特許 7318166 マイクロＲＮＡ２２の阻害剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-07-24

(45)【発行日】2023-08-01

(54)【発明の名称】マイクロＲＮＡ２２の阻害剤

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20230725BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230725BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230725BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230725BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230725BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230725BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20230725BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230725BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230725BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K31/7088

A61K48/00

A61P43/00 105

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2020573079

(86)(22)【出願日】2019-03-14

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-08-02

(86)【国際出願番号】 US2019022351

(87)【国際公開番号】W WO2019178411

(87)【国際公開日】2019-09-19

【審査請求日】2022-03-08

(31)【優先権主張番号】62/642,934

(32)【優先日】2018-03-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507316413

【氏名又は名称】ベス イスラエル デアコネス メディカル センター

(73)【特許権者】

【識別番号】520355378

【氏名又は名称】オールボー ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100084995

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 和詳

(72)【発明者】

【氏名】パンドルフィ、ピエル、パオロ

(72)【発明者】

【氏名】パネッラ、リッカルド

(72)【発明者】

【氏名】カウッピネン、サカリ

(72)【発明者】

【氏名】ペトリ、アンドレアス

【審査官】飯濱 翔太郎

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１０／０００４３２０（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ｃ１２Ｑ

Ａ６１Ｋ

Ａ６１Ｐ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＴＴｃａＡＣｔｇＧＣＡｇＣＴ（配列番号８）を含む配列を有する核酸を含み、ここで大文字はＬＮＡ（ロック核酸）修飾ヌクレオチドであり、小文字は非修飾ヌクレオチドである、ｍｉＲ－２２阻害性組成物。

【請求項2】

ＣＴＴｃａＡＣｔｇＧＣＡｇＣＴ（配列番号８）を含む配列を有する核酸を含み、ここで大文字はＬＮＡ（ロック核酸）修飾ヌクレオチドであり、小文字は非修飾ヌクレオチドである、ｍｉＲ－２２阻害剤と、
薬学的に許容可能な賦形剤又は担体と、
を含む、医薬組成物。

【請求項3】

ＣＴＴｃａＡＣｔｇＧＣＡｇＣＴ（配列番号８）を含む配列を有する核酸を含み、ここで大文字はＬＮＡ（ロック核酸）修飾ヌクレオチドであり、小文字は非修飾ヌクレオチドである、ベクター又はプラスミド。

【請求項4】

ＣＴＴｃａＡＣｔｇＧＣＡｇＣＴ（配列番号８）を含む配列を有する核酸を含み、ここで大文字はＬＮＡ（ロック核酸）修飾ヌクレオチドであり、小文字は非修飾ヌクレオチドである、宿主細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

優先権
本出願は２０１８年３月１４日に出願された米国特許仮出願第６２／６４２９３４号の利益と優先権を主張し、その内容全体を参照によりここに援用するものである。

【0002】

本開示の分野
本開示はマイクロＲＮＡの活性又は発現を調節する薬剤に関する。

【0003】

電子的に提出されたテキストファイルの説明
本出願と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容、すなわち、配列表のコンピュータ読み込み可能な形式のコピー（ファイル名：ＢＩＤ－００５ＰＣ２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；作成日：２０１９年３月１４日；ファイルサイズ：２９７６バイト）の全体を参照により本明細書に援用する。

【背景技術】

【0004】

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲ）は標的遺伝子の発現を調節する核酸分子である。ｍｉＲＮＡは短い（典型的には１８～２４ヌクレオチド）ことが典型的であり、標的ｍＲＮＡの配列が完全に相補的であるときにそれらの分解を促進すること、及び／又は標的ｍＲＮＡの配列がミスマッチを含んでいるときに翻訳を阻害することによって標的ｍＲＮＡの阻害因子として作用する。ｍｉＲＮＡの機能分析からこれらの低分子ノンコーディングＲＮＡが様々な生理的及び代謝的過程に寄与することが明らかになっており、それらの過程には様々な疾患又は障害に関連する遺伝子の制御が含まれている。したがって、ｍｉＲを制御する組成物と方法が必要である。

【発明の概要】

【0005】

本開示は、例えばマイクロＲＮＡの発現及び／又は活性を阻害することによるｍｉＲ－２２阻害のための新しい組成物と方法を提供する。ロック核酸（ＬＮＡ）等をはじめとする配列特異的な化学修飾オリゴヌクレオチドはこのような阻害を成立させることができる。１つの態様では、本発明はｍｉＲ－２２阻害性組成物を提供する。この組成物は、ｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号２）を含み、少なくとも１か所のロック核酸（ＬＮＡ）修飾を備える配列を有する核酸を含む。

【0006】

複数の実施形態において、前記核酸はｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号２）の７位及び８位にＬＮＡ修飾を含む。複数の実施形態において、前記核酸は約８～約１２のＬＮＡ修飾を含む。複数の実施形態において、前記核酸は４以上のＬＮＡ修飾を含む。複数の実施形態において前記核酸は４以下の連続的ＬＮＡ修飾を含む。

【0007】

複数の実施形態において、前記核酸はｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号２）、ｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号３）、ｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号４）、ｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号５）、及びｇｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号６）から選択される配列を有する核酸を含む。複数の実施形態において、前記核酸は約８～約１２のＬＮＡ修飾、例えば約８～約１０のＬＮＡ修飾を含む。複数の実施形態において前記核酸は約８、又は約９、又は約１０、又は約１１、又は約１２のＬＮＡ修飾を含む。

【0008】

複数の実施形態において前記核酸はｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号２）及び少なくとも６のＬＮＡ修飾を含む。

【0009】

複数の実施形態において前記核酸はｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号２）及び少なくとも８のＬＮＡ修飾を含む。

【0010】

複数の実施形態において前記核酸はｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号３）及び少なくとも６のＬＮＡ修飾、少なくとも８のＬＮＡ修飾、又は少なくとも１０のＬＮＡ修飾を含む。複数の実施形態において前記核酸はｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号３）及び８のＬＮＡ修飾を含み、前記修飾が１位、３位、６位、７位、１０位、１２位、１４位、及び１５位に存在する。複数の実施形態において前記核酸はｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号３）及び１０のＬＮＡ修飾を含み、前記修飾が１位、２位、３位、６位、７位、１０位、１１位、１２位、１４位、及び１５位に存在する。

【0011】

複数の実施形態において、前記核酸はｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号４）及び少なくとも８のＬＮＡ修飾、少なくとも１０のＬＮＡ修飾、又は少なくとも１１のＬＮＡ修飾を含む。複数の実施形態において前記核酸はｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号４）及び１０のＬＮＡ修飾を含み、前記修飾が１位、２位、４位、８位、１０位、１１位、１２位、１３位、１５位、及び１６位に存在する。複数の実施形態において前記核酸はｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号４）及び１１のＬＮＡ修飾を含み、前記修飾が１位、２位、４位、５位、６位、８位、１１位、１２位、１３位、１５位、及び１６位に存在する。複数の実施形態において前記核酸はｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号４）及び１１のＬＮＡ修飾を含み、前記修飾が１位、２位、４位、５位、６位、９位、１１位、１２位、１３位、１５位、及び１６位に存在する。

【0012】

複数の実施形態において前記核酸はｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号５）及び少なくとも１０のＬＮＡ修飾又は少なくとも１１のＬＮＡ修飾を含む。複数の実施形態において前記核酸はｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号５）及び１１のＬＮＡ修飾を含み、前記修飾が１位、２位、５位、６位、７位、１０位、１２位、１３位、１４位、１６位、及び１７位に存在する。

【0013】

複数の実施形態において前記核酸はｇｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号６）及び少なくとも９のＬＮＡ修飾又は少なくとも１０のＬＮＡ修飾を含む。複数の実施形態において前記核酸はｇｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号６）及び９のＬＮＡ修飾を含み、前記修飾が１位、２位、６位、１０位、１３位、１４位、１６位、１７位、及び１８位に存在する。

【0014】

別の態様では、本発明は上記の態様の核酸又は上記の実施形態のうちのいずれかの核酸と薬学的に許容可能な賦形剤又は担体を含む医薬組成物を提供する。

【0015】

さらに別の態様では、本発明は上記の態様の核酸又は上記の実施形態のうちのいずれかの核酸を含むベクター又はプラスミドを提供する。

【0016】

本発明の一態様は上記の態様の核酸又は上記の実施形態のうちのいずれかの核酸を含む宿主細胞を提供する。

【0017】

本発明の別の態様はｍｉＲ－２２阻害のための方法を提供する。この方法は上記の態様の核酸又は上記の実施形態のうちのいずれかの核酸であるｍｉＲ－２２阻害剤を含む組成物とｍｉＲ－２２を接触させることを含む。

【0018】

本明細書に記載されるどの態様又は実施形態も本明細書において開示される他のあらゆる態様又は実施形態と組み合わせることができる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

本特許ファイル又は本出願ファイルは少なくとも１つのカラー図面を含む。カラー図面を含む本特許公報又は特許出願公報の複写物は請求及び必要経費の支払いに応じて米国特許庁より提供される。

【図1】抗ｍｉＲ－２２ ＬＮＡのデザインを示す図である。配列番号１、配列番号２、及び配列番号７～配列番号１５が示されている。

【図2】Ａ～Ｃは、抗ｍｉＲ－２２オリゴヌクレオチドのデザインスペースを示す一連の棒グラフと線グラフである。

【図3】Ａ及びＢは、可能な抗ｍｉＲデザイン（１１２２８）のインシリコでの作成、及び最適な抗ｍｉＲ－２２デザイン（８～１８ヌクレオチド長）を選択するための特性の予測を示す図である。図３Ｂの図の説明の上から下に向かって配列番号１１、配列番号２、配列番号７～配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１が示されている。

【図4】ＭＣＦ７におけるＦＡＭ標識ＬＮＡの非補助取込みを示す図である。

【図5】ＭＣＦ７細胞における抗ｍｉＲ－２２ ＬＮＡの効果検証を示しているウエスタンブロットの図である。

【図6】Ａ～Ｃは、ＭＣＦ７における抗ｍｉＲ－２２ ＬＮＡの非補助取込みが標的タンパク質のレベルに影響することを示す図である。図６Ａ及び図６ＢはＨＳＰ－９０対照と比較したＴＥＴ２の発現を示しているウエスタンブロット像である。図６ＣはＴＥＴ２タンパク質の発現を示している棒グラフである。図６Ｃではこの棒グラフのデータの順序は左から右に向かってＳＣＲ（黒色）、２５ｎＭ（明灰色）、及び１００ｎＭ（暗灰色）である。

【図7】抗ｍｉＲ－２２ ＬＮＡがＭＣＦ７において５－ｈｍＣレベルを上昇させることを示している一対のドットブロット像である。

【図8】ＨＦＤを摂食しているｍｉＲ－２２－／－マウス及び野生型マウスが後にベヒクル（ＶＣＨ）、スクランブル対照ＲＮＡ（ＳＣＲ）、及びロック核酸（ＬＮＡ）のトランスフェクションを受けるインビボ実験の計画と条件を示す図である。

【図9】（Δ）ベヒクル、（◇）ＳＣＲ、（□）抗ｍｉＲ－２２について治療マウスと未治療マウスとの間で摂食量に差が無いことを示している棒グラフである。

【図10】Ａ及びＢは、インビボでのｍｉＲ－２２の薬理学的阻害によりマウスの肥満が防止されることを示している線グラフである。図１０Ａは最終的体重増加率を示している。図１０ＢはＤＩＯマウスにおけるｍｉＲ－２２のインビボサイレンシングを示している。両方の図において、データの順序は最終時点で上から下に向かってベヒクル（緑色）、ＳＣＲ（赤色）、及び抗ｍｉＲ－２２（青色）である。

【図11】ＨＦＤを摂食しているｍｉＲ－２２－／－マウス及び野生型マウスが抗ｍｉＲ－２２－ＬＮＡ、ＳＣＲ、及びＶＨＬで治療され、２回目のＨＦＤレジメンに割り当てられることを示している治療アプローチの挿絵である。

【図12】既に肥満であり、且つ、ＨＦＤを与えられているマウスで体重が顕著に減少する前記治療アプローチの結果を示している線グラフである。３か月半の治療の後、肥満でＨＦＤを与えられているマウス（４０ｇ超の平均重量）において体重の顕著な減少が観察された。マウスを殺処理し、組織を収集し、肝臓由来のＲＮＡをＲＮＡシーケンシングに使用した。

【図13】ｍｉＲ－２２の薬理学的阻害がＭＥＦの脂肪細胞への分化の阻害に有効であることを示しているオイルレッドＯ染色の図である。

【図14】Ａ及びＢは、２週間にわたって抗ｍｉＲ－２２ ＬＮＡを含む、又は含まない脂肪細胞分化培地中で培養されたヒト初代間葉系細胞における抗ｍｉＲ－２２処理を示しているオイルレッドＯ染色（図１４Ａ）及び棒グラフ（図１４Ｂ）を示す図である。５００ｎＭを自力取込み（２日毎にＬＮＡを添加）。図１４Ｂでは各棒グラフの右（赤色）の棒のデータはＬＮＡ＃１０処理細胞のデータである。

【図15】ｍｉＲ－２２の薬理学的阻害がＭＥＦの脂肪細胞への分化の阻害に有効であることを示している棒グラフである。棒グラフのデータの順序は、左から右に向かって上から下に向かう図の説明（グラフの右側）に対応する。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本開示はマイクロＲＮＡの発現及び／又は活性の阻害等によるｍｉＲ－２２阻害のための新しい組成物と方法を提供する。

【0021】

理論に捉われるものではないが、成熟ｍｉＲＮＡはポリメラーゼＩＩ又はポリメラーゼＩＩＩによって生成され、且つ、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡと呼ばれる初期転写物から発生すると考えられている。これらのｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは数千塩基長であることがしばしばであり、それ故にプロセッシングを受けてそれよりもずっと短い成熟ｍｉＲＮＡを生成する。これらのｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは多シストロン性の場合があり、多数のｍｉＲＮＡになる可能性があるものを組織する幾つかの配列の集合体から生じる。ｍｉＲＮＡを生み出すプロセッシングは２段階であり得る。第１にｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは核内でリボヌクレアーゼＤｒｏｓｈａによるプロセッシングを受けて約７０～約１００ヌクレオチド長のヘアピン型前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）になり得る。第２にこれらのヘアピン型ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは細胞質への移転後にさらにリボヌクレアーゼＤｉｃｅｒによるプロセッシングを受けて二本鎖ｍｉＲＮＡを作製し得る。その後、この成熟ｍｉＲＮＡ鎖がＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、そこでこの成熟ｍｉＲＮＡ鎖が塩基対相補性によりその標的ｍＲＮＡと結合し、タンパク質発現を抑制し得る。ＲＩＳＣサイレンシング複合体への組み込みに関して優先的に選択されない方のこのｍｉＲＮＡ二重鎖の鎖はパッセンジャー鎖又はマイナーｍｉＲＮＡ又はスター（＊）鎖として知られている。この鎖は分解される場合がある。明記されていない場合、本明細書において使用されるｍｉＲＮＡはｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ及び／又はｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ及び／又は成熟ｍｉＲＮＡ及び／又はマイナー（スター）鎖及び／又は二重鎖型ｍｉＲＮＡのことをいう場合があると理解される。

【0022】

幾つかの実施形態ではｍｉＲＮＡ遺伝子はタンパク質コード遺伝子のイントロン内又は非コード転写単位のイントロン若しくはエクソン内に位置し得る。イントロン性のｍｉＲＮＡの発現はそのホスト転写単位の発現と一致している場合がある。なぜなら、それらのｍｉＲＮＡとホスト転写単位は同方向に向いていることが典型的であり、且つ、それらが存在する前駆ｍＲＮＡと同調して発現されるからである。

【0023】

幾つかの実施形態ではｍｉＲＮＡは標的遺伝子転写物の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）内の配列に結合する場合がある。幾つかの実施形態ではｍｉＲＮＡは標的遺伝子転写物の３’ＵＴＲ外にある配列に結合する場合がある。幾つかの実施形態ではｍｉＲＮＡは標的遺伝子転写物の３’ＵＴＲ内と３’ＵＴＲ外の両方に結合する場合がある。

【0024】

幾つかの実施形態では標的の認識のためにｍｉＲＮＡの２番目と７番目のヌクレオチド（ｍｉＲＮＡシード配列）と標的３’ＵＴＲ上の対応する配列（シードマッチ）との間でヌクレオチド対合が生じ得る。したがって、ｍｉＲＮＡと標的との間の結合は約５ヌクレオチドの塩基対合を含み得る。さらに、ｍｉＲＮＡと標的との間の結合が５ヌクレオチドより多くの塩基対合を含む場合もある。幾つかの実施形態ではｍｉＲＮＡとこのｍｉＲＮＡによって制御される遺伝子との間の結合にはこの標的核酸の最大で２部位、最大で４部位、最大で６部位、最大で８部位、又は最大で１０部位へのこのｍｉＲＮＡの結合が介在する場合がある。

【0025】

ｍｉＲ－２２
ｍｉＲ－２２はチンパンジー、マウス、ラット、イヌ、及びウマを含む多くの脊椎動物種にわたって高度に保存されている。機能上の重要性がこのレベルの保存度から示唆される。ｍｉＲ－２２は先ず赤血球の成熟に役割を有するものとして特定され、後に発癌に役割を有するものとして特定された。ｍｉＲ－２２はホスファターゼ・テンシン・ホモログ（ＰＴＥＮ）及びｔｅｔメチルシトシンジオキシゲナーゼ（ＴＥＴ）を直接の標的として腫瘍発生、転移、及び代謝障害を促進する。幾つかの実施形態では本発明の核酸はＰＴＥＮ及び／又はＴＥＴ２の活性及び／又は発現を上昇させる。

【0026】

予測されたｍｉＲ－２２ヘアピン型前駆体は完全にＣ１７ｏｒｆ９１非コード転写物のエクソン２内に含まれ、且つ、タンパク質コード能が無いにもかかわらずスプライシングパターンが概してヒト及びマウスで保存されている。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら著、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｈｏｓｔ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｕｎｉｔｓ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．誌、２００４年１０月、第１４巻（第１０Ａ号）： １９０２～１０頁を参照されたい。マウスモデルにおいてｍｉｒ－２２を取り囲むＣ１７ｏｒｆ９１のエクソン２の欠失からｍｉＲ－２２が心臓肥大とＳＩＲＴ１（ＮＡＤ依存性デアセチラーゼｓｉｒｔｕｉｎ－ｌ）、ＨＤＡＣ４（ヒストンデアセチラーゼ４）、ＰＵＲＢ（プリンリッチ配列結合タンパク質Ｂ）、及びＰＴＥＮを標的とするリモデリングに役割を果たし得ることが明らかになっている。Ｇｕｒｈａら著、Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ－２２ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃａｒｄｉａｃ ｄｉｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ誌、２０１２年６月５日、第１２５巻（第２２号）：２７５１～６１頁、Ｈｕａｎｇら著、ＭｉｃｒｏＲＮＡ－２２ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃａｒｄｉａｃ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ ａｎｄ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｓｔｒｅｓｓ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．誌、２０１３年４月２６日、第１１２巻（第９号）： １２３４～４３頁を参照されたい。

【0027】

ｍｉＲ－２２の阻害剤
複数の実施形態において、ｍｉＲＮＡの阻害剤はアンチセンスオリゴヌクレオチドとして作用する核酸である。本発明の核酸はリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド又はそれらの組合せを含み得る。本発明の核酸は少なくとも１つの化学的修飾を有してよい（非限定的な例は糖又は骨格の修飾、例えばロック核酸（ＬＮＡ）である）。

【0028】

複数の実施形態においてｍｉＲ－２２を阻害する核酸の配列は種を超えて保存されている。複数の実施形態において前記核酸の配列はヒトｍｉＲ－２２の配列に対して部分的に相補的である。複数の実施形態においてこの阻害剤は細胞又は対象内で標的ｍｉＲ－２２の発現及び／又は活性を低下させるように選択される。

【0029】

複数の実施形態において本発明の核酸はヒトｍｉＲ－２２を阻害する。複数の実施形態においてヒトｍｉＲ－２２はＡＡＧＣＵＧＣＣＡＧＵＵＧＡＡＧＡＡＣＵＧＵ（配列番号１）を含むか、又はこれから成る。

【0030】

複数の実施形態において本発明の核酸は約８～約２０残基長（例えば、約８～１８残基長、又は約８～１６残基長、又は約８～１４残基長、又は約８～１２残基長、又は約８～１０残基長、又は約１０～１８残基長、又は約１０～１６残基長、又は約１０～１４残基長、又は約１０～１２残基長）である。複数の実施形態において前記核酸は約８残基長、又は約９残基長、又は約１０残基長、又は約１１残基長、又は約１２残基長である。

【0031】

複数の実施形態において本発明の核酸は完全な相同性を有してｍｉＲ－２２の一部分に結合する。例えば、本発明の核酸は１８残基長であってよく、１８残基の各々がｍｉＲ－２２のヌクレオチドに対して相補的である。あるいは、本発明の核酸は完全な相同性を有してｍｉＲ－２２の一部分に結合する。例えば、本発明の核酸は１６残基長であってよく、これらの残基のうちの１５以下の残基がｍｉＲ－２２のヌクレオチドに対して相補的である。

【0032】

複数の実施形態において、本発明の核酸は１か所、２か所、３か所、４か所、５か所、又は５か所より多くの位置でｍｉＲ－２２の一部分と異なっている。

【0033】

複数の実施形態において、本発明の核酸はｍｉＲ－２２を阻害するのに充分な親和性でｍｉＲ－２２に結合する。複数の実施形態において前記核酸は高い親和性（例えばｎＭレベルの親和性）でｍｉＲ－２２に結合する。したがって、本発明の核酸は１か所又は複数の位置でｍｉＲ－２２の一部分と異なっているとしても高い親和性でｍｉＲ－２２に結合する。

【0034】

本発明の核酸は、ｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号２）を含み、且つ、少なくとも１つのロック核酸（ＬＮＡ）修飾を備える配列を有してよい。

【0035】

ロック核酸（ＬＮＡ）では核酸のリボース部分が２’酸素と４’炭素を連結する特別な架橋によって修飾されており、その架橋によりこのリボースが３’エンド立体構成に固定される。本発明のＬＮＡを備える核酸は、効率的に送達され、且つ、様々な障害の治療と予防に対して充分な生物学的利用能を有することが可能な費用効果のある薬剤を実現する。

【0036】

複数の実施形態において本発明の核酸はその３’末端に向かって少なくとも２か所のＬＮＡ修飾（例えばその３’末端に向かって約２、又は約３、又は約４、又は約５の修飾）を含む。複数の実施形態において前記核酸はｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号２）及び少なくとも６のＬＮＡ修飾又は少なくとも８のＬＮＡ修飾を含む。

【0037】

例えば、前記核酸はｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号２）の７位及び８位にＬＮＡ修飾を含む。複数の実施形態において本発明の核酸は４以下の連続的ＬＮＡ修飾（例えば、２、又は３、又は４のみの連続的ＬＮＡ修飾）を含む。複数の実施形態において本発明の核酸は３以下の連続的非修飾残基（例えば、３、又は２、又は１のみの非修飾残基）を含む。複数の実施形態において、本発明の核酸は４以上のＬＮＡ修飾を含む。複数の実施形態において前記核酸は約８～約１２のＬＮＡ修飾、例えば約８、又は約９、又は約１０、又は約１１、又は約１２のＬＮＡ修飾を含む。

【0038】

複数の実施形態において、前記核酸はｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号２）、ｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号３）、ｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号４）、ｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号５）、及びｇｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号６）から選択される配列を有する核酸を含む、又はこの核酸から成る。複数の実施形態において前記核酸は、ｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号２）、ｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号３）、ｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号４）、ｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号５）、及びｇｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号６）から選択される配列を有し、約８～約１２のＬＮＡ修飾、例えば約８、又は約９、又は約１０、又は約１１、又は約１２のＬＮＡ修飾を備える核酸を含む。

【0039】

複数の実施形態において前記核酸はｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号３）及び少なくとも６のＬＮＡ修飾、少なくとも８のＬＮＡ修飾、又は少なくとも１０のＬＮＡ修飾を含むか、又はこれから成る。複数の実施形態において前記核酸はｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号３）及び８のＬＮＡ修飾であって、１位、３位、６位、７位、１０位、１２位、１４位、及び１５位に存在する修飾を含むか、又はこれから成る。例えば、前記核酸は配列ＣｔＴｃａＡＣｔｇＧｃＡｇＣＴ（配列番号７）を含むか、又はこれから成り、その配列において大文字はＬＮＡ修飾型であり、小文字は非修飾型である。複数の実施形態において、前記核酸はｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号３）及び１０のＬＮＡ修飾であって、１位、２位、３位、６位、７位、１０位、１１位、１２位、１４位、及び１５位に存在する前記修飾を含むか、又はこれから成る。例えば、前記核酸は配列ＣＴＴｃａＡＣｔｇＧＣＡｇＣＴ（配列番号８）を含むか、又はこれから成り、その配列において大文字はＬＮＡ修飾型であり、小文字は非修飾型である。

【0040】

複数の実施形態において前記核酸はｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号４）及び少なくとも８か所のＬＮＡ修飾、少なくとも１０のＬＮＡ修飾、又は少なくとも１１のＬＮＡ修飾を含むか、又はこれから成る。複数の実施形態において前記核酸はｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号４）及び１０のＬＮＡ修飾であって、１位、２位、４位、８位、１０位、１１位、１２位、１３位、１５位、及び１６位に存在する修飾を含むか、又はこれから成る。例えば、前記核酸は配列ＴＣｔＴｃａａＣｔＧＧＣＡｇＣＴ（配列番号１０）を含むか、又はこれから成り、その配列において大文字はＬＮＡ修飾型であり、小文字は非修飾型である。複数の実施形態において、前記核酸はｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号４）及び１１か所のＬＮＡ修飾であって、１位、２位、４位、５位、６位、８位、１１位、１２位、１３位、１５位、及び１６位に存在する修飾を含むか、又はこれから成る。例えば、前記核酸は配列ＴＣｔＴＣＡａＣｔｇＧＣＡｇＣＴ（配列番号９）を含むか、又はこれから成り、その配列において大文字はＬＮＡ修飾型であり、小文字は非修飾型である。

【0041】

複数の実施形態において前記核酸はｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号４）及び１１のＬＮＡ修飾であって、１位、２位、４位、５位、６位、９位、１１位、１２位、１３位、１５位、及び１６位に存在する前記修飾を含むか、又はこれから成る。例えば、前記核酸は配列ＴＣｔＴＣＡａｃＴｇＧＣＡｇＣＴ（配列番号１１）を含むか、又はこれから成り、その配列において大文字はＬＮＡ修飾型であり、小文字は非修飾型である。

【0042】

複数の実施形態において前記核酸はｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号５）及び少なくとも１０のＬＮＡ修飾又は少なくとも１１のＬＮＡ修飾を含むか、又はこれから成る。複数の実施形態において前記核酸はｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号５）及び１１のＬＮＡ修飾であって、１位、２位、５位、６位、７位、１０位、１２位、１３位、１４位、１６位、及び１７位に存在する前記修飾を含むか、又はこれから成る。例えば、前記核酸は配列ＴＴｃｔＴＣＡａｃＴｇＧＣＡｇＣＴ（配列番号１２）を含むか、又はこれから成り、その配列において大文字はＬＮＡ修飾型であり、小文字は非修飾型である。

【0043】

複数の実施形態において前記核酸はｇｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号６）及び少なくとも９のＬＮＡ修飾又は少なくとも１０のＬＮＡ修飾を含むか、又はこれから成る。複数の実施形態において前記核酸はｇｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号６）及び９のＬＮＡ修飾であって、１位、２位、６位、１０位、１３位、１４位、１６位、１７位、及び１８位に存在する修飾を含むか、又はこれから成る。例えば、前記核酸は配列ＧＴｔｃｔＴｃａａＣｔｇＧＣａＧＣＴ（配列番号１３）を含むか、又はこれから成り、その配列において大文字はＬＮＡ修飾型であり、小文字は非修飾型である。

【0044】

複数の実施形態において上記の配列を含む前記核酸は本明細書に記載される配列の５’側に追加のヌクレオチドをさらに含んでよく、且つ／又は本明細書に記載される配列の３’側に追加のヌクレオチドをさらに含んでよい。これらの追加のヌクレオチドは非修飾型でも修飾型、例えばＬＮＡ修飾型又はその他の化学的修飾型でもよい。

【0045】

幾つかの実施形態では本発明の核酸は追加の化学的修飾をさらに含んでよい。例として、化学的修飾はホスホロチオエート、２’－Ｏ－メチル、又は２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－ＯＭｅ－ＲＮＡ単位、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位（２’位にフッ素への置換（２’Ｆ）を含むＤＮＡ類似体を含むがこれに限定されない）、ＬＮＡ単位、ＰＮＡ単位、ＨＮＡ単位、ＩＮＡ単位、及び２’ＭＯＥ－ＲＮＡ単位のうちの１又は複数である。

【0046】

適切な核酸は、二環式糖ヌクレオシド（ＢＳＮ）修飾を含むオリゴヌクレオチドとそれらのオリゴヌクレオチドの相補的ｍｉＲＮＡ標的鎖との間で形成された複合体に対して熱安定性を向上させる１又は複数の立体構造規制修飾又は二環式糖ヌクレオシド（ＢＳＮ）修飾から構成され得る。例えば、１つの実施形態では前記核酸は少なくとも１つのロック核酸を含む。ロック核酸（ＬＮＡ）は２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレンリボヌクレオシド（構造Ａ）を含み、その中ではリボース糖部分がロックされたコンフォーメーションになっている。別の実施形態では前記核酸は少なくとも１つの２’，４’－Ｃ－架橋２’デオキシリボヌクレオシド（ＣＤＮＡ、構造Ｂ）を含む。例えば、参照により両方の全体が本明細書に援用される米国特許第６４０３５６６号明細書及びＷａｎｇら著、（１９９９年） Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ誌、第９巻： １１４７～１１５０頁を参照されたい。さらに別の実施形態では前記核酸は構造Ｃに示される構造を有する少なくとも１つの修飾型ヌクレオシドを含む。脂肪関連代謝合成経路の標的を制御するｍｉＲＮＡを標的とする前記核酸はＢＳＮ（ＬＮＡ、ＣＤＮＡ等）又は他の修飾型ヌクレオチド、及びリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドの組合せを含み得る。

【0047】

【化1】

【0048】

あるいは、前記核酸はペプチド核酸（ＰＮＡ）から構成されてよく、ペプチド核酸は糖リン酸骨格よりもむしろペプチドベースの骨格を含む。前記核酸に対する他の修飾糖又はホスホジエステル修飾も考えられている。非限定的な例として、他の化学的修飾には２’－Ｏ－アルキル修飾（例えば、２’－Ｏ－メチル修飾、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾）、２’－フルオロ修飾、及び４’－チオ修飾、並びに１又は複数のホスホロチオエート結合、モルホリノ結合、又はホスホノカルボキシレート結合などの骨格修飾（例えば、参照により全体が本明細書に援用される米国特許第６６９３１８７号明細書及び同第７０６７６４１号明細書を参照されたい）を挙げることができる。１つの実施形態では発癌遺伝子ｍｉＲＮＡを標的とする核酸は各塩基上に２’－Ｏ－メチル糖修飾を含み、且つ、ホスホロチオエート結合で連結されている。核酸、特に比較的に短い長さの核酸（例えば、１６ヌクレオチド未満、７～８ヌクレオチドの核酸）は、限定されないが、ＬＮＡ修飾、二環式ヌクレオシド修飾、ホスホノホルマート修飾、２’－Ｏ－アルキル修飾等、１又は複数の親和性増強修飾を含むことができる。幾つかの実施形態では適切な核酸は、中央に少なくとも１０個のデオキシリボヌクレオチドを含み、５’末端と３’末端の両方に２’－Ｏ－メトキシエチル修飾リボヌクレオチドを含む２’－Ｏ－メトキシエチルギャップマーである。これらのギャップマーはＲＮＡ標的のリボヌクレアーゼＨ依存性分解機構を発動することができる。参照により全体が本明細書に援用される米国特許第６８３８２８３号明細書に記載されている修飾等、安定性を上昇させ、且つ、効力を改善する他の核酸の修飾が当技術分野において知られており、それらの修飾は本発明の方法で使用するのに適切である。例えば、限定する意図はないが、インビボ送達と安定性を促進するために前記核酸はその３’末端においてコレステロール部分などのステロイド、ビタミン、脂肪酸、炭水化物若しくはグリコシド、ペプチド、又は他の低分子リガンドに結合していてよい。

【0049】

本明細書において使用される場合、実質的に相補的は、標的ポリヌクレオチド配列（非限定的な例はｍｉＲ－２２等の成熟配列、マイナー配列、前駆ｍｉＲＮＡ配列、又はｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列である）に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相補的な配列のことを指す。

【0050】

幾つかの実施形態では本発明の核酸はアンタゴミルである。アンタゴミルはｍｉＲＮＡに対して少なくとも部分的に相補的であり、したがってそれらのｍｉＲＮＡをサイレンシングする可能性がある一本鎖で化学的修飾を受けているリボヌクレオチドである。例えば、Ｋｒｉｉｔｚｆｅｌｄｔら著、Ｎａｔｕｒｅ誌、（２００５年） 第４３８巻（第７０６８号）： ６８５～９頁を参照されたい。アンタゴミルは２’－Ｏ－メチル糖修飾などの１又は複数修飾型ヌクレオチドを含む場合がある。幾つかの実施形態ではアンタゴミルは修飾型ヌクレオチドだけを含む。アンタゴミルは１又は複数ホスホロチオエート結合を含んでもよく、それにより部分的又は完全なホスホロチオエート骨格が生じる。インビボ送達と安定性を促進するために前記アンタゴミルはその３’末端においてコレステロール又は他の部分に結合していてよい。阻害に適切なアンタゴミルは約１５～約５０ヌクレオチド長、約１８～約３０ヌクレオチド長、及び約２０～約２５ヌクレオチド長であり得る。前記アンタゴミルは成熟発癌遺伝子ｍｉＲＮＡ配列又はマイナー発癌遺伝子ｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相補的であり得る。幾つかの実施形態では前記アンタゴミルは成熟発癌遺伝子ｍｉＲＮＡ配列又はマイナー発癌遺伝子ｍｉＲＮＡ配列に対して実質的に相補的、すなわち標的ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相補的であり得る。他の実施形態では前記アンタゴミルは成熟発癌遺伝子ｍｉＲＮＡ配列又はマイナー発癌遺伝子ｍｉＲＮＡ配列に対して１００％相補的である。

【0051】

本発明の核酸は発癌遺伝子ｍｉＲＮＡの前駆ｍｉＲＮＡ配列（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）又はプライマリーｍｉＲＮＡ配列（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）に対して実質的に相補的な配列を含んでよい。幾つかの実施形態では本発明の核酸はそのｍｉＲＮＡの標的の３’非翻訳領域外に位置する配列を含む。幾つかの実施形態では本発明の核酸はそのｍｉＲＮＡの標的の３’非翻訳領域内に位置する配列を含む。

【0052】

複数の実施形態において前記核酸は限定的な自己結合親和性を有するか、又は自己結合親和性を持たない。複数の実施形態において前記核酸は限定的な二重鎖構造を有するか、又は二重鎖構造を持たない。複数の実施形態において前記核酸は限定的な折り畳み構造を有するか、又は折り畳み構造を持たない。

【0053】

ｍｉＲＮＡ阻害剤又はアゴニストをコードする発現ベクターを細胞へ送達することによって、本発明のいずれの核酸も標的細胞へ送達可能である。ベクターは目的の核酸を細胞の内側に送達するために使用可能な組成物である。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性化合物又は両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含むがこれらに限定されない多数のベクターが当技術分野において知られている。したがって、ベクターという用語には自律複製プラスミド又はウイルスが含まれる。ウイルスベクターの例にはアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられるがこれらに限定されない。発現コンストラクトを生細胞中で複製することができ、又は合成により作製することができる。この用途目的について、発現コンストラクト、発現ベクター、及びベクターという用語は一般的で例示的な意味で本発明の用途を示すために互換的に使用され、これらの用語によって本発明を限定することを意図していない。

【0054】

１つの実施形態では、本発明の核酸を発現するための発現ベクターは本発明の核酸をコードするポリヌクレオチドに機能的に結合したプロモーターを含む。本明細書において使用される「機能的に結合した」又は「転写制御下」という言葉はＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始とポリヌクレオチドの発現を制御するためにこのポリヌクレオチドに関して正しい位置と方向でこのプロモーターが存在していることを意味する。

【0055】

本明細書において使用される場合、プロモーターは遺伝子の特異的な転写を開始するために必要な細胞の合成機械、又は導入された合成機械によって認識されるＤＮＡ配列のことをいう。適切なプロモーターにはＲＮＡポリメレースＩプロモーター、ポリメラーゼＩＩプロモーター、ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、及びウイルスプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス・ロングターミナルリピート）が挙げられるがこれらに限定されない。

【0056】

ある特定の実施形態では本発明の核酸をコードするポリヌクレオチドに機能的に結合した前記プロモーターは誘導プロモーターであってよい。誘導プロモーターは当技術分野において知られており、誘導プロモーターにはテトラサイクリンプロモーター、メタロチオネインＩＩＡプロモーター、熱ショックプロモーター、ステロイド／甲状腺ホルモン／レチノイン酸応答配列、アデノウイルス後期プロモーター、及び誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルスＬＴＲが挙げられるがこれらに限定されない。

【0057】

細胞に発現コンストラクト及び核酸を送達する方法は当技術分野において知られており、非限定的な例としてリン酸カルシウム共沈殿、電気穿孔法、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥデキストラン、リポフェクション、ポリアミントランスフェクションイオン性試薬を使用するトランスフェクション、細胞超音波処理、高速マイクロプロジェクタイルを使用する遺伝子ボンバードメント、及び受容体介在性トランスフェクションを挙げることができる。

【0058】

本発明の態様は本明細書に記載される本発明のいずれかの核酸を含む宿主細胞を提供する。

【0059】

本発明の別の態様はｍｉＲ－２２阻害のための方法を提供する。この方法は本明細書に記載される本発明のいずれかの核酸であるｍｉＲ－２２阻害性組成物と、ｍｉＲ－２２とを接触させることを含む。この方法はインビトロ法でもインビボ法でもよい。

【0060】

別の態様では本発明は本明細書に記載される本発明のいずれかの核酸と薬学的に許容可能な賦形剤又は担体を含む医薬組成物を提供する。

【0061】

臨床用途を企図している場合、意図した用途に適切な形態で医薬組成物を調製してよい。このためには発熱性物質並びにヒト又は動物に有害な可能性のある他の不純物を基本的に含まない組成物の調製が必要になることが一般的である。

【0062】

１つの実施形態では医薬組成物は有効用量の本明細書に記載される本発明のいずれかの核酸を含む。有効用量は有益又は望ましい臨床成果に影響を及ぼすのに充分な量である。有効用量は約１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、又は約５ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇであり得る。有効用量と考えられる量の正確な決定はそれぞれの患者に固有の因子に基づく場合があり、それらの因子には患者の体格、年齢、代謝障害の種類、及び阻害剤又はアゴニスト（非限定的な例にはアンタゴミル、発現コンストラクト、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド二重鎖等が挙げられる）の性質が挙げられる。したがって、本開示及び当技術分野の知識から当業者は投与量を容易に確認できる。例えば、内容全体を参照により援用するＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第６６版、ＰＤＲ Ｎｅｔｗｏｒｋ、２０１２年版（２０１１年１２月２７日）を参照して用量を決定してもよい。

【0063】

巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフィア、ビーズ、並びに水中油型乳液、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベースの系などのコロイド分散系を本明細書に記載される本発明のいずれかの核酸の送達ベヒクルとして使用してよい。脂肪組織（例えば、脂肪細胞）への本開示の核酸の送達に適切な市販の脂肪乳液としてＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤＯ、ＬＩＰＯＳＹＮ（登録商標）、ＬＩＰＯＳＹＮ（登録商標）ＩＩ、ＬＩＰＯＳＹＮ（登録商標）ＩＩＩ、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄ、及び他の類似の脂質乳液が挙げられる。インビボで送達ベヒクルとして使用される一つのコロイド系はリポソーム（すなわち、人工膜小胞）である。このような系の調製と使用は当技術分野においてよく知られている。例示的な製剤が参照により全体が本明細書に援用される米国特許第５９８１５０５号明細書、米国特許第６２１７９００号明細書、米国特許第６３８３５１２号明細書、米国特許第５７８３５６５号明細書、米国特許第７２０２２２７号明細書、米国特許第６３７９９６５号明細書、米国特許第６１２７１７０号明細書、米国特許第５８３７５３３号明細書、米国特許第６７４７０１４号明細書、及び国際公開第０３／０９３４４９号パンフレットにも開示されている。

【0064】

一般的に、送達ベヒクルを安定にし、標的細胞に取り込ませるために適切な塩と緩衝液を使用することが望まれる。本発明の水性組成物は薬学的に許容可能な担体又は水性媒体に溶解又は分散された本明細書に記載される本発明のいずれかの核酸を含む送達ベヒクル（例えば、リポソーム又は他の複合体又は発現ベクター）の有効量を含む。「薬学的に許容可能な」又は「薬理学的に許容可能な」という言葉は動物又はヒトに投与されたときに有害反応、アレルギー反応、又は他の不都合な反応を引き起こさない分子実体及び組成物を指す。本明細書において使用される場合、薬学的に許容可能な担体にはヒトへの投与に適切な医薬品などの医薬品の製剤に使用することを許されている溶媒、緩衝液、溶液、分散媒体、被覆材、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等が挙げられる。薬学的活性物質に適したこのような媒体と薬剤の使用は当技術分野においてよく知られている。どの従来の媒体又は薬剤でも本発明の有効成分と不適合である場合を除いて治療用組成物におけるその使用が考えられている。補助有効成分が前記組成物のベクター又はポリヌクレオチドを不活化しない限り前記組成物にそれらの補助有効成分を組み入れてもよい。

【0065】

前記医薬品は例えば無菌注射溶液又は分散液の即座調製用の無菌水溶液又は分散液と無菌粉剤を形成する。一般的にこれらの製剤は無菌であり、且つ、注射しやすい程度の流動性である。製剤は製造条件及び貯蔵条件下で安定である必要があり、且つ、細菌及び真菌などの微生物の汚染混入活動を抑えて保存される必要がある。適切な溶媒又は分散媒体は例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、及び植物油を含有してよい。例えばレシチンなどの被覆材の使用、分散体の場合は必要とされる粒子径の維持、及び界面活性剤の使用によって適切な流動性が維持され得る。微生物の活動は様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等により抑止され得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。前記注射可能組成物の中に吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを使用することにより前記組成物の吸収が延長され得る。

【0066】

適切な量の本明細書に記載される本発明のいずれかの核酸を所望により他のあらゆる成分（例えば上で列挙した成分）と共に溶媒中に組み入れ、その後でフィルター滅菌することにより無菌注射溶液を調製してよい。一般的に分散体は、基本分散媒体及び他の所望の成分、例えば上で列挙した成分を含む無菌ベヒクルに前記様々な滅菌済み有効成分を組み入れることにより調製される。無菌注射溶液の調製用の無菌粉剤の場合では、好ましい調製方法には前記有効成分とあらゆる所望の追加成分の粉末を前もって滅菌濾過したその溶液から生じさせる真空乾燥法及び凍結乾燥法が挙げられる。

【0067】

製剤時に溶液をその剤形に適合する方法、及び、治療に有効な量で投与してよい。

【実施例】

【0068】

本明細書において開示される発明をより効率的に理解できるようにするために実施例を以下に提示する。これらの実施例は例示を目的としているだけであり、本発明を少しでも限定するものとして解釈されてはならないことを理解されたい。

【0069】

実施例１：抗ｍｉＲ－２２ロック核酸（ＬＮＡ）コンストラクトの設計
全ての抗ｍｉＲ－２２ ＬＮＡがヒトとマウスの両方で有用である。宿主遺伝子はヒトとマウスとの間で４９％の相補性を示し、抗ＨＧ－ｍｉＲ－２２ ＬＮＡは主にヒトで作用する。

【0070】

シード配列をカバーし、８ヌクレオチド長と２０ヌクレオチド長の間のヌクレオチドを含み、許容された長さに特異的なＬＮＡの断片を有し、且つ、ｍｉＲ－２２に対してできるだけ高い結合親和性を持つようにコンストラクトを設計した（図１及び図２Ａ～Ｃ参照）。

【0071】

前記コンストラクトの末端の少なくとも２のＬＮＡ修飾が設計要素に含まれた。連続して４以上のＬＮＡ修飾がさらなる設計要素に含まれた。連続して３以上の非修飾型残基がさらに設計要素として含まれた。

【0072】

ｍｉＲ－２２を阻害するのに充分な親和性でｍｉＲ－２２に結合するように前記コンストラクトを設計した。また、限定的な自己結合親和性を有するか、又は自己結合親和性を持たない（例えば二重鎖構造又は折り畳み構造を持たないか、限定的に有する）ように前記コンストラクトを設計した。図３Ａ～Ｂを参照されたい。

【0073】

以下の配列では大文字はＬＮＡ修飾であり、小文字は非修飾である。ｍｉＲ－２２（配列番号１）と抗ｍｉＲ－２２オリゴヌクレオチド（配列番号２及び配列番号７～配列番号１３）の方向は５’から３’である。図１は抗ｍｉＲ－２２オリゴヌクレオチドがｍｉＲ－２２にハイブリダイズしたときの方向３’から５’の方向で抗ｍｉＲ－２２オリゴヌクレオチドを示している。５’から３’方向の配列番号１４及び配列番号１５のオリゴヌクレオチドはスクランブル配列であり、ｍｉＲ－２２（配列番号１）にハイブリダイズしない。

【0074】

hsa-miR-22 AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU （配列番号１）
CRM0008 TGGCAGCT （配列番号２）
CRM0009 CtTcaACtgGcAgCT （配列番号７）
CRM0010 CTTcaACtgGCAgCT （配列番号８）
CRM0011 TCtTCAaCtgGCAgCT （配列番号９）
CRM0012 TCtTcaaCtGGCAgCT （配列番号１０）
CRM0013 TCtTCAacTgGCAgCT （配列番号１１）
CRM0014 TTctTCAacTgGCAgCT （配列番号１２）
CRM0015 GTtctTcaaCtgGCaGCT （配列番号１３）
CRM0016 CGaATAgTtaGTAgCG （配列番号１４）
CRM0017 FAM標識CGaATAgTtaGTAgCG （配列番号１５）

【0075】

実施例２：ｍｉＲ－２２の阻害
ｍｉＲ－２２を阻害する実施例１のコンストラクトの能力を評価した。
接着細胞株のＬＮＡの補助取込み（Ｌｉｐｏ２００形質移入）のプロトコルを最適化することにより、前記配列をアッセイで検証し、ＦＡＭ標識ＬＮＡを使用し、接着細胞株において、補助取込み及び非補助取込みで、最も効力のある抗ｍｉＲ－２２を特定（処理前及び処理後のｍｉＲ－２２レベル、並びにＴＥＴ２の活性及びタンパク質レベルを分析）することにより生物学的効果を検証した。インビボ治療での使用のために最も効力のある抗ｍｉＲをマウスモデルにおいて使用することを目的とした。実証された結果については図３Ａ～Ｂ、図４、図５、図６、及び図７を参照されたい。

【0076】

実施例１のコンストラクトのｍｉＲ－２２を阻害する能力のさらなる検証を肥満モデルにおいてインビボで評価した。

【0077】

予防のインビボ実験計画では、図８を参照されたく、ＨＦＤを摂食している２か月齢のｍｉＲ－２２－／－及び野生型にベヒクル（ＶＣＨ）、スクランブル対照ＲＮＡ（ＳＣＲ）、及び実施例１のロック核酸（ＬＮＡ）を形質移入し、２０ｍｇ／ｋｇの（初回）負荷用量と毎週１０ｍｇ／ｋｇの維持用量の腹腔内（ＩＰ）注射、非補助取込みで治療した。摂食量については治療マウスと未治療マウスとの間で差が無かった。図９を参照されたい。インビボｍｉＲ－２２の薬理学的阻害によりマウスが肥満になることが抑制された。図１０Ａ～Ｂを参照されたい。

【0078】

図１１は治療アプローチの図示であり、ＨＦＤを摂食しているｍｉＲ－２２－／－及び野生型マウスが抗ｍｉＲ－２２－ＬＮＡ、ＳＣＲ、及びＶＨＬで治療4され、２回目のＨＦＤレジメンに割り当てられることを示している。図１２に示されるように、体重減少によって明らかな通り、実施例１のコンストラクトはｍｉＲ－２２を阻害した。

【0079】

ｍｉＲ－２２阻害のさらなる証拠はＭＥＦの脂肪細胞への分化の阻害を示しているオイルレッドＯ染色実験に見られた。図１３は実施例１のコンストラクトによるｍｉＲ－２２の薬理学的阻害がＭＥＦの脂肪細胞への分化の阻害に有効であることを示している。図１４は２週間にわたって抗ｍｉＲ－２２ ＬＮＡを含む、又は含まない脂肪細胞分化培地中で培養されたヒト初代間葉細胞における抗ｍｉＲ－２２処理を示しているオイルレッドＯ染色（図１４Ａ）と棒グラフ（図１４Ｂ）である。５００ｎＭ、非補助取り込み（２日毎にＬＮＡを添加）。図１４Ｂでは各棒グラフの右（赤色）の棒のデータはＬＮＡ＃１０処理細胞のデータである。図１５はｍｉＲ－２２の薬理学的阻害がＭＥＦの脂肪細胞への分化の阻害に有効であることを示している棒グラフである。棒グラフのデータの順序は左から右に向かって、上から下に向かう図の説明（グラフの右側）に対応する。ＬＮＡの数は上の実施例１に対応している。
したがって、実施例１の核酸コンストラクトはｍｉＲ－２２の阻害に有効である。

【0080】

他の実施形態
発明を実施するための形態と併せて本開示を説明してきたが、これまでの説明は本開示を例示することを意図するものであり、本開示の範囲を限定することを意図したものではないことが理解されるべきであり、本開示の範囲は添付されている特許請求の範囲によって規定される。他の態様、利点、及び変更点は以下の特許請求の範囲内に含まれる。

【0081】

参照による援用
本明細書において参照された全ての特許及び刊行物の全体を参照により本明細書に援用する。
本明細書において考察された刊行物は単に開示を目的として本願書の提出日の前に提示されている。本明細書中の何物も本発明が先行発明のためにこのような公開に先行するとは言えないと認めたと解釈されてはならない。

【0082】

本明細書において使用される場合、全ての見出しは単に構成のためのものであり、本開示を多少なりとも限定することを意図したものではない。
（付記）
本開示は以下の態様を含む。
＜１＞
ｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号２）を含む配列を有し、少なくとも１のロック核酸（ＬＮＡ）修飾を含む核酸を含む、ｍｉＲ－２２阻害性組成物。
＜２＞
前記核酸がｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号２）の７位及び８位にＬＮＡ修飾を含む、＜１＞に記載の組成物。
＜３＞
前記核酸が、ｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号２）、ｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号３）、ｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号４）、ｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号５）、及びｇｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号６）から選択される配列を有する核酸を含む、＜１＞に記載の組成物。
＜４＞
前記核酸が約８～約１２のＬＮＡ修飾を含む、＜１＞～＜３＞のいずれか一項に記載の組成物。
＜５＞
前記核酸が約８～約１０のＬＮＡ修飾を含む、＜４＞に記載の組成物。
＜６＞
前記核酸が約８、又は約９、又は約１０、又は約１１、又は約１２のＬＮＡ修飾を含む、＜１＞～＜３＞のいずれか一項に記載の組成物。
＜７＞
前記核酸が約１０のＬＮＡ修飾を含む、＜６＞に記載の組成物。
＜８＞
前記核酸がｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号２）及び少なくとも６のＬＮＡ修飾を含む、＜１＞に記載の組成物。
＜９＞
前記核酸がｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号２）及び少なくとも８のＬＮＡ修飾を含む、＜１＞に記載の組成物。
＜１０＞
前記核酸がｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号３）及び少なくとも６のＬＮＡ修飾を含む、＜１＞に記載の組成物。
＜１１＞
前記核酸がｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号３）及び少なくとも８のＬＮＡ修飾を含む、＜８＞に記載の組成物。
＜１２＞
前記核酸がｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号３）及び少なくとも１０のＬＮＡ修飾を含む、＜８＞に記載の組成物。
＜１３＞
前記核酸がｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号３）及び８のＬＮＡ修飾を含み、前記修飾が１位、３位、６位、７位、１０位、１２位、１４位、及び１５位に存在する、＜１１＞に記載の組成物。
＜１４＞
前記核酸がｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号３）及び１０のＬＮＡ修飾を含み、前記修飾が１位、２位、３位、６位、７位、１０位、１１位、１２位、１４位、及び１５位に存在する、＜１２＞に記載の組成物。
＜１５＞
前記核酸がｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号４）及び少なくとも８のＬＮＡ修飾を含む、＜１＞に記載の組成物。
＜１６＞
前記核酸がｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号４）及び少なくとも１０のＬＮＡ修飾を含む、＜１５＞に記載の組成物。
＜１７＞
前記核酸がｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号４）及び少なくとも１１のＬＮＡ修飾を含む、＜１６＞に記載の組成物。
＜１８＞
前記核酸がｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号４）及び１０のＬＮＡ修飾を含み、前記修飾が１位、２位、４位、８位、１０位、１１位、１２位、１３位、１５位、及び１６位に存在する、＜１６＞に記載の組成物。
＜１９＞
前記核酸がｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号４）及び１１のＬＮＡ修飾を含み、前記修飾が１位、２位、４位、５位、６位、８位、１１位、１２位、１３位、１５位、及び１６位に存在する、＜１７＞に記載の組成物。
＜２０＞
前記核酸がｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号４）及び１１か所のＬＮＡ修飾を含み、前記修飾が１位、２位、４位、５位、６位、９位、１１位、１２位、１３位、１５位、及び１６位に存在する、＜１７＞に記載の組成物。
＜２１＞
前記核酸がｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号５）及び少なくとも１０のＬＮＡ修飾を含む、＜１＞に記載の組成物。
＜２２＞
前記核酸がｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号５）及び少なくとも１１のＬＮＡ修飾を含む、＜２１＞に記載の組成物。
＜２３＞
前記核酸がｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号５）及び１１のＬＮＡ修飾を含み、前記修飾が１位、２位、５位、６位、７位、１０位、１２位、１３位、１４位、１６位、及び１７位に存在する、＜２２＞に記載の組成物。
＜２４＞
前記核酸がｇｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号６）及び少なくとも９のＬＮＡ修飾を含む、＜１＞に記載の組成物。
＜２５＞
前記核酸がｇｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号６）及び少なくとも１０のＬＮＡ修飾を含む、＜２４＞に記載の組成物。
＜２６＞
前記核酸がｇｔｔｃｔｔｃａａｃｔｇｇｃａｇｃｔ（配列番号６）及び９のＬＮＡ修飾を含み、前記修飾が１位、２位、６位、１０位、１３位、１４位、１６位、１７位、及び１８位に存在する、＜２４＞に記載の組成物。
＜２７＞
＜１＞～＜２６＞のいずれか一項に記載の核酸と、薬学的に許容可能な賦形剤又は担体を含む医薬組成物。
＜２８＞
＜１＞～＜２６＞のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター又はプラスミド。
＜２９＞
＜１＞～＜２６＞のいずれか一項に記載の核酸を含む宿主細胞。
＜３０＞
ｍｉＲ－２２と、＜１＞～＜２６＞のいずれか一項に記載のｍｉＲ－２２阻害性組成物とを接触させることを含むｍｉＲ－２２を阻害する方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

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