(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-07-21
(45)【発行日】2023-07-31
(54)【発明の名称】ネオアンチゲン特異的なＴ細胞受容体配列を単離する方法
(51)【国際特許分類】
C07K 14/725 20060101AFI20230724BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230724BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20230724BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20230724BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230724BHJP
A61P 35/00 20060101ALN20230724BHJP
A61P 35/02 20060101ALN20230724BHJP
A61K 31/7088 20060101ALN20230724BHJP
A61K 39/395 20060101ALN20230724BHJP
【ＦＩ】
C07K14/725
C12N5/10
C12Q1/68
C12N15/09 Z
C12N15/12 ZNA
A61P35/00
A61P35/02
A61K31/7088
A61K39/395 D
A61K39/395 N
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2019553512
(86)(22)【出願日】2018-03-28
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-04-23
(86)【国際出願番号】 US2018024828
(87)【国際公開番号】W WO2018183485
(87)【国際公開日】2018-10-04
【審査請求日】2021-03-26
(31)【優先権主張番号】62/479,398
(32)【優先日】2017-03-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】510002280
【氏名又は名称】アメリカ合衆国
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(72)【発明者】
【氏名】ルー、ヨン－チェン
(72)【発明者】
【氏名】フィッツジェラルド、ピーター
(72)【発明者】
【氏名】ジェン、ジリ
(72)【発明者】
【氏名】ローゼンバーグ、スティーヴン エー．
【審査官】千葉 直紀
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／０５３３３８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Clin Cancer Res，2017年，vol.23, no.10，p.2491-2505，Published OnlineFirst November 8, 2016
【文献】Nat Methods，2016年，vol.13, no.4，p.329-332
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｑ １／００－３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
対を成すＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及びベータ鎖の配列、又はその抗原結合部分の配列を単離する方法であって、（ａ）生体試料から、がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞を単離する工程；
（ｂ）単離されたＴ細胞を、変異したアミノ酸配列を提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）と共培養する工程であって、それによりＴ細胞は１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現する工程；
（ｃ）共培養されたＴ細胞を分取して分離した単一のＴ細胞試料とする工程；
（ｄ）各々の分離した単一のＴ細胞試料からｍＲＮＡを単離する工程；
（ｅ）各々の分離した単一のＴ細胞試料からｍＲＮＡを配列決定する工程であって、ここで該配列決定は：
（ｉ）ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、該ｃＤＮＡを増幅する工程；
（ｉｉ）増幅された該ｃＤＮＡの多様な断片を作製し、該多様な断片にタグを付す工程；
（ｉｉｉ）タグが付された該ｃＤＮＡの多様な断片を増幅する工程；及び
（ｉｖ）増幅され、タグが付された該ｃＤＮＡの多様な断片を配列決定する工程であって；ここで配列決定は、ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を同定する工程；
（ｆ）ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーの既知の配列に対してアラインメントして、どの単一のＴ細胞試料が、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現する単一のＴ細胞を含むかを同定する工程；
（ｇ）ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を、参照ＴＣＲ配列データベースに対してアラインメントして、（ｆ）で１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現すると同定された、各々の分離した単一のＴ細胞試料のｃＤＮＡの多様な断片の、ＴＣＲアルファ鎖の可変（Ｖ）セグメント配列とＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列を同定する工程、
（ｈ）（ｇ）で同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内と、（ｇ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内の、ＴＣＲ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を同定する工程；
（ｉ）同じアルファ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数と、同じベータ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数を計測する工程；
（ｊ）同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、同じベータ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、及び任意選択で、同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片を採取し、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＣＤＲ３配列を同定する工程であって、ここで２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列は、最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列とは異なる工程；
（ｋ）（ｊ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列、（ｊ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列、及び任意選択で、（ｊ）で採取された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列を同定し、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＶセグメント配列を同定する工程；並びに
（ｌ）（ｋ）で同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列と（ｊ）で採取されたＴＣＲアルファ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲアルファ鎖、及び
（ｋ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列と（ｊ）で採取されたＴＣＲベータ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲベータ鎖、
をコードする１つ以上のヌクレオチド配列をアセンブリングし、
任意選択で、（ｋ）で同定された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列と（ｊ）で採取された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＣＤＲ３配列を含む第２のＴＣＲアルファ鎖、及び、
（ｋ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列と（ｊ）で採取されたＴＣＲベータ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲベータ鎖、
をコードする１つ以上の第２のヌクレオチド配列をアセンブリングし、
単離され、対を成すＴＣＲアルファ及びベータ鎖配列、又はその抗原結合部分の配列を作製する工程、
を含む方法。
【請求項2】
１つ以上のＴ細胞活性化マーカーが、インターフェロン（ＩＦＮ）－γ、インターロイキン（ＩＬ）－２、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ１０７ａ、グランザイムＢ、顆粒球／単球コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、及びＩＬ－２２の１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
各々の分離した単一のＴ細胞試料に由来するｍＲＮＡを、各々の分離した単一のＴ細胞試料に対する異なるタグによりラベル化する工程をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
（ｈ）が、アルファとベータ鎖のＶセグメントによりコードされるアミノ酸配列のＣ末端近傍に位置する、保存されたアミノ酸残基をコードするｃＤＮＡ配列を同定することにより、ＴＣＲ ＣＤＲ３配列を同定する工程を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
（ｋ）が、（ｊ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖の定常（Ｃ）領域配列と、（ｊ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲベータ鎖のＣ領域配列を同定する工程、をさらに含む請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
（ｌ）が、（ｋ）で同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列、（ｋ）で同定されたＴＣＲアルファ鎖のＣ領域配列、及び（ｊ）で採取されたＴＣＲアルファ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲアルファ鎖をアセンブリングする工程、並びに、（ｋ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列、（ｋ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＣ領域配列、及び（ｊ）で採取されたＴＣＲベータ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲベータ鎖をアセンブリングする工程、を含む請求項５に記載の方法。
【請求項7】
（ｌ）が、（ｋ）で同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列、外因性のＴＣＲアルファ鎖のＣ領域配列、及び（ｊ）で採取されたＴＣＲアルファ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲアルファ鎖をアセンブリングする工程、並びに、（ｋ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列、外因性のＴＣＲベータ鎖のＣ領域配列、及び（ｊ）で採取されたＴＣＲベータ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲベータ鎖をアセンブリングする工程、を含む請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
使用者のコンピューター装置において、（ｆ）で同定された単一のＴ細胞のｃＤＮＡの多様な断片の配列を受け取る工程をさらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法であって；ここで（ｇ）は、ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を、参照ＴＣＲ配列データベースに対してコンピューター化されたアラインメントをして、（ｆ）で同定された単一のＴ細胞のｃＤＮＡの多様な断片の、ＴＣＲアルファ鎖の可変（Ｖ）セグメント配列とＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列を同定する工程を含み；
ここで（ｈ）は、（ｇ）で同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内と（ｇ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内の、ＴＣＲ ＣＤＲ３配列のコンピューター化された同定を行う工程を含み；
ここで（ｉ）は、同じアルファ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数と、同じベータ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数のコンピューター化された計測を行う工程を含み；
ここで（ｊ）は、同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、同じベータ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、及び任意選択で、同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片、のコンピューター化された採取を行い、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＣＤＲ３配列を同定する工程であって、ここで２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列は、最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列とは異なる工程を含み；及び
ここで（ｋ）は、（ｊ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列、（ｊ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列、及び任意選択で、（ｊ）で採取された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列のコンピューター化された同定を行い、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＶセグメント配列を同定する工程を含む、
方法。
【請求項9】
対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖又はその抗原結合部分を発現する細胞集団を調製する方法であって、該方法は、請求項１～８のいずれか１項の方法により、対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖の配列又はその抗原結合部分の配列を単離する工程、及び
単離された、対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖の配列又はその抗原結合部分の配列をコードするヌクレオチドを、宿主細胞内に導入し、対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖又はその抗原結合部分を発現する細胞を得る工程、
を含む方法。
【請求項10】
対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖又はその抗原結合部分を発現する宿主細胞の数を増大させる工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
がん特異的な変異によりコードされる、変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファとベータ鎖のＶセグメント配列とＴＣＲのＣＤＲ３配列を自動的に同定する方法であって、該方法は、（ａ）使用者のコンピューター装置において、ｃＤＮＡの多様な断片の配列を受け取る工程であって、ここで該ｃＤＮＡは単一のＴ細胞により、該Ｔ細胞と変異したアミノ酸配列を提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）との共培養に続いて作製されるｍＲＮＡによりコードされ、それによって該Ｔ細胞は１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現する工程；
（ｂ）ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を、参照ＴＣＲ配列データベースに対してコンピューター化されたアラインメントをして、ｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖の可変（Ｖ）セグメント配列とＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列を同定する工程；
（ｃ）（ｂ）において同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内の、及び、（ｂ）において同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内の、ＴＣＲ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列のコンピューター化された同定を行う工程；
（ｄ）同じアルファ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数と、同じベータ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数、のコンピューター化された計測を行う工程；
（ｅ）同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、同じベータ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、及び任意選択で、同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のコンピューター化された採取を行い、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＣＤＲ３配列を同定する工程であって、ここで２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列は、最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列と異なる工程；並びに
（ｆ）（ｅ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列、（ｅ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列、及び任意選択で、（ｅ）で採取された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列のコンピューター化された同定を行い、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＶセグメント配列を同定する工程；
を含む方法。
【請求項12】
（ｃ）が、アルファとベータ鎖のＶセグメントによりコードされるアミノ酸配列のＣ末端の近傍に位置する、保存されたアミノ酸残基をコードするｃＤＮＡ配列を同定することにより、ＴＣＲのＣＤ３配列を同定する工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
保存されたアミノ酸残基がＹＸ１ＣＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２(配列番号５)
のアミノ酸配列を含み、
ここで：
Ｘ１-Ｘ９の各々は任意の天然由来のアミノ酸であり、
Ｘ１０-Ｘ２１の各々はアミノ酸がないか又は任意の天然由来のアミノ酸であり、及び、
Ｘ２２はフェニルアラニン又はトリプトファンである、
請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
（ｆ）は、（ｅ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖の定常（Ｃ）領域配列と、（ｅ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲベータ鎖のＣ領域配列、のコンピューター化された同定を行う工程をさらに含む、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願に関する相互参照
本特許出願は、２０１７年３月３１日に出願された米国仮特許出願番号６２/４７９，３９８の利益を主張するものであり、それは参照により組み込まれる。
本特許出願は、２０１７年３月３１日に出願された米国仮特許出願番号６２/４７９，３９８の利益を主張するものであり、それは参照により組み込まれる。
【0002】
連邦に支援された研究と開発に関する記載
本発明はアメリカ国立衛生研究所、全米がん研究所により与えられた、プロジェクト番号ZIABC010985の下における政府支援により行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
本発明はアメリカ国立衛生研究所、全米がん研究所により与えられた、プロジェクト番号ZIABC010985の下における政府支援により行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【0003】
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本明細書に全体として参照により組み込まれるのは、本明細書と同時に提出され、下記：２０１８年３月２２日付けの”737921 SeqListing_ST25.txt”と名付けられた１つの５，５３０バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル、より同定される、コンピューター読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸の配列表である。
本明細書に全体として参照により組み込まれるのは、本明細書と同時に提出され、下記：２０１８年３月２２日付けの”737921 SeqListing_ST25.txt”と名付けられた１つの５，５３０バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル、より同定される、コンピューター読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸の配列表である。
【背景技術】
【0004】
発明の背景
がん抗原（例えばネオアンチゲン）特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝的に加工されている細胞を使用する養子細胞療法（ＡＣＴ）は、一部のがん患者においてポシティブな臨床応答を奏することができる。それにも関わらず、がんと他の疾患を幅広く治療するためにＴＣＲが加工された細胞を成功裏に使用するためには障害が残っている。例えばがん抗原（例えばネオアンチゲン）を特異的に認識するＴＣＲの同定及び／又は患者からの単離は困難であるかもしれない。従ってがん反応性（例えばネオアンチゲン反応性）のＴＣＲを得る改善された方法に対する需要がある。
がん抗原（例えばネオアンチゲン）特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝的に加工されている細胞を使用する養子細胞療法（ＡＣＴ）は、一部のがん患者においてポシティブな臨床応答を奏することができる。それにも関わらず、がんと他の疾患を幅広く治療するためにＴＣＲが加工された細胞を成功裏に使用するためには障害が残っている。例えばがん抗原（例えばネオアンチゲン）を特異的に認識するＴＣＲの同定及び／又は患者からの単離は困難であるかもしれない。従ってがん反応性（例えばネオアンチゲン反応性）のＴＣＲを得る改善された方法に対する需要がある。
【発明の概要】
【0005】
本発明の１態様は、対を成すＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及びベータ鎖配列、又はその抗原結合部分を単離する方法を提供し、その方法は、（ａ）生体試料から、がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞を単離する工程；（ｂ）単離されたＴ細胞を、変異したアミノ酸配列を提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）と共培養する工程であって、それによりＴ細胞は１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現する工程；（ｃ）共培養されたＴ細胞を分取（sorting）して分離した単一のＴ細胞試料（separate single T cell）とする工程；（ｄ）各々の分離した単一のＴ細胞試料からｍＲＮＡを単離する工程；（ｅ）各々の分離した単一のＴ細胞試料からｍＲＮＡの配列決定を行う工程であって、ここで該配列決定は：（ｉ）ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、該ｃＤＮＡを増幅する工程；（ｉｉ）増幅された該ｃＤＮＡの多様な断片を作製し、該多様な断片にタグを付す工程；（ｉｉｉ）タグが付された該ｃＤＮＡの多様な断片を増幅する工程；及び（ｉｖ）増幅され、タグが付された該ｃＤＮＡの多様な断片を配列決定する工程であって；ここで配列決定は、ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を同定する工程；（ｆ）ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーの既知の配列に対してアラインメントして、どの単一のＴ細胞試料が、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現する単一のＴ細胞を含むかを同定する工程；（ｇ）ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を、参照ＴＣＲ配列データベースに対してアラインメントして、（ｆ）で１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現すると同定された、各々の分離した単一のＴ細胞試料のｃＤＮＡの多様な断片の、ＴＣＲアルファ鎖の可変（Ｖ）セグメント配列とＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列を同定する工程、（ｈ）（ｇ）で同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内と、（ｇ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内の、ＴＣＲ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を同定する工程；（ｉ）同じアルファ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数と、同じベータ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数を計測する工程；（ｊ）同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、同じベータ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、及び任意選択で、同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片を採取し、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＣＤＲ３配列を同定する工程であって、ここで２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列は、最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列とは異なる工程；（ｋ）（ｊ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列、（ｊ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列、及び任意選択で、（ｊ）で採取された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列を同定し、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＶセグメント配列を同定する工程；並びに（ｌ）（ｋ）で同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列と（ｊ）で採取されたＴＣＲアルファ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲアルファ鎖、及び（ｋ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列と（ｊ）で採取されたＴＣＲベータ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲベータ鎖、をコードする１つ以上のヌクレオチド配列をアセンブリングし（assemble）、任意選択で、（ｋ）で同定された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列と（ｊ）で採取された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＣＤＲ３配列を含む第２のＴＣＲアルファ鎖、及び、（ｋ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列と（ｊ）で採取されたＴＣＲベータ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲベータ鎖、をコードする１つ以上の第２のヌクレオチド配列をアセンブリングし、単離され、対を成すＴＣＲアルファ及びベータ鎖配列、又はその抗原結合部分を作製する工程を含む。
【0006】
本発明の別の態様は、がん特異的な変異によりコードされる、変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファとベータ鎖のＶセグメント配列とＴＣＲのＣＤＲ３配列を自動的に同定する方法を提供し、該方法は：（ａ）使用者のコンピューター装置において、ｃＤＮＡの多様な断片の配列を受け取る工程であって、ここで該ｃＤＮＡは単一のＴ細胞により、該Ｔ細胞と変異したアミノ酸配列を提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）との共培養に続いて作製されるｍＲＮＡによりコードされ、それによって該Ｔ細胞は１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現する工程；（ｂ）ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を、参照ＴＣＲ配列データベースに対してコンピューター化されたアラインメントをして、ｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖の可変（Ｖ）セグメント配列とＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列を同定する工程；（ｃ）（ｂ）において同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内の、及び、（ｂ）において同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内の、ＴＣＲ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列のコンピューター化された同定を行う工程；（ｄ）同じアルファ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数と、同じベータ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数、のコンピューター化された計測を行う工程；（ｅ）同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、同じベータ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、及び任意選択で、同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のコンピューター化された採取を行い、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＣＤＲ３配列を同定する工程であって、ここで２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列は、最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列と異なる工程；並びに、（ｆ）（ｅ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列、（ｅ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列、及び任意選択で、（ｅ）で採取された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列のコンピューター化された同定を行い、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＶセグメント配列を同定する工程、を含む。
【0007】
本発明の別の態様は、対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖配列、又はその抗原結合部分を発現する細胞集団を調製する方法を提供し、該方法は、本明細書で述べられる本発明の方法のいずれかにより、対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖の配列、又はその抗原結合部分を単離する工程、及び、単離された、対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖の配列又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞内に導入し、対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖配列又はその抗原結合部分を発現する細胞を得る工程を含む。
【0008】
本発明のさらなる態様は、本明細書で述べられた本発明の方法のいずれかにより単離された、一対のＴＣＲアルファとベータ鎖配列又はその抗原結合部分を提供する。
【0009】
本発明のなお別の態様は、本明細書で述べられた本発明の方法のいずれかにより調製された、単離された細胞集団を提供する。
【0010】
本発明のさらなる態様は、関連する医薬組成物と、がんの治療又は予防の方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図3A】図３Ａと図３Ｂは、ＴＭＧ－５をパルスされた自家樹状細胞（ＤＣ）と４時間共培養され、その後に単一細胞のＲＮＡ配列解析（single cell RNA-seq analysis）にかけられた、４０９０Ｆ７ Ｔ細胞において測定された、合計のＲ１リード内での、ＩＦＮ－γ（Ａ）とＩＬ－２（Ｂ）リードのパーセンテージを示すグラフである。
【図3B】図３Ａと図３Ｂは、ＴＭＧ－５をパルスされた自家樹状細胞（ＤＣ）と４時間共培養され、その後に単一細胞ＲＮＡ配列解析にかけられた、４０９０Ｆ７ Ｔ細胞において測定された、合計のＲ１リード内での、ＩＦＮ－γ（Ａ）とＩＬ－２（Ｂ）リードのパーセンテージを示すグラフである。
【図3C】図３Ｃは、ＴＭＧ－５又はＴＭＧ－６をパルスされた樹状細胞（ＤＣ）との共培養に際して、形質導入されていない（陰が無いバー）又は４０９０ＴＣＲが形質導入された（陰があるバー）、ドナーＴ細胞により分泌されたＩＦＮ－γ（ｐｇ／ｍＬ）の量を示すグラフである。ＴＭＧ無しでパルスされた樹状細胞（ＤＣ）（「ｗ/ｏ」）は陰性コントロールとして役立った。
【図3D】図３Ｄは、ＴＭＧ－５に由来する示されたミニ遺伝子の１つに対応する変異した２５ｍｅｒペプチドでパルスされた４０９０樹状細胞（ＤＣ）との共培養に際して、４０９０ＴＣＲが形質導入されたＴ細胞により分泌されたＩＦＮ－γ（ｐｇ／ｍＬ）の量を示すグラフである。
【図3E】図３Ｅは、示された濃度（conc.）（μＭ）の精製された２５ｍｅｒの野生型（ＷＴ）（白丸）又は変異した（黒丸）ＵＳＰ８ペプチドでパルスされた４０９０樹状細胞（ＤＣ）との共培養に際して、４０９０ＴＣＲが形質導入されたＴ細胞により分泌されたＩＦＮ－γ（ｐｇ／ｍＬ）の量を示すグラフである。
【図4A】図４Ａと図４Ｂは、ＴＭＧ－１をパルスされた自家樹状細胞（ＤＣ）と４時間共培養され、その後に単一細胞のＲＮＡ配列解析にかけられた、４０９５Ｆ５ Ｔ細胞において測定された、合計のＲ１リード内での、ＩＦＮ－γ（Ａ）とＩＬ－２（Ｂ）リードのパーセンテージを示すグラフである。
【図4B】図４Ａと図４Ｂは、ＴＭＧ－１をパルスされた自家樹状細胞（ＤＣ）と４時間共培養され、その後に単一細胞のＲＮＡ配列解析にかけられた、４０９５Ｆ５ Ｔ細胞において測定された、合計のＲ１リード内での、ＩＦＮ－γ（Ａ）とＩＬ－２（Ｂ）リードのパーセンテージを示すグラフである。
【図4D】図４Ｄは、全長の野生型（ＷＴ）又は変異したＫＲＡＳ ｍＲＮＡをパルスされた樹状細胞（ＤＣ）との共培養に際して、形質導入されていない（陰が無いバー）又は４０９５ＴＣＲが形質導入された（陰があるバー）、ドナーＴ細胞により分泌されたＩＦＮ－γ（ｐｇ／ｍＬ）の量を示すグラフである。ペプチド無しでパルスされた樹状細胞（ＤＣ）（「ｗ/ｏ」）は陰性コントロールとして役立った。
【図4E】図４Ｅは、示された濃度（μＭ）の精製された９ｍｅｒの野生型（ＷＴ）（白丸）又は変異した（黒丸）ＫＲＡＳペプチドをパルスされた、４０９５樹状細胞（ＤＣ）との共培養に際して、４０９５ＴＣＲが形質導入されたＴ細胞により、分泌されたＩＦＮ－γ（ｐｇ／ｍＬ）の量を示すグラフである。
【図5A】図５Ａと図５Ｂは、ＴＭＧ－９をパルスされた自家樹状細胞（ＤＣ）と４時間共培養され、その後に単一細胞のＲＮＡ配列解析にかけられた、４１１２Ｆ５ Ｔ細胞において測定された、合計のＲ１リード内での、ＩＦＮ－γ（Ａ）とＩＬ－２（Ｂ）リードのパーセンテージを示すグラフである。
【図5B】図５Ａと図５Ｂは、ＴＭＧ－９をパルスされた自家樹状細胞（ＤＣ）と４時間共培養され、その後に単一細胞のＲＮＡ配列解析にかけられた、４１１２Ｆ５ Ｔ細胞において測定された、合計のＲ１リード内での、ＩＦＮ－γ（Ａ）とＩＬ－２（Ｂ）リードのパーセンテージを示すグラフである。
【図5D】図５Ｄは、ＴＭＧ－９又はＴＭＧ－１０をパルスされた樹状細胞（ＤＣ）との共培養に際して、形質導入されていない（陰が無いバー）又は４１１２ＴＣＲが形質導入された（陰があるバー）、ドナーＴ細胞により分泌されたＩＦＮ－γ（ｐｇ／ｍＬ）の量を示すグラフである。ペプチド無しでパルスされた樹状細胞（ＤＣ）（「ｗ/ｏ」）は陰性コントロールとして役立った。
【図5E】図５Ｅは、短いペプチドの示されたプール（ＳＰＰ－１からＳＰＰ－１０）の１つをパルスされたＥＢＶ形質転換したＢ細胞との共培養に際して、４１１２ＴＣＲが形質導入されたＴ細胞により分泌されたＩＦＮ－γ（ｐｇ／ｍＬ）の量を示すグラフである。ペプチド無しでパルスされたＥＢＶ形質転換したＢ細胞（「ｗ/ｏ」）は陰性コントロールとして役立った。
【図5F】図５Ｆは、ＳＰＰ－９又は示された短いペプチドであるＶＷＤＡＬＦＡＤＧＬＳＬＣＬ(配列番号１８)；ＷＲＲＶＡＷＳＹＤＳＴＬＬ(配列番号１９)；ＷＳＹＤＳＴＬＬ(配列番号２０)；ＷＳＹＤＳＴＬＬＡ(配列番号２１)；ＷＳＹＤＳＴＬＬＡＹ(配列番号２２)；ＹＬＡＬＶＤＫＮＩＩＧＹ(配列番号２３)；又はＹＳＥＰＤＶＳＧＫ(配列番号２４)の１つをパルスされたＥＢＶ形質転換したＢ細胞との共培養に際して、４１１２ＴＣＲが形質導入されたＴ細胞により分泌されたＩＦＮ－γ（ｐｇ／ｍＬ）の量を示すグラフである。ペプチド無しでパルスされたＥＢＶ形質転換したＢ細胞（「ｗ/ｏ」）は陰性コントロールとして役立った。
【図5G】図５Ｇは、精製された変異した（黒丸）ＮＢＡＳペプチドＷＳＹＤＳＴＬＬＡＹ（Ｃ＞Ｓ）（配列番号４）又はその野生型（ＷＴ）（白丸）の対応物をパルスされたＥＢＶ形質転換したＢ細胞との共培養に際して、４１１２ＴＣＲが形質導入されたＴ細胞により分泌されたＩＦＮ－γ（ｐｇ／ｍＬ）の量を示すグラフである。
【図8】図８は、本発明の１態様により、がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファとベータ鎖のＶセグメント配列と、ＴＣＲのＣＤＲ３配列を自動的に同定するための方法の工程の流れ図である。
【図9A】図９Ａは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて変異をコードする２５ｍｅｒの長いペプチドプール（ＰＰ）のライブラリーに対して、ＴＩＬ４１７１Ｆ６ Ｔ細胞をスクリーニングした後に検出された、ＩＦＮ－γ陽性スポットの数を示すグラフである。ＯＫＴ３抗体で処理されたＴ細胞は陽性コントロ－ルとして役立った。ペプチドプール無しで培養されたＴ細胞（ｗ/ｏ）は陰性コントロールとして役立った。
【図9B】図９Ｂと図９Ｃは、ＰＰ－３をパルスされた自家樹状細胞（ＤＣ）との共培養に際したＴＩＬ４１７１ Ｆ６ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ（ＦＰＫＭ（１００万個のマップされたリード当たりの転写産物の千塩基当たりの断片））（図９Ｂ）とＩＬ－２（図９Ｃ）の発現を示すグラフである。
【図9C】図９Ｂと図９Ｃは、ＰＰ－３をパルスされた自家樹状細胞（ＤＣ）との共培養に際したＴＩＬ４１７１ Ｆ６ Ｔ細胞による、ＩＦＮ－γ（ＦＰＫＭ（１００万個のマップされたリード当たりの転写産物の千塩基当たりの断片））（図９Ｂ）とＩＬ－２（図９Ｃ）の発現を示すグラフである。
【図9E】図９Ｅは、形質導入されていない（陰が無いバー）又は４１７１ＴＣＲを形質導入された（陰があるバー）細胞とＰＰがパルスされた樹状細胞（ＤＣ）との共培養に続いて、産生されたＩＦＮ－γの量（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。ペプチドプール無しで培養されたＴ細胞（ｗ/ｏ）は陰性コントロールとして役立った。
【発明を実施するための形態】
【0012】
発明の詳細な説明
１態様において本発明は、対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖の配列、又はその抗原結合部分を単離する方法を提供する。
１態様において本発明は、対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖の配列、又はその抗原結合部分を単離する方法を提供する。
【0013】
本発明の方法は、所望の抗原性特異性を有する機能的ＴＣＲの同定及び単離のための、種々の異なった課題のいずれかに対処し得る。これらの課題は、例えば、ＴＣＲ配列の多様性の大きさ、所望の抗原特異性を提供するために正しく対を成すべきＴＣＲαとβ鎖に対する要件、及び最大で約３分の１の成熟したＴ細胞が２つの機能を有するＴＣＲα鎖を発現し得る要件（ＴＣＲα鎖の１つのみが所望の特異性を有する可能性がある）を含み得る。
【0014】
本発明の方法は種々の利点の何れを提供してもよい。例えば本発明の方法は、患者からの生体試料（例えば腫瘍試料）の除去後に、がん抗原（例えばネオアンチゲン）に対して抗原特異性を有するＴＣＲの配列を単離して同定するのに必要な、時間及び／又は費用を顕著に低減し得る。ＴＣＲ配列の単離、同定後に、宿主細胞（例えば自家Ｔ細胞）にＴＣＲ配列を形質導入し、形質導入された細胞の数を増やし、数を増やした形質導入された細胞を、がんの治療及び／又は予防のために患者に投与してもよい。本発明の方法は、（ｉ）がん抗原と、そのがん抗原を認識するＴＣＲの配列の両方を同定し、及び／又は、（ｉｉ）がん抗原（例えばネオアンチゲン）を標的化する高度に個別化されたＴＣＲ療法を促進してもよい。さらに有利なことに本発明の方法は、限界希釈によるＴ細胞クローニングを用いた対を成すＴＣＲα／β配列を単離する方法と比較して、時間がかからず、労力を有さず、より高い成功率を有することができる。本発明の方法は、機能を有するＴＣＲα遺伝子を１つ超有するそれらのＴ細胞において、ＴＣＲアルファとベータ鎖の正しい対を効率的に同定することも可能とすることができる。本発明の方法は、多様性が高いＴ細胞集団から、対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖の配列（所望の抗原特異性を有する）も同定して単離し得る。
【0015】
αβＴＣＲは、αとβのタンパク質鎖からなるヘテロダイマーである。各々の鎖は可変（Ｖ）領域と定常（Ｃ）領域の２つの細胞外ドメインを含み、膜貫通ドメイン領域と短い細胞質尾部が続く。ＴＣＲα鎖とβ鎖の各々の可変ドメインは、ペプチド－ＭＨＣ複合体と接触して認識する、３つの「相補性決定領域」（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を有する。特にαとβのＣＤＲ３は処理された（processed）抗原の認識を担っている。Ｔ細胞の間で、ＣＤＲ３αとＣＤＲ３βのアミノ酸配列には非常に高度な多型がある。免疫システムが立ち向かう広範囲の抗原を認識するためには、Ｔ細胞にはこのレベルの多型が必要である。ＣＤＲ３αとＣＤＲ３βのアミノ酸配列における多型は、Ｔ細胞が成熟する間に起こるＴＣＲαとβ遺伝子内のＤＮＡ再構成に起因する。
【0016】
ＴＣＲをコードする遺伝子は、ＴＣＲα遺伝子の中では「Ｖセグメント」及び「Ｊセグメント」と呼ばれ、ＴＣＲβ鎖の中では「Ｖセグメント」、「Ｄセグメント」及び「Ｊセグメント」と呼ばれるコード配列のカセットから構成される。ゲノムＤＮＡ中の確率論的再配置はこれらのＤＮＡセグメントの並置（juxtaposition）をもたらし、機能を有するＴＣＲ遺伝子をもたらたす。これらの再配置は不正確であるかもしれず、Ｖα－ＪαとＶβ－Ｄｃ－Ｊβセグメントの接合部（junction）は可変性が高いかもしれない。アルファ鎖のＣＤＲ３は、Ｖセグメントの一部とＪセグメントの全てによりコードされている。ベータ鎖のＣＤＲ３は、Ｖセグメントの一部、Ｊセグメントの全て、及びＤセグメントの全てによりコードされている。
【0017】
本方法は、がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞を、生体試料から単離することを含むことができる。任意の適切な生体試料を使用することが可能である。本発明の１態様において生体試料は、腫瘍試料又は末梢血の試料である。本発明において使用できる生体試料の例は、原発腫瘍由来の組織、転移腫瘍の部位由来の組織、滲出物、浸出物、腹水、分画された末梢血細胞、骨髄、末梢血バフィーコート、及び脳脊髄液を含むが、限定されるものではない。したがって生体試料を、吸引、生検、切除、静脈穿刺、動脈穿刺、腰椎穿刺、シャント、カテーテル法、又はドレイン置換を含むが、限定されるものではない、任意の適切な手段により得てもよい。
【0018】
生体試料から単離されるＴ細胞は、がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有する。本明細書で使用される「抗原特異性」の語句は、ＴＣＲ又はその抗原結合部分が、がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列に特異的に結合することができ、且つ免疫学的に認識できることを意味する。がん特異的な変異は、変異したアミノ酸配列をコードし（「非サイレント変異」とも呼ばれる）、がん細胞には発現しているが、がん性ではない正常な細胞には発現していない、任意の遺伝子における任意の変異であってもよい。がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞を単離する方法は、例えば、国際公開番号２０１６/０５３３３８と国際公開番号２０１６/０５３３３９に述べられている。例えば、がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞の単離は：患者のがん細胞の核酸内の１つ以上の遺伝子を同定する工程であって、各々の遺伝子は変異したアミノ酸配列をコードするがん特異的な変異を含む工程；患者の自家抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導し、変異したアミノ酸配列を提示させる工程；患者の自家Ｔ細胞を、変異したアミノ酸配列を提示する自家ＡＰＣと共培養する工程；及び、（ａ）変異したアミノ酸配列を提示する自家ＡＰＣと共培養され、（ｂ）患者が発現する主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）分子との関連で提示される変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有する自家Ｔ細胞を選択する工程を含み、がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有する単離されたＴ細胞を提供してもよい。
【0019】
がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞が一度単離されたならば、本発明の方法は、それらの単離されたＴ細胞を変異したアミノ酸配列を提示するＡＰＣと共培養する工程をさらに含み、それによってＴ細胞は１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現する。ＡＰＣは、それらの細胞表面上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と関連して、タンパク質のペプチド断片を提示する任意の細胞を含み得る。ＡＰＣは、例えば、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、Ｂリンパ球、及びＴ細胞の任意の１つ以上を含んでもよい。好ましくは、ＡＰＣは樹状細胞（ＤＣ）である。種々のＴ細胞活性化マーカーの任意の１つ以上を、変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有するそれらのＴ細胞を同定するのに使用してもよい。Ｔ細胞活性化マーカーの例は、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ１０７ａ、グランザイムＢ、インターフェロン（ＩＦＮ）－γ、インターロイキン（ＩＬ）－２、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、顆粒球／単球コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７及びＩＬ－２２の任意の１つ以上を含むが、限定されるものではない。
【0020】
本方法は、共培養されたＴ細胞を分取して（sorting）分離した単一のＴ細胞試料とする工程、及び各々の分離した単一のＴ細胞試料からｍＲＮＡを単離する工程をさらに含む。分取して分離した単一のＴ細胞試料とする工程とｍＲＮＡを単離する工程は、自動化してもよい。例えば、分取して分離した単一のＴ細胞試料とする工程と、ｍＲＮＡを単離する工程は、ＦＬＵＩＤＩＧＭ Ｃ１の自動化された単一細胞の単離及び調製システム（フリューダイム、南サンフランシスコ、カリフォリニア州から入手可能）を用いて実施することができる。本発明の方法は、有利なことに、任意の数の分離した単一細胞のｍＲＮＡ試料（例えば、約２個、約３個、約４個、約５個、約１０個、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約４０個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約１５０個、約２００個、約４００個、約６００個、約８００個、約１０００個、約１５００個、約２０００個以上、又は前述の値の任意の２つにより規定される範囲）を提供することができる。本発明の１態様において本方法は、約９６個の分離した単一細胞のｍＲＮＡ試料の調製を含む。
【0021】
本発明の１態様において本方法は、各々の分離した単一のＴ細胞試料に由来するｍＲＮＡを、各々の分離した単一のＴ細胞試料に対する異なるタグ（例えばバーコード）によりラベル化する工程をさらに含んでもよい。例えば、各々の分離した単一のＴ細胞試料に由来するｍＲＮＡを、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＮＥＸＴＥＲＡ ＸＴ ＤＮＡライブラリー調製キット（イルミナ、サンディエゴ、カリフォルニア州から入手可能）を用いてラベル化してもよい。
【0022】
本発明の方法は、各々の分離した単一のＴ細胞試料由来のｍＲＮＡの配列決定をする工程をさらに含む。その配列決定は、本技術分野で既知の任意の適切な様式で実施することができる。本発明の方法において有用であり得る配列決定の技術の好適な例は、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）（「超並列シークエンシング技術（massively parallel sequencing technology）」若しくは「ディープシークエンシング」とも呼ばれる）又は第３世代シークエンシングを含む。ＮＧＳとは、サンガー法に基づかない高性能ＤＮＡ配列決定技術をいう。ＮＧＳによれば、何百万個又は何十億個のＤＮＡ鎖を平行して配列決定し、実質的により高い性能をもたらし、且つゲノムのサンガー配列決定法でしばしば使用される断片クローニング法の必要性を最小限とすることができる。ＮＧＳにおいては、ゲノム全体を小さな一片（piece）に分解することにより、全ゲノム亘って平行して、核酸テンプレードを無作為に読むことができる。ＮＧＳは有利なことに、各々の分離した単一のＴ細胞ｍＲＮＡ試料に由来する核酸配列情報を非常に短い期間内に、例えば、約１週間から約２週間以内、好ましくは約１日から約７日以内、又は最も好ましくは約２４時間未満に提供し得る。市販で入手可能であるか又は文献中に述べられている多様なＮＧＳプラットフォーム、例えば、Zhangら J. Genet. Genomics, 38(3): 95-109 (2011)及びVoelkerdingら Clinical Chemistry, 55: 641-658 (2009)に述べられたものを、本発明の方法に関連して使用することができる。
【0023】
ＮＧＳ技術とプラットフォームの非限定的な例は、１塩基合成（「パイロシークエンシング」としても知られている）（例えばＧＳ－ＦＬＸ４５４ゲノム配列決定装置、４５４ライフサイエンス（ブランフォ－ド、コネチカット州）、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＳＯＬＥＸＡゲノム解析装置（イルミナ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＨＩＳＥＱ２０００ゲノム解析装置（イルミナ）、若しくはＩＬＬＵＭＩＮＡ ＭＩＳＥＱシステム（イルミナ）を使用して、又は例えばRonaghiら Science, 281(5375): 363-365 (1998)に述べられたように実施される）、連結による配列決定（sequencing-by-ligation）（例えば、ＳＯＬＩＤプラットフォーム（ライフテクノロジー・コーポレーション、カールスバッド、カリフォルニア州）又はＰＯＬＯＮＡＴＯＲ Ｇ．００７プラットフォーム（ドーバーシステム、セイラム、ニューハンプシャー州）を使用して実施される）、単一分子配列決定（single-molecule sequencing）（例えば、ＰＡＣＢＩＯ ＲＳシステム（パシフィック・バイオサイエンス（メンローパーク、カリフォルニア州）又はＨＥＬＩＳＣＯＰＥプラットフォーム（ヘリコス・バイオサイエンス（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を使用して実施される）、単一分子配列決定のためのナノテクノロジー（例えば、オックスフォード・ナノポア・テクノロジーのＧＲＩＤＯＮプラットフォーム（オックスフォード、イギリス）、ナブシスにより開発されたハイブリダイゼーション支援ナノポア配列決定（ＨＡＮＳ）プラットフォーム（プロビデンス、ロードアイランド州）、及びプローブ－アンカーライゲーション（ｃＰＡＬ）と呼ばれるＤＮＡナノボール（ＤＮＢ）技術を伴うリガーゼに基づいたＤＮＡ配列決定プラットフォームを使用して実施される）、単一分子配列決定のための電子顕微鏡に基づいた技術、及びイオン半導体配列決定を含む。
【0024】
これに関連して、各々の分離した単一のＴ細胞試料に由来するｍＲＮＡの配列決定は、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、そのｃＤＮＡを増幅する工程、増幅されたｃＤＮＡの多様な断片を作製し、その多様な断片にタグを付す工程、タグが付されたそのｃＤＮＡの多様な断片を増幅する工程、及び、増幅され、タグが付されたそのｃＤＮＡの多様な断片を配列決定する工程を含むことができる。タグを付すことは、各々の多様な断片にヌクレオチド配列を加えることを含んでもよく、それにより多様な断片を互いに区別することができる。配列決定はｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を同定する。ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列は「リード（read）」とも呼ばれる。ｍＲＮＡの配列決定は任意の数のリードを生成してもよい。例えばｍＲＮＡの配列決定は、各々の単一のＴ細胞試料について、約１，０００，０００リード、約９００，０００リード、約８００，０００リード、約７００，０００リード、約６００，０００リード、約５００，０００リード、約４００，０００リード、約３００，０００リード、約２００，０００リード、約１００，０００リード以上、又は前述の値の任意の２つにより規定される範囲を生成してもよい。多くのＮＧＳプラットフォームにおいて２つの読み方向があってもよく：１つは順方向リーディング（「リード１」又は「Ｒ１」とも呼ばれる）であり、他は逆方向リーディング（「リード２」又は「Ｒ２」とも呼ばれる）である。ｃＤＮＡ断片について、Ｒ１とＲ２は互いに相補してもよい。本発明の１態様において、本方法はＲ１リードのみ、Ｒ２リードのみ、又はＲ１とＲ２リードの両方の測定を含む。Ｒ１はＲ２よりも高い配列決定の質を有してもよい。好ましくは、本方法はＲ１リードのみの測定を含む。
【0025】
本方法はさらに、ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーの既知の配列に対してアラインメントして、どの単一のＴ細胞試料が、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現する単一のＴ細胞を含むか同定する工程を含む。がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列を提示するＡＰＣとの共培養に続いて、１つ以上の単一のＴ細胞活性化マーカーを発現する１つ以上の単一のＴ細胞（複数可）は、がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴＣＲを発現していると同定される。
【0026】
本方法はさらに、ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を、参照ＴＣＲ配列データベ－スに対してアラインメントして、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現すると同定された、各々の分離した単一のＴ細胞試料のｃＤＮＡの多様な断片の、ＴＣＲアルファ鎖の可変（Ｖ）領域配列とＴＣＲベータ鎖のＶ領域配列を同定する工程を含む。これに関連して、どのｃＤＮＡ断片が可変セグメント配列の全て又は一部を含むかを同定し、ｃＤＮＡ断片（複数可）の可変セグメント配列の３’端のおおよその位置を決定するために、ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を、既知のＴＣＲ可変セグメント配列に対してアラインメントする。可変セグメント配列の３’端は、ＣＤＲ３のおおよその位置を示す。
【0027】
参照ＴＣＲ配列データベースは、任意の適切な参照ＴＣＲ配列データベースでよい。参照ＴＣＲ配列データベースの例は、Lefrancら Nucleic Acids Res., 43: D413-422 (2015)内に述べられている国際ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳ情報システム（ＩＭＧＴ）のデータベース(//www.imgt.org)から得られた配列を含んでもよい。ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列の参照ＴＣＲ配列データベースに対するアラインメントは、例えば、LiらBioinformatics, 25: 1754-60 (2009)とLiらBioinformatics, 26(5): 589-95 (2010)内に述べられている、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒアライナー（ＢＷＡ）ソフトウェアパッケージ(//bio-bwa.sourceforge.net/)を用いて実施されてもよい。
【0028】
本方法はさらに、同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内と、同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内の、ＴＣＲ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を同定する工程を含む。ＣＤＲ３領域配列は、任意の適切な様式で同定することができる。本発明の１態様において、ＴＣＲのＣＤＲ３配列の同定は、アルファとベータ鎖のＶセグメントによりコードされるアミノ酸配列のＣ末端の近傍に位置する、保存されたアミノ酸残基をコードするｃＤＮＡ配列を同定することにより行なう。例えばＴＣＲ ＣＤＲ３配列の同定は、
ＹＸ１ＣＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２（配列番号５）
のアミノ酸配列モチーフをコードする、任意のｃＤＮＡ配列（複数可）の同定により実施することができ、ここでＸ１からＸ９の各々は任意の天然由来のアミノ酸であり、Ｘ１０からＸ２１の各々はアミノ酸がないか又は任意の天然由来のアミノ酸であり、及び、Ｘ２２はフェニルアラニン又はトリプトファンである。配列番号５のアミノ酸配列モチーフは、Ｖセグメントによりコードされるアミノ酸配列のＣ末端の近傍に位置する保存されたアミノ酸配列モチーフである。
ＹＸ１ＣＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２（配列番号５）
のアミノ酸配列モチーフをコードする、任意のｃＤＮＡ配列（複数可）の同定により実施することができ、ここでＸ１からＸ９の各々は任意の天然由来のアミノ酸であり、Ｘ１０からＸ２１の各々はアミノ酸がないか又は任意の天然由来のアミノ酸であり、及び、Ｘ２２はフェニルアラニン又はトリプトファンである。配列番号５のアミノ酸配列モチーフは、Ｖセグメントによりコードされるアミノ酸配列のＣ末端の近傍に位置する保存されたアミノ酸配列モチーフである。
【0029】
本発明の１態様において本方法はさらに、採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖の定常（Ｃ）領域配列と、採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲベータ鎖のＣ領域配列を同定する工程を含む。任意選択で本方法はさらに、採取された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＣ領域配列を同定する工程を含む。ＴＣＲアルファ鎖は１つの定常領域アミノ酸配列の候補を有する。ＴＣＲベータ鎖は２つの定常領域アミノ酸配列候補のうちの１つを有する。
【0030】
本方法はさらに、同じアルファ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数と、同じベータ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数を計測する工程を含む。
【0031】
本方法はさらに、同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、同じベータ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、及び任意選択で、同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片を採取し、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＣＤＲ３配列を同定する工程を含む。２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列は、最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列とは異なる。同定されるＣＤＲ３配列は、がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴＣＲのベータ鎖のＣＤＲ３配列とアルファ鎖のＣＤＲ３配列、及び任意選択で、Ｔ細胞により発現され、ベータ鎖のＣＤＲ３配列と対を成して、がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴＣＲを形成することがない、追加のアルファ鎖のＣＤＲ３配列を含んでよい。成熟したＴ細胞の約３分の１は２つのＴＣＲアルファ鎖を発現し得ると推定されている。発現したアルファ鎖の１つのみが発現したＴＣＲベータ鎖と対を成し、がん特異的な変異によりコードされるアミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴＣＲを提供するであろう。
【0032】
本方法はさらに、採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列、採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列、及び任意選択で、採取された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列を同定し、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＶセグメント配列を同定する工程を含む。単一の、活性化されたＴ細胞により発現される優勢な（dominant）ＴＣＲのＣＤＲ３配列をコードするｃＤＮＡの多様な断片の数は、混入により存在するかもしれない、任意の他のＴＣＲのＣＤＲ３配列をコードするｃＤＮＡの断片の数を約１０～約１００倍上回るであろう。混入の起源は付近の単一細胞の試料であるか、又は未知の起源であるかもしれない。変異したアミノ酸配列を提示するＡＰＣとの共培養に対する応答で１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現する単一のＴ細胞により発現される優勢なＴＣＲは、がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴＣＲである。
【0033】
本方法はさらに、同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列と、採取されたＴＣＲアルファ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲアルファ鎖と、同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列と採取されたＴＣＲベータ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲベータ鎖、をコードする１つ以上のヌクレオチド配列をアセンブリングする工程を含む。同じＣＤＲ３配列をコードする種々のｃＤＮＡの多様な断片は、種々の長さのものであってもよく、互いに重複してもよい。種々の長さの同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする、種々のｃＤＮＡの多様な断片をお互いにアラインメントすることにより、優勢なＴＣＲアルファ鎖の全Ｖセグメント、Ｊセグメント、及び任意選択で定常領域の配列を決定することが可能である。種々の長さの同じベータ鎖のＣＤＲ３配列をコードするｃＤＮＡの種々の多様な断片を互いにアラインメントすることにより、優勢なＴＣＲベータ鎖の全Ｖセグメント、Ｊセグメント、Ｄセグメント、及び任意選択で、定常領域の配列を決定することが可能である。優勢なＴＣＲアルファ鎖の全Ｖセグメント、Ｊセグメント、及び任意選択で定常領域をコードするヌクレオチド配列、及び優勢なＴＣＲベータ鎖の全Ｖセグメント、Ｊセグメント、Ｄセグメント、及び任意選択で定常領域をコードするヌクレオチド配列を、日常的な技術を使用してアセンブリングすることできる。単離されて対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖の配列又はその抗原結合部分を作製することができる。
【0034】
本発明の１態様において、１つ以上のヌクオチド配列をアセンブリングする（assembling）工程は、試料の中で同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列、試料の中で同定されたＴＣＲアルファ鎖のＣ領域配列、及び採取されたＴＣＲアルファ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲアルファ鎖をアセンブリングする工程、並びに、試料の中で同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列、試料の中で同定されたＴＣＲベータ鎖のＣ領域配列、及び採取されたＴＣＲベータ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲベータ鎖をアセンブリングする工程を含む。これに関連して、アセンブリングしたヌクレオチド配列は内在性のＣ領域配列を含んでもよい。
【0035】
本発明の１態様において、１つ以上のヌクレオチド配列をアセンブリングする工程は、試料の中で同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列、外因性のＴＣＲアルファ鎖のＣ領域配列、及び採取されたＴＣＲアルファ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲアルファ鎖をアセンブリングする工程、並びに、試料の中で同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列、外因性のＴＣＲベータ鎖のＣ領域配列、及び採取されたＴＣＲベータ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲベータ鎖をアセンブリングする工程を含む。外因性のＣ領域配列は、Ｔ細胞に対して天然ではない（天然由来ではない）Ｃ領域の配列である。これに関連して、本方法により作製される、単離されて対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖の配列、又はその抗原結合部分は、２つの異なる哺乳類種に由来するＴＣＲから得られるアミノ酸配列からなる、キメラ又はハイブリッドＴＣＲであってもよい。例えばＴＣＲは、ＴＣＲが「ネズミ化」されるように、ヒトＴＣＲに由来する可変領域と、マウスＴＣＲの定常領域を含むことが可能である。キメラ又はハイブリッドＴＣＲを作製する方法は、例えば、Cohenら Cancer Res., 66: 8878-8886 (2006); Cohenら Cancer Res., 67: 3898-3903 (2007); 及びHaga-Friedmanら J. Immunol., 188: 5538-5546 (2012)内に述べられている。
【0036】
単一のＴ細胞は典型的には、１つのＴＣＲベータ鎖と１つ又は２つのＴＣＲアルファ鎖を発現する。単一の試料内に１つ超のＴＣＲベータ鎖が存在することは、Ｔ細胞の分離したＴ細胞試料への不完全な分取（imperfect sorting）の結果であるかもしれない。不完全な分取は１つの試料内に、うかつにも２つ以上のＴ細胞が含まれることをもたらすかもしれない。もし単一の試料が１つ超のＴＣＲベータ鎖を発現することが見出されたならば、その試料は引き続いた解析から除外されてもよい。
【0037】
上記で議論したように、成熟したＴ細胞の約３分の１は、２つのＴＣＲアルファ鎖を発現するかもしれないと推定されている。発現したアルファ鎖の１つのみが発現したＴＣＲベータ鎖と対を成し、がん特異的な変異によりコードされるアミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴＣＲを提供するであろう。どのＴＣＲアルファ鎖がＴＣＲベータ鎖と対を成して望まれる特異性を提供するのかを決定するために、本方法は、本明細書で述べられたように同定された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片の第１のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列、及び本明細書で述べられたように採取された第１のＴＣＲアルファ鎖のＣＤＲ３配列を含む第１のＴＣＲアルファ鎖、並びに、本明細書で述べられたように同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列、及び本明細書で述べられたように採取されたＴＣＲベータ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲベータ鎖、をコードする第１のヌクレオチド配列をアセンブリングする工程を含んでもよい。本方法は任意選択でさらに、同定された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列、及び採取された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＣＤＲ３配列を含む第２のＴＣＲアルファ鎖、並びに、同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列、及び採取されたＴＣＲベータ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲベータ鎖、をコードする１つ以上の第２のヌクレオチド配列をアセンブリングする工程を含んでもよい。
【0038】
本方法はさらに、第１と第２のヌクレオチド配列を各々、宿主細胞の第１と第２の集団の中に独立して導入する工程、及び、第１と第２の宿主細胞の集団を、がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列を提示するＡＰＣと独立して共培養する工程を含んでもよい。本方法はさらに、（ａ）変異したアミノ酸配列を提示するＡＰＣと共培養され、且つ（ｂ）その変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有する、宿主細胞の集団を選択する工程を含んでもよい。変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有する共培養された宿主細胞の集団は、ＴＣＲベータ鎖と共に、望まれる特異性を提供するＴＣＲアルファ鎖を発現するであろう。
【0039】
変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有する細胞は、本分野で知られている任意の適切な手段により同定されてもよい。例えば変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有する細胞は、例えば国際公開番号２０１６/０５３３３８と国際公開番号２０１６/０５３３３９内に述べられるように、１つ以上のＴ細胞活性化マーカー及び／又は１つ以上のサイトカインの発現に基づいて同定されてもよい。Ｔ細胞活性化マーカーは、本発明の他の側面に関して本明細書で述べられるようなものでもよい。サイトカインは、Ｔ細胞による分泌がＴ細胞活性化に特徴的である（例えば、変異したアミノ酸配列に特異的に結合して免疫学的に認識するＴ細胞により発現されるＴＣＲ）任意のサイトカインを含んでもよい。サイトカインの分泌がＴ細胞活性化に特徴的であるサイトカインの非限定的な例は、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、グランザイムＢ、及び腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、顆粒球／単球コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７及びＩＬ－２２を含む。
【0040】
いくつかの態様において、本発明の方法の１つ以上の工程は、ソフトウェアシステムを使用して実施される。これに関連して本発明の１態様は、がん特異的な変異によりコードされる、変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴＣＲアルファとベータ鎖のＶセグメント配列とＴＣＲのＣＤＲ３配列を自動的に同定する方法を提供する。
【0041】
図６は、本発明のある態様に従ったシステム１００のブロック図である。システム１００は１つ以上のシークエンサー計算装置（sequencer computer device）（複数可）１０１、使用者計算装置１０３、及び、使用者計算装置１０３とシークエンサー計算装置１０１の間のネットワーク接続１０２を含んでもよい。シークエンサー計算装置１０１は、各々の分離した単一のＴ細胞試料由来のｍＲＮＡの配列決定を行うことができる、任意のシステムであってもよい。シークエンサー計算装置１０１の例は、本発明の他の側面に関して本明細書で述べたＮＧＳ技術とプラットフォームの何れかを含んでもよい。
【0042】
使用者計算装置１０１はネットワークのコミュニケーションを支持する任意の型のコミュニケーション装置であることが可能であり、個人用コンピューター、ラップトップ型コンピューター、又は個人用デジタル補助装置（ＰＤＡ）などを含む。いくつかの態様において、使用者計算装置１０１は多様な型のネットワークを支持することができる。例えば、使用者計算装置１０１は、ＩＰ（インターネットプロトコル）を使用した有線の若しくは無線のネットワーク接続性を有してもよく、又はセルラ及びデータネットワークを許容するモバイルネットワーク接続性を有してもよい。
【0043】
本明細書でより詳細に述べるように、使用者計算装置１０３は、シークエンサー計算装置１０１により提供されるｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を捕捉するのに使用される。その配列はネットワーク接続１０２を通じて送信されてもよい。ネットワーク接続１０２の例は共用ディスクスペース（shared disk space）である。
【0044】
図７は、本発明の幾つかの側面に従った、計算装置１０３の基本的な機能要素のブロック図である。図７に描かれた態様において計算装置１０３は、１つ以上のプロセッサー２０２、メモリー２０４、ネットワーク・インターフェース２０６、記憶装置２０８、電源２１０、１つ以上の出力装置２１２、１つ以上の入力装置２１４、及びソフトウェアモジュール－操作システム２１６、及びメモリー２０４の中に内蔵されたシークエンス・アプリケーション２１８を含む。ソフトウェアモジュールはメモリー２０４の中に含まれるものとして提供されるが、態様によってソフトウェアモジュールは、記憶装置２０８又はメモリー２０４と記憶装置２０８の組み合せの中に含まれる。プロセッサー２０２、メモリー２０４、ネートワーク・インターフェース２０６、記憶装置２０８、電源２１０、出力装置２１２、入力装置２１４、操作システム２１６、及びシークエンス・アプリケーション２１８を含む各々の要素は、物理的に、通信可能な様に、及び／又は、部品間の通信のために作動可能なように相互接続される。
【0045】
描かれたようにプロセッサー２０２は、クライアント装置１０３の中で実行するための、機能及び／又はプロセスの指示を実施するように構成されている。例えばプロセッサー２０２は、メモリー２０４の中に記憶された指示、又は記憶装置２０８に記憶された指示を実行する。メモリー２０４は、一時的ではない、コンピューターが読み取り可能な記憶媒体であり得、操作の間にクライアント装置１０３の中に情報を記憶するように構成されている。いくつかの態様において、メモリー２０４は、クライアント装置１０３がオフになるときには維持されるべきではない情報のための領域である一時的なメモリーを含む。そのような一時的なメモリーの例は、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）、ダイナミイック・ランダムアクセスメモリー（ＤＲＡＭ）、及びスタティック・ランダムアクセスメモリー（ＳＲＡＭ）等の揮発性メモリー（volatile memory）を含む。メモリー２０４は、プロセッサー２０２による実行のためのプログラム指示も保持する。
【0046】
記憶装置２０８は１つ以上の、一時的ではないコンピューターが読み取り可能な記憶媒体も含む。記憶装置２０８は一般的に、メモリー２０４よりも多量の情報を記憶するように構成されている。記憶装置２０８はさらに、情報の長期記憶のために構成されていてもよい。いくつかの態様において、記憶装置２０８は、不揮発性記憶要素（non-volatile storage element）を含む。不揮発性記憶要素の非限定的な例は、磁気ハードディスク、光ディスク、フロッピーディスク、フラッシュメモリー、又は電気的にプログラム可能なメモリー（ＥＰＲＯＭ）又は電気的に消去可能且つプログラム可能な（ＥＥＰＲＯＭ）メモリーを含む。
【0047】
使用者計算装置１０３は、１つ以上のネットワーク１０２（図６を見よ）を介して、外部シークエンサー計算装置１０１と通信するためのネットワーク・インターフェイス２０６と、それを通じて使用者計算装置１０３との通信が確立され得る他の型のネットワークを使用してもよい。ネットワーク・インターフェイス２０６は、Ｅｔｈｅｒｎｅｔカード等のネットワーク・インターフェイスカード、光学トランシーバー、無線周波数トランシーバー（radio frequency transceiver）、又は情報を送り且つ受け取れる任意の他の型の装置であってもよい。ネットワーク・インターフェイスの他の非限定的な例は、クライアント計算装置内のＢｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、３Ｇ及びＷｉ－Ｆｉラジオ、並びにユニバーサル・シリアル・バス（ＵＳＢ）を含む。
【0048】
使用者計算装置１０３は１つ以上の電源２１０を含み、装置に電力を供給する。電源２１０の非限定的の例は、単回使用の電源、再充電可能な電源、及び／又はニッケル－カドミウム、リチウムイオン、又は他の適切な材料から開発された電源を含む。
【0049】
１つ以上の出力装置２１２も、使用者計算装置１０３内に含まれる。出力装置２１２は、触覚、聴覚、及び／又は映像刺激を使用する使用者に、出力を提供するように構成されている。出力装置２１２は、表示画面（存在感応画面の一部）、サウンドカード、ビデオグラフィックス・アダプターカード、又は信号をヒト又は機械が理解可能な適切な型に変換するための任意の他の型の装置を含んでもよい。出力装置２１２の追加の例は、ヘッドフォンなどのスピーカー、ブラウン管（ＣＲＴ）モニター、液晶表示（ＬＣＤ）、又は使用者が理解できる出力を生成可能な任意の他の型の装置を含む。
【0050】
使用者計算装置は、１つ以上の入力装置２１４を含む。入力装置２１４は、触感、聴覚、及び／又は映像のフィードバックを介して、使用者からの又は使用者の周囲の環境からの入力を受け取るように構成されている。入力装置２１４の非限定的な例は、写真（photo）用及びビデオカメラ、存在感受性スクリーン、マウス、キーボード、音声反応性システム、マイクロフォン又は他の任意の型の入力装置を含む。幾つかの例において存在感受性スクリーンは、タッチ式スクリーンを含む。
【0051】
クライアント装置１０３は操作システム２１６を含む。操作システム２１６は、クライアント装置１０３の部品の操作を制御する。例えば操作システム２１６は、プロセッサー（複数可）２０２、メモリー２０４、ネットワーク・インターフェイス２０６、記憶装置（複数可）２０８、入力装置２１４、出力装置２１２、及び電源２１０の相互作用を促進する。
【0052】
本明細書でより詳細に述べられたように、使用者計算装置はシークエンス・アプリケーション２１８を使用して、変異したアミノ酸配列を提示するＡＰＣとの共培養に続いて、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現すると同定された単一のＴ細胞（複数可）のｃＤＮＡの多様な断片の配列を捕捉する。いくつかの態様において、シークエンス・アプリケーション２１８はシークエンサー計算装置（sequencer computing device）と連動して、それからの入力を受け取ってもよい。いくつかの態様において、使用者は、単一の同定されたＴ細胞のｃＤＮＡの多様な断片の配列を、シークエンサー計算装置１０１から、例えばＵＳＢフラッシュドライブなどの取り外し可能なディスクにダウンロードしてもよい。使用者計算装置は、単一の同定されたＴ細胞のｃＤＮＡの多様な断片の配列を、取り外し可能なディスクから得てもよい。
【0053】
使用者計算装置１０３は、メモリーの中に内蔵され、プロセッサーにより実行されるソフトウェアを含み、本発明の他の側面に関連して本明細書で述べられたような、がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有する、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＶセグメント配列とＴＣＲのＣＤＲ３配列を同定してもよい。
【0054】
図８は、がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有する、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＶセグメント配列とＴＣＲのＣＤＲ３配列を自動的に同定する方法の工程の流れ図である。示されているように、本方法４００は工程４０２で開始し、ここで使用者計算装置１０３は、がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列を提示するＡＰＣとの共培養に続いて、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現すると同定された、単一のＴ細胞（複数可）のｃＤＮＡの多様な断片の配列を受け取る。本方法は、電子的なネットワーク又は取り外し可能なディスク（例えばＵＳＢドライブ）によって、ｃＤＮＡの多様な断片の配列を計算装置において受け取ることを含んでもよい。
【0055】
工程４０３において、使用者計算装置１０３は、ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を、参照ＴＣＲ配列データベースに対してコンピューター化したアラインメントをして、がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列を提示するＡＰＣとの共培養に続いて、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現すると同定された、単一のＴ細胞のｃＤＮＡの多様な断片の配列の、ＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列とＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列を同定する。
【0056】
工程４０４において、使用者計算装置１０３は、同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内と、同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内の、ＴＣＲ ＣＤＲ３配列のコンピューター化された同定を行う。
【0057】
工程４０５において、使用者計算装置１０３は、同じアルファ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数と、同じベータ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数のコンピューター化された計測を行う。
【0058】
工程４０６において使用者計算装置は、同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、同じベータ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、及び任意選択で、同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片、のコンピューター化された採取を行い、ＴＣＲアルファとベータ鎖ＣＤＲ３配列を同定し、ここで２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列は、最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列とは異なる。
【0059】
工程４０７において使用者計算装置１０３は、採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列、採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列、及び任意選択で、採取された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列のコンピューター化された同定を行い、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＶセグメント配列を同定する。
【0060】
本発明の他の態様は、本発明の他の側面に関連して本明細書で述べられた何れかの方法に従って単離された、一対のＴＣＲアルファとベータ鎖の配列、またはその抗原結合部分を提供する。本発明の１態様は、ＴＣＲのアルファ（α）鎖とＴＣＲのベータ（β）鎖など、２つのポリペプチド（すなわちポリペプチド鎖）を含む単離されたＴＣＲを提供する。本発明の単離された対のＴＣＲアルファとベータ鎖の配列（本明細書において「本発明のＴＣＲ（複数可）」とも呼ばれる）のポリペプチド、又はその抗原結合部分は、任意のアミノ酸配列を含むことが可能であるが、但し、そのＴＣＲ又はその抗原結合部分は、がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有する。
【0061】
本明細書で使用される単離された対のＴＣＲアルファとベータ鎖の配列の「抗原結合部分」とは、それが１部分であるＴＣＲの連続したアミノ酸を含む任意の部分を言うものであり、但し、その抗原結合部分は、本発明の他の側面との関連で本明細書において述べた、がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列に特異的に結合する。用語「抗原結合部分」は、本発明の方法により単離されるＴＣＲの任意の一部分又は断片をいい、その一部分又は断片は、それが一部分であるＴＣＲ（親のＴＣＲ）の生物活性を維持する。抗原結合部分は、例えば、親のＴＣＲとの比較で類似する程度、同程度、又はより高い程度で、変異したアミノ酸配列に特異的に結合するか、又はがんを検出する、治療する、若しくは予防する能力を維持する、ＴＣＲの一部分を包含する。親のＴＣＲを参照にして抗原結合部分は、親のＴＣＲの、例えば約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％以上を含むことができる。
【0062】
抗原結合部分は、本発明の方法により単離されたＴＣＲのαとβ鎖のいずれか又は両方の抗原結合部分、例えば本発明の方法により単離されたＴＣＲのα鎖及び／又はβ鎖の可変領域（複数可）の、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の１つ以上を含む部分を含むことができる。本発明の１態様において、抗原結合部分は、α鎖のＣＤＲ１（ＣＤＲ１α）、α鎖のＣＤＲ２（ＣＤＲ２α）、α鎖のＣＤＲ３（ＣＤＲ３α）、β鎖のＣＤＲ１（ＣＤＲ１β）、β鎖のＣＤＲ２（ＣＤＲ２β）、β鎖のＣＤＲ３（ＣＤＲ３β）のアミノ酸配列、又はその任意の組み合わせを含むことができる。好ましくは、抗原結合部分は、本発明の方法により単離されたＴＣＲの、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、及びＣＤＲ３αのアミノ酸配列；ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、及びＣＤＲ３βのアミノ酸配列；又はＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、及びＣＤＲ３βの全てのアミノ酸配列を含む。
【0063】
本発明の１態様において、抗原結合部分は、例えば、上記で述べたＣＤＲ領域（例えば上記で述べた６つのＣＤＲ領域の全て）の組み合わせを含む、本発明の方法により単離されたＴＣＲの可変領域を含むことができる。これに関連して抗原結合部分は、α鎖の可変領域（Ｖα）のアミノ酸配列、β鎖の可変領域（Ｖβ）のアミノ酸配列、又は本発明の方法により単離されたＴＣＲのＶαとＶβの両方のアミノ酸配列を含むことができる。
【0064】
本発明の１態様において、抗原結合部分は可変領域と定常領域の組み合わせを含んでもよい。これに関連して抗原結合部分は、本発明の方法により単離されたＴＣＲの、α若しくはβ鎖の全長、又はαとβ鎖の両方を含むことができる。
【0065】
本発明の方法により単離された、単離された対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖の配列、又はその抗原結合部分は、養子細胞療法のための細胞の調製のために有用であり得る。これに関連して本発明の別の態様は、対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖の配列又はその抗原結合部分を発現する細胞集団を調製する方法を提供する。本方法は対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖配列又はその抗原結合部分を、本発明の他の側面に関連して本明細書で述べた何れかの方法に従って単離する工程を含んでもよい。
【0066】
本方法はさらに、単離された対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖の配列、又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞内に導入し、対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖配列、又はその抗原結合部分を発現する細胞を得る工程を含んでもよい。これに関連して本方法は、単離された対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖配列、又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を、組み換え発現ベクター中に、例えば、Greenら(編集), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 第４版. (2012)内で述べられたような、確立された分子クローニング技術を使用して、クロ－ニングすることを含んでもよい。本明細書の目的において、用語「組み換え発現ベクター」は、遺伝的に改変されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドのコンストラクトであって、そのコンストラクトがｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、そのベクターが細胞と、その細胞によりそのｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを発現させるのに十分な条件下で接触するときに、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの発現を許容するものを意味する。本発明のベクターは全体として、天然由来ではない。しかしながら、ベクターの一部を天然由来とすることは可能である。組み換え発現ベクターは、任意の型のヌクレオチドを含むことができ、ＤＮＡとＲＮＡを含むがそれらに限定されず、そのＤＮＡとＲＮＡは一本鎖又は二本鎖、合成されるか又は一部を天然起源から得ることができ、天然の、非天然の、又は改変されたヌクレオチドを含むことができる。組み換え発現ベクターは、天然由来、非天然由来のヌクレオチド間結合、又は両方の型の結合を含むことができる。好ましくは、非天然由来若しくは改変されたヌクレオチド、又はヌクレオチド間結合は、ベクターの転写又は複製を妨げることはない。
【0067】
本発明の組み換え発現ベクターは、任意の適切な組み換え発現ベクタ－であることができ、任意の適切な宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするのに使用することができる。適切なベクターは増殖（propagation）と増大（expansion）のために若しくは発現のために、又は両方のために設計されたもの、例えばプラスミドとウイルスを含む。ベクターは、トランスポゾン／トランスポサーゼ、ｐＵＣシリーズ（フェルメンタスライフサイエンス）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（ストラタジーン、ラホヤ、カリフォルニア州）、ｐＥＴシリーズ（ノバゲン、マディソン、ウィスコンシン州）、ｐＧＥＸシリーズ（ファルマシア・バイオテック、アプサラ、スウェーデン）、及びｐＥＸシリーズ（クローンテック、パロアルト、カリフォルニア州）からなる群から選択することができる。λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＺａｐＩＩ（ストラタジーン）、λＥＭＢＬ４、及びλＮＭ１１４９などのバクテリオファージベクターも使用することができる。植物発現ベクターの例は、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１、及びｐＢＩＮ１９（クローンテック）を含む。動物発現ベクターの例は、ｐＥＵＫ－Ｃ１、ｐＭＡＭ及びｐＭＡＭｎｅｏ（クローンテック）を含む。好ましくは、組み換え発現ベクターはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターである。
【0068】
単離された対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖配列、又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列（例えば、組み換え発現ベクター）の宿主細胞内への導入は、例えば上記のGreenらの中で述べられたような、本技術分野で知られている様々な異なるやり方の何れかで実施することができる。宿主細胞の中にヌクレオチド配列を導入するのに有用な技術の非限定的な例は、形質転換（transformation）、形質導入（transduction）、トランスフェクション、及びエレクトロポレーションを含む。
【0069】
本発明の１態様において本方法は、単離されて対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖配列、又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を、生体試料を提供した患者に対して自家である宿主細胞の中に導入する工程を含む。これに関連して、本発明の方法により同定及び単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分は、各患者に対して個別化（personalized）されていてもよい。しかしながら別の態様において、本発明の方法は、再発した（「ホットスポット」とも呼ばれる）がん特異的な変異によりコードされる、変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有する、ＴＣＲ又はその抗原結合部分を同定して単離してもよい。これに関連して本方法は、単離されて対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖の配列、又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を、患者に対して同種異系（allogeneic）である宿主細胞内に導入する工程を含んでもよい。例えば本方法は、単離されて対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖の配列、又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を、そのＴＣＲを元々発現した患者と同じＭＨＣ分子との関連で腫瘍が同じ変異を発現する他の患者の宿主細胞内に導入する工程を含んでもよい。
【0070】
本発明の１態様において、宿主細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣはＴ細胞を含み得る。Ｔ細胞は患者の多くの起源（source）から得ることが可能であり、それは腫瘍、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、若しくは他の組織、又は体液を含むが、それらに限定されるものではない。Ｔ細胞は任意の型のＴ細胞を含むことができ、任意の発達段階のものであることができ、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋ 二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えばＴｈ１とＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞（例えば腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ））、末梢血Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞等を含むが、それらに限定されるものではない。Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、又はＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方であってもよい。
【0071】
特定の理論又は機構に縛られるものではないが、分化がより少ない「より若い（younger）」Ｔ細胞は、より分化した「より老いた（older）」Ｔ細胞と比較して、より大きいインビボの持続性（persistence）、増殖性、及び抗腫瘍活性の任意の１つ以上を伴ってもよいと考えられている。従って本発明の方法は有利に、変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有する、対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖の配列又はその抗原結合部分を同定し及び単離し、及び、その対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖の配列又はその抗原結合部分を、そのＴＣＲ又はその抗原結合部分がそれから単離されたかもしれない「より老いた」Ｔ細胞（例えば、患者の腫瘍内のエフェクター細胞）と比較して、より大きなインビボの持続性、増殖性、及び抗腫瘍活性の任意の１つ以上を提供し得る「より若い」Ｔ細胞の中に導入してもよい。
【0072】
本発明の１態様において本方法は、ＴＣＲ又はその抗原結合部分が導入されている宿主細胞の数を増やす工程をさらに含む。細胞数の増加は、例えば、米国特許番号８，０３４，３３４；米国特許番号８，３８３，０９９；米国特許出願公開番号２０１２/０２４４１３３；Dudleyら J. Immunother., 26:332-42 (2003)；及びRiddellらJ. Immunol. Methods,128:189-201 (1990)の中で述べられている、本分野で既知である多くの方法の何れかにより達成することができる。１態様において細胞数の増加は、ＯＫＴ３抗体、ＩＬ－２、及びフィーダーＰＢＭＣ（例えば、照射された同種異系のＰＢＭＣ）と共に、Ｔ細胞を培養することにより実施される。
【0073】
本発明の別の態様は、本発明の他の側面に関して本明細書で述べた方法の何れかに従って調製された、単離された細胞集団を提供する。その細胞集団は、単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する宿主細胞に加えて、例えば単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現しない宿主細胞（例えばＰＢＭＣ）、又はＴ細胞以外の細胞、例えばＢ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞等の少なくとも１つの他の細胞を含む、不均一な集団であることができる。あるいは細胞集団は、その中に単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する宿主細胞を主として含む（例えば本質的にそれからなる）、実質的に均質な集団であることもできる。その集団は、集団の全ての細胞が単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現するような、その集団内の全ての細胞が単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する単一のＰＢＭＣのクローンである、クローン性の細胞集団であることもできる。本発明の１態様において細胞集団は、本明細書で述べたような単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分を発現する、宿主細胞を含むクローン性の集団である。単離されたＴＣＲ又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞内に導入することにより、本発明の方法は有利に、単離されたＴＣＲを発現し、変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有する宿主細胞を、高い割合で含む細胞集団を提供してもよい。本発明の１態様において、約１％～約１００％、例えば約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、若しくは約１００％、又は前述の任意の２つの値により規定される範囲の細胞集団は、単離されたＴＣＲを発現し、変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有する宿主細胞を含む。特定の理論又は機構に縛られるものではないが、単離されたＴＣＲを発現し、変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有する宿主細胞を高い割合で含む細胞集団は、宿主細胞の機能、例えば宿主細胞が、がん細胞を標的として破壊する及び／又はがんを治療若しくは予防する能力を妨げるかもしれない、無関係の細胞をより低い割合で含むと信じられている。
【0074】
本発明のＴＣＲ又はその抗原結合部分、及び細胞集団を調合して組成物、例えば医薬組成物とすることができる。この関連で本発明は、本発明のＴＣＲ、又はその抗原結合部分、又は細胞集団の何れか、及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、本発明のＴＣＲ、又はその抗原結合部分、又は細胞集団を、他の医薬活性剤（複数可）又は薬剤（複数可）、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン等の化学療法剤と組み合わせて含むことができる。
【0075】
好ましくは、担体は医薬的に許容可能な担体である。医薬組成物に関連してその担体は、検討中の特定の本発明のＴＣＲ、又はその抗原結合部分、又は細胞集団のために通常使用されるものの何れかであってもよい。そのような医薬的に許容可能な担体は当業者に良く知られ、市販されて容易に入手することができる。その医薬的に許容可能な担体は、使用を検討している状況下で不利益な副作用又は毒性を有さないものであることが好ましい。
【0076】
担体の選択は、特定の本発明のＴＣＲ、その抗原結合部分、又は細胞集団によるだけではなく、本発明のＴＣＲ、その抗原結合部分、又は細胞集団を投与するのに使用される特定の方法により一部分は決定されるであろう。従って、本発明の医薬組成物に適した種々の製剤がある。適切な製剤は、経口、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、又は腹膜内投与のためのものの何れかを含んでもよい。本発明のＴＣＲ又は細胞集団を投与するのに１つ超の経路を使用することができ、場合によっては、特定の経路は別の経路よりもより迅速であり且つより効果が高い応答を提供できる。
【0077】
好ましくは本発明のＴＣＲ、その抗原結合断片、又は細胞集団は、注射、例えば静脈内注射により投与される。本発明の細胞集団が投与されるときに、注射用の細胞のための医薬的に許容可能な担体は、任意の等張担体、例えば、通常の生理食塩水（約０．９０％ｗ／ｖの塩化ナトリウム水溶液、約３００ｍＯｓｍ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液、又は水１リットル当たり約９．０ｇの塩化ナトリウム）、ＮＯＲＭＯＳＯＬ Ｒ 電解質溶液（アボット、シカゴ、イリノイ州）、ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ Ａ（バクスター、ディアフィールド、イリノイ州）、約５％のデキストロース水溶液、又は乳酸リンゲル液等を含んでもよい。１態様において、医薬的に許容可能な担体にヒト血清アルブミンが補足される。
【0078】
本発明のＴＣＲ、その抗原結合部分、細胞集団、及び医薬組成物は、がんを治療又は予防する方法において使用可能であると考えられる。特定の理論又は機構に縛られるものではないが、本発明のＴＣＲ又はその抗原結合部分は、そのＴＣＲ又はその抗原結合部分が細胞により発現したときには、変異したアミノ酸配列を発現する標的細胞に対する免疫応答を仲介できるように、がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列に特異的に結合すると信じられている。これに関連して本発明の１態様は、哺乳類においてがんを治療又は予防する方法を提供し、その方法はその哺乳類に、本明細書で述べられた本発明の医薬組成物、単離されたＴＣＲアルファとベータ鎖配列の対、その抗原結合部分、又は細胞集団の何れかを、その哺乳類においてがんを治療又は予防するのに有効な量で投与することを含む。
【0079】
本発明の別の態様は、哺乳類においてがんの治療又は予防に使用するための本発明の他の側面に関連して本明細書で述べた、本発明のＴＣＲ又はその抗原結合部分、細胞集団、又は医薬組成物の何れかを提供する。
【0080】
本明細書で使用される用語「治療」及び「予防」、並びにそれから生じる単語は、必ずしも１００％又は完全な治療又は予防を意味するものではない。むしろ、当業者が潜在的な利点又は治療効果を有すると認識する、様々な程度の治療又は予防がある。この点において本発明の方法は哺乳類において、がんの治療又は予防を任意のレベルの任意の量で提供することができる。さらに本発明の方法により提供される治療又は予防は、治療又は予防されるがんの１つ以上の状態又は症状の治療又は予防を含むことができる。例えば治療又は予防は腫瘍の退縮の促進を含むことができる。また本明細書の目的において「予防」は、がん又はその症状若しくは状態の発症の遅延を含むことができる。
【0081】
本発明の目的のために、本発明のＴＣＲ、その抗原結合部分、細胞集団、又は医薬組成物の投与される量又は用量（例えば、本発明の細胞集団が投与されるときの細胞数）は、妥当な時間枠に亘って哺乳類において、効果（例えば治療又は予防の応答）を奏するために十分でなければならない。例えば、本発明のＴＣＲ、その抗原結合部分、細胞集団、又は医薬組成物の用量は、がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列に結合するのに、又投与の時から約２時間以上、例えば１２～２４時間以上の期間においてがんを検出、治療、若しくは予防するのに十分であるべきである。態様によってその時間がより長いことでさえあり得る。用量は、投与される特定の本発明のＴＣＲ、その抗原結合部分、細胞集団、又は医薬組成物の効力、及び哺乳類（例えばヒト）の状態、並びに、治療される哺乳類（例えばヒト）の体重により決定されるであろう。
【0082】
投与された用量を測定するための多くのアッセイが本技術分野で知られている。
本発明の目的のために、Ｔ細胞の様々な用量がそれぞれ与えられる１組の哺乳動物間で、哺乳動物にある特定の用量のそのようなＴ細胞が投与された際に、本発明のＴＣＲ、又はその抗原結合部分を発現するＴ細胞により、標的細胞が溶解され又はＩＦＮ－γが分泌される程度を比較することを含むアッセイが、哺乳動物に投与する開始用量を決定するために用いられ得る。ある用量の投与により標的細胞が溶解する又はＩＦＮ－γが分泌される程度は、本技術分野で既知の方法でアッセイできる。
本発明の目的のために、Ｔ細胞の様々な用量がそれぞれ与えられる１組の哺乳動物間で、哺乳動物にある特定の用量のそのようなＴ細胞が投与された際に、本発明のＴＣＲ、又はその抗原結合部分を発現するＴ細胞により、標的細胞が溶解され又はＩＦＮ－γが分泌される程度を比較することを含むアッセイが、哺乳動物に投与する開始用量を決定するために用いられ得る。ある用量の投与により標的細胞が溶解する又はＩＦＮ－γが分泌される程度は、本技術分野で既知の方法でアッセイできる。
【0083】
本発明のＴＣＲ、その抗原結合部分、細胞集団、又は医薬組成物の用量は、具体的な本発明のＴＣＲ、その抗原結合部分、細胞集団、又は医薬組成物の投与に伴うかもしれない、任意の有害な副作用の存在、性質、及び程度によっても決定されるであろう。典型的には主治医は、各々の個別の患者を治療する本発明のＴＣＲ、その抗原結合部分、細胞集団、又は医薬組成物の用量を、種々の因子、例えば年齢、体重、全般的な健康、食事、性別、投与されるべき本発明のＴＣＲ、その抗原結合部分、細胞集団、又は医薬組成物、投与経路、及び治療するべき状態の重篤さを考慮して決定するであろう。
【0084】
本発明の細胞集団が投与される１態様において、注入により投与される細胞数は、例えば、１００万～１０００億細胞の範囲で変化し得るが；この例示的範囲を下回る又は上回る量も本発明の範囲内である。例えば、本発明の宿主細胞の一日当たりの用量は、約１００万～約１５００億細胞（例えば、約５００万細胞、約２５００万細胞、約５億細胞、約１０億細胞、約５０億細胞、約２００億細胞、約３００億細胞、約４００億細胞、約６００億細胞、約８００億細胞、約１０００億細胞、約１２００億細胞、約１３００億細胞、約１５００億細胞、又は前述の値の何れか２つにより規定される範囲）、好ましくは約１０００万～約１３００億細胞（例えば、約２０００万細胞、約３０００万細胞、約４０００万細胞、約６０００万細胞、約７０００万細胞、約８０００万細胞、約９０００万細胞、約１００億細胞、約２５０億細胞、約５００億細胞、約７５０億細胞、約９００億細胞、約１０００億細胞、約１１００億細胞、約１２００億細胞、約１３００億細胞、又は前述の値の何れか２つにより規定される範囲）、より好ましくは約１億細胞～約１３００億細胞（例えば、約１億２０００万細胞、約２億５０００万細胞、約３億５０００万細胞、約４億５０００万細胞、約６億５０００万細胞、約８億細胞、約９億細胞、約３０億細胞、約３００億細胞、約４５０億細胞、約５００億細胞、約７５０億細胞、約９００億細胞、約１０００億細胞、約１１００億細胞、約１２００億細胞、約１３００億細胞、又は前述の値の何れか２つにより規定される範囲）とすることができる。
【0085】
細胞集団が投与される本発明の方法の目的のために、その細胞はその哺乳類に対して、同種異系（allogeneic）又は自家（autologous）である細胞にすることができる。好ましくはその細胞はその哺乳類に対して自家である。
【0086】
本発明の他の態様は、本明細書で述べられた、哺乳類におけるがんの治療又は予防において使用するための、本発明のＴＣＲ、その抗原結合部分、単離された細胞集団、又は医薬組成物の何れかを提供する。
【0087】
がんは有利には、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、胞巣型横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん、肛門、肛門管、又は肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頸部、胆嚢、又は胸膜のがん、鼻、鼻腔、又は中耳のがん、口腔のがん、膣のがん、陰門のがん、胆管がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、消化管カルチノイド腫瘍、グリオーマ、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、悪性中皮腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、中咽頭のがん、卵巣がん、陰茎のがん、膵臓がん、腹膜、網（omentum）、及び腸間膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん（renal cancer）、皮膚がん、小腸がん、軟組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮のがん、尿管がん、膀胱がん、固形腫瘍、及び液性腫瘍の何れかを含む、任意のがんであり得る。好ましくは、がんは上皮がんである。１態様においてがんは、胆管がん、メラノーマ、大腸がん、又は直腸がんを含む、任意のがんである。
【0088】
本発明の方法で言及する哺乳動物は、任意の哺乳動物であり得る。本明細書で使用される用語「哺乳動物」は任意の哺乳動物を言い、マウスやハムスター等のネズミ目の哺乳動物、及び、ウサギ等のウサギ目の哺乳動物を含むが、それに限定されない。哺乳動物が、ネコ科動物（Feline）（ネコ（cat））とイヌ科動物（Canine）（イヌ（dog））を含むネコ目に由来することは好適である。哺乳動物は好ましくは、ウシ亜科動物（Bovine）（ウシ（cow））とイノシシ科動物（Swine）（ブタ（pig））を含むウシ目、又はウマ科動物（Equine）（ウマ（horse））を含むウマ目に由来する。哺乳動物は好ましくは、霊長目、セボイド目、若しくはシモイド目（サル）の哺乳動物、又はアンスロポイド目（ヒトと類人猿）の哺乳動物である。より好適な哺乳動物はヒトである。特に好適な態様においては、哺乳動物はがん特異的な変異を発現している患者である。
【0089】
下記の実施例において本発明をさらに描くが、もちろん、如何なる意味でも本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【0090】
実施例１～５
実施例１～５において述べられた実験のために、下記の材料及び方法が採用された。
実施例１～５において述べられた実験のために、下記の材料及び方法が採用された。
【0091】
ネオアンチゲン反応性のＴＩＬのスクリーニング
全ての患者材料は、全米がん研究所の審査委員会が承認した臨床治験（治験登録ＩＤ：ＮＣＴ０１１７４１２１）から得られた。ネオアンチゲンとネオアンチゲン反応性のＴＩＬ集団を同定する方法は、国際公開番号２０１６/０５３３３８に述べられている。簡単に言えば、腫瘍断片を切り出し、ＩＬ－２を含む培地（６０００ＩＵ／ｍＬ）中で３～６週間培養した（Dudley et al., J. Immunother., 26: 332-342 (2003)）。細胞数が増えたＴＩＬ培養物を、ネオアンチゲン認識についてスクリーニングした。増えたＴＩＬ培養物をネオアンチゲン認識についてスクリーニングするために、全エキソーム及びＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）により、腫瘍内の非同義変異を同定した。非同義変異を包含するタンデムミニ遺伝子（ＴＭＧ）ライブラリーを合成した。ＴＭＧを発現している自家の樹状細胞（ＤＣ）をスクリーニングし、ＴＩＬにより認識されるネオアンチゲン（複数可）を同定した(Lu et al., Clin. Cancer Res., 20: 3401-3410 (2014))（図１参照）。
全ての患者材料は、全米がん研究所の審査委員会が承認した臨床治験（治験登録ＩＤ：ＮＣＴ０１１７４１２１）から得られた。ネオアンチゲンとネオアンチゲン反応性のＴＩＬ集団を同定する方法は、国際公開番号２０１６/０５３３３８に述べられている。簡単に言えば、腫瘍断片を切り出し、ＩＬ－２を含む培地（６０００ＩＵ／ｍＬ）中で３～６週間培養した（Dudley et al., J. Immunother., 26: 332-342 (2003)）。細胞数が増えたＴＩＬ培養物を、ネオアンチゲン認識についてスクリーニングした。増えたＴＩＬ培養物をネオアンチゲン認識についてスクリーニングするために、全エキソーム及びＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）により、腫瘍内の非同義変異を同定した。非同義変異を包含するタンデムミニ遺伝子（ＴＭＧ）ライブラリーを合成した。ＴＭＧを発現している自家の樹状細胞（ＤＣ）をスクリーニングし、ＴＩＬにより認識されるネオアンチゲン（複数可）を同定した(Lu et al., Clin. Cancer Res., 20: 3401-3410 (2014))（図１参照）。
【0092】
単一細胞のＲＮＡ配列決定データからのネオアンチゲン特異的なＴＣＲ配列の同定
単一細胞（single cell）のＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）データから、ネオアンチゲン特異的なＴＣＲ配列を同定する方法を、図２に示す模式図で概説する。ネオアンチゲン反応性のＴＩＬ培養物を同定した後に、１×１０６個のＴＩＬを、１×１０６個のＴＭＧをパルスされた樹状細胞（ＤＣ）と共に４時間共培養した。共培養の後にＴ細胞を再懸濁し、大々的に洗浄した。その後、製造業者の指示（フリューダイム（サンフランシスコ、カリフォルニア））とクローンテック（マウンテンビュー、カリフォルニア）に従って、Ｔ細胞を単一細胞の分取（single-cell sorting）にかけ、ＲＮＡ配列決定試料を調製した。９６個全ての単一細胞のＲＮＡ配列決定試料を、ＮＥＸＴＥＲＡ ＸＴ ＤＮＡライブラリー調製キット（イルミナ（サンディエゴ、カリフォルニア州））を用いてバーコード化し、その後、試薬キットＶ３（２×２５０塩基対（ｂ．ｐ．））を使用したＩＬＬＵＭＩＮＡ ＭＩＳＥＱシステムを用いて配列決定した。
単一細胞（single cell）のＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）データから、ネオアンチゲン特異的なＴＣＲ配列を同定する方法を、図２に示す模式図で概説する。ネオアンチゲン反応性のＴＩＬ培養物を同定した後に、１×１０６個のＴＩＬを、１×１０６個のＴＭＧをパルスされた樹状細胞（ＤＣ）と共に４時間共培養した。共培養の後にＴ細胞を再懸濁し、大々的に洗浄した。その後、製造業者の指示（フリューダイム（サンフランシスコ、カリフォルニア））とクローンテック（マウンテンビュー、カリフォルニア）に従って、Ｔ細胞を単一細胞の分取（single-cell sorting）にかけ、ＲＮＡ配列決定試料を調製した。９６個全ての単一細胞のＲＮＡ配列決定試料を、ＮＥＸＴＥＲＡ ＸＴ ＤＮＡライブラリー調製キット（イルミナ（サンディエゴ、カリフォルニア州））を用いてバーコード化し、その後、試薬キットＶ３（２×２５０塩基対（ｂ．ｐ．））を使用したＩＬＬＵＭＩＮＡ ＭＩＳＥＱシステムを用いて配列決定した。
【0093】
単一細胞のＲＮＡ配列決定データを、国際免疫遺伝学情報システム（ＩＭＧＴ）データベース(Lefranc et al., Nucleic Acids Res., 43: D413-422 (2015))に由来するＴＣＲα／β可変（Ｖ）領域配列を用いて、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒアライナー（ＢＷＡ）(Liら, Bioinformatics, 25: 1754-60 (2009); Liら, Bioinformatics, 26(5): 589-95 (2010))によりアラインメントした。ＣＤＲ３領域の配列は、Ｖ領域のＣ末端近傍の保存アミノ酸残基（Ｃ．．．Ｆ／Ｗ）に基づいて同定され、ソフトウェアにより解析及び報告された。非生産的な（フレーム外の）配列を有する幾つかのＴＣＲを、解析から除去した。加えて、ＦＬＵＩＤＩＧＭ Ｃ１の単一細胞ｍＲＮＡ配列決定システムの分取（sorting）機構が不完全であるために、幾つかの試料は１つ超のＴ細胞を含むかもしれない。結果として、１つ以上のＴＣＲβを有する試料を、引き続いての解析から除外した。別個にＲＮＡ配列決定データを、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２又は他の可能性があるＴ細胞活性化マーカーの配列に対してアラインメントした。高いＩＦＮ－γを伴う単一細胞に関連するアラインメントされたＴＣＲ断片を抽出し、ＴＣＲ Ｖ、ＣＤＲ３及び定常（Ｃ）領域を同定した。対を成す全長ＴＣＲ配列をアセンブリングする（assemble）ために、不完全な５’Ｖ領域配列を、ＩＭＧＴデータベース由来の同定されたヒト全長ＴＣＲ Ｖ領域配列とアセンブリングした（assembled with）。対の形成を促進し、ＴＣＲα／βの誤った対形成を避けるために、３’Ｃ領域配列を改変されたマウス定常領域配列 (Cohenら, Cancer Res., 66: 8878-8886 (2006); Cohen et al., Cancer Res., 67: 3898-3903 (2007); Haga-Friedmanら, J. Immunol., 188: 5538-5546 (2012))と置き換えた。（図２）
【0094】
ネオアンチゲン特異的なＴＣＲの検証
詳細なプロトコールは、Morganら、Science, 314: 126-129 (2006)に述べられており、本明細書に述べられた幾つかの小さな改変を伴っている。改変されたマウス定常領域を有し、フリンＳＧＳＧＰ２Ａリンカー(ＲＡＫＲＳＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ)（配列番号１）により連結された、全長ＴＣＲαとＴＣＲβ配列を合成し、ＭＳＧＶ８レトロウイルス発現ベクター(Wargoら, Cancer Immunol. Immunother., 58: 383-394 (2009))にクローン化した。ＭＳＧＶ８－ＴＣＲプラスミド（１．５μｇ）と０．７５μｇのＶＳＶ－Ｇ（ＲＤ１１４）プラスミドを、（各６穴の中の）１×１０６個の２９３ＧＰ細胞の中に、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００トランスフェクション試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて共トランスフェクトした。４８時間後に上清を回収し、１分当たり３０００回転（ｒｐｍ）で１０分間回転し、破片を除去した。２０００ｇで２時間遠心分離することにより、レトロウイルスの上清を、ＲＥＴＲＯＮＥＣＴＩＮ試薬（タカラ、大津、日本）で被覆された６穴プレート上に搭載した。
詳細なプロトコールは、Morganら、Science, 314: 126-129 (2006)に述べられており、本明細書に述べられた幾つかの小さな改変を伴っている。改変されたマウス定常領域を有し、フリンＳＧＳＧＰ２Ａリンカー(ＲＡＫＲＳＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ)（配列番号１）により連結された、全長ＴＣＲαとＴＣＲβ配列を合成し、ＭＳＧＶ８レトロウイルス発現ベクター(Wargoら, Cancer Immunol. Immunother., 58: 383-394 (2009))にクローン化した。ＭＳＧＶ８－ＴＣＲプラスミド（１．５μｇ）と０．７５μｇのＶＳＶ－Ｇ（ＲＤ１１４）プラスミドを、（各６穴の中の）１×１０６個の２９３ＧＰ細胞の中に、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００トランスフェクション試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて共トランスフェクトした。４８時間後に上清を回収し、１分当たり３０００回転（ｒｐｍ）で１０分間回転し、破片を除去した。２０００ｇで２時間遠心分離することにより、レトロウイルスの上清を、ＲＥＴＲＯＮＥＣＴＩＮ試薬（タカラ、大津、日本）で被覆された６穴プレート上に搭載した。
【0095】
別途に、健康なドナー由来の１×１０６個／ｍＬの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、５％ヒト血清を含むＡＩＭ Ｖ培地の中で、５０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＯＫＴ３と３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２により刺激した。２日後に刺激された細胞を回収し、ＯＫＴ３を含まない同じ培地中に再懸濁した。刺激されたＰＢＭＣを、２×１０６細胞／穴でレトロウイルスを充填した各々の穴に添加し、１０００ｇで１０分間回転した。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。次の日に、ＰＢＭＣを新たなレトロウイルスを充填した穴に移動し、形質導入操作を繰り返した。実験の前にもう５日間、３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と５％のヒト血清を有するＡＩＭ Ｖ培地の中で、ＴＣＲを形質導入したＴ細胞を継続して培養した。
【0096】
ＴＣＲが形質導入されたＴ細胞の特異性を試験するために、自家の樹状細胞（ＤＣ）又はＥＢＶ形質転換したＢ細胞を、ＴＭＧ ＲＮＡ、全長ｍＲＮＡ、又はペプチドと２４時間パルスした。１×１０５個のＴ細胞をその後、１×１０５の樹状細胞（ＤＣ）又はＥＢＶ形質転換したＢ細胞と、９６穴のＵ底プレート内で一晩共培養した。上清を回収し、Ｔ細胞からのＩＦＮ－γの分泌を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）により測定した。
【0097】
実施例１
この実施例は、ＴＩＬ４０９０培養物から、ネオアンチゲン特異的なＴＣＲの対を成すアルファとベータ鎖配列を単離する方法を示す。
この実施例は、ＴＩＬ４０９０培養物から、ネオアンチゲン特異的なＴＣＲの対を成すアルファとベータ鎖配列を単離する方法を示す。
【0098】
直腸結腸がんを有する患者から切除した転移性肺病変から、ＴＩＬ４０９０培養物を培養した。培養物の１つであるＴＩＬ４０９０Ｆ７は、ＴＭＧライブラリースクリーニングの結果に基づき、ＴＭＧ－５を認識した。ネオアンチゲン特異的なＴＣＲを単離するために、ＴＩＬ４０９０Ｆ７細胞を、ＴＭＧ－５をパルスされた自家樹状細胞（ＤＣ）と４時間共培養し、単一細胞のＲＮＡ配列決定解析にかけた。単一細胞（single cell）のＲＮＡ配列決定データの中の全ての配列リードの間で、２つの単一の細胞は高いパーセンテージのＩＦＮ－γリードを発現した（全Ｒ１リードの６．４２％と１２．２５％）（図３Ａ）。残りの単一の細胞は０～０．１６％のＩＦＮ－γリードを発現したに過ぎなかった（図３Ａ）。このアプローチを使用して検出可能なＩＬ－２を発現した単一細胞は無かった（図３Ｂ）。これらのデータは、これら２つのＴ細胞が、樹状細胞（ＤＣ）により提示されたネオアンチゲンと特異的に反応することを示唆する。次に、ＴＣＲα／β可変領域とＣＤＲ３配列は、これら２つのＴ細胞の単一細胞のＲＮＡ配列決定データから同定され、両方のＴ細胞に由来するＴＣＲ配列は同一であった（表１）。
【0099】
【表1】
【0100】
実施例２
この実施例は、実施例１で単離されたＴＣＲアルファとベータ鎖の配列が形質導入されたＴ細胞は、実施例１の患者のがんにより発現されたネオアンチゲンを特異的に認識することを示す。
この実施例は、実施例１で単離されたＴＣＲアルファとベータ鎖の配列が形質導入されたＴ細胞は、実施例１の患者のがんにより発現されたネオアンチゲンを特異的に認識することを示す。
【0101】
ＴＩＬ４０９０Ｆ７から単離されたＴＣＲを検証するために、フリンＳＧＳＧＰ２Ａリンカーにより結合した改変されたマウス定常領域を有する、全長ＴＣＲαとＴＣＲβ配列を合成し、ＭＳＧＶ８レトロウイルス発現ベクター中にクローン化した。末梢血Ｔ細胞に４０９０ＴＣＲを形質導入し、ＴＭＧ－５をパルスされた４０９０樹状細胞（ＤＣ）と一晩共培養した。Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの分泌に基づいて、４０９０ＴＣＲを形質導入したＴ細胞はＴＭＧ－５をパルスされた樹状細胞（ＤＣ）を認識したが、無関係のＴＭＧをパルスされた樹状細胞（ＤＣ）は認識しなかった（図３Ｃ）。
【0102】
４０９０ＴＣＲの特異性を試験するために追加の実験を行った。ＴＭＧ－５は合計で１２個のミニ遺伝子を含んでいた。各々のミニ遺伝子に対応する２５ｍｅｒの変異した長いペプチドを合成し、４０９０樹状細胞（ＤＣ）に２４時間パルスした。洗浄した後に、ペプチドをパルスされた樹状細胞（ＤＣ）を、４０９０ＴＣＲを形質導入したＴ細胞と一晩共培養した。４０９０ＴＣＲが形質導入されたＴ細胞は、変異したＵＳＰ８（ユビキチン特異的ペプチダーゼ８）ペプチドであるＷＡＫＦＬＤＰＩＴＧＴＦＨＹＹＨＳＰＴＮＴＶＨＭＹ（Ｒ＞Ｈ）（配列番号２）をパルスされた樹状細胞（ＤＣ）とのみ反応し、４０９０ＴＣＲは変異したＵＳＰ８を認識することを示唆している（図３Ｄ）。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製された変異したＵＳＰ８の長いペプチドと野生型（ＷＴ）の同等物を、４０９０樹状細胞（ＤＣ）に２４時間パルスした。その後、ペプチドをパルスされたＤＣ（樹状細胞）を、４０９０ＴＣＲを形質導入したＴ細胞と一晩共培養した。４０９０ＴＣＲが形質導入されたＴ細胞は、０．０１μＭの最小濃度で、変異したＵＳＰ８ペプチドと反応したが、野生型（ＷＴ）ＵＳＰ８ペプチドの意味がある認識を示すことはなかった（図３Ｅ）。
【0103】
実施例３
この実施例は、ＴＩＬ４０９５培養物から、ネオアンチゲン特異的なＴＣＲの対を成すアルファとベータ鎖配列を単離する方法を示す。
この実施例は、ＴＩＬ４０９５培養物から、ネオアンチゲン特異的なＴＣＲの対を成すアルファとベータ鎖配列を単離する方法を示す。
【0104】
結腸直腸がんを有する患者から切除された転移性肺病変から、ＴＩＬ４０９５培養物を培養した。ＴＭＧライブラリースクリーニングの結果に基づいて、ＴＩＬ４０９５Ｆ５はＴＭＧ－１を認識した。ネオアンチゲン特異的なＴＣＲを単離するために、ＴＩＬ４０９５Ｆ５細胞を、ＴＭＧ－１をパルスされた自家樹状細胞（ＤＣ）と４時間共培養し、単一細胞のＲＮＡ配列決定解析にかけた。高いレベルのＩＦＮ－γリード（０．７９％～３．７４％）を有する全ての単一細胞を同定した（図４Ａ）。これらのＴ細胞は全て、まったく同一のＴＣＲα／βの可変及びＣＤＲ３の配列を含んでいた（表２）。１つの単一細胞のみが、検出可能なＩＬ－２リードを発現し（０．０３％）（図４Ｂ）、この単一細胞はＩＦＮ－γを高いレベルで共発現した（１．０７％）（図４Ｃ）。
【0105】
【表2】
【0106】
実施例４
この実施例は、実施例３で単離されたＴＣＲアルファとベータ鎖配列を形質導入されたＴ細胞が、実施例３の患者のがんにより発現されたネオアンチゲンを特異的に認識することを示す。
この実施例は、実施例３で単離されたＴＣＲアルファとベータ鎖配列を形質導入されたＴ細胞が、実施例３の患者のがんにより発現されたネオアンチゲンを特異的に認識することを示す。
【0107】
実施例３のＴＩＬ４０９５Ｆ５から単離されたＴＣＲを検証するために、改変されたマウス定常領域を有する全長のＴＣＲαとＴＣＲβの配列を合成し、ＭＳＧＶ８レトロウイルス発現ベクター中にクローン化し、その後ドナーＴ細胞中に形質導入した。過去の研究において、ＨＬＡ－Ｃ０８０２拘束性の様式で変異したＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）ペプチドを認識するＴＣＲが同定された（Tran et al., Science, 350: 1387-1390 (2015)）。患者４０９５はＨＬＡ－Ｃ０８０２とＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）について陽性であることが見い出され、且つ、ＴＭＧ－１はＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）をコードするために、この４０９５ＴＣＲもＨＬＡ－Ｃ０８０２拘束性のＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）を認識するかどうかを試験した。図４Ｄに示されるように、４０９５ＴＣＲを形質導入したＴ細胞を、全長の野生型（ＷＴ）ＫＲＡＳ又はＧ１２ＤのｍＲＮＡをパルスされた自家樹状細胞（ＤＣ）と一晩共培養した。４０９５ＴＣＲを形質導入したＴ細胞はＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）をパルスされた樹状細胞（ＤＣ）を認識したが、野生型（ＷＴ）ＫＲＡＳをパルスされた樹状細胞（ＤＣ）は認識しなかった。最後に、自家樹状細胞（ＤＣ）に、ＨＬＡ－Ｃ０８０２拘束性ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）抗原の最小エピトープＧＡＤＧＶＧＫＳＡ（配列番号３）を２時間パルスした。４０９５ＴＣＲを形質導入したＴ細胞は、０．０１μＭの最小濃度でＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）エピト－プを認識したが、野生型（ＷＴ）の同等物は認識しなかった（図４Ｅ）。
【0108】
実施例５
この実施例は、ＴＩＬ４１１２培養物から、ネオアンチゲン特異的なＴＣＲの対を成すアルファとベータ鎖の配列を単離する方法を示す。
この実施例は、ＴＩＬ４１１２培養物から、ネオアンチゲン特異的なＴＣＲの対を成すアルファとベータ鎖の配列を単離する方法を示す。
【0109】
胆管がんを有する患者から切除された転移性肝臓病変から、ＴＩＬ４１１２培養物を培養した。培養物の１つであるＴＩＬ４１１２Ｆ５は、ＴＭＧライブラリースクリーニングの結果に基づいて、ＴＭＧ－９を認識することが見い出された。ネオアンチゲン特異的なＴＣＲを同定するために、ＴＩＬ４１１２Ｆ５細胞を、ＴＭＧ－９をパルスされた自家樹状細胞（ＤＣ）と４時間共培養し、単一細胞のＲＮＡ配列決定解析にかけた。高いレベルのＩＦＮ－γリード（＞２％）を有する２２個の単一細胞は、全く同一のＴＣＲ配列を含んでいた（図５Ａ、図５Ｃ、及び表３）。しかしながら、２２個の単一細胞の中の１３個は、このクローン型ではＴＣＲαの発現のレベルが低いために、検出可能なＴＣＲαを含んでいなかった。８つの単一細胞は、０．０１％～０．１％の範囲の検出可能なＩＬ－２リードを発現した（図５Ｂと図５Ｃ）。それらの間で、６個の単一細胞は同じＴＣＲα／β配列を発現した。１つの単一細胞は同一のＴＣＲβ配列を発現したが、ＴＣＲαは検出不可能であった。加えて１つの単一細胞は、如何なる検出可能なＴＣＲα／β配列も発現しなかった（図５Ａ～５Ｃ）。
【0110】
【表3】
【0111】
ＴＩＬ４１１２Ｆ５から同定されたＴＣＲを検証するために、改変されたマウス定常領域を有する全長ＴＣＲαとＴＣＲβ配列を合成し、その後ドナーＴ細胞の中に形質導入した。４１１２ＴＣＲを形質導入したＴ細胞は、ＴＭＧ－９をパルスされた樹状細胞（ＤＣ）を認識したが、関連しないＴＭＧをパルスされた樹状細胞（ＤＣ）は認識しなかった（図５Ｄ）。次にＴＭＧ－９のアミノ酸配列を、免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＢ）及び解析リソースウェブサイト（iedb.org）、並びに生物学的配列解析センター（ＣＢＳ）の解析ＮｅｔＭＨＣウェブサイト（cbs.dtu.dk/services/NetMHC/）に提示し、患者４１１２の６つのＨＬＡに対して高い親和性を有するペプチドを予測した。ＩＥＤＢ（ランク＜１％）とＮｅｔＭＨＣ（ランク＜２％）由来の、合計で６７個の予測された高親和性ペプチドを合成し、混ぜ合わせて１０個のプールとした。４１１２ＴＣＲを形質導入したＴ細胞は、自家のＥＢＶで形質転換したＢ細胞にパルスされた短いペプチドプール（ＳＰＰ）－９を認識した（図５Ｅ）。引き続いた実験で、変異したＮＢＡＳ（神経芽細胞腫の増幅された配列）ペプチドであるＷＳＹＤＳＴＬＬＡＹ（Ｃ＞Ｓ）（配列番号４）は、４１１２ＴＣＲを形質導入したＴ細胞により認識される最小のエピトープであると同定された（図５Ｆ、５Ｇ）。
【0112】
実施例６
この実施例は、ＴＩＬ４１７１培養物から、ネオアンチゲン特異的なＴＣＲの対を成すアルファとベータ鎖配列を単離する方法を示す。
この実施例は、ＴＩＬ４１７１培養物から、ネオアンチゲン特異的なＴＣＲの対を成すアルファとベータ鎖配列を単離する方法を示す。
【0113】
結腸直腸がんを有する患者から切除された転移性肺病変から、ＴＩＬ４１７１培養物を培養した。１２８個の長いペプチド（２５ｍｅｒ）を合成し、各々のペプチドは、両側に１２個の正常なアミノ酸が隣接する非同義変異を含んでいた。ＴＩＬ４１７１培養物をペプチドライブラリーに対してスクリ－ニングし、培養物の１つであるＴＩＬ４１７１Ｆ６は、ペプチドプール３（ＰＰ－３）を認識した（図９Ａ）。その後ＴＩＬ４１７１Ｆ６細胞を、ＰＰ－３をパルスされた自家樹状細胞（ＤＣ）と４時間共培養し、単一細胞のＲＮＡ配列決定解析にかけた。ＩＦＮ－γとＩＬ－２の発現を測定した（図９Ｂ－９Ｄ）。９個の試料は高レベルのＩＦＮ－γのｍＲＮＡを含んでいた（２２０９～２４８４５のＦＰＫＭ（１００万個のマップされたリード当たりの転写産物の千塩基当たりの断片））（図９Ｂ）。それらの間で、６つの試料は同じＴＣＲβＣＤＲ３配列を有していた。２つの試料は如何なる検出可能なＴＣＲβを含まず、１つの試料は、他のＴ細胞による混入によってもたらされた可能性が高い、２つの異なるＴＣＲβのＣＤＲ３配列を含んでいた。しかしながらこれらの何れの試料も、如何なる検出可能なＴＣＲα鎖配列を含んでいなかった。同様に４つの試料は、検出可能なＩＬ－２のｍＲＮＡ（３３１．２～１４９７ＦＰＫＭ）を含んでいた。これらの試料は全て同一のＴＣＲβＣＤＲ３の配列を含んでいたが、どの試料も如何なる検出可能なＴＣＲα鎖配列を有しなかった。
【0114】
失われたＴＣＲα鎖を発見する試みの中で、この実験で得られた単一細胞のＲＮＡ配列決定のデータを更に検討した。４つのＩＦＮ－γ＋の単一細胞と２つのＩＬ－２＋の単一細胞は、Ｖ遺伝子セグメントＤＶ３、Ｊ遺伝子セグメントＡＪ５６とＣ遺伝子セグメントＡＣを含む独特なＴＣＲ鎖を発現することを見出した。ＡＶ１４／ＤＶ４、ＡＶ２３／ＤＶ６、ＡＶ２９／ＤＶ５、ＡＶ３６／ＤＶ７、及びＡＶ３８－２／ＤＶ８（Lefranc, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., pp. A.1O.1-A.1O.23 (2001)）を含む幾つかのＶ遺伝子セグメントが、ＴＣＲαとＴＣＲδ鎖の間で共有されていた。これらのＶ遺伝子セグメントは、ＴＣＲαのＡＪ接合（joining）遺伝子セグメントに再配置（rearrange）され、並びにＴＣＲδのＤＤ多様性遺伝子セグメント及びＤＪ接合遺伝子セグメントに再配置されていることが見い出された。特にＤＶ３の転写方向性は逆転している。これまでには、ＴＣＲα鎖がＤＶ３遺伝子セグメントを利用できることは報告されていなかった。
【0115】
この独得なＴＣＲ鎖の機能を試験するために、このＴＣＲ鎖を同定されたＴＣＲβ鎖と結合し、その後にレトロウイルスベクター中にクローン化した。４１７１ＴＣＲが形質導入されたＴ細胞はＰＰ－３に対する強い反応性を有した（図９Ｅ）。このペプチドプールＰＰ－３は、１４個の変異した２５ｍｅｒペプチドを含んでいた。
【0116】
次に自家樹状細胞（ＤＣ）に、ペプチドプールＰＰ－３に由来する個々のペプチドを２４時間パルスした。ペプチドをパルスされた樹状細胞（ＤＣ）を、４１７１ＴＣＲを形質導入したＴ細胞と共培養した。４１７１ＴＣＲは、変異したペプチドＳＩＮ３Ａ（ＳＩＮ３転写制御ファミリーメンバーＡ）をパルスされた樹状細胞（ＤＣ）を認識した（図９Ｆ）。
【0117】
最後に、精製した２５ｍｅｒの野生型（ＷＴ）又は変異したＳＩＮ３Ａペプチド（ＬＧＫＦＰＥＬＦＮＷＦＫＩＦＬＧＹＫＥＳＶＨＬＥＴ（配列番号２５）、Ｎ＞Ｉ）を、自家樹状細胞（ＤＣ）に２４時間パルスした。ペプチドをパルスされた樹状細胞（ＤＣ）を形質導入されたＴ細胞と共培養した。Ｔ細胞からのＩＦＮ－γの分泌をＥＬＩＳＡにより測定した。４１７１ＴＣＲを形質導入したＴ細胞は、変異したＳＩＮ３Ａペプチドを特異的に認識するが、野生型の同等物は認識しないことが示された（図９Ｇ）。
【0118】
よってこの独特なＴＣＲは機能を有し、且つそれは変異したＳＩＮ３Ａを特異的に認識することができた。他のＶ遺伝子セグメントと同様に、これらのデータは、ＤＶ３遺伝子セグメントはＴＣＲαとＴＣＲδ鎖の間で共有され得ることを示唆した。
【0119】
出版物、特許出願、及び特許を含む本明細書で引用された全ての参照文献は、各参照文献が個々に且つ具体的に参照により組み込まれると示され、本明細書に完全に記載されているのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【0120】
用語「a」及び「an」及び「the」及び「少なくとも１つ（at least one）」、並びに本発明の記述と関連する類似する指示対象物（特に下記の特許請求の範囲との関連における）の使用は、本明細書中に別段の指示がない限り、又は明確に文脈から否定されない限り、単数及び複数の両方を含むと解釈されるべきである。１つ以上の項目のリストに続く用語「少なくとも１つ（at least one）」の使用（例えば「Ａ及びＢの少なくとも１つ」）は、本明細書中に別段の指示がない限り、又は明確に文脈から否定されない限り、リストされた項目から選択される１つの項目（Ａ又はＢ）又はリストされた項目の２つ以上の任意の組み合わせ（Ａ及びＢ）を意味するものと解釈されるべきである。用語「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」、及び「含む（containing）」は、特に断りがない限り、非限定的用語（open-ended term）（すなわち、「含むが、限定されない」という意味）と解釈されるべきである。本明細書の数値範囲の言及は、本明細書中に別段の指示がない限り、単にその範囲内に入る各々の別の値を個別に言及する短縮された方法として働くことを意図するものであり、それぞれの別の値は、本明細書に個別に記載されたかのように、本明細書中に組み込まれる。本明細書で述べられる全ての方法は、本明細書中に別段の指示がない限り、又は特に明確に文脈から否定されない限り、任意の適切な順番で実施することができる。本明細書で提供された任意の及び全ての例、又は例示的な言語（例えば「など（such as）」）の使用は、単に本発明をより良く説明することを意図するものであり、特に特許請求されない限り、本発明の範囲の限定をもたらすものではない。本明細書の言語は、特許請求されない如何なる要素についても、本発明の実施に必須であると示すものと解釈されるべきではない。
【0121】
本発明を実施するための本発明者らに知られている最良の形態を含めて、本発明の好適な態様は本明細書に述べられている。それらの好適な態様の変形は、前記の記載を読んだ当業者にとって自明となり得る。本発明者らは当業者がそのような変形を適切に採用することを予測しており、本発明者らは本発明が、本明細書に明確に述べられた以外のように実施されることを意図している。従って本発明は、適用され得る法律により許可されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲の中で述べられた対象の全ての改変と均等物を含む。さらに、本明細書中に別段の指示がない限り、又は特に明確に文脈から否定されない限り、上記で述べた要素の任意の組み合わせが、その可能な全ての改変において本発明に包含される。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図9F】
【図9G】
【配列表】