vol. 29, pp.722-738

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３８／２０

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ａ６１Ｋ ４７／６０

Ａ６１Ｐ ３７／０４

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ｃ０７Ｋ １４／５４

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

【化31】

（式（Ｉ）について、
ＩＬ－１５は、インターロイキン－１５部分であり；
ｎは、約１５０～約３，０００であり、かつ約４０，０００ダルトンの重量平均分子量を有するポリエチレングリコールポリマーに対応する値を有する整数であり；
ｍは、３であり；
前記構造中の～ＮＨ～は、前記ＩＬ－１５部分のアミノ基を表す）
の構造を有する長時間作用型インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）受容体作動薬またはその薬学的に許容可能な塩形態を含む組成物であって、
ここで、ｎ’は、ＩＬ－１５アミノ基に共有結合したポリ（エチレングリコール）部分の数であり、前記組成物中のｎ’の平均数は、１．０～約１．３の範囲内である、組成物。

【請求項2】

請求項１に記載の組成物であって、前記長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬のうちの約１５モルパーセント以下が、式：

【化32】

（式（ＩＩ）について、変数ｎおよびｍは上記式（Ｉ）について定義したとおりである）
を有する、組成物。

【請求項3】

前記長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬のうちの約１０モルパーセント以下が、式（ＩＩ）を有する、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬のうちの約７モルパーセント以下が、式（ＩＩ）を有する、請求項２又は３に記載の組成物。

【請求項5】

前記長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬のうちの約５モルパーセント以下が、式（ＩＩ）を有する、請求項２～４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

前記組成物中のｎ’の平均数が、１．０、１．１、１．２及び約１．３の範囲内である、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

非修飾ＩＬ－１５のＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）と比較した場合、約７倍以下低下したＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

非修飾ＩＬ－１５のＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）と比較した場合、約６．５倍以下、約６倍以下、約５．５倍以下、約５倍以下、約４．５倍以下、約４倍以下、約３．５倍以下、又は約３倍以下低下したＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

非修飾ＩＬ－１５の受容体α結合（Ｋ_Ｄ、ｐＭ）値と比較した場合、約５０％以下低下した受容体α結合（Ｋ_Ｄ、ｐＭ）値を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

非修飾ＩＬ－１５の受容体α結合（Ｋ_Ｄ、ｐＭ）値と比較した場合、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、又は約３０％以下低下した受容体α結合（Ｋ_Ｄ、ｐＭ）値を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

非修飾ＩＬ－１５のＥＣ５０（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）値と比較した場合、約７倍以下低下したＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）を有し、非修飾ＩＬ－１５の受容体α結合値（Ｋ_Ｄ、ｐＭ）と比較した場合、約５０％以下低下した受容体α結合値（Ｋ_Ｄ、ｐＭ）を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項13】

哺乳動物対象に治療的有効用量で投与された場合、ＮＫ活性化及び増殖の刺激に有効である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

対象に治療的有効用量で投与された場合、ＣＤ８ Ｔ細胞生存及び記憶形成の支持に有効である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項15】

ＩＬ－１５を用いた処置に応答する状態を処置するための、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項16】

癌を処置するための、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項17】

前記組成物中に含まれる前記長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬が約３５％未満脱アミドされている、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項18】

式（Ｉ）および式（ＩＩ）の両方におけるｍが、３である、請求項２～１７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項19】

式（Ｉ）の構造を有する前記長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬の位置異性体の混合物を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項20】

前記式（Ｉ）の位置異性体の混合物について、前記アミノ基が、主に前記ＩＬ－１５部分のＮ末端にある、請求項１９に記載の組成物。

【請求項21】

式（Ｉ）におけるｎが、約９０９である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項22】

前記ＩＬ－１５が配列番号１～３のいずれか１つと少なくとも約９５％同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１～２１のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願に対する相互参照
本願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）の下で２０１７年５月１５日出願の米国仮特許出願第６２／５０６，４９４号；及び２０１７年７月２５日出願の米国仮特許出願第６２／５３６，９６６号；及び２０１７年１１月６日出願の米国仮特許出願第６２／５８２，１８６号；及び２０１８年３月２６日出願の米国仮特許出願第６２／６４８，２４０号による利益を主張し、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、（中でも）例えば、例えば持続性の免疫活性化及び抗腫瘍活性を提供するのに有効な治療に応答する状態の処置における、長時間作用型インターロイキン－１５（「ＩＬ－１５」）受容体作動薬、関連する組成物並びに製造及び使用方法に関する。

【背景技術】

【0003】

インターロイキン－１５（「ＩＬ－１５」）は、Ｇｒａｂｓｔｅｉｎら（Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：９６５－９６８）によって初めて報告された多面的サイトカインである。１６２アミノ酸前駆体として分泌されるヒトＩＬ－１５は、２９アミノ酸リーダー配列と１９アミノ酸プロ配列とを含む；従って成熟タンパク質は１１４アミノ酸長である。４本のα－ヘリックス束のサイトカインファミリーに属するＩＬ－１５はヘテロ三量体受容体に結合し、ここでユニークなαサブユニット（ＩＬ－１５Ｒα）はＩＬ－１５に受容体特異性を付与し、及びこの受容体のβ及びγサブユニットは１つ以上の他のサイトカイン受容体と共通する特徴を有する。Ｇｉｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４：３６５４－３６６３。

【0004】

サイトカインとしては、ＩＬ－１５は自然免疫系及び適応免疫系の両方に効果を及ぼす（ＤｉＳａｂｉｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．２２：１９－３３）。自然免疫系（これは外来性の侵入者から宿主を全般的に防御する）に関して、ＩＬ－１５は、他の特性に加えて、ナチュラルキラー細胞（「ＮＫ細胞」）及びナチュラルキラーＴ細胞（「ＮＫ－Ｔ細胞」）の発生を生じさせ、且つそれらの生存を維持する。自然免疫系におけるその役割と一致して、ＮＫ細胞は侵入病原体を特異的に攻撃することはない；むしろ、ＮＫ細胞は易感染性宿主細胞（腫瘍細胞又はウイルス感染細胞など）を破壊する。ＮＫ－Ｔ細胞は免疫調節性サイトカイン、特にインターフェロン－γを産生し、これにより免疫応答の全般的な活性化がもたらされる。

【0005】

適応免疫系（これは特定の病原体と最初に遭遇した後、当該の特異的な外来性の侵入者から宿主を防御する）に関して、ＩＬ－１５は免疫調節性サイトカイン産生ヘルパーＴ細胞の維持に必要である。重要なことに、ＩＬ－１５は「抗原を経験した」メモリーＴ細胞の長期維持も支え、メモリーＴ細胞は急激に複製する能力を有するため、宿主に侵入する特定の外来性病原体に再曝露したときに一層迅速で強力な免疫応答を生じさせる。

【0006】

最後に、自然免疫系及び適応免疫系の両方の内でのその特異的な役割にも関わらず、ＩＬ－１５は、免疫系の両カテゴリーにわたって重要で広範な効果を及ぼす。詳細には、ＩＬ－１５は、免疫系の両カテゴリーに関連する幾つもの細胞型（樹状細胞、好中球、好酸球、肥満細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、及びＢ細胞を含む）のアポトーシス（又は細胞死）を阻害し又は低減する。

【0007】

ＩＬ－１５は、宿主にとって外来性（又は「非自己」）に見える細胞と闘うことのできる免疫系内の多くの細胞の増殖及び維持を刺激するため、癌罹患者の治療におけるＩＬ－１５の利用が提案されている（Ｓｔｅｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．３３（１）：３５－４１）。例えば、ＩＬ－１５ベースの作動薬が骨髄腫の治療に提案されている（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２（１１），ｅ２６４４２：１－３）。加えて、ＩＬ－１５薬物療法がＨＩＶ感染症などのウイルス感染症罹患者の治療に提案されている。
幾つもの疾患の罹患者の治療に利用し得るその可能性にも関わらず、ＩＬ－１５ベースの治療法は幾つもの難題に直面している。例えば、ＩＬ－１５は急速にプラズマが除去され、生理的条件下で比較的不安定である。さらに、ＩＬ－１５のインビボでのシグナル伝達活性は、同様に短命であり、分子は、最適活性のために連日投与又は複数の日にわたる注入を必要とし、これは好ましくない。いくつかの手法において、ＩＬ－１５をＩＬ－１５受容体αサブユニットと複合体化することによりこれらの制約を解消する試みがなされている。しかしながら、かかる手法は、複数の細胞型で発現するＩＬ－１５受容体αを介してユニークに起こる望ましいシグナル伝達を無効にし得る。比較的低分子量（５ｋＤａ）の炭酸スクシンイミジル末端ポリマーとの遊離不可能なペグ化が報告されているが、これはＩＬ－１５の生物学的活性が著しく改変される結果となった。Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４）：２３１２－２３１８。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【文献】Ｇｉｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４：３６５４－３６６３。

【文献】ＤｉＳａｂｉｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．２２：１９－３３

【文献】Ｓｔｅｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．３３（１）：３５－４１

【文献】Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２（１１），ｅ２６４４２：１－３

【文献】Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４）：２３１２－２３１８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

しかしながら、前述した手法にも関わらず、改善された特性及びプロファイル、例えば、強力な免疫刺激効果、低い全身毒性、安定性及び／又は改善された薬物動態などを有する新たなＩＬ－１５受容体作動薬がなお必要とされている。従って、中でも、本開示は、新しく、また当技術分野により完全には示唆されていないと考えられる、本明細書に記載されるような、以下により詳細に記載される多数の有利な特徴を有する長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬、並びにそのような作動薬を含む組成物及びキット、並びに関連する製造及び使用方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0010】

第１の態様において、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬（その薬学的に許容可能な塩形態を含む）が本明細書に提供される。長時間作用型ＩＬ－１５受容体（ＩＬ－１５ Ｒ）作動薬は、少なくとも、アミド結合を介してＩＬ－１５アミノ基に安定して共有結合した単一直鎖ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）部分を含む。直鎖ＰＥＧ鎖と、ＩＬ－１５アミノ基に対する安定なアミド結合との間に介在するのは、２～５個の炭素原子を有する直鎖非置換アルキレン基（～ＣＨ_２～）_ｍ（すなわち、ｍ＝２、３、４、又は５）であり得る。

【0011】

例えば、いくつかの実施形態では、非置換アルキレン基は、（～ＣＨ_２～）_２であり；又は、いくつかの追加の実施形態では、非置換アルキレン基は（～ＣＨ_２～）_３であり；いくつかのなおさらなる実施形態では、非置換アルキレン基は（～ＣＨ_２～）_４であり；いくつかのなおさらなる実施形態では、非置換アルキレン基は（～ＣＨ_２～）_５である。

【0012】

例えば、いくつかの実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬は、以下の構造を有する：

【化1】

式中、ＩＬ－１５はインターロイキン－１５部分であり、ｎは約１５０～約３，０００の整数であり；ｍは２～５（例えば、２、３、４、又は５）の整数であり、ｎ’は１である。式（Ｉ）は［ＣＨ_３Ｏ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ（ＣＨ_２）_ｍＣ（Ｏ）－ＮＨ－］_ｎ’－ＩＬ１５として示すこともでき、２つの式は交換可能に使用され得る。式Ｉ（及び本明細書に提供される同様の式）において、構造中の～ＮＨ～は、ＩＬ－１５部分のアミノ基を表す。

【0013】

いくつかのさらなる実施形態では、ｎは約２００～約２０００、又は約４００～約１３００、又は約４５０～約１２００の整数である。

【0014】

さらなる１つ以上の追加の実施形態では、ｍは２又は３であり、従って、ＩＬ－１５に対する安定なアミド結合からＰＥＧ部分を分離する直鎖アルキレン基は、～（ＣＨ_２）_２～又は（ＣＨ_２）_３～である。いくつかの好ましい実施形態では、ｍは３である。

【0015】

１つ以上の実施形態では、ｎは、１０，０００ダルトン（例えば、ｎは約２２７である）、１５，０００ダルトン（例えば、ｎは約３４０である）、２０，０００ダルトン（例えば、ｎは約４５４である）、２５，０００ダルトン（例えば、ｎは約５６８である）、３０，０００ダルトン（例えば、ｎは約６８１である）、４０，０００ダルトン（例えば、ｎは約９０９である）、５０，０００ダルトン（例えば、ｎは約１１３６である）及び６０，０００ダルトン（例えば、ｎは約１３６４である）からなる群から選択される重量平均分子量を有するポリエチレングリコールポリマーに対応する値を有する整数である。

【0016】

１つ以上の実例的な実施形態では、本明細書に提供されるその関連実施形態の各々及び全てを非限定的に含む、式（Ｉ）による長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬を含む組成物が提供される。

【0017】

いくつかの実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬組成物は、集合的に考えた場合、下記の式：

【化2】

（式中、ｎ及びｍの値は、上記の式（Ｉ）に関して提供したとおりである。すなわち、そのような組成物の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬成分の観点から、組成物に含まれる約１５ｍｏｌパーセント以下の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬は、式（ＩＩ）のものである）により包含される、約１５モルパーセント以下の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬を含む。

【0018】

例えば、いくつかの実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬組成物は、集合的に考えた場合に式（ＩＩ）により包含される、約１０モルパーセント以下の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬を含む。

【0019】

前述のいくつかの追加の実施形態において、組成物は、約７モルパーセント以下の、２、３、又は３を超えるｎ’を有する（すなわち、より高級のＰＥＧｍｅｒ、「ｈｉｇｈ－ｍｅｒ」とも称される）長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬を含む。さらなるいくつかの他の実施形態では、組成物は、約５モルパーセント、６モルパーセント、９モルパーセント又は１０モルパーセント以下の、２、３又は３を超える（すなわち、２以上の）ｎ’を有する長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬を含む。

【0020】

いくつかのさらなる実施形態では、組成物は、式（Ｉ）による長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬を含む。

【化3】

式中、ｎ及びｍは上述したとおりであり、ｎ’は、ＩＬ－１５アミノ基に共有結合したポリエチレングリコール部分の平均数を表し（組成物に関して）、組成物に関するｎ’は、１．０～約１．３の範囲内である。例えば、ＩＬ－１５部分当たりのポリエチレングリコール部分の平均数は、約１．０、１．１、１．２及び約１．３から選択される。

【0021】

さらなる別の態様では、式（Ｉ）、例えば式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）に、並びに式（ＩＩ）、例えば（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）及び（ＩＩｄ）に記載されるような長時間作用型インターロイキン－１５受容体作動薬の製造方法が本明細書に提供される。本方法において、ほぼ７（例えば、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６）のｐＨのインターロイキン－１５（一般に、リン酸緩衝生理食塩水又は任意の他の好適な緩衝液などの緩衝液に溶解した）を、以下の構造：

【化4】

によるメトキシＰＥＧ－スクシンイミジルアルカノエート（ここでｎは、約１５０～約３，０００の整数である）などの活性化ＰＥＧ試薬と、

【化5】

（ここでｎ’は１である）を形成するのに十分な時間、反応させる。インターロイキン－１５と反応させるための例示的なメトキシＰＥＧ－スクシンイミジルアルカノエート試薬は、以下を含む。

【化6】

【0022】

いくつかの好ましい実施形態では、メトキシＰＥＧ－スクシンイミジルアルカノエート試薬は、

【化7】

ｍＰＥＧ－スクシンイミジルブタノエートである。

【0023】

いくつかの実施形態では、メトキシＰＥＧ－スクシンイミジルアルカノエート試薬は、約１０，０００ダルトン（例えば、ｎは約２２７である）、約１５，０００ダルトン（例えば、ｎは約３４０である）、約２０，０００ダルトン（例えば、ｎは約４５４である）、約２５，０００ダルトン（例えば、ｎは約５６８である）、約３０，０００ダルトン（例えば、ｎは約６８１である）、約４０，０００ダルトン（例えば、ｎは約９０９である）、約５０，０００ダルトン（例えば、ｎは約１１３６である）及び約６０，０００ダルトン（例えば、ｎは約１３６４である）からなる群から選択される重量平均分子量を有する。

【0024】

本方法の１つ以上の実施形態では、メトキシＰＥＧ－スクシンイミジルアルカノエート試薬は、インターロイキン－１５に対して当モル量（すなわち、当モル比）で添加される。

【0025】

１つ以上の代替的な実施形態では、メトキシＰＥＧ－スクシンイミジルアルカノエート試薬は、インターロイキン－１５のモル過剰で添加される。いくつかの特定の実施形態では、メトキシＰＥＧ－スクシンイミジルアルカノエート試薬は、２倍モル過剰、又は５倍モル過剰、又は７倍モル過剰、又は１０倍モル過剰、又はさらには１２倍モル過剰以上で存在する。いくつかの実施形態では、メトキシＰＥＧ－スクシンイミジルアルカノエート試薬は、５～１０倍モル過剰で添加される。

【0026】

いくつかの実施形態では、メトキシＰＥＧ－スクシンイミジルアルカノエート試薬は、固体として添加される。

【0027】

いくつかの別の実施形態では、メトキシＰＥＧ－スクシンイミジルアルカノエート試薬は、好適な溶媒に溶解される。特定の実施形態では、メトキシＰＥＧ－スクシンイミジルアルカノエート試薬は、水性酸、例えば希釈塩酸などに溶解されるが、任意の好適な酸を使用することができる。

【0028】

本方法のいくつかのさらなる実施形態では、インターロイキン－１５は、当初、すなわち、メトキシＰＥＧ－スクシンイミジルアルカノエート試薬と混合する前に、約０．５ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶液中に存在する。追加の例示的な濃度範囲としては、例えば約０．５ｍｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬのインターロイキン－１５、約０．５ｍｇ／ｍＬ～約３ｍｇ／ｍＬ、及び約１．０ｍｇ／ｍＬ～約４ｍｇ／ｍＬのインターロイキン－１５が挙げられる。

【0029】

いくつかのさらなる実施形態では、インターロイキン－１５溶液のｐＨは、メトキシＰＥＧ－スクシンイミジルアルカノエート試薬の添加前に、約８．０に調整される。

【0030】

いくつかのさらなる実施形態では、反応混合物のｐＨは、メトキシＰＥＧ－スクシンイミジルアルカノエート試薬の添加後に、約８．０に調整される。

【0031】

いくつかのさらなる実施形態では、得られた反応混合物を、反応関与体間で反応させるのに十分な時間、撹拌（又は混合）する。いくつかの実施形態では、反応関与体は、約１５分間～約１０時間まで（両端を含む）混合される。いくつかのさらなる実施形態では、反応関与体は、約３０分間～約５時間、又は約３０分間～約２時間混合される。

【0032】

いくつかの実施形態では、反応は、周囲条件下、例えば室温で、すなわち熱を加えずに行われる。反応を行うための例示的な温度範囲としては、例えば、約５℃～約５０℃、又は約１０℃～約４０℃、又は約１５℃～約３０℃が挙げられる。いくつかのさらなる実施形態では、反応は、約２０℃～約２５℃の温度で行われる。

【0033】

本方法のいくつかの実施形態では、反応は、アミノ酸の添加によりクエンチされる。いくつかの関連実施形態では、反応は、グリシンの添加によりクエンチされる。

【0034】

本方法のいくつかのさらなる実施形態では、コンジュゲーション生成物、すなわち、メトキシＰＥＧ－アルカノエート－インターロイキン－１５コンジュゲートは、反応混合物から分離される。

【0035】

いくつかの追加の実施形態では、メトキシＰＥＧ－アルカノエート－インターロイキン－１５コンジュゲートを含む反応混合物は、精製される。

【0036】

いくつかの特定の実施形態では、反応は、

【化8】

（ここでｎ’は１である）の形成をもたらす。

【0037】

いくつかのさらなる実施形態では、反応は、集合的に考えた場合に、下記の式により包含される：

【化9】

（式中、ｎ及びｍの値は、上記の式（Ｉ）に関して提供したとおりである）約１５モルパーセント（ｍｏｌ％）以下の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬（組成物中のＩＬ－１５含有分子の）を含む組成物を形成するのに有効である。

【0038】

さらなるいくつかの追加の実施形態では、反応は、２０～３５％未満又は約２５％未満脱アミドしたペグ化インターロイキン－１５を生成するのに有効である。

【0039】

いくつかの実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬は、非修飾（すなわち、非コンジュゲート化）ＩＬ－１５と比較した場合、ＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約７倍以下の低下を示す。例えば、１つ以上の関連実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬は、ＩＬ－１５と比較した場合、ＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約６．５倍以下の低下、又はＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約６倍以下の低下、又はＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約５．５倍以下の低下、又はＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約５倍以下の低下、又はＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約４．５倍以下の低下、又はＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約４倍以下の低下、又はＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約３．５倍以下の低下、又はさらにはＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約３倍以下の低下を示す。

【0040】

いくつかのさらなる実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬は、例えば、受容体α結合の決定に好適な技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などを用いて測定した場合、非コンジュゲート化ＩＬ－１５と比較して、受容体α結合（Ｋ_Ｄ、ｐＭ）における約５０％以下の低下を示す。いくつかの関連実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬は、非コンジュゲート化ＩＬ－１５と比較した場合、受容体α結合（Ｋ_Ｄ、ｐＭ）における約４５％以下の低下を示し、又は受容体α結合（Ｋ_Ｄ、ｐＭ）における約４０％以下の低下を示し、又は受容体α結合（Ｋ_Ｄ、ｐＭ）における約３５％以下の低下を示し、又はさらには受容体α結合（Ｋ_Ｄ、ｐＭ）における約３０％以下の低下を示す。

【0041】

いくつかのなおさらなる実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬は、非修飾ＩＬ－１５と比較した場合、ＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約７倍以下の低下、及び、ＩＬ－１５と比較した場合、受容体α結合（Ｋ_Ｄ、ｐＭ）における約５０％以下の低下を示す（上述したＥＣ５０値又はＫ_Ｄ値における低下の任意の１つ以上の特定の組み合わせを含む）。

【0042】

さらなる１つ以上の実施形態では、本明細書に記載される長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬、又はその薬学的に許容可能な塩、及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物が提供される。

【0043】

いくつかのなおさらなる実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬又は組成物は、治療的有効用量で対象に投与された場合、ＮＫ活性化及び／又は増殖を刺激するのに有効である。

【0044】

１つ以上のなおさらなる実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬又は組成物は、治療的有効用量で対象に投与された場合、ＣＤ８ Ｔ細胞生存及び／又は記憶形成を支持するのに有効である。

【0045】

別の態様では、ＩＬ－１５を用いた処置に応答する状態を有する対象に、本明細書に提供される治療的有効用量の長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬、又はそのような作動薬を含む組成物を投与することによる、該状態の処置方法が本明細書に提供される。

【0046】

なおさらなる態様では、本明細書に提供される治療的有効用量の長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬又は組成物を、癌を有する対象に投与することによる、癌の処置方法が提供される。

【0047】

追加の態様及び実施形態は、以下の明細書及び特許請求の範囲に提供される。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
アミド結合を介してＩＬ－１５のアミノ基に安定して共有結合した単一直鎖ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬であって、２～５個の炭素原子を有する直鎖非置換アルキレン基（～ＣＨ _２ ～） _ｍ が、前記ＰＥＧ部分と、前記ＩＬ－１５アミノ基に対する前記アミド結合との間に介在する、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬、及びその薬学的に許容可能な塩形態。
（項目２）
ｍが、２、３、４及び５からなる群から選択される整数である、項目１に記載の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬。
（項目３）
前記非置換アルキレン基が、（～ＣＨ _２ ～） _２ 、（～ＣＨ _２ ～） _３ 、（～ＣＨ _２ ～） _４ 、又は（～ＣＨ _２ ～） _５ から選択される、項目１又は項目２に記載の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬。
（項目４）
長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬であって、

【化31】

（式中、ＩＬ－１５は、インターロイキン－１５部分であり、ｎは、約１５０～約３，０００の整数であり；ｍは、２～５の整数であり、ｎ’は、１であり、前記構造中の～ＮＨ～は、前記ＩＬ－１５部分のアミノ基を表す）の構造を有する、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬。
（項目５）
ｎが、約２００～約２０００、又は約４００～約１３００、又は約４５０～約１２００の整数である、項目１～４のいずれか一項に記載の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬。
（項目６）
ｍが２又は３である、項目１～５のいずれか一項に記載の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬。
（項目７）
ｍが３である、項目１～６のいずれか一項に記載の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬。
（項目８）
ｎが、１０，０００ダルトン（約２２７）、１５，０００ダルトン（約３４０）、２０，０００ダルトン（約４５４）、２５，０００ダルトン（約５６８）、３０，０００ダルトン（約６８１）、４０，０００ダルトン（９０９）、５０，０００ダルトン（約１１３６）及び６０，０００ダルトン（約１３６４）からなる群から選択される重量平均分子量を有するポリエチレングリコールポリマーに対応する値を有する整数である、項目１～７のいずれか一項に記載の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬。
（項目９）
項目７～１１のいずれか一項に記載の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬を含む組成物であって、前記組成物は、集合的に考えた場合に式：

【化32】

により包含される、約１５モルパーセント以下の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬を含む、組成物。
（項目１０）
集合的に考えた場合に式（ＩＩ）により包含される、約１０モルパーセント以下の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬を含む、項目９に記載の組成物。
（項目１１）
集合的に考えた場合に式（ＩＩ）により包含される、約７モルパーセント以下の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬を含む、項目９又は１０に記載の組成物。
（項目１２）
集合的に考えた場合に式（ＩＩ）により包含される、約５モルパーセント以下の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬を含む、項目９～１１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３）
式（Ｉ）

【化33】

（式中、ＩＬ－１５は、インターロイキン－１５部分であり、ｎは、約１５０～約３，０００の整数であり；ｍは、２～５の整数であり、ｎ’は１であり、前記構造中の～ＮＨ～は、前記ＩＬ－１５部分のアミノ基を表し、ｎ’は、前記組成物中のＬ－１５アミノ基に共有結合したポリエチレングリコール部分の平均数を表し、前記組成物に関するｎ’は、１．０～約１．３の範囲内である）による長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬を含む組成物。
（項目１４）
前記組成物に関するｎ’が、１．０、１．１、１．２及び約１．３から選択される、項目９～１３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１５）
前記長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬が、非修飾ＩＬ－１５と比較した場合、ＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約７倍以下の低下を示す、項目１～８のいずれか一項に記載の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬。
（項目１６）
前記長時間作用型ＩＬ－１５受容体のＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における低下が、ＩＬ－１５と比較した場合、ＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約６．５倍以下の低下、ＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約６倍以下の低下、ＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約５．５倍以下の低下、ＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約５倍以下の低下、ＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約４．５倍以下の低下、ＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約４倍以下の低下、ＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約３．５倍以下の低下、及びＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約３倍以下の低下からなる群から選択される、項目１～８、１５のいずれか一項に記載の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬。
（項目１７）
前記長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬が、ＩＬ－１５と比較した場合、受容体α結合（Ｋ _Ｄ 、ｐＭ）における約５０％以下の低下を示す、項目１～８、１５、１６のいずれか一項に記載の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬。
（項目１８）
前記長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬が、ＩＬ－１５と比較した場合、受容体α結合（Ｋ _Ｄ 、ｐＭ）における約４５％以下の低下を示し、又は受容体α結合（Ｋ _Ｄ 、ｐＭ）における約４０％以下の低下を示し、又は受容体α結合（Ｋ _Ｄ 、ｐＭ）における約３５％以下の低下を示し、又はさらには受容体α結合（Ｋ _Ｄ 、ｐＭ）における約３０％以下の低下を示す、項目１～８、１５～１７のいずれか一項に記載の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬。
（項目１９）
前記長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬が、非修飾ＩＬ－１５と比較した場合、ＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約７倍以下の低下を示し、ＩＬ－１５と比較した場合、及び受容体α結合（Ｋ _Ｄ 、ｐＭ）における約５０％以下の低下を示す、項目１～８、１５～１８のいずれか一項に記載の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬。
（項目２０）
項目１～８、１５～１９のいずれか一項に記載の前記長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬、又は項目１２～２２のいずれか一項に記載の組成物、及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む、薬学的に許容可能な組成物。
（項目２１）
哺乳動物対象に治療的有効用量で投与された場合、ＮＫ活性化及び増殖の刺激に有効である、項目１～２０のいずれか一項に記載の長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬又は組成物。
（項目２２）
対象に治療的有効用量で投与された場合、ＣＤ８ Ｔ細胞生存及び記憶形成の支持に有効である、項目１～２１のいずれか一項に記載の長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬又は組成物。
（項目２３）
ＩＬ－１５を用いた処置に応答する状態を有する対象に、治療的有効用量の項目１～２２のいずれか一項に記載の長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬又は組成物を投与することによる、該状態の処置方法。
（項目２４）
治療的有効用量の項目１～２３のいずれか一項に記載の長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬又は組成物を、癌を有する対象に投与することによる、癌の処置方法。

【図面の簡単な説明】

【0048】

【図1】図１は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の例示的な組換えヒトＩＬ－１５のアミノ酸配列（配列番号１）、分子量１２．９ｋＤａを有する１１５アミノ酸を含む単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖を提供する。

【図2】図２は、実施例１に記載される例示的なコンジュゲーション反応混合物のＲＰ－ＨＰＬＣ分析を示すクロマトグラムである。

【図3】図３は、実施例１に記載される陰イオン交換クロマトグラフィーカラムからのＦＰＬＣ精製プロファイルである。

【図4】図４は、実施例１に記載される例示的な精製長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬、モノ－ｍＰＥＧ－ブタンアミド－ＩＬ－１５のＳＤＳ－ＰＡＧＥである。レーン１は、示されるような分子量マーカーを提供する；レーン２は、非コンジュゲート化親分子、ＩＬ－１５であり、レーン３は、モノ－ｍＰＥＧ－ブタンアミド－ＩＬ－１５である。

【図5】図５は、実施例１に記載される精製モノ－ｍＰＥＧ－ブタンアミド－ＩＬ－１５のＲＰ－ＨＰＬＣ分析である。

【図6】図６は、実施例６に記載される、マウスにおける静脈内単回用量の試験物品を投与後の、経時的な試験物品（ＩＬ－１５、中実丸、又はＮ－（２－メトキシＰＥＧ－エチル）－７－（４－（（２－メトキシＰＥＧ－エチル）アミノ）－４－オキソブチル）－９－エチル－９ Ｈ－フルオレン－４－カルボキサミドカルバメート－ＩＬ－１５とも称されるｍＰＥＧ２－ＣＡＣ－ＦＭＯＣ－２０Ｋ－ＮＨＳ－ＩＬ－１５、すなわちコンジュゲート２、中実四角形）の血漿濃度のプロットである。

【図7】図７は、実施例７に記載される、ラットにおける静脈内単回用量のコンジュゲート２を０．３（■）、０．１５（▲）及び０．０７５ｍｇ／ｋｇ（●）の投与量で、又は皮下単回用量のコンジュゲート２を０．１５ｍｇ／ｋｇ（◆）で投与後の、Ｎ－（２－メトキシＰＥＧ－エチル）－７－（４－（（２－メトキシＰＥＧ－エチル）アミノ）－４－オキソブチル）－９－エチル－９ Ｈ－フルオレン－４－カルボキサミドカルバミン酸塩－ＩＬ－１５とも称されるｍＰＥＧ２－ＣＡＣ－ＦＭＯＣ－２０Ｋ－ＮＨＳ－ＩＬ－１５、すなわちコンジュゲート２の経時的な平均血漿濃度のプロットである。

【図8A-8B】図８Ａ及び８Ｂは、実施例８に記載される、ｉ．ｖ．単回用量のＩＬ－１５（図８Ａ）又はコンジュゲート２（０．３ｍｇ／ｋｇ、図８Ｂ）のいずれかを投与後の様々なリンパ球、すなわち、ＣＤ４（■）、ＣＤ８（▲）、及びＮＫ細胞（▼）におけるＳＴＡＴ５リン酸化度を示す。

【図9A-9B】図９Ａ～９Ｃは、各々、実施例９に記載される、カニクイザルにおけるｉ．ｖ．単回用量のコンジュゲート２（０．５ｍｇ／ｋｇ）の投与後の、様々なリンパ球、すなわち、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＮＫ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化度を示すプロットである。

【図9C】図９Ａ～９Ｃは、各々、実施例９に記載される、カニクイザルにおけるｉ．ｖ．単回用量のコンジュゲート２（０．５ｍｇ／ｋｇ）の投与後の、様々なリンパ球、すなわち、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＮＫ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化度を示すプロットである。

【図10A】図１０Ａ及び１０Ｂは、各々、実施例１０に詳細に記載される、ヒトＰＢＭＣ、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ（図１０Ａ）及びＣＤ５６ｄｉｍ（図１０Ｂ）ＮＫ細胞のＮＫサブセットにおけるシグナル伝達により測定された、例示的な長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬（コンジュゲート１、３及び５）のインビトロ活性を示すプロットである。

【図10B】図１０Ａ及び１０Ｂは、各々、実施例１０に詳細に記載される、ヒトＰＢＭＣ、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ（図１０Ａ）及びＣＤ５６ｄｉｍ（図１０Ｂ）ＮＫ細胞のＮＫサブセットにおけるシグナル伝達により測定された、例示的な長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬（コンジュゲート１、３及び５）のインビトロ活性を示すプロットである。

【図11A】図１１Ａ及び１１Ｂは、実施例１１に記載される、モノ－ｍＰＥＧ－ＳＢＡ４０Ｋ－ＩＬ－１５（本明細書でコンジュゲート１とも称される）を用量０．０３ｍｇ／ｋｇ（低用量、中空四角形）、０．３ｍｇ／ｋｇ（中用量、中実丸、実線）、又は１ｍｇ／ｋｇ（高用量、菱形）でｉ．ｖ．投与後の、ビヒクルと比較した場合の、マウスにおけるＮＫ細胞増殖を示すプロットである。図１１Ａは、経時的なＫｉ６７発現（百分率として表す）を示す一方、図１１Ｂは、サンプルグループの各々に関する、投与後のＮＫ細胞数（細胞／ｕｌ）、対、時間を示す。

【図11B】図１１Ａ及び１１Ｂは、実施例１１に記載される、モノ－ｍＰＥＧ－ＳＢＡ４０Ｋ－ＩＬ－１５（本明細書でコンジュゲート１とも称される）を用量０．０３ｍｇ／ｋｇ（低用量、中空四角形）、０．３ｍｇ／ｋｇ（中用量、中実丸、実線）、又は１ｍｇ／ｋｇ（高用量、菱形）でｉ．ｖ．投与後の、ビヒクルと比較した場合の、マウスにおけるＮＫ細胞増殖を示すプロットである。図１１Ａは、経時的なＫｉ６７発現（百分率として表す）を示す一方、図１１Ｂは、サンプルグループの各々に関する、投与後のＮＫ細胞数（細胞／ｕｌ）、対、時間を示す。

【図12A】図１２Ａ～Ｄは、実施例１１に記載される、ビヒクル（中実丸、破線）と比較した用量０．０３ｍｇ／ｋｇ（低用量、中空四角形）、０．３ｍｇ／ｋｇ（中用量、中実丸、実線）、又は１．０ｍｇ／ｋｇ（高用量、菱形）のコンジュゲート１のｉ．ｖ．投与後の、マウスにおける増大する数の全成熟レベルのＮＫ細胞を示すプロットである。ＮＫ細胞のサブセットは、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ２７発現により規定される。図１２Ａは、投与後２４時間～１２０時間の、細胞／μＬで表される終末エフェクター細胞の数の増大を示し；図１２Ｂは、投与後２４時間～１２０時間の細胞／μＬで表されるプレＮＫ細胞の数の増大を示し；図１２Ｃは、投与後２４時間～１２０時間の細胞／μＬで表される高エフェクター細胞の数の増大を示し、図１２Ｄは、投与後２４時間～１２０時間の細胞／μＬで表される早期ＮＫ細胞の数の増大を示す。

【図12B-12C】図１２Ａ～Ｄは、実施例１１に記載される、ビヒクル（中実丸、破線）と比較した用量０．０３ｍｇ／ｋｇ（低用量、中空四角形）、０．３ｍｇ／ｋｇ（中用量、中実丸、実線）、又は１．０ｍｇ／ｋｇ（高用量、菱形）のコンジュゲート１のｉ．ｖ．投与後の、マウスにおける増大する数の全成熟レベルのＮＫ細胞を示すプロットである。ＮＫ細胞のサブセットは、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ２７発現により規定される。図１２Ａは、投与後２４時間～１２０時間の、細胞／μＬで表される終末エフェクター細胞の数の増大を示し；図１２Ｂは、投与後２４時間～１２０時間の細胞／μＬで表されるプレＮＫ細胞の数の増大を示し；図１２Ｃは、投与後２４時間～１２０時間の細胞／μＬで表される高エフェクター細胞の数の増大を示し、図１２Ｄは、投与後２４時間～１２０時間の細胞／μＬで表される早期ＮＫ細胞の数の増大を示す。

【図12D】図１２Ａ～Ｄは、実施例１１に記載される、ビヒクル（中実丸、破線）と比較した用量０．０３ｍｇ／ｋｇ（低用量、中空四角形）、０．３ｍｇ／ｋｇ（中用量、中実丸、実線）、又は１．０ｍｇ／ｋｇ（高用量、菱形）のコンジュゲート１のｉ．ｖ．投与後の、マウスにおける増大する数の全成熟レベルのＮＫ細胞を示すプロットである。ＮＫ細胞のサブセットは、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ２７発現により規定される。図１２Ａは、投与後２４時間～１２０時間の、細胞／μＬで表される終末エフェクター細胞の数の増大を示し；図１２Ｂは、投与後２４時間～１２０時間の細胞／μＬで表されるプレＮＫ細胞の数の増大を示し；図１２Ｃは、投与後２４時間～１２０時間の細胞／μＬで表される高エフェクター細胞の数の増大を示し、図１２Ｄは、投与後２４時間～１２０時間の細胞／μＬで表される早期ＮＫ細胞の数の増大を示す。

【図13A】図１３Ａ及び１３Ｂは、実施例１１に記載される、マウスにおけるビヒクル（中実丸、破線）と比較した用量０．０３ｍｇ／ｋｇ（低用量、中空四角形）、０．３ｍｇ／ｋｇ（中用量、中実丸、実線）、又は１ｍｇ／ｋｇ（高用量、菱形）のコンジュゲート１のｉ．ｖ．投与後のＮＫ細胞によるＮＫＧ２Ｄ（図１３Ａ）及びグランザイムＢ（図１３Ｂ）の発現のレベルを示すプロットである。

【図13B】図１３Ａ及び１３Ｂは、実施例１１に記載される、マウスにおけるビヒクル（中実丸、破線）と比較した用量０．０３ｍｇ／ｋｇ（低用量、中空四角形）、０．３ｍｇ／ｋｇ（中用量、中実丸、実線）、又は１ｍｇ／ｋｇ（高用量、菱形）のコンジュゲート１のｉ．ｖ．投与後のＮＫ細胞によるＮＫＧ２Ｄ（図１３Ａ）及びグランザイムＢ（図１３Ｂ）の発現のレベルを示すプロットである。

【図14】図１４は、実施例１１に記載される、用量０．０３ｍｇ／ｋｇ（低用量）、０．３ｍｇ／ｋｇ（中用量）、又は１ｍｇ／ｋｇ（高用量）のコンジュゲート１のｉ．ｖ．投与後の、マウスにおける投与前及び投与後２４時間～１２０時間の両方の、細胞／μＬで表されるＣＤ８ Ｔ細胞数を示すプロットである。

【図15A-15B】図１５Ａ及び１５Ｂは、各々、実施例１１に記載される、ビヒクル及びＩＬ－１５と比較した、用量０．３ｍｇ／ｋｇ又は１．０ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１のｉ．ｖ．投与後の、マウスにおける投与後のＴエフェクター記憶細胞及びＴ中央記憶細胞に関する経時的なＫｉ６７発現（百分率として表す）、対、時間を示すプロットである。

【図16A-16B】図１６Ａ及び１６Ｂは、実施例１２に記載される、カニクイザルにおける用量５００μｇ／ｋｇのコンジュゲート２のｉ．ｖ．投与後のＮＫ細胞増殖を示すプロットである。図１６Ａは、投与前から投与後の１５日目までのＮＫ細胞におけるＫｉ６７発現（百分率として表す）を示す一方、１６Ｂは、投与前から投与後の１５日目までのＮＫ細胞数を示す。

【図17】図１７は、実施例１２に記載される、カニクイザルにおける用量５００μｇ／ｋｇのコンジュゲート２のｉ．ｖ．投与後の、投与前から投与後の１４日目までのＣＤ８ Ｔ細胞数（各動物に関して示す）を示すプロットである。

【図18A】図１８Ａ及び１８Ｂは、各々、実施例１２に記載される、カニクイザルにおける用量５００μｇ／ｋｇのコンジュゲート２のｉ．ｖ．投与後の、ＣＤ８ Ｔエフェクター記憶細胞（Ｔ_ＥＭ細胞）及びＣＤ８ Ｔ中央記憶細胞（Ｔ_ＣＭ）の投与後の数、対、時間（投与前から投与後の１４日目まで）を示すプロットである。

【図18B】図１８Ａ及び１８Ｂは、各々、実施例１２に記載される、カニクイザルにおける用量５００μｇ／ｋｇのコンジュゲート２のｉ．ｖ．投与後の、ＣＤ８ Ｔエフェクター記憶細胞（Ｔ_ＥＭ細胞）及びＣＤ８ Ｔ中央記憶細胞（Ｔ_ＣＭ）の投与後の数、対、時間（投与前から投与後の１４日目まで）を示すプロットである。

【図19】図１９は、実施例１３に詳細に記載される、マウスＣＴ－２６結腸癌細胞で接種された後、以下の試験物品の１つで処置された雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの肺内の、マウス当たりの総病変を示す：ビヒクル、リン酸緩衝生理食塩水（グループＡ）；天然ＩＬ－１５のみ（グループＢ）；用量０．０３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート２（グループＣ）；用量０．１ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート２（グループＤ）；用量０．３ｍｇ／ｋｇコンジュゲート２（グループＥ）；用量１．０ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート２（グループＦ）；用量３．０ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート２（グループＧ）。

【図20】図２０は、実施例１３に詳細に記載される、マウスＣＴ－２６結腸癌細胞で接種された後、以下の試験物品の１つで処置された雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの肺内の、マウス当たりの総病変を示す：ビヒクル、リン酸緩衝生理食塩水（グループＡ）；用量０．０３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１（グループＨ）；及び用量０．３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１。

【図21】図２１は、実施例１４に記載される、１０００ｎｇ／ｍＬ（四角形）、３０００ｎｇ／ｍＬ（丸）、３００ｎｇ／ｍＬ（三角形）、３０ｎｇ／ｍＬ（上方Ｘ）、３ｎｇ／ｍＬ（菱形）、及び非刺激（下方Ｘ）でのＥ：Ｔ（エフェクター：標的）比の関数としてのパーセント特異的溶解を示す。このデータは、コンジュゲート１との培養後の、インビトロでの用量依存的に増大するＮＫ細胞の細胞毒性を示す。

【図22A】図２２Ａ～Ｄは、実施例１１に記載される、コンジュゲート１を用量０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び１．５ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖ．投与後のマウスにおける増大する数の全成熟レベルのＮＫ細胞を示すプロットである。図２２Ａは、細胞／μＬで表される、投与後の２４時間～１２０時間の終末エフェクター細胞の数の増大を示し；図２２Ｂは、細胞／μＬで表される、投与後の２４時間～１２０時間のプレＮＫ細胞の数の増大を示し；図２２Ｃは、細胞／μＬで表される、投与後の２４時間～１２０時間の高エフェクター細胞の数の増大を示し、図２２Ｄは、細胞／μＬで表される、投与後の２４時間～１２０時間の早期ＮＫ細胞の数の増大を示す。

【図22B-22C】図２２Ａ～Ｄは、実施例１１に記載される、コンジュゲート１を用量０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び１．５ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖ．投与後のマウスにおける増大する数の全成熟レベルのＮＫ細胞を示すプロットである。図２２Ａは、細胞／μＬで表される、投与後の２４時間～１２０時間の終末エフェクター細胞の数の増大を示し；図２２Ｂは、細胞／μＬで表される、投与後の２４時間～１２０時間のプレＮＫ細胞の数の増大を示し；図２２Ｃは、細胞／μＬで表される、投与後の２４時間～１２０時間の高エフェクター細胞の数の増大を示し、図２２Ｄは、細胞／μＬで表される、投与後の２４時間～１２０時間の早期ＮＫ細胞の数の増大を示す。

【図22D】図２２Ａ～Ｄは、実施例１１に記載される、コンジュゲート１を用量０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び１．５ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖ．投与後のマウスにおける増大する数の全成熟レベルのＮＫ細胞を示すプロットである。図２２Ａは、細胞／μＬで表される、投与後の２４時間～１２０時間の終末エフェクター細胞の数の増大を示し；図２２Ｂは、細胞／μＬで表される、投与後の２４時間～１２０時間のプレＮＫ細胞の数の増大を示し；図２２Ｃは、細胞／μＬで表される、投与後の２４時間～１２０時間の高エフェクター細胞の数の増大を示し、図２２Ｄは、細胞／μＬで表される、投与後の２４時間～１２０時間の早期ＮＫ細胞の数の増大を示す。

【図23】図２３は、実施例１５に記載される、用量０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び１．５ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１で処置後の関数としてのグランザイムＢ発現を示すプロットである。このデータは、コンジュゲート１を用いた処置が、ＮＫ細胞グランザイムＢ発現を増大させることを示す。

【図24】図２４は、実施例１１に記載される、マウスにおける用量０．０３ｍｇ／ｋｇ（中実丸、破線）及び０．３ｍｇ／ｋｇ（中実丸、実線）のコンジュゲート１、並びにビヒクルＩＬ－１５緩衝液（中空丸、破線）のｉ．ｖ．投与後の、投与前及び投与後の２４時間～９６時間の両方の、マウス脾臓から単離されたＣＤ８ Ｔ細胞の細胞／μＬで表される数を示すプロットである。

【図25】図２５は、実施例１１に記載される、マウスにおける用量０．０３ｍｇ／ｋｇ又は０．３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１のｉ．ｖ．投与後の、ビヒクルＩＬ－１５緩衝液と比較した、ＣＤ４９ｂ細胞に関するＫｉ６７発現のレベル（百分率として表される）、対、投与後の時間を示すプロットである。

【図26】図２６は、実施例１１に記載される、マウスにおける用量０．０３ｍｇ／ｋｇ又は０．３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１のｉ．ｖ．投与後の、ビヒクルＩＬ－１５緩衝液と比較した、ＣＤ４９ｂ細胞に関する経時的なグランザイムＢ発現（百分率として表される）のレベル、対、投与後の時間を示すプロットである。

【図27】図２７は、実施例１４に記載される、０．３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１で処置後のインビボでの細胞毒性結果を示すプロットである。細胞毒性は、処置後の２４時間、４８時間、及び７２時間に評価した。

【図28A-28B】図２８Ａ～Ｄは、実施例１１に記載される、用量０．０３ｍｇ／ｋｇ及び０．３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１の、単回投与でのｉ．ｖ．投与後又はｑ７ｄｘ３スケジュールでの第３の投与後の、マウスにおける増大する数の全成熟レベルのＮＫ細胞を示すプロットである。図２８Ａは、投与後の２４時間～２４０時間のＫｉ６７ ＣＤ４９ｂ細胞の百分率における増大を示し；図２２Ｂは、投与後の２４時間～２４０時間のグランザイムＢ ＣＤ４９ｂ細胞の百分率における増大を示し；図２８Ｃは、投与後の２４時間～２４０時間の、細胞／μＬで表されるＣＤ４９ｂ細胞の数における増大を示し；図２８Ｄは、投与後の２４時間～２４０時間のｇｒａｎＢ＋ＭＦＩ ＣＤ４９ｂ細胞の百分率における増大を示す。

【図28C-28D】図２８Ａ～Ｄは、実施例１１に記載される、用量０．０３ｍｇ／ｋｇ及び０．３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１の、単回投与でのｉ．ｖ．投与後又はｑ７ｄｘ３スケジュールでの第３の投与後の、マウスにおける増大する数の全成熟レベルのＮＫ細胞を示すプロットである。図２８Ａは、投与後の２４時間～２４０時間のＫｉ６７ ＣＤ４９ｂ細胞の百分率における増大を示し；図２２Ｂは、投与後の２４時間～２４０時間のグランザイムＢ ＣＤ４９ｂ細胞の百分率における増大を示し；図２８Ｃは、投与後の２４時間～２４０時間の、細胞／μＬで表されるＣＤ４９ｂ細胞の数における増大を示し；図２８Ｄは、投与後の２４時間～２４０時間のｇｒａｎＢ＋ＭＦＩ ＣＤ４９ｂ細胞の百分率における増大を示す。

【図29A-29B】図２９Ａ～Ｃは、実施例１６に記載される研究に関連したプロットである。図２９Ａは、ｂａｌｂ／ｃマウスにおける各々、０．５及び０．３ｍｇ／ｋｇでの静脈内単回用量の試験物品の投与後の１４４時間の時間経過中の試験物品（ＩＬ－１５又はコンジュゲート１）の血漿濃度のプロットである。コンジュゲート１は、約１２時間の半減期を示す一方、ＩＬ－１５は、１時間未満の半減期で血漿から急速に除去される。図２９Ｂは、０．０３及び０．３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１の単回注射後の、マウスにおけるＣＤ８ Ｔ細胞内のｐＳＴＡＴ５パーセント陽性のグラフである。両方の用量レベルのコンジュゲート１は、ＣＤ８ Ｔ細胞において持続性のｐＳＴＡＴ５シグナル伝達を誘導する。投与前を含む１２０時間の時間経過が示されている。図２９Ｃは、０．０３及び０．３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１の単回注射後の、ハツカネズミＮＫ細胞内のｐＳＴＡＴ５パーセント陽性のグラフである。両方の用量レベルのコンジュゲート１は、ＮＫ細胞において強力な及び持続性のｐＳＴＡＴ５シグナル伝達を誘導する。

【図29C】図２９Ａ～Ｃは、実施例１６に記載される研究に関連したプロットである。図２９Ａは、ｂａｌｂ／ｃマウスにおける各々、０．５及び０．３ｍｇ／ｋｇでの静脈内単回用量の試験物品の投与後の１４４時間の時間経過中の試験物品（ＩＬ－１５又はコンジュゲート１）の血漿濃度のプロットである。コンジュゲート１は、約１２時間の半減期を示す一方、ＩＬ－１５は、１時間未満の半減期で血漿から急速に除去される。図２９Ｂは、０．０３及び０．３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１の単回注射後の、マウスにおけるＣＤ８ Ｔ細胞内のｐＳＴＡＴ５パーセント陽性のグラフである。両方の用量レベルのコンジュゲート１は、ＣＤ８ Ｔ細胞において持続性のｐＳＴＡＴ５シグナル伝達を誘導する。投与前を含む１２０時間の時間経過が示されている。図２９Ｃは、０．０３及び０．３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１の単回注射後の、ハツカネズミＮＫ細胞内のｐＳＴＡＴ５パーセント陽性のグラフである。両方の用量レベルのコンジュゲート１は、ＮＫ細胞において強力な及び持続性のｐＳＴＡＴ５シグナル伝達を誘導する。

【図30A】図３０Ａ～Ｃは、各々、実施例１７に記載される、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１又は１．５ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１の単回投与後の総ＣＤ８、ＣＤ８中央記憶（Ｔｃｍ）及びＣＤ８エフェクター記憶（Ｔｅｍ）細胞数のプロットである。実施例１７に記載されるように、０．０３以上の用量レベルのコンジュゲート１は、血液中の総ＣＤ８ Ｔ細胞の有意な増大を誘導する。最低用量の０．０１ｍｇ／ｋｇは、ＣＤ８ Ｔｃｍ及びＣＤ８ Ｔｅｍを増大させた。０．３ｍｇ／ｋｇにおいて、コンジュゲート１はＣＤ８、ＣＤ８ Ｔｃｍ及びＣＤ８ Ｔｅｍを各々６．４Ｘ、３７．９Ｘ及び１４．５Ｘ増大させた。注目すべきことに、ＣＤ８及びＣＤ８記憶Ｔ細胞数は、コンジュゲート１が０．３～１．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合、注射後２４０時間においてベースラインに戻らず、コンジュゲート１の持続性のＰＤ効果が示された。

【図30B-30C】図３０Ａ～Ｃは、各々、実施例１７に記載される、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１又は１．５ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１の単回投与後の総ＣＤ８、ＣＤ８中央記憶（Ｔｃｍ）及びＣＤ８エフェクター記憶（Ｔｅｍ）細胞数のプロットである。実施例１７に記載されるように、０．０３以上の用量レベルのコンジュゲート１は、血液中の総ＣＤ８ Ｔ細胞の有意な増大を誘導する。最低用量の０．０１ｍｇ／ｋｇは、ＣＤ８ Ｔｃｍ及びＣＤ８ Ｔｅｍを増大させた。０．３ｍｇ／ｋｇにおいて、コンジュゲート１はＣＤ８、ＣＤ８ Ｔｃｍ及びＣＤ８ Ｔｅｍを各々６．４Ｘ、３７．９Ｘ及び１４．５Ｘ増大させた。注目すべきことに、ＣＤ８及びＣＤ８記憶Ｔ細胞数は、コンジュゲート１が０．３～１．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合、注射後２４０時間においてベースラインに戻らず、コンジュゲート１の持続性のＰＤ効果が示された。

【図30D-30E】図３０Ｄ、３０Ｅ及び３０Ｆは、各々、実施例１７に記載される、マウスにおける総ＣＤ８、ＣＤ８ Ｔｃｍ及びＣＤ８ Ｔｅｍ集団内のＫｉ－６７パーセント陽性のプロットである。全用量レベルの単回投与のコンジュゲート１は、全ＣＤ８及びＣＤ８亜集団においてＫｉ－６７陽性を増大させる。

【図30F】図３０Ｄ、３０Ｅ及び３０Ｆは、各々、実施例１７に記載される、マウスにおける総ＣＤ８、ＣＤ８ Ｔｃｍ及びＣＤ８ Ｔｅｍ集団内のＫｉ－６７パーセント陽性のプロットである。全用量レベルの単回投与のコンジュゲート１は、全ＣＤ８及びＣＤ８亜集団においてＫｉ－６７陽性を増大させる。

【図31A】図３１Ａ、３１Ｂ及び３１Ｃは、実施例１７に記載される、コンジュゲート１の単回（点線）又は０．０３及び０．３ｍｇ／ｋｇでＱ７ｄｘ３（実線）での投与後のＣＤ８及びＣＤ８記憶亜集団Ｔ細胞数のプロットである。反復投与はこれらの集団をさらに増大させ、ＣＤ８、ＣＤ８ Ｔｃｍ、ＣＤ８ Ｔｅｍは各々３５．３Ｘ、１８３Ｘ及び７３．８Ｘ増大した。時間経過の終わりに（０．３ｍｇ／ｋｇでの最初又は最後の投与から２４０時間後）、細胞数はマウスにおいてベースラインに戻らなかった。

【図31B-31C】図３１Ａ、３１Ｂ及び３１Ｃは、実施例１７に記載される、コンジュゲート１の単回（点線）又は０．０３及び０．３ｍｇ／ｋｇでＱ７ｄｘ３（実線）での投与後のＣＤ８及びＣＤ８記憶亜集団Ｔ細胞数のプロットである。反復投与はこれらの集団をさらに増大させ、ＣＤ８、ＣＤ８ Ｔｃｍ、ＣＤ８ Ｔｅｍは各々３５．３Ｘ、１８３Ｘ及び７３．８Ｘ増大した。時間経過の終わりに（０．３ｍｇ／ｋｇでの最初又は最後の投与から２４０時間後）、細胞数はマウスにおいてベースラインに戻らなかった。

【図32A-32B】図３２Ａ及び３２Ｂは、実施例１７に記載される、マウスにおける０．０１～１．５ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１の単回投与後のＮＫ細胞数及びＫｉ－６７パーセント陽性のプロットである。ＮＫ細胞数は、全用量レベルでビヒクル対照を有意に超えて増大し、投与後２４０時間までにベースラインに戻る。全用量レベルは、ＮＫ細胞においてＫｉ－６７パーセント陽性の強力な増大を誘導する。

【図32C】図３２Ｃは、実施例１７に記載される０．０３及び０．３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１の単回（実線）又はＱ７ｄｘ３（破線）投与後のハツカネズミＮＫ細胞数のプロットである。０．３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１の反復投与は、単回投与と比較して、僅かに少ないＮＫ細胞数を誘導したが、なお有意であった。同様のＮＫ数が０．０３ｍｇ／ｋｇの単回、対、反復投与で達成された。

【図33A】図３３Ａは、実施例１８に記載される、マウスにおける試験物品処置後のＮＫ媒介標的細胞溶解における変化を測定するインビトロでのＮＫ細胞毒性アッセイを示す。０．００６、０．０３又は０．３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１又は１ｍｇ／ｋｇのＩＬ－１５で処置したｂａｌｂ／ｃマウスから単離した脾臓ＮＫ細胞によるＹＡＣ－１細胞のパーセント特異的溶解の、示される時間における時間経過を示す。ビヒクルを投与したマウスからの脾臓ＮＫ細胞は、対照としての役割を果たした。０．３ｍｇ／ｋｇで投与されたコンジュゲート１は、１ｍｇ／ｋｇのＩＬ－１５の単回注射を受けたマウスからのＮＫ細胞と比較して、規模及び持続時間において上回る、ＮＫ細胞毒性の上昇を誘導した。

【図33B】図３３Ｂは、図３３ＡにおいてＮＫインビトロ細胞毒性アッセイに捧げられた同じマウスからの血液ＮＫ細胞におけるグランザイムＢパーセント陽性のグラフである。実施例１８を参照されたい。０．０３及び０．３ｍｇ／ｋｇで投与されたコンジュゲート１は、ＮＫグランザイムＢ発現の有意な増大を誘導し、０．３ｍｇ／ｋｇでは強力な及び持続性の上昇が見られた。

【図34A-34B】図３４Ａ及び３４Ｂは、実施例１９に記載される、静脈内ＣＴ－２６腫瘍細胞注射を受容した後、０．０３又は０．３ｍｇ／ｋｇで１週間隔でコンジュゲート１処置を２回投与された、ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるパーセント肺小結節阻害を示す。０．０３及び０．３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１注射は、各々、肺小結節形成を４０及び８０％阻害した。０．３ｍｇ／ｋｇで投与された同じマウスは、次いで３２日間のその後の腫瘍細胞注射を受けて、生存を評価した。コンジュゲート１を用いた処置は、ビヒクル対照を受容した腫瘍注入マウスと比較して生存を有意に増大させた。

【図35】図３５は、実施例２０に記載される、ＮＫ細胞（オリーブグリーン色）、ＩｇＧ対照（青色）、又はＰＢＳ（橙色）の抗体媒介枯渇を受けた、コンジュゲート２で処置したＣＴ－２６注入マウスにおけるパーセント肺小結節阻害のグラフである。データは、ＣＴ－２６注入マウスに対する、ＮＫ細胞枯渇されず、ビヒクル対照（黒色）で処置されたパーセント肺小結節阻害として表される。この腫瘍モデルにおけるコンジュゲート２の有効性は、マウスがＮＫ細胞を欠いていた場合、消失した。

【図36A】図３６Ａ及び３６Ｂは、実施例２１に記載される、用量０．１ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１の静脈内投与後の１匹の雄（点線）及び１匹の雌（実線）ｃｙｎｏの、増殖の尺度としてのＣＤ８細胞数及びＫｉ－６７パーセント陽性に関する２週間の時間経過を示すプロットである。コンジュゲート１は、ｃｙｎｏにおいて有意なＣＤ８ Ｔ細胞増加を誘導し、単回投与後に細胞数は７～１０Ｘ増加する。

【図36B】図３６Ａ及び３６Ｂは、実施例２１に記載される、用量０．１ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１の静脈内投与後の１匹の雄（点線）及び１匹の雌（実線）ｃｙｎｏの、増殖の尺度としてのＣＤ８細胞数及びＫｉ－６７パーセント陽性に関する２週間の時間経過を示すプロットである。コンジュゲート１は、ｃｙｎｏにおいて有意なＣＤ８ Ｔ細胞増加を誘導し、単回投与後に細胞数は７～１０Ｘ増加する。

【図36C】図３６Ｃ及び３６Ｄは、実施例２１に記載される、コンジュゲート１の単回注射後のｃｙｎｏＣＤ８ Ｔｃｍ及びＣＤ８ Ｔｅｍ細胞数の増加を示す。ＣＤ８ Ｔｃｍ及びＴｅｍ数は、各々、２７～３０Ｘ及び２１～３３Ｘ増加した。

【図36D】図３６Ｃ及び３６Ｄは、実施例２１に記載される、コンジュゲート１の単回注射後のｃｙｎｏＣＤ８ Ｔｃｍ及びＣＤ８ Ｔｅｍ細胞数の増加を示す。ＣＤ８ Ｔｃｍ及びＴｅｍ数は、各々、２７～３０Ｘ及び２１～３３Ｘ増加した。

【図37A】図３７Ａ及び３７Ｂは、ｃｙｎｏにおける０．１ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１の単回投与後のＮＫ細胞数及びＫｉ－６７パーセント陽性のグラフである。実施例２１を参照されたい。ＮＫ細胞は、コンジュゲート１を用いた処置後に９～１０Ｘ増大した。

【図37B】図３７Ａ及び３７Ｂは、ｃｙｎｏにおける０．１ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１の単回投与後のＮＫ細胞数及びＫｉ－６７パーセント陽性のグラフである。実施例２１を参照されたい。ＮＫ細胞は、コンジュゲート１を用いた処置後に９～１０Ｘ増大した。

【図38A】図３８Ａ及び３８Ｂは、実施例２２に記載される、ヒトＰＢＭＣのＩＬ－１５（赤色、中実丸）、対、コンジュゲート１（緑色、中実四角形）処置、及びその後のＣＤ８及びＣＤ５６ ｂｒｉｇｈｔ ＮＫ細胞におけるｐＳＴＡＴ５パーセント陽性の測定に関するＥＣ５０曲線である。コンジュゲート１は、ＣＤ８及びＣＤ５６ ｂｒｉｇｈｔ ＮＫ細胞の関与において、各々、ＩＬ－１５よりも５．５及び１５Ｘ強力でない。しかしながら、コンジュゲート１は、従来のＩＬ－１５と同じ最大応答を達成する。

【図38B】図３８Ａ及び３８Ｂは、実施例２２に記載される、ヒトＰＢＭＣのＩＬ－１５（赤色、中実丸）、対、コンジュゲート１（緑色、中実四角形）処置、及びその後のＣＤ８及びＣＤ５６ ｂｒｉｇｈｔ ＮＫ細胞におけるｐＳＴＡＴ５パーセント陽性の測定に関するＥＣ５０曲線である。コンジュゲート１は、ＣＤ８及びＣＤ５６ ｂｒｉｇｈｔ ＮＫ細胞の関与において、各々、ＩＬ－１５よりも５．５及び１５Ｘ強力でない。しかしながら、コンジュゲート１は、従来のＩＬ－１５と同じ最大応答を達成する。

【図39】図３９は、実施例２３に記載される、マウスにおける静脈内単回用量の投与後の、５００μｇ／ｋｇのＩＬ－１５（緑色、中実丸）又は１０μｇ／ｋｇ（桃色、中実四角形）、３０μｇ／ｋｇ（紫色、中実三角形）、１００μｇ／ｋｇ（赤色、中実逆三角形）、３００μｇ／ｋｇ（橙色、中実菱形）又は１０００μｇ／ｋｇ（暗赤色、中空六角形）のコンジュゲート１の経時的な血漿濃度のプロットである。

【図40】図４０は、実施例２４に記載される、ラットにおける静脈内単回用量の投与後の、１０μｇ／ｋｇ（桃色、中実四角形）、７５μｇ／ｋｇ（紫色、中実三角形）又は１５０μｇ／ｋｇ（橙色、中実逆三角形）のコンジュゲート１の経時的な血漿濃度のプロットである。

【図41】図４１は、実施例２５に記載される、カニクイザルにおける静脈内単回用量の試験物品の投与後の、５０μｇ／ｋｇのＩＬ－１５（緑色、中実丸）又は１０μｇ／ｋｇ（赤色、中実逆三角形）、５０μｇ／ｋｇ（青色、中実菱形）又は１００μｇ／ｋｇ（橙色、中実四角形）のコンジュゲート１の経時的な血漿濃度のプロットである。

【図42A-42B】図４２Ａ及び４２Ｂは、各々、実施例２６に記載される、マウスにおける用量０．０３ｍｇ／ｋｇ（青色、中実丸）又は０．３ｍｇ／ｋｇ（橙色、中実丸）のコンジュゲート１の単回投与後のＣＤ４ Ｔ細胞数及びＫｉ－６７パーセント陽性のプロットである。ビヒクル（黒色）及び投与前（中空丸）細胞レベルも示される。全用量レベルは、用量後２４０時間までにベースラインに戻った。０．３ｍｇ／ｋｇ用量レベルは、ＣＤ４ Ｔ細胞においてＫｉ－６７パーセント陽性の強力な増大を誘導した。

【図43】図４３は、実施例２６に記載される、マウスにおける、０．０３ｍｇ／ｋｇ（橙色、中実丸）又は０．３ｍｇ／ｋｇ（青色、中実四角形）のコンジュゲート１の単回注射後のＣＤ４ Ｔ細胞内のｐＳＴＡＴ５パーセント陽性のグラフである。両用量レベルのコンジュゲート１は、ＣＤ４ Ｔ細胞において増大したｐＳＴＡＴ５シグナル伝達を誘導し、０．３ｍｇ／ｋｇはより高い増大を誘導した。ビヒクル（黒色）及び投与前（中空丸）を含む、１２０時間の時間経過が示される。

【図44A-44C】図４４Ａ、４４Ｂ及び４４Ｃは、実施例２７に記載される、カニクイザルにおけるビヒクル（黒色）又は用量０．００３ｍｇ／ｋｇ（青色、逆三角形）、０．０１ｍｇ／ｋｇ（緑色、菱形）又は０．１ｍｇ／ｋｇ（橙色、中実四角形）のコンジュゲート１のｉ．ｖ．投与後のＮＫ細胞（図４４Ａ）、ＣＤ８ Ｔ細胞（図４４Ｂ）及びＣＤ４ Ｔ細胞（図４４Ｃ）に関する、細胞数、対、投与後の時間を示すプロットである。

【図45A-45C】図４５Ａ、４５Ｂ及び４５Ｃは、実施例２７に記載される、カニクイザルにおける用量０．００１ｍｇ／ｋｇ（紫色、中実四角形）、０．００３ｍｇ／ｋｇ（青色、逆三角形）又は０．１ｍｇ／ｋｇ（橙色、中実四角形）のコンジュゲート１の単回投与後のＫｉ－６７パーセント陽性を示すプロットである。ビヒクル（黒色）レベルも示される。全用量レベルは、投与後少なくとも１７日目までにベースラインに戻った。０．１ｍｇ／ｋｇ及び０．００３ｍｇ／ｋｇ用量レベルは、ＮＫ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞においてＫｉ－６７パーセント陽性の強力な増大を誘導した。０．１ｍｇ／ｋｇ用量レベルは、試験した全細胞タイプでＫｉ－６７パーセント陽性の増大を誘導した。

【図46A-46C】図４６Ａ、４６Ｂ及び４６Ｃは、実施例２７に記載される、カニクイザルにおけるｉ．ｖ．単回用量のビヒクル（黒色）又は０．００１ｍｇ／ｋｇ（紫色、中実四角形）、０．０１ｍｇ／ｋｇ（緑色、菱形）若しくは０．１ｍｇ／ｋｇ（橙色、中実四角形）のコンジュゲート１の投与後のＮＫ細胞（図４６Ａ）、ＣＤ８ Ｔ細胞（図４６Ｂ）及びＣＤ４ Ｔ細胞（図４６Ｃ）リンパ球におけるＳＴＡＴ５リン酸化度を示す。

【図47A-47D】図４７Ａ～Ｄは、実施例２７に記載される、カニクイザルにおける用量０．００１ｍｇ／ｋｇ（紫色、中実四角形）、０．０１ｍｇ／ｋｇ（緑色、菱形）又は０．１ｍｇ／ｋｇ（橙色、中実四角形）のコンジュゲート１の単回投与後のＫｉ－６７パーセント陽性を示すプロットである。ビヒクル（黒色）レベルも示される。図４７Ａは、ＣＤ８ Ｔ_天然細胞に関する結果を示し、図４７Ｂは、ＣＤ８ Ｔ_ｓｃｍ細胞に関する結果を示す。図４７Ｃは、ＣＤ８ Ｔ_ｃｍ細胞に関する結果を示す。図４７Ｄは、ＣＤ８ Ｔ_ｅｍ細胞に関する結果を示す。

【図48A-48C】図４８Ａ、４８Ｂ、及び４８Ｃは、実施例２８に記載される、用量０．００１ｍｇ／ｋｇ（図４８Ａ）、０．０１ｍｇ／ｋｇ（図４８Ｂ）及び０．１ｍｇ／ｋｇ（図４８Ｃ）のコンジュゲート１で処置後の、時間の関数としてのグランザイムＢ発現を示すプロットである。このデータは、コンジュゲート１を用いた処置が、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＮＫ細胞内のグランザイムＢのレベルを増大させることを示す。

【図49A-49C】図４９Ａ、４９Ｂ、及び４９Ｃは、実施例２８に記載される、用量０．００１ｍｇ／ｋｇ（図４９Ａ）、０．０１ｍｇ／ｋｇ（図４９Ｂ）及び０．１ｍｇ／ｋｇ（図４９Ｃ）のコンジュゲート１で処置後の、時間の関数としてのパーフォリン発現を示すプロットである。このデータは、コンジュゲート１を用いた処置が、ＮＨＰにおけるＮＫ細胞内のパーフォリンのレベルを増大させることを示す。

【発明を実施するための形態】

【0049】

本開示の１つ以上の態様又は実施形態を詳細に説明する前に、本開示は、特定の合成技術、ＩＬ－１５部分などに限定されることを意図するものではないことに留意するべきであり、それは、それらが、本開示が適合する技術分野の当業者により理解されうるように変動し得るためである。

【0050】

本開示の特定の特徴を説明及び特許請求する際に、以下の専門用語は、別に示さない限り、下記に記載される定義に従って使用される。

【0051】

本明細書及び付属する特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」が、文脈上特に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことは注記されるべきである。

【0052】

１つ又は複数の実施形態の説明及び特許請求においては、以下の専門用語を下記の定義に従い用いるものとする。

【0053】

「生理学的に切断可能な」又は「加水分解性」又は「分解性」結合は、生理学的条件下で水と反応する（すなわち、加水分解される）比較的不安定な結合である。結合が水中で加水分解される傾向は、所定の分子中の２つの原子を連結する結合の一般的なタイプのみに依存するのではなく、それらの原子に結合する置換基にも依存し得る。適切な加水分解的に不安定な又は弱い結合としては、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、ペプチド、オリゴヌクレオチド、チオエステル、及びカーボネートを挙げることができるが、これらに限定されない。

【0054】

「酵素的に分解可能な結合」は、１つ以上の酵素による分解に供される結合を意味する。

【0055】

「安定な」結合（ｌｉｎｋａｇｅ）又は結合（ｂｏｎｄ）は、水中で実質的に安定な、すなわち、長期間にわたり、認識できる任意の程度まで、生理学的条件下で加水分解を受けない化学結合を指す。加水分解的に安定な結合の例としては、一般に以下が挙げられるがこれらに限定されない：炭素－炭素結合（例えば、脂肪鎖における）、エーテル、アミド、アミンなど。一般に、安定な結合は、生理学的条件下で、１日当たり約１～２％未満の加水分解率を示すものである。代表的な化学結合の加水分解率は、最も標準的な化学テキストに見出すことができる。

【0056】

例えば、インターロイキン－１５のような活性部分に共有結合したポリエチレングリコールの状況における共有「解放性」結合は、生理学的条件下で、例えば任意の好適な機構によって、臨床的に有用な速度で、ポリエチレングリコールポリマーを活性部分から解放又は分離する結合であり、例えば非限定的に加水分解性結合及び酵素分解性結合を含む。

【0057】

「実質的に」又は「本質的に」は、ほぼ全体的に又は完全に（例えば９５％以上の所定の量）を意味する。

【0058】

同様に、本明細書で使用される「約（ａｂｏｕｔ）」又は「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、所定の量の±５％以内を意味する。

【0059】

「任意選択の」又は「任意選択的」は、続いて記載される状況が生じ得るが、必ずしも生じる必要がないことを意味し、従って、この記載は、その状況が生じる場合と生じない場合とを含む。

【0060】

「薬学的に許容可能な賦形剤」又は「薬学的に許容可能な担体」は、本明細書に記載される組成物に含まれ、対象に有意な有害な毒性学的効果を生じ得ない成分を指す。

【0061】

表現「薬学的に有効な量」及び「薬理学的に有効な量」及び「治療的有効量」及び「生理学的に有効な量」は、本明細書で交換可能に使用され、血液流又は標的組織中で物質の所望のレベルを提供して、所望の生物学的応答又は薬物応答を引き起こすのに必要な、本明細書に提供される長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬の量を指す。例えば、そのような応答は、対象において標的癌細胞を破壊し、又は癌の進行を遅延若しくは抑止することができる。この用語は、標的細胞における特定の応答を誘導する用量にも適用される。正確な量は、例えば、処置される特定の状態、意図される患者集団、個々の患者の考慮事項、投与される治療組成物の成分及び物理学的特性などの多数の因子に依存するであろう。

【0062】

本明細書に記載される長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬に対する参照は、その薬学的に許容可能な塩形態を包含することが意図される。

【0063】

本明細書で使用される用語「患者」又は「対象」は、本明細書に提供される化合物又は組成物の投与により予防又は処置され得る状態を患う又は該状態に罹り易い生物を指す。対象は、哺乳動物（例えば、ハツカネズミ、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）を含むがこれらに限定されず、好ましくはヒトである。

【0064】

水溶性ポリマー、例えばＰＥＧに関連した分子量は、数平均分子量又は重量平均分子量のいずれとしても表すことができる。特に指示されない限り、本明細書で分子量と言うときは全て、重量平均分子量を指す。数平均及び重量平均のいずれの分子量の測定も、ゲル浸透クロマトグラフィー法又は他の液体クロマトグラフィー法を用いて計測することができる（例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー）。ゲル浸透クロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィーが最も一般的に使用される。また、分子量を計測するための他の方法は、末端基分析、若しくは束一的性質（例えば、凝固点降下、沸点上昇、若しくは浸透圧）の計測が含まれ、それにより数平均分子量を決定してもよく、又は、光散乱法、超遠心法、ＭＡＬＤＩＴＯＦ、若しくは粘度測定法を用いることにより重量平均分子量を決定してもよい。ＰＥＧポリマーは、典型的には多分散系であり（すなわち、ポリマーの数平均分子量と重量平均分子量とが等しくない）、好ましくは約１．２未満、より好ましくは約１．１５未満、さらにより好ましくは約１．１０未満、なおさらにより好ましくは約１．０５未満、及び最も好ましくは約１．０３未満の低い多分散性値を有する。

【0065】

用語「活性の」、「反応性の」、又は「活性化された」は、特定の官能基と併せて使用されるとき、別の分子上の求電子剤又は求核剤と容易に反応する反応性官能基を指す。これは、反応させるために強力な触媒又は極めて非現実的な反応条件が必要な基（すなわち、「非反応性の」、又は「不活性の」基）と対比される。

【0066】

本明細書で使用されるとき、用語「官能基」又はその任意の同義語は、その保護型並びに無保護型を包含することが意図される。

【0067】

用語「スペーサー部分」、「連結」、及び「リンカー」は、本明細書では、例えば高分子剤の末端とＩＬ－１５部分の相互接続部分を場合により連結するために用いられる結合又は原子若しくは原子集合を指して用いられうる。スペーサー部分は、加水分解に対して安定であってもよく、又は生理的に加水分解可能か、若しくは酵素分解可能か、さもなければ解除可能な連結を含んでもよい。文脈上特に明確に指示されない限り、スペーサー部分は化合物の任意の２つの要素間に場合により存在する（例えば、ＩＬ－２部分とＰＥＧのような水溶性ポリマーは、直接的にも、又はスペーサー部分を介して間接的にも結合することができる）。

【0068】

「アルキル」は炭化水素鎖を指し、典型的には約１～１５個の範囲の原子長さである。かかる炭化水素鎖は、必須ではないが好ましくは飽和しており、分枝鎖状であっても、又は直鎖状であってもよく、但し典型的には直鎖状が好ましい。例示的なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、３－メチルペンチルなどが挙げられる。

【0069】

「低級アルキル」は、１～６個の炭素原子を含むアルキル基を指し、直鎖状であっても、又は分枝鎖状であってもよく、メチル、エチル、ｎ－ブチル、ｉ－ブチル、及びｔ－ブチルにより例示されるとおりである。

【0070】

「アルコキシ」は、－ＯＲ基であって、式中、Ｒがアルキルか、又は置換アルキル、好ましくはＣ_１～６アルキル（例えば、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシなど）である－ＯＲ基を指す。

【0071】

例えば「置換アルキル」にあるような用語「置換された」は、限定はされないが、アルキル、Ｃ_３～８シクロアルキル、例えば、シクロプロピル、シクロブチルなど；ハロ、例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨード；シアノ；アルコキシ、低級フェニル；置換フェニル；などの１つ又は複数の干渉しない置換基で置換された部分（例えば、アルキル基）を指す。「置換アリール」は、１つ又は複数の干渉しない基を置換基として有するアリールである。フェニル環に対する置換について、置換基はいかなる配向（すなわち、オルト、メタ、又はパラ）であってもよい。

【0072】

「干渉しない置換基」は、分子中に存在するとき、典型的にはその分子中に含まれる他の官能基との反応性を有しない基である。

【0073】

「アリール」とは、１つ又は複数の芳香環であって、各々が５個又は６個の中心炭素原子であるものを意味する。アリールは、ナフチルにおけるように縮合していることも、又はビフェニルにおけるように縮合していないこともある複数のアリール環を含む。アリール環はまた、１つ又は複数の環状炭化水素、ヘテロアリール、又は複素環式環と縮合していても、又は縮合していなくともよい。本明細書で使用されるとき、「アリール」にはヘテロアリールが含まれる。

【0074】

「ヘテロアリール」は、１～４個のヘテロ原子、好ましくは硫黄、酸素、若しくは窒素、又はそれらの組み合わせを含むアリール基である。ヘテロアリール環はまた、１つ又は複数の環状炭化水素、複素環式環、アリール環、又はヘテロアリール環と縮合していてもよい。

【0075】

「複素環」又は「複素環式」とは、５～１２個の原子、好ましくは５～７個の原子の１つ又は複数の環であって、不飽和特性又は芳香族特性を伴うことも、又は伴わないこともあり、且つ炭素以外の少なくとも１個の環原子を有する環を意味する。好ましいヘテロ原子としては、硫黄、酸素、及び窒素が挙げられる。

【0076】

「置換ヘテロアリール」は、１つ又は複数の干渉しない基を置換基として有するヘテロアリールである。

【0077】

「置換複素環」は、干渉しない置換基から形成された１つ又は複数の側鎖を有する複素環である。

【0078】

「有機ラジカル」は、本明細書で使用されるとき、アルキル、置換アルキル、アリール、及び置換アリールを含む。

【0079】

「薬学的に許容可能な賦形剤又は担体」とは、場合により本発明の組成物中に含めることができ、患者に対して何ら有意な毒性の有害作用を引き起こすことのない賦形剤を指す。

【0080】

用語「ＩＬ－１５部分」は、本明細書で使用されるとき、ヒトＩＬ－１５活性を有するペプチド又はタンパク質部分を指す。加えて、用語「ＩＬ－１５部分」は、コンジュゲート形成前のＩＬ－１５部分並びにコンジュゲート形成後のＩＬ－１５部分残基の双方を包含する。以下にさらに詳細に説明するとおり、当業者は、任意の所与の部分がＩＬ－１５活性を有するかどうかを決定することができる。配列番号１～３のいずれか１つに対応するアミノ酸配列を含むタンパク質、並びにそれと実質的に相同な任意のタンパク質又はポリペプチドが、ＩＬ－１５部分である。本明細書で使用されるとき、用語「ＩＬ－１５部分」には、例えば部位特異的突然変異誘発によって意図的に修飾されたか、又は突然変異によって偶発的に修飾されたかかるペプチド及びタンパク質が含まれる。これらの用語にはまた、１～６個のさらなるグリコシル化部位を有する類似体、ペプチド又はタンパク質のカルボキシ末端側の終端部に、少なくとも１個のさらなるアミノ酸であって、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む１個又は複数のさらなるアミノ酸を有する類似体、及び少なくとも１つのグリコシル化部位を含むアミノ酸配列を有する類似体も含まれる。この用語には、天然の部分及び組換え及び合成的に産生された部分の双方が含まれる。

【0081】

用語「実質的に相同な」又は「実質的に同一な」とは、特定の対象配列、例えば突然変異配列が、１つ又は複数の置換、欠失、又は付加だけ基準配列と異なるが、その正味の効果としては、基準配列と対象配列との間に機能上の有害な相違は生じないことを意味する。本発明の目的上、９５パーセントを超える相同性（同一性）、所定の配列に対する等価な生物活性（必須ではないが等価な生物活性強度）、及び等価な発現特性を有する配列が、実質的に相同（同一）であると見なされる。相同性を決定する目的では、天然配列のトランケーションは無視する必要がある。本明細書で使用される例示的なＩＬ－１５ポリペプチドは、配列番号１に対して実質的に相同な配列を含む。配列番号２は配列番号１とほぼ同一であるが、配列番号２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において翻訳の開始に必要なメチオニンを配列の最初に有する。

【0082】

用語「断片」は、ＩＬ－１５部分の一部分又は断片のアミノ酸配列を有し、ＩＬ－１５の生物活性、又は実質的に生物活性を有する任意のタンパク質又はポリペプチドを意味する。断片は、ＩＬ－１５部分のタンパク質分解により生成されるタンパク質又はポリペプチド、及び当技術分野で日常的な方法による化学合成によって生成されるタンパク質又はポリペプチドを含む。

【0083】

ペプチド中のアミノ酸残基は、以下のとおり略記される：フェニルアラニンはＰｈｅ又はＦであり；ロイシンはＬｅｕ又はＬであり；イソロイシンはＩｌｅ又はＩであり；メチオニンはＭｅｔ又はＭであり；バリンはＶａｌ又はＶであり；セリンはＳｅｒ又はＳであり；プロリンはＰｒｏ又はＰであり；スレオニンはＴｈｒ又はＴであり；アラニンはＡｌａ又はＡであり；チロシンはＴｙｒ又はＹであり；ヒスチジンはＨｉｓ又はＨであり；グルタミンはＧｌｎ又はＱであり；アスパラギンはＡｓｎ又はＮであり；リジンはＬｙｓ又はＫであり；アスパラギン酸はＡｓｐ又はＤであり；グルタミン酸はＧｌｕ又はＥであり；システインはＣｙｓ又はＣであり；トリプトファンはＴｒｐ又はＷであり；アルギニンはＡｒｇ又はＲであり；及びグリシンはＧｌｙ又はＧである。

【0084】

概要
本開示は、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬の提供に関する。そのような作動薬は、例えば少なくとも以下の１つのような、いくつかの利点及び予想外の特徴を理想的に有するであろう：（ｉ）連日投与の必要性を有することなく、測定可能な薬力学的効果を提供することによって持続性のＩＬ－１５活性を送達する能力、（ｉｉ）ＩＬ－１５受容体αに対する高い結合度を保持する（すなわち、ＩＬ－１５と比較して）、（ｉｉｉ）ＮＫ細胞活性化及び／若しくは増殖を刺激する、並びに／又は（ｉｖ）ＣＤ８ Ｔ細胞生存及び／若しくは記憶形成を支持する、並びに（ｖ）腫瘍成長の阻害を提供する。驚くべきことに、本出願人らは、以下に詳細に記載される、有利な特性の独特の組み合わせを有する長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬に到達した。

【0085】

長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬及び関連組成物
一般に、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬又はその薬学的に許容可能な塩形態は、アミド結合を介してＩＬ－１５アミノ基に安定して共有結合した単一直鎖ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）部分を含む。ＰＥＧ部分と、ＩＬ－１５アミノ基に対する安定なアミド結合との間には、２～５個の炭素原子を有する直鎖非置換アルキレン基（～ＣＨ_２～）_ｍ（すなわち、ｍ＝２、３、４、又は５）が介在する。

【0086】

ＩＬ－１５部分を考察する場合、用語「ＩＬ－１５部分」は、コンジュゲーション前のＩＬ－１５部分、及びポリ（アルキレンオキシド）（例えばポリ（エチレングリコール）又はＰＥＧ）などの非ペプチド性の水溶性ポリマーへの結合後のＩＬ－１５部分を指す。以後、ＰＥＧを非ペプチド性の水溶性ポリマーとして以下に特に参照するが、本開示は一般に、非ペプチド性の水溶性ポリマー又はポリ（アルキレングリコール）に関連することが理解されるであろう。しかしながら、元のＩＬ－１５部分がポリエチレングリコール部分に結合された場合、ＩＬ－１５部分は、ポリマーに対する結合に関連した１つ以上の共有結合の存在に起因して、僅かに変更されていることが理解されるであろう。

【0087】

ＩＬ－１５部分は、非組換え方法からも、及び組換え方法からも得ることができ、本開示はこの点について限定されない。加えて、ＩＬ－１５部分は、ヒト供給源にも、動物供給源（昆虫を含む）にも、菌類供給源（イーストを含む）にも及び植物供給源にも由来し得る。

【0088】

代替的に、ＩＬ－１５部分は、Ｇｒａｂｓｔｅｉｎらによって記載される手順に従い得ることができる。例えば、Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：９６５－９６８を参照のこと。ＩＬ－１５部分は、例えば、Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎへの欧州特許第０７７２６２４ Ｂ２号明細書に記載されているものなどの組換え方法を用いて調製することもできる。ＩＬ－１５部分は、例えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）及びＰｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙｈｉｌｌ，ＮＪ）から市販品を購入することができる。

【0089】

ＩＬ－１５部分は、細菌［例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（３）：２９５－３１１を参照］、哺乳動物［例えば、Ｋｒｏｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｇｅｎｅ １２１：２９５－３０４を参照］、酵母［例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、例えば、Ｍｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２８（１）：１２１－１２９を参照］、及び植物［例えば、Ｍｏｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７５（３）：２５９－２６６を参照］の発現系で発現させることができる。発現は、外因性発現によっても（宿主細胞が天然で所望の遺伝コードを含む場合）又は内因性発現によっても起こり得る。

【0090】

組換えに基づくタンパク質の調製方法には違いがあり得るが、典型的には、組換え方法には、所望のポリペプチド又は断片をコードする核酸の構築、核酸の発現ベクターへのクローニング、宿主細胞（例えば、植物、細菌、酵母、トランスジェニック動物細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞若しくはベビーハムスター腎臓細胞などの哺乳動物細胞）の形質転換、及び核酸の発現による所望のポリペプチド又は断片の産生が関わる。組換えポリペプチドをインビトロで原核生物及び真核生物の宿主細胞において産生し、発現させる方法は、当業者に公知である。

【0091】

組換えポリペプチドの同定及び精製を促進するため、エピトープタグ又は他の親和性結合配列をコードする核酸配列を、コード配列とインフレームで挿入又は付加し、それにより所望のポリペプチドと、結合に適したポリペプチドとを含む融合タンパク質を産生することができる。融合タンパク質の同定及び精製は、初めに融合タンパク質を含む混合物を、融合タンパク質中のエピトープタグ又は他の結合配列に対する結合部分（例えば、抗体）を有するアフィニティーカラムに通過させ、それによって融合タンパク質をカラム内に結合させることにより行うことができる。その後、カラムを適切な溶液（例えば、酸）で洗浄して結合した融合タンパク質を遊離させることにより、融合タンパク質を回収することができる。組換えポリペプチドはまた、宿主細胞の溶解、ポリペプチドの、例えばイオン交換クロマトグラフィーによる分離、親和性結合手法、疎水性相互作用手法により精製し、その後、ＭＡＬＤＩ又はウエスタンブロットにより同定し、及びポリペプチドを回収することもできる。組換えポリペプチドを同定及び精製するためのこれらの及び他の方法は、当業者に公知である。しかしながら、１つ又は複数の実施形態では、ＩＬ－１５部分は融合タンパク質の形態ではない。

【0092】

ＩＬ－１５活性を有するタンパク質の発現に用いられる系に応じて、ＩＬ－１５部分はグリコシル化されていなくても、又はグリコシル化されていてもよく、いずれも使用することができる。すなわち、ＩＬ－１５部分はグリコシル化されていなくてもよく、又はＩＬ－１５部分はグリコシル化されていてもよい。１つ又は複数の実施形態では、ＩＬ－１５部分はグリコシル化されていない。

【0093】

ＩＬ－１５部分は、有利には、１つ又は複数のアミノ酸残基、例えば、リジン、システイン及び／又はアルギニンを含む及び／又は置換するように修飾することができ、それによりポリマーがそのアミノ酸の側鎖内の原子と結合し易くなる。ＩＬ－１５部分の置換の例は、米国特許第６，１７７，０７９号明細書に記載される。加えて、ＩＬ－１５部分は、天然に存在しないアミノ酸残基を含むように修飾することができる。アミノ酸残基及び天然に存在しないアミノ酸残基を付加する方法は、当業者に公知である。Ｊ．Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２），ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｉｓｔｓ（ｅｄｓ．Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒ．Ｂａｒｎｅｓ ａｎｄ Ｉａｎ Ｃ Ｇｒａｙ），２００３ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ，Ｂｅｔｔｓ，Ｍ．Ｊ．，ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｒ．Ｂ．を参照されたい。

【0094】

加えて、ＩＬ－１５部分は、有利には、官能基の結合（官能基を含むアミノ酸残基の付加によるものは除く）を含むように修飾することができる。例えば、ＩＬ－１５部分は、チオール基を含むように修飾することができる。加えて、ＩＬ－１５部分は、Ｎ末端のα炭素を含むように修飾することができる。加えて、ＩＬ－１５部分は、１つ又は複数の炭水化物部分を含むように修飾することができる。加えて、ＩＬ－１５部分は、アルデヒド基を含むように修飾することができる。加えて、ＩＬ－１５部分は、ケトン基を含むように修飾することができる。本発明の一部の実施形態では、ＩＬ－１５部分は、チオール基、Ｎ末端のα炭素、炭水化物、アルデヒド基及びケトン基のうちの１つ又は複数を含むようには修飾されないことが好ましい。

【0095】

例示的ＩＬ－１５部分は、本明細書、文献、並びに例えば米国特許出願公開第２００６／０１０４９４５号明細書、Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４）：２３１２－２３１８、及びＷｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２（１１），ｅ２６４４２：１－３に記載される。好ましいＩＬ－１５部分には、配列番号１～３からなる群から選択される配列、及びそれと実質的に相同の配列を含むアミノ酸配列を有するものが含まれる（ここで、配列番号２及び３、及びそれらと実質的に相同の配列が本明細書に提供されるＩＬ－１５部分のインビトロ活性基準を満たさない場合であっても、本発明の目的上、それらの配列もまた「ＩＬ－１５部分」であると理解されることは理解されるであろう）。好ましいＩＬ－１５部分は、配列番号１に対応するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５部分は、配列番号１～３のいずれか１つと少なくとも約８５％又は少なくとも約９０％同一性を有する機能的相同体である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５部分は、配列番号１～３のいずれか１つと少なくとも約９５％、９８％又は９９％同一性を有する機能的相同体である。

【0096】

場合によっては、ＩＬ－１５部分は、対応するペプチドの単一の発現が個別の単位として体系付けられる「単量体」形態であり得る。他の場合には、ＩＬ－１５部分は、２つの単量体形態のタンパク質が互いに会合している「二量体」の形態（例えば、組換えＩＬ－１５の二量体）であり得る。

【0097】

加えて、前駆体形態のＩＬ－１５をＩＬ－１５部分として使用することができる。例示的な前駆体形態のＩＬ－１５は配列番号３の配列を有する。

【0098】

前述の配列のいずれかのトランケート型、ハイブリッド変異体、及びペプチド模倣物もまた、ＩＬ－１５部分として働き得る。少なくともある程度のＩＬ－１５活性を維持する前述のいずれかの生物学的に活性な断片、欠失変異体、置換変異体又は付加変異体もまた、ＩＬ－１５部分として働き得る。

【0099】

所与のペプチド、タンパク質部分又はコンジュゲートについて、当該のペプチド、タンパク質部分又はコンジュゲートがＩＬ－１５活性を有するかどうかを決定することが可能である。インビトロＩＬ－１５活性を決定するための様々な方法が当該技術分野において記載されている。例示的手法はｐＳＴＡＴアッセイに基づく。簡潔に言えば、ＩＬ－１５依存性ＣＴＬＬ－２細胞がＩＬ－１５活性を有する被験物質に曝露された場合、結果として、定量的に計測することのできるチロシン残基６９４（Ｔｙｒ６９４）におけるＳＴＡＴ５のリン酸化を含むシグナル伝達カスケードが惹起される。アッセイプロトコル及びキットは公知であり、例えば、ＭＳＤ Ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｔｙｒ６９４）／Ｔｏｔａｌ ＳＴＡＴａ，ｂ全細胞ライセートキット（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）が含まれる；例えばこの手法を用いて、５分又は１０分の少なくとも一方の時点で約３００ｎｇ／ｍＬ以下（より好ましくは約１５０ｎｇ／ｍＬ以下）のｐＳＴＡＴ５ ＥＣ_５０値を呈する候補ＩＬ－１５部分が、本開示に関連した「ＩＬ－１５部分」であると見なされる。しかしながら、使用されるＩＬ－１５部分はより強力である（例えば、５分又は１０分の少なくとも一方の時点で１５０ｎｇ／ｍＬ未満、例えば５分又は１０分の少なくとも一方の時点で約１ｎｇ／ｍＬ未満、さらにより好ましくは０．５ｎｇ／ｍＬ未満のｐＳＴＡＴ５ ＥＣ_５０値を有する）ことが好ましい。

【0100】

電位測定法、分光測定法、クロマトグラフィー法、及び放射測定法を含めた当該技術分野において公知の他の方法もまた、ＩＬ－１５機能の評価に用いることができる。一つのかかる別のタイプのアッセイについては、例えば、Ｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（１２）：１１８７－１１９５を参照のこと。

【0101】

ＩＬ－１５部分の活性の測定に関連して使用されるアッセイは、本明細書に記載される長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬の活性の測定にも使用することができる。例えば、本明細書に提供される支持実施例を参照されたい。

【0102】

化合物は、対象への投与後、作動薬が、ＩＬ－１５の投与の場合よりも長い時間、インビボでのＩＬ－１５受容体活性化作用を示す限り、本開示による長時間作用型のＩＬ－１５ Ｒ作動薬と見なされる。例えば化合物を放射性標識し、化合物をインビボで投与し、そのクリアランスを決定することを含む従来の手法を用いて、長時間作用型のＩＬ－１５ Ｒ作動薬として提案される化合物が「長時間作用型」である（すなわち、同じインビボ系に投与されたＩＬ－１５よりも長いクリアランスを有する）か否かを評価することができる。本発明の目的上、長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬の長時間作用の性質は、フローサイトメトリーを用いて、評価されるべき作動薬をマウスに投与後の様々な時点で、リンパ球におけるＳＴＡＴ５リン酸化を測定して決定され得、又は典型的には決定される。参照として、シグナルはＩＬ－１５によってほぼ２４時間で喪失するが、長時間作用型ＩＬ－１５作動薬の場合は、ある期間を超えて持続性である。

【0103】

前述したように、好ましい長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬は、一般に、アミド結合を介してＩＬ－１５アミノ基に安定して共有結合した単一直鎖ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）部分を含むであろう。ＰＥＧ部分と、ＩＬ－１５アミノ基に対する安定なアミド結合との間に、２～５個の炭素原子を有する直鎖非置換アルキレン基（～ＣＨ_２～）_ｍ（すなわち、ｍ＝２、３、４、又は５）が介在する。

【0104】

例えば、いくつかの実施形態では、非置換アルキレン基は（～ＣＨ_２～）_２であり；又は、いくつかの追加の実施形態では、非置換アルキレン基は（～ＣＨ_２～）_３であり；いくつかのなおさらなる実施形態では、非置換アルキレン基は（～ＣＨ_２～）_４であり；いくつかのなおさらなる実施形態では、非置換アルキレン基は（～ＣＨ_２～）_５である。

【0105】

例えば、いくつかの実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬は、以下の構造を有する：

【化10】

式中、ＩＬ－１５は、インターロイキン－１５部分であり、ｎは、約１５０～約３，０００の整数であり；ｍは、２～５の整数（例えば、２、３、４、又は５）であり、ｎ’は１である。式Ｉ（及び本明細書に提供される類似の式）において、構造中の～ＮＨ～は、ＩＬ－１５部分のアミノ基を表す。式（Ｉ）は、以下のように示すこともでき、

【化11】

ここで括弧は末端ＰＥＧメトキシ基を反映するように移動され、２つの式は、交換可能に使用され得る。例示的な化合物の例としては、式（Ｉ）により包含される以下が挙げられる：

【化12】

【0106】

いくつかの好ましい実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬は、式（Ｉａ）又は式（Ｉｂ）に対応する。いくつかの特に好ましい実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬は、式（Ｉｂ）に対応する。

【0107】

本明細書に記載される構造及び式に関連したいくつかのさらなる実施形態では、ｎは、約２００～約２０００、又は約４００～約１３００、又は約４５０～約１２００の整数である。すなわち、いくつかの実施形態では、ｎは、約２００～約２０００の整数である。いくつかのなおさらなる実施形態では、ｎは、約４００～約１３００の整数である。いくつかのなおさらなる実施形態では、ｎは、約４５０～約１２００の整数である。

【0108】

前述のｎ値の範囲のいずれかに対応する分子量を有するＰＥＧが一般に好ましい。

【0109】

１つ以上の実施形態では、ｎは、約１０，０００ダルトン（ここでｎは約２２７である）、又は約１５，０００ダルトン（ここでｎは約３４０である）、又は約２０，０００ダルトン（ここでｎは約４５４である）、又は約２５，０００ダルトン（ここでｎは約５６８である）、又は約３０，０００ダルトン（ここでｎは約６８１である）、又は約４０，０００ダルトン（ここでｎは約９０９である）、又は約５０，０００ダルトン（ここでｎは約１１３６である）又はさらには約６０，０００ダルトン（ここでｎは約１３６４である）以上からなる群から選択される重量平均分子量を有するポリエチレングリコールポリマーに対応する値を有する整数である。

【0110】

化合物のポリエチレングリコール部分に関するさらなる例示的な重量平均分子量は、前述に加えて、約１１，０００ダルトン、約１２，０００ダルトン、約１３，０００ダルトン、約１４，０００ダルトン、約２２，５００ダルトン、約３５，０００ダルトン、約４５，０００ダルトン、約５５，０００ダルトン、約６５，０００ダルトン、約７０，０００ダルトン、及び約７５，０００ダルトンを含む。

【0111】

いくつかの好ましい実施形態では、化合物のポリエチレングリコールポリマー部分の重量平均分子量は、約４０，０００ダルトンである。

【0112】

ＰＥＧ部分は、好ましくは、式（Ｉ）において上記に示すように、メトキシ基で末端キャップされるが、ＰＥＧ部分は、その末端を任意の低級Ｃ_１－６アルコキシ基でキャップされてもよく、又はヒドロキシル基若しくは他の好適な末端キャップ基で終結してもよい。

【0113】

いくつかの実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬組成物は、集合的に考えた場合、下記の式：

【化13】

（式中、ｎ及びｍの値は、上記の式（Ｉ）に関して提供したとおりである。すなわち、そのような組成物の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬成分の観点から、組成物に含まれる約２０モルパーセント以下の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬は、式（ＩＩ）のものである）により包含される、約２０モルパーセント（ｍｏｌ％）以下の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬（組成物中のＩＬ－１５含有分子の）を含む。

【0114】

いくつかの追加の実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬組成物は、集合的に考えた場合、下記の式：

【化14】

（式中、ｎ及びｍの値は、上記の式（Ｉ）に関して提供したとおりである。すなわち、そのような組成物の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬成分の観点から、組成物に含まれる約１５ｍｏｌパーセント以下の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬は、式（ＩＩ）のものである。いくつかの実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬組成物は、約０．１～２０ｍｏｌ％以下の式（ＩＩ）の化合物を含む。実施形態では、組成物は、約０．１～１５、０．１～１０、０．１～５、０．１～１、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、５～２０、５～１５、５～１０、１０～２０、１０～１５、又は１５～２０ｍｏｌ％以下の式（ＩＩ）の化合物を含む）により包含される、約１５モルパーセント（ｍｏｌ％）以下の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬（組成物中のＩＬ－１５含有分子の）を含む。

【0115】

前述に関連したいくつかの特定の実施形態では、式（Ｉａ）に関連した長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬組成物は、集合的に考えた場合、下記の式：

【化15】

（式中、ｎ及びｍの値は、上記の式（Ｉａ）に関して提供したとおりである）により包含される、約１５モルパーセント（ｍｏｌ％）以下の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬（組成物中のＩＬ－１５含有分子の）を含む。

【0116】

いくつかの他の好ましい実施形態では、式（Ｉｂ）に関連した長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬組成物は、集合的に考えた場合、下記の式：

【化16】

（式中、ｎ及びｍの値は、上記の式（Ｉｂ）に関して提供したとおりである）により包含される、１５モルパーセント（ｍｏｌ％）以下の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬（組成物中のＩＬ－１５含有分子の）を含む。

【0117】

いくつかの別の実施形態では、式（Ｉｃ）に関連した長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬組成物は、集合的に考えた場合、下記の式：

【化17】

（式中、ｎ及びｍの値は、上記の式（Ｉｃ）に関して提供したとおりである）により包含される、約１５モルパーセント（ｍｏｌ％）以下の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬（組成物中のＩＬ－１５含有分子の）を含む。

【0118】

いくつかの別の実施形態では、式（Ｉｄ）に関連した長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬組成物は、集合的に考えた場合、下記の式：

【化18】

（式中、ｎ及びｍの値は、上記の式（Ｉｄ）に関して提供したとおりである）により包含される、約１５モルパーセント（ｍｏｌ％）以下の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬（組成物中のＩＬ－１５含有分子の）を含む。

【0119】

いくつかの実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬組成物は、約０．１～２０ｍｏｌ％以下の式（ＩＩ）の化合物（式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、及び（ＩＩｄ）の化合物を含む）を含む。いくつかの追加の実施形態では、組成物は、約０．１～１５、０．１～１０、０．１～５、０．１～１、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、５～２０、５～１５、５～１０、１０～２０、１０～１５、又は１５～２０ｍｏｌ％以下の式（ＩＩ）の化合物（式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、及び（ＩＩｄ）の化合物を含む）を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約０．１、１、５、１０、１５、又は２０ｍｏｌ％以下の式（ＩＩ）の化合物（式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、及び（ＩＩｄ）の化合物を含む）を含む。組成物は、式（Ｉ）の化合物に関して当技術分野で既知の方法により精製され、その結果、式（ＩＩ）の化合物が組成物中に存在しない、微量存在する、又は実質的に存在し得ないことを認識するであろう。

【0120】

例えば、いくつかの実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬組成物は、集合的に考えた場合、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、及び（ＩＩｄ）の化合物を含む式（ＩＩ）により包含される、約１２モルパーセント以下、又は約１０モルパーセント以下の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬を含む。

【0121】

前述のいくつかの追加の実施形態では、組成物は、２、３に等しい、又は３を超えるｎ’を有する（すなわち、より高級のＰＥＧｍｅｒ）、約７ｍｏｌ％以下の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬を含む。さらなるいくつかの他の実施形態では、組成物は、２、３に等しい、又は３を超える（すなわち、２以上の）ｎ’を有する、約５ｍｏｌ％以下の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬を含む。

【0122】

いくつかのさらなる実施形態では、組成物は、式（Ｉ）、

【化19】

（式中、ｎ及びｍは上述したとおりであり、ｎ’は、ＩＬ－１５アミノ基に共有結合したポリエチレングリコール部分の平均数を表し（組成物に関して）、組成物に関するｎ’は、１．０～約１．３の範囲内である。例えば、ＩＬ－１５部分当たりのポリエチレングリコール部分の平均数は、約１．０、１．１、１．２及び約１．３から選択される。すなわち、式（Ｉ）による好ましい長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬は、本明細書では「モノペグ化」と称され得、ここで、上述したように、ペグ化度には幾分かの可変性が存在することを理解するべきである。本明細書に記載される式に関連した、いくつかの好ましい実施形態では、「ｍ」は３に等しい）による長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬を含む。

【0123】

長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬の組成物は、ｎ’が約１に等しく、ＰＥＧ部分が、組成物中の実質的に全てのＩＬ－１５コンジュゲートに関して同じ位置に結合している単一種を含んでもよく、又は代替的に、直鎖ポリエチレングリコール部分の結合が、インターロイキン－１５部分上の異なる部位に生じる、すなわち、特定の結合部位が、組成物中に含まれるモノペグ化ＩＬ－１５種の全てに関して同じではない、モノペグ化コンジュゲート種の混合物を含んでもよい）。従って、そのような組成物は、ＩＬ－１５に結合したＰＥＧ部分の数の観点から実質的に均一であるが（例えば、１－ｍｅｒ）、ＩＬ－１５分子上のアミノ基結合の位置の観点からは不均一である。

【0124】

追加のＰＥＧ構築及び結合化学を、長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬に到達するために使用することができるが、支持実施例に鑑みて考慮する場合に明らかとなるように、前述したような化合物は、１つ以上の実施形態において好ましい。しかしながら、本明細書に提供される構造を有する、追加の長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬も想定される。

【0125】

いくつかの実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬組成物は、集合的に考えた場合、式（Ｉａ～ｄ）を含む式（Ｉ）により包含される、少なくとも約８０ｍｏｌ％の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬（組成物中のＩＬ－１５含有分子の）を含む。１つ以上の実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬組成物は、少なくとも約８５ｍｏｌ％、９０ｍｏｌ％、９５ｍｏｌ％、９８ｍｏｌ％又は９９ｍｏｌ％の式（Ｉ）の長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬を含む。

【0126】

上述したように、長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬は、薬学的に許容可能な塩の形態であり得る。典型的には、そのような塩は、薬学的に許容可能な酸又は酸等価物との反応によって形成される。これに関連して用語「薬学的に許容可能な塩」は、一般に、比較的無毒の無機及び有機酸付加塩を指す。これらの塩は、投与ビヒクル若しくは剤形製造プロセスにおいてインサイチューで、又は、本明細書に記載される長時間作用型インターロイキン－１５受容体作動薬を、好適な有機若しくは無機酸と別々に反応させ、そのように形成された塩を単離することによって調製され得る。代替的な塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩（ｎａｐｔｈｙｌａｔｅ）、オキシル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、及びラウリルスルホン酸塩などが挙げられる。（例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９７７）「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１－１９参照）。従って、記載される塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機塩から誘導され；又は酢酸、プロピオン、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリシリック酸（ｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ）、スルファニル酸、２－アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イソチオン酸（ｉｓｏｔｈｉｏｎｉｃ）などの有機酸から調製され得る。

【0127】

いくつかの実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬組成物は、集合的に考えた場合、約１～５ｍｏｌ％以下の遊離ＩＬ－１５タンパク質（組成物中のＩＬ－１５含有分子の）を含む。いくつかのさらなる実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５作動薬組成物は、約０．５ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％、２ｍｏｌ％、３ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％、又は５ｍｏｌ％以下の遊離（すなわち、非コンジュゲート化）ＩＬ－１５を含む。

【0128】

長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬を調製するために、ＩＬ－１５部分を例えばそのアミノ基（例えばリシン又はＮ－末端）において、スクシンイミジル基（又は他の活性化エステルグループ）で官能化されたＰＥＧ試薬にコンジュゲートし得る。この手法を用いて、スクシンイミジル活性化ＰＥＧは、水性媒体中でｐＨ約７．０～９．０で、ＩＬ－１５部分のアミノ基に結合することができるが、異なる反応条件（例えば、６～７若しくは７～８などのより低いｐＨ、又は異なる温度及び／若しくは１５℃未満の温度）の使用により、ＩＬ－１５部分の異なる位置へのＰＥＧ部分の結合がもたらされ得る。

【0129】

長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬は、実施例１に記載するように調製することができる。例えば、長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬は、一般に、インターロイキン－１５、例えば、組換えＩＬ－１５などの精製ＩＬ－１５を、活性化エステル、メトキシＰＥＧ－スクシンイミジルブタノエート、ｍＰＥＧ－ＳＢＡなどの活性化ＰＥＧ試薬と反応させることによって調製することができる。他の好適な活性化ＰＥＧ試薬としては、メトキシＰＥＧ－スクシンイミジルプロピオネート、メトキシＰＥＧ－スクシンイミジルペンタノエート、及びメトキシＰＥＧ－スクシンイミジルヘキサノエートが挙げられる。スクシンイミジル活性化基が典型的には使用されるが、任意の好適な活性エステル又は活性化基を使用することができ、そのような反応性基は、所望の安定なアミド結合の形成に好適である。一般に、インターロイキン－１５は、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの好適な緩衝液に溶解される。ＰＥＧ試薬は、当モル比（インターロイキン－１５のモル量に対して）で、又はモル過剰で（ＩＬ－１５のモル量に基づいて）、すなわち約１５倍までのモル過剰、例えば、２倍モル過剰、又は５倍モル過剰、又は７倍モル過剰、又は１０倍モル過剰、又はさらには１２倍モル過剰以上で、一般に好適な緩衝液中の溶液のＩＬ－１５に添加され得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ試薬は、約５～１０倍のモル過剰で添加される。ＰＥＧ試薬は、固体形態で、又は好適な溶媒中の、例えば希釈塩酸などの水性酸中の溶液として、添加され得る。

【0130】

本方法のいくつかのさらなる実施形態では、インターロイキン－１５は、当初、すなわちメトキシＰＥＧ－スクシンイミジルアルカノエート試薬と混合する前に、約０．５ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶液中に存在する。追加の例示的な濃度範囲としては、例えば、溶液中の約０．５～５ｍｇ／ｍＬ、約０．５～４ｍｇ／ｍＬ、約０．５～３ｍｇ／ｍＬ、約０．５～２ｍｇ／ｍＬ、約０．５～１．５ｍｇ／ｍＬ、約０．５～１ｍｇ／ｍＬ、約１～１０ｍｇ／ｍＬ、約１～５ｍｇ／ｍＬ、約１～４ｍｇ／ｍＬ、約１～３ｍｇ／ｍＬ、約１～２ｍｇ／ｍＬ、約１～１．５ｍｇ／ｍＬ、約１．５～１０ｍｇ／ｍＬ、１．５～５ｍｇ／ｍＬ、約１．５～４ｍｇ／ｍＬ、約１．５～３ｍｇ／ｍＬ、約１．５～２ｍｇ／ｍＬ、約２～１０ｍｇ／ｍＬ、約２～５ｍｇ／ｍＬ、約２～４ｍｇ／ｍＬ、約２～３ｍｇ／ｍＬ、約３～１０ｍｇ／ｍＬ、約３～５ｍｇ／ｍＬ、約３～４ｍｇ／ｍＬ、約４～１０ｍｇ／ｍＬ、約４～５ｍｇ／ｍＬ又は約５～１０ｍｇ／ｍＬのインターロイキン－１５が挙げられる。いくつかの特定の、しかし非限定的な実施形態では、溶液中のインターロイキン－１５の濃度は、約０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、又は１０ｍｇ／ｍＬである。

【0131】

任意の好適な緩衝液を使用し、又は反応混合物に添加し得ることを認識するであろう。いくつかの例示的な緩衝液としては、リン酸ナトリウム（ＮａＰｉ）、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）、ホウ酸、ビシン、クエン酸、及びＢｉｓ－ＴＲＩＳ緩衝液が挙げられる。

【0132】

いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５溶液のｐＨは、ＰＥＧ試薬の添加前に、ほぼｐＨ８に調整される。

【0133】

ＰＥＧ試薬の添加後、次いで反応混合物を必要であれば好適なｐＨ、例えば約７．０～８．５、又は約８．０に調整してもよい。いくつかの実施形態では、反応混合物は、ｐＨ約７．０～８．０又は約７．４～８．５に調整される。いくつかの特定の実施形態では、反応混合物は、ｐＨ約８．０に調整される。ｐＨは、所望のｐＨを達成するために必要に応じて、ＰＥＧ試薬の添加の前及び後の両方で調整され得ることを認識するであろう。

【0134】

インターロイキン－１５は、多くのタンパク質と同様、特により高いｐＨで、脱アミドに供されるが、より低いｐＨレベルは、例えば、イプシロン（ε）アミンにおけるより低いコンジュゲーション度、並びに／又は、増大した及び／若しくは望ましくない位置アイソフォーム、並びにタンパク質凝集などのいくつかの可能な欠点をもたらす場合がある。脱アミドはタンパク質中に負電荷を導入し、このことは、タンパク質の活性、構造、機能、安定性の変化に繋がり得、及び／又は分解に対するタンパク質の感受性を変化させ得る。従って、本作動薬及び関連方法により対処される困難の１つは、他の考慮事項の中でも、十分な活性度（すなわち、治療的に有用であるための）を維持しながら、少なくとも（ｉ）所望のコンジュゲーション度、（ｉｉ）対象ＰＥＧ試薬とのコンジュゲーションの前及び後の両方で、インターロイキン－１５部分の低い脱アミド量（これは、例えばインターロイキン－１５活性の低下に繋がり得る）、及び（ｉｉｉ）タンパク質凝集（例えば、コンジュゲーションの前及び後の両方で）をバランスする、長時間作用型インターロイキン－１５受容体作動薬を提供することであった。

【0135】

本明細書に記載される長時間作用型インターロイキン－１５受容体作動薬を調製するための反応パラメーターに関連した、競合及び相反する困難に基づいて、インターロイキン－１５溶液（ＰＥＧ試薬との反応の前又は後）及び／又はＩＬ－１５－ＰＥＧ試薬反応混合物のｐＨを調整することによって、最適な（より低いレベルの）脱アミドに到達し得るとともに、依然としてインターロイキン－１５部分に対するＰＥＧ部分のコンジュゲーション（例えば、εアミン及びＮ－末端での）を促進して本明細書に記載される長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬が提供されることが、本出願人らにより発見された。理論に束縛されるものではないが、多数の反応パラメーターを変化させた一連の反応に基づいて、約７．０～約８．５、又は約７．５～約８．２、又は約７．８～約８．２の範囲、又は約８．０のｐＨが、依然としてＰＥＧ部分のコンジュゲーションを促進して本明細書に記載される生成物を形成する一方で、生成物における脱アミドのより低いレベルを提供するのに有効であり、また所望の治療的プロファイルを維持するように思われる。

【0136】

例えば、本明細書に記載される方法は、約３５％未満脱アミドした、又はいくつかの実施形態では、約３０％未満脱アミドした、又は約２５％未満脱アミドした、又は約２０％未満脱アミドしたペグ化インターロイキン－１５を生成するのに有効である。いくつかの実施形態では、生成物の脱アミドのレベルは、約２０～３５％の範囲内、又は約２０～２５％の範囲内、又は約２５～３５％の範囲内、又は約２５～３０％の範囲内である。或いは、いくつかの実施形態では、上記に述べたものに満たない脱アミドの程度を有するペグ化インターロイキン－１５が想定される。実施例１の実験２に示すように、約７．０～８．５の範囲内のｐＨの調整により、２１．２９％（組成物１）又は３３．２６％（組成物２）の脱アミドのレベルが得られた。

【0137】

反応関与体は、一般に、約５～１０時間まで（両端を含む）混合される。いくつかの実施形態では、反応関与体は、約２～５時間まで（両端を含む）混合される。いくつかの実施形態では、反応関与体は、約２時間まで（約２時間を含む）混合される。いくつかの例示的な実施形態では、反応関与体は、約３０分間～約３．０時間、又は約３０分間～２．５時間、又は約３０分間～２時間、又は約３０分間～１．５時間、又は約４５分間～約３．０時間、又は約４５分間～約２．５時間、又は約４５分間～約２．０時間、又は約４５分間～約１．５時間、又は約４５分間～約１．０時間混合される。混合は、一般に、穏やかな条件下、例えば、約２０℃～約６５℃、又は約２０℃～約４０℃、又は周囲温度若しくは室温（例えば約２２℃）で行われる。より低いペグ化度を援助するためにより低い温度が使用される。反応は、例えば、グリシンなどのアミノ酸の添加によりクエンチされ得る。

【0138】

実施形態では、組成物のｐＨは、脱アミドを軽減するためにさらに調整され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、ｐＨ約６．５～７．５又は６．５～７．０に調整される。いくつかの実施形態では、組成物は、ｐＨ約６．５、６．８、７．０又は７．５に調整される。

【0139】

次いで、ペグ化ｒＩＬ－１５反応生成物は、一般に、任意の好適な方法、例えばイオン交換クロマトグラフィーにより精製されて、所望の生成物を得ることができる。例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いることができる。次いで、クロマトグラフィー生成物プールを濃縮し、例えばタンジェント流ろ過（ＴＦＦ）を用いて好適な製剤緩衝液（例えば、ショ糖を含む酢酸ナトリウム緩衝液）中に透析ろ過し得る。分析は、例えばＳＤＳ－ＰＡＧＥ、逆相ＨＰＬＣなどの任意の好適な方法、又は任意の他の好適な分析方法により行うことができる。

【0140】

以前に記載したように、ＩＬ－１５部分上のアミノ基は、ＩＬ－１５部分とポリエチレングリコール部分との間の結合の部位（ｓｉｅ）を提供して、式（Ｉ）により包含される長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬を提供する。例えば、本明細書に提供される例示的なＩＬ－１５アミノ酸配列を考慮すると、コンジュゲーションに利用可能であり得るε－アミノ酸を各々有する７つのリシン残基が存在することが明らかである。さらに、メチオニンのＮ末端アミンも、ＰＥＧ部分に対する結合地点としての役割を果たし得る。ポリエチレングリコール部分は、リシン又はＮ－末端アミン位置の任意の１つ以上において結合し得ることを認識するであろう。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール部分結合部位は、Ｌｙｓ^１０及びＬｙｓ^１１の１つ以上にある（一例として配列番号２に示される番号付けを使用、又は配列番号１を使用してＬｙｓ^１１及びＬｙｓ^１２）。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール部分は、Ｎ－末端アミンにおいて結合する。リシン部位のいずれも、ＰＥＧ部分の結合部位（例えば配列番号１のＬｙｓ^３７又はＬｙｓ^４２）として好適であり得ることを認識するであろう。いくつかの実施形態では、長時間作用型インターロイキン－１５受容体作動薬は、ポリエチレングリコール部分の共有結合が主にＮ－末端にある（すなわち、位置異性体の集合のうち、Ｎ－末端で結合するＰＥＧ部分を有する異性体が、他の位置異性体と比較した場合に最大量で存在する）位置異性体の混合物を含む。

【0141】

所望であれば、生成物プールは、さらに、好適なカラム（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ又はＶｙｄａｃなどの会社から市販されているＣ１８カラム又はＣ３カラム）を使用する逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）を用いた逆相クロマトグラフィーによって、又はイオン交換カラム、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）イオン交換カラムを使用するイオン交換クロマトグラフィーによって、位置異性体に分離されてもよい。同じ分子量を有する（すなわち、位置アイソフォーム）ＰＥＧ－インターロイキン－１５位置異性体を分離するために、いずれの手法も使用することができる。

【0142】

このタイプの分離を行うのに好適なゲルろ過カラムとしては、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から入手可能なＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）カラム及びＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）カラムが挙げられる。特定のカラムの選択は、望ましい所望の分画範囲に依存し得る。溶出は、概して、リン酸、酢酸などの好適な緩衝液を使用して行われる。収集された画分は、例えば、（ｉ）タンパク質含量についての２８０ｎｍの吸光度、（ｉｉ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準として使用する色素ベースのタンパク質分析、（ｉｉｉ）ＰＥＧ含量についてのヨウ素試験（Ｓｉｍｓら（１９８０年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１０７：６０－６３頁）、（ｉｖ）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）と、続くヨウ化バリウムによる染色、及び（ｖ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）など、様々な異なる方法により分析され得る。

【0143】

本発明の長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬は、特定の顕著な及び有利な特徴を有することが発見されている。下記に記載する特徴は、一般に、本明細書に提供され及び式（Ｉ）により包含される化合物に適用されると考えられるが、以下の１つ以上の特徴は、特に、式（Ｉｂ）による化合物、及びその延長の式（ＩＩｂ）による化合物により示され得る。長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬は、以下の特徴の１つ以上を有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬は、非修飾ＩＬ－１５と比較した場合、ＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約７倍以下の低下を示す。例えば、１つ以上の関連実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬は、ＩＬ－１５と比較した場合、ＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約６．５倍以下の低下、又はＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約６倍以下の低下、又はＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約５．５倍以下の低下、又はＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約５倍以下の低下、又はＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約４．５倍以下の低下、又はＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約４倍以下の低下、又はＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約３．５倍以下の低下、又はさらにはＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約３倍以下の低下を示す。前述の特徴に従った例示的な長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬は、本明細書及び付随する実施例に記載されている。

【0144】

実施例１０に記載されるように、実例的なコンジュゲート（１、３及び５）のインビトロ活性は、ｈｕＰＢＭＣにおけるＩＬ－１５シグナル伝達を誘導し、コンジュゲート１はそのようなシグナル伝達を強力に誘導する。ヒトＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びＣＤ４ Ｔ細胞に対するコンジュゲート１のインビトロ活性を調べるためにさらなる実験を行った（実施例１６、２２及び２６～２７）。図１０Ａ、１０Ｂに示すように、少なくともコンジュゲート１は、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ及びＣＤ５６ｌｏｗ細胞内で、ＩＬ－１５と比較して同様の又は増大したシグナル伝達を誘導した。コンジュゲート１は、ＣＤ８及びＣＤ５６ ｂｒｉｇｈｔ ＮＫ細胞との関与においてＩＬ－１５よりも強度が低かったが（実施例２２）、コンジュゲート１は従来のＩＬ－１５と同じ最大応答を達成したことに留意することが重要である（図３８Ａ、３８Ｂ参照）。実施例１６でマウスモデルに関して記載したように、２つの異なる用量でのコンジュゲート１の単回注射は、ＣＤ８及びＮＫ細胞において持続性のｐＳＴＡＴシグナル伝達を誘導した。実施例２６のマウスモデルに記載されるように、コンジュゲート１の単回注射は、ＩＬ－１５と比較して、％ｐＳＴＡＴ５における増大をもたらした。マウスモデルにおいて、ＮＫ細胞は単回投与のコンジュゲートに対して最も感受性であり、ＣＤ８ Ｔ細胞がそれに続き、ＣＤ４ Ｔ細胞は、試験した細胞に関して感受性が最低であった。

【0145】

コンジュゲート１はまた、非ヒト霊長類モデル（実施例２７のカニクイザルモデル）において、ＮＫ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞及びＣＤ４ Ｔ細胞内のシグナル伝達を誘導する。ハツカネズミモデルと同様、ＮＫ細胞は、コンジュゲート１による誘導に最も感受性であった。

【0146】

いくつかの追加の実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬は、ＩＬ－１５と比較した場合、受容体α結合（Ｋ_Ｄ、ｐＭ）における約５０％以下の低下を示す。すなわち、いくつかの関連実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬は、ＩＬ－１５と比較した場合、受容体α結合（Ｋ_Ｄ、ｐＭ）における約４５％以下の低下を示し、又は受容体α結合（Ｋ_Ｄ、ｐＭ）における約４０％以下の低下を示し、又は受容体α結合（Ｋ_Ｄ、ｐＭ）における約３５％以下の低下を示し、又はさらには受容体α結合（Ｋ_Ｄ、ｐＭ）における約３０％以下の低下を示す。

【0147】

好ましくは、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬は、非修飾ＩＬ－１５と比較した場合、ＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約７倍以下の低下を示し、及びＩＬ－１５と比較した場合、受容体α結合（Ｋ_Ｄ、ｐＭ）における約５０％以下の低下を示す（上述したＥＣ５０値又はＫ_Ｄ値における低下の任意の１つ以上の特定の組み合わせを含む）。

【0148】

場合により、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬は、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物に含まれる。例示的な賦形剤としては、限定なしに、炭水化物、無機塩類、抗菌剤、抗酸化剤、界面活性剤、緩衝剤、酸、塩基、アミノ酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものが挙げられる。

【0149】

糖、誘導体化された糖、例えば、アルジトール、アルドン酸、エステル化された糖、及び／又は糖ポリマーなどの炭水化物が、賦形剤として存在し得る。具体的な炭水化物賦形剤としては、例えば：フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ－マンノース、ソルボースなどの単糖類；ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなどの二糖類；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなどの多糖類；及びマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトール、シクロデキストリンなどのアルジトールが挙げられる。

【0150】

賦形剤としてはまた、クエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせなどの無機塩又は緩衝剤も挙げることができる。

【0151】

組成物はまた、微生物の繁殖を防止又は抑止するための抗菌剤も含むことができる。本発明の１つ又は複数の実施形態に好適な抗菌剤の非限定的な例としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメルソール（ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、及びそれらの組み合わせが挙げられる。

【0152】

抗酸化剤も同様に組成物中に存在し得る。抗酸化剤を使用すると酸化が防止され、それによりコンジュゲート又は調製物の他の構成成分の劣化が防止される。本発明の１つ又は複数の実施形態での使用に好適な抗酸化剤としては、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、亜硫酸水素ナトリウム、スルホキシル酸ナトリウムホルムアルデヒド、メタ重亜硫酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせが挙げられる。

【0153】

賦形剤として界面活性剤が存在してもよい。例示的な界面活性剤としては、「Ｔｗｅｅｎ ２０」及び「Ｔｗｅｅｎ ８０」などのポリソルベート、並びにＦ６８及びＦ８８（双方とも、ＢＡＳＦ、Ｍｏｕｎｔ Ｏｌｉｖｅ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙから入手可能）などのプルロニック；ソルビタンエステル；レシチン及び他のホスファチジルコリンなどのリン脂質、ホスファチジルエタノールアミン（但し、リポソーム形態ではないことが好ましい）、脂肪酸、並びに脂肪酸エステルなどの脂質；コレステロールなどのステロイド；並びにＥＤＴＡ、亜鉛及び他のかかる好適な陽イオンなどのＩＬ－１５キレート剤が挙げられる。

【0154】

酸又は塩基が組成物中に賦形剤として存在してもよい。使用することのできる酸の非限定的な例としては、塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される酸が挙げられる。好適な塩基の例としては、限定なしに、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フマル酸カリウム、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される塩基が挙げられる。

【0155】

１つ又は複数のアミノ酸は、本明細書に記載される組成物中に賦形剤として存在することができる。この関連における例示的なアミノ酸としては、アルギニン、リジン及びグリシンが挙げられる。好適な薬学的に許容可能な追加の賦形剤は、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、７^ｔｈ ｅｄ．、Ｒｏｗｅ、Ｒ．Ｃ．、Ｅｄ．、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ、２０１２に記載されているものを含む。

【0156】

組成物中に含まれる長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬の量は、様々な要因によって異なり得るが、最適には、組成物が単位用量容器（例えば、バイアル）に保存されるとき、治療上有効な用量であり得る。加えて、医薬調製物はシリンジに収容されてもよい。治療上有効な用量は、本明細書中の臨床的に望ましいエンドポイントを生じさせる量を判断するために、長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬の量を漸増させながら反復投与することにより実験的に決定することができる。組成物中の任意の個別の賦形剤の量は、賦形剤の活性及び組成物の特定の必要性によって異なり得る。典型的には、任意の個別の賦形剤についての最適量の決定は、ルーチンの実験を通じて、すなわち、様々な量の賦形剤（低量から高量までの範囲にわたる）を含む組成物を調製して安定性及び他のパラメーターを調べ、次にどの時点で有意な副作用なしに最適な効果が得られるかを決定することにより行われる。

【0157】

長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬は、インターロイキン－１５を用いた処置に応答する状態を患う患者への投与に好適である。本方法は、一般に、治療的有効量の長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬（好ましくは、医薬組成物の一部として提供される）を患者に非経口的に投与することを含む。前述したように、長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬は、非経口的に（例えば、筋肉内、皮下、静脈内、又は腹腔内）投与され得る。非経口投与に好適な製剤タイプは、中でも、注射準備完了注射溶液、使用前に溶媒と組み合わされる乾燥粉末、注射準備完了の縣濁液、使用前にビヒクルと組み合わされる乾燥不溶性組成物、並びに投与前に希釈される乳剤及び液体濃縮物を含む。いくつかの特定の実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬は、静脈内投与に好適な製剤で提供され、静脈内に投与される。いくつかの別の実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬は、皮下投与に好適な製剤で提供され、皮下に投与される。

【0158】

長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬（例えば、医薬組成物の一部として提供される）の投与方法は、場合により、特定の範囲に局在化させるように行われ得る。例えば、作動薬を含む液体、ゲル及び固体製剤はまた、疾患範囲内（例えば腫瘍内、腫瘍付近、炎症範囲内、及び炎症範囲付近など）に外科的に移植され得る。器官及び組織は、所望の位置がコンジュゲートにより良好に暴露されることを確実にするように、画像化できることも都合がよい。

【0159】

投与の方法は、長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬の投与により治療又は予防され得る任意の状態、例えば癌などの処置に用いられ得る。例えば、長時間作用型作動薬は、ＩＬ－１５療法に応答し得る状態、例えば、癌などを患う患者を処置するために、単独で又は他の薬物療法と組み合わせて使用され得る。

【0160】

癌を有する対象の処置に関連して本明細書で使用されるとき、用語「処置」、「処置する」、及び「処置している」は、癌の１つ以上の症状を軽減、遅延、停止、若しくは逆行させ、又は癌が実際には除去されていない場合であっても、癌の進行を遅延させるための、対象が患っている癌の介入の全領域、例えば組み合わせの投与を含むことが意図される。処置としては、例えば、症状の重症度、症状の数、又は再発の頻度の低下、例えば腫瘍成長の阻害、腫瘍成長の抑止、又は既存の腫瘍の退行を挙げることができる。

【0161】

例えば、癌又は癌関連疾患の改善は、完全又は部分的な応答として特徴付けることができる。「完全応答」は、任意の以前の異常なＸ線検査試験、骨髄、及び脳脊髄液（ＣＳＦ）又は異常なモノクローナルタンパク質測定値の正常化を伴う、臨床的に検出可能な疾患の非存在を指す。「部分的応答」は、新たな病変の非存在下での（で＿）、全ての測定可能な腫瘍負荷（すなわち、対象内に存在する悪性細胞の数、又は測定された腫瘍塊の容積、又は異常なモノクローナルタンパク質の量）における少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の低下を指す。用語「処置」は、完全及び部分的応答の両方を想定している。

【0162】

用語「癌」及び「癌性」は、典型的には無秩序な細胞成長により特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指す又は記載する。

【0163】

本明細書で使用される「腫瘍」及び「固形腫瘍」は、悪性又は良性のいずれかの全ての病変及び腫瘍性細胞成長及び増殖、並びに全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を指す。

【0164】

例示的な状態は、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉種（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、扁平細胞癌、基底細胞癌、頭頸部癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、睾丸癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、グリア細胞腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴覚神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫（例えば、ぶどう膜黒色腫、粘膜黒色腫、及び軟膜黒色腫を含む）、神経芽腫、網膜芽細胞腫、及び白血病などの癌である。

【0165】

特定の一方法では、長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬は、白血病又はリンパ腫などの血液系悪性腫瘍を処置するために使用される。さらなる別の方法では、長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬は、固形癌を処置するために使用される。

【0166】

いくつかの実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬又は組成物は、治療的有効用量で対象に投与されて、ＮＫ活性化及び／又は増殖を刺激する場合に有効である。

【0167】

実施例１１に記載される例示的なマウスモデルにおいて、コンジュゲート１は、細胞数の増加（細胞／μ、図１２Ｂ、１２Ｃに示すように）及び％Ｋｉ６７の増大（例えば図１１Ａ）により示されるように、ＮＫ細胞の増殖及び数の持続性の増大を誘導するのに有効であった。％Ｋｉ６７は、増殖する細胞に関するマーカーとして使用される。図１２Ａ～１２Ｄから明らかなように、細胞数の増大は、全成熟レベルのＮＫ細胞（終末エフェクター細胞、プレＮＫ細胞、高エフェクター細胞及び早期ＮＫ細胞）から明らかであった。実施例１７に示すように、ＮＫ細胞数の増大は、全用量レベルで少なくとも９６時間持続し、中及び高用量レベルは少なくとも１４４時間持続した。マウスモデルにおけるコンジュゲート１の投与は、ビヒクルと比較して、全用量レベルで％Ｋｉ６７の増大を誘導し、これは少なくとも１２０時間持続した。％Ｋｉ６７少なくとも中用量範囲（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ及び０．３ｍｇ／ｋｇ）は、％Ｋｉ６７の増大を誘導し、これは少なくとも１４４時間持続した。

【0168】

コンジュゲート１の効果は、単回投与で誘導され、持続性であり得る。実施例１１に記載される例示的なハツカネズミモデルにおいて、細胞数の増加は、単回用量のコンジュゲート１の投与により誘導され、持続性である。単回投与は、ハツカネズミＣＤ４９ｂ細胞において、同じレベルの反復（例えばＱ７ｄｘ３）投与と同等の持続性の％Ｋｉ６７レベルを誘導した（図２８Ａ参照）。

【0169】

いくつかのさらなる実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬又は組成物は、治療的有効用量で投与された場合、ＮＫ細胞による細胞毒性プロテアーゼ発現の増大により証明されるように、ＮＫ細胞活性化を増大させるのに有効である。実施例２８に記載される例示的な非ヒト霊長類モデルにおいて、ＮＫ細胞溶解性酵素グランザイムＢ及びパーフォリンの発現は、コンジュゲート１の単回投与によって誘導及び増強された。図４８Ａ～４８Ｃから明らかなように、全用量レベルは、投与前レベルと比較して、グランザイムＢ発現を増大させ、中／より高い用量は発現（ＭＦＩ）を少なくとも３倍にした。図４９Ａ～４９Ｃから明らかなように、全用量レベルは投与前レベルと比較して、パーフォリン発現を増大させ、中／より高い用量は発現（ＭＦＩ）を２倍にした。従って、コンジュゲート１は、ＮＫ細胞の細胞毒性を増大させるのに有効である。

【0170】

いくつかのなおさらなる実施形態では、長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬又は組成物は、治療的有効用量で対象に投与されて、ＣＤ８ Ｔ細胞生存及び記憶形成を支持する場合に有効である。

【0171】

例示的なマウスモデルにおいて、全用量レベルでのコンジュゲート１の単回投与は、ＣＤ８細胞（図３０Ｄ）並びに記憶及びエフェクター記憶ＣＤ８亜集団（図３０Ｅ～３０Ｆ）における％Ｋｉ－６７陽性の増大により示されるように、細胞増殖を増大させる。実施例１７に示すように、ハツカネズミモデルにおけるコンジュゲート１の投与は、血液中の総ＣＤ８ Ｔ細胞の有意な増加を誘導した（図３０Ａ参照）。最低用量は、ＣＤ８ Ｔｃｍ及びＣＤ８ Ｔｅｍを増大させた（図３０Ｂ～３０Ｃ参照）。例示的なハツカネズミモデルにおいて、コンジュゲート１の単回ｉｖ注射は、ビヒクルの投与と比較して、少なくとも２４０時間、細胞数の増大を維持した（例えば図３０Ａ参照）。注目すべきことに、ＣＤ８及びＣＤ８記憶Ｔ細胞数は、コンジュゲート１がいくつかの用量レベルで投与された際、注射後の２４０時間においてベースラインに戻らなかった。従って、コンジュゲート１は、ＣＤ８＋記憶Ｔ細胞の集団を、延長した期間、維持する。全用量レベルでのコンジュゲート１の単回投与はまた、全ＣＤ８及びＣＤ８亜集団においてＫｉ－６７陽性を増大させ、これらの細胞の増大した増殖を示した。コンジュゲート１を用いた反復投与は、さらにＣＤ８、ＣＤ８ Ｔｃｍ、及びＣＤ８ Ｔｅｍ集団の増大をもたらした（図３１Ａ～３１Ｃ参照）。反復投与も、マウスにおいてＣＤ８、ＣＤ８ Ｔｃｍ、及びＣＤ８ Ｔｅｍ集団の各々に関して少なくとも２４０時間の細胞増殖の長期増大をもたらした。

【0172】

コンジュゲート１はまた、ビヒクルの投与と比較して、非ヒト霊長類モデル（実施例２７のカニクイザルモデル）におけるＮＫ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞の増殖及び細胞数の持続性の増大を誘導した。各用量レベルのコンジュゲート１は、少なくとも１４日間、ＮＫ細胞数を誘導し及び持続的に増大させた（図４４Ａ参照）。コンジュゲート１は、各用量レベルで、少なくとも１０日間、ＣＤ８ Ｔ細胞数を誘導し及び持続的に増大させた。

【0173】

１つ以上のなおさらなる実施形態では、ＩＬ－１５ Ｒ作動薬は、静脈内投与される。なおさらなる実施形態では、ＩＬ－１５ Ｒ作動薬は、皮下投与される。

【0174】

いくつかのなおさらなる実施形態では、投与後、ＩＬ－１５ Ｒ作動薬は、リンパ球における持続性のシグナル伝達を誘導して、ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖、及び／又はＣＤ８中央記憶集団の優先的な拡大をもたらすのに有効である。

【0175】

実際の投与用量は、対象の年齢、体重、及び全身状態並びに治療下の病態の重症度、医療専門家の判断、及び投与されるコンジュゲートに応じて異なり得る。治療有効量は当業者に公知であり、及び／又は関連する参考書及び文献に記載されている。概して、治療有効量は、約０．００１ｍｇ～１００ｍｇ、好ましくは０．０１ｍｇ／日～７５ｍｇ／日の用量、及びより好ましくは０．１０ｍｇ／日～５０ｍｇ／日の用量の範囲であり得る。所与の用量が、例えば臨床医が適切なエンドポイント（例えば、治癒、退縮、部分退縮など）に達したことを決定するまで、定期的に投与されてもよい。

【0176】

いくつかの実施形態では、治療的有効用量は、約０．２５～２５ｍｃｇ／ｋｇの範囲である。別の実施形態では、治療的有効用量は、１日当たり約０．２５ｍｃｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ、又は１日当たり約０．０３ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇの範囲である。別の実施形態では、治療的有効用量は、約１～１０ｍｃｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇの範囲である。いくつかの特定の、しかし非限定的な実施形態では、治療的有効用量は、約０．２５ｍｃｇ／ｋｇ、０．３ｍｃｇ／ｋｇ、０．５ｍｃｇ／ｋｇ、１ｍｃｇ／ｋｇ、２ｍｃｇ／ｋｇ、３ｍｃｇ／ｋｇ、５ｍｃｇ／ｋｇ、６ｍｃｇ／ｋｇ、７ｍｃｇ／ｋｇ、１０ｍｃｇ／ｋｇ，１５ｍｃｇ／ｋｇ、２０ｍｃｇ／ｋｇ、２５ｍｃｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、又は０．１ｍｇ／ｋｇである。本明細書の実施例に言及した用量を参照すれば、当業者は、当技術分野で既知の換算を用いて、動物用量（例えばマウス）を対応するヒトでの用量に変換することができる（例えばＮａｉｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎ．Ｐａｒｍａｃｙ（２０１６）７：２７～３１）。

【0177】

単位投薬量の任意の所与のコンジュゲート（ここでも、好ましくは医薬調製物の一部として提供されるもの）は、臨床医の判断、患者の必要性などに応じて様々な投薬スケジュールで投与することができる。具体的な投薬スケジュールは、当業者には周知であるか、又はルーチンの方法を用いて実験的に決定することができる。例示的な投薬スケジュールとしては、限定なしに、１日１回、週３回、週２回、週１回、月２回（例えばｑ／１４日）、月１回（例えばｑ／３０又は３１日或いはｑ／２１日）、及びそれらの任意の組み合わせの投与が挙げられる。所望される臨床的なエンドポイントが達成されると、組成物の投薬は中止又は低減される。いくつかの実施形態では、単位用量の任意の所定のコンジュゲートは、持続性の効果を達成するために、１回投与され得る。

【0178】

本発明は、その好ましい具体的な実施形態に関連して説明されているが、前述の説明並びに以下の実施例は例示を目的としており、本発明の範囲を限定する意図はないことが理解されるべきである。本開示の範囲内における他の態様、利点及び変更は、本発明の係る当該技術分野の当業者には明らかであろう。

【0179】

本明細書で参照される論文、著作、特許及び他の刊行物は全て、全体として参照により本明細書に援用される。本明細書の教示と、参照により組み込まれる技術との間に矛盾がある場合、この明細書における教示及び定義の意味が優先するものとする（特に、本明細書に添付の特許請求の範囲に使用されている用語に関して）。例えば、本願及び参照により組み込まれる刊行物が、同じ用語を異なるように定義する場合、用語の定義は、定義が位置する文書の教示の範囲内で保たれるものとする。

【実施例】

【0180】

前述の記載及び続く実施例は、本明細書に提供される発明を説明するものであり、限定を意図するものではないことを理解するべきである。他の態様、利点及び修正は、本開示が関係する当業者に明らかである。

【0181】

以下の実施例では、使用される数（例えば、量、温度等）に関する正確性を確保するように努めたが、いくらかの実験誤差及び偏差は考慮しなければならない。特に指示がない限り、温度は摂氏温度であり、圧力は海上気圧又はその近傍におけるものである。以下の例の各々は、当業者が本明細書に記載される実施形態の１つ又は複数を実行するための教示と見なされる。

【0182】

材料及び方法
従来の技術を用いて調製した組換えＩＬ－１５（「ｒＩＬ－１５」）配列番号１（図１に提供される）を以下の実施例に使用したが、任意の好適なＩＬ－１５部分を同様に使用することができる。配列番号１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の組換えヒトＩＬ－１５は、１１５アミノ酸を含む単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖であり、１２．９ｋＤａの分子量を有する。

【0183】

反応性ポリマー試薬、直鎖ｍＰＥＧ－スクシンイミジルブタノエート、４０ｋＤａ（「ｍＰＥＧ－ＳＢＡ」）は、以下の構造を有する。

【化20】

式中、ｎは、約４０キロダルトンの重量平均分子量を有するポリマーを提供する単量体サブユニットの数に対応し、すなわち、ｎは約９０９である。使用に好適な追加のｍＰＥＧ－スクシンイミジルブタノエート試薬は、例えば、約１０ｋＤ、１５ｋＤ、２０ｋＤ、２５ｋＤ、３０ｋＤ、４０ｋＤ、５０ｋＤ又は６０ｋＤの重量平均分子量を有するものを含む。この活性化ポリマー試薬は、ＩＬ－１５のアミノ基（例えば、リシン又はＮ－末端）と反応した場合、ＩＬ－１５部分とポリエチレングリコール部分との間に安定なアミド結合を形成するのに有効である。

【0184】

反応性フルオレニル－ＰＥＧ試薬、ＰＥＧ２－ＣＡＣ－ＦＭＯＣ－２０ｋＤ－ＮＨＳは、以下の構造を有する：

【化21】

式中、ｍＰＥＧは、メトキシ（ポリエチレングリコール）であり、ポリマー試薬の重量平均分子量は、約２０キロダルトンである（すなわち、約１０キロダルトンの重量平均分子量を有する各ｍＰＥＧ部分を有する）。異なる分子量を有する追加のＰＥＧ２－ＣＡＣ－ＦＭＯＣ試薬は、それに従って例えば、ＰＥＧ２－ＣＡＣ－ＦＭＯＣ－１０ｋＤ－ＮＨＳ、ＰＥＧ２－ＣＡＣ－ＦＭＯＣ－１５ｋＤ－ＮＨＳ、ＰＥＧ２－ＣＡＣ－ＦＭＯＣ－３０ｋＤ－ＮＨＳ、ＰＥＧ２－ＣＡＣ－ＦＭＯＣ－４０ｋＤ－ＮＨＳと命名され、それらの試薬は、上記に示した構造を有し、ＦＭＯＣコアに結合する「ｍＰＥＧ」部分の分子量のみが異なる。

【0185】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
試料はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎゲル電気泳動システム（ＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ Ｍｉｎｉ－Ｃｅｌｌ）を使用してドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって分析した。試料を試料緩衝液と混合した。次に、調製した試料をＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘプレキャストゲルにロードし、約３０分間泳動した。

【0186】

ＲＰ－ＨＰＬＣ分析
逆相クロマトグラフィー（ＲＰ ＨＰＬＣ）分析をＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）上で行った。サンプルをＰｏｒｏｓｈｅｌｌ ３００ＳＢ－Ｃ３カラム（２．１ｘ７５ｍＭ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して６０℃で分析した。使用した移動相は０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ（Ａ）及び０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ（Ｂ）であった。カラムの流速は０．５ｍｌ／分であった。溶出したタンパク質及びＰＥＧ－タンパク質コンジュゲートは、２８０ｎｍのＵＶを使用して検出した。

【0187】

バイオアッセイ
ＣＴＬＬ－２細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化に基づく効力アッセイ（マウスＴ細胞）
受容体結合後のホスホ－ＳＴＡＴ５アッセイにおいて、次いで下流細胞シグナル伝達は、リン酸化を介して転写５（ＳＴＡＴ５）のシグナルトランスデューサー及び活性化因子を活性化して遺伝子発現を促進し、細胞増殖を誘導することができる。ホスホ－ＳＴＡＴ５の活性化は、ＣＴＬＬ－２細胞、ハツカネズミＴリンパ球細胞株内で、ホスホＳＴＡＴ５／総ＳＴＡＴ５多重アッセイ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、ＭＤ）を用いて、サンプル及び参照処置に対する約１０分間の応答により測定する。

【0188】

アッセイの前日に、ＣＴＬＬ－２細胞を新鮮な成長培地［１０％ＦＢＳ、１０％Ｔ細胞培養添加物（カタログ番号３５４１１５、Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン酸塩、及び１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補足したＲＰＭＩ １６４０］に分けた。アッセイ当日、細胞をアッセイ培地（１％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン酸塩、及び１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補足したＲＰＭＩ １６４０）で少なくとも４時間プレインキュベートし、次に９６ウェルプレート中のアッセイ培地に５０，０００細胞／ウェルでプレーティングした。アッセイ直前に適切な緩衝液中に被験物質の希釈物を調製した。ＣＴＬＬ－２細胞が入ったトリプリケートウェルに２５倍被験物質溶液を移すことにより、ＣＴＬＬ－２細胞の刺激を開始した。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で１０分間インキュベートし、細胞溶解によって反応は停止した。ＭＳＤ Ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｔｙｒ６９４）／Ｔｏｔａｌ ＳＴＡＴａ，ｂ全細胞ライセートキット（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ＭＤ）を使用して細胞溶解物中のホスホ－ＳＴＡＴ５及び総ＳＴＡＴ５タンパク質レベルの検出を実施した。１０分間の処理後、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈから入手した組換えヒトＩＬ－１５は、０．２７ｎｇ／ｍＬの平均ＥＣ_５０でＣＴＬＬ－２細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化を誘導することによりＩＬ－１５活性を実証し、これを対照として供した。

【0189】

ＨｕＰＢＭＣ－ｐＳｔａｔ５アッセイ
様々なヒトリンパ球亜集団に対するＩＬ－１５又は長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬の効力を、ホスホ－ＳＴＡＴ５（Ｙ６９４）用量応答アッセイにより決定した。複数のドナーからの凍結ヒトＰＢＭＣを、ＡｌｌＣｅｌｌｓにより供給した。１ｘ１０^６細胞／１００ｕｌを完全ＲＰＭＩ培地中で２時間培養した後、示される濃度（１０，０００ｎｇ／ｍｌ～０．００１ｎｇ／ｍｌ段階希釈）のＩＬ－１５又はコンジュゲートと共に３７℃で２０分間インキュベートした。次いで、細胞を固定し（ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘを使用して）、透過化し（１００％予備冷却メタノールを使用して）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４－Ｔｒｅｇｓ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）、ＣＤ５６及びリン酸化ＳＴＡＴ５（Ｙ６９４）に対する抗体で染色した後、フローサイトメトリーで分析した。濃度－応答関係を使用してＥＣ_５０値を計算した。

【0190】

ＩＬ－１５Ｒαに対する長時間作用型ｒＩＬ－１５受容体作動薬の受容体親和性
表面プラズモン共鳴（「ＳＰＲ」）を用いて、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲシステムを用いて、ＩＬ－１５及び例示的な長時間作用型ｒＩＬ－１５受容体作動薬の親和性を測定した。簡潔に言えば、１：１のＮＨＳ：ＥＤＣ混合物を使用して活性ＮＨＳエステルを生じさせることにより、Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ５センサーチップの表面を活性化した。ヤギ抗ヒトＦｃ抗体を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）中において５分間注入することにより、それを表面に共有結合させた。約８０００ＲＵの抗体が表面に結合した。次に残りのＮＨＳエステルをエタノールアミンでクエンチした。

【0191】

各注入サイクルの開始時に、ＰＢＳＰ中における５分間の注入ステップによってセンサーチップチャネル上にＩＬ－１５－Ｒα－Ｆｃを捕捉した。典型的には、１５０～２００ＲＵの受容体が表面に結合した。

【0192】

長時間作用型ｒＩＬ－１５受容体作動薬試験物品を、ＰＢＳ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０及び０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有する）中で１０μＭに希釈した。一連の３倍希釈物を作製し、ＩＬ－１５Ｒαで被覆されたセンサーチップ上に注入した。ｋ_ａ及びｋ_ｄ率を別々に測定することにより親和性を測定し、ｋ_ｄとｋ_ａの比を用いてｋ_ｄ値を計算した。

【0193】

実施例１
長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬の調製

【化22】

実験１：２．７ｍｌ溶液のＩＬ－１５（ＰＢＳ緩衝液中１．２３ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）を小型反応バイアルに移動した。３００μｌのｐＨ８の０．６Ｍホウ酸緩衝液を添加してｐＨをｐＨ８に調整した。窒素下にて－２０℃で保管したｍＰＥＧ ＳＢＡ、４０ｋＤａを周囲温度に温めた。１０倍過剰（ＩＬ－１５のモル量に対して）のｍＰＥＧ ＳＢＡ－４０Ｋを２ｍＭ ＨＣｌに溶解して１０％ ＰＥＧ試薬溶液を形成した。１０％ ＰＥＧ試薬溶液をＩＬ－１５溶液に急速に加え、よく混合した。ｍＰＥＧ ＳＢＡ－４０Ｋを加えた後、反応混合物のｐＨを測定し、従来の技術を用いてｐＨ８に調整した。ｍＰＥＧ ＳＢＡ－４０ＫをＩＬ－１５にカップリングさせるために（すなわち、安定なアミド結合の形成を介して）、反応溶液をＳｌｏｗ Ｓｐｅｅｄ Ｌａｂ Ｒｏｔａｔｏｒ上に１．５時間配置して、室温でコンジュゲーションを促進した。反応をグリシン溶液の添加によりクエンチした。

【0194】

図２は、コンジュゲーション反応混合物のＲＰ－ＨＰＬＣ分析後のクロマトグラムを示す。反応は、４０％モノ－コンジュゲート（すなわち、ＩＬ－１５に結合した単一ＰＥＧ部分を有する）、２４％ジ－コンジュゲート（ＩＬ－１５に結合した２つのＰＥＧを有する）及び６％トリコンジュゲート（ＩＬ－１５に結合した３つのＰＥＧを有する）種を提供した。反応条件は最適化されていなかったが、約３０％の未反応ＩＬ－１５が反応混合物中に残留した。

【0195】

所望のモノ－コンジュゲートを、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高性能カラム及び溶離相としてのリン酸ナトリウム緩衝液を使用する陰イオン交換クロマトグラフィーにより分離／単離した。精製モノ－ｍＰＥＧ－ＳＢＡ４０Ｋ－ＩＬ－１５コンジュゲート（本明細書でモノ－ｍＰＥＧ－ブタンアミド－４０Ｋ－ＩＬ－１５又はモノ（メトキシＰＥＧ－Ｎ－ブタンアミドとも称される）_４０ｋＤインターロイキン－１５、又はモノ－ｍＰＥＧ_４０Ｋ－Ｃ４－アミド－ＩＬ－１５）を、ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥにより特徴付けた。他の実施例において、精製モノ－ｍＰＥＧ－ＳＢＡ４０Ｋ－ＩＬ－１５はコンジュゲート１と称される。

【0196】

図３は、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムからのＦＰＬＣ精製プロファイルを提供する。図４は、精製モノ－ｍＰＥＧ－ＳＢＡ－４０Ｋ－ＩＬ－１５コンジュゲートのＳＤＳゲルを示す。ゲルによって示されるように、精製コンジュゲートは高レベルの純度を有し、未反応ＩＬ－１５を含まない。図５は、精製モノ－ｍＰＥＧ－ＳＢＡ－４０Ｋ－ＩＬ－１５のＲＰ－ＨＰＬＣ分析を示す。ＨＰＬＣ結果から明らかであり得るように、精製モノ－ｍＰＥＧ－ＳＢＡ－４０Ｋ－ＩＬ－１５組成物は、約１０％（モル量）未満のジ－又はより高級レベルのコンジュゲートを含む。

【0197】

これと同じ手法を用いて、異なる重量平均分子量を有するｍＰＥＧ ＳＢＡを使用して、モノ－ｍＰＥＧ－ＳＢＡ－１０Ｋ－ＩＬ－１５、モノ－ｍＰＥＧ－ＳＢＡ－１５Ｋ－ＩＬ－１５、モノ－ｍＰＥＧ－ＳＢＡ－２０Ｋ－ＩＬ－１５、モノ－ｍＰＥＧ－ＳＢＡ－２５Ｋ－ＩＬ－１５、モノ－ｍＰＥＧ－ＳＢＡ－３０Ｋ－ＩＬ－１５；モノ－ｍＰＥＧ－ＳＢＡ－４０Ｋ－ＩＬ－１５；モノ－ｍＰＥＧ－ＳＢＡ－５０Ｋ－ＩＬ－１５；及びモノ－ｍＰＥＧ－ＳＢＡ－６０Ｋ－ＩＬ－１５などのコンジュゲートを調製する。

【0198】

実験２：緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０％ショ糖、ｐＨ７．４）中の約２ｍｇ／ｍｌ溶液のＩＬ－１５を、２つの異なる反応容器の各々に移した（本明細書で組成物１及び組成物２と称される）。ｐＨを８．０に調整するために、ｐＨ８のホウ酸緩衝液（０．４Ｍ又は０．６Ｍ）を加えた。２ｍＭ ＨＣｌ中で希釈した１０倍過剰（ＩＬ－１５のモル量に対して）のｍＰＥＧ ＳＢＡ－４０Ｋ（ｍＰＥＧ ＳＢＡ、４０ｋＤａ）をＩＬ－１５溶液の各々に加え、よく混合した。ｍＰＥＧ ＳＢＡ－４０Ｋの添加後、反応混合物のｐＨはｐＨ８と決定され、又は必要であれば追加のホウ酸緩衝液を使用することにより調整した。反応物中のＩＬ－１５の最終濃度は１ｇ／Ｌを目標とし、必要であれば追加の希釈剤（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０％ショ糖を含む緩衝液、ｐＨ７．４を組成物１に使用し、水を組成物２に使用した）を使用した。ｍＰＥＧ ＳＢＡ－４０ＫをＩＬ－１５にカップリングさせるために（すなわち、優性に安定なアミド結合の形成を介して）、反応溶液を組成物１又は組成物２に関して各々室温で４５又は６０分間混合してコンジュゲーションを促進した。７１倍過剰のグリシン（反応物に最初に添加したＰＥＧのモル量に対して）をｐＨ８．０で３０分間加えることにより反応をクエンチした。組成物１の場合、０．２Ｍリン酸を使用してｐＨ７．０に滴定することによりｐＨを調整した。

【0199】

得られた組成物を、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及びイオン交換ＨＰＬＣ（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）により特徴付けた。ＲＰ－ＨＰＬＣ分析の結果を、下記の表１Ａに提供する。

【0200】

【表1】

【0201】

ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析の結果を、下記の表１Ｂに提供する。

【0202】

【表2】

【0203】

ＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析の結果を、下記の表１Ｂに提供する。

【0204】

【表3】

【0205】

調製した組成物は、ｍＰＥＧ ＳＢＡ－４０Ｋモノペグ化種を優勢に含み、１０％未満のＰＥＧ二量体（すなわち、２つのＰＥＧ部分がＩＬ－１５に結合している）、及びさらに少量のより高級のＰＥＧ種（すなわち、３以上のＰＥＧ部分がＩＬ－１５に結合している）を含んでいた。

【0206】

さらに、組成物は、比較的低い脱アミド度を有した（表１Ｃの「酸性領域」として特定）。組成物１は２１．２９％脱アミドし、組成物２は３３．２６％脱アミドした。

【0207】

実施例２
長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬の調製。

【化23】

窒素下にて－８０℃で保管したｍＰＥＧ２－ＣＡＣ－ｆｍｏｃ－２０Ｋ－ＮＨＳを、窒素パージ下で周囲温度に温めた。ｍＰＥＧ２－ＣＡＣ－ｆｍｏｃ－２０Ｋ－ＮＨＳのストック溶液（２００ｍｇ／ｍＬ）を２ｍＭ ＨＣｌ中で調製し、ｍＰＥＧ２－ＣＡＣ－ｆｍｏｃ－２０Ｋ－ＮＨＳとｒＩＬ－１５のモル比が５：１～１００：１の範囲であるように、ｍＰＥＧ２－ＣＡＣ－ｆｍｏｃ－２０Ｋ－ＮＨＳをｒＩＬ－１５に加えた。混合物中のｒＩＬ－１５の最終濃度は、０．５ｍｇ／ｍＬ（０．０３１ｍＭ）であった。重炭酸ナトリウム緩衝液（１Ｍ、ｐＨ８．０）を混合物に加えて最終濃度１００ｍＭに到達させ、コンジュゲーションを３０分間進行させて［ｍＰＥＧ２－ＣＡＣ－ｆｍｏｃ－２０Ｋ－ＮＨＳ］－［ｒＩＬ－１５］コンジュゲートを提供した（コンジュゲートの非公式名は、コンジュゲートの調製に使用されたポリマー試薬を反映し、得られた生成物に関して、ポリマー試薬の反応性部分は、この場合、ＩＬ－１５に対する結合に置き換わっていることが理解される）。３０分後、１Ｍグリシン（ｐＨ６．０）を反応混合物に加えることによりクエンチングを達成して、最終濃度１００ｍＭに達した。次いで、クエンチした反応混合物のｐＨを、カラムクロマトグラフィー精製及び特徴付けに先立って、氷酢酸を使用して４．０に調整した。

【0208】

反応混合物をＲＰ－ＨＰＬＣ分析により分析した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、反応混合物は約１０～２０％モノ－コンジュゲート、約５０～７０％ジ－コンジュゲート、及び約２０～３０％トリ－コンジュゲートを含んでいた。すなわち、反応混合物は主として２コンジュゲート化種を含んでいた。コンジュゲート混合物をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高性能カラム及び溶離相としてのリン酸ナトリウム緩衝液を使用した陰イオン交換クロマトグラフィーにより分離／単離して、約２の平均ペグ化度を有する（約１．７～２．５の範囲のペグ化度を有する）、従って精製組成物に関する上記の構造のｎ’が約２である、精製［ｍＰＥＧ２－ＣＡＣ－ＦＭＯＣ－２０ｋＤ－ＮＨＳ］－ＩＬ－１５を提供した。

【0209】

以下の実施例において、精製［ｍＰＥＧ２－ＣＡＣ－ＦＭＯＣ－２０ｋＤ－ＮＨＳ］－ＩＬ－１５は、コンジュゲート２と称される。

【0210】

実施例３
長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬、［モノ－ＰＥＧ２－ＲＵ－ＢｕｔｒｙＡＬＤ－４０Ｋ］－ＩＬ１５の調製

【化24】

分枝鎖状ｍＰＥＧ－ブチルアルデヒドＰＥＧ試薬、モノ－ＰＥＧ２－ＲＵ－ＢｕｔｒｙＡＬＤ－４０Ｋ

【化25】

を使用して対象の長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬を調製し、作動薬の調製に使用したＰＥＧ試薬の重量平均分子量は、約４０，０００ダルトンであった。

【0211】

２．７ｍｌのＩＬ－１５（ＰＢＳ緩衝液中１．２３ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）を小型反応バイアルに移し、０．３ｍｌの１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）を加えてｐＨをｐＨ６に調整した。窒素下にて－２０℃で保管したｍＰＥＧ２－ｒｕ－ＢｕｔｙｒＡＬＤ、４０ｋＤａを周囲温度に温めた。１５倍過剰（ＩＬ－１５の量に対して）のｍＰＥＧ２－ｒｕ－ＢｕｔｙｒＡＬＤをＭｉｌｌｉＱ Ｈ２Ｏに溶解して１０％試薬溶液を形成した。１０％試薬溶液をＩＬ－１５溶液に急速に加え、よく混合した。及びＲｏｔｏＭｉｘｅｒ上に１５分間セットした。次いで、１／１００容積の１Ｍ ＮａＣＮＢＨ３／Ｈ２Ｏを反応混合物に加えた。第２級アミン結合を介したＩＬ－１５へのｍＰＥＧ２－ｒｕ－ＢｕｔｙｒＡＬＤのカップリングを可能にするために、反応溶液をＲｏｔｏＭｉｘｅｒ上に４℃で１７時間配置し、次いでグリシン溶液でクエンチした。ペグ化反応は酸性ｐＨで行われるため、ＩＬ－１５に対するＰＥＧ誘導体の結合は、Ｎ末端に対してより選択的であった。コンジュゲートを精製するために、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高性能カラム及びリン酸ナトリウム緩衝液を使用する陰イオン交換クロマトグラフィー方法も開発した。精製モノ－ＰＥＧ２－ｒｕ－ＢｕｔｙｒＡＬＤ－４０Ｋ－ＩＬ－１５コンジュゲートを、ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥにより特徴付けた。

【0212】

以下の実施例及び付随する開示において、精製［モノ－ＰＥＧ２－ＲＵ－ＢｕｔｒｙＡＬＤ－４０Ｋ］－ＩＬ－１５、すなわち、アミン結合を介してＩＬ－１５に共有結合した、上記に示した構造を有する単一ＰＥＧ部分を有するものは、コンジュゲート３と称される。

【0213】

これと同じ手法を用いて、異なる重量平均分子量を有するＰＥＧ２－ＲＵ－ＢｕｔｒｙＡＬＤ－を使用してコンジュゲートを調製する。例えば、モノ－ＰＥＧ２－ＲＵ－ＢｕｔｒｙＡＬＤ－２０Ｋ］－ＩＬ－１５は、２０ｋＤポリマー試薬を使用して、上述したように調製された（本明細書でコンジュゲート４と称される）。

【0214】

実施例４
長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬の調製、
モノ－ｍＰＥＧ－ＢｕｔｙｒＡＬＤ－４０Ｋ－ＩＬ－１５

【化26】

構造

【化27】

を有するＰＥＧ試薬、直鎖ｍＰＥＧ－ブチルアルデヒド、４０ｋＤａ（「ｍＰＥＧ－ＢｕｔｙｒＡＬＤ」）を使用して、対象の長時間作用型ＩＬ－１５ Ｒ作動薬を調製し、作動薬の調製に使用したＰＥＧ試薬の重量平均分子量は、約４０，０００ダルトンであった。

【0215】

２．７ｍｌのＩＬ－１５（ＰＢＳ緩衝液中１．２３ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）を小型反応バイアルに移し、０．３ｍｌの１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）を加えてｐＨをｐＨ６に調整した。窒素下にて－２０℃で保管したｍＰＥＧ－ＢｕｔｙｒＡＬＤ、４０ｋＤａを周囲温度に温めた。１０倍過剰（ＩＬ－１５の量に対して）のｍＰＥＧ－ＢｕｔｙｒＡＬＤをＭｉｌｌｉＱ Ｈ２Ｏに溶解して１０％試薬溶液を形成した。１０％試薬溶液をＩＬ－１５溶液に急速に加え、よく混合した。及びＲｏｔｏＭｉｘｅｒ上に１５分間セットした。次いで、１／１００容積の１Ｍ ＮａＣＮＢＨ３／Ｈ２Ｏを反応混合物に加えた。第２級アミン結合を介したＩＬ－１５ へのｍＰＥＧ－ＢｕｔｙｒＡＬＤのカップリングを可能にするために、反応溶液をＲｏｔｏＭｉｘｅｒ上に４℃で１７時間配置し、次いでグリシン溶液でクエンチした。ペグ化反応は酸性ｐＨで行われるため、ＩＬ－１５に対するＰＥＧ誘導体の結合は、Ｎ末端に対してより選択的であった。コンジュゲートを精製するために、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高性能カラム及びリン酸ナトリウム緩衝液を使用する陰イオン交換クロマトグラフィー方法も開発した。精製モノ－ｍＰＥＧ－ＢｕｔｙｒＡＬＤ－４０Ｋ－ＩＬ－１５コンジュゲートを、ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥにより特徴付けた。

【0216】

以下の実施例において、モノ－ｍＰＥＧ－ＢｕｔｒｙＡＬＤ－４０ｋ－ＩＬ－１５は、コンジュゲート５と称される。

【0217】

実施例５
ＩＬ－１５Ｒαに対する長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬の受容体バイアス評価
ＩＬ－１５ α受容体に対する例示的な長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬（試験物品）の親和性を測定し、ＩＬ－１５と比較した。固定化抗Ｆｃにより捕捉されるＩＬ－１５Ｒα：Ｆｃを使用するＢＩＡｃｏｒｅことにより親和性を測定した。

【0218】

試験物品をＰＢＳ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０及び０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有する）中で１０μＭに希釈した。一連の３倍希釈物を作製し、ＩＬ－１５Ｒαで被覆されたセンサーチップ上に注入した。ｋ_ａ及びｋ_ｄ率を別々に決定することにより親和性を測定し、ｋ_ｄとｋ_ａの比を用いてｋ_ｄ値を計算した。

【0219】

好ましいコンジュゲートは、一般に、非修飾ＩＬ－１５と比較して、ペグ化後に可能な限りＩＬ－１５ Ｒα親和性を保持するものである。逆に言えば、好ましいコンジュゲートは、一般に、ＩＬ－１５ Ｒαに対する親和性の消失が非修飾ＩＬ－１５のものと比較して最小である。

【0220】

例えば、いくつかの実施形態では、好ましいコンジュゲートは、ＩＬ－１５と比較して、ＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＬＬ－２ ｐＳＴＡＴ５）における約７倍以下の低下、及び受容体α結合（Ｋ_Ｄ、ｐＭ）における約５０％以下の低下を示す。例えば、コンジュゲート１は、ＩＬ－１５と比較した場合、効力における約２倍の低下を有し、ＩＬ－１５の受容体親和性の約８０％を保持する。

【0221】

【表4】

【0222】

上記の表に示すように、コンジュゲート１は、長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬に特に好ましい特徴である、ＩＬ－１５ α受容体に対するその高い親和性を保持する（すなわち、ＩＬ－１５と比較した場合）。追加のコンジュゲートに関する親和性定数（Ｋ_Ｄ）（単位ｐＭ）は、下記に提供される。

【0223】

【表5】

【0224】

実施例６
インビボ研究：マウスにおける単回投与ＰＫ研究
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３／グループ）に、静脈内単回用量のＩＬ－１５（対照）を０．３ｍｇ／ｋｇで）又はコンジュゲート２を用量０．３ｍｇ／ｋｇで投与した。投与後、血液サンプルを、投与後の様々な時点（２４時間、４８時間、７８時間、９６時間）で収集した。サンプルをプールし、リンパ球細胞集団に対する薬物作用の薬力学的分析のために、フローサイトメトリーによって評価し、ビヒクル対照に対する倍率変化として表した（結果は、下記の後の実施例に記載される）。細胞数の変化に加えて、機能的マーカー及び活性のマーカーを定量化した。最終的に、各時点で、薬物の血漿濃度を決定した。図６を参照されたい。

【0225】

図６に示すように、コンジュゲート２は、非長時間作用型ＩＬ－１５（中実丸）投与後に観察された血漿レベルにおける急速な低下とは対照的に、延長した期間にわたり、例えば１週間を超えて（中実四角形）、血漿中で測定可能な濃度を維持し、Ｔ_１／２は約２０～３０時間であった。

【0226】

実施例７
インビボ研究：ラットにおける単回投与ＰＫ研究
ラット（ｎ＝３／グループ）に、静脈内単回用量のコンジュゲート２を０．３、０．１５及び０．０７５ｍｇ／ｋｇの投与量で、又は皮下単回用量のコンジュゲート２を０．１５ｍｇ／ｋｇで投与した。投与後、血液を投与後の１～７日目に収集した（投与後の第１の２４時間で複数のサンプルを収集した）。各時点で、薬物の血漿濃度を決定した。図７を参照されたい。

【0227】

図７に示すように、マウスに関して図６に示した結果と同様、コンジュゲート２の投与は、薬物に対する持続性の及び用量比例的な暴露をもたらした。

【0228】

実施例８
マウスにおけるインビボでのＩＬ－１５シグナル伝達研究
マウスに上記の実施例６に記載されるように投与して、ＳＴＡＴ５リン酸化度により評価される、インビボでのシグナル伝達を評価した。様々なリンパ球（ＣＤ４、ＣＤ８、及びＮＫ細胞）におけるＳＴＡＴ５リン酸化度を、全血を白血球表面マーカー及びｐＳＴＡＴ５に関して染色した後、フローサイトメトリーにより測定することによって評価した。結果を各々ＩＬ－１５及びコンジュゲート２に関する図８Ａ及び８Ｂに示す。

【0229】

ＳＴＡＴ５リン酸化は、ＩＬ－１５／ＩＬ－２受容体シグナル伝達において早期且つ一過性である。図８Ａから明らかなように、インビボでのシグナル伝達活性は、ＩＬ－１５の場合、極度に短命であるが、例示的なコンジュゲート２は、最も注目すべきことにＮＫ細胞（中実逆三角形▼）において、及びＣＤ８細胞（中実三角形▲）においても、持続的なＳＴＡＴ５リン酸化を誘導し、ＮＫ及びＣＤ８細胞にて示された測定可能なＳＴＡＴ５リン酸化活性は、７２時間を超えた。ＣＤ４細胞に関するＳＴＡＴ５リン酸化活性も示す（中実四角形■）。

【0230】

実施例９
非ヒト霊長類におけるインビボでのＩＬ－１５シグナル伝達研究
この研究では、カニクイザル（ｃｙｎｏ）、１匹の雌及び１匹の雄の各々に、単回用量のコンジュゲート２（０．５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した。様々なタイプのリンパ球（ＣＤ４、ＣＤ８、及びＮＫ細胞）におけるＳＴＡＴ５リン酸化のフローサイトメトリーによる評価のために、一連の血液サンプルを、処置前（－６日目及び－１日目）及び処置後の複数の間隔で各動物から採取した。結果を図９Ａ（ＣＤ４）、９Ｂ（ＣＤ８）、及び９Ｃ（ＮＫ）に提供する。

【0231】

図９Ａ～９Ｃに示すように、結果は、マウスにおいて観察されたもの（実施例７）と同様であるが、非ヒト霊長類においては、ＳＴＡＴ５リン酸化はＣＤ４細胞でも観察された（図９Ａ）。３つの細胞タイプの各々におけるＳＴＡＴ５リン酸化は、実質的に投与後に上昇し、図示する長時間作用型ＩＬ－１５作動薬の投与後の約３及び４日目に最大レベルに到達し、約５～１０日目までにほぼ－１日目レベル（すなわち、投与前）に戻った。実施例７と同様、これらの結果は、活性ＩＬ－１５種の持続性の存在を示す。

【0232】

実施例１０
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のＮＫサブセットにおける例示的な長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬のインビトロでのＩＬ－１５活性
図１０Ａ（ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ細胞）及び１０Ｂ（ＣＤ５６ｄｉｍ細胞）に示すように、ヒトＰＢＭＣのＮＫ細胞サブセットにおけるシグナル伝達を研究することによって、例示的な長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬（例えば、コンジュゲート１、３及び５）のインビトロ活性の評価を行った。長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬のＩＬ－１５シグナル伝達活性を評価するために、ＳＴＡＴ５リン酸化を前述したように評価した。

【0233】

【表6】

【0234】

結果を図１０Ａ（ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ）及び１０Ｂ（ＣＤ５６ｄｉｍ）に示す。

【0235】

理解し得るように、実例的なコンジュゲートの各々は、ｈｕＰＢＭＣにおいてＩＬ－１５シグナル伝達を誘導するが、コンジュゲート１はそのようなシグナル伝達を強力に誘導する。試験したコンジュゲートの中でも（全データは示されない）、コンジュゲート１は、ｈｕＰＢＭＣに対して最大の効力／活性を示した。データは、ＩＬ－１５タンパク質当たり同じペグ化度（すなわち、ＰＥＧ部分の数）及び同じＰＥＧ部分のサイズを維持する場合であっても、異なるＰＥＧ構築及びリンカーは、得られたコンジュゲートにおける生理活性に対して非常に異なる効果を誘発できることを示す。

【0236】

第２の研究を行って、２人のドナーから得たヒトＰＢＭＣ（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６（ｂｒｉｇｈｔ及びｄｉｍ）及びＣＤ４－Ｔｒｅｇｓ（ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋））のＩＬ－１５、コンジュゲート１及びコンジュゲート５に対するｐＳｔａｔ５応答を検討／比較した。０．００１～１００００ｎｇ／ｍｌの用量範囲の１０倍希釈を用いて２０分の刺激により、１１点用量応答を調べた。試験物品の各々は、ＩＬ－１５緩衝液＋０．１％ ＢＳＡ中で希釈した。結果を以下の表に提供する。

【0237】

【表7】

【0238】

上記の表３データに基づけば、ＩＬ－１５はＣＤ３及びＣＤ４誘導の両方に関してコンジュゲート１の約４～６倍強力であると思われ；コンジュゲート１及びコンジュゲート５の効力は、ＣＤ３及びＣＤ４誘導に関して類似しているように思われる。

【0239】

【表8】

【0240】

上記の表５のデータに基づけば、ＩＬ－１５はＴｒｅｇ及びＣＤ８誘導に関してコンジュゲート１の約３～５倍強力であると思われ；コンジュゲート１及び５の効力は、ＣＤ４及びＣＤ８誘導に関して実質的に類似しているように思われる。

【0241】

【表9】

【0242】

表６に基づけば、ＩＬ－１５はＣＤ５６誘導に関してコンジュゲート１の～１０倍強力であると思われる。しかしながら、コンジュゲート１はＣＤ５６ ｂｒｉｇｈｔ及びＣＤ５６ｄｉｍの誘導においてコンジュゲート５よりも強力であると思われる。

【0243】

以前のデータに基づけば、ＩＬ－１５、コンジュゲート１及びコンジュゲート５は、細胞集団の全てに関して同様のｐＳＴＡＴ５誘導を示し、最大応答は、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ及びＴｒｅｇ細胞に関してより高いと思われる。

【0244】

【表10】

【0245】

前述のデータに基づけば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８及びＴｒｅｇ細胞の誘導において、ＩＬ－１５はコンジュゲート１の約３～４倍強力であり、コンジュゲート５の約５～８倍強力であると共に、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ及びＣＤ５６ｄｉｍ細胞の誘導において、ＩＬ－１５はコンジュゲート１の約１２倍強力であり、コンジュゲート５の約４０～６０倍強力であり、コンジュゲート１の特定の予想外の、且つ特に有利な特徴が示唆される。

【0246】

実施例１１
インビボ研究：マウスにおける単回投与ＰＤ研究－細胞増殖及び活性化
Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３／グループ）に、静脈内単回用量のビヒクル（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０％ショ糖、ｐＨ７．４）又は用量０．０３ｍｇ／ｋｇ（図１１、低用量）、０．３ｍｇ／ｋｇ（図１１、中用量）又は１ｍｇ／ｋｇ（図１１、高用量）のコンジュゲート１を投与した。投与後、血液サンプルを投与後の様々な時点（２４時間、４８時間、７８時間、９６時間、１２０時間）で収集した。各マウスからのサンプルを、フローサイトメトリーによってリンパ球細胞集団に対する薬物作用の薬力学的分析に供した。細胞数の変化に加えて、機能的マーカー及び活性のマーカーを調べた。

【0247】

コンジュゲート１の追加の投与を用量０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、及び１．５ｍｇ／ｋｇで行った。

【0248】

０．０３ｍｇ／ｋｇ（図１１、低用量）、０．３ｍｇ／ｋｇ（図１１、中用量）及び１ｍｇ／ｋｇ（図１１、高用量）の各々のコンジュゲート１を投与したマウスにおけるＮＫ細胞の増殖を示す結果を、図１１Ａ及び１１Ｂに提供する。

【0249】

ＣＤ４５＋ＣＤ３－ＣＤ４９ｂ＋及びＣＤ４５＋ＣＤ３－ＣＤ４９ｂ＋Ｋｉ６７＋マーカー組み合わせを使用してＮＫ細胞及びそれらの増殖を規定した。投与後、血液サンプルを、ＦＡＣＳ ＤＩＶＡソフトウエアを実行するＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターに取得した。Ｆｌｏｗｊｏソフトウエアを分析に使用し、ＮＫ細胞絶対値及びＮＫ細胞内のＫｉ６７％陽性を、Ｐｒｉｓｍを使用してプロットした。

【0250】

図１１Ａは、経時的なＫｉ６７発現（百分率としての）のプロットであり；図１１Ｂは、経時的なＮＫ細胞数を提供する。プロットは、コンジュゲート１がマウスにおいて持続性のＮＫ細胞増殖を誘導する能力を示す。

【0251】

例示的な長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬の効果を、全成熟レベルのＮＫ細胞に関して研究した。末梢ＮＫ細胞プールは、ＣＤ２７の発現により描写することができ、ＣＤ２７^ｌｏ／－ ＮＫ細胞はより細胞毒性であり、ＣＤ２７^ｈｉｇｈ ＮＫ細胞よりも多量のサイトカインを産生する（Ｈａｙａｋａｗａ Ｙ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６；１７６：１５１７－１５２４）。成熟末梢ＮＫ細胞集団は、ＣＤ１１ｂ発現の連続的な上方調節と、その後のＣＤ２７の下方調節により規定された４つの成熟段階にさらに精製されており、最も未熟なＮＫ細胞はＣＤ２７^－ＣＤ１１ｂ^－であり、最も成熟したＮＫ細胞はＣＤ２７^－Ｄ１１ｂ^－である（Ｃｈｉｏｓｓｏｎｅ Ｌ．、ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ、２００９；１１３：５４８８－５４９６）。

【0252】

マウスにおいて、ＮＫ細胞の４つの異なる成熟状態は、ＣＤ２７及びＣＤ１１ｂ発現により規定される。一旦、ＮＫマーカー（ＣＤ４９ｂ＋）、天然活性化ＮＫ受容体（ＮＫｐ４６＋）及びＩＬ－１５／ＩＬ－２ＲＢ（ＣＤ１２２＋）三重陽性細胞が特定されたら、未熟（ＣＤ１１ｂ－ＣＤ２７－）、早期（ＣＤ１１ｂ－ＣＤ２７＋）、高エフェクター（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２７＋）及び終末エフェクター（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２７－）ＮＫ細胞をフローサイトメトリーにより定量化した。

【0253】

上述したように０．０１、０．０３、０．１、０．３、１．０及び１．５ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１の単回投与を受け、又はｑ７ｄｘ３スケジュールの第３の投与後、様々な成熟状態にあるＮＫ細胞をマウスにおいて定量化した。フローサイトメトリーを用いて、関心対象のＮＫ集団をＣＤ４９ｂ、ＮＫｐ４６及びＣＤ１２２陽性により同定した。次いで、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ２７を使用して、ＮＫ集団を未熟（ＣＤ１１ｂ－ＣＤ２７－）、早期ＮＫ（ＣＤ１１ｂ－ＣＤ２７＋）、高エフェクター（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２７＋）及び終末エフェクター（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２７－）亜集団にさらに区別した。末梢血をＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターに流し、各集団に関する絶対値を、ＢＤ ＦＡＣＳ ＤＩＶＡソフトウエアを使用して、サンプル獲得中に計数ビーズを使用して決定した。Ｆｌｏｗｊｏソフトウエアを使用してフローサイトメトリー分析を行い、データをＰｒｉｓｍでプロットした。

【0254】

結果を図１２Ａ～Ｄに示す。追加の結果を図２２Ａ～Ｄに示す。ｑ７ｄｘ３結果を図２８Ａ～Ｄに示す。プロットから理解し得るように、コンジュゲート１は、全成熟レベルのＮＫ細胞（終末エフェクター細胞、プレＮＫ細胞、高エフェクター細胞及び早期ＮＫ細胞）の数の増大に有効であった。ＮＫ細胞の用量依存的増加を全成熟亜集団において観察し、効果は少なくとも１２０時間継続した。

【0255】

抗ＮＫＧ２Ｄシグナルのフローサイトメトリー分析を用いてＮＫＧ２Ｄの表面発現を行い、ＮＫ細胞における平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表した。同様に、抗グランザイムＢシグナルのフローサイトメトリーベースの検出を用いて細胞内グランザイムＢのレベルを行い、これもＮＫ細胞におけるＭＦＩとして表した。Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター及びＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウエアを用いてＮＫＧ２Ｄ及びグランザイムＢシグナルを検出した後、Ｆｌｏｗｊｏソフトウエアを使用して分析を行った。Ｐｒｉｓｍを使用してＭＦＩ値をプロットした。結果を図１３Ａ及び１３Ｂに示す。これらの図はさらに、ビヒクルとの比較によって、最も顕著には中及び高投与量に関して、ＮＫ細胞によるＮＫＧ２Ｄ及びグランザイムＢ（アポトーシス促進性セリンプロテアーゼ）の両方において持続的な増大を達成する能力により証明されるように、ＮＫ細胞活性化を増大させるコンジュゲート１の能力を示す。両方のＮＫ活性化マーカーの用量依存的増大は、コンジュゲート１の単回投与後に観察された。

【0256】

マウスにおいて、ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８＋として規定された。マウスからの血液及び脾臓を、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用する免疫表現型検査に供し、分析はＦｌｏｗｊｏソフトウエアを使用した。絶対ＣＤ８細胞数をＰｒｉｓｍにおいて図１４（血液）及び図２４（脾臓）に示すようにプロットした。図１４及び図２４は、上述した投与量の各々でのマウスにおける単回ｉ．ｖ．投与後に、コンジュゲート１がＣＤ８ Ｔ細胞の増殖及びＣＤ８ Ｔ細胞数の持続性の増大を誘導する能力を示す。この影響は、中（０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ）及び高（１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ）投与量に関して最も顕著である。

【0257】

マウスにおいて、ＣＤ８エフェクター記憶（Ｔｅｍ）及びＣＤ８中央記憶（Ｔｃｍ）Ｔ細胞を、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＣＤ６２－及びＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ＋として同定した。これらの記憶集団の増殖を、Ｋｉ－６７陽性を用いて行った。コンジュゲート１又はＩＬ－１５の単回投与後、血液及び脾臓を、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター、ＤＩＶＡ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎソフトウエア及びＦｌｏｗｊｏ分析ソフトウエアを使用する免疫表現型検査に供した。グラフはＰｒｉｓｍにおいてプロットした。血液に関する図１５Ａ及び１５Ｂに示すように、コンジュゲート１はエフェクター及び中央記憶ＣＤ８ Ｔ細胞の両方で用量依存的増加を誘導するが、単回投与ＩＬ－１５は誘導しない。脾臓に関する図２５及び２６に示すように、コンジュゲート１はＫｉ６７及びグランザイムＢの両方で用量依存的増加を誘導するが、単回投与ＩＬ－１５は誘導しない。エフェクター及び中央記憶集団の両方は、コンジュゲート１、例示的な長時間作用型ＩＬ－１５作動薬の投与に応答して増殖する。

【0258】

実施例１２
インビボ研究：非ヒト霊長類における単回投与ＰＤ研究
この研究では、カニクイザル、１匹の雌及び１匹の雄に５００μｇ／ｋｇのコンジュゲート２を静脈内投与した。リンパ球細胞数（ＮＫ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞など）及び活性化のフローサイトメトリーによる評価のために、処置前（－６日目及び－１日目）及び単回投与処置後の複数の間隔で、各動物から一連の血液サンプルを採取した。

【0259】

ＮＫ細胞数を決定して、非ヒト霊長類において持続性のＮＫ細胞増殖を誘導する例示的なコンジュゲート２の能力を評価した；結果を図１６Ａ及び１６Ｂに示す。カニクイザルからの血液中のＮＫ細胞及びそれらの増殖を、フローサイトメトリーにより同定した。ＮＫ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３－ＣＤ１６＋）及びそれらの増殖状態（ＣＤ４５＋ＣＤ３－ＣＤ１６＋Ｋｉ６７＋）の取得及び分析は、ＢＤ ＦＡＣＳ ＤＩＶＡソフトウエアを使用して行った。ＮＫ細胞及び増殖しているＮＫ細胞に関する絶対値を使用して、ＮＫ集団における％Ｋｉ６７陽性を計算した。Ｐｒｉｓｍを使用して処置前及び処置後の値をプロットした。

【0260】

これらの図に示すように、単回用量のコンジュゲート２の投与は、非ヒト霊長類において持続性のＮＫ細胞増殖を誘導するのに有効であった。

【0261】

図１７に示すように、投与前から投与後の１４日目までの各動物に関するＣＤ８ Ｔ細胞数も決定した。詳細には、ＣＤ８ Ｔ細胞をＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８＋として規定した。サルからの血液はまた、前述したような免疫表現型検査に供した。サルにおいて、ＣＤ８ Ｔ細胞は持続的に増大し、効果は少なくとも１０日間継続した。このプロットはさらに、投与後のＣＤ８ Ｔ細胞の増殖及び数の持続性の増大を誘導する例示的な長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬、コンジュゲート２の能力を例示する。

【0262】

サルにおいて、ＣＤ８ Ｔ_ＥＭ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８＋ＣＤ４５Ｒａ－ＣＤ１９７－として規定され、ＣＤ８ Ｔ_ＣＭは、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８＋ＣＤ４５Ｒａ－ＣＤ１９７＋として規定された。フローサイトメトリーによる免疫表現型検査を行い、ＤＩＶＡソフトウエア上でサンプルを取得し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウエア上でデータを分析した。Ｐｒｉｓｍを使用してグラフをプロットした。各々図１８Ａ及びＢに示すように、投与前から投与後の１４日目までの各動物に関するＣＤ８ Ｔエフェクター記憶細胞（Ｔ_ＥＭ細胞）及びＣＤ８ Ｔ中央記憶細胞（Ｔ_ＣＭ）数を決定した。コンジュゲート２は、カニクイザルにおいてＣＤ８エフェクター及び中央記憶Ｔ細胞集団の有意な及び持続性の増大を誘導する。図は、ＣＤ８エフェクター及び中央記憶Ｔ細胞集団の両方が、例示的なコンジュゲート２に応答して増殖することを示す。

【0263】

実施例１３
ＢＡＬＢ／ＣマウスにおけるＣＴ２６－誘導皮下肺転移腫瘍モデルの抗腫瘍活性の評価
０日目に、６～８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに１×１０^５マウスＣＴ－２６細胞を尾静脈注射により接種した。１日目、ＣＴ－２６細胞を投与した２４時間後にマウスを１０グループに分割した。各グループは、６～９匹の動物（コンジュゲート２に関して）又は９～１２匹の動物（コンジュゲート１に関して）からなっていた。（コンジュゲート１及びコンジュゲート２の投与について２つの別個の研究を行ったが、研究プロトコルは両方の研究で本質的に同じであった）。各グループを、以下のような１つの介入に割り当てた：ビヒクル、リン酸緩衝生理食塩水（グループＡ）；天然ＩＬ－１５単独（グループＢ）；用量０．０３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート２（グループＣ）；用量０．１ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート２（グループＤ）；用量０．３ｍｇ／ｋｇコンジュゲート２（グループＥ）；用量１．０ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート２（グループＦ）；用量３．０ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート２（グループＧ）；コンジュゲート１の場合：ビヒクル、リン酸緩衝生理食塩水（グループＨ）；用量０．０３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１（グループＩ）及び用量．３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１（グループＪ）。動物は１、５、及び１０日目に投与された。

【0264】

ＣＴ－２６腫瘍細胞投与の日から１３日後、マウスに麻酔をかけ、免疫表現型マーカーのさらなる分析のために血液及び脾臓細胞を収集した一方、肺はピクリン酸及びホルムアルデヒドを含むＢｏｕｉｎｓ溶液中で２４～４８時間固定した。

【0265】

各肺につき切開下で肺腫瘍小結節の数を計数し、各グループに関する肺小結節の平均を決定した。独立スチューデントｔ検定を用いて、ビヒクルグループ、対、介入グループの統計的有意性も得ることができた。

【0266】

各々コンジュゲート２及びコンジュゲート１に対応する、処置グループに関する肺転移結果を図１９及び２０に示す。両方の実例的な長時間作用型ＩＬ－１５受容体作動薬は、肺転移の減少の促進に有効であったが、コンジュゲート２はビヒクルと比較して、転移における６５％減少を提供し、一方、コンジュゲート１は転移の８５％減少を提供した。

【0267】

血液及び脾臓細胞を１３日目に、フローサイトメトリー及び様々な蛍光色素とコンジュゲートしたマーカー抗体を使用して、免疫表現性マーカーにおける変化に関して分析した。０．３、１、及び３ｍｇ／ｋｇで投与したコンジュゲート２は、各々、血液中でＣＤ８ Ｔ細胞の用量依存的増加を、ビヒクルに対して１．５、２．５、及び３．３倍誘導した。同様の観察事項が脾臓において得られ、０．３、１、及び３ｍｇ／ｋｇ用量レベルで、ビヒクルに対して１．３、１．７、及び２．２倍の増大を有した。Ｋｉ－６７免疫表現型検査は、ビヒクルと比較して、同じ低、中、及び高用量レベルでの１．７，４．６及び５．３倍変化を有する血液中のＣＤ８ Ｔ細胞増殖、並びに２．５、５．７及び６．９倍変化を有する脾臓における有意な用量依存的増大を明らかにした。加えて、コンジュゲート２処置は、ＣＤ８における生存促進性Ｂｃｌ－２＋ＭＦＩを血液及び脾臓の両方において１．５倍も増大させた。

【0268】

【表11】

【0269】

実施例１４
コンジュゲート１を用いた処置後のＮＫ細胞のインビトロ及びインビボ細胞毒性
標的腫瘍細胞に対するＮＫ細胞媒介細胞毒性を、フローサイトメトリーベースのアッセイを用いてインビトロで評価した。ネガティブ選択磁気細胞単離（マウスＮＫ細胞濃縮キット、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓からＮＫ細胞を単離し、エフェクター細胞として使用した。インビトロ研究のために、単離したＮＫ細胞を、細胞毒性アッセイに使用する前に、濃度３０００、１０００、３００、３０、３、又は０（非刺激）ｎｇ／ｍＬのコンジュゲート１で、加湿インキュベーター内で３７℃、５％ ＣＯ_２で一晩刺激した。インビボ研究のために、マウスに０．３ｍｇ／ｋｇコンジュゲート１を投与し、脾臓ＮＫ細胞を投与から２４、４８、及び７２時間後に単離し、細胞毒性アッセイに直接使用した。

【0270】

ＰＫＨ２６で標識したＹＡＣ－１ Ｔ細胞を標的細胞として使用した。ＮＫ細胞の細胞毒性を監視するために、ＮＫ及びＹＡＣ－１細胞を様々なエフェクター：標的比（５０：１、２５：１、及び１２．５：１）で３７℃、５％ ＣＯ_２で４時間共培養し、次いで７－ＡＡＤで１０分間染色して死細胞を標識した。細胞をフローサイトメトリーによって直ちに分析した。溶解した標的細胞をＰＫＨ２６^＋７－ＡＡＤ^＋として同定した。

【0271】

インビトロでの結果：４時間共培養した後、細胞毒性をフローサイトメトリーによって評価した。結果を図２１に提供する。

【0272】

インビボでの結果：０．３ｍｇ／ｋｇで処置後の細胞毒性を、２４時間、４８時間及び７２時間後に評価した。結果を図２７に提供する。

【0273】

このデータは、コンジュゲート１を用いた処置後のインビトロ及びインビボでのＮＫ細胞の用量依存的に増大した細胞毒性を示す。

【0274】

実施例１５
コンジュゲート１によるグランザイムＢの誘導
用量０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び１．５ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１で処置後の、時間の関数としてのＮＫ細胞グランザイムＢ発現を測定した。免疫表現型検査のために、投与後２４～２４０時間の全血を収集した。赤血球細胞を溶解した後、白血球細胞を生存性色素（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ）並びにＣＤ４５、ＣＤ３及びＣＤ４９ｂに特異的なマーカーで標識して、生きているＮＫ細胞を同定した。次いで、細胞を同時に固定し、細胞内グランザイムＢ染色のために透過化した。染色血液をＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターに流し、ＤＩＶＡソフトウエアにより取得し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウエアを使用して分析した。データはグランザイムＢ発現に関して陽性であったＮＫ細胞のパーセントとして表される。

【0275】

結果を図２３に提供する。このデータは、コンジュゲート１を用いた処置が、ＮＫ細胞のグランザイムＢ発現を増大させることを示す。

【0276】

実施例１６
インビボ研究：マウスにおける単回投与ＩＬ－１５及びコンジュゲート１ ＰＫ及びＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達研究
ＰＫ分析のために、コンジュゲート１を静脈内単回用量として０．３ｍｇ／ｋｇでｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３）に投与した。投与後、マウスを人道的に犠牲にし、血漿を処置後の２４、４８、７２、９６、１２０及び１４４時間に収集した。別個の研究から、マウスに静脈内単回用量のＩＬ－１５（０．５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。これらのマウスからのサンプルを、処置から６時間以内の示された時点で収集した。［ＰＫ方法は、本明細書に前述されている］。薬力学的試験のために、ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝／グループ）は、０．０３又は０．３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１又はビヒクル（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０％ショ糖、ｐＨ７．４）のｉ．ｖ．注射を受容し、投与前及び処置後の１５分、１、２４、４８、７２、９６及び１２０時間に血液を収集した。サンプルをフローサイトメトリーによって個別に分析し、ＣＤ８及びＮＫ細胞内のｐＳＴＡＴ５パーセント陽性として表した。

【0277】

図２９Ａは、各々、ｂａｌｂ／ｃマウスにおける０．５及び０．３ｍｇ／ｋｇの静脈内単回用量の試験物品の投与後の１４４時間の時間経過中の、試験物品（ＩＬ－１５又はコンジュゲート１）の血漿濃度のプロットである。

【0278】

結果：コンジュゲート１は、約１２時間の半減期を示す一方、ＩＬ－１５は、１時間未満の半減期で血漿から急速に除去される。

【0279】

図２９Ｂは、マウスにおける０．０３及び０．３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１の単回注射後のＣＤ８ Ｔ細胞内のｐＳＴＡＴ５パーセント陽性のグラフである。

【0280】

結果：コンジュゲート１は両方の用量レベルで、ＣＤ８ Ｔ細胞において持続性のｐＳＴＡＴ５シグナル伝達を誘導する。投与前を含む、１２０時間の時間経過を示す。

【0281】

図２９Ｃは、０．０３及び０．３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１の単回注射後のハツカネズミＮＫ細胞内のｐＳＴＡＴ５パーセント陽性のグラフである。

【0282】

結果：コンジュゲート１は両方の用量レベルで、ＮＫ細胞において強力な及び持続性のｐＳＴＡＴ５シグナル伝達を誘導する。

【0283】

実施例１７
マウスにおけるインビボでの単回及びＱ７ＤＸ３薬力学的研究－細胞数及び増殖
Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３／グループ）に、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１若しくは１．５ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１又はビヒクルの単回投与又は一週用量を３回投与した。マウスを犠牲にし、投与後の様々な時点（２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、２４０時間）で血液を収集した。各マウスからのサンプルをフローサイトメトリー分析に供して、リンパ球集団内の薬力学的効果、及び関心対象の機能的マーカー（ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ８記憶Ｔ細胞及びＮＫ細胞の細胞数、並びに各集団内のＫｉ－６７のパーセント陽性）を調べた。結果を図３０Ａ～Ｆ、３１Ａ～Ｃ、及び３２Ａ～Ｃに示す。

【0284】

図３０Ａ～Ｃは、各々、実施例１７に記載される０．０１、０．０３、０．１、０．３、１又は１．５ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１の単回投与後の、総ＣＤ８、ＣＤ８中央記憶（Ｔｃｍ）及びＣＤ８エフェクター記憶（Ｔｅｍ）細胞数のプロットである。０．０３以上の用量レベルのコンジュゲート１は、実施例１７に記載されるように、血液中の総ＣＤ８ Ｔ細胞の有意な増大を誘導する。最低用量の０．０１ｍｇ／ｋｇは、ＣＤ８ Ｔｃｍ及びＣＤ８ Ｔｅｍを増大させた。０．３ｍｇ／ｋｇでは、コンジュゲート１は、ＣＤ８、ＣＤ８ Ｔｃｍ及びＣＤ８ Ｔｅｍを６．４Ｘ、３７．９Ｘ及び１４．５Ｘ増大させた。注目すべきことに、ＣＤ８及びＣＤ８記憶Ｔ細胞数は、コンジュゲート１が０．３～１．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合、注射後の２４０時間でベースラインに戻らず、コンジュゲート１の持続性のＰＤ効果が示された。

【0285】

図３０Ｄ、３０Ｅ及び３０Ｆは、各々、実施例１７に記載される、マウスにおける総ＣＤ８、ＣＤ８ Ｔｃｍ及びＣＤ８ Ｔｅｍ集団内のＫｉ－６７パーセント陽性のプロットである。単回投与のコンジュゲート１は、全用量レベルで、全ＣＤ８及びＣＤ８亜集団においてＫｉ－６７陽性を増大させる。

【0286】

図３１Ａ、３１Ｂ及び３１Ｃは、実施例１７に記載される、コンジュゲート１の単回（点線）又は０．０３及び０．３ｍｇ／ｋｇでＱ７ｄｘ３（実線）での投与後のＣＤ８及びＣＤ８記憶亜集団Ｔ細胞数のプロットである。反復投与はこれらの集団をさらに増大させ、ＣＤ８、ＣＤ８ Ｔｃｍ、ＣＤ８ Ｔｅｍは各々３５．３Ｘ、１８３Ｘ及び７３．８Ｘ増大した。時間経過の終わりに（０．３ｍｇ／ｋｇでの最初又は最後の投与から２４０時間後）、細胞数はマウスにおいてベースラインに戻らなかった。

【0287】

図３２Ａ及び３２Ｂは、実施例１７に記載される、マウスにおける０．０１～１．５ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１の単回投与後のＮＫ細胞数及びＫｉ－６７パーセント陽性のプロットである。ＮＫ細胞数は、全用量レベルでビヒクル対照を有意に超えて増大し、投与後２４０時間までにベースラインに戻る。全用量レベルは、ＮＫ細胞においてＫｉ－６７パーセント陽性の強力な増大を誘導する。

【0288】

図３２Ｃは、実施例１７に記載される０．０３及び０．３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１の単回（実線）又はＱ７ｄｘ３（破線）投与後のハツカネズミＮＫ細胞数のプロットである。０．３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１の反復投与は、単回投与と比較して、僅かに少ないＮＫ細胞数を誘導したが、なお有意であった。同様のＮＫ数が０．０３ｍｇ／ｋｇの単回、対、反復投与で達成された。

【0289】

結果：０．０３以上の用量レベルのコンジュゲート１は、血液中の総ＣＤ８ Ｔ細胞の有意な増加を誘導する。最低用量の０．０１ｍｇ／ｋｇは、ＣＤ８ Ｔｃｍ（中央記憶）及びＣＤ８ Ｔｅｍ（エフェクター記憶）を増大させた。０．３ｍｇ／ｋｇでは、コンジュゲート１は、ＣＤ８、ＣＤ８ Ｔｃｍ及びＣＤ８ Ｔｅｍを各々６．４Ｘ、３７．９Ｘ及び１４．５Ｘ増大させた。注目すべきことに、ＣＤ８及びＣＤ８記憶Ｔ細胞数は、コンジュゲート１が０．３～１．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合、注射後の２４０時間でベースラインに戻らず、コンジュゲート１の有益な持続性のＰＤ効果が示された。

【0290】

実施例１８
コンジュゲート１で処置したマウスにおけるインビトロＮＫ細胞毒性の測定、及び血液ＮＫ細胞グランザイムＢ分析
Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝２／グループ）を、コンジュゲート１（０．００６、０．０３又は０．３ｍｇ／ｋｇ）、ＩＬ－１５（１ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクル対照で処置した。処置後、脾臓を、ＮＫ細胞単離のために２４、７２、及び９６時間で単離した。磁石ベースのネガティブ選択方法によりＮＫ細胞を単離し、１２．５：１、２５：１及び５０：１ ＮＫ（エフェクター）対ＹＡＣ－１（標的細胞）比（Ｅ：Ｔ）で３７Ｃ、５％ ＣＯ_２で４時間インキュベートした。ＹＡＣ－１標的細胞を前標識し、次いでＮＫ細胞インキュベーション後に７ＡＡＤで染色した。溶解した（７ＡＡＤ＋）標的細胞（ＰＫＨ２６＋）の検出をフローサイトメトリーにより行った。これらのマウスからの血液も同じ時点で収集し、ＮＫ細胞のグランザイムＢの発現のフローサイトメトリー測定に供した。結果を図３３Ａ及び３３Ｂに示す。

【0291】

図３３Ａは、マウスにおける試験物品処置後のＮＫ媒介標的細胞溶解における変化を測定するインビトロでのＮＫ細胞毒性アッセイを示す。０．００６、０．０３又は０．３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１又は１ｍｇ／ｋｇのＩＬ－１５で処置したｂａｌｂ／ｃマウスから単離した脾臓ＮＫ細胞によるＹＡＣ－１細胞のパーセント特異的溶解の、示される時間における時間経過を示す。ビヒクルを投与したマウスからの脾臓ＮＫ細胞は、対照としての役割を果たした。

【0292】

結果：０．３ｍｇ／ｋｇで投与されたコンジュゲート１は、１ｍｇ／ｋｇのＩＬ－１５の単回注射を受けたマウスからのＮＫ細胞と比較して、規模及び持続時間において上回る、ＮＫ細胞毒性の上昇を誘導した。

【0293】

図３３Ｂは、図３３ＡにおいてＮＫインビトロ細胞毒性アッセイに捧げられた同じマウスからの血液ＮＫ細胞におけるグランザイムＢパーセント陽性のグラフである。

【0294】

結果：０．０３及び０．３ｍｇ／ｋｇで投与されたコンジュゲート１は、ＮＫグランザイムＢ発現の有意な増大を誘導し、０．３ｍｇ／ｋｇでは強力な及び持続性の上昇が見られた。

【0295】

実施例１９
ＣＴ－２６肺転移モデルにおけるコンジュゲート１単回薬剤有効性
Ｂａｌｂ／ｃマウスは、１ｘ１０^５ ＣＴ－２６結腸直腸癌細胞の尾静脈注射を受容した。翌日、マウス（ｎ＝９／グループ）をコンジュゲート１（０．０３又は０．３ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクル対照で毎週、２回処置した。第２の注射から５日後、マウスを人道的に犠牲にし、肺小結節を計数した。結果を図３４Ａ及び３４Ｂに提供する。

【0296】

図３４Ａ及び３４Ｂは、静脈内ＣＴ－２６腫瘍細胞注射を受容した後、０．０３又は０．３ｍｇ／ｋｇで１週間隔でコンジュゲート１処置を２回投与された、ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるパーセント肺小結節阻害を示す。

【0297】

結果：０．０３及び０．３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１注射は、各々、肺小結節形成を４０及び８０％阻害した。０．３ｍｇ／ｋｇで投与された同じマウスは、次いで３２日間のその後の腫瘍細胞注射を受けて、生存を評価した。コンジュゲート１を用いた処置は、ビヒクル対照を受容した腫瘍注入マウスと比較して生存を有意に増大させた。

【0298】

実施例２０
ＣＴ－２６肺転移モデルにおけるコンジュゲート２有効性のＮＫ細胞依存性の評価
ＣＴ－２６マウス（ｎ＝７－１１／グループ）に抗アシアロＧＭ１又は２つの異なる対照（ＩｇＧ又はＰＢＳ）を注入してＮＫ細胞を枯渇させ、次いで１ｘ１０^５ ＣＴ－２６腫瘍細胞を注入した。次いで、腫瘍細胞注射又はビヒクル対照後の１、５及び１０日目に投与した０．３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート２でマウスを処置した。マウスを犠牲にし、処置の最終日から３日後に肺小結節を計数した。結果を図３５に示す。

【0299】

図３５は、ＮＫ細胞（オリーブグリーン色）、ＩｇＧ対照（青色）、又はＰＢＳ（橙色）の抗体媒介枯渇を受けた、コンジュゲート２で処置したＣＴ－２６注入マウスにおけるパーセント肺小結節阻害を示すグラフである。データは、ＣＴ－２６注入マウスに対する、ＮＫ細胞枯渇されず、ビヒクル対照（黒色）で処置されたパーセント肺小結節阻害として表される。この腫瘍モデルにおけるコンジュゲート２の有効性は、マウスがＮＫ細胞を欠いていた場合、消失した。

【0300】

実施例２１
非ヒト霊長類におけるコンジュゲート１の単回投与のインビボ薬力学的研究
この研究では、カニクイザル（ｃｙｎｏ）、１匹の雌及び１匹の雄に、各々、単回用量のコンジュゲート１（０．１ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した。一連の血液サンプルを１４日の時間経過にわたり各動物から採取し、様々なリンパ球（ＣＤ８ Ｔ細胞、総ＣＤ８、ＣＤ８中央記憶Ｔ細胞（Ｔｃｍ）及びＣＤ８エフェクター記憶Ｔ細胞（Ｔｅｍ）のＫｉ－６７パーセント陽性、ＮＫ細胞及びＮＫ細胞のＫｉ－６７パーセント陽性）のフローサイトメトリー分析に供した。結果を、図３６Ａ～Ｄ及び３７Ａ～Ｂに提供する。

【0301】

図３６Ａ及び３６Ｂは、用量０．１ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１を静脈内投与後の１匹の雄（点線）及び１匹の雌（実線）ｃｙｎｏの、増殖の尺度としてのＣＤ８細胞数及びＫｉ－６７パーセント陽性に関する２週間の時間経過を示すプロットである。理解し得るように、コンジュゲート１は、ｃｙｎｏにおいて有意なＣＤ８ Ｔ細胞増加を誘導し、単回投与後に細胞数は７～１０Ｘ増加する。

【0302】

図３６Ｃ及び３６Ｄは、コンジュゲート１の単回注射後のｃｙｎｏＣＤ８ Ｔｃｍ及びＣＤ８ Ｔｅｍ細胞数の増加を示す。ＣＤ８ Ｔｃｍ及びＴｅｍ数は、各々、２７～３０Ｘ及び２１～３３Ｘ増加した。

【0303】

図３７Ａ及び３７Ｂは、ｃｙｎｏにおける０．１ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１の単回投与後のＮＫ細胞数及びＫｉ－６７パーセント陽性のグラフである。ＮＫ細胞は、コンジュゲート１を用いた処置後に９～１０Ｘ増大した。

【0304】

実施例２２
ヒトＰＢＭＣにおけるＣＤ８及びＣＤ５６ ＢＲＩＧＨＴ ＮＫ細胞内のＩＬ－１５及びコンジュゲート１のインビトロ活性の比較
ヒトＰＢＭＣを用量範囲０．００１～１００００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５又はコンジュゲート１で処置した後のＮＫ及びＣＤ８ ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達を調べることによって、コンジュゲート１のインビトロ活性の評価を行った。ＳＴＡＴ５リン酸化を前述したように評価した。

【0305】

【表12】

【0306】

結果を図３８Ａ及び３８Ｂに提供する；これらの図は、ヒトＰＢＭＣのＩＬ－１５（●）、対、コンジュゲート１（■）処置に関するＥＣ５０曲線、及び続くＣＤ８及びＣＤ５６ ｂｒｉｇｈｔ ＮＫ細胞におけるｐＳＴＡＴ５パーセント陽性の測定値である。

【0307】

結果：コンジュゲート１は、ＣＤ８及びＣＤ５６ ｂｒｉｇｈｔ ＮＫ細胞の関与において、ＩＬ－１５よりも各々５．５及び１５Ｘ強力でない。しかしながら、重要なことに、コンジュゲート１は従来のＩＬ－１５と同じ最大応答を達成する。

【0308】

実施例２３
インビボ研究：マウスにおける単回投与ＰＫ研究
Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３／グループ）に、静脈内単回用量のＩＬ－１５（５００ｕｇ／ｋｇ）又はコンジュゲート１を１０、３０、１００、３００及び１０００μｇ／ｋｇで投与した。血液サンプルを投与後の示された時点（コンジュゲート１：２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、２４０時間；ＩＬ－１５対照：０．０３、０．０８、０．２５、０．５、１、２、４、６、８、時間）で収集し、薬物の血漿濃度を決定した。図３９を参照されたい。

【0309】

図３９に示すように、コンジュゲート１は、非長時間作用型ＩＬ－１５で観察された血漿レベルと比較して、約１４時間の半減期で、延長した薬物動態、測定可能な血漿中濃度を示し、急速に除去された。

【0310】

実施例２４
インビボ研究：ラットにおける単回投与ＰＫ研究
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝３）に、静脈内単回用量のコンジュゲート１を１０、７５及び１５０μｇ／ｋｇで投与した。薬物の血漿濃度を、注射後の示された時点（０．０３、０．０８、０．２５、０．５、１、２、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４時間）で決定した。図４０を参照されたい。

【0311】

図４０に示すように、コンジュゲート１は、非長時間作用型ＩＬ－１５で投与後に観察された血漿レベルと比較して、約１８時間の半減期で、持続性の薬物動態、測定可能な血漿中濃度を示し、急速に除去された。

【0312】

実施例２５
インビボ研究：非ヒト霊長類における単回投与ＰＫ研究
カニクイザル（ｎ＝２、１匹の雄及び１匹の雌）に、１０、５０及び１００μｇ／ｋｇのコンジュゲート１の静脈内単回用量を投与した。対照として５０μｇ／ｋｇのＩＬ－１５を静脈内単回用量として投与した。薬物の血漿濃度を、注射後の示された時点（０．０３、０．２５、１、４、１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８時間）で決定した。図４１を参照されたい。

【0313】

図４１に示すように、コンジュゲート１は、１００μｇ／ｋｇ用量に関して、非長時間作用型ＩＬ－１５と比較して、約３０時間の半減期で、持続性の薬物動態、測定可能な血漿中濃度を示し、血漿から急速に除去された。

【0314】

コンジュゲート１は、単回投与後に複数の種（マウス、ラット及びカニクイザル）にわたって、延長した及び持続性の血漿暴露を達成した（図３９～４１参照）。

【0315】

実施例２６
インビボ研究：マウスにおける単回投与ＰＤ研究－細胞数、増殖及びＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達の関与
Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３／グループ）に、静脈内単回用量のビヒクル（実施例１１に記載される）又は用量０．３ｍｇ／ｋｇ若しくは０．０３ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１を投与した。投与後、血液サンプルを投与後の時点（２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間及び２４０時間）で収集した。サンプルを、示された時点で、ＣＤ４ Ｔ細胞数（図４２Ａ参照）及び％Ｋｉ－６７（図４２Ｂ参照）に関する免疫表現型検査に供した。

【0316】

ＣＤ４ Ｔ細胞及びそれらの増殖を、各々、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８－及びＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８－Ｋｉ－６７＋マーカーにより同定した。図４２Ａは、ＣＤ４ Ｔ細胞数のプロットであり、図４２Ｂは、％Ｋｉ－６７陽性により経時的に測定したＣＤ４ Ｔ細胞増殖のプロットである。ＣＤ４ Ｔ細胞は、コンジュゲート１処置に対する最小感受性集団であり、ＣＤ８及びＮＫ細胞と比較して低い数及び％Ｋｉ－６７発現の増大を有した（用量後７２～１４４時間に観察）（例えば、実施例１１参照）。マウスにおいて、ＮＫ細胞は増殖性応答においてコンジュゲート１の単回投与による刺激に対して、ＣＤ４ Ｔ細胞又はＣＤ８ Ｔ細胞よりも感受性であった。

【0317】

ＣＤ４ Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化を、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８－ ｐＳＴＡＴ５＋マーカーの組み合わせを用いて決定した。図４３は、用量０．０３ｍｇ／ｋｇ（青色、中実四角形）又は０．３ｍｇ／ｋｇ（橙色、中実丸）におけるＣＤ４ Ｔ細胞内のｐＳＴＡＴ５リン酸化パーセント陽性の経時的な（投与後０．２５、１、６、２４、４８、７２、９６及び１２０時間の）プロットである。ビヒクルの経時的な（黒色）及び投与前（白丸）レベルも示される。

【0318】

結果：ＣＤ４ Ｔ細胞は、コンジュゲート１処置に対する最小感受性集団であり、ＣＤ８及びＮＫ細胞と比較して低いｐＳＴＡＴ５発現の増大を有した（用量後０．２５～７２時間に観察）。マウスにおいて、ＮＫ細胞は増殖性応答において単回投与のコンジュゲート１刺激に対してＣＤ８ Ｔ細胞又はＣＤ４ Ｔよりも感受性である。

【0319】

実施例２７
インビボ研究：非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における最小有効用量研究
カニクイザル（ｎ＝３～４雄）に、０．００３、０．０１、０．１ｍｇ／ｋｇのコンジュゲート１又はビヒクル対照の静脈内単回注射を投与した。血液サンプルを投与前及び投与後の示された時点（－５、－２、１、２、３、４、５、６、７、１０、１４、１７日目）で収集し、フローサイトメトリー分析に供して、リンパ球集団内の薬力学的効果を調べた。ＮＫ、ＣＤ８ Ｔ、及びＣＤ４ Ｔ細胞の細胞数を調べ、結果を図４４Ａ～Ｃに示す。ＮＫ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、及びＣＤ４ Ｔ細胞に関する増殖（％Ｋｉ－６７）及びＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達（％ｐＳＴＡＴ５）を調べ、結果を各々図４５Ａ～Ｃ及び図４６Ａ～Ｃに示す。ＣＤ８亜集団（Ｔ_天然、Ｔ_ｅｍ、Ｔ_ｃｍ及びＴ_ｓｃｍ）の増殖（％Ｋｉ－６７）を調べ、結果を図４７Ａ～Ｄに示す。

【0320】

ＮＨＰにおいて、ＮＫ（ＣＤ４５＋ＣＤ３－ＣＤ１６＋）細胞数は、コンジュゲート１の単回投与後に実質的に及び用量依存的に増加した。０．１及び０．０１ｍｇ／ｋｇ用量レベルで、最大細胞数を投与から５日後に観察し、１４日目まで持続した。ＮＫ細胞の有意な増加をもたらす最低用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇであった。ＮＫ細胞数の観察の裏付けとして、コンジュゲート１はまたＫｉ－６７発現の用量依存的な及び強力な誘導を推進し、これは処置から約３～４日後に最大に達し、約１４日目まで持続し得る。％Ｋｉ－６７の有意な増大は、０．００１ｍｇ／ｋｇ用量レベルの次に検出され得る。コンジュゲート１はまた、ＮＫ細胞におけるＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路に強く関与し、０．００１ｍｇ／ｋｇもの低い用量レベルで％ｐＳＴＡＴ５の用量依存的増加が検出され得る。

【0321】

図４４Ａ、４５Ａ及び４６Ａは、各々、コンジュゲート１処置後の経時的なＮＫ細胞数、％Ｋｉ－６７及び％ｐＳＴＡＴ５のプロットである。

【0322】

ＮＨＰにおいて、コンジュゲート１は、総ＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８＋として規定）のかなりの増大を誘導し、最大細胞数は処置からほぼ５日後に達成された。この効果は７日間持続し、投与後の１０～１４日でベースラインに戻った。総ＣＤ８細胞数に対するコンジュゲート１の効果は、０．００３ｍｇ／ｋｇで検出し得る。これらの発見の支持として、コンジュゲート１はＣＤ８ Ｔ細胞において低用量の０．０１ｍｇ／ｋｇで検出可能な大量の％Ｋｉ－６７陽性を誘導する。ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路のコンジュゲート１関与もＣＤ８ Ｔ細胞内で強力であり、０．１及び０．０１ｍｇ／ｋｇ用量レベルでｐＳＴＡＴ５が用量依存的に増加する。

【0323】

図４４Ｂ、４５Ｂ及び４６Ｂは、各々、コンジュゲート１処置後のＣＤ８細胞数、％Ｋｉ－６７及び％ｐＳＴＡＴ５の経時的なプロットである。

【0324】

コンジュゲート１は、ＮＨＰにおいて、ＮＫ及びＣＤ８ Ｔ細胞と比較して、総ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８－として規定）に対して低い効果を有する。最大用量レベル０．１ｍｇ／ｋｇで投与されたコンジュゲート１は、ＣＤ４ Ｔ細胞数、％Ｋｉ－６７及び％ｐＳＴＡＴ５において低い増大を誘導した。

【0325】

図４４Ｃ、４５Ｃ及び４６Ｃは、各々、コンジュゲート１処置後のＣＤ４ Ｔ細胞数、％Ｋｉ－６７及びｐＳＴＡＴ５の経時的なプロットである。

【0326】

ＮＫ細胞は、ＮＨＰにおいて、ＣＤ８ Ｔ細胞又はＣＤ４ Ｔ細胞と比較して、インビボでコンジュゲート１用量応答において最も感受性である。

【0327】

カニクイザルにおいて、ＣＤ８天然及び記憶亜集団をＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ１９７及びＣＤ９５により規定した。ＣＤ８ Ｔ天然（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８＋ＣＤ４５Ｒａ＋ＣＤ１９７＋）、ＣＤ８ Ｔｓｃｍ（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８＋ＣＤ４５Ｒａ＋ＣＤ１９７＋ＣＤ９５＋）、ＣＤ８ Ｔｅｍ（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８＋ＣＤ４５Ｒａ－ＣＤ１９７－）及びＣＤ８ Ｔｃｍ（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８＋ＣＤ４５Ｒａ－ＣＤ１９７＋）の増殖（％Ｋｉ－６７）の試験により、ＣＤ８天然Ｔ細胞と比較して、コンジュゲート１に対するＣＤ８記憶亜集団の増大した感受性が明らかとなった。ＣＤ８ Ｔｅｍ、Ｔｃｍ及びＴｓｃｍ集団内で、コンジュゲート１は強力な％Ｋｉ－６７発現を用量依存的に誘導し、増殖マーカー陽性の検出可能な増大は早くも２日目に開始し、５日目に最大に達し、１０～１４日目にベースラインに戻った。ＣＤ８集団内のＫｉ－６７発現及び動態は、実施例２７及び図４７Ａ～Ｄに示されるＣＤ８ Ｔ細胞数の持続性の増大を支持する。

【0328】

図４７Ａ～Ｄは、コンジュゲート１処置後のＣＤ８ Ｔ_天然、Ｔ_ｓｃｍ、Ｔ_ｃｍ及びＴ_ｅｍ集団の％Ｋｉ－６７の経時的なプロットである。図から明らかなように、ＣＤ８ Ｔ細胞記憶集団は、ＮＨＰにおいて、天然ＣＤ８ Ｔ細胞と比較して、インビボで単回投与のコンジュゲート１に対して増大した感受性を示した。

【0329】

実施例２８
コンジュゲート１によるグランザイムＢ又はパーフォリンの誘導
カニクイザルにおけるコンジュゲート１の単回投与後のＮＫ細胞溶解性酵素、グランザイムＢ及びパーフォリンの発現を調べた。グランザイムＢ及びパーフォリンの発現レベルを、ＮＫ細胞内での平均蛍光強度（ＭＦＩ）により０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ又は０．１ｍｇ／ｋｇ用量レベルで定量化した。コンジュゲート１は、０．０１及び０．１ｍｇ／ｋｇで、グランザイムＢのＭＦＩを約３倍（ピーク、対、投与前）増大させた。コンジュゲート１はまた０．０１及び０．１ｍｇ／ｋｇでパーフォリンのＭＦＩを約２倍（ピーク、対、投与前）増大させた。総じて、コンジュゲート１は、ＮＫ細胞の強力な拡大を誘導するだけでなく、それらの機能も向上させ得る。

【0330】

図４８Ａ～Ｃは、ＮＨＰにおけるコンジュゲート１処置（０．０００１～０．１ｍｇ／ｋｇ）後の、投与前（ベースライン）及びピークレベル時のグランザイムＢのプロットであり、図４９Ａ～Ｃは、パーフォリンＭＦＩのプロットである。

【0331】

コンジュゲート１は、ＮＨＰ ＮＫ細胞において、グランザイムＢ及びパーフォリンを構成的に発現させるなど、細胞毒性酵素のタンパク質レベルを増大させる。

【0332】

配列表
配列番号１（ｒｈＩＬ－１５）

【化28】

配列番号２

【化29】

配列番号３

【化30】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A-8B】

【図9A-9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B-12C】

【図12D】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15A-15B】

【図16A-16B】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22A】

【図22B-22C】

【図22D】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28A-28B】

【図28C-28D】

【図29A-29B】

【図29C】

【図30A】

【図30B-30C】

【図30D-30E】

【図30F】

【図31A】

【図31B-31C】

【図32A-32B】

【図32C】

【図33A】

【図33B】

【図34A-34B】

【図35】

【図36A】

【図36B】

【図36C】

【図36D】

【図37A】

【図37B】

【図38A】

【図38B】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42A-42B】

【図43】

【図44A-44C】

【図45A-45C】

【図46A-46C】

【図47A-47D】

【図48A-48C】

【図49A-49C】

【配列表】

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