特許 7317296 ｐＨｌｕｏｒｉｎ－Ｓｅｍａ３Ａノックイン非ヒト動物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-07-21

(45)【発行日】2023-07-31

(54)【発明の名称】ｐＨｌｕｏｒｉｎ－Ｓｅｍａ３Ａノックイン非ヒト動物

(51)【国際特許分類】

   A01K 67/027 20060101AFI20230724BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20230724BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20230724BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20230724BHJP

【ＦＩ】

A01K67/027 ZNA

G01N33/15 Z

C12N15/12

C12N15/62 Z

【請求項の数】 5

(21)【出願番号】P 2019190124

(22)【出願日】2019-10-17

(65)【公開番号】P2021061809

(43)【公開日】2021-04-22

【審査請求日】2022-05-23

(73)【特許権者】

【識別番号】505155528

【氏名又は名称】公立大学法人横浜市立大学

(74)【代理人】

【識別番号】100098121

【弁理士】

【氏名又は名称】間山 世津子

(74)【代理人】

【識別番号】100107870

【弁理士】

【氏名又は名称】野村 健一

(72)【発明者】

【氏名】五嶋 良郎

【審査官】西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２００５／０９４５７１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】De Wit, J. et al.，"Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons"，J. Neurosci.，2009年，Vol. 29，pp. 23-37

【文献】Bozza, T. et al.，"In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse"，Neuron，2004年，Vol. 42，pp. 9-21

【文献】Agosti, F. et al.，"pHluorin-tagged TRPV1 shines light on capsaicin tachyphylaxis"，Channels，2019年，Vol. 13，pp. 308-310，Published online: 08 Jul 2019

【文献】De Wit, J. et al.，"Semaphorin 3A displays a punctate distribution on the surface of neuronal cells and interacts with proteoglycans in the extracellular matrix"，Mol. Cell. Neurosci.，2005年，Vol. 29，pp. 40-55

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ａ０１Ｋ ６７／０２－６７／０２７

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

セマフォリン3Aの分泌シグナルの直下にpHluorinを融合させたノックイン遺伝子が導入され、pHluorinで標識されたセマフォリン3Aを発現する非ヒトノックイン動物。

【請求項2】

動物がマウスである、請求項１記載の動物。

【請求項3】

請求項１又は２に記載の動物に医薬品候補物質を投与することを含む、医薬品のスクリーニング方法。

【請求項4】

医薬品が、セマフォリン3Aが関与する疾患を予防及び／又は治療の対象とする請求項３記載の方法。

【請求項5】

セマフォリン3Aが関与する疾患が、喘息、アトピー性皮膚炎、アルツハイマー型認知症、変形性関節炎、悪性腫瘍及び循環器系疾患からなる群より選択される少なくとも一つの疾患である請求項４記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、pHluorin-Sema3Aノックイン非ヒト動物に関する。

【背景技術】

【0002】

セマフォリン3A(Sema3A)は、反発型軸索ガイダンス分子として同定された分泌型タンパク質である（非特許文献１：Luo et al., 1993）。近年Sema3Aには様々な機能や病態との関係が見出され、免疫、アレルギー、精神神経疾患、呼吸器疾患、心臓血管系の疾患における広範な役割が明らかになっている（非特許文献２：Goshima et al., 2012）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【文献】Luo, Y., Raible, D., and Raper, J.A. (1993). Collapsin: a protein in brain that induces the collapse and paralysis of neuronal growth cones. Cell 75, 217-227.

【文献】Goshima Y, Sasaki Y, Yamashita N, Nakamura F. Class 3 semaphorins as a therapeutic target. Expert Opin Ther Targets. 2012 Sep;16(9):933-44. doi: 10.1517/14728222.2012.710201.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

Sema3Aは分泌型で作用を表す。しかしながら、現在の抗体を用いる検出技術では、機能的なSema3Aの生体内動態を把握することは不可能である。本発明は、これを解決しようとするものである。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明者は、Sema3Aの分泌シグナルの直下にpHluorin(pH感受性GFP)を融合させた、pHluorin-Sema3Aノックインマウスを作製した。本ノックインマウスの作製により、まず蛍光タンパク質に対する抗体を用いることで内因性Sema3Aの活動依存的な発現分布および発現量の変化を検討することが可能となる。さらにpH感受性分子の特性を利用し、Sema3Aの分泌の様子を生体内で観察することが可能になる。さらにこのマウスから採取した細胞を用いて、一定の株化細胞を樹立し、発現を調節する因子のスクリーニング系の確立も可能となる。

【0006】

本発明の要旨は以下の通りである。
(１)セマフォリン3Aの分泌シグナルの直下にpHluorinを融合させた、非ヒトノックイン動物。
(２)動物がマウスである、(１)記載の動物。
(３)(１)又は(２)に記載の動物に医薬品候補物質を投与することを含む、医薬品のスクリーニング方法。
(４)医薬品が、セマフォリン3Aが関与する疾患を予防及び／又は治療の対象とする(３)記載の方法。
(５)セマフォリン3Aが関与する疾患が、喘息、アトピー性皮膚炎、アルツハイマー型認知症、変形性関節炎、悪性腫瘍及び循環器系疾患からなる群より選択される少なくとも一つの疾患である(４)記載の方法。

【0007】

Sema3Aあるいはその受容体を標的とする創薬の可能性が指摘されている。しかし現在までのところ、Sema3A自体の生体内動態を把握する技術は皆無である。本発明は、Sema3Aの様々な病態への関与の詳細やメカニズムの研究を加速し、創薬への可能性を広げる。

【発明の効果】

【0008】

本発明により、内因性Sema3Aの活動依存的な発現分布および発現量の変化を検討することが可能となる。また、Sema3Aの分泌の様子を生体内で観察することが可能になる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】Sema3Aは、AMPA受容体の海馬初代培養物ニューロン表面への輸送を制御する。（Ａ）（左）Sma3Aで処理した(+)または対照(-)の培養海馬ニューロンのMAP2陽性樹状突起における表面GluA1斑点(puncta)の免疫組織化学的イメージ。（右）樹状突起上の表面GluA1斑点の定量分析。データは、3つの独立した培養物由来の18～19個のニューロンから得た。（Ｂ）（左）Sma3Aで処理した(+)または対照(-)の培養海馬ニューロンのMAP2陽性樹状突起における表面PlexA4および表面GluA1の免疫組織化学的イメージ。（右）樹状突起上の表面PlexA4および表面GluA1の平均免疫染色強度の定量分析。データは、3つの独立した培養物由来の20個のニューロン(Sema3A)および20個のニューロン（対照）から得た。（Ｃ）（左）Sma3Aで処理した(+)または対照(-)の培養海馬ニューロンのMAP2陽性樹状突起における全PlexA4および全GluA1の免疫組織化学的イメージ。（右）樹状突起上の全PlexA4および全GluA1の平均免疫染色強度の定量分析。データは、25個のニューロン(Sema3A)および26個のニューロン（対照）から得た。（Ｄ）P5、P10またはP15のラット海馬ライセートにおけるGluA1およびPlexA4の免疫沈降。GluA1およびPlexA4は、検査した全ての日齢のラット海馬ライセート中で共免疫沈降した。（Ｅ）（上部）PlexA4の構造、および構築されたPlexA4変異体の模式的表示。PlexA4はシグナルペプチド、semaドメイン、3個のPSI（プレキシン、セマフォリンおよびインテグリンに見出されるドメイン）ドメイン、3個のIPT（免疫グロブリン様プレキシン転写因子）ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。略語は以下の通りである：Full: 全長; IPT: 3個のIPTドメイン；Δect: 全細胞外ドメイン欠損。（下部）EGFP-GluA1、およびPlexA4の全長、ΔectまたはIPTドメインの免疫沈降。EGFPでタグ付けしたGluA1は、PlexA4-MycのIPT変異体と相互作用した。（Ｆ）（左）Sma3Aで処理した(+)または対照(-)の PlexA4-IPTドメイン発現ニューロンのMAP2陽性樹状突起における表面GluA1斑点の免疫組織化学的イメージ。（右）PlexA4-IPTドメイン発現ニューロンの樹状突起上の表面GluA1斑点の定量分析。データは、3つの独立した培養物由来の15個のニューロンから得た。（Ｇ）（左）Sma3Aで処理した(+)または対照(-)のPlexA4-RNAiまたはスクランブル-RNAi発現ニューロンのMAP2陽性樹状突起における表面GluA1斑点の免疫組織化学的イメージ。（右）PlexA4-RNAiまたはスクランブル-RNAi発現ニューロンの樹状突起上の表面GluA1斑点の定量分析。データは、４つの独立した培養物由来の22-25個のニューロン(Sema3A)または24-26個のニューロン（対照）から得た。*P <0.05。

【図2】PlexinA4発現のノックダウンは海馬スライスにおけるLTPを減弱させる。海馬のCA1におけるPlexA4-RNAi感染細胞またはPlexA4スクランブル-RNAi感染細胞からの正規化された応答。4～5週齢のラットから急性脳スライスを調製した。海馬のCA1シナプスのLTPは、シナプス後脱分極(0 mv)をシナプス前刺激(5 Hz, 90 秒)と対にすることによって誘導した。対形成後、少なくとも30分間、記録づけを維持した。（左）EPSC（excitatory postsynaptic current:興奮性シナプス後電流）振幅は、対形成の前に、平均ベースライン振幅に対して正規化した。PlexA4スクランブル-RNAi（黒四角）およびPlexA4-RNAi（オレンジ色の円）を示す。（右）誘導後20から30分の間の平均振幅をベースライン振幅に対して正規化した。PlexA4スクランブル-RNAi：n=4；PlexA44 RNAi：n=5。*P <0.05。「n」は動物の数を表す。

【図3】恐怖学習は、記憶形成を媒介するSema3Aを分泌する。（Ａ）実験設計およびIA恐怖条件付けのための明暗ボックス。（Ｂ）マウスES細胞中にFlag-SEP Sema3Aノックイン変異を創出するための戦略。遺伝子型がWT, ki/+ およびki/kiのマウス。（Ｃ）未訓練またはIA条件付けされたSema3Aノックインマウスの海馬における、SEP-Sema3Aおよび表面GluA1（左）またはSEP-Sema3Aおよびシナプシン（右）の代表的な顕微鏡写真。矢じりは、SEP-Sema3Aおよび各タンパク質の共局在を示す。（Ｄ）Sema3Aノックインマウスの海馬におけるSEP-Sema3A斑点（未訓練：n=6、条件付け：n=6）、SEP-Sema3Aと表面GluA1との共局在の斑点（未訓練：n=8、条件付け：n=10）またはシナプシン１との共局在の斑点（未訓練：n=7、条件付け：n=7）の定量分析。「n」はスライスの数を表す。（Ｅ）（上）Sema3A中和抗体を用いたIA恐怖条件付けのための実験設計（下）陰性対照を投与された（n=6）またはSema3A中和抗体を投与された(n=7)動物の、IA訓練の前後に暗いボックスへ入るまでの反応時間。「n」は動物の数を表す。*P <0.05。

【図4】Sema3A-NRP1-PlexinA4シグナル伝達は恐怖学習を媒介する。（Ａ）RNAiノックダウンを用いたIA恐怖条件付けのための実験設計（Ｂ）スクランブルRNAi（n=7）またはPlexA4 RNAi (n=8)に感染した動物の、IA訓練の前後に暗いボックスへ入るまでの反応時間。（Ｃ）（左）ウォークスルーまたはIA訓練されたラットの海馬中のスクランブルRNAiまたはPlexA4 RNAi由来の代表的EPSC。（右）各条件における平均AMPA/NMDA比。（ウォークスルースクランブルRNAi: n=4; ウォークスルーPlexA4 RNAi: n=4；IA訓練スクランブルRNAi: n=5；IA 訓練PlexA4 RNAi: n=6）。（Ｄ）ウォークスルーまたはIA訓練されたラットの海馬中のスクランブルRNAiまたはPlexA4 RNAiに由来するNMDAR媒介電流の平均減衰時間（Ｅ）（左）ウォークスルーまたはIA訓練されたラットの海馬中の陰性対照RNAi、BRP1 RNAi またはNRP2 RNAi由来の代表的EPSC。（右）各条件における平均AMPA/NMDA比。（ウォークスルー陰性対照RNAi: n=4; ウォークスルーNRP1 RNAi: n=4；ウォークスルーNRP2 RNAi: n=4；IA訓練陰性対照RNAi：n=4；IA 訓練NRP1 RNAi: n=5；IA訓練 NRP2 RNAi: n=4）。（Ｆ）ウォークスルーまたはIA訓練されたラットの海馬中の陰性対照RNAi、NRP1 RNAiまたはNRP2 RNAiに由来するNMDAR媒介電流の平均減衰時間。（G）（左）未訓練の、またはIA訓練されたラットから得た海馬ライセートのPSD画分における全CRMP２およびリン酸化CRMP2のイムノブロット。（右）CRMP2 S522のリン酸化レベル。pCRMP2 のCRMP2に対する比を、未訓練群に対して正規化した。（未訓練：n=6、IA訓練：n=6）。「n」は動物の数を表す。*P <0.05。

【図5-1】Sema3A (flag-SEP)KIのためのKI Targeting vector構築。

【図5-2】Sema3A (flag-SEP)KIのためのKI Targeting vector構築。

【図6】本発明の非ヒトノックイン動物を用いた医薬品のスクリーニングの一例。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0011】

本発明は、セマフォリン3Aの分泌シグナルの直下にpHluorinを融合させた、非ヒトノックイン動物を提供する。

【0012】

本発明の非ヒトノックイン動物においては、pHluorinで標識されたセマフォリン3Aが発現する。これにより、蛍光タンパク質に対する抗体を用いることで内因性Sema3Aの活動依存的な発現分布および発現量の変化を検討することが可能となり、また、pH感受性分子の特性を利用して、Sema3Aの分泌の様子を生体内で観察することが可能になる。

【0013】

本発明の非ヒトノックイン動物は、ターゲティングベクターを用いて、相同組換えにより作製することができる。非ヒトノックイン動物を作製するためのターゲティングベクターは、相同組み換えを可能とするために、レシピエント動物の内在性セマフォリン3A遺伝子に相同な領域を含む5’アーム、pHluorinをコードする配列、及びレシピエント動物の内在性セマフォリン3A遺伝子に相同な領域を含む3’アームを含むとよい。

【0014】

5’アームは、セマフォリン3Aのエクソン１の全部、エクソン２の前半及び分泌シグナルを含むように設計するとよい。

【0015】

pHluorin（pH感受性GFP）は、GFPの遺伝子に変異を加え蛍光強度のpH依存的変化を増幅させた変異体であり、7.1程度のpKa値を示し、中性域では強い蛍光を発するが、弱酸性域では蛍光が減弱する。さらに蛍光強度を改良した変異体superecliptic pHluorin（SEP）が開発されており、これを用いてもよい。pHluorinをコードする配列には、FLAG-tagを付加してもよい。FLAG-tagを付加することにより、レシピエント動物におけるセマフォリン3Aの発現を抗FLAG抗体による免疫染色にて検出することができる。

【0016】

目的とするflag-SEP-Sema3Aを、分泌シグナルを持つfusionタンパク質として発現させるために、pHluorinをコードする配列の後に、セマフォリン3Aのエクソン２の後半12個のアミノ酸をコードする配列を挿入するとよい。またスプライシングが正常に行われるために、スプライシングドナー（splicing donor）部分を含むように、セマフォリン3Aのエクソン２の後半12個のアミノ酸をコードする配列の後にイントロン2-3の配列の一部を挿入するとよい。

【0017】

3’アームは、イントロン2-3の配列の一部を含むとよいが、エクソンを含まなくてよい。

【0018】

ターゲティングベクターを構築する際には、Sema3A transcript variant2 mRNA[NM_001243072.1]、Sema3A transcript variant1 mRNA[NM_009152.4]などを参考にするとよい。

【0019】

ターゲティングベクターは、組み換えが起きた細胞を選別するための選択マーカー遺伝子（ポジティブ選択マーカー）も含むとよい。ポジティブ選択マーカーとしては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子を用いることができる。ポジティブ選択マーカーの両端にFRT配列を挿入しておけば、組換えFLP発現動物と交配することにより、Sema3A遺伝子座からポジティブ選択マーカーを除去することができる。

【0020】

相同組換えによらない、ランダム挿入により組換えが起こった細胞を除去するためには、ターゲティングベクターはネガティブ選択マーカーを含むとよい。ターゲティングベクターに、ネガティブ選択マーカーとしてジフテリア毒素（DT）遺伝子が組み込まれていれば、該ベクターがランダムに挿入された細胞は自身の産生する毒素によって死滅するので、相同組換え体のみを選択することができる。DT遺伝子の他、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子なども用いることができる。

【0021】

ノックインDNA断片は、pHluorinをコードする配列、セマフォリン3Aのエクソン２の後半12個のアミノ酸をコードする配列、イントロン2-3の配列の一部（608bp）、及びFRT配列に挟まれたネオマイシン耐性遺伝子発現カセットの順に結果的に繋がった形で作製されればよい。ターゲティングベクターは、レシピエント動物のセマフォリン3A遺伝子のゲノム配列（エクソン１、エクソン２、及びイントロン2-3の配列を含む）をサブクローニングしたベクター（後述の実施例では、pDT-MC#3）のゲノム配列におけるエクソン２に位置する25アミノ酸の分泌シグナルペプチドの直後にノックインDNA断片が挿入され、挿入断片の直後がイントロン2-3の配列の609bpから始まるように作製されていればよく、それを制限酵素（後述の実施例では、SalI）により線状化して、作製することができる（図5-1, 5-2参照）。

【0022】

ノックイン動物は、以下の手順で作製することができる。エレクトロポレーション法によりターゲティングベクターをES細胞に導入して、培養し、G418などによる薬剤選別を行う。コロニーを形成した薬剤耐性ESクローンの中から相同組換えESクローンを同定し、同定された相同組換えESクローンを非ヒト動物の受精卵（８細胞期胚が好ましい）にインジェクションした後、偽妊娠動物の子宮に移植する。分娩または帝王切開で産仔を得て、ノックイン遺伝子を確認する。ノックイン遺伝子が確認されたキメラ動物を野生型動物と交配させて産仔（F1）を得て、同様に遺伝子型確認を行い、ヘテロ変異動物が得られれば、ノックイン動物が樹立できたことになる。ターゲティングベクターのポジティブ選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）の両端にFRT配列を挿入しておけば、キメラ動物を組換えFLP発現動物と交配することにより、Sema3A遺伝子座からポジティブ選択マーカーを除去することができる。ヘテロ変異動物同士を交配することにより、ホモ変異動物を得ることができる。

【0023】

非ヒト動物は、ヒト以外の哺乳動物であればよく、マウス、ラット、ウシ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどを例示することができ、マウスが好ましい。

【0024】

本発明の非ヒトノックイン動物に医薬品候補物質を投与することにより、医薬品として有効な物質をスクリーニングすることができる。本発明は、セマフォリン3Aの分泌シグナルの直下にpHluorinを融合させた、非ヒトノックイン動物に医薬品候補物質を投与することを含む、医薬品のスクリーニング方法を提供する。医薬品は、セマフォリン3Aが関与する疾患を予防及び／又は治療の対象とするものであるとよく、セマフォリン3Aが関与する疾患としては、喘息、アトピー性皮膚炎、アルツハイマー型認知症、変形性関節炎、悪性腫瘍、循環器系疾患などを例示することができる。医薬品候補物質は、特に限定されるものではなく、いかなる物質であってもよく、合成化合物であっても、天然物から抽出された化合物であってもよく、タンパク質、ペプチド、ビタミン、ホルモン、多糖、オリゴ糖、単糖、低分子化合物、核酸（DNA、RNA、オリゴヌクレオチド、モノヌクレオチド等）、脂質などのいかなる種類の化合物であってもよい。また、医薬品候補物質は、新しいリード化合物であっても、リード化合物から誘導体化された化合物であってもよい。さらに、医薬品候補物質は、単独の化合物であっても、複数の化合物から成る混合物であってもよい。

【0025】

医薬品のスクリーニング方法の一例を以下に記載する（図６）。

【0026】

Sema3Aタンパク質を含む溶液の皮内投与は、アトピー性皮膚炎モデルマウスの症状を劇的に改善する。またヒトのアトピー性皮膚炎の皮膚内のSema3Aの減少が報告されている (Tominaga et al., 2008)。従って、Sema3Aの皮膚における量を増加させる作用を持つ薬物のスクリーニングは、アトピー性皮膚炎治療薬を探索する上で有用である。同マウスを用い、in vivo及び in vitroの実験系において、様々な候補化合物を投与し、内在性のSema3Aの発現量の増加の有無を解析する。この系を用いることにより、抗体を用いることなく、Sema3Aの発現量を蛍光の強度を測定することにより評価することが可能となる。また、感度を上げるために、タグとしてSema3Aに付与したpHluorinに対する抗体を用いることも可能となる。

【実施例】

【0027】

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
〔実施例１〕
活動によって誘導されるセマフォリン3A分泌は、学習を媒介する。

【0028】

要約
セマフォリンファミリーは、軸索ガイダンスおよび細胞遊走という活動非依存的な神経発達過程、ならびに免疫システムに関与する分泌型または膜結合型タンパク質として、よく特徴づけられている。発達中の軸索の化学忌避物質(chemo-repellents)としてのセマフォリンの生理学的機能は十分に確立されているが、活動依存的なシナプス可塑性およびさらに学習・記憶におけるセマフォリンの役割は、いまだに殆ど分かっていない。本研究において、我々は、恐怖学習(恐怖条件付け)（inhibitory avoidance task）（これは海馬に依存した文脈的学習パラダイムである）が海馬において分泌型セマフォリンであるセマフォリン3Aの分泌を増加させることを見出した。さらに、海馬において分泌されたセマフォリン3Aは、ニューロピリン1/プレキシンA1セマフォリン受容体複合体を介してAMPA受容体を海馬シナプス中に移行させることによって、文脈的記憶形成を媒介する。このシグナル伝達過程は、セマフォリンシグナル伝達の下流分子として特徴付けられているコラプシン反応媒介タンパク質２（collapsin-response-mediator-protein 2; CRMP2）のリン酸化状態の変更を伴う。このことは、学習の制御因子としてのセマフォリンファミリーの生理学的役割を提供する。

【0029】

序論
セマフォリンは、軸索誘導、細胞遊走および免疫システムの制御に関与する、分泌型および膜結合型分子の最も大きいファミリーの一つを形成する(Kolodkin and Tessier-Lavigne, 2011)。セマフォリンは、その構造に基づいて幾つかのグループに分類される（Jongbloets and Pasterkamp, 2014; Kolodkin and Tessier-Lavigne, 2011)。セマフォリン3A (Sema3A)は、クラス3の分泌型セマフォリンであり、発達中の軸索の反発分子としてよく特徴付けられている（Jongbloets and Pasterkamp, 2014; Luo et al., 1993）。ニューロピリン1 (NRP1)は、Sema3Aの主要な結合部位であり、そして大きな細胞内ドメインを有するプレキシンと複合体を形成して、Sema3Aシグナルを伝達する（He and Tessier-Lavigne, 1997; Kolodkin et al., 1997; Nakamura et al., 1998; Takahashi et al., 1999; Takahashi et al., 1998; Tamagnone et al., 1999）。活動非依存的な軸索ガイダンスおよび神経細胞遊走におけるセマフォリンの生理学的役割は徹底的に研究されているが、活動依存的な神経現象、すなわち学習、記憶、等におけるセマフォリンの役割は未だに不明である。

【0030】

グルタミン酸作動性シナプスは、活動依存的な神経機能（学習、記憶、等）において重要な役割を果たす。α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソキサゾールプロピオン酸（AMPA）型グルタミン酸受容体のシナプス移行は、様々な形の学習および記憶の土台を成す、ヘブ（Hebb）の可塑性のメカニズムである(Clem and Barth, 2006; Clem et al., 2008; Jitsuki et al., 2016; Jitsuki et al., 2011; Kessels and Malinow, 2009; Lee et al., 2003; Mitsushima et al., 2011; Mitsushima et al., 2013; Rumpel et al., 2005; Takahashi et al., 2003; Takemoto et al., 2017)。AMPA受容体は、GluA1-A4からなるヘテロマーの四量体を形成する(Bredt and Nicoll, 2003; Malinow and Malenka, 2002)。我々は以前に、Sema3Aが樹状突起スパインの成熟およびAMPA受容体の樹状突起への輸送を制御することを示した(Morita et al., 2006; Yamashita et al., 2014)。PlexA4は、軸索成長円錐からの逆行性Sema3Aシグナル伝達を媒介し、細胞体樹状突起領域においてGluA2と共にcisに相互作用する受容体として働き、そしてGluA2を遠位樹状突起へとエスコートする(Yamashita et al., 2014)。さらに、我々は、CRMP2はAMPA受容体のシナプス移行を容易にし、そして脳損傷後のリハビリ効果を加速するエドネルピクマレアート（edonerpic maleate）の標的分子であると報告した（Abe et al., 2018）。最近の研究は、Sema3F/NRP2/PlexinA3がAMPA受容体に媒介されるシナプス電流のダウンスケーリングを媒介し、in vitroにおける神経活動の全体的増加をもたらすことを示した（Wang et al., 2017）。神経可塑性の制御因子としてのセマフォリンへの関心が高まっているにもかかわらず、ヘブ（Hebb）の可塑性および、最も重要なことに、学習・記憶におけるセマフォリンの役割は未だに解明されていない。

【0031】

本研究において、我々は、海馬に依存する学習は、海馬においてSema3Aの分泌を誘導したことを報告する。さらに、学習依存的なSema3Aの分泌は、(i) AMPA受容体のCA3-CA1海馬シナプスへの移行、および (ii) NRP1/PlexinA4複合体を介した文脈的恐怖学習の形成を媒介し、CRMP2のリン酸化の低下をもたらした。Sema3F/NRP2/PlexinA3はシナプスのスケーリング（scaling）を媒介するが(Wang et al., 2017)、Sema3F/NRP1/PlexinA4はヘブの可塑性に関与し、そして学習および記憶を媒介する。このようにSema3F/NRP/Plexin複合体のそれぞれは、神経可塑性において異なる役割を持つ。

【0032】

結果
Sema3Aは、海馬初代培養物のニューロン表面へのAMPA受容体の輸送を制御する。

【0033】

我々は、以前に、Sema3AはGluA2/GluA3ヘテロマーの樹状突起局在を制御することを示した(Yamashita et al., 2014)。そこで我々は、Sema3Aはシナプス機能を制御するのかどうかを考えた。Sma3Aがシナプス可塑性を改変するかどうかを調べるため、我々はまず海馬ニューロンの初代培養物(DIV 21-27)を免疫細胞化学的方法によって分析した。可塑性を誘導する刺激（in vitroおよび in vivoの両方とも）は主としてGluA1をシナプスに移行させるので、我々はGluA1サブユニットに焦点をあてた（Hayashi et al., 2000; Shi et al., 2001; Takahashi et al., 2003)。透過処理していない条件下で抗GluA1抗体を用いた免疫染色は、精製Sema3A（Sema3A精製の詳細な方法を参照）の添加が、海馬初代培養ニューロンにおいて樹状突起表面のGluA1の斑点(puncta)の数を増大させることを明らかにした（図1A）。興味深いことに、GluA1 およびPlexinA4の合計タンパク質量はSema3Aの添加によって変わらなかったが、Sema3A刺激は表面PlexinA4を増大させた (図1B、C)。Sema3Aシグナル伝達とGluA1の細胞表面への輸送の関係をさらに調べるため、我々は生後(P)５、10および15日齢の海馬脳ライセートを用いて免疫沈降を実施した。我々は、GluA2について以前に報告されたのと同様に（Yamashita et al., 2014）、GluA1が試験したどの日齢においてもPlexinA4と共免疫沈降することを見出した（図1D）。これは、GluA1 がPlexinA4と複合体を形成することを示している。我々は以前に、GluA2とPlexinA4が、PlexinA4のIPT（免疫グロブリン様プレキシン転写因子）ドメインを介して結合することを報告した（Yamashita et al., 2014）。我々は、GluA1 とPlexinA4もまたPlexinA4のIPTドメインを介して複合体を形成するかどうかを試験した。緑色蛍光タンパク質（GFP）でタグ付けしたGluA1を、mycでタグ付けした全長PlexinA4またはmycでタグ付けしたPlexinA4のIPTドメインと共に、リポフェクションによってHEK293細胞中で過剰発現させた（図1E）。これらの細胞からライセートを調製し、抗myc抗体を用いて免疫沈降を実施し、抗GFP抗体を用いてイムノブロッティングを行った。我々は、PlexinA4のIPTドメインがGluA1に結合することを見出した(図1E)。次に、我々は、IPTドメインを介したGluA1 とPlexinA4の相互作用が、Sema3Aによって誘導されるGluA1のニューロン表面への輸送増加の原因であるかどうかを検討した。我々は、エレクトロポレーションによってPlexinA4のIPTドメインを過剰発現させ、そしてGluA1のニューロン表面への輸送に対するSema3Aの影響を調べた。透過処理していない条件下で抗GluA1抗体を用いた免疫染色は、Sema3AがPlexinA4のIPTドメインの存在下でGluA1のニューロン表面への輸送を増加させないことを明らかにした(図1F)。このことと一致して、海馬初代培養物におけるSema3Aに誘導されるGluA1のニューロン表面への輸送は、スクランブル構築物の導入と比較して、Plexin4Aを標的とするRNA干渉(RNAi)をレンチウイルス媒介により導入してPlexinA4発現をノックダウンした場合に減弱された(図1G)。これらの結果は、Sema3AはIPTドメインによって媒介されるPlexinA4との相互作用を介して、GluA1のニューロン表面への輸送を推進することを示している。

【0034】

PlexinA4発現のノックダウンは、海馬スライス中でLTPを減弱させる。

【0035】

Sema3A-PlexinA4シグナル伝達はGluA1のニューロン表面への輸送を制御するので、我々は、Sema3A-PlexinA4シグナル伝達はヘブのシナプス可塑性にも関与しているという仮説を立てた。我々は、PlexinA4の発現をノックダウンするためのRNAi構築物、またはスクランブル構築物を、レンチウイルス媒介in vivo遺伝子導入によって4週齢ラットの背側海馬のCA1領域内にin vivoで発現させた。注入の1週間後に、我々は急性海馬スライスを調製し、対をなすプロトコール（0 mV, 5 Hz, 90秒）を用いてCA3-CA1錐体シナプスに長期増強（LTP）を誘導した。スクランブルを発現する海馬スライスには正常なLTPが観察されたが、PlexinA4の発現をノックダウンするためのRNAi構築物を発現する海馬スライスにおいて、我々はLTPの重大な減弱を検出した(図２)。このことは、LTP誘導にはSema3A-PlexinA4シグナル伝達が必要であることを示している。したがって、Sema3A-PlexinA4シグナル伝達はヘブのシナプス可塑性を制御することが可能である。

【0036】

恐怖学習は、記憶形成を媒介するSema3Aを分泌する。

【0037】

次に、我々はSema3Aが学習を媒介するかどうかを調べた。これを試験するため、我々は恐怖学習（IA task）、すなわち、海馬依存的な文脈的恐怖条件付けを用いた（Mitsushima et al., 2011; Mitsushima et al., 2013）。この学習では、明るいボックスを暗いボックスの隣に置き、そしてラットがボックスの間の開いたドアから両方のボックスに自由に出入りできるようにする。ラットが暗いボックスに入るとすみやかに足に電気ショックを与える。通常、ラットは暗いボックスに入ることを選ぶが、暗いボックスの中で足の電気ショックにより条件づけられたラットは、暗いボックスに再度入ることを避ける傾向を示す（図3A）。我々は、暗いボックスに再度入るまでの反応時間(latency)を測定した。さらに、我々はFlag-SEP（super ecliptic pHluorin：緑色蛍光タンパク質のpH感受性誘導体）-Sema3Aノックインマウスを作製した(図3B)。SEPはpH感受性であり、低いpHよりも中性pHでより高い蛍光強度を示すので、SEP-Sema3Aは分泌されるとより明るい蛍光を示す。IA条件付けの10分後に動物を固定し、海馬スライスを調製した(図3C)。我々は、Glu1Aおよびシナプシン１と共に共局在化するSEP-Sema3Aの斑点の増加を検出した(図3D)。このように、IA学習は、シナプスでGluA1と複合体を形成するSema3Aの分泌を誘導する。

【0038】

次に、我々は、分泌されたSma3AがIA学習形成を媒介するかどうかを調べた。我々は、Sema3A機能を中和するSema3A抗体（Yamashita et al., 2015）を背側海馬のCA1領域内にin vivoで注入した。次に、IA学習で動物を条件づけた。我々は、コントロール抗体を注入したラットと比較して、Sema3A中和抗体を注入したラットでは、暗いボックスに再度入るまで反応時間が減少したことを見出した(図3E)。これは、Sema3A中和抗体がIA学習形成を妨げることを示している。したがって、IA学習によって誘導されるSema3A分泌は、恐怖学習形成を媒介する。

【0039】

Sema3A-NRP1-PlexinA4シグナル伝達は、恐怖学習を媒介する。

【0040】

次に、我々は、Sema3A-NRP1-PlexinA4シグナル伝達が学習を媒介するかどうかを調べた。これを試験するため、PlexinA4の発現をノックダウンするためのRNAi構築物、またはスクランブル構築物をレンチウイルス媒介in vivo遺伝子導入によって背側海馬のCA1領域内に注入した。次に、注入を受けた動物をIA恐怖学習で条件づけた(図4A)。我々は、海馬においてPlexinA4が低下した動物では、スクランブルを注入された動物と比較して、暗いボックスに再度入る反応時間が有意に短いことを見出した(図4B)。これは、PlexinA4の発現ノックダウンがIA学習を減弱させたことを示している。

【0041】

我々は以前に、IA学習はGluA1を海馬のCA3-CA1錐体シナプスに移行させることを報告した(Mitsushima et al., 2011; Mitsushima et al., 2013; Takemoto et al., 2017)。我々は、PlexinA4の発現をノックダウンするためのRNAi構築物またはスクランブル構築物を海馬のCA1領域に有する、IA訓練された動物またはウォークスルー(walk through)動物（足に電気ショックを受けることなく、ただ単にIA条件付けの実験装置に入ってきた動物）から得た急性海馬スライスのホールセル記録を実施した。ウォークスルー動物においては、未感染ニューロンとPlexinA4 RNAi構築物を発現するニューロンとの間でNMDA受容体媒介電流に対するAMPA受容体媒介電流の比（AMPA/NMDA比；シナプスのAMPA受容体含有量の指標）に差は検出されなかったが、IAで訓練された動物においては、PlexinA4 RNAi構築物を発現するニューロンのAMPA/NMDA比は、未感染ニューロンと比較して有意な低下を示した(図4C)。我々は、海馬のCA3-CA1錐体シナプスにおけるNMDA受容体媒介電流の動態(kinetics)について、条件づけられた動物およびウォークスルー動物におけるPlexinA4 RNAi構築物発現ニューロンとスクランブル発現ニューロンの間で何ら差異を見出さなかった(図4D)。これらの結果は、IAによって引き出されるAMPA受容体の海馬CA3-CA1錐体シナプスへの移行は、PlexinA4シグナル伝達によって媒介されることを示している。

【0042】

NRP2ではなくNRP1が、IA学習によって誘導されるAMPA受容体のシナプス移行を媒介する。

【0043】

NRP2ではなくNRP1は、Sema3Aの結合部位である（Chen et al., 1997; Takahashi et al., 1998）。そこで、我々は、IA学習によって誘導されるAMPA受容体のシナプス移行はNRP1を必要とするかどうかを試験した。我々は、NRP1-RNAi（NRP1発現をノックダウンするため）、NRP2-RNAi（NRP2発現をノックダウンするため）またはスクランブル構築物を発現するレンチウイルスを海馬のCA1領域に4週齢でin vivo注入したラットを作製した。1週間後、ラットにIA条件付けの処置を施し、30分後に急性海馬スライスを調製した。我々は、背側海馬のCA3-CA1シナプスのAMPA/NMDA比を分析した。ウォークスルー動物においては、RNAi構築物およびスクランブル構築物の発現はAMPA/NMDA比に全く影響を及ぼさなかったが、IAで訓練された動物においては、NRP2-RNAiではなくNRP1-RNAi発現ニューロンにスクランブル発現ニューロンおよび未感染ニューロンと比較してAMPA/NMDA比の低下が観察された(図4E)。これらの実験グループの検査したニューロン（ウォークスルー動物およびIAで訓練された動物のNRP1-RNAi発現ニューロン、NRP2-RNAi発現ニューロン、スクランブル構築物発現ニューロン、および未感染ニューロン）の間では、NMDA受容体媒介電流の動態になんら差異は見出されなかった（図4F）。これらの結果は、Sma3A-NRP1-PlexinA4シグナル伝達が、IA学習によって誘導されるAMPA受容体のシナプスへの輸送を媒介することを示している。

【0044】

IA学習は海馬におけるCRMP2のリン酸化を低下させた。

【0045】

CRMP2は、Sma3A-NRP1-Plexin複合体の下流シグナル伝達分子である（Schmidt and Strittmatter, 2007）。CRMP2は、シナプス機能を制御すると報告されている(Jin et al., 2016)。さらに我々は最近、CRMP2は、経験依存的なAMPA受容体のシナプス移行を促進することによってリハビリ効果を加速する小さい化合物であるエドネルピクマレアート（edonerpic maleate）の主要な結合部位であり、機能上の標的であると報告した（Abe et al., 2018）。そこで、我々は、IA学習がCRMP2のリン酸化状態に影響を及ぼすかどうかを調べた。我々は、IA訓練された、またはウォークスルー動物の背側海馬のシナプス後膜肥厚(PSD)画分を調製した。我々は、IA訓練された動物では、ウォークスルー動物と比較して、CRMP2の522番目のセリンのリン酸化が低下していることを見出した(図4G)。

【0046】

考察
セマフォリンファミリーは、神経科学、免疫システムから腫瘍学に至るまで種々の生物学的分野において大いに注目されてきた(Gurrapu et al., 2018; Kolodkin and
Tessier-Lavigne, 2011; Vadasz and Toubi, 2018)。神経科学の分野では、セマフォリンは軸索ガイダンスおよび細胞遊走に関して徹底的に研究されてきた。本研究において我々は、Sema3Aはセマフォリンファミリーの神経系における新規な役割を意味する、学習の決定的なメディエーターであることを報告した。文脈的恐怖条件付けの一形態であるIA学習は、Sema3Aの分泌を誘導した。そして、Sema3A機能の中和抗体の海馬への注入は、IA記憶形成を妨げた。さらに、Sema3A受容体複合体の各コンポーネント（NRP1および PlexinA4）のノックダウンは、背側海馬におけるIA学習およびIA学習依存的なGluA1のCA3-CA1錐体シナプスへの移行を遮断した。我々の所見は、軸索ガイダンスおよびシナプス形成の両者を制御する分子および細胞メカニズムの間の関係を明らかにし、それによって軸索ガイダンス分子を神経可塑性と結び付ける証拠を提供する。

【0047】

最近、我々はCRMP2に結合する小さい新規化合物であるエドネルピクマレアートを同定した；この化合物は、経験依存的なAMPA受容体のシナプス移行を促進し、脳損傷からの運動機能回復の加速化をもたらす（Abe el al., 2018）。この結果は、CRMP2は経験依存的シナプス可塑性の制御因子となりうることを示した。Sema3Aシグナルは、軸索のCRMP2（セリン522）のリン酸化を増大させるが、我々はIAで条件づけられた動物ではCRMP2のこの残基のリン酸化が低下していることを検出した。さらに、我々は、皮質損傷後にエドネルピクマレアート（経験依存的AMPA受容体のシナプス移行を促進する、CRMP2結合性化合物）の投与によって機能回復を示した動物の機能代償性皮質領においても、CRMP2（おそらく522番目のセリン）のリン酸化は低下したことを報告した（Abe et al., 2018）。このように、Sma3A-NRP1-PlexinA4複合体は軸索と樹状突起スパインの間で差別的にCRMP2を制御し、そして神経系において様々な機能を発揮することが可能であった。

【0048】

我々は、Sema3Aによって誘導されるシナプス可塑性は、NRP2ではなく、NRP1によって媒介されることを見出し、セマフォリンシグナル伝達の特異性を実証した。Kolodkinグループによる最近のエレガントな研究は、Sema3F/NRP2/PlexinA3はビククリンによる全体的なニューロン活性化によってAMPA受容体媒介シナプス電流のダウンスケーリングを媒介することを示した（Wang et al., 2017）。興味深いことに、Sema3Aはこの恒常的シナプススケーリングを媒介しない。我々の本研究における所見とあいまって、この結果は、Sema3F/NRP2/PlexinA3がシナプスのスケーリング（ヘブのシナプス可塑性の別の形）を媒介するのに対し、Sma3A-NRP1-PlexinA4はヘブのシナプス可塑性および学習・記憶を媒介することを示唆する。したがって、クラス３セマフォリン分子のそれぞれは、各分子の特異的な受容体複合体を介して、差別的かつ正確に、別個の神経可塑性現象を制御する。多様なセマフォリン機能の基礎となっているシグナル伝達メカニズムを解明することが重要であろう。

【0049】

活動によって誘導される、シナプス機能を改変しうるタンパク質の分泌は興味深い。以前の研究は、脳由来神経栄養因子（BDNF）が活動によってニューロンから分泌されること、そしてこれはシナプトタグミン6およびコンプレキシン1/2によって媒介されることを示した(Wong et al., 2015)。さらに、全体的なニューロン活性化はSema3Fの分泌を促進し、これはシナプスのダウンスケーリングを制御する（Wang et al., 2017）。本研究において、我々は、学習がSema3Aの分泌を誘導し、そして学習を媒介することを示した。いかにして個別のシナプスインプットが異なる分子の分泌を誘導して神経機能を調節するのかを研究することは興味深いであろう。

【0050】

我々は最近、神経突起伸展に対する別の抑制分子であるNogoが、経験依存的なAMPA受容体のシナプス移行を制限することを報告した（Jitsuki et al., 2016）。これは、AMPA受容体のシナプス移行におけるSema3Aの機能とは逆である。NogoとSema3Aは幾つかのシグナル伝達分子（例えばRhoなど）を共有するので(Liu and Strittmatter, 2001)、これら2つの軸索伸展抑制分子がどのようにシグナル伝達分子を用いてAMPA受容体のシナプス移行を制御するのかは極めて重大な問題である。

【0051】

CRMP2はAMPA受容体のシナプス移行を媒介し、そして脳損傷後のリハビリ効果を加速させるので（Abe et al., 2018）、我々の所見は、Sema3A-CRMPシグナル伝達カスケードに対する薬理学的介入の可能性にさらに光をあてるものである。

【0052】

参照文献
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【0053】

材料および方法
倫理的声明
全ての実験は、「実験動物の管理と使用に関する指針」（日本神経科学学会）および横浜市立大学の指針に従って実施された。全ての動物実験は、横浜市立大学の「動物の管理および使用委員会」によって承認された（承認番号：F-A-14-026）。全ての外科的処置は麻酔下で実施され、そして苦痛を最小限にするためのあらゆる努力がなされた。

【0054】

細胞培養および組換えタンパク質
雄および雌ICR E16（チャールス・リバー・ラボラトリーズ）または雄および雌ウィスターラットE17-18（チャールス・リバー・ラボラトリーズ）由来の海馬ニューロンを、0.01%ポリ-L-リシン（和光純薬）でコーティングした培養皿で、2% B27サプリメント(Gibco)および0.5 mM L-グルタミン（Nacalai）を添加したneurobasal medium (Gibco)中で培養した。ニューロンは、プラスチック製カバーグラスの上で、21～28日間 in vitro（DIV）で培養した。

【0055】

組換えSema3Aは、TALON Metal Affinity Resin (タカラバイオ）を用いて、ヒスチジンタグを利用して調製した。Sema3Aの活性を推定するため、胚発生7日目のニワトリ胚の後根神経節（DRG）を、0.01%ポリ-L-リシンおよび8 mg/ml ラミニンをコーティングした培養皿で、10% FBSおよび 10 ng/ml NGF (和光純薬)を添加したHam’s F-12培地中に外植した。1日後、外植片をSema3Aと共に37℃で30分間インキュベートし、次に固定してAlexa488-ファロイジン (Invitrogen)で染色した。崩壊した成長円錐の百分率を数えた。成長円錐の崩壊50％をもたらす濃度を0.1 nMとした。APでタグ付けしたタンパク質の濃度を、そのAP活性に基づいて決定した。

【0056】

構築物
PlexA4 IPTは、以前に記述されているように（Yamashita et al., 2014）作製した。

【0057】

PlexA4、NRP1 およびNRP2をノックダウンするため、我々はFUGW上でショートヘアピン(Sh) RNAを用いた。標的配列は以下の通りであった。
PlexA4 (ref): 5’-GAGCAAGCTAGAGTATGCCACTGAT-3’（配列番号２）
NRP1: 5’-TATAGTTCTGAGAACATTCGG-3’（配列番号３）
NRP2 (ref): 5’-GCTATGACATGGAGTATCA-3’（配列番号４）

【0058】

免疫細胞化学
免疫細胞化学は、0.1% Triton X-100 (ref)を用いた透過処理のもとで、標準プロトコールにより実施した。培養ニューロンの染色に用いた抗体は以下の通りであった：抗N末端GluA1マウスモノクローナル抗体（1:500希釈）、抗MAP2ウサギポリクローナル抗体（PRB-547C、1:1000希釈、Covance)、抗MAP2マウスモノクローナル抗体(M1406、1:1000希釈、Sigma)、抗GFPニワトリ抗体（1:1000希釈、Aves）、抗PlexA4ハムスターモノクローナル抗体（1:500希釈、Sutoにより提供される）、および抗NRP1ウサギポリクローナル抗体（1:1000希釈、T. Kawasakiにより提供される）。ニューロンは、抗MAP2ウサギポリクローナル抗体を用いて対比染色した。免疫染色したニューロンを、40倍水浸対物レンズ （C-Apochromat/1.2W corr）を有し、Axioplan 2イメージング顕微鏡（Carl Zeiss）を備えたレーザー走査顕微鏡（LSM510）を用いて分析した。GluA1の表面発現レベルを可視化するため、我々は、非透過処理条件下で抗GluA1マウスモノクローナル抗体（1:500希釈）を用いて免疫細胞化学を実施した。次に、0.1% TritonX-100を用いて培養ニューロンを透過処理し、抗MAP2ウサギポリクローナル抗体を用いて対比染色した。免疫染色したニューロンを、40倍水浸対物レンズ （C-Apochromat/1.2W Korr M27）を有し、AxioImager Z1イメージング顕微鏡（Carl Zeiss）を備えたレーザー走査顕微鏡（LSM700）を用いて分析した。

【0059】

免疫沈降
HEK293T細胞を6 cmの培養皿に4.0 x 10⁵細胞／皿の密度で播種した。1日後、FuGENE6トランスフェクション試薬（Promega）を用いて、EGFP-GluA1、全長PlexA4、 Δect、IPTドメイン（Yamashita et al., 2014）およびPlexA4-Myc発現ベクターにより細胞をトランスフェクションした。48時間後、免疫沈降緩衝液（20mM Tris-HCl (pH 8.0), 100mM NaCl, 10mM NaF, 1mM Na3VO4, 1mM EDTA, 1% Nonidet P-40, cOmplete Mini プロテアーゼ・インヒビター・カクテル (Roche)）を用いて細胞を溶解し、次に2 mgの抗Mycマウスモノクローナル抗体（M5546, Sigma）を用いて免疫沈降させた。得られたサンプルは、抗Mycマウスモノクローナル抗体（1:5000希釈）および抗GFPマウスモノクローナル抗体を用いたイムノブロット分析に付した。

【0060】

P5、P10および P15ラット海馬サンプルは、免疫沈降緩衝液中でホモジナイズした。各ライセートを15,000 rpmで20分間4℃で遠心した。次に、上清を1 mgの抗PlexA4マウスモノクローナル抗体と共に、免疫原の存在下または不在下で、4℃で一晩インキュベートし、その後、プロテインＧ磁性ビーズ(GE Healthcare)と共に4℃で1時間さらにインキュベートした。免疫沈降緩衝液で3回洗浄した後、サンプルを抗GluA1マウスモノクローナル抗体および抗PlexA4ウサギポリクローナル抗体を用いたイムノブロット分析に付した。

【0061】

免疫組織化学
IA条件付けの10分後に、マウスに深い麻酔をかけ、経心的にPBSを灌流し、次に4%パラホルムアルデヒド（PFA）を灌流した。脳を摘出し、4% PFA中で室温で2時間インキュベートした。脳をPBS中に移し、ビブラトームを用いて50 μmの冠状スライスを調製した。免疫染色のために、各スライスを3%正常ヤギ血清を含むPBS＋0.2% TritonX-100 (PBS-T)中に2時間置き、次に一次抗体と共に4℃で24時間インキュベートした。PBS-Tを用いて各スライスを1回につき10分かけて3回洗浄し、二次抗体と共に1時間インキュベートした。PBS-Tを用いて1回につき10分かけてさらに3回洗浄した後、各スライスを顕微鏡スライド上にマウントした。染色に用いた抗体は以下の通りであった：抗N末端GluA1マウスモノクローナル抗体（1:500希釈、EMD Millipore）、抗MAP2ウサギポリクローナル抗体（1:1000希釈、Covance）、抗MAP2マウスモノクローナル抗体（1:1000希釈、Sigma）、抗PSD 95（1:500希釈、Alomone labs）、抗Synapsin1（1:1000希釈、Millipore）、および抗GFPニワトリ抗体（1:1000希釈、Aves）。

【0062】

免疫染色強度の測定
培養ニューロンをSema3Aで30分処理した後、染色のため固定した。抗GluA1抗体および抗PlexA4抗体によって染色された平均免疫染色強度をImageJソフトウエアを用いて測定した。ニューロンあたりの樹状突起の平均強度を求めるため、
各MAP2またはEGFP陽性樹状突起の免疫染色強度を、樹状突起の容積によって正規化した。これら3つの領域の各領域の相対免疫染色強度を計算した。

【0063】

動物（詳細は製造例１を参照）
flag-SEPノックインマウスを作製するため、我々は、flagでタグ付けしたsuper ecliptic pHluorin cDNA（flag-SEP）をSema3Aの分泌シグナルコード配列（25 aa）のすぐ後ろに配置したターゲティング構築物を設計した（図3B、中及び図5-1、5-2）。ターゲティングベクターの構築には、Quick and Easy BAC modification Kit (Gene Bridges, Dresden, Germany)を用いた。すなわち、我々は、C57/BL6 BACライブラリー (Advance GenoTechs、つくば、日本)のゲノムクローン(RP23-181I7)から 11.92 kb のホモロジーアームを回収し、これをCAGプロモーターによって駆動されるジフテリア毒素遺伝子を含有するpDT-MC#3中にサブクローン化した。次に、我々は、ノックイン断片〔flag-SEP、エクソン2の12個のアミノ酸をコードする配列およびそれに続くイントロン2-3の608bp、およびFRT配列によって挟まれたネオマイシン耐性カセット(Neo)〕をpDT-MC#3のホモロジーアームの正確な位置に挿入した。ES細胞の培養、組換えES細胞の同定、およびキメラマウスの作製は、以前に記述されているように（Nishina & Sakimura, 2007）実施した。FLP発現マウスと交配してSema3A遺伝子座からNeoカセットを除去した後、我々はSema3A^flag-SEPマウスを確立した。マウス尾DNAのPCR遺伝子型判定は、以下のプライマーを用いて実施した。
Sema3AF： 5’-AAGTTTCTGTGATTCCGTGACTGT-3’（配列番号５）
Sema3AR： 5’- AGCAAGCACACAGCTAGCTCACTG-3’（配列番号６）
SEP R： 5’- CTTGAATTCTTTGTATAGTTCATC-3’（配列番号７）
動物は、一定の14時間／10時間の明暗サイクルの元で、水および餌を自由に摂取できる状態で管理した。全ての動物管理および外科的処置は、横浜市立大学医学部大学院、動物実験センター、動物の管理および使用委員会のガイドラインに従って実施した。

【0064】

海馬CA1領域のin vivoインフェクション
イソフルラン-酸素混合物を用いてラットに深い麻酔をかけた。頭蓋を覆う皮膚を切り、そっと両側に広げた。座標は、ブレグマから3 mm前側、正中線の外側2 mm、および脳表面から2.5 mm下であった。組換えレンチウイルスを、ガラス製マイクロキャピラリー（ナリシゲ）から海馬CA1領域へ圧力注入した。ホールセル記録のためには、海馬右側への1回の片側注入を実施した。行動分析のためには、ウイルス溶液を両側に注入した（片側につき1回から約2回注入）。

【0065】

手術および抗Sema3A抗体の注入による中和
イソフルラン-酸素混合物を用いてラットに深い麻酔をかけた。誘導用カニューレ（AG-4; EICOM、京都、日本）を海馬CA1領域内へ定位的に植え込んだ。座標は、ブレグマから3.5 mm前側、正中線の外側2.5 mm、および脳表面から2.15 mm下であった。手術の7日後、抗体溶液4-2 CMchおよび対照IgG（Yamashita et al., 2015）を、テフロンチューブを用いて頭蓋ウインドウより圧力注入した。

【0066】

恐怖条件付け訓練（Inhibitory Avoidance Training）
訓練の日、IA訓練装置（長さ：25 cm、幅：62 cm、高さ：45 cm）を備えた、電磁気および音を遮断した部屋（長さ：1.2 m、幅：2.2 m、高さ：2.3 m）にラットを移した。上記装置は、トラップドアによって分けられた明るい安全な側と暗いショック側から成る、2チェンバーのPerspexボックスである。訓練中、ラットはドアと反対側のコーナーを向いて、ボックスの安全な側に置かれた。トラップドアを開けた後、ラットは随意に暗いボックスに入った。新規な暗いボックスへ入るまでの反応時間を行動パラメーターとして測定した（すなわち、IA訓練前の反応時間）。動物が暗いボックスに入って4秒後に、我々はドアを閉じて、ボックスの床に配置した帯電されたスチールロッドを介して足にスクランブル電気ショック（2秒、1.6 mA）をかけた。ホームケージに戻される前に、ラットは暗いコンパートメントに10秒間置かれた。学習の30分後に、ラットを再びボックスの明るい側に置いた。体験した暗い側に入るまでの反応時間を、学習成績として測定した（すなわち、IA学習後の反応時間）。次に、ペントバルビタールの過剰投与によってラットを屠殺した。未訓練対照（non-IA）については、IA訓練をせずにホームケージでラットに同用量のペントバルビタールを注射した。ウォークスルー対照(walk-through)については、ラットをIA訓練装置に入れ、1分間探検することを許した。

【0067】

電気生理学
レンチウイルス注入の5から7日後に、ラットをイソフルレンガスで麻酔し、脳を摘出した。脳は、5% CO₂/95% O₂でガス処理した氷冷解剖緩衝液（25.0 mM NaHCO₃, 1.25mM NaH₂PO₄, 2.5mM KCl, 0.5mM CaCl₂, 7.0 mM MgCl₂, 25.0 mM グルコース, 110.0 mM 塩化コリン, 11.6 mM アスコルビン酸, 3.1 mM ピルビン酸）中に速やかに移した。冠状脳スライスは解剖緩衝液中で切断し(350 μm、Leicaビブラトーム)、生理学的溶液（5% CO₂/95% O₂でガス処理した、22℃-25℃, 118 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 1 mM NaH₂PO₄, 10 mM グルコース, 4 mM MgCl₂, 4 mM CaCl₂ [pH 7.4]）中に移した。記録チェンバーを、0.1 mMピクロトキシンおよび4 mM 2-クロロアデノシンを含む生理学的溶液22℃-25℃で灌流した。パッチ記録ピペット(3-7 MΩ)を細胞内溶液（115 mM メタンスルホン酸セシウム, 20 mM CsCl, 10 mM HEPES, 2.5 mM MgCl₂, 4 mM Na₂ATP, 0.4 mM Na₃GTP, 10 mMクレアチニンリン酸 二ナトリウム, 0.6 mM EGTA [pH 7.25]）で満たした。ホールセル記録は、Multiclamp 700B（Axon Instruments）を用いて、ラット海馬の感染した、または未感染のCA1錐体ニューロンから得た。二極タングステン刺激電極をCA1領域に、記録した細胞から約200から300 μm外側に設置した。シナプス応答の振幅が＞約10 pAを記録するまで刺激強度を増大させた。AMPA/NMDA 比を、- 60 mVにおけるピーク電流の、刺激開始50ミリセカンド後の+40 mV におけるピーク電流に対する比として計算した（各保持電位について30-50トレースを平均した）。

【0068】

統計およびグラフ
細胞の生物学的実験については、我々は1匹の動物の実験に由来する観察を平均化した（培養物を用いた場合を除く）。したがって、我々は1匹の動物に由来する観察の平均をn=1として用いた。適切な統計試験を選択するため、サンプル分布の歪度および尖度を計算した。歪度が2未満で、かつ尖度が7未満の場合、我々はパラメトリック検定を用いてデータを分析した。歪度が2より大きい、または尖度が7より大きいとデータが示す場合、我々はノンパラメトリック検定を用いた。パラメトリック検定としては、対応のない両側t検定を用いて、2つの独立した群を比較した。また、一元配置分散分析を事後ダネット検定とともに用いて、3つ以上の群を比較した。ノンパラメトリック検定としては、マン・ホイットニーのU検定を用いて、2つの独立した群を比較した。p <0.05は、統計的に有意と考えられた。統計分析は、GraphPad Prism 7 (Graph Pad Software) または SPSS software (SPSS 22.0; IBM)を用いて実施した。箱ひげ図においては、ひげの末端は最大値および最小値によって規定された。中央の四角形は、第1四分位から第3四分位に広がっていた。四角形内のセグメントは、中央値を示した。箱ひげ図以外のグラフにおいては、エラーバーは平均値の標準誤差を示した。

【0069】

〔製造例１〕flag-SEPノックインマウスの作製
ノックインベクター構築（図5-1, 5-2）
Red/ETリコンビネーションシステムを用い、マウスSema3a遺伝子のエクソン１及びエクソン２を含む11.9 kbのゲノム配列をBACクローンよりpDT-MC#3へサブクローニングした。一方、FRT配列に挟まれたNeo耐性遺伝子含むベクターに、flag-SEP, Sema3Aのエクソン２の12個のアミノ酸をコードする配列及びそれに続くイントロン2-3の608 bpを連結したベクターを作製し、それを鋳型としてPCRにより両端に5’ホモロジーアーム及び3’ホモロジーアームの50 bpを連結したノックインDNA断片を作製した。再度Red/ETリコンビネーションシステムを用い、サブクローニングしたゲノム配列へノックインDNA断片を挿入し、それを制限酵素SalIにより線状化してノックインベクターとして用いた。

【0070】

Sema3A ノックインターゲティングベクターの配列を配列番号１に示す。配列番号１のヌクレオチド配列は以下の配列から構成されている。
ヌクレオチド番号1～2316：pDT-MC#3の配列。
ヌクレオチド番号2317～8162：5’ホモロジーアームの配列。（うち、ヌクレオチド番号8088～8162：シグナルペプチドをコードする配列）
ヌクレオチド番号8163～8906：flag-SEPの配列。（うち、ヌクレオチド番号8163～8186：flag-tagをコードする配列、ヌクレオチド番号8193～8906：SEPの配列）
ヌクレオチド番号8907～8912：前後をつなぐために挿入した配列。これにより2個のアミノ酸（EF）が付加する。
ヌクレオチド番号8913～8949：Sema3Aのエクソン２の12個のアミノ酸（KNNVPRLKLSYK）をコードする配列にGが挿入された配列。最後のGはexon3にまたがるアミノ酸をコードする。
ヌクレオチド番号8950～9557：イントロン2-3の608 bpの配列。
ヌクレオチド番号9558～9561：前後をつなぐために挿入した配列。
ヌクレオチド番号9562～11145：Neo[frt-Pgk promoter/gb2Neo-frt](1.6K)の配列。（うち、ヌクレオチド番号9562～9595及びヌクレオチド番号11112～11145：frt配列、ヌクレオチド番号11110~9596はPgk promoter/gb2Neo pA配列が逆向きに挿入。）
ヌクレオチド番号11146～11158：前後をつなぐために挿入した配列。
ヌクレオチド番号11159～16587：3’ホモロジーアームの配列。
ヌクレオチド番号16588～18685：pDT-MC#3の配列。

【0071】

ES細胞へのノックインベクター導入
エレクトロポーレーションと薬剤選別：ES細胞にはC57BL/6N系マウス由来RENKAを用いた。凍結保存されているES細胞を復元し、4日目に電気穿孔法（4mmキュベット、200 V、250 μF、R=∞）により1キュベットあたり2.5 pmolの線状化ベクターを2百万個のES細胞へ導入し、10 cmカルチャーディッシュ4枚に分割して培養した。導入2日後に175 μg/mL G418による薬剤選別を開始し、導入7日まで継続した。細胞培養のほぼ全ての過程で、ES細胞はフィーダー細胞として用いるマウス胎仔繊維芽細胞との共培養で維持された。

【0072】

薬剤耐性ESクローンの単離培養：ディッシュ中にコロニーを形成した薬剤耐性ESクローンを、ディッシュあたり48クローン、計192クローンを顕微鏡下でピックアップし、24穴プレートで単離培養した。ピックアップ後4日目に各クローンを凍結保存し、その際に一部を24穴プレートに継続して培養し、スクリーニングに用いた。

【0073】

相同組換えESクローンの同定と復元培養：24穴プレート中で充分量増殖したスクリーニング用ES細胞を細胞溶解液にて溶解し、自動DNA抽出機PI-80X（東洋紡）によってゲノムDNAを抽出した。100 μLのTEに溶解したゲノムDNAのうち10 μLを適当な制限酵素で消化してサザンブロット解析によるスクリーニングに用いた。得られた結果より相同組換えクローンの候補となったゲノムDNAを、さらにサザンブロットやPCRによって解析し、真の相同組換えESクローンであることを確定させた。確定したクローンを復元、約一週間拡大培養して最終的に5本程度のチューブに分割してキメラ作製に使用できるよう凍結保存した。

【0074】

ノックインマウスの作出と樹立
受精卵の準備：1回のインジェクションにつき採卵用のメスICRマウス15頭に排卵誘起処理（PMSG、hCGの投与）を行い、オスと同居させ、翌日プラグにより交配を確認したメスの卵管を潅流して受精卵を採取し、インジェクションまで培養を行った。

【0075】

ES細胞の準備：ノックイン変異を導入したC57BL/6N系マウス由来RENKA ES細胞をインジェクションに用いた。各クローンは凍結チューブ1本あたり約60万個で-150度フリーザーにて凍結保存されている。インジェクション当日の早朝にチューブ1本を融解し、細胞凍結液を遠心処理により除いた後、新規調製したES細胞培地に細胞を再懸濁して氷上で低温に維持した。

【0076】

ES細胞インジェクション：事前に準備作製したインジェクション用ガラス針、ES細胞懸濁液、ホールディングピペットをマニュピレーターにセットし、培養した受精卵（主に8細胞期胚）にインジェクションした。1回約100個インジェクションを行った。

【0077】

胚移植と分娩：翌朝に観察を行い、得られた胚盤胞をすべて偽妊娠マウスの子宮内に移植した。前々日夕方から精管結紮オスと同居させ、前日朝にプラグがついたものを偽妊娠マウスとして使用した。同時に通常のオスと交配させた里親用メスマウスを準備し、移植日を0日目として、17日目に分娩または帝王切開で産仔（キメラマウス）を得た。

【0078】

遺伝子型確認：出生から4週後に離乳を行い、個体識別と組織採取を行った。採取した組織を用いてノックイン遺伝子が確認されたキメラマウスを得た。

【0079】

ノックインマウス樹立：上記キメラマウスを雌C57BL/6Nマウスと交配させて産仔（F1マウス）を得て、同様に遺伝子型確認を行いヘテロ変異マウスが得られたので、ノックインマウスが樹立できたと判断された。

【産業上の利用可能性】

【0080】

本発明は、喘息、アトピー性皮膚炎、アルツハイマー型認知症、変形性関節炎、循環器系疾患等の病態解明に利用することができる。また、これらの疾患を対象とする創薬にも利用できる。

【配列表フリーテキスト】

【0081】

＜配列番号１＞Sema3A ノックインターゲティングベクターの配列。最初の大文字はベクター配列、次の小文字はゲノム配列、その後、エクソン１、エクソン２、Flag-SEP、イントロン2-3、FRT配列、ネオマシン耐性遺伝子、FRT配列、など特徴的な配列を区別する為に大文字、小文字を切り替えて配列を分かり易くした。最後はベクター配列である。
1 GACGAAAGGG CCTCGTGATA CGCCTATTTT TATAGGTTAA TGTCATGATA ATAATGGTTT 61 CTTAGACGTC AGGTGGCACT TTTCGGGGAA ATGTGCGCGG AACCCCTATT TGTTTATTTT 121 TCTAAATACA TTCAAATATG TATCCGCTCA TGAGACAATA ACCCTGATAA ATGCTTCAAT 181 AATATTGAAA AAGGAAGAGT ATGAGTATTC AACATTTCCG TGTCGCCCTT ATTCCCTTTT 241 TTGCGGCATT TTGCCTTCCT GTTTTTGCTC ACCCAGAAAC GCTGGTGAAA GTAAAAGATG 301 CTGAAGATCA GTTGGGTGCA CGAGTGGGTT ACATCGAACT GGATCTCAAC AGCGGTAAGA 361 TCCTTGAGAG TTTTCGCCCC GAAGAACGTT TTCCAATGAT GAGCACTTTT AAAGTTCTGC 421 TATGTGGCGC GGTATTATCC CGTATTGACG CCGGGCAAGA GCAACTCGGT CGCCGCATAC 481 ACTATTCTCA GAATGACTTG GTTGAGTACT CACCAGTCAC AGAAAAGCAT CTTACGGATG 541 GCATGACAGT AAGAGAATTA TGCAGTGCTG CCATAACCAT GAGTGATAAC ACTGCGGCCA 601 ACTTACTTCT GACAACGATC GGAGGACCGA AGGAGCTAAC CGCTTTTTTG CACAACATGG 661 GGGATCATGT AACTCGCCTT GATCGTTGGG AACCGGAGCT GAATGAAGCC ATACCAAACG 721 ACGAGCGTGA CACCACGATG CCTGTAGCAA TGGCAACAAC GTTGCGCAAA CTATTAACTG 781 GCGAACTACT TACTCTAGCT TCCCGGCAAC AATTAATAGA CTGGATGGAG GCGGATAAAG 841 TTGCAGGACC ACTTCTGCGC TCGGCCCTTC CGGCTGGCTG GTTTATTGCT GATAAATCTG 901 GAGCCGGTGA GCGTGGGTCT CGCGGTATCA TTGCAGCACT GGGGCCAGAT GGTAAGCCCT 961 CCCGTATCGT AGTTATCTAC ACGACGGGGA GTCAGGCAAC TATGGATGAA CGAAATAGAC 1021 AGATCGCTGA GATAGGTGCC TCACTGATTA AGCATTGGTA ACTGTCAGAC CAAGTTTACT 1081 CATATATACT TTAGATTGAT TTAAAACTTC ATTTTTAATT TAAAAGGATC TAGGTGAAGA 1141 TCCTTTTTGA TAATCTCATG ACCAAAATCC CTTAACGTGA GTTTTCGTTC CACTGAGCGT 1201 CAGACCCCGT AGAAAAGATC AAAGGATCTT CTTGAGATCC TTTTTTTCTG CGCGTAATCT 1261 GCTGCTTGCA AACAAAAAAA CCACCGCTAC CAGCGGTGGT TTGTTTGCCG GATCAAGAGC 1321 TACCAACTCT TTTTCCGAAG GTAACTGGCT TCAGCAGAGC GCAGATACCA AATACTGTTC 1381 TTCTAGTGTA GCCGTAGTTA GGCCACCACT TCAAGAACTC TGTAGCACCG CCTACATACC 1441 TCGCTCTGCT AATCCTGTTA CCAGTGGCTG CTGCCAGTGG CGATAAGTCG TGTCTTACCG 1501 GGTTGGACTC AAGACGATAG TTACCGGATA AGGCGCAGCG GTCGGGCTGA ACGGGGGGTT 1561 CGTGCACACA GCCCAGCTTG GAGCGAACGA CCTACACCGA ACTGAGATAC CTACAGCGTG 1621 AGCATTGAGA AAGCGCCACG CTTCCCGAAG GGAGAAAGGC GGACAGGTAT CCGGTAAGCG 1681 GCAGGGTCGG AACAGGAGAG CGCACGAGGG AGCTTCCAGG GGGAAACGCC TGGTATCTTT 1741 ATAGTCCTGT CGGGTTTCGC CACCTCTGAC TTGAGCGTCG ATTTTTGTGA TGCTCGTCAG 1801 GGGGGCGGAG CCTATGGAAA AACGCCAGCA ACGCGGCCTT TTTACGGTTC CTGGCCTTTT 1861 GCTGGCCTTT TGCTCACATG TTCTTTCCTG CGTTATCCCC TGATTCTGTG GATAACCGTA 1921 TTACCGCCTT TGAGTGAGCT GATACCGCTC GCCGCAGCCG AACGACCGAG CGCAGCGAGT 1981 CAGTGAGCGA GGAAGCGGAA GAGCGCCCAA TACGCAAACC GCCTCTCCCC GCGCGTTGGC 2041 CGATTCATTA ATGCAGCTGG CACGACAGGT TTCCCGACTG GAAAGCGGGC AGTGAGCGCA 2101 ACGCAATTAA TGTGAGTTAG CTCACTCATT AGGCACCCCA GGCTTTACAC TTTATGCTTC 2161 CGGCTCGTAT GTTGTGTGGA ATTGTGAGCG GATAACAATT TCACACAGGA AACAGCTATG 2221 ACCATGATTA CGCCAAGCTC GCGCAATTAA CCCTCACTAA AGGGAACAAA AGCTGGGTAC 2281 GTCGGGCCGT CAAGGCCGTC GACTTAATTA AGGCGCgtgg agactgtcac taacacccac 2341 caccaacagg tatttgcagt ggctggttaa ttaggaaact catttaggag atgatccagc 2401 aaagaaccca ggttagggat gggggtgggg gtgggggtgg gggtgggggc ggggttgtga 2461 caagctccag cacagatcca agtggttaaa agatgtgcca ttttaaaaca tttctgaaat 2521 gctaagatat 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81 aaatatgaaa ttatccatag ttaaataacc taaagagtga aatagtgatt acagacaatt 16441 atattagggt aaaacaggtg tgtgtgtgtt ttgttgtaca atttacatat gcacatattt 16501 acatgaatta taaaatatgc ttataggaag aaaaatcctg catatgattc attttggccc 16561 atcatttata taattagaga aggcctaGCG GCCGCATCTA GCTAGAGTCG ATCGACCAGC 16621 TTCTGATGGA ATTAGAACTT GGCAAAACAA TACTGAGAAT GAAGTGTATG TGGAACAGAG 16681 GCTGCTGATC TCGTTCTTCA GGCTATGAAA CTGACACATT TGGAAACCAC AGTACTTAGA 16741 ACCACAAAGT GGGAATCAAG AGAAAAACAA TGATCCCACG AGAGATCTAT AGATCTATAG 16801 ATCATGAGTG GGAGGAATGA GCTGGCCCTT AATTTGGTTT TGCTTGTTTA AAATTATGAT 16861 ATCCAACTAT GAAACATTAT CATAAAGCAA TAGTAAAGAG CCTTCAGTAA AGAGCAGGCA 16921 TTTATCTAAT CCCACCCCAC CCCCACCCCC GTAGCTCCAA TCCTTCCATT CAAAATGTAG 16981 GTACTCTGTT CTCACCCTTC TTAACAAAGT ATGACAGGAA AAACTTCCAT TTTAGTGGAC 17041 ATCTTTATTG TTTAATAGAT CATCAATTTC TGCATCCCTC GACTCTAGTG GATCTGCATT 17101 CCACCACTGC TCCCATTCAT CAGTTCCATA GGTTGGAATC TAAAATACAC AAACAATTAG 17161 AATCAGTAGT TTAACACATT ATACACTTAA AAATTTTATA TTTACCTTAG AGCTTTAAAT 17221 CTCTGTAGGT AGTTTGTCCA ATTATGTCAC ACCACAGAAG TAAGGTTCCT TCACAAAGAG 17281 ATCGCCTGAC ACGATTTCCT GCACAGGCTT GAGCCATATA CTCATACATC GCATCTTGGC 17341 CACGTTTTCC ACGGGTTTCA AAATTAATCT CAAGTTCTAC GCTTAACGCT TTCGCCTGTT 17401 CCCAGTTATT AATATATTCA ACGCTAGAAC TCCCCTCAGC GAAGGGAAGG CTGAGCACTA 17461 CACGCGAAGC ACCATCACCG AACCTTTTGA TAAACTCTTC CGTTCCGACT TGCTCCCATC 17521 AACGGTTCAG TGAGACTTAA ACCTAACTCT TTCTTAATAG TTTCGGCATT ATCCACTTTT 17581 AGTGCGAGAA CCTTCGTCAG TCCTGGATAC GTCACTTTGA CCACGCCTCC AGCTTTTCCA 17641 GAGAGCGGGT TTTCATTATC TACAGAGTAT CCCGCAGCGT CGTATTTATT GTCGGTACTA 17701 TAAAACCCTT TCCAATCATC GTCATAATTT CCTTGTGTAC CAGATTTTGG CTTTTGTATA 17761 CCTTTTTGAA TGGAATCTAC ATAACCAGGT TTAGTCCCGT GGTACGAAGA AAAGTTTTCC 17821 ATCACAAAAG ATTTAGAAGA ATCAACAACA TCATCAGGAT CCATGGCGAG GACCTGCAGG 17881 GTCGCTCGGT GTTCGAGGCC ACACGCGTCA CCTTAATATG CGAAGTGGAC CTGGGACCGC 17941 GCCGCCCCGA CTGCATCTGC GTGTTCGAAT TCGCCAATGA CAAGACGCTG GGCGGGGTTT 18001 GCTGCACATT GGGTGGAAAC ATTCCAGGCC TGGGTGGAGA GGCTTTTTGC TTCCTCTTGC 18061 AAAACCACAC TGCTCGACAT TGGGTGGAAA CATTCCAGGC CTGGGTGGAG AGGCTTTTTG 18121 CTTCCTCTTG AAAACCACAC TGCTCGAGGG GGGGCCCGCG AGCTCGAATT CACTGGCCGT 18181 CGTTTTACAA CGTCGTGACT GGGAAAACCC TGGCGTTACC CAACTTAATC GCCTTGCAGC 18241 ACATCCCCCT TTCGCCAGCT GGCGTAATAG CGAAGAGGCC CGCACCGATC GCCCTTCCCA 18301 ACAGTTGCGC AGCCTGAATG GCGAATGGCG CCTGATGCGG AACTTAATCG CCTTGCAGCA 18361 CATCCCCCTT TCGCCAGCTG GCGTAATAGC GAAGAGGCCC GCACCGATCG CCCTTCCCAA 18421 CAGTTGCGCA GCCTGAATGG CGAATGGCGC CTGATGCGGT ATTTTCTCCT TACGCATCTG 18481 TGCGGTATTT CACACCGCAT ATGGTGCACT CTCAGTACAA TCTGCTCTGA TGCCGCATAG 18541 TTAAGCCAGC CCCGACACCC GCCAACACCC GCTGACGCGC CCTGACGGGC TTGTCTGCTC 18601 CCGGCATCCG CTTACAGACA AGCTGTGACC GTCTCCGGGA GCTGCATGTG TCAGAGGTTT 18661 TCACCGTCAT CACCGAAACG CGCGA//
＜配列番号２～４＞Sh RNAの標的配列。
＜配列番号５～７＞プライマーの配列。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6】

【配列表】

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