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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-07-21
(45)【発行日】2023-07-31
(54)【発明の名称】血管新生抑制剤及び血管新生抑制剤のスクリーニング方法
(51)【国際特許分類】
A61K 38/16 20060101AFI20230724BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20230724BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230724BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230724BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230724BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20230724BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20230724BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20230724BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20230724BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20230724BHJP
A61K 35/76 20150101ALN20230724BHJP
A61P 3/10 20060101ALN20230724BHJP
A61P 9/10 20060101ALN20230724BHJP
A61P 13/12 20060101ALN20230724BHJP
A61P 17/00 20060101ALN20230724BHJP
A61P 17/06 20060101ALN20230724BHJP
A61P 19/02 20060101ALN20230724BHJP
A61P 19/08 20060101ALN20230724BHJP
A61P 25/00 20060101ALN20230724BHJP
A61P 27/02 20060101ALN20230724BHJP
A61P 1/04 20060101ALN20230724BHJP
A61P 29/00 20060101ALN20230724BHJP
A61P 9/14 20060101ALN20230724BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20230724BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20230724BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20230724BHJP
【ＦＩ】
A61K38/16 ZNA
A61K35/12
A61P43/00
A61P35/00
A61K48/00
C12Q1/02
C12Q1/686 Z
G01N33/15 Z
G01N33/50 Z
C12N15/113 Z
A61K35/76
A61P3/10
A61P9/10
A61P13/12
A61P17/00
A61P17/06
A61P19/02
A61P19/08
A61P25/00
A61P27/02
A61P1/04
A61P29/00
A61P29/00 101
A61P9/14
C07K14/47
C12N15/63 Z
C12N5/10
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2019567167
(86)(22)【出願日】2019-01-24
(86)【国際出願番号】 JP2019002370
(87)【国際公開番号】W WO2019146729
(87)【国際公開日】2019-08-01
【審査請求日】2022-01-13
(31)【優先権主張番号】P 2018010489
(32)【優先日】2018-01-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２９年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、（再生医療実現拠点ネットワークプログラム（技術開発個別課題））「再生医療用製品の大量生産に向けたヒトｉＰＳ細胞用培養装置開発」委託研究開発、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】591173198
【氏名又は名称】学校法人東京女子医科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100150810
【弁理士】
【氏名又は名称】武居 良太郎
(74)【代理人】
【識別番号】100197169
【弁理士】
【氏名又は名称】柴田 潤二
(72)【発明者】
【氏名】松浦 勝久
(72)【発明者】
【氏名】青木 信奈子
(72)【発明者】
【氏名】阪本 覚
(72)【発明者】
【氏名】清水 達也
【審査官】鶴 剛史
(56)【参考文献】
【文献】韓国公開特許第１０－２０１６－００２１０５８（ＫＲ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／１６４１４１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】KAYISLI, U A et al.，PNAS，2015年，Vol.112, No.16，p.5153-5158, Supporting information，Abstract, Supporting information Table S1,S2
【文献】SON, G W et al.，BioChip J，2014年，Vol.8, No.2，p.91-101，Abstract, 91頁33行-92頁2行, Table 4
【文献】MASUDA, S et al.，Biomaterials，2018年06月，Vol.166，p.109-121，Abstract
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８
Ａ６１Ｋ ３５／００－３５／７６８
Ａ６１Ｋ ４８／００
Ｃ１２Ｑ １／００－１／７０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＬＹＰＤ１タンパク質の発現を亢進させる血管新生抑制剤のスクリーニング方法であって、（ｉ）被験物質で第１細胞を処理し、培養する工程、
（ｉｉ）前記第１細胞のＬＹＰＤ１タンパク質の発現量を検出し、未処理の第１細胞のＬＹＰＤ１タンパク質の量と比較する工程、
を含む、方法。
【請求項2】
前記第１細胞が、皮膚由来、食道由来、精巣由来、肺由来又は肝臓由来の線維芽細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）において、未処理の第１細胞のＬＹＰＤ１タンパク質の量よりも、ＬＹＰＤ１タンパク質の発現を亢進させる前記被験物質を選択する工程、（ｉｖ）第２細胞と、血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞とを含む細胞群に、前記被験物質を添加し、培養する工程；
（ｖ）前記血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞によって形成させる血管内皮ネットワークを検出する工程、
をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記第２細胞が、皮膚由来、食道由来、精巣由来、肺由来又は肝臓由来の線維芽細胞である、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＬＹＰＤ１タンパク質若しくはその誘導体、又はその一部、或いはそれを発現するベクター、或いはそれを発現する細胞、を有効成分として含有する、血管新生抑制剤に関する。また、本発明はＬＹＰＤ１タンパク質の発現を亢進させる血管新生抑制剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【0002】
血管新生とは、組織や臓器に、既存の毛細血管から新たな毛細血管が形成されることをいう。正常な血管新生は、胚や胎児の発達、胎盤の増殖、黄体の形成、子宮の成熟、創傷治癒など、限られた状況において生じるものであり、必要な状況が整うと血管新生は停止する。そのため、血管新生は、過剰に行われないように血管新生調節因子などによって厳密に調節されている（非特許文献１）。
【0003】
異常な血管新生に関する疾患には、関節炎などの炎症性疾患、糖尿病性網膜症などの眼科疾患、乾癬などの皮膚科疾患、及び固形悪性腫瘍などが含まれる。原発性の固形悪性腫瘍や転移性の固形悪性腫瘍は、その増殖や成長に必要となる栄養や酸素を供給するために、まわりに血管新生を誘導することが知られている（非特許文献２、非特許文献３）。また、血管新生が、固形悪性腫瘍が転移する機会を促進している。
【0004】
このような固形悪性腫瘍に対する有効な治療法の一つとして、血管新生を抑制する試みが行われている。例えば、抗ＶＥＧＦ抗体などの血管新生促進因子に対する阻害剤を投与する試みが行われており、それによって生存期間が延長することが報告されている（非特許文献４～６）。しかしながら、血管新生調節因子の抑制は、全身の血管内皮の機能異常をきたし、高血圧や血栓形成などの副作用をもたらすなどの課題がある。
【0005】
血管新生には、促進系機序とともに、抑制系機序も存在するが、抑制系機序の活性化によるがん治療に関しては、依然として標準的治療法とはなっておらず、新たな治療法の探索が続けられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【文献】Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. J. Nature Med. (1995) 1: 27-31
【文献】Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. New Engl. J. Med., (1971) 285: 1182-1186
【文献】Folkman, J. Angiogenesis. J. Biol. Chem. (1992) 267: 10931-10934
【文献】Tewari KS., et al., Improved survival with bevacizumab in advanced cervical cancer. N Engl J Med. (2014) Feb. 20;370(8):734-43.
【文献】Yang JC., et al., A randomized trial of bevacizumab, an anti-vascular endothelial growth factor antibody, for metastatic renal cancer. New Engl. J. Med. (2003) Jul. 31;349(5):427-34.
【文献】Bear HD., et al., Bevacizumab added to neoadjuvant chemotherapy for breast cancer. New Engl. J. Med. (2012) Jan. 26;366(4):310-20.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、血管新生関連疾患の治療に用いることができる、新たな血管新生抑制剤を得ることを課題としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究を行った。その結果、驚くべきことに、血管新生を抑制する新規の因子であるＬＹＰＤ１タンパク質を見いだし、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
【0009】
［１］ ＬＹＰＤ１タンパク質若しくはその誘導体、又はその一部、或いはそれを発現するベクター、或いはそれを発現する細胞、を有効成分として含有する、血管新生抑制剤。
［２］ 血管新生関連疾患の治療又は予防に用いることを特徴とする、［１］に記載の血管新生抑制剤。
［３］ 前記血管新生関連疾患が、固形がん、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、未熟児網膜症、角膜移植拒絶反応、新生血管緑内障、紅皮症、増殖性網膜症、乾癬、血友病性関節症、アテローム性動脈硬化プラーク内の毛細血管増殖、ケロイド、創傷肉芽形成、血管癒着、関節リウマチ、骨関節炎、自己免疫疾患、クローン病、再狭窄症、アテローム性動脈硬化症、腸管癒着、潰瘍、肝硬変症、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症、臓器移植拒絶反応、腎糸球体症、糖尿病、炎症又は神経退行性疾患である、［２］に記載の血管新生抑制剤。
［４］ 前記固形がんが、子宮頸がん、肺がん、膵がん、非小細胞肺がん、肝がん、結腸がん、骨肉腫、皮膚がん、頭部がん、頸部がん、皮膚黒色腫、眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肝がん、脳腫瘍、膀胱がん、胃がん、肛門周囲腺がん、結腸がん、乳がん、卵管がん、子宮内膜がん、膣がん、外陰がん、ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、内分泌腺がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎がん、尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ；ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ）腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、又は脳下垂体腺腫である、［３］に記載の血管新生抑制剤。
［５］ 前記ＬＹＰＤ１タンパク質が、配列番号１～１４及び１９から選択される配列を有するＬＹＰＤ１タンパク質、又は配列番号１～１４及び１９から選択される配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するタンパク質である、［１］～［４］のいずれか１項に記載の血管新生抑制剤。
［６］ 前記細胞が、皮膚由来の線維芽細胞よりもＬＹＰＤタンパク質を高発現する細胞である、［１］～［５］のいずれか１項に記載の血管新生抑制剤。
［７］ 前記細胞が、心臓由来の線維芽細胞である、［６］に記載の血管新生抑制剤。
［２］ 血管新生関連疾患の治療又は予防に用いることを特徴とする、［１］に記載の血管新生抑制剤。
［３］ 前記血管新生関連疾患が、固形がん、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、未熟児網膜症、角膜移植拒絶反応、新生血管緑内障、紅皮症、増殖性網膜症、乾癬、血友病性関節症、アテローム性動脈硬化プラーク内の毛細血管増殖、ケロイド、創傷肉芽形成、血管癒着、関節リウマチ、骨関節炎、自己免疫疾患、クローン病、再狭窄症、アテローム性動脈硬化症、腸管癒着、潰瘍、肝硬変症、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症、臓器移植拒絶反応、腎糸球体症、糖尿病、炎症又は神経退行性疾患である、［２］に記載の血管新生抑制剤。
［４］ 前記固形がんが、子宮頸がん、肺がん、膵がん、非小細胞肺がん、肝がん、結腸がん、骨肉腫、皮膚がん、頭部がん、頸部がん、皮膚黒色腫、眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肝がん、脳腫瘍、膀胱がん、胃がん、肛門周囲腺がん、結腸がん、乳がん、卵管がん、子宮内膜がん、膣がん、外陰がん、ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、内分泌腺がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎がん、尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ；ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ）腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、又は脳下垂体腺腫である、［３］に記載の血管新生抑制剤。
［５］ 前記ＬＹＰＤ１タンパク質が、配列番号１～１４及び１９から選択される配列を有するＬＹＰＤ１タンパク質、又は配列番号１～１４及び１９から選択される配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するタンパク質である、［１］～［４］のいずれか１項に記載の血管新生抑制剤。
［６］ 前記細胞が、皮膚由来の線維芽細胞よりもＬＹＰＤタンパク質を高発現する細胞である、［１］～［５］のいずれか１項に記載の血管新生抑制剤。
［７］ 前記細胞が、心臓由来の線維芽細胞である、［６］に記載の血管新生抑制剤。
【0010】
［８］ ＬＹＰＤ１タンパク質の発現を亢進させる血管新生抑制剤のスクリーニング方法であって、
（ｉ）被験物質で第１細胞を処理し、培養する工程、
（ｉｉ）前記第１細胞のＬＹＰＤ１タンパク質の発現量を検出し、未処理の第１細胞のＬＹＰＤ１タンパク質の量と比較する工程、
を含む、方法。
［９］ 前記第１細胞が、皮膚由来、食道由来、精巣由来、肺由来又は肝臓由来の線維芽細胞である、［８］に記載の方法。
［１０］ （ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）において、未処理の第１細胞のＬＹＰＤ１タンパク質の量よりも、ＬＹＰＤ１タンパク質の発現を亢進させる前記被験物質を選択する工程、
（ｉｖ）第２細胞と、血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞とを含む細胞群に、前記被験物質を添加し、培養する工程；
（ｖ）前記血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞によって形成させる血管内皮ネットワークを検出する工程、
をさらに含む、［８］又は［９］に記載の方法。
［１１］ 前記第２細胞が、皮膚由来、食道由来、精巣由来、肺由来又は肝臓由来の線維芽細胞である、［１０］に記載の方法。
（ｉ）被験物質で第１細胞を処理し、培養する工程、
（ｉｉ）前記第１細胞のＬＹＰＤ１タンパク質の発現量を検出し、未処理の第１細胞のＬＹＰＤ１タンパク質の量と比較する工程、
を含む、方法。
［９］ 前記第１細胞が、皮膚由来、食道由来、精巣由来、肺由来又は肝臓由来の線維芽細胞である、［８］に記載の方法。
［１０］ （ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）において、未処理の第１細胞のＬＹＰＤ１タンパク質の量よりも、ＬＹＰＤ１タンパク質の発現を亢進させる前記被験物質を選択する工程、
（ｉｖ）第２細胞と、血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞とを含む細胞群に、前記被験物質を添加し、培養する工程；
（ｖ）前記血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞によって形成させる血管内皮ネットワークを検出する工程、
をさらに含む、［８］又は［９］に記載の方法。
［１１］ 前記第２細胞が、皮膚由来、食道由来、精巣由来、肺由来又は肝臓由来の線維芽細胞である、［１０］に記載の方法。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、血管新生の形成を阻害することが可能となり、血管新生関連疾患を治療又は予防することが可能となる。また、本発明によれば、血管新生関連疾患の治療又は予防に用いることができる、新たな血管新生阻害剤を得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】図１は、心臓線維芽細胞が血管内皮ネットワーク形成を阻害することを示す図である。（Ａ）本実施例の手順を示す図である。（Ｂ）ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）又は心臓線維芽細胞（心房はＮＨＣＦ－ａ、心室はＮＨＣＦ－ｖ）とヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とを共培養後、抗ＣＤ３１抗体で免疫染色した図を示す。緑はＣＤ３１陽性細胞を示す。（Ｃ）（Ｂ）で示された血管内皮ネットワークの全長を示すグラフである。（Ｄ）（Ｂ）で示された血管内皮ネットワークの分岐点数を示すグラフである。
【図2】図２は、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）又はヒト心臓線維芽細胞（心房はＮＨＣＦ－ａ、心室はＮＨＣＦ－ｖ）と、ｉＰＳ細胞由来血管内皮細胞（ｉＰＳ－ＣＤ３１＋）又はヒト心臓由来微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ－Ｃ）とを共培養後の、血管内皮ネットワークを示す図である。
【図3】図３は、マウス心臓線維芽細胞が血管内皮ネットワーク形成を阻害することを示す図である。（Ａ）本実施例の手順を示す図である。（Ｂ）マウス皮膚線維芽細胞（ＤＦ）又はマウス心臓線維芽細胞（ＣＦ）と、マウスＥＳ細胞由来心筋細胞、マウスＥＳ細胞由来血管内皮細胞とを共培養後の心筋細胞（緑）及びＣＤ３１陽性細胞（赤）を示す図である。
【図4】図４は、ラット心臓線維芽細胞が血管内皮ネットワーク形成を阻害することを示す図である。（Ａ）本実施例の手順を示す図である。（Ｂ）新生仔ラット皮膚線維芽細胞（ＲＤＦ）又は心臓線維芽細胞（ＲＣＦ）と、ラット新生仔心臓由来血管内皮細胞とを共培養後の血管内皮ネットワークを示す図である。ＣＤ３１陽性細胞（緑）及び核（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（青））を表す。（Ｃ）（Ｂ）で示された血管内皮ネットワークの全長を示すグラフである。（Ｄ）（Ｂ）で示された血管内皮ネットワークの分岐点数を示すグラフである。
【図6】図６は、ＬＹＰＤ１が発現する部位を示す図である。（Ａ）ラット由来の各臓器におけるＬＹＰＤ１の相対的発現量をｑＰＣＲにより評価したグラフである。（Ｂ）ラット心臓組織の免疫染色画像を示す図である（ｃＴｎＴ：心筋トロポニンＴ（緑）、ＬＹＰＤ１（赤）、ＤＡＰＩ：核（青）、Ｍｅｒｇｅｄ：マージ）。
【図7】図７は、ヒト及びラットの初代培養細胞におけるＬＹＰＤ１遺伝子発現を比較した図である。（Ａ）ヒト初代皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）及びヒト初代心臓線維芽細胞（心房：ＮＨＣＦ－ａ、心室：ＮＨＣＦ－ｖ）のＬＹＰＤ１の相対的発現量をｑＰＣＲにより評価したグラフである。（Ｂ）ラット初代皮膚線維芽細胞及びラット初代心臓線維芽細胞のＬＹＰＤ１の相対的発現量をｑＰＣＲにより評価したグラフである。
【図8】図８は、血管ネットワーク形成がＬＹＰＤ１の阻害（ｓｉＲＮＡ）により回復することを示す図である。（Ａ）本実施例の手順を示す図である。（Ｂ）ヒト心臓線維芽細胞にＬＹＰＤ１に対するｓｉＲＮＡを導入した後にＨＵＶＥＣと共培養後、抗ＣＤ３１抗体で免疫染色した図を示す。緑はＣＤ３１陽性細胞を示す。（Ｃ）ヒト心臓線維芽細胞にコントロールｓｉＲＮＡを導入した後にＨＵＶＥＣと共培養後、抗ＣＤ３１抗体で免疫染色した図を示す。緑はＣＤ３１陽性細胞を示す。（Ｄ）（Ｂ）及び（Ｃ）で示された血管内皮ネットワークの全長を示すグラフである。
【図9】図９は、血管ネットワーク形成がＬＹＰＤ１の阻害（抗ＬＹＰＤ１抗体）により回復することを示す図である。（Ａ）ヒト心臓線維芽細胞とＨＵＶＥＣとを抗ＬＹＰＤ１抗体存在下で共培養後、抗ＣＤ３１抗体で免疫染色した図を示す。緑はＣＤ３１陽性細胞を示す。（Ｂ）ヒト心臓線維芽細胞とＨＵＶＥＣとをコントロールＩｇＧ存在下にて共培養後、抗ＣＤ３１抗体で免疫染色した図を示す。緑はＣＤ３１陽性細胞を示す。（Ｃ）（Ａ）及び（Ｂ）で示された血管内皮ネットワークの全長を示すグラフである。（Ｄ）（Ａ）及び（Ｂ）で示された血管内皮ネットワークの分岐点数を示すグラフである。
【図10】図１０は、血管ネットワーク形成がＬＹＰＤ１の阻害（抗ＬＹＰＤ１抗体）により回復することを示す図である。（Ａ）ラット新生仔心臓線維芽細胞とラット新生仔心臓由来血管内皮細胞とを抗ＬＹＰＤ１抗体存在下で共培養後、抗ＣＤ３１抗体で免疫染色した図を示す。緑はＣＤ３１陽性細胞を示す。（Ｂ）ラット新生仔心臓線維芽細胞とラット新生仔心臓由来血管内皮細胞とをコントロールＩｇＧ存在下にて共培養後、抗ＣＤ３１抗体で免疫染色した図を示す。緑はＣＤ３１陽性細胞を示す。（Ｃ）（Ａ）及び（Ｂ）で示された血管内皮ネットワークの全長を示すグラフである。（Ｄ）（Ａ）及び（Ｂ）で示された血管内皮ネットワークの分岐点数を示すグラフである。
【図11】図１１は、ヒト皮膚芽細胞（ＮＨＤＦ）及びヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦ）、ｉＰＳ由来間質細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）における遺伝子発現をマイクロアレイで解析した結果を示した図である。クラスター解析を右に示す。
【図12】図１２は、ヒトｉＰＳ由来間質細胞（ｉＰＳ ｆｉｂｒｏ－ｌｉｋｅ）がヒトｉＰＳ ＣＤ３１陽性細胞（ｉＰＳ ＣＤ３１＋）由来の血管内皮ネットワーク形成を阻害することを示す図である。（Ａ）本実施例の手順を示す図である。（Ｂ）ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）又はヒトｉＰＳ由来間質細胞を、ヒトｉＰＳ ＣＤ３１陽性細胞と共培養後、抗ＣＤ３１抗体で免疫染色した図を示す。赤は、ＣＤ３１陽性細胞を示す。（Ｃ）ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）、ヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦａ）及びヒトｉＰＳ由来間質細胞（ｉＰＳ ｆｉｂｒｏ－ｌｉｋｅ）におけるＬＹＤＰ１の発現をｑＰＣＲで評価したグラフを示す。
【図13】図１３は、リコンビナントＬＹＰＤ１が、血管内皮ネットワーク形成を阻害することを示す図である。（Ａ）抗ＤＹＫＤＤＤＤＫタグ抗体磁気ビーズを用いて精製したＦＬＡＧ－ＬＹＰＤ１タンパク質をドデシル硫酸－ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び免疫ブロッティングに供し、ペルオキシダーゼ結合抗－ＤＹＫＤＤＤＤＫタグモノクローナル抗体（上段）及びウサギポリクローナル抗－ＬＹＰＤ１抗体（下段）で検出した。（Ｂ）リコンビナントＬＹＰＤ１タンパク質で処理した後の血管内皮ネットワーク（チューブ）形成の様子を示す。ＣＤ３１（緑）及び核（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（青））を染色した。スケールバーは４００μｍを表す。（Ｃ）リコンビナントＬＹＰＤ１タンパク質で処理した後の血管内皮ネットワーク（チューブ）の長さの合計を示す。ＣＤ３１陽性細胞が形成するチューブの長さを合計して算出した。値は、３回の独立した実験から、平均値±標準偏差を算出した。Ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明者らは、組織工学的に三次元生体組織を構築する研究を行う過程において、マウス、ラット及びヒトのいずれの哺乳動物由来の心臓線維芽細胞と血管内皮細胞を共培養した場合、血管内皮細胞のネットワーク形成が著しく抑制される現象を見出した。その原因について詳細に調べた結果、ＬＹＰＤ１タンパク質が、血管内皮ネットワークの形成阻害に関与することを見出した。本発明は、当該知見を基にして完成させたものである。
【0014】
１．血管内皮ネットワークの形成（血管新生）
本明細書において、用語「血管内皮ネットワーク」とは、血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞が生体組織において構築する毛細血管様のネットワークである。血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞の細胞表面マーカーとしてはＣＤ３１タンパク質が知られており、任意の方法によってＣＤ３１タンパク質を検出することで、生体組織における血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞の存在を検出することができる。血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞は、管腔構造を構築し、流体、特に血液が通る血管網を形成する。生体組織が生存するためには、栄養や酸素が含まれる血液をその隅々まで行き渡らせる必要があり、そのためには密度の高い血管網を構築する必要がある。その一方で、血管内皮ネットワークが過剰に形成されることにより、血管新生関連疾患（後述）が引き起こされたり、重篤化したりする。血管内皮ネットワークの形成（血管新生）が阻害されているか否かについては、上述のように構築された血管内皮ネットワークの長さ及び／又は分岐点を評価することによって判断することができる。血管内皮ネットワークの長さとは、単位面積あたりの血管内皮ネットワークの長さの合計をいい、血管内皮ネットワークの分岐点とは、単位面積あたりに存在する血管内皮ネットワーク同士が繋がった部位の総数をいう。後述の血管新生抑制剤のスクリーニング方法においては、被験物質を用いない場合（又はネガティブコントロールとしての化合物）と比較して、血管内皮ネットワークの長さ及び／又は分岐点が低い程、血管内皮ネットワークの形成を阻害する能力が高い血管新生抑制剤と評価することができる。血管内皮ネットワークの長さ及び／又は分岐点は、共焦点蛍光顕微鏡等により取得した画像を、例えば、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて、ＣＤ３１陽性領域を血管内皮細胞として、血管内皮ネットワークの長さと分枝点を算出することができる。
本明細書において、用語「血管内皮ネットワーク」とは、血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞が生体組織において構築する毛細血管様のネットワークである。血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞の細胞表面マーカーとしてはＣＤ３１タンパク質が知られており、任意の方法によってＣＤ３１タンパク質を検出することで、生体組織における血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞の存在を検出することができる。血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞は、管腔構造を構築し、流体、特に血液が通る血管網を形成する。生体組織が生存するためには、栄養や酸素が含まれる血液をその隅々まで行き渡らせる必要があり、そのためには密度の高い血管網を構築する必要がある。その一方で、血管内皮ネットワークが過剰に形成されることにより、血管新生関連疾患（後述）が引き起こされたり、重篤化したりする。血管内皮ネットワークの形成（血管新生）が阻害されているか否かについては、上述のように構築された血管内皮ネットワークの長さ及び／又は分岐点を評価することによって判断することができる。血管内皮ネットワークの長さとは、単位面積あたりの血管内皮ネットワークの長さの合計をいい、血管内皮ネットワークの分岐点とは、単位面積あたりに存在する血管内皮ネットワーク同士が繋がった部位の総数をいう。後述の血管新生抑制剤のスクリーニング方法においては、被験物質を用いない場合（又はネガティブコントロールとしての化合物）と比較して、血管内皮ネットワークの長さ及び／又は分岐点が低い程、血管内皮ネットワークの形成を阻害する能力が高い血管新生抑制剤と評価することができる。血管内皮ネットワークの長さ及び／又は分岐点は、共焦点蛍光顕微鏡等により取得した画像を、例えば、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて、ＣＤ３１陽性領域を血管内皮細胞として、血管内皮ネットワークの長さと分枝点を算出することができる。
【0015】
２．血管新生抑制剤
本明細書において、用語「血管新生抑制剤」とは、ＬＹＰＤ１タンパク質若しくはその誘導体又はその一部、或いはそれを発現するベクター、或いはそれを発現する細胞、或いは、直接的及び／又は間接的にＬＹＰＤ１タンパク質の発現を亢進し、血管内皮ネットワークの形成（血管新生）を阻害する天然の若しくは合成された化合物又は細胞をいう。血管新生抑制剤は、後述のＬＹＰＤ１タンパク質の発現を亢進させる血管新生抑制剤のスクリーニング方法によっても得ることができる。一実施態様において、本発明の血管新生抑制剤は、その医薬的に許容される塩であってもよい。本明細書において「医薬的な」又は「医薬的に許容される」とは、哺乳動物、特にヒトに適切に投与されたとき、副作用、アレルギー作用又はその他の有害作用を生じない分子及び組成物を意味する。本明細書において、医薬的に許容される担体又は賦形剤とは、非毒性の固形、半固形又は液体の注入剤、希釈剤、カプセル化物質又は任意の種類の製剤補助物を意味し、医薬的に許容される担体又は賦形剤は、本発明の血管新生抑制剤と共に用いることができる。
本明細書において、用語「血管新生抑制剤」とは、ＬＹＰＤ１タンパク質若しくはその誘導体又はその一部、或いはそれを発現するベクター、或いはそれを発現する細胞、或いは、直接的及び／又は間接的にＬＹＰＤ１タンパク質の発現を亢進し、血管内皮ネットワークの形成（血管新生）を阻害する天然の若しくは合成された化合物又は細胞をいう。血管新生抑制剤は、後述のＬＹＰＤ１タンパク質の発現を亢進させる血管新生抑制剤のスクリーニング方法によっても得ることができる。一実施態様において、本発明の血管新生抑制剤は、その医薬的に許容される塩であってもよい。本明細書において「医薬的な」又は「医薬的に許容される」とは、哺乳動物、特にヒトに適切に投与されたとき、副作用、アレルギー作用又はその他の有害作用を生じない分子及び組成物を意味する。本明細書において、医薬的に許容される担体又は賦形剤とは、非毒性の固形、半固形又は液体の注入剤、希釈剤、カプセル化物質又は任意の種類の製剤補助物を意味し、医薬的に許容される担体又は賦形剤は、本発明の血管新生抑制剤と共に用いることができる。
【0016】
２－１．ＬＹＰＤ１タンパク質
本明細書において、用語「ＬＹＰＤ１タンパク質」は、当該技術分野において一般的に使用される意味と同義のものとして使用され、ＬＹ６／ＰＬＡＵＲ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １、ＰＨＴＳ、ＬＹＰＤＣ１とも称されるタンパク質をいう（以下、「ＬＹＰＤ１」ともいう）。ＬＹＰＤ１タンパク質は、哺乳動物において広く保存されているタンパク質であり、例えば、ヒト、サル、イヌ、ウシ、マウス、ラット等においても見出されている。天然のヒトＬＹＰＤ１のｍＲＮＡ及びアミノ酸の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベース及びＧｅｎＰｅｐｔデータベースにおいて、受入番号ＮＭ＿００１０７７４２７（配列番号１）及びＮＰ＿００１０７０８９５（配列番号２）、ＮＭ＿１４４５８６（配列番号３）、及びＮＰ＿６５３１８７（配列番号４）、ＮＭ＿００１３２１２３４（配列番号５）及びＮＰ＿００１３０８１６３（配列番号６）、並びにＮＭ＿００１３２１２３５（配列番号７）及びＮＰ＿００１３０８１６４（配列番号８）として提供され、また、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースにおいて、Ｑ８Ｎ２Ｇ４－２（配列番号１９）として提供される。また、天然のマウスＬＹＰＤ１のｍＲＮＡ及びアミノ酸の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベース及びＧｅｎＰｅｐｔデータベースにおいて、受入番号ＮＭ＿１４５１００（配列番号９）及びＮＰ＿６５９５６８（配列番号１０）、ＮＭ＿００１３１１０８９（配列番号１１）及びＮＰ＿００１２９８０１８（配列番号１２）、並びに、ＮＭ＿００１３１１０９０（配列番号１３）及びＮＰ＿００１２９８０１９（配列番号１４）として提供されている。
本明細書において、用語「ＬＹＰＤ１タンパク質」は、当該技術分野において一般的に使用される意味と同義のものとして使用され、ＬＹ６／ＰＬＡＵＲ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １、ＰＨＴＳ、ＬＹＰＤＣ１とも称されるタンパク質をいう（以下、「ＬＹＰＤ１」ともいう）。ＬＹＰＤ１タンパク質は、哺乳動物において広く保存されているタンパク質であり、例えば、ヒト、サル、イヌ、ウシ、マウス、ラット等においても見出されている。天然のヒトＬＹＰＤ１のｍＲＮＡ及びアミノ酸の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベース及びＧｅｎＰｅｐｔデータベースにおいて、受入番号ＮＭ＿００１０７７４２７（配列番号１）及びＮＰ＿００１０７０８９５（配列番号２）、ＮＭ＿１４４５８６（配列番号３）、及びＮＰ＿６５３１８７（配列番号４）、ＮＭ＿００１３２１２３４（配列番号５）及びＮＰ＿００１３０８１６３（配列番号６）、並びにＮＭ＿００１３２１２３５（配列番号７）及びＮＰ＿００１３０８１６４（配列番号８）として提供され、また、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースにおいて、Ｑ８Ｎ２Ｇ４－２（配列番号１９）として提供される。また、天然のマウスＬＹＰＤ１のｍＲＮＡ及びアミノ酸の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベース及びＧｅｎＰｅｐｔデータベースにおいて、受入番号ＮＭ＿１４５１００（配列番号９）及びＮＰ＿６５９５６８（配列番号１０）、ＮＭ＿００１３１１０８９（配列番号１１）及びＮＰ＿００１２９８０１８（配列番号１２）、並びに、ＮＭ＿００１３１１０９０（配列番号１３）及びＮＰ＿００１２９８０１９（配列番号１４）として提供されている。
【0017】
ＬＹＰＤ１タンパク質は、脳において高発現しているタンパク質として知られているが、その機能についてはこれまでのところほとんど知られていない。ＬＹＰＤ１タンパク質のアミノ酸モチーフから、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型のタンパク質であると考えられている。
【0018】
本明細書において、「ＬＹＰＤ１タンパク質」とは、天然に存在するＬＹＰＤ１タンパク質若しくはその変異体及びその修飾体（総称して、「誘導体」という）、又はその一部をいう。この用語はまた、少なくとも１種のＬＹＰＤ１活性を保持したＬＹＰＤ１タンパク質のドメインが、例えば、他のポリペプチドと融合した融合タンパク質を意味するものであってもよい。ＬＹＰＤ１タンパク質はいかなる生物由来であってもよく、好ましくは、哺乳動物由来（例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモット等）、ウサギ、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、ヤギ、ヒツジ等）、より好ましくは、ヒト及びヒト以外の霊長類由来、特に好ましくはヒトのＬＹＰＤ１タンパク質である。本発明に用いられるＬＹＰＤ１タンパク質は、配列番号１～１４及び１９から選択される配列や、配列番号１～１４及び１９から選択される配列と少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有するタンパク質である。
【0019】
本発明のＬＹＰＤ１タンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記ＬＹＰＤ１タンパク質遺伝子の塩基配列から調製され得るプローブ、例えば同塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるタンパク質であってもよい。そのようなプローブは、例えば、同塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、同塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、或いは通常のサザンハイブリダイゼーションにおける洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、好ましくは６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、より好ましくは６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、好ましくは２～３回洗浄する条件を挙げることができる。また、例えば、プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗浄条件としては、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳが挙げられる。
【0020】
ＬＹＰＤ１タンパク質を得る方法は、公知の遺伝子工学的手法及びタンパク質工学的手法などを用いることによって得ることが可能であり、例えば、ＦＬＡＧタグと呼ばれる人工的な８アミノ酸配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ）をＬＹＰＤ１タンパク質のN末端又はC末端に発現するように構築したベクターを任意の細胞に導入し、培養して発現させたタンパク質を、ＦＬＡＧタグに対する抗体を結合させた樹脂によって精製する方法や、その他のタグ（例えば、ＢＣＣＰ、ｃ－ｍｙｃタグ、カルモジュリンタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、マルトース結合タンパク質タグ、Ｎｕｓタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、緑色蛍光タンパク質タグ、チオレドキシンタグ、Ｓタグ、Ｓｔｒｅｐｔａｇ ＩＩ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｔ７タグ、エラスチン様ペプチド、キチン結合ドメイン及びキシラナーゼ１０Ａなど）を組み込んだＬＹＰＤ１タンパク質を、任意の細胞にて発現させ、それぞれのタグに応じて最適な手法を選択して精製することにより得ることができる。タグを用いることなく、ＬＹＰＤ１タンパク質を発現している細胞を破砕し、例えば、抗ＬＹＰＤ１抗体を用いて直接精製することも可能である。
【0021】
ＬＹＰＤ１タンパク質は、植物細胞、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞、又はその抽出物などを用いて発現させることにより得ることが可能であり、好ましくは昆虫細胞又は哺乳動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞を用いて発現させて得ることができる。
【0022】
２－２．ＬＹＰＤ１タンパク質発現ベクター
本発明の一実施態様において、血管新生抑制剤としてのＬＹＰＤ１タンパク質若しくはその誘導体又はその一部は、それをコードする核酸が任意のベクターに組み込まれた発現ベクター（以下、総称して「ＬＹＰＤ１タンパク質発現ベクター」という。）から発現されるものであってもよい。本発明において、ＬＹＰＤ１タンパク質発現ベクターに使用されるベクターは限定されず、公知のものを適宜選択可能である。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、ウイルスベクター、人工染色体ベクターなどが挙げられる。ＬＹＰＤ１タンパク質若しくはその誘導体又はその一部をコードする核酸を任意のベクターに導入する方法は公知であり、特に限定されない。
本発明の一実施態様において、血管新生抑制剤としてのＬＹＰＤ１タンパク質若しくはその誘導体又はその一部は、それをコードする核酸が任意のベクターに組み込まれた発現ベクター（以下、総称して「ＬＹＰＤ１タンパク質発現ベクター」という。）から発現されるものであってもよい。本発明において、ＬＹＰＤ１タンパク質発現ベクターに使用されるベクターは限定されず、公知のものを適宜選択可能である。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、ウイルスベクター、人工染色体ベクターなどが挙げられる。ＬＹＰＤ１タンパク質若しくはその誘導体又はその一部をコードする核酸を任意のベクターに導入する方法は公知であり、特に限定されない。
【0023】
２－３．ＬＹＰＤ１タンパク質発現細胞
本発明の一実施態様において、血管新生抑制剤としてのＬＹＰＤ１タンパク質若しくはその誘導体又はその一部は、任意の細胞から発現されるものであってもよい（以下、「ＬＹＰＤ１タンパク質発現細胞」という。）。例えば、ＬＹＰＤ１タンパク質発現細胞は、上述のＬＹＰＤ１タンパク質発現ベクターによって形質転換された細胞であってもよい。ＬＹＰＤ１タンパク質発現ベクターを細胞へ導入する方法についても公知の方法に従えばよく、限定されない。ＬＹＰＤ１タンパク質発現ベクターが導入されて、ＬＹＰＤ１タンパク質を一時的又は持続的に発現する細胞を選択する方法も限定されず、例えば、発現ベクターにコードされている薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤（例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン等）を使用して選択すればよい。形質転換に用いることができる細胞は、生体から単離された細胞であってもよく、好ましくは、投与される対象から単離された細胞である。投与される対象由来の細胞であれば、対象に投与した場合に、免疫システムによって拒絶される可能性が低くなる。
本発明の一実施態様において、血管新生抑制剤としてのＬＹＰＤ１タンパク質若しくはその誘導体又はその一部は、任意の細胞から発現されるものであってもよい（以下、「ＬＹＰＤ１タンパク質発現細胞」という。）。例えば、ＬＹＰＤ１タンパク質発現細胞は、上述のＬＹＰＤ１タンパク質発現ベクターによって形質転換された細胞であってもよい。ＬＹＰＤ１タンパク質発現ベクターを細胞へ導入する方法についても公知の方法に従えばよく、限定されない。ＬＹＰＤ１タンパク質発現ベクターが導入されて、ＬＹＰＤ１タンパク質を一時的又は持続的に発現する細胞を選択する方法も限定されず、例えば、発現ベクターにコードされている薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤（例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン等）を使用して選択すればよい。形質転換に用いることができる細胞は、生体から単離された細胞であってもよく、好ましくは、投与される対象から単離された細胞である。投与される対象由来の細胞であれば、対象に投与した場合に、免疫システムによって拒絶される可能性が低くなる。
【0024】
また、本発明の一実施態様において、ＬＹＰＤ１タンパク質発現細胞は、生体から単離された細胞であってよく、例えば、皮膚由来の線維芽細胞よりもＬＹＰＤ１タンパク質を高発現する細胞、好ましくは脳、心臓、腎臓又は筋肉の生体組織に存在する間質細胞又は線維芽細胞であり、より好ましくは心臓由来の線維芽細胞である。
【0025】
また、本発明の一実施形態において、ＬＹＰＤ１タンパク質発現細胞は、ゲノム編集技術によってＬＹＰＤ１遺伝子の発現を直接的及び／又は間接的に亢進させた細胞を用いることができる。本明細書において、ゲノム編集核酸とは、遺伝子ターゲッティングに用いられるヌクレアーゼを利用したシステムにおいて、所望の遺伝子を編集するために用いられる核酸をいう。遺伝子ターゲッティングに用いられるヌクレアーゼは、公知のヌクレアーゼの他、今後遺伝子ターゲッティングのために使用される新たなヌクレアーゼも包含される。例えば、公知のヌクレアーゼとしては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１３，１５４，１３８０－１３８９）、ＴＡＬＥＮ（Ｍａｈｆｏｕｚ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１１，１０８，２６２３－２６２８）、ＺＦＮ（Ｕｒｎｏｖ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３５，６４６－６５１）等が挙げられる。ゲノム編集技術によって、例えば、ＬＹＰＤ１遺伝子のプロモーター領域及び／又はエンハンサー領域に変異を導入することができる。その結果、ＬＹＰＤ１タンパク質を高発現する細胞を得ることが可能となる。
【0026】
ゲノム編集技術によって得られるＬＹＰＤ１タンパク質発現細胞は、好ましくは皮膚由来の線維芽細胞よりもＬＹＰＤ１タンパク質を高発現する細胞であり、より好ましくは、心臓由来の線維芽細胞と同程度又はそれ以上のＬＹＰＤ１タンパク質を発現する細胞（例えば、心臓由来のヒト線維芽細胞が発現するＬＹＰＤ１タンパク質の発現量と比較して、８０％以上、９０％以上、１００％以上、１１０％以上、１２０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、１６０％以上、１７０％以上、１８０％以上、１９０％以上、２００％以上、ＬＹＰＤ１タンパク質を発現する細胞）である。
【0027】
本発明の一実施形態において、ＬＹＰＤ１タンパク質発現細胞は、多能性幹細胞から誘導された細胞であってもよい。本発明において、多能性幹細胞とは、自己複製能と多分化能を有する細胞であり、体を構成するあらゆる細胞を形成する能力（ｐｌｕｒｉｏｐｏｔｅｎｔ）を備える細胞をいう。自己複製能とは、１つの細胞から自分と同じ未分化な細胞を２つ作る能力のことをいう。本発明で用いられる多能性幹細胞は、例えば、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）、胚性癌腫細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ：ＥＣ細胞）、栄養芽幹細胞（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＴＳ細胞）、エビブラスト幹細胞（ｅｐｉｂｌａｓｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＥｐｉＳ細胞）、胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ：ＥＧ細胞）、多能性生殖細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ｍＧＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）などが含まれる。これらの多能性幹細胞を分化誘導する方法としては、例えば、Ｍａｔｓｕｕｒａらの方法（Ｍａｔｓｕｕｒａ Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｒｄｉａｃ ｃｅｌｌ ｓｈｅｅｔｓ ｕｓｉｎｇ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１２ Ａｕｇ．２４；４２５（２）：３２１－３２７）に従って実施できる。
【0028】
２－４．ＬＹＰＤ１タンパク質の発現を亢進させる血管新生抑制剤としての化合物
本明細書において、ＬＹＰＤ１タンパク質の発現を亢進させる血管新生抑制剤としての化合物は、例えば、有機低分子、ペプチド、タンパク質、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出物又は細胞培養上清、植物由来の化合物又は抽出物（例えば、生薬エキス、生薬由来の化合物）、及び微生物由来の化合物若しくは抽出物又は培養産物などであってもよい。本発明において、ＬＹＰＤ１タンパク質の発現を亢進させる血管新生抑制剤としての化合物とは、直接的及び／又は間接的に作用し、ＬＹＰＤ１の発現を亢進させ、血管内皮ネットワークの形成（血管新生）を阻害するものをいい、後述のスクリーニング方法によって、被験物質から選択することができる。
本明細書において、ＬＹＰＤ１タンパク質の発現を亢進させる血管新生抑制剤としての化合物は、例えば、有機低分子、ペプチド、タンパク質、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出物又は細胞培養上清、植物由来の化合物又は抽出物（例えば、生薬エキス、生薬由来の化合物）、及び微生物由来の化合物若しくは抽出物又は培養産物などであってもよい。本発明において、ＬＹＰＤ１タンパク質の発現を亢進させる血管新生抑制剤としての化合物とは、直接的及び／又は間接的に作用し、ＬＹＰＤ１の発現を亢進させ、血管内皮ネットワークの形成（血管新生）を阻害するものをいい、後述のスクリーニング方法によって、被験物質から選択することができる。
【0029】
３．医薬組成物
本発明は、血管新生抑制剤、特にＬＹＰＤ１タンパク質若しくはその誘導体、又はその一部、或いはそれを発現するベクター、或いはそれを発現する細胞、或いは、直接的及び／又は間接的にＬＹＰＤ１タンパク質の発現を亢進し、血管内皮ネットワークの形成（血管新生）を阻害する天然の若しくは合成された化合物又は細胞、を有効成分として含有する、血管新生関連疾患の治療又は予防に用いるための、医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、それを必要とする対象に適用し、血管新生関連疾患の治療又は予防が可能となる。本発明の医薬組成物は、医薬的に許容される担体又は賦形剤を含んでもよい。
本発明は、血管新生抑制剤、特にＬＹＰＤ１タンパク質若しくはその誘導体、又はその一部、或いはそれを発現するベクター、或いはそれを発現する細胞、或いは、直接的及び／又は間接的にＬＹＰＤ１タンパク質の発現を亢進し、血管内皮ネットワークの形成（血管新生）を阻害する天然の若しくは合成された化合物又は細胞、を有効成分として含有する、血管新生関連疾患の治療又は予防に用いるための、医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、それを必要とする対象に適用し、血管新生関連疾患の治療又は予防が可能となる。本発明の医薬組成物は、医薬的に許容される担体又は賦形剤を含んでもよい。
【0030】
４．血管新生抑制剤又は医薬組成物の対象への適用
本発明にかかる血管新生抑制剤又は医薬組成物は、対象に治療有効量で投与される。「治療有効量」とは、血管新生を阻害する所望の効果を発揮するのに必要かつ十分な血管新生抑制剤の量を意味する。
本発明にかかる血管新生抑制剤又は医薬組成物は、対象に治療有効量で投与される。「治療有効量」とは、血管新生を阻害する所望の効果を発揮するのに必要かつ十分な血管新生抑制剤の量を意味する。
【0031】
本明細書において、「投与」とは、任意の適切な方法で対象に所定の物質を提供することを意味し、本発明の血管新生抑制剤又は医薬組成物の投与経路は、標的組織に送達できるものであれば、一般的なあらゆる経路を介して経口又は非経口投与することができる。また、本発明の血管新生抑制剤又は医薬組成物は、有効成分を標的細胞に送達する任意の装置を用いて投与することができる。
【0032】
本明細書において、「対象」とは、ヒト、ヒト以外の霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモット等）、ウサギ、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、ヤギ、ヒツジ等を含むが、これらに限定されない動物を意味し、一実施例においては哺乳動物を、又他の実施例においてはヒトを意味する。
【0033】
本発明の血管新生抑制剤の一日の使用量は、医者による医学的判断の範囲で、決定される。治療有効量は、治療及び／又は予防の対象となる障害及びその障害の重症度、使用する化合物の活性、使用する組成物、患者の年齢、体重、患者の健康状態、性別及び食事、投与時間、投与経路並びに使用する化合物の排泄率、治療期間、同時に使用される薬剤、及びその他医療分野で周知のファクターによって変化する。例えば、所望する治療効果を実現するために必要な量よりも低い量で血管新生抑制剤の投与を開始し、所望する効果が実現するまで投薬量を徐々に増加させることは当業者が実現可能な範囲である。血管新生抑制剤の用量は、成人１日当たり０．０１～１０００ｍｇの広い範囲で変化させることができる。血管新生抑制剤を有効成分として含む医薬組成物は、治療する患者の症状に合わせて投薬するために、有効成分を０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０又は５００ｍｇを含有する。医薬組成物は、通常、活性成分を約０．０１ｍｇ～約５００ｍｇ、好ましくは活性成分を１ｍｇ～約１００ｍｇ含有する。薬物の有効量は通常、１日当たり０．０００２ｍｇ／ｋｇ体重～約２０ｍｇ／ｋｇ体重、特に１日当たり約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～７ｍｇ／ｋｇ体重までの投薬量で供給される。
【0034】
血管新生抑制剤又は医薬組成物が、ＬＹＰＤ１タンパク質若しくはその誘導体又はその一部を発現する細胞を含む場合、ＬＹＰＤ１タンパク質若しくはその誘導体又はその一部の形態や、その発現量などによって、治療有効用量（細胞数）は変化する。
【0035】
本発明の一実施態様において、血管新生抑制剤又は医薬組成物がＬＹＰＤ１タンパク質若しくはその誘導体又はその一部を発現する細胞を含む場合、当該血管新生抑制剤又は医薬組成物を含む懸濁液を、患部又はその周辺に注射してもよく、当該血管新生抑制剤又は医薬組成物を含む「生体組織」を構築し、それを対象に投与（移植）してもよい。生体組織であれば、患部に生着することが可能であり、継続的に血管新生抑制剤が患部周辺に徐放され、血管新生抑制効果が持続することとなる。
【0036】
「生体組織」を作製する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、血管床上において細胞シートを積層して生体組織を構築する方法（国際公開第２０１２／０３６２２４号及び国際公開第２０１２／０３６２２５号を参照）、三次元プリンター技術を用いて生体組織を構築する方法（国際公開第２０１２／０５８２７８号を参照）、接着膜で被覆された細胞を用いて三次元構造体を作製する方法（特開第２０１２－１１５２５４号公報を参照）、生体内において臓器を構築する方法（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｔ．，Ｎａｋａｕｃｈｉ Ｈ．［Ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｔｏ ｏｒｇａｎ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ： ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｏｒｇａｎｓ ｆｒｏｍ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ］．Ｎｉｈｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ．２０１１ Ｄｅｃ；６９（１２）：２１４８－５５；国際公開第２０１０／０２１３９０号;国際公開第２０１０／０９７４５９号を参照）の他、公知の製造方法により得られる生体組織も、本発明に適用することが可能であり、本発明の範囲に含まれる。
【0037】
本明細書において「細胞シート」とは、複数の任意の細胞を含む細胞群を細胞培養基材上で培養し、細胞培養基材上から剥離することで得られる１層又は複数層のシート状の細胞群をいう。細胞シートを得る方法としては、例えば、温度、ｐＨ、光等の刺激によって分子構造が変化する高分子を被覆した刺激応答性培養基材上で細胞を培養し、温度、ｐＨ、光等の刺激の条件を変えて刺激応答性培養基材表面を変化させることで、細胞同士の接着状態は維持しつつ、刺激応答性培養基材から細胞をシート状に剥離する方法や、任意の培養基材上で細胞培養し、物理的にピンセット等により剥離して得る方法等が挙げられる。細胞シートを得るための刺激応答性培養基材としては、０～８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した温度応答性培養基材が知られている。温度応答性培養基材上で、ポリマーの水和力が弱い温度域で細胞を培養し、その後、培養液をポリマーの水和力が強い状態となる温度に変化させることで細胞をシート状に剥離して回収することができる。
【0038】
細胞シートを得るために用いられる温度応答性培養基材は、細胞が培養可能な温度域でその表面の水和力を変化させる基材であることが好ましい。その温度域は、一般に細胞を培養する温度、例えば３３℃～４０℃であることが好ましい。細胞シートを得るために用いられる培養基材に被覆される温度応答性高分子は、ホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。このような高分子としては、例えば、特開平２－２１１８６５号公報に記載されているポリマーが挙げられる。
【0039】
刺激応答性高分子、特に温度応答性高分子としてポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）を用いた場合を例（温度応答性培養皿）に説明する。ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）は３１℃に下限臨界溶解温度を有するポリマーとして知られ、遊離状態であれば、水中で３１℃以上の温度で脱水和を起こしポリマー鎖が凝集して白濁する。逆に３１℃未満の温度ではポリマー鎖は水和し、水に溶解した状態となる。本発明では、このポリマーがシャーレなどの基材表面に被覆されて固定されたものである。したがって、３１℃以上の温度であれば、培養基材表面のポリマーも同じように脱水和するが、ポリマー鎖が培養基材表面に固定されているため、培養基材表面が疎水性を示すようになる。逆に、３１℃未満の温度では、培養基材表面のポリマーは水和するが、ポリマー鎖が培養基材表面に被覆されているため、培養基材表面が親水性を示すようになる。このときの疎水的な表面は細胞が付着し、増殖できる適度な表面であり、また、親水的な表面は細胞が付着できない表面となる。そのため、該基材を３１℃未満に冷却すると、細胞が基材表面から剥離する。細胞が培養面一面にコンフルエントになるまで培養されていれば、該基材を３１℃未満に冷却することによって細胞シートを回収できる。温度応答性培養基材は、同一の効果を有するものであれば限定されるものではないが、例えば、セルシード社（東京、日本）が市販するＵｐＣｅｌｌ（登録商標）などを使用することができる。
【0040】
本発明の一実施態様において用いられる生体組織は、複数枚の細胞シートを積層した細胞シート（積層化細胞シート）であってもよい。積層化細胞シートを作製する方法としては、ピペット等によって培養液中に浮かんでいる細胞シートを培養液ごと吸い取り、別の培養皿の細胞シート上に放出して液流によって積層する方法や、細胞移動治具を用いて積層する方法等が挙げられる。その他、公知の方法によって積層化細胞シートを含む生体組織が得られる。
【0041】
本発明のＬＹＰＤ１タンパク質若しくはその誘導体、又はその一部、或いはそれを発現するベクター、或いはそれを発現する細胞、或いは、直接的及び／又は間接的にＬＹＰＤ１タンパク質の発現を亢進し、血管内皮ネットワークの形成（血管新生）を阻害する天然の若しくは合成された化合物又は細胞を有効成分として含有する、血管新生抑制剤又は医薬組成物は、血管新生を阻害することを可能とするものであり、治療又は予防することが可能な血管新生関連疾患としては、例えば、固形がん、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、未熟児網膜症、角膜移植拒絶反応、新生血管緑内障、紅皮症、増殖性網膜症、乾癬、血友病性関節症、アテローム性動脈硬化プラーク内の毛細血管増殖、ケロイド、創傷肉芽形成、血管癒着、関節リウマチ、骨関節炎、自己免疫疾患、クローン病、再狭窄症、アテローム性動脈硬化症、腸管癒着、潰瘍、肝硬変症、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症、臓器移植拒絶反応、腎糸球体症、糖尿病、炎症又は神経退行性疾患などが挙げられる。本発明の血管新生抑制剤又は医薬組成物を用いることによって、異常な血管新生を抑制することができ、上記疾患を治癒又は予防することが可能となる。
【0042】
また、本発明のＬＹＰＤ１タンパク質若しくはその誘導体、又はその一部、或いはそれを発現するベクター、或いはそれを発現する細胞、を有効成分として含有する、血管新生抑制剤又は医薬組成物を用いて治療又は予防できる固形がんとしては、例えば、子宮頸がん、肺がん、膵がん、非小細胞肺がん、肝がん、結腸がん、骨肉腫、皮膚がん、頭部がん、頸部がん、皮膚黒色腫、眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肝がん、脳腫瘍、膀胱がん、胃がん、肛門周囲腺がん、結腸がん、乳がん、卵管がん、子宮内膜がん、膣がん、外陰がん、ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、内分泌腺がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎がん、尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ；ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ）腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、又は脳下垂体腺腫などが挙げられる。本発明の血管新生抑制剤又は医薬組成物を用いることによって、上記固形がんの周囲に生じる血管新生を抑制し、増殖や成長に必要となる栄養や酸素を欠乏させることによって上記固形がんを治癒又は予防することが可能となる。また、上記固形がんの転移も予防する。特に、固形がんの治療において、がん細胞に直接作用することなく腫瘍に栄養を供給する血管新生を阻害する本発明の血管新生抑制剤は、がん細胞の薬物耐性を避けることができるという利点もある。
【0043】
一実施態様において、本発明のＬＹＰＤ１タンパク質若しくはその誘導体、又はその一部、或いはそれを発現するベクター、或いはそれを発現する細胞、を有効成分として含有する、血管新生抑制剤又は医薬組成物は、公知の抗がん剤又は血管新生抑制剤をさらに含んでもよく、上記疾患の治療に用いられる公知の他の治療と併用することができる。他の治療としては、化学療法、放射線治療、ホルモン治療、骨髄移植、幹細胞治療、他の生物学的治療、免疫治療などが含まれるが、これらに限定されない。
【0044】
本発明の血管新生抑制剤又は医薬組成物に含まれる他の抗がん剤の例としては、例えば、ＤＮＡアルキル化剤（メクロレタミン、クロラムブシル、フェニルアラニン、シクロホスファミド、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾトシン、ブスルファン、チオテパ、シスプラチン、カルボプラチンなど）、抗がん性抗生物質（アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、マイトマイシン、Ｃブレオマイシンなど）及び植物アルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、テニポシド、トポテカン、イリノテカンなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0045】
本発明の血管新生抑制剤又は医薬組成物に含まれる、他の血管新生抑制剤の例としては、例えば、アンギオスタチン、抗血管新生アンチトロンビンＩＩＩ、アンギオザイム、ＡＢＴ－６２７、Ｂａｙ １２－９５６６、ベネフィン、ベバシズマブ、ＢＭＳ－２７５２９１、軟骨由来阻害剤、ＣＡＩ、ＣＤ５９補体断片、ＣＥＰ－７０５５、Ｃｏｌ ３、コンブレタスタチンＡ－４、エンドスタチン（コラーゲンＸＶＩＩＩ断片）、フィブロネクチン断片、Ｇｒｏ－β、ハロフジノン、ヘパリナーゼ、ヘパリンヘキササッカライド断片、ＨＭＶ８３３、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ＩＭ－８６２、インターフェロンα／β／γ、インターフェロン誘導タンパク質（ＩＰ－１０）、インターロイキン－１２、クリングル５（プラスミノーゲン断片）、マリマスタット、デキサメタゾン、メタロプロテアーゼ阻害剤（ＴＩＭＰ）、２－メトキシエストラジオール、ＭＭＩ２７０（ＣＧＳ ２７０２３Ａ）、ＭｏＡｂ ＩＭＣ－１Ｃ１１、ネオバスタット、ＮＭ－３、パンゼム、ＰＩ－８８、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤、プラスミノーゲン活性化阻害剤、血小板因子４（ＰＦ４）、プリノマスタット、プロラクチン１６ｋＤ断片、プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）、ＰＴＫ ７８７／ＺＫ ２２２５９４、レチノイド、ソリマスタット、スクアラミン、ＳＳ ３３０４、ＳＵ ５４１６、ＳＵ６６６８、ＳＵ１１２４８、テトラヒドロコルチゾール－Ｓ、テトラチオモリブデート、サリドマイド、トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）、ＴＮＰ－４７０、形質転換成長因子－β（ＴＧＦ－β）、バスキュロスタチン、バソスタチン、ＺＤ６１２６、ＺＤ６４７４、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）、ビスホスホネート（例えば、アレンドロネート、エチドロネート、パミドロネート、リセドローネート、イバンドロネート、ゾレドロネート、オルパドロネート、インカドロネート又はネリドロネート）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0046】
５．医薬組成物を製造するための血管新生抑制剤の使用
一実施態様において、本発明の血管新生抑制剤は、血管新生関連疾患の治療又は予防するための医薬組成物を製造するために使用することができる。
一実施態様において、本発明の血管新生抑制剤は、血管新生関連疾患の治療又は予防するための医薬組成物を製造するために使用することができる。
【0047】
６．血管新生抑制剤のスクリーニング法
本発明の血管新生抑制剤はさらに、公知のスクリーニング方法を応用することによって候補物質（被験物質）の中から同定することができる。例えば、以下の工程を含む方法が挙げられる。
本発明の血管新生抑制剤はさらに、公知のスクリーニング方法を応用することによって候補物質（被験物質）の中から同定することができる。例えば、以下の工程を含む方法が挙げられる。
【0048】
（ｉ）被験物質で第１細胞を処理し、培養する工程、
（ｉｉ）前記第１細胞のＬＹＰＤ１タンパク質の発現量を検出し、未処理の第１細胞のＬＹＰＤ１タンパク質の量と比較する工程。
（ｉｉ）前記第１細胞のＬＹＰＤ１タンパク質の発現量を検出し、未処理の第１細胞のＬＹＰＤ１タンパク質の量と比較する工程。
【0049】
ＬＹＰＤ１タンパク質の発現量を検出する方法は、公知の方法を用いればよく、例えば、定量的ＰＣＲ法（ｑＰＣＲ）、ウエスタンブロット法、フローサイトメータ法（ＦＡＣＳ）、ＥＬＩＳＡ法、免疫組織化学法など、周知の技術を用いて評価することができる。
【0050】
第１細胞は、ＬＹＰＤ１タンパク質を低発現する細胞であってよく、例えば、皮膚由来、食道由来、精巣由来、肺由来又は肝臓由来の細胞、好ましくは、皮膚由来、食道由来、精巣由来、肺由来又は肝臓由来の線維芽細胞、より好ましくは皮膚由来の線維芽細胞である。
【0051】
一実施態様において、本発明の血管新生抑制剤のスクリーニング法は、さらに以下の工程を含むことができる。
【0052】
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）において、未処理の第１細胞のＬＹＰＤ１タンパク質の量よりも、ＬＹＰＤ１タンパク質の発現を亢進させる前記被験物質を選択する工程、
（ｉｖ）第２細胞と、血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞とを含む細胞群に、前記被験物質を添加し、培養する工程；
（ｖ）前記血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞によって形成させる血管内皮ネットワークを検出する工程。
（ｉｖ）第２細胞と、血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞とを含む細胞群に、前記被験物質を添加し、培養する工程；
（ｖ）前記血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞によって形成させる血管内皮ネットワークを検出する工程。
【0053】
第２細胞は、ＬＹＰＤ１を低発現する細胞（２．４×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2）と、血管網を構築する血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞（例えば、２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）と、上記（ｉｉｉ）工程で選択された被験物質とを予めインキュベートし、培養皿に播種して３７℃、５％ＣＯ2にて数日間培養し、血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞が形成する血管内皮ネットワークを顕微鏡（好ましくは蛍光顕微鏡）にて観察し、血管内皮ネットワークの長さ及び分岐点の数を評価することができる。
【0054】
第２細胞は、ＬＹＰＤ１タンパク質を低発現する細胞であってよく、例えば、皮膚由来、食道由来、精巣由来、肺由来又は肝臓由来の細胞、好ましくは、皮膚由来、食道由来、精巣由来、肺由来又は肝臓由来の線維芽細胞、より好ましくは皮膚由来の線維芽細胞である。
【0055】
血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞が形成する血管内皮ネットワークは、蛍光標識された抗ＣＤ３１抗体又は血管内皮細胞特異的抗体を用いて検出して評価してもよい。また、例えば、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質を発現する血管内皮細胞及び／又は血管内皮前駆細胞を用い、蛍光を検出することにより評価してもよい。
【実施例】
【0056】
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
【0057】
＜使用した細胞及び調整方法＞
以下の実施例中で使用した細胞は以下の通りである。
・ヒト皮膚線維芽細胞（Ｌｏｎｚａより購入。ＮＨＤＦ－Ａｄ 正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＣＣ－２５１１））
・ヒト心臓線維芽細胞（Ｌｏｎｚａより購入。ＮＨＣＦ－ａ（正常ヒト心臓線維芽細胞－心房（ＣＣ－２９０３））、ＮＨＣＦ－ｖ（正常ヒト心臓線維芽細胞－心室（ＣＣ－２９０４））
・ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Ｌｏｎｚａより購入。Ｃａｔ．＃Ｃ２５１７Ａ））
・正常ヒト心臓微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ－Ｃ）（Ｌｏｎｚａより購入。Ｃａｔ．＃ＣＣ－７０３０）
・ヒトｉＰＳ由来間質細胞：ヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞を分化誘導する際に得られる細胞群より培養皿への接着性が心筋細胞よりも高い細胞群を分取すると線維芽様の細胞が得られる。これをヒトｉＰＳ由来間質細胞とした（図１２（Ａ）参照）。ヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞への分化は、Ｍａｔｓｕｕｒａ Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｒｄｉａｃ ｃｅｌｌ ｓｈｅｅｔｓ ｕｓｉｎｇ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１２ Ａｕｇ ２４；４２５（２）：３２１－７．に記載の方法により行った。
・ヒトｉＰＳ細胞由来血管内皮細胞（ｉＰＳ－ＣＤ３１＋）は、以下を参照して、調製することにより得た（Ｗｈｉｔｅ ＭＰ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１３ Ｊａｎ；３１（１）：９２－１０３）。
・Ｃｏｓ－７細胞（国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所 JCRB細胞バンクより入手）
以下の実施例中で使用した細胞は以下の通りである。
・ヒト皮膚線維芽細胞（Ｌｏｎｚａより購入。ＮＨＤＦ－Ａｄ 正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＣＣ－２５１１））
・ヒト心臓線維芽細胞（Ｌｏｎｚａより購入。ＮＨＣＦ－ａ（正常ヒト心臓線維芽細胞－心房（ＣＣ－２９０３））、ＮＨＣＦ－ｖ（正常ヒト心臓線維芽細胞－心室（ＣＣ－２９０４））
・ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Ｌｏｎｚａより購入。Ｃａｔ．＃Ｃ２５１７Ａ））
・正常ヒト心臓微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ－Ｃ）（Ｌｏｎｚａより購入。Ｃａｔ．＃ＣＣ－７０３０）
・ヒトｉＰＳ由来間質細胞：ヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞を分化誘導する際に得られる細胞群より培養皿への接着性が心筋細胞よりも高い細胞群を分取すると線維芽様の細胞が得られる。これをヒトｉＰＳ由来間質細胞とした（図１２（Ａ）参照）。ヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞への分化は、Ｍａｔｓｕｕｒａ Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｒｄｉａｃ ｃｅｌｌ ｓｈｅｅｔｓ ｕｓｉｎｇ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１２ Ａｕｇ ２４；４２５（２）：３２１－７．に記載の方法により行った。
・ヒトｉＰＳ細胞由来血管内皮細胞（ｉＰＳ－ＣＤ３１＋）は、以下を参照して、調製することにより得た（Ｗｈｉｔｅ ＭＰ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１３ Ｊａｎ；３１（１）：９２－１０３）。
・Ｃｏｓ－７細胞（国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所 JCRB細胞バンクより入手）
【0058】
＜実施例１＞
心臓線維芽細胞は血管内皮ネットワーク形成を阻害する（図１）
ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）又は心臓線維芽細胞（心房由来：ＮＨＣＦ－ａ、心室由来：ＮＨＣＦ－ｖ）（２．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）と、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）とを３日間、５％ＣＯ２、３７℃で共培養後、抗ＣＤ３１抗体（Ｈｕｍａｎ ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ－１ ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＦＡＢ３５６７Ｐ，Ｒ＆Ｄ）で免疫染色した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｕｌｔｒａ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色画像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて抗ＣＤ３１抗体で染色された領域を血管内皮細胞として血管内皮ネットワークの長さと分枝点を算出した。
心臓線維芽細胞は血管内皮ネットワーク形成を阻害する（図１）
ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）又は心臓線維芽細胞（心房由来：ＮＨＣＦ－ａ、心室由来：ＮＨＣＦ－ｖ）（２．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）と、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）とを３日間、５％ＣＯ２、３７℃で共培養後、抗ＣＤ３１抗体（Ｈｕｍａｎ ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ－１ ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＦＡＢ３５６７Ｐ，Ｒ＆Ｄ）で免疫染色した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｕｌｔｒａ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色画像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて抗ＣＤ３１抗体で染色された領域を血管内皮細胞として血管内皮ネットワークの長さと分枝点を算出した。
【0059】
血管内皮ネットワーク形成はヒト皮膚線維芽細胞との共培養で促進されるが、ヒト心臓線維芽細胞との共培養では阻害された。
【0060】
＜実施例２＞
心臓線維芽細胞は血管内皮ネットワーク形成を阻害する（図２）
ヒト皮膚線維芽細胞又は心臓線維芽細胞（２．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）と、ｉＰＳ細胞由来血管内皮細胞（ｉＰＳ－ＣＤ３１＋）又は正常ヒト心臓微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ－Ｃ）（２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）とを３日間、５％ＣＯ２、３７℃で共培養後、抗ＣＤ３１抗体（Ｈｕｍａｎ ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ－１ ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＦＡＢ３５６７Ｐ，Ｒ＆Ｄ）で免疫染色した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｕｌｔｒａ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色画像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて抗ＣＤ３１抗体で染色された領域を血管内皮細胞として血管内皮ネットワークの長さと分枝点を算出した。
心臓線維芽細胞は血管内皮ネットワーク形成を阻害する（図２）
ヒト皮膚線維芽細胞又は心臓線維芽細胞（２．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）と、ｉＰＳ細胞由来血管内皮細胞（ｉＰＳ－ＣＤ３１＋）又は正常ヒト心臓微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ－Ｃ）（２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）とを３日間、５％ＣＯ２、３７℃で共培養後、抗ＣＤ３１抗体（Ｈｕｍａｎ ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ－１ ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＦＡＢ３５６７Ｐ，Ｒ＆Ｄ）で免疫染色した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｕｌｔｒａ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色画像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて抗ＣＤ３１抗体で染色された領域を血管内皮細胞として血管内皮ネットワークの長さと分枝点を算出した。
【0061】
ヒトｉＰＳ由来血管内皮細胞やヒト心臓微小血管内皮細胞の血管内皮ネットワーク形成でもヒト皮膚線維芽細胞との共培養による促進、ヒト心臓線維芽細胞との共培養による阻害がみられた。
【0062】
＜実施例３＞
心臓線維芽細胞は血管内皮ネットワーク形成を阻害する（図３）
マウス皮膚線維芽細胞又は心臓線維芽細胞（６×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）と、マウスＥＳ細胞由来心筋細胞（２．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）と、マウスＥＳ細胞由来血管内皮細胞（２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）とを３日間、５％ＣＯ２、３７℃で共培養後、抗ＣＤ３１抗体（ＰＥ Ｒａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＣＤ３１，５５３３７３，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で免疫染色した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｕｌｔｒａ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色画像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて抗ＣＤ３１抗体で染色された領域を血管内皮細胞として血管内皮ネットワークの長さと分枝点を算出した。
心臓線維芽細胞は血管内皮ネットワーク形成を阻害する（図３）
マウス皮膚線維芽細胞又は心臓線維芽細胞（６×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）と、マウスＥＳ細胞由来心筋細胞（２．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）と、マウスＥＳ細胞由来血管内皮細胞（２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）とを３日間、５％ＣＯ２、３７℃で共培養後、抗ＣＤ３１抗体（ＰＥ Ｒａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＣＤ３１，５５３３７３，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で免疫染色した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｕｌｔｒａ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色画像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて抗ＣＤ３１抗体で染色された領域を血管内皮細胞として血管内皮ネットワークの長さと分枝点を算出した。
【0063】
マウスＥＳ細胞由来血管内皮細胞の血管内皮ネットワーク形成はマウス皮膚線維芽細胞の存在下で促進されるが、マウス心臓線維芽細胞の存在下では阻害された。
【0064】
＜実施例４＞
心臓線維芽細胞は血管内皮ネットワーク形成を阻害する（図４）
ＳＤラット（Ｊｃｌ：ＳＤ、三共ラボ、日本）より採取したプライマリーの新生仔ラット皮膚線維芽細胞（ＲＤＦ）又は心臓線維芽細胞（ＲＣＦ）（２．４×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2）と、ラット新生仔心臓由来血管内皮細胞（２．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2）とを３日間、５％ＣＯ2、３７℃で共培養後、抗ＣＤ３１抗体（Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ Ｒａｔ ＣＤ３１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＭＣＡ１３３４Ｇ，Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で免疫染色した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｕｌｔｒａ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色画像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて抗ＣＤ３１抗体で染色された領域を血管内皮細胞として血管内皮ネットワークの長さと分枝点を算出した。
心臓線維芽細胞は血管内皮ネットワーク形成を阻害する（図４）
ＳＤラット（Ｊｃｌ：ＳＤ、三共ラボ、日本）より採取したプライマリーの新生仔ラット皮膚線維芽細胞（ＲＤＦ）又は心臓線維芽細胞（ＲＣＦ）（２．４×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2）と、ラット新生仔心臓由来血管内皮細胞（２．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2）とを３日間、５％ＣＯ2、３７℃で共培養後、抗ＣＤ３１抗体（Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ Ｒａｔ ＣＤ３１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＭＣＡ１３３４Ｇ，Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で免疫染色した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｕｌｔｒａ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色画像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて抗ＣＤ３１抗体で染色された領域を血管内皮細胞として血管内皮ネットワークの長さと分枝点を算出した。
【0065】
血管内皮ネットワーク形成はラット皮膚線維芽細胞との共培養で促進されるが、ラット心臓線維芽細胞との共培養では阻害された。
【0066】
＜実施例５＞
皮膚線維芽細胞と心臓線維芽細胞の遺伝子発現比較（図５）
ヒト皮膚線維芽細胞及び心臓線維芽細胞（心房由来及び心室由来）よりトータルＲＮＡを抽出し遺伝子発現をマイクロアレイで解析した（ＤＮＡチップ研究所（日本）へ委託）。糖タンパク質関連遺伝子及び血管新生関連遺伝子についてヒートマップを示した（図５）。
皮膚線維芽細胞と心臓線維芽細胞の遺伝子発現比較（図５）
ヒト皮膚線維芽細胞及び心臓線維芽細胞（心房由来及び心室由来）よりトータルＲＮＡを抽出し遺伝子発現をマイクロアレイで解析した（ＤＮＡチップ研究所（日本）へ委託）。糖タンパク質関連遺伝子及び血管新生関連遺伝子についてヒートマップを示した（図５）。
【0067】
ヒト皮膚線維芽細胞及び心臓線維芽細胞における遺伝子発現パターンは大きく異なっていた。アレイの結果を元に候補分子のスクリーニングを行い、心臓線維芽細胞に高発現する血管新生抑制因子ＬＹＰＤ１（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ受入番号：ＮＭ＿１４４５８６．６、配列番号１）を同定した。
【0068】
＜実施例６＞
ＬＹＰＤ１はラット心臓間質に発現する（図６）
ラット由来の各臓器におけるＬＹＰＤ１の発現をｑＰＣＲで評価した。ラット各臓器よりトータルＲＮＡを抽出し、トータルＲＮＡ画分に含まれるｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、ｑＰＣＲの鋳型とした。ｑＰＣＲはＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ｒｎ０１２９５７０１＿ｍ１，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて比較ＣＴ法により行った（図６（Ａ））。ラット由来の各臓器におけるＬＹＰＤ１の発現を評価したところ心臓で高発現していた。
ＬＹＰＤ１はラット心臓間質に発現する（図６）
ラット由来の各臓器におけるＬＹＰＤ１の発現をｑＰＣＲで評価した。ラット各臓器よりトータルＲＮＡを抽出し、トータルＲＮＡ画分に含まれるｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、ｑＰＣＲの鋳型とした。ｑＰＣＲはＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ｒｎ０１２９５７０１＿ｍ１，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて比較ＣＴ法により行った（図６（Ａ））。ラット由来の各臓器におけるＬＹＰＤ１の発現を評価したところ心臓で高発現していた。
【0069】
図６（Ｂ）はラット心臓組織の免疫染色画像を示す。抗ｃＴｎＴ（ｃａｒｄｉａｃ Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ抗体（Ａｎｔｉ－Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ，Ｃａｒｄｉａｃ Ｉｓｏｆｏｒｍ，Ｍｏｕｓｅ－Ｍｏｎｏ（１３－１１），ＡＢ－１，ＭＳ－２９５－Ｐ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））、抗ＬＹＰＤ１抗体（ａｂ１５７５１６，ａｂｃａｍ）及びＤＡＰＩ（核）を染色した。
【0070】
ラット心臓組織における発現を免疫染色により評価したところ、ｃａｒｄｉａｃ Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ陽性の心筋細胞とは共染されず、心臓間質に発現していた。
【0071】
＜実施例７＞
ヒト及びラット初代培養細胞におけるＬＹＰＤ１の遺伝子発現比較（図７）
ヒト及び新生仔ラット由来の皮膚線維芽細胞及び心臓線維芽細胞におけるＬＹＰＤ１の発現をｑＰＣＲで評価した。各細胞よりトータルＲＮＡを抽出し、トータルＲＮＡ画分に含まれるｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成しｑＰＣＲの鋳型とした。ｑＰＣＲはＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ｈｓ００３７５９９１＿ｍ１（ｈｕｍａｎ），Ｒｎ０１２９５７０１＿ｍ１（ｒａｔ），Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて比較ＣＴ法により行った。
ヒト及びラット初代培養細胞におけるＬＹＰＤ１の遺伝子発現比較（図７）
ヒト及び新生仔ラット由来の皮膚線維芽細胞及び心臓線維芽細胞におけるＬＹＰＤ１の発現をｑＰＣＲで評価した。各細胞よりトータルＲＮＡを抽出し、トータルＲＮＡ画分に含まれるｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成しｑＰＣＲの鋳型とした。ｑＰＣＲはＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ｈｓ００３７５９９１＿ｍ１（ｈｕｍａｎ），Ｒｎ０１２９５７０１＿ｍ１（ｒａｔ），Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて比較ＣＴ法により行った。
【0072】
ヒト及び新生仔ラット由来の皮膚線維芽細胞ではＬＹＰＤ１はほとんど検出されなかったが、心臓線維芽細胞では高発現していた。
【0073】
＜実施例８＞
血管ネットワーク形成はＬＹＰＤ１の阻害により回復する（図８）
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてヒト心臓線維芽細胞にＬＹＰＤ１に対するｓｉＲＮＡ（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ ｓｉＲＮＡ，Ｃａｔ．＃４３９２４２０，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（１ｎＭ）又はコントロールＳｉＲＮＡ（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｎｏ．２ ｓｉＲＮＡ，Ｃａｔ．＃４３９０８４６）（１ｎＭ）を導入し２日間培養した後、ｓｉＲＮＡを導入したヒト心臓線維芽細胞（２．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）とＨＵＶＥＣ（２．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2）とを３日間、５％ＣＯ2、３７℃で共培養し、抗ＣＤ３１抗体（Ｈｕｍａｎ ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ－１ ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＦＡＢ３５６７Ｐ，Ｒ＆Ｄ）で免疫染色した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｕｌｔｒａ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色画像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて抗ＣＤ３１抗体で染色された領域を血管内皮細胞として血管内皮ネットワークの長さを算出した。
血管ネットワーク形成はＬＹＰＤ１の阻害により回復する（図８）
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてヒト心臓線維芽細胞にＬＹＰＤ１に対するｓｉＲＮＡ（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ ｓｉＲＮＡ，Ｃａｔ．＃４３９２４２０，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（１ｎＭ）又はコントロールＳｉＲＮＡ（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｎｏ．２ ｓｉＲＮＡ，Ｃａｔ．＃４３９０８４６）（１ｎＭ）を導入し２日間培養した後、ｓｉＲＮＡを導入したヒト心臓線維芽細胞（２．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）とＨＵＶＥＣ（２．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2）とを３日間、５％ＣＯ2、３７℃で共培養し、抗ＣＤ３１抗体（Ｈｕｍａｎ ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ－１ ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＦＡＢ３５６７Ｐ，Ｒ＆Ｄ）で免疫染色した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｕｌｔｒａ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色画像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて抗ＣＤ３１抗体で染色された領域を血管内皮細胞として血管内皮ネットワークの長さを算出した。
【0074】
ＬＹＰＤ１に対するｓｉＲＮＡの配列は以下の配列を使用することができる。
５’－ＧＧＣＵＵＵＧＣＧＣＵＧＣＡＡＡＵＣＣ－３’（配列番号１５）
５’－ＧＧＡＵＵＵＧＣＡＧＣＧＣＡＡＡＧＣＣ－３’（配列番号１６）
５’－ＧＧＣＵＵＵＧＣＧＣＵＧＣＡＡＡＵＣＣ－３’（配列番号１５）
５’－ＧＧＡＵＵＵＧＣＡＧＣＧＣＡＡＡＧＣＣ－３’（配列番号１６）
【0075】
本実施例においては、よりｓｉＲＮＡの安定性を高めるために、以下の配列を用いた。
【表1】
【0076】
ｓｉＲＮＡによりＬＹＰＤ１の発現を抑制したヒト心臓線維芽細胞ではＬＹＰＤ１による血管新生抑制効果が阻害され、共培養したＨＵＶＥＣの血管ネットワーク形成がみられた（図８（Ｂ）～（Ｄ）参照）。
【0077】
＜実施例９＞
血管ネットワーク形成はＬＹＰＤ１の阻害により回復する（図９）
ヒト心臓線維芽細胞（２．４×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2）とＨＵＶＥＣ（２．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2）とを抗ＬＹＰＤ１抗体（５μｇ／ｍＬ）（ａｂ１５７５１６，ａｂｃａｍ）存在下又はコントロール抗体の存在下（５μｇ／ｍＬ）（正常ウサギＩｇＧ、Ｗａｋｏ、日本、Ｃａｔ．＃１４８－０９５５１）にて４日間、５％ＣＯ2、３７℃で共培養後、抗ＣＤ３１抗体（Ｈｕｍａｎ ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ－１ ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＦＡＢ３５６７Ｐ，Ｒ＆Ｄ）で免疫染色した（図９（Ａ）及び（Ｂ））。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｕｌｔｒａ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色画像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて、抗ＣＤ３１抗体で染色された領域を血管内皮細胞として血管内皮ネットワークの長さと分枝点を算出した（図９（Ｃ）及び（Ｄ））。
血管ネットワーク形成はＬＹＰＤ１の阻害により回復する（図９）
ヒト心臓線維芽細胞（２．４×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2）とＨＵＶＥＣ（２．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2）とを抗ＬＹＰＤ１抗体（５μｇ／ｍＬ）（ａｂ１５７５１６，ａｂｃａｍ）存在下又はコントロール抗体の存在下（５μｇ／ｍＬ）（正常ウサギＩｇＧ、Ｗａｋｏ、日本、Ｃａｔ．＃１４８－０９５５１）にて４日間、５％ＣＯ2、３７℃で共培養後、抗ＣＤ３１抗体（Ｈｕｍａｎ ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ－１ ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＦＡＢ３５６７Ｐ，Ｒ＆Ｄ）で免疫染色した（図９（Ａ）及び（Ｂ））。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｕｌｔｒａ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色画像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて、抗ＣＤ３１抗体で染色された領域を血管内皮細胞として血管内皮ネットワークの長さと分枝点を算出した（図９（Ｃ）及び（Ｄ））。
【0078】
ＬＹＰＤ１に対する抗体の存在下では、ヒト心臓線維芽細胞に発現するＬＹＰＤ１による血管新生抑制効果が阻害され、共培養したＨＵＶＥＣの血管ネットワーク形成がみられた。
【0079】
＜実施例１０＞
血管ネットワーク形成はＬＹＰＤ１の阻害により回復する（図１０）
ラット新生仔心臓線維芽細胞（２．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）とラット新生仔心臓由来血管内皮細胞（２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）とをＬＹＰＤ１抗体（ａｂ１５７５１６，ａｂｃａｍ）存在下（５μｇ／ｍＬ）又はコントロール抗体の存在下（５μｇ／ｍＬ）（正常ウサギＩｇＧ、Ｗａｋｏ、日本、Ｃａｔ．＃１４８－０９５５１）にて４日間、５％ＣＯ２、３７℃で共培養後、抗ＣＤ３１抗体（Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ Ｒａｔ ＣＤ３１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＭＣＡ１３３４Ｇ，Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で免疫染色した（図１０（Ａ）及び（Ｂ））。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｕｌｔｒａ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色画像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて抗ＣＤ３１抗体で染色された領域を血管内皮細胞として血管内皮ネットワークの長さと分枝点を算出した（図１０（Ｃ）及び（Ｄ））。
血管ネットワーク形成はＬＹＰＤ１の阻害により回復する（図１０）
ラット新生仔心臓線維芽細胞（２．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）とラット新生仔心臓由来血管内皮細胞（２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）とをＬＹＰＤ１抗体（ａｂ１５７５１６，ａｂｃａｍ）存在下（５μｇ／ｍＬ）又はコントロール抗体の存在下（５μｇ／ｍＬ）（正常ウサギＩｇＧ、Ｗａｋｏ、日本、Ｃａｔ．＃１４８－０９５５１）にて４日間、５％ＣＯ２、３７℃で共培養後、抗ＣＤ３１抗体（Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ Ｒａｔ ＣＤ３１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＭＣＡ１３３４Ｇ，Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で免疫染色した（図１０（Ａ）及び（Ｂ））。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｕｌｔｒａ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色画像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて抗ＣＤ３１抗体で染色された領域を血管内皮細胞として血管内皮ネットワークの長さと分枝点を算出した（図１０（Ｃ）及び（Ｄ））。
【0080】
ＬＹＰＤ１に対する抗体の存在下ではラット心臓線維芽細胞に発現するＬＹＰＤ１による血管新生抑制効果が阻害され、共培養したラット心臓由来血管内皮細胞の血管ネットワーク形成がみられた。
【0081】
＜実施例１１＞
ｉＰＳ由来間質細胞は心臓線維芽細胞と同一のクラスターに分類される（図１１）
ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）及びヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦ）、ヒトｉＰＳ由来間質細胞、ヒト間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ．＃ＰＴ－２５０１）における遺伝子発現をマイクロアレイで解析しクラスタリングした。ｉＰＳ由来間質細胞は心臓線維芽細胞と同一のクラスターに分類された。
ｉＰＳ由来間質細胞は心臓線維芽細胞と同一のクラスターに分類される（図１１）
ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）及びヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦ）、ヒトｉＰＳ由来間質細胞、ヒト間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ．＃ＰＴ－２５０１）における遺伝子発現をマイクロアレイで解析しクラスタリングした。ｉＰＳ由来間質細胞は心臓線維芽細胞と同一のクラスターに分類された。
【0082】
＜実施例１２＞
ｉＰＳ由来間質細胞はｉＰＳ ＣＤ３１陽性細胞の血管内皮ネットワーク形成を阻害する（図１２）
ヒトｉＰＳ由来間質細胞をヒトｉＰＳ ＣＤ３１陽性細胞と共培養後、抗ＣＤ３１抗体（Ｈｕｍａｎ ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ－１ ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＦＡＢ３５６７Ｐ，Ｒ＆Ｄ）で免疫染色した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｕｌｔｒａ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色画像を取得した（図１２（Ｂ））。
ｉＰＳ由来間質細胞はｉＰＳ ＣＤ３１陽性細胞の血管内皮ネットワーク形成を阻害する（図１２）
ヒトｉＰＳ由来間質細胞をヒトｉＰＳ ＣＤ３１陽性細胞と共培養後、抗ＣＤ３１抗体（Ｈｕｍａｎ ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ－１ ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＦＡＢ３５６７Ｐ，Ｒ＆Ｄ）で免疫染色した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｕｌｔｒａ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色画像を取得した（図１２（Ｂ））。
【0083】
ヒトｉＰＳ ＣＤ３１陽性細胞の血管内皮ネットワーク形成はヒト皮膚線維芽細胞との共培養で促進されるが、ヒトｉＰＳ由来間質細胞との共培養では阻害された。
【0084】
ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）、ヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦａ）及びヒトｉＰＳ由来間質細胞（ｉＰＳ ｆｉｂｒｏ－ｌｉｋｅ）のＬＹＰＤ１の発現をｑＰＣＲで評価した。各細胞よりトータルＲＮＡを抽出し、トータルＲＮＡ画分に含まれるｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成しｑＰＣＲの鋳型とした。ｑＰＣＲはＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ｈｓ００３７５９９１＿ｍ１，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて比較ＣＴ法により行った（図１２（Ｃ））。
【0085】
ヒトｉＰＳ由来間質細胞はヒト心臓線維芽細胞と同様、ＬＹＰＤ１の発現が高かった。
【0086】
＜実施例１３＞
組換えＬＹＰＤ１発現及び精製、並びに血管内皮ネットワークの阻害効果の確認
ヒトＬＹＰＤ１ ｃＤＮＡ配列をコードするタンパク質を、公表された配列データに従って選択した。シグナル配列の後に挿入されたＦＬＡＧ配列を有するヒトＬＹＰＤ１を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）によって合成し、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（以下、「ｐＦＬＡＧ－ＬＹＰＤ１」という。）に挿入した。
組換えＬＹＰＤ１発現及び精製、並びに血管内皮ネットワークの阻害効果の確認
ヒトＬＹＰＤ１ ｃＤＮＡ配列をコードするタンパク質を、公表された配列データに従って選択した。シグナル配列の後に挿入されたＦＬＡＧ配列を有するヒトＬＹＰＤ１を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）によって合成し、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（以下、「ｐＦＬＡＧ－ＬＹＰＤ１」という。）に挿入した。
【0087】
ＣＯＳ－７細胞を、１０％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で維持培養した。ｐＦＬＡＧ－ＬＹＰＤ１を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の指示に従ってＣＯＳ－７細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をＲＩＰＡ緩衝液（Ｗａｋｏ、日本）で溶解した。
【0088】
ＦＬＡＧ－ＬＹＰＤ１タンパク質を、抗ＤＹＫＤＤＤＤＫタグ抗体磁気ビーズ（Ｗａｋｏ、日本）を用いて４℃で３時間免疫沈降させた。続いてビーズをＲＩＰＡ緩衝液で３回洗浄し、ＦＬＡＧ－ＬＹＰＤ１タンパク質を、ＤＹＫＤＤＤＤＫペプチド（Ｗａｋｏ、日本）を添加することによってビーズから溶出させた。溶出液を１２．５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）にブロットした。
【0089】
ＦＬＡＧ－ＬＹＰＤ１タンパク質を、ペルオキシダーゼ結合－抗ＤＹＫＤＤＤＤＫタグモノクローナル抗体（Ｗａｋｏ、日本）及びウサギポリクローナル抗ＬＹＰＤ１抗体（ａｂｃａｍ）を用いて検出した。
【0090】
ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．、英国）を製造者の指示に従って使用し、バンドを可視化し、ｄｉｇｉｔａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（ＬＡＳ３０００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ）によって検出した。標準としてウシ血清アルブミンを用いて、クーマシー（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）プロテインアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州、米国）によりタンパク質収量を測定した（図１３Ａ）。
【0091】
ヒト皮膚線維芽細胞（２．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）とＨＵＶＥＣ（２．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2）を混合した細胞群に、ＦＬＡＧ－ＬＹＰＤ１タンパク質（１．２５μｇ／ｍＬ）又はコントロールＩｇＧ（１．２５μｇ／ｍＬ、正常ウサギＩｇＧ、Ｗａｋｏ、日本、Ｃａｔ．＃１４８－０９５５１）を添加し、１０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地（５％ＣＯ２、３７℃）で培養した。抗ＣＤ３１抗体（Ｈｕｍａｎ ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ－１ ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＦＡＢ３５６７Ｐ，Ｒ＆Ｄ）で免疫染色した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｕｌｔｒａ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色画像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて抗ＣＤ３１抗体で染色された領域を血管内皮細胞として血管内皮ネットワークの長さを算出した。
【0092】
その結果、リコンビナントＬＹＰＤ１タンパク質を添加することによって、血管内皮ネットワーク形成が阻害されることが明らかとなった（図１３Ｂ及びＣ）。
【0093】
＜実施例１４＞
心臓線維芽細胞による血管新生抑制作用は、血管内皮細胞数に依存しない（図１４）
ヒト心房由来線維芽細胞（ＮＨＣＦ－ａ）（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２及び６×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）と、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（２．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）とを３日間、５％ＣＯ２、３７℃で共培養後、抗ＣＤ３１抗体（Ｈｕｍａｎ ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ－１ ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＦＡＢ３５６７Ｐ，Ｒ＆Ｄ）で免疫染色し、Ｈｏｅｃｈｓｔで核を染色した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｕｌｔｒａ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色像及び、Ｈｏｅｃｈｓｔの蛍光像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて抗ＣＤ３１抗体で染色された領域を血管内皮細胞として血管内皮ネットワークの長さと分枝点を算出した（図１４（Ａ）及び（Ｂ））。
心臓線維芽細胞による血管新生抑制作用は、血管内皮細胞数に依存しない（図１４）
ヒト心房由来線維芽細胞（ＮＨＣＦ－ａ）（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２及び６×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）と、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（２．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）とを３日間、５％ＣＯ２、３７℃で共培養後、抗ＣＤ３１抗体（Ｈｕｍａｎ ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ－１ ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＦＡＢ３５６７Ｐ，Ｒ＆Ｄ）で免疫染色し、Ｈｏｅｃｈｓｔで核を染色した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｕｌｔｒａ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＤ３１染色像及び、Ｈｏｅｃｈｓｔの蛍光像を取得し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）を用いて抗ＣＤ３１抗体で染色された領域を血管内皮細胞として血管内皮ネットワークの長さと分枝点を算出した（図１４（Ａ）及び（Ｂ））。
【0094】
心臓線維芽細胞による血管新生抑制作用は、血管内皮細胞数に依存しないことが明らかとなった。
【0095】
＜実施例１５＞
マトリゲル（登録商標）チューブ形成アッセイによる組換えＬＹＰＤ１の血管内皮ネットワーク形成の阻害効果の確認（図１５）
実施例１３と同様の方法によって得られた組換えＬＹＰＤ１タンパク質を本実験に用いた。
マトリゲル（登録商標）チューブ形成アッセイによる組換えＬＹＰＤ１の血管内皮ネットワーク形成の阻害効果の確認（図１５）
実施例１３と同様の方法によって得られた組換えＬＹＰＤ１タンパク質を本実験に用いた。
【0096】
成長因子を減らしたマトリゲル（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でプレコーティングした９６ウェルプレートのウェルに、ＨＵＶＥＣ（１．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2）を播種し、ＥＧＭ－２培地（Ｌｏｎｚａ）を用いて組換えＬＹＰＤ１タンパク質の非存在下（コントロール）又は存在下（１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ又は５μｇ／ｍＬ）で２０時間培養した（５％ＣＯ２、３７℃）。その後、光学顕微鏡を用いて、チューブ形成の様子を観察した（図１５）。
【0097】
その結果、組換えＬＹＰＤ１タンパク質は、ＨＵＶＥＣに直接作用し、量依存的に血管内皮ネットワーク形成を阻害できることが明らかとなった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】