特許 7317896 組換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ＲＳウイルス（ＲＳＶ）ワクチン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-07-21

(45)【発行日】2023-07-31

(54)【発明の名称】組換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ＲＳウイルス（ＲＳＶ）ワクチン

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/863 20060101AFI20230724BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230724BHJP

   C07K 14/08 20060101ALI20230724BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20230724BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20230724BHJP

【ＦＩ】

C12N15/863 Z ZNA

C12N7/01

C07K14/08

A61K39/12

A61P31/14

【請求項の数】 20

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2021094027

(22)【出願日】2021-06-04

(62)【分割の表示】P 2018242562の分割

【原出願日】2013-03-15

(65)【公開番号】P2021137023

(43)【公開日】2021-09-16

【審査請求日】2021-06-14

(31)【優先権主張番号】61/678,367

(32)【優先日】2012-08-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】12005594.2

(32)【優先日】2012-08-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】509296443

【氏名又は名称】バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ

(74)【代理人】

【識別番号】100069556

【弁理士】

【氏名又は名称】江崎 光史

(74)【代理人】

【識別番号】100111486

【弁理士】

【氏名又は名称】鍛冶澤 實

(74)【代理人】

【識別番号】100139527

【弁理士】

【氏名又は名称】上西 克礼

(74)【代理人】

【識別番号】100164781

【弁理士】

【氏名又は名称】虎山 一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100221981

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 大成

(72)【発明者】

【氏名】ケミナイ・セドリック

(72)【発明者】

【氏名】シュタイガーヴァルト・ロビン

(72)【発明者】

【氏名】チャップリン・パウル

【審査官】小倉 梢

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１２／０８５９３６（ＷＯ，Ａ２）

【文献】特表２０１０－５２２５４０（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１２／０８９８３３（ＷＯ，Ａ２）

【文献】国際公開第２０１２／０４８８１７（ＷＯ，Ａ２）

【文献】特許第６５２３９５５（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】特許第６８９５９４４（ＪＰ，Ｂ２）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００ － １５／９０

Ｃ１２Ｎ ７／００ － ７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下：
（ａ）ＲＳウイルス（ＲＳＶ）膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、ここで前記ヌクレオチド配列は全長ＲＳＶ Ｆ膜糖タンパク質をコードし、当該全長ＲＳＶ Ｆ膜糖タンパク質が少なくとも１つのＲＳＶ Ｆ抗原決定基を含む；
（ｂ）ＲＳＶヌクレオカプシドの抗原決定基をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、ここで前記ヌクレオチド配列は全長ＲＳＶ Ｎヌクレオカプシドタンパク質をコードし、当該全長ＲＳＶ Ｎヌクレオカプシドタンパク質が少なくとも１つのＲＳＶ Ｎヌクレオカプシドタンパク質抗原決定基を含む；
（ｃ）ＲＳＶヌクレオカプシドの抗原決定基をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、ここで前記ヌクレオチド配列は全長ＲＳＶ Ｍ２マトリックスタンパク質をコードし、当該全長ＲＳＶ Ｍ２マトリックスタンパク質が少なくとも１つのＲＳＶ Ｍ２マトリックスタンパク質抗原決定基を含み、ただし、前記ヌクレオチド配列は、配列番号１４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むか、または配列番号１３もしくは３２のヌクレオチド配列を含む、
を含み、さらに以下：
（ｄ）全長ＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、ここで、当該全長ＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質が少なくとも１つのＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質抗原決定基を含む、
を含む、組換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）。

【請求項2】

（ａ）における前記ヌクレオチド配列が、ＲＳＶ株Ａに由来する、請求項１に記載の組換えＭＶＡ。

【請求項3】

前記ＲＳＶ株Ａが、ＲＳＶ株Ａ２および／またはＡ_longである、請求項２に記載の組換えＭＶＡ。

【請求項4】

（ａ）における前記ヌクレオチド配列が、配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、または配列番号５のヌクレオチド配列を含む、請求項１～３のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ。

【請求項5】

（ｂ）における前記ヌクレオチド配列が、株Ａに由来する、請求項１～４のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ。

【請求項6】

前記株Ａが株Ａ２である、請求項５に記載の組換えＭＶＡ。

【請求項7】

（ｂ）における前記ヌクレオチド配列が、配列番号３５のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、または配列番号３４のヌクレオチド配列を含む、請求項１～６のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ。

【請求項8】

（ｂ）における前記ヌクレオチド配列が、配列番号１０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、または配列番号９のヌクレオチド配列を含む、請求項１～６のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ。

【請求項9】

ＲＳＶ Ｎ ヌクレオカプシドおよびＲＳＶ Ｍ２マトリックスタンパク質の両方の抗原決定基が、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードする１つのヌクレオチド配列によってコードされ、かつ両方が単一の読み取り枠によってコードされる、請求項１～８のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ。

【請求項10】

ＲＳＶ Ｎ ヌクレオカプシドおよびＲＳＶ Ｍ２マトリックスタンパク質の抗原決定基が、自己切断プロテアーゼドメインによって分離される、請求項９に記載の組換えＭＶＡ。

【請求項11】

前記自己切断プロテアーゼドメイン配列が口蹄疫ウイルスに由来する、請求項１０に記載の組換えＭＶＡ。

【請求項12】

前記自己切断プロテアーゼドメイン配列がプロテアーゼ２Ａ断片配列である、請求項１０または１１に記載の組換えＭＶＡ。

【請求項13】

（ｄ）における前記ヌクレオチド配列が、ＲＳＶ株Ａおよび／またはＢに由来する、請求項１～１２のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ。

【請求項14】

前記ＲＳＶ株Ａが株Ａ２である、請求項１３に記載の組換えＭＶＡ。

【請求項15】

（ｄ）における前記ヌクレオチド配列が、配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、または配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項１～１４のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ。

【請求項16】

前記組換えＭＶＡを作製するために使用されるＭＶＡが、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に番号Ｖ０００８３００８で寄託されたＭＶＡ－ＢＮ（登録商標）である、請求項１～１５のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ。

【請求項17】

ＲＳＶ感染症の予防に使用するための、請求項１～１６のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ。

【請求項18】

前記組換えＭＶＡが、鼻腔内投与および／または皮下投与される、請求項１７に記載の使用のための組換えＭＶＡ。

【請求項19】

ＲＳＶ感染症の予防に使用するための、請求項１～１６のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、および任意選択的に薬学的に許容される担体および／または希釈剤を含む、薬学的組成物。

【請求項20】

前記組換えＭＶＡが、鼻腔内投与および／または皮下投与される、請求項１９に記載の薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶウイルス）による感染に対する改善されたワクチンとしての組換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡウイルス）、ならびに関連する製品、方法、および使用に関する。具体的には、本発明は、ＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列とを含む、遺伝子改変組換えＭＶＡベクターに関する。本発明はまた、例えば、対象の免疫応答に影響を与えるのに適しているか、または、ＲＳＶ感染症を診断し、さらには対象がＲＳＶ感染症再発のリスクがあるかどうかを決定するのに適した、その製品、方法、および使用にも関する。

【背景技術】

【0002】

ＲＳＶは、重大な呼吸器病原体である。急性下気道（ＬＲＴ）感染症は、世界中で、５歳未満の乳幼児および小児における著しい罹患率および死亡率の原因となっている［Ａ．Ｍ．Ａｌｉｙｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｂａｙｅｒｏ Ｊ．Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｓｃｉ．３（１）：１４７－１５５］。ＲＳウイルス（ＲＳＶ）は、ＬＲＴ感染症の最も臨床的に重要な原因である：ＲＳＶによる一次感染は、一般的に２歳までに発生する［Ｗ．Ｐ．Ｇｌｅｚｅｎ（１９８７），Ｐｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．２：１－４；Ｙ．Ｍｕｒａｔａ（２００９），Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．２９（４）：７２５－７３９］。ＲＳＶの一次感染は、ＲＳＶに対する完全な免疫を誘導しないため、生涯を通じて頻繁に再感染が起こり、最も深刻な感染は、非常に幼い子供、非常に高齢の成人、およびあらゆる年齢の免疫不全の患者に発生する［Ｙ．Ｍｕｒａｔａ（２００９）］。

【0003】

ＲＳＶ感染者のうち４０％もの多くの人々が、最終的には、入院を要する深刻なＬＲＴ疾患を発症するが、疾患の重症度および強度は、感染の規模および強度、ならびに宿主応答に依存する［Ａｌｉｙｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０）］。ＲＳＶはまた、免疫系、呼吸器系、または心臓系に欠陥を有するあらゆる年齢の患者において深刻なＬＲＴ疾患を引き起こす可能性もあり、小児が後に喘息を発症する素因にもなり得る。米国だけでも、ＲＳＶは、１年間に推定１２６，０００件の入院および３００件の乳幼児の死亡の原因となっている［Ｙ．Ｍｕｒａｔａ（２００９）］。さらに、ＲＳＶは、高齢者患者、および心肺疾患または免疫抑制疾患を根底に有する患者の間で、毎冬、８０，０００件を超える入院および１３，０００件を超える死亡の原因となっている［Ｙ．Ｍｕｒａｔａ（２００９）］。呼吸器病原体としてのＲＳＶの重要性にもかかわらず、現在のところ、安全かつ効果的なＲＳＶ ワクチンが市場に存在しない。

【0004】

ＲＳＶは、パラミクソウイルス科亜科であるニューモウイルス属のエンベロープＲＮＡウイルスである［Ａｌｉｙｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０）］。各ＲＳＶビリオンは、８つの構造タンパク質（Ｇ、Ｆ、ＳＨ、Ｍ１、Ｎ、Ｐ、Ｍ２．１、およびＬ）と、３つの非構造タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２、およびＭ２．２）とを含む１１個の別個のタンパク質をコードする１０個の遺伝子を含有する（Ｍ２は２つの読み取り枠を含有する）、約１５，１９１ヌクレオチドの非分割型マイナスセンスの一本鎖ＲＮＡ分子を含有する［Ｙ．Ｍｕｒａｔａ（２００９）］。ゲノムは、以下の順序でＮＳ１からＬへ連続的に転写される：３’－ＮＳ１－ＮＳ２－Ｎ－Ｐ－Ｍ１－ＳＨ－Ｇ－Ｆ－Ｍ２．１－Ｍ２．２－Ｌ－５’。

【0005】

ウイルスのエンベロープは、３つの膜貫通糖タンパク質（付着糖タンパク質（Ｇ）、融合糖タンパク質（Ｆ）、および低分子疎水性タンパク質（ＳＨ））、ならびにマトリックス（Ｍ１）タンパク質を含有する［Ｙ．Ｍｕｒａｔａ（２００９）］。ＲＳＶの複製中、ウイルスは、重度にグリコシル化されたＧタンパク質によって媒介されるプロセスにおいて標的細胞に最初に付着する。次いで、ウイルスは、Ｆタンパク質によって媒介されるプロセスにおいて宿主細胞と融合し、それによって細胞膜を透過して宿主細胞に進入する；Ｆタンパク質は、ＲＳＶ感染細胞の特徴である合胞体の形成にも必要である。付着および融合プロセスは、ＳＨタンパク質によって増強される。Ｍ１タンパク質は、エンベロープタンパク質ＦおよびＧ、ならびにヌクレオカプシドタンパク質Ｎ、Ｐ、およびＭ２．１と相互作用することにより、成熟ＲＳＶの構築を調節する（以下を参照）。エンベロープ内で、ウイルスＲＮＡは、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、リン酸化タンパク質（Ｐ）、転写伸長因子（Ｍ２．１）およびＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質からなる転写酵素複合体によってキャプシド形成される［Ｙ．Ｍｕｒａｔａ（２００９）］。Ｎは、ゲノムＲＮＡと会合し、Ｐは、ウイルスＲＮＡポリメラーゼＬの補助因子である。Ｍ２．１は、ウイルス転写に必要な伸長因子であり、Ｍ２．２は、ウイルスゲノムの転写を調節する。最後に、ＮＳ１およびＮＳ２が、Ｉ型インターフェロンの活性を阻害する。

【0006】

臨床的なＲＳＶ分離株は、抗原群（ＡまたはＢ）に従って分離され、各抗原群のウイルスゲノム内の遺伝的変異性に基づいて複数の遺伝子型（例えば、Ａ群の，Ａ２またはＡ_Ｌｏｎｇ、およびＢ群のＢ１、ＣＨ－１８５３７、または８／６０）にさらに細分類される［Ｙ．Ｍｕｒａｔａ（２００９）］。分類は、付着糖タンパク質（Ｇタンパク質）に対するモノクローナル抗体とのウイルスの反応性に基づいており、種々の遺伝学的解析によるものである。［Ｍ．Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３（１）：３６－４０（２００５）］。ウイルス分離株の中でも、ＲＳＶによってコードされるいくつかのタンパク質は、アミノ酸配列のレベルで高度に保存される一方で（例えば、Ｆ）、他のタンパク質は、２つの主要な抗原群の間および中で広く異なる（例えば、Ｇ）［Ｙ．Ｍｕｒａｔａ（２００９）］。ＡおよびＢ抗原群のＦタンパク質は、著しい相同性を共有する。対照的に、Ｇタンパク質は、２つの抗原群の間で著しく異なる。

【0007】

Ｇタンパク質は、最も可変性が高いＲＳＶタンパク質であり、その超可変性Ｃ末端領域は、株特異性エピトープの大部分を構成する。Ｇタンパク質の分子疫学および進化パターンは、ＲＳＶの臨床的および疫学的特徴に関する重要な情報を提供してきた。典型的には、いくつかの異なる遺伝子型が一度に循環し、毎年、地域で優勢な遺伝子型が変化し得る。しかしながら、ＲＳＶの臨床的および疫学的特徴にとっての株の多様性の重要性は、依然として十分に理解されていない。したがって、組換えＲＳＶタンパク質は、遺伝子またはタンパク質がクローニングされた元のＲＳＶ株を示す株表示を伴う。例えば、ＲＳＶ株Ａ_ＬｏｎｇからクローニングされたＧタンパク質は、Ｇ（Ａ_Ｌｏｎｇ）、ＲＳＶ Ａ_Ｌｏｎｇ Ｇ、またはＲＳＶ Ａ_Ｌｏｎｇ Ｇタンパク質と命名される。

【0008】

ＲＳＶは、感染した宿主において、ケモカインおよびサイトカインの分泌、中和性液性抗体および粘膜抗体の産生、ならびにＣＤ４＋（例えば、Ｔ_Ｈ１およびＴ_Ｈ２）およびＣＤ８＋（例えば、ＣＴＬ）Ｔ細胞の産生を含む、様々な免疫応答を刺激する。ウイルスはｉｎ ｖｉｖｏでの細胞病理を限定する原因となるため、そのような宿主免疫応答は、ＲＳＶ感染症の臨床症状に大きく寄与する［Ｙ．Ｍｕｒａｔａ（２００９）］。ＲＳＶが誘導する疾患の表現型発現および重症度は、ＲＳＶ感染症によって刺激される免疫応答の範囲内でのバランスおよび相互作用によって媒介されるようである［Ｙ．Ｍｕｒａｔａ（２００９）］。

【0009】

多くの以前の研究は、細胞性免疫応答および液性免疫応答が、ＲＳＶに対する免疫の誘導およびＲＳＶ感染症の治癒、ならびに疾患の進行において異なる役割を果たすことを提唱している［Ｙ．Ｍｕｒａｔａ（２００９）および本明細書の参考文献］。例えば、ヒト化抗Ｆ抗体を用いた研究は、抗ＲＳＶ抗体が、感染の重症度を防止または制限するのに十分である一方で、それらは、ウイルス感染を排除するためには必要とされないことを示した［Ｙ．Ｍｕｒａｔａ（２００９）；Ａ．Ｆ．Ｇ．Ａｎｔｏｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｖａｃｃｉｎｅ ２５：４８１８－４８２７］。対照的に、Ｔ細胞応答は、確立されたＲＳＶ感染症を排除するために必要である［Ｙ．Ｍｕｒａｔａ（２００９）］。ＲＳＶが誘導するＴ細胞応答は、感染中の肺病理においても重要な役割を果たす。例えば、インターフェロン－γ（ＩＦＮγ）を分泌するＴ_Ｈ１細胞（関連するＣＤ８＋ＣＴＬ応答を伴うかまたは伴わない）は、最小限の肺病理をともなってＲＳＶを排除し、インターロイキン４（ＩＬ－４）を分泌するＴ_Ｈ２細胞もまた、ＲＳＶを排除するが、以前のワクチン臨床試験中に観察された重篤な疾患の特徴である好酸球浸潤を含む、著しい胚変化を伴うことが多い（以下を参照）。

【0010】

以下の項により詳しく記載するように、ＲＳＶ感染症の免疫学、ウイルス学、および生理学に関する豊富な情報が入手可能であるにもかかわらず、持続する免疫を誘導する一方で、同時に、ワクチン接種後にＲＳＶに曝露された時に重篤な疾患を引き起こさないためには正確にどのような免疫応答が最も効果的である可能性が高いかは、依然として全く明らかになっていない。

【0011】

従来のワクチン開発
ワクチンは、典型的には、標的感染性因子または病原体（例えば、ウイルス、細菌、もしくは寄生虫）に対する保護免疫を誘導するために、以下を含むいくつかの戦略のうちの１つを使用する：（１）不活化病原体の調製；（２）生の弱毒化病原体（遺伝的に弱毒化した病原体株を含む）の調製；（３）精製タンパク質サブユニットワクチンの調製；（４）病原体抗原および／またはアジュバントをコードするウイルスベクターに基づくワクチン、および（５）病原体抗原をコードするＤＮＡに基づくワクチン。

【0012】

１９６０年代に、米国でホルマリン不活化ＲＳＶ（ＦＩ－ＲＳＶ）ワクチンの有効性を試験する臨床試験が実施され、散々な結果となるまで、初期のＲＳＶ ワクチンの開発努力は、不活化ウイルスの調製に焦点を合わせていた［Ｍ．Ｒ．Ｏｌｓｏｎ＆Ｓ．Ｍ．Ｖａｒｇａ（２００７），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：５４１５－５４２４］。ワクチン接種を受けた有意な数の患者が、後にＲＳＶに自然感染すると、好酸球および好中球の浸潤を特徴とする重篤な肺疾患およびかなりの炎症反応を発生した［Ｏｌｓｏｎ＆Ｖａｒｇａ（２００７），［Ｂｌａｎｃｏ ＪＣ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ．６：４８２－９２］。これらの患者の多くは、入院が必要であり、数人の危篤状態の患者が死亡した。その結果として、研究者たちは、より安全なＲＳＶワクチンを開発するために、後に曝露された時の重篤な疾患の発症に寄与するウイルスおよび／または宿主因子の探究を開始した。その研究により、ＲＳＶの生物学およびそれが誘導することができる広範囲の免疫応答に関する新しい情報が得られたが、安全かつ効果的なＲＳＶワクチンは、依然として分からないままである。

【0013】

ＦＩ－ＲＳＶ後のワクチン開発努力は、主としてＧ、Ｆ、およびより低い程度のＮ、またはＭ２を使用した単一抗原ワクチンに焦点を当てており、ウイルス抗原は、ウイルスベクターもしくはウイルス遺伝子を発現するプラスミドＤＮＡベクターによって、または精製タンパク質としてのいずれかで送達される。［例えば、Ｗ．Ｏｌｓｚｅｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｖａｃｃｉｎｅ ２３：２１５－２２１；Ｇ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：３１９５－３２０６；ａｎｄ Ｌ．Ｓ．Ｗｙａｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０００），ワクチン １８：３９２－３９７を参照のこと］。Ｆ＋Ｇの組み合わせを用いたワクチン接種はまた、仔ウシ、コットンラット、およびＢＡＬＢ／ｃマウスにおいても試験され、様々な結果を示した［Ａｎｔｏｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）（仔ウシ）；Ｂ．Ｍｏｓｓ、１９８６年４月８日出願の米国特許出願第０６／８４９，２９９号（「’２９９出願」）（コットンラット）；およびＬ．Ｓ．Ｗｙａｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）（ＢＡＬＢ／ｃマウス）］。ＦおよびＧのどちらも、仔ウシ、マウス、ラット、ヒト、および少なくともある程度はマカク乳幼獣において免疫原性である［Ａ．Ｆ．Ｇ．Ａｎｔｏｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）（仔ウシ）；Ｂ．Ｍｏｓｓ、’２９９出願（コットンラット）；Ｌ．ｄｅ Ｗａａｌ ｅｔ ａｌ．（２００４），ワクチン ２２：９２３－９２６（マカク乳幼獣）；Ｌ．Ｓ．Ｗｙａｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）（ＢＡＬＢ／ｃマウス）］；Ｙ．Ｍｕｒａｔａ（２００９）（ヒト）］。

【0014】

しかしながら、意義深いことに、ＲＳＶ ワクチン候補によって誘導される免疫応答の性質および種類は、使用されるワクチンの種類、選択される抗原、投与経路、およびさらには使用されるモデル生物に応じて、非常に大きく異なることが多い。例えば、生ＲＳＶを用いた、またはＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする複製ベクターを用いた免疫化は、優勢なＴ_Ｈ１応答を伴って中和抗Ｆ抗体およびＣＤ８＋ＣＴＬの産生を誘導する：両方ともワクチン接種後にウイルスに曝露された時の最小限の肺病理と関連する［Ｙ．Ｍｕｒａｔａ（２００９）および本明細書に引用される参考文献］。対照的に、ＦＩ不活化ＲＳＶ調製物を用いた免疫化は、ＣＤ８＋ＣＴＬ応答を全く示さずに優勢なＴ_Ｈ２応答を誘導し、肺における病理変化の増加をもたらす［Ｙ．Ｍｕｒａｔａ（２００９）および本明細書に引用される参考文献］。興味深いことに、精製サブユニットワクチンとしてのまたは複製ベクター中におけるＲＳＶ Ｇタンパク質の投与は、優勢なＴ_Ｈ２応答を誘導し、最終的には、ワクチン接種後にウイルスに曝露されると、ＦＩ－ＲＳＶで観察された重篤な疾患に非常に類似した応答である好酸球性肺浸潤および気道過敏性を引き起こす［Ｙ．Ｍｕｒａｔａ（２００９）および本明細書に引用される参考文献］。さらに、ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）のワクチン接種は、仔ウシにおいて抗Ｆ抗体およびＦ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導し、一方、ＭＶＡ－Ｆ＋ＭＶＡ－Ｇのワクチン接種は、抗Ｆおよび抗Ｇ抗体は誘導したが、ＦまたはＧ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は誘導しなかった［Ａ．Ｆ．Ｇ．Ａｎｔｏｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）］。

【0015】

Ｆタンパク質（ＶＶ－Ｆ）を発現するワクシニアウイルス（ＶＶ）を用いたマウスのワクチン接種は、強いＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導し、ＦＩ－ＲＳＶで免疫したマウスと同様かまたはそれよりも多い体重損失を伴って、複製ＲＳＶの肺からのクリアランスをもたらした［Ｗ．Ｏｌｓｚｅｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．（２００４）］。しかしながら、それは、ＩＬ－４およびＩＬ－５等のＴ_Ｈ２サイトカインの分泌増大に起因する、ＦＩ－ＲＳＶまたはＧタンパク質を発現するＶＶ（ＶＶ－Ｇ）によって誘導される重篤な疾患（複合型のＴ_Ｈ２応答、肺好酸球および体重損失）とは関連していなかった。当該技術分野の中には、細胞成分および液性成分の両方を含む比較的バランスの取れた免疫応答を誘導することができるＲＳＶ ワクチンは、ワクチン接種後の曝露時に免疫病理の増強を示す可能性は低いと提唱する者もあった［Ｗ．Ｏｌｓｚｅｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．（２００４）］。

【0016】

しかしながら、Ｆ、Ｇ、またはＦ＋Ｇをコードする改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）を用いたＢＡＬＢ／ｃマウスのワクチン接種は、液性応答（すなわち、バランスの取れたＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの応答）およびＴ_Ｈ１応答（すなわち、ＩＦＮγ／インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）のレベルの増加およびインターロイキン－４（ＩＬ－４）／インターロイキン－５（ＩＬ－５）のレベルの減少）の両方を含む、まさにそのようなバランスの取れた免疫応答を誘導したが、それにもかかわらず、ワクチン接種した動物は、なおもある程度の体重損失を示した［Ｗ．Ｏｌｓｚｅｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．（２００４）］。

【0017】

いくつかの異なるモデル系において、種々のワクチン候補によって誘導される免疫応答の性質および程度を特徴づけようと多大な労力を費やしたにもかかわらず、ワクチンのレシピエントを重篤な疾患に罹患し易くすることなく、ＲＳＶに対する持続的かつ完全な免疫を伝達するためには、正確にどのような種類の免疫応答が必要とされるかは、依然として明らかになっていない。ＲＳＶの臨床的負担と利用可能な治療および予防の選択肢との間の著しい不均衡のために、ＲＳＶワクチンの開発は、未だに満たされない医学的な必要性である。

【発明の概要】

【0018】

ＲＳＶワクチンを開発するための以前の失敗に終わった努力は、主として、ＲＳＶ－ＦもしくはＲＳＶ－Ｇ 膜糖タンパク質またはその両方を用いたワクチン接種に焦点を当てていたが、本発明者らは、ＲＳＶ膜糖タンパク質の少なくとも１つの抗原決定基と、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の少なくとも１つの抗原決定基とを発現する組換えワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）のワクチン接種が、より良好な保護を誘導することを発見した。また、そのような構築物は、鼻腔内経路によって適用されると、皮下適用と比較した場合、またはＷｙａｔｔらによって使用された筋肉内投与経路と比較した場合でも、ほぼ完ぺきな無菌免疫を誘導する［Ｌ．Ｓ．Ｗｙａｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）］。候補ＲＳＶ ワクチンを鼻腔内に投与することによって、筋肉内投与と比較して強化された保護を得ることができる。

【0019】

ＲＳＶ ＦもしくはＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質のいずれか（または両方）（例えば、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ）を発現する組換えＭＶＡ、あるいはＲＳＶ膜糖タンパク質の少なくとも１つの抗原決定基と、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の少なくとも１つの抗原決定基とを発現する組換えＭＶＡ（例えば、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ）では、本発明者らは、曝露後４日目に肺におけるＲＳＶの複製を観察しなかったが、ＲＳＶゲノムは、なおもＲＴ－ｑＰＣＲによって検出可能であった。ＲＳＶ膜糖タンパク質の少なくとも１つの抗原決定基と、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の少なくとも１つの抗原決定基とを発現する組換えＭＶＡ（例えば、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ）は、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基に対してより強いＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導したため、それらは、より良好な保護と、ＲＴ－ｑＰＣＲによって検出可能なＲＳＶウイルス負荷のより大きな減少を誘導した。鼻腔内経路によるそのような組換えウイルスの投与はさらに、そのような構築物が皮下投与された場合には見られない応答である粘膜免疫応答およびＩｇＡ抗体分泌を誘導したため、それらは、ほぼ完全な無菌免疫（ＲＳＶウイルス負荷がＲＴ－ｑＰＣＲによってほとんど検出不能である）を誘導した。

【0020】

ＦＩ－ＲＳＶとは対照的に、そのような構築物は、良好な抗体応答を生成するバランスの取れたＴｈ１－免疫応答、およびＲＳＶ抗原に特異的な強い細胞性免疫応答を誘導する。良好なＩｇＡ抗体応答の誘導に加えて、従来の皮下投与から得られるものよりもさらに高いＩｇＧ抗体レベルを生成するワクチンの鼻腔内投与により、保護が改善され、体重損失が減少した。しかしながら、細胞性免疫応答の大きさは、投与経路とは無関係である。興味深いことに、本発明者らは、ＲＳＶ投与によって誘導されたＴ細胞応答と同様の、ＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列と、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列とを発現する組換えＭＶＡ（例えば、ＲＳＶ Ｆ、Ｇ、Ｎ、およびＭ２タンパク質を発現するＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ）によって誘導されるＴ細胞応答のパターンを、かなり高くはあったが、観察した。

【0021】

したがって、第１の態様において、本発明は、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列とを含む、組換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）を提供する。

【0022】

改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）
ＭＶＡは、Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ａｎｋａｒａ，Ｔｕｒｋｅｙ）で何年も維持され、ヒトのワクチン接種のための基盤として使用されていた皮膚ワクシニア株アンカラのニワトリ胚線維芽細胞で５７０を超える連続継代によって産生される［漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラウイルス、ＣＶＡ；検討にはＭａｙｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５），Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ３，６－１４を参照］。しかしながら、ワクシニアウイルスに関連したワクチン接種後の合併症が重症であることが多いため、より弱毒化された、より安全な天然痘ワクチンを作製しようとするいくつかの試みがあった。

【0023】

１９６０～１９７４の期間中、Ａｎｔｏｎ Ｍａｙｒ教授が、ＣＥＦ細胞において５７０を超える連続継代によりＣＶＡを弱毒化することに成功した［Ｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）］．様々な動物モデルにおいて、得られたＭＶＡが非病原性であることが示された［Ｍａｙｒ，Ａ．＆Ｄａｎｎｅｒ，Ｋ．（１９７８），Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．４１：２２５－２３４］。天然痘前ワクチンとしてのＭＶＡの初期開発の一環として、ワクシニアによる有害反応のリスクがある対象において、Ｌｉｓｔｅｒ Ｅｌｓｔｒｅｅと併用してＭＶＡ－５１７を用いた臨床試験が行われた［Ｓｔｉｃｋｌ（１９７４），Ｐｒｅｖ．Ｍｅｄ．３：９７－１０１；Ｓｔｉｃｋｌ ａｎｄ Ｈｏｃｈｓｔｅｉｎ－Ｍｉｎｔｚｅｌ（１９７１），Ｍｕｎｉｃｈ Ｍｅｄ．Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．１１３：１１４９－１１５３］。１９７６年に、ＭＶＡ－５７１原種（５７１番目の継代に相当する）に由来するＭＶＡが、２段階の非経口天然痘ワクチン接種プログラムにおける予備刺激ワクチンとしてドイツで登録された。続いて、大半が１～３歳の小児である約１２０，０００人の白人個体にＭＶＡ－５７２を使用した：対象の多くはワクシニアに関連する合併症のリスクが高い集団内であったが、重度の副作用は報告されなかった（Ｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．（１９７８），Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（Ｂ）１６７：３７５－３９０）。ＭＶＡ－５７２は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ ＣｕｌｔｕｒｅｓにＥＣＡＣＣ Ｖ９４０１２７０７として受託された。

【0024】

ＭＶＡを弱毒化するために用いられた継代の結果として、ＣＥＦ細胞における継代数に応じて多くの異なる株または単離株が存在する。例えば、ＭＶＡ－５７２は、天然痘撲滅プログラムの間にドイツで使用され、ＭＶＡ－５７５は、動物用ワクチンとして広く使用された。ＭＶＡ－５７５は、２０００年１２月７日に、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に受託番号Ｖ００１２０７０７で受託された。初代ニワトリ胚線維芽細胞上でＣＶＡを連続繁殖することにより（５７０を超える継代）、弱毒化ＣＶＡ－ウイルスＭＶＡ（改変ワクシニアウイルスアンカラ）を得た。

【0025】

１９７０年代に、Ｍａｙｒらが、ＭＶＡ はヒトおよび哺乳動物において高度に弱毒化され、非病原性であることを証明したが、一部の研究者は、哺乳類細胞株およびヒト細胞株において残存複製が起こる可能性があるため、ＭＶＡが完全には弱毒化されないと報告している［Ｂｌａｎｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７９：１１５９－１１６７；Ｃａｒｒｏｌｌ＆Ｍｏｓｓ（１９９７），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３８：１９８－２１１；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，１８５，１４６；Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ５５：５６９］。使用されたウイルスは、その特性、特に種々の細胞株におけるそれらの成長挙動が、本質的に異なるため、これらの刊行物で報告された結果は、様々な既知のＭＶＡ株を用いて得られたものであると推察される。そのような残存複製は、ヒトにおける使用に関連した安全性の懸念を含む種々の理由から望ましくない。

【0026】

より安全な製品、例えばワクチンまたは医薬品を開発するために、強化された安全性プロファイルを有するＭＶＡの株がＢａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃによって開発された：ＭＶＡは、Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃによってさらに継代され、ＭＶＡ－ＢＮと命名されている。ＭＶＡおよびＭＶＡ－ＢＮは、祖先ＣＶＡウイルスと比較してゲノムの約１５％（６つの領域から３１ｋｂ）を欠損している。この欠失は、多くの病原性および宿主範囲遺伝子、ならびにＡ型封入体の遺伝子に影響を与える。継代５８３に相当するＭＶＡ－ＢＮの試料は、２０００年８月３０日に、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）で番号Ｖ０００８３００８の下に受託された。

【0027】

ＭＶＡ－ＢＮは、ウイルスによってコードされる遺伝子が非常に効率的に発現されるヒト細胞に付着して、該細胞内に進入することができる。しかしながら、子孫ウイルスの構築および放出は起こらない。ＭＶＡ－ＢＮは、初代ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞に強く適合されており、ヒト細胞中では複製しない。ヒト細胞中では、ウイルス遺伝子は発現されるが、感染性ウイルスは生成されない。ＭＶＡ－ＢＮは、米国のＣｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎによってバイオセイフティーレベル１の生物として分類されている。ＭＶＡ－ＢＮおよび誘導体の調製物は、多くの種類の動物、および免疫不全の個体を含む２０００人を超えるヒト対象に投与されてきた。全てのワクチン接種は、一般的に安全であり、良好な忍容性を示すことが証明されている。その高度な弱毒化および病原性の低下にもかかわらず、前臨床試験において、ＭＶＡ－ＢＮは、ＭＶＡゲノム内にクローニングされた遺伝子によってコードされるワクチンおよび異種遺伝子産物に対して、液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方を誘発することが示されている［Ｅ．Ｈａｒｒｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．１０（２）：２８５－３００；Ａ．Ｃｏｓｍａ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｖａｃｃｉｎｅ ２２（１）：２１－９；Ｍ．Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４（１４）：１３４７－１３６０；Ｍ．Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１０（１６）：５３８１－５３９０］。

【0028】

ＭＶＡの「誘導体」または「変異体」は、本明細書に記載のＭＶＡと本質的に同じ複製特徴を示すが、それらのゲノムの１つ以上の部分で相違を示すウイルスを指す。ＭＶＡ－ＢＮおよびＭＶＡ－ＢＮの誘導体または変異体は、ヒトおよびマウス（たとえ重度に免疫抑制されたマウスであっても）においてｉｎ ｖｉｖｏで繁殖的に複製することができない。より具体的には、ＭＶＡ－ＢＮまたはＭＶＡ－ＢＮの誘導体もしくは変異体は、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）においても繁殖的に複製する能力を有するが、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａｔ［Ｂｏｕｋａｍｐ ｅｔ ａｌ（１９８８），Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０６：７６１－７７１］、ヒトの骨の骨肉腫細胞株１４３Ｂ（ＥＣＡＣＣ番号９１１１２５０２）、ヒト胚性腎臓細胞株２９３（ＥＣＡＣＣ番号８５１２０６０２）、およびヒト頚部腺癌細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ－２）において繁殖的に複製する能力を有しないことが好ましい。さらに、ＭＶＡ－ＢＮの誘導体または変異体は、Ｈｅｌａ細胞およびＨａＣａＴ細胞株におけるＭＶＡ－５７５よりも少なくとも２倍少ない、より好ましくは３倍少ないウイルス複製率を有する。ＭＶＡ変異体のこれらの特性に関する試験およびアッセイは、国際特許公開ＷＯ ０２／４２４８０（米国特許第２００３／０２０６９２６号）および国際特許公開ＷＯ ０３／０４８１８４（米国特許第２００６／０１５９６９９号）に記載されている（両方とも、参照により本明細書に組み込まれる）。

【0029】

ウイルスの増殖または複製は、通常、「複製率」と称される、最初に細胞を感染させるためにもともと使用した量（入力値）に対する感染細胞から生成されたウイルス（出力値）の比率として表される。複製率「１」は、感染細胞から生成されたウイルスの量が、細胞を感染させるために最初に使用した量と同じである複製状態を定義し、感染細胞がウイルスの感染および繁殖を許容することを意味する。対照的に、１未満の複製率、すなわち、入力レベルと比較した出力レベルの減少は、繁殖的複製の欠如、ひいてはウイルスの弱毒化を示唆する。

【0030】

ＭＶＡに基づくワクチンの利点は、それらの安全性プロファイルおよび大規模ワクチン生成の利用可能性を含む。前臨床試験によって、ＭＶＡ－ＢＮが、他のＭＶＡ株と比較して優れた弱毒化および有効性を示すことが明らかになっている（国際特許公開ＷＯ０２／４２４８０）。ＭＶＡ－ＢＮ株のさらなる特性は、ＤＮＡ予備刺激／ワクシニアウイルス追加免疫計画と比較した時に、ワクシニアウイルス予備刺激／ワクシニアウイルス追加免疫計画において実質的に同じレベルの免疫を誘導する能力である。

【0031】

本明細書において最も好ましい実施形態である組換えＭＶＡ－ＢＮウイルスは、哺乳類細胞におけるそれらの複製欠損性およびそれらの十分に確立された非病原性のために、安全であると考えられる。さらに、その有効性に加えて、産業規模での製造可能性が有益であり得る。その上、ＭＶＡに基づくワクチンは、複数の異種抗原を送達することができ、液性免疫と細胞性免疫の同時誘導を可能にする。

【0032】

別の態様において、組換えウイルスを作製するのに好適なＭＶＡウイルス株は、株ＭＶＡ－５７２、ＭＶＡ－５７５、または任意の同様に弱毒化されたＭＶＡ株であり得る。また、欠失型漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラ（ｄＣＶＡ）等の変異ＭＶＡも好適であり得る。ｄＣＶＡは、ＭＶＡゲノムのｄｅｌ Ｉ、ｄｅｌ ＩＩ、ｄｅｌ ＩＩＩ、ｄｅｌ ＩＶ、ｄｅｌ Ｖ、およびｄｅｌ ＶＩ欠失部位を含む。これらの部位は、複数の異種配列の挿入に特に有用である。ｄＣＶＡは、ヒト細胞株（ヒト２９３、１４３Ｂ、およびＭＲＣ－５細胞株等）において繁殖的に複製することができ（１０を超える増幅率）、ウイルスに基づくワクチン接種戦略に有用なさらなる突然変異により最適化を可能にする（国際特許公開ＷＯ ２０１１／０９２０２９を参照）。

【0033】

定義
「抗原決定基」という用語は、宿主の免疫系を刺激して、細胞応答および／または液性抗体応答のいずれかの抗原特異的免疫応答を起こす任意の分子を指す。抗原決定基は、宿主においてなおも免疫応答を誘発し、抗原の一部を形成するタンパク質、ポリペプチド、抗原タンパク質断片、抗原、およびエピトープ；例えば、グリコシル化タンパク質、ポリペプチド、抗原タンパク質断片、抗原およびエピトープを含む、タンパク質、ポリペプチド、ならびに抗原タンパク質断片、抗原およびエピトープの相同体または変異体；そしてそのような分子をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。したがって、タンパク質、ポリペプチド、抗原タンパク質断片、抗原およびエピトープは、特定の天然ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に限定されないが、天然の配列と同一な配列、ならびに欠失、付加、挿入、および置換等の天然の配列に対する修飾を包含する。

【0034】

好ましくは、そのような相同体または変異体は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列のレベルで、参照タンパク質、ポリペプチド、抗原タンパク質断片、抗原およびエピトープと、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％または６５％、少なくとも約７０％または７５％、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より典型的には、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、さらにより典型的には、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、最も典型的には、少なくとも約９９％の同一性を有する。相同体または変異体という用語はまた、切断した、欠失させた、もしくは別様に修飾したヌクレオチドまたはタンパク質配列、例えば、（１）全長ＲＳＶ－ＦもしくはＲＳＶ－Ｇタンパク質のシグナルペプチドならびに膜貫通および／もしくは細胞質ドメインを欠損した、対応するＲＳＶ－ＦもしくはＲＳＶ－Ｇタンパク質の可溶形態をコードするＲＳＶ－ＦもしくはＲＳＶ－Ｇヌクレオチド配列、（２）全長ＲＳＶ－Ｍ２もしくはＲＳＶ－Ｎタンパク質の欠失させた、切断した、もしくは別様に変異させた型をコードするＲＳＶ－Ｍ２もしくはＲＳＶ－Ｎヌクレオチド配列、（３）全長ＲＳＶ－ＦもしくはＲＳＶ－Ｇタンパク質のシグナルペプチドならびに膜貫通ドメインおよび／もしくは細胞質ドメインを欠損した、ＲＳＶ－ＦもしくはＲＳＶ－Ｇタンパク質の可溶形態、または（４）全長ＲＳＶ－Ｍ２もしくはＲＳＶ－Ｎタンパク質の欠失させた、切断した、もしくは別様に変異させた型を包含する。

【0035】

核酸とアミノ酸との間の配列同一性を決定するための技術は、当該技術分野で既知である。２つ以上の配列の「パーセント同一性」を決定することにより、それらを比較することができる。２つの配列のパーセント同一性は、核酸またはアミノ酸配列であろうと、整列させた２つの配列間の正確な一致の数を、より短い配列の長さで除して、１００を乗じたものである。

【0036】

本明細書に記載のタンパク質、ポリペプチド、抗原タンパク質断片、抗原およびエピトープに対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大パーセント配列同一性を達成するために、配列を整列させ、必要であればギャップを導入した後に、参照配列（すなわち、それが由来するタンパク質、ポリペプチド、抗原タンパク質断片、抗原またはエピトープ）中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義され、いずれの保存的置換も配列同一性の一部であるとは見なされない。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、当該技術分野の技術の範囲内の種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して得ることができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを得るために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。

【0037】

同じことが「ヌクレオチド配列同一性パーセント（％）」にも準用される。

【0038】

例えば、核酸配列に適切なアライメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，（１９８１），Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２－４８９の局所相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３－３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発されたスコアリングマトリックスを使用してアミノ酸配列に適用し、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ（１９８６），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５－６７６３によって正規化することができる。配列のパーセント同一性を決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実装は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティアプリケーション内のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）によって提供される。この方法のためのデフォルトパラメータは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（１９９５）（ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）に記載されている。本発明の文脈においてパーセント同一性を確立する好ましい方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ Ｊｏｈｎ Ｆ．Ｃｏｌｌｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋ，ａｎｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｂｙ ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ）に著作権があるプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。この一連のパッケージから、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いることができ、スコア表にデフォルトパラメータが使用される（例えば、ギャップオープンペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ１、およびギャップ６）。作成されたデータから、「一致」の値が「配列同一性」を反映する。配列間のパーセント同一性または類似性を計算するための他の好適なプログラムは、当該技術分野で一般的に知られており、例えば、別のアライメントプログラムは、デフォルトパラメータを用いて使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータを用いて使用することができる：遺伝コード＝標準；フィルタ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予想＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０ 配列；分別＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓ タンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスに見出すことができる：ｈｔｔｐ：／／ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／。

【0039】

本明細書で使用される場合、「異種」遺伝子、核酸、抗原、またはタンパク質は、野生型ポックスウイルスゲノムには存在しない核酸またはアミノ酸配列（例えば、ＭＶＡ）であると理解される。当業者は、ＭＶＡ等のポックスウイルスに存在する場合、「異種遺伝子」は、宿主細胞への組換えポックスウイルスの投与後、対応する異種遺伝子産物として、すなわち、「異種抗原」および／または「異種タンパク質」として発現されるような様式で、ポックスウイルスゲノム中に組み入れられるべきであることを理解する。発現は、通常、ポックスウイルスに感染した細胞における発現を可能にする調節要素に異種遺伝子を作動可能に連結することによって達成される。好ましくは、調節要素は、天然または合成ポックスウイルスプロモーターを含む。

【0040】

本明細書で使用される「無菌免疫」は、ＲＴ－ｑＰＣＲ等の高感度検出法が適用される場合に検出可能なＲＳＶ ゲノムの非存在下における保護免疫を意味する。

【0041】

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上そうではないと明らかに指示のない限り、複数形の指示対象を含むことに留意されなければならない。したがって、例えば、「エピトープ（ａｎ ｅｐｉｔｏｐｅ）」への言及は、１つ以上のエピトープを含み、「方法（ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、変更することができるか、または本明細書に記載の方法で置き換えることができる、当業者に既知の均等のステップおよび方法への言及を含む。

【0042】

別途指定のない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連のあらゆる要素を指すと理解されたい。当業者は、日常的な実験を用いるだけで、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識もしくは確認することができるであろう。そのような均等物は、本発明に包含されることが企図される。

【0043】

本明細書およびそれに続く特許請求の範囲を通じて、文脈上、別途要求のない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変化形は、記載される整数もしくは段階または整数もしくは段階の群を包含するが、任意の他の整数もしくは段階または整数もしくは段階の群を除外しないことを意味すると理解されたい。本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」もしくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語に置き換えることができるか、または、本明細書で使用される場合、時には「有する」という用語に置き換えることができる。前述の用語（含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、有する）のいずれも、あまり好まれないが、本発明の態様または実施形態の文脈において本明細書で使用される場合はいつも、「～からなる」という用語に置き換えることができる。

【0044】

本明細書で使用される場合、「～からなる」は、特許請求の範囲の構成要件に規定されていないあらゆる要素、ステップ、または成分も除外する。本明細書で使用される場合、「～から本質的になる」は、特許請求の範囲の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響しない材料またはステップを除外しない。

【0045】

本明細書で使用される場合、列挙される複数の要素の間の「および／または」という接続語は、個々の選択肢および組み合わせた選択肢の両方を包含すると解釈されたい。例えば、２つの要素が「および／または」によって結合される場合、最初の選択肢は、第２の要素を含まない第１の要素の適用性に言及する。第２の選択肢は、第１の要素を含まない第２の要素の適用性に言及する。第３の選択肢は、第１の要素および第２の要素の一緒の適用性に言及する。これらの選択肢のいずれも、本明細書で使用される「および／または」という用語の意味の範囲内に属し、従って、その要件を満たすと理解されたい。選択肢のうちの１つより多くの同時適用性もまた、「および／または」という用語の意味の範囲内に属し、従って、その要件を満たすと理解されたい。
ＲＳＶのヌクレオチド配列およびタンパク質
本明細書で述べるＲＳＶ遺伝子は、たとえ、株または分離株間で遺伝子の正確な配列および／またはゲノムの位置が異なる可能性がある場合であっても、任意のＲＳＶ株または分離株の対応するタンパク質をコードする遺伝子、またはその遺伝子の相同体もしくは変異体を指す。

【0046】

同様に、本明細書で述べるＲＳＶタンパク質は、上で定義した対応するタンパク質遺伝子によってコードされ、かつ発現されるタンパク質、またはそのタンパク質の相同体もしくは変異体を指す。

【0047】

例として、本明細書において交換可能に使用される場合、「Ｆタンパク質遺伝子」、「Ｆ糖タンパク質遺伝子」、「ＲＳＶ Ｆタンパク質遺伝子」、「ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質遺伝子」、またはＦ遺伝子」という用語は、たとえ、株または分離株間でＦタンパク質遺伝子の正確な配列および／またはゲノムの位置が異なる可能性がある場合であっても、任意のＲＳＶ株または分離株の膜貫通融合糖タンパク質をコードする遺伝子、またはその遺伝子の相同体もしくは変異体を指す。例えば、ＲＳＶのＡ２株において、Ｆ（Ａ２）タンパク質遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ 受入番号Ｍ１１４８６で番号付けされたヌクレオチド５６０１～７４９９（エンドポイントを含む）を含む。Ｆ（Ａ２）タンパク質遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ 受入番号 Ｍ１１４８６で番号付けされたヌクレオチド５６１４～７３３８（エンドポイントを含む）に及ぶ読み取り枠（ＯＲＦ）をコードするタンパク質をさらに含む。ＲＳＶ Ａ２からのＦタンパク質遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号２８に記載される。

【0048】

また、上で定義したＲＳＶ Ｆタンパク質遺伝子によってコードされ、かつ発現される重度にグリコシル化された膜貫通 融合糖タンパク質、またはそのタンパク質の相同体もしくは変異体を指す「Ｆタンパク質」、「Ｆ糖タンパク質」、「ＲＳＶ Ｆタンパク質」、「ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質」、または「Ｆ」という用語も、本明細書において交換可能に使用される。ＲＳＶ Ａ２からのＦタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２９に記載される。ＲＳＶ（Ａ２）Ｆタンパク質は、シグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含む（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ 受入番号 Ｐ０３４２０を参照）。ＲＳＶ Ａ２ Ｆタンパク質のシグナルペプチドは、配列番号２９のアミノ酸１～２１；配列番号２９のアミノ酸１～５２９または配列番号２９のアミノ酸２２～５２９からなるＲＳＶ Ａ２ Ｆタンパク質の細胞外ドメイン；配列番号２９のアミノ酸５３０～５５０からなるＲＳＶ Ａ２ Ｆタンパク質の膜貫通ドメイン；および配列番号２９のアミノ酸５５１－５７４からなるＲＳＶ Ａ２ Ｆタンパク質の細胞質ドメインからなる。

【0049】

同様に、「Ｇタンパク質遺伝子」、「Ｇ糖タンパク質遺伝子」、「ＲＳＶ Ｇタンパク質遺伝子」、「ＲＳＶ Ｇ糖タンパク質遺伝子」、または「Ｇ遺伝子」という用語も、本明細書において交換可能に使用される。例えば、ＲＳＶのＡ２株において、Ｇ（Ａ２）タンパク質遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ 受入番号Ｍ１１４８６で番号付けされたヌクレオチド４６２６～５５４３（エンドポイントを含む）を含む。Ｇ（Ａ２）タンパク質遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ 受入番号 Ｍ１１４８６で番号付けされたヌクレオチド４６４１～５５３７（エンドポイントを含む）に及ぶ読み取り枠（ＯＲＦ）をコードするタンパク質をさらに含む。ＲＳＶ Ａ２からのＧタンパク質遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号３０に記載される。

【0050】

「Ｇタンパク質」、「Ｇ糖タンパク質」、「ＲＳＶ Ｇタンパク質」、「ＲＳＶ Ｇ糖タンパク質」、または「Ｇ」という用語は、重度にグリコシル化された膜貫通付着糖タンパク質、またはそのタンパク質の相同体もしくは変異体を指す。ＲＳＶ Ａ２からのＧタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３１に記載される。ＲＳＶ Ａ２ Ｇタンパク質は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含む（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ 受入番号 Ｐ０３４２３を参照）。ＲＳＶ Ａ２ Ｇタンパク質の細胞外ドメインは、配列番号３１のアミノ酸６７～２９８；配列番号３１のアミノ酸３８～６６からなるＲＳＶ Ａ２ Ｇタンパク質の膜貫通ドメイン；および配列番号３１のアミノ酸１～３７からなるＲＳＶ Ａ２ Ｇタンパク質の細胞質ドメインからなる。

【0051】

また、「Ｍ２タンパク質遺伝子」、「Ｍ２ヌクレオカプシドタンパク質遺伝子」、「ＲＳＶ Ｍ２タンパク質遺伝子」、「ＲＳＶ Ｍ２ マトリックスタンパク質遺伝子」、「ＲＳＶ Ｍ２ヌクレオカプシドタンパク質遺伝子」、または「Ｍ２ ｇｅｎｅ」という用語も、本明細書において交換可能に使用される。例えば、ＲＳＶのＡ２株において、Ｍ２（Ａ２）タンパク質遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ 受入番号Ｍ１１４８６で番号付けされたヌクレオチド７５５０～８５０６（エンドポイント含む）を含む。Ｍ２（Ａ２）タンパク質遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ 受入番号 Ｍ１１４８６で番号付けされたヌクレオチド７５５９～８１４３（エンドポイントを含む）に及ぶ読み取り枠（ＯＲＦ）をコードするタンパク質をさらに含む。ＲＳＶ Ａ２からのＭ２タンパク質遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号３２に記載される。

【0052】

「Ｍ２タンパク質」、「Ｍ２ヌクレオカプシドタンパク質」、「ＲＳＶ Ｍ２タンパク質」、「ＲＳＶ Ｍ２ヌクレオカプシドタンパク質」、「ＲＳＶ Ｍ２マトリックスタンパク質」、または「Ｍ２」という用語は、本明細書において交換可能に使用される。ＲＳＶ Ａ２からのＭ２タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３３に記載される（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ 受入番号 Ｐ０４５４５を参照）。

【0053】

また、「Ｎタンパク質遺伝子」、「Ｎヌクレオカプシドタンパク質遺伝子」、「ＲＳＶ Ｎタンパク質遺伝子」、「ＲＳＶ Ｎヌクレオカプシドタンパク質遺伝子」、または「Ｎ ｇｅｎｅ」という用語も、交換可能に使用されてもよい。例えば、ＲＳＶのＡ２株において、Ｎ（Ａ２）タンパク質遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ 受入番号Ｍ１１４８６で番号付けされたヌクレオチド１０８１～－２２７７（エンドポイントを含む）を含む。Ｎ（Ａ２）タンパク質遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ 受入番号 Ｍ１１４８６で番号付けされたヌクレオチド １０９６～２２７１（エンドポイントを含む）に及ぶ読み取り枠（ＯＲＦ）をコードするタンパク質をさらに含む。ＲＳＶ Ａ２からのＮタンパク質遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号３４に記載される。

【0054】

ＲＳＶ Ａ２からの（本明細書において交換可能に使用される用語である）「Ｎタンパク質」、「Ｎヌクレオカプシドタンパク質」、「ＲＳＶ Ｎタンパク質」、「ＲＳＶ Ｎヌクレオカプシドタンパク質」、または「Ｎ」のアミノ酸配列は、配列番号３５に記載される（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ 受入番号 Ｐ０３４１８を参照）。

【0055】

本発明の特定の実施形態
特定の実施形態において、組換えＭＶＡは、ＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を発現する。特定の実施形態において、ＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列は、ＲＳＶ Ｆ抗原決定基をコードする。特定の実施形態において、ＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列は、ＲＳＶ Ｇ抗原決定基をコードする。特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｆ抗原決定基は、ＲＳＶ株Ａ２に由来する。特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｇ抗原決定基は、ＲＳＶ株Ａ２に由来する。

【0056】

特定の実施形態において、組換えＭＶＡは、各々がＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする２つの異種ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、ＲＳＶ膜糖タンパク質の第１の抗原決定基は、ＲＳＶ Ｆ抗原決定基であり、ＲＳＶ膜糖タンパク質の第２の抗原決定基は、ＲＳＶ Ｇ抗原決定基である。特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｆ抗原決定基は、ＲＳＶ株Ａ２に由来する。特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｇ抗原決定基は、ＲＳＶ株Ａ２に由来する。特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｆ抗原決定基およびＲＳＶ Ｇ抗原決定基の両方が、ＲＳＶ株Ａ２に由来し得る。

【0057】

特定の実施形態において、組換えＭＶＡは、ＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列と、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列とを発現する。特定の実施形態において、ＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列は、ＲＳＶ Ｆ抗原決定基をコードし、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列は、ＲＳＶ Ｍ２抗原決定基をコードする。特定の実施形態において、ＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列は、ＲＳＶ Ｆ抗原決定基をコードし、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列は、ＲＳＶ Ｎ抗原決定基をコードする。特定の実施形態において、ＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列は、ＲＳＶ Ｇ抗原決定基をコードし、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列は、ＲＳＶ Ｍ２抗原決定基をコードする。特定の実施形態において、ＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列は、ＲＳＶ Ｇ抗原決定基をコードし、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列は、ＲＳＶ Ｎ抗原決定基をコードする。

【0058】

特定の実施形態において、組換えＭＶＡは、各々がＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする２つの異種ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、ＲＳＶ膜糖タンパク質の第１の抗原決定基は、ＲＳＶ Ｆ抗原決定基であり、ＲＳＶ膜糖タンパク質の第２の抗原決定基は、ＲＳＶ Ｇ抗原決定基である。特定の実施形態において、組換えＭＶＡは、各々がＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする２つの異種ヌクレオチド配列と、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列とを含む。特定の実施形態において、ＲＳＶ膜糖タンパク質の第１の抗原決定基は、ＲＳＶ Ｆ抗原決定基であり、ＲＳＶ膜糖タンパク質の第２の抗原決定基は、ＲＳＶ Ｇ抗原決定基であり、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基は、ＲＳＶ Ｍ２抗原決定基である。特定の実施形態において、ＲＳＶ膜糖タンパク質の第１の抗原決定基は、ＲＳＶ Ｆ抗原決定基であり、ＲＳＶ膜糖タンパク質の第２の抗原決定基は、ＲＳＶ Ｇ抗原決定基であり、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基は、ＲＳＶ Ｎ抗原決定基である。特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｆ抗原決定基およびＲＳＶ Ｇ抗原決定基の両方が、ＲＳＶ株Ａ２に由来し得る。

【0059】

特定の実施形態において、組換えＭＶＡは、各々がＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする２つの異種ヌクレオチド配列と、各々がＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードする２つの異種ヌクレオチド配列とを含む。特定の実施形態において、ＲＳＶ膜糖タンパク質の第１の抗原決定基は、ＲＳＶ Ｆ抗原決定基であり、ＲＳＶ膜糖タンパク質の第２の抗原決定基は、ＲＳＶ Ｇ抗原決定基であり、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の第１の抗原決定基は、ＲＳＶ Ｍ２抗原決定基であり、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の第２の抗原決定基は、ＲＳＶ Ｎ抗原決定基である。特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｆ抗原決定基および ＲＳＶ Ｇ抗原決定基の両方が、ＲＳＶ株Ａ２に由来する。

【0060】

特定の実施形態において、組換えＭＶＡは、各々がＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする３つの異種ヌクレオチド配列と、各々がＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードする２つの異種ヌクレオチド配列とを含む。特定の実施形態において、ＲＳＶ膜糖タンパク質の第１の抗原決定基は、ＲＳＶ Ｆ抗原決定基であり、ＲＳＶ膜糖タンパク質の第２の抗原決定基は、ＲＳＶ Ｇ抗原決定基であり、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の第１の抗原決定基は、ＲＳＶ Ｍ２抗原決定基であり、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の第２の抗原決定基は、ＲＳＶ Ｎ抗原決定基である。特定の実施形態において、ＲＳＶ膜糖タンパク質の第１の抗原決定基およびＲＳＶ膜糖タンパク質の第２の抗原決定基の両方が、ＲＳＶ株Ａ２に由来する。特定の実施形態において、ＲＳＶ膜糖タンパク質の第３の抗原決定基は、ＲＳＶ Ｆ抗原決定基である。

【0061】

特定の実施形態において、組換えＭＶＡは、各々がＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする４つの異種ヌクレオチド配列と、各々がＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードする２つの異種ヌクレオチド配列とを含む。特定の実施形態において、ＲＳＶ膜糖タンパク質の第１の抗原決定基は、ＲＳＶ Ｆ抗原決定基であり、ＲＳＶ膜糖タンパク質の第２の抗原決定基は、ＲＳＶ Ｇ抗原決定基であり、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の第１の抗原決定基は、ＲＳＶ Ｍ２抗原決定基であり、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の第２の抗原決定基は、ＲＳＶ Ｎ抗原決定基である。特定の実施形態において、ＲＳＶ膜糖タンパク質の第１の抗原決定基およびＲＳＶ膜糖タンパク質の第２の抗原決定基の両方が、ＲＳＶ株Ａ２に由来する。特定の実施形態において、ＲＳＶ膜糖タンパク質の第３の抗原決定基は、ＲＳＶ Ｆ抗原決定基である。特定の実施形態において、ＲＳＶ膜糖タンパク質の第４の抗原決定基は、ＲＳＶ Ｇ抗原決定基である。

【0062】

特定の実施形態において、ＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列は、ＲＳＶ Ｆ抗原決定基をコードする。特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｆ抗原決定基は、全長である。特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｆ抗原決定基は、切断型である。特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｆ抗原決定基は、変異体ＲＳＶ Ｆ抗原決定基である。特定の実施形態において、全長、切断型、または変異体ＲＳＶ Ｆ抗原決定基は、ＲＳＶ株Ａ２に由来する。特定の実施形態において、全長ＲＳＶ（Ａ２）Ｆ抗原決定基は、配列番号２９のアミノ酸配列をコードする配列番号２８のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、変異体ＲＳＶ（Ａ２）Ｆ抗原決定基は、配列番号４のアミノ酸配列をコードする配列番号３のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、切断型ＲＳＶ（Ａ２）Ｆ抗原決定基は、全長ＲＳＶ（Ａ２）Ｆ抗原決定基の細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを欠損する。特定の実施形態において、切断型ＲＳＶ（Ａ２）Ｆ抗原決定基は、配列番号１６のアミノ酸配列をコードする配列番号１５のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、全長、切断型、または変異体ＲＳＶ Ｆ抗原決定基は、ＲＳＶ株ＡＬｏｎｇに由来する。特定の実施形態において、変異体ＲＳＶ（ＡＬｏｎｇ）Ｆ抗原決定基は、配列番号６のアミノ酸配列をコードする配列番号５のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、切断型ＲＳＶ（ＡＬｏｎｇ）Ｆ抗原決定基は、全長ＲＳＶ（ＡＬｏｎｇ）Ｆ抗原決定基の細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを欠損する。

【0063】

特定の実施形態において、ＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列は、ＲＳＶ Ｇ抗原決定基をコードする。特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｇ抗原決定基は、全長である。特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｇ抗原決定基は、切断型である。特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｇ抗原決定基は、変異体ＲＳＶ Ｇ抗原決定基である。特定の実施形態において、全長、切断型、または変異体ＲＳＶ Ｇ抗原決定基は、ＲＳＶ株Ａ２に由来する。特定の実施形態において、全長ＲＳＶ（Ａ２）Ｇ抗原決定基は、配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列番号１のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、切断型ＲＳＶ（Ａ２）Ｇ抗原決定基は、全長ＲＳＶ（Ａ２）Ｇ抗原決定基の細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを欠損する。特定の実施形態において、全長、切断型、または変異体ＲＳＶ Ｇ抗原決定基は、ＲＳＶ株Ｂに由来する。特定の実施形態において、切断型ＲＳＶ（Ｂ）Ｇ抗原決定基は、全長ＲＳＶ（Ｂ）Ｇ抗原決定基の細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを欠損する。特定の実施形態において、切断型ＲＳＶ（Ｂ）Ｇ抗原決定基は、配列番号８のアミノ酸配列をコードする配列番号７のヌクレオチド配列を含む。

【0064】

特定の実施形態において、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列は、ＲＳＶ Ｍ２抗原決定基をコードする。特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｍ２抗原決定基は、全長である。特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｍ２抗原決定基は、切断型である。特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｍ２抗原決定基は、変異体ＲＳＶ Ｍ２抗原決定基である。特定の実施形態において、全長、切断型、または変異体ＲＳＶ Ｍ２抗原決定基は、ＲＳＶ株Ａ２に由来する。特定の実施形態において、ＲＳＶ（Ａ２）Ｍ２抗原決定基は、配列番号３３のアミノ酸配列をコードする配列番号３２のヌクレオチド配列を含む。

【0065】

特定の実施形態において、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列は、ＲＳＶ Ｎ抗原決定基をコードする。特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｎ抗原決定基は、全長である。特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｎ抗原決定基は、切断型である。特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｎ抗原決定基は、変異体 ＲＳＶ Ｎ抗原決定基である。特定の実施形態において、全長、切断型、または変異体ＲＳＶ Ｎ抗原決定基は、ＲＳＶ株Ａ２に由来する。特定の実施形態において、ＲＳＶ（Ａ２）Ｎ抗原決定基は、配列番号３５のアミノ酸配列をコードする配列番号３４のヌクレオチド配列を含む。

【0066】

特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｎ抗原決定基およびＲＳＶ Ｍ２抗原決定基の両方が、単一の読み取り枠によってコードされ、自己切断プロテアーゼドメインによって分離される。特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｍ２抗原決定基は、全長である。特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｍ２抗原決定基は、切断型である。特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｍ２抗原決定基は、変異体ＲＳＶ Ｍ２抗原決定基である。特定の実施形態において、全長、切断型、または変異体ＲＳＶ Ｍ２抗原決定基は、ＲＳＶ株Ａ２に由来する。特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｎ抗原決定基は、全長である。特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｎ抗原決定基は、切断型である。特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｎ抗原決定基は、変異体ＲＳＶ Ｎ抗原決定基である。特定の実施形態において、全長、切断型、または変異体ＲＳＶ Ｎ抗原決定基は、ＲＳＶ株Ａ２に由来する。特定の実施形態において、自己切断プロテアーゼドメインは、口蹄疫ウイルスに由来する。特定の実施形態において、自己切断プロテアーゼドメインは、口蹄疫ウイルスからのプロテアーゼ２Ａ断片であり、配列番号１２のアミノ酸配列をコードする配列番号１１のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｎ抗原決定基およびＲＳＶ Ｍ２抗原決定基をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列は、配列番号１８のアミノ酸配列をコードする配列番号１７のヌクレオチド配列を含む。

【0067】

ＭＶＡの組込み部位
特定の実施形態において、ＲＳＶ膜糖タンパク質の１つ以上の抗原決定基と、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の１つ以上の抗原決定基とをコードする異種ヌクレオチド配列が、ＭＶＡゲノムまたはＭＶＡ－ＢＮゲノムの様々な挿入部位に組み入れられる。ＲＳＶタンパク質の１つ以上の抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列は、図１に示すように、別個の転写単位として、または融合遺伝子として、組換えＭＶＡに挿入することができる。

【0068】

特定の実施形態において、異種ＲＳＶヌクレオチド配列は、ＭＶＡの１つ以上の遺伝子間領域（ＩＧＲ）に挿入される。ＩＧＲは、ＩＧＲ０７／０８、ＩＧＲ４４／４５、ＩＧＲ６４／６５、ＩＧＲ８８／８９、ＩＧＲ１３６／１３７、およびＩＧＲ１４８／１４９、好ましくは、ＩＧＲ６４／６５、ＩＧＲ８８／８９、および／またはＩＧＲ１４８／１４９から選択されてもよい。異種ＲＳＶヌクレオチド配列は、付加的にまたは代替的に、ＭＶＡの自然に存在する欠失部位Ｉ、ＩＩ、ＩＩ、ＩＶ、Ｖ、またはＶＩのうちの１つ以上に挿入されてもよい。特定の実施形態において、組込み部位のうちの５つ、４つ、３つ、または２つ未満は、異種ＲＳＶヌクレオチド配列を含む。

【0069】

異種ＲＳＶヌクレオチド配列を含むＭＶＡの挿入部位の数は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはそれより多くてもよい。組換えＭＶＡは、４つ、３つ、２つ、またはそれよりも少ない挿入部位に挿入される異種ＲＳＶヌクレオチド配列を含むことができるが、好ましくは２つの挿入部位が使用される。特定の実施形態において、３つの挿入部位が使用される。好ましくは、組換えＭＶＡは、２つまたは３つの挿入部位に挿入される少なくとも４つ、５つ、６つ、または７つのヌクレオチド配列を含む。

【0070】

本明細書に提供される組換えＭＶＡウイルスは、当該技術分野で既知の常法によって作製することができる。組換えポックスウイルスを得るための、または異種ヌクレオチド配列をポックスウイルスゲノムに挿入するための方法は、当業者に周知である。例えば、標準的な分子生物学技術のための方法、例えば、ＤＮＡのクローニング、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離、ウェスタンブロット分析、ＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲ増幅技術等は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄ．）［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に記載され、ウイルスを取り扱うおよび操作するための技術は、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ［Ｂ．Ｗ．Ｊ．Ｍａｈｙ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）］に記載されている。同様に、ＭＶＡの取り扱い、操作、および遺伝子操作のための技術およびノウハウは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ［Ａ．Ｊ．Ｄａｖｉｓｏｎ＆Ｒ．Ｍ．Ｅｌｌｉｏｔｔ（Ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ（１９９３）（例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ ９：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｂｙ Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓを参照）］およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ［Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．（１９９８）（例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ １６，Ｓｅｃｔｉｏｎ ＩＶ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒを参照）］に記載されている。

【0071】

本明細書に開示される種々の組換えＭＶＡの作製のために、異なる方法が適用可能であり得る。ウイルスに挿入されるヌクレオチド配列は、ＭＶＡのＤＮＡのセクションに相同的なＤＮＡが挿入されている大腸菌プラスミド構築物内に配置されてもよい。別途、挿入されるＤＮＡ配列は、プロモーターに連結されてもよい。プロモーター－遺伝子結合が、非本質的遺伝子座を含有するＭＶＡ ＤＮＡの領域に隣接するＤＮＡ配列に相同的なＤＮＡと両端で隣接するように、プロモーター－遺伝子結合は、プラスミド構築物中に位置付けられてもよい。結果として生じるプラスミド構築物は、大腸菌内で繁殖させることにより増幅させ、単離することができる。挿入されるＤＮＡ遺伝子配列を含有する単離したプラスミドは、例えば、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の細胞培養物にトランスフェクトすることができ、同時に培養物をＭＶＡに感染させる。プラスミド中の相同的ＭＶＡ ＤＮＡとウイルスゲノムとの間の組換えは、それぞれ、外来ＤＮＡ配列の存在によって修飾されたＭＶＡを作製することができる。

【0072】

好ましい実施形態によれば、好適な細胞培養物の細胞、例えば、ＣＥＦ細胞を、ポックスウイルスに感染させることができる。続いて、好ましくは、ポックスウイルス発現制御要素の転写制御下で、外来遺伝子（単数または複数）を含む第１のプラスミドベクターで感染細胞をトランスフェクトすることができる。上で説明したように、プラスミドベクターはまた、ポックスウイルスゲノムの選択された部分への外来配列の挿入を指示することができる配列を含む。任意選択的に、プラスミドベクターはまた、ポックスウイルスプロモーターに作動可能に連結されたマーカーおよび／または選択遺伝子を含むカセットを含有する。好適なマーカーまたは選択遺伝子は、例えば、緑色蛍光タンパク質、β－ガラクトシダーゼ、ネオマイシン－ホスホリボシルトランスフェラーゼ、または他のマーカーをコードする遺伝子である。選択またはマーカーカセットの使用は、作製された組換えポックスウイルスの同定および単離を単純化する。しかしながら、組換えポックスウイルスは、ＰＣＲ技術によっても同定することができる。その後、さらなる細胞を上述のように得られた組換えポックスウイルスに感染させ、第２の外来遺伝子（単数または複数）を含む第２のベクターでトランスフェクトすることができる。この遺伝子をポックスウイルスゲノムの異なる挿入部位に投入することができる場合、第２のベクターもまた、ポックスウイルスのゲノムへの第２の外来遺伝子（単数または複数）の組込みを指示するポックスウイルス－相同的配列において異なる。相同的組換えを行った後、２つ以上の外来遺伝子を含む組換えウイルスを単離することができる。組換えウイルスにさらなる外来遺伝子を導入するために、前のステップで感染のために単離した組換えウイルスをすることによって、およびトランスフェクションのためにさらなる外来遺伝子（単数または複数）を含むさらなるベクターを使用することによって、感染およびトランスフェクションのステップを繰り返すことができる。

【0073】

代替として、上述の感染およびトランスフェクションのステップは入れ替え可能である、すなわち、好適な細胞を、最初に外来遺伝子を含むプラスミドベクターによりトランスフェクトし、次いでポックスウイルスに感染させることができる。さらなる代替案として、各外来遺伝子を異なるウイルスに導入し、１つの細胞を得られた全ての組換えウイルスに同時感染させ、全ての外来遺伝子を含む組換えについてスクリーニングすることも可能である。３つ目の代替案は、ＤＮＡゲノムと外来配列のｉｎ ｖｉｔｒｏでの連結、およびヘルパーウイルスを用いた組換えワクシニアウイルスＤＮＡゲノムの再構成である。４つ目の代替案は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）としてクローニングしたワクシニアウイルスゲノムと、ワクシニアウイルスゲノム内の所望の組込み部位に隣接する配列に相同的なＤＮＡ配列と隣接する直鎖状配列との間の、大腸菌または別の細菌種における相同的組換えである。

【0074】

ＲＳＶ遺伝子の発現
一実施形態において、異種ＲＳＶヌクレオチド配列のうちの１つ、それ以上、または全ての発現は、１つ以上のポックスウイルスプロモーターの制御下にある。特定の実施形態において、ポックスウイルスプロモーターは、Ｐｒ７．５プロモーター、ハイブリッド初期／後期プロモーター、ＰｒＳプロモーター、合成もしくは天然の初期もしくは後期プロモーター、または牛痘ウイルスＡＴＩプロモーターである。特定の実施形態において、ポックスウイルスプロモーターは、ＰｒＳプロモーター（配列番号３９）、Ｐｒ７．５プロモーター（配列番号４０）、ＰｒＳｙｎＩＩｍプロモーター（配列番号４１）、ＰｒＬＥ１プロモーター（配列番号４２）、およびＰｒＨ５ｍプロモーター（配列番号４３［Ｌ．Ｓ．Ｗｙａｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６），ワクチン１４（１５）：１４５１－１４５８］）からなる群から選択される。特定の実施形態において、ポックスウイルスプロモーターは、ＰｒＳプロモーター（配列番号３９）である。特定の実施形態において、ポックスウイルスプロモーターは、Ｐｒ７．５プロモーター（配列番号４０）である。特定の実施形態において、ポックスウイルスプロモーターは、ＰｒＳｙｎＩＩｍプロモーター（配列番号４１）である。特定の実施形態において、ポックスウイルスプロモーターは、ＰｒＬＥ１プロモーター（配列番号４２）である。特定の実施形態において、ポックスウイルスプロモーターは、ＰｒＨ５ｍプロモーター（配列番号４３）である。

【0075】

異種ＲＳＶヌクレオチド配列（単数または複数）は、単一転写単位として発現されてもよい。例えば、異種ＲＳＶヌクレオチド配列は、ワクシニアウイルスプロモーターに作動可能に連結されてもよく、かつ／またはワクシニアウイルス転写ターミネーターに連結されてもよい。特定の実施形態において、１つ以上の異種ＲＳＶヌクレオチド配列は、融合タンパク質として発現される。融合タンパク質はさらに、ペプチダーゼの認識部位または異種自己切断ペプチド配列を含むことができる。異種自己切断ペプチド配列は、口蹄疫ウイルスからの２Ａペプチダーゼであってもよい。

【0076】

特定の実施形態において、「転写単位」は、ＭＶＡゲノム内の挿入部位に単独で挿入されるが、他の転写単位（複数可）とともにＭＶＡゲノム内の挿入部位に挿入されてもよい。「転写単位」は、ＭＶＡゲノム内に自然に存在せず（すなわち、異種、外因性、または外来性である）、感染細胞における転写が可能である。

【0077】

好ましくは、組換えＭＶＡは、ＭＶＡゲノムに挿入される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多くの転写単位を含む。特定の実施形態において、組換えＭＶＡは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多くの転写単位によってコードされるＲＳＶタンパク質を安定に発現する。特定の実施形態において、組換えＭＶＡは、ＭＶＡゲノム内の１つ、２つ、３つ、またはそれより多くの挿入部位でＭＶＡゲノムに挿入される２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多くの転写単位を含む。
ＲＳＶワクチンおよび薬学的組成物
本明細書に記載のＭＶＡ－ＢＮを含む組換えＭＶＡウイルスは、高度に複製が制限されており、ひいては高度に弱毒化されているため、それらは、ヒトおよび免疫不全のヒトさえも含む幅広い哺乳動物の治療の理想的な候補である。したがって、活性医薬物質ならびに薬学的組成物およびワクチンとして使用するための本発明による組換えＭＶＡを本明細書に提供し、全て、ヒトを含む生きた動物の体内に免疫応答を誘導することを目的とする。

【0078】

このために、組換えＭＶＡ、ワクチン、または薬学的組成物は、１０^４～１０^９ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ、１０^５～５×１０^８ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ、１０^６～１０^８ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ、または１０^７～１０^８ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの濃度範囲で溶液中に製剤化される。ヒトのための好ましい用量は、１０^６ ＴＣＩＤ_５０、１０^７ ＴＣＩＤ_５０、１０^８ ＴＣＩＤ_５０、または５ｘ１０^８ ＴＣＩＤ_５０の用量を含む１０^６～１０^９ＴＣＩＤ_５０を含む。

【0079】

本明細書に提供される薬学的組成物は、一般的に、１つ以上の薬学的に許容されるおよび／または承認される担体、添加剤、抗生物質、保存剤、アジュバント、希釈剤、および／または安定剤を含み得る。そのような補助物質は、水、食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等であってもよい。好適な担体は、典型的には、大きな、緩徐に代謝される分子、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物等である。

【0080】

ワクチンの調製のために、本明細書に提供される組換えＭＶＡウイルスを生理学的に許容される形態に変換することができる。これは、Ｈ．Ｓｔｉｃｋｌ ｅｔ ａｌ．，Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９：２３８６－２３９２（１９７４）によって記載されるように、天然痘に対するワクチン接種に使用されたポックスウイルスワクチンの調製における経験に基づいて行うことができる。

【0081】

例えば、精製したウイルスは、５ｘ１０^８ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの力価で－８０oＣで保存することができ、約１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．７）中に製剤化することができる。ワクチン注射の調製のために、例えば、１０^２～１０^８または１０^２～１０^９粒子のウイルスを、アンプル、好ましくは、ガラスアンプル中で、２％ペプトンおよび１％ヒトアルブミンの存在下、１００ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で凍結乾燥することができる。代替として、製剤中にウイルスを滴下で凍結乾燥することによって、ワクチン注射を生成することもできる。この製剤は、マンニトール、デキストラン、砂糖、グリシン、ラクトース、もしくはポリビニルピロリドン等のさらなる添加剤、またはｉｎ ｖｉｖｏ投与に好適な他の補助剤、例えば、抗酸化剤もしくは不活性ガス、安定剤もしくは組換えタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）等を含有することができる。次いで、ガラスアンプルを密封し、４℃～室温で数ヶ月間保存することができる。しかしながら、必要性がない限り、アンプルは、２０℃未満の温度で保存されることが好ましい。

【0082】

ワクチン接種または治療のために、水溶液、好ましくは生理食塩水またはＴｒｉｓ緩衝液中に凍結乾燥物を溶解し、全身的または局所的のいずれかで、すなわち、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、鼻腔内、または当業者に既知の他の投与経路で、投与することができる。投与様式、用量、および投与回数は、当業者によって既知の様式で最適化され得る。しかしながら、最も一般的には、患者は、最初のワクチン接種の注射から約１ヶ月～６週間後に２回目の注射の接種を受ける。

【0083】

組換えＭＶＡウイルスを含むキット
本明細書に記載の組換えＭＶＡのうちのいずれか１つ以上を含むキットも本明細書に提供される。キットは、ＲＳＶ感染症のリスクがある対象に組換えＭＶＡを投与するための指示と一緒に、組換えＭＶＡの１つまたは複数の容器またはバイアルを含むことができる。特定の実施形態において、対象はヒトである。指示は、組換えＭＶＡが単回投与または複数回投与（すなわち、２回、３回、４回等）で対象に投与されることを示し得る。特定の実施形態において、指示は、組換えＭＶＡウイルスが、１回目（予備刺激）および２回目（追加免疫）の投与でナイーブまたは非ナイーブな対象に投与されることを示す。

【0084】

さらに、１回目の投与（予備刺激）のための第１のバイアルまたは容器中、および２回目の投与（追加免疫）のための第２のバイアルまたは容器中に組換えＭＶＡウイルスを含むキットが提供される。キットはまた、３回目、４回目、またはさらなる投与（追加免疫）のための第３、第４、またはさらなるバイアルまたは容器中に組換えＭＶＡを含んでもよい。

【0085】

組換えＭＶＡウイルの方法および使用
対象動物を免疫する方法、ならびに対象動物を免疫する方法において使用するための組換えＭＶＡ、および対象動物を免疫するための薬物またはワクチンの調製における本明細書に提供される組換えＭＶＡの使用もまた、本明細書に提供される。特定の実施形態において、動物は哺乳動物である。特定の実施形態において、哺乳動物は、ラット、ウサギ、ブタ、マウス、またはヒトであり、方法は、本明細書に提供される組換えＭＶＡのうちのいずれか１つ以上の用量を対象に投与することを含む。

【0086】

対象は、好ましくはヒトであり、成人であってもよく、成人は、免疫不全であり得る。特定の実施形態において、成人は、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、または８５歳である。他の実施形態において、対象の年齢は、５歳未満、３歳未満、２歳未満、１５ヶ月未満、１２ヶ月未満、９ヶ月未満、６ヶ月未満、または３ヶ月未満である。また、対象の年齢は、０～３ヶ月、３～６ヶ月、６～９ヶ月、９～１２ヶ月、１～２年、または２～５年の範囲であってもよい。

【0087】

特定の実施形態において、本明細書に提供される組換えＭＶＡのうちのいずれかが、１０^６～１０^９ ＴＣＩＤ_５０の用量で、１０^６～５×１０^８ ＴＣＩＤ_５０、または１０^７～１０^８ ＴＣＩＤ_５０の用量で対象に投与される。本明細書に提供される組換えＭＶＡは、１０^６、１０^７ ＴＣＩＤ_５０、１０^８、または５×１０^８ ＴＣＩＤ_５０の用量で対象に投与されてもよい。特定の実施形態において、本明細書に提供される組換えＭＶＡのうちのいずれかが、１０^７ ＴＣＩＤ_５０、１０^８、または５×１０^８ ＴＣＩＤ_５０の用量で対象に投与される。

【0088】

本明細書に提供される組換えＭＶＡは、単回投与、または複数回投与（すなわち、２回、３回、４回等）で対象に投与される。特定の実施形態において、組換えＭＶＡは、１回目（予備刺激）および２回目（追加免疫）の投与で投与される。特定の実施形態において、第１の用量は、１０^７～１０^８ ＴＣＩＤ_５０の組換えＭＶＡウイルスを含み、第２の用量は、１０^７～１０^８ ＴＣＩＤ_５０を組換えＭＶＡウイルスを含む。

【0089】

組換えＭＶＡは、全身的もしくは局所的に、非経口的に、皮下に、静脈内に、筋肉内に、または鼻腔内に、このましくは皮下にまたは鼻腔内に投与することができる。組換えＭＶＡはまた、当業者に既知のいずれか他の投与経路によって投与されてもよい。

【0090】

別の態様において、ＲＳＶ感染症を診断する方法、および対象にＲＳＶ感染症再発のリスクがあるかどうかを決定する方法が、本明細書に提供される：それらは、特に、新生児、１～６歳の小児、および／または高齢者にとって重大な脅威となり得る。

【0091】

本発明者らは、ＲＳＶ感染症を診断する現在の方法は、不正確な結果を提供する可能性があることを発見した。例えば、ＲＳＶに対する抗体を検出するイムノアッセイ、またはウイルスプラークアッセイは、感染症再発のリスクがある個体を必ずしも正確に同定するとは限らない。実際に、本発明者らは、たとえ個体から採取された試料がウイルスプラークアッセイで陰性の結果を示したとしても［例えば、Ｗ．Ｏｌｓｚｅｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２００４．を参照］、より感度の高い方法では感染性ＲＳＶ粒子がなおも存在することが示される場合もあるため、そのような結果が、時には偽陰性であり得ることを観察した。事実、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）等の方法では、対象が、本当にＲＳＶに感染している可能性があるかどうか、感染再発のリスクがあるか、または実際に、ワクチン接種を受けた対象がＲＳＶに対する無菌免疫を獲得したかどうかを確認する必要がある。ワクチン接種後の再感染は、時として死をもたらす重篤な疾患を引き起こす場合があるため、この判定は非常に重要である。

【0092】

したがって、特定の実施形態において、対象から採取した試料がＲＳＶゲノムを含有するかどうかを定量的に決定することを含み、ＲＳＶゲノムの存在は、ＲＳＶへの再感染の可能性を示唆する、対象にＲＳＶ感染症の再発のリスクがあるかどうかを決定する方法が提供される。特定の実施形態において、対象から採取した試料がＲＳＶゲノムを含有するかどうかの定量的な決定は、ｑＲＴ－ＰＣＲによって行われる。

【0093】

本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、個体、細胞株、組織培養、またはポリヌクレオチドおよびポリペプチドまたはその一部を含有する他の源から採取された任意の生体試料を指す。生体試料は、例えば、臨床試験または他の実験試験に参加している対象から採取された臨床試料を含む、ＲＳＶを含有することが判明したおよび／または疑われる体液（例えば、血液、血清、血漿、尿、滑液、脊髄液、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）等）および体組織を含む。哺乳動物から組織生検および体液を採取するための方法は、当該技術分野で周知である。特定の実施形態において、生体試料はＲＳＶ核酸を含む。

【0094】

本明細書において交換可能に使用される場合、「ＲＴ－ｑＰＣＲ」または「ｑＲＴ－ＰＣＲ」という用語は、「定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応」として知られる方法を指す。いくつかの場合において、この方法は、動力学的ポリメラーゼ連鎖反応（ＫＰＣＲ）と称されてもよい。

【0095】

特定の実施形態において、対象から採取した試料がＲＳＶゲノムを含有するかどうかを定量的に決定することを含み、ＲＳＶゲノムの存在は、対象がＲＳＶに対する無菌免疫を獲得していないことを示唆する、対象がＲＳＶに対する無菌免疫を獲得したかどうかを決定する方法が本明細書に提供される。本明細書に記載の組換えＭＶＡのうちのいずれか１つを対象に鼻腔内投与することを含む、ＲＳＶに対する無菌免疫を獲得していない対象を免疫する方法もまた、本明細書に提供される。付加的にまたは代替的に、本明細書に記載の組換えＭＶＡのうちのいずれか１つは、ＲＳＶに対する無菌免疫を獲得していない対象を免疫する方法において使用するために提供され、該方法は、本明細書に記載の組換えＭＶＡのうちのいずれか１つを対象に鼻腔内投与することを含む。ＲＳＶに対する無菌免疫を獲得していない対象を免疫するための薬物および／またはワクチンの調製における本明細書に記載の組換えＭＶＡのうちのいずれかの使用もまた本明細書に提供され、薬物またはワクチンは、鼻腔内投与される。

【0096】

特定の実施形態において、本明細書に記載の組換えＭＶＡのうちのいずれかを対象に鼻腔内投与することを含む、ＲＳＶに対する無菌免疫を獲得していない対象においてＲＳＶに対する無菌免疫を誘導する方法が、本明細書に提供される。ＲＳＶに対する無菌免疫を獲得していない対象においてＲＳＶに対する無菌免疫を誘導する方法において使用するための本明細書に記載の組換えＭＶＡのうちのいずれか１つもまた本明細書に提供され、該方法は、本明細書に記載の組換えＭＶＡのうちのいずれか１つを対象に鼻腔内投与することを含む。付加的にまたは代替的に、ＲＳＶに対する無菌免疫を獲得していない対象においてＲＳＶに対する無菌免疫を誘導するための薬物および／またはワクチンの調製における、本明細書に記載の組換えＭＶＡのうちのいずれかの使用が本明細書に提供され、薬物またはワクチンは鼻腔内投与される。
なお、本願は、特許請求の範囲に記載の発明に関するものであるが、他の態様として以下も包含し得る。
１．筋肉内投与は除外される、鼻腔内投与によってＲＳＶ感染症を治療または予防するための、少なくとも１つのＲＳウイルス（ＲＳＶ）膜糖タンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列を含む、組換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）。
２．鼻腔内投与のみを含む、上記１に記載の組換えＭＶＡ。
３．前記組換えＭＶＡは、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、上記１または２に記載の組換えＭＶＡ。
４．ＲＳウイルス（ＲＳＶ）膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と、ＲＳＶヌクレオカプシドの抗原決定基をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と、を含む、組換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）。
５．前記ＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする前記ヌクレオチド配列は、ＲＳＶ Ｆおよび／またはＲＳＶ Ｇの抗原決定基をコードする、上記１～４のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ。
６．ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードする前記ヌクレオチド配列は、前記ＲＳＶ Ｎ ヌクレオカプシドおよび／またＲＳＶ Ｍ２マトリックスタンパク質の抗原決定基をコードする、上記３～５のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ。
７．ＲＳＶ膜糖タンパク質、好ましくは、前記ＲＳＶ Ｆまたは前記ＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする１つのヌクレオチド配列と、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質、好ましくは前記ＲＳＶ Ｎまたは前記ＲＳＶ Ｍ２タンパク質の抗原決定基をコードする１つのヌクレオチド配列と、を含む、前記上記のいずれかに記載の組換えＭＶＡ。
８．ＲＳＶ膜糖タンパク質、好ましくは前記ＲＳＶ Ｆおよび／または前記ＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする２つのヌクレオチド配列と、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質、好ましくは前記ＲＳＶ Ｎヌクレオカプシドまたは前記ＲＳＶ Ｍ２マトリックスタンパク質の抗原決定基をコードする１つのヌクレオチド配列と、を含む、上記１～６のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ。
９．ＲＳＶ膜糖タンパク質、好ましくはＲＳＶ Ｆおよび／またはＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする２つのヌクレオチド配列と、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質、好ましくはＲＳＶ Ｎおよび／または前記ＲＳＶ Ｍ２タンパク質の抗原決定基をコードする２つのヌクレオチド配列と、を含む、上記１～６のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ。
１０．ＲＳＶ膜糖タンパク質、好ましくは、２つのＲＳＶ Ｆ膜糖タンパク質および／もしくは１つのＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質、または２つのＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質および／もしくは１つのＲＳＶ Ｆ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする３つのヌクレオチド配列と、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質、好ましくは前記ＲＳＶ Ｎヌクレオカプシドおよび／または前記ＲＳＶ Ｍ２マトリックスタンパク質の抗原決定基をコードする２つのヌクレオチド配列と、を含む、上記１～６のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ。１１．ＲＳＶ膜糖タンパク質、好ましくは２つのＲＳＶ Ｆ膜糖タンパク質および／または２つのＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする４つのヌクレオチド配列と、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質、好ましくは、前記ＲＳＶ Ｎヌクレオカプシドまたは前記ＲＳＶ Ｍ２マトリックスタンパク質の抗原決定基をコードする１つのヌクレオチド配列と、を含む、上記１～６のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ。
１２．ＲＳＶ膜糖タンパク質、好ましくは２つのＲＳＶ Ｆ膜糖タンパク質および／または２つのＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする４つのヌクレオチド配列と、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質、好ましくは前記ＲＳＶ Ｎおよび／または前記ＲＳＶ Ｍ２タンパク質の抗原決定基をコードする２つのヌクレオチド配列と、を含む、上記１～６のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ。
１３．対象がＲＳＶ感染症再発のリスクがあるかどうかを決定する方法であって、ＲＴ－ｑＰＣＲにより前記対象から採取した試料中にＲＳＶが存在するかどうかを決定し、ＲＳＶの存在は、ＲＳＶ感染症再発の存在を示唆する、方法。
１４．対象がＲＳＶに対する無菌免疫を獲得したかどうかを決定する方法であって、ＲＴ－ｑＰＣＲにより前記対象から採取した試料中にＲＳＶが存在するかどうかを決定し、ＲＳＶの存在は、対象がＲＳＶに対する無菌免疫を獲得していないことを示唆する、方法。１５．上記１４に記載の方法によってＲＳＶに対する無菌免疫を獲得していないと診断された対象を免疫し、かつ／または前記対象において無菌免疫を誘導する方法であって、前記方法は前記組換えＭＶＡの前記対象への鼻腔内投与を含む、上記１～１２のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ。

【0097】

本発明の特定の実施形態は、以下の項目も含む：
１．筋肉内投与は除外される、鼻腔内投与によってＲＳＶ感染症を治療または予防するための、少なくとも１つのＲＳウイルス（ＲＳＶ）膜糖タンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列を含む、組換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）。
２．薬学的組成物および／またはワクチンの調製のための、少なくとも１つのＲＳウイルス（ＲＳＶ）膜糖タンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列を含む組換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）の使用であって、薬学的組成物および／またはワクチンは鼻腔内投与され、筋肉内投与は除外される、使用。
３．ヒトを含む対象をＲＳＶ感染症に対して免疫する方法であって、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）膜糖タンパク質の少なくとも１つの抗原決定基をコードするヌクレオチド配列を含む組換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）を、ヒトを含む対象に鼻腔内投与することを含み、筋肉内投与は除外される、方法。
４．鼻腔内投与のみを含む、項目１に記載の組換えＭＶＡ、項目２に記載の使用、および／または項目３に記載の方法。
５．皮下投与を含む、項目１に記載の組換えＭＶＡ、項目２に記載の使用、および／または項目３に記載の方法。
６．組換えＭＶＡは、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目１もしくは４～５のいずれか１つの記載の組換えＭＶＡ、項目２、４、もしくは５のいずれか１つに記載の使用、および／または項目３～５のいずれか１つの方法。
７．ＲＳウイルス（ＲＳＶ）膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と、ＲＳＶヌクレオカプシドの抗原決定基をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と、を含む、組換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）。
８．ＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列は、ＲＳＶ Ｆ抗原決定基をコードする、項目１～７のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
９．ＲＳＶ Ｆ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列をさらに含む、項目１～８のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
１０．ＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列は、全長ＲＳＶ Ｆ膜糖タンパク質をコードする、項目１～９のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
１１．ＲＳＶ Ｆ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列は、ＲＳＶ株Ａ、好ましくはＡ２および／またはＡ_ｌｏｎｇに由来する、項目８～１０のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
１２．ＲＳＶ Ｆ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４のアミノ酸配列 をコードするヌクレオチド配列を含む、項目８～１１のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
１３．ＲＳＶ Ｆ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列配列は、配列番号３のヌクレオチド配列を含む、項目８～１２のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
１４．ＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列は、切断型ＲＳＶ Ｆ膜糖タンパク質をコードする、項目１～１３のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
１５．切断型ＲＳＶ Ｆ膜糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ＲＳＶ株Ａ、好ましくはＡ_ｌｏｎｇに由来する、項目１４に記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
１６．切断型ＲＳＶ Ｆ膜糖タンパク質は、膜貫通ドメインを欠損する、項目１４または１５に記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
１７．切断型ＲＳＶ Ｆ膜糖タンパク質は、細胞質ドメインを欠損する、項目１４～１６のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
１８．ＲＳＶ Ｆ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、項目８～１７のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
１９．ＲＳＶ Ｆ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５のヌクレオチド配列を含む、項目８～１８のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
２０．ＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列は、ＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする、前記項目のいずれかに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
２１．ＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列をさらに含む、項目１～２０のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
２２．ＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列は、全長ＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質をコードする、項目１～２１のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
２３．ＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列は、ＲＳＶ株Ａ、好ましくは株Ａ２、および／またはＢに由来する、項目２０～２２のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
２４．ＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、項目２０～２３のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
２５．ＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、項目２０～２４のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
２６．ＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列は、切断型ＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質をコードする、項目１～２５のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
２７．切断型ＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列は、ＲＳＶ株Ｂに由来する、項目２６に記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
２８．切断型ＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質は、膜貫通ドメインを欠損する、項目２６または２７に記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
２９．切断型ＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質は、細胞質ドメインを欠損する、項目２６～２８のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
３０．ＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列は、配列番号８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、項目２０～２９のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
３１．ＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列は、配列番号７のヌクレオチド配列を含む、項目２０～３０のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
３２．ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列は、ＲＳＶ Ｎヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードする、項目６～３１のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
３３．ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列は、ＲＳＶ Ｍ２マトリックスタンパク質の抗原決定基をコードする、項目６～３２のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
３４．ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列は、全長タンパク質をコードする、項目６～３３のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
３５．ＲＳＶ Ｎヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列は、ＲＳＶ株Ａ、好ましくは株Ａ２に由来する、項目３２～３４のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
３６．ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列は、ＲＳＶ Ｎ ヌクレオカプシドおよびＲＳＶ Ｍ２マトリックスタンパク質の抗原決定基をコードする、項目３２～３５のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
３７．ＲＳＶ Ｎ ヌクレオカプシドおよびＲＳＶ Ｍ２マトリックスタンパク質の両方の抗原決定基は、単一の読み取り枠によってコードされる、項目３６に記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
３８．ＲＳＶ Ｎ ヌクレオカプシドおよびＲＳＶ Ｍ２マトリックスタンパク質の抗原決定基は、自己切断プロテアーゼドメインによって分離される、項目３６または３７に記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
３９．自己切断プロテアーゼドメイン配列は、口蹄疫ウイルスに由来する、項目３８に記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
４０．自己切断プロテアーゼドメイン配列は、プロテアーゼ２Ａ断片配列である、項目３８または３９に記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
４１．自己切断プロテアーゼドメイン配列は、配列番号１２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、項目３８～４０のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
４２．自己切断プロテアーゼドメインは、配列番号１１のヌクレオチド配列を含む、項目３８～４１のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
４３．単一の読み取り枠は、配列番号１８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、項目３７～４２のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
４４．単一の読み取り枠は、配列番号１７のヌクレオチド配列を含む、項目３７～４３のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
４５．ＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする１つのヌクレオチド配列と、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードする１つのヌクレオチド配列とを含む、前記項目のいずれかに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
４６．ＲＳＶ Ｆ膜糖タンパク質およびＲＳＶ Ｎヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基を含む、項目４５に記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
４７． ＲＳＶ Ｆ膜糖タンパク質およびＲＳＶ Ｍ２マトリックスタンパク質の抗原決定基を含む、項目４５に記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
４８．ＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質およびＲＳＶ Ｎヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基を含む、項目４５に記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
４９．ＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質およびＲＳＶ Ｍ２マトリックスタンパク質の抗原決定基を含む、項目４５に記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
５０．ＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする２つのヌクレオチド配列と、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードする１つのヌクレオチド配列とを含む、項目１～４４のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
５１．ＲＳＶ Ｆおよび／またはＧ膜糖タンパク質ならびにＲＳＶ Ｎヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基を含む、項目５０に記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
５２．ＲＳＶ Ｆおよび／またはＧ膜糖タンパク質ならびにＲＳＶ Ｍ２マトリックスタンパク質の抗原決定基を含む、項目５０に記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
５３．ＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする２つのヌクレオチド配列と、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードする２つのヌクレオチド配列とを含む、項目１～４４のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
５４．ＲＳＶ Ｆおよび／またはＧ膜糖タンパク質の抗原決定基と、ＲＳＶ Ｎヌクレオカプシドおよび／またはＭ２マトリックスタンパク質の抗原決定基とをコードするヌクレオチド配列を含む、項目５３に記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
５５．ＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする３つのヌクレオチド配列と、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードする２つのヌクレオチド配列とを含む、項目１～４４のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
５６．２つのＲＳＶ Ｆ膜糖タンパク質および／または１つのＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質の抗原決定基と、ＲＳＶ Ｎヌクレオカプシドタンパク質および／またはＲＳＶ Ｍ２マトリックスタンパク質の抗原決定基とを含む、項目５５に記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
５７．２つのＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質および／または１つのＲＳＶ Ｆ膜糖タンパク質の抗原決定基と、ＲＳＶ Ｎヌクレオカプシドタンパク質および／またはＲＳＶ Ｍ２マトリックスタンパク質の抗原決定基とを含む、項目５５に記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
５８．ＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする４つのヌクレオチド配列と、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードする１つのヌクレオチド配列とを含む、項目１～４４のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
５９．２つのＲＳＶ Ｆ膜糖タンパク質および／または２つのＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質の抗原決定基とＲＳＶ Ｎヌクレオカプシドタンパク質またはＲＳＶ Ｍ２マトリックスタンパク質の抗原決定基とを含む、項目５８に記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
６０．ＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基をコードする４つのヌクレオチド配列と、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質の抗原決定基をコードする２つのヌクレオチド配列とを含む、項目１～４４のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
６１．２つのＲＳＶ Ｆ膜糖タンパク質および／または２つのＲＳＶ Ｇ膜糖タンパク質の抗原決定基と、ＲＳＶ Ｎヌクレオカプシドタンパク質および／またはＲＳＶ Ｍ２マトリックスタンパク質の抗原決定基とを含む、項目６０に記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
６２． 組換えＭＶＡを作製するために使用されるＭＶＡは、ＭＶＡ－ＢＮまたはその誘導体である、項目１～６１のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、使用および／または方法。
６３．活性医薬物質として使用するための、項目１または４～６２のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ。
６４．項目１または４～６３のいずれか１つの記載の組換えＭＶＡ、任意選択的に薬学的に許容される担体および／または希釈剤を含む、薬学的組成物および／またはワクチン。６５．薬学的組成物および／またはワクチンの調製のための、項目１または４～６３のいずれか１つの記載の組換えＭＶＡの使用。
６６．ＲＳＶ感染症を治療または予防するための、項目６～６３のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、項目６４の薬学的組成物および／もしくはワクチン、ならびに／または項目２、４～６、８～６２、もしくは６５のいずれか１つに記載の使用。
６７．項目１、４～６３もしくは６６のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡならびに／または項目６４～６６に記載の薬学的組成物および／もしくはワクチンを、ヒトを含む対象に投与することを含む、ヒトを含む対象をＲＳＶ感染症に対して免疫する方法。
６８．組換えＭＶＡは、１０^７～１０^９ ＴＣＩＤ_５０の用量で投与されるかまたは投与されるべきである、項目１、４～６３もしくは６６のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、項目６４～６６に記載の薬学的組成物および／もしくはワクチン、項目２、４～６、８～６２、６５もしくは６６のいずれか１つに記載の使用、ならびに／または項目３～６、８～６２もしくは６７のいずれか１つに記載の方法。
６９．組換えＭＶＡは、鼻腔内投与および／または皮下投与されるかまたはされるべきである、項目５～６８のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、薬学的組成物および／もしくはワクチン、使用ならびに／または方法。
７０．組換えＭＶＡは、ヒトを含む免疫学的にナイーブなまたは免疫学的に成熟な対象に、単回投与または複数回投与で投与されるかまたは投与されるべきである、項目１～６９のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、薬学的組成物および／もしくはワクチン、使用ならびに／または方法。
７１．２歳を上回るヒトを含む対象に投与するための、項目１～７０のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、薬学的組成物および／もしくはワクチン、使用ならびに／または方法。
７２．２歳未満のヒトを含む対象に投与するための、項目１～７０のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、薬学的組成物および／もしくはワクチン、使用ならびに／または方法。７３．項目１、４～６３、６６または６８～７２のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡの１つまたは複数のバイアルと、ＲＳＶ感染症のリスクがある対象にウイルスを投与するための指示とを含む、キット。
７４．１回目の投与（予備刺激）のための第１のバイアルまたは容器中、および２回目の投与（追加免疫）のための第２のバイアルまたは容器中に組換えＭＶＡを含む、項目１、４～６３、６６もしくは６８～７２のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡを含むキット、および／または項目７３に記載のキット。
７５．３回目、４回目、またはさらなる投与（追加免疫）のための第３、第４、またはさらなるバイアルまたは容器中に組換えＭＶＡを含む、項目７３または７４に記載のキット。
７６．項目１、４～６３または６６のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡを含む、細胞。７７．以下のステップを含む、項目１、４～６３、６６または６８～７２のいずれか１つに従って組換えＭＶＡを作製する方法：
（ａ）宿主細胞をＭＶＡウイルスに感染させるステップ、
（ｂ）感染細胞を、ＲＳＶ抗原決定基をコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクターでトランスフェクトするステップであって、前記ヌクレオチド配列は、ＭＶＡウイルスゲノムへのヌクレオチド配列の組込みを指示することが可能なゲノムＭＶＡウイルス配列をさらに含む、ステップ、
（ｃ）作製された組換えＭＶＡウイルスを同定、単離、および任意選択的に精製するステップ。
７８．項目７７に記載の方法に従って作製される、組換えＭＶＡ。
７９．以下のステップを含む、いずれか１つの項目１、４～６３、６６もしくは６８～７２に従って組換えＭＶＡを生成するため、および／または前記組換えＭＶＡのゲノムから発現される抗原決定基を生成するための方法：
（ａ）宿主細胞を、項目１、４～６３、６６もしくは項目６８～７２のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡに感染させるステップ、または該細胞を組換えＭＶＡの組換えＤＮＡでトランスフェクトするステップ、
（ｂ）感染またはトランスフェクトされた細胞を培養するステップ、
（ｃ）前記細胞からＭＶＡおよび／または抗原決定基を単離するステップ。
８０．項目７９の方法によって得られた、組換えＭＶＡおよび／または抗原決定基。
８１．対象がＲＳＶ感染症再発のリスクがあるかどうかを決定する方法であって、ＲＴ－ｑＰＣＲにより前記対象から採取した試料中にＲＳＶが存在するかどうかを決定し、ＲＳＶの存在は、ＲＳＶ感染症再発の存在を示唆する、方法。
８２．対象がＲＳＶに対する無菌免疫を獲得したかどうかを決定する方法であって、ＲＴ－ｑＰＣＲにより前記対象から採取した試料中にＲＳＶが存在するかどうかを決定し、ＲＳＶの存在は、対象がＲＳＶに対する無菌免疫を獲得していないことを示唆する、方法。８３．項目８２に記載の方法によってＲＳＶに対する無菌免疫を獲得していないと診断された対象を免疫する方法であって、項目１、４～６３、６６、６８～７２、７８もしくは８０のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、および／または項目６４、６６もしくは６８～７２のいずれか１つに記載の薬学的組成物および／もしくはワクチンを対象に鼻腔内投与することを含む、方法。
８４．項目８２に記載の方法によってＲＳＶに対する無菌免疫を獲得していないと診断された対象を免疫する方法（前記方法は、前記組換えＭＶＡを対象に鼻腔内投与することを含む）において使用するための、項目１、４～６３、６６、６８～７２、７８もしくは８０のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、および／または項目６４、６６もしくは６８～７２のいずれか１つに記載の薬学的組成物および／もしくはワクチン。
８５．項目８２に記載の方法によってＲＳＶに対する無菌免疫を獲得していないと診断された対象を免疫するための薬学的組成物および／またはワクチンの調製のための、項目１、４～６３、６６、６８～７２、７８または８０のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡの使用であって、薬学的組成物および／またはワクチンは、鼻腔内投与のためである、使用。
８６．項目８２に記載の方法によってＲＳＶに対する無菌免疫を獲得していないと診断された対象において無菌免疫を誘導する方法であって、項目１、４～６３、６６、６８～７２、７８もしくは８０のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、および／または項目６４、６６もしくは６８～７２のいずれか１つに記載の薬学的組成物および／もしくはワクチンを対象に鼻腔内投与することを含む、方法。
８７．項目８２に記載の方法によってＲＳＶに対する無菌免疫を獲得していないと診断された対象において無菌免疫を誘導する方法（前記方法は、前記組換えＭＶＡを対象に鼻腔内投与することを含む）において使用するための、項目１、４～６３、６６、６８～７２、７８もしくは８０のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡ、および／または項目６４、６６もしくは６８～７２のいずれか１つに記載の薬学的組成物および／もしくはワクチン。８８．項目８２に記載の方法によってＲＳＶに対する無菌免疫を獲得していないと診断された対象において無菌免疫を誘導するための薬学的組成物および／またはワクチンの調製のための、項目１、４～６３、６６、６８～７２、７８もしくは８０のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡの使用であって、薬学的組成物またはワクチンは、鼻腔内投与のためである、使用。

【0098】

上記の一般的および詳細な説明は、例示的および説明的であるに過ぎず、請求される本発明を制限または限定するものではないことを理解されたい。本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、本発明の種々の実施形態を例示し、説明とともに、本発明の主旨を説明する役割を果たす。

【図面の簡単な説明】

【0099】

【図1】試験した組換えＭＶＡ－構築物、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１ＢΔＭ２、ＭＶＡ－ｍＢＮ２９４Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２９５Ｂ、およびＭＶＡ－ｍＢＮ３３０Ｂにおいて使用した異種ＲＳＶ遺伝子を示す。

【図2】ＩＢＬ Ｈａｍｂｕｒｇに基づくＥＬＩＳＡによって測定された血清ＲＳＶ特異的ＩｇＧ応答を示す。ＴＢＳまたは１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ、もしくはＭＶＡ－ｍＢＮ２０１ＢDＭ２で、マウスを２回または３回（ｓｃまたはｉｎ）免疫した。１０^６ｐｆｕのＲＳＶで対照マウスを２回ｉｎ免疫した。血清を１／１００に希釈し、ＲＳＶ ＦおよびＧタンパク質でコーティングしたプレートを使用するＩＢＬ Ｈａｍｂｕｒｇキットに基づくＲＳＶ特異的ＩｇＧ ＥＬＩＳＡを用いて分析した。

【図3】連続希釈後、ＩＢＬ Ｈａｍｂｕｒｇに基づくＥＬＩＳＡによって測定された血清ＲＳＶ特異的ＩｇＧ応答を示す。ＴＢＳまたは１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ、もしくはＭＶＡ－ｍＢＮ２０１ＢDＭ２で、マウスを２回または３回（ｓｃまたはｉｎ）免疫した。１０^６ｐｆｕのＲＳＶで対照マウスを２回ｉｎ免疫した。血清を希釈し（１／１００、１／２００、および１／４００）、ＲＳＶ ＦおよびＧタンパク質でコーティングしたプレートを使用するＩＢＬ Ｈａｍｂｕｒｇキットに基づくＲＳＶ特異的ＩｇＧ ＥＬＩＳＡを用いて分析した。

【図4】Ｆタンパク質のみでコーティングしたプレートを使用するＩＢＬ Ｈａｍｂｕｒｇに基づくＥＬＩＳＡによって測定された血清ＲＳＶ特異的ＩｇＧ応答を示す。ＴＢＳまたは１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ、もしくはＭＶＡ－ｍＢＮ２０１ＢDＭ２で、マウスを２回または３回ｓｃ免疫した。１０^６ｐｆｕのＲＳＶで対照マウスを２回ｉｎ免疫した。血漿を１／１００に希釈し、ＲＳＶ Ｆタンパク質のみでコーティングしたプレートを使用するＩＢＬ Ｈａｍｂｕｒｇキットに基づくＲＳＶ特異的ＩｇＧ ＥＬＩＳＡを用いて分析した。

【図5】Ｓｅｒｉｏｎに基づくＥＬＩＳＡによって測定された血清ＲＳＶ特異的ＩｇＧ応答を示す。ＴＢＳまたは１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ、もしくはＭＶＡ－ｍＢＮ２０１ＢDＭ２のいずれかで、マウスを２回または３回（ｓｃまたはｉｎ）免疫した。１０^６ｐｆｕのＲＳＶで対照マウスを２回ｉｎ免疫した。血清を希釈し（１／１００）、ＲＳＶ溶解物でコーティングしたプレートを使用するＳｅｒｉｏｎキットに基づくＲＳＶ特異的ＩｇＧ ＥＬＩＳＡを用いて分析した。

【図6】気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液および血清中でＩＢＬ Ｈａｍｂｕｒｇに基づくＥＬＩＳＡによって測定されたＲＳＶ特異的ＩｇＡ対ＩｇＧ応答を示す。ＴＢＳまたは１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ、もしくはＭＶＡ－ｍＢＮ２０１ＢDＭ２で、マウスを２回または３回（ｓｃまたはｉｎ）免疫した。１０^６ｐｆｕのＲＳＶで対照マウスを２回ｉｎ免疫した。血清およびＢＡＬ液を希釈し（１／１００）、ＲＳＶ ＦおよびＧタンパク質でコーティングしたプレートを用いたＩＢＬ Ｈａｍｂｕｒｇキットに基づくＲＳＶ特異的ＩｇＧまたはＩｇＡ ＥＬＩＳＡを使用して分析した。

【図7】ＥＬＩＳＰＯＴによって測定されたＲＳＶ Ｆ－、ＲＳＶ Ｇ－、およびＲＳＶ Ｍ２特異的Ｔ細胞応答を示す。ＴＢＳまたは１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ、もしくはＭＶＡ－ｍＢＮ２０１ＢDＭ２のいずれかで、マウスを２回または３回（ｓｃまたはｉｎ）免疫した。１０^６ｐｆｕのＲＳＶで対照マウスを２回ｉｎ免疫した。４８日目に脾臓を単離し、３つの異なるＲＳＶ Ｆ特異的ペプチド（ＲＳＶ－１（配列番号１９）、ＲＳＶ－２（配列番号２０）、およびＲＳＶ－３（配列番号２１）、１つのＲＳＶ Ｇ特異的ペプチド（ＲＳＶ－４（配列番号２２））、１つのＲＳＶ Ｍ２特異的ペプチド（ＲＳＶ－９（配列番号２７））、またはＭＶＡ－ＢＮで脾細胞を再刺激した。ＩＦＮγ分泌細胞をＥＬＩＳＰＯＴにより検出した。実施例に説明するように刺激指数を算出した。

【図8】ＲＳＶ（Ａ２）による曝露後の相対的な体重減少を示す。ＴＢＳまたは１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ、もしくはＭＶＡ－ｍＢＮ２０１ＢDＭ２で、マウスを２回または３回（ｓｃまたはｉｎ）免疫した。１０^６ｐｆｕのＲＳＶで対照マウスを２回ｉｎ免疫した。次いで、４９日目に、マウスを１０^６ｐｆｕのＲＳＶ（Ａ２）に曝露した。曝露日から毎日体重を監視した。曝露日の体重を相対的体重変化の割合を算出するための基準として用いた。

【図9】プラークアッセイによって測定された肺内のＲＳＶ負荷を示す。ＴＢＳまたは１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ、もしくはＭＶＡ－ｍＢＮ２０１ＢDＭ２で、マウスを２回または３回（ｓｃまたはｉｎ）免疫した。１０^６ｐｆｕのＲＳＶで対照マウスを２回ｉｎ免疫した。次いで、４９日目に、マウスを１０^６ｐｆｕのＲＳＶ（Ａ２）に曝露した。４日後、肺を単離し、プラークアッセイによりＲＳＶ負荷（肺当たりのｐｆｕ）を決定した。

【図10】ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定された肺内のＲＳＶ負荷を示す。ＴＢＳまたは１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ、もしくはＭＶＡ－ｍＢＮ２０１ＢDＭ２で、マウスを２回または３回（ｓｃまたはｉｎ）免疫した。１０^６ｐｆｕのＲＳＶで対照マウスを２回ｉｎ免疫した。次いで、４９日目に、マウスを１０^６ｐｆｕのＲＳＶ Ａ２に曝露した。４日後、肺を単離し、ＲＴ－ｑＰＣＲによってＲＳＶ負荷（観察されたＬ遺伝子コピー数に基づいて推定される）を決定した。

【図11】ＥＬＩＳＡによって測定されたＲＳＶ（Ａ２）曝露後４日目の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）中のＩＬ４レベルを示す。ＴＢＳまたは１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ｍＢＮ１９９ＢもしくはＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂで、マウスを２回（ｓｃまたはｉｎ）免疫した。１０^６ｐｆｕのＲＳＶで対照マウスを２回ｉｎ免疫した。次いで、マウスを１０^６ｐｆｕのＲＳＶ Ａ２に曝露した。４日後、１ｍｌのＰＢＳで肺を洗浄し、ＥＬＩＳＡによってＢＡＬ中のＩＬ４レベルを決定した。（ｎ．ｄ．＝検出不能）

【図12】ＥＬＩＳＡによって測定されたＲＳＶ（Ａ２）曝露後４日目の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）中のＩＬ５レベルを示す。ＴＢＳまたは１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ｍＢＮ１９９ＢもしくはＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂで、マウスを２回（ｓｃまたはｉｎ）免疫した。１０^６ｐｆｕのＲＳＶで対照マウスを２回ｉｎ免疫した。次いで、マウスを１０^６ｐｆｕのＲＳＶ Ａ２に曝露した。４日後、１ｍｌのＰＢＳで肺を洗浄し、ＥＬＩＳＡによってＢＡＬ中のＩＬ５レベルを決定した。（ｎ．ｄ．＝検出不能）

【図13】Ｓｅｒｉｏｎに基づくＥＬＩＳＡによって測定された血清ＲＳＶ特異的ＩｇＧ応答を示す。ＴＢＳまたは１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ、もしくはＭＶＡ－ｍＢＮ２９４Ａのいずれかで、３週間開けて２回マウスをｓｃ免疫した。１０^６ｐｆｕのＲＳＶで対照マウスを２回ｉｎ免疫した。最後の免疫化の２週間後に採取した群当たり５匹のマウスの血清を希釈し、ＲＳＶ溶解物でコーティングしたプレートを使用するＳｅｒｉｏｎキットに基づくＲＳＶ特異的ＩｇＧ ＥＬＩＳＡを用いて分析した。

【図14】ＰＲＮＴによって測定された血清ＲＳＶ特異的中和抗体応答を示す。ＴＢＳまたは１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ、もしくはＭＶＡ－ｍＢＮ２９４Ａのいずれかで、３週間開けて２回マウスをｓｃ免疫した。１０^６ｐｆｕのＲＳＶで対照マウスを２回ｉｎ免疫した。ＰＲＮＴによって分析した、最後の免疫化の２週間後に採取した群当たり５匹のマウスの血清。

【図15】ＥＬＩＳＰＯＴによって測定されたＲＳＶ ＦおよびＲＳＶ Ｍ２特異的Ｔ細胞応答を示す。ＴＢＳまたは１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ、もしくはＭＶＡ－ｍＢＮ２９４Ａのいずれかで、３週間開けて２回マウスをｓｃ免疫した。１０^６ｐｆｕのＲＳＶで対照マウスを２回ｉｎ免疫した。３４日目に脾臓を単離し、１つのＲＳＶ Ｆ特異的ペプチド（ＲＳＶ－２（配列番号２０）、１つのＲＳＶ Ｍ２特異的ペプチド（ＲＳＶ－９（配列番号２７））、またはＭＶＡ－ＢＮで脾細胞を再刺激した。ＩＦＮγ分泌細胞をＥＬＩＳＰＯＴにより検出した。実施例に説明するように刺激指数を算出した。

【図16】プラークアッセイによって測定された肺内のＲＳＶ負荷を示す。ＴＢＳまたは１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ、もしくはＭＶＡ－ｍＢＮ２９４Ａのいずれかで、３週間開けて２回マウスをｓｃ免疫した。対照マウスを１０^６ ｐｆｕのＲＳＶで２回ｉｎ免疫したか、または５０μｌのＦＩ－ＲＳＶでｉｍ免疫した。次いで、４９日目に、マウスを１０^６ｐｆｕのＲＳＶ（Ａ２）に曝露した。４日後、肺を単離し、プラークアッセイによりＲＳＶ負荷（肺当たりのｐｆｕ）を決定した。

【図17】ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定された肺内のＲＳＶ負荷を示す。ＴＢＳまたは１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ、もしくはＭＶＡ－ｍＢＮ２９４Ａのいずれかで、３週間開けて２回マウスをｓｃ免疫した。対照マウスを１０^６ ｐｆｕのＲＳＶで２回ｉｎ免疫したか、または５０μｌのＦＩ－ＲＳＶでｉｍ免疫した。次いで、４９日目に、マウスを１０^６ｐｆｕのＲＳＶ Ａ２に曝露した。４日後、肺を単離し、ＲＴ－ｑＰＣＲによってＲＳＶ負荷（観察されたＬ遺伝子コピー数に基づいて推定される）を決定した。

【図18】ＲＳＶ（Ａ２）曝露後４日目の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中の好酸球および好中球の浸潤を示す。ＴＢＳまたは１×１０８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ、もしくはＭＶＡ－ｍＢＮ２９４Ａのいずれかで、３週間開けて２回マウスをｓｃ免疫した。対照マウスを１０^６ ｐｆｕのＲＳＶで２回ｉｎ免疫したか、または５０μｌのＦＩ－ＲＳＶでｉｍ免疫した。次いで、マウスを１０^６ｐｆｕのＲＳＶ Ａ２に曝露した。４日後、１ｍｌのＰＢＳで肺を洗浄し、ＢＡＬ液中の好酸球および好中球の割合を決定した。

【0100】

配列の簡単な説明

【0101】

配列番号１は、ヒト ＲＳＶ（ｈＲＳＶ）株Ａ２からの全長Ｇタンパク質をコードするＤＮＡ配列である（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ１１４８６）。

【0102】

配列番号２は、ｈＲＳＶ株Ａ２からの全長Ｇタンパク質をコードするアミノ酸配列である（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ１１４８６）。

【0103】

配列番号３は、ｈＲＳＶ株Ａ２からの全長Ｆタンパク質（ＢＮ変異体）をコードするＤＮＡ配列である。

【0104】

配列番号４は、ｈＲＳＶ株Ａ２からの全長Ｆタンパク質（ＢＮ変異体）をコードするアミノ酸配列である。

【0105】

配列番号５は、ｈＲＳＶ株ＡＬｏｎｇからの全長Ｆタンパク質（ＢＮ変異体）をコードするＤＮＡ配列である。

【0106】

配列番号６は、ｈＲＳＶ株ＡＬｏｎｇからの全長Ｆタンパク質（ＢＮ変異体）をコードするアミノ酸配列である。

【0107】

配列番号７は、ｈＲＳＶ株Ｂからの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠損した切断Ｇタンパク質をコードするＤＮＡ配列である（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｐ２０８９６）。

【0108】

配列番号８は、ｈＲＳＶ株Ｂからの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠損した切断Ｇタンパク質をコードするアミノ酸配列である（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｐ２０８９６）。

【0109】

配列番号９は、ｈＲＳＶ株Ａ２からの停止コドンを欠損したＮタンパク質をコードするＤＮＡ配列である（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ１１４８６）。

【0110】

配列番号１０は、ｈＲＳＶ株Ａ２からの停止コドンを欠損したＮタンパク質をコードするアミノ酸配列である（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ１１４８６）。

【0111】

配列番号１１は、開始コドンおよび停止コドンの両方を欠損した口蹄疫ウイルスからのプロテアーゼ２Ａの断片をコードするＤＮＡ配列である。

【0112】

配列番号１２は、開始コドンおよび停止コドンの両方を欠損した口蹄疫ウイルスからのプロテアーゼ２Ａの断片をコードするアミノ酸配列である。

【0113】

配列番号１３は、ｈＲＳＶ株Ａ２からの開始コドンを欠損した全長Ｍ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列である（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ１１４８６）。

【0114】

配列番号１４は、ｈＲＳＶ株Ａ２からの開始コドンを欠損した全長Ｍ２タンパク質をコードするアミノ酸配列である（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ１１４８６）。

【0115】

配列番号１５は、ｈＲＳＶ株Ａ２からの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠損した切断Ｆタンパク質（ＢＮ変異体）をコードするＤＮＡ配列であるＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ１１４８６）。

【0116】

配列番号１６は、ｈＲＳＶ株Ａ２からの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠損した切断Ｆタンパク質（ＢＮ変異体）をコードするアミノ酸配列である（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ１１４８６）。

【0117】

配列番号１７は、停止コドンｈＲＳＶ株Ａ２を欠損したＮタンパク質をコードするＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ１１４８６）＋開始コドンおよび停止コドンの両方を欠損した口蹄疫ウイルスからのプロテアーゼ２Ａ断片をコードするＤＮＡ配列＋ｈＲＳＶ株Ａ２からの開始コドンを欠損した全長Ｍ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ１１４８６）である。

【0118】

配列番号１８は、ｈＲＳＶ株Ａ２からのＮタンパク質のアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ１１４８６）＋開始コドンを欠損した口蹄疫ウイルスからのプロテアーゼ２Ａ断片のアミノ酸配＋ｈＲＳＶ株Ａ２からの開始コドンを欠損した全長Ｍ２タンパク質のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ１１４８６）である。

【0119】

配列番号１９は、ＲＳＶ Ｆタンパク質に由来するＲＳＶ－１ペプチドのアミノ酸配列である。

【0120】

配列番号２０は、ＲＳＶ Ｆタンパク質に由来するＲＳＶ－２ペプチドのアミノ酸配列である。

【0121】

配列番号２１は、ＲＳＶ Ｆタンパク質に由来するＲＳＶ－３ペプチドのアミノ酸配列である。

【0122】

配列番号２２は、ＲＳＶ Ｇタンパク質に由来するＲＳＶ－４ペプチドのアミノ酸配列である。

【0123】

配列番号２３は、ＲＳＶ Ｇタンパク質に由来するＲＳＶ－５ペプチドのアミノ酸配列である。

【0124】

配列番号２４は、ＲＳＶ Ｇタンパク質に由来するＲＳＶ－６ペプチドのアミノ酸配列である。

【0125】

配列番号２５は、ＲＳＶ Ｇタンパク質に由来するＲＳＶ－７ペプチドのアミノ酸配列である。

【0126】

配列番号２６は、ＲＳＶ Ｇタンパク質に由来するＲＳＶ－８ペプチドのアミノ酸配列である。

【0127】

配列番号２７は、ＲＳＶ Ｍ２タンパク質に由来するＲＳＶ－９ペプチドのアミノ酸配列である。

【0128】

配列番号２８は、ｈＲＳＶ株Ａ２からの全長Ｆタンパク質をコードするＤＮＡ配列である。

【0129】

配列番号２９は、ｈＲＳＶ株Ａ２からの全長Ｆタンパク質のアミノ酸配列である。

【0130】

配列番号３０は、ｈＲＳＶ株Ａ２からの全長Ｇタンパク質をコードするＤＮＡ配列である。

【0131】

配列番号３１は、ｈＲＳＶ株Ａ２からの全長Ｇタンパク質のアミノ酸配列である。

【0132】

配列番号３２は、ｈＲＳＶ株Ａ２からの全長Ｍ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列である。

【0133】

配列番号３３は、ｈＲＳＶ株Ａ２からの全長Ｍ２タンパク質のアミノ酸配列である。

【0134】

配列番号３４は、ｈＲＳＶ株Ａ２からの全長Ｎタンパク質をコードするＤＮＡ配列である。

【0135】

配列番号３５は、ｈＲＳＶ株Ａ２からの全長Ｎタンパク質のアミノ酸配列である。

【0136】

配列番号３６は、ＲＴ－ｑＰＣＲに使用されるプライマー１である。

【0137】

配列番号３７は、ＲＴ－ｑＰＣＲに使用されるプライマー２である。

【0138】

配列番号３８は、ＲＴ－ｑＰＣＲに使用されるプローブ６である。

【0139】

配列番号３９は、ＰｒＳプロモーターのヌクレオチド配列である。

【0140】

配列番号４０は、Ｐｒ７．５プロモーターのヌクレオチド配列である。

【0141】

配列番号４１は、ＰｒＳｙｎＩＩｍプロモーターのヌクレオチド配列である。

【0142】

配列番号４２は、ＰｒＬＥ１プロモーターのヌクレオチド配列である。

【0143】

配列番号４３は、ＰｒＨ５ｍプロモーターのヌクレオチド配列である。

【0144】

実施例
実施例１：組換えＭＶＡの構築
組換えＭＶＡの作製は、組換えＭＶＡを選択するための選択マーカーを使用したＣＥＦ細胞における相同的組換えを介して、示されるプロモーター（図１）と一緒にＲＳＶコード配列をＭＶＡゲノムに挿入することによって行われた。挿入部位としての遺伝子間領域（ＩＧＲｓ）の使用については、国際特許公開ＷＯ ０３／０９７８４５に記載されている。選択マーカーを欠失させるために、相同的組換えの第２のステップを用いた。

【0145】

ＭＶＡ－ＢＮ（登録商標）ウイルスを、ＩＧＲ８８／８９にＲＳＶ－Ａ２－ＧおよびＲＳＶ－Ｆ－Ａ２＿ＢＮの遺伝子を含有する組換えＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂを作製するための出発材料として用いた。ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９のＰｒｅＭａｓｔｅｒ材料を、後述のＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂを作製するための出発材料として用いた。

【0146】

ＩＧＲ８８／８９への挿入（ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ）：
ＲＳＶ－Ａ２－Ｇのコード配列は、ＲＳＶ－Ａ２株糖タンパク質Ｇの天然に存在する配列に基づいている。融合タンパク質ＲＳＶ－Ｆ－Ａ２ ＢＮのコード配列も、ＲＳＶ－Ａ２株に基づいているが、Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃによって修飾された。両方の挿入遺伝子は、ヒト適合化コドンの使用頻度を用いてＧｅｎｅａｒｔにより合成され、組換えプラスミドのクローニングに用いられた。ＲＳＶ－Ａ２－Ｇのタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ配列Ｐ０３４２３．１に対して１００％の同一性を示す。ＲＳＶ－Ｆ－Ａ２ ＢＮのタンパク質配列は、１０３位における１つの単一アミノ酸交換（ＰからＡ）のために、ＧｅｎＢａｎｋ配列Ｐ０３４２０．１に対して９９％の同一性を示すのみである。

【0147】

ＩＧＲ１４８／１４９への挿入（ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ）：
ＲＳＶ－Ｎ－Ａ２およびＲＳＶ－Ｍ２－Ａ２のコード配列は、それぞれのＲＳＶ－Ａ２株糖タンパク質の自然に存在する配列に基づいている。両方の遺伝子は、単一プロモーターの制御下で２つの別個の天然タンパク質の発現を可能にする２Ａ自己切断ペプチド配列によって接続される［Ｍ．Ｄ．Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２（Ｐｔ １１）：２７２７－２７３２］。ＲＳＶ－Ｇ（Ｂ）およびＲＳＶ－Ｆ Ａ ｌｏｎｇ ＢＮ のコード配列を切断して膜貫通ドメインを除去し、発現されたタンパク質を分泌することができるようにした。挿入した全ての遺伝子は、最適なコドン使用頻度を用いてＧｅｎｅａｒｔにより合成され、組換えプラスミドのクローニングに用いられた。ＲＳＶ－Ｎ－Ａ２およびＲＳＶ－Ｍ２－Ａ２のタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ配列Ｐ０３４１８．１およびＰ０４５４５．１に対してそれぞれ１００％の同一性を示す。切断型ＲＳＶ－Ｇ（Ｂ）のタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ配列Ｐ２０８９６．１に対して１００％の同一性を示す。切断型ＲＳＶ－Ｆ Ａ ｌｏｎｇ ＢＮのコード配列は、Ｒ．Ｐ．Ｄｕ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ Ｙ）１２（８）：８１３－８１８に記載されるように、ＲＳＶ－Ｆタンパク質の最初の５２６個のアミノ酸を含有するように設計した。

【0148】

ＭＶＡ－ｍＢＮ２１０ＢΔＭ２のＭ２（Ａ２）中の欠失変異体：
ＭＶＡ－ｍＢＮ２１０ＢΔＭ２は、Ｍ２（Ａ２）遺伝子の１２番目のコドンに欠失変異体を含むため、機能的Ｍ２を発現することができない。この欠失は、２つのアミノ酸スレオニンおよびアラニンの、Ｍ２（Ａ２）の最初の１１個のアミノ酸への付加、続いて転写の停止（ＵＧＡ停止コドン）を引き起こす。

【0149】

実施例２：ＲＳＶ Ｆタンパク質、ＲＳＶ Ｇタンパク質、ＲＳＶ Ｎタンパク質、およびＲＳＶ Ｍ２タンパク質を発現する組換えＭＶＡワクチンの免疫原性および有効性
ワクチン候補ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂは、ＲＳＶの糖タンパク質（Ｇ）および融合（Ｆ）タンパク質をコードし、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１ＢDＭ２およびＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂは、全長ＦおよびＧタンパク質に加えてＦおよびＧの切断型、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、ならびにＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂの場合はＲＳＶのマトリックスタンパク質（Ｍ２）も発現する（図１を参照）。この実験の目的は、皮下（ｓｃ）または鼻腔内（ｉｎ）投与経路を介した２回または３回の免疫化後に、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂと比較してＭＶＡ－ｍＢＮ２０１ＢΔＭ２およびＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂの免疫原性および保護効果を分析することであった。

【0150】

ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＲＳＶ（Ａ２）曝露モデルを使用して、これらの構築物の有効性を試験した。ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９ＢまたはＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂを用いた２回の免疫化は、皮下に適用された時は、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）によって判断されるような部分的な保護を提供し、鼻腔内経路によって適用された時は、ほぼ完全な保護を提供した。ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂによって提供された保護は、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂによって提供された保護よりも良好であった。２つの構築物によって誘導された液性免疫応答に差は認められなかったが、Ｔ細胞応答には大きな差が観察された。ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂが良好なＲＳＶ Ｆ特異的細胞応答を誘導したのに対し、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂでは、強いＭ２特異的Ｔ細胞応答、およびＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂと比較してより顕著なＧ特異的応答が観察された。皮下および鼻腔内免疫化後に誘導されたＩｇＧおよびＴ細胞応答は類似しており、鼻腔内免疫化によって得られたほぼ完全な無菌免疫は、粘膜感染部位におけるＲＳＶ特異的ＩｇＡの誘導および分泌と相関している可能性が高い。ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１ＢDＭ２の場合、Ｍ２特異的Ｔ細胞応答の欠如は、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂと比較して低い保護と相関しており、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂと同様の保護をもたらした。

【0151】

試験デザイン
１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ（群３、４、および５）、１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０ ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ（群６、７、および８）、または１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０ ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１ＢΔＭ２（群９）で、マウスを皮下（ｓｃ）または鼻腔内（ｉｎ）処理した。表１に従って、２回（群３、４、６、７、および９）または３回（群５および８）のいずれかでマウスを処理した。表７に従って、２つの対照群をＴＢＳで（ｓｃ）（群１）、またはＲＳＶで（ｉｎ）（群２）２回処理した。免疫化または曝露の前日および屠殺日に、血液を採取した。酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により、ＲＳＶ特異的ＩｇＧの力価を測定した。４８日目に、マウスの半数を屠殺した。それらの脾臓を摘出し、免疫吸着スポット法（ＥＬＩＳＰＯＴ）によるＲＳＶ特異的Ｔ細胞応答の分析のために調製した。４９日目に、残りのマウスを１０^６ ｐｆｕのＲＳＶ Ａ２に曝露した（ｉｎ）。曝露日から開始して、外観および体重を毎日監視した。曝露後４日目に、高用量のケタミン－キシラジンの注射によりマウスを屠殺し、最終採血を行った。肺洗浄後、肺を摘出し、プラークアッセイおよびＲＴ－ｑＰＣＲによりＲＳＶ負荷を分析した。

【0152】

【表1】

【0153】

試験スケジュール．生存段階のスケジュールを表２に要約する。

【0154】

【表2】

【0155】

材料および方法
実験動物．Ｊａｎｖｉｅｒ（Ｒｏｕｔｅ ｄｅｓ Ｃｈeｎｅｓ Ｓｅｃｓ、Ｆ－５３９４０ Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ－Ｓａｉｎｔ－Ｉｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から４８匹の７週齢のメスＢＡＬＢ／ｃＪ Ｒｊ（Ｈ－２ｄ）マウスを入手した。全てのマウスは、特定の病原体を有していなかった。

【0156】

飼育．試験は、Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃ－Ｍａｒｔｉｎｓｒｅｉｄにある動物施設の１１７号室で行われた。このユニットに、温度２０～２４℃および相対湿度４０％～７０％で濾過吸気を提供した。部屋は、１４時間の明期および１０時間の暗期のサイクルで人工的に照明した。試験馴化期間は、１５日であった。床面積５３０ｃｍ²の透明なＳｅａｌＳａｆｅ（商標）ケージ（Ｈ Ｔｅｍｐ［ポリスルホン］ケージＴｙｐｅ ＩＩ Ｌ（欧州標準））に動物を収容した。Ｈ－Ｔｅｍｐ ＳｅａｌＳａｆｅ（商標）蓋でケージを覆った。ケージごとに別個にＨＥＰＡ濾過空気を提供するＳＬＩＭＬｉｎｅ（商標）循環ユニットを装備したＴＥＣＮＩＰＬＡＳＴ－ＩＶＣ ＳｅａｌＳａｆｅ（商標）システム内にケージを設置した。週に１回、動物の寝床を交換した。

【0157】

食餌および水．マウスには、照射した維持食餌（ＳＳＮＩＦＦ Ｒ／Ｍ－Ｈ（照射済み）Ｖ１５３４－７２７）および水（１２１℃で２０分間加圧滅菌済み）を自由に摂取させた。

【0158】

処理前の手順：動物の識別．各ケージ内の動物を個別に識別するために、標準的手順に従って耳パンチを行った。

【0159】

組み入れ／除外試験．標準的手順に従って組み入れ／除外試験を行った。

【0160】

事前採血としての血液試料採取．標準的手順に従った顔面静脈穿刺により、約１５０μｌの血液試料を採取した。標準的手順に従ってさらに処理するために、血液試料を実験室に移した。

【0161】

処理手順：試験物１～３および参照物の調製および投与試験物および参照物の調製および投与は、クラスＩＩ微生物学的安全キャビネット（ＨＥＲＡｓａｆｅ（登録商標）／クラスＩＩ型Ｈ、Ｋｅｎｄｒｏ）内で標準的手順に従って行われた。端的に述べると、ｓｃ投与の場合、組換えＭＶＡをＴＢＳに希釈し、２×１０^８ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの濃度の作業溶液を得た。標準的手順に従って、５００μｌ中１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０をｓｃ注射した。ｉｎ投与の場合、組換えＭＶＡをＴＢＳに希釈し、２×１０^９ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの濃度の作業溶液を得た。標準的手順に従って、５０μｌの希釈ウイルスを麻酔（キシラジン／ケタミン）下のマウスの片方の鼻孔内に投与した。標準的手順に従って、５００μｌのＴＢＳをｓｃ投与した。

【0162】

試験物４／曝露ウイルスの調製および投与．ＲＳＶ原液バイアルを解凍し、ウイルスの不安定性のためにできるだけ迅速に使用した（氷上で最長１５分）。ウイルスは、常に氷上に維持し、標準的手順に従って鼻腔内経路により麻酔下（キシラジン／ケタミン）のマウスを１００μｌのニートウイルス溶液に曝露するために直ちに使用した。

【0163】

処理後の手順：
体重．体重標準的手順に従って、曝露日から屠殺するまで、毎日体重を監視した。

【0164】

血液試料採取．標準的手順に従って、眼球後または顔面静脈穿刺により血液試料（約１５０μｌ）を採取した（詳細については表１および２を参照のこと）。標準的手順に従ってさらに処理するために、血液試料を実験室に移した。

【0165】

安楽死．４８日目に、頸椎脱臼によりマウスの半数の屠殺を行った。５３日目に、腹腔内注射により２倍用量のケタミン－キシラジンを残りのマウスに投与し、腹腔内の大動脈を切断することにより安楽死を行った。

【0166】

脾臓摘出．脾臓を無菌的に摘出した。標準的手順に従って、培地を充填した試験管にそれらを入れた。これらの試験管は、標準的手順に従って動物施設に搬入され、次いで搬出された。

【0167】

肺洗浄および肺摘出．肺に１ｍｌのＰＢＳを４回流すことにより、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液を採取した。次いで、肺を摘出し、後のプラークアッセイおよびＲＮＡ抽出のために、２等分して液体窒素中で瞬間凍結した。

【0168】

分析：血液試料の処理および血清の保存．実験室に移した後、標準的手順に従って血液試料を処理して血清にした。調製後、分析のために必要となるまで、血清を－２０℃（±５℃）で保存した。

【0169】

血清試料からのＲＳＶ特異的抗体力価の分析．改良されたＥＬＩＳＡキット（Ｓｅｒｉｏｎ ＥＬＩＳＡ ｃｌａｓｓｉｃ、カタログ番号ＥＳＲ１１３Ｇ）を使用して、全ての血清試料からＲＳＶ特異的ＩｇＧの総ＥＬＩＳＡ力価を決定した：キットとともに供給されるアルカリホスファターゼコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体の代わりに、アルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｅｒｏｔｅｃカタログ番号１０３００４）を二次抗体として使用した。

【0170】

改良されたＥＬＩＳＡキットを使用して、全ての血清試料およびＢＡＬ液からＲＳＶ－Ｆ／Ｇ特異的ＩｇＧのＥＬＩＳＡ力価を決定した（ＩＢＬ－Ｈａｍｂｕｒｇ 参照番号ＲＥ５６８８１）。キットとともに供給されるＰＯＤコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体の代わりに、ＨＲＰコンジュゲートヒツジ抗マウスＩｇＧ（参照番号ＢＮ－６８７－９５／９６、Ｓｅｒｏｔｅｃカタログ番号ＡＡＣ１０Ｐ）を二次抗体として使用した。

【0171】

改良されたＥＬＩＳＡキット（ＩＢＬ－Ｈａｍｂｕｒｇ参照番号ＲＥ５６８８１の試薬およびＲＳＶ（Ｆタンパク質）ＩｇＧマイクロタイターストリップ、参照番号ＲＥ５６６９２）を使用して、群４および７以外の４８日目の血清試料からＲＳＶ－Ｆ特異的ＩｇＧのＥＬＩＳＡ力価を決定した。キット内に提供されるＰＯＤコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体の代わりに、ＨＲＰコンジュゲートヒツジ抗マウスＩｇＧ（参照番号ＢＮ－６８７－９５／９６、Ｓｅｒｏｔｅｃカタログ番号ＡＡＣ１０Ｐ）を二次抗体として使用した。

【0172】

改良されたＥＬＩＳＡキット（ＩＢＬ－Ｈａｍｂｕｒｇ Ｒｅｆ．ＲＥ５６８８１）を使用して、それぞれ、４８日目および５３日目の試料から、血清およびＢＡＬ液中のＲＳＶ特異的ＩｇＡのＥＬＩＳＡ力価を決定した：キット内に提供されるＰＯＤコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体の代わりに、ＨＲＰコンジュゲートヒツジ抗マウスＩｇＡ（参照番号ＢＮ－６８７－９５／９６、Ｓｅｒｏｔｅｃカタログ番号ＳＴＡＲ１３７Ｐ）を使用した。

【0173】

脾細胞からのＲＳＶ特異的細胞性免疫応答の分析．最後の投与から２週間後、他の箇所に記載するように、特異的ペプチドで脾細胞を再刺激し（例えば、Ｓ．Ｍ．Ｖａｒｇａ ｅｔ ａｌ．（２０００）；Ｓ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）；Ｓ．Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００２）；ａｎｄ Ａ．Ｂ．Ｋｕｌｋａｒｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７（７）：４０８６－４０９２（１９９３）を参照）、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより脾細胞からのＩＦＮγ放出を検出することにより、ＲＳＶ Ｆ－、ＲＳＶ Ｇ－、およびＲＳＶ Ｍ２特異的細胞応答を決定した。

【0174】

ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法．Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ－Ｇａｍｍａ－Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５１０８３）をＥＬＩＳＰＯＴアッセイに使用した。アッセイは、製造者の指示に従って行われた。端的に述べると、脾細胞単離の前日に、プレートを捕捉抗体でコーティングした。単離後、細胞をＥＬＩＳＰＯＴプレートに移し、異なるペプチド（表３を参照）で２０時間３７℃で刺激した。検出抗体を使用してＩＦＮγの産生を検出した。製造者の指示に従ってＢＤ（商標） ＥＬＩＳＰＯＴ ＡＥＣ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｅｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５１９５１）を使用して、プレートを展開した。

【0175】

ＥＬＩＳＰＯＴによる刺激計画．すべての条件を２通り試験した。ＲＳＶ－１、ＲＳＶ－２、ＲＳＶ－３、ＲＳＶ－４、およびＲＳＶ－５ペプチド（表３を参照）を最終濃度５μｇ／ｍｌ（１μｇ／ウェル）で使用して、ウェル当たり５×１０^５および２．５×１０^５個の脾細胞を刺激した。ＭＶＡ（免疫化対照）を感染効率（ＭＯＩ）１０で使用してウェル当たり５×１０^５および２．５×１０^５個の脾細胞を刺激し、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ［陽性対照］）を最終濃度０．５μｇ／ｍｌで使用して２．５×１０^５個の脾細胞を刺激した。陰性対照として、５×１０^５個の脾細胞を培地のみ（Ｇｌｕｔａｍａｘ、ペニシリン、ストレプトマイシン、１０％ウシ胎仔血清、および１０^５ Ｍ s－メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ－１６４０）で培養した。

【0176】

【表3】

【0177】

ＢＡＬ液および肺の分析．染色の問題のために、ＢＡＬの細胞の特徴付けは不可能であった。ＲＳＶプラークアッセイおよびＲＴ－ｑＰＣＲにより細胞試料中のＲＳＶ負荷を決定した。

【0178】

ＲＳＶプラークアッセイ．Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓを使用して、瞬間凍結した肺の各反片を１ｍｌの冷培地中でホモジナイズした（７％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地）。短期間の遠心分離後、試験管２本分の各上清を、４８ウェル平底プレート中で増殖させたＶｅｒｏ細胞単層上に２倍連続希釈で滴定した。６日後、単層を洗浄し、１％ホルムアルデヒドで固定した。２４時間後、０．０４％ Ｎｅｕｔｒａｌ Ｒｅｄで単層を染色し、プラークを数えた。

【0179】

ＲＳＶのＲＴ－ｑＰＣＲホモジナイズした１００μｌの肺組織を直ちに取り出し、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（カタログ番号７４１０４）を使用してＲＮＡを単離した。Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（カタログ番号４３８７４０６）を使用して逆転写反応を行った。Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（カタログ番号４３５２０４２）と、３つのプライマー：（１）プライマー１（５’－ＧＡＡ ＣＴＣ ＡＧＴ ＧＴＡ ＧＧＴ ＡＧＡ ＡＴＧ ＴＴＴ ＧＣＡ－３’；配列番号３６）；（２）プライマー２（５’－ＴＴＣ ＡＧＣ ＴＡＴ ＣＡＴ ＴＴＴ ＣＴＣ ＴＧＣ ＣＡＡ Ｔ－３’；配列番号３７）；および（３）プローブ６（５’－ＴＴＴ ＧＡＡ ＣＣＴ ＧＴＣ ＴＧＡ ＡＣＡ ＴＴＣ ＣＣＧ ＧＴＴ－３’；（配列番号３８）の混合物とを使用して、サーマルサイクラー内で以下のパラメータを用いて、ＲＳＶ Ｌ遺伝子に特異的なＰＣＲを行った：（１）５０℃で２分間；（２）９５℃で１０分間；（３）（９５℃で１５秒、６０℃で１分）を４５サイクル。コピー数は、ＲＳＶ Ｌ遺伝子の断片を含有するｐＭＩＳＣ２０２プラスミドベクターの標準曲線から決定した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号４３５１３１５）のＶＩＣ／ＭＧＢ標識プローブを使用したマウスβアクチンに対する同様の反応を、入力ｃＤＮＡの内部対照として用いた。

【0180】

試験の文書化．生存段階の個々のステップの間に全ての情報を収集するために、生存段階のフロー図を用意した。さらに、マウスまたはケージに特有な情報を、対応するケージカードに記録した。ケージカードは、試験の原データとは見なされないが、Ｕｐｐｅｒ Ｂａｖａｒｉａの政府からの要求であった。

【0181】

分析段階の個々のステップの間に全ての情報を収集するために、分析段階のフロー図を用意した。アッセイは、アッセイ特有の試験記録またはＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅ Ｂｏｏｋｓに文書化した；相互参照は、分析段階のフロー図中に文書化した。原データを含む全てのアッセイ文書は、標準的手順に従って見直された。さらに、標準的手順に従って血清試料のための試料追跡シートを用意した。

【0182】

データ処理．標準的手順によるさらなる分析のために原データをＥｘｃｅｌファイルに転送した。

【0183】

ＥＬＩＳＡ．Ｅｘｃｅｌを使用して、ＯＤの平均値および平均の標準誤差を算出した。

【0184】

ＥＬＩＳＰＯＴ．製造者の指示にしたがって、ＣＴＬリーダーを用いてＥＬＩＳＰＯＴプレートを読み取った。ウェルごとにスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数を決定し、さらなる評価のためにＥｘｃｅｌファイルに転送した。ウェル当たり５×１０^５および２．５×１０^５個の細胞を用いたインキュベーションから、ウェルごとに１×１０^６個の脾細胞当たりのスポットの数を算出した。陰性対照の平均を算出し、マウス１匹当たりの平均値を算出する前に各個々の値から差し引いて、マウス１匹当たりの刺激指数（ＳＩ）値を得た（ＩＦＮをγ放出する脾細胞のペプチド特異的な周期）。

【0185】

ペプチド刺激の場合、数えきれないほど多くのスポットがあった場合、またはＲＳＶで免疫した動物の場合を除いて、５×１０^５および２．５×１０^５個の細胞を含むウェルからＳＩを得た。これらの場合、２．５×１０^５の濃度のみを用いた。ＭＶＡ－ＢＮ刺激の場合、数えきれないほど多くのスポットがあった場合を除いて、５×１０^５個を含むウェルからＳＩを得た。その場合、２．５×１０^５の濃度のみを用いた。個々の動物についてＳＩを決定した後、ＳＩの平均値（１×１０^６個の脾細胞当たりのＳＦＣ）および平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を群ごとに算出した。

【0186】

体重変化．ＲＳＶ曝露前の個々の体重値（グラム表示）を基準値として採用した。これらの基準値を用いて、曝露後の各監視時点での個々の動物の体重変化（％表示）および群の平均体重変化をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを使用して算出した。

【0187】

ＲＳＶプラークアッセイ．計数可能なウイルス希釈液が最も多い３つのウェル内のプラークの数を数えた。希釈因子によって調整されたプラークの平均数に、次いで１０を乗じて溶液の力価をｐｆｕ／ｍｌで得、最終的に２を乗じて肺当たりの力価を得た。

【0188】

ＲＳＶのＲＴ－ｑＰＣＲ．Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＡＢＩ ７５００（カタログ番号４３５１１０７）を使用してリアルタイムでＰＣＲ増幅を測定し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから供給されたＳｙｓｔｅｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して分析した。全ての値は、Ｌ遺伝子の標準値と比較し、試料ごとにマウスβアクチンに正規化した。

【0189】

結果
液性免疫応答の分析：血清試料からのＲＳＶ特異的ＩｇＧ抗体応答の分析．最初に、組換えＲＳＶ ＦおよびＧタンパク質のみでコーティングしたプレートを使用するＩＢＬ－Ｈａｍｂｕｒｇキットに基づくＥＬＩＳＡにより、血清を分析した（図２および図３）。図２に示すように、単回免疫化後、免疫化に用いた経路（ｓｃまたはｉｎ）に関係なく、３つ全ての構築物（ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１ＢDＭ２、およびＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ）で同様のＲＳＶ特異的ＩｇＧ応答（０．８７０～１．３４７の範囲のＯＤ）が観察された。２回目の免疫化が、抗体応答に２．０倍から３．５倍近くの増加をもたらしたのに対し（２．６２７～３．４０７の範囲のＯＤ）、３回目のｓｃ注射は、Ｂ細胞応答にわずかな影響を及ぼしたに過ぎず、２回目の免疫化後のＯＤと比較して約０．５００ＯＤ単位の増加をもたらした。組換えＲＳＶ Ｆタンパク質のみでコーティングしたプレートを使用するＩＢＬ Ｈａｍｂｕｒｇキットに基づくＥＬＩＳＡでも同様の結果が得られた（図４）。

【0190】

血清の連続希釈（１／１００、１／２００、および１／４００）後、ＲＳＶ ＦおよびＲＳＶ Ｇ特異的ＥＬＩＳＡの結果は、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１ＢΔＭ２およびＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂによる切断ＲＳＶ Ｆタンパク質および切断ＲＳＶ Ｇタンパク質のさらなる発現にもかかわらず、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１ＢΔＭ２、およびＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂは、同様のＲＳＶ Ｆおよび ＲＳＶ Ｇ特異的ＩｇＧ応答を誘導したことを示した（図３）。構築物を用いた２回のｓｃ免疫化後、Ｂ細胞応答は、ＲＳＶ単独（陽性対照）による免疫化と比較してなおもより低かった。ＲＳＶの２回のｉｎ適用によって誘導される抗体応答のレベルに達するには、ＭＶＡ－ｍＢＮ構築物を用いた３回目のｓｃ免疫化が必要であった。対照的に、ＩＢＬ Ｈａｍｂｕｒｇキットに基づくＥＬＩＳＡにより分析した場合、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９ＢおよびＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂを用いた２回のｉｎ免疫化は、ＲＳＶ単独の２回の免疫化、またはＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１ＢΔＭ２、および ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂを用いた３回のｓｃ免疫化と同様のＢ細胞応答を誘導した（図３）。

【0191】

ＲＳＶ溶解物でコーティングしたプレートを使用するＳｅｒｉｏｎキットに基づくＥＬＩＳＡにより再び血清を分析した場合、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１ＢΔＭ２、およびＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂの間に差は認められなかった。２回目および３回目の免疫化の間、またはｓｃおよびｉｎ投与経路の間にも差は観察されなかった。また、応答は全て、ＲＳＶの２回のｉｎ適用によって誘導された抗体応答よりも低かった（図５）。

【0192】

ＲＳＶ特異的ＩｇＡ抗体応答の分析．曝露後４日目（５３日目）に、ＢＡＬ液中のＲＳＶ ＦおよびＲＳＶ Ｇ特異的ＩｇＡを（ＩＢＬ Ｈａｍｂｕｒｇキットに基づいて）測定した。加えて、ＥＬＩＳＡによるＲＳＶ ＦおよびＲＳＶ Ｇ特異的ＩｇＧについてもＢＡＬおよび血清を分析した。その結果を、曝露（４８日目）の直前に血清中で得られた結果と比較して図６に示す。

【0193】

予想されたように、ＩｇＡ応答は、ＲＳＶ、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、およびＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂのｉｎ適用後のみに検出された。ＩｇＧは、ＢＡＬ中にも検出することができたが、ＩｇＡは、ｉｎ適用後により高いレベルで検出された。適用経路に関係なく、ＩｇＡの血清レベルは、ＩｇＧレベルよりもはるかに低かった。

【0194】

ＲＳＶ特異的細胞性免疫応答の分析．最後の免疫化の２週間後、ＥＬＩＳＰＯＴにより脾臓のＴ細胞応答を分析した（図７）。ｉｎまたはｓｃ経路により投与されたＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂは、強いＲＳＶ－Ｆ特異的Ｔ細胞応答を誘導した。この免疫応答は、主に、ＲＳＶ－Ｍ２の非存在下で免疫優性であるＲＳＶ－Ｆ特異的ペプチドＲＳＶ－２に対するものであった。応答は、２回目のｓｃ免疫化後、１０^６個の脾細胞当たり約２０００スポットであり、３回目のｓｃ注射または２回目の鼻腔内適用後は、約４０００スポットであった。ＲＳＶの鼻腔内適用に対する応答と同様に、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂによる免疫化後にペプチドＲＳＶ－４に対する低いＧ特異的応答が検出され（１０^６個の脾細胞当たり約５００スポット）、予想されたように、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂは、Ｍ２特異的Ｔ細胞を誘導しなかった。Ｍ２ペプチドは、マウスにおけるＲＳＶの免疫優性ペプチドである。結果的に、ＲＳＶによる鼻腔内免疫化は、１０^６個の脾細胞当たり約１０００スポットを超える良好なＭ２特異的Ｔ細胞応答を誘導し、Ｆ特異的Ｔ細胞応答はほぼ全く誘導しなかった。

【0195】

ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂと同様に、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂは強いＴ細胞応答を誘導したが、それはＭ２が優勢であった（投与回数または投与経路に関係なく、１０^６個の脾細胞当たり約４０００スポット超）。ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂによって誘導されたＧ特異的応答でさえ、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９ＢまたはＲＳＶによって誘導されたＧ特異的応答より少なくとも３倍高かった。ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂとは対照的に、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂによって誘導されたＦ特異的応答は、ＲＳＶ－２ペプチドで１０^６個の脾細胞当たり６００スポット未満とはるかに低かった。

【0196】

ＲＳＶ Ａ２株によるＲＳＶ曝露．最後の免疫化の２週間後、マウスを１０^６ ｐｆｕのＲＳＶ（Ａ２）に鼻腔内曝露した。体重を毎日監視した。曝露後４日目に、マウスを屠殺した。１ｍｌのＰＢＳで肺を洗浄した後、肺を摘出し、上述のように実施したプラークアッセイおよびＲＴ－ｑＰＣＲにより肺内のＲＳＶ負荷を決定した。

【0197】

体重変化．おそらくは麻酔のためまたはｉｎ曝露自体のために、曝露後１日目に、全てのマウスに体重減少が見られた（図８）。ＴＢＳで処理したマウスは、ＲＳＶ曝露後４日目に著しく体重が減少し始めた。対照的に、３回目にＲＳＶを鼻腔内投与したマウスは、体重減少を示さなかった。曝露後４日目に、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ、またはＭＶＡ－ｍＢＮ２０１ＢDＭ２でｓｃ免疫した全てのマウスは、体重が約２０％減少した。そのような体重減少については、以前にＯｌｓｚｅｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．によって記載されている（Ｖａｃｃｉｎｅ ２３：２１５（２００４））。しかしながら、我々のＲＴ－ｑＰＣＲの結果（図１０）は、それが、一次ＲＳＶ感染の通常のクリアランスと比較して、ワクチンで予備刺激されたＣＴＬ応答によるより良好な保護および肺からのより早期のＲＳＶ排除と相関することを示している。ｉｎ適用した場合、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂで免疫したマウスは、曝露後２日目にｓｃ免疫化マウスと同様の体重減少を示したが、ｓｃ経路と比較して肺内のＲＳＶ負荷が低いため、曝露後４日目には回復した（図１０）。ＲＳＶで免疫した群と同様に、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂでｉｎ免疫したマウスも体重減少を示さなかった。

【0198】

プラークアッセイによって測定されたＲＳＶ負荷．曝露後４日目に、非免疫マウスに平均して肺当たり５７６７１ｐｆｕが検出された（図９）。ＲＳＶで免疫した対照群と同様に、２回のｓｃまたはｉｎ適用後、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ、またはＭＶＡ－ｍＢＮ２０１ＢΔＭ２で免疫した動物の肺にＲＳＶ Ａ２プラークは検出されなかった。

【0199】

定量的リアルタイムＰＣＲによって測定されたＲＳＶ負荷．ＲＴ－ｑＰＣＲによっても肺内のＲＳＶ負荷を分析した（図１０）。ワクチン接種したいずれのマウスにも、プラークアッセイによってＲＳＶは検出されなかったが、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂで３回免疫したマウスにおいてＲＳＶゲノムがなおも検出可能であった。ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂによる３回の免疫化後、ＲＳＶ負荷は、ＴＢＳ対照群と比較して３８倍低かった。ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂによる３回の免疫化後、ＲＳＶゲノムも検出可能であったが、負荷は、ＴＢＳ対照群と比較して１５８倍低かった。２回免疫したマウスと３回免疫したマウスの間に大きな差は認められなかった。興味深いことに、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂで観察されたＲＳＶ負荷の減少は、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂに相当するＭ２の非存在下でのＭＶＡ－ｍＢＮ２０１ＢΔＭ２のワクチン接種後には観察されなかった。

【0200】

ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂによるｉｎ免疫化後、ＲＳＶで処理した群で得られたものに匹敵するほぼ完全な保護が観察されたが、５匹のマウスのうち１匹において、Ｌ遺伝子の数個のコピーがなおも観察可能であった。ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂによる鼻腔内免疫化も、ＲＳＶ負荷の強い減少を誘導したが、４匹のマウスのうちの３匹になおもＬ遺伝子が検出された。

【0201】

考察および結論
ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂは、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ構築物にも含まれる全長ＲＳＶ ＦおよびＧタンパク質に加えて、ＲＳＶ ＦおよびＧタンパク質の切断型を発現するが、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂは、同様の規模の液性免疫応答を誘導した。ＲＳＶ ＦおよびＧのＥＬＩＳＡと比較してＲＳＶ ＦのみのＥＬＩＳＡにおいて測定された同様に良好な応答によって判断されるように、両方の構築物が、主にＲＳＶ Ｆタンパク質に対する抗体応答を誘導した。２回のｉｎ適用後の抗体レベルは、２回のｓｃ適用後よりも高かった。２回のｉｎ適用によって誘導される抗体応答レベルに達するには、３回目のｓｃ適用が必要であった。対照的に、ｓｃ経路対ｉｎ経路、または２回対３回のｓｃ適用を用いて誘導したＴ細胞応答に大きな差は認められなかった。しかしながら、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂが良好なＲＳＶ Ｆ特異的細胞応答を誘導したのに対し、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂでは強いＭ２特異的Ｔ細胞応答が観察された。ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂによって誘導されたＲＳＶ Ｇ特異的応答も、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂと比較してより顕著であった。ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂによって誘導されたＴ細胞応答のパターンは、ＲＳＶ免疫化によって誘導されたＴ細胞応答に類似していたが、はるかにより高かった。

【0202】

投与経路または投与回数に関係なく、両方の構築物がＲＳＶ（Ａ２）による曝露からマウスを保護し、複製ウイルスは肺から回収できなかった。しかしながら、以前に観察されたように、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９ＢまたはＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂによるｓｃ免疫化は、無菌免疫（すなわち、標的とする感染性因子が体内から排除された後でも続く免疫）をもたらさなかった。ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９ＢまたはＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂのｓｃ適用により免疫したマウスの肺内ゲノムＲＳＶ負荷（ウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）遺伝子のレベルによって測定される）は、有意に減少したものの、定量的ＲＴ－ＰＣＲによってなおも検出可能であり、３回目のｓｃ免疫化は、そのＲＳＶ特異的ＩｇＧレベルの増加にもかかわらず、ウイルス負荷に有益な影響を与えなかった。ＲＳＶ Ｌタンパク質発現の低下は、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂによるワクチン接種後にＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂと比較してやや顕著であったが、ＲＳＶゲノム負荷は、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂと同様にＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂをワクチン接種した動物よりも、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１ＢΔＭ２をワクチン接種した動物においてより高かったため、それは、Ｍ２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の増加に起因していたのかもしれない。

【0203】

ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９ＢまたはＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂの２回のｉｎ適用後、もう少しで無菌免疫が得られそうであった。この観察は、粘膜感染部位におけるＲＳＶ特異的ＩｇＡの誘導および分泌と相関していた。

【0204】

実施例３：ＦＩ－ＲＳＶと比較した、ＲＳＶ Ｆタンパク質、ＲＳＶ Ｇタンパク質、ＲＳＶ Ｎタンパク質、およびＲＳＶ Ｍ２タンパク質を発現する組換えＭＶＡワクチンの安全性
ワクチン候補ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂは、ＲＳＶの糖タンパク質（Ｇ）および融合（Ｆ）タンパク質をコードし、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂは、ＲＳＶの全長タンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、およびマトリックスタンパク質（Ｍ２）に加えてＦおよびＧの切断型を発現する（図１を参照）。これらの実験の目的は、皮下（ｓｃ）または鼻腔内（ｉｎ）投与経路による２回の免疫化後に、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９ＢおよびＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂの安全性をＦＩ－ＲＳＶと比較して分析することであった。

【0205】

ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＲＳＶ（Ａ２）曝露モデルを使用して、これらの構築物の安全性を試験した。ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９ＢまたはＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂを用いた２回の免疫化は、ＲＳＶ（Ａ２）への曝露後に、ＦＩ－ＲＳＶと比較してＢＡＬにおけるＩＬ４およびＩＬ５の分泌増加を誘導しなかった。

【0206】

試験デザイン
表ｘに従って、１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ（群３および４）、１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０ ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ（群５および６）で、３週間開けて２回マウスを皮下（ｓｃ）または鼻腔内（ｉｎ）処理した。表ｘに従って、３つの対照群を２回、ＴＢＳで（ｓｃ）処理するか（群１）、またはＲＳＶでｉｎ処理するか（群２）、または３０μｇのＦＩ－ＲＳＶでｉｍ処理（群７）した。３５日目に、マウスを１０^６ ｐｆｕのＲＳＶ Ａ２に曝露（ｉｎ）した。曝露後４日目に、高用量のケタミン－キシラジンの注射によりマウスを屠殺し、最終採血を行った。肺洗浄後、ＥＬＩＳＡによりＢＡＬ中のＩＬ４およびＩＬ５レベルを分析した。

【0207】

【表4】

【0208】

試験スケジュール．生存段階のスケジュールを表ｙに要約する。

【0209】

【表5】

【0210】

材料および方法
実験動物．Ｊａｎｖｉｅｒ（Ｒｏｕｔｅ ｄｅｓ Ｃｈeｎｅｓ Ｓｅｃｓ、Ｆ－５３９４０ Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ－Ｓａｉｎｔ－Ｉｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から７週齢のメスＢＡＬＢ／ｃＪ Ｒｊ（Ｈ－２ｄ）マウスを入手した。全てのマウスは、特定の病原体を有していなかった。

【0211】

飼育．試験は、Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃ－Ｍａｒｔｉｎｓｒｅｉｄにある動物施設の１１７号室で行われた。このユニットに、温度２０～２４℃および相対湿度４０％～７０％で濾過吸気を提供した。部屋は、１４時間の明期および１０時間の暗期のサイクルで人工的に照明した。試験馴化期間は、１５日であった。床面積５３０ｃｍ²の透明なＳｅａｌＳａｆｅ（商標）ケージ（Ｈ Ｔｅｍｐ［ポリスルホン］ケージ Ｔｙｐｅ ＩＩ Ｌ（欧州標準））に動物を収容した。Ｈ－Ｔｅｍｐ ＳｅａｌＳａｆｅ（商標）蓋でケージを覆った。ケージごとに別個にＨＥＰＡ濾過空気を提供するＳＬＩＭＬｉｎｅ（商標）循環ユニットを装備したＴＥＣＮＩＰＬＡＳＴ－ＩＶＣ ＳｅａｌＳａｆｅ（商標）システム内にケージを設置した。週に１回、動物の寝床を交換した。

【0212】

食餌および水．マウスには、照射した維持食餌（ＳＳＮＩＦＦ Ｒ／Ｍ－Ｈ（照射済み）Ｖ１５３４－７２７）および水（１２１℃で２０分間加圧滅菌済み）を自由に摂取させた。

【0213】

処理前の手順：動物の識別．各ケージ内の動物を個別に識別するために、標準的手順に従って耳パンチを行った。

【0214】

組み入れ／除外試験．標準的手順に従って組み入れ／除外試験を行った。

【0215】

事前採血のための血液試料採取．標準的手順に従った顔面静脈穿刺により、約１５０μｌの血液試料を採取した。標準的手順に従ってさらに処理するために、血液試料を実験室に移した。

【0216】

処理手順：試験物および参照物の調製および投与。試験物および参照物の調製および投与は、クラスＩＩ微生物学的安全キャビネット（ＨＥＲＡｓａｆｅ（登録商標）／クラスＩＩ型Ｈ、Ｋｅｎｄｒｏ）内で標準的手順に従って行われた。端的に述べると、ｓｃ投与の場合、組換えＭＶＡをＴＢＳに希釈し、２×１０^８ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの濃度の作業溶液を得た。標準的手順に従って、５００μｌ中１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０をｓｃ注射した。ｉｎ投与の場合、組換えＭＶＡをＴＢＳに希釈し、２×１０^９ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの濃度の作業溶液を得た。標準的手順に従って、５０μｌの希釈ウイルスを麻酔（キシラジン／ケタミン）下のマウスの片方の鼻孔内に投与した。標準的手順に従って、５００μｌのＴＢＳをｓｃ投与した。

【0217】

ＲＳＶ（Ａ２）ウイルスの調製および投与．ＲＳＶ原液バイアルを解凍し、ウイルスの不安定性のためにできるだけ迅速に使用した（氷上で最長１５分）。ウイルスは、常に氷上に維持し、標準的手順に従って鼻腔内経路により麻酔下（キシラジン／ケタミン）のマウスを１００μｌのニートウイルス溶液に曝露するために直ちに使用した。

【0218】

ＦＩ－ＲＳＶの調製および投与．４０μｌ中３０μｇのＦＩ－ＲＳＶを筋肉内注射した。

【0219】

安楽死．３５日目に、腹腔内注射により２倍用量のケタミン－キシラジンを残りのマウスに投与し、腹腔内の大動脈を切断することにより安楽死を行った。

【0220】

肺洗浄．肺に１ｍｌのＰＢＳを４回流すことにより、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液を採取した。

【0221】

分析
市販のＥＬＩＳＡキット（ｅＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ Ｃａｔ Ｎ°ＢＭＳ６１３のｍＩＬ４ ＰＬＡＴＩＮＵＭ ＥＬＩＳＡおよびｅＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ Ｃａｔ Ｎ°８８－７０５４－２２のＲＥＡＤＹ－ＳＥＴ－ＧＯ ＭＩＬ－５ ＥＬＩＳＡ）を使用して、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）上清中のＩＬ－４およびＩＬ－５のレベルを測定した。

【0222】

試験の文書化．生存段階の個々のステップの間に全ての情報を収集するために、生存段階のフロー図を用意した。さらに、マウスまたはケージに特有な情報を、対応するケージカードに記録した。ケージカードは、試験の原データとは見なされないが、Ｕｐｐｅｒ Ｂａｖａｒｉａの政府からの要求であった。

【0223】

分析段階の個々のステップの間に全ての情報を収集するために、分析段階のフロー図を用意した。アッセイは、アッセイ特有の試験記録またはＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅ Ｂｏｏｋｓに文書化した；相互参照は、分析段階のフロー図中に文書化した。原データを含む全てのアッセイ文書は、標準的手順に従って見直された。さらに、標準的手順に従って血清試料のための試料追跡シートを用意した。

【0224】

データ処理．標準的手順によるさらなる分析のために原データをＥｘｃｅｌファイルに転送した。

【0225】

ＥＬＩＳＡ．サイトカインの濃度は、それぞれのＥＬＩＳＡキットの標準曲線から決定した。

【0226】

結果
ＦＩ－ＲＳＶで観察されたようなＩＬ－４（図１１）およびＩＬ－５（図１２）産生の増加は、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９ＢまたはＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂの場合には観察されなかった。ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９ＢまたはＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂでマウスをｉｎ免疫した時、両方のサイトカインは検出レベル未満であった。

【0227】

考察および結論
Ｔｈ２応答によって評価されるように、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９ＢおよびＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂのどちらとも、ＦＩ－ＲＳＶと比較して重篤な疾患を誘導しなかった。

【0228】

実施例４：ＲＳＶ Ｆタンパク質、ＲＳＶ Ｇタンパク質、ＲＳＶ Ｎタンパク質、およびＲＳＶ Ｍ２タンパク質を発現する異なる組換えＭＶＡワクチンの免疫原性、有効性、および安全性の比較．
ワクチン候補ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂは、ＲＳＶの糖タンパク質（Ｇ）および融合（Ｆ）タンパク質をコードし、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂは、ＲＳＶの全長タンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、およびマトリックスタンパク質（Ｍ２）に加えてＦおよびＧの切断型を発現し、ＭＶＡ－ｍＢＮ２９４Ｂは、ＲＳＶの１つのＦおよび２つの２Ｇ全長タンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、およびマトリックスタンパク質（Ｍ２）を発現する（図１を参照）。ＭＶＡ－ｍＢＮ２９４Ａは、なおも１つのクローニングカセットを有するＭＶＡ－ｍＢＮ２９４Ｂのクローニングにおける中間産物である。このクローニングカセットは、導入遺伝子の発現またはトランスジェニックタンパク質の免疫原性特性のいずれにも影響しない。これらの実験の目的は、皮下（ｓｃ）投与経路による２回の免疫化後に、ＭＶＡ－ｍＢＮ２９４Ａの免疫原性、有効性、および安全性をＭＶＡ－ｍＢＮ１９９ＢおよびＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂと比較して分析することであった。

【0229】

ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＲＳＶ（Ａ２）曝露モデルを使用して、これらの構築物の免疫原性、有効性、および安全性を試験した。ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂと比較したＭＶＡ－ｍＢＮ２９４Ａ（ＭＶＡ－ｍＢＮ２９４Ｂと同等）における変化にもかかわらず、それが同様のＢ細胞およびＴ細胞応答を誘導し、同様の保護を提供したことを確認した。この実験は、ＲＳＶ膜糖タンパク質（ＦまたはＧ）の少なくとも１つの抗原決定基、およびＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質（ＮまたはＭ２）の少なくとも１つの抗原決定基を発現するいずれの構築物（ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１ＢまたはＭＶＡ－ｍＢＮ２９４Ａ）も、ＲＳＶ膜糖タンパク質の抗原決定基のみを発現する構築物（ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ）よりも良好な保護を誘導することを示している。

【0230】

試験デザイン
表６に従って、予備刺激－追加免疫スケジュール（０日目および２１日目）において、１ｘ１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡ－ｍＢＮ２９４Ａ、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、またはＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂをマウスにワクチン接種（ｓｃ）した。表６に従って、ＴＢＳまたはＲＳＶ－Ａ２で対照群を２回皮下処理した。表６に従って、ホルマリン不活化（ＦＩ）－ＲＳＶを１回または２回筋肉内（ｉｍ）注射した。

【0231】

各免疫化の前日および曝露の前日、ならびに屠殺日に、血液を採取した。３４日目に、群１～５の５匹の動物について、ＲＳＶ特異的ＩｇＧの力価およびＲＳＶ特異的中和抗体の力価を、それぞれ、ＥＬＩＳＡおよびＰＲＮＴにより決定した。

【0232】

３４日目に、致死量のケタミン－キシラジンの注射および最終採血により数匹の（表６）マウスを屠殺した。脾臓を摘出し、ＥＬＩＳＰＯＴによるＲＳＶ特異的Ｔ細胞応答の分析のために調製した。

【0233】

３５日目に、残りのマウスを（表６）を１０^６ ｐｆｕのＲＳＶ－Ａ２に曝露した。曝露後４日目に、致死量のケタミン－キシラジンの注射によりマウスを屠殺し、最終採血を行った。肺洗浄後、肺を摘出し、プラークアッセイおよびＲＴ－ｑＰＣＲによりＲＳＶ負荷を分析した。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中の細胞浸潤およびサイトカインレベルを分析した。

【0234】

【表6】

【0235】

試験スケジュール．生存段階のスケジュールを表７に要約する。

【0236】

【表7】

【0237】

材料および方法
実験動物．Ｊａｎｖｉｅｒ（Ｒｏｕｔｅ ｄｅｓ Ｃｈeｎｅｓ Ｓｅｃｓ、Ｆ－５３９４０ Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ－Ｓａｉｎｔ－Ｉｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から７週齢のメスＢＡＬＢ／ｃＪ Ｒｊ（Ｈ－２ｄ）マウスを入手した。全てのマウスは、特定の病原体を有していなかった。

【0238】

飼育．試験は、Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃ－Ｍａｒｔｉｎｓｒｅｉｄにある動物施設の１１７号室で行われた。このユニットに、温度２０～２４℃および相対湿度４０％～７０％で濾過吸気を提供した。部屋は、１４時間の明期および１０時間の暗期のサイクルで人工的に照明した。試験馴化期間は、１５日であった。床面積５３０ｃｍ²の透明なＳｅａｌＳａｆｅ（商標）ケージ（Ｈ Ｔｅｍｐ［ポリスルホン］ケージ Ｔｙｐｅ ＩＩ Ｌ（欧州標準））に動物を収容した。Ｈ－Ｔｅｍｐ ＳｅａｌＳａｆｅ（商標）蓋でケージを覆った。ケージごとに別個にＨＥＰＡ濾過空気を提供するＳＬＩＭＬｉｎｅ（商標）循環ユニットを装備したＴＥＣＮＩＰＬＡＳＴ－ＩＶＣ ＳｅａｌＳａｆｅ（商標）システム内にケージを設置した。週に１回、動物の寝床を交換した。

【0239】

食餌および水．マウスには、照射した維持食餌（ＳＳＮＩＦＦ Ｒ／Ｍ－Ｈ（照射済み）Ｖ１５３４－７２７）および水（１２１℃で２０分間加圧滅菌済み）を自由に摂取させた。

【0240】

処理前の手順：
動物の識．別各ケージ内の動物を個別に識別するために、標準的手順に従って耳パンチを行った。

【0241】

組み入れ／除外試験．標準的手順に従って組み入れ／除外試験を行った。

【0242】

事前採血のための血液試料採取．標準的手順に従った顔面静脈穿刺により、約１５０μｌの血液試料を採取した。標準的手順に従ってさらに処理するために、血液試料を実験室に移した。

【0243】

処理手順：試験物および参照物の調製および投与。試験物および参照物の調製および投与は、クラスＩＩ微生物学的安全キャビネット（ＨＥＲＡｓａｆｅ（登録商標）／クラスＩＩ型Ｈ、Ｋｅｎｄｒｏ）内で標準的手順に従って行われた。端的に述べると、ｓｃ投与の場合、組換えＭＶＡをＴＢＳに希釈し、２×１０^８ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの濃度の作業溶液を得た。標準的手順に従って、５００μｌ中１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０をｓｃ注射した。標準的手順に従って、５００μｌのＴＢＳをｓｃ投与した。

【0244】

ＲＳＶ（Ａ２）ウイルスの調製および投与．ＲＳＶ原液バイアルを解凍し、ウイルスの不安定性のためにできるだけ迅速に使用した（氷上で最長１５分）。ウイルスは、常に氷上に維持し、標準的手順に従って鼻腔内経路により麻酔下（キシラジン／ケタミン）のマウスを１００μｌのニートウイルス溶液に曝露するために直ちに使用した。

【0245】

ＦＩ－ＲＳＶの調製および投与：５０μｌのＦＩ－ＲＳＶをｉｍ適用した。

【0246】

処理後の手順：
血液試料採取．標準的手順に従って、眼球後または顔面静脈の穿刺により血液試料（約１５０μｌ）を採取した（詳細については表７を参照）。標準的手順に従ってさらに処理するために、血液試料を実験室に移した。

【0247】

安楽死．腹腔内注射により２倍用量のケタミン－キシラジンをマウスに投与し、腹腔内の大動脈を切断することにより安楽死を行った。

【0248】

脾臓摘出．脾臓を無菌的に摘出した。標準的手順に従って、培地を充填した試験管にそれらを入れた。これらの試験管は、標準的手順に従って動物施設に搬入され、次いで搬出された。

【0249】

肺洗浄および肺摘出．肺に１ｍｌのＰＢＳを４回流すことにより、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液を採取した。次いで、肺を摘出し、後のプラークアッセイおよびＲＮＡ抽出のために、２等分して液体窒素中で瞬間凍結した。

【0250】

分析：
血液試料の処理および血清の保存．実験室に移した後、標準的手順に従って血液試料を処理して血清にした。調製後、分析のために必要となるまで、血清を－２０℃（±５℃）で保存した。

【0251】

血清試料からのＲＳＶ特異的抗体力価の分析．改良されたＥＬＩＳＡキット（Ｓｅｒｉｏｎ ＥＬＩＳＡ ｃｌａｓｓｉｃ、カタログ番号ＥＳＲ１１３Ｇ）を使用して、全ての血清試料からＲＳＶ特異的ＩｇＧの総ＥＬＩＳＡ力価を決定した：キットとともに供給されるアルカリホスファターゼコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体の代わりに、アルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｅｒｏｔｅｃカタログ番号１０３００４）を二次抗体として使用した。

【0252】

血清試料からのＲＳＶ特異的中和抗体の力価の分析．端的に述べると、試験血清の２倍連続希釈液を調製し、定義された数のＲＳＶプラーク形成単位（ｐｆｕ）を血清希釈液に加えた。３６℃（±２℃）および５％ ＣＯ_２（±１％）で１８５分のインキュベーション後、Ｖｅｒｏ細胞を含む予め播種したプレートに加えた。２日後、プレートを固定し、ＲＳＶ特異的抗体の混合物で免疫染色し、プラークを数えた。

【0253】

脾細胞からのＲＳＶ特異的細胞性免疫応答の分析．最後の投与から２週間後、他の箇所に記載するように、特異的ペプチドで脾細胞を再刺激し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより脾細胞からのＩＦＮγ放出を検出することにより、ＲＳＶ ＦおよびＲＳＶ Ｍ２特異的細胞応答を決定した。

【0254】

ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法．Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ－Ｇａｍｍａ－Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５１０８３）をＥＬＩＳＰＯＴアッセイに使用した。アッセイは、製造者の指示に従って行われた。端的に述べると、脾細胞単離の前日に、プレートを捕捉抗体でコーティングした。単離後、細胞をＥＬＩＳＰＯＴプレートに移し、異なるペプチド（表３を参照）で２０時間３７℃で刺激した。検出抗体を使用してＩＦＮγの産生を検出した。製造者の指示に従ってＢＤ（商標）ＥＬＩＳＰＯＴ ＡＥＣ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｅｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５１９５１）を使用して、プレートを展開した。

【0255】

ＥＬＩＳＰＯＴによる刺激計画．すべての条件を２通り試験した。ＲＳＶ－２およびＲＳＶ－５ペプチド（表８を参照）を最終濃度５μｇ／ｍｌ（１μｇ／ウェル）で使用して、ウェル当たり５×１０^５および２．５×１０^５個の脾細胞を刺激した。ＭＶＡ（免疫化対照）を感染効率（ＭＯＩ）１０で使用してウェル当たり５×１０^５および２．５×１０^５個の脾細胞を刺激し、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ［陽性対照］）を最終濃度０．５μｇ／ｍｌで使用して２．５×１０^５個の脾細胞を刺激した。陰性対照として、５×１０^５個の脾細胞を培地のみ（Ｇｌｕｔａｍａｘ、ペニシリン、ストレプトマイシン、１０％ウシ胎仔血清、および１０^５ Ｍ s－メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ－１６４０）で培養した。

【0256】

【表8】

【0257】

ＢＡＬ液の分析：
１００μｌのＢＡＬ液をサイトスピンで遠心分離する（８００ｒｐｍ、５分）ことにより、２つのスライドを調製した。スライドを一晩乾燥させ、次いで染色した。顕微鏡によりスライドを分析して、好酸球および好中球の割合を決定した。次いで、残りのＢＡＬを遠心分離した（１２，０００ｒｐｍ、５分）。調製後、ＢＡＬ上清を分析まで－２０℃（±５℃）で保存した。市販のＥＬＩＳＡキット（ｅＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ Ｃａｔ Ｎ°ＢＭＳ６１３のｍＩＬ４ ＰＬＡＴＩＮＵＭ ＥＬＩＳＡ およびｅＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ Ｃａｔ Ｎ°８８－７０５４－２２のＲＥＡＤＹ－ＳＥＴ－ＧＯ ＭＩＬ－５ ＥＬＩＳＡ）を使用して、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）上清中のＩＬ－４およびＩＬ－５のレベルを測定した。

【0258】

肺内のＲＳＶ負荷の分析
ＲＳＶ プラークアッセイおよびＲＴ－ｑＰＣＲにより細胞試料中のＲＳＶ負荷を決定した。

【0259】

ＲＳＶプラークアッセイ．Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓを使用して、瞬間凍結した肺の各反片を１ｍｌの冷培地中でホモジナイズした（７％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地）。短期間の遠心分離後、試験管２本分の各上清を、４８ウェル平底プレート中で増殖させたＶｅｒｏ細胞単層上に２倍連続希釈で滴定した。６日後、単層を洗浄し、１％ホルムアルデヒドで固定した。２４時間後、０．０４％ Ｎｅｕｔｒａｌ Ｒｅｄで単層を染色し、プラークを数えた。

【0260】

ＲＳＶのＲＴ－ｑＰＣＲ．ホモジナイズした１００μｌの肺組織を直ちに取り出し、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（カタログ番号７４１０４）を使用してＲＮＡを単離した。Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（カタログ番号４３８７４０６）を使用して逆転写反応を行った。Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（カタログ番号４３５２０４２）と、３つのプライマー： （１）プライマー １（５’－ＧＡＡ ＣＴＣ ＡＧＴ ＧＴＡ ＧＧＴ ＡＧＡ ＡＴＧ ＴＴＴ ＧＣＡ－３’；配列番号３６）；（２）プライマー２（５’－ＴＴＣ ＡＧＣ ＴＡＴ ＣＡＴ ＴＴＴ ＣＴＣ ＴＧＣ ＣＡＡ Ｔ－３’；配列番号３７）；および（３）プローブ６（５’－ＴＴＴ ＧＡＡ ＣＣＴ ＧＴＣ ＴＧＡ ＡＣＡ ＴＴＣ ＣＣＧ ＧＴＴ－３’；（配列番号３８）の混合物を使用して、サーマルサイクラー内で以下のパラメータを用いて、ＲＳＶ Ｌ遺伝子に特異的なＰＣＲを行った：（１）５０℃で２分間；（２）９５℃で１０分間；（３）（９５℃で１５秒、６０℃で１分）を４５サイクル。コピー数は、ＲＳＶ Ｌ遺伝子の断片を含有するｐＭＩＳＣ２０２プラスミドベクターの標準曲線から決定した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号４３５１３１５）のＶＩＣ／ＭＧＢ標識プローブを使用したマウスβアクチンに対する同様の反応を、入力ｃＤＮＡの内部対照として用いた。

【0261】

試験の文書化．
生存段階の個々のステップの間に全ての情報を収集するために、生存段階のフロー図を用意した。さらに、マウスまたはケージに特有な情報を、対応するケージカードに記録した。ケージカードは、試験の原データとは見なされないが、Ｕｐｐｅｒ Ｂａｖａｒｉａの政府からの要求であった。

【0262】

分析段階の個々のステップの間に全ての情報を収集するために、分析段階のフロー図を用意した。アッセイは、アッセイ特有の試験記録またはＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅ Ｂｏｏｋｓに文書化した；相互参照は、分析段階のフロー図中に文書化した。原データを含む全てのアッセイ文書は、標準的手順に従って見直された。さらに、標準的手順に従って血清試料のための試料追跡シートを用意した。

【0263】

データ処理．標準的手順によるさらなる分析のために原データをＥｘｃｅｌファイルに転送した。

【0264】

ＥＬＩＳＡ．Ｅｘｃｅｌを使用して、ＯＤの平均値および平均の標準誤差を算出した。

【0265】

ＰＲＮＴ．プラークをマクロに移し、標準的手順に従ってＰＲＮＴ力価を算出した。

【0266】

ＥＬＩＳＰＯＴ．製造者の指示にしたがって、ＣＴＬリーダーを用いてＥＬＩＳＰＯＴプレートを読み取った。ウェルごとにスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数を決定し、さらなる評価のためにＥｘｃｅｌファイルに転送した。ウェル当たり５×１０^５および２．５×１０^５個の細胞を用いたインキュベーションから、ウェルごとに１×１０^６個の脾細胞当たりのスポットの数を算出した。陰性対照の平均を算出し、マウス１匹当たりの平均値を算出する前に各個々の値から差し引いて、マウス１匹当たりの刺激指数（ＳＩ）値を得た（ＩＦＮをγ放出する脾細胞のペプチド特異的な周期）。

【0267】

ペプチド刺激の場合、数えきれないほど多くのスポットがあった場合、またはＲＳＶで免疫した動物の場合を除いて、５×１０^５および２．５×１０^５個の細胞を含むウェルからＳＩを得た。これらの場合、２．５×１０^５の濃度のみを用いた。ＭＶＡ－ＢＮ刺激の場合、数えきれないほど多くのスポットがあった場合を除いて、５×１０^５個を含むウェルからＳＩを得た。その場合、２．５×１０^５の濃度のみを用いた。個々の動物についてＳＩを決定した後、ＳＩの平均値（１×１０^６個の脾細胞当たりのＳＦＣ）および平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を群ごとに算出した。

【0268】

ＲＳＶプラークアッセイ．計数可能なウイルス希釈液が最も多い３つのウェル内のプラークの数を数えた。希釈因子によって調整されたプラークの平均数に、次いで１０を乗じて溶液の力価をｐｆｕ／ｍｌで得、最終的に２を乗じて肺当たりの力価を得た。

【0269】

ＲＳＶのＲＴ－ｑＰＣＲ．Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＡＢＩ ７５００（カタログ番号４３５１１０７）を使用してリアルタイムでＰＣＲ増幅を測定し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから供給されたＳｙｓｔｅｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して分析した。全ての値は、Ｌ遺伝子の標準値と比較し、試料ごとにマウスβアクチンに正規化した。

【0270】

サイトカインのＥＬＩＳＡ．サイトカインの濃度は、それぞれのＥＬＩＳＡキットの標準曲線から決定した。

【0271】

結果
液性免疫応答の分析：
ＲＳＶ特異的ＩｇＧ応答（ＥＬＩＳＡ、図１３）およびＲＳＶ特異的中和抗体応答（ＰＲＮＴ、図１４）の両方について、３つの構築物（ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ、およびＭＶＡ－ｍＢＮ２９４Ａ）の間にいずれの差も観察されなかった。

【0272】

細胞性免疫応答の分析：
予想されたように、ＭＶＡ－ｍＢＮ２９４Ａは、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂと同様のＴ細胞応答パターンを有し（図１５）、Ｍ２ Ｔ細胞応答が優勢であるＦおよびＭ２の両方に特異的な応答を誘導する。対照的に、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂは、Ｆ特異的応答を誘導したのみであったが、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１ＢおよびＭＶＡ－ｍＢＮ２９４Ａよりも高いレベルであった。

【0273】

肺内のＲＳＶ負荷の分析：
ＲＳＶ Ａ２株によるＲＳＶ．曝露最後の免疫化の２週間後、マウスを１０^６ ｐｆｕのＲＳＶ（Ａ２）に鼻腔内曝露した。曝露後４日目に、マウスを屠殺した。１ｍｌのＰＢＳで肺を洗浄した後、肺を摘出し、上述のように実施したプラークアッセイおよびＲＴ－ｑＰＣＲにより肺内のＲＳＶ負荷を決定した。

【0274】

プラークアッセイによって測定されたＲＳＶ負荷．曝露後４日目に、非免疫マウスに平均して肺当たり２９８４２ｐｆｕが検出された（図１６）。ＲＳＶで免疫した対照群と同様に、２回のｓｃ適用後、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ、またはＭＶＡ－ｍＢＮ２９４Ａで免疫した動物の肺にＲＳＶ Ａ２プラークは検出されなかった。

【0275】

定量的リアルタイムＰＣＲによって測定されたＲＳＶ負荷．ＲＴ－ｑＰＣＲによっても肺内のＲＳＶ負荷を分析した（図１７）。ワクチン接種したいずれのマウスにも、プラークアッセイによってＲＳＶは検出されなかったが、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ、またはＭＶＡ－ｍＢＮ２９４Ａで２回ｓｃ免疫したマウスにおいてＲＳＶゲノムがなおも検出可能であった。ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂの場合、ＲＳＶ負荷は、ＴＢＳ対照群と比較して４５倍低かった。ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１ＢおよびＭＶＡ－ｍＢＮ２９４Ａの場合もＲＳＶゲノムが検出可能であったが、ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂと比較すると負荷が大きく減少され、ＴＢＳ対照群と比較して、それぞれ、４１６倍および２８１倍低かった。

【0276】

重篤な疾患の徴候の分析
実施例３に記載した実験に使用したＦＩ－ＲＳＶのバッチとは対照的に、この試験に使用した新しいバッチは、ＩＬ－４またはＩＬ－５の産生にはいずれの増加も示さなかった。しかしながら、我々は、このバッチを用いて、ＦＩ－ＲＳＶに関する重篤な疾患の主な特徴であるＢＡＬ液中の好酸球および好中球の浸潤を検出することができた。ＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂ、ＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂ、およびＭＶＡ－ｍＢＮ２９４Ａで重篤な疾患の徴候が検出可能であった。

【0277】

考察および結論
ＭＶＡ－ｍＢＮ２９４Ａ（ＭＶＡ－ｍＢＮ２９４Ｂと同等）とＭＶＡ－ｍＢＮ２０１Ｂとの間の差にもかかわらず、どちらも同様のＢ細胞およびＴ細胞応答を誘導し、重篤な疾患を誘発することなく同様の保護を提供する。どちらの構築物も、膜糖タンパク質（ＦおよびＧ）の抗原決定基のみを発現したＭＶＡ－ｍＢＮ１９９Ｂよりも良好な保護を誘導した。

【0278】

本発明の他の実施形態は、本明細書の検討および本明細書に開示される本発明の実践から、当業者に明らかとなるであろう。本明細書および実施例は、例示的なものに過ぎないと見なされることが意図され、本発明の真の範囲および主旨は、以下の特許請求の範囲によって示される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

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