特許 7317017 Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ワクチンおよびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-07-20

(45)【発行日】2023-07-28

(54)【発明の名称】Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ワクチンおよびその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/29 20060101AFI20230721BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230721BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20230721BHJP

   A61K 39/295 20060101ALI20230721BHJP

   A61P 31/20 20060101ALI20230721BHJP

   C12N 15/51 20060101ALI20230721BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20230721BHJP

【ＦＩ】

A61K39/29

A61K35/76

A61K35/761

A61K39/295

A61P31/20

C12N15/51 ZNA

C12N15/62 Z

【請求項の数】 32

(21)【出願番号】P 2020533746

(86)(22)【出願日】2018-12-18

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-03-18

(86)【国際出願番号】 IB2018060259

(87)【国際公開番号】W WO2019123252

(87)【国際公開日】2019-06-27

【審査請求日】2021-12-10

(31)【優先権主張番号】PCT/IB2017/058142

(32)【優先日】2017-12-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】IB

(31)【優先権主張番号】62/607,426

(32)【優先日】2017-12-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】510020022

【氏名又は名称】ヤンセン・サイエンシズ・アイルランド・アンリミテッド・カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100093676

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100149010

【弁理士】

【氏名又は名称】星川 亮

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】ボーデン，ダニエル

(72)【発明者】

【氏名】ホートン，ヘレン

(72)【発明者】

【氏名】ネーフス，ジャン－マルク エドモンド フェルナンド マリー

(72)【発明者】

【氏名】ロイ，スミトラ

(72)【発明者】

【氏名】デ プーター，ドリエン

【審査官】春日 淳一

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１４－５２７４０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／１７６３１９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２００５－５０５２３８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ，Ａ６１Ｐ，Ｃ１２Ｎ

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の天然に存在しない核酸分子であって、前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有しない、第１の天然に存在しない核酸分子；
（ｂ）配列番号２または配列番号１４と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の天然に存在しない核酸分子；および
（ｃ）薬学的に許容可能な担体、
を含む組成物であって、
前記第１の天然に存在しない核酸分子および前記第２の天然に存在しない核酸分子が、同じ天然に存在しない核酸分子または２つの異なる天然に存在しない核酸分子に存在し、
前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原および前記切断型ＨＢＶコア抗原が、哺乳動物において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、ＣおよびＤに対するＴ細胞応答を誘導することが可能である、組成物。

【請求項2】

前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原および前記切断型ＨＢＶコア抗原が、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能である、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記第１の天然に存在しない核酸分子および前記第２の天然に存在しない核酸分子が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）プラスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、バクテリオファージ、リボ核酸（ＲＮＡ）レプリコン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レプリコン、改変ｍＲＮＡレプリコン、または自己増幅ｍＲＮＡ、および完全閉鎖線形デオキシリボ核酸からなる群から選択される非ウイルスベクターに含まれる、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記第１の天然に存在しない核酸分子および前記第２の天然に存在しない核酸分子が、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、腸内ウイルスベクター、ベネズエラウマ脳炎ウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、タバコモザイクウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アレナウイルスウイルスベクター、複製欠損アレナウイルスウイルスベクターまたは複製コンピテントアレナウイルスウイルスベクター、２分節または３分節アレナウイルス、感染性アレナウイルスウイルスベクター、ゲノム分節の１つのオープンリーディングフレームが欠失しているかまたは機能的に不活化されており、かつＨＢＶ抗原をコードする核酸に置換されている、アレナウイルスゲノム分節を含む核酸、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、およびフニンウイルスからなる群から選択されるウイルスベクターに含まれる、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記第１の天然に存在しない核酸分子および前記第２の天然に存在しない核酸分子が、同じ天然に存在しない核酸に存在し、前記同じ天然に存在しない核酸が、個々のＨＢＶコアおよびＨＢＶポリメラーゼ抗原が単一のｍＲＮＡ転写物から発現されるバイシストロニック発現ベクターであり、前記バイシストロニック発現ベクターが、リボソーム翻訳スリップ部位またはシス－ヒドロラーゼ部位コード配列をさらに含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

請求項１に記載の組成物を含むキット。

【請求項7】

前記第１のポリヌクレオチドが、配列番号４と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードし、前記第２のポリヌクレオチドが、配列番号２または配列番号１４のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードする、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物またはキット。

【請求項8】

前記第１のポリヌクレオチドが、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物またはキット。

【請求項9】

前記第１の天然に存在しない核酸分子および前記第２の天然に存在しない核酸分子の少なくとも１つが、前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原および前記切断型ＨＢＶコア抗原の少なくとも１つに作動可能に連結されたシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物またはキット。

【請求項10】

前記シグナル配列が、独立して配列番号６または配列番号１９のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の組成物またはキット。

【請求項11】

前記第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号３または配列番号１６と少なくとも９０％同一である、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物またはキット。

【請求項12】

前記第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号３または配列番号１６のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１１に記載の組成物またはキット。

【請求項13】

前記第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１または配列番号１５と少なくとも９０％同一である、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物またはキット。

【請求項14】

前記第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１または配列番号１５のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の組成物またはキット。

【請求項15】

前記第１の天然に存在しない核酸分子および前記第２の天然に存在しない核酸分子が同じベクターに存在する、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物またはキット。

【請求項16】

前記ベクターが、任意選択でリンカーを介して、前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結された前記切断型ＨＢＶコア抗原を含む融合タンパク質をコードする、請求項１５に記載の組成物またはキット。

【請求項17】

前記融合タンパク質が、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の組成物またはキット。

【請求項18】

前記ベクターが、５’末端から３’末端に、プロモーター配列、エンハンサー配列、シグナルペプチドコード配列、前記第２のポリヌクレオチド配列、リンカーコード配列、前記第１のポリヌクレオチド配列、およびポリアデニル化シグナル配列を含有する、請求項１６または請求項１７に記載の組成物またはキット。

【請求項19】

前記ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項１８に記載の組成物またはキット。

【請求項20】

前記アデノウイルスベクターが、配列番号１７のポリヌクレオチド配列を含む前記プロモーター配列、配列番号２３のポリヌクレオチド配列を含む調節配列、配列番号１８のポリヌクレオチド配列を含む前記シグナルペプチドコード配列、配列番号１５のポリヌクレオチド配列を含む前記第２のポリヌクレオチド配列、配列番号２２のポリヌクレオチド配列を含む前記リンカーコード配列、配列番号１６のポリヌクレオチド配列を含む前記第１のポリヌクレオチド配列、および配列番号２４のポリヌクレオチド配列を含む前記ポリアデニル化シグナル配列を含有する、請求項１９に記載の組成物またはキット。

【請求項21】

前記第１の天然に存在しない核酸分子および前記第２の天然に存在しない核酸分子が、２つの異なるベクターに存在する、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物またはキット。

【請求項22】

前記第１の天然に存在しない核酸分子が第１のプラスミドＤＮＡベクターに存在し、前記第２の天然に存在しない核酸分子が第２のプラスミドＤＮＡベクターに存在する、請求項２１に記載の組成物またはキット。

【請求項23】

前記第１および前記第２のプラスミドＤＮＡベクターの各々が、複製開始点、抗生物質耐性遺伝子、ならびに５’末端から３’末端に、プロモーター配列、調節配列、シグナルペプチドコード配列、前記第１のポリヌクレオチド配列または前記第２のポリヌクレオチド配列、およびポリアデニル化シグナル配列を含む、請求項２２に記載の組成物またはキット。

【請求項24】

前記抗生物質耐性遺伝子が、配列番号１２と少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド配列を有するカナマイシン耐性遺伝子である、請求項２３に記載の組成物またはキット。

【請求項25】

前記組成物またはキットが、
（ａ）３’末端から５’末端に、配列番号７のポリヌクレオチド配列を含む前記プロモーター配列、配列番号８のポリヌクレオチド配列を含む前記調節配列、配列番号５のポリヌクレオチドを含む前記シグナルペプチドコード配列、配列番号３のポリヌクレオチド配列を含む前記第１のポリヌクレオチド配列、および配列番号１１のポリヌクレオチド配列を含む前記ポリアデニル化シグナル配列を含む第１のプラスミドＤＮＡベクター；
（ｂ）３’末端から５’末端に、配列番号７のポリヌクレオチド配列を含む前記プロモーター配列、配列番号８のポリヌクレオチド配列を含む前記調節配列、配列番号５のポリヌクレオチド配列を含む前記シグナルペプチドコード配列、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む前記第２のポリヌクレオチド配列、および配列番号１１のポリヌクレオチド配列を含む前記ポリアデニル化シグナル配列を含む第２のプラスミドＤＮＡベクター；ならびに
（ｃ）薬学的に許容可能な担体、
を含み、
前記第１のプラスミドＤＮＡベクターおよび前記第２のプラスミドＤＮＡベクターの各々が、配列番号１２のポリヌクレオチド配列を有するカナマイシン耐性遺伝子、および配列番号１０のポリヌクレオチド配列を有する複製開始点をさらに含み、ならびに
前記第１のプラスミドＤＮＡベクターおよび前記第２のプラスミドＤＮＡベクターが、同じ組成物または２つの異なる組成物に存在する、
請求項２４に記載の組成物またはキット。

【請求項26】

配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む天然に存在しない核酸分子であって、前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原が逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有さず、前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、哺乳動物において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、ＣおよびＤに対するＴ細胞応答を誘導することが可能である、天然に存在しない核酸分子。

【請求項27】

任意選択でリンカーを介して前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原を含む融合タンパク質をコードする、請求項２６に記載の天然に存在しない核酸分子。

【請求項28】

前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能である、請求項２６に記載の天然に存在しない核酸分子。

【請求項29】

それを必要とする対象においてＢ型肝炎ウイルスに対する免疫応答を誘導するのに用いるための、請求項１～６または２６～２８のいずれか１項に記載の組成物、キット、または天然に存在しない核酸分子。

【請求項30】

それを必要とする対象においてＨＢＶ感染症を治療するのに用いるための、請求項１～６または２６～２８のいずれか１項に記載の組成物、キット、または天然に存在しない核酸分子。

【請求項31】

前記対象が、慢性ＨＢＶ感染症を有する、請求項２９に記載の組成物、キット、または核酸分子。

【請求項32】

前記対象が、慢性ＨＢＶ感染症を有する、請求項３０に記載の組成物、キット、または核酸分子。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１７年１２月１９日に提出された国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２０１７／０５８１４２号明細書、および２０１７年１２月１９日に提出された米国特許仮出願第６２／６０７，４２６号明細書の優先権を主張する。

【0002】

電子提出された配列表の参照
本出願は、作成日が２０１８年１２月１０日で、サイズ４６．６ＫＢを有するファイル名「６８８０９７－４０３ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ」を有するＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子提出された配列表を含有する。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

【0003】

発明の背景
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、４つのオープンリーディングフレームおよび７つのタンパク質をコードする小さい３．２ｋｂの肝臓指向性ＤＮＡウイルスである。約２０億人の人がＨＢＶに感染しており、およそ２億４０００万人の人が、血液中のウイルスおよびサブウイルス粒子が６ヶ月超持続することによって特徴付けられる慢性Ｂ型肝炎感染症（慢性ＨＢＶ）を有する（１）。持続性のＨＢＶ感染症は、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞受容体がウイルスペプチドおよび循環中の抗原によって慢性的に刺激されることにより、循環中および肝臓内のＨＢＶ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の枯渇をもたらす。その結果、Ｔ細胞の多機能性が減少する（すなわち、ＩＬ－２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α、ＩＦＮ－γレベルの減少、および増殖の欠如）。

【0004】

ＨＢＶ感染症に対する安全かつ有効な予防用ワクチンは、１９８０年代以降、利用できるようになり、Ｂ型肝炎予防の主流である（３）。世界保健機構は、全ての乳児のワクチン接種を推奨しており、Ｂ型肝炎の流行が低いまたは中間の国では、全ての子供および青年（年齢＜１８歳）、ならびにある特定のリスク集団カテゴリーの人々のワクチン接種を推奨している。ワクチン接種により、世界全体での感染率は劇的に低下した。しかし、予防用ワクチンは、確立されたＨＢＶ感染症を治癒しない。

【0005】

慢性的なＨＢＶは現在、ＩＦＮ－α、ならびにヌクレオシドまたはヌクレオチドアナログによって処置されているが、ウイルスＲＮＡの鋳型として、したがって新規ビリオンの鋳型として根本的な役割を果たす完全閉鎖環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）と呼ばれる細胞内ウイルス複製中間体が、感染した肝細胞において持続することにより、最終的な治癒は生じない。誘導されたウイルス特異的Ｔ細胞およびＢ細胞応答は、ｃｃｃＤＮＡを有する肝細胞を有効に排除することができると考えられている。ＨＢＶポリメラーゼを標的とする現行の治療は、ウイルス血症を抑制するが、核に存在するｃｃｃＤＮＡおよび関連する循環中の抗原の産生に及ぼす効果は限定的である。最も厳格な治癒の形態は、生物からのＨＢＶｃｃｃＤＮＡの排除であり得るが、これは自然の転帰としてもいずれかの治療介入の結果としても観察されていない。しかし、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の喪失は、臨床的に信頼できる治癒等価物であり、その理由は疾患の再発が重度の免疫抑制の場合に限って起こり得、これは予防的処置によって防止できるためである。このように、少なくとも臨床的見地から、ＨＢｓＡｇの喪失は、ＨＢＶに対する免疫再構成の最も厳格な形態に関連する。

【0006】

例えば、ｐｅｇ化インターフェロン（ｐｅｇＩＦＮ）－αによる免疫調節は、有限の一連の処置による非処置時の持続的応答に関して、ヌクレオシドまたはヌクレオチド治療と比較してより良好であることが証明されている。直接の抗ウイルス効果に加えて、ＩＦＮ－αは、細胞培養およびヒト化マウスにおいてｃｃｃＤＮＡの後成的抑制を発揮することが報告されており、これはビリオン生産性の低減および転写物の低減をもたらす（４）。しかし、この治療もなお副作用を伴い、理由の一部としてＩＦＮ－αがＨＢＶ特異的Ｔ細胞に及ぼす調節的影響がごくわずかであることから、全体的な応答はむしろ低い。特に、治癒率は低く（＜１０％）、毒性は高い。同様に、直接作用するＨＢＶ抗ウイルス剤、すなわちＨＢＶポリメラーゼ阻害剤であるエンテカビルおよびテノフォビルは、ウイルス抑制の誘導において単剤として有効であり、薬物耐性変異体の出現に対する遺伝的障壁が高く、肝疾患の進行を持続的に防止する。しかし、ＨＢｓＡｇの喪失またはセロコンバージョンによって定義される慢性Ｂ型肝炎の治癒が、そのようなＨＢＶポリメラーゼ阻害剤によって達成されることはめったにない。したがって、これらの抗ウイルス剤は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の抗レトロウイルス治療と同様に、理論的には、肝疾患の再発を防止するためにいつまでも投与する必要がある。

【0007】

治療的ワクチン接種は、慢性的に感染した患者からＨＢＶを排除する潜在性を有する（５）。多くの戦略が探索されているが、今日まで治療的ワクチン接種の成功は証明されていない。

【0008】

発明の簡単な概略
したがって、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、特に慢性的なＨＢＶの処置において、高い治癒率で忍容性が良好な有限の処置のアンメットメディカルニーズが存在する。本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症に対する免疫応答を誘導するための免疫原性組成物および方法を提供することによって、このニーズを満たす。本発明の免疫原性組成物および方法を使用して、慢性ＨＢＶ感染症を有する対象等の対象に治療免疫を提供することができる。

【0009】

全般的態様では、本出願は、切断型ＨＢＶコア抗原またはＨＢＶポリメラーゼ抗原等のＨＢＶ抗原をコードする天然に存在しない核酸分子に関する。本出願の実施形態に従うＨＢＶ抗原は、哺乳動物において少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答（液性および細胞性）を誘導する、好ましくは哺乳動物において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＴ細胞応答を誘導する、より好ましくはヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能なコンセンサス抗原である。

【0010】

一実施形態では、本出願の天然に存在しない核酸分子は、配列番号２または配列番号１４のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードし、天然に存在しない核酸分子は、配列番号１または配列番号１５と少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。好ましくは、天然に存在しない核酸分子は、配列番号１または配列番号１５のポリヌクレオチド配列を含む。

【0011】

一実施形態では、本出願の天然に存在しない核酸分子は、配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードし、ＨＢＶポリメラーゼ抗原は、逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有しない。好ましくは、ＨＢＶポリメラーゼ抗原は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。より好ましくは天然に存在しない核酸分子は、配列番号３または配列番号１６と少なくとも９０％同一である、最も好ましくは配列番号３または配列番号１６と１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。

【0012】

別の一般的な態様では、本出願は、本出願の天然に存在しない核酸分子を含むベクター、好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターに関する。

【0013】

別の一般的な態様では、本出願は、本出願の天然に存在しない核酸分子またはベクターを含む組換え宿主細胞に関する。

【0014】

別の一般的な態様では、本出願は、本出願の天然に存在しない核酸分子によってコードされる天然に存在しないポリペプチドに関する。

【0015】

なお別の一般的な態様では、本出願は、本出願の天然に存在しない核酸分子、ベクター、組換え宿主細胞、および天然に存在しないポリペプチドのうちの少なくとも１つ、ならびに薬学的に許容可能な担体を含む組成物に関する。

【0016】

別の一般的な態様では、本出願は：
（ａ）配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の天然に存在しない核酸分子であって、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有しない、第１の天然に存在しない核酸分子；
（ｂ）配列番号２または配列番号１４のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の天然に存在しない核酸分子；および
（ｃ）薬学的に許容可能な担体
を含む、免疫原性組合せ、特にキットであって
第１の天然に存在しない核酸分子および第２の天然に存在しない核酸分子が、同じ天然に存在しない核酸分子、または２つの異なる天然に存在しない核酸分子に存在する、免疫原性組合せに関する。

【0017】

一部の実施形態では、本出願の免疫原性組合せ、特にキットは、第１のベクターに存在する第１のポリヌクレオチドおよび第２のベクターに存在する第２のポリヌクレオチドを含む。好ましくは、第１のベクターは、第２のベクターとは異なる。より好ましくは、ベクターは、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである。より好ましくは、第１のベクターおよび第２のベクターの各々は、プラスミドＤＮＡベクターである。

【0018】

一実施形態では、本出願の免疫原性組合せ、特にキットは：
ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む第１のプラスミドＤＮＡベクター；
ｂ）配列番号２または１４のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のプラスミドＤＮＡベクター；および
ｃ）薬学的に許容可能な担体
を含み、
第１のプラスミドＤＮＡベクターおよび第２のプラスミドＤＮＡベクターの各々は、抗生物質耐性遺伝子、および複製開始点をさらに含み、ならびに
第１のプラスミドＤＮＡベクターおよび第２のプラスミドＤＮＡベクターは、同じ組成物または２つの異なる組成物に存在する。

【0019】

特定の実施形態では、本出願の免疫原性組合せ、特にキットは：
ａ）３’末端から５’末端に、配列番号７のポリヌクレオチド配列を含むプロモーター配列、配列番号８のポリヌクレオチド配列を含むエンハンサー配列、配列番号５のポリヌクレオチドを含むシグナルペプチドコード配列、配列番号３のポリヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチド配列、および配列番号１１のポリヌクレオチド配列を含むポリアデニル化シグナル配列を含む第１のプラスミドＤＮＡベクター；
ｂ）３’末端から５’末端に、配列番号７のポリヌクレオチド配列を含むプロモーター配列、配列番号８のポリヌクレオチド配列を含む調節配列、配列番号５のポリヌクレオチド配列を含むシグナルペプチドコード配列、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチド配列、および配列番号１１のポリヌクレオチド配列を含むポリアデニル化シグナル配列を含む第２のプラスミドＤＮＡベクター；ならびに
ｃ）薬学的に許容可能な担体、
を含み、
第１のプラスミドＤＮＡベクターおよび第２のプラスミドＤＮＡベクターの各々は、配列番号１２のポリヌクレオチド配列を有するカナマイシン耐性遺伝子、および配列番号１０のポリヌクレオチド配列を有する複製開始点をさらに含み、ならびに
第１のプラスミドＤＮＡベクターおよび第２のプラスミドＤＮＡベクターは、同じ組成物または２つの異なる組成物に存在する。

【0020】

他の実施形態では、本出願の免疫原性組合せ、特にキットは、同じベクターに存在する第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む。好ましくは、ベクターは、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである。より好ましくは、ベクターは、アデノウイルスベクター、例えばＡｄ２６またはＡｄ３５ベクターである。

【0021】

一実施形態では、本出願の免疫原性組合せ、特にキットは：
ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチド配列、および配列番号２または配列番号１４のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクター；ならびに
ｂ）薬学的に許容可能な担体
を含む。

【0022】

特定の実施形態では、本出願の免疫原性組合せ、特にキットは、５’末端から３’末端に、配列番号１７のポリヌクレオチド配列を含むプロモーター配列、配列番号２３のポリヌクレオチド配列を含む調節配列、配列番号１８のポリヌクレオチド配列を含むシグナルペプチドコード配列、配列番号１５のポリヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチド配列、配列番号２２のポリヌクレオチド配列を含むリンカーコード配列、配列番号１６のポリヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチド配列、および配列番号２４のポリヌクレオチド配列を含むポリアデニル化シグナル配列を含むウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクター、ならびに薬学的に許容可能な担体を含む。

【0023】

本出願の他の態様は、本出願のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、および組成物、ならびに免疫原性組合せまたはキットを製造する方法に関する。

【0024】

なお別の一般的な態様では、本出願は、それを必要とする対象においてＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、本出願の組成物または免疫原性組合せの免疫原性有効量を対象に投与するステップを含む方法に関する。好ましくは、方法は、対象において少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答、例えば抗体応答および／またはＴ細胞応答を誘導する。好ましくは、方法は、対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、ＣおよびＤに対するＴ細胞応答を誘導する。より好ましくは、方法は、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導する。一実施形態では、方法は、対象に、別の免疫原性剤、好ましくは別のＨＢＶ抗原を投与するステップをさらに含む。

【0025】

別の態様では、本出願は、それを必要とする対象におけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）誘導疾患を処置する方法であって、本出願の組成物または免疫原性組合せの治療有効量を対象に投与するステップを含む方法に関する。好ましくは、対象は慢性ＨＢＶ感染症を有し、ＨＢＶ誘導疾患は進行線維症、肝硬変、および肝細胞癌（ＨＣＣ）からなる群から選択される。一実施形態では、方法は、別の治療剤、好ましくは別の抗ＨＢＶ抗原を対象に投与するステップをさらに含む。

【0026】

本出願はまた、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する免疫応答の誘導に使用するための本出願の組成物、免疫原性組合せ、またはキット；およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する免疫応答を誘導するための医薬の製造における本出願の組成物、免疫原性組合せ、またはキットの使用にも関する。使用は、別の免疫原性剤、好ましくは別のＨＢＶ抗原との組合せをさらに含み得る。好ましくは、対象は慢性ＨＢＶ感染症を有する。

【0027】

本出願はさらに、それを必要とする対象におけるＨＢＶ誘導疾患の処置に使用するための本出願の組成物、免疫原性組合せ、またはキット、およびそれを必要とする対象におけるＨＢＶ誘導疾患を処置するための医薬の製造における本出願の組成物、免疫原性組合せ、またはキットの使用に関する。使用は、別の治療剤、好ましくは別のＨＢＶ抗原との組合せをさらに含み得る。好ましくは、対象は慢性ＨＢＶ感染症を有し、ＨＢＶ誘導疾患は、進行線維症、肝硬変、および肝細胞癌（ＨＣＣ）からなる群から選択される。

【0028】

発明の他の態様、特色および利点は、発明の詳細な記述、ならびにその好ましい実施形態および添付の特許請求の範囲を含む以下の開示から明らかであろう。

【0029】

図面の簡単な説明
発明の前述の概要、ならびに以下の詳細な説明は、添付の図面と共に読むとより良好に理解される。発明は、図面に示された実施形態そのものに限定されないと理解すべきである。
以下の図において：

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】図１Ａ～１Ｂは、Ｂ型肝炎ウイルスのゲノムおよびウイルス生活環を示す。図１Ａは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のゲノムの図であり、ネイティブウイルスでは、ポリメラーゼタンパク質（Ｐｏｌ）は、異なるオープンリーディングフレームにエンベロープタンパク質のコード配列を含有し、エンベロープタンパク質（ｐｒｅ－Ｓ１、ｐｒｅ－Ｓ２、およびＳ）は、同じオープンリーディングフレームに存在する。図１Ｂは、ＨＢＶのウイルス生活環を示す。

【図2-1】図２Ａ～２Ｈは、実施例１に記載の発現カセット、ならびにＨＢＶ ｐｏｌおよびコア抗原をコードするＤＮＡプラスミドの設計および最適化を示す。図２Ａは、ＨＢＶコアおよびｐｏｌ抗原のコード配列がインフレームで融合される発現戦略の略図である。図２Ｂは、コアおよびｐｏｌ抗原の両方のコード配列がリボソームＦＡ２翻訳スリップ部位によって単一のプラスミドから発現される発現戦略の略図を示す。図２Ｃは、コアおよびｐｏｌ抗原が２つの個別のプラスミドから発現される発現戦略の略図である。図２Ｄは、転写後調節エレメントＷＰＲＥの存在下および非存在下でコアを発現するプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるコア抗原発現のウェスタンブロットである；発現を、α－コア抗体を使用して細胞ライセート（左）および上清（ｓｕｐ、右）において試験した；図２Ｅは、ヒトアポリポタンパク質Ａ１前駆体に由来するイントロン／エクソン配列（「ＡＩイントロン」）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）長末端反復（ＬＴＲ）（「ＨＴＬＶ Ｒ」）の非翻訳Ｒ－Ｕ５ドメイン、またはＨＴＬＶ－１ ＬＴＲのトリプルエンハンサー複合配列、合成ウサギβ－グロビンイントロン、およびスプライシングエンハンサー（「トリプル」）を含むコア発現プラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるコア発現の比較を示すウェスタンブロット分析である；非標識レーンはサイズマーカーとしての精製コアタンパク質であり、発現をライセート（左）および上清（ｓｕｐ、右）の両方において試験した；コア抗原発現は、トリプルエンハンサー複合配列において最も高かった。図２Ｆは、ＨＢＶコア抗原のＮ末端に融合した異なるシグナルペプチドを使用するコア抗原分泌のウェスタンブロット分析である；最も効率的なタンパク質分泌は、シスタチンＳシグナルペプチドによって観察された。図２Ｇは、図２Ａ～２Ｃに例証した３つの発現戦略の各々に関する最適化されたＨＢＶコア／ｐｏｌ抗原発現カセットの略図である；ＣＭＶｐｒ：ヒトＣＭＶ－ＩＥプロモーター；ＴＲＥ：トリプルエンハンサー配列；ＳＰ：シスタチンＳシグナルペプチド；ＦＡ２：ＦＭＤＶリボソーム翻訳スリップ部位；ｐＡ：ＢＧＨポリアデニル化シグナル。図２Ｈは、図２Ｇに示す発現カセットの各々を含有するｐＤＫベクターのＨＢＶコアおよびｐｏｌ抗原発現のウェスタンブロット分析である；レーン１および２：ｐＤＫ－コア；レーン３および４：ｐＤＫ－ｐｏｌ；レーン５および６：ｐＤＫ－コアＦＡ２Ｐｏｌ；レーン７および８：ｐＤＫ－コア－ｐｏｌ融合体；細胞のおよび分泌されたコアおよびｐｏｌ抗原の最も一貫した発現プロファイルは、抗原が個別のベクターによってコードされる場合に観察された。

【図2-2】（前記の通り。）

【図3】図３Ａ～３Ｂは、本出願の実施形態に従うＤＮＡプラスミドの略図を示す。図３Ａは、本出願の実施形態に従うＨＢＶコア抗原をコードするＤＮＡプラスミドを示す。図３Ｂは、本出願の実施形態に従うＨＢＶポリメラーゼ（ｐｏｌ）抗原をコードするＤＮＡプラスミドを示す；ＨＢＶコアおよびｐｏｌ抗原は、ＣＭＶプロモーターの制御下で発現され、Ｎ末端シスタチンＳシグナルペプチドは、細胞からの分泌時に発現された抗原から切断される；プラスミドの転写調節エレメントは、ＣＭＶプロモーターとＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列との間に位置するエンハンサー配列、およびＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列の下流に位置するｂＧＨポリアデニル化配列を含む；第２の発現カセットは、プラスミドにおいて逆方向に含まれ、Ａｍｐ^ｒ（ｂｌａ）プロモーターの制御下でカナマイシン耐性遺伝子を含む；複製開始点（ｐＵＣ）もまた、逆方向に含まれる。

【図4】図４は、実施例２に記載するように、ＨＢＶコア抗原またはＨＢＶ ｐｏｌ抗原を発現する異なるＤＮＡプラスミドによって免疫したＢａｌｂ／ｃマウスのＥＬＩＳＰＯＴ応答を示す。様々なワクチン接種動物群から単離した脾細胞を刺激するために使用したペプチドプールをグレースケールで示し；応答性のＴ細胞の数を脾細胞１０^６個あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）として表記してｙ軸で示す。

【図5】図５は、実施例３に記載の用量設定試験に従ってＨＢＶコア抗原およびＨＢＶ ｐｏｌ抗原を発現するＤＮＡプラスミドの組合せによって免疫したＢａｌｂ／ＣマウスのＥＬＩＳＰＯＴ応答を示す。様々なワクチン接種動物群から単離した脾細胞を刺激するために使用したペプチドプールをグレースケールで示し；応答性のＴ細胞の数を脾細胞１０^６個あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）として表記してｙ軸に示す。

【図6】図６は、実施例４に記載の免疫干渉試験に従ってＨＢＶコア抗原およびＨＢＶ ｐｏｌ抗原を発現するＤＮＡプラスミド（ｐＤＮＡ）によって免疫したＢａｌｂ／ｃマウスのＥＬＩＳＰＯＴ応答を示す。群１、単一のコアｐＤＮＡ；群２、単一のＰｏｌ ｐＤＮＡ；群３、混合したコアおよびＰｏｌ ｐＤＮＡ；群４、異なる部位に個別に適用したコアおよびＰｏｌ ｐＤＮＡ；様々なワクチン接種動物群から単離した脾細胞を刺激するために使用したペプチドプールをグレースケールで示し、応答性のＴ細胞の数を脾細胞１０^６個あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）として表記してｙ軸に示す。

【図7】図７Ａおよび７Ｂは、実施例５に記載のＮＨＰにおける本出願の実施形態に従うＤＮＡワクチンの免疫原性を示す。図７Ａは、ＨＢＶコア抗原およびｐｏｌ抗原を発現するＤＮＡプラスミドによる免疫後のＩＦＮ－γサイトカイン応答を示す。ワクチン接種動物群から単離したＰＢＭＣを刺激するために使用したペプチドプールをグレースケールで示し；応答性のＴ細胞の数をＰＢＭＣ１０^６個あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）として表記してｙ軸に示す。図７Ｂは、フローサイトメトリーによって測定したコア、Ｐｏｌ－１、およびＰｏｌ－２ペプチドプールに対するＣＤ４およびＣＤ８ メモリーＴ細胞の免疫応答を示す；グラフは、７６日目の結果を、ＤＭＳＯ培地のみのバックグラウンドを各プールに関して差し引いた後の３つのプールに対する％ＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞応答（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、およびＴＮＦ－α）として示す；ＣＤ４応答を左に示し、ＣＤ８応答を右に示す。

【図8】図８Ａおよび８Ｂは、本出願の実施形態に従うアデノウイルスベクターにおける発現カセットの略図を示す。図８Ａは、ＣＭＶプロモーター、イントロン（ヒトＡｐｏＡＩ遺伝子に由来する断片－ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０１０３８、塩基対２９５～５２３、ＡｐｏＡＩの第２のイントロンを有する）、ヒト免疫グロブリン分泌シグナル、この後に続く切断型ＨＢＶコア抗原のコード配列およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含有する、切断型ＨＢＶコア抗原の発現カセットを示す。図８Ｂは、ＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原の融合タンパク質の発現カセットを示し、これは、ＨＢＶ抗原を除き、それ以外は切断型ＨＢＶコア抗原の発現カセットと同一である；ならびに

【図9】図９は、実施例８に記載のＨＢＶアデノウイルスベクターによって免疫したＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６×Ｂａｌｂ／Ｃ）におけるＥＬＩＳＰＯＴ応答を示す；様々なワクチン接種動物群から単離した脾細胞を刺激するために使用したＨＢＶコアまたはポリメラーゼペプチドプールを黒色（コア）および灰色（ｐｏｌ）で示す；Ｐｏｌ１およびｐｏｌ２応答を合計する；Ｘ軸は、アデノベクターの用量および実験群を示す。応答性のＴ細胞の数を、脾細胞１０^６個あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）として表記してｙ軸に示す。

【0031】

発明の詳細な記述
様々な刊行物、論文、および特許が、背景および本出願全体を通して引用または記載されているが、これらの参照の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。本明細書に含まれている文書、行為、材料、デバイス、品目等に関する考察は、本発明の内容を提供する目的のためである。そのような考察は、これらの事柄のいずれかまたは全てが、開示または特許請求される任意の本発明に関連して先行技術の一部を形成すると認めたわけではない。

【0032】

それ以外であると定義している場合を除き、本明細書で使用する全ての科学技術用語は、本発明が属する当業者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。そうでなければ、本明細書で使用するある特定の用語は、本明細書に記載の意味を有する。本明細書で引用した全ての特許、公開された特許出願、および刊行物は、それが本明細書に十分に記載されているように参照により本明細書に組み込まれている。

【0033】

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの」、「１つの（ａｎ）」、および「その」は、本文がそれ以外であると明白に示していない限り、複数形を含むことに注意しなければならない。

【0034】

それ以外であると示していない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、その一連のあらゆる要素を指すと理解される。当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を、単なる通例の実験を使用して認識するか、または確認することができる。そのような均等物は、本発明に包含されると意図される。

【0035】

以下に続く本明細書および特許請求の範囲を通して、本文がそれ以外であることを必要としていない限り、用語「含む」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変化形は、記載の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を含むことを暗示するが、他の任意の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を除外しないと理解される。本明細書で使用する場合、用語「含む」は、用語「含有する」もしくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」に置換することができ、または時に本明細書において使用される場合、「有する」という用語に置換することができる。

【0036】

本明細書で使用される場合、「からなる」は、特許請求の範囲の要素に明記されていないいかなる要素、ステップ、または成分も除外する。本明細書で使用される場合、「本質的にからなる」は、特許請求の範囲の基本的および新規特徴に実質的に影響を及ぼさない材料またはステップを除外しない。上記の用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する」はいずれも、本出願の一態様または一実施形態の文脈において本明細書で使用されている場合は常に、本開示の範囲を変化させるために用語「からなる」または「本質的にからなる」と置換することができる。

【0037】

本明細書で使用される場合、複数の列挙された要素の間の接続詞「および／または」は、個々のおよび組合せの選択肢の両方を包含すると理解される。例えば、２つの要素を「および／または」で接続する場合、第１の選択肢は第２の要素を有しない第１の要素の適応性を指す。第２の選択肢は、第１の要素を有しない第２の要素の適応性を指す。第３の選択肢は、第１および第２の要素の両方の適応性を指す。これらの選択肢の任意の１つが、その意味に含まれ、したがって本明細書で使用される用語「および／または」の必要条件を満たすと理解される。１つより多くの選択肢の同時の適応性もまた、その意味に含まれ、したがって用語「および／または」の必要条件を満たすと理解される。

【0038】

それ以外であると明記していない限り、本明細書で記載する濃度または濃度範囲等のいかなる数値も、全ての例において用語「約」によって修飾されると理解される。このように、数値は典型的に、列挙した値の±１０％を含む。例えば、濃度１ｍｇ／ｍＬは、０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、濃度範囲１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬは、０．９ｍｇ／ｍＬ～１１ｍｇ／ｍＬを含む。本明細書で使用される場合、本文が明白にそれ以外であることを示していない限り、数値範囲の使用は、全ての可能性がある小範囲、ならびにそのような範囲内の整数および値の分数を含む、その範囲内の全ての個々の数値を明白に含む。

【0039】

アミノ酸配列を参照して使用する場合の、語句「パーセント（％）配列同一性」または「％同一性」、または「％同一である」は、アミノ酸配列の全長を構成するアミノ酸残基の数と比較して、２つまたはそれより多くの整列させたアミノ酸配列の同一のアミノ酸のマッチ（「ヒット」）数を記載する。言い換えれば、２つまたはそれより多くの配列のアライメントを使用して、当技術分野で公知の配列比較アルゴリズムを使用して測定した場合に最大に一致するように、配列を比較および整列させた場合、または手作業で整列させて肉眼で検分する場合に、同じであるアミノ酸残基のパーセンテージ（例えば、アミノ酸配列の完全長に対する９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性）を決定してもよい。配列同一性を決定するために比較される配列は、このように、アミノ酸の置換、付加、または欠失によって異なっていてもよい。タンパク質配列を整列させるための適したプログラムが当業者に公知である。タンパク質配列のパーセンテージ配列同一性は、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴ、例えばＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Altschul SF, et al(1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）等のプログラムによって決定することができる。

【0040】

本明細書で使用される場合、２つまたはそれより多くの治療または構成要素を対象に投与する文脈における、用語および語句「組合せ」または「組み合わせて」、「同時送達」、および「共に投与する」は、２つのベクター、例えばＤＮＡプラスミド、または免疫原性組合せおよびアジュバント等の２つまたはそれより多くの治療剤または構成要素の同時投与を指す。「同時投与」は、２つの構成要素の少なくとも同じ日の投与であり得る。２つの構成要素を「共に投与する」または「組み合わせて投与する」場合、それらは、個別の組成物において短時間の間に、例えば２４、２０、１６、１２、８、もしくは４時間、もしくは１時間以内に連続して投与することができ、またはそれらは単一の組成物で同時に投与することができる。用語「組み合わせて」の使用は、治療または構成要素が対象に投与される順序を制限しない。例えば、第１の治療または構成要素（例えば、ＨＢＶ抗原をコードする第１のＤＮＡプラスミド）を、第２の治療または構成要素（例えば、ＨＢＶ抗原をコードする第２のＤＮＡプラスミド）の投与の前（例えば、５分から１時間前）、付随してもしくは同時に、または後に（例えば、５分から１時間後）に投与することができる。一部の実施形態では、第１の治療または構成要素（例えば、ＨＢＶ抗原をコードする第１のＤＮＡプラスミド）および第２の治療または構成要素（例えば、ＨＢＶ抗原をコードする第２のＤＮＡプラスミド）を、同じ組成物で投与する。他の実施形態では、第１の治療または構成要素（例えば、ＨＢＶ抗原をコードする第１のＤＮＡプラスミド）および第２の治療または構成要素（例えば、ＨＢＶ抗原をコードする第２のＤＮＡプラスミド）を個別の組成物で投与する。

【0041】

本明細書で使用される場合、「天然に存在しない」核酸またはポリペプチドは、自然界に存在しない核酸またはポリペプチドを指す。「天然に存在しない」核酸またはポリペプチドは、研究所および／または製造の状況で合成、処置、作製、および／またはそうでなければ操作することができる。一部の例では、天然に存在しない核酸またはポリペプチドは、処置前に天然に存在する核酸またはポリペプチドには存在しない特性を示すように、処置、処理、または操作されている天然に存在する核酸またはポリペプチドを含み得る。本明細書で使用される場合、「天然に存在しない」核酸またはポリペプチドは、それが発見された天然起源から単離または分離されている核酸またはポリペプチドであり得て、それが天然起源で会合している配列との共有結合を欠如する。「天然に存在しない」核酸またはポリペプチドは、組換えによって、または他の方法、例えば化学合成を介して作製することができる。

【0042】

本明細書で使用される場合、「対象」は、本出願の実施形態に従う方法によって処置されるまたは処置された任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。本明細書で使用される用語「哺乳動物」は、任意の哺乳動物を包含する。哺乳動物の例には、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）、例えばサルまたは類人猿、ヒト等が挙げられるがこれらに限定されず、より好ましくはヒトである。

【0043】

本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、記述の構成要素がその意図する様式でそれらを機能させる関係にある連結または並置を指す。例えば、目的の核酸配列に作動可能に連結された調節配列は、目的の核酸配列の転写を指示することができ、または目的のアミノ酸配列に作動可能に連結されたシグナル配列は、目的のアミノ酸配列を、膜を超えて分泌または移動させることが可能である。

【0044】

本出願の読者を助ける試みで、説明は様々な段落または節で区切られているか、または本出願の様々な実施形態を対象としている。これらの区切りは、段落または節または実施形態の物質を別の段落、節、または実施形態の物質と切り離すと考えるべきではない。逆に、当業者は、説明が広い応用を有し、企図することができる様々な節、段落、および文章の全ての組合せを包含すると理解するであろう。いかなる実施形態の考察も単なる例であることを意味しており、特許請求の範囲を含む本開示の範囲はこれらの例に限定されないと示唆することを意図する。例えば、本明細書に記載の本出願のＨＢＶベクターの実施形態（例えば、プラスミドＤＮＡまたはウイルスベクター）は、特定の順序で配置したある特定のプロモーター配列、エンハンサーまたは調節配列、シグナルペプチド、ＨＢＶ抗原のコード配列、ポリアデニル化シグナル配列等を含むがこれらに限定されない特定の構成要素を含有し得るが、当業者は、本明細書で開示される概念が、本出願のＨＢＶベクターにおいて使用することができる他の順序で配置した他の構成要素にも等しく当てはまり得ることを認識するであろう。本出願は、特定の組合せが明白に記載されているか否かによらず、本出願のＨＢＶベクターにおいて使用することができる任意の配列を有する任意の応用可能な構成要素の任意の組合せでの使用を企図する。

【0045】

Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）
本明細書で使用される場合、「Ｂ型肝炎ウイルス」または「ＨＢＶ」は、ヘパドナウイルス科のウイルスを指す。ＨＢＶは、４つのオープンリーディングフレームおよび７つのタンパク質をコードする小さい（例えば、３．２ｋｂ）肝臓指向性のＤＮＡウイルスである。図１Ａを参照されたい。ＨＢＶによってコードされる７つのタンパク質は、ｓｍａｌｌ（Ｓ）、ｍｅｄｉｕｍ（Ｍ）、およびｌａｒｇｅ（Ｌ）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、またはエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質、プレコアタンパク質、コアタンパク質、ウイルスポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、およびＨＢｘタンパク質を含む。ＨＢＶは、３つの表面抗原またはエンベロープタンパク質、Ｌ、Ｍ、およびＳを発現し、Ｓが最小であり、Ｌが最大である。ＭおよびＬタンパク質におけるエクストラドメインはそれぞれ、Ｐｒｅ－Ｓ２およびＰｒｅ－Ｓ１と呼ばれる。コアタンパク質は、ウイルスヌクレオキャプシドのサブユニットである。Ｐｏｌは、ウイルスＤＮＡの合成にとって必要であり（逆転写酵素、ＲＮアーゼＨ、およびプライマー）、これは感染した肝細胞の細胞質に局在するヌクレオキャプシドで起こる。プレコアは、Ｎ末端シグナルペプチドを有するコアタンパク質であり、そのＮ末端およびＣ末端でタンパク質分解によりプロセシングされ、感染した細胞からいわゆるＢ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）として分泌される。ＨＢｘタンパク質は、完全閉鎖環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の効率的な転写にとって必要である。ＨＢｘは、ウイルスの構造タンパク質ではない。ＨＢＶの全てのウイルスタンパク質は、ｍＲＮＡを共有するコアおよびポリメラーゼを除き自身のｍＲＮＡを有する。タンパク質プレコアを除き、いずれのＨＢＶウイルスタンパク質も翻訳後タンパク質分解によるプロセシングを受けない。

【0046】

ＨＢＶビリオンは、ウイルスエンベロープ、ヌクレオキャプシド、および１コピーの部分的二本鎖ＤＮＡゲノムを含有する。ヌクレオキャプシドは、コアタンパク質の１２０個の二量体を含み、Ｓ、Ｍ、およびＬウイルスエンベロープ、または表面抗原タンパク質に埋もれているキャプシド膜によって覆われている。細胞内に侵入後、ウイルスは、脱殻し、ウイルスポリメラーゼが共有結合したキャプシド含有不完全閉鎖環状ＤＮＡ（ｒｃＤＮＡ）が核に移行する。そのプロセスの間、コアタンパク質のリン酸化が構造の変化を誘導し、核移行シグナルを露出させ、キャプシドといわゆるインポーチンとの相互作用を可能にする。これらのインポーチンは、コアタンパク質と核膜孔複合体との結合を媒介し、それによってキャプシドが分解し、ポリメラーゼ／ｒｃＤＮＡ複合体が核に放出される。核内でｒｃＤＮＡが、脱タンパク質化され（ポリメラーゼの除去）、宿主ＤＮＡ修復機構によって完全閉鎖環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）ゲノムに変換され、重複する転写物がＨＢｅＡｇ、ＨＢｓＡｇ、コアタンパク質、ウイルスポリメラーゼおよびＨＢｘタンパク質をコードする。コアタンパク質、ウイルスポリメラーゼ、およびプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）は、細胞質で会合し、未成熟なｐｇＲＮＡ含有キャプシド粒子へと自己アセンブリし、これはさらに成熟ｒｃＤＮＡキャプシドへと変換して共通の中間体として機能し、エンベロープに包まれて感染性のウイルス粒子として分泌されるか、または核に再度輸送されて安定なｃｃｃＤＮＡプールを補充および維持する。図１Ｂを参照されたい。

【0047】

今日まで、ＨＢＶは、エンベロープタンパク質に存在する抗原性エピトープに基づいて４つの血清型（ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒ、ａｙｗ）に、およびウイルスゲノムの配列に基づいて８つの遺伝子型（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨ）に分類される。ＨＢＶ遺伝子型は、異なる地域にわたって分布している。例えば、アジアで最も多い遺伝子型は、遺伝子型ＢおよびＣである。遺伝子型Ｄは、アフリカ、中東、およびインドで一般的であるが、遺伝子型Ａは、北部ヨーロッパ、サハラ下アフリカ、および西アフリカで広く認められる。

【0048】

ＨＢＶ抗原
本明細書で使用される場合、用語「ＨＢＶ抗原」、「ＨＢＶの抗原性ポリペプチド」、「ＨＢＶ抗原性ポリペプチド」、「ＨＢＶ抗原性タンパク質」、「ＨＢＶ免疫原性ポリペプチド」、および「ＨＢＶ免疫原」は全て、対象においてＨＢＶに対する免疫応答、例えば液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を誘導することが可能なポリペプチドを指す。ＨＢＶ抗原は、ＨＢＶのポリペプチド、その断片もしくはエピトープ、または複数のＨＢＶポリペプチド、その一部もしくは誘導体の組合せであり得る。ＨＢＶ抗原は、宿主において保護的免疫応答を生じる、例えばウイルス疾患または感染症に対する免疫応答を誘導することが可能であり、および／または対象において、ウイルス疾患または感染症に対して対象を保護する、ウイルス疾患もしくは感染症に対する免疫を生じる（すなわち、ワクチン接種する）ことが可能である。例えば、ＨＢＶ抗原は、任意のＨＢＶタンパク質、例えばＨＢｅＡｇ、プレコアタンパク質、ＨＢｓＡｇ（Ｓ、Ｍ、またはＬタンパク質）、コアタンパク質、ウイルスポリメラーゼ、または任意のＨＢＶ遺伝子型、例えば遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、および／もしくはＨに由来するＨＢｘタンパク質からのポリペプチドまたはその免疫原性断片、またはその組合せを含み得る。

【0049】

（１）ＨＢＶコア抗原
本明細書で使用される場合、用語「ＨＢＶコア抗原」、「ＨＢｃＡｇ」、および「コア抗原」は全て、対象においてＨＢＶコアタンパク質に対する免疫応答、例えば液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を誘導することが可能なＨＢＶ抗原を指す。用語「コア」、「コアポリペプチド」、および「コアタンパク質」の各々は、ＨＢＶウイルスコアタンパク質を指す。完全長のコア抗原は、典型的には、１８３アミノ酸長であり、アセンブリドメイン（アミノ酸１～１４９）および核酸結合ドメイン（アミノ酸１５０～１８３）を含む。３４残基の核酸結合ドメインは、プレゲノムＲＮＡキャプシド形成にとって必要である。このドメインはまた、核輸入シグナルとしても機能する。これは、１７個のアルギニン残基を含み、その機能と整合して、高度に塩基性である。ＨＢＶコアタンパク質は溶液中で二量体であり、二量体は、正二十面体のキャプシドへと自己アセンブルする。コアタンパク質の各々の二量体は、いずれかの側にα－ヘリックスドメインが隣接する４つのα－ヘリックスバンドルを有する。核酸結合ドメインを欠如する切断型ＨＢＶコアタンパク質もまた、キャプシドを形成することが可能である。

【0050】

本出願の一実施形態では、ＨＢＶ抗原は、切断型ＨＢＶコア抗原である。本明細書で使用される場合、「切断型ＨＢＶコア抗原」は、ＨＢＶコアタンパク質の完全長を含有しないが、対象においてＨＢＶコアタンパク質に対する免疫応答を誘導することが可能であるＨＢＶ抗原を指す。例えば、ＨＢＶコア抗原は、典型的に１７個のアルギニン（Ｒ）残基を含有するコア抗原の高度に正に帯電した（アルギニンに富む）Ｃ末端核酸結合ドメインの１つまたは複数のアミノ酸を欠失させるように改変することができる。本出願の切断型ＨＢＶコア抗原は、好ましくはＨＢＶコア核輸入シグナルを含まないＣ末端切断型ＨＢＶコアタンパク質、および／またはＣ末端ＨＢＶコア核輸入シグナルが欠失している切断型ＨＢＶコアタンパク質である。一実施形態では、切断型ＨＢＶコア抗原は、Ｃ末端核酸結合ドメインの１～３４アミノ酸残基の欠失、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４アミノ酸残基の欠失、好ましくは３４アミノ酸残基全ての欠失を含む。好ましい実施形態では、切断型ＨＢＶコア抗原は、Ｃ末端核酸結合ドメインの欠失を含み、好ましくは３４アミノ酸残基全ての欠失を含む。

【0051】

本出願のＨＢＶコア抗原は、複数のＨＢＶ遺伝子型（例えば、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨ）に由来するコンセンサス配列であり得る。本明細書で使用される場合、「コンセンサス配列」は、例えば相同なタンパク質のアミノ酸配列のアライメント（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して）によって決定した、相同なタンパク質のアミノ酸配列のアライメントに基づく人工的なアミノ酸配列を意味する。これは、少なくとも１００個の天然のＨＢＶ単離体からのＨＢＶ抗原（例えば、コア、ｐｏｌ等）の配列に基づいて、配列アライメントにおける各位置で見出される最も頻繁なアミノ酸残基の計算された順序であり得る。コンセンサス配列は、天然に存在せず、ネイティブウイルス配列とは異なり得る。コンセンサス配列は、マルチプル配列アライメントツールを使用して異なる起源からの複数のＨＢＶ抗原配列を整列させるステップ、および多様なアライメント位置で最も頻繁なアミノ酸を選択するステップによって設計することができる。好ましくは、ＨＢＶ抗原のコンセンサス配列は、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに由来する。用語「コンセンサス抗原」は、コンセンサス配列を有する抗原を指すために使用される。

【0052】

本出願に従う例示的な切断型ＨＢＶコア抗原は、核酸結合機能を欠如し、哺乳動物において少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答を誘導することが可能である。好ましくは、切断型ＨＢＶコア抗原は、哺乳動物において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、ＣおよびＤに対するＴ細胞応答を誘導することが可能である。より好ましくは、切断型ＨＢＶコア抗原は、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能である。

【0053】

好ましくは、本出願のＨＢＶコア抗原は、コンセンサス抗原、好ましくはＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに由来するコンセンサス抗原、より好ましくはＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに由来する切断型コンセンサス抗原である。本出願に従う例示的な切断型ＨＢＶコアコンセンサス抗原は、配列番号２または配列番号１４と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号２または配列番号１４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であるアミノ酸配列からなる。配列番号２および配列番号１４は、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに由来するコアコンセンサス抗原である。配列番号２および配列番号１４は、ネイティブコア抗原の高度に正に帯電した（アルギニンに富む）核酸結合ドメインの３４アミノ酸Ｃ末端欠失を含有する。

【0054】

本出願の特定の実施形態では、ＨＢＶコア抗原は、配列番号２のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶ抗原である。別の特定の実施形態では、ＨＢＶコア抗原は、配列番号１４のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶ抗原である。

【0055】

（２）ＨＢＶポリメラーゼ抗原
本明細書で使用される場合、用語「ＨＢＶポリメラーゼ抗原」、「ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原」、または「ＨＢＶ ｐｏｌ抗原」は、対象においてＨＢＶポリメラーゼに対する免疫応答、例えば液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を誘導することが可能であるＨＢＶ抗原を指す。用語「ポリメラーゼ」、「ポリメラーゼポリペプチド」、「Ｐｏｌ」、および「ｐｏｌ」は、ＨＢＶウイルスＤＮＡポリメラーゼを指す。ＨＢＶウイルスＤＮＡポリメラーゼは、Ｎ末端からＣ末端に、マイナス鎖ＤＮＡ合成のプライマーとして作用する末端タンパク質（ＴＰ）ドメイン、ポリメラーゼ機能にとって必須ではないスペーサー、転写のための逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、およびＲＮアーゼＨドメインを含む４つのドメインを有する。

【0056】

本出願の一実施形態では、ＨＢＶ抗原は、ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原、またはその免疫原性断片または組合せを含む。ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原は、例えばある特定の酵素活性を減少させるかまたは実質的に排除するために、ポリメラーゼおよび／またはＲＮアーゼドメインの活性部位に変異を導入することによって、抗原の免疫原性を改善するためにさらなる改変を含有し得る。

【0057】

好ましくは、本出願のＨＢＶ Ｐｏｌ抗原は、逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有さず、哺乳動物において少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答を誘導することが可能である。好ましくは、ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原は、哺乳動物において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、ＣおよびＤに対するＴ細胞応答を誘導することが可能である。より好ましくは、ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原は、ヒト対象において、少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能である。

【0058】

このように、一部の実施形態では、ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原は、不活化Ｐｏｌ抗原である。一実施形態では、不活化ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原は、ポリメラーゼドメインの活性部位に１つまたは複数のアミノ酸変異を含む。別の実施形態では、不活化ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原は、ＲＮアーゼＨドメインの活性部位に１つまたは複数のアミノ酸変異を含む。好ましい実施形態では、不活化ＨＢＶ ｐｏｌ抗原は、ポリメラーゼドメインおよびＲＮアーゼＨドメインの両方の活性部位に１つまたは複数のアミノ酸変異を含む。例えば、ヌクレオチド／金属イオン結合にとって必要であり得るＨＢＶ ｐｏｌ抗原のポリメラーゼドメインにおける「ＹＸＤＤ」モチーフを、例えばアスパラギン酸塩残基（Ｄ）の１つまたは複数をアスパラギン残基（Ｎ）に置換することによって、変異させることができ、それによって金属配位機能を排除するかまたは低減させ、それによって逆転写酵素機能を減少させるかまたは実質的に排除することができる。あるいは、または「ＹＸＤＤ」モチーフの変異に加えて、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原のＲＮアーゼＨドメインにおけるＭｇ^２＋配位にとって必要な「ＤＥＤＤ」モチーフを、例えば１つまたは複数のアスパラギン酸塩残基（Ｄ）をアスパラギン残基（Ｎ）に置換することによって、および／またはグルタミン酸塩残基（Ｅ）をグルタミン（Ｑ）に置換することによって変異させることができ、それによってＲＮアーゼＨ機能を減少させるかまたは実質的に排除することができる。特定の実施形態では、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原は、（１）ポリメラーゼドメインの「ＹＸＤＤ」モチーフにおいてアスパラギン酸塩残基（Ｄ）をアスパラギン残基（Ｎ）に変異させることによって、および（２）ＲＮアーゼＨドメインの「ＤＥＤＤ」モチーフにおける第１のアスパラギン酸塩残基（Ｄ）をアスパラギン残基（Ｎ）に、および第１のグルタミン酸塩残基（Ｅ）をグルタミン残基（Ｎ）に変異させることによって改変され、それによってｐｏｌ抗原の逆転写酵素およびＲＮアーゼＨ機能を減少させるかまたは実質的に排除する。

【0059】

本出願の好ましい実施形態では、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原は、コンセンサス抗原、好ましくはＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに由来するコンセンサス抗原であり、より好ましくはＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに由来する不活化コンセンサス抗原である。本出願に従う例示的なＨＢＶ ｐｏｌコンセンサス抗原は、配列番号４と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号４と少なくとも９８％同一である、例えば配列番号４と少なくとも９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。配列番号４は、ポリメラーゼおよびＲＮアーゼＨドメインの活性部位に位置する４つの変異を含むＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに由来するｐｏｌコンセンサス抗原である。特に、４つの変異は、ポリメラーゼドメインの「ＹＸＤＤ」モチーフにおけるアスパラギン酸塩残基（Ｄ）のアスパラギン残基（Ｎ）への変異、ならびにＲＮアーゼＨドメインの「ＤＥＤＤ」モチーフにおける第１のアスパラギン酸塩残基（Ｄ）のアスパラギン残基（Ｎ）への変異、およびグルタミン酸塩残基（Ｅ）のグルタミン残基（Ｑ）への変異を含む。

【0060】

本出願の特定の実施形態では、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。本出願の他の実施形態では、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原は、配列番号４のアミノ酸配列からなる。

【0061】

（３）ＨＢＶコア抗原およびＨＢＶポリメラーゼ抗原の融合体
本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」、または「融合体」は、単一の天然のポリペプチドに通常存在しない少なくとも２つのポリペプチドドメインを有する単一のポリペプチド鎖を指す。

【0062】

本出願の一実施形態では、ＨＢＶ抗原は、好ましくはリンカーを介して、ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原、または切断型ＨＢＶコア抗原に作動可能に連結されたＨＢＶ Ｐｏｌ抗原を含む融合タンパク質を含む。

【0063】

本明細書で使用される場合、用語「リンカー」は、リンカーの１つの部分が第１の分子に作動可能に連結され、リンカーの別の部分が、第２の分子に作動可能に連結される、２つの異なる分子を作動可能に連結するための分子架橋として作用する化合物または部分を指す。例えば、第１のポリペプチドおよび第２の異種ポリペプチドを含有する融合タンパク質では、リンカーは、主に第１のポリペプチドと第２の異種ポリペプチドとの間のスペーサーとしての役目を果たす。一実施形態では、リンカーは、ペプチド結合によって共に連結されたアミノ酸、好ましくはペプチド結合によって連結された１～２０個のアミノ酸で構成され、アミノ酸は、２０個の天然に存在するアミノ酸から選択される。一実施形態では、１～２０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリジンから選択される。好ましくは、リンカーは、立体妨害を受けないアミノ酸、例えばグリシンおよびアラニンで大部分が構成される。例示的なリンカーは、ポリグリシン、特に（Ｇｌｙ）_５、（Ｇｌｙ）_８、ポリ（Ｇｌｙ－Ａｌａ）、およびポリアラニンである。以下の実施例に示される１つの例示的な適したリンカーは、（ＡｌａＧｌｙ）_ｎであり、式中ｎは２～５の整数である。

【0064】

好ましくは、本出願の融合タンパク質は、哺乳動物において、少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型のＨＢＶコアおよびＨＢＶ Ｐｏｌに対する免疫応答を誘導することが可能である。好ましくは、融合タンパク質は、哺乳動物において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、ＣおよびＤに対するＴ細胞応答を誘導することが可能である。より好ましくは、融合タンパク質は、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能である。

【0065】

本出願の一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２または配列番号１４と少なくとも９０％同一である、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する切断型ＨＢＶコア抗原、リンカー、および配列番号４と少なくとも９０％同一である、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｏｌ抗原を含む。

【0066】

本出願の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原、ｎが２～５の整数である（ＡｌａＧｌｙ）_ｎを含むリンカー、および配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｏｌ抗原を含む。より好ましくは、本出願の実施形態に従う融合タンパク質は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。

【0067】

本出願の一実施形態では、融合タンパク質は、シグナル配列をさらに含む。好ましくは、シグナル配列は、配列番号６または配列番号１９のアミノ酸配列を有する。より好ましくは、融合タンパク質は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。

【0068】

ポリヌクレオチドおよびベクター
別の一般的な態様では、本出願は、本出願に従うＨＢＶ抗原をコードする天然に存在しない核酸分子および天然に存在しない核酸を含むベクターを提供する。天然に存在しない核酸分子は、本出願のＨＢＶ抗原をコードする任意のポリヌクレオチド配列を含むことができ、これは本開示を考慮して当技術分野で公知の方法を使用して作製することができる。好ましくは、ポリヌクレオチドは、本出願の切断型ＨＢＶコア抗原およびＨＢＶポリメラーゼ抗原の少なくとも１つをコードする。ポリヌクレオチドは、組換え技術（例えば、クローニング）によって得た、または合成（例えば、化学合成）によって産生されたＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは、一本鎖もしくは二本鎖であり得るか、または二本鎖および一本鎖配列の両方の部分を含有し得る。例えば、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはその組合せを含み得る。ポリヌクレオチドはまた、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドでもあり得る。本出願のポリヌクレオチドおよびベクターは、組換えタンパク質産生、宿主細胞におけるタンパク質の発現、またはウイルス粒子の産生のために使用することができる。好ましくは、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。

【0069】

本出願の一実施形態では、天然に存在しない核酸分子は、配列番号２または配列番号１４と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号２または配列番号１４と９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチドを含む。本出願の特定の実施形態では、天然に存在しない核酸分子は、配列番号２または配列番号１４のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする。

【0070】

配列番号２または配列番号１４のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする本出願のポリヌクレオチド配列の例には、配列番号１または配列番号１５と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号１または配列番号１５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号１または配列番号１５と９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列が挙げられるがこれらに限定されない。切断型ＨＢＶコア抗原をコードする例示的な天然に存在しない核酸分子は、配列番号１または１５のポリヌクレオチド配列を有する。

【0071】

本出願の一実施形態では、天然に存在しない核酸分子は、配列番号４と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号４と１００％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする。本出願の特定の実施形態では、天然に存在しない核酸分子は、配列番号４のアミノ酸配列からなるＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする。

【0072】

配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＢＶ Ｐｏｌ抗原をコードする本出願のポリヌクレオチド配列の例には、配列番号３または配列番号１６と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号３または配列番号１６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号３または配列番号１６と９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列が挙げられるがこれらに限定されない。ＨＢＶ ｐｏｌ抗原をコードする例示的な天然に存在しない核酸分子は、配列番号３または１６のポリヌクレオチド配列を有する。

【0073】

本出願の別の実施形態では、天然に存在しない核酸分子は、ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原、または切断型ＨＢＶコア抗原に作動可能に連結されたＨＢＶ Ｐｏｌ抗原を含む融合タンパク質をコードする。特定の実施形態では、本出願の天然に存在しない核酸分子は、配列番号２または配列番号１４と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号２または配列番号１４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号２または配列番号１４と１００％同一である、より好ましくは配列番号１４と１００％同一であるアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原；リンカー；ならびに配列番号４と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号４と９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする。本出願の特定の実施形態では、天然に存在しない核酸分子は、配列番号１４のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原、ｎが２～５の整数である（ＡｌａＧｌｙ）_ｎを含むリンカー、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＢＶ Ｐｏｌ抗原を含む融合タンパク質をコードする。本出願の特定の実施形態では、天然に存在しない核酸分子は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする。

【0074】

融合タンパク質をコードする本出願のポリヌクレオチド配列の例には、配列番号１または配列番号１５と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号１または配列番号１５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号１または配列番号１５と９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列であって、配列番号２２と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号２２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号２２と９８％、９９％、または１００％同一であるリンカーコード配列に作動可能に連結され、リンカーコード配列がさらに、配列番号３または配列番号１６と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号３または配列番号１６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号３または配列番号１６と９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列にさらに作動可能に連結される、ポリヌクレオチド配列が挙げられるがこれらに限定されない。本出願の特定の実施形態では、融合タンパク質をコードする天然に存在しない核酸分子は、配列番号３または配列番号１６にさらに作動可能に連結された配列番号２２に作動可能に連結された配列番号１または配列番号１５を含む。

【0075】

本出願はまた、ＨＢＶ抗原をコードする単離されたポリヌクレオチドを含むベクターにも関する。本明細書で使用される場合、「ベクター」は、遺伝子材料を別の細胞に運ぶために使用され、そこで複製および／または発現させることができる核酸分子である。本開示を考慮して当業者に公知の任意のベクターを使用することができる。ベクターの例には、プラスミド、ウイルスベクター（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）、コスミド、および人工染色体（例えば、ＹＡＣ）が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、ベクターはＤＮＡプラスミドである。ベクターは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであり得る。当業者は、本開示を考慮して標準的な組換え技術を通して、本出願のベクターを構築することができる。

【0076】

本出願のベクターは、発現ベクターであり得る。本明細書で使用される場合、用語「発現ベクター」は、転写することが可能なＲＮＡをコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝子構築物を指す。発現ベクターには、組換えタンパク質発現のためのベクター、例えばＤＮＡプラスミド、またはウイルスベクター、および対象の組織において発現させるために対象に核酸を送達するためのベクター、例えばＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等の要因に依存し得ることは当業者によって認識される。

【0077】

本出願のベクターは、多様な調節配列を含有し得る。本明細書で使用される場合、用語「調節配列」は、複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、核酸またはその誘導体の１つ（すなわち、ｍＲＮＡ）の安定性および／または宿主細胞もしくは生物への輸送を含む、核酸分子の機能的調節を可能にする、寄与する、またはモジュレートする任意の配列を指す。本開示の文脈では、この用語は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナルおよびｍＲＮＡ安定性に影響を及ぼすエレメント）を包含する。

【0078】

本出願の一部の実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。非ウイルスベクターの例には、ＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、バクテリオファージ等が挙げられるがこれらに限定されない。非ウイルスベクターの例には、ＲＮＡレプリコン、ｍＲＮＡレプリコン、改変ｍＲＮＡレプリコン、または自己増幅ｍＲＮＡ、完全閉鎖線形デオキシリボ核酸、例えば完全閉鎖線形ＤＮＡ、例えば完全閉鎖線形二本鎖ＤＮＡ分子が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、非ウイルスベクターは、ＤＮＡプラスミドである。「ＤＮＡプラスミド」は、「ＤＮＡプラスミドベクター」、「プラスミドＤＮＡ」または「プラスミドＤＮＡベクター」と互換的に使用され、適した宿主細胞において自立複製を可能にする、二本鎖で一般的に環状のＤＮＡ配列を指す。コードされるポリヌクレオチドの発現のために使用されるＤＮＡプラスミドは、典型的には、複製開始点、マルチクローニングサイト、および例えば抗生物質耐性遺伝子であり得る選択可能マーカーを含む。使用することができる適したＤＮＡプラスミドの例には、周知の発現系において使用するための市販の発現ベクター（原核細胞および真核細胞系の両方を含む）、例えば大腸菌（Escherichia coli）におけるタンパク質の産生および／または発現のために使用することができるｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）；酵母（Saccharomyces cerevisiae）株における産生および／または発現のために使用することができるｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；昆虫細胞における産生および／または発現のために使用することができるＭＡＸＢＡＣ（登録商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；哺乳動物細胞における高レベルの構成的タンパク質発現のために使用することができるｐｃＤＮＡ（商標）またはｐｃＤＮＡ３（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；ならびにほとんどの哺乳動物細胞において目的のタンパク質の高レベルの一過性の発現のために使用することができるｐＶＡＸまたはｐＶＡＸ－１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が挙げられるがこれらに限定されない。任意の市販のＤＮＡプラスミドの骨格を、宿主細胞におけるタンパク質発現を最適にするために、通常の技術および容易に入手可能な出発材料を使用して、例えばある特定のエレメント（例えば、複製開始点および／または抗生物質耐性カセット）の方向を逆転させるように、プラスミドに対して内因性のプロモーター（例えば、抗生物質耐性カセットにおけるプロモーター）を置換するように、および／または転写されたタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子のコード配列）を置換するように改変することができる（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press(1989)を参照されたい）。

【0079】

好ましくは、ＤＮＡプラスミドは、哺乳動物宿主細胞におけるタンパク質発現にとって適した発現ベクターである。哺乳動物宿主細胞におけるタンパク質発現にとって適した発現ベクターには、ｐｃＤＮＡ（商標）、ｐｃＤＮＡ３（商標）、ｐＶＡＸ、ｐＶＡＸ－１、ＡＤＶＡＸ、ＮＴＣ８４５４等が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、発現ベクターはｐＶＡＸ－１に基づくが、これを、哺乳動物細胞におけるタンパク質発現を最適にするためにさらに改変することができる。ｐＶＡＸ－１は、ＤＮＡワクチンにおいて一般的に使用されるプラスミドであり、強いヒト前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ－ＩＥ）プロモーター、その後に続くウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）由来ポリアデニル化配列（ｐＡ）を含有する。ｐＶＡＸ－１は、細菌プラスミドの繁殖を可能にする小さい原核細胞プロモーターによって駆動されるｐＵＣ複製開始点およびカナマイシン耐性遺伝子をさらに含有する。

【0080】

本出願のベクターはまた、ウイルスベクターであり得る。一般的に、ウイルスベクターは、非感染性にされているが、それでもなおウイルスプロモーターおよびトランスジーンを含有し、それによってウイルスプロモーターを通してのトランスジーンの翻訳を可能にする、改変ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを保有する遺伝子操作ウイルスである。ウイルスベクターはしばしば、感染性の配列を欠如することから、それらは大規模トランスフェクションのためにはヘルパーウイルスまたはパッケージングラインを必要とする。使用することができるウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、腸内ウイルスベクター、ベネズエラウマ脳炎ウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、タバコモザイクウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アレナウイルスウイルスベクター、複製欠損アレナウイルスウイルスベクターまたは複製コンピテントアレナウイルスウイルスベクター、２分節または３分節アレナウイルス、感染性アレナウイルスウイルスベクター、ゲノム分節の１つのオープンリーディングフレームが欠失しているかまたは機能的に不活化されている（および本明細書に記載のＨＢＶ抗原をコードする核酸に置換されている）アレナウイルスゲノム分節を含む核酸、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、例えばクローン１３株またはＭＰ株等のアレナウイルス、およびフニンウイルス、例えばＣａｎｄｉｄ ＃１株等のアレナウイルス等が挙げられるがこれらに限定されない。ベクターはまた、非ウイルスベクターでもあり得る。

【0081】

好ましくは、ウイルスベクターはアデノウイルスベクター、例えば組換えアデノウイルスベクターである。組換えアデノウイルスベクターは、例えばヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶ、またはＡｄＨｕ）、またはシミアンアデノウイルス、例えばチンパンジーもしくはゴリラアデノウイルス（ＣｈＡｄ、ＡｄＣｈ、またはＳＡｄＶ）もしくはアカゲザルアデノウイルス（ｒｈＡｄ）に由来し得る。好ましくは、アデノウイルスベクターは、組換えヒトアデノウイルスベクター、例えば組換えヒトアデノウイルス血清型２６、または組換えヒトアデノウイルス血清型５、４、３５、７、４８等のいずれか１つである。他の実施形態では、アデノウイルスベクターは、ｒｈＡｄベクター、例えばｒｈＡｄ５１、ｒｈＡｄ５２またはｒｈＡｄ５３である。本出願にとって有用な組換えウイルスベクターは、本開示を考慮して当技術分野で公知の方法を使用して調製することができる。例えば、遺伝子コードの縮重を考慮して、同じポリペプチドをコードするいくつかの核酸配列を設計することができる。本出願のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞（例えば、細菌または哺乳動物細胞）における適切な発現を確保するために、任意選択でコドン最適化することができる。コドン最適化は、当技術分野で広く適用される技術であり、コドン最適化ポリヌクレオチドを得る方法は本開示を考慮して当業者に周知である。

【0082】

本出願のベクター、例えばＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクター（特に、アデノウイルスベクター）は、ベクターのポリヌクレオチド配列によってコードされるＨＢＶ抗原の複製および発現を含むがこれらに限定されないベクターの通常の機能を確立するために、任意の調節エレメントを含み得る。調節エレメントには、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、翻訳終止コドン、リボソーム結合エレメント、転写ターミネーター、選択マーカー、複製開始点等が挙げられるがこれらに限定されない。ベクターは、１つまたは複数の発現カセットを含み得る。「発現カセット」は、細胞機構にＲＮＡおよびタンパク質を作製するよう指示するベクターの一部である。発現カセットは典型的には、３つの構成要素：プロモーター配列、オープンリーディングフレーム、および任意選択でポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、開始コドンから終止コドンまでの目的のタンパク質（例えば、ＨＢＶ抗原）のコード配列を含有する読み取り枠である。発現カセットの調節エレメントは、目的のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結させることができる。本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、その最も広い妥当な文脈で解釈され、機能的に関連するポリヌクレオチドエレメントの連結を指す。ポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドと機能的関係にある場合に「作動可能に連結」されている。例えば、プロモーターは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている。本明細書に記載の発現カセットにおいて使用するために適した任意の構成要素を、本出願のベクターを調製するために任意の組合せおよび任意の順序で使用することができる。

【0083】

ベクターは、目的のＨＢＶ抗原の発現を制御するために、好ましくは発現カセット内にプロモーター配列を含み得る。用語「プロモーター」は、その通常の意味で使用され、作動可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を開始するヌクレオチド配列を指す。プロモーターは、それが転写するヌクレオチド配列の近くの同じ鎖上に位置する。プロモーターは、構成的、誘導型、または抑制性であり得る。プロモーターは、天然に存在するかまたは合成であり得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む起源に由来し得る。プロモーターは、同種プロモーター（すなわちベクターと同じ遺伝的起源に由来する）または異種プロモーター（すなわち、異なるベクターまたは遺伝的起源に由来する）であり得る。例えば、使用されるベクターが、ＤＮＡプラスミドである場合、プロモーターは、プラスミドに対して内因性であり得るか（同種）、または他の起源に由来し得る（異種）。好ましくは、プロモーターは、発現カセット内でＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドの上流に位置する。

【0084】

使用することができるプロモーターの例には、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えばウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ前初期プロモーター（ＣＭＶ－ＩＥ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。プロモーターはまた、ヒト遺伝子のプロモーター、例えばヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、またはヒトメタロチオネインのプロモーターであり得る。プロモーターはまた、組織特異的プロモーター、例えば天然または合成の筋特異的または皮膚特異的プロモーターであり得る。

【0085】

好ましくは、プロモーターは、強い真核細胞プロモーター、好ましくはサイトメガロウイルス前初期（ＣＭＶ－ＩＥ）プロモーターである。例示的なＣＭＶ－ＩＥプロモーターのヌクレオチド配列を、配列番号７および配列番号１７に示す。

【0086】

ベクターは、発現された転写物を安定化する、ＲＮＡ転写物の核輸出を増強する、および／または転写－翻訳カップリングを改善する追加のポリヌクレオチド配列を含み得る。そのような配列の例には、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサー配列が挙げられる。ポリアデニル化シグナルは、典型的には、ベクターの発現カセット内の目的のタンパク質（例えば、ＨＢＶ抗原）のコード配列の下流に位置する。エンハンサー配列は、転写因子が結合すると、関連する遺伝子の転写を増強する調節性ＤＮＡ配列である。エンハンサー配列は、ベクターの発現カセット内で、好ましくはＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列の上流であるが、プロモーター配列の下流に位置する。

【0087】

本開示を考慮して当業者に公知の任意のポリアデニル化シグナルを使用することができる。例えば、ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（例えば、配列番号２４）、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。好ましくは、ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである。例示的なｂＧＨポリアデニル化シグナルのヌクレオチド配列を配列番号１１に示す。例示的なＳＶ４０ポリアデニル化シグナルのヌクレオチド配列を配列番号２４に示す。

【0088】

本開示を考慮して当業者に公知の任意のエンハンサー配列を使用することができる。例えば、エンハンサー配列は、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、またはウイルスエンハンサー、例えばＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶ、もしくはＥＢＶ由来のエンハンサーであり得る。特定のエンハンサーの例には、ウッドチャックＨＢＶ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ヒトアポリポタンパク質Ａ１前駆体（ＡｐｏＡＩ）に由来するイントロン／エクソン配列、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）長末端反復（ＬＴＲ）の非翻訳Ｒ－Ｕ５ドメイン、スプライシングエンハンサー、合成ウサギβ－グロビンイントロン、またはその任意の組合せが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、エンハンサー配列は、ＨＴＬＶ－１ ＬＴＲの非翻訳Ｒ－Ｕ５ドメイン、ウサギβ－グロビンイントロン、およびスプライシングエンハンサーの３つの連続するエレメントの複合配列であり、これを本明細書において「トリプルエンハンサー配列」と呼ぶ。例示的なトリプルエンハンサー配列のヌクレオチド配列を配列番号８に示す。別の例示的なエンハンサー配列は、配列番号２３に示すＡｐｏＡＩ遺伝子断片である。

【0089】

ベクターは、シグナルペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含み得る。好ましくは、シグナルペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列は、ＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列の上流に位置する。シグナルペプチドは、典型的には、タンパク質の局在化を指示し、それが産生される細胞からのタンパク質の分泌を容易にし、ならびに／または抗原発現および抗原提示細胞に対する交差提示を改善する。シグナルペプチドは、ベクターから発現される場合、ＨＢＶ抗原のＮ末端に存在し得るが、細胞からの分泌時にシグナルペプチダーゼによって切断される。シグナルペプチドが切断されている発現されたタンパク質は、しばしば「成熟タンパク質」と呼ばれる。本開示を考慮して当技術分野で公知の任意のシグナルペプチドを使用することができる。例えば、シグナルペプチドは、シスタチンＳシグナルペプチド、免疫グロブリン（Ｉｇ）分泌シグナル、例えばＩｇ重鎖ガンマシグナルペプチドＳＰＩｇＧ、またはＩｇ重鎖イプシロンシグナルペプチドＳＰＩｇＥであり得る。

【0090】

好ましくは、シグナルペプチド配列は、シスタチンＳシグナルペプチドである。シスタチンＳシグナルペプチドの例示的な核酸およびアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号５および６に示す。免疫グロブリン分泌シグナルの例示的な核酸およびアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号１８および１９に示す。

【0091】

ベクター、例えばＤＮＡプラスミドはまた、細菌複製開始点、ならびに細菌細胞、例えば大腸菌（E. coli）におけるプラスミドの選択および維持のための抗生物質耐性発現カセットも含み得る。細菌の複製開始点および抗生物質耐性カセットは、ベクター内でＨＢＶ抗原をコードする発現カセットと同じ方向に、または反対（逆）方向に位置することができる。複製開始点（ＯＲＩ）は、そこで複製が開始される配列であり、プラスミドが細胞内で再生および生存することを可能にする。本出願で使用するために適したＯＲＩの例には、ＣｏｌＥ１、ｐＭＢ１、ｐＵＣ、ｐＳＣ１０１、Ｒ６Ｋ、および１５Ａ、好ましくはｐＵＣが挙げられるがこれらに限定されない。ｐＵＣ ＯＲＩの例示的なヌクレオチド配列を配列番号１０に示す。

【0092】

細菌細胞における選択および維持のための発現カセットは典型的には、抗生物質耐性遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。好ましくは、抗生物質耐性遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列は、目的のタンパク質、例えばＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列とは異なる。抗生物質耐性遺伝子は、コドン最適化することができ、抗生物質耐性遺伝子の配列組成は通常、細菌、例えば大腸菌（E. coli）のコドン使用に調整される。カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ^ｒ）、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ^ｒ）、およびテトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｅｔ^ｒ）、ならびにクロラムフェニコール、ブレオマイシン、スペクチノマイシン、カルベニシリン等に対して耐性を付与する遺伝子を含むがこれらに限定されない、本開示を考慮して当業者に公知の任意の抗生物質耐性遺伝子を使用することができる。

【0093】

好ましくは、ベクターの抗生物質発現カセットにおける抗生物質耐性遺伝子は、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ^ｒ）である。Ｋａｎ^ｒ遺伝子の配列を配列番号１３に示す。好ましくは、Ｋａｎ^ｒ遺伝子はコドン最適化されている。コドン最適化したＫａｎ^ｒ遺伝子の例示的な核酸配列を配列番号１２に示す。Ｋａｎ^ｒは、そのネイティブプロモーターに作動可能に連結させることができ、またはＫａｎ^ｒ遺伝子を異種プロモーターに連結させることができる。特定の実施形態では、Ｋａｎ^ｒ遺伝子を、ｂｌａプロモーターとしても知られるアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ^ｒ）プロモーターに作動可能に連結させる。ｂｌａプロモーターの例示的なヌクレオチド配列を配列番号９に示す。

【0094】

本出願の特定の実施形態では、ベクターは、配列番号４と少なくとも９８％同一である、例えば配列番号４と少なくとも９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶ ｐｏｌ抗原、および配列番号２のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原からなる群から選択されるＨＢＶ抗原の少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド；５’末端から３’末端に、プロモーター配列、好ましくは配列番号７のＣＭＶプロモーター配列、エンハンサー配列、好ましくは配列番号８のトリプルエンハンサー配列、およびシグナルペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列、好ましくは配列番号６のアミノ酸配列を有するシスタチンＳシグナルペプチドを含む、ＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された上流の配列；ならびにポリアデニル化シグナル、好ましくは配列番号１１のｂＧＨポリアデニル化シグナルを含む、ＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された下流の配列を含む発現カセットを含むＤＮＡプラスミドである。そのようなベクターは、配列番号１２と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号１２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号１２と１００％同一である抗生物質耐性遺伝子、好ましくはＫａｎ^ｒ遺伝子、より好ましくはコドン最適化Ｋａｎ^ｒ遺伝子をコードするポリヌクレオチドであって、抗生物質耐性遺伝子をコードするポリヌクレオチドの上流で作動可能に連結された配列番号９のＡｍｐ^ｒ（ｂｌａ）プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む抗生物質耐性発現カセット、および複製開始点、好ましくは配列番号１０のｐＵＣ ｏｒｉをさらに含む。好ましくは、抗生物質耐性カセットおよび複製開始点は、プラスミドにおいてＨＢＶ抗原発現カセットとは逆方向で存在する。上記で言及した特色を含む例示的なＤＮＡプラスミドを図２Ａおよび２Ｂに示す。

【0095】

本出願の別の特定の実施形態では、ベクターはウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクター、より好ましくはＡｄ２６またはＡｄ３５ベクターであって、配列番号４と少なくとも９８％同一である、例えば配列番号４と少なくとも９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶ ｐｏｌ抗原、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原からなる群から選択されるＨＢＶ抗原の少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド；５’末端から３’末端に、プロモーター配列、好ましくは配列番号１７のＣＭＶプロモーター配列、エンハンサー配列、好ましくは配列番号２３のＡｐｏＡＩ遺伝子断片配列、およびシグナルペプチド配列、好ましくは配列番号１９のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分泌シグナルをコードするポリヌクレオチド配列を含む、ＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された上流の配列；ならびにポリアデニル化シグナル、好ましくは配列番号２４のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む、ＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された下流の配列を含む発現カセットを含むベクターである。

【0096】

本出願の一実施形態では、ベクター、例えばプラスミドＤＮＡベクターまたはウイルスベクター（好ましくはアデノウイルスベクター、より好ましくはＡｄ２６またはＡｄ３５ベクター）は、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｏｌ抗原をコードする。好ましくは、ベクターは、配列番号３のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号３と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号３と１００％同一であるＨＢＶ Ｐｏｌ抗原のコード配列を含む。

【0097】

本出願の一実施形態では、ベクター、例えばプラスミドＤＮＡベクターまたはウイルスベクター（好ましくはアデノウイルスベクター、より好ましくはＡｄ２６またはＡｄ３５ベクター）は、配列番号２または配列番号１４のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする。好ましくは、ベクターは、配列番号１または配列番号１５のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号１または配列番号１５と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号１または配列番号１５と１００％同一である切断型ＨＢＶコア抗原のコード配列を含む。

【0098】

本出願のなお別の実施形態では、ベクター、例えばプラスミドＤＮＡベクターまたはウイルスベクター（好ましくはアデノウイルスベクター、より好ましくはＡｄ２６またはＡｄ３５ベクター）は、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｏｌ抗原、および配列番号２または配列番号１４のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原を含む融合タンパク質をコードする。好ましくは、ベクターは、配列番号１または配列番号１５と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号１および配列番号１５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号１または配列番号１５、より好ましくは配列番号１５と９８％、９９％または１００％同一である切断型ＨＢＶコア抗原のコード配列であって、配列番号３または配列番号１６と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号３または配列番号１６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号３または配列番号１６と、より好ましくは配列番号１６と９８％、９９％または１００％同一であるＨＢＶ Ｐｏｌ抗原のコード配列に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原のコード配列を含有する融合体のコード配列を含む。好ましくは切断型ＨＢＶコア抗原のコード配列は、配列番号２２と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号２２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号２２と９８％、９９％または１００％同一であるリンカーのコード配列を介してＨＢＶ Ｐｏｌ抗原のコード配列に作動可能に連結されている。本出願の特定の実施形態では、ベクターは、配列番号１６にさらに作動可能に連結された配列番号２２に作動可能に連結された、配列番号１５を有する融合体のコード配列を含む。

【0099】

本出願のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドおよび発現ベクターは、本開示を考慮して当技術分野で公知の任意の方法によって作製することができる。例えば、ＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドを、当業者に周知である標準的な分子生物学技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等を使用して発現ベクターに導入または「クローニング」することができる。

【0100】

細胞、ポリペプチドおよび抗体
本出願はまた、本明細書に記載の任意のポリヌクレオチドおよびベクターを含む細胞、好ましくは単離された細胞も提供する。細胞は、例えば組換えタンパク質の産生のために、またはウイルス粒子を産生するために使用することができる。

【0101】

本出願の実施形態は、本出願のＨＢＶ抗原を作製する方法にも関する。方法は、宿主細胞に、プロモーターに作動可能に連結された本出願のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターをトランスフェクトするステップ、トランスフェクトした細胞を、ＨＢＶ抗原の発現にとって適した条件下で増殖させるステップ、および任意選択で細胞において発現されたＨＢＶ抗原を精製または単離するステップを含む。ＨＢＶ抗原は、アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等を含む当技術分野で公知の任意の方法によって細胞から単離または収集することができる。組換えタンパク質発現のために使用する技術は、本開示を考慮して当業者に周知である。発現されたＨＢＶ抗原はまた、発現されたタンパク質を精製または単離することなく、例えばＨＢＶ抗原をコードする発現ベクターをトランスフェクトして、ＨＢＶ抗原の発現にとって適した条件で増殖させた細胞の上清を分析することによって、試験することもできる。

【0102】

このように、配列番号２、配列番号１４、または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む天然に存在しないまたは組換えポリペプチドも提供される。上記および以下に記載するように、これらの配列をコードする単離された核酸分子、プロモーターに作動可能に連結されたこれらの配列を含むベクター、およびポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはベクターを含む組成物もまた、本出願によって企図される。

【0103】

本出願の一実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号２と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、天然に存在しないまたは組換えポリペプチドは、配列番号２からなる。

【0104】

本出願の別の実施形態では、天然に存在しないまたは組換えポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号４と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、天然に存在しないまたは組換えポリペプチドは配列番号４を含む。

【0105】

本出願の別の実施形態では、天然に存在しないまたは組換えポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号１４と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、天然に存在しないまたは組換えポリペプチドは配列番号１４からなる。

【0106】

同様に、本出願の天然に存在しないポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片も提供する。本出願の一実施形態では、本出願の天然に存在しないＨＢＶ抗原に対して特異的である抗体は、別のＨＢＶ抗原に特異的に結合しない。例えば、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｏｌ抗原に特異的に結合する本出願の抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を有しないＨＢＶ Ｐｏｌ抗原に特異的に結合しない。

【0107】

本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２、二機能性ハイブリッド（例えば、Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17:105, 1987）、一本鎖（Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879, 1988; Bird et al., Science 242:423, 1988）、および変化した定常領域を有する抗体（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号明細書）を含む。

【0108】

本明細書で使用される場合、抗原に「特異的に結合する」抗体は、１×１０^－７Ｍまたはそれ未満のＫＤで抗原に結合する抗体を指す。好ましくは、抗原に「特異的に結合する」抗体は、１×１０^－８Ｍもしくはそれ未満、より好ましくは５×１０^－９Ｍもしくはそれ未満、１×１０^－９Ｍもしくはそれ未満、５×１０^－１０Ｍもしくはそれ未満、または１×１０^－１０Ｍもしくはそれ未満のＫＤで抗原に結合する。用語「ＫＤ」は、解離定数を指し、ＫｄのＫａに対する比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表記される。抗体のＫＤ値は、本開示を考慮して当技術分野で公知の方法を使用して決定することができる。例えば、抗体のＫＤは、表面プラズモン共鳴、例えばバイオセンサーシステム、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムを使用することによって、またはバイオレイヤー干渉技術、例えばＯｃｔｅｔ ＲＥＤ９６システムを使用することによって決定することができる。

【0109】

抗体のＫＤ値がより小さければ、抗体が標的抗原に結合する親和性はより高い。

【0110】

組成物、免疫原性組合せ、およびワクチン
本出願はまた、本出願に従う１つまたは複数のＨＢＶ抗原、ポリヌクレオチド、および／または１つまたは複数のＨＢＶ抗原をコードするベクターを含む組成物、免疫原性組合せ、より特にキット、およびワクチンにも関する。本明細書に記載の本出願のＨＢＶ抗原、ポリヌクレオチド（ＲＮＡおよびＤＮＡを含む）、および／またはベクターはいずれも、本出願の組成物、免疫原性組合せまたはキット、およびワクチンにおいて使用することができる。

【0111】

本出願は、配列番号２もしくは配列番号１４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原、もしくは配列番号４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする単離されたもしくは天然に存在しない核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、単離されたもしくは天然に存在しない核酸分子を含むベクター、および／または単離されたもしくは天然に存在しない核酸分子によってコードされる単離されたもしくは天然に存在しないポリペプチドを含む組成物を提供する。

【0112】

本出願の一実施形態では、組成物は、配列番号２または配列番号１４と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２または配列番号１４と１００％同一であるアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする単離されたまたは天然に存在しない核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。

【0113】

本出願の一実施形態では、組成物は、配列番号４と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号４と１００％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶ Ｐｏｌ抗原をコードする単離されたまたは天然に存在しない核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。

【0114】

本出願の一実施形態では、組成物は、配列番号２または配列番号１４と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２または配列番号１４と１００％同一であるアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離されたまたは天然に存在しない核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）；および配列番号４と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号４と１００％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶ Ｐｏｌ抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離されたまたは天然に存在しない核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。切断型ＨＢＶコア抗原およびＨＢＶ Ｐｏｌ抗原のコード配列は、同じ単離されたもしくは天然に存在しない核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、または２つの異なる単離されたもしくは天然に存在しない核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に存在し得る。

【0115】

本出願の一実施形態では、組成物は、配列番号２または配列番号１４と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２または配列番号１４と１００％同一であるアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター）を含む。

【0116】

本出願の一実施形態では、組成物は、配列番号４と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号４と１００％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶ Ｐｏｌ抗原をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター）を含む。

【0117】

本出願の一実施形態では、組成物は、配列番号２または配列番号１４と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２または配列番号１４と１００％同一であるアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター）；および配列番号４と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号４と１００％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶ Ｐｏｌ抗原をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター）を含む。切断型ＨＢＶコア抗原のコード配列を含むベクターおよびＨＢＶ Ｐｏｌ抗原のコード配列を含むベクターは、同じベクターまたは２つの異なるベクターであり得る。

【0118】

本出願の一実施形態では、組成物は、配列番号２または配列番号１４と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２または配列番号１４と１００％同一であるアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原であって、配列番号４と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号４と１００％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶ Ｐｏｌ抗原に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原、またはその逆を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター）を含む。好ましくは、融合タンパク質は、切断型ＨＢＶコア抗原をＨＢＶ Ｐｏｌ抗原に作動可能に連結する、またはその逆に連結するリンカーをさらに含む。好ましくは、リンカーは、アミノ酸配列（ＡｌａＧｌｙ）_ｎを有し、式中ｎは２～５の整数である。

【0119】

本出願の一実施形態では、組成物は、配列番号２または配列番号１４と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２または配列番号１４と１００％同一であるアミノ酸配列からなる単離されたまたは天然に存在しない切断型ＨＢＶコア抗原を含む。

【0120】

本出願の一実施形態では、組成物は、配列番号４と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号４と１００％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたまたは天然に存在しないＨＢＶ Ｐｏｌ抗原を含む。

【0121】

本出願の一実施形態では、組成物は、配列番号２または配列番号１４と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２または配列番号１４と１００％同一であるアミノ酸配列からなる単離されたまたは天然に存在しない切断型ＨＢＶコア抗原；および配列番号４と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号４と１００％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたまたは天然に存在しないＨＢＶ Ｐｏｌ抗原を含む。

【0122】

本出願の一実施形態では、組成物は、配列番号２または配列番号１４と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２または配列番号１４と１００％同一であるアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原であって、配列番号４と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号４と１００％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶ Ｐｏｌ抗原に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原を含む、またはその逆を含む、単離されたまたは天然に存在しない融合タンパク質を含む。好ましくは、融合タンパク質は、切断型ＨＢＶコア抗原をＨＢＶ Ｐｏｌ抗原に作動可能に連結する、またはその逆に連結するリンカーをさらに含む。好ましくは、リンカーは、アミノ酸配列（ＡｌａＧｌｙ）_ｎを有し、式中ｎは２～５の整数である。

【0123】

本出願はまた、本出願の実施形態に従う切断型ＨＢＶコア抗原およびＨＢＶ ｐｏｌ抗原を発現するポリヌクレオチドを含む免疫原性組合せまたはキットにも関する。本明細書に記載の本出願のＨＢＶコアおよびｐｏｌ抗原をコードする任意のポリヌクレオチドおよび／またはベクターを、本出願の免疫原性組合せまたはキットにおいて使用することができる。

【0124】

本出願の実施形態に従って、ワクチンの組合せまたはキットは：
（ａ）配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の天然に存在しない核酸分子であって、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有しない、第１の天然に存在しない核酸分子；
（ｂ）配列番号２または配列番号１４のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の天然に存在しない核酸分子；および
（ｃ）薬学的に許容可能な担体
を含み、
第１の天然に存在しない核酸分子および第２の天然に存在しない核酸分子は、同じ天然に存在しない核酸分子または２つの異なる天然に存在しない核酸分子に存在する。

【0125】

本出願の実施形態に従って、ワクチンの組合せまたはキットにおけるポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオチドから発現されたＨＢＶ抗原が、同じまたは異なるポリヌクレオチドから発現されたか否かによらず、共に融合されるかまたは個別のタンパク質として産生されるように、連結され得るかまたは個別であり得る。一実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチドは、発現されたタンパク質がまた個別のタンパク質であるが、組み合わせて使用されるように、同じまたは個別の組成物のいずれかとして組み合わせて使用される個別のベクター、例えば、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターに存在する。別の実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチドによってコードされるＨＢＶ抗原を、ＨＢＶコア－ｐｏｌ融合抗原が産生されるように、同じベクターから発現させることができる。任意選択で、コアおよびｐｏｌ抗原を、短いリンカーによって共に結合または融合することができる。あるいは、第１および第２のポリヌクレオチドによってコードされるＨＢＶ抗原は、コアおよびｐｏｌ抗原コード配列の間にリボソーム翻訳スリップ部位（シス－ヒドロラーゼ部位としても知られる）を使用して、単一のベクターから独立して発現させることができる。この戦略によって、個々のコアおよびｐｏｌ抗原が単一のｍＲＮＡ転写物から産生されるバイシストロニック発現ベクターが得られる。そのようなバイシストロニック発現ベクターから産生されるコアおよびｐｏｌ抗原は、ｍＲＮＡ転写物のコード配列の順序づけに応じて、追加のＮ末端またはＣ末端残基を有し得る。この目的のために使用することができるリボソーム翻訳スリップ部位の例には、手足口病ウイルス（ＦＭＤＶ）のＦＡ２翻訳スリップ部位が挙げられるがこれらに限定されない。別の可能性は、第１および第２のポリヌクレオチドによってコードされるＨＢＶ抗原を、２つの個別のベクター、すなわち１つがＨＢＶコア抗原をコードし、１つがＨＢＶ ｐｏｌ抗原をコードするベクターから独立して発現させることができることである。

【0126】

好ましい実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチドは、個別のベクター、例えばＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターに存在する。好ましくは個別のベクターは、同じ組成物に存在する。

【0127】

本出願の好ましい実施形態に従って、免疫原性組合せまたはキットは、第１のベクターに存在する第１のポリヌクレオチドおよび第２のベクターに存在する第２のポリヌクレオチドを含む。第１および第２のベクターは同じまたは異なり得る。好ましくは、ベクターはＤＮＡプラスミドである。

【0128】

本出願の特定の実施形態では、免疫原性組合せまたはキットは、配列番号２と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２と１００％同一であるアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクター；および配列番号４と少なくとも９８％同一である、好ましくは配列番号４と１００％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターを含む。

【0129】

本出願の特定の実施形態では、第１のベクターは第１のＤＮＡプラスミドであり、第２のベクターは第２のＤＮＡプラスミドである。第１および第２のＤＮＡプラスミドの各々は、複製開始点、好ましくは配列番号１０のｐＵＣ ＯＲＩ、および好ましくは配列番号１２と少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド配列を有するコドン最適化Ｋａｎ^ｒ遺伝子を含み、好ましくはｂｌａプロモーター、例えば配列番号９に示すｂｌａプロモーターの制御下にある抗生物質耐性カセットを含む。第１および第２のＤＮＡプラスミドの各々は、独立してプロモーター配列、エンハンサー配列、および第１のポリヌクレオチド配列または第２のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたシグナルペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つをさらに含む。好ましくは、第１および第２のＤＮＡプラスミドの各々は、第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された上流の配列を含み、上流の配列は、５’末端から３’末端に、配列番号７のプロモーター配列、配列番号８のエンハンサー配列、および配列番号６のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む。第１および第２のＤＮＡプラスミドの各々はまた、ＨＢＶ抗原のコード配列の下流に位置するポリアデニル化シグナル、例えば配列番号１１のｂＧＨポリアデニル化シグナルも含み得る。

【0130】

本出願のある特定の実施形態では、第１のベクターは第１のウイルスベクターであり、第２のベクターは第２のウイルスベクターである。好ましくは、第１および第２のウイルスベクターの各々は、アデノウイルスベクター、より好ましくはＡｄ２６またはＡｄ３５ベクターであって、本出願のＨＢＶ ｐｏｌ抗原または切断型ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド；５’末端から３’末端に、プロモーター配列、好ましくは配列番号１７のＣＭＶプロモーター配列、エンハンサー配列、好ましくは配列番号２３のＡｐｏＡＩ遺伝子断片配列、およびシグナルペプチド配列、好ましくは配列番号１９のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分泌シグナルをコードするポリヌクレオチド配列を含む、ＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された上流の配列；ならびにポリアデニル化シグナル、好ましくは配列番号２４のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む、ＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された下流の配列を含む発現カセットを含むアデノウイルスベクターである。

【0131】

別の好ましい実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチドは、単一のベクター、例えばＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターに存在する。好ましくは単一のベクターは、アデノウイルスベクター、より好ましくはＡｄ２６ベクターであって、本出願のＨＢＶ ｐｏｌ抗原および切断型ＨＢＶコア抗原をコードし、好ましくは融合タンパク質として本出願のＨＢＶ ｐｏｌ抗原および切断型ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド；５’末端から３’末端に、プロモーター配列、好ましくは配列番号１７のＣＭＶプロモーター配列、エンハンサー配列、好ましくは配列番号２３のＡｐｏＡＩ遺伝子断片配列、およびシグナルペプチド配列、好ましくは配列番号１９のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分泌シグナルをコードするポリヌクレオチド配列を含む、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原および切断型ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された上流の配列；ならびにポリアデニル化シグナル、好ましくは配列番号２４のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含むＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された下流の配列を含む発現カセットを含むアデノウイルスベクターである。

【0132】

本出願の免疫原性組合せが第１のベクター、例えばＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクター、および第２のベクター、例えばＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターを含む場合、第１および第２のベクターの各々の量は特に限定されない。例えば、第１のＤＮＡプラスミドおよび第２のＤＮＡプラスミドは、１０：１～１：１０の重量比で、例えば１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、または１：１０の重量比で存在し得る。好ましくは、第１および第２のＤＮＡプラスミドは、１：１の重量比で存在する。

【0133】

本出願の組成物および免疫原性組合せは、追加のＨＢＶ抗原および／または追加のＨＢＶ抗原もしくはその免疫原性断片をコードする追加のポリヌクレオチドまたはベクターを含み得る。しかし、特定の実施形態では、本出願の組成物および免疫原性組合せは、ある特定の抗原を含まない。

【0134】

特定の実施形態では、本出願の組成物または免疫原性組合せまたはキットは、ＨＢｓＡｇまたはＨＢｓＡｇをコードするポリヌクレオチド配列を含まない。

【0135】

別の特定の実施形態では、本出願の組成物または免疫原性組合せまたはキットは、ＨＢＶ Ｌタンパク質またはＨＢＶ Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含まない。

【0136】

本出願のなお別の特定の実施形態では、本出願の組成物または免疫原性組合せは、ＨＢＶエンベロープタンパク質またはＨＢＶエンベロープタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含まない。

【0137】

本出願の組成物および免疫原性組合せはまた、薬学的に許容可能な担体も含み得る。薬学的に許容可能な担体は、非毒性であり、活性成分の有効性を妨害してはならない。薬学的に許容可能な担体は、１つまたは複数の賦形剤、例えば結合剤、崩壊剤、膨張剤、懸濁剤、乳化剤、湿潤剤、潤滑剤、香味料、甘味料、保存剤、色素、溶解剤、およびコーティングを含み得る。薬学的に許容可能な担体は、ビヒクル、例えば脂質（ナノ）粒子を含み得る。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば筋肉内、皮内、皮下、経口、静脈内、皮下、粘膜内（例えば、腸）、鼻腔内、または腹腔内経路に依存し得る。液体注射可能調製物、例えば懸濁剤および液剤の場合、適した担体および添加剤は、水、グリコール、油、アルコール、保存剤、着色剤等を含む。固体経口調製物、例えば散剤、カプセル剤、カプレット、ゲルキャップおよび錠剤の場合、適した担体および添加剤は、デンプン、砂糖、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等を含む。鼻腔内スプレー／吸入混合物の場合、水溶液／懸濁液は、適した担体および添加剤として水、グリコール、油、エモリエント、安定剤、湿潤剤、保存剤、芳香剤、着香料等を含み得る。

【0138】

本出願の組成物および免疫原性組合せは、経口（腸内）投与および非経口注射を含むがこれらに限定されない、投与を容易にするためおよび有効性を改善するために対象への投与にとって適した任意の物質で製剤化することができる。非経口注射は、静脈内注射または注入、皮下注射、皮内注射、および筋肉内注射を含む。本出願の組成物はまた、経粘膜、眼、直腸、長時間作用型埋め込み、舌下投与、門脈循環を迂回する舌の下の口腔粘膜、吸入、または鼻腔内を含む他の投与経路のために製剤化することもできる。

【0139】

本出願の好ましい実施形態では、本出願の組成物および免疫原性組合せは、非経口注射のために、好ましくは皮下、皮内注射、または筋肉内注射のために製剤化され、より好ましくは筋肉内注射のために製剤化される。

【0140】

本出願の実施形態に従って、投与のための組成物および免疫原性組合せは、典型的には薬学的に許容可能な担体、例えば水性担体中の緩衝溶液、例えば緩衝食塩水等、例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。組成物および免疫原性組合せはまた、ｐＨ調節剤および緩衝剤等の生理的条件を近似するために必要な薬学的に許容可能な物質を含有し得る。例えば、プラスミドＤＮＡを含む本出願の組成物または免疫原性組合せは、薬学的に許容可能な担体としてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含有し得る。プラスミドＤＮＡは、例えば０．５ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬ、例えば０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、または５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。

【0141】

本出願の組成物および免疫原性組合せは、当技術分野で周知の方法に従ってワクチン（「免疫原性組成物」とも呼ばれる）として製剤化することができる。そのような組成物は、免疫応答を増強するためのアジュバントを含み得る。製剤における各々の構成要素の最適な比は、本開示を考慮して当業者に周知の技術によって決定することができる。

【0142】

本出願の特定の実施形態では、組成物または免疫原性組合せは、ＤＮＡワクチンである。ＤＮＡワクチンは、典型的には強い真核細胞プロモーターの制御下で目的の抗原をコードするポリヌクレオチドを含有する細菌プラスミドを含む。プラスミドが宿主の細胞の細胞質に送達されると、コードされた抗原が、内因性に産生され、プロセシングされる。得られた抗原は、典型的には、液性および細胞性免疫応答の両方を誘導する。ＤＮＡワクチンは、それらが少なくとも改善された安全性を提供し、温度安定であり、抗原性のバリアントを発現させるように容易に適合させることができ、および産生が単純であることから有利である。本出願の任意のＤＮＡプラスミドを使用してそのようなＤＮＡワクチンを調製することができる。

【0143】

本出願の他の特定の実施形態では、組成物または免疫原性組合せは、ＲＮＡワクチンである。ＲＮＡワクチンは、典型的には目的の抗原、例えばＨＢＶ抗原をコードする少なくとも１つの一本鎖ＲＮＡ分子を含む。ＲＮＡが宿主の細胞の細胞質に送達されると、コードされる抗原が内因性に産生されてプロセシングされ、ＤＮＡワクチンと類似の液性および細胞性免疫応答の両方を誘導する。ＲＮＡ配列をコドン最適化して、翻訳効率を改善することができる。ＲＮＡ分子は、安定性および／または翻訳を増強するために、本開示を考慮して当技術分野で公知の任意の方法で改変することができ、例えば少なくとも３０アデノシン残基のポリＡテールを付加することによって、および／またはＲＮＡ合成の際に取り込まれ得るかもしくはＲＮＡ転写後に酵素的に操作され得る改変リボヌクレオチド、例えば７－メチルグアノシンキャップによって５末端をキャッピングすることによって改変することができる。ＲＮＡワクチンはまた、アルファウイルス発現ベクターから作製された自己複製ＲＮＡワクチンでもあり得る。自己複製ＲＮＡワクチンは、ＨＢＶ抗原ＲＮＡの複製を制御するサブゲノムプロモーターの後にレプリカーゼの下流に位置する人工ポリＡテールを含む、アルファウイルス科に属するウイルスに由来するレプリカーゼＲＮＡ分子を含む。

【0144】

ある特定の実施形態では、アジュバントは、本出願の組成物または免疫原性組合せに含められるか、または本出願の組成物もしくは免疫原性組合せと同時投与される。アジュバントの使用は、任意選択であり、組成物をワクチン接種目的のために使用する場合、免疫応答をさらに増強することができる。本出願に従う同時投与または組成物に含めるために適したアジュバントは、好ましくはヒトにおいて潜在的に安全で、良好に認容され、および有効であるアジュバントでなければならない。アジュバントは、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ１、抗ＴＩＭ－３等）、ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ受容体アゴニスト（例えば、ＴＬＲ７アゴニストおよび／またはＴＬＲ８アゴニスト）、ＲＩＧ－１アゴニスト、ＩＬ－１５スーパーアゴニスト（Ａｌｔｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、変異体ＩＲＦ３およびＩＲＦ７遺伝子アジュバント、ＳＴＩＮＧアゴニスト（Ａｄｕｒｏ）、ＦＬＴ３Ｌ遺伝子アジュバント、ＩＬ－１２遺伝子アジュバント、およびＩＬ－７－ｈｙＦｃが挙げられるがこれらに限定されない低分子または抗体であり得る。アジュバントはまた、例えば以下の抗ＨＢＶ剤：ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤；イムノモジュレーター；ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ受容体７モジュレーター；ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ受容体８モジュレーター；ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ受容体３モジュレーター；インターフェロンアルファ受容体リガンド；ヒアルロニダーゼ阻害剤；ＩＬ－１０のモジュレーター；ＨＢｓＡｇ阻害剤；ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ受容体９モジュレーター；シクロフィリン阻害剤；ＨＢＶ予防用ワクチン；ＨＢＶ治療用ワクチン；ＨＢＶウイルス侵入阻害剤；ウイルスｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、より特に抗ＨＢＶアンチセンスオリゴヌクレオチド；低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、より特に抗ＨＢＶ ｓｉＲＮＡ；エンドヌクレアーゼモジュレーター；リボヌクレオチドレダクターゼの阻害剤；Ｂ型肝炎ウイルスＥ抗原阻害剤；Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原を標的とするＨＢＶ抗体；ＨＢＶ抗体；ＣＣＲ２ケモカインアンタゴニスト；サイモシンアゴニスト；サイトカイン、例えばＩＬ１２；キャプシドアセンブリモジュレーター、ヌクレオタンパク質阻害剤（ＨＢＶコアまたはキャプシドタンパク質阻害剤）；核酸ポリマー（ＮＡＰ）；レチノイン酸誘導遺伝子１の刺激剤；ＮＯＤ２の刺激剤；組換えサイモシンアルファ－１；Ｂ型肝炎ウイルス複製阻害剤；ＰＩ３Ｋ阻害剤；ｃｃｃＤＮＡ阻害剤；免疫チェックポイント阻害剤、例えばＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＰＤ－１阻害剤、ＴＩＭ－３阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、Ｌａｇ３阻害剤、およびＣＴＬＡ－４阻害剤；免疫細胞（より特にＴ細胞）において発現される共刺激受容体のアゴニスト、例えばＣＤ２７、ＣＤ２８等；ＢＴＫ阻害剤；ＨＢＶを処置するための他の薬物；ＩＤＯ阻害剤；アルギナーゼ阻害剤；ならびにＫＤＭ５阻害剤から選択することができる。

【0145】

本出願はまた、本出願の組成物および免疫原性組合せを作製する方法も提供する。組成物または免疫原性組合せを産生する方法は、本出願のＨＢＶ抗原をコードする単離されたポリヌクレオチド、ベクター、および／またはポリペプチドを、１つまたは複数の薬学的に許容可能な担体と混合するステップを含む。当業者は、そのような組成物を調製するために使用される通常の技術を熟知している。

【0146】

免疫応答を誘導する方法
本出願はまた、それを必要とする対象においてＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、本出願の組成物または免疫原性組成物の免疫原性有効量を対象に投与するステップを含む方法も提供する。本明細書に記載の本出願の組成物および免疫原性組合せのいずれも、本出願の方法に使用することができる。

【0147】

本明細書で使用される場合、用語「感染症」は、病原体による宿主の侵入を指す。病原体は、それが宿主に侵入することが可能で、宿主内で複製または繁殖することが可能である場合、「感染性」であると考えられる。感染性作用剤の例には、ウイルス、例えばＨＢＶおよびある特定の種のアデノウイルス、プリオン、細菌、真菌、原虫等が挙げられる。「ＨＢＶ感染症」は、具体的には、ＨＢＶによる宿主生物、例えば宿主生物の細胞および組織の侵入を指す。

【0148】

語句「免疫応答を誘導する」は、本明細書に記載の方法に関連して使用する場合、それを必要とする対象において、感染症、例えばＨＢＶ感染症に対して所望の免疫応答または効果を引き起こすことを包含する。「免疫応答を誘導する」はまた、病原体、例えばＨＢＶに対して処置するために治療免疫を提供することも包含する。本明細書で使用される場合、用語「治療免疫」または「治療的免疫応答」は、ワクチン接種した対象が、それに対するワクチン接種を行った病原体による感染症を制御することができること、例えばＨＢＶワクチンによるワクチン接種によって付与されたＨＢＶ感染症に対する免疫を意味する。一実施形態では、「免疫応答を誘導する」は、それを必要とする対象において免疫を生じること、例えばＨＢＶ感染症等の疾患に対する治療効果を提供することを意味する。ある特定の実施形態では、「免疫応答を誘導する」は、ＨＢＶ感染症に対する細胞性免疫、例えばＴ細胞応答を引き起こすまたは改善することを指す。ある特定の実施形態では、「免疫応答を誘導する」は、ＨＢＶ感染症に対する液性免疫応答を引き起こすまたは改善することを指す。ある特定の実施形態では、「免疫応答を誘導する」とは、ＨＢＶ感染症に対する細胞性および液性免疫応答を引き起こすまたは改善することを指す。

【0149】

本明細書で使用される場合、用語「保護免疫」または「保護免疫応答」は、ワクチン接種した対象が、それに対するワクチン接種を行った病原体による感染症を制御することができることを意味する。通常、「保護免疫応答」を有する対象は、ごく軽度から中等度の臨床症状を示すか、または症状を全く示さない。通常、ある特定の病原体に対して「保護免疫応答」、または「保護免疫」を有する対象は、前記病原体による感染症の結果として死亡することはない。

【0150】

典型的には、本出願の組成物および免疫原性組合せの投与は、ＨＢＶ感染後にＨＢＶに対する免疫応答を生成するか、または例えば治療的ワクチン接種の場合では、ＨＢＶ感染症に特徴的な症状を発症させる治療目的を有する。

【0151】

本明細書で使用される場合、「免疫原性有効量」または「免疫学的有効量」は、それを必要とする対象において所望の免疫効果または免疫応答を誘導するために十分な組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または抗原の量を意味する。免疫原性有効量は、それを必要とする対象において免疫応答を誘導するために、十分な量であり得る。免疫原性有効量は、それを必要とする対象において免疫を生じるために、例えばＨＢＶ感染症等の疾患に対する治療効果を提供するために十分な量であり得る。免疫原性有効量は、多様な要因、例えば対象の身体条件、年齢、体重、健康等；特定の応用、例えば保護免疫または治療免疫を提供すること；およびそれに対する免疫が望ましい特定の疾患、例えばウイルス感染症に応じて変化し得る。免疫原性有効量は、本開示を考慮して当業者によって容易に決定することができる。

【0152】

本出願の特定の実施形態では、免疫原性有効量は、以下の効果の１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれより多くを達成するために十分である組成物または免疫原性組合せの量を指す：（ｉ）ＨＢＶ感染症またはそれに関連する症状の重症度を低減または改善すること；（ｉｉ）ＨＢＶ感染症またはそれに関連する症状の持続を低減させること；（ｉｉｉ）ＨＢＶ感染症またはそれに関連する症状の進行を防止すること；（ｉｖ）ＨＢＶ感染症またはそれに関連する症状の退行を引き起こすこと；（ｖ）ＨＢＶ感染症またはそれに関連する症状の発生または発症を防止すること；（ｖｉ）ＨＢＶ感染症またはそれに関連する症状の再発を防止すること；（ｖｉｉ）ＨＢＶ感染症を有する対象の入院を低減させること；（ｖｉｉｉ）ＨＢＶ感染症を有する対象の入院期間を低減させること；（ｉｘ）ＨＢＶ感染症を有する対象の生存を増加させること；（ｘ）対象におけるＨＢＶ感染症を排除すること；（ｘｉ）対象におけるＨＢＶ複製を阻害または低減させること；ならびに／または（ｘｉｉ）別の治療の予防効果または治療効果を増強または改善すること。

【0153】

免疫原性有効量はまた、臨床的セロコンバージョンへの進展と整合するまでＨＢｓＡｇレベルを低減させるために；対象の免疫系による感染した肝細胞の低減に関連する持続的なＨＢｓＡｇクリアランスを達成するために；ＨＢＶ抗原特異的活性化Ｔ細胞集団を誘導するために；および／または１２ヶ月以内のＨＢｓＡｇの持続的喪失を達成するために十分な量でもあり得る。目標とする指標の例は、５００コピーのＨＢｓＡｇ国際単位（ＩＵ）の閾値より下のより低いＨＢｓＡｇおよび／またはより高いＣＤ８数を含む。

【0154】

一般的な指針として、ＤＮＡプラスミドを参照して使用する場合の免疫原性有効量は、ＤＮＡプラスミド全体の約０．１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬの範囲、例えば０．１ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．７５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、または１０ｍｇ／ｍＬであり得る。好ましくは、ＤＮＡプラスミドの免疫原性有効量は、８ｍｇ／ｍＬ未満、より好ましくは６ｍｇ／ｍＬ未満、さらにより好ましくは３～４ｍｇ／ｍＬ未満である。免疫原性有効量は、１つのベクターまたはプラスミド、または複数のベクターもしくはプラスミドに由来し得る。免疫原性有効量は、単一の組成物で、または複数の組成物で、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の組成物（例えば、錠剤、カプセル剤または注射剤、または皮内送達のために適合させた任意の組成物、例えば皮内送達パッチを使用する皮内送達）で投与することができ、複数のカプセル剤または注射剤の投与は、集合的に対象に免疫原性有効量を提供する。例えば、２つのＤＮＡプラスミドを使用する場合、免疫原性有効量は３～４ｍｇ／ｍＬであり、各プラスミドについて１．５～２ｍｇ／ｍＬであり得る。同様に、いわゆるプライム－ブーストレジメンにおいて、対象に免疫原性有効量を投与し、その後同じ対象に免疫原性有効量の別の用量を投与することが可能である。プライム－ブーストレジメンのこの一般的な考え方は、ワクチンの分野の当業者に周知である。さらなるブースター投与を、必要に応じて任意選択でレジメンに追加することができる。

【0155】

２つのＤＮＡプラスミド、例えばＨＢＶコア抗原をコードする第１のＤＮＡプラスミドおよびＨＢＶ ｐｏｌ抗原をコードする第２のＤＮＡプラスミドを含む免疫原性組合せを、両方のプラスミドを混合するステップおよび混合物を単一の解剖学的部位に送達するステップによって、対象に投与することができる。あるいは、各々が単一の発現プラスミドを送達する２つの個別の免疫を実施することができる。そのような実施形態では、両方のプラスミドを混合物として単一の免疫として投与するかまたは２つの個別の免疫として投与するかによらず、第１のＤＮＡプラスミドおよび第２のＤＮＡプラスミドを、１０：１～１：１０の重量比で、例えば１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、または１：１０の重量比で投与することができる。好ましくは、第１および第２のＤＮＡプラスミドは、１：１の重量比で投与される。

【0156】

好ましくは、本出願の方法に従って処置される対象は、ＨＢＶ感染対象、特に慢性ＨＢＶ感染症を有する対象である。急性ＨＢＶ感染症は、生得の免疫系の効率的な活性化がその後の広い適応性の応答（例えば、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞、中和抗体）によって補完されることによって特徴付けられ、これは通常、感染した肝細胞の複製の抑制または除去の成功をもたらす。これに対し、そのような応答は、ウイルス負荷および抗原負荷が高い場合には損なわれるかまたは減損し、例えばＨＢＶエンベロープタンパク質が大量に産生され、感染性ウイルスに対して１，０００倍過剰量でサブウイルス粒子として放出され得る。

【0157】

慢性ＨＢＶ感染症は、ウイルス量、肝酵素レベル（壊死炎症活性）、ＨＢｅＡｇ、またはＨＢｓＡｇ量、またはこれらの抗原に対する抗体の存在によって特徴付けられる語句として記載される。ｃｃｃＤＮＡレベルは、およそ１０～５０コピー／細胞で比較的一定のままであるが、ウイルス血症はかなり多様であり得る。ｃｃｃＤＮＡ種の持続は慢性化をもたらす。より詳しくは、慢性ＨＢＶ感染症のフェーズは：（ｉ）高いウイルス量および正常またはわずかに上昇した肝酵素によって特徴付けられる免疫寛容フェーズ；（ｉｉ）肝酵素の有意な上昇を伴うウイルス複製レベルの低下または減少が観察される免疫活性化ＨＢｅＡｇ陽性フェーズ；（ｉｉｉ）血清中の低いウイルス量および正常な肝酵素レベルを伴う低い複製状態の後にＨＢｅＡｇセロコンバージョンが起こり得る不活性なＨＢｓＡｇキャリアフェーズ；および（ｉｖ）ウイルス複製が周期的に起こり（再活性化）、肝酵素レベルの同時の変動、プレコアおよび／または基礎コアプロモーターの変異が一般的であり、ＨＢｅＡｇが感染細胞によって産生されないＨＢｅＡｇ陰性フェーズを含む。

【0158】

本明細書で使用される場合、「慢性ＨＢＶ感染症」は、６ヶ月より長いＨＢＶの検出可能な存在を有する対象を指す。慢性ＨＢＶ感染症を有する対象は、慢性ＨＢＶ感染症のいずれかのフェーズにあり得る。慢性ＨＢＶ感染症は、当技術分野でその通常の意味に従って理解される。慢性ＨＢＶ感染症は、例えば急性ＨＢＶ感染症後６ヶ月またはそれより長い間のＨＢｓＡｇの持続によって特徴付けられ得る。例えば、本明細書で呼ぶ慢性ＨＢＶ感染症は、米国疾病予防管理センター（ＣＤＣ）によって公表された定義に従い、それに従って慢性ＨＢＶ感染症を以下の臨床基準によって特徴付けることができる：（ｉ）Ｂ型肝炎コア抗原に対するＩｇＭ抗体（ＩｇＭ抗ＨＢｃ）陰性およびＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）陽性、Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）陽性、もしくはＢ型肝炎ウイルスＤＮＡに関する核酸試験陽性、または（ｉｉ）ＨＢｓＡｇもしくはＨＢＶ ＤＮＡの核酸試験陽性、または少なくとも６ヶ月間空けて２回のＨＢｅＡｇ陽性。

【0159】

好ましくは、免疫原性有効量は、慢性ＨＢＶ感染症を処置するために十分である本出願の組成物または免疫原性組合せの量を指す。

【0160】

一部の実施形態では、慢性ＨＢＶ感染症を有する対象は、ヌクレオシドアナログ（ＮＵＣ）処置を受けており、ＮＵＣ抑制されている。本明細書で使用される場合、「ＮＵＣ抑制」は、ＨＢＶの検出不能なウイルスレベルおよび安定なアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを少なくとも６ヶ月間有する対象を指す。ヌクレオシド／ヌクレオチドアナログ処置の例は、ＨＢＶポリメラーゼ阻害剤、例えばエンタカビルおよびテノフォビルを含む。好ましくは、慢性ＨＢＶ感染症を有する対象は、進行した肝線維症または肝硬変を有しない。そのような対象は典型的に、線維症に関してＭＥＴＡＶＩＲスコア３未満および９ｋＰａ未満のフィブロスキャン結果を有するであろう。ＭＥＴＡＶＩＲスコアは、Ｂ型肝炎患者の肝生検における組織病理学的評価によって炎症および線維症の程度を評価するために一般的に使用される採点システムである。採点システムは、２つの標準化された数字：炎症の程度を反映する数字、および線維症の程度を反映する数字を割付する。

【0161】

慢性ＨＢＶの排除または低減は、ウイルス性肝硬変および肝細胞癌を含む重度の肝疾患の早期の疾患の妨害を可能にし得ると考えられている。このように、本出願の方法はまた、ＨＢＶ誘導疾患を処置するための治療としても使用することができる。ＨＢＶ誘導疾患の例には、肝硬変、がん（例えば、肝細胞癌）、および線維症、特にＭＥＴＡＶＩＲスコアが線維症に関して３またはそれより高いことによって特徴付けられる進行線維症が挙げられるがこれらに限定されない。そのような実施形態では、免疫原性有効量は、１２ヶ月以内のＨＢｓＡｇの持続的な喪失および臨床疾患（例えば、肝硬変、肝細胞癌等）の有意な減少を達成するために十分な量である。

【0162】

本出願の実施形態に従う方法は、それを必要とする対象に、本出願の組成物と組み合わせて別の免疫原製剤（例えば、別のＨＢＶ抗原または他の抗原）、または別の抗ＨＢＶ剤（例えば、ヌクレオシドアナログまたは他の抗ＨＢＶ剤）を投与するステップをさらに含む。例えば、別の抗ＨＢＶ剤または免疫原性剤は、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ１、抗ＴＩＭ－３等）、ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ受容体アゴニスト（例えば、ＴＬＲ７アゴニストおよび／またはＴＬＲ８アゴニスト）、ＲＩＧ－１アゴニスト、ＩＬ－１５スーパーアゴニスト（Ａｌｔｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、変異体ＩＲＦ３およびＩＲＦ７遺伝子アジュバント、ＳＴＩＮＧアゴニスト（Ａｄｕｒｏ）、ＦＬＴ３Ｌ遺伝子アジュバント、ＩＬ－１２遺伝子アジュバント、ＩＬ－７－ｈｙＦｃ；ＨＢＶ ｅｎｖに結合するＣＡＲ－Ｔ（Ｓ－ＣＡＲ細胞）；キャプシドアセンブリモジュレーター；ｃｃｃＤＮＡ阻害剤、ＨＢＶポリメラーゼ阻害剤（例えば、エンテカビルおよびテノフォビル）が挙げられるがこれらに限定されない低分子または抗体であり得る。１つまたは複数の他の抗ＨＢＶ活性剤は、例えば低分子、抗体またはその抗原結合性断片、ポリペプチド、タンパク質、または核酸であり得る。１つまたは複数の他の抗ＨＢＶ剤は、例えば、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤；イムノモジュレーター；ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ受容体７モジュレーター；ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ受容体８モジュレーター；ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ受容体３モジュレーター；インターフェロンアルファ受容体リガンド；ヒアルロニダーゼ阻害剤；ＩＬ－１０のモジュレーター；ＨＢｓＡｇ阻害剤；ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ受容体９モジュレーター；シクロフィリン阻害剤；ＨＢＶ予防用ワクチン；ＨＢＶ治療用ワクチン；ＨＢＶウイルス侵入阻害剤；ウイルスｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、より特に抗ＨＢＶアンチセンスオリゴヌクレオチド；低分子干渉ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡ）、より特に抗ＨＢＶ ｓｉＲＮＡ；エンドヌクレアーゼモジュレーター；リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤；Ｂ型肝炎ウイルスＥ抗原阻害剤；Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原を標的とするＨＢＶ抗体；ＨＢＶ抗体；ＣＣＲ２ケモカインアンタゴニスト；サイモシンアゴニスト；サイトカイン、例えばＩＬ１２；キャプシドアセンブリモジュレーター、ヌクレオタンパク質阻害剤（ＨＢＶコアまたはキャプシドタンパク質阻害剤）；核酸ポリマー（ＮＡＰ）；レチノイン酸誘導遺伝子１の刺激剤；ＮＯＤ２の刺激剤；組換えサイモシンアルファ－１；Ｂ型肝炎ウイルス複製阻害剤；ＰＩ３Ｋ阻害剤；ｃｃｃＤＮＡ阻害剤；免疫チェックポイント阻害剤、例えばＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＰＤ－１阻害剤、ＴＩＭ－３阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、Ｌａｇ３阻害剤、およびＣＴＬＡ－４阻害剤；免疫細胞（より特に、Ｔ細胞）において発現される共刺激受容体のアゴニスト、例えばＣＤ２７、ＣＤ２８等；ＢＴＫ阻害剤；ＨＢＶを処置するための他の薬物；ＩＤＯ阻害剤；アルギナーゼ阻害剤；およびＫＤＭ５阻害剤から選択することができる。

【0163】

送達方法
本出願の組成物および免疫原性組合せは、非経口投与（例えば、筋肉内、皮下、静脈内、または皮内注射）、経口投与、経皮投与、および鼻腔内投与を含むがこれらに限定されない、本開示を考慮して当業者に公知の任意の方法によって対象に投与することができる。好ましくは、組成物および免疫原性組合せは、非経口（例えば、筋肉内注射または皮内注射によって）、または経皮投与される。

【0164】

組成物または免疫原性組合せが１つまたは複数のＤＮＡプラスミドを含む本出願の一部の実施形態では、投与は皮膚を通しての注射、例えば筋肉内または皮内注射、好ましくは筋肉内注射であり得る。筋肉内注射は、電気穿孔、すなわちＤＮＡプラスミドの細胞への送達を容易にするための電場の印加と組み合わせることができる。本明細書で使用される場合、用語「電気穿孔」は、生体膜において顕微鏡的経路（孔）を誘導するために膜内外で電場パルスを使用することを指す。Ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔の間、適切な大きさおよび持続の電場を細胞に印加し、細胞膜透過性が一過性に増強された状態を誘導し、このようにして単独では細胞膜を通過することができない分子の細胞取り込みを可能にする。電気穿孔によるそのような孔の作製は、細胞膜の１つの側から他方の側への生体分子、例えばプラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物等の通過を容易にする。ＤＮＡワクチンを送達するためのＩｎ ｖｉｖｏ電気穿孔は、宿主細胞によるプラスミド取り込みを有意に増加させることが示されているが、注射部位で軽度から中等度の炎症ももたらす。その結果、皮内または筋肉内電気穿孔では、通常の注射と比較するとトランスフェクション効率および免疫応答が有意に改善される（例えば、それぞれ最大１，０００倍および１００倍）。

【0165】

典型的な実施形態では、電気穿孔は、筋肉内注射と組み合わせる。しかし、電気穿孔を非経口投与の他の形態、例えば皮内注射、皮下注射等と組み合わせることも可能である。

【0166】

本出願の組成物、免疫原性組合せ、またはワクチンの電気穿孔による投与は、可逆的な孔を細胞膜に形成させるために有効なエネルギーのパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成することができる電気穿孔デバイスを使用して達成することができる。電気穿孔デバイスは、電気穿孔構成要素および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを含み得る。電気穿孔構成要素は、電気穿孔デバイスの以下の構成要素の１つまたは複数を含み得る：コントローラー、電流波形ジェネレーター、インピーダンステスター、波形ロガー、インプットエレメント、ステータス報告エレメント、接続口、メモリー構成要素、電源、および電源スイッチ。電気穿孔は、ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔デバイスを使用して達成することができる。本出願の組成物および免疫原性組合せ、特にＤＮＡプラスミドを含むものの送達を容易にすることができる電気穿孔デバイスおよび電気穿孔方法の例は、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｂｌｕｅ Ｂｅｌｌ、ＰＡ）、Ｅｌｇｅｎエレクトロポレーター（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．）Ｔｒｉ－Ｇｒｉｄ（商標）送達システム（Ｉｃｈｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ ９２１２１）、ならびにその全ての全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第７，６６４，５４５号明細書、米国特許第８，２０９，００６号明細書、米国特許第９，４５２，２８５号明細書、米国特許第５，２７３，５２５号明細書、米国特許第６，１１０，１６１号明細書、米国特許第６，２６１，２８１号明細書、米国特許第６，９５８，０６０号明細書、および米国特許第６，９３９，８６２号明細書、米国特許第７，３２８，０６４号明細書、米国特許第６，０４１，２５２号明細書、米国特許第５，８７３，８４９号明細書、米国特許第６，２７８，８９５号明細書、米国特許第６，３１９，９０１号明細書、米国特許第６，９１２，４１７号明細書、米国特許第８，１８７，２４９号明細書、米国特許第９，３６４，６６４号明細書、米国特許第９，８０２，０３５号明細書、米国特許第６，１１７，６６０号明細書、および国際特許出願国際公開第２０１７１７２８３８号明細書に記載されるものを含む。Ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔デバイスの他の例は、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、代理人文書番号６８８０９７－４０５ＷＯ１として本出願と同じ日に提出されている「Method and Apparatus for the Delivery of Hepatitis B Virus (HBV) Vaccines」と題する国際特許出願に記載されている。同様に、本出願の組成物および免疫原性組合せを送達するための応用によって企図されるのは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第６，６９７，６６９号明細書に記載されるパルス電場の使用である。

【0167】

組成物または免疫原性組合せが１つまたは複数のＤＮＡプラスミドを含む本出願の他の実施形態では、投与方法は経皮である。経皮投与は、ＤＮＡプラスミドの細胞への送達を容易にするために表皮アブレーションと組み合わせることができる。例えば、表皮アブレーションのために皮膚パッチを使用することができる。皮膚パッチを除去すると、組成物または免疫原性組合せが剥削された皮膚に堆積することができる。

【0168】

送達方法は、上記の実施形態に限定されず、細胞内送達のための任意の手段を使用することができる。本出願の方法によって企図される他の細胞内送達方法には、リポソーム封入、ナノ粒子等が挙げられるがこれらに限定されない。

【0169】

アジュバント
本出願の一部の実施形態では、ＨＢＶに対する免疫応答を誘導する方法は、アジュバントを投与するステップをさらに含む。用語「アジュバント」および「免疫刺激剤」は、本明細書において互換的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１つまたは複数の物質として定義される。この文脈において、アジュバントは、本出願のＨＢＶ抗原および抗原性ＨＢＶポリペプチドに対する免疫応答を増強するために使用される。

【0170】

本出願の実施形態に従って、アジュバントは、本出願の免疫原性組合せもしくは組成物に存在し得るか、または個別の組成物で投与することができる。アジュバントは、例えば低分子または抗体であり得る。本出願で使用するために適したアジュバントの例には、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ１、抗ＴＩＭ－３等）、ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ受容体アゴニスト（例えば、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８ アゴニスト）、ＲＩＧ－１アゴニスト、ＩＬ－１５スーパーアゴニスト（Ａｌｔｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、変異体ＩＲＦ３およびＩＲＦ７遺伝子アジュバント、ＳＴＩＮＧアゴニスト（Ａｄｕｒｏ）、ＦＬＴ３Ｌ遺伝子アジュバント、ＩＬ－１２遺伝子アジュバント、およびＩＬ－７－ｈｙＦｃが挙げられるがこれらに限定されない。アジュバントの例は、例えば以下の抗ＨＢＶ剤：ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤；イムノモジュレーター；ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ受容体７モジュレーター；ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ受容体８モジュレーター；ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ受容体３モジュレーター；インターフェロンアルファ受容体リガンド；ヒアルロニダーゼ阻害剤；ＩＬ－１０のモジュレーター；ＨＢｓＡｇ阻害剤；ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ受容体９モジュレーター；シクロフィリン阻害剤；ＨＢＶ予防用ワクチン；ＨＢＶ治療用ワクチン；ＨＢＶウイルス侵入阻害剤；ウイルスｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、より特に抗ＨＢＶアンチセンスオリゴヌクレオチド；低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、より特に抗ＨＢＶ ｓｉＲＮＡ；エンドヌクレアーゼモジュレーター；リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤；Ｂ型肝炎ウイルスＥ抗原阻害剤；Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原を標的とするＨＢＶ抗体；ＨＢＶ抗体；ＣＣＲ２ケモカインアンタゴニスト；サイモシンアゴニスト；サイトカイン、例えばＩＬ１２；キャプシドアセンブリモジュレーター、ヌクレオタンパク質阻害剤（ＨＢＶコアまたはキャプシドタンパク質阻害剤）；核酸ポリマー（ＮＡＰ）；レチノイン酸誘導遺伝子１の刺激剤；ＮＯＤ２の刺激剤；組換えサイモシンアルファ－１；Ｂ型肝炎ウイルス複製阻害剤；ＰＩ３Ｋ阻害剤；ｃｃｃＤＮＡ阻害剤；免疫チェックポイント阻害剤、例えばＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＰＤ－１阻害剤、ＴＩＭ－３阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、Ｌａｇ３阻害剤、およびＣＴＬＡ－４阻害剤；免疫細胞（より特にＴ細胞）において発現される共刺激受容体のアゴニスト、例えばＣＤ２７、ＣＤ２８等；ＢＴＫ阻害剤；ＨＢＶを処置するための他の薬物；ＩＤＯ阻害剤；アルギナーゼ阻害剤；ならびにＫＤＭ５阻害剤から選択することができる。

【0171】

本出願の組成物および免疫原性組合せはまた、少なくとも１つの他の抗ＨＢＶ剤と組み合わせて投与することもできる。本出願と共に使用するために適した抗ＨＢＶ剤の例には、低分子、抗体、および／またはＨＢＶ ｅｎｖに結合するＣＡＲ－Ｔ治療（Ｓ－ＣＡＲ細胞）、キャプシドアセンブリモジュレーター、ＴＬＲアゴニスト（例えば、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニスト）、ｃｃｃＤＮＡ阻害剤、ＨＢＶポリメラーゼ阻害剤（例えば、エンテカビルおよびテノフォビル）、および／または免疫チェックポイント阻害剤等が挙げられるがこれらに限定されない。少なくとも１つの抗ＨＢＶ剤は、例えば、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤；イムノモジュレーター；ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ受容体７モジュレーター；ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ受容体８モジュレーター；ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ受容体３モジュレーター；インターフェロンアルファ受容体リガンド；ヒアルロニダーゼ阻害剤；ＩＬ－１０のモジュレーター；ＨＢｓＡｇ阻害剤；ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ受容体９モジュレーター；シクロフィリン阻害剤；ＨＢＶ予防用ワクチン；ＨＢＶ治療用ワクチン；ＨＢＶウイルス侵入阻害剤；ウイルスｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、より特に抗ＨＢＶアンチセンスオリゴヌクレオチド；低分子干渉ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡ）、より特に抗ＨＢＶ ｓｉＲＮＡ；エンドヌクレアーゼモジュレーター；リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤；Ｂ型肝炎ウイルスＥ抗原阻害剤；Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原を標的とするＨＢＶ抗体；ＨＢＶ抗体；ＣＣＲ２ケモカインアンタゴニスト；サイモシンアゴニスト；サイトカイン、例えばＩＬ１２；キャプシドアセンブリモジュレーター、ヌクレオタンパク質阻害剤（ＨＢＶコアまたはキャプシドタンパク質阻害剤）；核酸ポリマー（ＮＡＰｓ）；レチノイン酸誘導遺伝子１の刺激剤；ＮＯＤ２の刺激剤；組換えサイモシンアルファ－１；Ｂ型肝炎ウイルス複製阻害剤；ＰＩ３Ｋ阻害剤；ｃｃｃＤＮＡ阻害剤；免疫チェックポイント阻害剤、例えばＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＰＤ－１阻害剤、ＴＩＭ－３阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、Ｌａｇ３阻害剤、およびＣＴＬＡ－４阻害剤；免疫細胞（より特に、Ｔ細胞）において発現される共刺激受容体のアゴニスト、例えばＣＤ２７、ＣＤ２８等；ＢＴＫ阻害剤；ＨＢＶを処置するための他の薬物；ＩＤＯ阻害剤；アルギナーゼ阻害剤；およびＫＤＭ５阻害剤から選択することができる。そのような抗ＨＢＶ剤は、本出願の組成物および免疫原性組合せと同時にまたは連続的に投与することができる。

【0172】

プライム／ブースト免疫方法
本出願の実施形態はまた、いわゆるプライム－ブーストレジメンで、組成物または免疫原性組合せの免疫原性有効量を対象に投与するステップ、およびその後に同じ対象に組成物または免疫原性組合せの免疫原性有効量の別の用量を投与するステップも企図する。このように、一実施形態では、本出願の組成物または免疫原性組合せは、免疫応答をプライミングするために使用されるプライマーワクチンである。別の実施形態では、本出願の組成物または免疫原性組合せは、免疫応答をブーストするために使用されるブースターワクチンである。本出願のプライミングおよびブースティングワクチンは、本明細書に記載の本出願の方法において使用することができる。プライム－ブーストレジメンのこの一般的な考え方は、ワクチン技術分野の当業者に周知である。本明細書に記載の本出願の組成物および免疫原性組合せのいずれも、ＨＢＶに対する免疫応答をプライミングおよび／またはブースティングするためのプライムおよび／またはブーストワクチンとして使用することができる。

【0173】

本出願の一部の実施形態では、本出願の組成物または免疫原性組合せは、免疫をプライミングするために投与することができる。組成物または免疫原性組合せは、免疫をブースティングするために再投与することができる。組成物またはワクチン組合せのさらなるブースター投与を、任意選択で必要に応じてレジメンに追加することができる。アジュバントは、免疫をブースティングするために使用される本出願の組成物に存在することができ、ブースティング免疫のために本出願の組成物または免疫原性組合せと共に投与される個別の組成物に存在することができ、またはブースティング免疫として単独で投与することができる。アジュバントがレジメンに含まれるそれらの実施形態では、アジュバントは、好ましくは免疫をブースティングするため使用される。

【0174】

プライム－ブーストレジメンの例示的なおよび非制限的な例は、本出願の組成物または免疫原性組合せの免疫原性有効量の１回用量を対象に投与して、免疫応答をプライミングするステップ、および次に本出願の組成物または免疫原性組合せの免疫原性有効量の別の用量を投与して、免疫応答をブーストするステップを含み、ブースティング免疫は、プライミング免疫を最初に投与した約２～６週間後、好ましくは４週間後に初めて投与される。任意選択で、プライミング免疫を最初に投与した１０～１４週間後、好ましくは１２週間後に、組成物または免疫原性組合せまたは他のアジュバントのさらなるブースティング免疫を投与する。

【0175】

キット
同様に本明細書において本出願の免疫原性組合せを含むキットも提供される。キットは、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを個別の組成物中に含むことができ、またはキットは、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを単一の組成物中に含むことができる。キットはさらに、１つまたは複数のアジュバントまたは免疫刺激剤、および／または他の抗ＨＢＶ剤を含み得る。

【0176】

動物またはヒト生物において投与時に抗ＨＢＶ免疫応答を誘導または刺激する能力は、当技術分野で標準的な多様なアッセイを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで評価することができる。免疫応答の開始および活性化を評価するために利用することができる技術の一般的な説明に関しては、例えばＣｏｌｉｇａｎら（1992 and 1994, Current Protocols in Immunology; ed. J Wiley & Sons Inc, National Institute of Health）を参照されたい。細胞性免疫の測定は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞に由来する細胞を含む活性化エフェクター細胞によって分泌されるサイトカインプロファイルの測定（例えば、ＥＬＩＳＰＯＴによるＩＬ－１０またはＩＦＮガンマ産生細胞の定量）によって、免疫エフェクター細胞の活性化状態の決定によって（例えば、古典的な［^３Ｈ］チミジン取り込みによるＴ細胞増殖アッセイまたはフローサイトメトリーに基づくアッセイ）、または感作された対象における抗原特異的Ｔリンパ球に関してアッセイすることによって（例えば、細胞傷害性アッセイにおけるペプチド特異的溶解等）実施することができる。

【0177】

細胞性および／または液性応答を刺激する能力は、抗体結合および／または結合の競合によって決定することができる（例えば、Harlow, 1989, Antibodies, Cold Spring Harbor Pressを参照されたい）。例えば、免疫原を提供する組成物の投与に応答して産生される抗体の力価を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定することができる。免疫応答はまた、ウイルスの中和が、特異的抗体によるウイルスの反応／阻害／中和を通しての感染性の喪失として定義される中和抗体アッセイによっても測定することができる。免疫応答はさらに、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）アッセイによって測定することができる。

【0178】

実施形態
実施形態第１節
実施形態１は、配列番号２または配列番号１４と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２または配列番号１４と１００％同一であるアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離されたまたは天然に存在しない核酸分子であって、好ましくは、切断型ＨＢＶコア抗原は、哺乳動物において少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答を誘導することが可能であり、より好ましくは、切断型ＨＢＶコア抗原は、哺乳動物において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、ＣおよびＤに対するＴ細胞応答を誘導することが可能であり；さらにより好ましくは、切断型ＨＢＶコア抗原は、ヒト対象において、少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能であり；ならびに最も好ましくは、切断型ＨＢＶコア抗原コード配列は、配列番号１または配列番号１５と少なくとも９０％、例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であるポリヌクレオチドを含む、単離されたまたは天然に存在しない核酸分子を含む。

【0179】

実施形態２は、切断型ＨＢＶコア抗原が配列番号２または配列番号１４のアミノ酸配列からなる、実施形態１の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0180】

実施形態３は、ＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結されたシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態１または実施形態２に記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0181】

実施形態４は、シグナル配列が配列番号６または配列番号１９のアミノ酸配列を含み、好ましくはシグナル配列が配列番号５または配列番号１８のポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態３に記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0182】

実施形態５は、切断型コアＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号１または配列番号１５と少なくとも９０％同一である、実施形態１～４のいずれか１つに記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0183】

実施形態６は、切断型ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号１または配列番号１５のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態５に記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0184】

実施形態７は、配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む、天然に存在しない核酸分子であって、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有しない、天然に存在しない核酸分子を含む。

【0185】

実施形態８は、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が哺乳動物において少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答を誘導することが可能であり、好ましくはＨＢＶポリメラーゼ抗原が、哺乳動物において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、ＣおよびＤに対するＴ細胞応答を誘導することが可能であり、ならびにより好ましくは、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能である、実施形態７に記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0186】

実施形態９は、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が配列番号４のアミノ酸配列を含む、実施形態７に記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0187】

実施形態１０は、ＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結されたシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態７～９のいずれか１つに記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0188】

実施形態１１は、シグナル配列が、配列番号６または配列番号１９のアミノ酸配列を含み、好ましくはシグナル配列が配列番号５または配列番号１８のポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態１０に記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0189】

実施形態１２は、第１のポリヌクレオチド配列が配列番号３または配列番号１６と少なくとも９０％同一である、実施形態７～１１のいずれか１つに記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0190】

実施形態１３は、第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号３または配列番号１６のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１２に記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0191】

実施形態１４は、配列番号２または配列番号１４のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態７～１３のいずれか１つに記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0192】

実施形態１５は、第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１または配列番号１５と少なくとも９０％同一である、実施形態１４に記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0193】

実施形態１６は、第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１または配列番号１５のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１５に記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0194】

実施形態１７は、ＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原を含む融合タンパク質をコードする、実施形態１４～１６のいずれか１つに記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0195】

実施形態１８は、融合タンパク質が、リンカーを介してＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原を含む、実施形態１７に記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0196】

実施形態１９は、リンカーが、アミノ酸配列（ＡｌａＧｌｙ）_ｎを含み、ｎが２～５の整数であり、好ましくはリンカーが配列番号２２を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態１８に記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0197】

実施形態２０は、融合タンパク質が、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、実施形態１９に記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0198】

実施形態２１は、融合タンパク質がシグナル配列をさらに含み、好ましくはシグナル配列が、配列番号６または配列番号１９のアミノ酸配列を含み、より好ましくはシグナル配列が配列番号５または配列番号１８のポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態１７～２０のいずれか１つに記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0199】

実施形態２２は、天然に存在しない核酸分子が、プロモーター配列、任意選択で１つまたは複数の追加の調節配列をさらに含み、好ましくは、プロモーター配列は、配列番号７または配列番号１７のポリヌクレオチド配列を含み、ならびに追加の調節配列は、配列番号８または配列番号２３のエンハンサー配列、および配列番号１１または配列番号２４のポリアデニル化シグナル配列からなる群から選択される、実施形態７～２１のいずれか１つに記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0200】

実施形態２３は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ＨＢＶエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原、およびＨＢＶ Ｌタンパク質抗原からなる群から選択されるＨＢＶ抗原をコードしない、実施形態７～２２のいずれかに記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0201】

実施形態２４は、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の天然に存在しない核酸分子を含むベクターを含む。

【0202】

実施形態２５は、天然に存在しない核酸分子が、５’末端から３’末端にプロモーター配列、エンハンサー配列、シグナルペプチドコード配列、第１のポリヌクレオチド配列、およびポリアデニル化シグナル配列を含み、任意選択で天然に存在しない核酸分子が、第２のポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態２４に記載のベクターを含む。

【0203】

実施形態２６は、ベクターがプラスミドＤＮＡベクターであり、プラスミドＤＮＡベクターが複製開始点および抗生物質耐性遺伝子をさらに含む、実施形態２４または２５に記載のベクターを含む。

【0204】

実施形態２７は、プラスミドＤＮＡベクターが、配列番号１０のポリヌクレオチド配列を含む複製開始点、配列番号１２のポリヌクレオチド配列を含む抗生物質耐性遺伝子、配列番号７のポリヌクレオチド配列を含むプロモーター配列、配列番号８のポリヌクレオチド配列を含むエンハンサー配列、配列番号５のポリヌクレオチド配列を含むシグナルペプチドコード配列、配列番号３のポリヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチド配列、および配列番号１１のポリヌクレオチド配列を含むポリアデニル化シグナル配列、ならびに任意選択で配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチド配列を含有する、実施形態２６に記載のベクターを含む。

【0205】

実施形態２８は、アデノウイルスベクター、好ましくはＡｄ２６またはＡｄ３５ベクターである、実施形態２４または２５に記載のベクターを含む。

【0206】

実施形態２９は、実施形態１～６のいずれか１つに記載の切断型コアＨＢＶ抗原をコードする天然に存在しない核酸を含むＡｄ２６ベクターである、実施形態２８に記載のベクターを含む。

【0207】

実施形態３０は、実施形態７～１３のいずれか１つに記載のＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする天然に存在しない核酸を含むＡｄ２６ベクターである、実施形態２８に記載のベクターを含む。

【0208】

実施形態３１は、実施形態１７～２１のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードする天然に存在しない核酸を含むＡｄ２６ベクターである、実施形態２８に記載のベクターを含む。

【0209】

実施形態３１は、アデノウイルスベクターが、配列番号１７のポリヌクレオチド配列を含むプロモーター配列、配列番号２３のポリヌクレオチド配列を含む調節配列、配列番号１８のポリヌクレオチド配列を含むシグナルペプチドコード配列、配列番号１５のポリヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチド配列、配列番号２２のポリヌクレオチド配列を含むリンカーコード配列、配列番号１６のポリヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチド配列、および配列番号２４のポリヌクレオチド配列を含むポリアデニル化シグナル配列を含有する、実施形態２８～３１のいずれか１つに記載のベクターを含む。

【0210】

実施形態３２は、実施形態１～３２のいずれか１つに記載の天然に存在しない核酸分子によってコードされる天然に存在しないポリペプチドを含む。

【0211】

実施形態３３は、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の天然に存在しない核酸分子、または実施形態２４～３２のいずれか１つに記載のベクターを含む宿主細胞を含む。

【0212】

実施形態３４は、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の天然に存在しない核酸分子、実施形態２４～３２のいずれか１つに記載のベクター、または実施形態３３に記載の天然に存在しないポリペプチドおよび薬学的に許容可能な担体を含む組成物を含む。

【0213】

実施形態３５は、実施形態７～１３のいずれか１つに記載の第１のポリヌクレオチド、実施形態１４～１６のいずれか１つに記載の第２のポリヌクレオチド、および薬学的に許容可能な担体を含み、第１および第２のポリヌクレオチドが同じ核酸分子または同じ核酸ベクターに含まれない、実施形態３４に記載の組成物を含む。

【0214】

実施形態３６は、第１および第２のポリヌクレオチドが２つの個別のベクター、好ましくはアデノウイルスベクター、より好ましくはＡｄ２６ベクターに含まれる、実施形態３５に記載の組成物を含む。

【0215】

実施形態３７は：
（ａ）配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の天然に存在しない核酸分子であって、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有しない、第１の天然に存在しない核酸分子；
（ｂ）配列番号２または配列番号１４のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の天然に存在しない核酸分子；および
（ｃ）薬学的に許容可能な担体、
を含むキットであって、
第１の天然に存在しない核酸分子および第２の天然に存在しない核酸分子が、同じ天然に存在しない核酸分子または２つの異なる天然に存在しない核酸分子に存在する、キットを含む。

【0216】

実施形態３８は、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、哺乳動物において少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答を誘導することが可能であり、好ましくはＨＢＶポリメラーゼ抗原が、哺乳動物において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、ＣおよびＤに対するＴ細胞応答を誘導することが可能であり、ならびにより好ましくはＨＢＶポリメラーゼ抗原が、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能である、実施形態３７に記載のキットを含む。

【0217】

実施形態３９は、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、実施形態３７に記載のキットを含む。

【0218】

実施形態４０は、第１の天然に存在しない核酸分子および第２の天然に存在しない核酸分子の少なくとも１つが、ＨＢＶポリメラーゼ抗原および切断型ＨＢＶコア抗原の少なくとも１つに作動可能に連結されたシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態３７～３９のいずれか１つに記載のキットを含む。

【0219】

実施形態４１は、シグナル配列が独立して配列番号６または配列番号１９のアミノ酸配列を含み、好ましくはシグナル配列が独立して配列番号５または配列番号１８のポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態４０に記載のキットを含む。

【0220】

実施形態４２は、第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号３または配列番号１６と少なくとも９０％同一である、実施形態３７～４１のいずれか１つに記載のキットを含む。

【0221】

実施形態４３は、第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号３または配列番号１６のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態４２に記載のキットを含む。

【0222】

実施形態４４は、第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１または配列番号１５と少なくとも９０％同一である、実施形態３７～４３のいずれか１つに記載のキットを含む。

【0223】

実施形態４５は、第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１または配列番号１５のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態４４に記載のキットを含む。

【0224】

実施形態４６は、第１の天然に存在しない核酸分子および第２の天然に存在しない核酸分子の少なくとも１つが、プロモーター配列、任意選択でエンハンサー配列、およびさらに任意選択でポリアデニル化シグナル配列をさらに含み、好ましくはプロモーター配列が、配列番号７または配列番号１７のポリヌクレオチド配列を有し、エンハンサー配列が独立して配列番号８または配列番号２３のポリヌクレオチド配列を有し、およびポリアデニル化シグナル配列が独立して配列番号１１または配列番号２４のポリヌクレオチド配列を有する、実施形態３７～４５のいずれか１つに記載のキットを含む。

【0225】

実施形態４７は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ＨＢＶエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原、およびＨＢＶ Ｌタンパク質抗原からなる群から選択されるＨＢＶ抗原をコードする核酸分子、またはＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ＨＢＶエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原、およびＨＢＶ Ｌタンパク質抗原からなる群から選択されるＨＢＶ抗原を含有しない、実施形態３７～４６のいずれか１つに記載のキットを含む。

【0226】

実施形態４８は、第１の天然に存在しない核酸分子および第２の天然に存在しない核酸分子が同じベクターに存在する、実施形態３７～４７のいずれか１つに記載のキットを含む。

【0227】

実施形態４９は、ベクターが、ＨＢＶポリメラーゼ抗原および切断型ＨＢＶコア抗原を２つの個別のタンパク質としてコードする、実施形態４８に記載のキットを含む。

【0228】

実施形態５０は、ベクターが、ＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原を含む融合タンパク質をコードする、実施形態４９に記載のキットを含む。

【0229】

実施形態５１は、融合タンパク質が、リンカーを介してＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原を含む、実施形態５０に記載のキットを含む。

【0230】

実施形態５２は、リンカーが、アミノ酸配列（ＡｌａＧｌｙ）_ｎを含み、ｎが２～５の整数であり、好ましくはリンカーが配列番号２２を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態５１に記載のキットを含む。

【0231】

実施形態５３は、融合タンパク質が配列番号２０のアミノ酸配列を含む、実施形態５２に記載のキットを含む。

【0232】

実施形態５４は、融合タンパク質がシグナル配列をさらに含み、好ましくはシグナル配列が、配列番号６または配列番号１９のアミノ酸配列を有し、より好ましくはシグナル配列が、配列番号５または配列番号１８のポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態５３に記載のキットを含む。

【0233】

実施形態５５は、融合タンパク質が配列番号２１のアミノ酸配列を含む、実施形態５４に記載のキットを含む。

【0234】

実施形態５６は、ベクターが、５’末端から３’末端に、プロモーター配列、エンハンサー配列、シグナルペプチドコード配列、第２のポリヌクレオチド配列、リンカーコード配列、第１のポリヌクレオチド配列、およびポリアデニル化シグナル配列を含有する、実施形態４８～５５のいずれか１つに記載のキットを含む。

【0235】

実施形態５７は、ベクターが、アデノウイルスベクター、好ましくはＡｄ２６またはＡｄ３５ベクターである、実施形態５６に記載のキットを含む。

【0236】

実施形態５８は、アデノウイルスベクターが、配列番号１７のポリヌクレオチド配列を含むプロモーター配列、配列番号２３のポリヌクレオチド配列を含む調節配列、配列番号１８のポリヌクレオチド配列を含むシグナルペプチドコード配列、配列番号１５のポリヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチド配列、配列番号２２のポリヌクレオチド配列を含むリンカーコード配列、配列番号１６のポリヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチド配列、および配列番号２４のポリヌクレオチド配列を含むポリアデニル化シグナル配列を含有する、実施形態５７に記載のキットを含む。

【0237】

実施形態５９は、キットが、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ＨＢＶエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原、およびＨＢＶ Ｌタンパク質抗原からなる群から選択されるＨＢＶ抗原をコードする核酸分子、またはＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ＨＢＶエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原、およびＨＢＶ Ｌタンパク質抗原からなる群から選択されるＨＢＶ抗原を含有しない、実施形態５８に記載のキットを含む。

【0238】

実施形態６０は、第１の天然に存在しない核酸分子および第２の天然に存在しない核酸分子が２つの異なるベクターに存在する、実施形態３７～５９のいずれか１つに記載のキットを含む。

【0239】

実施形態６１は、第１の天然に存在しない核酸分子が第１のプラスミドＤＮＡベクターに存在し、および第２の天然に存在しない核酸分子が第２のプラスミドＤＮＡベクターに存在する、実施形態６０に記載のキットを含む。

【0240】

実施形態６２は、第１および第２のプラスミドＤＮＡベクターの各々が、複製開始点、抗生物質耐性遺伝子、および５’末端から３’末端に、プロモーター配列、調節配列、シグナルペプチドコード配列、第１のポリヌクレオチド配列または第２のポリヌクレオチド配列、およびポリアデニル化シグナル配列を含む、実施形態６１に記載のキットを含む。

【0241】

実施形態６３は、抗生物質耐性遺伝子が、配列番号１２と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号１２と１００％同一であるポリヌクレオチド配列を有するカナマイシン耐性遺伝子である、実施形態６２に記載のキットを含む。

【0242】

実施形態６４は：
キットが、
（ａ）３’末端から５’末端に、配列番号７のポリヌクレオチド配列を含むプロモーター配列、配列番号８のポリヌクレオチド配列を含む調節配列、配列番号５のポリヌクレオチド配列を含むシグナルペプチドコード配列、配列番号３のポリヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチド配列、および配列番号１１のポリヌクレオチド配列を含むポリアデニル化シグナル配列を含む、第１のプラスミドＤＮＡベクター；
（ｂ）３’末端から５’末端に、配列番号７のポリヌクレオチド配列を含むプロモーター配列、配列番号８のポリヌクレオチド配列を含む調節配列、配列番号５のポリヌクレオチド配列を含むシグナルペプチドコード配列、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチド配列、および配列番号１１のポリヌクレオチド配列を含むポリアデニル化シグナル配列を含む、第２のプラスミドＤＮＡベクター；ならびに
（ｃ）薬学的に許容可能な担体、
を含み、
第１のプラスミドＤＮＡベクターおよび第２のプラスミドＤＮＡベクターの各々が、配列番号１２のポリヌクレオチド配列を有するカナマイシン耐性遺伝子、および配列番号１０のポリヌクレオチド配列を有する複製開始点をさらに含み、ならびに
第１のプラスミドＤＮＡベクターおよび第２のプラスミドＤＮＡベクターが同じ組成物または２つの異なる組成物に存在する、
実施形態６３に記載のキットを含む。

【0243】

実施形態６５は、第１の天然に存在しない核酸分子が第１のアデノウイルスベクター、好ましくはＡｄ２６ベクターに存在し、および第２の天然に存在しない核酸分子が第２のアデノウイルスベクター、好ましくはＡｄ２６ベクターに存在する、実施形態６０に記載のキットを含む。

【0244】

実施形態６６は、第１および第２のアデノウイルスベクターの各々が、５’末端から３’末端に、プロモーター配列、調節配列、シグナルペプチドコード配列、第１のポリヌクレオチド配列または第２のポリヌクレオチド配列、およびポリアデニル化シグナル配列を含む、実施形態６５に記載のキットを含む。

【0245】

実施形態６７は：
キットが、
（ａ）３’末端から５’末端に、配列番号１７のポリヌクレオチド配列を含むプロモーター配列、配列番号２３のポリヌクレオチド配列を含む調節配列、配列番号１７のポリヌクレオチド配列を含むシグナルペプチドコード配列、配列番号１５のポリヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチド配列、および配列番号２４のポリヌクレオチド配列を含むポリアデニル化シグナル配列を含む、第１のＡｄ２６ベクター；
（ｂ）３’末端から５’末端に、配列番号１７のポリヌクレオチド配列を含むプロモーター配列、配列番号２３のポリヌクレオチド配列を含む調節配列、配列番号１７のポリヌクレオチド配列を含むシグナルペプチドコード配列、配列番号１６のポリヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチド配列、および配列番号２４のポリヌクレオチド配列を含むポリアデニル化シグナル配列を含む、第２のＡｄ２６ベクター；ならびに
（ｃ）薬学的に許容可能な担体、
を含み、
第１のＡｄ２６ベクターおよび第２のＡｄ２６ベクターが同じ組成物または２つの異なる組成物に存在する、
実施形態６６に記載のキットを含む。

【0246】

実施形態６８は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ＨＢＶエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原、およびＨＢＶ Ｌタンパク質抗原からなる群から選択されるＨＢＶ抗原をコードする核酸分子、またはＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ＨＢＶエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原、およびＨＢＶ Ｌタンパク質抗原からなる群から選択されるＨＢＶ抗原を含有しない、実施形態６４～６７のいずれか１つに記載のキットを含む。

【0247】

実施形態６９は、組成物またはキットが、それを必要とする対象におけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する免疫応答の誘導に使用するためのものであり、好ましくは、対象は慢性ＨＢＶ感染症を有する、実施形態３４～３６のいずれか１つに記載の組成物または実施形態３７～６８のいずれか１つに記載のキットを含む。

【0248】

実施形態７０は、それを必要とする対象におけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する免疫応答の誘導に使用するための、別の免疫原性剤、好ましくは別のＨＢＶ抗原と、実施形態３４～３６のいずれか１つに記載の組成物または実施形態３７～６８のいずれか１つに記載のキットとの組合せであって、好ましくは、対象は慢性ＨＢＶ感染症を有する、組合せを含む。

【0249】

実施形態７１は、組成物またはキットが、それを必要とする対象におけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）誘導疾患の処置に使用するためのものであり、好ましくは、対象は慢性ＨＢＶ感染症を有し、ＨＢＶ誘導疾患は、進行線維症、肝硬変、および肝細胞癌（ＨＣＣ）からなる群から選択される、実施形態３４～３６のいずれか１つに記載の組成物または実施形態３７～６８のいずれか１つに記載のキットを含む。

【0250】

実施形態７２はそれを必要とする対象におけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）誘導疾患の処置に使用するための、別の治療剤、好ましくは別の抗ＨＢＶ剤と、実施形態３４～３６のいずれか１つに記載の組成物または実施形態３７～６８のいずれか１つに記載のキットとの組合せであって、好ましくは、対象は慢性ＨＢＶ感染症を有し、ＨＢＶ誘導疾患は、進行線維症、肝硬変、および肝細胞癌（ＨＣＣ）からなる群から選択される、組合せを含む。

【0251】

実施形態第２節
実施形態１は、配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む天然に存在しない核酸分子であって、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有しない、天然に存在しない核酸分子を含む。

【0252】

実施形態２は、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、哺乳動物において少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答を誘導することが可能であり、好ましくはＨＢＶポリメラーゼ抗原が、哺乳動物において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、ＣおよびＤに対するＴ細胞応答を誘導することが可能であり、およびより好ましくはＨＢＶポリメラーゼ抗原が、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能である、実施形態１に記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0253】

実施形態３は、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0254】

実施形態４は、ＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結されたシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0255】

実施形態５は、シグナル配列が、配列番号６または配列番号１９のアミノ酸配列を含み、好ましくはシグナル配列が、配列番号５または配列番号１８のポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態４に記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0256】

実施形態６は、第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号３または配列番号１６と少なくとも９０％同一である、実施形態１～５のいずれか１つに記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0257】

実施形態７は、第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号３または配列番号１６のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態６に記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0258】

実施形態８は、配列番号２または配列番号１４のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0259】

実施形態９は、第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１または配列番号１５と少なくとも９０％同一である、実施形態８に記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0260】

実施形態１０は、第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１または配列番号１５のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態９に記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0261】

実施形態１１は、ＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原を含む融合タンパク質をコードする、実施形態８～１０のいずれか１つに記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0262】

実施形態１２は、融合タンパク質が、リンカーを介してＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原を含む、実施形態１１に記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0263】

実施形態１３は、リンカーがアミノ酸配列（ＡｌａＧｌｙ）_ｎを含み、ｎが２～５の整数であり、好ましくはリンカーが、配列番号２２を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態１２に記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0264】

実施形態１４は、融合タンパク質が配列番号２０のアミノ酸配列を含む、実施形態１３に記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0265】

実施形態１５は、融合タンパク質がシグナル配列をさらに含み、好ましくはシグナル配列が、配列番号６または配列番号１９のアミノ酸配列を含み、より好ましくはシグナル配列が、配列番号５または配列番号１８のポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態１１～１４のいずれか１つに記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0266】

実施形態１６は、天然に存在しない核酸分子が、プロモーター配列、任意選択で１つまたは複数の追加の調節配列をさらに含み、好ましくは、プロモーター配列は、配列番号７または配列番号１７のポリヌクレオチド配列を含み、および追加の調節配列は、配列番号８または配列番号２３からなる群から選択され、およびポリアデニル化シグナル配列は、配列番号１１または配列番号２４からなる群から選択される実施形態１～１５のいずれか１つに記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0267】

実施形態１７は、天然に存在しない核酸分子が、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ＨＢＶエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原、およびＨＢＶ Ｌタンパク質抗原からなる群から選択されるＨＢＶ抗原をコードしない、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の天然に存在しない核酸分子を含む。

【0268】

実施形態１８は、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の天然に存在しない核酸分子を含むベクターを含む。

【0269】

実施形態１９は、天然に存在しない核酸分子が、５’末端から３’末端に、プロモーター配列、エンハンサー配列、シグナルペプチドコード配列、第１のポリヌクレオチド配列、およびポリアデニル化シグナル配列を含み、任意選択で天然に存在しない核酸分子が第２のポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態１８に記載のベクターを含む。

【0270】

実施形態２０は、ベクターがプラスミドＤＮＡベクターであり、プラスミドＤＮＡベクターが複製開始点および抗生物質耐性遺伝子をさらに含む、実施形態１８または１９に記載のベクターを含む。

【0271】

実施形態２１は、プラスミドＤＮＡベクターが、配列番号１０のポリヌクレオチド配列を含む複製開始点、配列番号１２のポリヌクレオチド配列を含む抗生物質耐性遺伝子、配列番号７のポリヌクレオチド配列を含むプロモーター配列、配列番号８のポリヌクレオチド配列を含むエンハンサー配列、配列番号５のポリヌクレオチド配列を含むシグナルペプチドコード配列、配列番号３のポリヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチド配列、および配列番号１１のポリヌクレオチド配列を含むポリアデニル化シグナル配列、ならびに任意選択で配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチド配列を含有する、実施形態２０に記載のベクターを含む。

【0272】

実施形態２２は、ベクターがアデノウイルスベクター、好ましくはＡｄ２６またはＡｄ３５ベクターである、実施形態１８または１９に記載のベクターを含む。

【0273】

実施形態２３は、アデノウイルスベクターが、配列番号１７のポリヌクレオチド配列を含むプロモーター配列、配列番号２３のポリヌクレオチド配列を含む調節配列、配列番号１８のポリヌクレオチド配列を含むシグナルペプチドコード配列、配列番号１５のポリヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチド配列、配列番号２２のポリヌクレオチド配列を含むリンカーコード配列、配列番号１６のポリヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチド配列、および配列番号２４のポリヌクレオチド配列を含むポリアデニル化シグナル配列を含有する、実施形態２２に記載のベクターを含む。

【0274】

実施形態２４は、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の天然に存在しない核酸分子によってコードされる、天然に存在しないポリペプチドを含む。

【0275】

実施形態２５は、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の天然に存在しない核酸分子または実施形態１８～２３のいずれか１つに記載のベクターを含む宿主細胞を含む。

【0276】

実施形態２６は、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の天然に存在しない核酸分子、実施形態１８～２３のいずれか１つに記載のベクター、または実施形態２４に記載の天然に存在しないポリペプチド、および薬学的に許容可能な担体を含む組成物を含む。

【0277】

実施形態２７は、組成物が、実施形態１～７のいずれか１つに記載の第１のポリヌクレオチド、実施形態８～１０のいずれか１つに記載の第２のポリヌクレオチド、および薬学的に許容可能な担体を含み、第１および第２のポリヌクレオチドが同じ核酸分子または同じ核酸ベクターに含まれない、実施形態２６に記載の組成物を含む。

【0278】

実施形態２８は：
（ａ）配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の天然に存在しない核酸分子であって、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有しない、第１の天然に存在しない核酸分子；
（ｂ）配列番号２または配列番号１４のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む第２の天然に存在しない核酸分子；および
（ｃ）薬学的に許容可能な担体、
を含むキットであって、
第１の天然に存在しない核酸分子および第２の天然に存在しない核酸分子が、同じ天然に存在しない核酸分子または２つの異なる天然に存在しない核酸分子に存在する、
キットを含む。

【0279】

実施形態２９は、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、哺乳動物において少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答を誘導することが可能であり、好ましくはＨＢＶポリメラーゼ抗原が、哺乳動物において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、ＣおよびＤに対するＴ細胞応答を誘導することが可能であり、およびより好ましくはＨＢＶポリメラーゼ抗原が、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能である、実施形態２８に記載のキットを含む。

【0280】

実施形態３０は、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が配列番号４のアミノ酸配列を含む、実施形態２９に記載のキットを含む。

【0281】

実施形態３１は、第１の天然に存在しない核酸分子および第２の天然に存在しない核酸分子の少なくとも１つが、ＨＢＶポリメラーゼ抗原および切断型ＨＢＶコア抗原の少なくとも１つに作動可能に連結されたシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態２８～３０のいずれか１つに記載のキットを含む。

【0282】

実施形態３２は、シグナル配列が、独立して配列番号６または配列番号１９のアミノ酸配列を含み、好ましくはシグナル配列が、独立して配列番号５または配列番号１８のポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態３１に記載のキットを含む。

【0283】

実施形態３３は、第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号３または配列番号１６と少なくとも９０％同一である、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載のキットを含む。

【0284】

実施形態３４は、第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号３または配列番号１６のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態３３に記載のキットを含む。

【0285】

実施形態３５は、第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１または配列番号１５と少なくとも９０％同一である、実施形態２８～３４のいずれか１つに記載のキットを含む。

【0286】

実施形態３６は、第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１または配列番号１５のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態３５に記載のキットを含む。

【0287】

実施形態３７は、第１の天然に存在しない核酸分子および第２の天然に存在しない核酸分子の少なくとも１つが、プロモーター配列、任意選択でエンハンサー配列、およびさらに任意選択でポリアデニル化シグナル配列をさらに含み、好ましくは、プロモーター配列は、配列番号７または配列番号１７のポリヌクレオチド配列を有し、エンハンサー配列は、独立して配列番号８または配列番号２３のポリヌクレオチド配列を有し、およびポリアデニル化シグナル配列は、独立して配列番号１１または配列番号２４のポリヌクレオチド配列を有する、実施形態２８～３６のいずれか１つに記載のキットを含む。

【0288】

実施形態３８は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ＨＢＶエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原、およびＨＢＶ Ｌタンパク質抗原からなる群から選択されるＨＢＶ抗原をコードする核酸分子、またはＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ＨＢＶエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原、およびＨＢＶ Ｌタンパク質抗原からなる群から選択されるＨＢＶ抗原を含有しない、実施形態２８～３７のいずれか１つに記載のキットを含む。

【0289】

実施形態３９は、第１の天然に存在しない核酸分子および第２の天然に存在しない核酸分子が同じベクターに存在する、実施形態２８～３８のいずれか１つに記載のキットを含む。

【0290】

実施形態４０は、ベクターが、ＨＢＶポリメラーゼ抗原および切断型ＨＢＶコア抗原を２つの個別のタンパク質としてコードする、実施形態３９に記載のキットを含む。

【0291】

実施形態４１は、ベクターが、ＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原を含む融合タンパク質をコードする、実施形態３９に記載のキットを含む。

【0292】

実施形態４２は、融合タンパク質が、リンカーを介してＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原を含む、実施形態４１に記載のキットを含む。

【0293】

実施形態４３は、リンカーがアミノ酸配列（ＡｌａＧｌｙ）_ｎを含み、ｎが２～５の整数であり、好ましくはリンカーが配列番号２２を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態４２に記載のキットを含む。

【0294】

実施形態４４は、融合タンパク質が、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、実施形態４３に記載のキットを含む。

【0295】

実施形態４５は、融合タンパク質が、シグナル配列をさらに含み、好ましくはシグナル配列が、配列番号６または配列番号１９のアミノ酸配列を有し、より好ましくはシグナル配列が、配列番号５または配列番号１８のポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態４４に記載のキットを含む。

【0296】

実施形態４６は、融合タンパク質が配列番号２１のアミノ酸配列を含む、実施形態４５に記載のキットを含む。

【0297】

実施形態４７は、ベクターが、５’末端から３’末端に、プロモーター配列、エンハンサー配列、シグナルペプチドコード配列、第２のポリヌクレオチド配列、リンカーコード配列、第１のポリヌクレオチド配列、およびポリアデニル化シグナル配列を含有する、実施形態４１～４６のいずれか１つに記載のキットを含む。

【0298】

実施形態４８は、ベクターがアデノウイルスベクター、好ましくはＡｄ２６またはＡｄ３５ベクターである、実施形態４７に記載のキットを含む。

【0299】

実施形態４９は、アデノウイルスベクターが、配列番号１７のポリヌクレオチド配列を含むプロモーター配列、配列番号２３のポリヌクレオチド配列を含む調節配列、配列番号１８のポリヌクレオチド配列を含むシグナルペプチドコード配列、配列番号１５のポリヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチド配列、配列番号２２のポリヌクレオチド配列を含むリンカーコード配列、配列番号１６のポリヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチド配列、および配列番号２４のポリヌクレオチド配列を含むポリアデニル化シグナル配列を含有する、実施形態４８に記載のキットを含む。

【0300】

実施形態５０は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ＨＢＶエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原、およびＨＢＶ Ｌタンパク質抗原からなる群から選択されるＨＢＶ抗原をコードする核酸分子、またはＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ＨＢＶエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原、およびＨＢＶ Ｌタンパク質抗原からなる群から選択されるＨＢＶ抗原を含有しない、実施形態４９に記載のキットを含む。

【0301】

実施形態５１は、第１の天然に存在しない核酸分子および第２の天然に存在しない核酸分子が２つの異なるベクターに存在する、実施形態２８～３８のいずれか１つに記載のキットを含む。

【0302】

実施形態５２は、第１の天然に存在しない核酸分子が第１のプラスミドＤＮＡベクターに存在し、および第２の天然に存在しない核酸分子が第２のプラスミドＤＮＡベクターに存在する、実施形態５１に記載のキットを含む。

【0303】

実施形態５３は、第１および第２のプラスミドＤＮＡベクターの各々が、複製開始点、抗生物質耐性遺伝子、および５’末端から３’末端に、プロモーター配列、調節配列、シグナルペプチドコード配列、第１のポリヌクレオチド配列または第２のポリヌクレオチド配列、およびポリアデニル化シグナル配列を含む、実施形態５２に記載のキットを含む。

【0304】

実施形態５４は、抗生物質耐性遺伝子が、配列番号１２と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号１２と１００％同一であるポリヌクレオチド配列を有するカナマイシン耐性遺伝子である、実施形態５３に記載のキットを含む。

【0305】

実施形態５５は：
キットが、
（ａ）３’末端から５’末端に、配列番号７のポリヌクレオチド配列を含むプロモーター配列、配列番号８のポリヌクレオチド配列を含む調節配列、配列番号５のポリヌクレオチド配列を含むシグナルペプチドコード配列、配列番号３のポリヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチド配列、および配列番号１１のポリヌクレオチド配列を含むポリアデニル化シグナル配列を含む、第１のプラスミドＤＮＡベクター；
（ｂ）３’末端から５’末端に、配列番号７のポリヌクレオチド配列を含むプロモーター配列、配列番号８のポリヌクレオチド配列を含む調節配列、配列番号５のポリヌクレオチド配列を含むシグナルペプチドコード配列、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチド配列、および配列番号１１のポリヌクレオチド配列を含むポリアデニル化シグナル配列を含む、第２のプラスミドＤＮＡベクター；ならびに
（ｃ）薬学的に許容可能な担体、
を含み、
第１のプラスミドＤＮＡベクターおよび第２のプラスミドＤＮＡベクターの各々が、配列番号１２のポリヌクレオチド配列を有するカナマイシン耐性遺伝子、および配列番号１０のポリヌクレオチド配列を有する複製開始点をさらに含み、ならびに
第１のプラスミドＤＮＡベクターおよび第２のプラスミドＤＮＡベクターが同じ組成物または２つの異なる組成物に存在する、
実施形態５４に記載のキットを含む。

【0306】

実施形態５６は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ＨＢＶエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原、およびＨＢＶ Ｌタンパク質抗原からなる群から選択されるＨＢＶ抗原をコードする核酸分子、またはＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ＨＢＶエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原、およびＨＢＶ Ｌタンパク質抗原からなる群から選択されるＨＢＶ抗原を含有しない、実施形態５５に記載のキットを含む。

【0307】

実施形態５７は、組成物またはキットが、それを必要とする対象におけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する免疫応答の誘導に使用するためのものであり、好ましくは、対象は慢性ＨＢＶ感染症を有する、実施形態２６に記載の組成物または実施形態２７～５５のいずれか１つに記載のキットを含む。

【0308】

実施形態５８は、それを必要とする対象におけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する免疫応答の誘導に使用するための、別の免疫原性剤、好ましくは別のＨＢＶ抗原と、実施形態２６に記載の組成物または実施形態２７～５５のいずれか１つに記載のキットとの組合せであって、好ましくは、対象は慢性ＨＢＶ感染症を有する、組合せを含む。

【0309】

実施形態５９は、組成物またはキットが、それを必要とする対象におけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）誘導疾患の処置に使用するためのものであり、好ましくは、対象は慢性ＨＢＶ感染症を有し、ＨＢＶ誘導疾患は、進行線維症、肝硬変、および肝細胞癌（ＨＣＣ）からなる群から選択される、実施形態２６もしくは２７に記載の組成物または実施形態２８～５６のいずれか１つに記載のキットを含む。

【0310】

実施形態６０は、それを必要とする対象におけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）誘導疾患の処置に使用するための、別の治療剤、好ましくは別の抗ＨＢＶ剤と、実施形態２６もしくは２７に記載の組成物または実施形態２８～５６のいずれか１つに記載のキットとの組合せであって、好ましくは、対象は慢性ＨＢＶ感染症を有し、ＨＢＶ誘導疾患は、進行線維症、肝硬変、および肝細胞癌（ＨＣＣ）からなる群から選択される、組合せを含む。

【実施例】

【0311】

本出願の以下の実施例は、本出願の性質をさらに例証するためである。以下の実施例は本出願を限定せず、本出願の範囲は添付の特許請求の範囲によって決定されると理解すべきである。

【0312】

[実施例１]
ＨＢＶコアおよびＰｏｌ抗原配列の生成ならびにプラスミドの最適化
肝炎コアタンパク質上のＴ細胞エピトープは、Ｂ型肝炎感染症の排除にとって重要であると考えられており、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質、例えばポリメラーゼは、応答の幅を改善するために役目を果たし得る。このため、Ｂ型肝炎コアおよびポリメラーゼタンパク質を、治療用Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ワクチンの設計のための抗原として選択した。

【0313】

ＨＢＶコアおよびポリメラーゼ抗原コンセンサス配列の誘導
ＨＢＶ ｐｏｌおよびコア抗原コンセンサス配列を、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに基づいて生成した。異なるＨＢＶ配列を異なる起源から得て、コアおよびポリメラーゼタンパク質に関して個別に整列させた。全てのサブタイプ（Ａ～Ｈ）に関する当初の配列アライメントを、次にＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに限定した。コンセンサス配列を、各サブタイプにおいて個別におよび全ての合同ＢＣＤ配列において各々のタンパク質アライメントに関して定義した。多様なアライメント位置において、最も頻繁なアミノ酸をコンセンサス配列に使用した。

【0314】

ＨＢＶコア抗原の最適化
ＨＢＶコア抗原コンセンサス配列を、ネイティブウイルスタンパク質の欠失によって最適化した。特に、プレゲノムＲＮＡキャプシド形成にとって必要であるＣ末端の高度に正に帯電した分節に対応する３４アミノ酸の欠失を作製した。

【0315】

ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原の最適化
ＨＢＶ ｐｏｌ抗原コンセンサス配列を、逆転写酵素およびＲＮアーゼＨ酵素活性を除去するために４つの残基を変化させることによって最適化した。特に、任意の配位機能、およびこのようにヌクレオチド／金属イオン結合を排除するために、逆転写酵素ドメインの「ＹＸＤＤ」モチーフにおけるアスパラギン酸塩残基（Ｄ）をアスパラギン残基（Ｎ）に変化させた。加えて、Ｍｇ^２＋配位を排除するために、ＲＮアーゼＨドメインの「ＤＥＤＤ」モチーフにおける第１のアスパラギン酸塩残基（Ｄ）をアスパラギン残基（Ｎ）に変化させ、第１のグルタミン酸塩残基（Ｅ）をグルタミン残基（Ａ）に変化させた。加えて、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原の配列をコドン最適化して、Ｓタンパク質およびＮ末端伸長部ｐｒｅ－Ｓ１およびｐｒｅ－Ｓ２を有するＳタンパク質の変化型を含むエンベロープタンパク質の内部オープンリーディングフレームを組み換えた。その結果、エンベロープタンパク質（ｐｒｅ－Ｓ１、ｐｒｅ－Ｓ２、およびＳタンパク質）およびＸタンパク質のオープンリーディングフレームが除去された。

【0316】

ＨＢＶコアおよびＰｏｌ抗原発現戦略の最適化
プラスミドベクターからのコアおよびｐｏｌ抗原の両方の最大の等しい発現を得るために、以下の３つの異なる戦略を試験した：（１）単一のコア－Ｐｏｌ融合タンパク質を産生するために、コード配列間に挿入した小さいＡＧＡＧとインフレームでのＨＢＶコアおよびｐｏｌ抗原の融合（図２Ａ）；（２）単一のｍＲＮＡからコアおよびｐｏｌタンパク質を個々に発現するバイシストロニック発現ベクターを産生するための、リボソーム翻訳スリップ部位、特に手足口病（ＦＭＤＶ）からのＦＡ２翻訳スリップ部位による１つのプラスミドからのコアおよびｐｏｌ抗原の両方の発現（図２Ｂ）、ならびに（３）ＨＢＶコアおよびｐｏｌ抗原をそれぞれコードする２つの個別のプラスミド（図２Ｃ）。

【0317】

Ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現解析
上記の３つの発現戦略の各々に従うコンセンサスＨＢＶコアおよびｐｏｌ抗原のコード配列を、市販の発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞にベクターをトランスフェクトし、ＨＢＶコア特異的抗原を使用して、タンパク質発現をウェスタンブロットによって評価した。

【0318】

転写後調節エレメントの最適化
以下の４つの異なる転写後調節エレメントを、一次転写物を安定化させること、その核輸出を容易にすること、および／または転写－翻訳カップリングを改善することによるタンパク質発現の増強に関して評価した：（１）ウッドチャックＨＢＶ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｊ０４５１４．１）；（２）ヒトアポリポタンパク質Ａ１前駆体に由来するイントロン／エクソン配列（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ０１０３８．１）；（３）ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）長末端反復（ＬＴＲ）の非翻訳Ｒ－Ｕ５ドメイン（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＭ０２３７６８．１）；および（４）ＨＴＬＶ－１ ＬＴＲ、合成ウサギβ－グロビンイントロン（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｖ００８８２．１）、およびスプライシングエンハンサーの複合配列（トリプル複合配列）。エンハンサー配列を、プラスミドにおいてＣＭＶプロモーターと、ＨＢＶ抗原コード配列の間に導入した。ＷＰＲＥエレメントの存在下および非存在下でプラスミドから発現させた場合、ウェスタンブロットによってコア抗原の発現に有意差は観察されなかった（図２Ｄ）。しかし、ＨＥＫ２９３Ｔトランスフェクト細胞における他の転写後調節配列を有するプラスミドからのコア抗原発現をウェスタンブロットによって評価すると、トリプルエンハンサー配列は、最も強いコア抗原発現をもたらした（図２Ｅ）。

【0319】

効率的なタンパク質分泌のためのシグナルペプチドの選択
以下のＨＢＶコア抗原のＮ末端にインフレームで導入した３つの異なるシグナルペプチドを評価した：（１）Ｉｇ重鎖ガンマシグナルペプチドＳＰＩｇＧ（ＢＡＡ７５０２４．１）；（２）Ｉｇ重鎖イプシロンシグナルペプチドＳＰＩｇＥ（ＡＡＢ５９４２４．１）；および（３）シスタチンＳ前駆体シグナルペプチドＳＰＣＳ（ＮＰ＿００１８９０１．１）。シグナルペプチド切断部位を、ＳｉｇｎａｌＰ予測プログラムを使用してコア融合体に関してｉｎ ｓｉｌｉｃｏで最適化した。分泌効率を、上清中のコアタンパク質レベルを分析することによって決定した。Ｎ末端で融合した３つの異なるシグナルペプチドを使用するコア抗原分泌のウェスタンブロット分析は、シスタチンＳシグナルペプチドが最も効率的なタンパク質分泌をもたらすことを証明した（図２Ｆ）。

【0320】

ＤＮＡワクチンベクターの最適化
Ｎ末端シスタチンＳシグナルペプチド配列を有するＨＢＶ抗原コード配列の上流にトリプル複合エンハンサー配列を含有する最適化発現カセットを、ＤＮＡワクチンベクターｐＶａｘ－１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）にクローニングした。ｐＶａｘ－１中の発現カセットは、ヒトＣＭＶ－ＩＥ プロモーターの後にウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）由来ポリアデニル化配列（ｐＡ）を含有する。細菌の繁殖は、ｐＵＣ ｏｒｉレプリコンによって駆動され、カナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）は小さい真核細胞プロモーターによって駆動される。ｐＵＣ ｏｒｉ複製、ＫａｎＲ発現カセット、およびＣＭＶ－ＩＥプロモーターによって駆動される発現カセットは全て、プラスミド骨格内で同じ方向に存在する。しかし、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにおいて観察された発現レベルと比較すると、ｐＶａｘ－１ベクターではコア抗原発現の顕著な低減が観察された。

【0321】

タンパク質発現を改善するために以下のいくつかの戦略を使用した：（１）ｐＵＣｏｒｉ－ＫａｎＲカセット全体を反時計回りの方向に逆転させる（ｐＶＤ－ｃｏｒｅ）；および（２）ＫａｎＲ遺伝子のコドン使用を、ＫａｎプロモーターをｐｃＤＮＡ３．１ベクターのＡｍｐプロモーターに置換すると共に変化させる（ｐＤＫ－ｃｏｒｅ）。いずれの戦略も、コア抗原発現を回復させるが、コア抗原発現は、コドン調整したＫａｎＲ遺伝子、ＡｍｐＲプロモーター（ＫａｎＲプロモーターの代わりに）、およびｐＵＣｏｒｉ－ＫａｎＲカセットの逆方向を含有するｐＤＫベクターにおいて最も高かった。

【0322】

図２Ｇに示す４つの異なるＨＢＶコア／ｐｏｌ抗原最適化発現カセットをｐＤＫプラスミド骨格に導入して、図２Ａ～２Ｃに例証する３つの発現戦略の各々を試験した。プラスミドを、コアおよびｐｏｌ特異的抗体を使用するウェスタンブロット分析によって、コアおよびｐｏｌ発現に関してｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。細胞のおよび分泌されたコアおよびｐｏｌ抗原に関して最も一貫した発現プロファイルは、コアおよびｐｏｌ抗原が個別のベクターによってコードされる場合、すなわち個々のＤＮＡベクターｐＤＫ－コアおよびｐＤＫ－ｐｏｌによって達成された（図２Ｈ）。ｐＤＫ－ｐｏｌおよびｐＤＫ－コアベクターの略図をそれぞれ、図３Ａおよび３Ｂに示す。

【0323】

[実施例２]
切断型ＨＢＶコア抗原とＨＢＶ Ｐｏｌ抗原との融合体を発現するアデノウイルスベクターの生成
アデノウイルスベクターの作製は、単一のオープンリーディングフレームから発現された融合タンパク質として設計されている。例えば２つの個別の発現カセットを使用する、または２つの配列を分離するために２Ａ様配列を使用する、２つのタンパク質を発現させるための追加の構成も同様に想像することができる。

【0324】

アデノウイルスベクターの発現カセットの設計
発現カセット（図８Ａおよび図８Ｂに図示する）は、ＣＭＶプロモーター（配列番号１７）、イントロン（配列番号２３）（ヒトＡｐｏＡＩ遺伝子に由来する断片、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０１０３８、塩基対２９５～５２３、ＡｐｏＡＩの第２のイントロンを有する）、後に続く最適化コード配列－ヒト免疫グロブリン分泌シグナルコード配列（配列番号１８）の後に続くコア単独またはコアとポリメラーゼとの融合タンパク質、その後に続くＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号２４）で構成される。

【0325】

分泌シグナルは、過去の実験により、誘発されるＴ細胞応答に影響を及ぼすことなく（マウスの実験）、分泌されるトランスジーンを有する一部のアデノウイルスベクターの製造性が改善することが示されたことから含めた。

【0326】

コアタンパク質の最後の２つの残基（ＶＶ）およびポリメラーゼタンパク質の最初の２つの残基（ＭＰ）を融合すると、隣接する相同配列と共にヒトドーパミン受容体タンパク質（Ｄ３アイソフォーム）上に存在する接合配列（ＶＶＭＰ）をもたらす。

【0327】

コア配列とポリメラーゼ配列との間にＡＧＡＧリンカーを挿入すると、この相同性が排除され、ヒトプロテオームのＢｌａｓｔにおいてさらなるヒットなしに戻った。

【0328】

[実施例３]
マウスにおけるＤＮＡワクチンのｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性試験
ＨＢＶコア抗原またはＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするＤＮＡプラスミドを含有する免疫治療用ＤＮＡワクチンを、マウスにおいて試験した。試験の目的を、ＢＡＬＢ／ｃマウスへの電気穿孔を介した筋肉内送達後にワクチンによって誘導されたＴ細胞応答を検出するように設計した。最初の免疫原性試験は、導入されたＨＢＶ抗原によって誘発される細胞性免疫応答を決定することに集中した。

【0329】

特に、試験したプラスミドは、図３Ａおよび３Ｂにそれぞれ示すように、および上記の実施例１で説明したように、ｐＤＫ－ＰｏｌプラスミドおよびｐＤＫ－コアプラスミドを含んだ。ｐＤＫ－Ｐｏｌプラスミドは、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリメラーゼ抗原をコードし、ｐＤＫ－コアプラスミドは、配列番号２のアミノ酸配列を有するコア抗原をコードした。第１に、各々のプラスミドによって個々に誘導されたＴ細胞応答を試験した。ＤＮＡプラスミド（ｐＤＮＡ）ワクチンを、マウス前脛骨筋モデルに適用するために適合させた市販のＴｒｉＧｒｉｄ（商標）送達システム－筋肉内（ＴＤＳ－ＩＭ）を使用して、電気穿孔を介してＢＡＬＢ／ｃマウスに筋肉内送達した。電気穿孔によるＤＮＡのマウスへの筋肉内送達の方法およびデバイスに関する追加の説明に関しては、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれている、国際特許出願国際公開２０１７１７２８３８号明細書、および本出願と同日に代理人文書番号６８８０９７－４０５Ｕ１として提出された「Method and Apparatus for the Delivery of Hepatitis B Virus (HBV) Vaccine」と題する米国特許出願を参照されたい。特に、電極間に２．５ｍｍの間隔を空けて、電極直径が０．０３０インチである電極アレイを有するＴＤＳ－ＩＭ ｖ１．０デバイスのＴＤＳ－ＩＭアレイを、導体の長さが３．２ｍｍ、有効な貫通深度が３．２ｍｍであり、電極の菱形構成の主軸が筋繊維と平行な方向を向くように、選択した筋肉内に経皮挿入した。電極の挿入後、注射を開始してＤＮＡ（例えば、０．０２０ｍｌ）を筋肉内に分布させた。ＩＭ注射の完了後、２５０Ｖ／ｃｍ電場（印加電圧５９．４～６５．６Ｖ、印加電流の限界４Ａ未満、０．１６Ａ／秒）を、全期間約４００ｍｓの間、１０％デューティ比（すなわち、電圧を、約４００ｍｓの期間のうち全体で約４０ｍｓの間、積極的に印加する）で全６パルスを局所に印加する。電気穿孔手順の終了後、ＴｒｉＧｒｉｄ（商標）アレイを除去し、動物を回復させた。ＢＡＬＢ／ｃマウスへの高用量（２０μｇ）投与を、表１に要約するように実施した。マウス６匹に、ＨＢＶコア抗原をコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＤＫ－コア；群１）を投与し、マウス６匹に、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原をコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＤＫ－ｐｏｌ；群２）を投与し、およびマウス２匹に陰性対照として空のベクターを投与した。動物に、２週間空けて２回のＤＮＡ免疫を行い、最後の免疫の１週間後に脾細胞を収集した。

【0330】

【表1】

【0331】

ＩＦＮ－γ酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）によって抗原特異的応答を分析および定量した。このアッセイにおいて、免疫した動物の単離された脾細胞を、コアタンパク質、Ｐｏｌタンパク質、または小さいペプチドリーダーおよび接合配列（各ペプチド２μｇ／ｍｌ）を含むペプチドプールと共に一晩インキュベートした。これらのプールは、コアおよびＰｏｌワクチンベクターの遺伝子型ＢＣＤコンセンサス配列にマッチする１１残基が重複する１５量体ペプチドからなった。大きい９４ｋＤａ ＨＢＶ Ｐｏｌタンパク質を中央で２つのペプチドプールに分割した、抗原特異的Ｔ細胞を相同なペプチドプールによって刺激し、ＩＦＮ－γ陽性Ｔ細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して評価した。単一の抗原特異的Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの放出を、適切な抗体によって、およびスポット形成細胞（ＳＦＣ）と呼ばれるマイクロプレート上での着色スポットとしてその後の色素産生の検出によって可視化した。

【0332】

ＤＮＡワクチンプラスミドｐＤＫ－コア（群１）によって免疫したマウスでは、ＨＢＶコアに対する実質的なＴ細胞応答が達成され、１，０００ＳＦＣ／細胞１０^６個（図４）に達した。Ｐｏｌ １ペプチドプールに対するＰｏｌ Ｔ細胞応答は強力であった（～１，０００ＳＦＣ／細胞１０^６個）。弱いＰｏｌ－２指向性抗Ｐｏｌ細胞応答は、おそらく、マウスにおける限定的なＭＨＣ多様性が原因であった。これは、１つの抗原からの異なるエピトープの認識が同等でないこととして定義されるＴ細胞イムノドミナンスと呼ばれる現象である。この試験において得られた結果を確認する確認試験を実施した（データは示していない）。

【0333】

上記の結果は、ＨＢＶ抗原をコードするＤＮＡプラスミドワクチンによるワクチン接種が、投与したＨＢＶ抗原に対する細胞性免疫応答を誘導することを証明する。

【0334】

[実施例４]
マウスにおけるｐＤＫコア／ｐＤＫ－Ｐｏｌ組合せプラスミドの用量設定試験
組合せプラスミドによるこの用量設定試験の目的は、異なるＤＮＡ用量を使用して１つの部位に適用されたＨＢＶコアおよびｐｏｌ抗原をコードするＤＮＡプラスミド（ｐＤＮＡ）ベクターの混合物の、マウスにおける免疫応答を評価することであった。この試験において、実施例１に記載の２つのプラスミド、すなわちｐＤＫ－ｐｏｌおよびｐＤＫ－コアプラスミドの１：１（重量／体積）混合物を含有する免疫治療用ＤＮＡワクチンを、マウスにおいて試験した。ＤＮＡワクチンをＢＡＬＢ／ｃマウスの１つの解剖学的部位に、上記の実施例３に記載の電気穿孔を介して筋肉内に送達した。組み合わせたコアおよびＰｏｌ発現プラスミドの、１０μｇ、１μｇ、および０．１μｇの各プラスミドＤＮＡ／部位でのワクチン接種を、表２に要約するように実施した。各群においてマウス８匹を試験し、マウス２匹に陰性対照として空のベクターを投与した。動物に３週間空けて２回のＤＮＡ免疫を行い、最後の免疫の１週間後に脾細胞を収集した。

【0335】

【表2】

【0336】

抗原特異的応答を、実施例１に記載するようにＩＦＮ－γ酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）によって分析および定量した。コアおよびＰｏｌに対する相当なＴ細胞応答が、プラスミドｐＤＫ－コアおよびｐＤＫ－Ｐｏｌからなる組合せＤＮＡワクチンによって免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて達成された（図５）。各プラスミド１０μｇによって免疫した群１と、各プラスミド１μｇのみによって免疫した群２との間で免疫応答の程度に関して統計学的な差はなかった。この結果は、Ｔ細胞応答が、およそ１μｇのコアおよびＰｏｌ抗原発現プラスミドで最高レベルに達することを示唆した。しかし、１０倍低いＤＮＡ暴露、すなわち各プラスミド０．１μｇでは、ＳＦＣの有意な減少が観察された。Ｐｏｌ １ペプチドプールに対するＰｏｌ Ｔ細胞応答が支配的であった。弱いＰｏｌ ２指向性抗Ｐｏｌ細胞応答は、おそらく、近交系マウスにおける限定的なＭＨＣ多様性が原因であった。これは、１つの抗原からの異なるエピトープの認識が同等でないこととして定義されるＴ細胞イムノドミナンスと呼ばれる現象である。

【0337】

上記の結果は、ＨＢＶコアおよびｐｏｌ抗原を発現するＤＮＡプラスミドの組合せによって免疫したマウスにおいて、相当なＴ細胞応答が各プラスミド１μｇの用量で見出され、一部の免疫応答は、用量０．１μｇ／プラスミドでもなお観察されたことを証明する。

【0338】

[実施例５]
マウスにおける免疫干渉試験
現実的な理由から、組合せＨＢＶコアおよびｐｏｌ抗原ＤＮＡワクチンを、組合せ（混合）ベクター製剤として開発することが望ましいであろう。しかし、イムノドミナンスは、多価ワクチンについて起こり得て、サブドミナント抗原に対する免疫応答が鈍化し得る。したがって、異なる解剖学的部位におけるいずれかのベクターの免疫と比較した場合の、共に混合した２つの抗原発現プラスミドの組合せの投与による免疫干渉、すなわちコアおよび／またはＰｏｌ特異的細胞応答の減少を評価した。

【0339】

Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ｐＤＫ－コアおよび／またはｐＤＫ－ｐｏｌ ＤＮＡプラスミドを、実施例３に記載するように電気穿孔を介して筋肉内にワクチン接種した。ＤＮＡプラスミド（ｐＤＮＡ）を、表３に要約するように、５μｇ／部位の用量で個別に適用して、１つの部位で組み合わせるか（混合して）、または別の部位で組み合わせて投与した。動物に、３週間空けて２回のＤＮＡ免疫を行い、最後の免疫の１週間後に脾細胞を収集した。

【0340】

【表3】

【0341】

抗原特異的応答を、実施例１に記載するようにＩＦＮ－γ酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）によって分析および定量した。強いコアおよびＰｏｌ特異的抗原応答が、この実験においてＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて確認された（図６）。両方のプラスミドを混合して同じ部位に適用した群３、ならびにコアおよびｐｏｌ抗原を発現するｐＤＮＡを２つの異なる部位に個々に電気穿孔した群４に関して得られたＴ細胞応答が実質的に同一であったことに基づき、有意な免疫干渉は観察されなかった。群１の動物１匹は、低い異常なＰｏｌ－２プール指向性応答を示した。同じ実験をＣ５７／Ｂｌ６マウスにおいて繰り返し、同等の結果を得た。

【0342】

上記の結果は、２つのＨＢＶ抗原－発現プラスミドｐＤＫ－コアおよびｐＤＫ－Ｐｏｌを組み合わせた場合、実質的に免疫干渉が観察されなかったことを証明する。

【0343】

[実施例６]
非ヒト霊長類におけるＤＮＡワクチンの有効性の評価
本試験の目的は、電気穿孔によって筋肉内に送達した治療用ＨＢＶ ＤＮＡワクチンの有効性を評価すること、およびカニクイザル（Macaca fascicularis）におけるＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答／細胞活性化を誘導および測定することであった。

【0344】

ワクチン
本試験で使用したワクチンは、ＨＢＶコア抗原およびＨＢＶポリメラーゼ抗原をそれぞれコードする２つの個別のＤＮＡプラスミドの組合せであった。特に、ＤＮＡプラスミドは、図３Ａおよび３Ｂにそれぞれ示すように、および実施例１に記載するように、ｐＤＫ－Ｐｏｌプラスミド（配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする）およびｐＤＫ－コアプラスミド（配列番号２のアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードする）であった。

【0345】

ＤＮＡプラスミドを、１つの解剖学的部位に送達した両方のプラスミドの１：１（重量／重量）混合物として投与した。非ヒト霊長類（ＮＨＰ）に、ＮＨＰモデルに適用するために適合させたＴｒｉＧｒｉｄ（商標）送達システム－筋肉内（ＴＤＳ－ＩＭ）によって電気穿孔した。電気穿孔によるＤＮＡのＮＨＰへの筋肉内送達の方法およびデバイスに関する追加の説明に関しては、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれている、国際特許出願国際公開２０１７１７２８３８号明細書、および本出願と同日に代理人文書番号６８８０９７－４０５Ｕ１として提出された「Method and Apparatus for the Delivery of Hepatitis B Virus (HBV) Vaccine」と題する米国特許出願を参照されたい。特に、電極間の間隔が６．０ｍｍで、電極の直径がそれぞれ０．０２１または０．０２３インチである電極アレイを有するＴＤＳ－ＩＭ ｖ１．０またはＴＤＳ－ＩＭ ｖ２．０のＴＤＳ－ＩＭアレイを、電極の菱形構成の主軸が筋繊維と平行な方向を向くように、選択した筋肉に経皮挿入した。導体の長さはＴＤＳ－ＩＭ ｖ１．０またはＴＤＳ－ＩＭ ｖ２．０に関して５．０ｍｍであったが、有効な貫通深度は、ＴＤＳ－ＩＭ ｖ１．０に関して１５．５．ｍｍおよびＴＤＳ－ＩＭ ｖ２．０に関して９．０ｍｍであった。電極の挿入後、注射を開始してＤＮＡ（例えば、１．０ｍｌ）を筋肉に分布させた。ＩＭ注射の終了後、２５０Ｖ／ｃｍ電場（印加電圧１４２．４～１５７．６Ｖ、印加電流限界０．６～４Ａ、０．１６Ａ／秒）を、全期間約４００ｍｓの間、１０％デューティ比（すなわち、電圧を、約４００ｍｓの期間のうち全体で約４０ｍｓの間、積極的に印加する）で全６パルスを局所に印加した。電気穿孔手順の終了後、ＴｒｉＧｒｉｄ（商標）アレイを除去し、動物を回復させた。最初の免疫原性試験は、導入されたＨＢＶ抗原によって誘発される細胞性免疫応答を決定することに集中した。

【0346】

非ヒト霊長類
カニクイザル（ｎ＝３０）を中国から調達し（Ｃｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．ＵＳＡ）、年齢は２．５～５歳、試験開始時の体重は３．０～５．０ｋｇであった。動物を、獣医学のガイドラインおよびNational Research Council, Guide For the Care and Use of Laboratory Animals, 8th Edition, Washington DC: National Academies Press (2011)に従って充実した環境下で収容した。動物を試験開始前２週間馴化させた。サルをケタミンで麻酔後、各プラスミドの電気穿孔による投与を行った。各免疫の２週間後に血液を、ヘパリンナトリウムを含有するバイアルに収集した。ＰＢＭＣを、フィコール勾配を使用して単離し、液体窒素タンクにおいて分析するまで保存した。

【0347】

非ヒト霊長類における筋肉内／電気穿孔投与
プラスミドの投与を、表４に要約するように、０、３６、および６２日目に３回実施した（群１）。ｐＤＫ－コア（１．０ｍｇ）およびｐＤＫ－Ｐｏｌ（１．０ｍｇ）を、大腿四頭筋に１９ｍｍ（短い）の注射深度に設定した送達システムによって電気穿孔を介して投与した。各々の注射に関して、交互の脚の筋肉に投与した。ＤＮＡプラスミドを含有するシリンジに、筋肉への約１０ｍｍの注射標的深度のために、ＮＨＰ大腿四頭筋にとって適した注射深度リミッターを備え、菱形構成の主軸は筋繊維と平行な方向であった。ＩＭ注射の終了直後、電気穿孔装置を起動させ、４００ｍＳ間隔で、全体で最大４０ｍＳの持続で電極の間隔１ｃｍあたり最大２５０Ｖの振幅の電気刺激を行った。試料を０、１４、５０、および７６日目に収集し、ＥＬＩＳＰＯＴおよび細胞内サイトカイン染色によって分析した。

【0348】

【表4】

【0349】

ＥＬＩＳＰＯＴ分析
抗原特異的応答を、ＩＦＮ－γ酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）によって、霊長類ＩＦＮ－γＥＬＩＳｐｏｔキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ、カタログ番号ＥＬ９６１）を使用して分析および定量した。このアッセイでは、免疫した動物の単離されたＰＢＭＣを、コアタンパク質およびＰｏｌタンパク質を含むペプチドプール（２μｇ／ｍｌ）と共に３連のウェルで一晩インキュベートした。これらのプールは、コアおよびＰｏｌワクチンベクターの遺伝子型ＡＢＣＤコンセンサス配列にマッチする、１１残基が重複する１５量体ペプチドからなる。ペプチドを９０％純度（ＪＰＴ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で合成した。大きい９４ｋＤａのＨＢＶ Ｐｏｌタンパク質を中央で２つのペプチドプールに分割した。単一の抗原特異的Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの放出を、適切な抗体によって、およびスポット形成細胞（ＳＦＣ）と呼ばれるマイクロプレート上での着色スポットとしてその後の色素産生の検出によって可視化した。結果を図７Ａに示す。

【0350】

細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を使用して、ワクチン誘導性Ｔ細胞応答を試験した。凍結したＰＢＭＣを融解し、１０％ＦＢＳ、ＲＰＭＩ培地中で一晩休ませた後、ワクチンインサートマッチコア、Ｐｏｌ－１またはＰｏｌ－２ペプチドプール（２μｇ／μｌ）、ＤＭＳＯまたは白血球活性化カクテルによって、１０％ＦＢＳ、Ｇｏｌｇｉｐｌｕｇタンパク質輸送阻害剤（１μｇ／μｌ）を含有するＲＰＭＩ培地中で６時間刺激した。刺激した細胞を、固定可能な生存率解析用色素ｅＦｌｕｏｒ７８０（６５－０８６５－１４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって染色し、固定／透過処理溶液（５５４７１４、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって２０分間処置した後、以下の表５に示す細胞内染色ミクスによって３０分間染色した。染色した細胞を、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用して、適切な単色補正対照によって獲得した。応答の程度を、刺激後にＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、またはＩＬ－２を発現するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋ Ｔ細胞のパーセンテージとして報告した。結果を図７Ｂに示す。

【0351】

【表5】

【0352】

結果
ＥＬＩＳＰＯＴデータ（図７Ａ）は、２回の免疫後に、強いコアおよびＰｏｌ－２応答を示した。３回目の免疫はＩＦＮ－γの大きさを大きく増加させた。Ｐｏｌ－１ペプチドプールは、中間の応答を誘発し、これは３回目の免疫によって改善したが、コアおよびＰｏｌ－２ほど大きく改善しなかった。７６日目のデータは、５匹目のサルの採血が成功しなかったことから、４匹のＮＨＰからの結果のみを含む。各群における高い変動は、ＮＨＰが非近交系の動物から調達されていることが原因であり、遺伝的多様性が、異なる免疫応答を説明し得る。

【0353】

ＩＣＳアッセイデータ（図７Ｂ）は、ＥＬＩＳＰＯＴによって以前に観察されたように、ＨＢＶペプチド刺激によるサイトカイン応答がＣＤ８駆動性であり、コアおよびＰｏｌ－２ペプチドプールに対して特異的であることを示した。ＩＣＳアッセイにおいて応答性のＮＨＰは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイと同じ応答性の個体である。いくつかの個体のＩＣＳ応答は、ＥＬＩＳＰＯＴデータにおいて認められるように陽性を示さなかったが、これはＥＬＩＳＰＯＴアッセイ感度がより高いことに起因し得る。

【0354】

結論
上記の結果は、電気穿孔を介する筋肉内注射によってｐＤＫ－コアおよびｐＤＫ－Ｐｏｌワクチンの組合せによって免疫したＮＨＰにおいて、相当なＴ細胞応答が各プラスミド１．０ｍｇの用量で見出され、ペプチド特異的応答は２回の免疫後に検出され、３回の免疫後ではより大きい応答が検出されたことを証明している。７６日目では、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ結果は、試験したあらゆるＮＨＰ（４／５ＮＨＰ）において、ペプチドプールコア、Ｐｏｌ－１およびＰｏｌ－２が、陽性のＩＦＮ－γＴ細胞応答を誘導することを示した。免疫したＮＨＰからのＰＢＭＣに関するＩＣＳアッセイは、ＨＢＶペプチド特異的応答がＣＤ８駆動性であり、最も高い応答はコアおよびＰｏｌ－２ペプチドプールに対する応答であることを示している。

【0355】

[実施例７]
ヒト対象におけるＤＮＡワクチンの有効性の評価
電気穿孔によって筋肉内に送達した治療用ＨＢＶ ＤＮＡワクチンの有効性をヒト対象において評価する。

【0356】

ヒト対象
ヒト対象は、ＨＢｓＡｇ陽性である慢性ＨＢＶ感染症を有する成人患者である。ヒト対象は、ＨＢＶポリメラーゼ阻害剤（エンテカビルまたはテノフォビル）によって処置されている。

【0357】

ワクチン
ヒト患者に、ＨＢＶコア抗原およびＨＢＶポリメラーゼ抗原をそれぞれコードする２つの個別のＤＮＡプラスミドの組合せを投与する。特に、ＤＮＡプラスミドは、図３Ａおよび３Ｂにそれぞれ示すように、ならびに実施例１に記載するように、ｐＤＫ－Ｐｏｌプラスミド（配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする）およびｐＤＫ－コアプラスミド（配列番号２のアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原をコードする）であった。ＤＮＡプラスミドを、無作為プラセボ対照用量漸増試験に従って、両方のプラスミドの１：１混合物を異なる投薬量で、特に総プラスミド０．２５ｍｇ、１ｍｇ、および６ｍｇの投薬量で投与する。

【0358】

ヒト対象における筋肉内／電気穿孔投与
ＤＮＡプラスミドを、ヒトに適用するために適合させたＴｒｉＧｒｉｄ（商標）送達システム－筋肉内（ＴＤＳ－ＩＭ）を使用して２～３回の筋肉内免疫において電気穿孔によってヒト対象に投与する。一部の患者には、プラセボ（すなわち、ＨＢＶ抗原のコード配列を欠如するプラスミド）を対照として投与する。ヒトに適用するために適合させたＴｒｉＧｒｉｄ（商標）送達システム－筋肉内（ＴＤＳ－ＩＭ）を、電気穿孔によるプラスミドＤＮＡの送達のために使用する。電気穿孔によるＤＮＡのヒトへの筋肉内送達の方法およびデバイスに関する追加の説明に関しては、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれている、国際特許出願国際公開２０１７１７２８３８号明細書、および本出願と同日に代理人文書番号６８８０９７－４０５Ｕ１として提出された「Method and Apparatus for the Delivery of Hepatitis B virus (HBV) vaccine」と題する米国特許出願を参照されたい。例えば、電極間の間隔が６．０ｍｍで、電極の直径がそれぞれ０．０２３インチである電極アレイを有するＴＤＳ－ＩＭ ｖ２．０のＴＤＳ－ＩＭアレイを、電極の菱形構成の主軸が筋繊維と平行な方向となるように、骨格筋に経皮挿入することができる。導体の長さは、５．０ｍｍであり得るが、有効な貫通深度は、１９ｍｍであり得る。電極の挿入後、注射を開始してＤＮＡ（例えば、１．０ｍｌ）を筋肉に分布させる。ＩＭ注射の終了後、２５０Ｖ／ｃｍ電場（印加電圧１４２．４～１５７．６Ｖ、印加電流限界０．６～４Ａ、０．１６Ａ／秒）を、全期間約４００ｍｓの間、１０％デューティ比（すなわち、電圧を、約４００ｍｓの期間のうち全体で約４０ｍｓの間、積極的に印加する）で全６パルスを局所に印加する。電気穿孔手順の終了後、ＴｒｉＧｒｉｄ（商標）アレイを除去し、ヒト対象を回復させる。

【0359】

血液試料を免疫後様々な時点で患者から収集する。特に臨床的セロコンバージョンへの進展と整合するレベルの免疫後のＨＢｓＡｇレベルの推移を、免疫後３～６ヶ月後に患者において評価する。ＨＢｓＡｇの持続的な喪失および臨床疾患（例えば、肝硬変、肝細胞癌）の減少を、免疫の６～１２ヶ月後に患者において評価する。

【0360】

[実施例８]
マウスにおけるアデノウイルスベクターのｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性試験
ＨＢＶコア抗原またはＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするアデノウイルスベクターを含有する免疫治療用ワクチンを、マウスにおいて試験した。試験の目的は、Ｆ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６×Ｂａｌｂ／Ｃ）への筋肉内送達後のワクチンによって誘導されたＴ細胞応答を検出することであった。最初の免疫原性試験は、導入されたＨＢＶ抗原によって誘発される細胞性免疫応答の決定に集中した。特に、試験したアデノベクターは、図８Ａおよび８Ｂに示す発現カセットを含有した。

【0361】

Ｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性試験
アデノウイルスワクチンのｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性を評価するために、ＨＢＶアデノウイルスベクターをＦ１マウスに筋肉内投与した。これらの免疫原性試験は、ＨＢＶ抗原コアおよびポリメラーゼによって誘発される細胞性免疫応答の決定に集中した。Ｆ１マウスへの投与を、表６に要約するように実施した。動物は１回のＨＢＶアデノウイルスベクター免疫を受けた。９週間後に脾細胞を収集した。

【0362】

【表6】

【0363】

ＨＢＶアデノウイルスベクターの免疫原性の評価
抗原特異的応答を、ＩＦＮ－γ酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）によって分析および定量した。このアッセイにおいて、免疫した動物の単離した脾細胞を、コアおよびＰｏｌタンパク質（各ペプチド２μｇ／ｍｌ）を含むペプチドプールと共にインキュベートした。プールは、コアおよびＰｏｌアデノウイルスベクターの遺伝子型ＡＢＣＤコンセンサス配列にマッチする、１１残基が重複する１５量体ペプチドからなる。大きい９４ｋＤａのＨＢＶ Ｐｏｌタンパク質を、中央で２つのペプチドプールに分割した。ＥＬＩＳＰＯＴでは、単一の抗原特異的Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの放出を、適切な抗体によって、およびスポット形成細胞（ＳＦＣ）と呼ばれるマイクロプレート上での着色スポットとしてその後の色素産生の検出によって可視化した。

【0364】

結果を図９に示す。結果から、ＨＢＶ アデノウイルスベクター、特にコア Ｐｏｌ融合体およびコアアデノベクターの組合せは、コアおよびＰｏｌ特異的Ｔ細胞応答を生じたことが認められ得る。これらのデータは、ＨＢＶコアおよびｐｏｌ抗原をコードするアデノウイルスベクターがＦ１マウスにおいてコアおよびｐｏｌに対して強いＴ細胞応答を生じることを示している。

【0365】

本明細書に記載の実施例および実施形態は、単なる例証目的のためであり、広い本発明の概念から逸脱することなく、上記の実施形態に変更を行うことができると理解される。したがって、本発明は、開示の特定の実施形態に限定されないと理解され、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲内の改変を含むと意図される。
参考文献

【0366】

【表7】

以下の態様を包含し得る。
［１］ （ａ）配列番号４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の天然に存在しない核酸分子であって、前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有しない、第１の天然に存在しない核酸分子；
（ｂ）配列番号２または配列番号１４と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の天然に存在しない核酸分子；および
（ｃ）薬学的に許容可能な担体、
を含む組成物であって、
前記第１の天然に存在しない核酸分子および前記第２の天然に存在しない核酸分子が、同じ天然に存在しない核酸分子または２つの異なる天然に存在しない核酸分子に存在する、
組成物。
［２］ （ａ）配列番号４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の天然に存在しない核酸分子であって、前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有しない、第１の天然に存在しない核酸分子；
（ｂ）配列番号２または配列番号１４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の天然に存在しない核酸分子；および
（ｃ）薬学的に許容可能な担体、
を含むキットであって、
前記第１の天然に存在しない核酸分子および前記第２の天然に存在しない核酸分子が、同じ天然に存在しない核酸分子または２つの異なる天然に存在しない核酸分子に存在する、
キット。
［３］ 前記第１のポリヌクレオチドが、配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードし、前記第２のポリヌクレオチドが、配列番号２または配列番号１４のアミノ酸配列からなるＨＢＶコア抗原をコードする、上記［１］または［２］に記載の組成物またはキット。
［４］ 前記第１のポリヌクレオチドが、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする、上記［１］または［２］に記載の組成物またはキット。
［５］ 前記第１の天然に存在しない核酸分子および前記第２の天然に存在しない核酸分子の少なくとも１つが、前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原および前記切断型ＨＢＶコア抗原の少なくとも１つに作動可能に連結されたシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、上記［１］～［４］のいずれか１項に記載の組成物またはキット。
［６］ 前記シグナル配列が、独立して配列番号６または配列番号１９のアミノ酸配列を含み、好ましくは前記シグナル配列が、配列番号５または配列番号１８のポリヌクレオチド配列によってコードされる、上記［５］に記載の組成物またはキット。
［７］ 前記第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号３または配列番号１６と少なくとも９０％同一である、上記［１］～［６］のいずれか１項に記載の組成物またはキット。
［８］ 前記第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号３または配列番号１６のポリヌクレオチド配列を含む、上記［７］に記載の組成物またはキット。
［９］ 前記第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１または配列番号１５と少なくとも９０％同一である、上記［１］～［８］のいずれか１項に記載の組成物またはキット。
［１０］ 前記第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１または配列番号１５のポリヌクレオチド配列を含む、上記［９］に記載の組成物またはキット。
［１１］ 前記第１の天然に存在しない核酸分子および前記第２の天然に存在しない核酸分子が同じベクターに存在する、上記［１］～［１０］のいずれか１項に記載の組成物またはキット。
［１２］ 前記ベクターが、任意選択でリンカーを介して、前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結された前記切断型ＨＢＶコア抗原を含む融合タンパク質をコードする、上記［１１］に記載の組成物またはキット。
［１３］ 前記融合タンパク質が、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、上記［１２］に記載の組成物またはキット。
［１４］ 前記ベクターが、５’末端から３’末端に、プロモーター配列、エンハンサー配列、シグナルペプチドコード配列、前記第２のポリヌクレオチド配列、リンカーコード配列、前記第１のポリヌクレオチド配列、およびポリアデニル化シグナル配列を含有する、上記［１２］または上記［１３］に記載の組成物またはキット。
［１５］ 前記ベクターが、アデノウイルスベクター、好ましくはＡｄ２６またはＡｄ３５ベクターである、上記［１４］に記載の組成物またはキット。
［１６］ 前記アデノウイルスベクターが、配列番号１７のポリヌクレオチド配列を含む前記プロモーター配列、配列番号２３のポリヌクレオチド配列を含む調節配列、配列番号１８のポリヌクレオチド配列を含む前記シグナルペプチドコード配列、配列番号１５のポリヌクレオチド配列を含む前記第２のポリヌクレオチド配列、配列番号２２のポリヌクレオチド配列を含む前記リンカーコード配列、配列番号１６のポリヌクレオチド配列を含む前記第１のポリヌクレオチド配列、および配列番号２４のポリヌクレオチド配列を含む前記ポリアデニル化シグナル配列を含有する、上記［１５］に記載の組成物またはキット。
［１７］ 前記第１の天然に存在しない核酸分子および前記第２の天然に存在しない核酸分子が、２つの異なるベクターに存在する、上記［１］～［１０］のいずれか１項に記載の組成物またはキット。
［１８］ 前記第１の天然に存在しない核酸分子が第１のプラスミドＤＮＡベクターに存在し、前記第２の天然に存在しない核酸分子が第２のプラスミドＤＮＡベクターに存在する、上記［１７］に記載の組成物またはキット。
［１９］ 前記第１および前記第２のプラスミドＤＮＡベクターの各々が、複製開始点、抗生物質耐性遺伝子、ならびに５’末端から３’末端に、プロモーター配列、調節配列、シグナルペプチドコード配列、前記第１のポリヌクレオチド配列または前記第２のポリヌクレオチド配列、およびポリアデニル化シグナル配列を含む、上記［１８］に記載の組成物またはキット。
［２０］ 前記抗生物質耐性遺伝子が、配列番号１２と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号１２と１００％同一であるポリヌクレオチド配列を有するカナマイシン耐性遺伝子である、上記［１９］に記載の組成物またはキット。
［２１］ 前記組成物またはキットが、
（ａ）３’末端から５’末端に、配列番号７のポリヌクレオチド配列を含む前記プロモーター配列、配列番号８のポリヌクレオチド配列を含む前記調節配列、配列番号５のポリヌクレオチドを含む前記シグナルペプチドコード配列、配列番号３のポリヌクレオチド配列を含む前記第１のポリヌクレオチド配列、および配列番号１１のポリヌクレオチド配列を含む前記ポリアデニル化シグナル配列を含む第１のプラスミドＤＮＡベクター；
（ｂ）３’末端から５’末端に、配列番号７のポリヌクレオチド配列を含む前記プロモーター配列、配列番号８のポリヌクレオチド配列を含む前記調節配列、配列番号５のポリヌクレオチド配列を含む前記シグナルペプチドコード配列、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む前記第２のポリヌクレオチド配列、および配列番号１１のポリヌクレオチド配列を含む前記ポリアデニル化シグナル配列を含む第２のプラスミドＤＮＡベクター；ならびに
（ｃ）薬学的に許容可能な担体、
を含み、
前記第１のプラスミドＤＮＡベクターおよび前記第２のプラスミドＤＮＡベクターの各々が、配列番号１２のポリヌクレオチド配列を有するカナマイシン耐性遺伝子、および配列番号１０のポリヌクレオチド配列を有する複製開始点をさらに含み、ならびに
前記第１のプラスミドＤＮＡベクターおよび前記第２のプラスミドＤＮＡベクターが、同じ組成物または２つの異なる組成物に存在する、
上記［２０］に記載の組成物またはキット。
［２２］ 前記組成物またはキットが、それを必要とする対象におけるＢ型肝炎ウイルスに対する免疫応答の誘導に使用するためのものであり、好ましくは前記対象が慢性ＨＢＶ感染症を有する、上記［１］～［２１］のいずれか１項に記載の組成物またはキット。
［２３］ 前記組成物またはキットが、それを必要とする対象におけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）誘導疾患の処置に使用するためのものであり、好ましくは前記対象が、慢性ＨＢＶ感染症を有し、前記ＨＢＶ誘導疾患が、進行線維症、肝硬変、および肝細胞癌（ＨＣＣ）からなる群から選択される、上記［１］～［２１］のいずれか１項に記載の組成物またはキット。
［２４］ 配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む天然に存在しない核酸分子であって、前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原が逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有さず、前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、哺乳動物において少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答を誘導することが可能であり、好ましくは前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、哺乳動物において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、ＣおよびＤに対するＴ細胞応答を誘導することが可能であり、ならびにより好ましくは前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能であり、任意選択で前記天然に存在しない核酸分子が、配列番号２または配列番号１４のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含む、天然に存在しない核酸分子。
［２５］ 任意選択でリンカーを介して前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結された前記切断型ＨＢＶコア抗原を含む融合タンパク質をコードする、上記［２４］に記載の天然に存在しない核酸分子。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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